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RODRIGO CESAR CARVALHO FREITAS
PAPEL DA CAVEOLINA-1 NO
DESENVOLVIMENTO DA RETINA DE PINTO
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL
FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM NEUROIMUNOLOGIA
Orientadora: Dra. Ana Lúcia Marques Ventura
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
2008
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA
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ii
RODRIGO CESAR CARVALHO FREITAS
PAPEL DA CAVEOLINA-1 NO DESENVOLVIMENTO DA
RETINA DE PINTO
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Neuroquímica do
Departamento de Neurobiologia, Instituto de Biologia, UFF
Tese de Doutorado submetida à
Universidade Federal Fluminense como
requisito parcial para obtenção de grau
de Doutor em Neuroimunologia.
Orientadora: Dra. Ana Lúcia Marques Ventura
Niterói
2008
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iii
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Neuroquímica, do
Programa de Neuroimunologia do Instituto de Biologia da
Universidade Federal Fluminense sob orientação de Ana Lúcia
Marques Ventura e na vigência de auxílios concedidos pelo
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico
(CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino
Superior (CAPES) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de
Janeiro (FAPERJ)
iv
FICHA CATALOGRÁFICA:
Freitas, Rodrigo César Carvalho
Papel da Caveolina-1 no desenvolvimento da retina
de pinto, Niterói, UFF, Instituto de Biologia, 2008
Tese: Doutor em Neuroimunologia.
1. Caveolina; 2. Proliferação celular; 3.
Diferenciação celular; 4. Retina.
I. Universidade Federal Fluminense
II.Título.
v
Dedico esta tese
aos meus pais
ao meu filho
pela contribuição,
apoio e inspiração
vi
“Derrotar o inimigo em
cem batalhas não é a
excelência suprema: a
excelência suprema
consiste em vencer o
inimigo sem ser
preciso lutar”
(Sun Tzu, 544a.C
496a.C, A Arte da
Guerra).
vii
Das Três Transformações
Três metamorfoses, nomeio-vos, do espírito: como o espírito se torna camelo e
o camelo, leão e o leão, por fim, criança.
Muitos fardos pesados há para o espírito, o espírito forte, o espírito de
suportação, ao qual inere o respeito; cargas pesadas, as mais pesadas, pede a
sua força.
“O que há de pesado?”, pergunta o espírito de suportação; e ajoelha como um
camelo e quer ficar bem carregado.
“O que há de mais pesado, ó heróis”, pergunta o espírito de suportação, “para
que eu o tome sobre mim e minha força se alegre?
Não será isto: humilhar-se, para magoar o próprio orgulho? Fazer brilhar a
própria loucura, para escarnecer da própria sabedoria?
Ou será isto: apartar-se da nossa causa, quando ela celebra o seu triunfo?
Subir para altos montes, a fim de tentar o tentador?
Ou será isto: alimentar-se das bolotas e da erva do conhecimento e, por amor à
verdade, padecer fome na alma?
Ou será isto: estar enfermo e mandar embora os consoladores e ligar-se de
amizade aos surdos, que não ouvem nunca o que queremos?
Ou será isto: entrar na água suja, se for a água da verdade, e não enxotar de si
nem as frias rãs nem os ardorosos sapos?
Ou será isto: amar os que nos desprezam e estender a mão ao fantasma,
quando ele nos quer assustar?”
Todos esses pesadíssimos fardos toma sobre si o espírito de suportação; e, tal
como o camelo, que marcha carregado para o deserto, marcha ele para o seu
próprio deserto.
Mas, no mais ermo dos desertos, dá-se a segunda metamorfose: ali o espírito
torna-se leão, quer conquistar, como presa, a sua liberdade e ser senhor em
seu próprio deserto.
Procura, ali, o seu derradeiro senhor: quer tornar-se-lhe inimigo, bem como do
seu derradeiro deus, quer lutar para vencer o dragão.
Qual é o grande dragão, ao qual o espírito não quer mais chamar senhor nem
deus? “Tu deves” chama-se o grande dragão. Mas o espírito do leão diz: “Eu
quero”.
viii
“Tu deves” barra-lhe o caminho, lançando faíscas de ouro; animal de escamas,
em cada escama resplende, em letras de ouro, “Tu deves!”
Valores milenários resplendem nessas escamas; e assim fala o mais poderoso
de todos os dragões: “Todo o valor das coisas resplende em mim.
Todo o valor já foi criado e todo o valor criado sou eu. Na verdade, não deve
mais haver nenhum ‘Eu quero’!” Assim fala o dragão.
Meus irmãos, para que é preciso o leão, no espírito? Do que já não dá conta
suficiente o animal de carga, suportador e respeitador?
Criar novos valores - isso também o leão ainda não pode fazer; mas criar para
si a liberdade de novas criações - isso a pujança do leão pode fazer.
Conseguir o direito de criar novos valores - essa é a mais terrível conquista
para o espírito de suportação e de respeito. Constitui para ele, na verdade, um
ato de rapina e tarefa de animal rapinante.
Como o que há de mais sagrado amava ele, outrora, o “Tu deves”; e, agora, é
forçado a encontrar quimera e arbítrio até no que tinha de mais sagrado, a fim
de arrebatar a sua própria liberdade ao objeto desse amor: para um tal ato de
rapina, precisa-se do leão.
Mas dizei, meus irmãos, que poderá ainda fazer uma criança, que nem sequer
pôde o leão? Por que o rapace leão precisa ainda tornar-se criança?
Inocência, é a criança, e esquecimento; um novo começo, um jogo, uma roda
que gira por si mesma, um movimento inicial, um sagrado dizer “sim”.
Sim, meus irmãos, para o jogo da criança é preciso dizer um sagrado “sim”: o
espírito, agora, quer a sua vontade, aquele que está perdido para o mundo
conquista o seu mundo.
Nomeei-vos três metamorfoses do espírito: como o espírito tornou-se camelo e
o camelo, leão e o leão, por fim, criança.
Assim falou Zaratustra. E achava-se nesse tempo, na cidade chamada A Vaca
Pintalgada.
(NIETZSCHE, Friedrich. Assim Falou Zaratustra: Um livro para todos e para
ninguém. 9ª Edição, Rio de Janeiro: Bertrand Brasil, 1998, p. 43-45).
ix
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Ana Lúcia Marques Ventura pelos anos de paciência, convivência e
orientação no desenvolvimento deste trabalho. Muito Obrigado!
A minha namorada, pelo seu amor, paciência e dedicação. Paty, você me
ajudou muito em todos os meus objetivos, incluindo este trabalho.
Ao meu filho, pela inspiração e por ser a minha razão de viver. Caio! Quero
você sempre perto de mim!!!
Agradeço aos meus Pais e irmãos pelo apoio emocional, físico, econômico,
universal que vocês me ofereceram ao longo desta caminhada.
Agradecimento muito especial aos amigos de maior convívio: Guilherme, Isis,
Liana, Thayane, Erick e Roxana. A amizade, inteligência e alegria de vocês
contribuiu muito para minha maturidade cientifica e para o desenvolvimento
deste trabalho.
Aos queridos amigos do departamento, com os quais aprendi tanto: Pablo,
Wandison, Flávio, Patrícia, Caco, Alexandre, Renato, Camila, Priscila, Aline,
Mariana, Aninha... Um agradecimento especial aos professores Karin,
Elizabeth, Robertão, Cláudio, Paulinha e Chico pela decicação para ensinar
tudo que eu queria e precisava aprender.
A Maria Leite Eduardo pelo apoio técnico, eficiência e boa vontade que
contribuíram muito para o desenvolvimento deste trabalho.
A todos os professores do departamento de Neurobiologia pela amizade e boa
vontade em sempre oferecer ajuda durante os experimentos.
Ao professor Marco Vinícius Prado por sua boa vontade e competência técnica
na realização das imagens de imunofluorescência e a todos os alunos e
estagiários do laboratório de farmacologia da UFMG pela receptividade e ajuda
prática.
x
A professora Adriana Melibeu pela boa vontade e competência com que
revisou este trabalho.
xi
SUMÁRIO
Páginas
Sumario das Figuras xiv
Lista de Abreviaturas xvii
Resumo xx
Abstract xxi
1.INTRODUÇÃO .............................................................................................1
1.1.CAVÉOLAS....................................................................................................1
1.1.1. Definição e morfologia das cavéolas.........................................................1
1.1.2. Localização tecidual e celular das cavéolas..............................................3
1.1.3. Composição e propriedades bioquímicas das cavéolas............................3
1.2. CAVEOLINA................................................................................................4
1.2.1- DESCOBERTA DA CAVEOLINA-1: Definição de sua família de proteínas
e tipos celulares onde é encontrada...................................................................4
1.2.2 - Propriedades estruturais das caveolinas e sua relação com as
cavéolas...............................................................................................................7
1.2.3 - CAVÉOLAS COMO “SINALOSSOMAS”: Microorganelas de
compartimentalização da sinalização intracelular...............................................9
1.2.4 - CAVEOLINAS COMO MODULADORAS DA SINALIZAÇÃO: Inibidoras
genéricas de cinases.........................................................................................10
1.3 - Participação das cavéolas e caveolinas no desenvolvimento celular.......13
1.3.1- Participação das cavéolas e caveolinas na proliferação celular..............14
1.3.2 - Participação das caveolinas na diferenciação celular............................15
1.4 - Definições anatômicas, histológicas e citológicas da retina e sua
importância como modelo de estudo do sistema nervoso central.....................17
1.4.1 - Glia de Muller..........................................................................................20
1.5 - Proliferação celular durante o desenvolvimento do sistema nervoso e na
retina..................................................................................................................21
xii
1.6 - Papel de receptores para nucleotídeos durante a gênese da
retina..................................................................................................................24
1.7 - Glicocorticóides.........................................................................................27
1.7.1 - Mecanismo de ação genômico...............................................................28
1.7.2 - Mecanismo de ação não-genômico........................................................31
2- OBJETIVOS..................................................................................................32
2.1- Objetivos gerais..........................................................................................32
2.2 -Objetivos específicos..................................................................................33
3 - MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................35
3.1 - Obtenção de culturas complexas de retina de embrião de pinto...............35
3.2 -Obtenção das culturas purificadas de glia..................................................35
3.3 - Obtenção de culturas purificadas de neurônios........................................36
3.4 - Tratamento das culturas de retina com hidrocortisona ou PD 98059........36
3.5 - Visualização e quantificação da área das culturas recoberta por
células................................................................................................................36
3.6 - Western blotting.........................................................................................37
3.7 - Ensaio de Viabilidade Celular....................................................................38
3.8 - Incorporação de [
3
H]-timidina em culturas de células de retina..................38
3.9 - Determinação do acúmulo de [
3
H]-fosfoinositídeos...................................39
3.10 - Imunofluorescência para caveolina-1 e antígeno 2M6 em retinas de
pinto...................................................................................................................40
3.11 - Imunofluorescência para caveolina-1, antígeno 2M6, Brdu,
Neurofilamento-L em culturas de células de retina...........................................40
3.12 – Análise Estatística...................................................................................42
xiii
4- RESULTADOS..............................................................................................43
4.1 - Localização de caveolina–1 durante o desenvolvimento da retina...........43
4.2 - Localização e expressão de caveolina–1 durante o desenvolvimento de
culturas de células retinianas. ..........................................................................47
4.3 - Caveolina-1 como marcador de células gliais diferenciadas.....................55
4.4 - Efeito de hidrocortisona sobre a proliferação celular.................................61
4.5- Efeito da hidrocortisona na expressão de caveolina-1 em culturas de
retina..................................................................................................................75
5 - DISCUSSÃO................................................................................................89
6- CONCLUSÕES.............................................................................................94
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................97
xiv
SUMÁRIO DE FIGURAS
Figura 1: Seqüências de Microscopias eletrônicas demonstrando cavéolas em
diferentes tipos celulares.
Figura 2: Modelo esquemático de organização dos “rafts” de lipideos e das
caveolas na membrana plasmática
Figura 3: Modelo atual da topologia da caveolina-1 na membrana.
Figura 4: Modelo esquemático da interação entre o domínio “scaffolding” da
caveolina -1 (CDS) e os domínios ligantes de caveolina -11 (CBS) em
diferentes moléculas de sinalização.
Figura 5: Representação esquemática mostrando as diferentes camadas e
tipos celulares na retina.
Figura 6: Neurogênese na retina de pinto.
Figura 7: Diagrama esquemático ilustrando a liberação de ATP, seu
metabolismo e sua interação com sistemas de segundos mensageiros,
seguindo a ativação de receptores ionotrópicos (P2X) e metabotrópicos (P2Y).
Figura 8: Imunofluorescência para cav-1 em retinas intactas de embriões em
diversos estágios de desenvolvimento.
Figura 9: Imunorreatividade para cav-1 em retina de animais com 1 dia após a
eclosão (P1).
Figura 10: Expressão de caveolina-1 (cav-1) durante o desenvolvimento de
retinas embrionárias de pinto.
Figura 11: Imunofluorescência para cav-1 em culturas de retina em diversos
estágios de desenvolvimento.
Figura 12: Expressão de caveolina-1 (cav-1) durante o desenvolvimento de
culturas de células de retina.
Figura 13: Imunofluorescência para cav-1 e antígeno glial 2M6 em culturas de
células de retina.
Figura 14: Imunorreatividade para caveolina –1 e antígeno glial 2M6 em
culturas de células de retina em E8C7.
Figura 15: Imunofluorescência para caveolina-1 e Neurofilamento L em
culturas purificadas de Neurônios e Glia.
xv
Figura 16: Imunorreatividade para caveolina-1 e Brdu em culturas de retina de
E7C1 tratadas ou não com ATP.
Figura 17: Imunorreatividade para Cav-1 e BrdU em culturas de E8C8 tratadas
ou não com ATP.
Figura 18: Imunorreatividade para Cav-1 e BrdU em culturas que incorporaram
BrdU em E8C2.
Figura 19: Efeito de hidrocortisona sobre a proliferação celular induzida por
ATP durante o desenvolvimento das culturas de retina.
Figura 20: Efeito de concentrações crescentes de hidrocortisona sobre a
proliferação celular induzida por ATP em culturas de E8C1.
Figura 21: Efeito da retirada de Hidrocortisona sobre a morfologia das culturas
de células de retina.
Figura 22: Efeito de hidrocortisona sobre a área de confluência das culturas
em função do tempo de cultivo das células de retina.
Figura 23: Viabilidade celular de culturas após o tratamento com
concentrações crescentes de hidrocortisona.
Figura 24: Efeito da hidrocortisona sobre a fosforilação da ERK induzida por
ADP em culturas de E8C1 (a) ou E8C6 (b).
Figura 25: Efeito de 0.2mM de Hidrocortisona sobre a expressão e localização
de ERK-P durante o desenvolvimento “in vitro” de células retina de pinto.
Figura 26: Expressão de receptores purinérigicos P2Y1 em culturas de células
de retina em E8C1 e E8C8.
Figura 27: Efeito de PD 98059 sobre a expressão de caveolina-1 durante o
desenvolvimento de culturas de células de retina.
Figura 28: Efeito de hidrocortisona sobre a expressão de caveolina-1 durante o
desenvolvimento de culturas de células de retina.
Figura 29: Efeito de hidrocortisona sobre a imunorreatividade para cav-1 em
culturas de retina em diversos estágios de desenvolvimento.
Figura 30: Efeito do tratamento tardio com hidrocortisona sobre a expressão
de caveolina-1 em culturas de células de retina.
Figura 31: Efeito da retirada de Hidrocortisona sobre a proliferação induzida
por ATP em culturas de células de retina durante o desenvolvimento.
Figura 32: Proliferação celular induzida por ATP em culturas previamente
tratadas por tempos variáveis com hidrocortisona 0.2 mM.
xvi
Figura 33: Efeito de hidrocortisona sobre a incorporação de [H3]-timidina
induzida por ATP em diferentes períodos do desenvolvimento das culturas.
Figura 34: Efeito de concentrações crescentes de hidrocortisona sobre a
expressão de caveolina-1 em culturas de E8C4.
Figura 35: Efeito de Hidrocortisona sobre o acúmulo de fosfoinositídeos
induzido por ATP em culturas de E8C4.
Figura 36: Modelo representando o desenvolvimento de precursores da Glia de
Muller em culturas de retina.
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP : Adenosina trifosfato
ADP: Adenosina difosfato
AKAPs: proteínas ancoradoras de quinase-A
BDNF: fator neurotrófico derivado do cérebro
BRDU: Bromo-deoxi-uridina
Cav-1: Caveolina 1
Cav-2: Caveolina 2
Cav-3: Caveolina 3
CCG: Camada de células ganglionares
CBDs: Domínios ligantes de caveolina
CDK: Cinase dependente de ciclina
CNI: Camada nuclear interna
CNE: Camada nuclear externa
CMF: Solução salina balanceada de Hank’s livre de cálcio e magnésio
C-MAD: Domínio C-terminal de atracamento à membrana
CPE: Camada plexiforme externa
CPI: Camada plexiforme interna
CSD: Domínio “scaffolding” da caveolina
ERK: Proteína cinase ativada por sinal extracelular
E7: Sétimo dia de estágio de desenvolvimento embrionário
E7C1: Embriões de pinto sete dias cultivados por um dia
E8: Oitavo dia de estágio de desenvolvimento embrionário
E8C1: Embriões de pinto oito dias cultivados por um dia
E8C2: Embriões de pinto oito dias cultivados por dois dia
E9: Nono dia de estágio de desenvolvimento embrionário
FGFb: fator de crescimento fibroblastos básico
GDNF: fator neurotrófico derivado de células gliais
GLAST: Transportador de glutamato
GS: Glutamina sintetase
GR: Receptor de glicocorticóide
GRE: Elemento responsivo aos glicocorticóides
GRKs: Cinases ativadas por receptores acoplados a proteína G
xviii
GRm: receptores de glicocorticóides de membrana
GPCR: Receptores Acoplados a Proteína G
GTP: Guanosina trifosfato
HC: Hidrocortisona
IF: imunofluorescência
IP
3
: inositol trifosfato
IR: imunorreatividade
KDa: kilodalton
MAP cinase: Proteína cinase ativada por mitógenos
MEM: meio essencial mínimo
Neuro-L: Neurofilamento do tipo L
NMDA: N-Metil-D-Aspartato
N-MAD: Domínio N-terminal de atracamento à membrana
MTT: (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide: tetrazol)
NOS: Óxido Nítrico sintase
OD: Domínio de oligomerização
PAGE: Gel de poliacrilamida para eletroforese
PLC: Fosfolipase C
PBS: Salina tamponada com fosfato
PI3K/AKT: proteínas fosfatidilinositol 3’-quinase
PR: Receptores de progesterona
PKC: proteína cinase dependente de cálcio
PKA: Proteína cinase dependente de AMPc
P1: primeiro dia pós -natal
P2: segundo dia pós -natal
P2: receptores purinergicos 2
p30: trigésimo dia pós natal
Rb: Retinoblastoma
RNA: Ácido ribonucléico
RNAm: ácido ribonucléico mensageiro
RT-PCR: reação em cadeia da Polimerase- Transcriptase reversa
SH3: Domínio homólogo da Src
SNC: Sistema Nervoso Central
TBS: Salina tamponada com tris
xix
TD: Domínio terminal
TM: Domínio transmembrana
Tris: [hidroximetil] amino-metano
WB: Western blotting
UTP: uridina trifosfato
2M6: antígeno glial 2M6
xx
RESUMO
A Caveolina-1 (cav-1) forma as cavéolas e está envolvida com a regulação da
diferenciação e a proliferação celular. Neste trabalho, estudamos a expressão
de cav-1, bem como sua função durante o desenvolvimento da retina de pinto.
Ensaios de “western blotting” revelaram que a expressão de cav-1 em culturas
deste tecido foi bem reduzida no início do cultivo, aumentando a partir do 3
o
dia
(E8C3) atingindo níveis máximos em torno de E9C9. Este aumento também foi
observado durante desenvolvimento “in vivo” da retina. Ensaios de
imunofluorescência (IF) realizados em culturas mostraram a expressão de cav-
1 somente em células gliais positivas para o antígeno glial 2M6. Nenhuma IF
para cav-1 foi observada em células positivas para BrDU, assim como
nenhuma IF para BrDu foi observada em células positivas para cav-1 em
culturas de E8C8, sugerindo que a expressão de cav-1 só ocorra em células
gliais pós-mitóticas. Hidrocortisona (HC) foi capaz de inibir a proliferação de
progenitores gliais induzida por ATP em culturas de E8C1-2. Este hormônio
também foi capaz de inibir a ativação da ERK dependente de ADP em culturas
jovens (E8C1), mas não em culturas mais diferenciadas (E8C6). Já a
expressão de receptores P2Y1 foi observada apenas em culturas de E8C1,
mas não em culturas de E8C8, sugerindo que a expressão destes sítios possa
ser modulada durante o desenvolvimento. Por outro lado, a expressão de cav-1
foi inibida por PD 98059, um inibidor da via da ERK, sugerindo que a expressão
desta proteína seja dependente desta via de sinalização. A HC inibiu a
expressão de cav-1 em estágios iniciais de cultivo (E8C0-C4), mas não em
estágios mais diferenciados (E8C4-E8C8). Além disso, a retirada da
hidrocortisona após 72 horas de tratamento de culturas de estágios precoces
favoreceu a proliferação celular induzida por ATP em um período mais
avançado de cultivo (E8C4). Tendo em vista que a expressão de cav-1 foi
inibida por HC nesta condição, estes dados sugerem que a ausência desta
proteína mantenha os precursores gliais susceptíveis ao ATP, em um estado
proliferativo, em períodos pós-proliferativos do desenvolvimento.
xxi
ABSTRACT
Caveolin-1 (cav -1) forms the caveolae and is involved in the regulation of
cellular differentiation and proliferation. In this work, we studied the cav-1
expression, as well as its function during the development of the chick retina.
Experiments of "western blotting" revealed that cav-1 expression in retinal
cultures was very reduced in the beginning of the culture, increased after the
day 3 (E8C3) and attained maximal levels at E9C9. This increase was also
observed during the development "in vivo" of the retina. Immunofluorescence
(IF) for cav-1 was not observed in positive cells for BrDU in E8C1. In the same
way, no If for BrDU was found in cav-1 positive cells of E8C8, suggesting that
the cav-1 expression was just found in post- mitotic glial cells. Hydrocortisone
(HC) was capable of inhibiting the proliferation of glial progenitors induced by
ATP in cultures of E8C1-2. This hormone was also capable of inhibiting ADP-
dependent activation of ERK in young cultures (E8C1), but not in more
differentiated cultures (E8C6). Moreover, the expression of P2Y1 receptors was
only observed in cultures of E8C1, but not in cultures of E8C8, suggesting that
the expression of these receptors can be modulated during development. On
the other hand, cav-1 expression was inhibited by PD 98059, an ERK inhibitor,
suggesting that the expression of this protein is dependent on the activation of
this signalling pathway. HC inhibited cav-1 expression at initial stages of the
cultures (E8C0-C4), but not at more differentiated stages. Moreover, the
removal of HC after 72 hours of treatment of young cultures favored the cellular
proliferation induced by ATP in a more advanced period of the cultures (E8C4).
