( PDF ) Estudos teóricos da atividade e seletividade de drogas inibidoras da enzima diidrofolato redutase

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

RÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

ÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

MARCELO LEITE DOS SANTOS

ESTUDOS TEÓRICOS DA ATIVIDADE E SELETIVIDADE

DE DROGAS INIBIDORAS DA ENZIMA DIIDROFOLATO

REDUTASE

São Cristóvão

Sergipe – Brasil

2006

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ESTUDOS TEÓRICOS DA ATIVIDADE E SELETIVIDADE

DE DROGAS INIBIDORAS DA ENZIMA DIIDROFOLATO

REDUTASE

MARCELO LEITE DOS SANTOS

Dissertação apresentada ao Núcleo de

Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal de Sergipe

como um dos requisitos para a

obtenção do título de Mestre em

Química.

Orientador: Prof. Dr. Nivan Bezerra da Costa Júnior

São Cristóvão

2006

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Santos, Marcelo Leite dos

S237e Estudos teóricos da atividade e seletividade de drogas inibidoras

da enzima diidrofolato redutase / Marcelo Leite dos Santos. – São

Cristóvão, 2006.

xxxf.

Dissertação (Mestrado) – Núcleo de Pós-Graduação em Química,

Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de

Sergipe, 2006.

Orientador: Prof. Dr. Nivan Bezerra da Costa Júnior.

1. Química. 2. Farmacos. 3. Antifolatos. 4. DHFR. 5. QSAR.

I. Título.

CDU 54:615

Dedico este trabalho a todos que direta ou indiretamente contribuíram

para minha formação, especialmente a professora Ledjane Silva Barreto

que me iniciou na carreira científica e, felizmente, é o melhor exemplo de

profissionalismo, ética e competência que um jovem pesquisador pode

seguir.

AGRADECIMENTOS

A minha esposa, Jacqueline Carvalho Peixoto dos Santos, que me ampara nas

horas difíceis e me alegra com seu sorriso;

Ao meu pai, José Bispo dos Santos, e a minha mãe, Magna Almeida Leite dos

Santos, foi com o esforço e carinho de vocês que cheguei até aqui;

Aos meus irmãos, Márcio Leite dos Santos e Márcia Leite dos Santos, irmãos

não só no sangue, mas também na alma;

Aos meus novos pais, José Veríssimo Peixoto e Genilde Carvalho Peixoto, e

novos irmãos, Vinícius Carvalho Peixoto e Tiago Carvalho Peixoto, é muito

bom tê-los como família;

Minha avó materna, Maria Almeida Leite (Dona Nina), você é a raiz mais

profunda da árvore familiar em que brotei;

Aos tios, tias, primos, primas e demais familiares, vocês são peças

fundamentais na engrenagem de minha vida;

Aos colegas de trabalho e alunos da UFS e do CEMB, é bom poder

reconhecê-los como amigos;

Aos amigos de cada dia, especialmente, Jeremias, Porfírio, Xavier, Linda,

Cris, Danilo, Elias, Iata, Danika, Fernandes, Luciano e outros que esqueci no

momento, mas que guardo no coração. Obrigado pela paciência, compreensão

e momentos de algazarra;

Aos meus professores, especialmente, a professora Ledjane, ao professor

Nivan, a professora Djalma e ao professor Luis Eduardo, vocês não são

somente meus professores, são também grandes amigos;

A professora Ana Eleonora do departamento de Engenharia Química da UFS

pela concessão da utilização do programa STATISTICA 6.0.

iii

CURRICULUM VITAE

1. Dados Pessoais

Nome: Marcelo Leite dos Santos

Nome em citações bibliográficas: Santos, M.L.

Naturalidade: Itabaiana-SE Data de Nascimento: 22/03/1981

2. Formação Acadêmica/Titulação:

Nível Superior

Curso: Química Licenciatura, Universidade Federal de Sergipe, UFS.

Ano de Conclusão: 2004

Pós-graduação

Mestrado: Química, Universidade Federal de Sergipe, UFS. Em andamento

3. Atividades Desenvolvidas no Curso de Mestrado

3.1. Atuação Profissional:

1. Colégio Estadual Murilo Braga – CEMB. Professor titular de química. Carga

horária semanal: 25 h. Servidor Público.

2. Universidade Federal de Sergipe – UFS. Professor substituto de físico-

química. Regime de 20 h semanais. Professor contratado. Disciplinas

ministradas: Química, Química Experimental, Química Básica, Química

Geral, Química Inorgânica e Físico-química II.

3.2. Trabalho em Evento (Resumo):

1. SANTOS, Marcelo Leite dos; PORFÍRIO, Leandro Oliveira; ALMEIDA,

Luis Eduardo; BARRETO, Ledjane Silva; COSTA JR, Nivan Bezerra da.

Modelos para a descrição dos índices de atividade e seletividade de

inibidores da enzima diidrofolato redutase (DHFR): um estudo teórico.

In: 28ª REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE

QUÍMICA, 2005, Poços de Caldas. Livro de resumos da 28ª Reunião

Anual da Sociedade Brasileira de Química. 2005.

3.3. Trabalhos em Eventos (Resumos submetidos):

1. SANTOS, M.L. dos; PORFÍRIO, L.O.; ALMEIDA, L.E.; BARRETO, L.S.;

COSTA JR, N.B. da. Efeito do Diedro na Construção de Modelos de

Seletividade e Atividade na Inibição da Enzima DHFR do Toxoplasma

gondii: Um Estudo Teórico. In: 29ª REUNIÃO ANUAL DA SBQ, 2006,

Águas de Lindóia, São Paulo.

2. SANTOS, M.L. dos; PORFÍRIO, L.O.; ALMEIDA, L.E.; BARRETO, L.S.;

COSTA JR, N.B. da. Relações quantitativas entre estrutura e atividade de

drogas homólogas a trimetoprima inibidoras da enzima diidrofolato

redutase. In: 29ª REUNIÃO ANUAL DA SBQ, 2006, Águas de Lindóia,

São Paulo.

3. SANTOS, M.L. dos; PORFÍRIO, L.O.; ALMEIDA, L.E.; BARRETO, L.S.;

COSTA JR, N.B. da. Estudos de QSAR da inibição enzimática da

diidrofolato redutase baseadas em drogas homólogas ao trimetrexato. In:

29ª REUNIÃO ANUAL DA SBQ, 2006, Águas de Lindóia, São Paulo.

4. SANTOS, M.L. dos; PORFÍRIO, L.O.; ALMEIDA, L.E.; BARRETO, L.S.;

COSTA JR, N.B. da. Modelagem molecular, docking de ligantes e estudos

teóricos do mecanismo de catálise enzimática da diidrofolato redutase.

In: 29ª REUNIÃO ANUAL DA SBQ, 2006, Águas de Lindóia, São Paulo.

3.4. Outros trabalhos relevantes:

1. SANTOS, Marcelo Leite dos. Modelagem Molecular no Planejamento de

Drogas. Escola de Verão de Iniciação Científica. UFS. 2005. (Curso

ministrado).

ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................

LISTA DE TABELAS ..............................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS .........................................................

LISTA DE SÍMBOLOS ............................................................................................

CURRICULUM VITAE ..........................................................................................

RESUMO .................................................................................................................

ABSTRACT .............................................................................................................

Capítulo 1 - Introdução ............................................................................................

1.1. A enzima diidrofolato redutase e seus inibidores

1.1.1. Mecanismo de ação dos inibidores

1.1.2. Principais inibidores da síntese de folato

1.2. Modelagem molecular no desenvolvimento de drogas

1.2.1. Modelagem de proteínas

1.2.2. Efeito da solvatação na modelagem de proteínas

1.2.3. Docking molecular

i) Modelagem das interações ligante-receptor

1.2.4. Estudos teóricos dos mecanismos de reações enzimáticas

1.3. Métodos teóricos aplicados na modelagem molecular

1.3.1. Método da mecânica molecular

1.3.2. Método da mecânica quântica

i) Métodos ab initio

ii) Métodos semi-empíricos

iii) Métodos de Solvatação

1.4. Relações quantitativas entre estrutura e atividade

1.4.1. Histórico e desenvolvimento de QSAR

1.4.2. Descritores empregados nos estudos de QSAR

i) Coeficiente de partição octanol-água

ii) Índices de conectividade e topológicos

iii) Área da superfície acessível ao solvente; área e volume de

superfície de van der Waals

iv) Energias dos orbitais moleculares, potencial de ionização e

afinidade eletrônica

v) Densidade dos orbitais de fronteira

vi) Superdelocalizabilidades e cargas atômicas

vii) Momento de dipolo

viii) Descritores de ligações de hidrogênio

1.4.3. Problemas e aplicação das equações de QSAR

1.4.4. Estudos de QSAR baseados na inibição da DHFR

1.5. Regressões lineares múltiplas e procedimento estatístico

1.5.1. Avaliação dos modelos lineares

i) Avaliação do grau de ajuste

ii) Avaliação do grau de significância

iii) Avaliação do grau de previsibilidade

Capítulo 2 - Objetivos .............................................................................................

2.1. Objetivo Geral ........................................................................................

2.2. Objetivos Específicos .............................................................................

Capítulo 3 - Parte Experimental ............................................................................

3.1. Classificação das drogas derivadas do TMP e TMQ

3.2. Modelagem computacional das estruturas

3.3. Alinhamento da seqüência das proteínas

3.4. Docking por superposição

3.5. Cálculos dos descritores moleculares

3.6. Regressões e modelos de QSAR

3.7. Proposição do conjunto de novas estruturas

3.8. Estudos do mecanismo da reação enzimática

Capítulo 4 - Resultados e Discussões .....................................................................

4.1. Estruturas das drogas e das enzimas modeladas

vii

4.2. Estudos de docking

4.3. Modelos de QSAR obtidos através das regressões

4.3.1. Modelos de atividade e seletividade para a série do TMP

i) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

Pneumocystis carinii

ii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

Toxoplasma gondii

iii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

Mycobacterium avium

iv) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

fígado de rato

v) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do

Pneumocystis carinii

vi) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do

Toxoplasma gondii

vii) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do

Mycobacterium avium

4.3.2. Modelos de atividade e seletividade para a série do TMQ

i) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

Pneumocystis carinii

ii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

Toxoplasma gondii

iii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do

fígado de Rato

iv) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do

Pneumocystis carinii

v) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do

Toxoplasma gondii

4.4. Estruturas das novas drogas propostas

4.5. Estudos teóricos do mecanismo da reação enzimática

Capítulo 5 - Conclusões ..........................................................................................

Capítulo 6 - Perspectivas Futuras .........................................................................

Referências Bibliográficas .................................................................

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 01. Estrutura do ácido fólico.

Figura 02. Esquema da redução do folato a diidrofolato e a tetraidrofolato pela

enzima DHFR.

Figura 03. Esquema da síntese do 2-desoxitimidilato.

Figura 04. Estruturas da sulfanilamida e sulfadiazina.

Figura 05. Esquema da ação das sulfonamidas e da trimetoprima sobre a síntese

bacteriana de folato.

Figura 06. Estruturas da trimetoprima e pirimetamina.

Figura 07. Estrutura do metotrexato.

Figura 08. Estruturas da piritrexina e trimetrexato.

Figura 09. Cavidade do sítio ativo da enzima TB-PNP complexada com um análogo

da ImmH.

Figura 10. Sítio ativo da RNase T

e o substrato 3GMP.

Figura 11. Estrutura do PNP030 sobreposto na estrutura da ImmH dentro da

cavidade do sítio ativo da enzima TB-PNP.

Figura 12. Estruturas dos complexos ternários formados por um antifolato, NADPH

e DHFR do Pc ou humana.

Figura 13. Redução do folato a 7,8-diidrofolato e 5,6,7,8-tetraidrofolato.

Figura 14. Algumas situações encontradas na investigação qualitativa da falta de

ajuste.

Figura 15. Representação da estrutura do TMP, PTX e híbridos estruturais.

Figura 16. Estrutura base dos derivados do trimetrexato.

Figura 17. Modelos balls-and-sticks das estruturas do TMP, PTX e TMQ após a

otimização da geometria.

Figura 18. Modelos das estruturas da DHFR do P. carinii e Humana.

Figura 19. Resíduos de aminoácidos selecionados ao redor dos substratos TMP e

CO4. Figura 20. Seqüências das enzimas humana e do Pc alinhadas.

Figura 21. Mapas das superfícies das proteínas DHFR humana e do Pc.

Figura 22. Comparação da região de fixação na superfície da DHFR do Pc com os

resíduos de aminoácidos do sítio ativo.

Figura 23. Superfícies das cavidades do sítio ativo da DHFR do Pc e do Hs, dos

complexos de inclusão com o TMP, PTX e TMQ.

Figura 24. Estruturas do TMP, PTX e TMQ acomodadas dentro da cavidade do sítio

ativo da DHFR do Pc e do Hs.

Figura 25. Ligações de hidrogênio formadas entre as drogas TMP, PTX, TMQ e os

resíduos de aminoácidos e moléculas de água conservadas no sítio ativo da DHFR do

Pc e humana.

Figura 26. Valores de lnIC

previstos contra os observados para o Pc.

Figura 27. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Pc.

Figura 28. Valores de lnIC

previstos contra os observados para o Tg.

Figura 29. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Tg.

Figura 30. Valores de lnIC50 previstos contra os observados para o Ma.

Figura 31. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Ma.

Figura 32. Valores de lnIC50 previstos contra os observados para o fígado de rato.

Figura 33. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o fígado de rato.

Figura 34. Valores de lnSI previstos contra os observados para o Pc.

Figura 35. Resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o Pc.

Figura 36. Valores de lnSI previstos contra os observados para o Tg.

Figura 37. Resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o Tg.

Figura 38. Valores de lnSI previstos contra os observados para o Ma.

Figura 39. Resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o Ma.

Figura 40. Atividades (lnIC

) previstas contra as observadas para o Pc.

Figura 41. Gráfico dos resíduos da regressão para a atividade contra o Pc.

Figura 42. Atividades (lnIC

) previstas contra as observadas para o Tg.

Figura 43. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o

Tg.

Figura 44. Atividades (lnIC50) previstas contra as observadas para o Rl.

Figura 45. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Rl.

Figura 46. Seletividades (lnSI) previstas contra as observadas para o Pc.

Figura 47. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o

Pc.

Figura 48. Seletividades (lnSI) previstas contra as observadas para o Tg.

Figura 49. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o

Tg.

Figura 50. Sugestões de locais para modificações estruturais nos compostos base

TMP e TMQ.

Figura 51. Modelo da estrutura do mlp

após a otimização de sua geometria.

Figura 52. Cavidade do sítio ativo da DHFR do Pc complexada com o mlp

Figura 53. Ligações de hidrogênio estabelecidas entre a mlp

e os resíduos de

aminoácidos e moléculas de água do sítio ativo da DHFR do Pc.

Figura 54. Localização dos orbitais de fronteira (HOMO-10 até LUMO+9) do

complexo proteico formado pela DHFR do Hs, NADPH e folato.

Figura 55. Localização dos orbitais de fronteira (HOMO-10 até LUMO+9) nos

resíduos de aminoácidos do sítio ativo da DHFR do Hs.

Figura 56. Estrutura do folato e átomos de nitrogênio que correspondem aos sítios

de protonação no mecanismo da reação.

Figura 57. Localização dos orbitais de fronteira para o sistema proteico sem

considerar a protonação do folato.

Figura 58. HOMO-2 e LUMO+6 localizados em posições estratégicas para a

transferência do íon hidreto do NADPH para o folato.

Figura 59. HOMO-1 e LUMO localizados em posições estratégicas para a

transferência do íon hidreto do NADPH para o diidrofolato.

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Códigos de uma e três letras usados para representar os resíduos dos

aminoácidos

Tabela 02. Conjunto de dados, contendo n objetos e m propriedades descritivas

Tabela 03. Análise da variância (ANOVA) do modelo de regressão linear múltipla

Tabela 04. Atividade e seletividade da série homóloga ao TMP e PTX

Tabela 05. Atividade e seletividade da série homóloga ao TMQ

Tabela 06. Descritores calculados para a elaboração dos modelos de QSAR

Tabela 07. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Pc

Tabela 08. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o Pc

Tabela 09. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Tg

Tabela 10. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o Tg

Tabela 11. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Ma

Tabela 12. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o Ma

Tabela 13. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Rl

Tabela 14. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o

fígado de rato

Tabela 15. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o

Tabela 16. Matriz de correlação das variáveis do modelo de seletividade contra o Pc

Tabela 17. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o

Tabela 18. Matriz de correlação das variáveis do modelo de seletividade contra o Tg

Tabela 19. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o

xii

Tabela 20. Matriz de correlação das variáveis do modelo de seletividade contra o Ma

Tabela 21. Erros para as previsões de atividade e seletividade das drogas do grupo

de teste dos derivados do TMP

Tabela 22. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Pc

Tabela 23. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de atividade contra o

Tabela 24. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Tg

Tabela 25. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de atividade contra o

Tabela 26. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Rl

Tabela 27. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de atividade contra o Rl

Tabela 28. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o

Tabela 29. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de seletividade contra o

Tabela 30. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o

Tabela 31. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de seletividade contra o

Tabela 32. Erros para as previsões de atividade e seletividade das drogas do grupo

de teste dos derivados do TMQ

Tabela 33. Atividades e seletividades previstas para as melhores estruturas propostas

derivadas do TMP e TMQ

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS OU SIGLAS

AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida

DHFR Diidrofolato redutase

Pc Pneumocystis carinii

Tg Toxoplasma gondii

Ma Mycobacterium avium

Rl Fígado de rato (Rat liver)

DNA Ácido desoxirribonucléico

NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato na forma reduzida

DUMP Monofosfato de desoxiuridilato

DTMP Monofosfato de desoxitimidilato

TS Timidilato sintetase

PABA Ácido p-aminobenzóico

TMP Trimetoprima

MTX Metotrexato

PTX Piritrexina

TMQ Trimetrexato

TB-PNP Purina nucleotídeo fosforilase do Mycobacterium tuberculosis

ImmH Immucillina-H

HOMO Orbital molecular de mais alta energia ocupado

LUMO Orbital molecular de mais baixa energia vazio

RNase T

Enzima ribonuclease T

3GMP 3-Guanosina 5-monofosfato

CAChe CAChe WorkSytem Pro Versão 6.01

PDB Protein data bank

PNP030 Derivado da 9-deazaguanina

xiv

MC Método de monte carlo

CoMFA Análise de campo molecular comparativa

FMO Teoria dos orbitais moleculares de fronteira

Ec Escherichia coli

MM Mecânica molecular

EE Energia estérica

MM3 Campo de força utilizado em mecânica molecular

SEP Superfície de energia potencial

SCF Método do campo autoconsistente

CI Interação de configuração

SCF MO Método do campo autoconsistente dentro do contexto da teoria do

orbital molecular

MNDO Modified neglect of diatomic overlap

AM1 Austin model 1

PM3 Parametric model 3

DFT Teoria do funcional de densidade

COSMO Conductor-like screening model

QSAR Relações quantitativas entre estrutura e atividade

2D Duas dimensões

3D Três dimensões

QSAR 4D Relações quantitativas entre estrutura e atividade em quatro dimensões

QSAR 5D Relações quantitativas entre estrutura e atividade em cinco dimensões

G Gráfico molecular

EC Conectividade estendida

EC(G) Conectividade estendida de k-ésima ordem

SASA Área de superfície acessível ao solvente

IP Potencial de ionização

EA Afinidade eletrônica

RML Regressão linear múltipla

MMQ Método dos mínimos quadrados

ANOVA Análise da variância

SS Soma dos quadrados

Tot

Soma dos quadrados total

Reg

Soma dos quadrados da regressão

Res

Soma dos quadrados dos resíduos

MS Média da soma dos quadrados

Hs Homo sapiens

NADP

Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato na forma oxidada

AS Área de superfície

VS Volume de superfície

xvi

LISTA DE SÍMBOLOS

Tetraidrofolato

Diidrofolato

M Matriz do alinhamento seqüencial

Par de aminoácidos da matriz do alinhamento seqüencial

W Moléculas de água

Ψ Função de onda

H Operador Hamiltoniano

E Energia

F Teste F

Concentração mínima inibitória de 50% da atividade fisiológica

100

Dose letal capaz de matar 100% dos indivíduos

Dose capaz de produzir 50% de seu efeito máximo

P Coeficiente de partição octanol-água

LogP Logaritmo do coeficiente de partição octanol-água

M1 Primeiro índice de grupo de Zagreb

M2 Segundo índice de grupo de Zagreb

χ Conectividade molecular

Conectividade de valência

Número atômico do átomo i

Número de elétrons de valência do átomo i

κ Índice de forma de primeira ordem

κ Índice de forma de segunda ordem

κ Índice de forma de terceira ordem

Densidade eletrônica de fronteira eletrofílica

xvii

Densidade eletrônica de fronteira nucleofílica

OMO,n

Coeficientes dos orbitais atômicos no HOMO

Orbitais atômicos

LUMO,n

Coeficiente dos orbitais atômicos no LUMO

Superdelocalizabilidade

E,A

Superdelocalizabilidade eletrofílica

N,A

Superdelocalizabilidade nucleofílica

Coeficientes dos orbitais moleculares j

A Número de orbitais de valência

Energia do orbital molecular j

Q Cargas atômicas parciais

µ Momento de dipolo molecular

Energias das ligações de hidrogênio

, X

,..., X

Variáveis independentes ou explicativas

Y Fenômeno observado

Termo constante de ajuste

, β

,..., β

Coeficientes das variáveis independentes

ε Erro associado ao modelo

, b

,..., b

Estimativas para os valores das variáveis independentes

Valores previstos do fenômeno observado

Y Média dos valores do fenômeno observado

R Coeficiente de correlação

Ajust

Coeficiente de correlação ajustado

s Desvio padrão

i-ésimo resíduo

Coeficiente de determinação do modelo

df Graus de liberdade

Variância do modelo de regressão

p Probabilidade

T Intervalo de confiança

t Teste de student

xviii

PRESS PREdictive Sum of Squares

Coeficiente de correlação da validação cruzada

PRESS

Desvio padrão da validação cruzada

SI Índice de seletividade

µM Concentração em micromols por litro

1DYR Código PDB para a enzima DHFR do Pc

1PD9 Código PDB para a enzima DHFR do Hs

CO4 2,5-diamino-5-metil-6-[(3,4,5-trimetoxi-N-

metilanilina)metil]pirido[2,3-d]pirimidina

TOP Trimetoprima

∆

H Calor de formação

HOMO

Energia do HOMO

LUMO

Energia do LUMO

η Dureza molecular

Eletronegatividade molecular

HOMO

Densidade do HOMO

LUMO

Densidade do LUMO

Densidade eletrônica de fronteira radicalar

R,A

Superdelocalizabilidade radicalar

lnIC

Logaritmo natural do índice de atividade

lnSI Logaritmo natural do índice de seletividade

pH -log da concentração de hidrogênios

-log da constante ácida

xix

RESUMO

Doenças infecciosas causadas por parasitas oportunistas como Pneumocystis

carinii (Pc), Toxoplasma gondii (Tg) e Mycobacterium avium (Ma) estão entre as

principais causas de óbitos entre pacientes aidéticos. Por isso, atualmente, há um

grande interesse no desenvolvimento de novos inibidores da diidrofolato redutase

(DHFR), uma importante enzima alvo no tratamento destas patologias. As terapias

medicamentosas atuais apresentam intensa possibilidade de efeitos colaterais,

tornando necessário o desenvolvimento de drogas mais seletivas. Algumas propostas

encontradas na literatura são baseadas nos análogos do folato trimetoprima (TMP),

piritrexina (PTX) e trimetrexato (TMQ), com o objetivo de unir as características de

alta seletividade do TMP à alta potência do PTX e do TMQ. Estes estudos serviram-

nos de base para a elaboração de relações quantitativas entre estrutura e atividade

(QSAR) através dos valores de IC

e índices de seletividade (SI). Estas relações

foram estabelecidas através de regressões lineares múltiplas (RML) no programa

STATISTICA 6.0, utilizando um conjunto de 130 descritores atômicos e

moleculares, clássicos e quânticos, estes últimos foram obtidos através de métodos

semi-empíricos AM1, todos os descritores foram calculados no programa CAChe

Worksystem Pro Versão 6.01. Os modelos de QSAR aqui obtidos apresentaram

consideráveis significâncias estatísticas, destacando-se o modelo para a atividade

contra o Ma (R

= 0,9756 e F

8,13

= 64,9278) na série derivada do TMP e, o modelo

para a atividade contra o Tg (R

= 0,9446 e F

4,22

= 93,8288) na série homóloga ao

TMQ. Na seqüência, a partir da modelagem molecular e estudos de docking das

estruturas da DHFR humana e do Pc, fizemos a sugestão de novos inibidores mais

potentes e/ou seletivos. Nestes estudos avaliamos as diferenças existentes entre as

duas DHFR através de mapas da superfície das proteínas, das cavidades dos sítios

ativos e do alinhamento das seqüências de aminoácidos, verificando que os

aminoácidos Ile123 na DHFR do Pc e Val115 na DHFR humana devem ser

responsáveis por ligações de hidrogênio diferenciais com as drogas que podem

proporcionar maior seletividade. Uma das novas drogas propostas, o mlp

apresentou uma elevada atividade (IC

= 0,0203µM) e seletividade (SI = 10,7970)

contra a DHFR do Pc. Por fim, avaliamos o mecanismo da reação de conversão do

folato a diidrofolato e a tetraidrofolato, através de cálculos semi-empíricos AM1 dos

orbitais de fronteira do complexo enzimático, utilizando o escalonamento linear

MOZYME e considerando o efeito de solvatação com o COSMO. Verificamos que a

influência do solvente é importante na localização dos orbitais de fronteira e que a

etapa de protonação precede a transferência do íon hidreto.

Palavras-chave: Antifolatos, DHFR, QSAR, modelagem molecular e docking.

xxi

ABSTRACT

Infectious diseases caused by opportunistic parasites as Pneumocystis carinii

(Pc), Toxoplasma gondii (Tg) and Mycobacterium avium (Ma), often found in

patients with AIDS, are the major cause of death in these patients. Therefore,

actually, there is a great interest in the development of new inhibitors of the

dihydrofolate reductase (DHFR), an important target enzymatic in the treatment of

these pathologies. The current therapies present intense possibility of side-effects,

turning necessary the development of more selective drugs. Some proposed found in

the literature are a set of analogous of the antifolates trimethoprim (TMP), piritrexim

(PTX) and trimetrexate (TMQ), with objective of conjugate the characteristics of

high selectivity of TMP and high potency of PTX and TMQ. These studies served us

as base for the elaboration of quantitative structure-activity relationships (QSAR)

through the values of IC

and selectivity index (SI). These relationships were

established through multiple linear regressions (RML) in the STATISTICA 6.0

program, using a group of 130 atomic and molecular, classical and quantum

descriptors, these last ones were obtained through AM1 semi-empiric methods, all

the descriptors was calculated in the CAChe Worksystem program Version 6.01. The

QSAR models here obtained presented considerable statistical significance, standing

out the model for the activity against Ma (R

= 0,9756 and F

8,13

= 64,9278) to derived

series of TMP and, the model for the activity against Tg (R

= 0,9446 and F

4,22

93,8288) in the homologous series to TMQ. In the sequence, starting from the

molecular modeling and docking studies of the structures of human and Pc DHFR,

we made the suggestion of new inhibitors more potent and selective. In these studies

we evaluated the differences among two DHFR through of the surface proteins maps,

cavities of the active sites and alignment of the sequences of amino acids, verifying

that the amino acids Ile123 in Pc DHFR and Val115 in human DHFR should be

xxii

responsible for hydrogen bonding differentiate with the drugs that can provide larger

selectivity. One of the new proposed drugs, the mlp

, presented a high activity (IC

= 0,0203 µM) and selectivity (SI = 10,7970) against DHFR of the Pc, appearing as a

potential molecule for the synthesis and experimental evaluation of the biological

activity. Finally, we evaluated the mechanism of the enzymatic reaction of

conversion of the folate to the dihydrofolate and the tetrahydrofolate, through AM1

semi-empiric calculations of the enzymatic complex frontier orbitals, using the

linear-scaling MOZYME and considering the solvent-effect with COSMO. We

verified that the influence of the solvent is important in the location of the frontier

orbitals and that the protonation stage precedes the transfer of the hydride ion.

Key-words: Antifolates, DHFR, QSAR, molecular modeling and docking.

INTRODUÇÃO

- 1 -

Capítulo 1

Introdução

1.1. A enzima diidrofolato redutase e seus inibidores

Apesar da revolução da saúde nas últimas três décadas ter produzido um

substancial ganho em termos de expectativa de vida e avanços sem precedentes na

medicina, doenças infecciosas, tais como doenças tropicais, ainda acarretam um

grande sofrimento à população dos países pobres e em desenvolvimento. Uma das

causas é a falta de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos para o tratamento

de doenças que atingem os povos mais carentes [1]. Trata-se de uma simples questão

de economia: o retorno potencial sobre o investimento determina como as empresas

privadas decidem alocar seus recursos de pesquisa.

As populações dos paises em desenvolvimento que sofrem da síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS) ficam praticamente as margens de todos os

progressos no tratamento devido aos poucos recursos disponíveis. Como resultado do

limitado acesso aos coquetéis de medicamentos, freqüentemente muito caros,

infecções causadas por diversos parasitas “oportunistas” que afligem pacientes

aidéticos são um problema de saúde pública global, com importantes implicações

políticas e sociais [2].

As doenças causadas por estes microorganismos figuram na primeira posição

de causas de óbitos em pacientes com AIDS, por isso, desde os anos 90, vem

aumentando o interesse no desenvolvimento de inibidores da diidrofolato redutase

(DHFR), um importante alvo no combate desses parasitos [3]. Dois grupos que tem

feito as maiores contribuições nessa área são o de Andre Rosowsky [4] e o de Aleem

Gangjee [5].

INTRODUÇÃO

- 1 -

Os microorganismos frequentemente estudados nestas pesquisas são fungos

como o Pneumocystis carinii (Pc) causador de pneumonia; protozoários como o

Toxoplasma gondii (Tg), responsável pela toxoplasmose, doença autolimitada e até

mesmo assintomática, que pode, porém, causar graves danos ao feto e a indivíduos

imunodeprimidos; e, algumas vezes, bactérias como Mycobacterium avium (Ma),

que pode causar infecções no sangue, hepatite, lesões na pele, pneumonia e muitas

outras doenças graves [3]. Além destes, também são avaliados os efeitos dos

inibidores frente à enzima dos mamíferos usando como modelo o fígado de rato (Rl).

1.1.1. Mecanismo de ação dos inibidores

O mecanismo de ação dessas drogas está relacionado à utilização do ácido

fólico (ácido pteroilglutâmico) pelo parasito. Este é constituído de um anel de

pteridina, ácido para-aminobenzóico e ácido glutâmico, figura 01.

Figura 01. Estrutura do ácido fólico.

Provavelmente não ocorre dessa forma na natureza, mas pode ser considerado

como o composto original de um grupo de folatos de ocorrência natural. Esses

compostos diferem do ácido fólico em diversos aspectos. Podem ocorrer em

diferentes estados de redução do anel pteridina, várias unidades de um carbono

podem ligar-se aos nitrogênios 5 ou 10, ou a ambos, e radicais adicionais de ácido

glutâmico podem ligar-se ao glutamato através de ligações γ-peptídicas incomuns,

produzindo poliglutamatos de folato.

Os folatos são essenciais para a síntese do ácido desoxirribonucléico (DNA),

visto que atuam como cofatores na síntese de purinas e pirimidinas. São também

NH C NH CH

COOH

(CH

)

COOH

Anel de pteridina

Ácido

-aminobenzóico

(PABA)

Ácido glutâmico

INTRODUÇÃO

- 2 -

necessários para reações envolvidas no metabolismo dos aminoácidos. Em todas as

reações, os poliglutamatos são consideravelmente mais ativos do que os

monoglutamatos. Para adquirir atividade, o folato deve encontrar-se na forma

tetraidro, na qual é mantido pela enzima diidrofolato redutase. Esta enzima reduz o

ácido fólico da dieta a tetraidrofolato (FH

) numa reação em duas etapas e também

reduz o diidrofolato (FH

) produzido a partir do FH

durante a síntese do timidilato.

