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Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Aspectos Básicos do Desenvolvimento e da Reprodução em
Laboratório de Anopheles Neotropicais, Vetores de Malária
ALINE SANTANA DE SOUZA LIMA
- Rio de Janeiro -
Abril, 2009
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ii
Instituto Oswaldo Cruz
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Aline Santana de Souza Lima
Aspectos Básicos do Desenvolvimento e da Reprodução em Laboratório de
Anopheles Neotropicais, Vetores de Malária
Dissertação apresentada à Coordenação
do Programa de Pós-graduação em
Biologia Parasitária do Instituto Oswaldo
Cruz como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Dr. José Bento Pereira Lima
- Rio de Janeiro -
Abril, 2009
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iii
Instituto Oswaldo Cruz
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Aline Santana de Souza Lima
Aspectos Básicos do Desenvolvimento e da Reprodução em Laboratório de
Anopheles Neotropicais, Vetores de Malária.
Orientador: Dr. José Bento Pereira Lima
Banca Examinadora
_________________________________________________________
Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira - FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz - Presidente
_________________________________________________________
Dr. Alexandre Afrânio Peixoto - FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz - Revisor
_________________________________________________________
Dra. Marinete Marins Póvoa – IEP/ Instituto Evandro Chagas - Membro
Suplentes
Dra. Claudia Masini d’Avila Levy – FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz
Dra. Elvira Maria Saraiva - UFRJ
- Rio de Janeiro -
Abril, 2009
iv
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes
Vetores (LAFICAVE), Instituto Oswaldo Cruz, sediado no Laboratório de Entomologia
do Centro de Pesquisa General Dr. Ismael da Rocha, Instituto de Biologia do
Exército. Foram utilizados recursos da Fundação Oswaldo Cruz, da Fundação de
Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (Faperj), do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES) e da Secretaria de
Vigilância em Saúde (SVS-MS).
v
À minha família: Arcélia,
José, Leo, Larissa,
Leandro e Matheus que
são a razão do meu viver.
vi
Foram muitos, os que me ajudaram a concluir este trabalho.
Meus agradecimentos...
...À minha mãe Arcélia por ter me ajudado em toda a minha vida;
...Ao meu Pai José Rodrigues e meu irmão Leonardo Santana que embora estejam morando
em Minas, sempre contribuíram para minha formação;
...À minha linda filha Larissa Souza Lima por compreender minhas faltas e falhas;
...Aos meus pequeninos sobrinhos lindos Matheus e Leandro pela alegria;
...Ao Dr. José Bento Pereira Lima pela orientação, pela credibilidade, paciência, pelas
viagens e amizade;
... À Dr. Denise Valle pela oportunidade de me deixar fazer parte da equipe LAFICAVE e
realizar este estudo, pelos ensinamentos e paciência;
... Ao LAFICAVE pela ajuda, desde a entrada no mestrado, nos experimentos, até a
elaboração da dissertação. Também pela alegria, consolo, conversas, apoio, eventos e
amizade;
... Em especial aos amigos “Laficavianos” Thiago, Luana, Edna, Diogo, Diego, Tânia,
Eliane, Nathália, Gustavo, Ademir, Jutta, Luciana, Adriana e recentemente a Glória por me
aturar diariamente. Vocês são 10!;
... À tia Cibele, minha gratidão pelo apoio e incentivo dado durante toda minha formação;
...Aos meus primos Rosalva, Dani, Monique, Marquito, Thiago, Elizeu Jr e Anderson;
...e as amigas Márcia, Juliana e Renata, sempre presentes na minha vida;
... Aos amigos da turma de Mestrado da Biologia Parasitária 2007, principalmente Dani
Misael (amigona), Daniela Rosas, Tamarita, Allan (10!), Mari Almeida, Mari Gandini,
vii
Márcio Pavan (e a Silvia), Anna Carol, Caroline, Uruguaio, Mônica, Xande e Lívia pelas
festas, conversas, amizade e aprendizagem;
...À galera da especialização em Entomologia Médica principalmente a Cecília, Rodrigo,
Leandro, Antônio e Daniel. Foi ótimo conhecer vocês;
...Ao Allan Kardec, Clícia, Rafaela e toda a equipe do IEPA pela oportunidade, dicas,
fornecimento dos anofelinos e ajuda na captura dos mosquitos em Macapá;
...Aos gregos Alexis e Alexandros Evremidis pelos momentos felizes e pelos ensinamentos da
vida;
...Ao vírus Dengue e ao meu sistema imunológico por ter me deixado sobreviver e continuar
com o desenvolvimento desta Dissertação;
...Ao pessoal de Manaus, pelas boas conversas que tivemos, tanto pesquisadores quanto os
participantes da reunião de malária;
... A UFRJ pelas aulas que me deram suporte para passar no mestrado e aos amigos que lá eu
fiz;
...Ao Instituto de Biologia do Exército (IBEx) pelo espaço fornecido;
...Ao Instituto Oswaldo Cruz (IOC) pelo apoio financeiro;
...À CAPES pela bolsa de Mestrado;
... A natureza por eu existir.
viii
Basta olhar algo com atenção para que se torne interessante.
Eugênio d’Ors
ix
ÍNDICE
RESUMO ............................................................................................................................ xi
ABSTRACT ....................................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................1
1.1. Anopheles aquasalis..............................................................................................5
1.1.1. Morfologia dos adultos ......................................................................................5
1.1.2. Distribuição geográfica......................................................................................6
1.1.3. Comportamento .................................................................................................6
1.1.4. Criadouros ..........................................................................................................7
1.1.5. Hábitos alimentares e relação com a malária.................................................8
1.2. Complexo Albitarsis...............................................................................................9
1.3. Anopheles albitarsis sensu stricto ...................................................................10
1.3.1. Morfologia dos adultos ....................................................................................10
1.3.2. Distribuição geográfica....................................................................................11
1.3.3. Comportamento ...............................................................................................11
1.3.4. Criadouros ........................................................................................................12
1.3.5. Hábitos alimentares e relação com a malária...............................................12
1.4. Anopheles marajoara...........................................................................................12
1.4.1. Morfologia dos adultos ....................................................................................12
1.4.2. Distribuição geográfica....................................................................................14
1.4.3. Comportamento ...............................................................................................14
1.4.4. Criadouros ........................................................................................................14
1.4.5. Hábitos alimentares e relação com a malária...............................................15
1.5. Aspectos Básicos do Desenvolvimento ..........................................................15
1.5.1. Desenvolvimento das formas imaturas .........................................................15
1.5.2. Alimentação sanguínea e postura..................................................................17
1.5.3. Longevidade.....................................................................................................18
1.6. Aspectos Básicos da Reprodução....................................................................20
1.7. Colonização de Anofelinos em Laboratório....................................................21
2. OBJETIVO GERAL.......................................................................................................24
2.1. Objetivos Específicos..........................................................................................24
3. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................25
3.1. Desenvolvimento ..................................................................................................25
3.1.1. Manutenção dos mosquitos no laboratório ...................................................25
3.1.2. Viabilidade das larvas e cinética de emergência de machos e de fêmeas
de Anopheles albitarsis..............................................................................................27
3.1.3. Influência do tempo entre repasto e postura sobre a taxa de eclosão das
larvas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis...........................................28
3.1.4. Longevidade de fêmeas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis .28
3.2. Reprodução (Anopheles albitarsis) ..................................................................29
3.2.1. Influência da densidade de adultos nas gaiolas sobre a eficácia de cópula
livre...............................................................................................................................29
x
3.2.2. Influência do tempo de contato entre machos e fêmeas sobre a eficácia de
cópula livre ..................................................................................................................30
3.2.3. Avaliação de parâmetros que influenciam a cópula induzida .....................30
3.3. Colonização de Anopheles marajoara..............................................................32
3.3.1. Por cópula induzida .........................................................................................32
3.3.2. Tentativa de cópula livre .................................................................................35
3.4. Análises Estatísticas............................................................................................35
4. RESULTADOS ..............................................................................................................36
4.1. Desenvolvimento ..................................................................................................36
4.1.1. Viabilidade e cinética de emergência de Anopheles albitarsis ...................36
4.1.2. Influência do tempo entre repasto e postura sobre a taxa de eclosão das
larvas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis...........................................37
4.1.3. Longevidade das fêmeas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis
......................................................................................................................................41
4.2. Reprodução (Anopheles albitarsis) ..................................................................45
4.2.1. Densidade ideal nas gaiolas...........................................................................45
4.2.2. Tempo de contato entre machos e fêmeas...................................................46
4.2.3. Influência da idade dos machos sobre a eficácia de cópula induzida........48
4.2.4. Número de cópulas viáveis por macho .........................................................49
4.3. Colonização de Anopheles marajoara..............................................................49
4.3.1. Por cópula induzida .........................................................................................49
4.3.2. Por cópula livre ................................................................................................53
5. DISCUSSÃO ..................................................................................................................54
6. CONCLUSÕES..............................................................................................................65
7. REFERÊNCIAS .............................................................................................................66
xi
RESUMO
A malária é uma doença infecto-parasitária que ainda hoje acomete cerca de 500
milhões de pessoas e mata um milhão no mundo a cada ano, principalmente no
continente africano. No Brasil, são registrados cerca de 500 mil casos anuais, dos
quais 99,7% ocorrem na Amazônia Legal. Anopheles neotropicais são importantes
vetores do parasito da malária humana. A colonização destes vetores em laboratório
é de suma importância para se estudar características biológicas e comportamentais
visando, entre outros, seu controle. No entanto, é sabido que algumas espécies de
anofelinos neotropicais possuem certas limitações para a colonização em laboratório.
Neste estudo, colonizamos uma espécie críptica, pertencente ao Complexo
Albitarsis, Anopheles marajoara, incriminada como vetor primário de malária no
estado do Amapá, Brasil. Por meio da técnica de cópula induzida, alcançamos até o
momento a geração F19. Também foram avaliados alguns aspectos básicos do
desenvolvimento e da reprodução de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis,
duas espécies já estabelecidas no laboratório. Com relação ao desenvolvimento,
verificamos que a viabilidade de larvas L1 até a emergência do adulto de Anopheles
albitarsis, utilizando o mesmo procedimento de criação da colônia e diferentes
quantidades (60 e 100 larvas por bacia), ficou em torno de 35%. Observamos ainda
que estas diferentes condições não interferiram na cinética de emergência dos
adultos. A emergência de machos adultos antecede a de fêmeas, confirmando
resultados da literatura. Verificamos que o período de tempo entre o repasto
sanguíneo e a postura influencia a taxa de eclosão das larvas de forma distinta para
cada espécie. Realizamos ensaios de longevidade comparando diversas situações
fisiológicas: fêmeas virgens e acasaladas, alimentação apenas com açúcar, ou
adicionada de repasto sanguíneo e, neste último caso, com possibilidade ou não de
realização de postura. Todos os grupos de Anopheles albitarsis foram equivalentes,
embora houvesse tendência a menor longevidade de fêmeas alimentadas
exclusivamente com açúcar. No caso de Anopheles aquasalis, ao contrário, a menor
longevidade foi detectada em fêmeas que fizeram repasto sanguíneo. Com relação
aos aspectos reprodutivos, observamos em Anopheles albitarsis que, com exceção
de 25 casais por gaiola, todas as outras densidades avaliadas, até 250 casais por
gaiola, proporcionaram pelo menos 60% de fêmeas inseminadas. Na avaliação da
influência do tempo de contato entre machos e fêmeas Anopheles albitarsis sobre a
eficácia de cópula livre, usando densidade de 100 casais por gaiola, obtivemos
percentuais crescentes de fêmeas inseminadas entre três e seis noites de contato,
quando taxa superior a 80% foi alcançada. Utilizando a técnica de cópula induzida
com Anopheles albitarsis, verificamos que quase 100% dos machos utilizados com
até quatro dias de idade adulta agarram as fêmeas e aproximadamente 70% as
inseminam. Machos mais velhos tendem a perder sua eficiência para agarrá-las;
entretanto, a maioria dos que conseguem agarrar, as inseminam. Identificamos ainda
que um mesmo macho, com três dias de idade, pode ser usado com sucesso para
copular continuamente até quatro fêmeas com percentual de aproximadamente 60%.
Os parâmetros avaliados servem como ferramenta para tornar mais eficiente a
criação de anofelinos neotropicais em condições de laboratório. A colonização de
Anopheles marajoara será usada, inicialmente, para estudos de isolamento
reprodutivo das espécies do Complexo Albitarsis.
xii
ABSTRACT
Malaria is a parasitic disease that still affects roughly 500 million persons and kills
one million yearly in the world, mainly in Africa. In Brazil 500 thousand cases are
reported each year, 99.7% at Legal Amazon. Neotropical Anopheles are important
vectors of human malaria parasites. Laboratory colonization of these vectors is
crucial to the study of their biologic and behaviour characteristics aiming their control,
among others. However, it is known that some neotropical Anopheles species
present limitations when laboratory colonization is considered. In the present study
we colonized a criptical species belonging to the Albitarsis Complex, Anopheles
marajoara, incriminated as primary malaria vector at Amapá State, Brazil. We
reached the F19 generation with forced mating. Some basic aspects of Anopheles
albitarsis and Anopheles aquasalis development and reproduction were also
evaluated. Both species are stablished in the laboratory. With respect to
development, we verified that viability of Anopheles albitarsis L1 larvae up to adult
emergence, following the same colony rearing procedure, was around 35%. The
same adult emergence kinetics was obtained with 60 or 100 larvae per basin. Adult
males emergence precedes that of females, confirming results of litetature. We
verified that the time period between blood meal and egglaying influences larvae
eclosion rate differently for each species. Longevity assays were performed
comparing distinct physiological situations: virgin or mated females, only sugar
feeding, sugar and blood meal and, for this last condition, with or without possibility of
performing oviposition. In relation to Anopheles albitarsis, all the different conditions
presented equivalent longevity, although a tendency to a lower longevity has been
observed in females fed exclusively on sugar. By contrast, in the case of Anopheles
aquasalis, the lowest longevity was observed in blood fed females. Regarding
reproductive aspects, except for the density of 25 couples per cage, insemination of
at least 60% of Anopheles albitarsis females was attained, up to the density of 250
couples per cage. Influence of the time of contact between Anopheles albitarsis
males and females on the free mating eficacy was also evaluated, at the density of
100 couples per cage. Increasing rates of inseminated females were obtained
between three and six nights of contact, when more than 80% inseminated females
were observed. Using the technique of forced mating with Anopheles albitarsis, found
that almost 100% of males up to four days after adult emergence are competent to
grab females and inseminate 70% them. Older males do not grab females with the
same ability but the majority of those that do it are competent to inseminate them. We
also verified, with three day old males that the same specimen can be successfully
employed to copulate with up to four females with percentage of approximately 60%.
The parameters here evaluated will serve as a tool to raise the efficiency of rearing
neotropical Anopheles in captivity. Anopheles marajoara colonization will be initially
employed on studies regarding the reproductive isolation among species belonging to
the Albitarsis Complex.
1
1. INTRODUÇÃO
A malária é uma doença que ainda hoje acomete cerca de 500 milhões de
pessoas e mata um milhão no mundo a cada ano principalmente no continente
africano (Greenwood et al. 2008).
No Brasil, são registrados cerca de 500 mil casos de malária por ano
sendo que 99,7% destes ocorrem na Amazônia Legal (Mayumi e Portela 2008). A
transmissão da doença nesta área está relacionada a diversos fatores como:
existência do parasito, do vetor, e de pessoas susceptíveis, grandes coleções
hídricas, alto índice pluviométrico, modificações antrópicas como o desmatamento,
construção de hidroelétricas, estradas, entre outros e finalmente fatores econômicos
e sociais como, por exemplo, o tipo de habitação e o hábito de trabalho, se no
interior ou próximo das matas (MS, 2008). A Figura 1 ilustra as áreas de ocorrência
de malária no mundo.
Figura 1: casos de malária no mundo. Mapa interativo. Última atualização 29 de agosto de 2008.
Fonte: www.cdc.gov/malaria/risk_map/
Sem casos de malária relatados
Casos de malária relatados
2
A malária tem como agente etiológico protozoários do gênero Plasmodium,
que possuem ciclos complexos de multiplicação sexuada e assexuada. Existem
quatro espécies de plasmódios que infectam o homem: Plasmodium falciparum
Welch, 1897, responsável pela maioria dos casos fatais, Plasmodium vivax Grassi e
Feleti, 1890, responsável por uma forma menos grave, mas recidiva, Plasmodium
malariae Laveran, 1881 e Plasmodium ovale Stephens, 1822, ausente do Brasil
(Camargo 1995, Pereira-da-Silva e Oliveira 2002). A Figura 2 mostra o ciclo da
malária nos hospedeiros vertebrado e invertebrado.
Figura 2: Ciclo da malária. Durante o repasto sanguíneo, o mosquito Anopheles infectado com o
parasito da malária inocula esporozoítas no hospedeiro humano . Os esporozoítas invadem as
células hepáticas e transformam-se em esquizontes maduros no qual se rupturam e liberam os
merozoítas . Após o ciclo exoeritrocítico , os parasitas sofrem multiplicação assexuada nos
eritrócitos (ciclo eritrocítico) . Merozoítas infectam os glóbulos vermelhos e transformam-se em
esquizontes maduros. Estes rupturam-se e liberam os merozoítas que reinvadem novos eritrócitos.
