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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
LÍGIA SOUZA FERREIRA
SELEÇÃO DE Bacillus thuringiensis BERLINER E Trichogramma
pretiosum RILEY (HYMENOPTERA:TRICHOGRAMMATIDAE) PARA
Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
E SUAS INTERAÇÕES
ALEGRE
2010
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1
LÍGIA SOUZA FERREIRA
SELEÇÃO DE Bacillus thuringiensis BERLINER E Trichogramma
pretiosum RILEY (HYMENOPTERA:TRICHOGRAMMATIDAE) PARA
Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
E SUAS INTERAÇÕES
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Espírito Santo, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Produção Vegetal, para obtenção do título
de Mestre em Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo A. Polanczyk
Co-orientador: Prof. Dr. Dirceu Pratissoli
ALEGRE
2010
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Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Setorial de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
F383s
3
LÍGIA SOUZA FERREIRA
SELEÇÃO DE Bacillus thuringiensis BERLINER E Trichogramma
pretiosum RILEY (HYMENOPTERA:TRICHOGRAMMATIDAE) PARA
Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
E SUAS INTERAÇÕES
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Espírito Santo, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal, para obtenção do
título de Mestre em Produção Vegetal.
Aprovada em 12 de fevereiro de 2010
COMISSÃO EXAMINADORA
________________________________
Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk
Universidade Federal do Espírito Santo
(Orientador)
________________________________
Prof. Dr. Dirceu Pratissoli
Universidade Federal do Espírito Santo
(Co-orientador)
________________________________
Prof. Dr. Anderson Mathias Holtz
Instituto Federal do Espirito Santo
________________________________
Prof. Dr. Hugo J. G. dos Santos Junior
Universidade Federal do Espírito Santo
4
DEDICO
Aos meus Pais Sebastião e Fátima, as minhas
irmãs Luciana e Luciene, ao meu esposo Amilton e
a minha amiga Débora.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, por conduzir meus caminhos sempre me abençoando e me dando
sabedoria para enfrentar os obstáculos e a Nossa Senhora pela sua interseção;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudo;
Ao Prof. Ricardo Antonio Polanczyk, pela orientação, amizade, apoio, atenção, até
mesmo, pelas críticas que me ajudaram a crescer e principalmente, pela
oportunidade de cursar este mestrado nesta instituição;
Ao Prof Dirceu Pratissoli, pela co-orientação, pelos conhecimentos, confiança e
apoio;
Ao Setor de Entomologia do Núcleo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
em Manejo Fitossanitário de Pragas e Doenças (NUDEMAFI), por ceder o espaço
para criação dos insetos;
A minha família, em especial aos meus pais, por todo carinho, apoio, dedicação,
força, por acreditarem em mim e principalmente por suas orações;
Ao meu esposo Amilton, por todo amor, carinho, compreensão, companheirismo e
por sempre acreditar em mim;
A minha querida amiga Débora, por todo seu apoio, fazendo-se presente em todos
os momentos, não permitindo que eu desanimasse e a sua mãe Alenir, por todo
carinho e pelos deliciosos almoços;
À companheira Carol, pelos momentos de alegria, descontração e desabafo, e
também por ter me ajudado no abstract;
6
Ao Dr. Ulysses Rodrigues Vianna;
Ao Prof. Dr. Hugo José Gonçalves dos Santos Junior, por todo apoio e por estar
sempre disposto a ajudar;
Ao Prof. Dr. Anderson Mathias Holtz, pelo apoio, sugestões e por aceitar participar
dessa banca e contribuir com meu trabalho;
Aos companheiros e colegas André Malacarne, Vando, Flávio Neves e José
Romário, que com tanto carinho e disposição me ajudaram na estatística;
Ao estagiário Rafael Alves, por toda sua disponibilidade;
Ao funcionário e amigo Leonardo Mardgan, por todo apoio, amizade, conversas e
momentos de alegria e descontração;
Aos funcionários do NUDEMAFI, Carlos Magno e Dona Carlota;
Aos amigos do Laboratório de Entomologia: Camila, Eduardo, Fernando, Gustavo,
João Paulo, Kharen, Larissa, Lauana, Luziani, Marcel, Marina, Marília, Marquinhos,
Priscila, Rafael Dohler, Raul, Samara, Suelen, Tiago, Victor Lima e Victor Vicentini;
As minhas amigas, que mesmo de longe estão sempre por perto: Andréia, Deíse,
Érica, Jacqueline, Michelle, Paolla, Raquel e Sandra;
E a todos aqueles que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para
realização deste trabalho.
7
RESUMO
A expansão da área de cultivo e o consequentemente uso de algumas técnicas de
manejo tem propiciado o aumento de problemas fitossanitários. Dentre essas
técnicas, o monocultivo, o plantio escalonado, e a utilização desordenada de
agrotóxicos favorecem o ataque de diversos insetos-praga. Entre os insetos-praga,
destaca-se, a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda) (J.E.Smith), devido ao
difícil controle e aos prejuízos ocasionados que variam entre 20 a 40%. Visando ao
controle da praga e a redução da utilização de inseticidas, o controle biológico se
destaca como o método mais promissor e adequado. Entre os agentes de controle
biológico, a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Berliner) (Bt) e o
parasitoide de ovos do gênero Trichogramma (Westwood) são considerados
promissores visando ao manejo de diversos insetos-praga. Dessa forma, o objetivo
deste trabalho foi selecionar uma ou mais linhagens e isolados de Bt, bem como a
interação entre esses dois agentes de controle biológico, no controle de S.
frugiperda. Foram utilizadas 11 linhagens de Trichogramma pretiosum (Riley), sendo
que a linhagem Tp 16 apresentou melhor desempenho para o controle dessa praga,
com 60,66% de parasitismo. Foram testados 50 isolados de Bt para o controle de S.
frugiperda. Os isolados 676 e 984 mostraram-se mais promissores para o controle
dessa praga, causando mortalidade acima de 50%. Para verificar a interação entre
os agentes de controle, utilizou-se os isolados de Bt selecionados misturados ao mel
e oferecidos a linhagem Tp 16 para sua alimentação. Em outro experimento, as
cartelas contendo os ovos da praga foram imersas nos isolados de Bt e oferecidas
para a linhagem Tp 16 do parasitoide. Houve interação positiva no experimento em
que as cartelas foram imersas no Bt, apresentando um total de 32,85 ovos parasitados
para o isolado 676, 30,35 para o isolado 984 e 31,20 para a testemunha. Porém,
observou-se uma redução no número total de ovos parasitados quando o Bt foi oferecido
como alimento. A testemunha apresentou um total de 55,30 ovos parasitados, enquanto
que os isolados 676 e 984, apresentaram 35,15 e 18,70 ovos parasitados,
respectivamente.
Palavras Chave: Controle Biológico, Milho, Entomopatógenos, Parasitoides de ovos.
8
ABSTRACT
The increasing number of corn production areas and the different amount of working
strategies used to grow it have increased the number of pests. The monoculture
strategy and the frequent use of insecticides expose this culture to severe attacks of
several pests. The most common corn pest is the fall armyworm (Spodoptera
frugiperda) (J.E.Smith), it has caused around 20 to 40% of losses of corn culture,
because it is not easy to be controlled. Aiming the pest control and use less
insecticides, the biological control is considered the most promising and suitable
method to be used. Among the biological control agents the entomopathogenic
bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) and Trichogramma parasite id eggs are
considered the most promising ones. This project aimed to analyze the effects
isolated B. thuringiensis and Trichogramma eggs have on S. frugiperda control.
Eleven Trichogramma pretiosum strains were analyzed, Tp 16 presented the best
performance , with 60,66% of parasitism. Isolated 676 and 984 showed to be the
most promising in this pest control, the rates of mortality caused by them were over
50%. Two experiments were carried out to test such controlling process, in one of
them the selected isolated were mixed with honey and they were used to feed Tp 16.
In the second one, cards with the pest eggs were immersed in the isolated Bt and
offered to Tp 16. It was observed that where the cards were immersed in Bt there
was a positive interaction, resulting in 32,85 parasitized eggs when the isolated 676
were used, 30,35 eggs when the isolated 984 were used and 31,20 for the other.
However, when the isolated were offered as food, it was observed that the number of
parasitized eggs decreased compared to when they were used to control the pest. The
controlling experiment resulted in 55,30 parasitized eggs , the isolated 676 and 984,
resulted in 35,15 and 18,70 parasitized eggs, respectively.
Key words: Biological control, Corn, Entomopathogenic, Eggs parasitoids.