Once cav-1 expression was inhibited by HC in this condition, these data
suggest that the absence of this protein maintains the glial precursors
susceptible to ATP in proliferative state, in a post proliferation period of
development.
1
1- INTRODUÇÃO
1.1 - CAVÉOLAS
1.1.1 - Definição e morfologia das cavéolas
Em 1953, George Palade notou um grande número de pequenas
invaginações de membrana plasmática em células endoteliais, as quais
posteriormente Palade e Bruns (1968) chamaram de “vesículas plasmáticas”.
Em 1955, Yamada e colaboradores propuseram o termo cavéola (“pequenas
cavernas”) para descrever morfologicamente essas pequenas invaginações de
membrana presentes em células epiteliais de vesícula biliar. Atualmente, as
cavéolas são descritas como invaginações dispostas na forma de frasco ou de
“omega” , com tamanho médio de 70 nm e conectadas à membrana plasmática
por finas estruturas pedunculares (figura 1). O termo “vesículas lisas” ou
“vesículas sem revestimento” também é usado para discriminar as vesículas
recobertas de clatrina, proteína do citoesqueleto responsável pela endocitose
de receptores, das vesículas caveolares. Com as técnicas atuais, a morfologia
destas estruturas se mostra bem variada, uma vez que as vesículas caveolares
podem formar grupos que se assemelham a “cachos de uva” ou a “rosetas”.
Estes grupos podem estar tanto próximos à membrana quanto dispersos no
citoplasma. Ainda em virtude dessa plasticidade morfológica, as cavéolas
também podem formar estruturas tubulares alongadas ou canais transcelulares
que estão freqüentemente presentes em adipócitos e células endoteliais (para
revisão, Razani et al 2002). Considerando o conceito de fluidez da membrana
plasmática (Singer e Nicolson, 1972) e a idéia de dinamismo na morfologia das
cavéolas, se torna improvável que as cavéolas sejam apenas pequenas bolsas
estáticas presas à membrana plasmática, mas sim microorganelas capazes de
assumir diferentes formas. Tal fato se deve em parte pela agregação ou fusão
das vesiculas caveolares que pode dar origem à formação de morfologias
caveolares desconhecidas e diversas.
2
C
A
B
Gotículas de
lipídeos
C
A
B
Gotículas de
lipídeos
Figura 1: Seqüências de Microsgrafias eletrônicas demonstrando cavéolas
em diferentes tipos celulares. (A) e (B) Microscopia eletrônica (ME)
demostrando a ultraestrutura de membranas de células HeLa. Note a
imunorreatividade para caveolina -1 presente nas membranas celulares (setas)
(Thomsen et al, 2002). (C) ME de adipócito (mostrada à esqueda) e de células
endotelias (mostrada á direita). Observe a presença de rosetas caveolares nos
adipócitos e as invaginações caveolares associadas á membrana das células
endoteliais (Razani et al, 2002).
3
1.1.2 - Localização tecidual e celular das cavéolas
Em um nível ultraestrutural, a identificação de estruturas caveolares tem
ocorrido em numerosos tecidos. Uma leitura dos dados da literatura revela que
muitos tipos celulares apresentam poucas cavéolas enquanto outros
apresentam uma extraordinária abundância destas microorganelas. Neste
último grupo, estão as células endoteliais, os adipócitos, as células musculares
(estriada, cardiaca e lisa), os fibroblastos e os pneumócitos do tipo I (Palade,
1953; Napolitano, 1963; Mobley e Eisenberg, 1975; Gabella, 1976; Gil,1983).
Alguns estudos demonstraram que cerca de 70% da membrana plasmática de
células endoteliais e pneumócitos do tipo I são formados por cavéolas (Gil,
1983).
Entretanto, a literatura também lista tipos celulares que apresentam
carência de cavéolas e que, entre os mais estudados, estão neurônios e
linfócitos (Fra et al, 1994; Cameron et al, 1997). Entretanto, estudos recentes
questionam essas observações, uma vez que Elliott e colaboradores (2003)
evidenciaram a presença de caveolina-1(cav-1), um marcador clássico de
membranas caveolares, no segmento externo de fotoreceptores bovinos e do
mesmo modo, Harris e colaboradores (2002) utilizando análises de
imunofluorecência e “immunoblot” demonstraram a expressão das caveolinas
1, 2 e 3 em linfócitos bovinos. Essas evidências, em conjunto com outras
(Galbiati et al, 1998a; para revisão, Alonso e Millan, 2001; Bu et al, 2003),
acabaram por fragilizar o dogma da carência de estruturas caveolares em
células neuronais e do sistema imune.
1.1.3 - Composição e propriedades bioquímicas das cavéolas
Após os estudos clássicos realizados por Singer e Nicolson (1972) ficou
estabelecido na literatura o modelo do mosaico fluido para descrever a
natureza fisico-química da bicamada lipídica que forma a membrana plasmática
celular. Essa natureza confere à membrana um estado desordenado, onde os
fosfolipideos são capazes de realizar rapidamente difusões laterais.
Atualmente, aceita-se a existência de um estado líquido ordenado para a
4
membrana plasmática onde a bicamada lipídica se mostra mais rígida e os
movimentos dos fosfolipídeos mais restrito.
Hoje já se sabe que esses dois estados líquidos (ordenado e
desordenado) podem coexistir na membrana plásmatica. Todavia, esse estado
organizado da membrana tende a se estabelecer como formações insulares,
como “ilhas de lípideos” ou “rafts” que apresentam uma rigidez maior quando
comparada com a bicamada de fosfolipídeos circunvizinha. Esses “rafts” são
formados pela coalescência de moléculas de colesterol e de esfingolipídeos
(figura 2) (Brown e London, 1998; Simons e Toomre, 2000).
Tradicionalmente, as cavéolas são consideradas um tipo especializado
de “raft” ou ilha lipídica que se destaca primordialmente por sua forma
invaginante e/ou vesicular e pela presença de uma proteína chamada
caveolina. A composição incomum dos lípideos presentes nos “rafts” e
cavéolas confere a esses microdomínios de membrana uma resistência á
solubilização com detergentes aniônicos, tal como o triton X-100. Essa
propriedade fisico-química é usualmente explorada para o isolamento
experimental das cavéolas em vários tipos celulares (Brown e Rose, 1994;
Lisanti et al, 1994a). A técnica mais usual utilizada para a purificação e
caracterização de membranas de cavéolas/rafts é a ultracentrifugação em
gradientes de sacarose. Esse método utiliza tanto a resistência quanto a
densidade destes microdomínios para separá-los de outros constituintes
celulares (Lisanti et al, 1994b).
1.2 - CAVEOLINA
1.2.1 - DESCOBERTA DA CAVEOLINA-1: Definição de sua família de
proteínas e tipos celulares onde é encontrada.
A caveolina foi originalmente isolada no laboratório de John Glenney em
1989 como o principal substrato protéico fosforilado em resíduos tirosina (peso
molecular ≅ 21 kDa) de fibroblastos de galinha infectados com vírus do
Sarcoma de Rous. Já em 1992, Rothberg e colaboradores demonstraram
complementando os estudos de Glenney e Zokas (1989), através de
microscopia eletrônica que anticorpos produzidos contra uma proteína de
5
Figura 2: Modelo esquemático de organização dos “rafts” de lipideos e das
caveólas na membrana plasmática. (A) representa “rafts” de membrana em estado
ordenado enriquecidos em colesterol (amarelo) e esfingomielina (vermelho claro). (B)
representa a cavéola com aspecto invaginante e composta por caveolinas (rosa).
(Razani et al, 2002)
6
22kDa, que eles denominaram de caveolina, marcavam vesículas
(cavéolas) presentes na membrana plasmática de células endoteliais com um
aspecto puntacta. Além disso, estes pequisadores também observaram que os
anticorpos contra a caveolina promoviam uma série de marcações na forma de
anéis estriados e concêntricos nessas vesículas e constataram ser esta
proteína o principal constituinte dos sacos caveolares. Também observaram
que o tratamento destas membranas com agentes que se ligam ao colesterol
como nistatina ou filipina, promovia alterações profundas na morfologia das
cavéolas, uma vez que elas se tornavam mais achatadas e a proteína de 22-
kDa (caveolina) se dissociava das zonas das vesículas caveolares ricas em
estrias, promovendo uma espécie de desmanche estrutural. Após essas
observações, a caveolina se tornou o primeiro marcador bioquímico das
membranas caveolares (Rothberg et al, 1992).
Atualmente, a caveolina é descrita como pertencente a uma família de 4
proteínas: (a) caveolina-1 isoforma-1α (24 kDa com 178 aminoácidos) e
isoforma 1β (21 kDa com 147 aminoácidos), (b) caveolina-2 (cav-2) (20 KDa e
149 aminoácidos) e (c) caveolina-3 (cav-3) (17. 2 kDa com 151 aminoácidos).
Todos os três tipos de caveolina se apresentam como marcadores de cavéolas
e os tecidos ou células que apresentam a expressão tanto de caveolina-1
quanto de caveolina 2 e 3 são também abundantes em cavéolas. Desse modo,
muitos estudos evidenciam a presença abundante tanto de cav-1 quanto de
cav-2 em adipócitos, pneumócitos, células endoteliais e fibroblastos (Scherer et
al, 1996 e 1997). Entretanto, a expressão de cav-3 é limitada ás células
musculares (cardíacas, esqueléticas e lisas) (Way e Parton, 1996; para revisão,
Parton, 1996; Song et al, 1996; Tang et al,1996). A presença de cav-1 também
foi demonstrada em células do sistema nervoso, que incluem neurônios e
neuroglia (Galbiati et al,1998a; Bu et al, 2003; Ikezu et al, 1998), e linfócitos
(Harris et al, 2002).
Análises de imunocitoquimica mostraram a colocalização da cav-1 e cav-
2 com o transportador de glutamato (GLAST) e a glutamina sintetase (GS)
confirmando que esta proteína está presente nas células de Muller da retina de
rato (Ueda, 2002).
7
1.2.2 - Propriedades estruturais das caveolinas e sua relação com as
cavéolas
A caveolina é uma proteína integral de membrana e, atualmente, sua
topologia genérica é determinada pela estrutura da caveolina-1. Essa estrutura
pode ser dividida em cinco regiões: (1) domínio terminal (TD), (2) domínio C-
terminal de atracamento à membrana (C-MAD), (3) domínio transmembrana
(TM), (4) domínio N-terminal de atracamento à membrana (N-MAD) e (5)
domínio de oligomerização (OD) (figura 3). Esses 5 domínios proteicos da cav-
1 foram determinados por uma série de experimentos bioquímicos e
moleculares (para revisão, Razani et al, 2002). Essas descobertas geraram
subsídios que acabaram por definir algumas relações entre a estrutura e a
função das caveolinas no ambiente intracelular. Dentre essas funções
podemos citar a própria interação entre os diferentes tipos de caveolina e a
biogênese das cavéolas.
O domínio OD é conhecido por ser o principal elemento na estrutura das
caveolinas que favorece a formação de oligômeros entre essas proteínas (para
revisão, Razani et al, 2002). Esses oligômeros parecem ser a forma usual de
apresentação das caveolinas nas cavéolas e esses aglomerados protéicos
tendem a ser formados por 14 a 16 monômeros de caveolinas (Monier et al,
1995; Sargiacomo et al. 1995, Li et al, 1996). Esses mesmos estudos, em
conjunto com outros, demonstram que somente as cav-1 e cav-3 podem formar
homo-oligômeros, ou seja, aglomerados protéicos contendo apenas cav-1 ou
cav-3.
Nesse mesmo contexto, a cav-2 só existe na forma monomérica ou
homo-dimérica. Entretanto a cav-1 parece ser capaz de recrutar e formar
hetero-oligômeros com a cav-2 (Li et al, 1998) e essas duas proteínas são co-
localizadas em complexos protéicos presentes em domínios caveolares e em
outras membranas celulares internas (Mora et al,1999).
8
Figura 3: Modelo atual da topologia da caveolina-1 na membrana. Em vermelho,
está destacado o domínio transmembrana hidrofóbico (TM) responsável pela
penetração da cav-1 na membrana. Em azul e verde, estão representados,
respectivamente, o domínio N-terminal de atracamento á membrana (N-MAD) e o
domínio C-Terminal de atracamento á membrana (C-MAD) que desempenham um
papel de auxílio na inserção de cav-1 na membrana. Em marrom, está destacado o
domínio de oligomerização (OD) que é responsável, em conjunto com o N-MAD, pela
associação de diversos monomêros de cav-1 nos “rafts” lipídicos. Em lilás, está
destacado do domínio terminal (TD) responsável pela interação lateral entre os
diferentes oligomêros de cav-1. O sitios de palmitoilação (Cy 133, 143 e 156) estão
demonstrados em azul claro (Razani et al, 2002).
9
A tendência das caveolinas em formar complexos proteicos de alto peso
molecular (~350 a 400 kDa) (Monier et al, 1995; Sargiacomo et al. 1995)
parece contribuir para a biogênese das cavéolas. Estudos que promoveram a
deleção do domínio TD e C-MAD da cav-1 provocaram inibição nas interações
entre os oligômeros formados por essas proteínas (Song et al, 1997; Schlegel e
Lisanti, 2000). Baseados nessas evidências, Razani e colaboradores (para
revisão, 2002) propuseram que a interação entre os diferentes oligômeros de
caveolina tende a envolver e confinar pequenas porções da membrana
plasmática, conferindo desse modo, o formato invaginante característico das
cavéolas.
Do mesmo modo, experimentos que provocaram a superexpressão de
cav-1 em células deficientes em estruturas caveolares (linfócitos e fibroblastos
transformados) resultaram na produção de novas vesículas e invaginações de
membrana compatíveis com a forma das cavéolas nessas células (Fra et al,
1995b; Engelman et al, 1997; Li et al, 1998). Esta evidência, em conjunto com
outras que mostram a diminuição das cavéolas concomitante ao declínio de
expressão de cav-1 (Galbiati et al, 1998, Liu et al, 2001), demonstram
claramente a ligação entre a expressão de cav-1 e a formação de cavéolas.
1.2.3 - CAVÉOLAS COMO “SINALOSSOMAS”: Microorganelas de
compartimentalização da sinalização intracelular.
Apesar da sua presença majoritária na constituição da estrutura caveolar, a
caveolina-1 não é a única proteína responsável pela integridade estrutural das
cavéolas, uma vez que vários estudos evidenciaram a presença de outras
proteínas residentes nesse ambiente caveolar (Razani et al, 2002). Tal fato
levantou a idéia de que as cavéolas podem funcionar como plataformas que
promovem tanto a agregação quanto a concentração de várias proteínas em
um determinado local subcelular. Esta idéia foi inicialmente considerada, após
as observações feitas por Sargiacomo (1993), por Lisanti (1994) e seus
respectivos colaboradores que utilizaram a insolubilidade das cavéolas em
meio contendo detergentes para separar bioquimicamente as membranas
10
caveolares do conjunto celular e posteriormente determinar a identidade das
proteínas presentes nessas membranas.
Desse modo, o estado heterogêneo das cavéolas em relação ao seu
conteúdo proteico, em conjunto com outras considerações feitas por Lisanti e
colaboradores em meados de 1994, acabou por estabelecer a hipótese da
sinalização mediada por cavéolas e “rafts” que postula a compartimentalização
de diferentes moléculas sinalizadoras da célula para o ambiente caveolar. Esse
fenômeno acaba por favorecer uma aproximação física entre moléculas
sinalizadoras com diferentes mecanismos de regulação e permite que a
comunicação entre vias de sinalização distintas seja fisicamente estabelecida.
1.2.4 - CAVEOLINAS COMO MODULADORAS DA SINALIZAÇÃO:
Inibidoras genéricas de cinases.
Atualmente, os estudos que investigam a caveolina não se resumem
apenas em análises que envolvem seu isolamento e localização. A relevância
funcional dessa proteína está cada vez mais presente nos processos de
sinalização intracelular, particularmente, devido á sua característica típica de
ser uma proteína recrutadora ou “scaffolding”. Na literatura, a definição dada
para esse tipo de proteína foi bem descrita por Pawson e Scott (1997) que
associaram o termo “scaffolding” á capacidade de ação de uma proteína em
promover a restrição, organização ou/e regulação da distribuição subcelular de
outras moléculas de sinalização. Por exemplo, as proteínas que assumiram
classicamente essa alcunha são as AKAPs (proteínas ancoradoras de quinase-
A), conhecidas por determinar tanto a localização quanto a ativação da
proteína quinase A em diferentes compartimentos celulares e assim evitar a
ativação promíscua e desordenada desta cinase (College e Scott, 1999).
Nesse contexto, vários estudos reúnem evidências que apontam a
caveolina como uma potente e importante proteína “scaffolding”, já que esta
proteína demonstra possuir a capacidade de interagir e modular a atividade das
diferentes moléculas sinalizadoras presentes no microambiente caveolar. A
primeira evidência desse fato foi obtida em estudos “in vitro”, onde um peptídeo
de 20 aminoácidos derivado da caveolina-1 (resíduos 82-101) promoveu uma
11
inibição potente da atividade GTPase de proteínas G heterotriméricas ( Li et al,
1995).
Estudos subsequentes demonstraram a seletividade dessa região da
cav-1 em se ligar e modular a atividade de diferentes proteínas sinalizadoras,
tais como a H-Ras, as tirosinas quinases da família da Src, algumas isoformas
da proteína quinase C, o receptor de EGF e a NOS endotelial (Engelman et al,
1998b, Okamoto et al, 1998, Smart et al, 1999). Desse modo, esta pequena
região regulatória da caveolina tem sido conhecida como domínio “scaffolding”
da caveolina (CSD) (figura 4).
Observações feitas por Couet e colaboradores (1997) apontaram uma
característica importante do CSD presente na caveolina. Nestes estudos, a
presença de três aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr ou Trp) era sempre
observada intercalada com um, dois ou três outros aminoácidos, sugerindo a
existência de uma região delimitada de natureza hidrofóbica próxima ao centro
da proteína caveolina-1. O conhecimento da seqüência primária do domínio
CSD da caveolina-1 em conjunto com a análise da seqüência de aminoácidos
de várias proteínas sinalizadoras possibilitou a identificação de regiões
presentes nestas proteínas que podiam ser sítios de interação direta com a
caveolina-1. Esse fato acabou por sugerir a existência dos “domínios ligantes
de caveolina” ou “caveolin binding domains” (CBDs) em proteínas sinalizadoras
(Figura 4).
Entretanto, estudos posteriores constataram que a presença do CBD em
uma proteína sinalizadora não é o critério exclusivo para permitir sua interação
com a caveolina-1 (Garica-Cardena et al, 1997; Carman et al, 1999; Nystrom et
al, 1999). Isto porque a disponibilização ou solubilização tanto do CBD,
presentes em diferentes proteínas sinalizadoras como o receptor de insulina, a
NOS endotelial e as GRKs, quanto do CSD, presente na caveolina-1, parece
ser necessária para que ocorra a interação entres esses domínios. Couet e
colaboradores (1997) sugerem que a interação entre os sítios CBD e CDS
possa ocorrer pela justaposição linear dos mesmos que acaba por favorecer
interações hidrofóbicas entre ambos.
12
Figura 4: Modelo esquemático da interação entre o domínio “scaffolding” da
caveolina -1 (CDS) e os domínios ligantes de caveolina -11 (CBS) em diferentes
moléculas de sinalização. Note a sequência do sítio CDS da caveolina-1 e os sítios
CDBs da subunidade α da proteína G (Gi2α), óxido nítrico sintase endotelial (eNOS),
proteínas tirosina cinases da família das Src, receptores tirosina cinases (EGF-R) e
isoformas da proteína cinase C (PKCα). Em muitos casos a interação da caveolina-1
se mostrou inibitória promovendo, desse modo, inativação das moléculas de
sinalização e modulação de cascatas de transdução de sinal (Razani et al, 2002)
13
Estudos adicionais acabaram por evidenciar que a capacidade de
ligação da caveolina-1 em diferentes proteínas via o domínio CDS promove a
inibição da sinalização intracelular tanto em experimentos bioquímicos quanto
em experimentos com culturas de células, o que acabou por conferir às
proteínas da família da caveolina a denominação de “inibidoras genéricas de
cinases” (para revisão, Razani et al, 2002) (figura 4). No caso das proteínas
tirosinas e serinas/treoninas cinases, tal interação funcional favorece o
desenho de novas estratégias para o tratamento de diversos fenômenos
patológicos, que vão desde processos degenerativos a distúrbios proliferativos.
Em quase todas as cinases dessas classes, os sítios de ligação da caveolina-1
estão localizados dentro de seus domínios catalíticos (Couet et al, 1997). Foi
demonstrado que a construção de peptídeos sintéticos correspondentes ao
domínio CDS da cavolina-1 eram capazes de inibir a atividade cinase destas
enzimas “in vitro”, o que levanta a possibilidade de utilização desses peptídeos
no tratamento de neoplasias, por exemplo.
1.3 - PARTICIPAÇÃO DAS CAVÉOLAS E CAVEOLINAS NO
DESENVOLVIMENTO CELULAR.
Nos últimos 10 anos, um grande número de estudos com o propósito de
investigar a participação das cavéolas e caveolinas na fisiologia celular tem
tentado explicar o papel destes elementos em diferentes processos celulares
que vão desde o controle do tráfego de colesterol e mecanismos de transdução
de sinal à regulação do desenvolvimento celular (para revisão, Razani et al
2002).
No tocante ao desenvolvimento celular, tem sido necessário considerar
as implicações funcionais do binômio cavéolas/cavolinas nos processos que
envolvem proliferação, diferenciação, migração e morte celular. No entanto,
para objetivar essa revisão, vamos expor abaixo os possíveis papéis das
caveolinas apenas nos processos de proliferação e diferenciação dos
diferentes tipos celulares estudados até o momento, incluindo as células
neuronais.
14
1.3.1 - Participação das cavéolas e caveolinas na proliferação celular
Com base em várias evidências, elaboradas tanto “in vitro” quanto “in
vivo”, pode-se dizer que a caveolina-1 tem uma ação inibitória em vias de
sinalização pró-mitóticas em diferentes tipos celulares (Couet et al, 1997;
Engelman et al, 1998 a, Galbiati et al, 1998b; Scheel et al, 1999, Cohen et al,
2003).