Alguns merozoítas se diferenciam em gametócitos masculinos e femininos e, uma vez ingeridos
pelo mosquito durante o repasto sanguíneo o parasito realizará o ciclo esporogônico . No
estômago do mosquito, gametas masculinos e femininos se fundem formando o zigoto . O zigoto
3
torna-se móvel e alongado formando o oocineto . O oocineto se dirige para a parede intestinal do
inseto, perfura-a, resultando em um oocisto . Inicia-se o processo de multiplicação esporogônica,
que produz, no interior do oocisto, milhares de esporozoítas que invadem a glândula salivar do
anofelino. A inoculação de esporozoítos em um novo hospedeiro humano perpetua o ciclo da malária.
Fonte: www.cdc.gov/malaria/cicle
Vetores dos parasitos da malária humana são insetos da ordem Diptera,
pertencentes à família Culicidae, subfamília Anophelinae e gênero Anopheles. Este
gênero é constituído por seis subgêneros: Cellia, Stethomyia, Lophopodomyia,
Anopheles, Kerteszia e Nyssorhynchus. Embora todos, à exceção de Cellia, sejam
encontrados na região neotropical, as espécies de importância médica desta região
estão incluídas nos subgêneros Anopheles, Kerteszia e Nyssorhynchus (Lozovei
2001).
O subgênero Anopheles inclui espécies que, de um modo geral,
transmitem o parasito da malária em áreas de altitude elevada, como os Andes, e
entre as terras elevadas e a planície. Anopheles pseudopunctipennis Theobald, 1901
e Anopheles vestitipennis Dyar e Knab, 1906, são algumas espécies importantes
desse grupo (Forattini 2002).
Os Kerteszia são mosquitos silvestres que desovam na água que se
acumula geralmente na base das folhas de gravatás. Tiveram grande importância na
transmissão da malária das bromélias no Brasil, na década de 1940, quando a
doença foi considerada endêmica nos estados de São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Rio Grande do Sul. Com medidas de controle eficazes foi possível reduzir
a malária nessas regiões (Ueno et al. 2007). As espécies Anopheles bellator Dyar e
Knab, 1906 e Anopheles cruzii Dyar e Knab, 1903, são exemplos de vetores
importantes de malária deste subgênero.
O subgênero Nyssorhynchus constitui o grupo de anofelinos com maior
número de vetores de malária na região neotropical (Beaty e Marquardt 1996).
Possuem variados tipos de criadouros e além de transmitir malária, algumas
espécies vetoram outros tipos de doenças como a filária bancroftiana e algumas
arboviroses (Lozovei 2001). Anopheles darlingi Root, 1926 é o principal vetor da
malária no Brasil e está presente no interior do território nacional. É um mosquito que
facilmente se adapta e se beneficia das modificações antrópicas do ambiente
silvestre e mesmo em baixas densidades é capaz de transmitir o parasito. De um
modo geral, este anofelino tem comportamento endofílico, endofágico e antropofílico
(Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994).
4
Anopheles aquasalis Curry, 1932, é vetor primário no litoral do Atlântico,
onde encontra-se distribuído, devido a sua preferência por águas com certa
salinidade. Anopheles albitarsis Lynch Arribálzaga, 1878 é considerado um complexo
de espécies crípticas do qual alguns membros têm sido incriminados como vetores
primários do parasito da malária humana em certas regiões do Brasil (Conn et al.
2002, Póvoa et al. 2006). Outras espécies deste subgênero, como Anopheles
nuneztovari Gabaldon, 1940, Anopheles oswaldoi Peryassui, 1926, Anopheles
triannulatus Neiva e Pinto, 1922 e Anopheles braziliensis Chagas, 1907, são
consideradas vetores importantes em algumas regiões do país (Lourenço-de-Oliveira
et al. 1989, Tadei e Thatcher 2000, Póvoa et al. 2001, Silva et al. 2006, Galardo et al.
2007).
O ciclo de vida desses mosquitos consiste de quatro estágios, sendo eles:
ovo, larva, pupa e adulto. Os ovos, as larvas e as pupas são aquáticos, enquanto os
adultos são terrestres. As fêmeas depositam seus ovos diretamente na água, sendo
esta limpa, parada ou com pouca correnteza. Os ovos dos anofelinos são postos
isoladamente e flutuam devido à presença de expansões laterais que contêm ar.
Após a fecundação, o desenvolvimento embrionário prossegue com o contato com a
água, por período de tempo que varia de acordo com a temperatura (Rey 2001).
A larva apresenta quatro estadios e ao final do desenvolvimento se
transforma em pupa. Esta não se alimenta e sofre modificações necessárias para a
metamorfose em adulto (Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994). O inseto adulto
completamente formado emerge, abandona a água e vai para um abrigo até o
momento do início das suas atividades.
Os adultos, quando em repouso, mantêm a probóscide e o corpo em linha
reta, formando um ângulo quase reto com a superfície de pouso, e por esta razão
são conhecidos vulgarmente como “mosquitos prego”. Ambos os sexos se alimentam
de seiva de plantas, sendo que somente a fêmea se alimenta de sangue, pois este é
necessário para o desenvolvimento dos ovos (Forattini 2002).
Anofelinos são mosquitos de hábitos crepusculares e noturnos. As fêmeas
de uma maneira geral se acasalam após a emergência e posteriormente partem em
busca de suas fontes alimentares. Algumas espécies são eurigâmicas, ou seja, a
união sexual acontece durante o voo. Em geral, basta um acasalamento para que a
fêmea se mantenha fértil por toda sua vida (Rey 2001). A busca pela fonte
sanguínea dependerá de vários fatores tais como a preferência de cada espécie, a
5
disponibilidade de hospedeiros na região, requisitos nutricionais, e densidade vetorial
(Zimmerman et al. 2006). Após o repasto sanguíneo, que poderá ser em mais de um
hospedeiro, as fêmeas descansam por algum tempo, até que a digestão do sangue
se complete, e então procuram um lugar para a desova.
1.1. Anopheles aquasalis
1.1.1. Morfologia dos adultos
Anopheles aquasalis foi descrito por Curry em 1932 e o adulto dessa
espécie, como representado na Figura 3, é caracterizado principalmente por
apresentar o tarso posterior II com mais de 40% de negro na porção basal, os tarsos
posteriores III e IV inteiramente brancos e o tarso posterior V com um anel negro
basal. Na asa, a primeira mancha escura da veia costa é menor que a mancha clara
seguinte e a porção não bifurcada da veia média é predominantemente clara
(Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994).
Figura 3: características da morfologia de Anopheles aquasalis diagnósticas para sua identificação. À
esquerda são mostrados os tarsômeros posteriores, com o anel negro no V tarso; à direita, detalhes
do tamanho das manchas claras e escuras da veia costa e da veia média da asa. Fonte: Consoli e
Lourenço-de-Oliveira (1994).
6
Algumas variações morfológicas dessa espécie foram estudadas por
Flores-Mendoza em 1994. Ela observou diferenças na morfologia de todas as fases
do desenvolvimento de populações brasileiras de Anopheles aquasalis; no entanto,
essas diferenças não foram significantes.
1.1.2. Distribuição geográfica
Como mencionado acima, Anopheles aquasalis é encontrado em ampla
faixa do litoral Atlântico devido à sua preferência por águas salobras, o que deu
origem a seu nome. Pode também ser encontrado em locais afastados da costa,
como no sertão nordestino, onde o solo é rico em cloretos e a água da chuva alaga
estes terrenos, formando coleções de água salobra (Consoli e Lourenço-de-Oliveira
1994, Forattini 2002). Segundo Faran e Linthicun (1981) a distribuição de Anopheles
aquasalis se estende da América do Sul, desde o estado do Paraná, Brasil, até as
Guianas, Venezuela e Colômbia. No litoral do Oceano Pacífico seu limite vai do norte
da Colômbia até o sul do Equador. Na América Central, ocorre no Panamá, Costa
Rica, Nicarágua, Trinidad e Tobago e nas Pequenas Antilhas.
1.1.3. Comportamento
Os hábitos de Anopheles aquasalis variam de acordo com sua localização
geográfica. De uma maneira geral são exofílicos, com atividade crepuscular e
noturna. Em algumas regiões do Brasil, como no Nordeste, onde o clima é semi-
árido, é considerado um mosquito endofílico com acentuada antropofilia (Deane et al.
1948, Flores-Mendoza 1994, Flores-Mendoza e Lourenço-de-Oliveira 1996).
Segundo Deane et al. (1948) o comportamento intradomiciliar nesta região estaria
relacionado com a falta de abrigo no extradomicílio e a invasão de casas seria um
refúgio contra os ventos e a aridez do local, e também consequência da procura por
alimento.
Xavier e Rebêlo (1999), estudando espécies de Anopheles em área
endêmica de malária no Maranhão, viram que Anopheles aquasalis foi a espécie
mais freqüente no intradomicílio, com predomínio na estação chuvosa (janeiro a
7
junho) e atividade hematofágica no crepúsculo vespertino e nas primeiras horas da
noite. Contudo, Flores-Mendoza e Lourenço-de-Oliveira (1996) já haviam observado,
por meio de estudo da bionomia de Anopheles aquasalis em Guaraí, no Rio de
Janeiro, que esta é a espécie mais comum no período seco, de poucas chuvas
(entre abril e agosto).
Com estes trabalhos da literatura é possível observar o variado
comportamento que as populações possuem em diferentes regiões. Devido a este
ecletismo alguns autores sugeriram que Anopheles aquasalis poderia ser um
complexo de espécies crípticas.
1.1.4. Criadouros
Os criadouros mais utilizados por este anofelino são coleções de água
parada, de variadas dimensões, salobra e com influência das marés. Podem ser
encontrados em valas, canais, brejos, lagoas, igarapés e manguezais, que são
criadouros com grandes variações de salinidade (Deane et al. 1948, Andrade 1952,
Xavier e Rebêlo 1999, Osborn et al. 2006). Embora no campo esta espécie seja
primariamente associada à água com certa salinidade, alguns autores já
encontraram formas imaturas em criadouros de água doce.
Segundo o Conselho Nacional do Meio Ambiente (Conama 2000) a água é
considerada salobra quando possui concentração de sal entre 0,5 e 3,0 g/L. No
Laficave (Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC) esta
espécie está sendo mantida com água salobra, a uma concentração de 2,0 g/L. Silva
et al. (2006) mantiveram Anopheles aquasalis em laboratório com água doce, de
poço artesiano, com salinidade de 0,04 g/L. Osborn et al. (2006), estudando a
desova de Anopheles aquasalis em várias concentrações de sal (0, 10, 20, 30 e
40 g/L) observaram, em condições experimentais, que fêmeas desta espécie
preferem depositar seus ovos em água doce (zero de sal) e rejeitam a concentração
de 40 g/L. Eles observaram também que as larvas eclodiram mais rapidamente em
água doce e na concentração de 10 g/L. Entretanto, não houve diferença na
viabilidade dos ovos até a concentração de 20 g/L, o que só foi observado nas
concentrações de 30 e 40 g/L, sugerindo que a escolha do criadouro por Anopheles
aquasalis influencia o tamanho da prole resultante. Embora a presença de sal na
8
água seja um dos parâmetros importantes para a distribuição dessa espécie, outras
características físico-químicas, presença de predadores, feromônios, entre outros,
podem afetar a preferência de fêmeas desta espécie para realizarem suas desovas.
1.1.5. Hábitos alimentares e relação com a malária
Embora tenha um comportamento variável quanto à fonte alimentar, é um
mosquito essencialmente zoofílico (Xavier e Rebêlo 1999). Deane et al. (1949)
observaram nítida preferência alimentar de Anopheles aquasalis por outros animais
que não o homem, por meio de estudos realizados em Belém, PA, utilizando
espécimes criados em laboratório e expostos a diferentes iscas, em gaiolas. Flores-
Mendoza et al. (1996) observaram que mosquitos Anopheles aquasalis do Rio de
Janeiro, quando coletados em abrigos naturais, fora do perímetro de 500 metros do
conjunto da casa, exibiam preferência por animais de grande porte, como boi e
cavalo. Ao contrário destes trabalhos, vários autores observaram, em algumas
regiões do Nordeste brasileiro, comportamento antropofílico deste mosquito (Deane
et al. 1948, Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994, Forattini 2002).
Diante da diversidade comportamental desta espécie, e após identificação
de divergências no DNA mitocondrial de duas populações brasileiras (Ilha de Marajó
e Rio de Janeiro) de Anopheles aquasalis, por meio de enzimas de restrição, Conn et
al. (1993) sugeriram a existência de um complexo de espécies crípticas. Entretanto,
Flores-Mendoza em 1994, estudando populações do Nordeste e do Sudeste
brasileiro, verificou, através de análises morfológicas e bioquímicas, que todas
pertencem à mesma espécie, embora exibam hábitos diferentes.
Independente de seu status taxonômico, este anofelino tem papel
importante no litoral, participando da transmissão de malária, principalmente quando
sua densidade está bastante elevada. Geralmente atua como vetor secundário no
litoral da região Norte, onde vive em simpatria com Anopheles darlingi.
Recentemente tem atuado como vetor importante de malária em Belém, PA onde
tem sido encontrado em maior quantidade nas coletas desta região (Flores-Mendoza
e Lourenço-de-Oliveira 1996, Póvoa et al. 2003, Lourenço-de-Oliveira 2005, Silva et
al. 2006).
9
1.2. Complexo Albitarsis
Complexo de espécies é um fenômeno comum entre mosquitos.
Anopheles albitarsis, descrito por Lynch Arribálzaga, 1878, era considerado uma
espécie com grandes variações morfológicas e comportamentais. Galvão e
Damasceno (1942) descreveram Anopheles marajoara, da Ilha de Marajó, como uma
espécie estreitamente relacionada a Anopheles albitarsis. Entretanto, Galvão, em
1944, considerou Anopheles marajoara como sinônimo de Anopheles albitarsis.
Ainda neste ano, Galvão e Damasceno, analisando material da Ilha de Marajó, de
São Paulo e da Argentina, dividiram Anopheles albitarsis em duas subespécies, com
base em diferenças morfológicas e biológicas: Anopheles albitarsis albitarsis e
Anopheles albitarsis domesticus
Rios et al. (1984) em seus estudos com populações de Anopheles
albitarsis em 18 estados brasileiros, observaram, através de caracteres morfológicos,
grande variedade intrapopulacional e consideraram impossível separá-los em duas
subespécies como havia sido proposto anteriormente por Galvão e Damasceno
(1944). Com isto, acreditaram estar diante de um complexo de espécies crípticas,
que denominaram Complexo Albitarsis. Mais tarde, várias evidências indicaram que
Anopheles albitarsis é de fato um complexo de espécies crípticas (Klein et al. 1991,
Wilkerson et al. 1995a, 1995b, Lima et al. 2004b, Li e Wilkerson 2005). Desse modo,
Linthicum (1988) ressuscitou Anopheles marajoara como um nome de espécie válida
e no ano seguinte Rosa-Freitas descreveu Anopheles deaneorum, a partir de
observações morfológicas, feitas em adultos e larvas, e avaliações isoenzimáticas,
utilizando material coletado nos estados de Rondônia e do Acre (Rosa-Freitas 1989,
Brandolini 1995, Rubio-Palis et al. 2003).
Wilkerson et al. (1995a,b) usando "Random Amplified Polymorphic DNA-
Polymerase Chain Reaction" (RAPD-PCR) demonstraram que o Complexo Albitarsis
era composto por pelo menos quatro espécies: Anopheles albitarsis s.s., Anopheles
albitarsis B, Anopheles marajoara e Anopheles deaneorum.
Lehr et al. (2005), por meio de análise de sequências do gene mitocondrial
Citocromo Oxidase I (COI), sugeriram uma nova espécie do Complexo Albitarsis, que
chamaram de Anopheles albitarsis E, presente no norte do Brasil e da Venezuela.
Entretanto, análises moleculares independentes, baseadas em sequências de DNA
ribosomal (por exemplo, internal transcribed space 2 - ITS2), para discriminar os
10
membros do Complexo Albitarsis, não confirmaram a quinta espécie (Li e Wilkerson
2005). Dessa forma, Anopheles albitarsis E ainda não possui um status taxonômico
resolvido (Póvoa et al. 2006). Mais recentemente, sugeriu-se que uma nova espécie
participa deste complexo, Anopheles albitarsis F, vivendo em simpatria com
Anopheles marajoara em uma área endêmica de malária na Colômbia (Brochero et
al. 2007).
1.3. Anopheles albitarsis sensu stricto
1.3.1. Morfologia dos adultos
Anopheles albitarsis foi descrito por Lynch Arribálzaga 1878 e o adulto
dessa espécie é caracterizado principalmente por apresentar os três últimos
segmentos do tarso posterior, III-V, inteiramente brancos, o tarso posterior I com anel
claro apical, o esternito abdominal com duas linhas paralelas de escamas brancas, o
tergito abdominal com tufos póstero-laterais de escamas escuras a partir do III
segmento e a primeira mancha escura da veia costa menor que a mancha clara
seguinte (Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994). Como esta espécie pertence a um
complexo de espécies crípticas, a Figura 4 mostra os caracteres de Anopheles
albitarsis latu sensu.
11
Figura 4: características da morfologia de Anopheles albitarsis diagnósticas para sua identificação. À
esquerda estão os tarsômeros posteriores de Anopheles albitarsis l.s., evidenciando, no segmento I, o
anel claro apical. Ao centro, estão o esternito (esclerito ventral) com as duas linhas paralelas de
escamas brancas, características, e o tergito (esclerito dorsal) mostrando os tufos póstero-laterais de
escamas escuras a partir do III segmento. À direita é mostrado o tamanho das manchas claras e
escuras da veia costa da asa. Fonte: Consoli e Lourenço-de-Oliveira (1994
).