9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................11
2 REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................15
2.1 A cultura do milho ........................................................................................... 15
2.2 Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepdoptera: Noctuidae) ............... 16
2.2.1 Danos e controle ................................................................................... 17
2.3 O parasitóide de ovos Trichogramma pretiosum ............................................ 18
2.4 A Bactéria entomopatogenica Bacillus thuringiensis ............................... 20
2.5 Interação Bacillus thuringiensis - Trichogramma - insetos-alvo ...................... 22
2.6 REFERÊNCIAS BLIOGRÁFICAS .................................................................. 24
CAPÍTULO 1 ............................................................................................................. 32
Seleção de linhagens de Trichogramma pretiosum Riley (Hymenoptera:
Trichogrammatidae) para o controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae)............................................................................................33
3.1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 35
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 36
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 38
3.4 CONCLUSÃO .................................................................................................. 41
3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 42
CAPÍTULO 2 ..............................................................................................................50
Suscetibilidade de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) a
Bacillus thuringiensis Berliner ................................................................................... 51
4.1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 53
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 54
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 55
4.4 CONCLUSÃO .................................................................................................. 58
4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 59
10
CAPÍTULO 3 ..............................................................................................................62
Interação entre Trichogramma pretiosum e Bacillus thuringiensis para o controle
biológico de Spodoptera frugiperda .......................................................................... 63
5.1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 65
5.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 66
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 69
5.4 CONCLUSÃO ................................................................................................. 76
5.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 77
11
1. INTRODUÇÃO GERAL
Alternativas de controle têm-se buscado atualmente, dentre as quais a utilização do
controle biológico, pois cerca de 15% da safra de alimentos do mundo é perdida por
causa do ataque de insetos, cujo controle tem sido feito, predominantemente, com
uso de agrotóxicos, que se utilizados de forma incorreta podem ser altamente
tóxicos ao ambiente. (SILVA-FILHO & FALCO, 2000). Portanto, é necessário
substituir esses produtos por alternativas ecologicamente mais corretas (PRAÇA et
al., 2004).
Dentre os agentes de controle biológico, os entomopatógenos, predadores e
parasitoides são considerados alternativas viáveis no controle de insetos-pragas.
Dentre esses agentes a bactéria entomopatogenica Bacillus thuringiensis e o
parasitoide de ovos Trichogramma pretiosum têm sido amplamente estudados
(ATLAS & BARTHA, 1998; PRAÇA et al., 2004, BETZ et al., 2006).
A bactéria B. thuringiensis é o ingrediente ativo da maioria dos bioinseticidas
empregados mundialmente (GLARE & O´CALLAGHAM, 2000). Essa bactéria produz
diferentes proteínas tóxicas, denominadas cristais, altamente específicas para
insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hemiptera e Hymenoptera.
Essas toxinas não afetam o homem, os animais e as plantas (POLANCZYK &
ALVES, 2003, POLANCZYK et al., 2008). O parasitoide de ovos T. pretiosum é o
mais estudado e mais comercializado em todo mundo para o controle de
lepidópteros-praga (PARRA & ZUCCHI, 2004) apresentando altas taxas de
parasitismo (PRATISSOLI & PARRA, 2001; QUERINO & ZUCCHI, 2003).
O Manejo Integrado de Pragas (MIP) consiste na interação de técnicas de controle
para manter a populaçãoo de pragas em níveis abaixo dos danos econômicos
(WAQUIL et al., 2002). Dessa forma, é comum no MIP a integração de dois ou mais
métodos de controle. No caso específico de B. thuringiensis e Trichogramma, os
dois agentes de controle são empregados em conjunto, por exemplo, na cultura do
tomate no México, Colômbia e Brasil (TRUMBLE & ALVARADO-RODRIGUEZ, 1993;
HAJI et al., 2002).
12
Este trabalho analisa o potencial de controle de isolados de B. thuringiensis e T.
pretiosum sobre S. frugiperda, bem como a interação entre os dois agentes de
controle biológico.
13
1.1 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ATLAS, R.M.; BARTHA, R. Microbial ecology: fundamentals and applications. 4 ed.
Redwood: Cummings Science. 1998, p. 694.
BETZ, F.S, B.G. HAMMOND & R.L. FUCHS. Safety and advantages of Bacillus
thuringiensis-protected plants to control insect pests. Regul Toxicol Pharmacol. v.
32, p.156-173, 2006.
GLARE, T. R.; O’CALLAGHAN, M. Bacillus thuringiensis: biology, ecology and
safety. Chichester: John Wiley. 2000, p. 350.
HAJI, F.N.P., L. PREZOTTI, J.S. CARNEIRO & J.A. ALENCAR. Trichogramma
pretiosum para o controle de pragas no tomateiro industrial, p.477-494. In: J.R.P.
PARRA, P.S.M. BOTELHO, B.S. CORRÊA-FERREIRA & J.M.S. BENTO (Eds.).
Controle biológico no Brasil – parasitoides e predadores. Piracicaba, Ed.
Manole, 2002, p. 609.
PARRA, J.R.P.; ZUCCHI, A. Trichogramma in Brazil: feasibility of use after twenty
years of research. Neotropical Entomology, n. 33, v. 3, p. 271-281, 2004.
POLANCZYK, R.; ALVES, S. Bacillus thuringiensis: uma breve revisão.
Agrociência, Montevidéu, v.7, p.1-10, 2003.
POLANCZYK, R.; MONNERAT, R. G., BERNARDES, C.O.; FERREIRA, L.S;
BESTETE, L.R. A Bacteria Entomopatogenica Bacillus thuringiensis. Estudos
Avançados em Produção Vegetal. v. 1, p. 225-248, 2008.
PRAÇA, L. B.; BATISTA, A. C.; MARTINS, E. S.; SIQUEIRA, C. B.; DIAS, D. G. S.;
GOMES, A. C. M. M.; FALCÂO, R.; MONNERAT, R. G. Estirpes de Bacillus
thuringiensis efetivas contra insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera e Diptera.
Pesquisa agropecuária brasileira. v.39, n.1, p.11-16, 2004.
14
PRATISSOLI, D. & J.R.P. PARRA. Seleção de linhagens de Trichogramma
pretiosum Riley, para o controle das traças Tuta absoluta (Meyrick) e Phthorimaea
operculella (Zeller). Neotropical Entomology. v. 30, p. 277-282. 2001.
QUERINO, R.B. & ZUCCHI, R.A. New species of Trichogramma Westwood
associated whit lepidopterous eggs in Brazil. Zootaxa. v.163, p.1-10, 2003.
SILVA-FILHO, M.C.; FALCO, M.C. Interação planta-inseto: adaptação dos insetos
aos inibidores de proteinase produzidos pelas plantas. Biotecnologia, Ciência &
Desenvolvimento, v.2, p.38-42, 2000.
TRUMBLE, J.; ALVARADO-RODRIGUEZ. B. Development of economic evaluation of
an IPM program for fresh market tomato production in Mexico. Agriculture,
Ecosystems & Environment, v.43, p.267-284, 1993.
WAQUIL, J.M., VIANA, P.A. & CRUZ, I. . Cultivo de milho: manejo integrado de
pragas (MIP). Embrapa-CNPMS. 2002, p.16.
15
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A cultura do milho
A cultura do milho (Zea mays L.) ocupa no Brasil cerca de 15 milhões de hectares
com uma produção de aproximadamente 134,3 milhões de toneladas por ano,
destacando-se como uma das mais importantes no contexto econômico e social no
mundo, sendo que o Brasil ocupa a terceira posição em termo de produção mundial
(AGRIANUAL, 2007; COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO – CONAB,
2009). Esta cultura é nativa da América Central, pertencente à família Poaceae
(Gramineae), mas com uma enorme capacidade de adaptação a diversos climas,
regiões e hemisférios; podendo ser considerada uma espécie altamente politípica e
também como a mais cosmopolita (ESPIRITO-SANTO, 2001; CESCONETTO;
2002).
A importância social do milho respalda-se, em duas evidências: a primeira, por ser
componente básico da alimentação animal; a segunda, por ser produto típico do
pequeno produtor rural (MELO FILHO & RICHETTI, 1999). Emprega-se a ma
ior parte do milho produzido como ração animal, sendo aproximadamente dois
terços da produção nacional. O milho consiste também em importante fonte de óleo
vegetal, glúten e amido (MELO FILHO & RICHETTI, 1999; MATTOSO et al., 2001).
Embora o cultivo do milho apresente alta produtividade, praticamente em todo o
mundo, a cultura sofre o ataque de várias espécies de insetos-praga, destacando-se
a lagarta-do-cartucho, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). No Brasil as perdas
causadas por essa praga variam entre 20 e 40%, atingindo um prejuízo de 400
milhões de dólares por ano (CRUZ & TURPIN, 1982; GALLO et al., 2002).
O milho apresenta alta suscetibilidade ao ataque dessa praga, principalmente em
função da conformação da planta (cartucho), que propicia proteção para a lagarta,
dificultando o seu controle. A ampla distribuição dessa espécie no Brasil ocorre pelo
fato de haver alimentação diversificada e disponível o ano todo (semeadura normal e
16
safrinha), condições favoráveis de clima e a boa capacidade migratória do inseto
(SANTOS, 2002).
Entretanto, sua importância deve-se não somente aos danos provocados, mas
especialmente à dificuldade de seu controle. É imprescindível o conhecimento dos
parâmetros populacionais da praga, como seu padrão de dispersão na cultura, para
buscar alternativas de manejo mais econômicas e sustentáveis (SANTOS, 2002).