A catálise ocorre usando o cofator enzimático nicotinamida adenina dinucleotídeo

fosfato (NADPH) como agente redutor [6]. Nesta reação um íon hidreto é

transferido diretamente do anel nicotinamida do NADPH para o anel pteridina do

diidrofolato, figura 02. Como as duas estruturas estão muito próximas, separadas

apenas por uma distância menor do que a de interações de van der Waals, este

contato promove a formação de um estado de transição para a transferência

eletrônica [6].

Figura 02. Esquema da redução do folato a diidrofolato e, em seguida, a

tetraidrofolato pela enzima DHFR. As regiões selecionadas indicam os sítios de

reação.

Os folatos são particularmente importantes na conversão do monofosfato de

desoxiuridilato (DUMP) em monofosfato de desoxitimidilato (DTMP). Esta

conversão é catalisada pela enzima timidilato sintetase (TS), o folato atua como

doador de um grupo metila. Durante essa reação, o FH

é oxidado a FH

, figura 03,

devendo ser reduzido para que possa novamente atuar. A reação da TS limita a

velocidade na síntese de DNA dos mamíferos.

INTRODUÇÃO

- 3 -

Figura 03. Esquema da síntese do 2-desoxitimidilato.

A síntese de folatos constitui um exemplo de via metabólica encontrada nas

bactérias, mas não no ser humano. O folato é necessário para a síntese de DNA tanto

nas bactérias quanto no ser humano. O ser humano obtém o ácido fólico a partir da

dieta e desenvolveu um mecanismo de transporte para a sua captação no interior das

células. Não precisa sintetizá-lo e, na verdade, não pode fazê-lo. Ao contrário, a

maioria das espécies de bactérias, bem como as formas assexuadas dos protozoários,

não desenvolveram os mecanismos de transporte necessários e não podem utilizar o

folato pré-formado. Necessariamente, devem sintetizar seu próprio folato.

1.1.2. Principais inibidores da síntese de folato

As sulfonamidas contêm o componente sulfanilamida – um análogo estrutural

do ácido p-aminobenzóico (PABA), que é essencial na síntese de folatos. As

sulfonamidas competem com o PABA pela enzima envolvida na síntese de folato, a

saber, a diidropteroato sintetase, e, portanto, inibem o metabolismo das bactérias. Em

geral, as sulfonamidas são utilizadas na forma de sais de sódio. Alguns exemplos de

sulfonamidas de uso clínico incluem: sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfadimidina e

sulfametoxazol administrado com trimetoprima (TMP) conhecido como

cotrimoxazol. A figura 04 apresenta a estrutura de duas sulfonamidas.

INTRODUÇÃO

- 4 -

(a (b

N SO

NHH

a) b)

Figura 04. (a) Estrutura da sulfanilamida e (b) da sulfadiazina.

Nos últimos dez anos, vários trabalhos foram realizados com o objetivo de

desenvolver e sintetizar moléculas inibidoras da enzima DHFR [4,7-21], na

esperança de encontrar agentes que possam ser superiores aos regimes que

combinam duas drogas antifólicas, onde um inibidor da diidropteroato sintetase

(sulfametoxazol, por exemplo) é combinado a um inibidor da DHFR tal como TMP

ou pirimetamina, figura 05.

Figura 05. Esquema da ação das sulfonamidas e da trimetoprima sobre a

síntese bacteriana de folato.

Do ponto de vista estrutural, a trimetoprima, figura 06 (a), apresenta alguma

semelhança com o componente pteridina do folato. A semelhança é próxima o

suficiente para confundir a enzima bacteriana relevante. A TMP é quimicamente

relacionada com o agente antimalárico, pirimetamina, figura 06 (b), ambos são

antagonistas do folato [22].

INTRODUÇÃO

- 5 -

OMe

NCH

(a)

(b)

Figura 06. (a) Estrutura da trimetoprima e (b) da pirimetamina.

A utilização de folatos, na forma de tetraidrofolato, como cofator na síntese

de timidilato é um exemplo de uma via em que se verifica uma sensibilidade

diferencial das enzimas humanas e bacterianas a substâncias químicas. A DHFR das

bactérias é muitas vezes mais sensível ao antagonista do folato TMP que a enzima

humana.

Por outro lado, a DHFR humana é muito sensível ao efeito do análogo do

folato, metotrexato (MTX), sendo este composto utilizado na quimioterapia de certos

cânceres [23]. O MTX é inativo nas bactérias, visto que, em virtude de sua estrutura

ser muito semelhante à do folato, figura 07, é necessária sua captação ativa pelas

células.

CONH CH

COOH

(CH

)

COOH

Figura 07. Estrutura do metotrexato.

Este é uma droga usada no tratamento de muitos tumores que crescem

rapidamente, tais como leucemia aguda e coriocarcinoma. No entanto, o MTX é

muito tóxico, destruindo rapidamente as células que se replicam, sendo elas malignas

ou não. Células originadas na medula óssea, células epiteliais do trato intestinal, e

folículo capilar são vulneráveis a ação deste folato antagonista, ocorrendo em muitos

casos seus efeitos tóxicos colaterais.

INTRODUÇÃO

- 6 -

Um aspecto fundamental para o uso de antifólicos como medicamentos é a

necessidade de fortalecer as interações entre as drogas e a DHFR do parasito, em

detrimento das interações com a DHFR dos mamíferos. Isto leva a um aumento da

seletividade em relação à enzima do microorganismo, com a possibilidade de

diminuição dos efeitos colaterais.

Os medicamentos utilizados clinicamente apresentam uma intensa

possibilidade de efeitos adversos, o que dificulta o tratamento dessas doenças.

Algumas drogas lipofílicas inibidoras da DHFR são o TMP, já citado, a piritrexina

(PTX) e o trimetrexato (TMQ), figura 08.

Me OMe

OMe

(b)

(a)

OMe

Figura 08. (a) Estrutura da piritrexina e (b) do trimetrexato.

Quando usado sozinho, o TMP não é potente o bastante para alcançar uma

significante redução da parasitemia e, por isso, requer uma coadministração com uma

droga sulfa para aumentar sua eficácia. No entanto, muitos pacientes desenvolvem

sérias reações alérgicas na pele devido às drogas sulfa e, portanto, tem

descontinuidade no tratamento antes da cura completa ser alcançada.

Um inibidor muito mais potente da DHFR do que o TMP, aprovado há

poucos anos para o uso em pacientes aidéticos com pneumonia devido ao fungo

Pneumocystis carinii é o MTX. Ao contrário do TMP, que é muito mais seletivo em

sua capacidade de ligar-se a DHFR do Pc e outros parasitos oportunistas, quando

comparado com a DHFR humana, o MTX perde em seletividade, interagindo

fortemente também com a enzima humana e, por isso, requer uma coadministração

com leucovorin (ácido 5-formiltetraidrofólico) para proteger seletivamente o

paciente dos severos efeitos colaterais hematológicos que podem ocorrer. A

explicação para esta proteção seletiva é que os parasitos sintetizam seu próprio folato

INTRODUÇÃO

- 7 -

e, então, em contraste com as células mamíferas, não possuem proteínas

transportadoras de folato em sua membrana celular [2].

O PTX e o TMQ apresentam certa semelhança com o MTX, possuindo

também alta afinidade pela DHFR dos parasitas, sendo também pouco seletivos a

enzima destes microorganismos, o que acarreta severos efeitos colaterais e requer

coadministração de leucovorim.

Devido às limitações apresentadas pelos regimes já mencionados, um inibidor

da DHFR que combine a potência do MTX, TMQ ou PTX com a especial

seletividade do TMP poderá ser a solução para eliminar a necessidade de

coadministração com uma droga sulfa ou leucovorin.

1.2. Modelagem molecular no desenvolvimento de drogas

Modelos são representações simplificadas de objetos e fenômenos físicos

reais. A modelagem consiste na construção e manipulação de modelos com o

objetivo de compreender mais profundamente os elementos por eles representados

[24].

A modelagem molecular consiste na geração, manipulação e/ou representação

realista de estruturas moleculares e cálculo das propriedades físico-químicas

associadas. Geralmente é assistida por computadores. O instrumento matemático

usado é a química teórica e a computação gráfica é a ferramenta para manusear os

modelos. Atualmente, os sistemas de modelagem molecular estão munidos de

poderosas ferramentas para construção, visualização, análise e armazenamento de

modelos de sistemas moleculares complexos que auxiliam na interpretação das

relações entre a estrutura e a atividade biológica. São realizados cálculos de energias

de conformação, de propriedades termodinâmicas, de orbitais moleculares e

estatísticos.

A modelagem molecular pode ser aplicada ao planejamento de fármacos de

modo direto ou indireto. Diretamente, quando se conhece a estrutura tridimensional

do alvo biológico, na tentativa de compreender as interações dos complexos ligante-

receptor. Indiretamente, quando não se dispõe da estrutura do receptor, na tentativa

de obter parâmetros eletrônicos e estéricos que elucidem as relações estrutura-

INTRODUÇÃO

- 8 -

atividade biológica. Ambos os modos tentam otimizar o encaixe da molécula com o

receptor. A modelagem molecular e suas representações gráficas permitem explorar

aspectos tridimensionais de reconhecimento molecular e gerar hipóteses que levam

ao planejamento e à síntese de novos ligantes.

Normalmente, os ligantes apresentam interações com alto grau de

complementaridade com seu alvo. Esta característica pode ser avaliada de várias

formas. Com o auxílio de computadores e softwares de modelagem, modelos

moleculares de compostos podem ser construídos, desenhando-os em um monitor e

movimentando-os para assumir diferentes conformações. Assim, o uso da

modelagem molecular com o auxílio da computação gráfica permite o

desenvolvimento mais racional de uma droga [25].

Qualquer composto que se mostre promissor pode ser modelado juntamente

com a imagem tridimensional do sítio receptor. O ajuste entre o composto e o

receptor pode sugerir modificações que podem ser feitas para que o composto

resultante tenha ligações mais favoráveis. Neste sentido, a seleção de compostos a

serem sintetizados passa por um processo de filtração, onde a interpretação da

atividade biológica será mais racional e permitirá que compostos

farmacologicamente ativos sejam mais rapidamente descobertos [25].

Muitos ligantes apresentam complementaridade de forma com a região da

macromolécula onde irá se ligar, o sítio de ligação, também chamado de sítio ativo.

Isto pode ser analisado pela construção de superfícies moleculares como superfícies

da cavidade do sítio ativo [26]. Essa superfície é criada acima dos átomos do sítio

ativo da proteína considerando seus raios de van der Waals. O diagrama da superfície

é apresentado na forma de contornos paralelos que permitem avaliar as interações

entre a droga e os átomos do sítio ativo. A superfície é colorida para dar informações

precisas sobre a especificidade química como pode ser observado na figura 09.

INTRODUÇÃO

- 9 -

Figura 09. Cavidade do sítio ativo da enzima purina nucleotídeo fosforilase do

Mycobacterium tuberculosis (TB-PNP) complexada com um análogo da

Immucillina-H (ImmH) [27].

Na superfície apresentada acima as linhas vermelhas representam a região da

proteína que requer grupos aceptores de hidrogênio na droga, as azuis doadores de

hidrogênio e as amarelas representam uma região hidrofóbica da proteína formada

por grupos de aminoácidos apolares. O esquema de cores permite o desenvolvimento

racional de novos ligantes, através de modificações no composto base com o objetivo

de fortalecer as interações, principalmente as ligações de hidrogênio.

É importante lembrar que uma boa droga não é simplesmente aquela que

interage favoravelmente com seu alvo. Depois da administração, a droga deve

alcançar o sítio de ação. Este processo de transporte freqüentemente requer que a

droga passe pela membrana celular, ambiente hidrofóbico, logo, a droga deve ser

suficientemente lipofílica para atravessar a membrana. Uma vez dentro da célula, a

droga pode atingir seu alvo. Porém, durante este processo a droga pode ser removida

do organismo pelo metabolismo, excreção e outros mecanismos.

1.2.1. Modelagem de proteínas

A análise das propriedades de macromoléculas que contém milhares de

átomos como proteínas é mais facilmente realizada fazendo-se uso da computação

INTRODUÇÃO

- 10 -

gráfica, esta reduz a complexidade de observação do sistema e permite focar somente

uma porção relativamente pequena da estrutura da proteína, por exemplo, o sítio

ativo onde a molécula de uma droga se liga [28].

Observando a estrutura de proteínas é possível perceber similaridades na

topologia e até mesmo em detalhes estruturais. A comparação da estrutura de

proteínas pode revelar certas relações evolucionárias. Se a seqüência de aminoácidos

de duas proteínas puder ser alinhada, pode-se contar o número de resíduos idênticos

ou usar um índice de similaridade entre os aminoácidos. Tais índices têm a forma de

uma matriz M, de modo que cada entrada correspondente a um par de aminoácidos

dá uma medida da similaridade entre qualquer par de aminoácidos [29]. A

similaridade entre duas seqüências é então a soma dos valores para cada par do

alinhamento dos aminoácidos examinados na matriz, mais uma correção para os

espaços vazios encontrados nas seqüências dos sítios de inserção ou deleção de

aminoácidos.

Normalmente os nomes dos resíduos de aminoácidos das seqüências das

proteínas que estão sendo alinhadas são escritos em códigos de 1 ou 3 letras, a tabela

01 apresenta a relação entre os nomes dos aminoácidos e os seus respectivos códigos.

INTRODUÇÃO

- 11 -

Tabela 01. Códigos de uma e três letras usados para representar os resíduos dos

aminoácidos

Resíduos Código de 1 letra Código de 3 letras

Alanina

A Ala

Arginina

R Arg

Asparagina

N Asn

Ácido aspártico

D Asp

Cisteína

C Cys

Glutamina

Q Gln

Ácido glutâmico

E Glu

Glicina

G Gly

Histidina

H His

Isoleucina

I Ile

Leucina

L Leu

Lisina

K Lys

Metionina

M Met

Fenilalanina

F Phe

Prolina

P Pro

Serina

S Ser

Treonina

T Thr

Triptofano

W Trp

Tirosina

Y Tyr

Valina

V Val

1.2.2. Efeito da solvatação na modelagem de proteínas

A solvatação pode ter um profundo efeito nos resultados de cálculos

moleculares. O solvente pode afetar fortemente as energias de diferentes

conformações. Ela influência o padrão de formação de ligações de hidrogênio, área

da superfície do soluto, e exposição dos grupos hidrofílicos/hidrofóbicos de

moléculas de proteínas [29]. O efeito do solvente pode ser avaliado levando-se em

consideração uma constante dielétrica que representa o efeito provocado por

INTRODUÇÃO

- 12 -

moléculas do solvente através de interações eletrostáticas, esta constante

normalmente varia de 1 (no vácuo) a 7,8 (em água) [28].

O efeito da solvatação provoca uma grande modificação na energia e

distribuição espacial dos orbitais moleculares de uma proteína. Interessantemente, os

orbitais de fronteira, orbital molecular de mais alta energia ocupado (HOMO) e

orbital molecular de mais baixa energia vazio (LUMO), da proteína hidratada são

encontrados localizados na maior parte dos resíduos de aminoácidos importantes,

geralmente os que compõem o sítio ativo, o que difere em fase gasosa [30]. A

explicação para a origem na modificação das energias dos orbitais é atribuída ao

efeito dielétrico da água que abaixa consideravelmente a energia dos orbitais.

A hidratação da proteína causa uma mudança relativa no ordenamento dos

orbitais moleculares, resultando em uma localização dos orbitais de fronteira no sítio

ativo no caso da enzima ribonuclease T

(RNase T

) hidratada, figura 10.

Figura 10. Sítio ativo da RNase T

e o substrato 3-guanosina 5-monofosfato (3GMP).

HOMO-1 e HOMO-2 são representados pelos lóbulos vermelhos e LUMO+2 e

LUMO+3 são representados pelos lóbulos azuis [30].

1.2.3. Docking molecular

Nos estudos de docking molecular procura-se predizer a estrutura, ou

estruturas, de um complexo intermolecular formado entre duas ou mais moléculas. O

docking é amplamente usado para sugerir modos de ligação de inibidores proteicos.

INTRODUÇÃO

- 13 -

Estes estudos são realizados em programas que possuem algoritmos capazes de gerar

um grande número de possíveis estruturas, e também são capazes de avaliar cada

estrutura para identificar aquela mais promissora, normalmente, essa pesquisa

envolve muitos graus de liberdade, entre eles são considerados os translacionais,

rotacionais e conformacionais [28].

Muitos métodos que levam em consideração os graus de liberdade

conformacionais, o fazem apenas para o espaço conformacional do ligante, nestes o

receptor é invariavelmente avaliado como uma cavidade rígida.

O método ideal em docking é aquele onde ambos, ligante e receptor, estão

livres para assumir diferentes conformações. Uma das melhores formas de considerar

esta flexibilidade no sítio de ligação é utilizar simulações de dinâmica molecular do

complexo. No entanto, tais cálculos são muito demorados e na prática somente são

utilizados para refinar estruturas obtidas por outros métodos.

O problema do docking também pode ser atacado manualmente, usando

gráficos computacionais interativos, o que pode ser feito pela superposição de um

análogo sobre o composto base que esta sendo estudado. Isto pode ser muito

proveitoso se houver uma boa idéia sobre as ligações estabelecidas entre o inibidor e

a proteína.

i) Modelagem das interações ligante-receptor

Um modo de determinar a estrutura tridimensional de complexos proteicos

com seus ligantes é utilizando técnicas de difração de raios-x, de ressonância

magnética nuclear, ou ainda, por métodos computacionais baseados na mecânica

quântica ou na mecânica molecular. Os cálculos da mecânica quântica necessitam de

um maior poder computacional ao contrário daqueles da mecânica molecular que por

isso, são uma fonte mais prática nos estudos de estruturas tridimensionais.

Utilizando programas computacionais de modelagem molecular com altos

recursos de computação gráfica como é o caso do programa CAChe WorkSytem Pro

Versão 6.01. (CAChe) [31] é possível sobrepor uma estrutura sobre outra. Em outras

palavras, pode-se sobrepor a estrutura tridimensional de um possível fármaco sobre

um inibidor já conhecido que esteja complexado no sítio alvo de uma enzima, o que

pode ser conseguido em muitas estruturas cristalográficas disponíveis no Protein

INTRODUÇÃO

- 14 -

Data Bank (PDB) [32]. Este processo de encaixe de fármacos em potencial no sítio

alvo é chamado de docking [33], figura 11.

Figura 11. Estrutura de um derivado da 9-deazaguanina (PNP030) em rosa,

sobreposto na estrutura da ImmH em azul, dentro da cavidade do sítio ativo da

enzima TB-PNP [27,34]. Os átomos indicados de 1 a 4 foram os utilizados para a

sobreposição e têm coordenadas coincidentes nas duas estruturas.

Se o fármaco em potencial possuir um bom encaixe e seus grupamentos

funcionais estiverem posicionados de tal modo que possam interagir com a estrutura

do sítio alvo estudado, é provável que este tenha atividade biológica.

Um problema importante com esta abordagem é o fato de que muitas

moléculas não possuem estruturas rígidas, como aquelas que possuem sistemas de

anéis aromáticos ou outros sistemas com insaturações conjugadas. Essas moléculas

apresentam estruturas flexíveis cuja conformação dependerá da energia do ambiente

molecular num determinado momento. Isto significa que as conformações assumidas

pelo novo ligante e pelo sítio ativo não são necessariamente as mesmas que aquelas

determinadas pela cristalografia de raios-x ou pelo docking. Para considerar estes

efeitos pode-se realizar uma análise conformacional, ou ainda utilizar-se de outros

INTRODUÇÃO

- 15 -

métodos da química computacional, tais como, o método Metrópolis Monte Carlo

(MC) e a Análise de Campo Molecular Comparativa (CoMFA).

Em um trabalho recente [2] foram realizadas simulações computacionais da

estrutura tridimensional do complexo ternário formado por um antifolato de notável

seletividade dentro do sítio ativo da DHFR do Pc ou humana, e NADPH. As

coordenadas para o início da simulação foram geradas pela superposição do grupo

pteridínico do antifolato sobre uma 2,4-diamina pteridina dibenzazepina complexada

no sítio ativo da DHFR, estrutura já descrita na literatura [35]. O complexo ternário

resultante foi solvatado em uma caixa de simulação com moléculas de água.

Verificou-se que o inibidor estabelece, em ambas as enzimas, uma interação

comum entre um átomo de nitrogênio protonado do grupo 2-amina do anel

pteridínico com o ácido glutâmico (E32 na enzima do Pc, E30 na enzima humana). O

outro nitrogênio do grupo 4-amina está a uma distância de ligação de hidrogênio do

átomo de oxigênio do grupo amida da isoleucina (I10 e I123 da DHFR do Pc) e,

isoleucina e valina (I7 e V115 da DHFR humana), figura 12.

Figura 12. Estruturas dos complexos ternários formados pelo antifolato (em amarelo)

NADPH na DHFR do Pc em A e, na DHFR humana em B [2].

O inibidor está situado dentro de um canal hidrofóbico que permite o

estabelecimento de interações de van der Waals entre o anel dibenzazepínico com a

fenilalanina (F69, 5,75 Å do centro do primeiro anel), prolina (P66, 3,77 Å do centro

INTRODUÇÃO

- 16 -

do segundo anel), e Leucina (L25, 3,80 Å do centro do terceiro anel) no caso da

enzima do Pc.

O grupo carboxila (COOH) do antifolato está aproximadamente a 3 Å da

cadeia lateral da arginina em ambas enzimas Pc (R75) e humana (R70). Como o

resíduo arginina é conservada nas duas enzimas, presume-se que ele não pode atuar

numa inibição preferencial pela enzima do Pc.

1.2.4. Estudos teóricos dos mecanismos de reações enzimáticas

Desde os primórdios da química quântica foram propostos vários índices que

buscavam indicar qual átomo é mais reativo em uma dada molécula, para uma dada

reação. Muitos desses são índices baseados na Teoria de Orbitais Moleculares de

Fronteira, (FMO) [36,37], principalmente os coeficientes dos orbitais de fronteira

(HOMO ou LUMO) e as cargas atômicas parciais. Quando empregados

adequadamente esses índices produzem resultados satisfatórios [38]. Possibilitando,

por exemplo, o estudo de reações enzimáticas.

A ação da enzima diidrofolato redutase tem sido alvo de muitos trabalhos

teóricos que avaliam o seu mecanismo [39-42]. Mais especificadamente tenta-se

entender os processos de protonação e transferência do íon hidreto que ocorrem entre

os resíduos de aminoácidos do sítio ativo da enzima, NADPH e o folato. As etapas

desse processo podem ser ilustradas pela figura 13. O folato e seus substratos são

apresentados em conjunto com os resíduos de aminoácidos e moléculas de água (W)

que estabelecem ligações de hidrogênio, a ilustração leva em conta as interações

formadas sítio ativo da DHFR da Escherichia coli (Ec) baseada na estrutura de raios-

x [39].

INTRODUÇÃO

- 17 -

Figura 13. Redução do folato a 7,8-diidrofolato e 5,6,7,8-tetraidrofolato [39].

Pode ser observado na figura acima que as modificações em cada etapa do

mecanismo ocorrem no anel pirazina do anel pteridínico substituído. A enzima

catalisa a reação em duas etapas, primeiro com a forma completamente oxidada do

folato e depois com o diidrofolato.

Os estudos teóricos foram realizados através de cálculos híbridos de mecânica

molecular/mecânica quântica semi-empíricos e cálculos quânticos ab initio do folato

e substratos complexados nos resíduos de aminoácidos do sítio ativo da enzima

DHFR, incluindo grupos carboxílicos, outros grupos polares e moléculas de água

conservadas. A protonação foi considerada em cada etapa, juntamente com a

transferência do hidreto. Os efeitos de polarização do restante do sistema enzimático

foram aproximados por um modelo de campo dielétrico utilizando uma constante

dielétrica efetiva igual a 2. Foi observado que moléculas de água conservadas no

sítio ativo são importantes na etapa de protonação. E que esta etapa ocorre antes da

entrada do íon hidreto.

INTRODUÇÃO

- 18 -

1.3. Métodos teóricos aplicados na modelagem molecular

O planejamento de fármacos com o auxílio dos métodos teóricos [43-45], em

conjunto com técnicas de reconhecimento do padrão [46-48] têm gerado nas últimas

décadas uma economia em tempo e em custo na seleção da melhor opção para a

síntese de compostos mais promissores de uma série.

Os métodos de cálculo usados na modelagem molecular podem ser clássicos,

como os da mecânica molecular, ou quânticos, que se dividem basicamente em duas

linhas principais: os que usam dados empíricos (semi-empíricos) e os que não os

usam (ab initio e teoria do funcional densidade) [49].

1.3.1. Método da mecânica molecular

Os cálculos de mecânica molecular (MM), também chamados de cálculos de

campo de força, tratam as moléculas como uma coleção de átomos que pode ser

descrita por forças newtonianas, ou seja, uma coleção de partículas mantidas unidas

por forças harmônicas ou elásticas. Essas forças podem ser descritas como funções

de energia potencial de características estruturais, como comprimentos de ligação,

ângulos de ligação, interações não-ligantes e outras. A combinação dessas funções de

energia potencial é o campo de força. A energia potencial total, ou energia estérica

(EE), da molécula é representada na forma mais simples pela equação de

Westhemeier [24], equação 01.

E = E

+ E

(01)

Onde:

= energia de estiramento (ou compressão) de uma ligação;

= energia de deformação angular;

= energia de torção em torno de ligações;

= energia de interação não-ligante.

INTRODUÇÃO

- 19 -

()

ll−

∑

(02)

Onde:

= constante de força;

l = comprimento de ligação;

= comprimento de ligação livre de tensão.

()

−

∑

(03)

Onde:

= constante de força;

θ = ângulo de ligação;

= ângulo de ligação livre de tensão.

(1 cos )

Vnw±

∑

(04)

Onde:

= constante de força;

w = ângulo torsional;

n = periodicidade.

()

E exp 12 1

⎧⎫

=−+ −⎡⎤

⎨⎬

⎣⎦

⎩⎭

∑

(05)

Onde:

= constante de força;

, r = distância interatômica entre átomos não-ligados; r

e r

constantes de van der Waals.

INTRODUÇÃO

- 20 -

Cada uma dessas funções de energia representa a diferença de energia entre

uma molécula real e uma molécula hipotética, sendo que todos os parâmetros

estruturais, como comprimentos de ligação e ângulos de ligação, estão exatamente

em seus valores ideais ou naturais.

A rapidez e a economia do tempo de computação e a facilidade de

compreensão em relação aos métodos da mecânica quântica são algumas das

vantagens da mecânica molecular. Quando um tratamento mais refinado é requerido,

a geometria otimizada pela MM pode ser usada como ponto de partida para cálculos

da mecânica.

Algumas desvantagens dos métodos de MM são que algumas classes de

moléculas de interesse não estão correntemente parametrizadas e a MM não é

apropriada para as determinações de propriedades em que o efeito eletrônico (por

exemplo: interações de orbitais, quebra de ligações etc.) é predominante. Um dos

campos de força mais utilizados em cálculos de mecânica molecular é denominado

MM3 e foi desenvolvido por Allinger, et all. [50].

Durante um cálculo de MM a geometria de uma molécula é especificada de

acordo com as suas coordenadas atômicas. Assim, a partir de um conjunto de dados

de entrada, uma geometria inicial é especificada e sua energia estérica é calculada.

Todos os parâmetros que definem a geometria do sistema são modificados em

pequenos incrementos e, com o uso de métodos de minimização do gradiente, a

geometria é otimizada (ou seja, a EE é minimizada). É importante lembrar que a

minimização é um método interativo de otimização geométrica que depende da

geometria de partida. A minimização geralmente leva ao mínimo local mais próximo

e não ao mínimo global. Vários problemas nos estudos de relação estrutura-atividade

requerem soluções que podem não ser o mínimo global da molécula isolada. A

varredura completa da superfície de energia potencial (SEP) de uma molécula é

chamada de análise conformacional. Para que a análise conformacional seja feita

com alguma segurança são feitos incrementos nos valores dos ângulos diedros de

todas as ligações passíveis de rotação para explorar o espaço conformacional da

molécula.

INTRODUÇÃO

- 21 -

1.3.2. Método da mecânica quântica

A aplicação da mecânica quântica a problemas de química é chamada

química quântica. A química quântica nas últimas décadas tem se mostrado uma

ferramenta muito importante no estudo de inúmeros problemas de química e física

molecular. Hoje todo o seu aparato é usado para problemas de estrutura molecular,

reatividade e espectroscopia entre outros.

Um fator que tem impulsionado a aplicação dos métodos da mecânica

quântica a problemas químicos é o progresso recente em

hardware de computação e

o desenvolvimento de algoritmos eficientes, que têm acompanhado o

desenvolvimento das rotinas de cálculos. Novos métodos quânticos fornecem

quantidades apreciáveis em um tempo computacional razoável. Desse modo, cálculos

da química quântica são uma fonte atrativa para descritores moleculares que podem

ser utilizados em estudos de relações entre estrutura e atividade [51], estes

descritores são capazes de expressar todas as propriedades eletrônicas e geométricas

das moléculas [52].

i) Métodos ab initio

Os métodos

ab initio procuram solucionar a equação de Schrödinger de forma

aproximada. O método de Hartree-Fock, é em geral, o ponto de partida para a

obtenção de funções de ondas mais próximas da exatidão. Neste método, aproxima-

se a função de onda de um sistema de

N elétrons para produto de N funções de um

elétron (orbitais) anti-simetrizada com referência à troca de duas e quaisquer

coordenadas eletrônicas e de spin. Esta aproximação é conhecida como a

aproximação das partículas independente (não correlacionados), uma vez que a

probabilidade de encontrar simultaneamente quaisquer duas ou mais partículas fica

sendo produto das probabilidades individuais de encontrar cada partícula.

Físicamente, isto significa que os elétrons não sentem o efeito direto dos outros

elétrons e sim um campo médio gerado pelos os demais.

As equações de Hartree-Fock são constituídas de um operador, operador de

Fock, e suas autofunções, os spinorbitais, e seus autovalores, as energias orbital. As

INTRODUÇÃO

- 22 -

equações são calculadas de maneira iterativa, por isso o método também é conhecido

como o método do campo autoconsistente (SCF).

Ele se baseia na simples idéia que particularmente em conjunto com a

expansão dos orbitais espaciais, como no esquema SCF de Roothaan. O esforço

computacional para esse cálculo é proporcional à quarta potência do número de

elétrons. Esse representa o menor nível em que as interações eletrônicas podem ser

descritas completamente.

Cálculos mais precisos podem ser realizados usando tratamentos pós-Hartree-

Fock, como os métodos de interação de configuração (CI) e os métodos baseados na

teoria da perturbação. O esforço computacional para esses métodos é proporcional a

uma determinada potência do número de elétrons.

ii) Métodos semi-empíricos

Como uma alternativa aos métodos

ab initio, os métodos quânticos semi-

empíricos podem ser utilizados para os cálculos de descritores moleculares. Estes

métodos foram desenvolvidos dentro do contexto matemático da teoria do orbital

molecular (SCF MO), mas baseado em simplificações e aproximações introduzidas

no procedimento teórico que reduz drasticamente o tempo computacional. Valores

estimados através da reprodução de propriedades atômicas e moleculares

experimentais são utilizados nos cálculos como parâmetros. Por esta razão, esses

procedimentos são amplamente conhecidos como métodos semi-empíricos.

Devido às dificuldades encontradas na aplicação dos métodos

ab initio para

moléculas com um considerado número de átomos, vários métodos semi-empíricos

foram desenvolvidos. Estes são rápidos e precisos o suficiente para permitir

aplicações rotineiras em sistemas moleculares maiores. O objetivo fundamental dos

métodos semi-empíricos é o desenvolvimento de um tratamento quantitativo de

propriedades moleculares com precisão, confiabilidade e custo computacional com

valor prático em química.

Os métodos semi-empíricos mais populares atualmente são o MNDO [53]

(

Modified Neglect of Diatomic Overlap), AM1 [54] (Austin Model 1) e PM3 [55]

(

Parametric Model 3). O método MNDO é amplamente utilizado para calcular

calores de formação, geometrias moleculares, momentos de dipolo, energias de

INTRODUÇÃO

- 23 -

ionização e afinidades eletrônicas. Este método apresenta problemas nos cálculos de

moléculas que apresentam isomeria estrelada, anéis de quatro membros, ligações de

hidrogênio e compostos hipervalentes. O método AM1 é uma modificação do

MNDO e é, em geral, um método mais preciso para muitos problemas. Ele trata

corretamente as ligações de hidrogênio, realiza previsões precisas de barreiras de

ativação para muitas reações e prevê calores de formação melhor do que o MNDO. O

método PM3 é uma re-parametrização do método AM1, inicialmente usado para

moléculas orgânicas.