1.3.2. Distribuição geográfica
De acordo com Li e Wilkerson (2005), Anopheles albitarsis sensu stricto é
encontrado no sul do Brasil, no norte da Argentina e no Paraguai.
1.3.3. Comportamento
Poucos trabalhos da literatura relatam comportamento de Anopheles
albitarsis s.s. Lourenço-de-Oliveira et al. (1989) capturaram este anofelino com isca
animal no intra, peri e extradomicílio, e observaram uma nítida preferência pelo
extradomicílio. Como a maioria dos dados disponíveis não discrimina a espécie,
referindo-se ao Anopheles albitarsis l.s., muitos trabalhos apontam comportamento
exofílico e zoofílico.
12
1.3.4. Criadouros
Anopheles albitarsis s.s. já foi encontrado nas margens de campos
irrigados para cultivo de arroz, expostos ou não à luz solar. São encontrados também
em alagados de água doce e limpa e, por isso, são mais abundantes na estação
chuvosa, quando ocorre aumento no número de criadouros (Forattini et al. 1996).
1.3.5. Hábitos alimentares e relação com a malária
De acordo com Guimarães et al. (1997), Anopheles albitarsis s.s. é
preferencialmente zoofílico. Os autores coletaram esta espécie no Paraná, no
extradomicílio, utilizando atração humana, o que sugere a possibilidade de
realização do repasto sanguíneo em humanos na ausência de outros mamíferos de
grande porte. Esta espécie foi também coletada em arrozais e dentro de residências
no estado de São Paulo, quando o homem foi utilizado como atrativo. Nesta região
(Vale do Ribeira) Forattini et al. (1996) sugerem que a irrigação para a cultura de
arroz favorece o aumento da densidade das espécies do Complexo Albitarsis, o que
pode trazer problemas epidemiológicos locais. Segundo Rachou (1958) esta espécie
poderia participar como vetor principal ou auxiliar na transmissão de malária, estando
a capacidade vetora ligada principalmente à sua densidade e freqüência nos
domicílios. Santos e Forattini (1999) estudando o tamanho da população natural
também na região do Vale do Ribeira, no verão, viram que nessa época do ano,
mesmo com probabilidade de sobrevivência baixa a transmissão poderia ocorrer.
1.4. Anopheles marajoara
1.4.1. Morfologia dos adultos
Quando se trata de espécies crípticas, ferramentas moleculares são
comumente utilizadas para o diagnóstico de espécimes em laboratório. Muitos
trabalhos morfométricos também são realizados para tentar achar algum caráter que
possa diagnosticar tais espécies. No âmbito das espécies do Complexo Albitarsis,
13
por exemplo, Rosa-Freitas (1989) diagnosticou a forma adulta de Anopheles
deaneorum morfologicamente, em função de seu aspecto geral mais claro e da
presença de tufos laterais de escamas escuras a partir do quarto ou quinto tergitos
abdominais. Na fase larvária, foi possível diferenciar pela presença de ramificações
nas cerdas clipeais anteriores externas, que em Anopheles albitarsis são aciculadas.
Rubio-Palis et al. (2003) sugeriram caracteres que poderiam diagnosticar
morfologicamente adultos de Anopheles marajoara coletados na Venezuela e serem
usados para atualizar a chave taxonômica de Cova-Garcia e Sutil (1977),
amplamente usada para identificação de anofelinos na Venezuela e em outros
países da América do Sul. Eles confirmaram, por meio da técnica de RAPD-PCR,
que Anopheles marajoara foi a única espécie do Complexo Albitarsis coletada na
Venezuela. Os autores observaram que os adultos de Anopheles marajoara daquela
região podem ser identificados pelo comprimento da mancha escura no segundo
segmento do tarso anterior, que pode variar de 17 a 73%, e no segundo segmento
do tarso posterior, que pode variar entre 30 e 62%, como mostrado na Figura 5.
Neste trabalho também foram apresentadas medições das manchas claras e escuras
da veia costa da asa. As manchas pré humeral escura e humeral clara se mostraram
características-chave para separar Anopheles marajoara das outras espécies da
seção Argyritarsis (Anopheles argyritarsis Robineau-desvoidy, 1827, Anopheles
braziliensis e Anopheles darlingi).
Figura 5: características da morfologia de Anopheles marajoara diagnósticas para sua identificação,
de acordo com Rubio-Palis et al. (2003). À esquerda observamos os tarsômeros das pernas anterior e
14
posterior de Anopheles marajoara evidenciando, nos dois casos, a mancha escura no II segmento
tarsal. À direita, detalhe das manchas claras e escuras da veia costa da asa.
1.4.2. Distribuição geográfica
Este anofelino está distribuído desde a Costa Rica até a América do Sul,
sendo mais especificamente encontrado no Brasil, Venezuela, Colômbia e sul da
América Central (Rubio-Palis et al. 2003, Li e Wilkerson 2005).
1.4.3. Comportamento
Alguns trabalhos relatam comportamento exofílico de Anopheles marajoara
com atividade noturna (Conn et al. 2002, Voorham 2002, Kakitani et al. 2003).
Estudos realizados em São Paulo detectaram comportamento hematofágico entre 2
e 5 horas da manhã (Kakitani et al. 2003). Já Voorham (2002) no Amapá observou
um pico representativo durante as três primeiras horas da noite.
1.4.4. Criadouros
Anopheles marajoara tem sido encontrado em criadouros pantanosos e em
poças iluminadas pelo sol. Segundo Conn et al. (2002) este anofelino se adapta
muito bem a criadouros formados a partir de modificações antrópicas. Chadee e
Wilkerson (2006), estudando a ecologia de Anopheles marajoara em Trinidad,
encontraram grande densidade deste anofelino em campos de arroz ora inundados
com água de chuva ora irrigados com água de rio. O constante fornecimento de água
nesses campos ajudou a manter elevada a população nesta região durante todo o
tempo, independente das estações, seca ou úmida.
15
1.4.5. Hábitos alimentares e relação com a malária
Zimmerman et al. (2006), estudando a origem da alimentação sanguínea
de anofelinos no Amapá, em área endêmica para a malária, observaram um alto
índice de sangue humano em Anopheles marajoara, comprovando sua antropofilia,
anteriormente observada naquele mesmo estado por Conn et al. (2002). Neste último
caso, a alta densidade populacional de mosquitos, decorrente das modificações
antrópicas, e o aumento da oferta de hospedeiros humanos, por causa da imigração
para a região, parecem favorecer este comportamento, alçando este mosquito à
categoria de vetor primário do parasito da malária no estado do Amapá.
1.5. Aspectos Básicos do Desenvolvimento
1.5.1. Desenvolvimento das formas imaturas
Vários são os fatores que podem interferir no desenvolvimento larvar.
Podemos citar a temperatura, salinidade, poluentes, movimento da água, tipo e
quantidade de alimento e densidade larvar. Estes fatores podem interferir tanto na
taxa de sobrevivência quanto no tempo de desenvolvimento total e de cada estágio
de determinada espécie. Muitos trabalhos em laboratório foram realizados na
tentativa de atingir bons resultados no desenvolvimento das larvas para várias
espécies de anofelinos. Muitas vezes os critérios de avaliação são o
desenvolvimento rápido e homogêneo das larvas e a taxa de sobrevivência elevada.
Muitos trabalhos relatam a importância da temperatura para o sucesso da
criação desses mosquitos em laboratório. Boyd et al. (1935) mostraram que a
temperatura ideal para criação das larvas de Anopheles quadrimaculatus Say,1824 é
de 21,1ºC. Barreto e Coutinho em 1943 constataram, depois de muitas tentativas,
que a temperatura de 25 a 26ºC era ideal para colonizar algumas espécies de
anofelinos devido ao rápido desenvolvimento e ao bom rendimento dos imaturos.
Estes autores ainda observaram que a partir de 26ºC as larvas e as pupas se
desenvolviam mais rapidamente, porém havia muita mortalidade; por outro lado, em
temperaturas mais baixas, o desenvolvimento era mais prolongado.
16
A água é um fator importante para a criação de anofelinos. Cada espécie
possui um tipo de criadouro preferencial e muitos pesquisadores tentam simular as
condições de seus ambientes naturais. (Boyd et al. 1935, Barreto e Coutinho 1943,
Galvão et al. 1944). Outros trabalhos de colonização em laboratório relatam
utilização de água de criadouros naturais para a manutenção dos imaturos (Bates
1947). Entretanto, em muitos trabalhos utiliza-se água da rede de abastecimento,
água de poço filtrada, água desclorada e mesmo água mineral comercializada;
quando necessário adiciona-se certa quantidade de sal marinho ou de água do mar
(Galvão et al. 1944, Copeland 1987, Klein et al. 1990, Silva et al. 2006).
A alimentação das larvas também foi um ponto que chamou atenção de
vários autores. Quando a alimentação é escassa observa-se aumento da taxa de
mortalidade e até canibalismo. Em muitos casos, quando as larvas chegam a
completar seu desenvolvimento, a falta de nutrientes muitas vezes tem reflexos na
redução da longevidade do adulto e em alterações no ciclo gonotrófico, podendo
haver discordância gonotrófica. Muitas dietas já foram testadas para várias espécies
de anofelinos, algumas das quais foram bem sucedidas. Já foram utilizados, para
larvas, biscoitos para cães, infusões + biscoito para cães + fermento Fleishmann,
ração para cães, ração para cães + fígado de porco em pó, farinha de peixe + pão +
germe de trigo, farinha de milho + ração para aves domésticas + fermento para
biscoito de polvilho, ração para peixes ornamentais, apenas para citar alguns
exemplos (Boyd et al. 1935, Barreto e Coutinho 1943, Galvão et al. 1944, Brandolini
1995).
Outro fator importante na manutenção das formas imaturas é a quantidade
de larvas por bacia de criação. A competição por espaço e alimento pode afetar o
tamanho corporal de fêmeas adultas resultantes ou acarretar em desnutrição, e isso
pode influenciar vários fatores como desenvolvimento, fecundidade, dispersão e
longevidade (Gama et al. 2005).
Diante dessas informações, é possível avaliar e estabelecer as melhores
condições para o desenvolvimento de uma determinada espécie. Isto pode ser visto
analisando o rendimento ou a viabilidade, como feito por Barreto e Coutinho em
1943. Os autores, na tentativa de colonizar Anopheles albitarsis domesticus
(=Anopheles marajoara), obtiveram, com temperatura de 26ºC, viabilidade de 72% e
tempo de desenvolvimento de ovo a adulto de 14 dias. Com Anopheles
17
tarsimaculatus (=Anopheles aquasalis) obtiveram viabilidade de 88,8% e
desenvolvimento de ovo a adulto também de 14 dias.
Klein et al. (1990), em ensaios de criação na temperatura de 26 ± 2ºC,
observaram taxa de mortalidade de larvas de Anopheles deaneorum de
aproximadamente 35%, reduzida para 10% quando gramíneas secas foram
acrescentadas às bacias. Adição de gramíneas também contribuiu para reduzir o
tempo de desenvolvimento das larvas. A alta taxa de mortalidade de larvas
observada em alguns grupos foi associada à baixa qualidade da água.
Horosko et al. (1997) observaram 20 a 30% de mortalidade de Anopheles
albitarsis s.s. entre o estadio de larva L1 até pupa. Nestes ensaios o tempo de
desenvolvimento foi de aproximadamente 10 dias e a temperatura variou entre 25 e
29ºC. Carvalho (2003) utilizou esta mesma metodologia, com algumas modificações,
para acompanhar o desenvolvimento de Anopheles aquasalis de larva L1 a adulto,
tendo observado taxa de mortalidade de 18%.
Mais recentemente, Silva et al. (2006), criando Anopheles aquasalis em
laboratório, observaram taxa extremamente baixa de mortalidade das larvas (menos
de 1%) e tempo de desenvolvimento até pupa de aproximadamente oito dias, com
temperatura variando entre 26 e 30ºC. Para a criação dos imaturos, os autores
utilizaram água doce, trocada somente quando havia quantidades consideráveis de
detritos na superfície ou no fundo do recipiente. Ração para peixe triturada
Tetramin® era fornecida às larvas duas a três vezes ao dia. Os autores atribuíram a
baixa mortalidade a esse conjunto de fatores utilizados para a manutenção da
espécie, distintos das técnicas utilizadas por Klein et al. (1990) e Horosko et al.
(1997) por exemplo.
1.5.2. Alimentação sanguínea e postura
A alimentação básica dos culicídeos adultos na natureza consiste de
carboidratos, obtidos principalmente de néctar de flores e frutos. Esses carboidratos,
armazenados no divertículo, fornecem o combustível inicial para a produção de ovos
e a energia necessária para o voo, além de prolongar a longevidade dos mosquitos
(Consoli 1982, Souza-Neto et al. 2007). As fêmeas, além desta alimentação
açucarada, fazem repastos sanguíneos. Em mosquitos, a digestão do sangue está
18
relacionada primariamente ao desenvolvimento dos ovários e, em muitos casos,
pode contribuir para o metabolismo energético (Consoli 1982, Clements 1992).
Fêmeas mal nutridas durante a fase larvar apresentam dificuldades para
realizar a postura com um só repasto sanguíneo (Lourenço-de-Oliveira 2005). Da
mesma forma, fêmeas de alguns culicídeos, na falta de carboidratos, realizam vários
repastos sanguíneos antes da primeira postura (Nayar e Sauerman 1975, Foster e
Eischen 1987). Este comportamento pode estar relacionado à baixa reserva
energética (Clements 1992). Gary e Foster (2001) identificaram aumento na
freqüência de picadas de fêmeas de Anopheles gambiae Giles,1920 alimentadas
somente com sangue. A este aumento, porém, não correspondia um incremento na
freqüência de postura.
O repasto sanguíneo é digerido no estômago do inseto, em geral, em dois
ou três dias nas regiões tropicais. Contudo, o tempo de digestão pode variar em
função de parâmetros como luz, temperatura, umidade ou mesmo a quantidade de
sangue ingerido (Clements 1992).
Quando os ovos estão maduros, as fêmeas precisam encontrar criadouros
para fazer suas desovas. Já foi observado em algumas espécies que, se a fêmea
não encontrar criadouros para desova após completar a maturação dos ovos, algum
tempo depois da alimentação os ovócitos são reabsorvidos, para suprir as
necessidades metabólicas da fêmea. Foi observado em laboratório que a taxa de
viabilidade dos ovos de Anopheles gambiae decresce progressivamente a partir do
quarto dia após a alimentação sanguínea (Valle e Mazur, dados não publicados). Por
outro lado, Carvalho (2002) observou que a queda na viabilidade dos ovos da
espécie neotropical Anopheles aquasalis é abrupta e ocorre a partir do quinto dia
depois do repasto sanguíneo.
1.5.3. Longevidade
Na natureza a longevidade irá depender tanto de fatores intrínsecos, como
nutrição larval e adulta e metabolismo dos alados, quanto de fatores extrínsecos
como temperatura e umidade, efeito das chuvas, dos ventos e dos predadores
(Consoli e Lourenço-de-Oliveira 1994). No campo algumas análises podem ser feitas
para estimar a sobrevida de mosquitos, como por exemplo, avaliação do desgaste
19
das asas, descamação do corpo do inseto, observação da morfologia dos ovários.
Neste último caso, as extremidades das traquéias são distendidas quando a fêmea é
parida, e enoveladas no caso de fêmeas nulíparas. Grande proporção de fêmeas
paridas em uma determinada região indica longevidade. Uma outra medida indireta
da sobrevida resulta da identificação de pequenas dilatações deixadas no tubo
folicular, como consequência do desenvolvimento do ovócito: a cada dilatação pode-
se considerar a ocorrência de um ciclo gonotrófico. Entretanto, para estimar a idade
cronológica (o tempo - em dias - vivido pelo mosquito) com este tipo de avaliação é
preciso assumir que há concordância gonotrófica e que o intervalo entre a
alimentação e a postura é constante.
Muitos trabalhos de campo estimam a sobrevida de um vetor através do
conhecimento da paridade (Kakitani e Forattini 2000). Como mencionado acima, a
identificação de fêmeas paridas em grandes proporções sugere longevidade da
população, parâmetro importante para determinação da capacidade vetorial: quanto
mais longevo um anofelino vetor, maior a probabilidade de transmitir o parasito.
Kakitani et al. (2003) no Vale do Ribeira, SP, verificaram que aproximadamente 50%
das fêmeas de Anopheles marajoara dissecadas eram paridas, sugerindo
longevidade do vetor nesta região.
Os culicídeos adultos em geral sobrevivem cerca de um mês nas regiões
temperadas. No entanto, nos trópicos essa taxa de sobrevivência varia entre duas e
três semanas (Forattini 2002). Ivanova (1942) recapturou fêmeas de Anopheles
maculipennis Meigen, 1818, na Rússia, que haviam sido soltas 36 dias antes. Em
laboratório verificou-se que a sobrevivência de alguns espécimes de Anopheles
albitarsis l.s. chegou a 32 dias, sob temperatura de 23-25ºC (Galvão et al. 1944).