2.2. Spodoptera fugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera:
Noctuidae)
A lagarta-do-cartucho, S. frugiperda foi citada pela primeira vez em 1797, na Geórgia
(EUA) e inicialmente foi classificada como Phalaena frugiperda, passando por várias
denominações até receber o nome científico atual de Spodoptera frugiperda
(BERTELS, 1970; PEDIGO, 1989). É nativa de zonas tropical e subtropical das
Américas, sendo que sua distribuição abrange desde o sul do Canadá até a
Argentina (LEIDERMAN & SAUER, 1953). Encontrada em inúmeros hospedeiros,
ataca preferencialmente o milho, podendo ocorrer em outras culturas de importância
agrícola, como: trigo, arroz, feijão, tomate, batata, abóbora, sorgo, alfafa, algodão,
amendoim, espinafre, couve, pastagens e outros (CRUZ et al., 1999).
A mariposa é de coloração cinza-escura e mede cerca de 4 cm de envergadura.
Emerge à noite e apresenta acentuado dimorfismo sexual, faz postura nas folhas,
em grupos de 50 a 300 ovos, podendo chegar ao número médio de 1300 ovos por
fêmea. O período médio de duração das fases de ovo, larva, pupa e adulto é em
torno de 3, 25, 11 e 12 dias, respectivamente (GASSEN, 1996; CRUZ, 1995). As
lagartas apresentam coloração que varia de parda escura até quase preta,
apresentando três finas linhas longitudinais branco-amareladas na parte dorsal do
corpo (ÁVILA et al., 1997; CRUZ, 1995; GASSEN, 1994).
Durante a fase larval, o inseto pode apresentar de quatro a sete ínstares, variando
conforme a fonte de alimento (artificial ou natural), temperatura, sexo e genética. A
17
duração dessa fase é de 12 a 30 dias, quando a lagarta atinge aproximadamente 5
cm de comprimento (PARRA & HADDAD, 1989) .
A partir do segundo estádio de desenvolvimento as lagartas podem apresentar
canibalismo. Quando falta alimento, elas migram em grupos, sendo, por isso,
conhecidas também como lagartas militares (GASSEN, 1996). Após completarem
seu desenvolvimento, as lagartas penetram no solo, onde empupam (VALICENTE &
CRUZ, 1991).
2.2.1. Danos e Controle
A S. frugiperda ataca a planta desde sua emergência até a formação de espigas
(CRUZ, 1995). No início do desenvolvimento, apenas raspam as folhas. Porém,
após tornarem-se mais ativas, perfuram as folhas, diminuindo a área fotossintética
ativa da planta. A redução no rendimento de milho pode chegar a 40% (CRUZ,
1995). O controle é feito, principalmente, com aplicação de inseticidas que, na
maioria dos casos, não soluciona o problema e ainda causa inúmeros impactos
negativos ao meio ambiente e ao homem (CORTEZ & TRUJILLO, 1994).
O número de aplicações tem aumentado ao longo dos anos e, em algumas regiões,
é comum a utilização de mais de cinco aplicações de inseticidas durante a safra
(CRUZ et al., 2002). Dessa forma, a grande preocupação com a praga, atualmente,
é o uso de agrotóxicos, que, às vezes, são aplicados em proporções pouco
recomendáveis, tanto do ponto de vista econômico quanto ecológico, sem levar em
conta os seus inimigos naturais, reduzindo dessa forma o componente biótico do
agroecossistema, acarretando também o desenvolvimento de populações
resistentes à praga (RIBAS et al., 2008).
Ao se adotar o controle biológico, aproveita-se ao máximo o controle natural já
disponível, como parasitóides, predadores e entomopatógenos. Também se espera
que em alguns anos, um equilíbrio seja atingido onde um mínimo de intervenção
seja necessário em uma determinada lavoura (MOSCARDI, 2003).
18
2.3. O parasitoide de ovos Trichogramma pretiosum Riley
(Hymenoptera:Trichogrammatidae)
Trichogramma Westwood é um microhimenóptero da família Trichogrammatidae,
que se caracteriza pelo tamanho diminuto e por parasitar ovos de inúmeras espécies
de pragas de diversas ordens. Porém, a sua utilização no controle de insetos-praga
da ordem Lepidoptera merece destaque, impedindo, dessa forma, que a praga atinja
a fase larval e, consequentemente, cause danos (HAJI, 1996).
A utilização de Trichogramma em larga escala só foi possível, quando Flanders
(1930), demonstrou a possibilidade de utilização de ovos de Sitotroga cerealella
(1819) o que tornou possível a utilização desse parasitoide como agente de controle
biológico em muitos países (HASSAN, 1994). Posteriormente, métodos similares de
produção massal utilizaram ovos de Anagasta kuehniella (Zeller, 1879) e Corcyra
cephalonica (Stainton, 1865) como hospedeiro alternativo para multiplicação do
parasitoide (PARRA & ZUCCHI, 1997; HAJI et al, 2002) .
No processo de desenvolvimento, os insetos do gênero Trichogramma passam pela
fase de ovo, larva, pré-pupa e pupa. Na fase de pupa, com o desenvolvimento do
parasitoide, o ovo do hospedeiro torna-se escuro, em virtude da esclerotização da
cutícula, sendo uma característica marcante de parasitismo por Trichogramma
(CONSOLI et al., 1999).
O gênero Trichogramma, constituído por aproximadamente 200 espécies, é
considerado um importante agente de controle biológico, devido a sua ampla
distribuição geográfica, em que está associado eficientemente a um grande número
de insetos-pragas de cultura de interesse econômico como: soja, milho, algodão,
tomate, hortaliças, abacate, etc. (PARRA & ZUCCHI, 2004; PARRA et al., 2002;
PRATISSOLI & PARRA, 2000; PRATISSOLI & OLIVEIRA, 1999).
Atualmente esse parasitoide é o mais estudado no mundo, sendo criado em 23
países, dos quais se destacam no controle de pragas a Rússia, o México e a China,
onde as liberações inundativas são frequentes (HASSAN, 1997). Na América do Sul,
19
38 espécies foram registradas, enquanto no Brasil, foram relatadas 28 espécies
(ZUCCHI & MONTEIRO, 1997; QUERINO & ZUCCHI, 2003). Contudo, a utilização
de Trichogramma em larga escala só foi possível, quando Flanders (1930),
demonstrou a possibilidade de utilização de ovos de Sitotroga cerealella (1819) o
que tornou possível a utilização desse parasitóide como agente de controle biológico
em muitos países (HASSAN, 1994). Posteriormente, métodos similares de produção
massal utilizaram ovos de Anagasta kuehniella (Zeller, 1879) e Corcyra cephalonica
(Stainton, 1865) como hospedeiro alternativo para multiplicação deste parasitóide
(PARRA & ZUCCHI, 1997; HAJI et al., 2002).
No Brasil, a espécie Trichogramma pretiosum Riley está associada a diversos
hospedeiros e se destaca como parasitoide de maior frequência. É comumente
encontrada parasitando ovos de Heliothis virescens (Fabricius) (ZUCCHI et al.,
1989) e Alabama argillacea (Hübner) em algodoeiro (ALMElDA, 2000), Spodoptera
frugiperda (J. E. Smith) em milho (BESERRA & PARRA, 2003), Plutella xylostella
(Linneau) em repolho (PEREIRA et al., 2004) e Tuta absoluta (Meyrick) em tomateiro
(PRATISSOLI et al., 2005).
O fato de Trichogramma ser muito eficiente e fácil de criar em laboratório, permite
sua utilização em liberações inundativas. Outra característica que favorece a sua
utilização em programas de controle biológico é que várias espécies já foram
coletadas em diversos hospedeiros, pertencentes a mais de 70 famílias e 8 ordens
de insetos (HAJI et al., 2002; ZUCCHI & MONTEIRO, 1997; PARRA & ZUCCHI,
1997; HASSAN, 1993; PRATISSOLI, 1995).
Contudo, um dos fatores que pode ser responsável pelo sucesso ou fracasso da
utilização de parasitoides desse gênero é o conhecimento dos parâmetros biológicos
dos mesmos, quando associado a determinado hospedeiro alvo, tais como:
capacidade e viabilidade do parasitismo, duração do ciclo de desenvolvimento,
razão sexual e longevidade. Essas características podem ser altamente
influenciadas por fatores bióticos e abióticos (NOLDUS, 1989, HASSAN, 1997,
PRATISSOLI & PARRA, 2001).
20
Nesse sentido, alguns fatores bióticos devem ser considerados para que
parasitoides do gênero Trichogramma possam expressar sua potencialidade. Por
exemplo, a idade do hospedeiro é fator importante na aceitação do parasitoide, uma
vez que com avanços da idade dos ovos o valor nutricional dos mesmos é alterado,
o que pode modificar a taxa de parasitismo (MALACARNE, 2009). Como pode ser
comprovado em alguns estudos que verificaram o comportamento de T. pretiosum
em relação à fase embrionária de P. xylostella, em que o parasitismo foi reduzido
quando fêmeas de 48 horas foram expostas a ovos com dois ou três dias de idade
(PRATISSOLI et al., 2007). No entanto, Trichogramma exiguum (Hym.:
Trichogrammatidae) apresentou melhor porcentagem de parasitismo quando
parasitou ovos de P. xylostella com três dias de desenvolvimento embrionário
(POLANCZYK et al., 2007).