Estes métodos encontram uma ampla aplicação no cálculo de um número

muito grande de moléculas pequenas, como no estudo de efeitos de substituintes para

o projeto de fármacos; para inúmeros e repetitivos cálculos de um mesmo tipo de

sistema, como em simulações de dinâmica molecular ou Monte Carlo e; para o

cálculo de macromoléculas.

Até meados da década de 90, os métodos semi-empíricos eram aplicados a

sistemas moleculares que continham até uma centena de átomos, do tamanho que

normalmente aparecem em estudos da química orgânica. Mais recentemente, numa

combinação do avanço computacional com novos métodos numéricos e suas

implementações, estes sistemas passaram a ser domínio dos métodos baseados em

teoria de funcionais de densidade (DFT) [56].

Atualmente, sistemas moleculares com dezenas de milhares de átomos

começam a ser tratados com métodos semi-empíricos, por exemplo, cálculos

completos de orbitais moleculares de sistemas como enzimas, conjuntos de proteínas,

DNA, polissacarídeos, etc. Isto tornou-se possível com o surgimento de métodos de

escalonamento verdadeiramente linear do tipo MOZYME [57]

e LocalSCF [58].

iii) Métodos de Solvatação

Efeitos de solventes podem ser incorporados em cálculos de química

quântica. Muitos métodos consideram o solvente como um meio dielétrico continuo

caracterizado por uma constante dielétrica. Uma técnica muito popular é uma

adaptação do modelo de Born baseada em interações eletrostáticas, permissividade

elétrica e cálculos baseados na sobreposição de orbitais. Os métodos de solvatação

são desenvolvidos para usar ambos cálculos semi-empíricos e

ab initio. Eles são

INTRODUÇÃO

- 24 -

baseados no conceito de superfície acessível ao solvente e são capazes de computar

cargas atômicas parciais, energia livre de solvatação e geometria em solução. O

modelo conhecido por COSMO (

Conductor-like screening model) [59] é um método

continuo que usa uma equação aproximada para a interação eletrostática entre o

solvente e o soluto.

1.4. Relações quantitativas entre estrutura e atividade

Para que um novo composto tenha aplicações medicinais, este deve produzir

os efeitos esperados com o mínimo de efeitos colaterais, demonstrando ser melhor do

que as terapias já estabelecidas [28]. O primeiro passo na descoberta de novas drogas

é identificar um ou mais

compostos base. Um composto base é uma molécula que

apresenta atividade em um determinado sistema. Este composto é então modificado

para aumentar sua potência e seletividade, assegurando, desse modo, que os

compostos homólogos ou algum de seus produtos metabólicos não sejam tóxicos e,

apresentem características de transporte apropriadas que os permitam passar através

das membranas celulares e alcançar seu alvo.

Muitas drogas produzem seus efeitos pela interação com uma macromolécula

biológica tal como uma enzima, o DNA ou uma glicoproteína. Esta interação entre o

ligante, inibidor ou substrato, com seu alvo receptor, enzima, gene, etc.,

normalmente ocorre por forças intermoleculares, entre átomos não ligados, mas em

alguns casos uma ligação covalente pode estar envolvida. Drogas que interagem com

receptores proteicos podem ser classificadas como

agonistas ou antagonistas.

Agonistas produzem o mesmo efeito, ou mais pronunciado, que um substrato natural,

enquanto um antagonista inibe este efeito do ligante natural [22].

No planejamento de drogas, é sempre importante lembrar que uma molécula

deve apresentar outras qualidades além de uma alta atividade

in vitro. O inibidor

mais potente de uma enzima não terá muita utilidade se não puder alcançar seu alvo.

A atividade

in vivo de uma molécula depende freqüentemente de muitos fatores. Um

estudo de estrutura e atividade pode ajudar a decidir que características da molécula

podem aumentar sua atividade, permitindo sugerir mudanças com esse objetivo. Uma

relação quantitativa entre estrutura e atividade (QSAR) [60] relaciona propriedades

INTRODUÇÃO

- 25 -

numéricas da estrutura molecular com a atividade via modelo matemático. Essa

relação é normalmente descrita por uma equação de forma geral:

()vfp= (06)

v é a atividade em questão, p são as propriedades derivadas da estrutura da molécula,

e f é uma função qualquer [61].

1.4.1. Histórico e desenvolvimento de QSAR

Atualmente, encontramos uma enorme quantidade de métodos utilizados para

derivar equações de QSAR, estes vão deste aproximações ‘clássicas’ baseadas na

estrutura molecular bidimensional (2D) dos ligantes, passando por métodos que

consideram a estrutura tridimensional (3D) destes, até aqueles que exploram a

estrutura 3D dos receptores macromoleculares. Estes últimos são impulsionados pela

enorme quantidade de estruturas tridimensionais de receptores disponíveis em bancos

de dados como o PDB. Os termos QSAR 4D [62] e QSAR 5D [63] vem sendo muito

utilizados, entretanto, esses referem-se somente a variações nos modelos de QSAR

3D considerando dimensões extras, respectivamente, as possíveis conformações dos

ligantes e, dos ligantes em conjunto com as possíveis conformações dos receptores

[64].

O QSAR 2D ‘clássico’ é baseado na aproximação pioneira de Hansch [65]

que surgiu por volta de 1960. Esta aproximação ainda continua sendo amplamente

usada. Estes estudos estão baseados num conjunto de descritores moleculares obtidos

da estrutura bidimensional da molécula que relacionam a atividade biológica com

características eletrônicas, hidrofóbicas, etc.

No ano de 1973 foi publicado um artigo de Unger e Hansch [66] considerado

como um marco no desenvolvimento de QSAR, neste foram estabelecidas regras

gerais para a elaboração e validação dos modelos matemáticos que correlacionam

estrutura química e atividade biológica [67]. A idéia era disciplinar a metodologia de

elaboração de modelos de QSAR.

As cinco regras gerais estabelecidas para a proposição de modelos

matemáticos de relações estrutura-atividade são as seguintes:

INTRODUÇÃO

- 26 -

a. Seleção de variáveis independentes: o número de descritores testados deve

ser o máximo possível, incluindo propriedades lipofílicas, eletrônicas,

estruturais, estérea e de polarizabilidade. Incluindo aquelas calculadas por

cálculos quânticos. As variáveis selecionadas na melhor equação devem ser

essencialmente independentes;

Validação estatística das variáveis selecionadas: todas as variáveis que

aparecem no modelo devem ser validadas por testes estatísticos apropriados,

tais como o teste F;

Princípio da parcimônia (Navalha de Occam): quando houver dúvida na

escolha de um entre muitos modelos semelhantes, deve-se escolher o mais

simples;

Número de variáveis em cada modelo: para minimizar a ocorrência de

correlação por coincidência, deve haver, no mínimo, cerca de cinco ou seis

compostos para cada variável incluída no modelo;

Modelo qualitativo para o mecanismo de ação dos compostos: é essencial que

o modelo obtido seja consistente com o mecanismo de ação, em nível

molecular, dos compostos testados.

A derivação das equações de QSAR envolve vários estágios distintos.

Primeiro, é obviamente necessário sintetizar os compostos e determinar suas

atividades biológicas. A medida da atividade é a concentração em mol/L de cada

composto capaz de produzir resposta biológica definida, tais como, IC

–

concentração em mol/L do fármaco capaz de proporcionar 50% de inibição da

atividade fisiológica de um sistema biológico, por exemplo, a atividade catalítica de

uma enzima; LD

100

– a concentração em mol/L do fármaco capaz de matar 100% dos

indivíduos em que é administrado; ED

– concentração em mol/L do fármaco capaz

de produzir 50% de seu efeito máximo.

As equações podem ser construídas para um conjunto muito grande de

compostos, no entanto, é mais comum, e mais lógico, considerar apenas uma série de

compostos relacionados, compostos homólogos, que diferem entre si em pequenos

grupos da molécula.

Essas relações quantitativas entre estrutura e atividade são construídas a partir

de descritores (variáveis independentes) usados para predizer complexas

INTRODUÇÃO

- 27 -

propriedades físico-químicas e biológicas [51], principalmente em estudos de

inibição da atividade enzimática [68-71].

1.4.2. Descritores empregados nos estudos de QSAR

Os descritores utilizados na construção dos modelos podem ser de dois tipos:

quânticos e clássicos. São exemplos de descritores clássicos os coeficientes de

partição, dados de área e volume de superfície, geométricos, propriedades

termodinâmicas, etc. Em estudos de QSAR a maior parte dos descritores empregados

são quânticos, onde estes são correlacionados com atividade biológica, tais como, a

inibição da atividade enzimática, atividade alucinógena, etc [72-74]. Isto ocorre

porque, historicamente, a pesquisa das relações quantitativas com a estrutura química

iniciou-se com o desenvolvimento dos métodos de planejamento teórico [75].

Os principais descritores quânticos utilizados para a determinação das

relações quantitativas entre estrutura e atividade em estudos bioquímicos são: as

cargas atômicas, as energias dos orbitais moleculares, as densidades dos orbitais de

fronteira, as superdelocalizabilidades, as polarizabilidades átomo-átomo, a

polarizabilidade molecular, o momento de dipolo, os índices de polaridade, o calor

de formação, etc [51,62].

Em trabalho realizado, sobre a formulação de equações de QSAR

toxicológicas [76], foi demonstrado que o uso de descritores quânticos, calculados

por métodos ab initio, não oferece considerável vantagem quando comparado aos

mesmos modelos obtidos utilizando descritores de cálculos semi-empíricos. O que

em conjunto com o elevado custo computacional e temporal dos cálculos ab initio,

tornam-nos inviáveis em estudos de QSAR.

i) Coeficiente de partição octanol-água

A atividade biológica de vários grupos de compostos pode ser correlacionada

com os seus coeficientes de partição em solventes polares e apolares. Overton e

INTRODUÇÃO

- 28 -

Meyer foram os pioneiros nesses estudos. Recorreram aos coeficientes de partição

primeiramente para explicar a atividade de certos narcóticos e, mais tarde, dos

anestésicos gerais [65].

O coeficiente de partição (P) óleo-água é definido como a relação das

concentrações da substância em óleo e em água. Para determinar o valor de P realiza-

se um experimento no qual se misturam quantidades conhecidas da substância, um

solvente orgânico imiscível com água (n-octanol, clorofórmio, éter etílico, etc.), que

mimetiza a fase oleosa, e água. Após a separação das fases orgânica e aquosa,

determina-se quantidade de substância presente em cada uma das fases.

De todos os parâmetros que podem aparecer em uma equação de QSAR, o

coeficiente de partição é o mais freqüentemente encontrado [28], usualmente na

forma de logaritmo (LogP), isto converte o valor para uma escala de energia livre. A

determinação experimental do coeficiente de partição pode ser muito complicada,

particularmente para compostos zwitteriônicos, ou ainda muito lipofílicos ou polares.

Os valores de P são normalmente medidos entre n-octanol e água como usado

originalmente por Hansch.

Vários métodos teóricos podem ser usados para calcular os coeficientes de

partição. Este é uma constante de equilíbrio e, desse modo, está diretamente

relacionado a uma mudança de energia livre. Os coeficientes de partição podem ser

calculados usando um método de perturbação da energia livre. Porém, mais

amplamente são determinados por aproximações baseadas nos fragmentos

moleculares, a partir da soma das contribuições positivas de fragmentos individuais e

um conjunto de fatores de correção [77].

ii) Índices de conectividade e topológicos

A estrutura química de um composto pode ser expressa através de

ferramentas matemáticas de topologia e teoria gráfica. Gráficos moleculares G

formam a base da caracterização quantitativa da estrutura química. Vários métodos

gráficos expressam a conectividade de átomos em uma molécula [78]. A partir

destes, foi introduzida uma idéia de identidade química estrutural através do conceito

de conectividade estendida (EC), de acordo com este conceito, os graus de um

vértice i, ou número de ligações conectadas ao átomo i, são recalculados em

INTRODUÇÃO

- 29 -

sucessivas etapas como a soma graus com um vértice vizinho j até que o valor

apareça em duas etapas consecutivas. Esta soma,

, em cada etapa k é chamada

conectividade estendida de k-ésima ordem,

EC(G):

∑∑∑

−

aaGEC

)(

(07)

Posteriormente foi desenvolvido o primeiro índice de grupo de Zagreb (M1)

que é definido como a soma do quadrado dos graus do vértice, ao invés de uma

simples soma, enquanto que o segundo índice de grupo de Zagreb M2 é a soma sobre

todos os limites do produto dos graus do vértice de pares de vértices vizinhos:

∑

;

todos limites

aa=

∑

(08)

Randic transformou M2 em uma nova função (χ) fazendo o inverso da raiz quadrada

de M2:

2/1

lim

)(

−

∑

itestodos

(09)

Kier e Hall estenderam a idéia de limites em uma única direção, a duas, três e

n direções. Os descritores moleculares construídos a partir desta idéia foram

chamados de conectividades moleculares de primeira, segunda, terceira ordem, etc,

respectivamente. O índice de ordem zero foi definido por complementaridade:

∑

−

2/10

)(

;

1/2

todoslimites

()

−

∑

;

1/2

limites em duas direções

()

ijk

aa a

−

∑

; ... (10)

INTRODUÇÃO

- 30 -

Foi feita ainda uma extensão importante desta aproximação para moléculas

com hereroátomos pela introdução de um conjunto análogo de índices de

conectividade de valência [79]. Neste caso, a conectividade é dada em termos de

valores delta de valência

de átomos i e j sendo representada por χ

, índice

de conectividade de valência de primeira ordem:

∑

−

2/1

)()(

δδχχ

(11)

onde a soma é feita sobre todas as ligações i–j da molécula. O valor delta de valência

é dado por

1−−

−

(12)

onde Z

é o número atômico do átomo i,

é o número de elétrons de valência do

átomo i e H

é o número de átomos de hidrogênio ligados ao átomo i. Os índices de

conectividade de valência de ordens superiores é definido analogamente.

Um outro conjunto de índices topológicos muito utilizado quantifica a forma

da estrutura química [80]. Estes quantificam o número de ciclos da molécula, índice

de forma de primeira ordem,

κ; o grau de linearidade do composto, índice de forma

de segunda ordem

κ; e, o grau de ramificação da molécula,

κ.

Índices de conectividades e topológicos são amplamente utilizados em

estudos de QSAR, estes conceitos permitem a construção de uma enorme variedade

de novos descritores que ajudam a correlacionar aspectos estruturais com a atividade

biológica [81].

iii) Área da superfície acessível ao solvente; área e volume de superfície de van

der Waals

INTRODUÇÃO

- 31 -

A área de superfície acessível ao solvente (SASA) é calculada após a

otimização da geometria molecular considerando a água como solvente, o efeito do

solvente é calculado usando um modelo contínuo conhecido como COSMO [59].

A área e o volume de van der Waals são calculados a partir da estrutura

tridimensional da molécula considerando os raios da superfície de van der Waals da

estrutura.

iv) Energias dos orbitais moleculares, potencial de ionização e afinidade

eletrônica

A energia do HOMO e do LUMO estão relacionados diretamente ao potencial

de ionização da molécula (IP) e a sua afinidade eletrônica (EA), respectivamente.

Estes são descritores quânticos muito utilizados e que governam o mecanismo de

muitas reações químicas [51]. De acordo com a teoria dos orbitais de fronteira da

reatividade química, a formação de estados de transição deve-se a interação entre os

orbitais de fronteira HOMO e LUMO das espécies reagentes.

A energia do HOMO, diretamente relacionada ao IP, caracteriza a

susceptibilidade de uma molécula a um ataque eletrofílico. A energia do LUMO,

diretamente relacionada a EA, caracteriza a susceptibilidade de uma molécula sofrer

um ataque nucleofílico. Em reações radicalares ambos HOMO e LUMO são

importantes.

v) Densidade dos orbitais de fronteira

A densidade eletrônica dos orbitais de fronteira (HOMO e LUMO) de átomos

pode fornecer detalhes sobre interações que envolvem a doação e acepção de elétrons

[51]. De acordo com a teoria de reatividade eletrônica de fronteira, na maior parte

das reações químicas é importante a localização e orientação do HOMO e LUMO

dos respectivos reagentes. Neste caso em uma molécula doadora, a densidade do

HOMO é critica para a transferência de carga (densidade eletrônica de fronteira

INTRODUÇÃO

- 32 -

eletrofílica,

) e no caso de uma molécula aceitadora a densidade do LUMO é

importante (densidade eletrônica de fronteira nucleofílica,

∑

)(

nHOMO

(13)

∑

)(

nLUMO

(14)

onde,

OMO n

são os coeficientes do orbital atômico X

no HOMO e,

,LUMO n

LUMO. Esses índices são fundamentais quando se pretende descrever os sítios de

interação entre uma droga e seu receptor.

vi) Superdelocalizabilidades e cargas atômicas

São definidas como um índice de reatividade dos orbitais ocupados e

desocupados. A superdelocalizabilidade (

) de um átomo r é um somatório

relacionado a contribuição feita pelo átomo

r a energia de estabilização na formação

de um complexo de transferência de carga com uma segunda molécula, ou a

habilidade de um reagente formar ligações através de transferência de carga [51].

Este parâmetro é freqüentemente empregado para caracterizar interações moleculares

e pode ser usado para comparar átomos correspondentes em moléculas diferentes.

Podemos distinguir a superdelocalizabilidade em eletrofílica

E,A

) e,

nucleofílica (

N,A

), da mesma forma que são diferenciadas as densidades eletrônicas

de fronteira. Se os elétrons de um orbital de fronteira predominam em uma

determinada interação, o análogo para um orbital da superdelocalizabilidade

calculada pode ser usado.

∑∑

jmANAE

CSS

/)(2,

(15)

onde,

são os coeficientes dos orbitais moleculares j em relação ao número de

orbitais de valência

A (m = 1,...,N

). ε

é a energia do orbital molecular j.

INTRODUÇÃO

- 33 -

As superdelocalizabilidades são também chamadas de índices de reatividade

dinâmicos. Enquanto os índices estáticos, como cargas atômicas (

Q), descrevem

moléculas isoladas no seu estado fundamental, os índices dinâmicos referem-se aos

estados de transição das reações.

vii) Momento de dipolo

A polaridade de uma molécula tem influência em diversas propriedades

físico-químicas, por isso, muitos descritores são propostos para quantificar os efeitos

de polaridade. O mais óbvio e mais convencional descritor de polaridade é o

momento de dipolo molecular

µ [51]. O momento de dipolo total, no entanto, reflete

somente uma polaridade global da molécula. Por isso, índices de polaridade locais

são muitas vezes mais úteis.

viii) Descritores de ligações de hidrogênio

Ligações de hidrogênio são interações de extrema importância em muitos

processos químicos e biológicos. Existem vários métodos que estimam

quantitativamente a força deste tipo de interação entre átomos de moléculas

diferentes [82]. Estes tentam reproduzir valores de energia de ligações de hidrogênio

(

) medidas experimentalmente através de descritores teóricos obtidos através de

cálculos da mecânica quântica.

Estes cálculos permitem modelar as capacidades de doação de átomos de

hidrogênio através da energia do LUMO da molécula, cargas atômicas dos átomos de

hidrogênio, superdelocalizabilidade e efeitos de alto polarização de átomos pesados

ligados a doadores de hidrogênios. A acepção é avaliada através da energia do

HOMO, cargas atômicas dos átomos mais negativos da molécula e, do potencial

eletrostático da molécula.

1.4.3. Problemas e aplicação das equações de QSAR

INTRODUÇÃO

- 34 -

Um problema típico no desenvolvimento de modelos de QSAR é a presença

outliers. Estes, geralmente, correspondem aos compostos que apresentam algum

problema na medida da atividade biológica e são incapazes de ajustarem-se no

modelo obtido. Ou ainda, representam uma possível fala de ajuste do modelo. Desse

modo, os

outliers devem ser avaliados com uma atenção particular para saber se a

razão de sua presença pode ser determinada. Modelos de QSAR que não apresentam,

ou apresentam poucos,

outliers são considerados bons modelos. A análise destes

outliers pode indicar que estes compostos interagem diferentemente com o receptor

através de um mecanismo incomum ao conjunto de compostos do modelo [83].

Após estabelecer uma equação que correlaciona a atividade biológica com a

estrutura de uma série de compostos homólogos, a equação deve ser empregada para

prever a atividade de um conjunto de moléculas ainda não testadas e possivelmente

ainda não sintetizadas. A habilidade de predição do modelo de QSAR é geralmente

maior para previsões interpolativas, por exemplo, para compostos que tem valores de

parâmetros dentro da região daqueles utilizados na construção do modelo [28].

1.4.4. Estudos de QSAR baseados na inibição da DHFR

Diversos estudos de QSAR baseados na inibição da enzima DHFR são

encontrados na literatura [84-91], uma boa parte destes são baseados na análise de

Hansch. Entre alguns estudos mais recentes está o planejamento de drogas derivadas

da PTX utilizando índices topológicos [92]; a avaliação de um conjunto de 345

inibidores da enzima DHFR, utilizando modelos de QSAR para correlacionar a

estrutura química com o potencial de inibição de três tipos de DHFR:

Rl, Pc e Tg

onde

as relações quantitativas foram construídas usando subconjuntos de descritores

das estruturas moleculares sendo analisados por redes neurais computacionais [93] e;

um estudo de inibidores da DHFR da

Ec também por redes neurais [94].

1.5. Regressões lineares múltiplas e procedimento estatístico

INTRODUÇÃO

- 35 -

No estudo de QSAR procura-se estabelecer uma relação quantitativa entre um

fenômeno observado, a saber, a atividade biológica, e variáveis independentes,

chamadas descritores, que são propriedades de natureza físico-químicas, estruturais,

entre outras. Isto é feito através da construção de um modelo matemático que seja

capaz de explicar o fenômeno observado e proporcione previsões dentro e, se

possível, fora dos limites investigados.

A equação pode ser obtida a partir de uma regressão linear múltipla (

RML)

pelo ajuste do conjunto de dados a um modelo linear e posteriormente deve ser

submetida a um conjunto de testes estatísticos consistentes para fazer sua validação.

O modelo linear é uma combinação linear de variáveis independentes,

também chamadas

explicativas, X

, X

,..., X

, capaz de reproduzir da melhor forma

possível os valores experimentais de um grupo de

n observações do fenômeno Y,

equação 16.

01122

...

YXXX

ββ β ε

=+ + ++ + (16)

Na equação 16,

é o termo constante de ajuste, β

, β

,..., β

são os

coeficientes das variáveis independentes e

ε é o erro associado ao modelo. Em

estatística

, β

,..., β

são chamados de parâmetros. Nesta equação são conhecidos

apenas os valores de

, X

,..., X

e Y e não os de ε.

No modelo de regressão, para cada valor

, X

,..., X

, em que o índice i

refere-se ao

i-ésimo objeto (composto) incluído no modelo, há uma distribuição de

probabilidade total para os valores de

Y. Isto significa que uma dada observação Y

nunca poderá ser exatamente prevista. A incerteza relativa a

Y surge por causa da

presença do erro

ε.

Tecnicamente,

estimativa do modelo é o termo correto para se referir às

equações de regressão, muito embora, regularmente, essas equações são chamadas

apenas de modelos. Em estudos de QSAR, a designação de modelo ou estimativa de

modelo é reservada para as equações de regressão que realmente representem alguma

relação entre estrutura e atividade.

A estimativa do modelo é uma equação capaz de fornecer valores previstos

para

Y, que são geralmente representados por Ŷ, equação 17.

INTRODUÇÃO

- 36 -

01122

...

YbbX bX bX=+ + ++

(17)

Nesta equação,

, b

,..., b

são estimativas para os valores dos parâmetros β

,..., β

, respectivamente. A construção da estimativa do modelo, representada pela

equação 17, requer a aplicação do método dos mínimos quadrados (MMQ). Este

consiste em encontrar o conjunto de valores

, b

,..., b

capaz de minimizar os

desvios (ao quadrado) entre cada um dos valores observados,

, e os respectivos

valores previstos,

. Ou seja, deve-se minimizar o somatório dos resíduos deixados

pela regressão

()

−

∑

Para facilitar o desenvolvimento do método dos mínimos quadrados vamos

simplificar a equação 17 considerando apenas os dois primeiros termos, equação 18.

YbbX=+

(18)

Para que o valor de

()

−

∑

seja mínimo, é preciso que suas derivadas em

relação a b

e b

se anulem.

()

⎛⎞

∂−

⎜⎟

⎝⎠

∂

∑

(19)

()

⎛⎞

∂−

⎜⎟

⎝⎠

∂

∑

(20)

Substituindo a equação 18 nas equações acima e derivando, chegamos às expressões:

()

Yb bX

⎛⎞

∂−

⎜⎟

⎝⎠

=− − − =

∂

∑

(21)

INTRODUÇÃO

- 37 -

()

ii i

XY b bX

⎛⎞

∂−

⎜⎟

⎝⎠

=− − − =

∂

∑

(22)

Cortando o fator -2 e desdobrando todos os somatórios, ficamos com um

sistema de duas equações lineares em b

e b

, que são chamadas equações normais.

nb b X Y

∑∑

(23)

111

nnn

iiii

iii

bXbX XY

===

∑∑∑

(24)

Isolando b

na equação 23, obtemos:

Yb X

−

∑∑

bYbX=− . (25)

Substituindo a primeira destas expressões em 24, podemos escrever:

111

nnn

iii

Yb X X

bX XY

===

⎛⎞

−

⎜⎟

⎝⎠

∑∑∑

∑∑

e daí

iii

bX XY

⎛⎞

⎜⎟

⎝⎠

⎜⎟

++ =

⎜⎟

⎝⎠

∑

∑∑

isolando

, temos finalmente

INTRODUÇÃO

- 38 -

−

⎛⎞

⎜⎟

⎝⎠

−

∑∑

∑

. (26)

Podemos calcular os valores de

e b

resolvendo uma única equação

matricial. Que podem ser construídas a partir das equações 23 e 24, equação 27.

XXb XY=

(27)

onde

⎛⎞

⎜⎟

⎝⎠

∑

∑∑

⎛⎞

⎜⎟

⎝⎠

∑

Para resolver esta equação, devemos multiplicá-la à esquerda pela inversa de

X. Assim isolamos o vetor b, cujos elementos são os estimadores que procuramos:

(

)

(

)

(

)

tt tt

XX XX b XX XY

−−

(

)

bXXXY

−

= . (28)

Se as matrizes

X e Y forem ampliadas adequadamente, teremos a solução

geral para o ajuste de um modelo por mínimos quadrados, não importa quantas sejam

as observações ou quantos parâmetros sejam necessários para caracterizar o modelo.

Para que a solução exista, porém, é preciso que.

a) A matriz (

-1

possa ser calculada, isto é, é preciso que a matriz X

X não seja

singular.

b) Os modelos sejam lineares nos parâmetros, ou seja, eles não podem conter termos

como

b ou

bb. Esta restrição, no entanto, não é tão severa quanto parece.

A obtenção do modelo representado pela equação 17 inicia-se com a

construção de um conjunto de dados contendo uma amostra de

n observações, ou

INTRODUÇÃO

- 39 -

objetos, e m variáveis explicativas X, tabela 02. Em QSAR, isso significa selecionar

uma amostra de

n compostos, determinar experimentalmente as respectivas

atividades

Y e escolher um conjunto de m descritores físico-químicos e estruturais

que se acreditam ser capazes de explicar a atividade biológica observada. O símbolo

m refere-se ao número de descritores presentes no conjunto de dados, enquanto que o

símbolo

k, da equação 16, refere-se ao número de descritores efetivamente incluídos

nos modelos de QSAR.

Tabela 02. Conjunto de dados, contendo

n objetos e m propriedades descritivas

Um aspecto importante na construção do conjunto de dados é o

comportamento de

, o valor observado do i-ésimo objeto. Caso fossem feitas

diversas medidas experimentais de

, dificilmente haveria muitas coincidências. O

erro experimental do processo de medição faz com que cada medida resulte num

valor ligeiramente diferente de

, ficando todos esses valores agrupados em torno de

sua média,

Y . Um dos pilares do MMQ pressupõe que os valores obtidos em

diversas medições de

apresentam distribuição normal em torno de

. Nos estudos

de QSAR, isso significa dizer que a execução de diversas medidas da atividade de

um dado composto resultaria numa coleção de valores que apresentaria distribuição

normal em torno de sua média. Apesar dessa suposição ser razoável, raramente vê-se

comprovação experimental desse fato. Quando muito, a atividade biológica de cada

composto é medida em triplicata, o que não é suficiente para observar qualquer

possível padrão de distribuição.

INTRODUÇÃO

- 40 -

O fato de se tentar descrever um conjunto de observações experimentais

através de um modelo linear não significa que essas possam ser bem descritas através

desse modelo. O uso de um modelo linear, bem como de qualquer outro tipo de

modelo, é feito por hipótese. Acreditando-se que as observações possam ser descritas

por esse modelo, cria-se a hipótese de que estas observações são adequadamente

descritas. Entretanto, isso não é necessariamente verdadeiro e, por isso, é necessário

testá-la, submetendo-a a testes para verificar sua veracidade na qual o modelo está

fundamentado.

1.5.1. Avaliação dos modelos lineares

A avaliação consiste em verificar se a equação do modelo adapta-se

convenientemente aos dados observados, podendo ser dividida em três partes: i)

avaliação do grau de ajuste; ii) avaliação do grau de significância e; iii) avaliação do

grau de previsibilidade.

i) Avaliação do grau de ajuste

O grau de ajuste do modelo é medido em termos de sua capacidade de

reproduzir o valor observado dos objetos. Essa parte da avaliação é feita através do

cálculo do coeficiente de correlação (

R), do coeficiente de correlação ajustado

(

Ajust

), que permite comparações entre os modelos com número diferente de

variáveis, e do desvio-padrão (

s), além da análise dos resíduos (Y

- Ŷ

). O que se

espera de um modelo em relação ao grau de ajuste é que ele apresente

R o mais

próximo possível de 1, que o valor de

s seja o mais próximo possível de zero e que os

resíduos apresentem distribuição normal em torno de zero.

A avaliação do ajuste do modelo pode ser feita através da

análise da

variância

(ANOVA) da regressão. Os principais objetivos da ANOVA são a)

verificar se há falta de ajuste no modelo; b) obter estimativa correta para a variância

do modelo de regressão (

) e; c) estimar o grau de ajuste e significância do modelo.

A análise da variância é construída com base nos valores de

Y (observado), Ŷ

(previsto) e

Y (média global dos valores de Y). Nesta análise é válida a identidade

representada pela equação 29.

INTRODUÇÃO

- 41 -

(

)

(

)

(

)

ˆˆ

iiii

YY YY YY−=−+−

(29)

Nesta equação,

(

)

−

é o desvio do i-ésimo valor observado de Y em

relação à média de todos os valores de

(

)

−

é o desvio do i-ésimo valor

previsto de Y em relação à média dos seus valores e

(

)

−

é o desvio entre o i-

ésimo valor observado de Y e o seu respectivo valor previsto, também chamado de i-

ésimo resíduo, ou e

(

)

iii

eYY=− . Num modelo bem ajustado, essa diferença deve

ser pequena.

Se ambos os membros da equação 29 forem elevados ao quadrado e seus

termos forem somados sobre todos os pontos teremos:

(

)

(

)

(

)

ˆˆ

iiii

YY YY YY

⎡⎤

−= −+−

⎣⎦

∑∑

(

)

(

)

(

)

(

)

ˆˆˆˆ

iiiiii

YY YYYY YY=−+ −−+−

∑∑ ∑

(30)

O somatório dos produtos

(

)

(

)

ˆˆ

iii

YYYY−−

é igual a zero, portanto,

(

)

(

)

(

)

ˆˆ

iiii

YY YY YY−= −+ −

∑∑∑

(31)

Equação esta que também pode ser escrita da seguinte forma:

Tot

= SS

Reg

Res

, em que a abreviação SS refere-se à soma dos quadrados dos desvios (sum of

squares

). O termo SS

Tot

é a variabilidade total da regressão, SS

Reg

é a variabilidade

explicada pelo modelo de regressão e

Res

é a variabilidade que o modelo não

consegue explicar e refere-se aos resíduos. Isto quer dizer que uma parte da variação

total das observações

em torno da média Y é descrita pela equação de regressão, e

o restante fica por conta dos resíduos. Evidentemente, quanto maior for a fração

descrita pela regressão, melhor será o ajuste do modelo, o que podemos quantificar

por meio da razão,

INTRODUÇÃO

- 42 -

(

)

()

Reg

Tot

−

∑

(32)

é chamado de coeficiente de determinação do modelo. O valor máximo de R

é 1,

e só ocorrerá se não houver resíduo nenhum e portanto toda a variação em torno da

média for explicada pela regressão. Quanto mais perto de 1 estiver o valor de

melhor terá sido o ajuste do modelo às respostas observadas. A análise da variância

geralmente é apresentada no formato da tabela 03.