No estudo realizado por Galbiati e colaboradores (1998b) ficou
evidenciado que a diminuição da expressão de cav-1 era suficiente para
promover a hiperativação da via das MAP cinases p42/p44 em células NIH
3T3. Essa diminuição também determinava um aumento significativo na
proliferação destas células. Portanto, o aumento de expressão de cav-1 nessas
células promovia uma inibição da ativação dessas enzimas e um aumento na
inibição de contato observada entre essas células.
Estudos de Cohen e colaboradores (2003) demonstraram que a
atividade das MAP cinases p42/p44 também era aumentada em fibroblastos
cardíacos de camundongos deficientes em cav-1. Essa observação era
acompanhada de uma hipertrofia do tecido cardíaco destes animais com altos
níveis de fibrose intersticial e perivascular, sugerindo um aumento pronunciado
na proliferação de fibroblastos cardíacos na ausência de cav-1.
Já Park e colaboradores (2002), utilizando esses mesmo camundongos
deficientes em cav-1, observaram que a prolactina induzia uma hiperativação
da via JAK-2/STAT5a em células do epitélio mamário. Esse fenômeno era
acompanhado de uma hiperplasia dessas células epitéliais, sugerindo uma
importante participação da cav-1 no controle negativo da proliferação induzida
por hormônios e citocinas nessas células.
Do mesmo modo, a análise do desenvolvimento em culturas de
fibroblastos embrionários, provenientes de camundongos deficientes para cav-
1 revelou uma maior atividade do ciclo celular nessas células quanto
comparada com células de animais controle. Logo, na ausência de cav-1, o
número de fibroblastos na fase S estava aumentado em aproximadamente 30
% quando comparado com fibroblastos de camundongos selvagens. Do
mesmo modo, após 10 dias de cultivo a densidade celular dessas culturas foi
cerca de 3 vezes maior do que a das culturas controle (Razani et al, 2001).
15
Esses dados sugerem que a cav-1 seja uma peça importante na regulação
negativa do ciclo celular de fibroblastos de embriões de camundongos em
desenvolvimento.
1.3.2 - Participação das caveolinas na diferenciação celular
Vários estudos demonstram aumentos significativos na expressão das
três isoformas de caveolina (cav-1, 2 e 3) em células diferenciadas (Parton et
al, 1997; Holinns et al, 2002; para revisão, Razani et al, 2002). Tal fato, em
conjunto com evidências que apontam uma ação inibitória das caveolinas na
proliferação celular (Koleske et al, 1995; Engelman et al, 1997; Galbiati et al,
1998b; Park et al, 2002; Sunaga et al, 2004), acaba por conferir a essas
proteínas a alcunha de marcadores da diferenciação celular.
Nesse contexto, os estudos de Parton e colaboradores (1997)
demonstraram que a cav-3 está associada ao desenvolvimento e à
diferenciação de miócitos esqueléticos de camundongos. Nestes estudos foi
mostrado que a cav-3 é associada a estruturas celulares normalmente
observadas em miócitos completamente diferenciados, tais como os túbulos T.
Estes dados estão de acordo com os estudos realizados por Shin e
colaboradores (2003) que demonstraram uma imunoreatividade intensa para
cav-3 em miótomos, estruturas embrionárias precursoras dos músculos
presente em embriões de pinto de 4 dias de incubação.
Estudos realizados por Fuchs e colaboradores (2003) demonstraram,
através de diferentes metodologias experimentais (citometria de fluxo,
imunofluorêscencia, “immunoblotting” e RT-PCR), um aumento progressivo na
expressão de cav-1 em células alveolares humanas do tipo II após vários dias
de cultivo. Esse aumento era concomitante com a diminuição na expressão da
proteína surfactante-C caracteristicamente produzida nos estágios iniciais do
cultivo dessas células. Estes autores também observaram, ao longo do tempo
de cultivo, mudanças morfológicas que culminavam na formação e
diferenciação de uma monocamada epitelial contendo tanto células alveolares
do tipo II quanto do tipo I. Surpreendentemente, essa monocamada se mostrou
semelhante ao epitélio alveolar nativo. Desse modo, estes dados sugerem que
16
a cav-1 pode desempenhar um papel relevante na diferenciação celular e
tecidual do epitélio pulmonar humano “in vitro”.
Recentemente, alguns estudos evidenciam a participação das
caveolinas na diferenciação tanto do tecido nervoso periférico quanto central
(SNC) (Mikol et al, 2002, Petralia et al, 2003; Shin et al, 2003).
Os trabalhos realizados por Mikol e colaboradores (2002) mostravam
que a expressão de cav-1 era baixa nas membranas de células de Schwann
presentes no nervo ciático de ratos em sua primeira semana pós-natal. Outro
fato também observado nesses animais jovens era a baixa mielinização da
membrana plasmática dessas células gliais. Entretanto, esse perfil era distinto
em animais com 1 mês de idade (p30), uma vez que tanto a mielinização
quanto a expressão de cav-1 nas células de Schwann se mostravam altas.
Todavia, após a axotomia do nervo ciático desses ratos adultos (p30) a
expressão de cav-1 diminuía e as células de Schwann adquiriam um fenótipo
pré-mielinização. Estes resultados sugerem um importante papel da cav-1 no
desenvolvimento “in vivo” de células gliais componentes do sistema nervoso
periférico.
Dentro do sistema nervoso central a participação da caveolina nos
processos de diferenciação celular é exemplificada pelos estudos realizados
por Shin e colaboradores (2003) que analisaram o padrão de expressão da
cav-3 ao longo do desenvolvimento do cérebro de embriões de pinto. Nesses
estudos, foi observado que a intensidade da imunorreatividade (IR) para cav-3
no cérebro aumentava progressivamente entre o 4
o
(E4) e o 11
o
(E11) dia de
desenvolvimento embrionário. Essa IR para cav-3 era marcante em células da
glia radial em E8 e, em estágios mais posteriores do desenvolvimento (E11),
esta marcação era notada em alguns tipos de neurônios presentes no
parênquima do cerebelo.
Estes dados estão de acordo com os estudos recentes realizados por
Pedralia e colaboradores (2003) que demonstraram uma baixa expressão de
caveolina-1 em neurônios do hipocampo de ratos com 1 ou 2 dias pós-natal e
uma alta expressão desta proteína em animais adultos com mais de 5 meses
de idade. O aumento na expressão de cav-1 foi acompanhado por um
amadurecimento da função sináptica desses neurônios, uma vez que a cav-1
era concentrada somente em terminais pós-sinápticos e associada a
17
receptores glutamatérgicos. Esses dados, em conjunto, sugerem que as
caveolinas participem da diferenciação tanto de neurônios quanto de células
gliais no sistema nervoso central.
1.4 - DEFINIÇÃO ANATÔMICA, HISTOLÓGICA E CITOLÓGICA DA RETINA
E SUA IMPORTÂNCIA COMO MODELO DE ESTUDO DO SISTEMA
NERVOSO CENTRAL.
A retina (figura 5) é uma delgada lâmina de tecido nervoso, conectada
ao cérebro e localizada na região posterior do olho. Esse tecido é especializado
em promover a conversão da energia luminosa refletida pelo ambiente em
sinais químicos e elétricos neurais e, assim, permitir que esses sinais sejam
processados e interpretados pelo cérebro. A retina tem sido muito utilizada
como modelo experimental para o estudo do desenvolvimento e das
comunicações químicas entre as células nervosas.
A retina se destaca por ser um tecido nervoso de fácil acesso podendo
ser obtido durante quase todo o período de desenvolvimento embrionário. Além
disso, seus tipos celulares expressam quase todos os sistemas de
neurotransmissores e neuromoduladores que estão presentes em diversas
áreas cerebrais. Esse tecido também apresenta a característica peculiar de
apresentar seus circuitos sinápticos restritos ao próprio tecido, facilitando um
estudo isolado, principalmente através de culturas primárias de células.
Histologicamente, sete tipos celulares foram descritos na retina:
fotorreceptores, células bipolares, ganglionares, amácrinas, horizontais e as
células de Müller. As únicas células sensibilizadas pela luz são os
fotorreceptores, que são os cones e os bastonetes. Os cones são responsáveis
pela detecção de luminosidade mais intensa e, na maioria das espécies,
contém pigmentos específicos que conferem a estas espécies a capacidade de
visão colorida (para revisão, Cohen, 1972). A detecção visual em ambiente de
pouca luminosidade deve-se aos bastonetes. A transdução do sinal luminoso
para sinais eletroquímicos se inicia quando fótons de luz atingem os pigmentos
presentes nessas células que mudam de conformação e ativam uma proteína
G denominada transducina que, por sua vez, ativa a fosfodisterase visual que
induz a degradação do GMPc que leva ao fechamento de canais de Sódio
18
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CFO
MLI
SEF
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CFO
MLI
CNE
CPE
CNI
CPI
CCG
CFO
MLI
SEF
A
B
Figura 5: (A) Representação esquemática
mostrando as diferentes camadas e tipos
celulares na retina. SEF:segmento externo dos
fotorreceptores, CNE:camada nuclear externa,
CPE:camada plexiforme externa, CNI:camada
nuclear interna, CPI:camada plexiforme interna,
CCG:camada de células ganglionares,
CFO:camada de fibras óticas, MLI: membrana
limitante interna.(publish.uwo.ca/jkiernan/retina.jpg)
(B) Desenho esquemático mostrando a inserção
histológica da glia de Muller no tecido retiniano de
mamíferos. M = célula de Muller, que está
marcada na cor azul, EF= pés da célula de Muller,
MV=microvilosidade da célula de Muller, A=célula
amácrina, B= célula bipolar, H=célula horizontal,
R= bastonetes, C= cones, G=células ganglionares
e CAP= vasos capilares. Retirado de Newman e
Reichenbach, 1996.
19
dependentes de GMPc na membrana e a conseqüente hiperpolarização da
célula fotorreceptora. É no segmento externo de fotorreceptores que ocorre a
transdução do sinal luminoso em sinalização neural que passa a ser
transmitida para as células bipolares, sofrendo múltiplas regulações ao longo
do percurso pelas células Horizontais, amácrinas e da glia de Müller no interior
da retina, chegando até as células ganglionares. A integração e processamento
da informação visual na retina ocorrem na circuitaria sináptica presente nas
regiões plexiformes do tecido, onde variações morfológicas e eletrofisiológicas
de contatos sinápticos são abundantes e complexas (para revisão, Shepherd,
1972; Stell, 1972).
As sinapses intra-retinianas mais externas são estabelecidas entre os
fotorreceptores e as células bipolares na camada plexiforme externa. Nesta
região, as células horizontais também se comunicam através de sinapses com
as células bipolares e fotorreceptores. Mais internamente encontra-se as
células amácrinas localizadas na camada nuclear interna. Estas células são os
neurônios retinianos que apresentam a maior diversidade morfológica e
neuroquímica e por isso são as células mais bem estudadas (para revisão,
Morgan e Chubb, 1991; Macneil e Masland, 1998). As células amácrinas
recebem aferências de células bipolares e de células amácrinas vizinhas,
passando informações tanto para outras amácrinas quanto para células
ganglionares na camada plexiforme interna. As células ganglionares, em
conjunto com células amácrinas deslocadas, formam a camada de células
ganglionares. As células ganglionares são os neurônios retinianos que enviam
a informação visual processada na retina para os centros cerebrais da visão.
Esse encaminhamento é feito através dos seus axônios que, em conjunto,
formam o nervo óptico.
1.4.1 - Glia de Müller
A glia de Müller consiste no principal elemento glial na retina de
vertebrados, compreendendo 90% das células gliais retinianas (figura 5B).
Além disso, existem mais 2 tipos de células gliais retinianas que são
representadas pelos astrócitos e microglia. As células de Müller apresentam
uma orientação transversal, percorrendo toda a espessura do tecido retiniano e
20
se extendendo da membrana limitante interna até a externa, seus corpos
celulares estão localizados na camada nuclear interna e seus processos
laterais se expandem para dentro das camadas plexiformes do tecido retiniano
(Robinson e Dreher, 1990). A glia de Müller parece estar associada tanto á
presença quanto a distribuição dos vasos sanguíneos na retina, formando o
principal suporte de sobrevida celular dos neurônios retinianos, principalmente
em retinas avascularizadas, como as das aves.
As células de Müller são o último tipo celular a sofrer diferenciação na
retina de vertebrados (Prada et al, 1991). Estudos recentes demonstraram que
a glia de Müller pode ser preponderante na regeneração neuronal da retina de
galinha, uma vez que após a injeção intraocular de NMDA, agente que induz
morte de neurônios, essas células foram capazes de se transformar em
diferentes tipos neuronais (Fisher and Reh, 2001).
Muitos estudos demonstram que a glia de Muller podem responder ou
liberar diferentes sinalizadores no tecido retiniano (Para revisão Reis et al,
2007). Entre estes sinais quimicos, podemos destacar neurotrofinas como fator
de crescimento de fibroblastos básico (FGFb), fator neurotrófico derivado de
células gliais (GDNF) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) que
parecem ser liberados pela glia de Muller, durante uma intricada interação com
a microglia, após a degeneração de fotoreceptores induzida pela intensa e
prolongada exposição a luz (Harada et al, 2002). Também há
neurotransmissores clássicos como aceticolina e glutamato presentes na glia
de Müller (Lam, 1976). Estes estudos reforçam a participação ativa da Glia de
Muller na sinalização química da retina. Nesse estudo, damos ênfase á
sinalização do ATP associada a essas células.
O ATP pode ser liberado no tecido retiniano através de vários estímulos
que vão desde luminosidade passando pela despolarização induzida por KCl
ou agonistas glutamatérgicos (Newman, 2005; Perez et al, 1986 e Santos et al,
1999). O ATP também pode ser liberado pelo epitélio pigmentado (Pearson et
al, 2005) ou pela glia de Muller através de ondas transitórias de Cálcio
induzidas na retina (Newman,2001). A glia de Muller responde ao ATP na
retina utilizando vários subtipos de receptores P2. Já foram identificados nestas
células o RNAm para os receptores P2Y1, P2Y2, P2Y3, P2Y4, P2Y6 (Fries et
21
al, 2005), além dos receptores P2X3, P2X4, P2X5 e P2X7 (Jabs et al, 2000,
Pannicke et al ,2000).
1.5 - PROLIFERAÇÃO CELULAR DURANTE O DESENVOLVIMENTO DO
SISTEMA NERVOSO E NA RETINA
A retina é um modelo experimental adequado para o estudo do
desenvolvimento do sistema nervoso servindo de exemplo para o que ocorre
no desenvolvimento do córtex. As células progenitoras da retina apresentam o
fenômeno de migração nuclear intercinética durante o ciclo celular. Durante a
fase G1, os núcleos das células se deslocam da zona ventricular, localizada em
uma região imediatamente adjacente ao epitélio pigmentar, para a camada
ganglionar prospectiva, onde ocorre a fase S. Após a duplicação do DNA, os
núcleos retornam à “zona ventricular”, onde ocorre a fase M (mitose). Durante
este período, a célula mantém contato com ambas as extremidades da retina
através de processos citoplasmáticos, os quais são retraídos na transição de
G2 para M. (Pearson et al., 2002). No embrião de galinha, espécie cujo
desenvolvimento embrionário dura 21 dias, a formação do cálice óptico ocorre
entre E2 e E3. A neurogênese inicia-se na área dorsotemporal da retina
central, próximo ao nervo óptico. A ordem de nascimento dos diversos tipos
celulares é a mesma das outras espécies (para revisão ver Donovan and Dyer,
2005). Considera-se que o dia de nascimento corresponde à última fase S da
célula, determinado a partir de experimentos que submetem a retina ao
tratamento com pulsos de [
3
H]-Timidina nas diferentes fases do
desenvolvimento. Na retina de embrião de pinto, estes experimentos
mostraram que neuroblastos de células ganglionares são os primeiros a sair do
ciclo celular, a partir de E2 e principalmente entre E5 e E7. Neuroblastos de
fotorreceptores começam a sair do ciclo celular a partir de E4, sendo sua
geração prolongada até E7 ou até períodos posteriores na retina periférica.
Grande parte dos progenitores que irão gerar células amácrinas ou horizontais
sai do ciclo entre E6 e E7. As primeiras células de Muller começam a nascer
em E4, sendo seu maior nível de produção em E8. As últimas células a saírem
do ciclo são as bipolares, sendo as primeiras em E5 e as últimas entre E12 e
E13 (Prada et al., 1991) (figuras 6A e B). Este padrão de formação das
22
Photorecep
tor
E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
Photorecep
tor
E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
Photorecep
tor
Photorecep
tor
Photorecep
tor
E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
E2 E4E3 E5 E7E6E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
A
B
C
E6
D
V
D
V
D
V
D
V
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células de Müller
Células Bipolares
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
E6
D
V
D
V
D
V
D
V
Células de Müller
Células Bipolares
Células de Müller
E6E6
D
V
D
V
D
V
D
V
D
V
D
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D
V
D
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D
V
D
V
D
V
D
V
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
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E7
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E9 E12 E14E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
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E9 E12 E14
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células de Müller
Células Bipolares
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
C
Photorecep
tor
E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
Photorecep
tor
E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
Photorecep
tor
Photorecep
tor
Photorecep
tor
E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
E2 E4E3 E5 E7E6E2 E4E3 E5 E7E6
E8 E10E9 E11 E13E12
E
1
A
B
C
E6
D
V
D
V
D
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D
V
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
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E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células de Müller
Células Bipolares
E6
D
V
D
V
D
V
D
V
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
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E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células de Müller
E6
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V
D
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D
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D
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Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
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E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
E6
D
V
D
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D
V
D
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D
V
D
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D
V
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
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E7
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E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
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E9 E12 E14E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células de Müller
Células Bipolares
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
E6
D
V
D
V
D
V
D
V
D
V
D
V
D
V
D
V
Células de Müller
Células Bipolares
Células de Müller
E6E6
D
V
D
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D
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D
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D
V
D
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D
V
D
V
D
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D
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D
V
D
V
D
V
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Idade Embrionária
E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14E13E11
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
E10
E2 E3
E4
E5
E7
E8
E9 E12 E14
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células Ganglionares
Células Horizontais
Fotorreceptores
Células Amácrinas
Células de Müller
Células Bipolares
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
Proliferação via P2Y2
Proliferação via P2Y1
C
Figura 6: Neurogênese na retina de pinto. A: Períodos de nascimento dos diversos
tipos celulares da retina de acordo com Prada et al., 1991. As regiões em destaque
correspondem a períodos nos quais ATP induz proliferação via receptores P2Y2 (rosa)
ou P2Y1 (azul); B: Curvas de nascimento dos vários tipos celulares da retina. Note que
os picos de geração de células ganglionares, horizontais, amácrinas e de cones ocorre
no período em que ATP induz proliferação via receptores P2Y2 (em rosa). Por outro
lado, células bipolares e de Muller, apresentam maior taxa de nascimento no período em
que ATP induz a proliferação via receptores P2Y1 (em azul); C: Modelo proposto por
Cepko et al., 1996 para descrever a variação da competência dos progenitores da retina
ao longo do desenvolvimento. Em vez de uma perda gradual de competência, como a
observada para os progenitores do córtex cerebral, os progenitores da retina se
moveriam através de estados discretos, sem poderem voltar ao estado anterior.
23
camadas de células retinianas é diferente do descrito para o córtex (Para
revisão ver Cepko et al., 1996), no qual as camadas vão sendo formadas de
dentro (próximo à zona ventricular) para fora. Na retina, as camadas limítrofes,
compostas por células ganglionares e fotorreceptores, já são encontradas em
estágios precoces do desenvolvimento, sendo a porção mais central do tecido,
composta por células bipolares e de Muller, formada por último.
A produção de células pelos progenitores do SNC e a determinação de
seus destinos é regulada por fatores intrínsicos (relógios internos) e extrínsicos
(sinalização extracelular).
Os progenitores do córtex sofrem 11 divisões celulares ao longo do
desenvolvimento, ocorrendo uma alteração gradual de “divisão proliferativa”
para “divisão neurogênica” (Takahashi et al., 1995). Coincidente com esta
conversão é a diminuição na proporção de células que sofrem mitose simétrica
(que expande o conjunto de progenitores) e um aumento na população de
células que sofrem mitose assimétrica (que gera células pós-mitóticas). Em
cada ciclo, a célula perderia os fatores intrínsicos necessários para mantê-la no
estado indiferenciado, sendo a ocorrência de diferenciação uma conseqüência
do número de ciclos celulares apresentado pelo progenitor e não da idade, em
dias, da célula (Estivil-Torrus et al., 2002; Morrow et al, 2001). Por outro lado,
células progenitoras também poderiam responder a diversos fatores presentes
no meio extracelular. Estes sinais poderiam conferir competência ao progenitor
multipotente, comprometendo-o com a diferenciação em um determinado tipo
celular (instrução) ou induzindo a sobrevivência de uma população já
comprometida de progenitores (seleção) (Morrow et al, 2001). Já para retina, o
modelo atualmente aceito é o proposto por Cepko et al. (1996). Neste modelo,
os progenitores seriam multipotentes e se moveriam através de estados
discretos, sendo estes estados definidos como a competência de responder a
pistas ambientais e gerar um determinado tipo celular. Cada estado de
competência corresponderia à expressão de fatores de transcrição específicos,
capazes de direcionar a síntese de receptores de membrana e de proteínas
das cascatas de transdução de sinal, tornando a célula responsiva a
determinados fatores extracelulares.
24
A célula se moveria de um estado para outro sem poder voltar ao estado
anterior. O comprometimento seria obtido quando a célula não dependesse
mais de pistas ambientais para seguir adiante no seu programa de
diferenciação, estado que seria alcançado com a estabilização da sua rede de
fatores de transcrição.
As concentrações intracelulares de cálcio ([Ca
2+
]
i
) apresentam uma
influência chave no desenvolvimento do SNC e têm sido relacionadas à
regulação de diferenciação, migração, destino e formação de circuitos (Pearson
et al., 2002). Ondas de cálcio também são importantes para coordenar
localmente o ciclo celular. Aumentos nas concentrações intracelulares de cálcio
promovem a quebra do envelope nuclear, a condensação da cromatina e o
início da anáfase em ovos de ouriço do mar (Poenie et al., 1985) e em cultura
de fibroblastos (Keith et al., 1985; Kao et al., 2001). Também podem promover
a transição G1/S, comprometendo a célula com a divisão celular (Berridge,
1983).
1.6 - PAPEL DE RECEPTORES PARA NUCLEOTÍDEOS DURANTE A
GÊNESE DA RETINA.