2.4. A bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria de ocorrência cosmopolita, sendo
encontrada em vários substratos como solo, água, superfície de plantas, restos
vegetais, insetos, pequenos mamíferos mortos, teias de aranha, grãos armazenados
e locais inabitados (BIZZARI & BISHOP, 2007; KONECKA et al., 2007; SWIECICKA
& DE VOS, 2003; GLARE & O’CALLAGHAM, 2000). É uma bactéria gram-positiva e
aeróbica, podendo facultativamente crescer em anaerobiose, na faixa de 10 a 40ºC.
A atividade entomopatogênica dessa bactéria se deve à presença de inclusões
proteicas cristalinas, com ação inseticida, que são sintetizados a partir da fase
estacionária e acumulados no compartimento da célula-mãe durante a esporulação,
podendo corresponder até 25% do peso seco das células. Esses cristais compostos
por proteínas denominadas endotoxinas ou proteínas cristais podem ser
visualizados por microscopia de contraste de fase (AGLAISSE & LERECLUS, 1995;
GLARE & O’CALLAGHAM, 2000; BRAVO et al., 2007). Uma das grandes vantagens
de sua utilização é sua inocuidade ao homem e animais domésticos, além de seu
efeito não poluente ao ambiente (ARANGO et al., 2002).
21
Entre as toxinas produzidas por B. thuringiensis, destacam-se as α-exotoxina, β-
exotina e δ-endotoxina. Esta última, também denominada proteína Cry, apresenta
ação extremamente tóxica para as fases imaturas de insetos de diversas ordens,
principalmente Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera, Hymenoptera, entre
outras (MONNERAT & BRAVO, 2000; GUTIÉRREZ & GONÇÁLVES, 2008).
Para que as proteínas Cry sejam efetivas, é necessário primeiramente que as larvas
dos insetos suscetíveis ingiram os esporos e cristais de Bt. Após a ingestão dos
esporos + cristais pelo inseto alvo, os cristais são solubilizados em pH alcalino,
originando as protoxinas, que em presença de enzimas digestivas (proteinases) são
convertidas em 4 ou mais polipeptídeos tóxicos (-endotoxinas). Essas toxinas
hidrolizadas cruzam a membrana peritrófica, ligam-se a receptores específicos
localizados na membrana apical das células colunares do intestino médio,
interferindo no gradiente iônico e balanço osmótico da membrana apical, formando
poros que aumentam a permeabilidade da membrana. O aumento na absorção de
água causa lise celular, eventual ruptura e desintegração das células do intestino
médio, e então se iniciam os sintomas: perda do apetite e o abandono do alimento,
paralisia do intestino, vômito, diarréia, paralisia total e finalmente a morte que pode
também ocorrer por inanição, uma vez que pouco tempo após a infecção o inseto
cessa a alimentação (HABIB & ANDRADE, 1998; COPPING & MENN, 2000).
Uma determinada cepa de Bt pode produzir um ou mais cristais e estes, por sua vez,
podem conter uma ou mais toxinas com peso molecular variado. Por exemplo,
Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 contém três Cry1 (130 kDa) e duas Cry2 (70
kDa), enquanto que Bacillus tenebrionis var. tenebrionis produz uma única toxina
com peso molecular de 67 KDa. A forma do cristal é determinada pelo número de -
endotoxinas presentes, e uma relação parcial entre composição da proteína e sua
estrutura molecular foi estabelecida por Glare & O’Callagham (2000) e Lereclus et al.
(1993).
Embora os produtos comerciais disponíveis restrinjam-se ao controle de lepidópteros,
dípteros e coleópteros, Glare & O’Callagham (2000) citam que mais de 1.000 espécies
de insetos, pertencentes a diversas ordens, são suscetíveis ao B. thuringiensis.
22
2.5. Interação Bacillus thuringiensis (Bt) – Trichogramma – insetos-
alvo
Uma das principais formas de incrementar a ação de agentes de controle biológico
de insetos-praga é a interação entre inimigos naturais, contudo, como qualquer tipo
de interação, os efeitos podem ser favoráveis ou não (HAFEZ et al., 1995; ALVES
1998; DEQUECH et al., 2005).
Pratissoli et al. (2006) e Polanczyk et al. (2006) estudaram o efeito de isolados de B.
thuringiensis sobre o parasitoide de ovos Trichogramma spp. Ambos os trabalhos
mostraram que Bt não afeta o parasitismo de Trichogramma pratissoli e T.
pretiosum. Mas alguns isolados afetaram a emergência da progênie de T. pratissoli.
Em ambos os estudos, foi utilizado como hospedeiro alternativo A. kuehniella. Esses
resultados sugerem a necessidade de estudos detalhados sobre a interação Bt e
Trichogramma spp.
Contudo a interação desses dois agentes de controle, Bt – Trichogramma é bastante
comum em programas de MIP, como na cultura do tomate no México, na Colômbia e
no Brasil (TRUMBLE & ALVARADO-RODRIGUEZ, 1993; HAJI et al., 2002). Embora
os efeitos prejudiciais dos bioinseticidas à base de Bt sobre os inimigos naturais
sejam mínimos e/ou significativamente menores que os dos agrotóxicos, eles não
podem ser desprezados e estudos são necessários em regiões nas quais essas
táticas são empregadas em conjunto ou tem potencial de uso (POLANCZYK et al.,
2006).
23
Tabela 1. Atividade de Bacillus thuringiensis (Bt) para Anticarsia gemmatalis, Helicoverpa zea,
Heliothis virescens e Spodoptera frugiperda (GLARE & O'CALLAGHAM, 2000)
Linhagem/Subespécie Bt
Noctuídeo suscetível
Bt aizawai e Bt kurstaki
Anticarsia gemmatalis, Helicoverpa zea, Heliothis
virescens e Spodoptera frugiperda
Bt alesti e Bt thuringiensis
H. zea, H. virescens e S. frugiperda
Bt darmstadiensis
H. virescens e S. frugiperda
Bt dendrolimus, Bt galleriae, Bt entomocidus e Bt
tenebrionis
H. virescens
Bt kenyae, Bt sotto, Bt oyamensis e Bt tolworthi
S. frugiperda
Tabela 2. Atividade de Bacillus thuringiensis (Bt) para Trichogramma spp. (GLARE &
O'CALLAGHAM, 2000)
Linhagem/Subespécie Bt
Trichogramma spp. suscetível
Bt dendrolimus
Trichogramma sp.
Bt kustaki
T. cacoeiciae e T. pretiosum
Bt thuringiensis
Trichogramma sp.
Linhagem/Subespécie Bt
Trichogramma spp. não suscetível
Bt dendrolimus
Trichogramma euproctidius, Trichogramma
evanescens e Trichogramma sp.
B t galleriae
Trichogramma cacoeciae pallida, Trichogramma
embryophagum, Trichogramma euproctidus, T.
evanescens e Trichogramma pallidum
Bt israelensis
T. evanescens
Bt kurstaki
Trichogramma cacoeciae,Trichogramma carverae,
T. embryophagum, T. evanescens, Trichogramma
exiguum,Trichogramma japonicum,Trichogramma
maidis,Trichogramma nubillale, T. pallidum,
Trichogramma platneri e Trichogramma pretiosum
Bt thuringiensis
T. cacoeciae, T. evanescens e T. pallidum
24
2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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32
3. CAPÍTULO 1
SELEÇÃO DE LINHAGENS DE Trichogramma pretiosum RILEY
(HYMENOPTERA: TRICHOGRAMMATIDAE) PARA O CONTROLE DE
Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
33
Seleção de linhagens de Trichogramma pretiosum Riley (Hymenoptera:
Trichogrammatidae) para o controle de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae)
RESUMO
A lagarta do cartucho, Spodoptera frugiperda, é considerada a principal praga do
milho no Brasil e o parasitoide de ovos do gênero Trichogramma Westwood vem
sendo estudado como uma forma de controle dessa praga, no Manejo Fitossanitario
de Pragas. Dessa forma, este trabalho foi realizado para avaliar as características
biológicas de 11 linhagens de Trichogramma pretiosum em ovos S. frugiperda, com
o objetivo de selecionar a linhagem com maior potencial para ser empregada no
manejo dessa praga. Os experimentos foram conduzidos em tubos de vidro de 8,5 x
2,5 cm, com 15 repetições. Para cada fêmea, foram oferecidos 20 ovos do
hospedeiro, permitindo um parasitismo por um período de 24h. As fêmeas de T.
pretiosum foram alimentadas com mel puro. Os parâmetros biológicos avaliados
foram: a porcentagem de parasitismo, a viabilidade, a razão sexual e o número de
indivíduos/ovo. Ocorreu uma grande variabilidade entre as 11 linhagens estudadas.