Muitos trabalhos utilizam a longevidade como parâmetro para avaliar, por
exemplo, o efeito de diferentes tipos de alimentação. Nayar e Sauerman (1971)
demonstraram que fêmeas de Aedes taeniorhynchus alimentadas somente com
sangue sobreviveram menos tempo que as fêmeas que se alimentaram somente
com açúcar. Eles atribuíram essa diferença ao desenvolvimento dos ovos e ao baixo
acúmulo de reserva energética nas fêmeas alimentadas somente com sangue. Gary
e Foster (2001) relataram que fêmeas de Anopheles gambiae alimentadas somente
com sangue sobrevivem de 20 a 43 dias, sugerindo que com o repasto sanguíneo
esta espécie pode viver tempo suficiente para ser considerada um bom vetor de
malária.
20
1.6. Aspectos Básicos da Reprodução
A dificuldade no estabelecimento e manutenção de algumas espécies de
anofelinos neotropicais em laboratório é historicamente conhecida. A reprodução em
cativeiro é um dos pontos que mais chamam a atenção para anofelinos sul-
americanos, devido à falta de habilidade para copular em condições artificiais.
Enxames são muito comuns em anofelinos e provavelmente isto é um
importante componente para o sucesso de cópula (Clements 1999 apud Lima et al.
2004a). Para realizar a cópula, anofelinos neotropicais necessitam de amplo espaço:
machos formam um enxame para o qual as fêmeas são atraídas; vários machos
podem disputar uma mesma fêmea, que pode cair e se acasalar no solo ou sair do
enxame acasalada em voo com um macho. O enxame pode durar de 10 a 50
minutos (Rey 2001). Entretanto, vários fatores como luz, estado fisiológico do
mosquito, ventos, entre outros podem interferir na formação do enxame (Consoli e
Lourenço-de-Oliveira 1994).
No laboratório, o pequeno espaço dentro das gaiolas provavelmente não
permite a formação correta deste enxame, o que leva a uma baixa taxa de
inseminação das fêmeas e à consequente queda na produção de ovos viáveis. Em
muitos trabalhos, observou-se a utilização de gaiolas grandes com altas densidades
de mosquitos para a obtenção de alguns espécimes de fêmeas inseminadas.
Entretanto, em gaiolas menores (como por exemplo, aquelas utilizadas na rotina de
nosso laboratório, 17 x 17 cm) o acasalamento espontâneo pode ocorrer depois de
um processo de adaptação destes mosquitos. Lima et al. (2004a) chamam atenção
para a habilidade de machos para cópula em espaços confinados.
Fatores como idade dos machos, densidade de mosquitos nas gaiolas,
tempo de contato e proporção entre machos e fêmeas, também podem influenciar no
acasalamento. É sabido que, após emergirem, os machos demoram de seis a 24
horas até estarem prontos para a cópula (Forattini 2002). Neste contexto, Carvalho
(2003) observou que machos adultos de Anopheles aquasalis emergem
aproximadamente um dia antes das fêmeas, sugerindo que o acasalamento ocorra
imediatamente após a emergência das fêmeas. Carvalho (2003) também analisou,
para a mesma espécie, diferentes densidades de adultos por gaiola, por diferentes
períodos de contato entre machos e fêmeas no laboratório. Ela observou que com
21
todas as densidades avaliadas a taxa de fêmeas inseminadas aumentava ao longo
dos sete dias de observação.
1.7. Colonização de Anofelinos em Laboratório
É conhecida a utilidade de colônias estabelecidas para o estudo da
biologia de uma espécie. Em função disto, durante muito tempo, várias tentativas de
colonizar anofelinos em condições de laboratório foram realizadas - mas nem
sempre bem sucedidas. Boyd et al. (1935), que obtiveram sucesso na colonização
de Anopheles quadrimaculatus, destacaram dois pontos fundamentais: 1)
fornecimento abundante de alimentação para as larvas e 2) temperatura constante e
ótima. Desde então, outros trabalhos foram publicados na tentativa de colonizar
anofelinos e solucionar parte dos problemas que poderiam intervir na manutenção
das colônias (Galvão e Grieco 1943, Bates 1947).
Galvão et al. (1944), utilizando a mesma técnica descrita por Boyd et al.
(1935) com algumas modificações, colonizaram três espécies de anofelinos do
subgênero Nyssorhynchus. Para o acasalamento dos adultos os autores utilizaram
gaiolas (40 x 40 x 47 cm) com dois mil anofelinos aproximadamente; a postura foi
iniciada depois de sete dias. Desse modo a colônia de Anopheles albitarsis
domesticus (=Anopheles marajoara) chegou à sétima geração. A produção de ovos
da colônia de Anopheles tarsimaculatus (=Anopheles aquasalis), no entanto, foi
baixa, o que a manteve com apenas algumas dezenas de casais até a quinta
geração. Os autores atribuíram os problemas enfrentados na tentativa de
colonização desta espécie à falta de espaço para cópula e à alimentação oferecida
aos machos.
Com o advento da técnica da cópula induzida, descrita originalmente por
McDaniel e Horsfall (1957) para Aedes, muitos trabalhos foram realizados com
anofelinos. Com esta técnica, Baker et al. 1962 colonizaram várias espécies de
anofelinos, Ow Yang et al. (1963) mantiveram uma colônia de Anopheles maculatus
Theobald, 1901 por mais de 24 gerações, Baker (1964) manteve Anopheles
punctipennis (Say, 1823) por mais de dois anos e meio no laboratório, Klein et al.
(1990) colonizaram Anopheles deaneorum por mais de 25 gerações e Horosko et al.
(1997) colonizaram Anopheles albitarsis s.s. por aproximadamente dois anos.
22
Entretanto, a cópula induzida, embora seja um procedimento simples, requer
bastante tempo, exige uma boa formação técnica e é insuficiente para a produção
em massa, por vezes necessária para determinados trabalhos experimentais.
Baker (1964) ressalta em seu trabalho com Anopheles punctipennis que
machos com idade de três ou quatro dias são melhores para a realização da cópula,
embora indivíduos com um dia de idade possam ser usados para este fim. O autor
ressalta ainda que os machos podem ser usados mais de uma vez. Ele chegou a
realizar oito cópulas sucessivas utilizando um único macho; entretanto, somente as
três primeiras fêmeas foram inseminadas. Resultados parecidos foram observados
por Klein et al. (1990) com Anopheles deaneorum. A taxa de fêmeas inseminadas
decresceu de 80% na primeira cópula para 43%, 35% e 23% na segunda, terceira e
quarta cópulas respectivamente.
Diferente de Baker (1964), Arruda et al. (1982), utilizando a técnica da
cópula induzida para a criação de Anopheles aquasalis e Anopheles albitarsis em
laboratório, viram que o índice de fêmeas inseminadas era maior quando machos
entre oito a 14 dias de idade eram utilizados. Entretanto, esses autores conseguiram
colonizar Anopheles aquasalis e Anopheles albitarsis somente até a segunda e
quarta geração respectivamente, devido a problemas com microorganismos.
Embora muitos problemas relacionados com colônias de anofelinos sejam
evidentes, várias tentativas foram bem sucedidas. Recentemente Anopheles
pseudopunctipennis, uma espécie eurigâmica, vetor de malária andina, foi
colonizado em laboratório por meio de cópula livre. Para isso, os pesquisadores
expuseram os mosquitos adultos a uma luz estroboscópica azul por vinte minutos
durante várias noites, o que os incentivou a copular naturalmente sob condições de
laboratório. Depois de algumas gerações, obtiveram uma colônia estável, que se
reproduz por cópula livre (Lardeux et al. 2007).
Nosso laboratório estabeleceu, há cerca de 15 anos, colônias de duas
espécies de anofelinos neotropicais. Anopheles albitarsis s.s. foi colonizado em 1993
por meio de cópula induzida. Após aproximadamente dois anos de manutenção da
colônia com cópula induzida, testou-se, com sucesso, a ocorrência de cópula livre:
foram utilizadas gaiolas grandes (60 x 60 x 60 cm) com mil adultos e relação do sexo
de 1:1 aproximadamente (Horosko et al. 1997). Anopheles aquasalis foi colonizado
em 1995, desde o início por meio de cópula livre.
23
Hoje, essas colônias dão suporte a vários estudos de embriogênese
(Carvalho et al. 2002, Monnerat et al. 2002), adaptação em laboratório (Lima et al.
2004a); isolamento reprodutivo (Lima et al. 2004b) e além disto, espécimes são
fornecidos para experimentação ou criação em outros laboratórios (Caroci et al.
2003, Souza-Neto et al. 2007). Apesar de estarem mantidas por muito tempo, essas
colônias ainda sofrem flutuações, principalmente nos meses mais frios. Neste
trabalho avaliamos alguns parâmetros do desenvolvimento e da reprodução de
Anopheles aquasalis e Anopheles albitarsis para tentar otimizar as condições de
manutenção dessas espécies em cativeiro, tornando mais racional sua criação em
laboratório e sobretudo, para obter conhecimento que auxilie tentativas de
colonização de outras espécies, particularmente Anopheles darlingi. Realizamos
também a colonização de Anopheles marajoara utilizando cópula induzida.
24
2. OBJETIVO GERAL
Estudar aspectos básicos do desenvolvimento e da reprodução de anofelinos
neotropicais, em condições de laboratório.
2.1. Objetivos Específicos
a) Desenvolvimento
Anopheles aquasalis
- Avaliar a influência do tempo entre repasto e a postura sobre a taxa de eclosão das
larvas
- Acompanhar a longevidade de fêmeas virgens e acasaladas, alimentadas ou não
com sangue de cobaios
Anopheles albitarsis
- Acompanhar a viabilidade e a cinética de emergência dos adultos
- Avaliar a influência do tempo entre repasto e a postura sobre a taxa de eclosão das
larvas
- Acompanhar a longevidade de fêmeas virgens e acasaladas, alimentadas ou não
com sangue de cobaios
b) Reprodução
Anopheles albitarsis
- Cópula livre:
- Avaliar a influência da densidade de adultos nas gaiolas
- Avaliar a influência do tempo de contato entre machos e fêmeas
- Cópula induzida:
- Avaliar a influência da idade dos machos
- Avaliar o número de cópulas viáveis por macho
c) Colonizar Anopheles marajoara por meio de cópula induzida
25
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Desenvolvimento
3.1.1. Manutenção dos mosquitos no laboratório
Anopheles aquasalis foi colonizado com espécimes coletados na parede
de um curral em Guaraí, município de Guapimirim, Rio de Janeiro (Lima,
comunicação pessoal), Anopheles albitarsis s.s. foi originário de um campo de
plantação de arroz em Massaranduba, Santa Catarina (Horosko et al. 1997) e os
espécimes Anopheles marajoara foram coletados na parede de um curral, no
município de Mazagão no Amapá.
A manutenção dos mosquitos foi feita de acordo com Horosko et al. (1997)
e com o procedimento definido pelo Laboratório de Fisiologia e Controle de
Artrópodes Vetores. As larvas L1 após a eclosão eram criadas em copos plásticos
brancos medindo 11 cm de diâmetro X 11 cm de altura, contendo 100 ml de uma
solução de água desclorada e sal marinho.
A água era proveniente da rede de abastecimento local. Vinte e quatro
horas antes da utilização, a mesma era armazenada em galões com capacidade
para um volume de 50 litros. Esses galões continham uma bomba de aquário que
funcionava para eliminar o cloro por evaporação.
O sal marinho utilizado era iodado de marca Maisvita®. Foram usadas
soluções de 0,2% para Anopheles aquasalis e 0,1% para Anopheles albitarsis.
Utilizamos esta concentração para Anopheles albitarsis, previamente testada no
laboratório, para evitar a proliferação de microorganismos. Para Anopheles
marajoara utilizamos somente água desclorada.
Aproximadamente 80 larvas eram colocadas nos copos e permaneciam
até atingirem segundo ínstar. À medida que as larvas cresciam, eram transferidas
para bacias plásticas maiores com um volume maior das soluções acima
mencionadas. Assim, além dos copos plásticos brancos, foram usadas bacias
redondas medindo 18 X 8 cm com 200 ml de solução, e bacias retangulares medindo
30 X 22 X 6,5 cm para Anopheles aquasalis ou 34 X 28 X 5 cm para Anopheles
26
albitarsis
1
com aproximadamente 400 ml da solução de água desclorada e sal
marinho. Dessa forma, a cada troca de bacia, as larvas eram transferidas para água
limpa. Além disto, diariamente as bacias eram limpas, ora com papel toalha para
retirar o excesso de comida da superfície da água ora com pipetas plásticas para
retirar a sujeira e as exúvias e mais água era adicionada, para repor o volume
perdido por evaporação. Aproximadamente 0,02 gramas de ração para peixe
(Tetramin®) pulverizada era fornecida às larvas uma vez ao dia. As larvas foram
mantidas em uma sala apropriada ("sala de larvas") com temperatura de 27 ± 2ºC e
umidade 70 ± 10%.
As pupas eram recolhidas diariamente, 150 eram colocadas em pequenos
copos plásticos descartáveis com capacidade para 50 mL e inseridas em gaiolas de
papelão medindo 17 cm de diâmetro X 17 cm de altura com a parte superior ocluída,
com tela de nylon preta, onde os adultos emergiam e eram mantidos.
Os insetos adultos foram mantidos em uma sala separada ("sala de
adultos") a uma temperatura média de 25 ± 2°C e umidade relativa de 70 ± 10%. A
janela do insetário fornecia luz natural, complementada com lâmpadas fluorescentes
durante o dia. Para os adultos era oferecida solução de sacarose a 10% em
Erlenmeyers (50 ml) contendo um “pavio” longo com gaze e algodão, de forma a
garantir suprimento contínuo. Esta solução era trocada duas vezes por semana e
retirada das gaiolas 12 horas antes da hematofagia. Para obtenção de ovos, as
fêmeas adultas, após cinco noites em contato com os machos, eram alimentadas
com sangue de cobaios anestesiados (de acordo com protocolo aprovado pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais, Fiocruz) e colocados sobre as gaiolas durante
aproximadamente 20 minutos.
Após a digestão do sangue, aproximadamente 72 horas, copos plásticos
pretos medindo 6 cm de diâmetro x 4 cm de altura, contendo água de criação das
larvas, eram introduzidos nas gaiolas para a coleta de ovos. Depois de dois dias
esses copos eram retirados das gaiolas e os ovos eram transferidos para bacias
retangulares (22 x 12,5 x 4 cm), forradas com papel-filtro nas laterais internas para
evitar a dessecação dos ovos. Quando as larvas L1 começavam a eclodir, comida
era adicionada neste recipiente e, depois de dois dias aproximadamente, eram
1
Além do tamanho, o tipo de plástico das bacias foi o parâmetro mais importante para a manutenção
de cada espécie. As larvas de Anopheles albitarsis se adaptaram melhor a bacias mais duras e
porosas, enquanto para larvas de Anopheles aquasalis este parâmetro era irrelevante. Esta última
espécie então foi criada nas bacias mais flexíveis e lisas, facilmente encontradas no mercado.
27
removidas com o auxílio de pipetas plásticas e transferidas para copos plásticos.
Todos os ensaios a seguir foram realizados dentro do insetário ("sala de larvas" ou
"sala de adultos") com temperatura e umidade controladas.
3.1.2. Viabilidade das larvas e cinética de emergência de machos e de fêmeas de
Anopheles albitarsis
Ovos provenientes de posturas de fêmeas da colônia foram colocados em
bacias retangulares (22 x 12,5 x 4 cm) forradas com papel-filtro nas laterais internas.
Após a eclosão, as larvas foram transferidas, com auxílio de pipetas plásticas, para
copos de 11 x 11 cm, para o acompanhamento da viabilidade. Para estes
experimentos acompanhamos o desenvolvimento das larvas L1 até a emergência
dos adultos. As avaliações de viabilidade foram realizadas com duas quantidades: 60
e 100 larvas/bacia. Como nosso objetivo era avaliar a viabilidade com a metodologia
de rotina de nosso grupo, utilizamos então o procedimento-padrão do laboratório.
Desta forma, para larvas L1/L2 utilizamos copos (11 x 11 cm) com 100 ml de solução
de água desclorada, para o estadio L2/L3 utilizamos bacias redondas 18 x 8 cm com
200 ml da mesma solução e para larvas L4 utilizamos bacias retangulares 34 x 28 x
5 cm com 400 ml.
Com Anopheles marajoara acompanhamos a viabilidade nas gerações F5,
F9, F12 e F14 até a emergência do adulto. Neste experimento, também utilizamos o
mesmo procedimento mencionado acima, porém, utilizamos apenas a quantidade de
60 larvas por bacia e água desclorada.
Para acompanhar a cinética de emergência dos adultos de Anopheles
albitarsis, as pupas provenientes de cada coleta diária foram contadas e mantidas
em gaiolas diferentes. As coletas prosseguiam até que todas as larvas tivessem
completado o seu desenvolvimento. O número de machos e de fêmeas de cada
gaiola foi contado diariamente, até a emergência do último adulto.
28
3.1.3. Influência do tempo entre repasto e postura sobre a taxa de eclosão das larvas
de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis
Para este ensaio as fêmeas permaneciam em contato com os machos por
seis noites, a alimentação açucarada era fornecida continuamente aos adultos e
após o repasto sanguíneo, somente as fêmeas ingurgitadas eram separadas em
grupos de dez, em gaiolas. Copos contendo solução de água desclorada e sal
marinho a 0,2 % (para Anopheles aquasalis) ou 0,1% (para Anopheles albitarsis),
misturada a água de criação, foram inseridos para estimular a postura. Estes copos
foram introduzidos diariamente, entre três e 10 dias, em gaiolas diferentes.