No sistema nervoso central, os neurônios têm sido tradicionalmente
considerados como sendo a principal fonte de liberação de ATP. Segundo
Zimmermann (1994), o ATP pode ser liberado na fenda sináptica em conjunto
com outros neurotransmissores clássicos, onde irá ativar receptores
purinérgicos específicos e funcionar, desta forma, como um neurotransmissor
ou neuromodulador na fisiologia de neurônios do SNC (figura 7). Entretanto,
estudos recentes têm demonstrado que células gliais também podem liberar
ATP (Cotrina et al. 1998; Wang et al., 2000; Newman, 2001), sugerindo que
estas células possam modular a atividade neuronal pela ativação de receptores
purinérgicos. Segundo Pearson e colaboradores (2002), tanto o sistema
purinérgico quanto o colinérgico muscarínico podem modular a proliferação
celular na retina de pinto. Neste estudo foi demonstrado que carbacol, um
agonista muscarínico, podia aumentar o intervalo de tempo entre as mitoses de
células da retina, causando uma diminuição de populações celulares neste
tecido. Já o efeito do UTP era diminuir o intervalo entre as mitoses, causando
25
Figura 7: Diagrama esquemático ilustrando a liberação de ATP, seu
metabolismo e sua interação com sistemas de segundos mensageiros,
seguindo a ativação de receptores ionotrópicos (P2X) e metabotrópicos (P2Y).
Retirado de Franke e Illes, 2005.
26
um aumento na proliferação celular da retina. Entretanto, em contraste com
ATP, estudos do nosso laboratório (Sanches et al., 2002) não evidenciaram
nenhum efeito de UTP ou carbacol sobre a incorporação de [
3
H]-timidina em
células de retina de pinto em cultura, embora estes dois compostos possam
estimular a formação de fosfoinositídeos e a fosforilação de MAP cinases, dois
eventos envolvidos no efeito proliferativo de nucleotídeos neste tecido (Nunes
et al, 2007).
Enquanto receptores P2X têm sido implicados na comunicação rápida
entre neurônios (North, 1996), receptores P2Y têm sido comumente
encontrados em células gliais como os astrócitos corticais. Tem sido bastante
estudada a ativação destes receptores pela liberação maciva de ATP que
ocorre no processo de gliose reativa induzida por trauma e isquemia (Neary et
al. 1996; Abbrachio et al, 1999). Em 2001, Newman demonstrou, por
quimioluminescência, que o estímulo de astrócitos e células gliais de Müller
provoca uma liberação significativa de ATP que é responsável pela propagação
de ondas de cálcio nestas células da retina, realçando a ideia de que
receptores de nucleotídeos têm um papel preponderante na sinalização glial.
O efeito de nucleotídeos sobre a sinalização de fatores tróficos ou outros
sistemas de neurotransmissores tem sido demonstrado em diversos tipos
celulares, inclusive na retina. Estudos recentes mostram que receptores para
nucleotídeos podem potenciar os efeitos tróficos de alguns fatores de
crescimento (para revisão, Burnstock. ,2007).
Na retina, onde a presença tanto de receptores P2X quanto P2Y foi
demonstrada (Bundle et al, 1998; Fries et al, 2005), a ativação de receptores
do tipo P2X por ATP parece potenciar a liberação de GABA induzida por
concentrações altas de KCl (Neal et al., 1998) e diminuir a liberação de
acetilcolina dependente de luz (Neal e Cunningham, 1994). Já a ativação de
receptores do tipo P2Y por ATP está envolvida na mobilização de cálcio
proveniente de estoques intracelulares neste tecido (Sugioka et al., 1996).
Na retina embrionária de pinto, a mobilização capacitiva de cálcio
intracelular foi associada temporal e espacialmente com a proliferação celular
(Sakaki et al., 1996). Além disso, a participação de receptores purinérgicos P2
na proliferação de células retinianas foi sugerida pela inibição da incorporação
27
de [³H]-timidina pelos antagonistas purinérgicos PPADS e suramina (Sugioka et
al., 1999).
Em estudo recente do nosso laboratório, demonstramos que ATP é
capaz de aumentar a incorporação de [
3
H]-timidina em células retinianas em
cultura, um efeito que é mediado pela ativação de receptores P2Y1, PKC e
pela via das MAP cinases (Sanches et al., 2002). Em estudos mais detalhados,
demonstramos que tanto ATP quanto ADP induzem a forforilação das ERKs na
camada neuroblástica de retinas de embriões de E8 (Nunes et al, 2007).
Também demonstramos que o efeito mitogênico do ATP se dá em progenitores
gliais presentes em culturas de retina e esse efeito foi inibido por fatores
sintetizados por culturas mais diferenciadas (França et al, 2007).
1.7 – GLICOCORTICÓIDES.
Os glicocorticóides afetam virtualmente todos os órgãos e sistemas do
organismo, participando da regulação do metabolismo de carboidratos,
proteínas e lipídeos. Participam ainda do balanço hidroelotrolítico, da
manutenção da fisiologia dos sistemas nervoso, cardiovascular, imune, renal,
além da musculatura esquelética e do sistema endócrino.
Devido á sua alta lipossolubilidade, os glicocorticóides atravessam
facilmente a membrana plasmática e ligam-se aos seus receptores específicos
(receptor de glicocorticóide – GR) no citosol, com conseqüente transporte para
o núcleo e interação com regiões específicas do DNA, promovendo a
transcrição e/ou repressão de determinados elementos responsivos aos
glicocorticóides (modelo clássico de ativação de GR)
Durante décadas este foi considerado como o único mecanismo de ação
dos glicocorticóides. No entanto, evidências recentes indicam que os
glicocorticóides também podem agir através de receptores específicos
expressos na membrana das células, o que caracteriza um mecanismo de ação
não-genômico dos glicocorticóides (para revisão ver Falkenstein et al., 2000 e
Borsk, 2000).
28
1.7.1 - Mecanismo de ação genômico
Os efeitos genômicos dos glicocorticóides são mediados através de um
receptor intracelular, o receptor de glicocorticóide (GR) (Hollemberg et al.,
1985, Arriza et al., 1987). Após ativação por seu respectivo hormônio nos
tecidos alvos, este receptor regula a expressão de genes responsivos a
glicocorticóides, alterando os níveis de determinadas proteínas.
O GR é membro de uma superfamília de receptores nucleares que
incluem os receptores para mineralocorticóides, progesterona, androgênios,
estrogênios, hormônios da tireóide, vitamina D e ácido retinóico. O GR humano
foi clonado em 1985 por Hollemberg e colaboradores. Há duas isoformas de
receptores GR humanos, GRα e GRβ. O GRα humano apresenta 777
aminoácidos enquanto que a GRβ possui 742 aminoácidos (para revisão,
Chrousos e Kino, 2005). Estes receptores podem ser divididos em três
domínios funcionais, o dominio N-terminal ou domínio imunogênico, o dominio
de ligação ao DNA e o dominio de ligação do hormônio.
A maior diferença entre os receptores é observada no domínio N-
terminal, considerado como uma região “moduladora”, envolvida na regulação
da transcrição mediada por receptor. Nesta região, existem resíduos de serina
passíveis de regulação via fosforilação. As fosforilações destes residuos podem
estar envolvidas com o “turnover”, com a translocação intracelular do GR ou
com a regulação da ativação das ações genômicas deste receptor.
Estudos realizados por Itoh e colaboradores (2002) demonstraram que
a fosforilação promovida pela JNK no resíduo Ser 226 da região N-terminal do
GR inibiu a transcrição gênica induzida por dexametasona em células HEK
293. No entanto, estudos conduzidos por Miller e colaboradores (2005)
demonstraram que a fosforilação do resíduo 211 de GR presentes em linfocitos
humanos acentuam tanto a transcrição gênica quando a apoptose induzida por
GR nestas células.
O domínio de ligação ao DNA está localizado no centro da proteína. É
uma região altamente básica e enriquecida de resíduos de cisteína, lisina e
arginina. Esta região tem aproximadamente 70 aminoácidos. Existem também
nesta região duas projeções em forma de dedo, as quais interagem com o
29
DNA, chamados “dedos de zinco”, que são formados por um átomo de zinco
ligado a quatro resíduos de cisteína (para revisão, Chrousos e Kino, 2005).
O domínio de ligação do hormônio está localizado no extremo C-terminal
do receptor. A ligação do glicocorticóide ocorre nesta região e ativa as
respostas biológicas mediadas pelo receptor (Ismaili e Garabedian, 2004).
O receptor para glicocorticóide em repouso é um complexo protéico de
aproximadamente 300 kDa localizado no citosol celular e que é resultado da
associação do receptor propriamente dito com proteínas de choque térmico
(heat shock proteins -hsp). Cada molécula de receptor encontra-se associada a
duas moléculas de hsp com 90 kDa, as hsp90. A ligação com as hsp90 confere
ao receptor uma conformação de alta afinidade de ligação ao esteróide. Já a
dissociação que ocorre sob algumas condições, como elevação da temperatura
e do pH, promove a alteração da conformação do receptor para um estado de
alta afinidade de ligação ao DNA. A ligação do esteróide ao GR também
acarreta dissociação da hsp90 e possibilita a translocação do mesmo para o
núcleo. Além da hsp90, outras proteínas como a hsp70 e a hsp56 fazem parte
do hetero-complexo que forma o GR. Estas proteínas de choque térmico
existem no citosol independentes de sua ligação com o receptor (Kurmar e
Thompson , 2005).
No núcleo, o GR interage com sítios específicos no DNA, chamados de
elementos responsivos a glicocorticóides (GRE), atuando, portanto, como
fatores de transcrição (Wurtz, 1985). Esta interação pode resultar em ativação
de genes sensíveis a estes hormônios (Pratt, 1990). Os receptores ativados
também podem interagir com outros fatores de transcrição gênica, como c-
jun/c-fos e NFκB, promovendo a transcrição de diversos genes envolvidos na
ativação e no crescimento de diversos tipos celulares (Scheinman et al., 1995).
Além disso, os glicocorticóides alteram a estabilidade de RNA mensageiros e,
portanto, a tradução de várias proteínas responsivas aos glicocorticóides (Fève
et al., 1992).
Estes receptores são expressos tanto em células nervosas quanto gliais,
embora sua presença esteja bem caracterizada em células gliais (Linser e
Moscona, 1979, 1981 e 1983). Nos clássicos trabalhos desenvolvidos por
Moscona em meados da década de 60, foi constatado um antagonismo entre a
proliferação e a indução da expressão de glutamina sintetase (GS) por
30
glicocorticóides em células de Muller na retina embrionária de pinto. Após estes
estudos, a expressão de GS regulada por glicocorticóides ficou associada à
diferenciação de glia de Muller, sendo que este processo parece ser depende
da interação entre glias e neurônios e não foi observado em culturas de retina
(Vardimon et al. 1999). Estudos posteriores realizados por Vento e
colaboradores (1987) demostraram que o tratamento com hidrocortisona
diminuiu em mais de 70% a atividade da timidina quinase em retinas de
embriões de 8 a 10 dias de incubação e este efeito inibitório decaiu com o
desenvolvimento da retina.
Além da GS, vários estudos demonstraram que a caveolina (cav-1)
também teve sua expressão gênica regulada por glicocorticóides. Em culturas
de células epiteliais pulmonares, a incubação com dexametasona aumentou a
expressão de cav-1 e, este efeito, parece estar associado á estabilização do
RNAm desta proteína. Além disso, a dexametasona promoveu a diferenciação
do epitélio alveolar que passou a apresentar múltiplas formações caveolares na
membrana celular (Barar et al, 2007). Processo semelhante foi observado em
culturas de ductos de Wolffian tratados com testostorona. Um aumento na
expressão de cav-1 foi observado assim como a conseqüente diferenciação
dos ductos (Hannema et al, 2006). Estudos realizados por Sudhir e
colaboradores (2005) demostraram a necessidade da associação em rafts
lipidicos dos GR, da cav-1, da HSP90 e da STAT3 para que exista a
sinalização transcricional dos GR induzida por hormônios, uma vez que a
destruição dos domínios caveolares com filipina III inibiu a sinalização mediada
por GR.
Além disso, também foi observado inibição da proliferação celular
induzida por glicocorticóides em outros tecidos. Nas células de músculo liso de
ratos tanto a hidrocortisona como a dexametasona diminuiram os níveis de
proliferação celular através da inibição da fosforilação da proteína
retinoblastoma. Esta proteína regula positivamente o ciclo celular e também
está envolvida na supressão de tumores (Reil et al.,1999). Também já foi
mostrado em cultura de células de músculo liso que os glicocorticóides inibem
a expressão da ciclina D1, mas não sendo capazes de inibir a atividade
extracelular regulada por quinases (Darren et al.,2000). Crossin e
colaboradores (1997) demonstraram que dexametasona, corticorterona e
31
aldosterona inibem a proliferação de astrócitos corticais de ratos em cultura.
Este efeito inibitório parece estar associado ao aumento da expressão de N-
CAM induzido por esses glicocorticóides, uma vez que antagonista RU-486 foi
capaz de reverter os efeitos inibitórios da dexametasona nessas culturas.
1.7.2 - Mecanismo de ação não-genômico
As primeiras observações dos efeitos rápidos dos glicocorticóides foram
feitas na década de 40. No entanto, esses efeitos não-genômicos
demonstrados para vários esteróides e mediados por mecanismos associados
à membrana plasmática, foram melhor explicados nos últimos 15 anos (Borski,
2000).
Através deste mecanismo, os esteróides modulam a secreção de
hormônios, a excitabilidade neural, o comportamento, a morfologia celular e o
metabolismo de carboidratos. Os efeitos não-genômicos destes esteróides
sobre as várias funções celulares envolvem proteinas e segundos mensageiros
clássicos, tais como a fosfolipase C (PLC), o inositol trifostato (IP3), o cálcio, a
proteína cinase C (PKC) (Falkenstein, et al., 2000) e mais recentemente a
família de proteínas fosfatidilinositol 3’-quinase (PI3K/AKT) (Simoncini et al.,
2002)
Recentemente os receptores de glicocorticóides de membrana (GRm)
foram demonstrados no cérebro de anfíbios, em células leucêmicas humanas e
em células S-49 (linfoma de camundongos). No entanto, a existência fisiológica
destes receptores ainda é controversa. Isto se deve à dificuldade de marcação
do GR na membrana das células por inúmeras técnicas. Conseqüentemente,
os resultados obtidos por diferentes grupos de pesquisadores são controversos
(Buttgereit et al., 2002). Porém, como baixas concentrações são necessárias
para a ativação das ações rápidas relacionadas aos glicocorticóides e estas
ações são bloqueadas por antagonistas específicos de GR, assume-se a
existência desses receptores na membrana de vários tipos celulares. Além
disso, vários efeitos dos glicocorticóides são observados após um curto período
de tempo, o que não poderia ser explicado pelo mecanismo clássico de
ativação dos glicocorticóides. Aliado a isso, as respostas rápidas associadas a
glicocorticóides não causam ativação/repressão do GRE e não são inibidas por
32
bloqueadores de transcrição gênica e síntese protéica (Borski, 2000). Um
exemplo das ações não-genômicas dos glicocorticóides está nos estudos
realizados por Borski e colaboradores (2002) onde cortisol inibiu a liberação de
prolactina em células da glândula pituitária de peixes reduzindo rapidamente os
níveis de Cálcio intracelular através da inativação de canais de Ca
+2
dependentes de voltagem do tipo-L.
Um dos suportes teóricos utilizados para explicar as ações não-
genômicas dos GR envolve a interação destas proteínas com receptores
acoplados a proteína G (GPCR). Alguns estudos demostraram que o domínio
N-terminal dos GR, particularmente as regiões entre os resíduos 263 e 419,
podem interagir fisicamente com a subunidade β da proteína G (Kino et al,
2005). Esta interação além de ocorrer na membrana plasmática, foi estimulada
pela ativação dos GPCR. Após a formação do complexo entre o RG e a
subunidade β, este migra para o núcleo, interage com GRE e suprime a
transcrição gênica. Um processo semelhante ocorre com os receptores de
progesterona (PR), uma vez que o domínio N-terminal destes receptores pode
interagir com domínios SH3 e ativar tirosinas quinases solúveis da família da
Src. A interação entre PR e o domínio SH3 pode levar á ativação em cascata
das MAPK de forma independente da ativação transcricional do PR
(Boonvaratanakirnkit et al, 2007)
2 – OBJETIVOS.
2.1- Objetivos gerais:
Tendo em vista que cada vez mais se evidenciam importantes funções
para as caveolinas em diferentes processos celulares, que incluem
proliferação, diferenciação e regulação da transdução de sinal, resolvemos
estudar o padrão de expressão da caveolina-1 em culturas de células
retinianas e alguns aspectos relacionados às conseqüências biológicas do seu
aparecimento durante o desenvolvimento embrionário destas células.
33
2.2 - Objetivos específicos:
• Identificar a expressão de caveolina-1 por imunocitoquímica e western
blotting tanto em culturas quanto em cortes de retina de pinto durante o
desenvolvimento embrionário.
• Verificar se caveolina-1 é um marcador exclusivo da glia de Mulller
diferenciada em culturas utilizando o antígeno glial 2M6 como marcador
controle.
• Avaliar se a cav-1 está presente apenas em células gliais diferenciadas
e ausente em células gliais proliferantes via ATP, através de ensaios
simultâneos de imunocitoquimica utilizando anticorpos para cav-1 e
Brdu.
• Avaliar o papel da hidrocortisona sobre o efeito mitogênico do ATP em
culturas retinianas durante o desenvolvimento, bem como o efeito deste
glicocorticóide na morfologia das culturas e principalmente das células
gliais.
• Analisar por imunocitoquímica o perfil de ativação de ERK-p em culturas
retinianas jovens/proliferantes e tardias/diferenciadas pré-tratadas com
hidrocortisona. Além de investigar o perfil de localização da ERK-p nas
culturas tratadas com hidrocortisona durante o desenvolvimento.
• Verificar a expressão de receptores P2Y1 durante o desenvolvimento de
culturas retinianas.
• Avaliar, por western blotting, se a regulação da expressão de cav-1
durante o desenvolvimento está associada á ativação das ERK e de
receptores de glicocorticóides sensíveis a hidrocortisona.
34
• Investigar se a expressão de cav-1 está relacionada á diminuição do
efeito proliferativo do ATP durante o desenvolvimento da retina, através
da mensuração da incorporação de [
3
H]-timidina e do acúmulo de [
3
H]-
fosfoinosideos induzidos por ATP.
35
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Obtenção de culturas complexas de retina de embrião de pinto.
Culturas de células da retina de embriões de pinto foram obtidas como
descrito anteriormente (Paes de Carvalho e De Mello, 1982), usando embriões
de sete ou oito dias de incubação. As retinas foram dissecadas em solução
salina estéril, livre de cálcio e magnésio e incubadas com tripsina 0,1 % a 37º
C, por 25 min. Em seguida, a tripsina foi retirada e a dissociação mecânica
realizada em um tubo com 5 ml de meio (MEM), suplementado com 5% de soro
fetal bovino e antibióticos. A densidade de células foi estimada em câmara de
Neubauer sendo semeadas 3 X 10
6
e 10
7
células em cada placa de 35 mm
para os experimentos de incorporação de [
3
H]-timidina e Western Blotting
(WB), respectivamente. Após 2 h de incubação em estufa à 37
º
C, as culturas
foram tratadas com ATP ou hidrocortisona e, após um ou vários dias de cultivo,
foram utilizadas nos experimentos de incorporação de [
3
H]-timidina ou WB para
caveolina-1.
3.2 -Obtenção das culturas purificadas de glia.
Culturas purificadas de glia foram obtidas através de um protocolo
semelhante àquele utilizado para a obtenção de culturas complexas. A
densidade de células semeada foi de 3,0 x 10
6
por placa de 35 mm. As culturas
foram mantidas por cerca de três semanas de cultivo, sendo o meio trocado
regularmente duas vezes por semana. Após o 20
o
dia de cultivo, o meio foi
trocado para MEM e as culturas foram tratadas até o 23
o
dia de cultivo (72h)
com 0.2 mM de hidrocortisona. A viabilidade celular foi mensurada através da
técnica de MTT. As culturas purificadas de glia também foram utilizadas nos
ensaios de imunofluorescência para caveolina-1, Neurofilamento-L e antígeno
glial 2M6.
36
3.3 - Obtenção de culturas purificadas de neurônios
Culturas purificadas de neurônios foram obtidas por um protocolo
semelhante ao utilizado para obtenção das culturas complexas. No entanto, as
placas foram previamente tratadas com solução de Poli-ornitina 25 µg/ml por
24 h. Antes do início do procedimento das culturas, essas placas foram lavadas
2 vezes com 1 ml de água milli-Q estéril e preenchidas com 1 ml de meio MEM
com 5 % de soro fetal e incubadas em estufa à 37
o
C. A densidade de células
semeadas foi de 5 X 10
6
células/placa e as culturas foram mantidas por até 6
dias sem troca de meio. As culturas purificadas de neurônio foram utilizadas
nos ensaios de imunofluorescência para caveolina-1 e neurofilamento-L.
3.4 - Tratamento das culturas de retina com hidrocortisona ou PD 98059
Exceto quando indicado na legenda da figura, o início do tratamento das
culturas de retina com hidrocortisona ou PD 98059 foi realizado 2 horas após a
semeadura das células nas placas de cultura, portanto, em E8C0. Nos dias de
cultivo indicados, o meio foi trocado e as culturas processadas para
microscopia de contraste de fase, imunofluorescência, incorporação de [
3
H]-
timidina ou western blotting. Em alguns experimentos de incorporação de [
3
H]-
timidina ou western blotting para caveolina-1, o tratamento com hidrocortisona
foi iniciado em períodos diferentes do cultivo, podendo ser ou não fixado em 72
hs ou 96 hs.
3.5 - Visualização e quantificação da área das culturas recoberta por
células
Culturas de retinas obtidas de embriões com 8 dias foram cultivadas na
presença de hidrocortisona 200 μM por diversos períodos de tempo e fixadas
com solução gelada de paraformaldeído 4% em tampão fosfato (TPO
4
) 0.16 M,
pH = 7.4. As culturas foram então visualizadas e fotografadas em contraste de
fase em microscópio Nikon Eclipse2000. As imagens obtidas através de uma
câmara digital foram então processadas pelo software Scion Image após
delimitação manual da área da placa recoberta por células. Pelo menos 3
imagens obtidas em cada condição de tratamento foram analisadas. A área
37
expressa nos gráficos foi obtida diminuindo-se a área recoberta por células da
área total da imagem.