Considerando as características biológicas desejáveis, ou seja, melhor parasitismo,
maior viabilidade, predominância de fêmeas e indivíduo/ovo, a linhagem Tp 16
apresentou maior potencial para controle de S. frugiperda.
PALAVRAS-CHAVE. Controle biológico; lagarta-do-cartucho; parasitoide de ovos.
34
Selection of the most effective kind of Trichogramma pretiosum Riley
(Hymenoptera: Trichogrammatidae) to control the germination of Spodoptera
frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae)
ABSTRACT
The fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J. E. Smith), is considered the main corn
pest in Brazil and the egg parasitoid Trichogramma, has been studied in the
Integrated Management of Pests as a possible controlling pest. This project aims
to analyze the characteristics of 11 kinds of Trichogramma pretiosum Riley , in
order to select the one which best controls the germination of S. frugiperda eggs.
The experiments were carried out in 8,5 x 2,5 cm glasses tubes . The females were
fed with pure honey. Each female was offered 25 host eggs and it was allowed a 24-
hour-period of parasitism. Biological aspects, level of parasitism, the sex ratio and
the number of parasites/eggs were measured. Considering the biological
characteristics aimed, like better parasitism, higher amount found, female domination
and the number of parasites per egg, Tp 16 is the one which shows higher potential
to control S. frugiperda .
KEY WORDS: Biological control; fall armyworm; egg parasitoids.
35
3.1 INTRODUÇÃO
O cultivo do milho (Zea mays L.) ocorre praticamente em todo o mundo, atingindo
aproximadamente 777 milhões de toneladas (EMBRAPA MILHO E SORGO, 2007).
Dentre os fatores que afetam a produção, destacam-se os insetos-praga,
especialmente a lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda (J. E. Smith). Essa
praga ocorre durante todos os estádios de desenvolvimento da cultura, ataca o
cartucho e as folhas, podendo destruí-los completamente. Esta praga causa perdas
entre 20 e 40% na produtividade, sendo de difícil controle em função da sua grande
gama de hospedeiros e capacidade de dispersão durante o período de cultivo
(SILVA-WERNECK et al., 2000). As perdas causadas por esta lagarta no Brasil
podem causar um prejuízo de até 400 milhões de dólares por ano (CRUZ & TURPIN,
1982; GALLO et al., 2002).
Para contornar tais problemas, o controle dessa praga tem sido realizado através de
pulverizações com agrotóxicos. No entanto, má utilização destes produtos pode
acarretar prejuízo à entomofauna benéfica, além de favorecer o surgimento de
novas pragas ou ressurgência de outras. Uma alternativa é a adoção do controle
biológico, ao se adotar este método de controle, aproveita-se ao máximo o controle
natural já disponível, através da atuação dos parasitóides, predadores e
entomopatógenos (CORRÊA-FERREIRA, 2003).
Dentre os agentes utilizados no controle biológico da lagarta-do-cartucho, os
parasitoides do gênero Trichogramma Westwood, apresentam grande importância,
pois parasitam os ovos dessa praga e são facilmente multiplicados em laboratório
(CRUZ et al., 1999). A taxa de parasitismo natural de T. pretiosum e ovos da lagarta-
do-cartucho pode variar de 0,06 a 98%, sendo esses valores influenciados por
características de postura como camadas de ovos e presença de escamas (SÁ,
1991).
Contudo, um dos fatores que pode ser responsável pelo sucesso ou fracasso da
utilização de parasitoides do gênero Trichogramma no controle de lepidópteros-
praga é o conhecimento dos parâmetros biológicos dos mesmos, quando
36
associados a determinado hospedeiro alvo, tais como: capacidade e viabilidade do
parasitismo, duração do ciclo de desenvolvimento, razão sexual e longevidade.
Essas características podem ser altamente influenciadas por fatores bióticos e
abióticos (NOLDUS, 1989).
Dessa forma, este trabalho desenvolve estudos biológicos com diferentes linhagens
de T. pretiosum, visando selecionar aquela com melhores características biológicas,
para utilização em programas de manejo integrado de S. frugiperda.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Entomologia do Núcleo de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo Fitossanitário de Pragas e
Doenças (NUDEMAFI) do Centro de Ciências Agrárias.
Criação de S. frugiperda - A criação foi estabelecida em tubos de vidro (8,5 x 2,5
cm) contendo dieta artificial (BURTON & PERKINS, 1972), à 25ºC, 70% UR e 14h de
fotofase. Inicialmente, lagartas de 1º instar foram individualizadas nos tubos até a
fase de pupa. Posteriormente, foram retiradas e acondicionadas em gaiolas
cilíndricas de PVC (20 cm de diâmetro x 20 cm de altura) nas condições descritas
anteriormente até a emergência dos adultos. As gaiolas foram fechadas na parte
superior com tecido tipo “tule” e forradas internamente com papel, que serviu de
substrato para a oviposição. Os adultos foram alimentados com solução aquosa de
mel a 10%. As posturas foram retiradas diariamente para serem utilizadas nos
experimentos e para manutenção da criação.
Criação de Anagasta kuehniella - O hospedeiro alternativo (A. kuehniella) foi
criado em dieta à base de farinha de trigo integral (60%), milho (37%) e levedura de
cerveja (3%). Essa criação foi realizada em caixas plásticas (30x25x10cm) com fitas
de papelão corrugado (25x2cm) no seu interior e a dieta, previamente
homogeneizada, foi distribuída sobre as fitas e os ovos de A. kuehniella colocados
aleatoriamente na dieta. Os adultos foram coletados, diariamente, com aspirador de
37
pó adaptado e transferidos para tubos de PVC (150 mm de diâmetro por 25 cm de
altura) com tiras de tela de náilon, dobradas em zig-zag no seu interior para
oviposição.
Criação de Trichogramma pretiosum - As linhagens utilizadas no experimento
foram coletadas em diferentes regiões (Tabela 1). Para criação, foram utilizados
recipientes de vidro (14 x 7 cm), em cujas paredes internas foram colocadas
gotículas de mel para a alimentação dos adultos. Esses frascos foram fechados com
plástico filme de PVC, a fim de evitar a fuga dos parasitoides, e perfurados com
alfinete entomológico número 0 para a aeração dos frascos. Para a manutenção dos
parasitoides, foram oferecidos ovos do hospedeiro alternativo, A. kuehniella, colados
em retângulos de cartolina azul celeste (2,5 cm x 10 cm), com goma arábica e
inviabilizados pela exposição à lâmpada germicida, por um período de 45 minutos
(PARRA et al., 1989).
Seleção de T. pretiosum – Foram utilizadas 11 linhagens de T. pretiosum sobre
ovos de S. frugiperda, em câmara climatizada a 25±1ºC, umidade relativa de
70±10% e fotofase de 14h. Foram individualizadas 15 fêmeas recém-emergidas de
cada linhagem em tubos de vidro de 8,5 x 2,5 cm. Estes tubos foram fechados com
filme plástico de PVC para evitar a fuga dos parasitóides. Para alimentação das
fêmeas de T. pretisoum, foram oferecidas, gotículas de mel puro, na parede interna
dos tubos. Para cada fêmea, foram oferecidos 25 ovos do hospedeiro, com no
máximo 24h. O parasitismo foi permitido por um período de 24h.
Foram avaliados a porcentagem de parasitismo e emergência (viabilidade), a razão
sexual e o número de individuos/ovo. Utilizou-se delineamento experimental
inteiramente casualizado, constando de 11 tratamentos (linhagens) com 15
repetições, sendo os resultados submetidos à análise de variância. As médias foram
comparadas através do teste de Scott Knot, 5% de probabilidade. Os dados foram
transformados através de arc sen da √(x/100) para porcentagem de parasitismo e
porcentagem de emergência e arc sen da √(x + 0,5) para razão sexual e número de
indivíduos/ovo.
38
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A taxa de parasitismo das 11 linhagens de T. pretiosum quando criadas em ovos de
S. frugiperda, variou de 9,66 a 60,66% (Tabela 2). Os maiores valores foram
observados para as linhagens 16 e 13, que apresentaram 60,66 e 53,33% de
parasitismo, respectivamente (Tabela 2), sendo que essas diferiram
significativamente das demais. Valores de até 82% de parasitismo já foram
encontrados para T. pretiosum em ovos de S. frugiperda (BESERRA et al., 2003).
No entanto, o período de parasitismo foi de 48 horas, o que favoreceu para que o
índice de parasitismo fosse maior. As variações nas taxas de parasitismo podem ser
influenciadas por vários fatores, dentre os quais estão: hospedeiro, habitat,
condições climáticas e espécie e/ou linhagem do parasitóide (MOLINA & PARRA,
2006; ZAGO et al., 2007; PRATISSOLI et al., 2008). Cada espécie de parasitóide
pode apresentar características distintas quanto à capacidade de dispersão e ao
parasitismo do hospedeiro (ZACHRISSON & PARRA, 1998; PINTO et al., 2003).