Vinte e quatro horas depois, os copos de postura foram removidos. As
fêmeas, com e sem ovos no abdômen foram separadas em dois grupos e suas
espermatecas foram dissecadas para verificar a presença ou não de
espermatozóides. Com essa metodologia, queríamos quantificar as fêmeas (de cada
grupo de 10 espécimes) com postura e aquelas inseminadas. Uma vez que foram
utilizadas nestes ensaios apenas fêmeas que comprovadamente realizaram o
repasto sanguíneo, apenas espécimes com o abdômen vazio eram interpretados
como fêmeas que haviam realizado a postura. Dessa forma, o número total de ovos
postos por fêmea foi calculado considerando-se somente as fêmeas que fizeram a
oviposição.
O número total de ovos de cada grupo de dez fêmeas foi contado e
colocado em bacias apropriadas para o acompanhamento diário da taxa de eclosão
das larvas. Este acompanhamento era encerrado três a quatro dias depois da
eclosão da última larva.
3.1.4. Longevidade de fêmeas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis
Os testes de longevidade com fêmeas de Anopheles albitarsis e
Anopheles aquasalis foram realizados sob diferentes condições fisiológicas: virgens
ou acasaladas e submetidas a diferentes regimes alimentares. Em todas as
condições, a mortalidade das fêmeas foi registrada diariamente.
Para obtenção de fêmeas virgens, pupas da mesma idade oriundas das
colônias foram colocadas dentro de gaiolas e, durante a emergência dos adultos, os
29
machos eram retirados duas vezes ao dia até a emergência de todos os alados. As
fêmeas, após a emergência, permaneciam em gaiolas por um período de cinco
noites, quando o experimento era montado. Este procedimento foi realizado para
permitir a comparação com fêmeas acasaladas, também com cinco dias de idade
adulta.
Para obtenção de fêmeas acasaladas, as pupas provenientes da colônia
foram colocadas dentro de uma gaiola e os adultos, após emergência, permaneciam
nestas durante cinco noites, para que ocorresse o acasalamento. Este procedimento
de tempo de contato entre machos e fêmeas havia sido estabelecido por Carvalho
(2003) para Anopheles aquasalis. Observações prévias do nosso estudo
confirmaram este procedimento para Anopheles albitarsis.
Grupos de 30 fêmeas, virgens ou acasaladas, foram colocados em
diferentes gaiolas e submetidos a diferentes condições de alimentação. Cada
condição experimental foi testada em triplicata. O primeiro grupo foi alimentado
somente com solução açucarada, ad libitum; o segundo grupo, com solução
açucarada e, semanalmente, com sangue de cobaio; ao terceiro grupo, além de
solução açucarada e sangue de cobaio, foi dada a possibilidade, uma vez por
semana, de realizar a postura, por meio da introdução de copos apropriados nas
gaiolas.
3.2. Reprodução (Anopheles albitarsis)
3.2.1. Influência da densidade de adultos nas gaiolas sobre a eficácia de cópula livre
Para analisar a densidade ideal de adultos por gaiola, pupas provenientes
da colônia foram retiradas e colocadas dentro de gaiolas até a emergência dos
adultos. Machos e fêmeas de mesma idade, na proporção de 1:1, foram transferidos
de gaiolas. Foram testadas densidades de 25, 50, 100, 150, 200 e 250 casais por
gaiola. Machos e fêmeas permaneceram em contato por cinco noites, de acordo com
resultados obtidos em experimentos prévios realizados no laboratório com
Anopheles aquasalis. Os adultos foram alimentados continuamente com solução de
sacarose a 10%, trocada duas vezes por semana. O parâmetro utilizado para avaliar
a eficácia de cópula livre com as diferentes densidades foi a observação, ao
3
0
microscópio óptico, da presença de espermatozóides na espermateca das fêmeas.
Além de registro do percentual de fêmeas inseminadas de cada gaiola, a mortalidade
dos adultos foi quantificada no dia da dissecação.
3.2.2. Influência do tempo de contato entre machos e fêmeas sobre a eficácia de
cópula livre
A densidade utilizada neste experimento foi determinada no item anterior,
ou seja, de 100 casais por gaiola. Foram testadas três, quatro, cinco e seis noites de
contato. Os adultos receberam alimentação açucarada e as fêmeas de cada gaiola
foram submetidas à dissecação e ao exame da espermateca, ao microscópio óptico
para detectar a presença ou não de espermatozóides. A mortalidade de cada sexo
foi quantificada no dia da dissecação.
3.2.3. Avaliação de parâmetros que influenciam a cópula induzida
3.2.3.1. Procedimento da cópula induzida
O procedimento de cópula induzida foi feito de acordo com Baker et al.
(1962) com modificações. Machos foram retirados das gaiolas com auxílio de um
capturador de Castro, anestesiados com acetato de etila por aproximadamente cinco
segundos e transpassados em suas mesopleuras por microalfinetes fixados em
bastões de madeira, para facilitar a manipulação durante a cópula. Após acordarem,
eram decapitados, pois o gânglio subesofagiano, onde se encontra o centro de
inibição da cópula, localiza-se na cabeça (Roeder, 1935). Posteriormente as suas
pernas foram arrancadas, para facilitar o contato durante a cópula. As fêmeas, logo
após a alimentação sanguínea, também foram retiradas das gaiolas por sucção e
levemente anestesiadas para provocar o relaxamento dos apêndices abdominais.
Em seguida, foram colocadas sobre a base da lupa estereomicroscópica com o
dorso voltado para baixo. As extremidades posteriores do abdômem do macho e da
fêmea foram aproximadas, em um ângulo de 90º, para a realização da cópula, que
tinha duração de aproximadamente cinco segundos. Após o procedimento, os
machos eram desprezados e as fêmeas, transferidas para as gaiolas. Detalhes da
manipulação dos machos e da cópula induzida estão representados nas Figuras 6
(a) e (b) e na Figura 7, respectivamente.
31
a) b)
Figura 6: detalhes da manipulação dos machos de Anopheles albitarsis para a realização da
cópula induzida. a) macho transpassado em sua mesopleura por microalfinete, fixado em bastão
de madeira, b) macho pronto para a cópula, decapitado e com as pernas removidas.
Figura 7: detalhes da cópula induzida de Anopheles albitarsis. Os
machos agarram as fêmeas com suas pinças genitais e o acasalamento
ocorre durante cinco segundos aproximadamente.
3.2.3.2. Idade dos machos X eficiência de cópula
Machos foram retirados das gaiolas imediatamente após a emergência e
separados para o procedimento de cópula induzida. Foram utilizados machos entre
um e 10 dias de idade adulta. Para cada idade foram utilizados entre 50 e 100
machos. De cada condição aproximadamente 50 fêmeas foram dissecadas para
verificação da presença de espermatozóides na espermateca, 24 horas após a
cópula. Foram avaliados: 1) os machos que agarram as fêmeas e 2) os machos que
transferem o espermatozóides para a fêmea no procedimento da cópula induzida.
32
3.2.3.3. Avaliação do número de cópulas viáveis por macho
Para este ensaio, os machos foram utilizados para copular com até cinco
fêmeas. Foram utilizadas 200 fêmeas para este experimento. Os machos que não
conseguiam chegar até a quinta cópula eram descartados e as fêmeas copuladas
eram colocadas em gaiolas diferenciadas, de acordo com o número da cópula
realizada pelo mesmo macho. A identificação de inseminação era feita por exame
das espermatecas, depois de dissecação das fêmeas, 24 horas após o procedimento
de cópula para a identificação de presença de espermatozóides.
3.3. Colonização de Anopheles marajoara
3.3.1. Por cópula induzida
Fêmeas de anofelinos, alimentadas com sangue de mamíferos de grande
porte, foram coletadas da parede de um curral, representado pela Figura 8a, na
Fazenda Manga Funda, Município de Mazagão, Estado do Amapá, Brasil -
00º08’747’’S, 51º18’039’’W, como representado na Figura 9. Somente as fêmeas
alimentadas foram capturadas, para obtenção de geração F1. Após a coleta, os
mosquitos foram acondicionados em caixas apropriadas, inseridas em caixa de
isopor e enviadas ao Laficave via Sedex como mostrado na Figura 8b.
a) b)
Figura 8: a) coleta de anofelinos na parede de um curral em Macapá e b) detalhes da caixa para o
transporte dos anofelinos para o Rio de Janeiro.
33
Figura 9: detalhe da localização do município de Mazagão, Amapá, onde foi realizada a coleta dos
mosquitos.
No laboratório, as fêmeas foram anestesiadas com acetato de etila e a
triagem foi realizada. Os indivíduos foram identificados até espécie, de acordo com o
item 1.3.1. Sugerimos que todos os espécimes de Anopheles albitarsis l.s.
correspondiam a Anopheles marajoara, pois este material foi coletado em Mazagão,
ao lado da cidade de Santana, onde Conn et al. (2002), usando métodos
moleculares, identificaram somente Anopheles marajoara. Além disto, de acordo com
relato recente, os espécimes do Complexo Albitarsis encontrados no Amapá
pertencem exclusivamente à espécie Anopheles marajoara (Wilkerson apud
Zimmerman et al. 2006).
Para a obtenção de ovos, três dias depois da coleta em campo, as fêmeas
de Anopheles marajoara foram separadas em grupos de aproximadamente 50, para
postura forçada e obtenção da geração F1.
Para o procedimento de postura forçada, as fêmeas foram colocadas em
um aparato plástico (8,5 cm de diâmetro X 4,5 cm de altura), no qual a parte superior
34
é recoberta por uma tela de nylon com um pequeno orifício (que permite a introdução
dos mosquitos). O aparato plástico era mergulhado em uma bacia (18 x 8 cm)
contendo água desclorada, com a superfície interna recoberta com papel–filtro, como
ilustrado na Figura 10. As fêmeas permaneciam ali durante dois dias consecutivos.
Os mosquitos vivos eram descartados, o aparato removido e os ovos continuavam
na bacia até a eclosão das larvas. Com pissete, aspergia-se água pelas bordas da
bacia (nos papéis-filtro) para manter os ovos na superfície da água e evitar seu
ressecamento.
Figura 10: detalhes do aparato utilizado para a postura forçada.
Após a eclosão das larvas, ração para peixe (Tetramin®) pulverizada era
adicionada. Dois dias após a remoção do aparato, quando as larvas estavam
maiores, eram transferidas, com auxílio de uma pipeta plástica, para copos plásticos
medindo (11 X 11 cm) contendo 100 ml de água desclorada. Em cada copo eram
colocados grupos de 60 larvas. As larvas eram criadas de acordo com o
procedimento padrão do laboratório, como descrito acima para os anofelinos da
colônia, sem acréscimo de sal marinho na água desclorada.
As pupas eram transferidas para gaiolas e, à medida em que os adultos
emergiam, os machos eram separados. Para evitar utilizar machos com mais de
cinco dias de vida no procedimento de cópula, estes eram colocados na mesma
gaiola por apenas três dias consecutivos. As fêmeas permaneciam na mesma gaiola
até o dia da alimentação e da cópula induzida.
Para o repasto sanguíneo, a solução açucarada da gaiola era retirada 12
horas antes da alimentação. Após a hematofagia, as fêmeas eram submetidas à
cópula induzida (Figuras 6 e 7), para obtenção da geração seguinte.
35
Três a quatro dias depois da alimentação sanguínea as fêmeas copuladas
eram forçadas a desovar (Figura 10). A partir da geração F1, passamos a utilizar um
grupo de aproximadamente 30 fêmeas para realizar a postura forçada. As fêmeas
que sobreviviam depois da postura eram retiradas com o auxílio de um capturador de
Castro (aspirador) para dissecação das suas espermatecas. Quando possível, as
fêmeas mortas também eram dissecadas. Para a avaliação da cópula em cada
geração, dois parâmetros foram analisados: a presença de espermatozóides na
espermateca e a presença de larvas resultantes dos grupos de fêmeas forçadas a
ovipor.
3.3.2. Tentativa de cópula livre
Também foram realizadas tentativas de colonização por meio de cópula
livre. Para isto foram utilizados adultos de Anopheles marajoara oriundos da
colonização por cópula induzida, das gerações F1 e F8. Para a geração F1,
aproximadamente 400 pupas foram colocadas em uma gaiola (17 x 17 cm) e os
adultos permaneceram em contato por sete noites. Foram dissecadas 44 fêmeas
para a análise de espermatozóide na espermateca. O restante das fêmeas foi
alimentado com sangue de cobaio e, depois de três dias, um aparato para a coleta
de ovos foi introduzido.
Na geração F8, 250 pupas (em torno de 125 casais) foram introduzidas
dentro da gaiola. Quinze fêmeas, depois de sete noites de contato com os machos,
foram dissecadas para o exame de suas espermatecas. As fêmeas restantes foram
alimentadas e, após quatro dias, forçadas a realizar a postura de acordo com a
Figura 10. Ao final do experimento todas as fêmeas vivas (e algumas mortas) tiveram
suas espermatecas dissecadas e a mortalidade dos adultos foi quantificada.
3.4. Análises Estatísticas
Para as análises estatísticas, utilizamos o pacote estatístico GraphPad
Prism 4. Usamos três testes distintos: o Qui-quadrado para avaliar proporções de
valores absolutos, teste T-Student para comparar duas amostras ou teste ANOVA
36
para comparar mais de duas amostras. Utilizamos comparação múltipla de
Bonferroni para identificar as diferenças. Utilizamos nível de significância a 5% para
todas as análises.
4. RESULTADOS
4.1. Desenvolvimento
4.1.1. Viabilidade e cinética de emergência de Anopheles albitarsis
A Tabela 1 mostra os resultados de viabilidade de larvas, desde o estadio
L1 até o desenvolvimento de todas as pupas e emergência de todos os adultos.
Obtivemos sobrevivência média de 32,2 e 35,7% de adultos para as quantidades de
60 e 100 larvas L1 por bacia, respectivamente. Nas duas condições a sobrevivência
no estágio de pupa já era inferior a 50%. Observamos uma tendência de maior
mortalidade na condição de 60 larvas/bacia quando comparada à quantidade de 100
larvas/bacia. Entretanto, quando a viabilidade dos adultos entre as duas condições
experimentais foi estatisticamente comparada, não observamos diferenças
significativas (t=2.229; g.l.=8; p=0,056). Vimos também que a quantidade de machos
foi ligeiramente maior que as fêmeas, na quantidade de 100 larvas/bacia e o período
de desenvolvimento médio de larva L1 até a emergência do primeiro adulto foi, em
média, 14 dias para as duas quantidades de larvas/bacia avaliadas.
Tabela 1: Viabilidade de Anopheles albitarsis em diferentes quantidades de larvas/bacia.
N° larvas L1
Larvas/bacia N° pupas (%) % Adultos/EP ♂ ♀ ♂/♀
1.440 60 522 (36,25) 32,22 ± 0,72
204 260 0,8
3.500 100 1564 (44,7) 35,74 ± 0,96
655 596 1,1
EP = erro padrão
Com relação à cinética de emergência dos adultos verificamos, para as
duas condições que, nos primeiros dias, o número de machos é ligeiramente
superior ao de fêmeas. A partir do terceiro (60 larvas/bacia) ou do sexto (100
larvas/bacia) dia esse resultado se inverte, como mostrado na Figura 11a,b.
37
a) b)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
5
10
15
20
25
30
60 larvas
tempo (dias)
Nº Adultos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
5
10
15
20
25
30
Machos
Fêmeas
100 larvas
tempo (dias)
Nº Adultos
Figura 11: Acompanhamento diário da emergência de adultos de Anopheles albitarsis, crescidos a a)
60 larvas/bacia ou b) 100 larvas/bacia. Cada ponto representa a média e o erro padrão de 3
experimentos com 8 bacia cada (a) ou de 7 experimentos com 5 bacia cada (b).
4.1.2. Influência do tempo entre repasto e postura sobre a taxa de eclosão das larvas
de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis
As Tabelas 2 e 3 mostram os resultados de posturas realizadas por
fêmeas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis respectivamente em
diferentes momentos, entre três e 10 dias depois do repasto sanguíneo. A média de
ovos por fêmea e o percentual de eclosão das larvas também foram representados,
na Figura 12.
Não encontramos diferenças significativas na proporção de fêmeas de
Anopheles albitarsis que realizaram ou não a postura nos diferentes dias após do
repasto sanguíneo (χ²=10,71, g.l.=7, p=0,1517, Tabela 2). Também não
encontramos diferenças significativas na média de ovos por fêmea, ao longo dos
dias após a alimentação sanguínea (p=0,6047, ANOVA, Figura 12a). O percentual
de eclosão das larvas diferiu significativamente a partir do sexto dia (p<0,0001,
ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni, Figura 12c).
Quando a mesma avaliação foi realizada com Anopheles aquasalis, ao
contrário de Anopheles albitarsis, observamos diferenças significativas na proporção
de fêmeas que realizaram ou não a postura nos diferentes dias após do repasto
sanguíneo (χ²=35,54, g.l.=7, p<0,001, Tabela 3). Encontramos diferenças
significativas na média de ovos por fêmea, no sétimo dia e a partir do nono dia
38
depois da alimentação (p<0,0001, ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni,
Figura 12b). Com relação ao percentual de eclosão das larvas, observamos
diferenças significativas a partir do oitavo dia. A eclosão no décimo dia, de apenas
11,3%, diferiu de todos os outros pontos (p<0,0001, ANOVA com comparação
múltipla de Bonferroni, Figura 12d).