3.6 - Western blotting
Para a técnica de imunoblotting utilizamos culturas de retina mantidas
por vários dias. As culturas foram incubadas com os agentes (ATP 100 μM, ,
ADP 500 μM ou hidrocortisona 200 μM) por tempos determinados em 2ml de
MEM. Após o estímulo foram lavadas com 1 ml de BME tamponado com Hepes
25 mM, pH 7.4. Em seguida, 70 µl de tampão de amostra (0,5 ml Tris-HCl 1
mM com pH 6,8, 0,8 ml de glicerol, 1.6 ml de SDS 10%, 0.4 ml Mercaptoetanol
e 0.7 ml água MilliQ) foram adicionados e o extrato total de proteínas recolhido.
As amostras foram fervidas por 10 min e centrifugadas a 15.000 rpm durante
10 min. Os sobrenadantes das amostras foram coletados e o seu conteúdo
protéico determinado pelo método de Bradford (1976) modificado, utilizando-se
a albumina sérica bovina como padrão. Após a adição de azul de bromofenol
0.1 %, amostras contendo 50 µg de proteína foram submetidas à eletroforese
em gel de poliacrilamida 12% por cerca de 2 horas a 15 v e transferidas para
membranas PVDF por cerca de 1 hora a 96 v.
Para a imunodetecção, as membranas foram bloqueadas em solução
salina tamponada com Tris-HCl contendo Tween 0.1% (TBS-T) e 5% de
caseína, por uma hora e meia sob agitação constante. Após o bloqueio, as
membranas foram incubadas com os seguintes anticorpos primários, em
solução TBS-T com 5% de caseína, overnight a 4ºC: anticorpo monoclonal de
camundongo para fosfo-ERK (New England Biolabs), na diluição de 1:2000;
anticorpo policlonal de coelho para o receptor P2Y
1
(Sigma-Adrich), na diluição
de 1:400; anticorpo monoclonal de camundongo para a caveolina-1 (BD
Transduction Labs.), na diluição de 1:5000; anticorpo policlonal de coelho para
a caveolina-1 (Cell Signaling Inc.), na diluição de 1: 5000. Após esse período,
as membranas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos em TBS-T. Em seguida, o
anticorpo secundário correspondente conjugado com peroxidase, diluído na
solução inicial de bloqueio (1:2000) foi adicionado e as membranas incubadas
à temperatura ambiente e sob agitação constante. Após 1 hora, as membranas
foram lavadas novamente, 2 vezes por 5 minutos com TBS-T e 1 vez com TBS
38
por 10 minutos. A revelação foi realizada pelo ensaio de quimioluminescência,
utilizando o kit ECL plus da Amersham Pharmacia e seguindo o protocolo
padrão do fabricante. Nos experimentos de imunoblotting para caveolina-1, a
quantificação das bandas foi realizada por densitometria, utilizando-se o
programa Scion Image.
3.7 - Ensaio de Viabilidade Celular
A morte celular foi estimada através do ensaio colorimétrico de
viabilidade celular descrito por Mosmann (1983). Neste método, o reagente
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide: tetrazol) é
reduzido à formazan púrpura pelas mitocôndrias de células vivas, uma vez que
acontece somente quando a enzima reductase mitocondrial está ativa. Deste
modo, a conversão do reagente MTT à formazan é diretamente relacionada ao
número de células vivas e a efetividade do agente em causar a morte das
células pode ser inferido através de uma curva dose resposta. MTT na
concentração de 1.5 mg/mL foi adicionado às culturas de células de retina de
embrião de pinto, tratadas ou não com hidrocortisona, em E8C4 ou em E8C23.
Após 4 horas de incubação, as culturas foram lavadas com solução salina
completa (Hank’s), a 37°C e a camada de células da placa contendo o
formazan insolúvel dissolvida numa mistura de HCl concentrado e álcool
isopropílico absoluto (6:1). Após este procedimento, a absorbância do material
foi determinada em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 570 e 650
nm.
3.8 - Incorporação de [
3
H]-timidina em culturas de células de retina
Culturas de células de retinas de E8 ou E7, tratadas ou não, foram
incubadas por 1 hora a 37
o
C com 0.5 μCi de [
3
H]-timidina. Após a incubação,
as células foram lavadas quatro vezes com 1mL de MEM tamponado com
Hepes 25 mM, pH 7,4. O material aderido à placa foi dissolvido com 0,2mL de
NaOH 0.4N por 15min, à 4ºC. A mistura foi então diluída com 3 ml de água
deionizada e transferida para tubos onde 600 μl de TCA 50% foram
adicionados. O material foi incubado a 4
o
C por pelo menos 30 minutos e a
suspensão filtrada em filtro de fibra de vidro (GFC). Os filtros foram lavados
39
três vezes com TCA 5%, secos a 100
o
C e a radioatividade presente
determinada por cintilação líquida.
3.9 - Determinação do acúmulo de [
3
H]-fosfoinositídeos (adaptação do
método de Berridge et al., 1983)
Culturas em E8C4, tratadas ou não com hidrocortisona, tiveram seus meios
trocados e substituídos por 1 mL de solução salina de Hank´s, contendo 1 μCi
de [
3
H]-mio-inositol. Após 1h30 min de incubação a 37ºC, foi adicionado LiCl
na concentração final de 10 mM e as culturas incubadas por mais 1h. Após
este período, ATP na concentração de 100 μM foi adicionado e as culturas
incubadas por mais 1 hora. O estímulo foi interrompido com a lavagem das
placas com 2 mL de solução de Hanks (3 vezes) seguida pela adição de TCA
50 % à uma concentração final de 15 % em solução de Hanks. As soluções
finais, contendo os lisados celulares, foram então transferidas para tubos de
centrífuga e congeladas por 30 minutos ou overnight. Após descongelamento,
as amostras foram centrifugadas a 27000 g por 25 minutos a 4ºC. O
sobrenadante de cada tubo foi transferido para tubos de vidro, lavado por três
vezes com 2,5 mL de éter etílico e neutralizado com solução de Tris-HCl 20
mM (pH 7,4) contendo 5mM de EDTA. A solução final foi transferida para
colunas de troca iônica contendo 1 mL de resina Dowex X-8, previamente
equilibrada com ácido fórmico 1 M. As frações foram seqüencialmente eluídas
com (1) 5 mL de água deionizada, (2) 5 mL de solução de tetraborato de sódio
5 mM / formiato de amônio 60 mM e (3) 4 mL de solução de ácido fórmico 0,1
mM / formiato de amônio 1 M. Esta seqüência de eluição removeu em (1) [
3
H]-
inositol, em (2) [
3
H]-glicerofosfoinositol e em (3) derivados fosforilados de [
3
H]-
inositol. A radioatividade foi determinada por cintilação líquida.
O precipitado obtido a partir da centrifugação foi dissolvido em NaOH 1 M e
o teor protéico dosado utilizando-se o método de Lowry et al., 1951. Os
resultados obtidos a partir da determinação da radioatividade foram
normalizados para CPM/mg de proteína (CPM = contagens por minuto na
cintilação líquida).
40
3.10 - Imunofluorescência para caveolina-1 e antígeno 2M6 em retinas de
pinto.
Retinas intactas de embrião de pinto em diversos estágios do
desenvolvimento (E9, E13, E16 e P1) foram imediatamente fixadas por imersão
em solução de paraformaldeído 4 % em tampão fosfato 0,16 M (pH 7,2) por
uma hora. Os tecidos foram então lavados com solução salina tamponada com
fosfato (PBS) e submetidos ao procedimento de crioproteção com soluções de
sacarose a 15 e 30 %, respectivamente. Após 24 h, as retinas foram montadas
em OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), congeladas e cortadas a -15ºC.
Cortes transversais à superfície vítrea (10 µm) foram coletados em lâminas
gelatinizadas. As lâminas foram mantidas a -20ºC até serem submetidas à
imunohistoquímica.
Para o ensaio de imunofluorescência, os cortes foram lavados com PBS e
pré-incubados com PBS contendo soro normal de cabra 3 % e BSA 3% por 1
hora. A seguir, foi realizada uma incubação de 24h com anticorpo monoclonal
de camundongo contra cav-1 na diluição de 1:400 ou com anticorpo
monoclonal de camundongo contra 2M6 na diluição de 1:400. Após diversas
lavagens com PBS, os cortes foram incubados com anticorpo fluorescente
Alexa 488, contra IgG de camundongo (Molecular Probes), na diluição 1:200
por 1h30min. Após novas lavagens com tampão PBS, os cortes foram
montados em solução de N-propil galato 5%, encobertos por lamínulas de 24
por 70 mm. Nos cortes controle omitimos o anticorpo primário. Os cortes foram
analisados por microscopia de fluorescência num microscópio Nikon
Eclipse2000.
3.11 - Imunofluorescência para caveolina-1, antígeno 2M6, Brdu,
Neurofilamento-L em culturas de células de retina.
As culturas obtidas de embriões de 7 e 8 dias em diversos estágios de
cultivo tiveram o meio trocado e foram lavadas, com 1mL de MEM tamponado
com Hepes 25mM, pH 7,4. Após esta lavagem, as culturas foram
imediatamente fixadas por imersão em solução de paraformaldeído 4 % em
tampão fosfato 0,16 M (pH 7,2) por 30 min. Após a fixação, culturas foram
41
lavadas 3 vezes com PBS e submetidas aos ensaios de imunofluorescência
(IF) para cav-1 ou 2M6 de forma semelhante ao realizado nos cortes de retina.
Sendo que neste ensaio, realizamos uma incubação conjunta com o anticorpo
policlonal de coelho contra cav-1 e com anticorpo monoclonal de camundongo
contra 2M6 na dilução ambos na dilução de 1:400. A lamínulas contendos as
culturas foram incubados com anticorpo fluorescente Alexa 488, contra IgG de
camundongo (Molecular Probes) e com anticorpo Alexa 568, ambos na diluição
1:200 por 1h30min. Após novas lavagens com tampão PBS, os laminulas foram
montados com solução de N-propil galato 5% em laminas para microscopia.
Nos ensaios de IF para ERK-p, as culturas passaram pelo mesmo
procedimento descrito acima, sendo que o anticorpo monoclonal de
camundongo contra ERK-p foi utilizado na diluição 1:400 e o anticorpo
secundário utilizado foi Alexa 488 de camundongo na dilução de 1:200.
Nos ensaios de IF para Bromo-deoxi-uridina (Brdu), as culturas, já fixadas,
foram lavadas duas vezes com PBS 0.1 mM e incubadas por 30 min com
solução de PBS contento 1 % de Triton X-100. Após esse período de
permeabilização, as culturas foram incubadas em solução HCl 2N por mais 30
min, lavadas e incubadas com tampão borato 0.1mM, pH = 8, por mais 10 min.
Após esse procedimento, as culturas foram submetidas aos ensaios de IF para
o anticorpo monoclonal de camundongo anti-Brdu, na diluição de 1:100 e
anticorpo policlonal de coelho anti-caveolina-1, na diluição de 1:400,
simultaneamente. Após seguidas lavagens com tampão PBS, as culturas foram
incubados com anticorpo Alexa 568 de camundongo (Molecular Probes) e
anticorpo Alexa 488 de coelho, ambos na diluição 1:200 por 1h30min. Após
novas lavagens com tampão PBS, as lamínulas contendo as culturas foram
montados com solução de N-propil galato 5% em lâminas de microscopia.
Nos ensaios de IF para Neurofilamento-L (Neuro-L), as culturas, já fixadas,
foram lavadas duas vezes com PBS 0.1 mM e incubadas com tampão citrato
10 mM aquecido a 90
o
C por 10 min. Após esse procedimento, as culturas
foram submetidas ao ensaio de IF para o anticorpo monoclonal de coelho anti-
neurofilamento-L na dilução de 1:100 (Cell Signaling Inc.) e para o anticorpo
monoclonal de camundongo anti-caveolina-1 na dilução de 1:400
simultaneamente. Após várias lavagens com tampão PBS, as culturas foram
42
incubadas com anticorpo fluorescente Alexa 568 de camundongo (Molecular
Probes) e com anticorpo Alexa 488 de coelho, ambos na diluição 1:200 por
1h30min. Após novas lavagens com tampão PBS, os laminulas foram
montados com descrito anteriormente. A maior parte os ensaios de IF
realizados nas culturas foram analisados por microscopia de fluorescência em
um microscópio Nikon Eclipse2000. Parte dos ensaios de IF para cav-1, 2M6 e
ERK-p foram analisados utilizando microscopia de epifluorescência em um
microscópio Zeiss Apotome.
3.12 - Análise estatística.
Análise estatística dos dados foi feita com o auxilio de programa Graph
Pad Prism. Os resultados foram apresentados como média ± EPM, indicando o
número de experimentos realizados. A significância dos dados apresentados foi
obtida através da análise de variância (ANOVA) e o pós-teste de Bonferroni.
Os filmes fotográficos com marcação para caveolina-1 foram
digitalizados e submetidos a análise de desitometria pelo programa Sigma Gel.
Os valores experimentais foram representados em porcentagem dos valores
basais.
43
4 – RESULTADOS
4.1 - LOCALIZAÇÃO DE CAVEOLINA–1 DURANTE O DESENVOLVIMENTO
DA RETINA.
A neuroquímica da retina embrionária de pinto tem sido bastante
estudada, uma vez que ela apresenta a maioria dos sistemas de
neurotransmissão encontrados no cérebro. Com o objetivo de investigar o
papel da cav-1 no desenvolvimento “in vitro” da retina embrionária de pinto,
resolvemos caracterizar a expressão desta proteína em cortes de retina em
diferentes idades. Essa caracterização foi realizada utilizando-se tanto técnicas
de imunofluorescência (IF) quanto de “Western Blotting” (WB). Essa
diversidade metodológica nos permitiu identificar o tipo de célula retiniana que
expressa esta proteína, e sua forma de distribuição nestas células, assim como
quantificar os níveis de expressão durante o desenvolvimento.
Na figura 8 e 9 estão representadas seqüências de fotomicrografias com
IF para cav-1 em cortes de retina de embriões em diferentes idades (E9, E13,
E16 e P1). Nas retinas de E9, não detectamos imunorreatividade (IR)
especifica para cav-1 e foi observado um aumento progressivo na IR para cav-
1 nas retinas de E13, E16 e P1 (figuras 8 e 9). Nestas idades, uma intensa IR
para cav-1 foi observada em toda a extensão da membrana limitante externa,
uma região da retina que se localiza entre os segmentos internos e os corpos
celulares dos fotorreceptores. Além disso, a IR para cav-1 foi observada em
forma de estrias transversais que percorriam a camada nuclear externa, a
camada plexiforme externa e a porção externa da camada nuclear interna, até
aproximadamente a metade desta camada (figura 9a). Ao compararmos a IR
para cav-1 com a do antígeno 2M6, proteína que está presente exclusivamente
na glia de Müller (figura 9c), percebemos uma concentração de IR para cav-1
na porção apical da glia de Muller. Já a IR para 2M6 se distribui por todo soma
da célula de Muller, transpassando todas as camadas retinianas (figura 9c).
44
E9
Cav-1
E16
E13
ab
cd
e
f
dapi
E9
Cav-1
E16
E13
ab
cd
e
f
dapi
Figura 8: Imunofluorescência para cav-1 em retinas intactas de embriões em
diversos estágios de desenvolvimento. Painéis da esquerda, imunofluorescência
para cav-1. Painéis da direita, marcação nuclear com DAPI dos cortes mostrados a
esquerda. A) e B) E9; C) e D) E13; E) e F) E16. Barra = 20 μm.
45
dapi
b
P1
P1
cav-1
a
antígeno 2M6
P1
c
Figura 9: Imunorreatividade para cav-1 em retina de animais com 1 dia após a
eclosão (P1). (a) Fotomicrografia representativa de um corte transversal da retina
mostrando a IR típica para cav-1 (aumento de 400X). (b) Marcação para Dapi
correspondente a região mostrada em (a). (c) IR para o antígeno 2M6 com aumento de
20X. Barras = 20 μm.
46
8 9 10 11 15 17 P2 14 16
2 DIAS
PÓS-NATAL
a
b
Figura 10: Expressão de caveolina-1 (cav-1) durante o desenvolvimento de
retinas embrionárias de pinto. Extratos proteicos de retinas de embriões em
diversos estágios de desenvolvimento foram obtidos e processadas para WB com
descrito em Materiais e Métodos. A) Filme representativo da imunodetecção por WB
para cav-1. B) Quantificação por desitometria de pelo menos 2 experimentos
realizados em duplicata. O ponto sem barra representa a média entre 89.4% e 92.8%
da ex
p
ressão média de cav-1 obtida nas retinas de P1.
6 8 10 12 14 16 18 20
50
100
150
Período Embrionário
1 2 3 4
Período Pós-natal
(Dias)
(Dias)
EXPRESSÃO DE
CAVEOLINA-1
(% intensidade máxima)
47
A Análise de WB para cav-1 realizada em homogeneizados de retinas
intactas obtidas de embriões em diferentes etapas embrionárias também
demonstrou um aumento progressivo na expressão de cav-1 com o
desenvolvimento “in vivo” deste tecido. A expressão de cav-1 aumentou
significativamente após o 11
0
dia embrionário, se tornando máxima e constante
entre o 14
0
dia embrionário e o 2
0
dia pós-eclosão (P2) (figura 10). Estes dados
sugerem que a cav-1 esteja ausente no tecido retiniano (E8-E11) mais jovem.
Da mesma forma, estes dados demonstraram que esta proteína foi abundante
em retinas intactas (E19 e P2) mais maduras.
4.2 - LOCALIZAÇÃO E EXPRESSÃO DE CAVEOLINA–1 DURANTE O
DESENVOLVIMENTO DE CULTURAS DE CÉLULAS RETINIANAS.
Na figura 11 estão mostradas fotomicrografias da imunorreatividade (IR)
para cav-1 em células de retina de embriões com 8 dias de idade mantidas em
cultura por 2 (E8C2), 3 (E8C3), 4 (E8C4), 5 (E8C5), 6 (E8C6) e 8 (E8C8) dias.
Apesar das culturas em E8C2 e C3 apresentarem um grande número de
neurônios sobre uma significativa monocamada glial, a IR para cav-1 nessas
culturas foi praticamente inexistente tanto em neurônios quanto em células
gliais. Ausência de imunomarcação para cav-1 também foi observada em
culturas com tempos de cultivo menores, como E8C1(dados não mostrados), o
que nos permite sugerir que nessas idades de cultivo não existam células
imuno-positivas para cav-1. No entanto, ao analisarmos com mais atenção as
culturas em E8C2 foi possível observar, em um número total de três lâminas
analisadas, uma única célula glial positiva para cav-1 (figura 11a). A IR para
cav-1 nesta célula assumiu um aspecto pontiforme característico que se
distribuí por grande parte do corpo celular. Além disso, foi possível observar
nesta célula um acúmulo característico de IR específica para cav-1 localizado
nas bordas de seu corpo celular (figura 11a).
Uma intensidade maior na IR para cav-1 foi observada em um número
maior de células nas culturas em E8C4. C5, C6 e C8 (figura 11 c,d,e,f). O
padrão
48
E8C2
E8C3
E8C4
E8C5
E8C6
E8C8
20 μm
• cav-1
• dapi
a
b
cd
ef
E8C2
E8C3
E8C4
E8C5
E8C6
E8C8
20 μm20 μm
• cav-1
• dapi
a
b
cd
ef
Figura 11: Imunofluorescência para cav-1 em culturas de
retina em diversos estágios de desenvolvimento. Retinas
obtidas de embriões em E8 foram cultivadas em lamínulas e nos
estágios indicados foram fixadas e processadas para
imunofluorescência. a) E8C2; b) E8C3; c) E8C4; d) E8C5; e)
E8C6; f) E8C8. No destaque está mostrada uma célula glial
positiva para cav-1 em culturas de E8C6. Aumento de 400X e
Escala de 20μm.
49
Embriões de 8 dias (E8)
CC C CC C1C C C1 C1
a
0 2 4 6 8 10 12 14
0
20
40
60
80
100
tempo em cultura (dias)
Expressão de caveolina-1
(% intensidade máxima)
b
Figura 12: Expressão de caveolina-1 (cav-1) durante o desenvolvimento de
culturas de células de retina. Culturas de células de retinas de embriões com 8 dias
foram cultivadas pelos períodos indicados. A) Experimento representativo de
imunodetecção por WB para cav-1. B) Quantificação por desitometria de pelo menos 2
experimentos realizados em duplicata. Os dados representam à média ± D.M. No
primeiro e segundo dia de cultura a cav-1 não foi detectada, portanto os valores da
porcentagem de intensidade foram considerados nulos. No décimo terceiro dia de
cultura (E8C13) consideramos a intensidade máxima para imunodectecção de cav-1,
ou seja, 100% da expressão máxima. O ponto sem barra no terceiro dia de cultura
(E8C3) representa a média entre 4.3 % e 4.6% da expressão máxima de cav-1 obtida
em E8C13.
50
de imunomarcação para cav-1 nestes estágios progressivos de cultivo foi
característico e semelhante entre si. A IR apresentou-se com um aspecto
granular típico e se distribuiu por uma grande parte do soma das células com
morfologia glial. Além disso, parte dessa IR se concentrava em regiões que
pareciam delimitar áreas de contato entre as células ou simplesmente na borda
de uma célula isolada.
Com base neste padrão de marcação, especulamos que a IR para cav-1
acumulada nas bordas celulares seja devida a sua localização em cavéolas,
visto que em adipócitos e células endoteliais, células especializadas em
processos de secreção e transporte, estas estruturas estão normalmente
concentradas em regiões da membrana plasmática de um dos pólos da célula
(para revisão, Razani, 2002).
Nas análises de WB realizadas nas culturas, observamos um aumento
progressivo e marcante na expressão de cav-1 (figura 12) em células
retinianas, em função do tempo de cultivo. A imunodetecção de cav-1 só foi
significativa a partir do 4
o
dia de cultivo (18 ± 3.4% da expressão máxima, n=3).
Antes desse estágio de cultivo (E7C1, E8C1 e E8C2), a expressão de cav-1
não foi detectada. Após o 4
o
dia de cultivo (E8C4), o aumento na expressão de
cav-1 foi intenso nas culturas (63.5 ± 9.45% da expressão máxima, em
E8C5/E8C6, n=3), se tornando máximo em E8C13 (figura 12). Estes dados são
condizentes com os obtidos nas análises de IF para esta proteína nestes
mesmos estágios de cultivo (figura 12).
Os ensaios de imunofluorescência sugerem que a expressão de cav-1
na retina de pinto ocorra em células da glia de Muller. Para confirmar esta
hipótese, realizamos um ensaio de IF para marcação simultânea da cav-1 e
2M6 em nossas culturas. Na figura 13 observamos estas duas proteínas em
inúmeras células gliais presentes em culturas de E8C6. Já na figura 14
observamos a dupla marcação de cav-1 e 2M6 em duas células gliais de E8C7.