A porcentagem de emergência (viabilidade) das linhagens de T. pretiosum criadas
em ovos de S. frugiperda variou de 53,06 a 97,80% (Tabela 2), sendo que apenas
as linhagens 1, 9, 11, 12 e 16 apresentaram valores satisfatórios, visto que, valores
acima de 85% de emergência são considerados como padrão de qualidade para a
criação desses inimigos naturais (ALMEIDA et al., 1998). Essa variação na
porcentagem de emergência para linhagens de T. pretiosum foi relatada por outros
pesquisadores em diferentes hospedeiros, encontrando na literatura valores de
emergência de 35,7 a 100% (PRATISSOLI & PARRA, 2001; BESERRA & PARRA,
2004; PRATISSOLI et al., 2004; MOLINA & PARRA, 2006; ANDRADE et al., 2009).
Alguns fatores podem estar relacionados com esta variação na emergência de
Trichogramma, tais como, a agressividade da espécie e/ou linhagem e a qualidade
nutricional e densidade de ovos do hospedeiro (PRATISSOLI et al., 2005).
Com relação à razão sexual, as linhagens 1, 12 e 13 de T. pretiosum criadas em
ovos de S. frugiperda apresentaram valores inferiores a 0,90, diferindo das demais
linhagens que apresentaram razão sexual com valores iguais ou próximos a 1,0
(Tabela 2). A ausência de machos verificada para essas linhagens de T. pretiosum
39
que apresentaram valores iguais ou próximos a 1, pode ser um fenômeno atribuído à
presença de microorganismos como Wolbachia que inibem o desenvolvimento de
machos (STOUTHAMER et al., 1993). Essa ausência de machos também pode
ocorrer, devido à criação por várias gerações em laboratório desses parasitoides,
que podem adquirir estabilidade genética, gerando apenas fêmeas (PEREIRA et al.,
2004). Os valores de razão sexual foram semelhantes aos obtidos por outros
autores para T. pretiosum criados em ovos de diferentes hospedeiros (PRATISSOLI
& PARRA, 2001; MOLINA & PARRA, 2006; ANDRADE et al., 2009; BUENO et al.,
2009).
Analisando a razão sexual em relação ao controle de pragas, observa-se que as
linhagens que obtiverem valores diferentes de 1 são as mais adequadas, pois taxa
igual a 1 significa ausência de machos na população. Porém, a presença de macho
em uma população é desejada para que haja reprodução sexuada, gerando
variabilidade genética e melhores condições de manutenção da população em
campo (MALACARNE, 2009). Entretanto, razão sexual abaixo de 0,5 não é aceita
uma vez que a maior concentração de macho interfere negativamente no controle de
praga (NAVARRO, 1998). Porém, no caso de liberações inundativas, é
recomendável o maior numero de fêmeas do que de machos, pois para o controle é
preciso que as fêmeas parasitem o maior numero de ovos possível.
O número de indivíduos por ovo das 11 linhagens de T. pretiosum variou de 1,0 a
2,0 (Tabela 2). O menor número de indivíduos por ovo do hospedeiro pode ser
vantajoso para o desenvolvimento de Trichogramma, já que mais nutrientes estarão
disponíveis para a sua assimilação e desenvolvimento, gerando, com isso,
indivíduos maiores e mais competitivos. Por outro lado, o aumento no número de
adultos por hospedeiro, além de poder diminuir a qualidade do indivíduo gerado,
poderá refletir na eficiência de controle, já que poderá resultar numa menor
quantidade de ovos parasitados (BESERRA et al., 2003).
Para S. frugiperda, o número de indivíduos por ovo variou de 1,1 a 1,5 indivíduos
por ovo (BESERRA et al., 2003), em Gymnandrosoma aurantianum Lima
(Lepidoptera, Tortricidae) foi de 1,3 a 1,8 indivíduos por ovo (MOLINA & PARRA,
2006) e em ovos de Pseudoplusia includens Walker (Lepidoptera: Noctuidae) foi de
40
1,0 a 1,2 (BUENO et al., 2009). O número de parasitoides por ovo pode variar em
função da linhagem e/ou espécie do parasitoide e do volume e qualidade do ovo do
hospedeiro em questão (BESERRA et al., 2003; MOLINA & PARRA, 2006;
ANDRADE et al., 2009; BUENO et al., 2009).
Com os resultados obtidos, observa-se que as 11 linhagens de T. pretiosum
apresentaram grande variabilidade em seu comportamento e isso pode estar
diretamente relacionado ao habitat de origem, à aceitação do hospedeiro, à cultura e
às condições climáticas (PRATISSOLI & OLIVEIRA, 1999, FARIA et al., 2000).
Tabela 1: Linhagens de T. pretiosum utilizadas na presente pesquisa, com os respectivos locais de
coleta, hospedeiros naturais e culturas.
Linhagen
Local de Coleta
Hospedeiros
Culturas
Tp 16
Farroupilha - RS
Helicoverpa zea
Tomate
Tp 13
Paraopeba
-
Tp 12
Teófilo Otoni – MG
-
Tomate
Tp 1
EAFA – Rive – Alegre – ES
Helicoverpa zea
Tomate
Tp 10
Cristalina – GO
Tricoplusia ni
Couve
Tp 9
Cristalina – GO
-
Tomate
Tp 15
Fazenda São José Jaciará – MT
-
Tp 11
Cristalina – GO
Anticarsia gemmatalis
Soja
Tp 14
Sítio N. S. Aparecida – Pedra Preta -MT
-
Tp 17
Rio Verde – GO
-
Tp 8
Afonso Cláudio – ES
Helicoverpa Zea
Tomate
41
Tabela 2 - Taxa de parasitismo, viabilidade, razão sexual e indivíduos/ovo de onze linhagens de T.
pretiosum em ovos de S.frugiperda. Temperatura de 25+1ºC, UR: 70+10% e fotofase de 14h.
Médias (± EP) seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem estatisticamente entre si, pelo teste
de Scott Knot, a 5% de probabilidade.
1
Dados transformados em arc sen de √(x/100)
2
Dados transformados em √(x+0,5)
3.4 CONCLUSÃO
A linhagem Tp16 foi a mais promissora para o controle de S. frugiperda.
Linhagens
Parasitismo
1
(%)
Viabilidade
1
(%)
Razão Sexual
2
Individuo/Ovo
2
Tp 16
60,66 ± 3,90 A
87,73 ± 4,33 A
0,92 ± 0,01 A
1,34 ± 0,15 A
Tp13
53,33 ± 4,82 A
69,73 ± 7,11 B
0,80 ± 0,05 B
1,13 ± 0,05 B
Tp 12
47,66 ± 4,44 B
81,66 ± 5,44 A
0,75 ± 0,06 C
2,00 ± 0,68 A
Tp 1
45,66 ± 5,80 B
84,53 ± 3,55 A
0,85 ± 0,03 B
1,40 ± 0,09 A
Tp 10
38,33 ± 5,24 B
53,06 ± 5,32 B
1,00 ± 0,00 A
1,00 ± 0,00 B
Tp 9
26,33 ± 4,45 C
81,33 ± 6,18 A
1,00 ± 0,00 A
1,00 ± 0,01 B
Tp 15
25,66 ± 3,48 C
63,28 ± 6,70 B
1,00 ± 0,00 A
1,00 ± 0,00 B
Tp 11
25,66 ± 4,60 C
97,80 ± 2,22 A
0,92 ± 0,02 A
1,06 ± 0,05 B
Tp 14
25,33 ± 2,78 C
71,00 ± 7,20 B
1,00 ± 0,00 A
1,06 ± 0,13 B
Tp 17
18,66 ± 2,86 C
63,66 ± 6,68 B
1,00 ± 0,00 A
1,13 ± 0,07 B
Tp 8
9,66 ± 1,33 D
72,73 ± 8,15 B
1,00 ± 0,00 A
1,00 ± 0,00 B
42
3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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50
4. CAPÍTULO 2
SUSCETIBILIDADE DE Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH) (LEPIDOPTERA:
NOCTUIDAE) A Bacillus thuringiensis BERLINER (BACILLACEAE)
51
Suscetibilidade de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera:
Noctuidae) a Bacillus thuringiensis Berliner (Bacillaceae)
RESUMO
Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) é uma das pragas mais importantes da cultura
do milho. Visando reduzir a utilização de inseticidas, têm-se buscado alternativas de
controle para esta praga, dentre as quais se destaca a utilização de Bacillus
thuringiensis. Contudo, o isolamento, a identificação e a seleção de isolados, são
etapas importantes e essenciais para inserir este patógeno no contexto do manejo
fitossanitário. Desse modo, este estudo avalia o efeito de B. thuringiensis sobre
lagartas de S. frugiperda. Foram utilizados 50 isolados de B. thuringiensis e o Dipel,
para verificar aqueles mais patogênicos a S. frugiperda a uma concentração de 3 x
10
8
esporos/mL
-1
.
Para os bioensaios, uma alíquota de 300 µL de suspensão foi
aplicada na superfície da dieta artificial. Foram distribuidas 5 lagartas de segundo
instar em 10 repetições de cada isolado e para a testemunha utilizou-se água
destilada estéril sobre a dieta. O isolados 676 e 984 se destacaram dentre os
demais causando uma mortalidade acima de 50%, sendo considerados os mais
virulentos e mais promissores para o controle dessa praga.