Tabela 2: Influência do tempo entre o repasto sanguíneo e a postura sobre a quantidade e a
viabilidade dos ovos de Anopheles albitarsis.
Dia após repasto
Nº ♀
Nº(%) ♀ c/ postura
Nº ovos
Média de ovos/♀
% eclosão
3 80 38 (47,5)
3.308 87,0 ± 16,9 81,0
4 70 41 (58,6)
4.613 112,5 ± 21,1 65,4
5 70 32 (45,7)
2.509 78,4 ± 12,9 81,0
6 70
37 (52,9
)
3.349 90,5 ± 10,8 58,0
7 60 27 (45,0)
1.670 62,0 ± 27,6 55,1
8 60 33 (55,0)
2.662 80,6 ± 8,2 49,0
9 60 41 (68,3)
3.303 80,7 ± 16,8 26,2
10 80
41 (51,3
)
2.671 65,1 ± 14,7 32,1
Tabela 3: Influência do tempo entre o repasto sanguíneo e a postura sobre a quantidade e a
viabilidade dos ovos de Anopheles aquasalis.
Dia após repasto
Nº ♀
Nº(%) ♀ c/postura
Nº ovos
Média de ovos/♀
% eclosão
3 80 36 (45,0) 3.092 86,0 ± 18,5 83,0
4 90 52 (57,8) 4.214 81,0 ± 13,2 85,5
5 70 40 (57,1) 3.681 92,0 ± 13,5 87,3
6 80 52 (65,0) 3.408 65,5 ± 4,7 89,3
7 90 49 (54,4) 2.230 45,5 ± 6,2 79,0
8 90 70 (77,8) 4.636 66,2 ± 14,3 67,3
9 60 41 (68,3) 1.999 49,0 ± 10,7 45,1
10 70 57 (81,4)
484
8,4 ± 4,5 11,3
Nossos resultados sugerem que o intervalo entre o repasto e a postura
não influenciou o número de ovos postos pelas fêmeas Anopheles albitarsis (Figura
12a). Entretanto fêmeas Anopheles aquasalis apresentaram redução da postura no
sétimo dia e a partir do nono dia (Figura 12b). Com relação à viabilidade dos ovos,
39
avaliada pelo percentual de eclosão das larvas, verificamos duas quedas abruptas
em Anopheles albitarsis, a partir do sexto e do nono dias – ou seja, aparentemente a
intervalos de três dias (Figura 12c). Em oposição, o perfil observado para Anopheles
aquasalis revelou maior estabilidade neste parâmetro: a queda na taxa de eclosão
das larvas foi progressiva e ocorreu somente a partir do oitavo dia (Figura 12d).
40
a) Média de ovos/fêmea b) Média de ovos/fêmea
3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120
140
a
a
a
a
a
a
a
a
Dias entre repasto e postura
Média de ovos/fêmea
3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120
140
a
b
a
a
a,b
a
a
a,b
Dias entre repasto e postura
Média de ovos/fêmeas
c) Percentual de eclosão das larvas d) Percentual de eclosão das larvas
3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
a
a,b
a
b,c
b,c b,c
c
c
Dias entre repasto e postura
% eclosão das larvas
3 4 5 6 7 8 9 10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
a
a
a
a,b
a
a
a,b
c
Dias entre repasto e postura
% eclosão das larvas
Figura 12: Influência do tempo entre o repasto sanguíneo e a postura sobre a quantidade e a viabilidade dos ovos de Anopheles albitarsis e Anopheles
aquasalis. Em azul (painéis a, c): Anopheles albitarsis. Em vermelho (painéis b, d): An aquasalis. a, b) média de ovos por fêmea. c, d) percentual de eclosão
de larvas. As barras representam a média e o erro padrão de vários grupos experimentais, como indicado nas Tabelas 2 e 3. Letras distintas sobre as barras
indicam diferenças significativas.
An. albitarsis An. aquasalis
41
4.1.3. Longevidade das fêmeas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis
A Figura 13 mostra o percentual de mortalidade cumulativa de fêmeas
virgens e acasaladas de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis submetidas a
diferentes regimes alimentares. A mortalidade em cada gaiola foi acompanhada
diariamente até a morte da última fêmea. Nesta figura identificamos, em todas as
condições, o momento no qual a mortalidade foi 50%. De maneira geral, a
longevidade de cada espécie pareceu equivalente nas diferentes condições, com
exceção da alimentação exclusivamente com açúcar, que resultou, aparentemente,
em maior mortalidade para Anopheles albitarsis, e menor para Anopheles aquasalis.
Para facilitar a interpretação, as cinéticas obtidas foram comparadas duas a duas,
como mostrado na Figura 14. Além disto, utilizamos o vigésimo dia para realizar as
análises estatísticas, quando as diferenças se mostram mais acentuadas (Figura 15).
Este momento tem um significado epidemiológico uma vez que o anofelino que o
alcança tem grandes possibilidades de transmitir o parasito da malária.
A Figura 14 compara, em cada painel, a mortalidade de fêmeas virgens e
acasaladas de cada espécie expostas aos diferentes regimes de alimentação.
Observamos para Anopheles albitarsis (painéis a, b, c) tendência a maior
mortalidade de fêmeas acasaladas em todas as condições de alimentação. Por outro
lado, a cinética de mortalidade foi muito semelhante entre fêmeas virgens e
acasaladas de Anopheles aquasalis, com exceção dos grupos alimentados somente
com açúcar (painel d), no qual as fêmeas acasaladas pareceram um pouco mais
longevas. Apesar destas tendências, contudo, as análises estatísticas (T-Student)
não mostraram diferenças significativas em nenhuma das condições testadas.
A Figura 15 mostra a mortalidade de fêmeas nas diferentes condições em um
único ponto, o vigésimo dia de vida adulta. Confirmamos percentual de mortalidade
de fêmeas virgens de Anopheles albitarsis discretamente reduzido quando
comparado às fêmeas acasaladas (painel a). Nestas duas condições fisiológicas, a
alimentação sanguínea parece influenciar positivamente a longevidade, ou seja, o
repasto sanguíneo diminui a mortalidade de fêmeas quando comparadas às que
receberam somente alimentação açucarada. Observamos também que a postura
parece não ter efeito na sobrevida desses mosquitos.
Quando comparamos estatisticamente as médias de mortalidade, no vigésimo
dia, de fêmeas virgens com as diferentes condições de alimentação, não
42
encontramos diferenças significativas (p=0,4080, ANOVA). Da mesma maneira, não
encontramos diferenças significativas com as fêmeas acasaladas (p=0,3617,
ANOVA). Nesta espécie, comparação dos resultados obtidos para as fêmeas
virgens, expostas às diferentes condições de alimentação também foi feita no 25º
dia, quando a diferença havia sido, aparentemente, mais acentuada (Figura 13a).
Contudo, também não encontramos diferenças significativas, utilizando o mesmo
teste estatístico (p=0,8627).
Ao contrário de Anopheles albitarsis, a alimentação sanguínea pareceu
influenciar negativamente a longevidade de fêmeas Anopheles aquasalis (Figura
15b). Por outro lado, de maneira similar a Anopheles albitarsis, não observamos
qualquer efeito da postura sobre a longevidade das fêmeas de Anopheles aquasalis.
Na avaliação estatística não encontramos diferenças significativas com fêmeas
virgens (p=0,6328, ANOVA) e com as fêmeas acasaladas (p=1,900, ANOVA) entre
as diferentes condições de alimentação.
43
a) Fêmeas virgens b) Fêmeas acasaladas
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Açúcar
Açúcar + Sangue
Açúcar + Sangue + Postura
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativo
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
c) Fêmeas virgens d) Fêmeas acasaladas
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
Figura 13: Longevidade de fêmeas virgens e acasaladas de
Anopheles albitarsis
e
Anopheles aquasalis
expostas a diferentes condições de alimentação.
Painéis (a) e (b):
Anopheles albitarsis
; painéis (c) e (d):
Anopheles aquasalis.
Painéis (a) e (c) fêmeas virgens; painéis (b) e (d): fêmeas acasaladas. Os
pontos dos gráficos representam a média cumulativa da mortalidade diária das fêmeas com erro padrão. As curvas representam regressões não lineares. Os
traços pontilhados indicam os momentos em que a mortalidade das fêmeas atingiu 50%.
An. albitarsis
An. aquasalis
44
a) Açúcar b) Açúcar + sangue c) Açúcar + sangue + postura
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Fêmeas virgens
Fêmeas acasaladas
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
d) Açúcar e) Açúcar + sangue f) Açúcar + sangue + postura
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Fêmeas virgens
Fêmeas acasaladas
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Fêmeas virgens
Fêmeas acasaladas
Tempo (dias)
% mortalidade cumulativa
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
20
40
60
80
100
Fêmeas virgens
Fêmeas acasaladas
Tempo (dias)
% mortalidade
Figura 14: Longevidade de fêmeas virgens e acasaladas de
Anopheles albitarsis
e
de
Anopheles aquasalis
expostas a diferentes condições de alimentação,
com foco na comparação entre virgens e acasaladas, nas diferentes situações. Painéis (a), (b), (c):
Anopheles albitarsis;
painéis (d), (e), (f):
Anopheles
aquasalis.
Os pontos dos gráficos representam a média cumulativa e o erro padrão dos diversos experimentos. As curvas nos gráficos representam
regressões não lineares.
An. albitarsis
An. aquasalis
45
a)
An. albitarsis
Virgens Acasaladas
0
20
40
60
80
100
Açúcar
Açúcar + Sangue
Açúcar + Sangue + Postura
condição
% mortalidade no 20º dia
b)
An. aquasalis
Virgens Acasaladas
0
20
40
60
80
100
condição
% mortalidade no 20º dia
Figura 15: Influência de várias condições fisiológicas sobre a mortalidade de fêmeas de Anopheles albitarsis
(a) e Anopheles aquasalis (b) no vigésimo dia após a emergência dos adultos. As barras representam a
média e o erro padrão de 3 experimentos com 9 grupos de 30 fêmeas por gaiola, totalizando 810 fêmeas
para cada condição.
4.2. Reprodução (Anopheles albitarsis)
4.2.1. Densidade ideal nas gaiolas
Resultados prévios do laboratório com Anopheles aquasalis indicavam que,
depois de cinco noites de contato entre machos e fêmeas adultos, aproximadamente 60%
46
das fêmeas estavam inseminadas (Carvalho, 2003). Utilizamos este período para avaliar a
influência da densidade de adultos Anopheles albitarsis sobre a eficácia de cópula livre. A
densidade de 25 casais por gaiola foi a única que apresentou diferença significativa com
relação as demais (exceto 50 casais) (p=0,0005, ANOVA com comparação múltipla de
Bonferroni) como mostrado na Figura 16. Como controle do experimento, monitoramos a
mortalidade das fêmeas em todas as condições, que foi sempre inferior a 20%.
25 50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
100
a
a,b
b
b
b
b
Densidade (casais por gaiola)
% fêmeas inseminadas
Figura 16: Influência da densidade de adultos Anopheles albitarsis sobre o percentual de fêmeas
inseminadas. As barras representam o percentual médio e o erro padrão de 3-4 experimentos para cada
densidade. Letras distintas indicam diferença significativa.
4.2.2. Tempo de contato entre machos e fêmeas
Para avaliar a influência do tempo de contato entre machos e fêmeas sobre a
eficácia de cópula livre, utilizamos 100 casais por gaiola, com base nos resultados acima
(Figura 16), que mostraram equivalência no percentual de fêmeas inseminadas para as
densidades acima de 50 casais por gaiola. O percentual de fêmeas inseminadas depois de
três, quatro, cinco e seis noites de contato foi de 41,4, 72,8, 77,6 e 83,6, respectivamente
(Figura 17). Nas condições avaliadas, apenas o resultado obtido após três noites de
contato diferiu significativamente dos demais (p=0,0066, ANOVA com comparação múltipla
de Bonferroni).
Repetimos este ensaio com a densidade de 300 pupas por gaiola. As
avaliações, neste caso foram feitas de três a cinco dias de contato entre os espécimes
(Figura 18). Estas são as condições utilizadas na rotina do laboratório. Neste caso, em que
não houve preocupação em controlar a proporção de machos e fêmeas, verificamos que o
47
percentual de fêmeas inseminadas foi inferior ao observado no teste anterior, quando a
proporção de machos e fêmeas foi de 1:1. Nesta avaliação obtivemos uma média de 18,3,
31,3 e 50,3% de fêmeas inseminadas com três, quatro e cinco noites de contato,
respectivamente. Houve diferença significativa com cinco noites de contato (p=0,0040,
ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni).
Embora resultados satisfatórios tenham sido obtidos após quatro noites de
contato quando a proporção de machos e fêmeas foi de 1:1, os dados apontam para a
necessidade, na rotina de criação do laboratório, de facilitar o acasalamento de Anopheles
albitarsis por pelo menos cinco noites.
3 4 5 6
0
20
40
60
80
100
a
b
b
b
Tempo (noites)
% fêmeas inseminadas
Figura 17: Percentual de fêmeas Anopheles albitarsis inseminadas depois de diferentes períodos de contato
com machos. Todos os ensaios foram feitos com a densidade de 100 casais por gaiola. As barras
representam o percentual médio e o erro padrão de 3 experimentos para cada tempo de contato. Letras
diferentes indicam diferença significativa.
3 4 5
0
20
40
60
80
100
a
a
b
Tempo (noites)
% fêmeas inseminadas
Figura 18: Percentual de fêmeas Anopheles albitarsis inseminadas depois de diferentes períodos de contato
com machos. Foi utilizada a densidade de 300 pupas por gaiola, condição da rotina de criação de anofelinos
no Laficave. As barras representam o percentual médio e o erro padrão de 3-4 experimentos para cada
tempo de contato. Letras distintas indicam diferença significativa.
48
4.2.3. Influência da idade dos machos sobre a eficácia de cópula induzida
Com o objetivo de otimizar a colonização de anofelinos por meio de cópula
induzida, algumas avaliações foram realizadas com Anopheles albitarsis. Inicialmente,
verificamos a idade ideal dos machos para este procedimento. A Figura 19 mostra que, a
partir do sétimo dia de vida adulta, a eficiência de cópula dos machos decai, ou seja, nem
todos os machos utilizados conseguem agarrar as fêmeas com suas pinças genitais. No
décimo dia, dos 96 espécimes utilizados, apenas 56 seguraram as fêmeas. Observamos
também que nem todos os machos que agarram as fêmeas conseguem inseminá-las. A
Figura 19b mostra o percentual de machos que conseguem agarrar as fêmeas (azul). Em
relação a todos os machos utilizados no ensaio, verificamos que a partir do quarto dia
decai progressivamente o percentual dos que inseminam as fêmeas (vermelho). No
entanto, quando calculamos o percentual de machos que inseminam as fêmeas em
relação aos que as agarram (verde), observamos que há um aparente aumento no 10º dia
de vida adulta. Nas análises estatísticas, encontramos diferença significativa quando
fizemos correlação das freqüências de machos utilizados com machos que agarram as
fêmeas e quando comparamos machos utilizados com machos que agarraram as fêmeas
no primeiro e décimo dias encontramos diferença altamente significativa (χ²=23,74, g.l.=1,
p<0,0001).
a) Número de machos b) Percentual de machos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
Machos utilizados
Machos que agarram
Machos que inseminam
Idade dos machos
Nº
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
Machos que agarram/ utilizados
Machos que inseminam/ machos que agarram
Machos que inseminam/ utilizados
Idade dos machos
%
Figura 19: influência da idade de machos Anopheles albitarsis sobre a eficácia de cópula induzida. a)
número de machos e b) percentual de machos para a realização de cópula induzida.
49
4.2.4. Número de cópulas viáveis por macho
Este ensaio foi realizado com machos de três dias, em função dos resultados
anteriores (Figura 19). Dos machos utilizados, 49 agarraram as fêmeas. Cada macho foi
utilizado para copular com até cinco fêmeas. A Figura 20 mostra que os machos perderam
um pouco da sua eficiência para agarrar as fêmeas depois da primeira cópula, ou seja, de
100% de eficiência inicial, este índice caiu para 98% na segunda e terceira cópulas. Na
quarta cópula, apenas 69,5% dos machos agarraram as fêmeas e na quinta, somente
43%. Com relação aos machos que conseguem inseminar as fêmeas, nossos resultados
indicam inseminação de 57% das fêmeas na primeira cópula, e de 64,6, 60,4 e 59% na
segunda, terceira e quarta cópulas, respectivamente. Na quinta cópula a taxa de fêmeas
inseminadas foi de 28,6%. Estes resultados sugerem que, embora os machos reduzam
sua capacidade de agarrar as fêmeas no decorrer de sucessivas cópulas, o percentual de
machos que conseguem inseminá-las é mantido.
1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
Machos que agarram
Machos que inseminam
Nº fêmeas copuladas
%
Figura 20: Influência do número de cópulas induzidas realizadas por machos Anopheles albitarsis sobre a
taxa de inseminação das fêmeas. Em todos os casos foram utilizados machos de três dias de idade.