A IR para 2M6 foi observada no corpo das células gliais e ausente em seus
núcleos, propiciando uma nítida individualização das células gliais (figura 13b e
14e, b).
51
• cav-1- Alexa 488
• DAPI
E8C6
E8C8
a
b
c
d
e
• 2M6 - Alexa 488
• DAPI
Figura 13: Imunofluorescência para cav-1 e antígeno glial 2M6 em culturas de células
de retina. (a), (b) e (c) Imunorreatividade (IR) para cav-1 em culturas de E8C6 utilizando
anticorpo secundário ALEXA 488 e observada em microscopia de deconvolução
Zeiss/Apotome. Note a intensa IR para cav-1 tanto no corpo quanto nos bordos das células
retinianas com morfologia glial típica. (d) e (e), IR para antígeno glial 2M6 em culturas de
E8C6 e C8 utilizando anticorpo secundário ALEXA 488. A IR para 2M6 se apresentou com
aspecto filamentoso e se distribuiu por todo citoplasma das células gliais. Aumento de
400X; barra = 20 μM.
52
E8C7
cav-1 2M6 dapi
a
b
c
E8C7
d
e f
Figura 14: Imunorreatividade para caveolina –1 e antígeno glial 2M6 em culturas de
células de retina em E8C7. (a) e (d) IR para cav-1. (b) e (e) IR para o antígeno 2M6. (c) e
(f) DAPI. A seta aponta para uma região intensamente marcada para caveolina-1,
possivelmente um caveossoma (seta). Barra = 20μm.
53
Portanto, estes dados, em conjunto, sugerem que a expressão de cav-1
em culturas de retina embrionária de pinto ocorra exclusivamente em células
gliais.
Para confirmar a hipótese que a cav-1 é um marcador exclusivo de
células gliais na retina de pinto, uma dupla marcação para cav-1 e Neuro L em
culturas enriquecidas em neurônios foi realizada (figura 15). Para obtermos
estas culturas, utilizamos um protocolo experimental onde cultivamos nossas
células em baixa densidade sobre poli-ornitina. Nossa experiência demonstra
que este composto promove uma redução no crescimento de células gliais e,
portanto, garante um ambiente de cultura rico em neurônios (figura 15 c, f). Nas
várias culturas enriquecidas de neurônios, não observamos IR para cav-1 neste
tipo celular (figura 15 a, d). No entanto, observamos muitos neurônios positivos
para Neuro-L (figura 15 e, h). Apesar da poli-ornitina, ainda podemos observar
algumas células gliais em nossas culturas. Assim, na figura 15, notamos mais
uma vez que a IR para cav-1 foi observada apenas nas células gliais.
Vale a pena ressaltar que não observamos nenhuma IR específica para
cav-1 em neurônios retinianos em nenhum dos estágios de cultivo analisados,
apesar da presença abundante desse tipo celular em nossas culturas.
Entretanto, existem poucos neurônios em estágios de cultivo mais tardios,
como E8C11, C20 e C23 (dados não mostrados), uma vez que ocorre uma
perda de viabilidade destas células ao longo do tempo de cultivo das culturas
primárias de retina.
Para descartamos essa hipótese, realizamos análises de IF simultâneas
para cav-1 e Neurofilamento L tanto em culturas purificadas de neurônios
quanto em culturas enriquecidas de células gliais. Na figura 15 observamos um
conjunto de células gliais em culturas de E8C5 e E8C16 que se espalharam
pelo assoalho da placa de cultura e que foram imunorreativas para cav-1.
Neste mesmo campo, podemos observar um neurônio retiniano localizado
sobre a monocamada de células gliais (figura 15 h). Este neurônio apresenta
uma intensa IR para Neurofilamento L, uma proteína de filamento intermediário
conhecida como marcador neuronal. Notamos que a IR para Neuro L se
espalha homogeneamente tanto pelo soma quanto pelos neuritos do neurônio
em questão. No entanto, não observamos IR para cav-1 neste tipo celular.
54
Cav-1
Neurofilamento L
Dapi
Cav-1
Neurofilamento L
Cav-1 Neuro-L
Fase
E8C5
E8C16
a
b
c
d e f
g
h i
E8C5
Figura 15: Imunofluorescência para caveolina-1 e Neurofilamento L em culturas
purificadas de Neurônios e Glia. (a), célula glial isolada e positiva para cav-1 em cultura
enriquecida de neurônios em E8C5. (b), ausência de imunorreatividade para Neurofilamento
L nesta célula glial. (c) microscopia de fase da célula glial mostrada em (a). (d) Ausência de
IR para cav-1 em culturas enriquecidas de neurônios. (e) Marcação para Neurofilamento L na
cultura enriquecida de neurônios mostrada em (d). (f) contraste de fase da cultura mostrada
em (d) e (e). (g) IR para cav-1 em culturas de E8C16 enriquecida em células gliais. (h)
neurônio isolado positivo para neurofilamento L. (i) imagem em contraste de fase da cultura
mostrada em (g) e (h). Aumento de 400X; barra = 20μm.
55
4.3 - CAVEOLINA-1 COMO MARCADOR DE CÉLULAS GLIAIS
DIFERENCIADAS.
Vários estudos demonstram que a cav-1 pode ser um marcador de
diferenciação celular (Barar et al, 2007). Nosso grupo demonstrou em 2002
(Sanches et al) que ATP induz proliferação em culturas de retina de E7C1, ou
seja, um estágio precoce do desenvolvimento embrionário deste tecido (E8).
No decorrer dos últimos anos, a questão constante em nosso laboratório tem
girado em torno do tipo celular que responde ao efeito proliferativo induzido por
ATP em nossas culturas. Em 1990, Prada e colaboradores caracterizaram a
neurogênese dos diferentes tipos celulares que compõe o tecido retiniano.
Nesse estudo, os autores observaram que as células bipolares e a glia de
Müller fazem o seu último ciclo mitótico, portanto são geradas, entre o 7
o
e o
10
o
dia embrionário (figura 6). Portanto, tomando por base as hipóteses de
Prada et al (1990), assim como os estudos conduzidos por nosso grupo (Calvet
e Ventura 1998; Sanches et al 2002, França et al, 2007) realizamos tanto
experimentos de proliferação celular induzida por ATP quanto experimentos
para caracterização da expressão de cav-1 dentro da janela embrionária
compreendida entre o 7
o
e o 15
o
dia de desenvolvimento.
Com o objetivo de investigar o tipo celular que prolifera por estímulo com
ATP 0.1mM, realizamos a incorporação de Bromo-deoxi-uridina (Brdu), um
análogo do nucleosídeo timidina que é captado pelas células durante a fase S
do ciclo mitótico. Nas figuras 16 e 17 realizamos a quantificação das IF para
Brdu e observamos que em períodos de cultivo mais precoces (E7C1) a
incubação com ATP 0.1 mM por 24h induziu um aumento de ≅ 32% (de 660
células/cm
2
para 1000 células/cm
2
) no número de células positivas para Brdu,
quando comparado às culturas controle (figura 16e). Já em períodos de
culturas mais tardios (E8C8) não observamos diferenças no número de células
positivas para Brdu tanto nas culturas tratadas com ATP quanto nas culturas
controle (figura 17 e). Notamos também que o número de células positivas para
Brdu nas culturas de E7C1 e E8C2 tratadas com ATP (figura 16 e) foi
aproximadamente 30 vezes superior às culturas de E8C8 (figura 17 e),
sugerindo que o ATP induza mais proliferação
56
CONTROLE ATP 0.1mM
0
250
500
750
1000
*
Número de células
positivas para Brdu por mm
2
e
a
b
E7C1
Brdu
Cav-1
E7C1
CONTROLE
ATP 0.1 mM por 24H
d
Brdu
E7C1
c
Cav-1
E7C1
Figura 16: Imunorreatividade para
caveolina-1 e Brdu em culturas de
retina de E7C1 tratadas ou não com
ATP. Culturas de E7 foram tratadas ou
não com ATP 0.1 mM por 24 h. Após este
período, foram incubadas com BrdU por 2
h, lavadas, fixadas e processadas para
imunofluorescência. (a) e (c), IR para cav-
1. (b) e (d) IR para BrdU. (e) Quantificação
de células positivas para BrdU. *P< 0.05,
quando comparado com os valores de
culturas controle. Aumento de 400X; Barra
=20 μm.
57
ATP 0.1 mM por 24h
CONTROLE
Cav-1
a
E8C8
E8C8
c
Cav-1
d
E8C8
Brdu
CONTROLE ATP 0.1mM
0
10
20
30
40
Número de células
positivas para Brdu por mm
2
e
Brdu
b
E8C8
Figura 17: Imunorreatividade para Cav-1 e
BrdU em culturas de E8C8 tratadas ou não
com ATP. Culturas de E8C7 foram tratadas
ou não com ATP 0.1 mM por 24 h. Após este
período, as culturas foram incubadas com
BrdU por 2 h, lavadas, fixadas e processadas
para imunofluorescência. (a) e (c) IR para
cav-1 em células gliais. (b) e (d) IR para
BrdU. A seta em (b) indica um núcleo positivo
para BrdU nas culturas de E8C8. (e)
Quantificação das células positivas para
BrdU. Nenhuma diferença significativa no
número de células positivas para Brdu foi
observada quando comparamos as culturas
controle com as tratadas com ATP. Aumento
de 400; Barra = 20μm.
58
celular nas idades mais precoces do desenvolvimento “in vitro” do que idades
mais tardias (E8C8), revelando uma janela para efeito mitótico do ATP em
nossas culturas de retina, o que confirma os resultados obtidos por França e
colaboradores em 2007.
Uma vez que o efeito mitótico do ATP em nossas culturas só foi
observado entre E7C1/ E8C2 e a expressão de cav-1 foi ausente ou baixa
nestes períodos precoces de cultivo, só se tornando abundante nas idades
mais tardias (E8C6/C8) onde o efeito mitótico do ATP foi reduzido,
especulamos que a presença de cav-1 marcaria o início do processo de
diferenciação de nossas células gliais “in vitro”. Para confirmar essa hipótese,
realizamos ensaios de IF utilizando simultaneamente anticorpos anti-cav-1 e
anti-Brdu em culturas de E7C1 tratadas ou não com ATP 0.1 mM por 24h
(figura 16). Observamos inúmeras células positivas para Brdu nas culturas
tratadas com ATP (figura 16 d). Além disso, notamos que núcleos positivos
para Brdu se mostraram pequenos e aglomerados, indicando nesta idade a
existência de um grande número de células pequenas e proliferantes sensíveis
ao ATP (figura 16 d). Esta observação nos leva a especular que estas células
sejam possíveis precursores de células gliais ou de neurônios bipolares.
Durante a análise das imagens dos vários ensaios de IF realizados em
culturas de E8C1, notamos que ao lado das muitas células positivas para Brdu
estava presente uma única célula positiva para cav-1 (dados não mostrados).
Em uma análise mais detalhada, onde fizemos a sobreposição dessas
imagens, constatamos que esta única célula positiva para cav-1 era negativa
para Brdu, sugerindo que esta célula possa ser uma glia que saiu
precocemente do ciclo celular. Em experimentos adicionais, não observamos
células IR para cav-1 nas culturas em E7C1 (figura 16 a,c), apesar da intensa
IR para Brdu induzida por ATP neste estágio de cultivo (figura 16 d).
Ao realizamos o mesmo protocolo experimental em culturas mais velhas
(E8C7 e C8), notamos que células positivas para Brdu tornaram-se mais raras
(figura 17 b, d) enquanto que a IR para cav-1 se tornou mais intensa em
nessas culturas (figura 17 a, c). Além disso, esta IR para Brdu foi observada
em células com núcleos grandes e bem espaçados, demonstrando um padrão
de marcação para Brdu bem diferente do observado nas culturas de E7C1
59
(figura 16 b). Achamos que esta incorporação de Brdu em E8C7 se deva a um
processo conhecido como gliose reativa, onde as células gliais ainda
proliferam, sob estímulos diversos, após o término da janela propícia para a
proliferação celular durante o desenvolvimento embrionário (figura 17 b).
A análise da seqüência de ensaios de IF para Brdu nos levaram a
perguntar se as células sensíveis aos efeitos mitóticos do ATP em E7C1 ou
E8C2 eram precursores gliais ou de células bipolares. Para responder essa
questão, resolvemos tratar nossas células com ATP 0.1 mM em E8C1 por 24h.
No dia seguinte, incubamos as células com Brdu por 2 horas. Após esta
incubação, trocamos o meio de cultivo e deixamos as células se
desenvolverem até E8C7. Nesta etapa do cultivo, fixamos as culturas e
iniciamos o protocolo de IF conjunta para cav-1 e Brdu. Na figura 18
observamos que em E8C2, idade de cultivo onde promovemos a incorporação
de Brdu pelas células, a IR para este composto foi intensa e se distribuiu em
muitos aglomerados celulares (figura 18 b), enquanto que a IR para cav-1 foi
ausente (figura 18 a).
Já nas figuras 18c e 18d, realizamos, respectivamente, o ensaio de IF
conjunta para cav-1 e Brdu em culturas de E8C7 que incorporaram Brdu em
E8C2 e foram estimuladas por ATP 0.1 mM em E8C1. Nestes experimentos, foi
observado que as células intensamente imunorreativas para cav-1 (figura 18c)
em E8C7 também eram positivas para Brdu (figura 18d), sugerindo que parte
das células que passaram por seu ultimo ciclo mitótico induzido por ATP em
E8C2 se tornaram imunorreativas para cav-1 em E8C7. Estes estudos nos
levam a postular que pelo menos uma parte da população das células
sensíveis ao efeito mitogênico do ATP sejam precursores gliais, uma vez que a
cav-1 se mostrou ao longo dos nossos experimentos, um marcador da
diferenciação deste tipo celular.
60
E8C7
e
a b
c
d
E8C7
E8C7
Cav-1
Cav-1
E8C2 E8C2
Brdu
Brdu
E8C7
Figura 18: Imunorreatividade para Cav-
1 e BrdU em culturas que incorporaram
BrdU em E8C2. Culturas de E8C1 foram
tratadas com ATP 0.1 mM por 24 h. Após
este período, foram incubadas com BrdU
por 2 h, fixadas e processadas para
imunofluorescência (E8C2) ou cultivadas
por mais 5 dias na ausência de BrdU
(E8C7). (a) IR para cav-1 em E8C2. (b) IR
para BrdU na cultura mostrada em (a). (c)
IR para cav-1 em culturas de E8C7. (d) IR
para BrdU da cultura mostrada em (c). (e)
microscopia de fase da cultura mostrada
em (c) e (d). As setas vermelhas apontam
para as células positivas para Brdu
indicadas pelas cabeças de seta em (d).
A d 400 b 20
61
4.4 - EFEITO DE HIDROCORTISONA SOBRE A PROLIFERAÇÃO
CELULAR.
Sanches de colaboradores (2002) demonstraram que retinas obtidas de
embriões de pinto em estágios crescentes de desenvolvimento incorporavam
menos [H
3
]-timidina quando estimuladas por ATP, sugerindo que a proliferação
celular induzida por ATP diminuía com a diferenciação deste tecido. Com base
nisto, nos perguntamos se essa diminuição na incorporação de [H
3
]-timidina
induzida por ATP também poderia ser observada durante o desenvolvimento
de células de retina mantidas em cultura. Para isso, células obtidas de
embriões de 8 dias (E8) foram mantidas em cultura na presença ou ausência
de ATP 100µM (figura 19 a). Nas culturas de E8C1, um aumento na
incorporação de [H
3
]-timidina de aproximadamente 55 % acima dos níveis
basais foi observado após 24 horas de tratamento com ATP. Apesar da
incorporação de [H
3
]-timidina diminuir em ≅ 50% nas próximas 24h de cultivo
(E8C2) tanto nas culturas controle quando nas tratadas, o ATP ainda foi capaz
de induzir uma incorporação de [H
3
]-timidina ≅ de 54% acima dos níveis
basais (figura 19 a). Nesta etapa, efeito semelhante foi observado quando
analisamos a proliferação celular induzida por ATP em culturas de E7C1
através da contagem de células positivas para Brdu (figura 16 e). No entanto, a
partir do terceiro dia de cultura (E8C3), uma diminuição progressiva na
incorporação de [H
3
]-timidina induzida por ATP foi observada, já que nas
culturas de E8C3 e E8C8, o efeito deste nucleotídeo foi de apenas ~27% e ~13
% acima dos níveis basais, respectivamente (figura 19 a).
Muitos estudos demonstraram que a ativação de receptores para
glicocorticóides (para revisão, Amanatullah et al, 2002) constitui uma via de
diferenciação celular presente em vários tipos celulares, incluindo células da
retina (Linser e Moscona 1979, Grossman et al, 1994; para revisão, Azmitia e
Liao, 1994). Logo, resolvemos investigar o efeito de hidrocortisona, um
conhecido glicocorticóide, na proliferação induzida por ATP durante o
desenvolvimento “in vitro” de nossas células.
Para isso, células de E8 mantidas em cultura foram tratadas com
hidrocortisona 200µM após a semeadura das células nas placas de cultura.
Nos diferentes dias de cultivo indicados, as células expostas ou não a
62
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
1000
2000
3000
4000
5000
BASAL
A TP 0.1 mM
por 24 h
Tempo de cultivo (dias)
b
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
1000
2000
3000
4000
5000
BA SA L
A TP 0.1 mM
por 24 h
Tempo de cultivo (dias)
INCORPORAÇÃO DE [
3
H]-TIMIDINA
(cpm/cultura)
Figura 19: Efeito de hidrocortisona sobre a proliferação celular induzida por ATP
durante o desenvolvimento das culturas de retina. (a) Culturas controle
preparadas a partir de embriões com 8 dias foram pré-tratadas ou não por 24 h com
ATP 0.1mM e processadas para a incorporação de [
3
H]-timidina nos tempos
indicados. (b) Culturas tratadas com hidrocortisona 200 μM desde o início do cultivo
foram pré-tratadas ou não por 24 h com ATP 0.1 mM e processadas para a
incorporação de [
3
H]-timidina nos tempos indicados. Os dados representam a média ±
E.P.M. de 10 experimentos realizados em quadruplicata.
a
63
hidrocortisona foram ou não tratadas com ATP 0,1mM por 24h e processadas
para incorporação de [H
3
]-timidina (figura 19 b).
Tanto nas culturas de E8C1 quanto nas de E8C2, o tratamento com
200µM hidrocortisona bloqueou completamente o aumento na incorporação de
[H
3
]-timidina induzido por ATP (figura 19 b). Nenhuma alteração significativa na
incorporação basal de [H
3
]-timidina foi observada nas culturas de E8C1-C2
tratadas somente com 200µM hidrocortisona. Como esperado não foram
observadas modificações nos níveis de incorporação de [H
3
]-timidina nas
culturas estimuladas com ATP de E8C3, C4, C5, C6 e C8 tratadas com
hidrocortisona, sugerindo que o ATP e o glicocorticóide não foram capazes de
modular a proliferação celular após 3
0
dia de desenvolvimento “in vitro” de
nossas culturas.
Como a proliferação celular induzida por ATP em nossas culturas só foi
observada entre o primeiro (E8C1) e o segundo dia de cultura (E8C2),
resolvemos investigar o efeito de concentrações crescentes de hidrocortisona
sobre a proliferação celular induzida por ATP nas primeiras 24 horas de cultivo
(E8C1). Para isso, culturas de E8C0 foram incubadas ou não com ATP 0.1 mM
por 24h. Durante esse período de 24h, também foram adicionadas
concentrações crescentes de hidrocortisona as células (figura 20). Semelhante
ao observado em experimentos anteriores (figura 20), um aumento na
incorporação de [H
3
]-timidina de ≅ 50% acima dos níveis basais foi observado
nas culturas tratadas com ATP. Entretanto, o tratamento com hidrocortisona
inibiu completamente o estímulo proliferativo do ATP, sendo esse efeito
dependente da sua dose. Nesses experimentos, a concentração máxima de
hidrocortisona necessária para inibir a proliferação induzida por ATP em
nossas culturas foi de 50µM. (figura 20).
Estes dados em conjunto sugerem que a hidrocortisona esteja inibindo a
proliferação celular induzida por ATP em nossas células.
64
Figura 20: Efeito de concentrações crescentes de hidrocortisona sobre a
proliferação celular induzida por ATP em culturas de E8C1. As culturas foram
preparadas como descrito em Materiais e Métodos, incubadas com 0.1 mM de ATP
por 24h e processadas para a incorporação de [H3]-timidina. HC = hidrocortisona.
Os dados representam a média ± E.P.M. de 7 experimentos realizados em
triplicata. *P< 0.05, quando comparado com os valores de culturas controle.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Basal
ATP 0.1 mM
E8C1
25 μM
HC
50 μM
HC
100 μM
HC
0 μM
HC
200 μM
HC
Incorporação de [
3
H]-timidina
(cpm/placa)
*
65
A visualização, através de microscopia de contraste de fase, de nossas
culturas após sucessivos dias de tratamento com 200µM hidrocortisona revelou
uma progressiva e significativa agregação das células neuronais, aliada a uma
proeminente falta de crescimento da monocamada glial (figura 21). Tal fato foi
observado após 24 horas de tratamento com hidrocortisona. Após 48 horas de
exposição das culturas ao glicocorticóide, uma agregação significativa dos
neurônios retinianos foi observada. Após 96 horas de tratamento o processo de
agregação se intensificou (figura 21 b, e, g, l, o), perdurando até pelo menos o
8
0
dia de tratamento (E8C8). Estas observações sugerem que a exposição
prolongada de nossas culturas a hidrocortisona induziu uma atrofia do
crescimento glial. Esse efeito de agregação não foi observado nas culturas
controle em nenhum estágio de cultivo analisado (figura 21 a, d, g, j, n).
Para verificar se a hidrocortisona afetava irreversivelmente o
crescimento glial em nossas culturas, incubamos as culturas com 200µM de
hidrocortisona, por 4 dias. Após este período, as culturas foram lavadas e
incubadas com meio fresco por diversos períodos de tempo. 24h após a
retirada de hidrocortisona (E8C5) não foi observado crescimento da
monocamada glial (figura 21 f). Somente 72h após da retirada do hormônio
(E8C7) que foi observado o crescimento da monocamada glial e o
espalhamento dos neurônios em nossas culturas (figura 21 i). Este crescimento
foi progressivo com o passar dos dias de cultivo, sendo que a confluência da
placa foi observada 9 dias após a retirada de hidrocortisona (E8C13) (figura 21
p).