Palavras-chave: Controle biológico, Controle microbiano, entomopatógenos,
lagarta-do-cartucho.
52
Susceptibility of Spodoptera frugiperda (JE Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) to
Bacillus thuringiensis Berliner (Bacillaceae)
ABSTRACT
Spodoptera frugiperda (JE Smith) is one of the main corn pests . In order to reduce
the use of insecticides to control it, alternatives have been sought. Among the ones
achieved, the use of Bacillus thuringiensis stood out . B. thuringiensis is an
important pathogen that can be used to reduce the use of pesticides. Isolation,
identification and selection of individual pests are important and essential steps to
introduce this pathogen in the IPM context. Due to that, the purpose of this study
was to analyze the effects caused by B. thuringiensis on S. frugiperda. A group of
fifty isolated B. thuringiensis and Dipel were tested to check which one was more
pathogenic to a 3 x 10
8
spores/mL
-1
concentration of S.frugiperda. The isolated 676
and 984 stood out among the others resulting on a rate of mortality 50% higher. So,
they were considered the most effective in controlling this pest.
Keywords: Biological control, microbial control, entomopathogenic, fall armyworm
53
4.1. Introdução
O número de isolados de B. thuringiensis com alta atividade inseticida vem
crescendo, porém os produtos comerciais de bioinseticidas atualmente usados no
controle de pragas de lepidópteros são constituídos por poucos isolados, podendo
aumentar rapidamente a frequência de indivíduos resistentes em populações de
pragas a estes bioinseticidas (SWIECICKA et al., 2008).
A maioria dos bioinseticidas à base de B. thuringiensis, utilizados para o controle de
pragas, é constituída, na mistura, por esporos e cristais, produzidos pela estirpe HD-
1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki, pelo amplo espectro de ação larvicida para
lepidópteros (NAVON, 1993). Entretanto, é reduzido o número de toxinas de Bt que
possuem atividade tóxica para Spodoptera spp. (NAVON, 1993, LAMBERT et al.,
1996).
Entretanto, nove subespécies de B. thuringiensis (aizawai, alesti, colmeri,
darmstadiensis, kenyae, kurstaki, sotto, thuringiensis, tolworthi) foram relatadas por
Glare & O’ Callagham (2000) como patogênicas para S. frugiperda. No Brasil, as
pesquisas, inicialmente, determinaram que este entomopatógeno é pouco eficiente
no controle da referida praga (GARCIA et al., 1982; LIMA & ZANUNCIO, 1976).
Porém, devido à necessidade de métodos de controle menos agressivos ao meio
ambiente, de produtos com menores níveis de resíduos e a pouca eficiência dos
agroquímicos utilizados, as pesquisas se voltaram para a busca de novos isolados
desse patógeno para seu emprego no controle dessa praga, com as premissas do
Manejo Fitossanitário de Pragas (POLANCZYK, 2004).
Na fase de produção de bioinseticidas, a seleção de isolados virulentos é a mais
importante. Para isso são realizados bioensaios de patogenicidade com objetivo de
verificar se o patógeno tem efeito sobre o inseto-alvo, para determinar as curvas de
mortalidade e virulência, visando selecionar os isolados mais promissores
(POLANCZYK, 2004).
54
Nesse contexto, o objetivo deste trabalho, foi selecionar isolados com potencial de
controle para a S. frugiperda.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Entomologia, NUDEMAFI CCA-UFES,
em Alegre, ES.
Criação de Spodoptera frugiperda - A criação foi estabelecida em tubos de vidro
(8,5 x 2,5 cm) contendo dieta artificial (BURTON & PERKINS, 1972), a temperatura
de 25 ± 1ºC, 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 14h. Inicialmente, lagartas
de 2º instar foram individualizadas nos tubos até a fase de pupa. Até a emergência
dos adultos, as pupas foram retiradas e acondicionadas em gaiolas cilíndricas de
PVC (20 cm de diâmetro x 20 cm de altura) nas condições descritas anteriormente.
As gaiolas foram fechadas na parte superior com tecido tipo “tule” e forradas
internamente com papel, que serviu de substrato para a oviposição. Os adultos
foram alimentados com solução aquosa de mel a 10%. As posturas foram retiradas
diariamente para serem utilizadas nos experimentos e para manutenção da criação.
Obtenção e Multiplicação dos Isolados de Bacillus thuringiensis (Bt) - Foram
utilizados 50 isolados de Bt, selecionados aleatoriamente entre os 200 do Banco de
Entomopatógenos do laboratório de Entomologia do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal do Espírito Santo e Bt kurstaki (Dipel). Os isolados de Bt foram
multiplicados em meio de cultura BHI (Infusão de Cérebro e Coração) a 28º C, 250
rpm e 72 horas para o crescimento das colônias. Após esse processo, as colônias
foram transferidas para tubos Falcon com 20mL de água destilada e esterilizada e
centrifugados por 20 minutos por três vezes (5.000 rpm) para retirada do meio de
cultura e toxinas indesejáveis. Após a última centrifugação, o material de cada
isolado foi ressuspenso em água destilada estéril e a concentração foi ajustada para
3 x 10
8
esporos/mL
-1
com auxílio de câmara de Neubauer
®
e microscópio óptico. A
concentração de Dipel
®
PM (Btk) foi ajustada para 3 x 10
8
esporos/mL
-1
de acordo
especificação do fabricante.
55
Para os bioensaios, uma alíquota de 300 µL de suspensão de Bt na concentração de
3 x 10
8
esporos/mL
-1
foi aplicada na superfície da dieta artificial previamente
distribuída em pote de plástico, devidamente selecionados para o experimento. Após
a evaporação do excesso de umidade, 5 lagartas de segundo ínstar foram
distribuídas em 10 repetições de cada isolado, totalizando 50 lagartas por tratamento.
Para a testemunha foi realizado o mesmo procedimento, porém utilizando água
destilada estéril (ADE).
Foi utilizada câmara incubadora tipo Biological Oxigen Demand (B.O.D.), para
acondicionamento do material, à 25º C, 70% de UR e 14 horas de fotofase. Os
tratamentos foram avaliados diariamente até o 7º dia após a inoculação. O
experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado e os dados
foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott
Knot, a 5% de probabilidade, utilizando o programa SAEG (versão 5.0).
O critério de mortalidade usado para as lagartas foi o de imobilidade ou
escurecimento ou, ainda, aquelas que não conseguissem se locomover por uma
distância igual a do seu corpo.
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se um baixo percentual de mortalidade entre os 50 isolados testados,
apenas os isolados 676 e 984 causaram mortalidade acima de 50%, e os isolados
852F e 1024A superior a 30%, embora o 633 com 27% de mortalidade não tenha
diferido estatisticamente. Os demais isolados apresentaram mortalidade abaixo de
25%, inclusive o produto comercial Dipel com 11% de mortalidade (Tabela 1).
Segundo Aranda et al. (1996), as espécies do gênero Spodoptera tem reduzida
suscetibilidade à maioria das delta-endotoxinas produzidas por B. thuringiensis. De
acordo com Navon (1993), as espécies desse gênero não são sensíveis às
linhagens comerciais de B. thuringiensis kurstaki. No entanto, os isolados de B.
56
thuringiensis aizawai são considerados particularmente ativos contra lagartas de
Spodoptera spp. (BEEGLE & YAMAMOTO, 1992). Apesar das dificuldades para o
controle da S. frugiperda em milho, alguns trabalhos têm referido isolados de B.
thuringiensis com maior eficiência, como, por exemplo, Silva-Werneck et al. (2000)
estudaram o efeito de 205 isolados de Bt sobre esse lepidóptero e apenas um
causou mortalidade de 100%; Loguercio et al. (2001) testaram 3.408 isolados
nativos e somente 3,3% causaram mortalidade acima de 75%, sendo que 52% do
material testado mostrou-se pouco ativo (0 a 10%); Fatoretto (2002) avaliou a
eficiência de 115 isolados de Bt, de várias regiões do Brasil, contra S. frugiperda,
obtendo 100% de mortalidade para 25 destes (21,7%) e acima de 75% de
mortalidade para 31 isolados (26,9%). Por outro lado, 7,8% dos isolados testados
foram inócuos ao inseto.
O produto à base de Bt com maior alcance no mercado mundial é o Dipel (Bt
kurstaki HD-1). Esse produto, pouco tóxico para ácaros, coleópteros, dípteros e
hemípteros é altamente eficiente para 170 lepidópteros-praga (BEEGLE &
YAMAMOTO, 1992; GLARE & O’CALLAGHAM, 2000). Contudo neste trabalho, o
Dipel não apresentou mortalidade satisfatória, embora o esperado fosse que
obtivesse um resultado positivo já que este produto é eficiente para o controle de
lepidópteros-praga. Valicente & Fonseca (2004) também observaram mortalidade
entre 20 e 30% para o bioinseticida Dipel, em larvas de S. frugiperda.