4.3. Colonização de Anopheles marajoara
4.3.1. Por cópula induzida
50
Para a colonização de Anopheles marajoara foram obtidas, por coleta em
campo, 449 fêmeas. Estes mosquitos foram separados em grupos de aproximadamente
50 fêmeas e induzidos a realizar postura para a obtenção da geração F1. Desta postura,
obtivemos 5.600 larvas, criadas de acordo com o procedimento padrão do laboratório. As
gerações subsequentes foram obtidas por cópula induzida. Inicialmente foi utilizado um
macho para copular uma vez com até duas fêmeas. Após os resultados de cópula induzida
observados com Anopheles albitarsis (Figuras 19 e 20), passamos a utilizar um macho
para copular duas vezes com a mesma fêmea e, quando não havia machos suficientes
para realizar a cópula e garantir a geração seguinte, utilizávamos um macho para copular
duas vezes com até duas fêmeas diferentes, ou seja, o total de cópula de um macho não
ultrapassava quatro vezes.
A Tabela 4 mostra alguns parâmetros monitorados durante a colonização de
Anopheles marajoara, das gerações F1 até F15. Observamos grandes flutuações no
número total de larvas por geração. As gerações F7 e F13 foram as que tiveram os
menores números de larvas. Foi observada uma elevada mortalidade de larvas em todas
as gerações, principalmente nos estadios iniciais. As gerações F3-F6 apresentaram menor
proporção de pupas quando comparadas às demais gerações.
O número de fêmeas submetidas à cópula foi registrado e, depois da postura,
uma amostra destas fêmeas foi dissecada para análise da presença de espermatozóides
na espermateca. O percentual de fêmeas inseminadas ao longo das gerações está
apresentado na Tabela 4 e ilustrado na Figura 21. As gerações F1 e F2 apresentaram os
menores percentuais de fêmeas inseminadas quando comparada as demais gerações. A
Figura 22 mostra uma tendência de aumento do percentual de fêmeas inseminadas. A
eficácia de cópula pôde ser avaliada tanto pelo percentual de fêmeas inseminadas quanto
pela presença de larvas resultantes dos grupos de fêmeas forçadas a ovipor. Na geração
F9, o número de fêmeas dissecadas para o exame das espermatecas foi pequeno, o que
pode ter influenciado no resultado obtido para a taxa de fêmeas inseminadas.
51
Tabela 4: Colonização de Anopheles marajoara por meio de cópula induzida. Acompanhamento da
viabilidade e dos valores reprodutivos ao longo das gerações de Anopheles marajoara criados no laboratório
utilizando cópula induzida. Os valores em negrito estão mencionados no texto acima.
(*) fêmeas não dissecadas.
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14
0
10
20
30
40
50
Gerações
% Fêmeas inseminadas
Figura 21: Colonização de Anopheles marajoara por cópula induzida. Percentual de fêmeas inseminadas por
geração.
Geração Nº larvas L1
% viabilidade
larva L1 a pupa
Nº ♀ copuladas
% ♀
inseminadas
F1 5.600 35,0 407 10,8
F2 2.372 30,2 212 8,8
F3 2.873 18,3 153 27,5
F4 4.729 23,8 234 37,6
F5 4.818 21,3 180 27,3
F6 1.606 15,5 74 17,0
F7 1.245 61,2 160 26,3
F8 7.236 31,0 370 24,5
F9 2.800 55,5 336 18,3
F10 2.812 30,1 74 33,3
F11 1.414 33,0 123 41,9
F12 2.337 34,1 99 24,1
F13 629 39,5 84 40,3
F14 3.003 29,9 175 23,0
F15 3.692 31,5 237 *
52
R
2
= 0,2368
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
gerações
% fêmeas inseminadas
Figura 22: Percentual de fêmeas inseminadas por geração. A reta representa regressão linear
Durante a colonização
uma amostra das gerações F5, F9, F12 e F14 foi
acompanhada mais detalhadamente para análise da viabilidade de larvas L1 até a
emergência dos adultos, utilizando 60 larvas por bacia. A Tabela 5 mostra os parâmetros
monitorados, relativos à taxa de sobrevivência. Embora na geração F5 a sobrevivência dos
adultos tenha sido de apenas 14,6%, nas demais gerações, a viabilidade média foi de
35%, equivalente àquela obtida com o monitoramento da colônia de Anopheles albitarsis,
estabelecida no laboratório há mais de 15 anos.
Tabela 5: Colonização de Anopheles marajoara por meio de cópula induzida. Acompanhamento da
viabilidade nas gerações: F5, F9, F12, F14.
Geração N° larvas L1 N° pupas (%) % Adultos ♂ ♀ ♂/♀
F5 500 101 (20,2) 14,6 31 42 0,7
F9 900 477 (53,0) 43,0 174 213 0,8
F12 480 265 (55,2) 35,4 102 68 1,5
F14 920 402 (43,7) 29,0 124 142 0,9
53
4.3.2. Por cópula livre
Na tentativa de manter Anopheles marajoara de forma autônoma, utilizamos a
colônia mantida por cópula induzida, nas gerações F1 e F8, quando obtivemos maior
número de larvas. Na geração F1, de 44 fêmeas dissecadas (aproximadamente 10% dos
adultos), observamos apenas uma inseminada, equivalente a 2,3%. As fêmeas restantes
foram alimentadas para realizarem a postura e não obtivemos sucesso, pois não
conseguimos ovos. Repetimos esse procedimento de alimentação e indução de postura
até que todas as fêmeas morressem e em nenhum caso obtivemos resultado positivo.
Na geração F8, dissecamos 15 fêmeas (em torno de 6% dos adultos) e duas
encontravam-se inseminadas. As demais foram alimentadas e obtivemos um número
reduzido de ovos. No entanto, nenhum deles foi viável. Ao final do experimento, mais 21
fêmeas foram dissecadas e apenas uma estava inseminada. No total, 36 fêmeas foram
dissecadas e três estavam positivas (8,33%). O número de machos e fêmeas utilizados
neste experimento foi de 103 e 115 respectivamente (razão 0,9).
54
5. DISCUSSÃO
A malária ainda é uma das doenças transmitidas por vetores com maiores
implicações na saúde pública no Brasil e no mundo, atingindo populações com baixo poder
aquisitivo. No Brasil, na região Amazônica, a doença é registrada em áreas rurais e
urbanas. O diagnóstico e o tratamento precoce são fundamentais para o controle da
malária, pois diminuem as fontes de infecção para o mosquito. Com relação ao controle de
vetores, tem havido ênfase na redução de criadouros, com ações de limpeza e retirada da
vegetação, drenagem de coleções de água ou aplicação de larvicidas biológicos (Tauil
2006). A utilização de inseticidas químicos depende do conhecimento do comportamento
dos vetores e das características de transmissão da malária em cada local.
Estudos sobre o desenvolvimento e a reprodução de anofelinos são
fundamentais para o melhor entendimento da biologia e do comportamento do vetor.
Colônias de anofelinos mantidas em laboratório facilitam esses estudos devido à
disponibilidade de mosquitos crescidos de forma controlada e à possibilidade de obtenção
de espécimes em quantidade suficiente para ensaios específicos.
Em nossa avaliação do desenvolvimento das colônias estabelecidas,
mantivemos todo o procedimento rotineiro do laboratório para a criação dos mosquitos,
cuja prioridade é a obtenção de espécimes em quantidade. Dessa forma, utilizamos os
recipientes e volumes de água específicos para cada fase da criação. Variamos, para os
ensaios, apenas o número de larvas por bacia: 60 ou 100. Nos dois casos o
desenvolvimento durou, em média, 14 dias. Obtivemos viabilidade, de larva L1 a adulto, de
aproximadamente 35% para Anopheles albitarsis, independente do número de larvas por
bacia. Os resultados não diferiram significativamente entre as duas condições testadas,
embora houvesse aparente tendência de maior mortalidade na menor densidade.
Há relatos de aumento na mortalidade de culicídeos quando a densidade de
larvas é aumentada, devido à competição por alimento, canibalismo e superpopulação
(Gama et al. 2005). Entretanto, não consideramos que os ensaios aqui apresentados
possam ser comparados a estes trabalhos, pois utilizamos quantidades muito baixas
(poucas larvas por bacia). É provável que a tendência que observamos, de maior
mortalidade de larvas crescidas com menor quantidade, tenha sido resultado do excesso
de comida não consumido pelas larvas, que deixava as bacias mais sujas. Estas
suposições seriam, no entanto, sutilezas da criação, uma vez que as diferenças de
mortalidade nas duas densidades não foram significativas.
55
Trabalho prévio de nossa equipe havia observado, anteriormente, viabilidade de
82% de L1 à fase adulta de Anopheles aquasalis (Carvalho 2002). Embora este resultado
tenha sido obtido com espécie distinta, acreditamos que a diferença em relação aos
ensaios atuais seja principalmente fruto de nossa opção por manter a rotina da colônia,
que privilegia a quantidade final de espécimes, com algum compromisso da qualidade de
um tratamento mais diferenciado. A baixa viabilidade encontrada em nossos experimentos
também difere de outros autores, como Barreto e Coutinho (1943) com Anopheles
albitarsis domesticus (=Anopheles marajoara) e Anopheles tarsimaculatus (=Anopheles
aquasalis), de Klein et al. (1990) com Anopheles deaneorum e da viabilidade encontrada
por Horosko et al. (1997), também com Anopheles albitarsis. É provável que, também
nestes casos, cuidados específicos tenham sido tomados com os ensaios de criação, que
justificam as diferenças de resultados.
Nossa metodologia de criação de Anopheles albitarsis, originalmente descrita
por Horosko et al. (1997), atualmente difere do procedimento inicial em alguns pontos: a)
criação de larvas e de adultos em ambientes separados e independentes, b) a água
desclorada é acrescida de um grama de sal marinho/litro; c) a comida é feita à base de
ração para peixes (Tetramin® Tropical Flakes) fornecida uma vez ao dia; d) duas vezes
por semana as larvas são transferidas para bacia com água limpa. É provável que a baixa
viabilidade das larvas e o desenvolvimento médio de 14 dias que obtivemos, diferente de
Horosko et al. (1997), estejam também relacionados ao tipo e quantidade de comida
fornecida às larvas e, principalmente, à excessiva manipulação, com frequentes trocas de
água, que adotamos na rotina do laboratório.
Observamos que, nas duas quantidades de larvas avaliadas, machos de
Anopheles albitarsis emergiram primeiro que fêmeas. Nossos resultados corroboram
dados na literatura com culicídeos (Forattini 2002) e confirmam resultados anteriores do
laboratório obtidos com machos Anopheles aquasalis, que emergem aproximadamente um
dia antes das fêmeas (Carvalho 2002). Este é um aspecto importante para a manutenção
de colônias em laboratório. Nossas colônias de anofelinos são grandes e, como mantemos
as bacias ordenadas por idade e trabalhamos com um número limitado de pupas por
gaiola (300) não é incomum que todas as pupas de uma mesma gaiola sejam coletadas de
bacias de mesma idade. Com isto, é frequente o desequilíbrio na proporção entre machos
e fêmeas nas gaiolas. Em situações extremas, a colônia poderia se tornar inviável, pois
poucas fêmeas seriam fertilizadas, tanto pelo excesso quanto pela falta de machos nas
gaiolas, resultando em número reduzido de ovos para a geração seguinte. Este detalhe da
56
rotina de criação provavelmente contribui com eventuais flutuações observadas em nossas
colônias estabelecidas no laboratório.
Já foi observado que a reabsorção de folículos ovarianos, durante o
desenvolvimento dos ovócitos, por fêmeas de anofelinos e de outros culicídeos, pode estar
relacionada com uma série de fatores, como a virgindade, a escassez de reserva
energética, o volume de sangue ingerido e o status nutricional da fêmea, entre outros
(Klowden e Chambers 1991, Clements 1992, Gary e Foster 2001, Ahmed e Hurd 2005).
Por outro lado, havia preocupação do laboratório em avaliar a habilidade de
fêmeas de anofelinos de armazenar ovos já desenvolvidos, caso não encontrem sítios de
postura disponíveis. Neste sentido, verificou-se que para Anopheles gambiae o percentual
de ovos viáveis decresce progressiva e rapidamente a partir do 4º dia após o repasto. A
redução de viabilidade, nesta espécie, é acompanhada de alteração da morfologia dos
ovos, que ganham aparência progressivamente mais frágil, e se tornam mais claros,
maleáveis e menores (Valle e Mazur, dados não publicados).
Posteriormente, observações preliminares do laboratório, com amostras de
tamanho limitado, encontraram resultados distintos para Anopheles aquasalis:
acompanhamento da viabilidade dos ovos entre três e seis dias depois do repasto
sanguíneo revelou decréscimo abrupto da taxa de eclosão entre o 4º e o 5º dia. Nesta
espécie, ao contrário de Anopheles gambiae, não foram detectadas alterações
morfológicas significativas dos ovos durante o período de experimentação (Carvalho
2002).
Com base nestas observações preliminares, procuramos avaliar detalhadamente
a influência do tempo decorrido depois do repasto sanguíneo sobre a viabilidade da
postura das duas colônias estabelecidas no laboratório, Anopheles albitarsis e Anopheles
aquasalis. Para ambas, foram feitos ensaios entre três e dez dias depois da alimentação
sanguínea. Adicionalmente, procuramos estimar também a quantidade média de ovos
depositados pelas fêmeas. Este último parâmetro deve ser avaliado com algumas
ressalvas, uma vez que a) não foi possível acompanhar a postura de fêmeas individuais e
b) nem todas as fêmeas de anofelinos em cativeiro são inseminadas.
Para estimar a quantidade de fêmeas que depositaram ovos, seu status
fisiológico foi monitorado. Depois da postura, as fêmeas foram separadas em dois grupos:
com ou sem ovos no abdômen. Avaliamos também se estavam inseminadas, por meio do
exame da presença de espermatozóides na espermateca. Consideramos que fêmeas com
ovos no abdômen não haviam realizado a postura. Ou seja, o cálculo do número de ovos
57
por fêmea apresentado nas Tabelas 2 e 3 e na Figura 12 considerou apenas as fêmeas
com abdômen vazio, sem ovos.
Em todo caso, existe a possibilidade de que alguns ovos tenham sido
depositados por fêmeas do grupo com ovos no abdômen (inseminadas ou não)
mencionado acima. Preferimos não considerá-las: assumimos que a quantidade de ovos
postos por estas fêmeas seria pequena e que não alteraria o resultado final de forma
significativa. No caso de fêmeas inseminadas que não realizaram postura, acreditamos
que provavelmente a maturação dos ovos não estava completa. Também não pode ser
descartada a possibilidade de não adaptação ou não reconhecimento do aparato ou da
água de postura. Neste sentido, vale mencionar que o aparato de postura permaneceu por
apenas 24 horas na gaiola. O outro grupo, de fêmeas virgens que não realizaram postura,
confirma dados da literatura, que apontam para inibição parcial ou total da postura neste
caso (Clements 1992).
Consideramos que fêmeas com o abdômen vazio realizaram a postura,
independente de estarem inseminadas. Encontramos fêmeas com espermateca negativa
neste grupo, nas duas espécies, em todos os tempos avaliados depois da alimentação
sanguínea, porém em percentuais muito baixos em comparação com fêmeas inseminadas.
Estas corresponderiam às poucas fêmeas virgens que depositam ovos mencionadas na
literatura. De fato, o percentual de fêmeas virgens que não realizaram postura foi muito
alto. Embora já tenha sido relatada, em outros modelos, reabsorção de oócitos por fêmeas
virgens (Davis 1964 apud Klowden e Chambers 1991) e que, em nosso caso, seja
teoricamente possível que as fêmeas virgens com abdômen vazio tenham reabsorvido os
ovos, principalmente em momentos mais tardios, esta possibilidade não foi considerada:
todas as fêmeas com abdômen vazio foram incluídas no cálculo da média de ovos por
fêmea.
Achamos importante reiterar que todas estas questões envolvendo o número de
fêmeas a considerar para o cálculo seria contornado se pudéssemos realizar posturas
individuais o que, de nossa experiência, não é viável para as espécies de que dispomos.
Verificamos que o número de ovos por fêmea Anopheles albitarsis foi
equivalente em todos os pontos experimentais considerados, entre três e dez dias após o
repasto sanguíneo. A média de ovos por fêmea aparentemente mais elevada no quarto dia
não revelou diferença significativa em relação aos outros dias avaliados. Anopheles
aquasalis parece ter comportamento distinto: a quantidade de ovos postos por fêmea
58
parece decrescer progressivamente ao longo do ensaio. Apesar disto, diferenças
significativas só são percebidas nos últimos dias analisados.
Em relação à taxa de eclosão das larvas, detectamos redução significativa da
viabilidade a partir do sexto dia para Anopheles albitarsis, e no caso de Anopheles
aquasalis, mais tardiamente, depois do oitavo dia. Estes resultados confirmam
observações prévias que indicam prejuízo da viabilidade dos ovos retidos pelas fêmeas de
anofelinos. Este foi o caso, como mencionado acima, de ovos de Anopheles gambiae, cuja
viabilidade decresceu progressivamente a partir do 4º dia após o repasto (Valle e Mazur,
dados não publicados). Os resultados distintos encontrados anteriormente no laboratório
para Anopheles aquasalis, decréscimo abrupto da viabilidade dos ovos a partir do quinto
dia (Carvalho 2002), são provavelmente consequência do tamanho reduzido das amostras
utilizadas naquela época.