Tabela 03. Análise da variância (ANOVA) do modelo de regressão linear múltipla

Fonte

Regressão

(

)

YY−

∑

Reg

/df

Reg

F = MS

Reg

Resíduo n – k - 1

(

)

YY−

∑

= SS

Res

/df

Res

= SS

Reg

/SS

Tot

Total

n - 1

(

)

YY−

∑

Tot

/df

Tot

df = Graus de liberdade (degrees of freedom);

SS = Soma dos quadrados (sum of

squares

);

MS = Média da soma dos quadrados (mean square).

Como pode ser observado na tabela 03, pode-se definir a média da soma dos

quadrados da regressão como

Reg

= SS

Reg

/k e a média da soma dos quadrados dos

resíduos como

Res

= SS

Res

/(n-k-1). Utilizando-se esta notação, defini-se o quadrado

do desvio-padrão ou estimativa da variância como

= MS

Res

. Como s

é a razão

entre a variabilidade não explicada pelo modelo e o número de graus de liberdade

relativo aos resíduos da regressão, quanto maior for a variabilidade dos valores de

que o modelo for capaz de explicar (maior

R), menor será o desvio-padrão. O teste F

é definido como

F = MS

Reg

, sendo portanto uma razão entre a variabilidade

explicada pelo modelo e a variabilidade que permanece sem explicação. O quadrado

INTRODUÇÃO

- 43 -

do coeficiente de correlação ajustado, citado anteriormente, é calculado de acordo

com a equação 33.

()

22 2

Ajust

RR R

−

⎛⎞

=− −

⎜⎟

−

⎝⎠

(33)

Há uma observação importante acerca da variância. A variância de um

modelo de regressão, σ

, somente poderá ser determinada se o verdadeiro modelo de

regressão for construído. Como isso nunca é possível, o valor de σ

sempre será

desconhecido.

A falta de ajuste do modelo proposto pode ser realizada através da utilização

dos resíduos da regressão. Os resíduos de um modelo de regressão contêm toda a

informação necessária à compreensão dos motivos que fazem com que o mesmo não

consiga explicar 100% da variabilidade dos valores observados de Y. Existem

basicamente dois motivos para que isso ocorra: a) presença de erros aleatórios

relativos à determinação experimental dos valores de Y e b) especificação imprópria

do modelo (falta de ajuste). Uma vez que os valores de Y tenham origem em medidas

experimentais, os erros aleatórios estarão sempre presentes e, devido a isso, nenhum

modelo consegue explicar 100% da variabilidade de Y.

Quando cada valor de Y

presente no conjunto de dados foi determinado uma

única vez, como normalmente é o caso das mediadas de atividade biológica, a

verificação da falta de ajuste pode ser feita qualitativamente através da análise da

distribuição dos resíduos do modelo. Nos casos em que o modelo é bem ajustado, o

conjunto de resíduos e

contém apenas os erros aleatórios citados anteriormente.

Portanto, a análise visual gráfica dos resíduos deverá revelar um padrão estritamente

aleatório para a distribuição dos mesmos. Quando o modelo apresenta falta de ajuste,

além dos erros aleatórios, os resíduos contêm erros sistemáticos devidos à

especificação incorreta do modelo. A presença desses erros pode ser detectada com

relativa facilidade na análise visual da distribuição dos resíduos. A figura 14 mostra

quatro situações típicas encontradas na verificação qualitativa da falta de ajuste de

modelos lineares.

INTRODUÇÃO

- 44 -

Figura 14. Algumas situações encontradas na investigação qualitativa da falta de

ajuste [95].

Nos casos 1 e 2 não há falta de ajuste pois os pontos estão dispostos

aleatoriamente ao longo da reta ajustada. Portanto, o modelo obtido nestas situações

deve ser adequado aos dados observados. Os casos 3 e 4 são típicos da falta de ajuste

dos modelos, observa-se clara falta de ajuste devido ao padrão não aleatório da

distribuição dos pontos.

ii) Avaliação do grau de significância

INTRODUÇÃO

- 45 -

O grau de significância é medido através da execução de testes de validação

(teste estatístico de hipótese), sendo que cada teste destina-se a verificar a

significância de diferentes partes do modelo.

Para testar a significância estatística de R

, aplica-se um teste de hipótese

conhecido como teste F, cujo valor é obtido na tabela ANOVA associada à

regressão. O teste F verifica o quanto da variabilidade de Y pose ser explicada pelas

variáveis X

, X

,..., X

, e o quanto pode ser atribuída ao efeito do erro aleatório ε. Para

validar R

através do teste F, é preciso comparar o valor de F obtido no modelo com

o valor de referência. Este, em geral, se refere ao nível de confiança de 95% e pode

ser encontrado em tabelas apropriadas [95].

Os valores do teste F de dois ou mais modelos de regressão, que possuam

diferentes valores de n e k, em princípio não podem ser comparados. Nesse caso,

deve-se calcular as probabilidades (p-valor) associadas aos valores de F. O p-valor

fornece um meio seguro de comparação do nível de significância de modelos com

diferentes números de objetos e variáveis. Um valor de p = 0,0001, significa que o

valor de R

é estatisticamente significante e o erro envolvido na afirmação dessa

hipótese é de 0,01%. Para dois modelos, aquele que tiver o menor p-valor, terá maior

significância estatística.

A significância estatística dos coeficientes da regressão é testada mediante o

cálculo de seus intervalos de confiança (T), geralmente referentes a um nível de

confiança de 95% (t). O resultado do teste é mostrado em associação com o

respectivo coeficiente, equação 34.

(

)

(

)

(

)

(

)

00 111

... ...

iii kkk

Yb T b TX b TX b TX=±+± ++± ++± (34)

O valor de T

é calculado de acordo com a equação 35.

()

1,95

..'

Tst XX

−

−−

= (35)

em que s é o desvio-padrão da regressão, t

(n-k-1,95)

é o valor da distribuição t de

Student para a probabilidade de 95% e o argumento da raiz quadrada refere-se ao

elemento diagonal (linha i, coluna i) da matriz resultante da operação indicada com a

INTRODUÇÃO

- 46 -

matriz das variáveis independentes, X. Se T

for maior do que o valor do próprio

coeficiente b

, significa que o valor b

= 0 pertence ao intervalo de confiança de 95%

considerado. Isso implica em que a variável X

, em relação à qual b

está associada,

não contribui para a explicação da variabilidade dos valores observados de Y.

Naturalmente quanto mais T

se aproxima de b

, menor será a significância estatística

de b

iii) Avaliação do grau de previsibilidade

O grau de previsibilidade do modelo é testado através da validação cruzada

(cross validation) [96-98]. O processo de validação cruzada consiste nas seguintes

etapas: (a) excluir um dos objetos do modelo; (b) reconstruir o modelo sem esse

objeto; (c) utilizar esse modelo para calcular o valor do objeto excluído; (d) obter o

desvio entre o valor observado e o valor previsto para esse objeto; (e) refazer as

etapas a-d para os demais objetos do conjunto de dados, um por vez; (f) calcular o

valor da estatística PRESS (PREdictive Sum of Squares), que corresponde à soma dos

quadrados dos desvios obtidos no item d e; (g) calcular o quadrado do coeficiente de

correlação da validação cruzada (Q

) e o desvio-padrão da validação cruzada (s

PRESS

A forma de calcular PRESS, Q

e s

PRESS

é mostrada nas equações 36, 37 e 38.

(

)

RESS Y Y=−

∑

(36)

()

RESS

=−

−

∑

(37)

PRESS

RESS

−−

(38)

Um modelo com elevado grau de previsibilidade para objetos não incluídos

no mesmo apresentará Q

próximo de 1 e s

PRESS

próximo de zero.

INTRODUÇÃO

- 47 -

Capítulo 2

Objetivos

2.1. Objetivo Geral:

Estudar as relações entre propriedades moleculares, atividade e seletividade

de inibidores da enzima DHFR, através do docking molecular, do QSAR e dos

cálculos de mecanismos enzimáticos.

2.2. Objetivos Específicos:

Classificar as drogas derivadas do TMP e TMQ em conjunto de treinamento,

utilizado para construção dos modelos, e conjunto de teste dos modelos,

através de sorteio;

Modelar a estrutura tridimensional das drogas derivadas e da enzima DHFR

do Pc e humana;

Localizar os resíduos de aminoácidos que compõem o sítio ativo das enzimas

estudadas;

Alinhar sequencialmente os resíduos de aminoácidos das enzimas;

Investigar as interações estabelecidas entre as drogas e os resíduos de

aminoácidos presentes no sítio ativo da enzima DHFR através de estudos de

docking;

OBJETIVOS

- 49 -

Avaliar as ligações de hidrogênio formadas entre as drogas e os resíduos de

aminoácidos do sítio ativo;

Calcular as energias das ligações de hidrogênio que serão utilizadas como

descritores na construção dos modelos;

Calcular as propriedades, quânticas e clássicas, das drogas, para a construção

do conjunto de descritores moleculares;

Estabelecer modelos de QSAR para o conjunto de treinamento através de

regressões lineares múltiplas;

Avaliar os modelos obtidos através de procedimentos estatísticos: R

, teste F,

análise de resíduos, etc.;

Avaliar a capacidade de previsão dos modelos obtidos aplicando-os as

estruturas as estruturas do grupo teste;

Propor um conjunto de novas drogas com potencial atividade e seletividade

baseando-se nos estudos de modelagem molecular;

Prever a atividade e seletividade das drogas propostas utilizando os modelos

de QSAR construídos;

Estudar o mecanismo da reação enzimática de conversão do folato a

diidrofolato a tetraidrofolato.

OBJETIVOS

- 49 -

Capítulo 3

Parte Experimental

3.1. Classificação das drogas derivadas do TMP e TMQ

Com base em estudos de síntese e medida da atividade inibitória de drogas

antifólicas descritas na literatura, selecionamos duas séries homólogas com valores

de IC

medidos contra a DHFR do Pc, Tg, Ma e Rl. A primeira série escolhida é

intimamente relacionada com a trimetoprima [4,7,99,100] e a segunda é derivada do

trimetrexato [5, 101-103].

A série homóloga que tem como composto base o TMP foi, na realidade,

idealizada para ser uma classe de compostos estruturalmente híbridos da

trimetoprima e piritrexina, figura 15, e, dessa forma, unir as características de alta

seletividade apresentada pelo TMP e a alta potência do PTX.

PARTE EXPERIMENTAL

- 51 -

Figura 15. Representação da estrutura do TMP em (a), PTX em (b), híbridos

estruturais em (c) sem o grupo benzila (p

-p

) e híbridos com o grupo benzila (p

) em (d). As partes destacadas referem-se aquelas derivadas dos precursores TMP

e PTX. Os átomos numerados referem-se aqueles utilizados para o cálculo das

propriedades atômicas.

Na tabela 04, são apresentados os grupos substituintes das drogas homólogas

da trimetoprima, bem como os valores de atividade (IC

) contra o Pc, Tg, Ma e Rl e;

os índices de seletividade (SI) que são definidos como o quociente entre a atividade

OMe

(a)

(b)

(d)

(c)

PARTE EXPERIMENTAL

- 52 -

das drogas em relação à DHFR do fígado de rato e à DHFR dos parasitas (IC

Rl /

parasita).

PARTE EXPERIMENTAL

- 52 -

Tabela 04. Atividades e seletividades da série homóloga ao TMP e PTX [4,7,99,100]

(µM) SI

Drogas R

Pc Tg Ma Rl

Pc Tg Ma

OCH

H O(CH

)

19,000 6,500 0,310 44,000

2,300 6,800 140,000

OCH

H O(CH

)

14,000 9,200 0,390 29,000

2,100 3,100 74,000

OCH

H O(CH

)

5,600 5,000 0,890 11,000

1,900 2,100 12,000

OCH

H O(CH

)

44,000 15,000 3,300 30,000

0,690 2,000 9,100

OCH

H O(CH

)

51,000 32,000 32,000 86,000

1,700 2,700 2,700

OCH

H O(CH

)

COOH -

0,250 0,180 0,005 2,700

11,000 16,000 560,000

OCH

H O(CH

)

COOH -

0,054 0,110 0,058 4,600

85,000 42,000 79,000

OCH

H O(CH

)

COOH -

0,800 0,480 0,150 17,000

21,000 35,000 110,000

OCH

H O(CH

)

COOH -

2,600 0,180 0,190 12,000

4,500 65,000 63,000

OCH

H O(CH

)

COOH -

7,100 0,360 0,130 12,000

1,700 33,000 92,000

OCH

H O(CH

)

COOH -

4,800 0,430 0,150 12,000

2,500 28,000 80,000

OCH

H C ≡ C(CH

)

COOH -

0,130 0,097 0,004 4,000

31,000 41,000 910,000

OCH

H C

≡

C(CH

)

COOH -

0,028 0,032 0,008 2,200

79,000 69,000 280,000

OCH

H C ≡C(CH

)

COOH -

0,870 0,072 0,041 25,000

28,000 340,000 590,000

OCH

H (CH

)

COOH -

0,150 0,058 0,035 3,200

21,000 54,000 91,000

PARTE EXPERIMENTAL

- 53 -

Atividades e seletividades da série homóloga ao TMP e PTX

OCH

H (CH

)

COOH -

0,150 0,008 0,016 4,100

27,000 490,000 260,000

OCH

H (CH

)

COOH -

0,530 0,030 0,089 4,600

8,600 150,000 52,000

H OCH

C≡C(CH

)

COOH -

0,001 0,034 0,002 5,000

5000,000 150,000 2100,000

OCH

H OCH

3-COOH

0,890 0,600 0,120 19,000

21,000 31,000 150,000

OCH

H OCH

4-COOH

1,200 2,000 0,060 21,000

17,000 11,000 340,000

OCH

H C=CCH

O 2-COOH

2,300 0,500 0,036 6,200

2,700 13,000 170,000

OCH

H C=CCH

O 3-COOH

5,600 1,600 0,057 14,000

2,400 8,300 240,000

OCH

H CH=CHCH

O 2-COOH

8,600 2,500 0,380 6,400

0,740 2,600 17,000

OCH

H (CH

)

O 2-COOH

7,800 0,710 0,310 25,000

3,200 35,000 81,000

OCH

H (CH

)

O 3-COOH

1,100 0,210 0,025 4,000

3,600 19,000 160,000

OCH

H C

≡

C 2-COOH

4,100 1,900 0,100 25,000

6,000 13,000 250,000

OCH

H C

≡

C 3-COOH

0,023 0,006 0,002 0,650

28,000 120,000 430,000

OCH

H C

≡

C 4-COOH

1,300 0,340 0,004 8,200

6,300 24,000 2200,000

OCH

H (CH

)

4-COOH

7,100 1,500 0,025 13,000

1,800 8,700 520,000

H OCH

≡

C 4-COOH

1,200 0,420 0,008 88,000

73,000 210,000 11000,000

TMP

H OCH

OCH

12,000 2,800 0,300 180,000

14,000 65,000 610,000

PARTE EXPERIMENTAL

- 54 -

Os compostos derivados do TMQ apresentam estrutura básica apresentada na

figura 16. Os números de 1 a 11 indicam os átomos que foram considerados nos

cálculos dos descritores atômicos, a escolha deve-se ao fato de que os mesmos são

conservados em todas as estruturas das drogas utilizadas na elaboração do modelo de

QSAR.

( )

Figura 16. Estrutura base dos derivados do trimetrexato.

Um total de 37 compostos homólogos ao trimetrexato (q

-q

), PTX e o

próprio TMQ, foram inicialmente utilizados na elaboração e teste dos modelos de

QSAR. Após a elaboração destes modelos, foram encontradas na literatura [3] mais

34 estruturas (q

-q

) com medidas de atividade contra os parasitos estudados. Estes

últimos foram utilizados somente para completar o conjunto de teste dos modelos.

Todos os grupos substituintes das drogas estruturalmente derivadas do TMQ,

incluindo o próprio e o PTX, seus valores de atividade contra a DHFR do Pc, Tg, Rl

e, seus índices de seletividade são apresentados na tabela 05.

PARTE EXPERIMENTAL

- 55 -

Tabela 05. Atividades e seletividades da série homóloga ao TMQ [5, 101-103]

(µM) SI

Drogas n R

Pc Tg Rl

Pc Tg

0 N CH

NH 3,4,5-(OCH

)

0,086 0,007 0,002

0,024 0,284

0 N CH

NCH

3,4,5-(OCH

)

0,013 0,001 0,008

0,585 8,941

0 N CH

NH 3,4,5-(Cl)

0,063 0,012 0,033

0,524 2,750

0 N CH

NCH

3,4,5-(Cl)

0,105 0,038 0,036

0,347 0,953

0 N CH

NH 3,4-(OCH

)

0,044 0,009 0,008

0,173 0,864

0 N CH

NCH

3,4-(OCH

)

0,320 0,029 0,044

0,138 1,517

0 N CH

NCH

2,5-(OCH

)

0,216 0,030 0,407

1,884 13,522

0 N CH

NH 3,4-(Cl)

0,320 0,028 0,053

0,166 1,893

0 N CH

NCH

3,4-(Cl)

0,100 0,027 0,042

0,420 1,556

0 N CH

NH H

0,080 0,017 0,170

2,125 10,000

0 N CH

NH 2-OCH

0,117 0,023 0,169

1,444 7,348

0 N CH

NH 3-OCH

0,069 0,007 0,080

1,163 10,824

0 N CH

NH 4-OCH

0,095 0,012 0,056

0,583 4,633

0 N CH

NH 2-Cl

0,047 0,007 0,088

1,872 12,394

PARTE EXPERIMENTAL

- 56 -

Atividades e seletividades da série homóloga ao TMQ

0 N CH

NH 3-Cl

0,023 0,011 0,037

1,609 3,364

0 N CH

NH 4-Cl

0,055 0,019 0,051

0,921 2,684

0 N CH

NH 4-Br

0,081 0,010 0,035

0,432 3,674

0 N CH

NCH

3-OCH

0,030 0,006 0,018

0,600 2,857

0 N CH

NCH

4-OCH

0,035 0,007 0,013

0,371 1,781

0 N CH

NCH

2-Cl

0,084 0,018 0,100

1,190 5,556

0 N CH

NCH

4-Cl

0,029 0,005 0,026

0,897 4,815

0 N CH

NCH

4-Br

0,037 0,030 0,036

0,973 1,200

0 N H CH

NH 3,4,5-(OCH

)

1,500 0,300 1,900

1,267 6,333

0 N H CH

NCH

3,4,5-(OCH

)

0,240 0,009 0,280

1,167 31,111

0 N H CH

NH H

2,220 0,270 2,300

1,036 8,519

0 N H CH

NH 3-OCH

0,520 0,210 0,790

1,519 3,762

0 N H CH

NH 2,5-(OCH

)

6,100 0,450 5,000

0,820 11,111

0 N H CH

NH 3,4-(OCH

)

0,430 0,330 0,560

1,302 1,697

0 N H CH

NH 2,5-(Cl)

0,440 0,300 6,900

15,682 23,000

0 N H CH

NH 3,4-(Cl)

0,250 0,230 0,480

1,920 2,087

PARTE EXPERIMENTAL

- 57 -

Atividades e seletividades da série homóloga ao TMQ

0 N H CH

NH 3,4,5-(Cl)

0,350 0,980 4,600

13,143 4,694

0 N H CH

NH 2,3-C

0,070 0,096 0,600

8,571 6,250

0 N H CH

NH 3,4-C

2,000 0,830 4,900

2,450 5,904

0 N CH

NCH

100,000 - 395,000

3,950 -

0 N CH

NCH

3,4-(Cl)

0,131 0,110 0,180

1,374 1,636

0 N CH

NCH

3,4,5-(Cl)

0,196 1,980 0,270

1,378 0,136

0 N H NCH

2,5-(OCH

)

0,084 0,006 0,057

0,679 9,048

0 N H CH

- 2,5-(OCH

)

0,280 0,034 0,054

0,190 1,600

0 N H CH

- 3,4-(OCH

)

0,240 0,064 0,210

0,880 3,300

0 N H CH

- 3,5-(OCH

)

0,210 0,036 0,370

1,800 10,300

0 N H CH

- 2-Cl

0,510 0,017 0,073

0,140 4,300

0 N H CH

- 4-F

0,520 0,040 0,130

0,250 3,300

0 CH H CH

- 2-OCH

0,310 0,011 0,054

0,170 4,900

0 CH H CH

- 3-OCH

0,200 0,010 0,038

0,190 3,800

0 CH H CH

- 4-OCH

0,230 0,018 0,100

0,430 5,600

0 CH H CH

- 2,5-(OCH

)

0,110 0,010 0,009

0,085 0,940

PARTE EXPERIMENTAL

- 58 -

Atividades e seletividades da série homóloga ao TMQ

0 CH H CH

- 3,4-(OCH

)

0,092 0,013 0,028

0,300 2,200

0 CH H CH

- 3,5-(OCH

)

0,110 0,010 0,030

0,270 3,000

0 CH H CH

- 3,4,5-(OCH

)

0,150 0,017 0,042

0,280 2,500

0 CH H CH

- 2-Cl

0,110 0,006 0,011

0,100 1,200

0 CH H CH

- 3-Cl

0,170 0,016 0,040

0,240 2,500

0 CH H CH

- 4-Cl

0,150 0,022 0,040

0,270 1,800

0 CH H CH

- 3,4-(Cl)

0,050 0,056 0,028

0,560 0,500

0 CH H CH

- 4-F

0,670 0,026 0,068

0,100 2,600

0 N H NH CH

2,700 0,520 2,100

0,800 4,000

0 N H NCH

0,068 0,032 0,140

2,100 4,400

0 N H NH CH

3,4,5-(OCH

)

14,100 0,350 3,300

0,230 9,400

0 N H NCH

3,4,5-(OCH

)

0,061 0,014 0,033

0,500 2,400

0 N H NH CH

3,4,5-(OCH

)

15,300 0,670 3,240

0,200 4,800

0 N H NCH

3,4,5-(OCH

)

0,079 0,026 0,030

0,400 1,200

0 N H NH CH

3,4,5-(OCH

)

20,700 0,230 1,200

0,060 5,200

0 N H NH CH

3,4,5-(OCH

)

5,500 0,480 1,100

0,200 2,300

PARTE EXPERIMENTAL

- 59 -

Atividades e seletividades da série homóloga ao TMQ.

0 N H NH CH

3,4-(OCH

)

4,800 0,730 1,500

0,300 2,100

0 N H NH CH

3,4-(OCH

)

5,700 1,200 3,400

0,600 2,800

0 N H NCH

3,4-(OCH

)

0,076 0,031 0,072

0,900 2,300

0 N H NH CH

3,4-(OCH

)

3,800 0,310 0,350

0,090 1,100

0 N H NH CH

2,3-C

3,900 0,980 0,240

0,060 0,200

0 N H NH CH

4-OCH

, 2,3-C

8,200 0,380 0,430

0,050 1,100

0 N H NH CH

6-OCH

, 2,3-C

15,400 0,710 0,370

0,020 0,500

0 N H NH CH

4-OC

24,300 3,700 2,900

0,120 0,800

1 N H NH CH

1,940 4,450 0,280

0,140 0,060

1 N H NCH

1,800 0,920 1,400

0,800 1,500

PTX

0 N CH

- 2,5-(OCH

)

0,031 0,011 0,002

0,048 0,136

TMQ

0 CH CH

NH 3,4,5-(OCH

)

0,042 0,010 0,003

0,071 0,300

PARTE EXPERIMENTAL

- 60 -

As duas séries homólogas estudadas foram divididas um conjunto de

treinamento, utilizado para a determinação dos modelos, e num conjunto de teste

para avaliar os modelos. Essa divisão foi realizada através de sorteio.

Das 32 drogas derivadas do TMP aquelas que compõem o conjunto de

treinamento são: p

-p

, p

-p

e p

-p

(22 estruturas); e, aquelas que

compõem o conjunto teste: p

, p

, TMP e PTX (10

estruturas).

O sorteio para a série homóloga ao TMQ levou em conta somente o conjunto

inicial de 37 estruturas (q

-q

), já que as demais 34 estruturas (q

-q

) ainda não

tinham sido localizadas, por isso, estas foram empregadas somente na etapa de

avaliação dos modelos. O conjunto de treinamento sorteado foi: q

-q

, q

-q

, q

-q

, q

, PTX e TMQ (27 estruturas); e o conjunto de teste ficou:

, q

-q

, q

e q

-q

(12 estruturas), juntamente com as 34 estruturas

restantes q

-q

, totalizando 46 estruturas para os testes. No entanto, a estrutura q

foi excluída deste conjunto por apresentar valores de IC

duvidosos, como pode ser

verificado na tabela 1 da referência [5]. Assim, o total de estruturas utilizadas na

avaliação do modelo é 45.

3.2. Modelagem computacional das estruturas

Todas as estruturas dos grupos de treinamento e grupo de teste foram

construídas por modelagem molecular utilizando os recursos disponíveis no

programa CAChe. A geometria foi otimizada completamente para cada molécula

livre no estado gasoso, ou seja, sem considerar efeito de solvente ou outras

interações. A otimização foi realizada através de cálculos semi-empíricos do tipo

AM1.

As estruturas das proteínas aqui estudadas foram obtidas através do banco de

dados PDB, estas foram determinadas por cristalografia de raios-x. Utilizamos as

enzimas DHFR do Pc, código PDB: 1DYR, e DHFR humana (Homo sapiens, Hs),

código PDB: 1PD9. Não localizamos as enzimas DHFR do Tg e do Ma, muito

provavelmente por ainda não terem sido resolvidas.

PARTE EXPERIMENTAL

- 61 -

Baseando-se no fato de que a maior parte dos resíduos de aminoácidos, no

sítio ativo da DHFR humana e do rato são conservados [104], a enzima humana foi

utilizada como modelo para avaliar as interações entre as drogas estudadas e os

aminoácidos do sítio ativo, possibilitando, desse modo, a utilização da energia dessas

interações como descritores na construção dos modelos de atividade para o Rl e

modelos de seletividade.

Modelamos as estruturas das enzimas supra citadas a partir do arquivo

disponível no PDB, utilizando a interface gráfica do programa CAChe. Inicialmente

fixamos todos os átomos em suas posições cristalográficas originais, com exceção

dos átomos de hidrogênio que foram adicionados na seqüência. Procedemos a um

balanceamento de cargas do sistema, corrigimos alguns problemas de ligação e

estados de oxidação que eventualmente são encontrados nos cofatores enzimáticos

(NADPH, NADP

) e drogas complexadas, 2,5-diamino-5-metil-6-[(3,4,5-trimetoxi-

N-metilanilina)metil]pirido[2,3-d]pirimidina (CO4) na enzima humana e

trimetoprima (TOP) na enzima do P. carinii.

As posições dos átomos de hidrogênio adicionados foram ajustadas através de

cálculos de mecânica molecular do tipo MM3.

Localizamos o sítio ativo das enzimas através da seleção dos resíduos de

aminoácidos, moléculas de água e cofatores enzimáticos vizinhos, aproximadamente

a uma esfera de 3 Å do substrato.

3.3. Alinhamento da seqüência das proteínas

Procedemos ao alinhamento seqüencial [105] dos resíduos de aminoácidos

das duas enzimas estudadas para verificar a semelhança em sua estrutura primária,

bem como para avaliar diferenças entre os aminoácidos que compõem o sítio ativo da

DHFR do Hs e do Pc. As seqüências foram posicionadas de acordo com a máxima

relação no alinhamento usando o BLOSUM50 [106] que é uma matriz de substituição

no algoritmo de alinhamento Needleham-Wunsh [107] implementados no programa

CAChe.

PARTE EXPERIMENTAL

- 62 -

3.4. Docking por superposição

Os estudos de docking foram realizados no programa CaChe WorkSystem Pro

Versão 6.01, a partir da superposição das moléculas estudadas (conjunto treinamento

e teste) sobre os ligantes complexados nos sítios ativos das enzimas DHFR do Pc

(TMP) e humana (CO4), ambas contendo NADPH. As conformações das estruturas

foram ajustadas manualmente através de mudanças nos valores de ângulos de diedro,

observando a cavidade da superfície do sítio ativo para maximizar as interações com

os resíduos de aminoácidos.

Na seqüência, a geometria dos novos sistemas foram otimizadas através de

cálculos de mecânica molecular MM3, nesta etapa todos os átomos do sítio ativo,

resíduos de aminoácidos, moléculas de água, cofator NADPH e droga, foram

liberados da condição de rigidez imposta anteriormente pela fixação dos mesmos em

suas coordenadas obtidas por cristalografia de raios-x. Isto possibilitou uma melhor

acomodação da nova estrutura molecular na cavidade do sítio ativo.

Identificamos as ligações de hidrogênio estabelecidas entre os resíduos de

aminoácidos e os átomos das drogas. Selecionamos estes pares para posteriormente

calcular as energias destas interações.

3.5. Cálculos dos descritores moleculares

Com as geometrias das drogas otimizadas, procedemos ao cálculo das

propriedades físico-químicas e estruturais que foram utilizadas como descritores

moleculares. Todas as propriedades foram calculadas no programa CAChe. Os

coeficientes de partição foram calculados pelo esquema de fragmentos moleculares;

as propriedades eletrônicas foram calculadas através do método semi-empírico AM1;

a área de superfície acessível ao solvente foi determinada utilizando cálculos AM1 e

o modelo COSMO; as energias das ligações de hidrogênio foram calculadas a partir

da diferença entre os calores de formação (∆

H) obtidos pelos cálculos AM1 do par

droga-aminoácido e, da droga e do aminoácido separadamente, equação 39.

()

(

)

(droga-aminoácido) (droga) (aminoácido)Hb f f f

EH H H=∆ −∆ +∆

(39)

PARTE EXPERIMENTAL

- 63 -

Todos os descritores que foram calculados para a elaboração dos modelos são

apresentados na tabela 06

Tabela 06. Descritores calculados para a elaboração dos modelos de QSAR

Descritores Definição

a,c

LogP Coeficiente de partição octanol-água.

a,c

χ,

χ Índices de conectividade de ordem 0, 1 e 2.

a,c

Índices de conectividade de valência de ordem 0, 1 e 2.

a,c

κ,

κ Índices de forma de ordem 1, 2 e 3.

a,d

AS Área da superfície de van der Waals.

a,d

VS Volume da superfície de van der Waals.

a,d

SASA Área de superfície acessível ao solvente.

a,d

∆

Calor de formação.

a,d

HOMO

, ε

LUMO

Energias do HOMO e do LUMO

a,d

Momento de dipolo molecular.

a,d

EA Afinidade eletrônica.

a,d

IP Potencial de ionização.

a,d

Dureza absoluta = (ε

HOMO

- ε

LUMO

)/2.

a,d

Eletronegatividade molecular = (ε

HOMO

+ ε

LUMO

)/2.

b,d

HOMO

, ρ

LUMO

Densidade do HOMO e do LUMO.

b,d

Q Cargas atômicas parciais.

b,d

Densidade eletrônica de fronteira eletrofílica.

b,d

Densidade eletrônica de fronteira nucleofílica.

b,d

Densidade eletrônica de fronteira radicalar.

b,d

E,A

Superdelocalizabilidade eletrofílica.

b,d

N,A

Superdelocalizabilidade nucleofílica.

b,d

R,A

Superdelocalizabilidade radicalar.

a,d

Energia da ligação de hidrogênio do par droga-aminoácido.

Propriedades calculadas considerando toda a estrutura molecular,

propriedades

atômicas calculadas para os átomos enumerados em cada estrutura,

propriedades

clássicas e

propriedades obtidas por métodos quânticos semi-empíricos.

PARTE EXPERIMENTAL

- 64 -

Podemos diferenciar as propriedades calculadas em clássicas ou quânticas e,

atômicas ou moleculares. A obtenção das propriedades clássicas não leva em

consideração quaisquer aspectos eletrônicos, enquanto que as quânticas estão

diretamente relacionadas a estes. Os descritores atômicos foram calculados somente

para os átomos enumerados nas estruturas dos homólogos do TMP (N

, C

, N

e N

), figura 15, e dos homólogos do TMQ (C

, N

, C

, N

, C

, N

e N

), figura 16. As propriedades moleculares foram calculadas

considerando toda a estrutura da molécula.