A quantificação destas observações revelou que 48h após a retirada do
glicocorticóide (culturas em E8C6) ocorreu um crescimento significativo de
cerca de 20% da área glial (figura 22). Já as culturas que permaneceram
expostas à hidrocortisona mantiveram sua área glial reduzida ( ≅ 40% menor,
em comparação com culturas controle). Após 9 de dias de cultivo na ausência
do glicocorticóide (E8C13), a área recoberta por células gliais atingiu 100% da
placa de cultivo (figura 22). Estes resultados sugerem que a diminuição do
crescimento glial induzido por hidrocortisona é reversível e reforça a hipótese
de que a hidrocortisona não exerça nenhum efeito tóxico em nossas culturas.
66
Para verificar a viabilidade celular de nossas culturas foi utilizado o
método de MTT (Mossman, 1983). Assim, as culturas foram incubadas com
concentrações crescentes de hidrocortisona por 72 h e no 4
o
dia de cultivo
(E8C4) as células foram submetidas ao teste de MTT. Não foram observadas
alterações significativas na viabilidade celular das culturas de E8C4 em
nenhuma das concentrações de Hidrocortisona testadas (figura 23 a).
Resultado semelhante foi observado nas culturas de E8C23 pré-tratadas com
100 ou 200µM de hidrocortisona por 72h (figura 23 b). Uma vez que nessa
idade de cultivo há uma predominância de células glias, estes dados sugerem
que a hidrocortisona não induz morte significativa nesse tipo celular. Sendo
assim, passamos a utilizar 200 µM de hidrocortisona em nossos experimentos
posteriores.
67
E8C4
E8C5
Controle
HC 0.2 mM
Interrupção do
tratamento em C4
E8C7
E8C8
E8C13
a
b
c
d e f
g
j
g
i
l m
n
o p
Figura 21: Efeito da retirada de hidrocortisona sobre a morfologia das culturas de
células de retina. Culturas obtidas a partir de embriões com 8 dias foram incubadas ou
não com hidrocortisona (HC) 0.2 mM desde o início do cultivo. Nas etapas indicadas, as
culturas foram fixadas e visualizadas por contraste de fase. Esquerda: culturas controle.
Centro: Culturas tratadas com 0.2 mM de hidrocortisona até o estágio indicado. Direita:
Culturas tratadas com hidrocortisona até E8C4 e cultivadas na ausência do hormônio até
as etapas indicadas. As fotomicrografias são representativas da média de 10 campos
diferentes obtidos em pelo menos 5 experimentos. Barra = 20 µm.
68
0 2 4 6 8 10 12 14
0
25
50
75
100
Controle
HC 0.2 mM
Retirada de
HC 0.2 mM
Tempo de cultivo (dias)
Área de confluência
(% área total)
Culturas de Embriões de 8 dias (E8)
Figura 22: Efeito de hidrocortisona sobre a área de confluência das culturas em
função do tempo de cultivo das células de retina. Hidrocortisona 0.2 mM foi
adicionada 2 h após a semeadura das células (E8C0). Nos dias de cultivo indicados, as
culturas foram fixadas e fotografadas sob iluminação de contraste de fase. A área de
confluência foi estimada como descrito em Material e Métodos. (■) controle; (▲) HC
0.2mM; (▼) Retirada do tratamento com HC em E8C4. Os dados representam a média
± E.P.M. de 5 experimentos mensurados em 10 campos por placa .
69
0
250
500
750
1000
25μM
HC
50μM
HC
100μM
HC
200μM
HC
E8C4
0 μM
HC
Viabilidade celular
(A 570 nm- A 650 nm)
0
150
300
450
600
750
+
_
+
_
_
_
Hidrocortisona
100μM por 72h
Hidrocortisona
200μM por 72h
Viabilidade celular
(A570 - A650mm)
Figura 24: Viabilidade celular de culturas após o tratamento com concentrações
crescentes de hidrocortisona. (a) Culturas de E8C4 tratadas com concentrações
crescentes de hidrocortisona (HC) por 72 h. (b) Culturas enriquecidas em glia (E8C23)
tratadas com 100μM e 200μM de hidrocortisona por 72 h. Os dados representam a média
± E.P.M. de 10 experimentos realizados em quadruplicada.
70
A via das MAP cinases p42/p44, também conhecidas como ERKs, estão
envolvidas na proliferação de vários tipos celulares (Denhardt, 1996; Lopez-
ilasaca, 1998). A participação destas enzimas na proliferação induzida por ATP
em células da retina embrionária de pinto também foi evidenciada (Sanches et
al, 2002, Nunes et al, 2007). Resolvemos então investigar o efeito de
hidrocortisona sobre a ativação das ERKs em culturas de retina. Para isso,
culturas de E8C1 e E8C6 foram incubadas com 0.2mM de hidrocortisona por
24 h e submetidas ao tratamento com ADP por 5 minutos. A taxa de
fosforilação de ERKs foi estimada por western blotting. Um aumento na
fosforilação das ERKs foi observado nas culturas de E8C1 tratadas com ADP.
Entretanto, hidrocortisona 0,2 mM bloqueou completamente o estimulo induzido
por este nucleotídeo (figura 24 a). Já em culturas em E8C6, tanto o tratamento
com ADP quando com hidrocortisona não alteraram a taxa de fosforilação das
ERKs (figura 24 b), sugerindo que estes compostos não regulem a via das
ERKs nessa idade de cultivo.
Tendo em vista que a ativação das ERKs é necessária para modular a
proliferação celular induzida por ATP em culturas jovens, resolvemos investigar
se essa mudança de sinalização poderia envolver modificações na distribuição
da ERK-p durante o desenvolvimento “in vitro” de nossas células. Análises de
IF para ERK-p em diferentes dias do cultivo mostraram uma progressiva
alteração na localização da ERK-p durante o desenvolvimento das culturas. Em
E8C2, a Imunorreatividade para ERK-p foi observada principalmente em
células retinianas pequenas e com corpo celular alongado (figura 26 a, b). Essa
IR apresentou um padrão puntiforme e distribuído por todo o corpo celular. Em
culturas de E8C4 (figura 25 f,g), a IF para ERK-p foi mais abundante quando
comparada com as culturas de E8C2 (figura 25 a,b). Múltiplos pontos de
intensa IR para ERKp foram observadas por todo o citoplasma das células
retinianas, que se mostraram bem desenvolvidas e espalhadas pela placa de
cultura (figura 25 f,g). Em E8C6, a distribuição da IF para ERK-p além de estar
presente em todo o citoplasma, também se concentrava nas bordas destas
células, caracterizando uma marcação típica que delimitava o corpo celular de
muitas células gliais (figura 25 j, l).
71
Basal ADP
HC
HC+ADP
Basal ADP
HC
E8C1 E8C6
ERK-P
a
b
HC+ADP
Figura 24: Efeito da hidrocortisona sobre a fosforilação da ERK induzida por
ADP em culturas de E8C1 (a) ou E8C6 (b). Culturas nos estágios indicados foram
pré-incubadas ou não com hidrocortisona 0.2 mM por 24 h. Após este período, as
culturas foram incubadas com 0.5 mM de ADP por 5 min e os extratos protéicos
obtidos e processados para ensaios de WB. Este WB é representativo de um
experimento realizado em duplicata.
72
E8C4
400x
E8C4
400x
400x
400x
E8C2 hidrocortisona 200 µM
630
X
630
X
400x
ERK-P
E8C2
• ERK-P
DAPI
E8C2
630
X
400x
E8C2
Hidrocortisona 200 µM
Controle
a
b
c
d
e
g
E8C6
E8C6
j
400x
400x
400x
20
μ
m
h
f
E8C4
E8C6 E8C6
E8C4
i
l
m
n
Figura 25: Efeito de 0.2mM de Hidrocortisona sobre a expressão e localização de ERK-
P durante o desenvolvimento “in vitro” de células retina de pinto. (a) e (b), culturas
controle de E8C2. (c), (d) e (e), culturas de E8C2 tratadas com 0.2 mM de Hidrocortisona por
48h. (f) e (g),culturas controle de E8C4. (h) e (i), culturas de E8C4 tratadas com
hidrocortisona por 4 dias. (j) e (l), culturas controle de E8C6. (m) e (n), culturas de E8C6
tratadas com 0.2mM de hidrocortisona por 6 dias. Em verde: marcação para ERK-P. Em
azul: marcação por DAPI. Aumento de 630X em (a),(c) e (e). Aumento de 400X nas outras
micrografias. Barra = 20 µm
73
Ensaios de IF para ERK-p após as primeiras 48h de cultivo (E8C2) na
presença de hidrocortisona revelaram uma diminuição na IR específica para
ERK-p (figura 25 c, e, d). Já após 96 h de cultivo (E8C4) e tratamento com este
glicocorticóide, a IR para ERK-p se mostrou intensa, sendo que sua distribuição
ficou restrita as regiões perinucleares das células gliais (figura 25 h, i). Após
132h de cultivo (E8C6) e tratamento com hidrocortisona, tanto a intensidade
quanto a distribuição da IR para ERK-p não foi diferente das culturas controle
(figura 25 m,n).
Nossos trabalhos recentes nos permitem sugerir que a resposta
proliferativa induzida pelo ATP entre E8 e E9 é mediada pela ativação de
receptores P2Y1 (Sanches et al, 2002; Nunes et al, 2007). Vários experimentos
descritos aqui evidenciaram a ausência de resposta ao estimulo proliferativo do
ATP em culturas mais maduras. Para investigar se essa perda de resposta ao
ATP estaria associada à ausência de receptores P2Y1 nas culturas mais
maduras, resolvemos medir a expressão destes receptores em células
retinianas de diferentes estágios de cultivo por western blotting para este
receptor. Nossos dados revelaram que a expressão dos receptores P2Y1 foi
abundante em culturas de E8C1, mas ausente em culturas E8C8. Estes
resultados sugerem que a ausência de proliferação em culturas mais
diferenciadas seja devido a diminuição da expressão destes receptores (figura
26).
74
P2Y1
E8C1 E8C8
Figura 26: Expressão de receptores purinérigicos P2Y1 em culturas de
células de retina em E8C1 e E8C8. Extratos protéicos de culturas de E8C1 e
E8C8 foram obtidos e submetidos ao ensaio de Western Blotting para o receptor
purinérgico P2Y. Este WB é representativo de um experimento realizado em
duplicata.
75
4.5 - EFEITO DA HIDROCORTISONA NA EXPRESSÃO DE CAVEOLINA-1
EM CULTURAS DE RETINA.
Muitos estudos apontam a cav-1 como uma proteína marcadora de
diferenciação celular (para revisão, Razani 2002). Um dos argumentos
imputados para fortalecer essa hipótese está no fato da cav-1 regular
negativamente a progressão do ciclo celular e, portanto, proliferação em vários
tecidos (Galbiati et al, 2001; Razani et al, 2002). Vários estudos demonstram
que o efeito inibitório da cav-1 sobre a proliferação celular envolve também a
inibição das MAP cinases p42/p44 (Engelman et al, 1998a; para revisão Razani
et al, 2002), uma vez que estas enzimas parecem exercer um papel decisivo na
indução de processos proliferativos, tanto durante o desenvolvimento (para
revisão, Zhang e Liu, 2002) quanto na fisiopatologia do câncer (para revisão,
Katsanakis et al, 2002 ; Fan e Chambers, 2001).
Para associarmos a expressão de cav-1 com a proliferação de células
retinianas “in vitro”, resolvemos expor, por diversos dias, nossas culturas ao PD
98059, um inibidor da via das MAP cinases, a fim de verificar se este composto
seria capaz de alterar o perfil endógeno de expressão de cav-1 em nossas
culturas. Foi observado que a expressão de cav-1 nas culturas tratadas
cronicamente com 25 μM PD 98059 foi significativamente menor quando
comparada com culturas controle, revelando um efeito inibitório sobre a
expressão desta proteína durante todas as etapas do desenvolvimento
analisadas (figura 27). Essas observações sugerem que a síntese de cav-1 em
nossas culturas possa estar vinculada à ativação das MAPK p42/p44 durante o
desenvolvimento. Esta hipótese está de acordo com alguns estudos (Elgelman
et al, 1999) que demonstram a existência de um “feedback negativo” entre a
síntese de cav-1 e ativação das MAPKs. Neste contexto, especulamos a
existência de um ciclo de regulação que envolve a ativação das MAPKs e a
conseqüente síntese de cav-1. Posteriormente, o aumento dos níveis desta
proteína no meio intracelular geraria, além das estruturas caveolares, o
controle negativo das vias de sinalização das MAPK, o que finalizaria, portanto,
o ciclo de regulação.
76
PD 98059 25 µM
E8
dias de cultivo
a
C3 C4
C5 C6 C7 C3
C4
C5 C6 C7
1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
120
tempo em cultura (dias)
Expressão de
caveolina-1
(% intensidade máxima)
b
Figura 27: Efeito de PD 98059 sobre a expressão de caveolina-1 durante o
desenvolvimento de culturas de células de retina. Culturas obtidas de embriões com 8
dias foram tratadas ou não com 25 μM de PD 98059 2 horas após o início do cultivo Nos
tempos indicados, extratos proteicos eram obtidos e submetidos ao ensaio de Western
Blotting para cav-1. (a) WB representativo. (b) Quantificação das bandas por densitometria
de 3 experimentos separados. (•) Controle. (•) Culturas tratadas com PD 98059. Os dados
representam a média ± E.P.M. Em E8C2 a cav-1 não foi detectada, portanto os valores da
porcentagem da intensidade foram considerados nulos. Os pontos sem barra nas culturas
controle em E8C4 e C6 representam, respectivamente, os valores de 14% ± 3,9 e 56,5% ±
1,6 da expressão máxima de cav-1 obtida nas culturas controle de E8C7. Os pontos sem
barra nas culturas tratadas com PD 98059 em E8C4, C6 e C7 representam,
respectivamente, os valores de 23% ± 0.3, 18,3% ± 1.0 e 35,5% ± 1.0 da expressão
máxima de cav-1 observada nas culturas controle de E8C7.
77
Uma vez que cav-1 está se mostrando um marcador de células gliais
diferenciadas em culturas de retina (figura 18), buscamos associar a expressão
desta proteína ao efeito inibitório da hidrocortisona sobre a proliferação celular
induzida por ATP durante o desenvolvimento de nossas culturas. Para isto,
resolvemos investigar o efeito do tratamento prolongado das células com
hidrocortisona sobre a expressão de cav-1.
Culturas em E8C0 foram tratadas com 200 μM de hidrocortisona e
mantidas por diversos períodos de tempo na presença deste glicocorticóide.
Nos tempos indicados, as células foram lisadas e os extratos protéicos
analisados para a expressão de cav-1 por WB (figura 28). Esses experimentos
revelaram um atraso de 48 horas na expressão de cav-1 nas culturas tratadas
com hidrocortisona. Apenas a partir do 5
o
dia de cultivo (E8C5) foi possível
detectar a presença de cav-1 nos extratos assim como observar o aumento na
sua expressão em função do desenvolvimento das culturas (figura 28).
Também observamos o mesmo perfil de variação na expressão de cav-1 após
o tratamento com hidrocortisona quando analisamos a expressão de cav-1
através de ensaios imunofluorescência (IF) (figura 29). Nestes ensaios, a
imunorreatividade (IR) para cav-1 foi ausente nas culturas de E8C2-C3 (figura
29 a,b) e rara nas culturas em E8C4 tratadas com 200μM de hidrocortisona
(figura 29 c). Apesar da atrofia do crescimento glial induzida por
hidrocortisona, muitas células postivas para cav-1 foram observadas nas
culturas de E8C5 (figura 29 d). Da mesma forma, uma IR mais intensa para
cav-1 foi observada em muitas células gliais nas culturas em E8C6 e C8
tratadas com hidrocortisona (figura 29 e,f)
.
78
C3 C4 C5 C6 C7 C3 C4 C5 C6 C7
HIDROCORTISONA 200 µM
Embriões de 8 dias de idade
dias de cultivo
b
CONTROLE
HC 200μM
E8C3 C4 C5 C6 C3 C4 C5 C6
a
1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
120
tempo em cultura (dias)
Expressão de caveolina-1
(% intensidade máxima)
c
Figura 28: Efeito de hidrocortisona sobre a expressão de caveolina-1 durante o
desenvolvimento de culturas de células de retina. Culturas de retina obtidas de
embriões com 8 dias foram tratadas ou não com 0.2 mM de hidrocortisona desde o
início do cultivo. Nos estágios indicados, as culturas foram lisadas e processadas para
Western Blotting. (a) e (b), são WB representativos destes tratamentos. (c)
Quantificação por densitometria, de 5 experimentos, dos dados mostrados em (a) e (b).
(•) Culturas controle. (•) Culturas tratadas com hidrocortisona. Em E8C2 a cav-1 não foi
detectada, portanto os valores da porcentagem da intensidade foram considerados
nulos. O mesmo foi observado nas culturas de E8C3 e C4 tratadas com HC. Os pontos
sem barra nas culturas controle em E8C4 e C6 representam, respectivamente, os
valores de 56.3% ± 1.58 e 80% ± 1.0 da expressão máxima de cav-1 obtida nas culturas
controle de E8C8. Os pontos sem barra nas culturas tratadas HC em E8C6 e C7
representam, respectivamente, os valores de 65% ± 1.0 e 119.2% ± 1.0 da expressão
máxima de cav-1 observada nas culturas controle de E8C8.
79
E8C2
E8C3
cav-1
E8C4
E8C5
A
E8C6
E8C8
20µm
a b
• cav-1
• dapi
c
d
e f
Figura 29: Efeito de hidrocortisona sobre a imunorreatividade para cav-1 em culturas
de retina em diversos estágios de desenvolvimento. Retinas obtidas de embriões em
E8 foram tratadas ou não com 0.2 mM de hidrocortisona desde E8C0, cultivadas em
lamínulas e nos estágios indicados foram fixadas e processadas para imunofluorescência.
a) E8C2; b) E8C3; c) E8C4; d) E8C5; e) E8C6; f) E8C8. Aumento de 400X e Escala de
20μm.
80
Já que a hidrocortisona, após 72h de incubação, inibiu a expressão de
cav-1 entre o 4
0
e o 5
0
dia de cultivo tanto nas analises de WB quanto nos
ensaios de IF(figuras 28 e 29, respectivamente), resolvemos investigar se esse
efeito inibitório poderia ocorrer em estágios mais tardios do desenvolvimento de
nossas culturas. Para isso, culturas de E8C4 foram incubadas com
hidrocortisona 200µM e a expressão de cav-1 foi verificada nos dias de cultivo
indicados (figura 30). Nenhuma alteração da expressão de cav-1 foi observada,
mesmo após 4 dias de incubação com 200µM de hidrocortisona (E8C8),
sugerindo que o efeito de inibição deste glicocorticóide sobre a expressão de
cav-1 só ocorra nos 3 primeiros dias de cultura (E8C1 a C3).
O atraso de 2 dias induzido por hidrocortisona na expressão de cav-1
(figura 28 e 29) ocorreu em estágios de cultivo onde as células não respondiam
mais ao ATP em termos de proliferação. Tendo em vista que o início da
expressão de cav-1 é coincidente com a diminuição no efeito proliferativo ao
ATP em nossas culturas, resolvemos investigar se o atraso na expressão desta
proteína induzido por hidrocortisona poderia retardar a diminuição do efeito
proliferativo do ATP.
Para isso, realizamos o tratamento das culturas com 200 µM de
hidrocortisona por tempos crescentes de cultivo, retiramos a hidrocortisona e
medimos a incorporação de [
3
H]-timidina após 24h de estimulo com ATP (figura
31). Em culturas pré-tratadas por 72 h com hidrocortisona 200µM e
estimuladas 24h com ATP 0.1mM, ou seja, culturas em E8C4, foi observado
um aumento (110% ± 19.3) significativo na incorporação de [
3
H]-timidina
quando comparado com culturas controle (12,5 % ± 13.5). Nos estágios
posteriores de cultivo, a retirada de hidrocortisona não elevou a incorporação
de [
3
H]-timidina após o estimulo de 24h com ATP (figura 31).
Em culturas de E8C3, tratadas com hidrocortisona entre C0 e C2 (48hs),
nenhum efeito proliferativo do ATP também foi observado (figura 30). Com o
objetivo de investigar o tempo de tratamento com hidrocortisona necessário
para induzir uma resposta proliferativa de nossas culturas ao ATP, resolvemos
analisar diferentes períodos de tratamento com hidrocortisona sobre a
proliferação induzida por ATP em culturas de E8C4.
81
Para isso, culturas em E8C4 foram pré-tratadas com hidrocortisona
200µM por 24h, 48h e 72 horas. Em E8C3, a hidrocortisona foi retirada e ATP
0,1 mM foi adicionado e a incorporação de [
3
H]-timidina foi medida em E8C4.
Somente o pré-tratamento com hidrocortisona por 72 horas foi capaz de induzir
um aumento significativo na incorporação de [
3
H]-timidina, dependente de ATP
(≅ 130 % acima dos níveis basais) (figura 32).
82
HIDROCORTISONA 200 µM
*
dias de cultivo
C4 C5 C6 C7 C8 C4 C5 C6 C7 C8
Culturas de Embriões de 8 dias
Figura 30: Efeito do tratamento tardio com hidrocortisona sobre a expressão de
caveolina-1 em culturas de células de retina. Culturas de retinas obtidas de
embriões com 8 dias foram submetidas ou não ao tratamento com Hidrocortisona 0.2
mM após o 4o dia de cultivo (E8C4). Nos estágios indicados, as amostras proteicas
foram obtidas e submetidas ao ensaio de Western Blotting para caveolina-1. Este
experimento foi repetido 4 vezes com o mesmo resultado.
83
INCORPORAÇÃO DE [
3
H]-TIMIDINA
(cpm/cultura)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
1000
2000
3000
4000
BASAL
ATP 0.1 mM
por 24 h
Dias de Culturas
Figura 31: Efeito da retirada de Hidrocortisona sobre a proliferação induzida
por ATP em culturas de células de retina durante o desenvolvimento.
Culturas obtidas de embriões com 8 dias foram tratadas com hidrocortisona 0.2
mM desde o início do cultivo. Vinte e quatro horas antes do experimento, a
hidrocortisona foi retirada, as culturas incubadas com ATP 0.1 mM por mais 24h
e processadas para a incorporação de [3H]-timidina. Os dados representam a
média ± E.P.M. de 10 experimentos realizados em duplicata.
84
controle HC controle HC controle HC
0
100
200
300
BASAL
ATP 0.1 mM
24 h
48 h
72 h
Incorporação de [
3
H]-Timidina
(% controle)
Figura 32: Proliferação celular induzida por ATP em culturas previamente
tratadas por tempos variáveis com hidrocortisona 0.2 mM. Culturas de E8C4
foram pré-tratadas com hidrocortisona por 24, 48 ou 72 h. Após este tratamento, as
culturas foram lavadas, a hidrocortisona retirada e as culturas incubadas por mais 24
h com ATP 0.1 mM. Após a incubação com o nucleotídeo, as culturas foram
processadas para a incorporação de [3H]-timidina. Os dados representam a média ±
E.P.M. de 9 experimentos realizados em duplicata.