Avaliação mais detalhada da cinética de viabilidade dos ovos ao longo dos dias
depois do repasto sanguíneo aponta para diferenças entre as duas espécies: verificamos
duas quedas relativamente abruptas em Anopheles albitarsis, no sexto e nono dias.
Anopheles aquasalis se mostrou mais estável, com queda progressiva e discreta de
viabilidade a partir do oitavo dia, intensificada no décimo dia (Figura 12c,d).
Embora os resultados de média de ovos por fêmea devam ser avaliados com
ressalvas, como detalhado acima, quando estes dados são comparados com a viabilidade
dos ovos, percebemos dinâmicas diferentes para as duas espécies avaliadas: ao contrário
de Anopheles aquasalis, Anopheles albitarsis parece depositar sempre quantidades
equivalentes de ovos, independente de sua qualidade.
Alguns estudos têm mostrado diferenças na fisiologia e no comportamento de
fêmeas virgens e acasaladas, em grande parte em função de estímulos por substâncias
presentes nas glândulas acessórias dos machos (Giesel et al. 1989 apud Klowden e
Chambers 1991). Klowden e Chambers (1991) detectaram maior mortalidade de fêmeas
acasaladas de Aedes aegypti em jejum, quando comparadas com fêmeas virgens. Nos
ensaios descritos pelos autores, a totalidade das fêmeas, nas diferentes condições,
morreu até o nono dia.
Em nossos ensaios de longevidade, utilizamos fêmeas virgens ou acasaladas e
para cada condição fisiológica foram oferecidas alternativas de alimentação: apenas com
açúcar, ou açúcar e repasto sanguíneo. Neste último caso, houve ainda a possibilidade de
realizar postura, ou não. Embora avaliações estatísticas não tenham revelado diferenças
significativas em nenhum caso, diferenças sutis foram percebidas entre os grupos
59
experimentais – e também entre as duas espécies avaliadas – e merecem ser comentadas
(ver Figuras 13, 14 e 15).
Nossos resultados com Anopheles albitarsis estão de acordo com os observados
por Klowden e Chambers (1991) para Aedes aegypti: observamos tendência de maior
mortalidade de fêmeas Anopheles albitarsis acasaladas, quando comparadas com fêmeas
virgens. Isto ocorreu em todas as condições de alimentação, sugerindo que a inseminação
pode ter interferido negativamente na longevidade desta espécie. O mesmo não foi
verificado para Anopheles aquasalis, espécie na qual a mortalidade de fêmeas virgens e
acasaladas foi equivalente em todas as condições.
Observamos longevidade aparentemente maior de fêmeas Anopheles aquasalis
alimentadas apenas com açúcar. Em oposição, fêmeas Anopheles albitarsis mais longevas
foram aquelas que receberam, além de açúcar, repasto sanguíneo. Os resultados obtidos
para esta espécie corroboram os achados de Gary e Foster (2001) com fêmeas Anopheles
gambiae acasaladas. Estes autores observaram maior longevidade de fêmeas Anopheles
gambiae alimentadas com açúcar e sangue quando comparadas com fêmeas que
receberam somente sangue, ou somente açúcar.
A tendência de menor longevidade de fêmeas Anopheles aquasalis alimentadas
com sangue poderia ser atribuída principalmente à mortalidade aumentada nos dias
imediatamente posteriores ao repasto sanguíneo (Figura 13 c,d). Sugerimos que esta
mortalidade inicial seja consequência de estresse causado pela própria ingestão de
sangue: já foi observado em nosso laboratório que a repleção de fêmeas Anopheles
aquasalis é maior que Anopheles albitarsis, o que poderia indicar maior gasto de energia
para a digestão.
Depois de um mês, 50% das fêmeas Anopheles gambiae alimentadas com
açúcar e sangue ainda estavam vivas, em condições de laboratório (Gary e Foster 2001).
Os anofelinos neotropicais são caracteristicamente menos longevos. Em nossos ensaios,
depois de um mês todas as fêmeas Anopheles albitarsis haviam morrido, com exceção
das fêmeas virgens que receberam sangue (Figura 13 a,b), confirmando efeito positivo do
repasto sanguíneo sobre a longevidade desta espécie, a exemplo de Anopheles gambiae.
Para Anopheles aquasalis, espécie um pouco mais robusta em condições de laboratório,
obtivemos, depois de 30 dias, aproximadamente 80% de mortalidade de fêmeas em todas
as condições avaliadas em laboratório.
Nestes ensaios também procuramos investigar se a postura de ovos interfere
com a longevidade. Para parte das fêmeas alimentadas com sangue foi disponibilizado
60
aparato de postura. Contudo, não observamos, em nenhuma das duas espécies, qualquer
efeito da postura sobre a longevidade das fêmeas.
Finalmente, nas avaliações de longevidade observamos, em todos os grupos
que recebiam o repasto sanguíneo uma vez por semana que, tanto a quantidade de
fêmeas que aceitavam o repasto quanto o número de ovos por fêmea (na verdade, por
grupo de 30 fêmeas) era menor ao longo do ensaio. Com Anopheles albitarsis, as últimas
fêmeas sobreviventes dificilmente realizavam o repasto ou faziam a postura e as fêmeas
virgens, mesmo alimentadas, raramente faziam postura. No caso de Anopheles aquasalis
houve maior quantidade de ovos postos por fêmeas virgens. Esses fatos já foram
previamente descritos para outros culicídeos (Clements 1992).
Um mosquito, para ser considerado um bom vetor, precisa sobreviver tempo
pelo menos equivalente ao período de incubação extrínseco, parâmetro importante para
determinar a capacidade vetorial de uma espécie. Dependendo da espécie de plasmódio,
o parasito da malária humana geralmente requer de 10 a 35 dias até que o mosquito se
torne infectante (Igreja et al. 1992). Embora as condições de laboratório favoreçam a
sobrevivência dos espécimes do vetor e não representem a situação na natureza, os
resultados obtidos fornecem indicações sobre a longevidade potencial das espécies sob
diferentes situações fisiológicas.
No laboratório, nas fases iniciais de manutenção das colônias estabelecidas de
anofelinos, não havia muito rigor em relação a uma série de parâmetros, entre eles a
quantidade de adultos por gaiola ou a idade em que as fêmeas eram alimentadas com
sangue. As flutuações de densidade das colônias eram frequentes, em muitos casos
resultantes de posturas insatisfatórias ou de grandes eventos de mortalidade.
Racionalizou-se, na época, que em muitos casos estas variações poderiam ser evitadas,
ou diminuídas, com controle da densidade de adultos nas gaiolas e do tempo de contato
entre machos e fêmeas, para inseminação. Para isto seria necessário definir as condições
ideais em relação a estes parâmetros.
Ensaios para avaliação simultânea da densidade de adultos nas gaiolas e da
influência do tempo de contato entre machos e fêmeas sobre a taxa de fêmeas
inseminadas foram realizados previamente no Laficave com Anopheles aquasalis
(Carvalho 2003). Na ocasião foram avaliadas densidades entre 50 e 500 espécimes por
gaiola - e tempos de contato de machos e fêmeas que variaram entre três e sete dias de
vida adulta. Todas as avaliações foram feitas por análise da presença de espermatozóides
nas espermatecas das fêmeas. Estes ensaios com Anopheles aquasalis mostraram taxas
61
satisfatórias de inseminação, em torno de 60%, a partir de quatro dias de contato de
machos e fêmeas, com densidade de 300 indivíduos por gaiola (17x 17 cm). Com base
nestes resultados passamos a manter, para as duas espécies, gaiolas com 300 espécimes
adultos. Adicionalmente, estabelecemos cinco dias como tempo mínimo de contato entre
os adultos antes da alimentação. Vale ainda salientar que testes preliminares, também
com Anopheles aquasalis, haviam indicado que fêmeas recém-alimentadas com sangue
dificilmente são inseminadas, o que só volta a ocorrer ao final da digestão, três a quatro
dias depois do repasto sanguíneo (Carvalho 2001).
Nos ensaios aqui apresentados avaliamos, para Anopheles albitarsis, os dois
parâmetros, influência da densidade de adultos nas gaiolas e do tempo de contato entre
machos e fêmeas sobre a eficácia de cópula livre, separadamente. Não observamos
diferenças significativas entre as densidades de 50 a 250 casais por gaiola. Todas as
condições resultaram em aproximadamente 60-80% de fêmeas inseminadas depois de
cinco noites de contato. Escolhemos então, por conveniência metodológica, a densidade
de 100 casais por gaiola para o acompanhamento do tempo de contato entre machos e
fêmeas. Confirmamos dados prévios do laboratório (Carvalho 2003) com Anopheles
aquasalis, que apontavam o período de quatro dias de contato como mínimo satisfatório.
Em nossas condições, obtivemos cerca de 70% de fêmeas Anopheles albitarsis
inseminadas depois de quatro noites. Nossos resultados sugerem que a densidade nas
gaiolas não foi um fator determinante para o sucesso da cópula. Contudo, vimos que o
tempo de contato entre machos e fêmeas foi fundamental para a inseminação das fêmeas.
Reproduzimos então os mesmos ensaios, de avaliação do tempo mínimo
necessário de contato entre machos e fêmeas Anopheles albitarsis, na condição utilizada
na rotina do laboratório, de gaiolas com 300 espécimes. Observamos depois de quatro
noites de contato (cinco dias) uma média de 31% de fêmeas inseminadas, bem abaixo das
condições experimentais prévias. Bem abaixo também do que havia sido verificado
anteriormente para Anopheles aquasalis, quando aproximadamente 60% de fêmeas
inseminadas foram detectadas neste mesmo intervalo (Carvalho 2003). Estas diferenças
podem ser atribuídas em parte às particularidades de cada espécie, mas também à rotina
de manutenção das colônias que, como mencionado, não contempla os cuidados
diferenciados que se tem com os ensaios. É ainda provável que a razão entre machos e
fêmeas, controlada apenas nos experimentos iniciais, tenha alguma participação nas taxas
de inseminação obtidas, mas não foram realizadas, até o momento, avaliações deste
parâmetro.
62
Com relação à cópula induzida, avaliamos dois parâmetros, com o objetivo de
aumentar a eficiência deste procedimento em espécies do Complexo Albitarsis: a melhor
idade dos machos e o número de fêmeas que um mesmo macho é capaz de inseminar.
Esses experimentos foram realizados com Anopheles albitarsis, espécie já adaptada para
a cópula induzida no laboratório. Durante os ensaios, quantificamos a taxa de machos
capazes de agarrar as fêmeas com suas pinças genitais. Contudo, nem todos estes
machos inseminavam efetivamente as fêmeas. A inseminação também era monitorada,
por meio de exame das espermatecas das fêmeas.
Verificamos que, dos machos utilizados de até seis dias de idade, quase 100%
agarraram as fêmeas. A partir de então, esta habilidade decresceu progressivamente,
sugerindo que a idade é fundamental para realização da cópula. O percentual de machos
capazes de inseminar as fêmeas foi calculado em relação ao número de machos utilizados
e ao número de machos que agarraram as fêmeas. Em relação ao total de machos
utilizados, verificamos decréscimo, depois do quarto dia, da taxa de machos que
efetivamente inseminavam as fêmeas. Ou seja, no geral obtivemos melhores taxas de
cópula induzida com machos mais novos. Estes resultados estão de acordo com os
achados de Baker (1964).
Entre o oitavo e o décimo dia, apenas cerca de 30% dos machos utilizados
foram capazes de inseminar as fêmeas. Porém observamos, ao final do experimento,
tendência ao aumento da eficiência de inseminação, entre os machos capazes de agarrar
as fêmeas. No décimo dia, 60% dos machos que agarraram as fêmeas foram capazes de
inseminá-las, em contraste com os dois dias anteriores, quando este índice foi de apenas
50%. Apesar destes valores, análises estatísticas não mostraram diferenças significativas
nestes pontos avaliados. Com 10 dias de idade a habilidade dos machos de agarrar as
fêmeas estava bastante comprometida: para obter 56 fêmeas copuladas foi preciso utilizar
96 machos. Estes resultados diferem de Arruda et al. (1982), que observaram aumento
dos índices de inseminação das fêmeas quando machos mais velhos eram utilizados.
Outro ponto que avaliamos foi o número de cópulas viáveis por macho.
Observamos que um macho pode inseminar, com a mesma eficiência, até quatro fêmeas.
Em oposição, Klein et al. (1990) obtiveram, com Anopheles deaneorum, maior taxa de
fêmeas inseminadas na primeira cópula do macho; esta taxa diminuía progressivamente
até a quarta cópula.
Nossos resultados de colonização de Anopheles marajoara por cópula induzida
mostram elevada mortalidade de larvas em todas as gerações. O procedimento para a
63
criação dessas larvas foi o mesmo utilizado para os anofelinos já estabelecidos no
laboratório, com exceção da água, que utilizamos sem salinidade para esta espécie, e da
quantidade de larvas por bacia, que fixamos em 60 indivíduos. De uma maneira geral,
observamos maior viabilidade de larvas L1 a pupa a partir da geração F7.
O percentual de fêmeas inseminadas foi menor nas duas primeiras gerações,
quando comparadas às demais (Tabela 4). Estes resultados diferem de Ow-Yang et al.
(1963), que observaram maiores percentuais de fêmeas inseminadas nas cinco primeiras
gerações com Anopheles maculatus. Verificamos ainda que, apesar de flutuações no
rendimento ao longo do procedimento, houve tendência de aumento na taxa de fêmeas
inseminadas a partir da terceira geração. Nas gerações F5, F9, F12 e F14 parte dos
espécimes foram separados; fizemos, neste grupo, o acompanhamento mais controlado
da viabilidade de larvas L1 até a emergência dos adultos (Tabela 5). Os resultados
indicam menor viabilidade na geração F5 quando comparada às outras gerações
avaliadas, que apresentaram taxas bastante próximas às obtidas na rotina da criação de
Anopheles albitarsis, espécie já estabelecida em laboratório. As diferenças entre os
resultados de viabilidade de pupas obtidos para toda a colônia e para os grupos
acompanhados separadamente (Tabelas 4 e 5) se devem, provavelmente, aos maiores
cuidados durante a criação destes últimos.
Apesar das variações obtidas, os resultados sugerem processo de adaptação de
Anopheles marajoara às condições de laboratório. Considerando a dificuldade de
colonização de espécies do Complexo Albitarsis, conseguimos taxas relativamente altas
de inseminação das fêmeas de Anopheles marajoara. Criamos os espécimes de acordo
com a rotina do laboratório, pois nossa intenção era colonizar a espécie sem a
preocupação de controlar a manipulação durante este processo. Com nossa metodologia
padrão, mesmo com flutuações, a colônia de Anopheles marajoara está sendo mantida no
laboratório até o momento por meio de cópula induzida.
Horosko et al. (1997) após aproximadamente dois anos de manutenção da
colônia com cópula induzida, conseguiram colonizar Anopheles albitarsis s.s. por meio de
cópula livre. Eles utilizaram gaiolas grandes (60 x 60 x 60 cm) com aproximadamente mil
indivíduos e relação entre os sexos de aproximadamente 1:1; os casais permaneceram em
contato por várias noites, após o que, as fêmeas eram alimentadas. Três dias depois,
vários aparatos eram colocados dentro das gaiolas para a coleta de ovos.
No nosso caso, para cópula livre, utilizamos gaiolas bem menores e fizemos
duas tentativas: a primeira com 400 pupas e a segunda com 250 pupas por gaiola
64
(17 X 17 cm). Nossos resultados não foram bem sucedidos, pois encontramos poucas
fêmeas inseminadas nas duas tentativas. Provavelmente a falta de espaço dentro das
gaiolas de criação não permitiu a cópula livre dessas espécies eurigâmicas. Consideramos
que a utilização da mesma metodologia descrita por Horosko et al. (1997), em gaiolas
maiores, para tentativa de cópula livre, teria maiores chances de sucesso. Para isto,
contudo, seria necessária maiores quantidades de indivíduos.
65
6. CONCLUSÕES
1. Verificamos aproximadamente 35% de sobrevivência de Anopheles albitarsis entre L1 e
a fase adulta, com as duas quantidades de larvas por bacia avaliadas, mantidas de acordo
com o procedimento do laboratório; nos dois casos, confirmamos que emergência dos
machos antecede a das fêmeas.
2. Detectamos diferenças na influência do tempo entre repasto e a postura sobre a taxa de
eclosão das larvas de Anopheles albitarsis e de Anopheles aquasalis.
3. Apesar de algumas variações sutis, não encontramos, para nenhuma das duas espécies
avaliadas, diferenças significativas na longevidade de fêmeas virgens e acasaladas,
alimentadas ou não com sangue de cobaios.
4. Com relação à cópula livre, observamos que as densidades de 50 a 250 casais de
adultos Anopheles albitarsis por gaiola não interferiu no percentual de fêmeas
inseminadas; a única exceção foi a condição de 25 casais por gaiola.
5. Observamos que é preciso um tempo de contato entre machos e fêmeas de no mínimo
cinco noites para obter mais de 50% de fêmeas inseminadas.
6. Com relação à cópula induzida, observamos que praticamente todos os machos com
até seis dias de vida adulta são capazes de agarrar as fêmeas com suas pinças genitais;
machos de até quatro dias inseminam pelo menos 60% das fêmeas com as quais
copulam.
7. Um macho insemina até quatro fêmeas sem perder sua eficácia;
8. Obtivemos sucesso na colonização de Anopheles marajoara por meio de cópula
induzida. No momento, alcançamos a geração F19.
66
7. REFERÊNCIAS
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