3.6. Regressões e modelos de QSAR

Os modelos de QSAR estabelecidos neste trabalho foram obtidos através de

RML. As técnicas de análise aqui utilizadas estão disponíveis no programa

STATISTICA 6.0 [108], este pacote permitiu-nos construir matrizes de correlação,

proceder às regressões lineares múltiplas e análise da variância.

Para encontrar a melhor previsão de modelo de QSAR construímos,

inicialmente, uma matriz de correlação entre os valores dos descritores calculados e

as medidas de atividade biológica e índices de seletividade. A partir dessa matriz foi

possível identificar as propriedades que melhor descrevem o valor de lnIC

ou lnSI

para cada DHFR. Escolhemos o descritor que apresentava maior correlação,

elaboramos uma regressão e, procedemos à análise dos resíduos desta regressão.

Utilizamos os resíduos da regressão para construir uma nova matriz de correlação e

identificar a propriedade que melhor descreveria este conjunto de resíduos.

Consideramos este novo descritor juntamente com o anterior para proceder a uma

nova regressão. Refizemos estas etapas até estabelecer uma equação que apresentasse

parâmetros estatísticos de avaliação dos modelos aceitáveis, como um valor de R

mais próximo de 1 e, um valor de teste F maior do que o tabelado a 95% de

confiança.

Realizamos a análise da variância e construímos uma tabela de ANOVA para

cada modelo obtido. Aplicamos os modelos obtidos as drogas dos conjuntos de teste

e, calculamos os erros na determinação dos valores de lnIC

e lnSI.

PARTE EXPERIMENTAL

- 65 -

3.7. Proposição do conjunto de novas estruturas

Procedemos à proposição de conjuntos de novas drogas potencialmente ativas

e/ou seletivas. Estes conjuntos foram construídos através de uma análise das

interações estabelecidas entre o TMP, TMQ, PTX e a superfície da cavidade do sítio

ativo da DHFR do Pc. Estas interações foram utilizadas para sugerir modificações

estruturais nos compostos base.

As novas estruturas formuladas foram modeladas no programa CAChe. Suas

geometrias foram otimizadas através de cálculos semi-empíricos AM1 para as

moléculas livres no estado gasoso. Os descritores que apareceram nos modelos de

QSAR obtidos foram calculados para os conjuntos propostos. As equações de QSAR

foram aplicadas na previsão da atividade e seletividade destas novas drogas. As

estruturas indicadas para uma possível síntese e avaliação biológica foram escolhidas

através dos valores de IC

e SI previstos.

3.8. Estudos do mecanismo da reação enzimática

De posse da estrutura cristalográfica da enzima DHFR humana (1PD9) já

modelada e refinada, realizamos o docking por superposição sobre o ligante CO4

para incluir na cavidade do sítio ativo desta enzima a molécula do folato. Ajustamos

as posições dos grupos moleculares do folato com base na cavidade da superfície do

sítio ativo e, otimizamos a geometria do novo sistema através de cálculos de

mecânica molecular MM3.

Realizamos ainda uma otimização da geometria do complexo formado entre

enzima, folato de NADPH, através de cálculos semi-empíricos AM1 utilizando o

escalonamento MOZYME, sendo que todos os átomos do sistema, com exceção

daqueles que compõem o sítio ativo, foram mantidos fixos em suas posições

cristalográficas. Calculamos os orbitais de fronteira do sistema proteico (HOMO-10

até o LUMO+9) em duas situações diferentes: uma com o sistema livre em fase

gasosa, e outra considerando o efeito de solvente, no caso água (constante dielétrica

igual a 7,8), através do modelo COSMO.

PARTE EXPERIMENTAL

- 66 -

Avaliamos as etapas de protonação e transferência do íon hidreto do

mecanismo enzimático da conversão de folato a diidrofolato e a tetraidrofolato,

através da localização dos orbitais de fronteira.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 67 -

Capítulo 4

Resultados e Discussões

4.1. Estruturas das drogas e das enzimas modeladas

Tendo em vista a enorme quantidade de estruturas moleculares modeladas,

neste capítulo serão apresentados apenas os resultados obtidos para a trimetoprima,

piritrexina e trimetrexato livres e, complexados nas enzimas DHFR do Pc e Hs,

levando em consideração o fato de que todas as drogas que compõem as séries

homólogas são estruturalmente derivadas destes compostos base.

As estruturas do TMP, PTX e TMQ após a otimização de suas geometrias,

livres no estado gasoso, através de cálculos AM1, são apresentadas na figura 17.

Figura 17. Modelos balls-and-sticks das estruturas do TMP (a), PTX (b) e TMQ

(a)

(b)

(c)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 68 -

As estruturas das proteínas modeladas, enzimas diidrofolato redutase, através

dos cálculos de mecânica molecular MM3, são apresentadas na figura 18.

Figura 18. Modelos das estruturas da DHFR do P. carinii com 3963 átomos (a) e

Humana com 3341 átomos (b).

Uma observação importante a respeito das enzimas modeladas é o fato de que

os átomos de enxofre dos resíduos de cisteína não foram protonados juntamente com

os demais resíduos, o que ocasionou problemas nos cálculos quânticos, pois,

tratavam-se de sistemas com um número ímpar de elétrons. Este problema foi

solucionado adicionando manualmente o átomo de hidrogênio ao átomo de enxofre

com elétron desemparelhado.

As cargas dos dois sistemas enzimáticos foram balanceadas levando em

consideração o pH do meio em que as enzimas foram cristalizadas e os valores de

dos resíduos de aminoácidos. Nos dados cristalográficos da DHFR do Pc não

consta o valor de pH [109], por isso, não alteramos as cargas dos resíduos, equação

40.

DHFR Pc

= [N-terminal: Asn(+1)] + [18Lys(+1)] + [11Arg(+1)] + [12Glu(-1)] +

+ [12Asp(-1)] + [NADPH: 4PO

(-1)] +

+[C-terminal: Leu(-1)] = +1 (40)

(a) (b)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 69 -

O pH no qual a DHFR humana foi cristalizada é igual a 8,00 [110]. Os

valores de pK

de referência das cadeias laterais, bem como do N-terminal e C-

terminal, dos resíduos de aminoácidos são encontrados em livros texto de bioquímica

[6] ou química orgânica [25]. A equação 41 apresenta a carga total do sistema da

DHFR humana.

DHFR Hs

= [N-terminal: Val(+1)] + [17Lys(+1)] + [8Arg(+1)] + [3His(+1)] +

+ [16Glu(-1)] + [9Asp(-1)] + [NADPH: 4PO

(-1)] +

+ [C-terminal: Asp(-1)] = -1 (41)

Na seqüência, localizamos os resíduos de aminoácidos que em conjunto com

o NADPH e moléculas de água conservadas compõem o sítio ativo destas enzimas.

Os resíduos foram selecionados considerando uma esfera de 3 Å ao redor dos

substratos complexados nas enzimas estudadas, figura 19.

Figura 19. Resíduos de aminoácidos selecionados (modelo: balls-and-sticks) ao redor

dos substratos (modelo: space filling) TMP (TOP) na DHFR do Pc (a) e CO4 na

DHFR do Hs (b).

Após a localização do conjunto de átomos que compõem o sítio ativo das

enzimas estudadas, realizamos um alinhamento das seqüências completas de

(a) (b)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 70 -

aminoácidos e comparamos os resíduos que são conservados nos sítios ativos das

duas enzimas, figura 20.

Figura 20. Seqüências das enzimas humana (1PD9) e do Pc (1DYR) alinhadas. Os

resíduos de aminoácidos que compõem os sítios ativos estão destacados.

Podemos notar que a maior parte dos resíduos que compõem o sítio ativo das

duas enzimas são conservados, o que pode explicar a falta de especificidade das

drogas utilizadas na inibição da enzima dos parasitos quando comparadas com a

humana. Os espaços em branco na figura 20 representam partes da seqüência que não

foram conservadas nas proteínas humana e do Pneumocystis.

Além dos resíduos destacados também compõem o sítio ativo da DHFR

humana uma molécula de água (W190) e da DHFR do Pc quatro moléculas de água

(W408, W520, W522 e W525).

Em seguida analisamos as superfícies das proteínas com o objetivo de

encontrar uma cavidade que pudesse identificar possíveis sítios de ligação [111], e

até mesmo o canal de entrada do substrato. A figura 21 apresenta os mapas das

superfícies das proteínas.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 71 -

Figura 21. Mapas das superfícies das proteínas DHFR humana (a) e do Pc (b).

As cores das superfícies criadas dependem da topologia, regiões mais

profundas na proteína, onde ligantes podem fixar-se são coloridas de azul e as outras

áreas de amarelo. Pode-se notar uma cavidade colorida de azul mais intenso na

enzima do Pc. Esta é a região da superfície que deve ser um bom sítio de ligação, ou

canal de entrada, devido a sua forma e profundidade.

Após a comparação desta região com a localização dos aminoácidos do sítio

ativo desta enzima pôde-se verificar que se trata da mesma área, figura 22, portanto,

muito provavelmente, os inibidores da DHFR alcançam o sítio ativo por esse canal.

Figura 22. Comparação da região de fixação na superfície da DHFR do Pc com os

resíduos de aminoácidos do sítio ativo.

Após a modelagem e análises iniciais das estruturas proteicas procedemos à

realização da inclusão das drogas estudadas nos sítios ativos das enzimas.

(a)

Potencial sítio de

ligação

(b)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 72 -

4.2. Estudos de docking

A inclusão das drogas estudadas foi realizada através do docking por

superposição, as estruturas otimizadas dos compostos das séries homólogas, da

trimetoprima, da piritrexina e do trimetrexato, foram superpostas sobre a estrutura

cristalográfica do TMP (TOP) na DHFR do Pneumocystis carinii e sobre o ligante

CO4 na DHFR humana. As estruturas dos complexos de inclusão formados durante o

docking molecular são apresentadas na figura 23.

Figura 23. Superfícies das cavidades do sítio ativo da DHFR do Pc (a-c) e do Hs (d-

f), dos complexos de inclusão formados pelo TMP (a) e (d), PTX (b) e (e), e TMQ

compostos incluídos.

(a) (b)

(e) (f)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 73 -

Pela análise da figura anterior podemos observar que a simples inclusão não

corresponde a uma geometria adequada dentro da cavidade do sítio ativo, isto pode

ser observado mais facilmente na inclusão de compostos com estruturas maiores que

os de base, como é o caso do PTX e do TMQ que apresentaram grupos fora da

cavidade do sítio ativo. Outro fato importante é que as geometrias das drogas livres

no estado gasoso, não correspondem, necessariamente, a geometria das drogas

quando complexadas no sítio ativo das enzimas. Para ajustar as estruturas inclusas,

procedemos a mudanças manuais nos valores de ângulos diedrais dos grupos que

ficaram fora da cavidade do sítio ativo e, realizamos cálculos de mecânica molecular

MM3. As estruturas das drogas após o ajuste manual e a otimização da geometria são

apresentadas na figura 24.

Figura 24. Estruturas do TMP (a) e (d), PTX (b) e (e), e TMQ (c) e (f) acomodadas

dentro da cavidade do sítio ativo da DHFR do Pc (a-c) e do Hs (d-f).

(a) (b)

(c)

(d)

(e) (f)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 74 -

Após a otimização das estruturas moleculares das drogas estudadas dentro da

cavidade do sítio ativo das enzimas, realizamos uma análise das ligações de

hidrogênio estabelecidas entre grupos funcionais das moléculas das drogas e resíduos

de aminoácidos do sítio ativo e moléculas de água conservadas. Tal análise levou em

consideração a orientação e proximidade dos pares droga-aminoácido ou droga-água.

Na figura 25 são apresentadas as principais ligações de hidrogênio formadas.

Figura 25. Ligações de hidrogênio formadas entre as drogas TMP, PTX, TMQ e os

resíduos de aminoácidos e moléculas de água conservadas no sítio ativo da DHFR do

Pc (a-c) e humana (d-f).

(a) (b)

(c)

(d)

(e) (f)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 75 -

Podemos observar na figura 25 que as principais ligações de hidrogênio

formadas na enzima diidrofolato redutase do P. carinii são com os resíduos de

aminoácidos Ile10, Ile123, Glu32 e com algumas moléculas de água, W520 e W525.

Na DHFR humana os resíduos são: Ile7, Val115, Glu30 e com a molécula de água

W190. Quando comparamos as interações nas duas enzimas e, observamos os

resíduos de aminoácidos que são importantes, percebemos que somente a Ile123 na

DHFR do Pc e a Val115 na DHFR do Hs devem colaborar para um ganho de

seletividade, pois, os outros resíduos equivalem nas duas enzimas, como pode ser

verificado na seqüência de aminoácidos alinhados na figura 20.

Esse aumento de seletividade pode ser conseguido fortalecendo a interação

entre as drogas e o resíduo Ile123 na enzima do parasita, concomitantemente com a

diminuição da interação entre o resíduo Val115 da enzima humana e as drogas. As

interações com as moléculas de água são mais específicas, não ocorrendo com todas

as drogas estudadas. Mas, como já foi sugerido na literatura, devem ter papel

fundamental no mecanismo enzimático de protonação do substrato [39].

4.3. Modelos de QSAR obtidos através das regressões

Após calcular os descritores moleculares que representam as propriedades das

drogas, procedemos à elaboração dos modelos de QSAR através das regressões

lineares múltiplas, na seqüência são apresentadas as previsões de modelos obtidas

para as séries de drogas estudadas.

4.3.1. Modelos de atividade e seletividade para a série do TMP

i) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do Pneumocystis carinii

A equação estabelecida que descreve a atividade inibitória das drogas

derivadas do TMP contra a enzima diidrofolato redutase do P. carinii é apresentada

abaixo, equação 42.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 76 -

lnIC

Pc = -195,39 + 2,53 LogP + 588,02 QC

+ 528,49 ρ

HOMO

+ 783,51 S

R,A

+ 3,53 E

Ile123Pc (42)

O grau de ajuste do modelo obtido foi avaliado através da análise da

variância, esta avaliação está desenvolvida na tabela 07.

Tabela 07. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Pc

Fonte

df SS MS

Regressão

5 84,1241 16,8248 F = 35,6779

Resíduo

16 7,5452 s

= 0,4716 R

= 0,9177

Total

21 91,6693 4,3652

Podemos observar que o valor do coeficiente de determinação do modelo (R

)

é maior que 90% o que demonstra um bom ajuste do modelo às respostas observadas.

Isto quer dizer que a maior parte da variação em torno da média é explicada pelo

modelo, ou seja, são poucos os resíduos da regressão. O valor de F obtido é cerca de

12,5 vezes maior que o tabelado a 95% de confiança (F

5,16

= 2,85). Indicativo de que

o modelo explica a maior parte da variabilidade dos dados, como pode ser observado

na figura 26 onde são avaliados os valores de lnIC

previstos contra os observados a

95% de confiança.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 77 -

Figura 26. Valores de lnIC

previstos contra os observados para o Pc.

O elevado valor de F também valida o coeficiente de determinação do

modelo. O quadrado do coeficiente de correlação ajustado obtido para este modelo é

just

= 0,8920 e o da probabilidade associada ao valor de F é p < 0,0001. Este valor

ratifica a significância estatística do coeficiente de correlação sendo que o erro

envolvido na afirmação dessa hipótese é menor que 0,01%.

A falta de ajuste do modelo proposto foi ainda avaliada através da utilização

dos resíduos da regressão como pode ser observado na figura 27.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 78 -

Figura 27. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Pc.

Através da análise do gráfico dos resíduos podemos observar a estrutura

aleatória dos pontos, um indicativo de que o modelo não possui erros sistemáticos

devido à especificação incorreta do mesmo. Somente erros aleatórios estão presentes

e, desse modo, o modelo proposto não apresenta falta de ajuste.

A significância estatística dos coeficientes da regressão foi testada através dos

seus intervalos de confiança a 95% como pode ser observado na equação 43.

lnIC

Pc = -195,39 (± 33,20) + 2,53 (± 0,22) LogP + 588,02 (± 177,33) QC

+ 528,49 (± 163,67) ρ

HOMO

+ 783,51 (± 150,79) S

R,A

+ 3,53 (0,51) E

Ile123Pc (43)

Percebe-se facilmente que todos os coeficientes são estatisticamente

significantes, pois, os valores dos intervalos de confiança não são maiores do que o

próprio valor do coeficiente.

O número de variáveis utilizadas para explicar a variabilidade dos valores de

atividade observados é igual a cinco, esta quantidade corresponde aquela enumerada

por Hansch para minimizar a ocorrência de correlação das variáveis por

coincidência. “Deve haver no mínimo cinco ou seis compostos para cada variável

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 79 -

incluída no modelo”. Entretanto, como pode ser observado na tabela 08 existem dois

descritores que apresentam uma moderada correlação.

Tabela 08. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o Pc

LogP QC

HOMO

R,A

Ile123Pc

LogP 1,00

0,01 1,00

HOMO

-0,08 0,36 1,00

R,A

-0,22 -0,07 -0,53 1,00

Ile123Pc -0,08 -0,40 0,30 -0,35 1,00

As variáveis superdelocalizabilidade radicalar do átomo de nitrogênio 14 e a

densidade do HOMO do carbono 2 apresentam correlação maior que 50%, porém,

todas duas são importantes na determinação do modelo e representam características

fundamentais do mecanismo de inibição enzimática das drogas estudadas.

A primeira variável, LogP, esta relacionada a processos de permeabilidade

em meios hidrofílicos e lipofílicos, sendo, por isso, de fundamental importância no

transporte das drogas. Pela análise da equação 42 podemos perceber que quanto

maior for o valor do coeficiente de partição octanol-água, maior será a estimativa de

atividade das drogas, ou seja, quanto mais lipossolúveis forem as drogas melhor.

Para todas as demais variáveis um incremento no seu valor eleva a potência do

composto.

Segundo a mesma equação, a carga do átomo de carbono 4 também é

importante, quanto mais positiva for sua carga melhor. Tal idéia condiz com o fato

de que é numa posição equivalente a esta, que um átomo de carbono do folato,

recebe um íon hidreto do cofator enzimático NADPH durante sua redução a

diidrofolato.

A densidade do HOMO do carbono 2, juntamente com a

superdelocalizabilidade do nitrogênio 14, devem representar a interação que um dos

grupos amino das drogas realiza com a Ile10 e Ile123 do Pc.

A energia da ligação de hidrogênio com a Ile123 também aparece no modelo

de regressão como variável importante, esta interação é específica para a enzima do

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 80 -

Pneumocystis carinii, levando a um ganho de atividade e seletividade, pois, na

enzima humana o aminoácido correspondente é a Val115.

ii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do Toxoplasma gondii

A previsão do modelo para a atividade contra a enzima do T. gondii

estabelecida através das RML é apresentada na equação 44.

lnIC

Tg = 228,70 + 0,90 µ + 1,61 LogP - 0,79

κ + 1074,21 ρ

HOMO

- 246,10 S

E,A

- 3661,57 ρ

LUMO

(44)

A análise da variância para o modelo apresentado acima está desenvolvida na

tabela 09.

Tabela 09. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Tg

Fonte

df SS MS

Regressão

6 101,3433 16,8905 F = 19,6323

Resíduo

15 12,9051 0,8603 R

= 0,8870

Total

21 114,2484 5,4404

O valor de R

é cerca de 89% o que ainda representa um modelo com um bom

grau de ajuste. F obtido é cerca de sete vezes maior que o valor tabelado a 95% de

confiança (F

6,15

= 2,79), desse modo, o modelo é capaz de explicar uma boa parcela

da variabilidade dos dados. Na figura 28 podemos observar a capacidade de previsão

dos valores de atividade, bem como as estruturas que não se ajustam muito bem ao

modelo de regressão (outliers).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 81 -

Figura 28. Valores de lnIC

previstos contra os observados para o Tg.

O valor do coeficiente de correlação ajustado para este modelo é 0,8419,

menor que o obtido para o modelo contra o Pc e, por isso, indica de que a equação 42

apresenta maior grau de ajuste que a equação 44. A probabilidade associada ao valor

de F é menor que 0,0001, o que valida o coeficiente de correlação.

A análise qualitativa da falta de ajuste do modelo de regressão é apresentada

na figura 29.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 82 -

Figura 29. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Tg.

A análise visual dos resíduos no gráfico acima revela um padrão estritamente

aleatório para a distribuição dos mesmos, sugerindo que o modelo representado pela

equação 44 não apresenta falta de ajuste e que não devem existir erros sistemáticos

devido à especificação incorreta do mesmo.

Os intervalos de confiança para os coeficientes das variáveis do modelo de

atividade contra o Tg são apresentados na equação 45. Pode-se notar que todos os

coeficientes da regressão são estatisticamente significantes, já que todos os valores a

95% de confiança são maiores que o próprio coeficiente.

lnIC

Tg = 228,70 (± 52,94) + 0,90 (± 0,41) µ + 1,61 (± 0,31) LogP +

- 0,79 (± 0,30)

κ + 1074,21 (± 180,00) ρ

HOMO

- 246,10 (± 47,06) S

E,A

- 3661,57 (± 728,24) ρ

LUMO

(45)

O número de seis variáveis utilizadas no modelo de regressão está no limite

da faixa proposta, para os 32 derivados do TMP o número máximo de variáveis

utilizadas deve ser seis, com o objetivo de minimizar a ocorrência de correlação entre

as mesmas. Como pode ser observado na tabela 10 nenhuma das variáveis apresenta

correlação apreciável.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 83 -

Tabela 10. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o Tg

LogP

κ ρ

HOMO

E,A

LUMO

1,00

LogP

0,01 1,00

-0,46 0,24 1,00

HOMO

-0,15 -0,08 0,33 1,00

E,A

0,27 -0,28 -0,32 0,23 1,00

LUMO

-0,26 -0,03 0,11 -0,08 -0,23 1,00

Segundo a equação 44 quanto maior for o momento de dipolo elétrico

molecular maior será a atividade do composto avaliado, isto reflete a importância da

polaridade nos processos de interação das drogas com o substrato. Do mesmo modo,

quanto maior o coeficiente de partição octanol-água maior será a atividade prevista,

ou seja, é preferível drogas um pouco mais lipofílicas que hidrofílicas.

O índice de forma de ordem 3 (

κ) reflete o grau de ramificação da molécula,

observando o modelo verificamos que um aumento na quantidade de ramificações

leva a uma diminuição da atividade, fato que deve estar relacionado a impedimentos

estéricos que dificultam a entrada e acomodação das moléculas na cavidade do sítio

ativo das enzimas.

A densidade do HOMO do carbono 2, como já foi citado para o Pc, deve estar

relacionada com as interações estabelecidas entre o grupo amina diretamente ligado a

este e aminoácidos importantes na enzima do Toxoplasma gondii.

Uma diminuição da superdelocalizabilidade eletrofílica do carbono 3 leva a

um aumento da atividade, isto condiz com a etapa de transferência do íon hidreto do

mecanismo enzimático, pois, para que o íon hidreto seja adicionado ao carbono 3,

átomo que possui uma posição equivalente a um carbono do diidrofolato onde ocorre

a conversão a tetraidrofolato, sua capacidade de ser atacado por um eletrófilo deve

ser mínima.Na realidade este carbono deve sofrer um ataque de um nucleófilo.

A densidade do LUMO do átomo de nitrogênio 5 pode ser relacionada com a

etapa de protonação do átomo de nitrogênio no folato.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 84 -

iii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do Mycobacterium

avium

O modelo de regressão obtido para a atividade das drogas estudadas contra a

enzima diidrofolato redutase do Mycobacterium avium é apresentado na equação 46.

lnIC

Ma = 375,46 + 0,83 µ + 1,23 LogP - 0,59

χ + 288,44 QN

+ 596,31 ρ

HOMO

- 129,35 S

E,A

- 173,18 S

E,A

- 2571,97 ρ

LUMO

(46)

A equação acima, obtida após as regressões lineares múltiplas, teve seu grau

de ajuste avaliado através da análise da variância da regressão. Os dados da ANOVA

são apresentados na tabela 11.

Tabela 11. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Ma

Fonte

df SS MS

Regressão

8 101,3513 12,6689 F = 64,9278

Resíduo

13 2,5366 0,1951 R

= 0,9756

Total

21 103,8879 4,94710

O modelo de regressão para a atividade contra o Ma apresenta o maior

coeficiente de determinação dentre todas as equações estabelecidas, seu valor é

maior que 97%, o que demonstra seu ótimo grau de ajuste e o mínimo de resíduos da

regressão. O valor de F é maior que 24 vezes o tabelado a 95% de confiança (F

8,13

2,77), por esta razão a validade do coeficiente de determinação do modelo é certa. Os

valores das atividades previstas pelo modelo estão muito próximas dos valores

observados, figura 30.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 85 -

Figura 30. Valores de lnIC50 previstos contra os observados para o Ma.

O valor obtido para o quadrado do coeficiente de correlação ajustado é

0,9606, possibilitando comparar as correlações entre os modelos e, demonstrando

que esta é sem dúvida a melhor equação de regressão entre todas as estudadas. A

probabilidade associada ao valor de F é menor que 0,0001, sendo assim, o erro

envolvido na significância estatística de F é menor que 0,01%.

A análise qualitativa da falta de ajuste do modelo de regressão através pode

ser feita através da observação do gráfico dos resíduos apresentado na figura 31.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 86 -

Figura 31. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Ma.

A estrutura apresentada pelos resíduos do modelo de regressão é

indiscutivelmente aleatória, esta informa qualitativamente que não há falta de ajuste

no modelo de regressão e que os erros do mesmo são unicamente de natureza

aleatória.

A análise da significância estatística dos coeficientes da regressão, avaliada

através dos intervalos de confiança dos mesmos a 95% de confiança, é apresentada

na equação 47.

lnIC

Ma = 375,46 (± 32,72) + 0,83 (± 0,21) µ + 1,23 (± 0,18) LogP +

- 0,59 (± 0,13)

χ + 288,44 (± 65,12) QN

+ 596,31 (± 117,54) ρ

HOMO

2 +

- 129,35 (± 34,21) S

E,A

- 173,18 (± 43,47) S

E,A

- 2571,97 (± 408,44) ρ

LUMO

(47)

Todos os coeficientes são significativos, pois, os valores dos intervalos de

confiança não são maiores que os próprios coeficientes.

Todas as oito variáveis da equação de regressão apresentam significância

estatística, porém, há correlação por coincidência entre algumas delas como pode ser

observado na tabela 12.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 87 -

Tabela 12. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o Ma

LogP

χ QN

HOMO

E,A

LUMO

1,00

LogP

0,01 1,00

-0,01 0,19 1,00

-0,38 -0,06 -0,02 1,00

HOMO

-0,15 -0,08 -0,69 0,12 1,00

E,A

0,27 -0,28 -0,30 -0,54 0,23 1,00

E,A

0,46 -0,51 -0,20 -0,41 0,05 0,75 1,00

LUMO

-0,26 -0,03 -0,17 0,19 -0,08 -0,23 -0,36 1,00

As variáveis LogP e S

E,A

apresentam uma baixa correlação, bem como a

e a S

E,A

. Entretanto, as variáveis

χ e ρ

HOMO

, e as S

E,A

e S

E,A

tem

correlação relativamente grande, por essa razão apenas uma delas, dentro de cada

par, deveria ser considerada no modelo de regressão, já que devem conter o mesmo

tipo de informação. Porém, nesta situação, a significância estatística do modelo,

avaliada através da análise da variância, diminui absurdamente. Assim decidimos

considerar todas elas.

As variáveis LogP e µ aparecem novamente como descritores moleculares

importantes para a atividade biológica das drogas estudadas. O índice de

conectividade de segunda ordem (

χ) representa a quantidade de vizinhos de um dado

átomo em duas direções. A análise da equação 47 informa que quanto menor for seu

valor, maior será a atividade do composto no conjunto estudado.

Um aumento no valor da carga do átomo de nitrogênio 5 implica num

aumento da atividade. Este fato pode estar relacionado com uma maior facilidade de

protonação do nitrogênio durante a inibição enzimática. Da mesma forma deve aturar

a diminuição da densidade do LUMO do mesmo átomo.

A densidade do HOMO do carbono 2 já foi discutida, um aumento desta

propriedade eleva o valor da atividade prevista, o que pode estar relacionado com o

fortalecimento das interações entre um dos grupos amina e resíduos de aminoácidos

próximos. Com uma alta densidade eletrônica, o átomo de nitrogênio do grupo

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 88 -

amina, diretamente ligado ao carbono 2, deve ficar também como uma densidade

eletrônica elevada e formar ligações de hidrogênio mais fortes.

Pelas mesmas razões expostas para a atividade contra o Tg, a diminuição da

superdelocalizabilidade eletrofílica do carbono 3 leva a um aumento da atividade.

Uma superdelocalizabilidade eletrofílica do nitrogênio 15 pequena é

indicativa de que este átomo atua como nucleófilo, ou seja, possui densidade

eletrônica elevada. Este átomo estabelece importantes ligações de hidrogênio com

resíduos de aminoácidos de ácido glutâmico na enzima humana e do P. carinii.

iv) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do fígado de rato

A última equação estabelecida para a atividade da série derivada do TMP é

apresentada abaixo, equação 48, onde podemos observar as variáveis que descrevem

a atividade das drogas estudadas contra a enzima do fígado de rato.

lnIC

Rl = - 207,13 + 0,59 µ + 1,33 LogP - 414,16 QC

+ 362,17 ρ

HOMO

+ 280,20 S

R,A

+ 570,03 S

R,A

+ 99,70 S

E,A

- 5,54 E

Val115Hs (48)

Esta equação foi analisada através da análise da variância da regressão. Os

parâmetros de avaliação do grau de ajuste do modelo são apresentados na tabela 13.

Tabela 13. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Rl

Fonte

df SS MS

Regressão

8 23,1697 2,8962 F = 21,2976

Resíduo

13 1,7678 0,1360 R

= 0,9291

Total

21 24,9375 1,1875

O modelo de regressão apresenta um valor de R

bastante elevado, próximo

de 93 %, este parâmetro indica que há um bom ajuste do modelo às respostas

observadas. O valor de F é cerca de 7,7 vezes o tabelado a 95% de confiança (F

8,13

2,77). Este modelo apesar apresentar menor capacidade de previsão quando

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 89 -

comparado aos outros, ainda assim, é capaz de explicar a maior parte da

variabilidade dos dados, figura 32.

Figura 32. Valores de lnIC50 previstos contra os observados para o fígado de rato.

O valor do quadrado do coeficiente de correlação ajustado obtido para este

modelo é

just

= 0,8855 e o da probabilidade associada ao valor de F é p < 0,0001,

demonstrando que apesar da menor capacidade de previsão, o coeficiente de

correlação apresenta significância estatística.

A análise do gráfico dos resíduos do modelo de regressão indica que o

modelo não apresenta falta de ajuste devido a sua especificação, figura 33.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 90 -

Figura 33. Resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o fígado de rato.

A distribuição dos pontos no gráfico dos resíduos assume uma estrutura

aleatória, indicando a inexistência de erros sistemáticos.

A avaliação dos intervalos de confiança demonstrou a significância estatística

dos coeficientes da regressão, equação 49.

lnIC

Rl = - 207,13 (± 35,55) + 0,59 (± 0,22) µ + 1,33 (± 0,16) LogP +

- 414,16 (± 69,26) QC

+ 362,17 (± 160,32) ρ

HOMO

+ 280,20 (± 61,74) S

R,A

+ 570,03 (± 85,86) S

R,A

+ 99,70 (± 29,23) S

E,A

- 5,54 (± 0,63) E

Val115Hs (49)

Do mesmo modo que para o modelo de atividade contra o Mycobacterium

avium, um total de oito variáveis foram utilizadas na equação de regressão, número

superior as seis variáveis sugeridas com o objetivo de minimizar as correlações por

coincidência. Porém, neste caso, somente três variáveis apresentaram correlação e,

mesmo assim, esta foi relativamente pequena, tabela 14.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 91 -

Tabela 14. Matriz de correlação das variáveis do modelo de atividade contra o fígado

de rato

LogP QC

HOMO

R,A

E,A

Val115Hs

1,00

LogP

0,01 1,00

0,43 0,07 1,00

HOMO

0,02 0,02 0,29 1,00

R,A

-0,11 0,08 0,51 0,34 1,00

R,A

0,31 -0,22 0,38 -0,15 -0,17 1,00

E,A

0,46 -0,55 0,28 0,31 0,15 0,18 1,00

Val115Hs

0,41 0,01 0,52 0,17 0,43 0,31 0,36 1,00

Novamente as variáveis momento de dipolo e coeficiente de partição octanol-

água aparecem nos modelos, isto indica que estes são descritores fundamentais para a

atividade dos compostos estudados derivados do TMP.