85
Para verificar se a proliferação induzida por ATP em culturas de E8C4
estava associada a uma ação da hidrocortisona apenas nos 3 primeiros dias do
desenvolvimento “in vitro” de nossas células, ou seja num estágio de cultivo
onde a hidrocortisona inibia a proliferação induzida por ATP, resolvemos
incubar células em diferentes estágios de cultivo com esse glicocorticóide por
72h (figura 33). Esses períodos variaram de E8C1 até E8C5 (figura 33 a), de
E8C2 até E8C6 (figura 33b), de E8C3 até E8C7(figura 33 c) e de E8C4 até
E8C8 (figura 33 d). Nenhuma alteração significativa nos níveis basais de
incorporação de [
3
H]-timidina foi observada, antes ou após a adição de ATP 0.1
mM por 24h, em todos os períodos investigados (figura 33).
Estes dados, em conjunto, sugerem que somente o pré-tratamento por
72h com hidrocortisona, ou seja, nos três primeiros dias de cultivo, pode tornar
as células de E8C4 susceptíveis ao efeito proliferativo do ATP.
Como dito anteriormente, em nossas culturas, a expressão de cav-1 se
inicia e aumenta em E8C4 (figura 8 e 10). Como neste estágio da cultura, as
células são insensíveis ao efeito do ATP, em termos de proliferação (figura 19),
resolvemos investigar se o pré-tratamento por 72h com concentrações
crescentes de hidrocortisona poderia afetar a expressão de cav-1 no 4
0
dia de
cultivo. Como pode ser visto na figura 28, concentrações crescentes de
hidrocortisona diminuíram a expressão de cav-1 nas culturas. A concentração
máxima de hidrocortisona necessária para alcançar completa inibição da
expressão desta proteína foi de 200µM (figura 34).
Além disso, também resolvemos analisar como este pré-tratamento e a
retirada de hidrocortisona modula os níveis de [
3
H]-fosfoinositídeos induzido
por ATP em culturas de E8C4. O ATP 0.1 mM foi capaz de aumentar de 100 ±
1,7% para 202 ± 28,6 % o acúmulo de [
3
H]-fosfoinositídeos nas culturas de
E8C4. A incubação das células por 72 h com 200µM de hidrocortisona
promoveu um efeito semelhante (223 ± 24,1 % dos níveis basais). Já nas
culturas de E8C4, onde pré-tratamento com Hidrocortisona totalizou 96h, o
acúmulo de [
3
H]-fosfoinositídeos induzido por ATP foi de apenas 76,12 ± 15,1%
dos níveis basais (figura 35). Estes dados, em conjunto, sugerem que a
ausência de cav-1 induzida por hidrocortisona pode favorecer a ativação de
receptores P2Y1 e iniciar a proliferação das células em E8C4.
86
0
500
1000
72h HC 96h HC
E8C1
E8C5
incorporação de [H
3
]-timidina
(cmp/cultura)
0
500
1000
BASAL
ATP 0.1mM
por 24h
72h HC 96h HC
E8C2
E8C6
Incoporação de [H
3
]
Timidina
(cpm/cultura)
0
500
1000
72h HC
96h HC
E8C3 E8C7
Incoporação de [H
3
]
Timidina
(cpm/cultura)
0
250
500
750
1000
72h HC 96h HC
E8C4 E8C8
Incoporação de [H
3
]
Timidina
(cpm/cultura)
a
b
c
d
Figura 33: Efeito de hidrocortisona sobre a incorporação de [H3]-timidina induzida por
ATP em diferentes períodos do desenvolvimento das culturas. Culturas obtidas de
embriões com 8 dias foram tratadas com hidrocortisona 0.2 mM, por 72 ou 96 h, em E8C1
(a), E8C2 (b), E8C3 (c) ou E8C4 (d). Nas culturas tratadas por 72 h, a hidrocortisona foi
retirada e as culturas incubadas por mais 24 h na presença de ATP 0.1 mM. Nas culturas
tratadas por 96 h, a hidrocortisona não foi retirada e as culturas foram incubadas com ATP
0.1 mM na presença do hormônio. Ao final do período, as culturas foram processadas para a
incorporação de [
3
H]-timidina. Os dados representam a média ± E.P.M. de 6 experimentos
realizados em duplicata.
87
E8C4
HIDROCORTISONA
E8C4
Cav-1
100
μ
M
200
μ
M
50
μ
M 25
μ
M
Controle
Figura 34: Efeito de concentrações crescentes de hidrocortisona sobre a
expressão de caveolina-1 em culturas de E8C4. A incubação das culturas
com diferentes concentrações de hidrocortisona (HC) foi iniciada 2 horas
(E8C0) após o início da cultura. Após 72 h, a hidrocortisona foi retirada e as
células cultivadas por mais 24 h. Após este período, as culturas foram
processadas para o ensaio de Western Blotting para caveolina-1 (cav-1). O
experimento mostrado é representativo de 4 experimentos.
88
0
100
200
300
CONTROLE
ATP 0.1 mM por 1h
hidrocortisona
200μM por 72h
hidrocortisona
200μM por 96h
-
-
-
-
--
--
+
+
++
*
**
E8C4
ACÚMULO DE FOSFOINOSITÍEOS
(% DO CONTROLE)
Figura 35: Efeito de Hidrocortisona sobre o acúmulo de fosfoinositídeos
induzido por ATP em culturas de E8C4. As culturas foram incubadas com 200 µM
de hidrocortisona 2 horas após a semeadura das células. Nas culturas tratadas por
72h, a hidrocortisona foi retirada e as células incubadas por mais 24 h na ausência
do hormônio. Nas culturas tratadas por 96h, a hidrocortisona não foi retirada. Ao final
do tratamento, em E8C4, as culturas foram lavadas e incubadas com [
3
H]-inositol por
3 h. Durante a ultima hora desta incubação, as culturas foram estimuladas ou não
com 0.1mM de ATP. O acúmulo de [H
3
]-fosfoinositídeos foi determinado como
descrito em Materiais e Métodos. Os dados representam a média ± E.P.M. de 4
experimentos realizados em triplicata.
89
5 - DISCUSSÃO
Enquanto Kachi e colaboradores (2001) mostraram a expressão de
caveolina-1 em terminais de fotorreceptores, Kim e colaboradores (2006)
mostraram a expressão desta proteína na maioria das camadas e tipos
celulares da retina de rato. Em contraste, Ueda (2002) demonstrou a expressão
desta proteína apenas em células gliais de Müller na retina de rato. Neste
trabalho, caracterizamos a expressão de caveolina-1 na retina de embrião de
pinto. Nossos dados revelam uma imunoreatividade intensa para caveolina-1
em corpos celulares localizados na porção média da camada nuclear interna
(CNI), assim como a existência de processos provenientes dos corpos destas
células direcionados para a porção externa na CNI e atravessando a Camada
Plexiforme Externa e a Camada Nuclear Externa até a membrana limitante
externa, sugerindo fortemente que esta proteína seja expressa na porção
externa de células gliais de Müller neste animal. Tendo em vista que nenhuma
imunorreatividade foi observada em células amácrinas ou outros tipos
neuronais, estes dados sugerem que somente células gliais expressem esta
proteína. Esta idéia é reforçada por um outro grupo de experimentos realizados
em culturas de células que mostram que nenhuma expressão de caveolina-1
foi observada em células positivas para Neurofilamento L, um marcador de
neurônios. Somente células com morfologia glial que expressam o antígeno
glial 2M6 foram positivas para caveolina-1. Entretanto, estas observações
foram contrárias a dados recentes que mostraram que esta proteína foi
expressa em neurônios do gânglio da raiz dorsal em cultura (Galbiati et al.,
1998), em neurônios de rato em cultura (Head et al., 2007) e somente em
neurônios provenientes de córtex cerebral e hipocampo de ratos velhos, mas
não em tecidos de ratos jovens (Kang et al., 2006),
A expressão de caveolina-1 foi bastante reduzida ou até ausente em
retinas de embriões em fases precoces do desenvolvimento. A expressão
desta proteína só foi observada em retinas de embriões com 13 ou mais dias
de idade. Além disto, em culturas de células de retinas obtidas de embriões
com 7 dias de desenvolvimento, a expressão de caveolina 1 só foi observada
no 4
o
dia de cultivo das células e aumentando a partir deste estágio. Tendo em
vista que na retina embrionária de pinto a divisão celular cessa por volta do 12
o
90
dia de desenvolvimento in vivo (Prada et al., 1991) e por volta do 3
o
ou 4
o
dia
de cultivo das células in vitro (França et al., 2007; Nunes et al., 2007), nossos
dados sugerem fortemente que apenas células gliais pós-mitóticas expressem
a proteína caveolina 1. Esta idéia está condizente com outros dados desta tese
que mostram que células positivas tanto para BrdU, um marcador de células
em proliferação, quanto para caveolina 1 só foram observadas quando a
incorporação de BrdU foi realizada no 2
o
dia de cultivo e as células
processadas por imunocitoquímica no 7
o
dia de cultivo. Nenhuma
imunorreatividade para BrdU e caveolina 1 foi observada em células que
incorporaram BrdU no 2
o
dia de cultivo e que foram processadas para
imunocitoquímica no mesmo dia ou mesmo em culturas que incorporaram BrdU
no dia 7 e que foram processadas no dia 8.
O efeito proliferativo do ATP foi observado em uma janela temporal bem
definida durante o desenvolvimento da retina de pinto (Sanches et al., 2002;
França et al., 2007; Nunes et al., 2007). Tanto na retina intacta quanto em
células de retina cultivadas em monocamada, o efeito proliferativo deste
nucleotídeo só foi observado, respectivamente, até o 9
o
dia embrionário ou até
o 3
o
ou 4
o
dia de cultivo de células obtidas a partir de embriões com 7 dias.
Nenhum efeito de ATP foi observado em retinas mais amadurecidas. Tendo em
vista que neste período embrionário apenas progenitores de células gliais e/ou
bipolares estão em processo proliferativo (Prada et al., 1991), estes achados
sugeriram fortemente que este nucleotídeo induz a proliferação apenas de
progenitores gliais. Com base nestes achados, nos parece razoável considerar
os efeitos observados com hidrocortisona como efeitos em progenitores gliais
se observados no período inicial de nossas culturas (até o 4
o
dia de cultivo) e
efeitos em células gliais em diferenciação ou já diferenciadas se observados
após o 4
o
dia de cultivo.
Os resultados desta tese mostram que hidrocortisona, de uma maneira
dependente da dose, foi capaz de inibir completamente a proliferação de
progenitores gliais em nossas culturas. Este efeito inibitório foi acompanhado
por uma redução acentuada na área de confluência das culturas, um efeito que
se mostrou reversível, uma vez que a retirada deste hormônio restabeleceu a
área de confluência original das culturas. Estes dados obtidos em cultura estão
plenamente de acordo com observações anteriores que mostram que injeções
91
“in ovo” de glicocorticóides inibem a proliferação celular na retina de embrião
de pinto durante o seu desenvolvimento “in vivo” (Vento et al., 1987; Vardimon
et al., 1999, para revisão). Além disto, este efeito anti-proliferativo da
hidrocortisona está de acordo com o conceito de que este hormônio seja uma
agente diferenciador de células gliais da retina, uma vez que glicocorticóides
são capazes de induzir nestas células, a expressão de glutamina sintetase,
uma enzima considerada como um marcador de diferenciação glial (Vardimon
et al., 1999).
Nesta tese, mostramos também que, além de inibir a proliferação de
progenitores induzida por ATP, hidrocortisona foi capaz de inibir tanto a
fosforilação de ERK induzida por ADP (figura 20) quanto a formação de
fosfoinositídeos dependente de ATP (figura 33) em culturas de E8C1-4 e E8C4,
respectivamente. Tendo em vista que a proliferação de progenitores gliais na
retina embrionária de pinto por ATP foi mostrada ser dependente da ativação
sequencial de receptores P2Y1, da PLC, da PKC e das ERKs (Sanches et al.,
2002; Nunes et al., 2007), nossos dados levantam a possibilidade que o efeito
inibitório na proliferação observado com hidrocortisona seja devido a uma
inibição na expressão de receptores P2Y1 por este glicocorticóide. Embora
resultados preliminares de western blot (que não foram incluídos nesta tese)
indiquem que hidrocortisona não altera a expressão de receptores P2Y1 em
nossas culturas, os dados da figura 22 mostram a presença do receptor P2Y1
somente em culturas de E8C1, mas não em culturas de E8C8. Estes dados
sugerem que a expressão deste receptor seja regulada durante o
desenvolvimento deste tecido, sendo que esta proteína foi expressa de forma
abundante somente em etapas precoces do desenvolvimento. Entretanto,
tendo em vista que tanto a fosforilação da ERK quanto a formação de
fosfoinositídeos induzida por nucleotídeos foram inibidas por hidrocortisona,
nossos dados levantam a possibilidade de que outras moléculas, como por
exemplo, a proteína Gq responsável pela ativação da PLC-β, sejam os
componentes desta via de sinalização cuja expressão e/ou fisiologia sejam
alteradas pelo glicocorticóide. Experimentos adicionais serão necessários para
esclarecer este ponto.
Além do efeito inibitório da proliferação celular, hidrocortisona foi capaz
de inibir a expressão de caveolina 1 em nossas culturas. Esta inibição foi
92
observada apenas no intervalo de tempo compreendido entre o início da cultura
e o 4
o
dia de cultivo das células (figura 24). A partir do 4
o
dia de cultivo, mesmo
tratamentos prolongados de 5 dias não foram capazes de diminuir a expressão
desta proteína em nossas culturas.
Inicialmente, estas observações foram surpreendentes uma vez que a
hidrocortisona é um reconhecido agente diferenciador de células gliais
(Vardimon et al., 1999) que promoveu uma inibição significativa na proliferação
de progenitores gliais em nossas culturas. Neste contexto, nós esperávamos
que este hormônio fosse capaz de induzir e não inibir a expressão desta
proteína no início de nossas culturas, uma vez que sua expressão só foi
observada em células pós-mitóticas e em tecidos mais diferenciados. Uma
possibilidade para explicar esta aparente contradição seria a de que a falta de
detecção da caveolina 1 nas culturas de E8C3-4 tratadas com hidrocortisona
fosse devida á inibição da proliferação das células gliais induzida por este
hormônio. Entretanto, nossos dados revelam que a expressão de caveolina 1
aumentou consideravelmente nas culturas que mantiveram a área de
confluência bastante reduzida após o 4
o
dia de cultivo na presença do
hormônio.
Galbiati e colaboradores (1998) demonstraram que a expressão de
caveolina 1 em células NIH 3T3 é dependente da ativação de ERKs. Em
nossas culturas, o tratamento das células com PD98059, um bloqueador
específico da via das ERKs, diminuiu significativamente a expressão desta
proteína até pelo menos o 7
o
dia de cultivo, sugerindo que em nossas culturas,
a expressão desta proteína esteja sob controle desta via de sinalização. Por
outro lado, ao observarmos atentamente o efeito de hidrocortisona sobre a
fosforilação das ERKs, podemos observar que este hormônio bloqueou a
fosforilação destas enzimas em culturas de E8C1 tanto tratadas quanto não
tratadas com ADP. Já em culturas de E8C6, nenhuma diminuição na
fosforilação destas enzimas pode ser notada em nenhuma condição. Tendo
em vista que a expressão de caveolina 1 em nossas culturas também parece
estar sob controle da via das ERKs, nossos dados sugerem que hidrocortisona
seja capaz de inibir a expressão de caveolina 1 através da inibição desta via de
sinalização. Tendo em vista que a via das ERKs em progenitores gliais da
retina pode ser ativada por ADP, nossos dados levantam a possibilidade de
93
que hidrocortisona, ao inibir a ativação das ERKs induzida por nucleotídeos,
iniba também a expressão de caveolina-1 nestas células. Analisar se
nucleotídeos induzem ou não a expressão desta proteína merece experimentos
futuros.
Nossos dados também mostram que a retirada da hidrocortisona de
nossas culturas possibilitou a proliferação induzida por ATP de células em um
período mais avançado de cultivo. Este efeito só foi observado em culturas de
4 dias pré-tratadas por 72 h com o hormônio. Nestas culturas de 4 dias,
somente o pré-tratamento com hidrocortisona por 72 h foi eficaz e em células
cultivadas por mais tempo e tratadas com hidrocortisona por 72 h, este efeito
não foi observado. Estes dados sugerem que a reversibilidade do efeito
inibitório da hidrocortisona sobre a proliferação dependente de nucleotídeos
esteja restrita ao período inicial de cultivo das células, provavelmente por
envolver precursores gliais existentes neste período. De forma igualmente
interessante, o pré-tratamento das culturas de 4 dias com hidrocortisona por 72
h, seguido pela retirada do hormônio, provocou uma inibição na expressão de
caveolina 1 que foi dependente da dose de hidrocortisona. Nesta idade da
cultura (E8C4), enquanto a expressão desta proteína já era cerca de 50% da
expressão máxima nas culturas controle, nas culturas pré-tratadas com 0.2 mM
de hidrocortisona, nenhuma expressão foi detectada. Esta observação reforça
a idéia de que o estado proliferativo dos precursores gliais é acompanhado
pela não expressão da proteína caveolina 1 e sugere que a inibição da
expressão desta proteína mantenha as células em estado proliferativo após o
seu período normal de gênese. Esta idéia está de acordo com dados da
literatura que mostram que a expressão de caveolina 1 regula negativamente a
progressão do ciclo mitótico em células NIH 3T3 cultivadas (Galbiati et al.,
2001) e que a “downregulation” desta proteína é suficiente para induzir uma
hiperativação da via de sinalização das ERKs acompanhada por um aumento
na proliferação independente de ancoramento destas células (Galbiati et al.,
1998). Analisar o efeito da inativação desta proteína sobre a proliferação
celular induzida por nucleotídeos em nossas culturas, por experimentos de
RNA de interferência, por exemplo, seria bastante esclarecedor neste ponto.
94
6 - CONCLUSÕES
• A expressão de caveolina-1 aumentou progressivamente com o
desenvolvimento “in vitro” de culturas de células de retina. Este
fenômeno também foi observado no desenvolvimento “in vivo” da retina.
• A expressão de caveolina-1 foi encontrada apenas em células gliais pós-
mitóticas, sugerindo que esta proteína seja um marcador específico da
Glia de Muller pós-mitótica.
• Hidrocortisona foi capaz de inibir a proliferação de progenitores gliais
induzida por nucleotídeos presentes em nossas culturas (E8C1-2).
• Este hormônio também foi capaz de inibir a ativação da ERK
dependente de ADP em culturas jovens (E8C1) sugerindo que a
hidrocortisona iniba a proliferação celular através da inibição da
fosforilação da ERK em nossas culturas. Este glicocorticóide não foi
capaz de inibir a ativação das ERK mediada por ADP em culturas mais
diferenciadas (E8C6).
• A expressão de receptores P2Y1 foi observada apenas em culturas
jovens (E8C1), mas não em culturas mais desenvolvidas (E8C8),
sugerindo que a expressão destes receptores possa ser modulada
durante o desenvolvimento.
• A expressão de cav-1 foi inibida por um bloqueador da via da ERK,
sugerindo que a expressão desta proteína seja dependente desta via de
sinalização.
• A hidrocortisona inibiu a expressão de caveolina-1 em estágios iniciais
de cultivo (E8C0-C4), mas não em estágios mais diferenciados. Além
disso, a retirada da hidrocortisona após 72 horas de tratamento de
culturas de estágios precoces favoreceu a proliferação celular induzida
95
por ATP em um período mais avançado de cultivo (E8C4). Tendo em
vista que a expressão de caveolina-1 foi inibida por hidrocortisona nesta
condição, estes dados sugerem que a ausência de caveolina-1
mantenha os precursores gliais sensiveis ao ATP no estado proliferativo.
Com base nos dados obtidos neste trabalho e nas conclusões listadas
acima, resolvemos propor um modelo que demonstre o desenvolvimento de
precursores da glia de Muller em culturas de retina embrionária de pinto (figura
37). Cabe ressaltar que a participação de alguns elementos citados ainda é
especulativa e será investigada em experimentos futuros.
Nesta hipótese, postulamos que as células gliais jovens ou precursores
gliais presente em culturas com menos de 3 dias de cultivo (figura 36A) são
pequenas e sensíveis ao efeito mitogênico do ATP. A intensa proliferação
destas células depende tanto da ativação quando da migração da ERK
fosforilada (ERK-p) para o núcleo. Além disso, a expressão de receptores P2Y1
nesta célula é alta durante esse período de cultivo. Na seqüência do processo
de desenvolvimento, a célula glial em E8C4 (figura 36B) está em um período
de cultivo onde há a transição de um estado proliferativo para um estado de
crescimento e diferenciação. Neste estágio esta célula é insensível ao efeito
mitogênico do ATP e a ativação da ERK mediada por receptores purinégicos
do tipo P2Y1 já induz síntese de caveolina-1 que começa a se inserir na
membrana desta célula. Nos estágios mais tardios do desenvolvimento (figura
36C), a célula glial madura presente em culturas já está com mais de 4 dias de
cultivo e apresenta um citoplasma bem desenvolvido e continua não suceptivel
ao efeito mitogênico do ATP. Além disso, a expressão de caveolina-1 se
estende por vários pontos da célula e as setas roxas (figura 36C) indicam
possíveis interações entre ERK-p, caveolina-1 e outros alvos citoplasmáticos e
de membrana. Desta forma, nos estágios mais tardios do desenvolvimento a
ativação da ERK pela estimulação de receptores purinérgicos na célula glial
estaria sendo redirecionada para alvos extra-nucleares com o auxilio da
caveolina-1 e das cavéolas. A associação deste efeito com a diminuição da
expressão dos receptores P2Y1 explicaria, em parte, a insensibilidade de
célula gliais maduras á proliferação induzida pelo ATP.
96
= E8C4
CÉLULA
GLIAL EM TRANSIÇÃO
< E8C3
CÉLULA
GLIAL
JOVEM
(A)
(C)
(B)
CÉLULA
GLIAL
MADURA
>E8C4
Figura 36: Modelo representando o desenvolvimento de precursores da Glia de
Mulller em culturas de retina. (A) célula glial jovem ou precursor glial presente em
culturas com menos de 3 dias de cultivo (B) Célula glial em E8C4, período de cultivo onde
há a transição de um estado proliferativo para um estado de crescimento e diferenciação.
(C) Célula glial madura presente em culturas com mais de 4 dias de cultivo. ERK-p :
cinases regulada por sinais extracelulares forforilada, Cav-1: caveolina-1.
97
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