Um aumento da carga do carbono 2 leva a uma diminuição da atividade, o

que fortalece a idéia de que o átomo de carbono 2 influência a interação formada

entre o átomo de nitrogênio 14 do grupo amina e os resíduos de aminoácidos, que no

presente caso correspondem a Ile7 e Val115. A superdelocalizabilidade radicalar do

nitrogênio 14 também deve estar associada a sua capacidade de estabelecer esta

interação.

A densidade do HOMO do nitrogênio 1 e a sua superdelocalizabilidade

eletrofílica devem estar relacionadas com a protonação deste átomo, um aumento nos

seus valores contribui positivamente para a atividade, ou seja, um aumento na

densidade do HOMO e no seu caráter nucleófilico facilitam a protonação do átomo

de nitrogênio.

Quanto menor for a energia da ligação de hidrogênio entre o grupo amina e o

aminoácido Val115 maior será a elevação da atividade. Um fato muito importante a

ser mencionado é a especificidade da Ile123 na enzima do Pc que deve proporcionar

não só um ganho de atividade, mas também na seletividade para este parasita. No

caso da Val115 temos a mesma situação, está interação é específica com a enzima

humana que, na pretensão de elaborar substâncias com o mínimo de efeitos

colaterais, deve ser desfavorecida.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 92 -

v) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do Pneumocystis

carinii

A equação que tenta descrever a seletividade das drogas derivadas do TMP

contra a enzima diidrofolato redutase do P. carinii é apresentada na equação 50.

lnSIPc = - 101,77 + 1,03

κ - 318,02 QC

+ 555,83 S

R,A

- 0,05 VS (50)

A análise da variância para o modelo apresentado acima está desenvolvida na

tabela 15.

Tabela 15. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o Pc

Fonte

df SS MS

Regressão

4 28,1634 7,0409 F = 13,8481

Resíduo

17 8,6434 0,5084 R

= 0,7652

Total

21 36,8069 1,7527

Podemos observar facilmente que o primeiro modelo para seletividade

apresenta um grau de ajuste muito menor quando comparado aos modelos de

atividade das drogas derivadas do TMP. O valor de F é apenas 4,6 vezes o tabelado a

95% de confiança (F

4,17

= 2,96). Este indica que uma parte razoável da variabilidade

dos dados é explicada como pode ser observado na figura 34.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 93 -

Figura 34. Valores de lnSI previstos contra os observados para o Pc.

O valor de

just

= 0,7099 em comparação com os modelos de atividade

ratifica o menor grau de ajuste obtido para os modelos de seletividade. A

probabilidade associada ao valor de F ainda assim apresenta valor menor que 0,0001.

Apesar do menor grau de ajuste podemos observar através da análise dos resíduos de

regressão que não devem existir erros sistemáticos no modelo proposto, figura 35.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 94 -

Figura 35. Resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o Pc.

A significância estatística dos coeficientes de regressão avaliada através dos

intervalos de confiança a 95% é apresentada na equação 51.

lnSIPc = - 101,77 (± 33,64) + 1,03 (± 0,29)

κ - 318,02 (± 148,34) QC

+ 555,83 (± 149,55) S

R,A

- 0,05 (± 0,01) VS (51)

Todos os coeficientes são estatisticamente significantes, contudo é importante

observar que os valores dos intervalos de confiança estão relativamente próximos dos

valores dos coeficientes, o que diminui sua significância estatística.

O número de variáveis utilizadas no modelo para seletividade corresponde ao

valor sugerido com intuito de minimizar as correlações por coincidência, entretanto,

pode-se observar na tabela 16 que três das variáveis estudadas apresentam correlação

considerável.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 95 -

Tabela 16. Matriz de correlação das variáveis do modelo de seletividade contra o Pc

κ QC

R,A

1,00

-0,30 1,00

R,A

-0,65 0,21 1,00

0,71 -0,17 -0,51 1,00

A correlação existente entre as variáveis

κ, S

R,A

e VS é relativamente

grande. Por isso, somente uma dentre as três deveria constar na equação de

regressão, no entanto, sem elas a especificação do modelo conteria apenas duas

variáveis.

O índice de forma de ordem 3 é um indicativo do grau de ramificação como

já foi citado anteriormente, e segundo a equação 51 um aumento no número de

ramificações eleva a seletividade das drogas contra o Pc. De certa forma isto vai de

encontro com o discutido para a atividade contra o Tg aonde um aumento de

κ leva

a uma redução da atividade.

Um aumento da carga do átomo de carbono 4 diminui a seletividade. Este

átomo corresponde a um sítio equivalente no folato onde ocorre a entrada o íon

hidreto.

A superdelocalizabilidade radicalar do átomo de nitrogênio 5 deve estar

associada com o processo de protonação do mesmo.

Por fim, um aumento no volume da superfície de van der Waals leva a uma

diminuição da seletividade, esta propriedade pode representar diferenças no tamanho

entre as cavidades dos sítios ativos da enzima humana e do Pc.

vi) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do Toxoplasma

gondii

A previsão do modelo que tenta descrever a seletividade da série homóloga

ao TMP contra a enzima diidrofolato redutase do T. gondii é apresentada na equação

52.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 96 -

lnSITg = - 557,74 - 1,10 µ + 0,66

χ - 516,74 QC

+ 216,25 S

E,A

+ 339,31 S

E,A

+ 2513,31 ρ

LUMO

(52)

A equação apresentada acima foi avaliada através da análise da variância da

regressão. Os parâmetros da ANOVA para o modelo de seletividade contra o Tg

estão apresentados na tabela 17.

Tabela 17. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o Tg

Fonte

df SS MS

Regressão

6 46,0164 7,6694 F = 13,7931

Resíduo

15 8,3405 0,5560 R

= 0,8466

Total

21 54,3569 2,5884

O coeficiente de determinação para este modelo de seletividade é próximo de

85% e o valor do teste F é aproximadamente 5 vezes o tabelado a 95% de confiança

6,15

= 2,79). Tais parâmetros sugerem que apenas uma parte da variabilidade dos

dados é explicada, figura 36.

Figura 36. Valores de lnSI previstos contra os observados para o Tg.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 97 -

Como pode ser observado na figura acima o modelo de seletividade para o

Tg, do mesmo modo que o modelo de seletividade para o Pc, apresenta uma menor

capacidade de previsão dos valores observados quando comparado aos modelos de

atividade. O coeficiente de correlação ajustado é igual a 0,7852 e a probabilidade é

menor que 0,0001. Embora menos ajustados que os modelos de atividade, a análise

dos resíduos da regressão demonstra uma distribuição aleatória dos pontos, figura 37.

Figura 37. Resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o Tg.

A estrutura aleatória na distribuição dos pontos do gráfico acima demonstra a

não ocorrência de erros sistemáticos. Tal análise sugere que apesar da menor

capacidade de previsão do modelo de seletividade este, ainda assim, é

estatisticamente significante.

Os intervalos de confiança avaliados a 95% para os coeficientes das variáveis

do modelo de regressão sugerem que todos são significativos, equação 53.

lnSITg = - 557,74 (± 92,16) - 1,10 (± 0,32) µ + 0,66 (± 0,17)

χ +

- 516,74 (± 189,53) QC

+ 216,25 (± 38,40) S

E,A

+ 339,31 (± 81,87) S

E,A

+ 2513,31 (± 661,66) ρ

LUMO

(53)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 98 -

O número de variáveis utilizadas na especificação do modelo corresponde ao

valor máximo para evitar correlação por coincidência, mesmo assim as variáveis

χ e

E,A

apresentam uma correlação apreciável, tabela 18.

Tabela 18. Matriz de correlação das variáveis do modelo de seletividade contra o Tg

χ QC

E,A

LUMO

1,00

-0,06 1,00

0,37 -0,26 1,00

E,A

0,27 -0,39 0,44 1,00

E,A

0,22 -0,69 0,14 0,24 1,00

LUMO

-0,26 -0,18 -0,43 -0,23 0,14 1,00

O momento de dipolo molecular também aparece no modelo de seletividade

como variável importante, entretanto, aqui quanto maior for o valor de µ menor será

a seletividade do composto.

O índice de conectividade de ordem zero indica o número de vizinhos mais

próximos de um dado átomo. Segundo a equação 53 um aumento no valor de

contribui para um aumento de seletividade.

A carga do carbono 4 e superdelocalizabilidade eletrofílica do carbono 3

devem estar relacionadas com a etapa de entrada do íon hidreto no mecanismo

enzimático do folato.

A superdelocalizabilidade eletrofílica do nitrogênio 14 deve estar relacionada

com as interações entre um dos grupos amina e os resíduos de aminoácidos do sítio

ativo das enzimas.

A densidade do LUMO do nitrogênio 5 deve estar relacionada a protonação

do mesmo.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 99 -

vii) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do Mycobacterium

avium

A equação obtida para a seletividade das drogas derivadas do TMP contra a

enzima diidrofolato redutase do M. avium é apresentada na equação 54.

lnSIMa = - 255,38 - 1,13 µ +268,39 ρ

HOMO

+ 440,38 S

R,A

+ 417,18 S

R,A

+ 86,51 S

E,A

- 1,16 E

Glu30Hs (54)

Tal equação teve seu grau de ajuste avaliado através da análise da variância

que é apresentada na tabela 19.

Tabela 19. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o

Fonte

df SS MS

Regressão

6 45,8731 7,6455 F = 20,7487

Resíduo

15 5,5272 0,3685 R

= 0,8925

Total

21 51,4003 2,4476

Pode ser observado na tabela acima que o coeficiente de determinação do

modelo R

apresenta valor próximo de 90% e o valor de F é maior que o tabelado a

95% de confiança cerca de 7,5 vezes. Entre todos os modelos de seletividade este é

sem dúvida o melhor. O que pode ser comprovado através do valor de

just

= 0,8494

e da probabilidade associada ao valor de F, p < 0,0001. A capacidade de previsão

deste modelo é apresentada na figura 38.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 100 -

Figura 38. Valores de lnSI previstos contra os observados para o Ma.

Podemos perceber pelo gráfico acima que uma boa parte das estruturas não se

ajustaram ao modelo, esta situação foi avaliada através dos resíduos da regressão que

são apresentados na figura 39.

Figura 39. Resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o Ma.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 101 -

A estrutura dos resíduos apresentados demonstra certa aleatoriedade o que

valida a equação obtida para o modelo de seletividade. No entanto, é importante

ressaltar a menor capacidade de previsão dos modelos de seletividade.

Todos os coeficientes do modelo de regressão apresentam significância

estatística, o que pode ser verificado através dos intervalos de confiança a 95%

apresentados na equação 55.

lnSIMa = - 255,38 (± 30,51) - 1,13 (± 0,34) µ + 268,39 (± 46,16) ρ

HOMO

+ 440,38 (± 123,79) S

R,A

+ 417,18 (± 156,50) S

R,A

+ 86,51 (± 26,72) S

E,A

- 1,16 E

Glu30Hs (± 0,26) (55)

Das seis variáveis utilizadas na equação de regressão três apresentam

correlação considerável como pode ser visto na tabela 20.

Tabela 20. Matriz de correlação das variáveis do modelo de seletividade contra o Ma

HOMO

R,A

E,A

Glu30Hs

1,00

HOMO

-0,08 1,00

R,A

0,69 0,13 1,00

R,A

0,31 0,20 0,61 1,00

E,A

0,22 -0,29 0,13 -0,31 1,00

Glu30Hs

-0,02 0,23 0,05 -0,21 0,23 1,00

A maioria das variáveis do modelo de seletividade já foram discutidas

anteriormente, porém, a superdelocalizabilidade eletrofílica do carbono 6 aparece

neste modelo como variável importante, isto pode ser devido a um efeito no

fortalecimento de interações entre o grupo amina do nitrogênio 15 e alguns resíduos

de aminoácidos nas enzimas. Um desses resíduos aparece no modelo, na realidade,

um enfraquecimento da ligação de hidrogênio do grupo amina com a Glu30 na

enzima humana eleva a seletividade das drogas frente a enzima do Ma.

Após avaliar os modelos de atividade e seletividade obtidos e verificar a

capacidade de previsão dos valores observados, procedemos a aplicação das

equações ao conjunto de drogas reservadas para o teste dos modelos, e desse modo

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 102 -

suas validações. Os erros para as previsões de atividade e seletividade das drogas do

grupo de teste são apresentados na tabela 21.

Tabela 21. Erros para as previsões de atividade e seletividade das drogas do grupo de

teste dos derivados do TMP

Erros para lnIC

(%) Erros para lnSI

(%)

Drogas

Pc Tg Ma Rl

Pc Tg Ma

247,11 8299,08 41,40 86,44

62,00 111,18 24,33

84,32 6096,23 94,06 4,10

39,93 104,79 68,21

56,55 2443,73 1,89 72,35

23,75 30,83 1,30

54,54 1737,89 11,66 78,73

18,26 22,12 23,27

196,45 750,86 114,24 1123,57

111,86 602,23 520,92

3187,88 4103,33 105,58 328,78

34,04 76,75 8,31

62,32 8990,71 61,95 36,30

83,90 91,14 12,70

8825,04 2942,73 108,60 402,69

146,54 540,93 418,14

TMP

306,82 4745,39 895,76 47,12

17,65 23,91 64,89

PTX

1164,79 2330,27 1894,65 411,31

2043,07 8525,23 999,68

Em azul mais escuro são apresentados os erros que ficaram na faixa de 0,00 a

30,00 %, sendo considerados como pequenos. Os valores em azul claro representam

os erros na faixa de 30,01 a 50,00 % considerados como erros medianos. Os demais

valores representam erros superiores a 50,01% e, desse modo, são indicativos de

previsões mal sucedidas.

Podemos perceber que, ao contrário do que esperávamos, os menores erros

ocorreram para os modelos de seletividade. O modelo para atividade contra o Ma foi

o que apresentou maior capacidade de previsão do conjunto teste dentre os demais

modelos de atividade. É fácil perceber que a estrutura p

e o PTX não devem

pertencer a uma série considerada homóloga ao TMP, para o PTX o motivo devem

ser as consideráveis diferenças estruturais apresentadas.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 103 -

4.3.2. Modelos de atividade e seletividade para a série do TMQ

i) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do Pneumocystis carinii

A equação estabelecida para a atividade inibitória das drogas derivadas do

TMQ contra a enzima diidrofolato redutase do P. carinii é apresentada abaixo,

equação 56.

lnIC

Pc = - 113,79 - 100,47 QN

- 18,39 f

+ 62,11 S

N,A

+ 236,95 S

R,A

- 287,57 S

R,A

+ 199,95 S

R,A

(56)

O grau de ajuste da equação apresentada acima foi avaliado através da análise

da variância. Na tabela 22 é apresentado o resultado desta análise.

Tabela 22. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Pc

Fonte

df SS MS

Regressão

6 22,2511 3,7085 F = 26,6344

Resíduo

20 2,7847 0,1392 R

= 0,8888

Total

26 25,0358 0,9629

Os parâmetros obtidos da ANOVA demonstram que o modelo para a

atividade dos derivados do TMQ contra a DHFR do Pc é estatisticamente

significante. O valor de F é 10 vezes maior que o tabelado a 95% de confiança (F

6,20

= 2,60). O coeficiente de correlação ajustado é

just

= 0,8554 e a probabilidade

associada ao valor de F é p < 0,0001. A maior parte da variabilidade dos dados é

explicada pelo modelo de regressão como pode ser observado na figura 40.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 104 -

Figura 40. Atividades (lnIC

) previstas contra as observadas para o Pc.

Pela análise da figura acima algumas estruturas não se ajustaram muito bem

aos modelos. A análise da falta de ajuste do modelo foi realizada através do gráfico

dos resíduos da regressão, figura 41.

Figura 41. Gráfico dos resíduos da regressão para a atividade contra o Pc.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 105 -

Os resíduos da regressão apresentam distribuição aleatória, comprovando o

bom ajuste do modelo e indicando que os erros pertencentes ao mesmo não são de

origem sistemática.

Todos os coeficientes da regressão apresentam significância estatística como

pode ser observado na equação 57. A avaliação destes coeficientes foi realizada com

base nos intervalos de confiança a 95 %, em parênteses.

lnIC

Pc = - 113,79 (± 24,73) - 100,47 (± 16,03) QN

- 18,39 (± 5,58) f

+ 62,11 (± 7,78) S

N,A

+ 236,95 (± 56,87) S

R,A

- 287,57 (± 83,06) S

R,A

+ 199,95 (± 83,07) S

R,A

(57)

Nenhuma das seis variáveis do modelo de regressão apresentou correlação

significativa, tabela 23. Nesta nova série de estruturas derivadas do TMQ o número

máximo de variáveis propostas para evitar correlação por coincidência é sete.

Tabela 23. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de atividade contra o Pc

N,A

R,A

1,00

0,36 1,00

N,A

-0,04 0,15 1,00

R,A

0,29 -0,00 -0,19 1,00

R,A

0,43 -0,23 -0,03 0,46 1,00

R,A

-0,11 -0,09 -0,16 -0,28 0,14 1,00

Uma variável que aparece com importância elevada para a atividade contra o

Pc é a carga atômica do nitrogênio 12. Átomo do grupo amina que estabelece

importantes interações com os aminoácidos Glu30 na enzima humana e Glu32 na

enzima do Pc. Segundo a equação 56 quanto mais negativa for a carga desse átomo

maior será sua contribuição para a atividade dos compostos, isto pode ser explicado

pelo fortalecimento da ligação de hidrogênio.

A segunda variável que aparece no modelo é a densidade eletrônica de

fronteira nucleofílica do átomo de nitrogênio 10. Uma diminuição no seu valor leva a

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 106 -

um aumento da atividade, isto esta de acordo com a etapa de protonação do

nitrogênio no mecanismo de conversão do folato a diidrofolato.

Um aumento na superdelocalizabilidade nucleofílica do carbono 4 contribui

positivamente para o aumento da atividade. Do mesmo modo ocorre com a

superdelocalizabilidade radicalar do carbono 3 e do nitrogênio 12. Ao contrário, uma

diminuição na superdelocalizabilidade radicalar do carbono 9 eleva a atividade. O

átomo de carbono 9 corresponde ao sítio de entrada do íon hidreto no folato, e esta

diminuição pode estar relacionada com uma maio facilidade de entrada deste íon.

ii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do Toxoplasma gondii

A previsão do modelo para a atividade contra a enzima do T. gondii

estabelecida através das RML é apresentada na equação 58.

lnIC

Tg = - 170,18 + 0,51

- 330,90 QN

+ 152,46 S

N,A

- 78,93 ρ

LUMO

(58)

A análise da variância para o modelo apresentado acima está desenvolvida na

tabela 24.

Tabela 24. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Tg

Fonte

df SS MS

Regressão

4 77,5090 19,3772 F = 93,8288

Resíduo

22 4,5434 0,2065 R

= 0,9446

Total

26 82,0523 3,1559

O valor de R

é cerca de 94% o que representa um modelo com um ótimo

grau de ajuste. F obtido é cerca de trinta e três vezes maior que o valor tabelado a

95% de confiança (F

4,22

= 2,82), desse modo, o modelo é capaz de explicar a maior

parte da variabilidade dos dados. Na figura 42 podemos observar a capacidade de

previsão dos valores de atividade.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 107 -

Figura 42. Atividades (lnIC

) previstas contra as observadas para o Tg.

O valor do coeficiente de correlação ajustado para este modelo é 0,9346, o

maior coeficiente obtido para os modelos de atividade e seletividade da série

derivada do TMQ. A probabilidade associada ao valor de F é menor que 0,0001, o

que valida o coeficiente de correlação.

A análise qualitativa da falta de ajuste do modelo de regressão é apresentada

na figura 43.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 108 -

Figura 43. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Tg.

A análise visual dos resíduos no gráfico acima revela um padrão estritamente

aleatório para a distribuição dos mesmos, sugerindo que o modelo representado pela

equação 57 não apresenta falta de ajuste e que não devem existir erros sistemáticos

devido à especificação incorreta do mesmo.

Os intervalos de confiança para os coeficientes das variáveis do modelo de

atividade contra o Tg são apresentados na equação 59. Pode-se notar que todos os

coeficientes da regressão são estatisticamente significantes, já que todos os valores a

95% de confiança são maiores que o próprio coeficiente.

lnIC

Tg = - 170,18 (± 12,79) + 0,51 (± 0,18)

- 330,90 (± 17,73) QN

+ 152,46 (± 23,53) S

N,A

+ 78,93 (± 16,25) ρ

LUMO

(59)

O número de quatro variáveis utilizadas no modelo de regressão está abaixo

do limite proposto, para os 37 derivados do TMQ o número máximo de variáveis

utilizadas deve ser sete, com o objetivo de minimizar a ocorrência de correlação

entre as mesmas. Como pode ser observado na tabela 25 nenhuma das variáveis

apresenta correlação apreciável.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 109 -

Tabela 25. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de atividade contra o Tg

N,A

LUMO

1,00

0,08 1,00

N,A

-0,10 0,08 1,00

LUMO

0,14 -0,35 -0,00 1,00

O primeiro descritor do modelo de regressão, índice de conectividade de

valência de segunda ordem, representa o número de vizinhos diretamente ligados a

um dado átomo em duas direções. O aumento de seu valor implica em um aumento

da atividade.

A segunda variável do modelo já foi discutida anteriormente e como foi

sugerido esta deve ter importância fundamental nas interações com os aminoácidos

Glu30 e Glu32. A terceira variável deve exercer praticamente a mesma importância

nestas interações.

A densidade do LUMO do carbono 8, átomo que assume uma posição

equivalente a um carbono do diidrofolato, deve estar relacionada com a etapa de

entrada do íon hidreto na conversão do diidrofolato a tetraidrofolato.

iii) Previsão do modelo para a atividade contra a enzima do fígado de Rato

A última equação estabelecida para a atividade da série derivada do TMQ é

apresentada abaixo, equação 60, onde podemos observar as variáveis que descrevem

a atividade das drogas estudadas contra a enzima do fígado de rato.

lnIC

Rl = - 213,76 + 137,27 QN

- 317,50 QN

+ 73,19 S

N,A

+ 338,17 S

R,A

- 0,55E

Val115Hs (60)

Esta equação foi analisada através da análise da variância da regressão. Os

parâmetros de avaliação do grau de ajuste do modelo são apresentados na tabela 26.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 110 -

Tabela 26. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de atividade contra o Rl

Fonte

df SS MS

Regressão

5 90,7119 18,1424 F = 36,3337

Resíduo

21 10,4858 0,4993 R

= 0,8964

Total

26 101,1977 3,8922

O modelo de regressão apresenta um valor de R

próximo de 90 %, este

parâmetro indica que há um bom ajuste do modelo às respostas observadas. O valor

de F é cerca de 13,6 vezes o tabelado a 95% de confiança (F

5,21

= 2,68). Este modelo

apresenta uma elevada capacidade de previsão e, por isso, é capaz de explicar a

maior parte da variabilidade dos dados, figura 44.

Figura 44. Atividades (lnIC50) previstas contra as observadas para o Rl.

O valor do quadrado do coeficiente de correlação ajustado obtido para este

modelo é

just

= 0,8717 e o da probabilidade associada ao valor de F é p < 0,0001,

demonstrando que o coeficiente de correlação apresenta significância estatística.

A análise do gráfico dos resíduos do modelo de regressão indica que o

modelo não apresenta falta de ajuste devido a sua especificação, figura 45.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 111 -

Figura 45. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a atividade contra o Rl.

A distribuição dos pontos no gráfico dos resíduos assume uma estrutura

aleatória, indicando a inexistência de erros sistemáticos.

A avaliação dos intervalos de confiança demonstrou a significância estatística

dos coeficientes da regressão, equação 61.

lnIC

Rl = - 213,76 (± 32,99) + 137,27 (± 52,88) QN

- 317,50 (± 29,77) QN

+ 73,19 (± 17,78) S

N,A

+ 338,17 (± 77,27) S

R,A

- 0,55 (± 0,19) E

Val115Hs (61)

Um total de oito variáveis foram utilizadas na equação de regressão, número

inferior as sete variáveis sugeridas com o objetivo de minimizar as correlações por

coincidência. Estas variáveis e as correlações existentes entre elas são apresentadas

na tabela 27.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 112 -

Tabela 27. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de atividade contra o Rl

N,A

R,A

Val115Hs

1,00

0,48 1,00

N,A

-0,01 -0,02 1,00

R,A

0,24 0,13 0,01 1,00

Val115Hs

0,04 0,20 0,10 -0,06 1,00

Nenhuma das variáveis utilizadas no modelo apresentou correlação. O

descritor carga atômica do nitrogênio 11 parece ter a mesma importância que a QN

porém, quanto mais negativa for a carga no nitrogênio 12 maior será a atividade, ao

contrário do nitrogênio 11.

A superdelocalizabilidade nucleofílica do carbono 1 pode estar relacionada

com o fortalecimento da interação entre o grupo amina do nitrogênio 12 e o Glu30 na

enzima humana.

Quanto menor for a energia da ligação de hidrogênio entre o grupo amina e o

aminoácido Val115 maior será a elevação da atividade. Está interação é específica

com a enzima humana e deve ser suprimida para que se alcance uma maior

seletividade das drogas frente às enzimas dos parasitos.

iv) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do Pneumocystis

carinii

A equação que tenta descrever a seletividade das drogas derivadas do TMQ

contra a enzima diidrofolato redutase do P. carinii é apresentada na equação 62.

lnSIPc = - 43,89 + 1,41 IP + 157,17 QN

- 141,91 QN

+ 11,81 S

E,A

+ 125,89 ρ

LUMO

- 0,17 E

Glu30Hs (62)

A análise da variância para o modelo apresentado acima está desenvolvida na

tabela 28.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 113 -

Tabela 28. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o Pc

Fonte

df SS MS

Regressão

6 37,5336 6,2556 F = 26,4747

Resíduo

20 4,7257 0,2363 R

= 0,8882

Total

26 42,2594 1,6254

Podemos observar facilmente, através do coeficiente de determinação do

modelo, que o primeiro modelo para seletividade apresenta um considerável grau de

ajuste. O valor de F é 10 vezes maior que o tabelado a 95% de confiança (F

6,20

2,60). Este indica que a maior parte da variabilidade dos dados é explicada como

pode ser observado na figura 46.

Figura 46. Seletividades (lnSI) previstas contra as observadas para o Pc.

O valor de

just

= 0,8546 é comparável com os obtidos para os modelos de

atividade, o que demonstra a boa capacidade de previsão dos modelos de seletividade

para os derivados do TMQ. A probabilidade associada ao valor de F apresenta valor

menor que 0,0001. Através da análise dos resíduos de regressão podemos perceber a

não existência de erros sistemáticos no modelo proposto, figura 47.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 114 -

Figura 47. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o

Pc.

A significância estatística dos coeficientes de regressão avaliada através dos

intervalos de confiança a 95% é apresentada na equação 63.

lnSIPc = - 43,89 (± 13,20) + 1,41 (± 0,60) IP + 157,17 (± 38,39) QN

- 141,91 (± 23,16) QN

+ 11,81 (± 1,99) S

E,A

+ 125,89 (± 25,14) ρ

LUMO

- 0,17 (± 0,08) E

Glu30Hs (63)

Todos os coeficientes são estatisticamente significantes e o número de

variáveis utilizadas no modelo para seletividade corresponde é menor que o sugerido

com intuito de minimizar as correlações por coincidência, entretanto, pode-se

observar na tabela 29 que quatro das variáveis estudadas apresentam correlação

mínima.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 115 -

Tabela 29. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de seletividade contra o

E,A

LUMO

Glu30Hs

1,00

-0,48 1,00

-0,57 0,48 1,00

E,A

0,42 -0,11 -0,23 1,00

LUMO

-0,53 0,26 0,29 -0,23 1,00

Glu30Hs

-0,51 0,46 0,50 -0,19 0,59 1,00

Uma nova variável aparece como descritor importante para a seletividade, a

saber, o potencial de ionização. Este caracteriza a susceptibilidade da molécula a um

ataque eletrofílico. Quanto maior for o valor de IP maior será a seletividade do

composto segundo o modelo de regressão.

Os demais descritores já foram discutidos. É importante ressaltar o papel da

energia das ligações de hidrogênio também nos modelos de seletividade.

v) Previsão do modelo para a seletividade contra a enzima do Toxoplasma gondii

A previsão do modelo que tenta descrever a seletividade da série homóloga

ao TMQ contra a enzima diidrofolato redutase do T. gondii é apresentada na equação

64.

lnSITg = 68,71 - 0,27

- 81,44 QN

+ 255,53 QN

+ 44,63 S

N,A

+ 66,58 S

N,A

- 160,50 S

N,A

– 1294,98 ρ

LUMO

- 0,72 E

Val115Hs (64)

A equação apresentada acima foi avaliada através da análise da variância da

regressão. Os parâmetros da ANOVA para o modelo de seletividade contra o Tg

estão apresentados na tabela 30.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 116 -

Tabela 30. Análise da variância (ANOVA) para o modelo de seletividade contra o Tg

Fonte

df SS MS

Regressão

8 39,7383 4,9673 F = 22,1104

Resíduo

18 4,0438 0,2246 R

= 0,9076

Total

26 43,7821 1,6839

O coeficiente de determinação para este modelo de seletividade é maior que

90% e o valor do teste F é aproximadamente 9 vezes o tabelado a 95% de confiança

8,18

= 2,51). Tais parâmetros sugerem que a maior parte da variabilidade dos dados

é explicada, figura 48.

Figura 48. Seletividades (lnSI) previstas contra as observadas para o Tg.

Como pode ser observado na figura acima o modelo de seletividade para o

Tg, do mesmo modo que o modelo de seletividade para o Pc, apresenta uma

capacidade de previsão dos valores observados comparável com a dos modelos de

atividade. O coeficiente de correlação ajustado é igual a 0,8666 e a probabilidade é

menor que 0,0001. A análise dos resíduos da regressão demonstra uma distribuição

aleatória dos pontos, figura 49.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 117 -

Figura 49. Gráfico dos resíduos do modelo de regressão para a seletividade contra o

Tg.

A estrutura aleatória na distribuição dos pontos do gráfico acima demonstra a

não ocorrência de erros sistemáticos. Tal análise sugere que este modelo de

seletividade, do mesmo modo que contra o Pc, é estatisticamente significante.

Os intervalos de confiança avaliados a 95% para os coeficientes das variáveis

do modelo de regressão sugerem que todos são significativos, equação 65.

lnSITg = 68,71 (± 20,06) - 0,27 (± 0,09)

- 81,44 (± 24,44) QN

+ 255,53 (± 40,29) QN

+ 44,63 (± 6,96) S

N,A

+ 66,58 (± 24,27) S

N,A

- 160,50 (± 30,66) S

N,A

- 1294,98 (± 307,00) ρ

LUMO

- 0,72 (± 0,13) E

Val115Hs (65)

O número de variáveis utilizadas na especificação do modelo é maior do que

o valor máximo para evitar correlação por coincidência, mesmo assim as somente as

variáveis QN

e QN

apresentam correlação significativa, tabela 31.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 118 -

Tabela 31. Matriz de correlação para as variáveis do modelo de seletividade contra o

N,A

LUMO

Val115Hs

1,00

-0,15 1,00

-0,10 0,62 1,00

N,A

-0,15 0,50 0,13 1,00

N,A

-0,26 0,17 0,17 -0,03 1,00

N,A

-0,18 -0,02 0,03 -0,06 0,50 1,00

LUMO

0,11 -0,07 -0,06 -0,11 -0,26 -0,26 1,00

Val115Hs

-0,02 -0,05 0,04 -0,13 0,10 -0,24 0,06 1,00

O índice de conectividade de valência de ordem zero aparece na equação da

regressão como variável importante. Uma diminuição no seu valor leva a um

aumento da atividade. Este índice reflete o número de vizinhos mais próximos,

diretamente ligados a um dado átomo.

Quanto menor for a carga do átomo de nitrogênio 6 maior será a atividade

prevista pelo modelo. Esta carga deve estar associada a protonação do átomo de

nitrogênio no anel pteridínico.

As demais variáveis já foram discutidas e em sua maioria podem ser

associadas ao mecanismo de conversão do folato a diidrofolato e posteriormente a

tetraidrofolato.

Após avaliar os modelos de atividade e seletividade obtidos para a série

derivada do TMQ e verificar a capacidade de previsão dos valores observados,

procedemos a aplicação das equações ao conjunto de drogas reservadas para o teste

dos modelos, e desse modo suas validações. Os erros para as previsões de atividade e

seletividade das drogas do grupo de teste são apresentados na tabela 32.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 119 -

Tabela 32. Erros para as previsões de atividade e seletividade das drogas do grupo de

teste dos derivados do TMQ

Erros para lnIC

(%) Erros para lnSI (%)

Drogas

Pc Tg Rl Pc Tg

3,31 29,13 389,00

87,99 120,10

20,90 29,30 0,08

80,63 156,43

8,98 16,13 41,84

308,91 161,10

22,56 56,65 12,69

116,96 51,95

22,45 3,75 15,05

5,83 103,42

6,41 188,71 21,31

3,24 93,42

26,65 17,70 10,08

3316,44 10,21

43,58 24,29 36,03

442,88 79,20

27,08 25,22 4,64

100,83 72,13

30,43 23,22 26,92

29,14 31,55

23,13 27,37 45,40

322,42 268,22

21,20 17,42 19,10

290,76 493,98

9,28 23,95 24,49

2837,10 123,17

9,67 42,24 0,70

468,22 43,11

21,01 81,66 43,96

286,30 75,04

25,33 58,83 21,95

321,43 56,63

39,97 50,83 46,60

153,78 51,89

35,17 95,89 27,61

158,14 78,44

31,92 48,84 38,85

206,01 34,54

21,55 85,53 29,06

150,74 1875,18

24,27 11,59 30,27

166,21 286,89

32,27 75,18 47,03

164,40 60,43

29,48 63,83 19,62

196,47 51,43

20,14 93,95 11,12

131,46 1112,45

16,68 61,18 3,77

171,08 71,37

28,20 29,24 28,73

175,63 156,42

4,95 9,05 26,28

239,30 405,09

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 120 -

Erros para as previsões de atividade e seletividade das drogas do grupo

de teste dos derivados do TMQ

41,50 4,34 27,93

143,27 217,60

19,41 55,90 73,56

478,44 796,68

32,31 1,63 4,43

28,30 48,92

37,98 33,52 77,82

17,61 627,58

52,86 90,46 60,28

259,52 216,60

28,89 43,89 100,46

53,50 985,47

13,29 4,69 36,72

153,31 797,85

46,03 51,13 77,51

77,23 211,70

40,19 62,56 63,80

90,96 146,75

17,88 69,03 53,00

22,26 983,07

31,06 61,23 83,15

297,91 1034,90

51,04 22,06 1,91

403,88 236,73

31,04 133,47 66,59

146,33 6894,46

29,27 52,45 81,20

447,08 206,11

43,03 68,39 97,43

151,46 2856,54

74,84 65,17 181,90

601,82 731,33

37,66 63,84 80,23

2,23 4183,52

13,93 67,86 32,60

87,38 196,88

8,74 63,49 46,62

213,00 2048,17

Em azul mais escuro são apresentados os erros que ficaram na faixa de 0,00 a

30,00 %, sendo considerados como pequenos. Os valores em azul claro representam

os erros na faixa de 30,01 a 50,00 % considerados como erros medianos. Os demais

valores representam erros superiores a 50,01% e, desse modo, são indicativos de

previsões mal sucedidas.

Podemos perceber que para a série derivada do TMQ os modelos de atividade

são validados pelo conjunto testes, ao contrário dos modelos de seletividade. Estes

últimos, apesar de apresentarem parâmetros estatísticos de determinação do grau de

ajuste melhores do que os modelos de seletividade da série do TMP, não

apresentaram uma previsão do grupo teste tão boa.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 121 -

Dentre os modelos obtidos o melhor foi sem dúvida aquele que descreve a

atividade das drogas derivadas do TMQ na inibição da enzima do Pneumocystis

carinii.

4.4. Estruturas das novas drogas propostas

A proposição de novas estruturas foi feita com base na análise da superfície

da cavidade do sítio ativo da enzima DHFR do Pneumocystis carinii, com o objetivo

de formular drogas mais potentes e seletivas. Foram imaginadas substituições

moleculares nos compostos base, de forma que as interações com os resíduos de

aminoácidos fossem maximizadas. A análise das cavidades e as regiões de possíveis

interações são apresentadas na figura 50.

Figura 50. Sugestões de locais para modificações estruturais, grupos destacados, dos

compostos base TMP (a) e TMQ (b).

As modificações sugeridas para o TMP foram baseadas nas regiões dos

grupos indicados como segue: R

(região azul) grupos doadores de hidrogênio como

–NH

; R

(região amarela) grupos hidrofóbicos como –CH

; R

(região azul e

vermelha) grupos doadores e/ou aceitadores de hidrogênio como –COOH, –CONH

ou –COCH

; R

(região vermelha) grupos aceitadores de hidrogênio como –COOH

e; R

(região amarela e vermelha) grupos hidrofóbicos ou aceitadores de hidrogênio

como –CH

ou –COOH.

(a)

(b)

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 122 -

Da mesma forma foram imaginadas as substituições no TMQ: R

(região

azul) átomo de nitrogênio no anel aromático; R

(região predominantemente azul)

átomo de nitrogênio no anel aromático ou grupo –NH

; R

(região

predominantemente azul e vermelha) grupos –OH, –NH

, –COOH, –CONH

ou –

COCH

, e; R

(região amarela) grupo –CH

Após a construção, modelagem e cálculo dos descritores realizamos a

previsão dos valores de IC

(atividade) e SI (seletividade) das novas drogas, com

base nas equações de QSAR estabelecidas. Num total foram propostas 112 novas

estruturas derivadas do TMP (mlp

-mlp

112

) e, 160 novas estruturas derivadas do

TMQ (mlq

-mlq

160

). Na tabela 33 são apresentados os grupos substituintes e os

valores de atividade e seletividade para as melhores propostas baseadas no TMP e

TMQ. Os valores de todas as demais previsões são apresentados nas tabelas do

apêndice.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 123 -

Tabela 33. Atividades e seletividades previstas para as melhores estruturas propostas derivadas do TMP e TMQ

(µM) SI

Drogas R

Pc Tg Ma

Pc Tg

mlp

H CH

CONH

H H H

5,8207 0,0002 ?

9,3590 14,1082

mlp

H H H H COOH H

? 0,0002 ?

? 13,4970

mlp

H CH

CONH

H COOH H

2,1120 0,0001 ?

42,7180 13,9057

mlp

H CH

COCH

H COOH H

5,4051 0,0002 ?

9,1886 19,0827

mlp

H CONH

H H CH

0,0596 ? 0,0016

12,2919 ?

mlp

H CH

CONH

H COOH CH

1,4992 0,0007 ?

6,8099 17,3170

mlp

H CONH

H COOH CH

0,0203 ? 0,0002

10,7970 ?

mlp

H H H CONH

H H

4,5442 0,0001 ?

36,7500 10,0144

mlp

H CONH

COOH H

0,0710 ? 0,0014

14,5602 ?

mlq

N N NH

COCH3 H H H

1,7787 3,2650

0,3104 16,4929

mlq

N -C-NH2 NH

H H H H

0,3803 1,9866

? 11,5451

mlq

N -C-NH2 CONH

COOH H H H

0,0603 ?

? 4,7514

mlq

N -C-NH2 CONH

COCH3 H H H

0,0731 ?

? ?

mlq

112

N -C-NH2 CONH

COCH3 H H CH3

0,0412 7,2724

? 2,2054

mlq

140

N -C-NH2 CONH

H H COOH H

0,0763 9,0232

? 1,6148

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 124 -

Os valores previstos representados por (?) são aqueles que apresentaram

resultados superestimados, que muito provavelmente ocorreram devido à

incapacidade dos modelos em prever as atividades destas moléculas propostas. A

estrutura mlp

, em azul, aparece como a melhor proposta de inibidor da enzima do

P. carinii, figura 51.

Figura 51. Modelo da estrutura do mlp

após a otimização de sua geometria.

Tal estrutura apresenta um valor de IC

para o Pneumocystis carinii menor

do que os valores do PTX (IC

= 0,031 µM) e do TMQ (IC

= 0,042 µM) que são

inibidores muito potentes da DHFR, este valor indica que a droga proposta, mlp

, é

mais potente que o PTX e o TMQ. O valor do índice de seletividade do mlp

para o

Pc é muito próximo do valor da trimetoprima (SI = 14,000) que é um inibidor

seletivo da DHFR do parasito. Estes resultados sugerem que a droga proposta

apresenta uma alta atividade e seletividade para a DHFR do P. carinii, surgindo

como um promissor inibidor desta enzima. Obviamente é necessário verificar a

possibilidade de síntese deste composto e avaliar sua atividade biológica

experimentalmente, para que se possam comprovar nossas previsões.

Com o intuito de avaliar as possíveis interações que proporcionam elevada

atividade e seletividade contra o P. carinii, a estrutura da mlp

foi colocada na

cavidade do sítio da DHFR do Pc. Este complexo de inclusão foi otimizado através

de cálculos de mecânica molecular MM3 e, a superfície da cavidade do sítio ativo foi

construída, figura 52.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 125 -

Figura 52. Cavidade do sítio ativo da DHFR do Pc complexada com o mlp

sob dois

ângulos de visualização.

Pela simples observação da cavidade representada na figura 52 é fácil

perceber que as modificações sugeridas na estrutura base do TMP levam a uma

maximização das interações e, a um melhor encaixe da droga no sítio ativo da

enzima, com a acomodação dos grupos hidrofóbicos na região amarela, dos grupos

ácidos nas regiões vermelhas e dos grupos básicos nas regiões azuis.

A conformação assumida pela mlp

favorece ainda o estabelecimento de

ligações de hidrogênio especificas para este composto, o que pode contribuir para um

aumento da atividade e seletividade. Todas as interações com os resíduos de

aminoácidos e moléculas de água conservadas são apresentadas na figura 53.

Figura 53. Ligações de hidrogênio estabelecidas entre a mlp

e os resíduos de

aminoácidos e moléculas de água do sítio ativo da DHFR do Pc.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 126 -

Como pode ser observado na figura acima, além das interações que já eram

formadas pela trimetoprima, três novas ligações de hidrogênio foram estabelecidas

com moléculas de água conservadas no sítio ativo da enzima. Estas interações podem

ser responsáveis pela maior atividade e seletividade prevista nos modelos de

regressão.

4.5. Estudos teóricos do mecanismo da reação enzimática

Após realizar a modelagem, otimização do folato dentro da cavidade do sítio

ativo da DHFR humana e, cálculo dos orbitais de fronteria do sistema proteíco livre

em fase gasosa, observamos que os orbitais não se localizavam nos resíduos de

aminoácidos do sítio ativo, figura 54.

Figura 54. Localização dos orbitais de fronteira (HOMO-10 até LUMO+9) do

complexo proteico formado pela DHFR do Hs, NADPH e folato. Os lóbulos

representados em amarelo e vermelho correspondem aos LUMOs e os lóbulos em

azul e ver aos HOMOs.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 127 -

É fácil de perceber que os orbitais de fronteira calculados localizam-se nos

resíduos de aminoácidos da superfície da proteína, isto pode ser explicado pela

natureza ionizada da maior parte destes resíduos. Entretanto, devido a natureza

dielétrica da água, quando o efeito do sovente é considerado, ocorre uma modifiação

no campo elétrico desses resíduos da superfície neutralizando-os.

O efeitro de solvatação foi avaliado a partir dos cálculos do complexo

enzimático formado entre o folato, o cofator NADPH e a DHFR humana

considerando a água como solvente (constante dielétrica 78,4) através do modelo

COSMO. Pudemos perceber que a maior parte dos orbitais de fronteira HOMO e

LUMO localizam-se nos resíduos de aminoácidos que compoem o sítio ativo da

enzima.

Figura 55. Localização dos orbitais de fronteira (HOMO-10 até LUMO+9) nos

resíduos de aminoácidos do sítio ativo da DHFR do Hs.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 128 -

Para avaliar o mecanismo da reação enzimática do folato a diidrofolato e

posteriormente a tetraidrofolato realizamos cálculos dos orbitais moleculares do

complexo proteico considerando sua solvatação. A análise das etapas do mecanismo

de conversão do folato a diidrofolato foi realizada inicialmente através dos cálculos

do sistema sem considerar a protonação dos nitrogênios do folato, figura 56.

Figura 56. Estrutura do folato e átomos de nitrogênio que correspondem aos sítios de

protonação no mecanismo da reação.

Pudemos observar que a protonação é uma etapa fundamental no mecanismo

de reação enzimática, pois, quando o cálculo foi realizado desconsiderando a

protonação dos nitrogênios do folato não houve localização de orbitais moleculares

de fronteira em nenhum dos átomos do folato, estes aparcem apenas nos resíduos de

aminoácidos do sítio ativo e no cofator enzimático NADPH, figura 57.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 129 -

Figura 57. Localização dos orbitais de fronteira para o sistema proteico sem

considerar a protonação do folato.

Após protonar um dos nitrogênios do folato, algo possível de ocorrer dentro

da enzima através da interação com algum resíduo de aminoácido ácido ou até

mesmo com alguma molécula de água, como sugerido na literatura para a DHFR da

Escherichia coli [39] e como pode ser observado na figura 13, realizamos um novo

cálculo dos orbitais de fronteira e verificamos que estes são localizados em posições

estratégicas para a segunda etapa da conversão do folato a diidrofolato, a

transferência do íon hidreto do NADPH para o folato, figura 58.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 130 -

Figura 58. HOMO-2 e LUMO+6 localizados em posições estratégicas para a

transferência do íon hidreto do NADPH para o folato.

Podemos observar na figura acima que o HOMO-2 está localizado no anel do

NADPH que sofre oxidação, isto sugere que este grupo deve ser um bom reagente

nucleofílico, capaz de doar o íon hidreto, o que está de acordo com o mecanismo

proposto para a reação estudada, na qual o NADPH é oxidado à NADP

. O

LUMO+6 localiza-se principalmente no átomo de carbono onde ocorre a entrada do

íon hidreto na conversão do folato a diidrofolato, o que o caracteriza como um bom

reagente eletrofílico.

No processo de conversão do diidrofolato a tetraidrofolato também avaliamos

as etapas de protonação e transferência do íon hidreto do mecanismo enzimático

através da localização dos orbitais de fronteira. Foi possível verificar novamente que

sem a protonação do segundo átomo de nitrogênio do folato não ocorre a localização

dos orbitais. Após protoná-lo observamos a localização do HOMO-1 no anel do

NADPH e do LUMO no diidrofolato, figura 59.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

- 131 -

Figura 59. HOMO-1 e LUMO localizados em posições estratégicas para a

transferência do íon hidreto do NADPH para o diidrofolato.

Podemos observar na figura acima que o HOMO-1 está localizado no anel do

NADPH que sofre oxidação durante a transferência do hidreto para o diidrofolato,

caracterizando-o como um bom reagente nucleofílico. O LUMO esta localizado

principalmente no átomo de carbono onde ocorre a entrada do íon hidreto na

conversão do diidrofolato a tetraidrofolato, o que o caracteriza como um bom

reagente eletrofílico.

Estes estudos do mecanismo enzimático através da localização dos orbitais de

fronteira sugerem que a etapa de protonação é fundamental para a transferência do

hidreto. Uma análise mais aprofundada das etapas da reação pode ser realizada

através de índices de reatividade descritos na teoria dos orbitais de fronteira,

chamdos índices de Fukui.

CONCLUSÕES

- 132 -

Capítulo 5

Conclusões

Todas as estruturas das drogas foram modeladas satisfatoriamente inclusive

as estruturas das enzimas diidrofolato redutase do Pneumocystis carinii e

humana;

Os resíduos de aminoácidos dos sítios ativos das enzimas estudadas foram

determinados através da análise dos vizinhos dos substratos complexados;

As seqüências de aminoácidos das duas enzimas estudadas foram alinhadas e

através dessa análise foi possível perceber que os resíduos Ile123 na DHFR

do Pc e Val115 na DHFR do Hs devem contribuir para um aumento da

seletividade das drogas estudadas;

As interações estabelecidas entre as drogas estudadas e os resíduos de

aminoácidos, após sua inclusão, foram analisadas através dos mapas das

superfícies das cavidades dos sítios ativos das enzimas;

Pudemos identificar as principais ligações de hidrogênio formadas entre as

drogas e o receptor enzimático, na enzima do Pc os principais grupos que

estabelecem ligações de hidrogênio são a Ile10, Ile123, Glu32, W520 e W525,

na enzima humana são Ile7, Val115, Glu30 e W190;

CONCLUSÕES

- 133 -

As energias das ligações de hidrogênio calculadas foram utilizadas como

descritores moleculares e, através dos modelos de regressão, foi possível

perceber que estas variáveis são importantes na previsão da atividade e

seletividade dos conjuntos de drogas estudadas;

Dentre todos os descritores clássicos calculados aquele que aparece com

maior freqüência em nossas equações é o coeficiente de partição octanol-

água, demonstrando que as características de permeabilidade são importantes,

os descritores de conectividade e topológicos também demonstraram

relevância como variáveis;

Vários descritores quânticos foram utilizados como variáveis nas equações de

QSAR, entre estes, as densidades dos orbitais HOMO e LUMO, as

superdelocalizabilidades e o momento de dipolo apresentaram maior

ocorrência. As propriedades atômicas associadas às características do

mecanismo de reação enzimática encontraram boa aplicação nos modelos

obtidos;

Todos os modelos de QSAR estabelecidos apresentaram significância

estatística o que pode ser observado através da análise de sua variância. Os

modelos de atividade para o conjunto de drogas derivadas do TMP

demonstraram melhor grau de ajuste que os de seletividade. Para as drogas

derivadas do TMQ todos os modelos de atividade e de seletividade

apresentaram elevada grau de ajuste;

A melhor previsão de modelo para o conjunto de drogas derivadas do TMP

foi o que tenta descrever a atividade dos compostos na inibição da enzima

DHFR do Mycobacterium avium. O melhor modelo proposto para a série

homóloga ao TMQ foi o da atividade contra a DHFR do Toxoplasma gondii;

Através da avaliação da capacidade de previsão para o grupo teste foi

possível perceber que ao contrário do esperado, as previsões foram melhores

sucedidas para os modelos de seletividade das drogas derivadas do TMP.

CONCLUSÕES

- 134 -

Para as drogas derivadas do TMQ os menores erros na previsão ocorreram

para os modelos de atividade, destacando-se o modelo para a atividade contra

o Pc;

Nossas propostas de estruturas potencialmente mais ativas e/ou seletivas,

baseadas em modificações estruturais com o objetivo de maximizar as

interações entre as drogas e o os aminoácidos da enzima do P. carinii,

apresentaram nove candidatos em potencial derivados do TMP (mlp

, mlp

mlp

, mlp

e mlp

), sendo o mlp

uma proposta

de inibidor mais ativo e seletivo contra o Pc. Um total de seis potenciais

candidatos foi obtido para os derivados do TMQ.

Os estudos teóricos do mecanismo da reação enzimática de conversão do

folato a diidrofolato e posteriormente a tetraidrofolato demonstraram a

importância da primeira etapa, protonação dos nitrogênios, para que a

segunda etapa possa ocorrer, transferência do íon hidreto do cofator NADPH

para o folato e diidrofolato. Pudemos ainda comprovar o efeito da solvatação

na localização dos orbitais de fronteira do sistema enzimático, como já havia

sido sugerido na literatura.

PERSPECTIVAS FUTURAS

- 135 -

Capítulo 6

Perspectivas Futuras

Proceder a avaliação do grau de previsibilidade dos modelos obtidos através

da validação cruzada (cross validation);

Ampliar os estudos do mecanismo de reação enzimática pela análise dos

índices de reatividade derivados da teoria dos orbitais de fronteira, índices de

Fukui;

Aprofundar os estudos das ligações de hidrogênio através de cálculos ab

initio;

Redigir pelo menos três artigos, sendo um deles baseados nos estudos de

QSAR para a série homóloga ao TMP, outro baseado na série de homólogos

ao TMQ e um terceiro sobre os estudos de modelagem molecular, docking

dos ligantes e mecanismo de reação da enzima diidrofolato redutase. E

submete-los a publicação em periódicos indexados.

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APÊNDICE

- 151 -

APÊNDICE

Valores de atividade de seletividade previstos para o Pneumocystis

carinii, Toxoplasma gondii, Mycobacterium avium e fígado de rato.

APÊNDICE

- 152 -

Tabela 01. Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMP

(µM) SI

Drogas R

Pc Tg Ma Rl

Pc Tg Ma

mlp1 H H H H H H

1,6176E+02 2,6044E-55 7,4001E+04 6,9252E-04

7,8769E+01 6,3256E+37 4,8218E+02

mlp2 H H COOH H H H

1,5919E+00 5,8723E-04 4,5951E+03 2,2452E+04

1,0651E+02 2,6303E+00 1,5980E+04

mlp3 H H CONH

H H H

5,3075E+00 5,4406E-04 6,9988E+03 8,0785E-04

6,6153E+01 5,7662E-01 8,1527E+04

mlp4 H H COCH

H H H

1,9010E+01 1,9268E-03 9,3603E+03 4,9873E-04

4,2265E+01 2,8740E-01 1,1692E+05

mlp5 H CH

H H H H

1,7385E+02 3,8149E-53 2,8221E+05 1,0245E-03

4,5074E+01 5,1363E+35 3,1522E+04

mlp6 H CH

COOH H H H

7,3617E+00 7,4700E-03 3,2311E+04 6,9608E+04

1,5842E+01 8,7989E+00 1,7000E+05

mlp7 H CH

CONH

H H H

5,8207E+00 2,2948E-04 3,4213E+04 5,3884E-05

9,3590E+00 1,4108E+01 3,8826E+04

mlp8 H CH

COCH

H H H

1,0180E+00 1,1247E-02 4,8931E+04 2,4383E+04

8,5776E+00 6,2901E+00 3,4416E+04

mlp9 NH

H H H H H

2,9124E+00 5,6899E-20 1,4389E-02 3,3715E-05

1,0780E+01 8,6808E+20 1,2604E+03

mlp10 NH

H COOH H H H

7,7404E+00 4,8430E-13 6,7555E-04 9,8463E-05

4,3158E+01 3,5069E+14 6,0472E+04

mlp11 NH

H CONH

H H H

4,2741E-01 6,0320E-13 1,2935E-03 2,2878E-05

1,5063E+01 4,0997E+14 6,1397E+03

mlp12 NH

H COCH

H H H

1,5094E+00 3,8268E-13 1,4274E-03 4,5589E-05

1,7254E+01 1,0068E+15 1,3108E+04

mlp13 NH

H H H H

8,1379E+00 3,4092E-16 6,4049E-02 1,1600E-05

1,1157E+01 7,0703E+18 3,3106E+02

mlp14 NH

COOH H H H

8,8325E+00 7,7020E-13 6,6516E-03 3,4629E-06

7,2588E+00 7,6395E+14 7,3008E+02

mlp15 NH

CONH

H H H

6,1425E-01 1,3167E-12 3,0923E-02 3,7600E-06

3,1563E+00 1,0562E+14 1,1558E+01

mlp16 NH

COCH

H H H

8,9893E-01 2,1266E-12 2,0859E-02 9,6223E-06

5,0366E+00 1,5092E+14 4,3308E+01

mlp17 H H H H COOH H

1,2437E+02 2,3383E-04 2,2863E+03 4,6188E-04

1,0694E+02 1,3497E+01 2,4864E+06

APÊNDICE

- 153 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMP

mlp18 H H COOH H COOH H

8,0753E+01 4,1452E-05 2,2542E+02 2,4346E-04

1,1264E+02 2,4033E+00 1,0340E+07

mlp19 H H CONH

H COOH H

8,2735E-01 4,5801E-05 3,7276E+02 4,6246E-04

1,1984E+02 3,5917E-01 1,8921E+06

mlp20 H H COCH

H COOH H

6,4480E+00 8,8974E-05 8,4293E+02 7,0846E-04

4,4339E+01 4,8042E-01 2,4328E+06

mlp21 H CH

H H COOH H

3,5092E+02 2,4192E-03 1,4772E+04 2,8645E-03

3,4317E+01 1,6919E+01 1,3544E+06

mlp22 H CH

COOH H COOH H

4,8491E+01 1,3791E-04 8,0657E+02 2,7836E-04

3,7502E+01 1,4163E+00 1,7376E+06

mlp23 H CH

CONH

H COOH H

2,1120E+00 9,2643E-05 6,1844E+02 4,5754E-05

4,2718E+01 1,3906E+01 2,6181E+06

mlp24 H CH

COCH

H COOH H

5,4051E+00 2,2489E-04 8,5555E+02 6,5184E-05

9,1886E+00 1,9083E+01 4,7712E+06

mlp25 NH

H H H COOH H

1,7605E+00 7,7256E-13 2,0322E-03 5,0403E-05

3,4280E+01 4,2308E+15 1,2400E+04

mlp26 NH

H COOH H COOH H

9,6363E-01 1,6533E-14 5,5879E-05 1,5105E-05

7,9822E+01 1,7819E+15 1,5202E+05

mlp27 NH

H CONH

H COOH H

3,0508E-02 3,3798E-14 9,8744E-05 1,3829E-05

3,9102E+01 8,8782E+14 1,2661E+04

mlp28 NH

H COCH

H COOH H

8,5537E-02 2,8339E-14 1,1594E-04 1,3237E-05

3,2088E+01 1,0955E+15 1,1451E+04

mlp29 NH

H H COOH H

3,0900E+00 1,0916E-12 6,1484E-03 1,2468E-05

2,0713E+01 1,2410E+16 1,0678E+03

mlp30 NH

COOH H COOH H

2,3002E+00 1,8015E-13 2,0879E-03 1,3319E-06

1,0410E+01 1,0942E+16 2,0880E+03

mlp31 NH

CONH

H COOH H

1,6033E-01 3,7850E-14 3,2029E-04 9,3453E-08

1,0792E+01 5,2590E+16 9,6597E+03

mlp32 NH

COCH

H COOH H

7,0625E-01 8,6633E-14 1,9465E-03 6,2193E-06

5,1590E+00 3,1992E+15 2,0290E+02

mlp33 H H H H H CH

2,4935E+00 9,1917E-52 1,2380E+05 2,9401E+04

2,3671E+01 2,2461E+34 4,3179E+02

mlp34 H H COOH H H CH

2,1577E+00 1,8098E-03 1,2846E+04 9,2309E+04

3,4455E+01 2,7762E+00 1,3128E+04

mlp35 H H CONH

H H CH

5,5897E+00 2,7188E-03 1,4001E+04 8,1512E-04

3,9741E+01 2,9384E+01 1,7369E+03

mlp36 H H COCH

H H CH

6,1770E+01 5,9419E-03 3,2126E+04 3,4037E-03

1,3590E+01 5,1936E+00 1,5314E+03

APÊNDICE

- 154 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMP

mlp37 H CH

H H H CH

1,5248E+03 6,3755E-57 5,8389E+05 5,0424E-03

1,0750E+01 5,0548E+39 6,3809E+02

mlp38 H CH

COOH H H CH

2,7995E+00 1,6271E-02 9,5133E+04 6,9522E+04

6,9540E+00 5,0679E-01 3,5355E+03

mlp39 H CH

CONH

H H CH

4,6596E-02 7,8660E-03 3,5016E+04 3,3335E+03

7,7760E+00 3,2878E+01 2,1493E+04

mlp40 H CH

COCH

H H CH

9,5750E-01 1,1063E-01 4,3564E+05 4,4183E+05

2,7169E+00 4,8163E-01 4,7177E+03

mlp41 NH

H H H H CH

1,0651E+01 1,4376E-19 2,4312E-02 3,5001E-05

3,3274E+00 3,9873E+20 1,5211E+03

mlp42 NH

H COOH H H CH

1,7478E+01 2,7811E-12 3,2190E-03 3,6065E-04

1,0748E+01 1,1507E+14 3,0146E+04

mlp43 NH

H CONH

H H CH

5,9551E-02 1,5265E-12 1,5975E-03 1,4204E-05

1,2292E+01 9,4653E+14 2,8868E+03

mlp44 NH

H COCH

H H CH

3,4084E+00 1,2156E-12 2,5384E-03 7,6821E-05

7,5665E+00 4,0977E+14 5,4127E+03

mlp45 NH

H H H CH

1,0327E+01 8,5516E-24 1,1778E-01 1,7661E-05

2,8779E+00 1,2431E+24 1,1737E+02

mlp46 NH

COOH H H CH

1,9117E+01 1,1392E-12 9,2653E-03 7,0256E-06

3,1816E+00 6,1455E+14 5,4939E+02

mlp47 NH

CONH

H H CH

1,2521E+00 5,7256E-12 6,0113E-02 1,2200E-05

1,3938E+00 1,7610E+13 1,9722E+01

mlp48 NH

COCH

H H CH

1,9234E+00 1,3805E-11 1,2602E-01 5,1074E-06

1,2663E+00 8,7657E+13 1,2830E+01

mlp49 H H H H COOH CH

4,5382E+02 5,7143E-04 3,8352E+03 6,8387E-04

2,0276E+01 1,2874E+01 1,8422E+06

mlp50 H H COOH H COOH CH

7,8433E+01 5,2321E-05 4,3810E+02 2,4950E-04

6,6170E+01 1,3559E+00 2,5451E+06

mlp51 H H CONH

H COOH CH

1,3407E+00 9,2467E-05 9,1570E+02 2,3339E-04

2,3549E+01 7,0482E-01 2,6039E+05

mlp52 H H COCH

H COOH CH

1,0890E+01 1,8618E-04 1,5133E+03 5,5507E-04

1,5319E+01 4,5868E-01 4,7338E+05

mlp53 H CH

H H COOH CH

1,8100E+02 2,3852E-03 2,1228E+04 2,0841E-03

1,6563E+01 8,1759E+00 5,1510E+05

mlp54 H CH

COOH H COOH CH

9,1258E+01 3,1997E-04 1,9346E+03 9,7929E-04

5,9904E+00 2,7013E+00 7,5083E+05

mlp55 H CH

CONH

H COOH CH

1,4992E+00 6,7565E-04 4,0657E+03 3,5629E-05

6,8099E+00 1,7317E+01 2,6516E+05

APÊNDICE

- 155 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMP

mlp56 H CH

COCH

H COOH CH

8,4549E+00 1,0522E-03 3,9014E+03 1,1132E-04

5,7672E+00 4,2896E+00 6,6033E+05

mlp57 NH

H H H COOH CH

7,2079E+00 1,9400E-12 2,4280E-03 9,9372E-05

5,1614E+00 1,2792E+15 1,7771E+04

mlp58 NH

H COOH H COOH CH

2,2700E+00 9,4706E-14 1,2638E-04 5,5163E-05

9,3049E+00 5,2019E+14 3,0191E+05

mlp59 NH

H CONH

H COOH CH

2,0342E-02 1,3195E-13 2,4894E-04 3,5755E-06

1,0797E+01 9,7515E+14 3,4710E+04

mlp60 NH

H COCH

H COOH CH

1,8579E-01 1,1885E-13 4,3350E-04 2,4709E-05

3,7182E+00 2,1826E+14 3,8605E+04

mlp61 NH

H H COOH CH

3,6447E+00 1,2706E-12 9,0915E-03 6,1999E-06

4,4322E+00 6,3426E+15 1,3276E+03

mlp62 NH

COOH H COOH CH

1,2159E+01 4,8353E-13 3,7385E-03 4,8056E-06

3,9457E+00 1,2652E+16 4,8311E+03

mlp63 NH

CONH

H COOH CH

7,6271E-02 1,4944E-13 7,7238E-04 1,7631E-07

4,1689E+00 3,5340E+15 2,4118E+03

mlp64 NH

COCH

H COOH CH

8,0903E-01 3,1997E-13 6,1050E-03 1,9380E-06

1,1483E+00 1,5077E+15 2,9230E+02

mlp65 H H H COOH H H

2,0169E+02 5,4967E-04 2,2661E+03 2,3818E-03

1,0689E+02 5,1642E+00 1,1974E+04

mlp66 H H H CONH

H H

4,5442E+00 1,3926E-04 1,7486E+03 9,0498E-05

3,6750E+01 1,0014E+01 5,8081E+05

mlp67 H H H COCH

H H

1,8678E+01 3,4741E-04 2,8569E+03 3,2247E-04

7,5211E+01 5,9414E+00 6,3172E+05

mlp68 H CH

H COOH H H

1,4891E+02 1,1399E-03 7,6706E+03 1,4824E-03

2,4573E+01 6,6106E-01 3,1321E+05

mlp69 H CH

H CONH

H H

3,6532E+00 1,2189E-03 1,0228E+04 7,4492E-05

2,0663E+01 2,0996E+00 2,0979E+05

mlp70 H CH

H COCH

H H

5,2121E+01 2,2243E-03 1,0349E+04 6,8084E-04

1,7135E+01 1,0006E+00 4,0749E+05

mlp71 NH

H H COOH H H

7,9695E+00 2,4889E-13 4,4935E-04 1,1776E-04

2,4942E+01 6,9766E+14 1,5575E+05

mlp72 NH

H H CONH

H H

3,4342E-01 2,7809E-13 1,0165E-03 2,6867E-05

1,5146E+01 8,1963E+14 5,4833E+03

mlp73 NH

H H COCH

H H

1,2344E+00 5,9313E-13 8,8614E-04 8,6311E-05

1,7498E+01 9,7987E+14 1,3070E+04

mlp74 NH

H COOH H H

6,9823E+00 2,2767E-13 2,4555E-03 9,2573E-06

1,1863E+01 6,6280E+15 5,8919E+03

APÊNDICE

- 156 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMP

mlp75 NH

H CONH

H H

5,1379E-01 1,2920E-12 1,1641E-02 5,7604E-06

9,3270E+00 5,3682E+14 1,7529E+02

mlp76 NH

H COCH

H H

1,9472E+00 9,1846E-13 5,7683E-03 5,3024E-06

6,1314E+00 3,4553E+15 1,0043E+03

mlp77 H H H COOH COOH H

3,5159E+01 9,6862E-05 3,4462E+02 2,9649E-03

1,1761E+02 3,5633E+00 1,0687E+05

mlp78 H H H CONH

COOH H

1,9029E+00 1,4070E-05 1,2194E+02 5,3982E-05

5,2328E+01 6,8833E+00 2,8238E+06

mlp79 H H H COCH

COOH H

6,3831E+00 1,5584E-04 4,8173E+02 6,1437E-04

2,6422E+01 8,8096E+00 3,0941E+04

mlp80 H CH

H COOH COOH H

2,6035E+01 1,6160E-04 7,0598E+02 1,7200E-03

3,9394E+01 1,9713E+00 3,0430E+06

mlp81 H CH

H CONH

COOH H

1,4872E+00 7,1726E-05 3,8433E+02 1,5537E-04

3,0132E+01 2,2635E+00 1,4205E+06

mlp82 H CH

H COCH

COOH H

4,4989E+00 3,4162E-04 1,8269E+03 3,2636E-04

1,5733E+01 5,3328E+00 1,4078E+06

mlp83 NH

H H COOH COOH H

9,9610E-01 5,8307E-14 9,2061E-05 9,6111E-05

1,6643E+01 1,2003E+15 1,5777E+05

mlp84 NH

H H CONH

COOH H

3,6653E-02 2,7835E-14 6,2344E-05 2,9120E-06

1,7646E+01 3,5163E+15 4,3531E+04

mlp85 NH

H H COCH

COOH H

1,1280E-01 5,4534E-14 1,3465E-04 2,6727E-06

1,9764E+01 3,6161E+15 1,3337E+04

mlp86 NH

H COOH COOH H

8,1574E-01 1,5127E-13 8,8482E-04 2,0981E-05

1,7463E+01 1,4321E+15 3,7389E+03

mlp87 NH

H CONH

COOH H

7,1047E-02 4,2882E-13 1,4133E-03 4,9731E-07

1,4560E+01 5,8366E+15 4,8807E+03

mlp88 NH

H COCH

COOH H

2,4306E-01 1,2248E-13 1,8974E-03 1,0106E-06

9,5285E+00 3,2113E+16 1,8625E+03

mlp89 H H H COOH H CH

3,7031E+02 5,3910E-03 1,5878E+04 3,0164E-03

3,4249E+01 2,8377E+00 8,2812E+03

mlp90 H H H CONH

H CH

8,8279E+00 5,4748E-04 5,5106E+03 1,2899E-04

3,5808E+01 6,0846E+00 3,5339E+05

mlp91 H H H COCH

H CH

7,4364E-01 4,7723E-03 2,3805E+04 5,3978E+04

1,7517E+01 3,1404E+00 1,0451E+05

mlp92 H CH

H COOH H CH

2,6862E+02 4,5206E-03 2,3673E+04 3,4025E-03

1,4517E+01 5,3312E-01 2,0820E+05

mlp93 H CH

H CONH

H CH

1,1728E+01 3,3981E-03 1,6789E+04 1,8482E-04

8,7892E+00 1,4308E+00 1,5323E+05

APÊNDICE

- 157 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMP

mlp94 H CH

H COCH

H CH

4,0408E+01 1,0525E-02 4,2946E+04 5,4379E-04

1,0195E+01 3,5975E-01 4,6199E+04

mlp95 NH

H H COOH H CH

1,7743E+01 4,1658E-13 7,5530E-04 1,5587E-04

1,0775E+01 5,2476E+14 5,8280E+04

mlp96 NH

H H CONH

H CH

1,5920E-01 3,2023E-13 5,8178E-04 8,5544E-05

5,0890E+00 6,4240E+14 1,9314E+04

mlp97 NH

H H COCH

H CH

2,9182E+00 1,1336E-12 3,0523E-03 7,1499E-05

7,6311E+00 6,8205E+14 3,4819E+03

mlp98 NH

H COOH H CH

1,7404E+01 2,4958E-12 9,9616E-03 4,1300E-05

5,1512E+00 1,4001E+15 3,5895E+03

mlp99 NH

H CONH

H CH

6,1246E-01 6,5796E-12 2,9993E-02 1,9610E-06

2,3324E+00 2,4449E+14 1,5255E+02

mlp100 NH

H COCH

H CH

4,9748E+00 2,5424E-12 2,5469E-02 7,8992E-06

1,5417E+00 1,8320E+15 6,3187E+02

mlp101 H H H COOH COOH CH

6,5545E+01 4,1837E-04 2,9070E+03 1,7463E-03

2,3553E+01 2,4612E+00 1,2411E+04

mlp102 H H H CONH

COOH CH

9,9149E-01 5,0818E-04 2,5477E+03 4,4615E-05

6,5359E+00 4,3767E+00 2,8656E+03

mlp103 H H H COCH

COOH CH

1,0260E+01 9,1322E-04 4,2732E+03 7,8308E-04

9,5683E+00 4,1893E+00 3,5622E+03

mlp104 H CH

H COOH COOH CH

1,8106E+02 1,0749E-02 1,8959E+04 1,2111E-02

4,5555E+00 2,4912E-01 9,2409E+03

mlp105 H CH

H CONH

COOH CH

7,9391E-01 7,9693E-04 4,3435E+03 8,6857E-05

4,8060E+00 2,9612E-01 7,9009E+04

mlp106 H CH

H COCH

COOH CH

1,5625E+01 6,6331E-03 1,3366E+04 6,1243E-04

3,1847E+00 3,2124E-01 4,1832E+05

mlp107 NH

H H COOH COOH CH

2,0710E+00 1,3128E-13 3,9434E-04 1,1195E-04

4,4381E+00 1,1711E+14 1,5711E+05

mlp108 NH

H H CONH

COOH CH

7,1416E-02 4,6533E-14 1,0608E-04 1,0467E-05

1,9394E+00 5,3994E+13 9,6603E+03

mlp109 NH

H H COCH

COOH CH

1,8653E-01 4,8620E-13 1,3591E-03 2,6770E-05

4,2261E+00 3,7555E+14 4,2813E+03

mlp110 NH

H COOH COOH CH

2,3066E+00 1,5432E-12 2,2926E-03 1,9317E-05

3,8215E+00 3,0968E+14 2,7452E+03

mlp111 NH

H CONH

COOH CH

9,1634E-02 2,3357E-12 1,0647E-02 7,9197E-07

7,6312E-01 2,0354E+14 1,3149E+03

mlp112 NH

H COCH

COOH CH

4,1286E-01 4,0111E-12 1,0008E-02 8,6603E-06

5,1282E-01 2,2594E+14 8,3349E+02

APÊNDICE

- 158 -

Tabela 02. Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

(µM) SI

Drogas R

Pc Tg Rl

Pc Tg

mlq1 N N H H H H H

7,3195E-01 5,6675E-01 3,2025E+02

2,9089E-01 7,2328E+02

mlq2 N N OH H H H H

1,1513E+00 3,9185E-01 1,6147E+02

1,2849E-01 3,4489E+02

mlq3 N N NH

H H H H

6,1117E-01 2,7123E-01 3,9770E+02

1,7257E-01 1,0656E+03

mlq4 N N CONH

H H H H

1,8691E+00 1,0551E+00 1,7781E+01

5,5019E-01 1,1013E+02

mlq5 N N H COOH H H H

1,0200E+00 2,3335E+00 1,2939E+02

1,3265E+00 3,4159E+02

mlq6 N N OH COOH H H H

2,8019E+00 5,7319E-01 8,7436E+01

1,4502E-01 1,1503E+02

mlq7 N N NH

COOH H H H

7,8462E+00 4,7631E+00 2,4865E+02

3,2443E-01 3,6656E+00

mlq8 N N CONH

COOH H H H

2,1777E+00 4,2366E-01 8,2977E+01

1,1543E+00 2,7151E+02

mlq9 N N H CONH

H H H

5,6263E-01 5,5246E-01 1,3688E+02

4,2625E-01 2,6079E+03

mlq10 N N OH CONH

H H H

1,4968E+00 3,9627E-01 1,1601E-08

2,7624E-01 4,7610E-11

mlq11 N N NH

CONH

H H H

2,8161E+00 4,7772E+00 4,1599E+02

6,1430E-01 2,3330E+01

mlq12 N N CONH

CONH

H H H

3,0882E+00 1,4479E+00 7,5254E+01

2,5410E-01 8,0417E+01

mlq13 N N H COCH3 H H H

5,0775E-01 8,0407E-01 5,2708E+01

6,2269E-01 5,2420E+02

mlq14 N N OH COCH3 H H H

4,4114E+00 7,2616E-01 2,0158E+02

7,7533E-02 6,9239E+02

mlq15 N N NH

COCH3 H H H

1,7787E+00 3,2650E+00 2,6131E+02

3,1039E-01 1,6493E+01

mlq16 N N CONH

COCH3 H H H

1,9875E+00 1,1576E+00 8,4727E+01

2,9556E-01 1,0945E+02

mlq17 N N H H H H CH3

6,5808E-01 2,3364E-01 9,9912E+01

1,2452E-01 7,6232E+02

APÊNDICE

- 159 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq18 N N OH H H H CH3

1,1023E+00 9,1660E-01 9,4519E+01

1,3232E-01 2,6448E+02

mlq19 N N NH

H H H CH3

9,0118E-01 3,2083E+00 7,9439E+01

2,4583E-01 2,7947E+01

mlq20 N N CONH

H H H CH3

2,0790E+00 5,9969E+00 4,0527E+01

7,5414E-01 3,4549E+01

mlq21 N N H COOH H H CH3

2,8308E-01 6,0560E-01 6,5307E+01

7,9659E-01 6,6981E+02

mlq22 N N OH COOH H H CH3

1,4393E+00 9,5693E-01 5,3557E+02

2,4431E-01 7,2467E+02

mlq23 N N NH

COOH H H CH3

3,4075E+00 1,5834E+01 4,6857E+02

4,7664E-01 2,7880E+00

mlq24 N N CONH

COOH H H CH3

1,4718E+00 5,0036E-01 8,3090E+01

4,1388E-01 5,2944E+01

mlq25 N N H CONH

H H CH3

4,5291E+00 9,2857E+00 5,6268E+03

1,3106E+00 4,2893E+02

mlq26 N N OH CONH

H H CH3

7,9099E+00 3,9075E-01 2,8395E+02

2,6352E-01 4,0626E+02

mlq27 N N NH

CONH

H H CH3

3,6432E+00 3,0318E+01 1,1233E+03

8,5181E-01 2,5202E+00

mlq28 N N CONH

CONH

H H CH3

2,9306E+00 3,9856E-01 1,3681E+02

2,1198E-01 4,2902E+02

mlq29 N N H COCH3 H H CH3

6,6302E-01 2,3289E+00 7,5188E+01

5,2149E-01 1,4481E+02

mlq30 N N OH COCH3 H H CH3

2,4844E+00 1,1275E+00 1,4501E+02

7,1534E-02 6,6364E+02

mlq31 N N NH

COCH3 H H CH3

1,3651E+00 4,8079E+00 7,0875E+01

2,5912E-01 3,9337E+00

mlq32 N N CONH

COCH3 H H CH3

6,8381E+00 1,0189E+00 7,4482E+01

5,1735E-01 3,5891E+01

mlq33 N N H H COOH H H

5,6913E-01 1,5217E+00 1,0582E+02

5,1944E-01 1,3120E+02

mlq34 N N OH H COOH H H

1,6248E+00 7,1675E+00 2,4395E+02

5,0405E-01 1,2741E+02

mlq35 N N NH

H COOH H H

6,0896E-01 2,8677E+00 3,0633E+02

3,1863E-01 1,9907E+03

mlq36 N N CONH

H COOH H H

8,4009E+00 2,8920E+01 5,7887E+01

3,0726E-04 1,8379E+01

APÊNDICE

- 160 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq37 N N H H CONH

H H

5,8245E-01 6,8710E-01 5,1728E+02

5,1459E-01 5,7465E+03

mlq38 N N OH H CONH

H H

8,9485E-01 1,0465E+00 7,0383E+01

2,4526E-01 2,2466E+02

mlq39 N N NH

H CONH

H H

1,2791E+00 2,2446E+00 1,2842E+02

1,0725E+00 7,9423E+01

mlq40 N N CONH

H CONH

H H

3,6649E+00 4,6003E+00 3,2362E+01

8,0229E-01 1,2856E+01

mlq41 N N H H COCH3 H H

4,8255E-01 7,6065E-01 9,9243E+01

3,8191E-01 2,3689E+02

mlq42 N N OH H COCH3 H H

5,6142E-01 3,3014E-01 5,1350E+01

1,8850E-01 3,4359E+02

mlq43 N N NH

H COCH3 H H

4,9850E-01 3,8176E+00 1,2397E+02

1,4602E-01 5,0240E+02

mlq44 N N CONH

H COCH3 H H

1,8124E+00 8,1462E-01 1,4460E+01

4,4604E-02 4,7517E+01

mlq45 N N H H COOH H CH3

1,3674E+00 7,0427E+00 3,6871E+02

5,7345E-01 7,4215E+01

mlq46 N N OH H COOH H CH3

4,7868E-01 1,3775E+00 2,8994E+01

2,9668E-01 1,9507E+02

mlq47 N N NH

H COOH H CH3

1,8621E+00 7,6848E+00 3,4042E+02

1,4838E-01 1,0817E+03

mlq48 N N CONH

H COOH H CH3

2,1053E+00 2,2406E+00 1,4558E+02

2,9765E-01 1,1851E+02

mlq49 N N H H CONH

H CH3

4,7398E-01 9,1104E-01 3,4522E+02

3,0797E-01 2,5568E+03

mlq50 N N OH H CONH

H CH3

2,8285E-01 1,6194E+00 9,5629E+01

2,0108E-01 6,9049E+02

mlq51 N N NH

H CONH

H CH3

9,4267E-01 3,4546E+00 4,7551E+01

3,0070E-01 1,0234E+01

mlq52 N N CONH

H CONH

H CH3

8,8069E-01 1,8417E+00 2,1973E+01

1,1080E+00 3,0255E+01

mlq53 N N H H COCH3 H CH3

7,5969E-01 1,4647E+00 3,4886E+02

5,2804E-01 4,9530E+02

mlq54 N N OH H COCH3 H CH3

1,2589E+00 2,0769E+00 7,5162E+01

2,0817E-01 1,2772E+02

mlq55 N N NH

H COCH3 H CH3

1,3833E+00 1,4390E+00 1,4453E+02

3,3814E-01 1,7413E+02

APÊNDICE

- 161 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq56 N N CONH

H COCH3 H CH3

4,7208E+00 7,4271E+01 7,6719E+02

7,0912E-01 9,1015E+00

mlq57 N N H H H COOH H

6,2679E-01 6,6427E-01 1,3685E+02

5,8238E-01 5,6536E+02

mlq58 N N OH H H COOH H

2,7195E+00 4,5680E-01 8,2164E+01

2,9050E-01 1,8276E+02

mlq59 N N NH

H H COOH H

4,2888E+00 3,4979E+00 1,3149E+02

8,3974E-01 8,9317E+00

mlq60 N N CONH

H H COOH H

6,9924E-01 7,7186E+02 2,7645E-01

3,7090E-11 5,2828E+00

mlq61 N N H H H CONH

1,1352E+00 2,3404E+00 1,8675E+03

8,1711E-01 2,8910E+03

mlq62 N N OH H H CONH

1,6599E+00 6,2177E+00 6,4312E+01

3,6864E-01 3,8957E+01

mlq63 N N NH

H H CONH

4,3616E+00 8,7185E+00 1,2545E+02

7,3455E-01 1,1407E+00

mlq64 N N CONH

H H CONH

5,7306E-01 2,2149E+00 3,4882E+02

3,4532E-01 6,3592E+02

mlq65 N N H H H COCH3 H

5,3497E-01 4,7493E-01 3,7344E+02

5,1599E-01 1,9202E+03

mlq66 N N OH H H COCH3 H

1,0334E+01 9,2424E-01 5,2765E+02

6,7990E-01 3,1325E+02

mlq67 N N NH

H H COCH3 H

2,7679E+00 2,1930E+01 1,2106E+02

5,2171E-01 3,8843E-01

mlq68 N N CONH

H H COCH3 H

3,0349E+00 1,7069E+00 3,2764E+02

2,3155E-01 1,1314E+02

mlq69 N N H H H COOH CH3

6,9941E+00 2,5531E+00 1,5948E+03

7,5633E-01 2,2561E+02

mlq70 N N OH H H COOH CH3

1,0227E+00 4,2353E-01 4,0256E+01

2,7316E-01 2,5098E+02

mlq71 N N NH

H H COOH CH3

1,3716E+00 1,9279E+00 1,0571E+02

4,8220E-01 2,9130E+01

mlq72 N N CONH

H H COOH CH3

4,1769E+00 3,0593E+02 1,1748E+03

6,2826E-04 1,5074E+03

mlq73 N N H H H CONH

CH3

3,0280E+00 1,9779E+00 1,0792E+03

6,7448E-01 1,2120E+03

mlq74 N N OH H H CONH

CH3

7,8184E+00 9,6504E-01 5,6347E+02

3,0880E-01 1,4241E+02

APÊNDICE

- 162 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq75 N N NH

H H CONH

CH3

1,2319E+00 5,1667E+00 2,7745E+02

4,5167E-01 3,9241E+01

mlq76 N N CONH

H H CONH

CH3

7,5368E+00 5,6016E+01 4,9995E+04

3,5875E+00 1,8504E+03

mlq77 N N H H H COCH3 CH3

9,6626E-01 3,5298E+00 4,5052E+02

5,7216E-01 2,8726E+03

mlq78 N N OH H H COCH3 CH3

3,9538E-01 3,6285E+00 1,3679E+02

2,8379E-01 6,9844E+02

mlq79 N N NH

H H COCH3 CH3

1,6305E+00 5,5491E+00 8,1696E+02

5,2230E-01 1,6797E+01

mlq80 N N CONH

H H COCH3 CH3

1,1961E+00 5,8162E-01 1,2420E+02

4,0146E-01 1,6805E+03

mlq81 N -C-NH2 H H H H H

8,3237E-01 5,5487E+00 3,3969E+00

1,2652E+03 2,5763E-02

mlq82 N -C-NH2 OH H H H H

3,6647E-01 5,5740E-01 1,9561E+00

4,9444E+02 4,2387E+00

mlq83 N -C-NH2 NH

H H H H

3,8035E-01 1,9866E+00 2,0165E+00

2,7614E+02 1,1545E+01

mlq84 N -C-NH2 CONH

H H H H

7,6620E-01 7,9973E+00 1,1287E+01

1,4940E+03 2,2822E+00

mlq85 N -C-NH2 H COOH H H H

6,1242E-01 6,7377E+02 3,4158E+00

3,4045E-10 6,5781E-01

mlq86 N -C-NH2 OH COOH H H H

4,7740E-03 1,0580E+00 1,0125E-03

5,7064E-11 6,9244E+00

mlq87 N -C-NH2 NH

COOH H H H

1,2346E+00 1,2412E+00 7,1833E+00

1,3064E+03 3,8043E+00

mlq88 N -C-NH2 CONH

COOH H H H

6,0343E-02 5,8323E+01 2,0427E-01

1,2391E-10 4,7514E+00

mlq89 N -C-NH2 H CONH

H H H

5,5798E-01 1,7158E+00 4,8878E+01

1,8830E+03 2,5216E-03

mlq90 N -C-NH2 OH CONH

H H H

4,5005E+00 2,8336E+01 2,0574E+00

1,2661E-06 5,6313E-03

mlq91 N -C-NH2 NH

CONH

H H H

3,4235E-01 1,4513E+00 1,6634E+00

4,4053E+02 4,1615E-01

mlq92 N -C-NH2 CONH

CONH

H H H

1,6341E+00 1,0889E+01 2,4871E+01

1,1626E+03 1,0416E-04

mlq93 N -C-NH2 H COCH3 H H H

2,8259E+00 4,0355E+00 8,3955E+00

6,7509E+02 9,2159E-04

APÊNDICE

- 163 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq94 N -C-NH2 OH COCH3 H H H

1,6015E+00 1,3673E+01 1,6080E+01

3,2893E-06 1,1193E-01

mlq95 N -C-NH2 NH

COCH3 H H H

1,3292E+00 4,5049E-01 1,8662E+01

8,4253E+02 5,3452E+00

mlq96 N -C-NH2 CONH

COCH3 H H H

7,3051E-02 5,6872E+01 1,3913E+00

2,3174E-10 5,3250E+01

mlq97 N -C-NH2 H H H H CH3

3,4769E-01 7,4223E-01 4,1724E+00

6,8414E+02 1,7608E+00

mlq98 N -C-NH2 OH H H H CH3

2,6501E-01 4,4367E-01 1,1624E+00

3,6616E+02 5,2211E+00

mlq99 N -C-NH2 NH

H H H CH3

4,3997E-01 3,3361E+00 1,3639E+00

2,3253E+02 1,4994E+01

mlq100 N -C-NH2 CONH

H H H CH3

3,6812E-01 4,5476E+00 3,7137E+00

1,8786E+03 3,7760E+00

mlq101 N -C-NH2 H COOH H H CH3

4,9875E-01 3,7678E+02 5,0901E-01

1,4233E-10 5,0498E-01

mlq102 N -C-NH2 OH COOH H H CH3

1,1572E+00 3,8449E+01 1,1965E+01

1,9380E-10 7,8900E+00

mlq103 N -C-NH2 NH

COOH H H CH3

5,9269E-01 1,3401E+00 6,6142E+00

9,8385E+02 2,3973E+00

mlq104 N -C-NH2 CONH

COOH H H CH3

4,0026E-01 1,3359E+01 3,2102E-01

1,2535E-10 1,4186E+01

mlq105 N -C-NH2 H CONH

H H CH3

2,8569E+00 3,9859E+00 1,8256E+02

1,4750E+03 6,2234E-04

mlq106 N -C-NH2 OH CONH

H H CH3

9,7203E-01 1,5394E+00 6,6106E+02

4,4648E+02 1,4693E+00

mlq107 N -C-NH2 NH

CONH

H H CH3

6,1288E-01 3,6718E-01 3,9001E+00

3,4972E+02 1,1848E+00

mlq108 N -C-NH2 CONH

CONH

H H CH3

3,1062E+00 1,8972E+00 1,1819E+02

1,6563E+03 1,8576E-03

mlq109 N -C-NH2 H COCH3 H H CH3

3,2177E+00 2,1039E+00 2,3267E+02

1,3537E+03 6,1602E-03

mlq110 N -C-NH2 OH COCH3 H H CH3

1,0925E+00 3,0830E+01 5,2172E+01

1,6660E-07 1,6241E-01

mlq111 N -C-NH2 NH

COCH3 H H CH3

1,6666E+00 1,0991E+00 3,5727E+00

6,0092E+02 9,2453E-01

mlq112 N -C-NH2 CONH

COCH3 H H CH3

4,1185E-02 7,2724E+00 6,6773E-03

3,7567E-11 2,2054E+00

APÊNDICE

- 164 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq113 N -C-NH2 H H COOH H H

7,9931E-01 2,5848E+00 4,6659E+01

1,9571E+03 2,8459E-03

mlq114 N -C-NH2 OH H COOH H H

2,4859E+00 2,0192E+01 1,4632E+01

5,0849E+00 1,3078E-04

mlq115 N -C-NH2 NH

H COOH H H

6,0598E-01 1,0183E+00 3,8141E+00

1,5961E+03 7,5314E-01

mlq116 N -C-NH2 CONH

H COOH H H

5,4517E-01 6,8426E+00 2,5574E+00

5,0107E-04 2,4630E-05

mlq117 N -C-NH2 H H CONH

H H

8,9486E-01 4,5534E+00 3,2848E+01

3,2696E+03 5,7414E-03

mlq118 N -C-NH2 OH H CONH

H H

6,5123E-01 3,3390E+00 1,6068E+01

5,2969E+02 1,4951E+00

mlq119 N -C-NH2 NH

H CONH

H H

1,7263E+00 1,0549E+00 5,0105E+00

1,5929E+03 5,4503E-01

mlq120 N -C-NH2 CONH

H CONH

H H

4,8892E-01 2,3078E+00 1,8719E+01

4,7245E+02 1,1652E-04

mlq121 N -C-NH2 H H COCH3 H H

8,0137E-01 3,1767E+00 1,2851E+02

2,7306E+03 2,6029E-03

mlq122 N -C-NH2 OH H COCH3 H H

2,1723E+00 2,8300E+00 2,9987E+01

4,9246E+01 7,5920E-04

mlq123 N -C-NH2 NH

H COCH3 H H

7,8647E-01 7,1705E-01 3,4445E+00

8,8886E+02 3,4471E+00

mlq124 N -C-NH2 CONH

H COCH3 H H

5,2624E-01 4,4199E+00 9,3454E+00

2,2554E+00 4,3567E-05

mlq125 N -C-NH2 H H COOH H CH3

1,1056E+00 5,9814E+00 6,1859E+01

3,1368E+03 4,6070E-04

mlq126 N -C-NH2 OH H COOH H CH3

1,5646E+00 1,1260E+01 4,9236E+01

6,0964E+01 1,4882E-03

mlq127 N -C-NH2 NH

H COOH H CH3

1,4128E+00 3,7284E+00 1,4677E+00

1,0232E+03 8,7152E-02

mlq128 N -C-NH2 CONH

H COOH H CH3

2,5870E-01 2,1156E+00 4,9214E+00

3,5717E-02 8,7472E-05

mlq129 N -C-NH2 H H CONH

H CH3

1,4287E+00 1,6566E+00 6,8595E+01

2,7870E+03 1,7502E-02

mlq130 N -C-NH2 OH H CONH

H CH3

3,9052E+00 1,4088E+00 5,7098E+01

4,6838E+02 2,1550E-03

mlq131 N -C-NH2 NH

H CONH

H CH3

8,0694E-01 2,2131E+00 3,1352E+00

1,0663E+03 7,5513E-01

APÊNDICE

- 165 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq132 N -C-NH2 CONH

H CONH

H CH3

1,4348E+00 5,3511E+00 6,8941E+01

9,5981E+02 2,1254E-04

mlq133 N -C-NH2 H H COCH3 H CH3

1,1577E+00 8,5616E+00 7,9816E+01

1,7560E+03 2,6893E-03

mlq134 N -C-NH2 OH H COCH3 H CH3

5,9331E+00 4,9917E+00 5,7002E+01

1,7550E+02 1,9660E-03

mlq135 N -C-NH2 NH

H COCH3 H CH3

6,5291E-01 1,4191E+00 4,8257E+00

7,5480E+02 3,1213E-01

mlq136 N -C-NH2 CONH

H COCH3 H CH3

3,6372E+00 1,8556E+00 9,3580E+01

1,0365E+01 4,6775E-05

mlq137 N -C-NH2 H H H COOH H

1,1164E+00 5,7057E+00 1,4356E+00

4,2952E-02 4,9326E-02

mlq138 N -C-NH2 OH H H COOH H

2,2706E+00 3,2758E+00 1,5828E+00

9,2225E+02 6,5265E-01

mlq139 N -C-NH2 NH

H H COOH H

1,1113E+00 2,2663E+00 2,3790E+00

1,1236E+03 8,1739E-01

mlq140 N -C-NH2 CONH

H H COOH H

7,6264E-02 9,0232E+00 6,0513E-02

3,8287E-10 1,6148E+00

mlq141 N -C-NH2 H H H CONH

7,7618E-01 1,1937E+01 3,4428E+00

5,8419E+02 3,4622E-03

mlq142 N -C-NH2 OH H H CONH

1,4687E+00 1,9011E+00 4,0240E+01

1,2186E+03 6,4813E-03

mlq143 N -C-NH2 NH

H H CONH

1,9056E-01 3,1168E+00 4,0837E+00

1,5667E+03 2,9520E+00

mlq144 N -C-NH2 CONH

H H CONH

1,0696E+00 1,8035E+00 2,2528E+01

1,1240E+03 1,3244E-03

mlq145 N -C-NH2 H H H COCH3 H

1,8005E+00 4,0098E+00 1,0547E+01

5,1460E+02 4,3562E-02

mlq146 N -C-NH2 OH H H COCH3 H

2,1892E+00 1,9944E+01 3,8758E+00

2,0622E-03 2,4503E-02

mlq147 N -C-NH2 NH

H H COCH3 H

1,7590E-01 4,8871E+00 1,1079E+00

1,4557E+03 1,8144E+00

mlq148 N -C-NH2 CONH

H H COCH3 H

1,9855E-01 1,4492E+02 3,1558E+00

2,6583E-09 6,8217E-01

mlq149 N -C-NH2 H H H COOH CH3

1,0850E+00 5,4688E+00 3,3919E+01

6,8447E+02 4,0711E-03

mlq150 N -C-NH2 OH H H COOH CH3

3,1446E+00 2,4467E+00 3,7889E+01

1,0680E+03 4,8895E-03

APÊNDICE

- 166 -

Atividades e seletividades previstas para as novas estruturas propostas derivadas do TMQ

mlq151 N -C-NH2 NH

H H COOH CH3

3,7252E-01 1,6753E+00 1,2744E+00

1,1659E+03 1,5393E+00

mlq152 N -C-NH2 CONH

H H COOH CH3

1,1278E+00 4,3857E+00 8,2930E+00

3,9704E-01 2,1208E-04

mlq153 N -C-NH2 H H H CONH

CH3

6,6567E-01 2,1316E+00 1,7361E+01

2,6411E+02 1,7291E-02

mlq154 N -C-NH2 OH H H CONH

CH3

3,7712E-01 1,7191E+00 1,8959E+01

6,5540E+02 3,4040E-01

mlq155 N -C-NH2 NH

H H CONH

CH3

2,7881E-01 8,8106E-01 1,3807E+00

7,4352E+02 7,2448E+00

mlq156 N -C-NH2 CONH

H H CONH

CH3

9,2125E-01 3,7379E+00 3,9340E+01

1,5462E+03 5,1108E-04

mlq157 N -C-NH2 H H H COCH3 CH3

2,0223E+00 1,8844E+00 2,1340E+01

9,1172E+02 3,4148E-03

mlq158 N -C-NH2 OH H H COCH3 CH3

1,2051E+00 1,3049E+00 8,0431E+00

8,1095E+02 3,5735E-01

mlq159 N -C-NH2 NH

H H COCH3 CH3

3,3118E+00 7,5851E+00 5,0028E+00

2,7701E+03 3,4021E-02

mlq160 N -C-NH2 CONH

H H COCH3 CH3

1,4663E+00 2,4217E+00 3,1470E+01

1,9851E+03 9,8607E-05

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