Algumas toxinas de Bt podem ligar-se ao(s) receptor (es) dos insetos.Os receptores
estão de alguma forma envolvidos na fisiologia do inseto, como por exemplo, as
caderinas, são essenciais para a manutenção de solidez dos tecidos e também no
arranjamento e a rearrajamento celular que ocorre numerosas vezes, em tecidos
neurais e não neurais, durante o desenvolvimento embrionário do inseto (UEMURA,
1998; POLANCZYK, 2004).
No entanto, essa ligação pode não ser suficiente para causar a morte do inseto.
Aranda et al. (1996) realizaram estudo para verificar a interação entre as toxinas Cry
e as células epiteliais do intestino médio de S. frugiperda. Os autores observaram
que, embora as toxinas Cry 1Aa, Cry 1Ab, Cry 1Ac e Cry 2B se liguem aos
receptores, esta ligação não implica em toxicidade para o inseto. Nesses casos, a
57
ligação é estável e altamente específica, sendo suficiente para a formação do poro
no epitélio e consequente morte do inseto.
Embora a afinidade pelos receptores seja o principal fator que determine o nível de
suscetibilidade de uma espécie para as toxinas Cry, Forcada et al. (1996),
observaram que para Heliothis virescens, a ativação da protoxina pelas proteases é
o principal fator determinante para a eficiência do patógeno. Os autores verificaram
que as enzimas digestivas da população de insetos resistentes são capazes de
degradar as toxinas de tal modo que diminui significativamente a quantidade de
toxina ativa no lúmen do intestino médio em um determinado momento, reduzindo a
toxicidade.
Na etapa de seleção de isolados de Bt para S. frugiperda, assim como para outros
insetos, novo estudos são necessários para determinar as razões do sucesso ou
não dessa etapa. Por isso, é importante conhecer detalhadamente o inseto-alvo
seus hábitos, fisiologia e histologia, e qual é a resposta do inseto para presença
deste microrganismo (NAVON, 2000; POLANCZYK, 2004).
Dessa forma, somente os isolados 676 e 984 são considerados os mais promissores
para serem utilizados no controle da lagarta-do-cartucho, pois atingiram um nível de
mortalidade acima de 50%. Dessa forma, não foi possível realizar a CL50, pois para
isso, é necessário que a mortalidade seja acima de 80% (ALVES, 1998).
58
Tabela 1: Mortalidade de S. frugiperda por diferentes isolados de B. thuringiensis.
Trat
Mortalidade (%)
Trat
Mortalidade (%)
676
56,25 ± 5,76 A
531
14,00 ± 5,20 D
984
52,96 ± 5,31 A
1028
14,00 ± 4,26 D
1024A
36,17 ± 3,13 B
238
13,75 ± 3,67 D
853F
34,04 ± 4,90 B
977 FA
13,19 ± 4,40 D
633
27,08 ± 3,13 B
872 B
13,19 ± 4,40 D
273
25,07 ± 5,18 C
933 E
13,18 ± 4,28 D
105
24,56 ± 4,28 C
167
12,71 ± 3,81 D
1000
24,56 ± 5,23 C
886
12,27 ± 4,47 D
537
24,00 ± 4,00 C
1052 B
11,70 ± 4,59 D
716
23,19 ± 7,68 C
Dipel
11,70 ± 4,59 D
775C
23,19 ± 7,01 C
878 B
11,36 ± 4,63 D
1009
22,55 ± 4,82 C
868 G
10,90 ± 3,74 D
466
22,00 ± 4,66 C
766 B
10,90 ± 3,74 D
725
20,69 ± 4,59 C
816 A
9,90 ± 4,03 D
1077
20,69 ± 4,59 C
100
9,16 ± 5,06 D
862
20,42 ± 5,58 C
927 R
9,09 ± 4,03 D
1005
19,78 ± 3,82 C
926
8,72 ± 4,78 D
775G
19,78 ± 3,82 C
1044-CV-N
8,18 ± 4,13 D
275 G
18,29 ± 4,30 C
637
8,00 ± 3,23 D
1054
18,00 ± 4,66 C
478
8,00 ± 3,26 D
997
16,66 ± 4,00 D
1115
6,66 ± 2,77 D
101
16,00 ± 4,00 D
80
6,59 ± 3,81 D
467
16,00 ± 4,00 D
108
5,00 ± 2,59 D
941 D
14,46 ± 5,87 D
927 R
4,35 ± 2,00 D
287
14,00 ± 5,00 D
985
3,18 ± 3,20 D
1077 A
14,00 ± 4,80 D
Testemunha
0,05 ± 0,01 E
*Médias seguidas de uma mesma letra não diferem estatisticamente (Teste Scott-Knott)
4.4 CONCLUSÃO
Entre os 50 isolados testados, dois (676 e 984) causaram mortalidade superior a
50% em S. frugiperda.
59
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62
5. CAPÍTULO 3
INTERAÇÃO ENTRE Trichogramma pretiosum RILEY (HYMENOPTERA:
TRICHOGRAMMATIDAE) E Bacillus thuringiensis BERLINER PARA O
CONTROLE DE Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH)
63
Interação entre Trichogramma pretiosum Riley e Bacillus thuringiensis Berliner
para o controle biológico de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)
RESUMO
Estudou-se o efeito da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis Berliner (Bt)
sobre fêmeas de Trichogramma pretiosum Riley, e ovos de Spodoptera frugiperda
(J.E. Smith). O experimento foi dividido em duas etapas: primeiramente, os isolados
de Bt, 676 e 984, pré-selecionados foram misturados em gotícula de mel (1:1), como
fonte de alimento para o parasitoide e mel puro para a testemunha. Na segunda
parte, foram oferecidos cartelas com 25 ovos do hospedeiro imersas nos respectivos
isolados, sendo que na testemunha, a cartela foi imersa em água, para o
parasitismo. Utilizou-se 20 repetições por tratamento. Foram avaliados os
parasitismos diários, totais e acumulados; sobrevivência; emergência e razão sexual
da progênie. Os tratamentos não afetaram a viabilidade, razão sexual e a
longevidade, alterando apenas o parasitismo do Trichogramma. Porém, quando as
cartelas foram imersas nos isolados Bt os resultados foram satisfatórios, e o isolado
676 se destacou apresentando melhor parasitismo. Este trabalho enfatiza a interação
entre linhagens de Trichogramma spp, isolados de Bacillus thuringiensis e insetos-praga
em sistemas de Manejo Integrado de Pragas.
Palavras-chave: controle biológico, parasitoide de ovos, interação.
64
Interaction among Trichogramma pretiosum and Bacillus thuringiensis for
Spodoptera frugiperda biological control
ABSTRACT
This project studied the effects the bacteriaBacillus thuringiensis (Bt) has on
Trichogramma pretiosum females and Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) eggs. The
experiment done was divided into two parts: in the first part isolated Bts, 676 and
984, were mixed with honey (1:1), to feed the parasitoid. In the second one, cards
with 25 host eggs immersed in the isolates were offered , but in the other the card
was immersed in water, this way the parasitism would be able to happen. Total and
accumulated parasitism, survival, emergency and progeny sexual ratio were
analyzed every day. The treatments did not affect the viability, sex ratio and
longevity. Parasitism was affected when Trichogramma was fed with honey+Bt. The
expected results were observed when the cards were immersed in the Bt isolates,
and the isolate 676 was detached obtaining a better parasitism. This project
emphasizes the interaction among Trichogramma spp, isolated Bacillus thuringiensis
and insect pests in the Integrated Management of Pests system.
Key words: Biological control, egg parasitoid, interaction.
65
5.1 INTRODUÇÃO
A atividade agrícola tem se intensificado ao longo do tempo e tem provocado um
desequilíbrio ecológico, fazendo-se necessária a utilização de produtos seletivos que
não afetem o equilíbrio entre as pragas e seus predadores, parasitoides e patógenos
responsáveis por boa parte do controle biológico, já que eles mantém as pragas em
níveis populacionais aceitáveis (DENT, 2000).
De forma a reverter esse quadro, preconiza-se o desenvolvimento de programas de
Manejo Integrado de Pragas, definido como um sistema de decisão para uso de
táticas de controle, isoladamente ou associadas harmoniosamente, em uma
estratégia de manejo baseada em análises de custo/benefício que levam em conta o
interesse e/ou impacto nos produtores, sociedade e ambiente (KOGAN, 1998). Entre
as táticas de controle disponíveis para esses sistemas de manejo, estão os
entomopatógenos e os insetos parasitoides, que em conjunto englobam os
diferentes segmentos do controle biológico de pragas (POLANCZYK et al. 2006,
PRATISSOLI et al. 2006, SANTOS JUNIOR, 2009).
Entre os entomopatógenos, Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) destaca-se como a
bactéria mais utilizada e estudada no controle de insetos e responsável por 90% do
mercado mundial de bioinseticidas. Sua alta especificidade e seletividade favorecem
a preservação do meio ambiente e é considerada uma excelente alternativa para o
agricultor, visando ao controle de insetos-praga (GLARE & O’CALLAGHAM, 2000).
Apesar de favorecerem a preservação do meio ambiente, generalizações, nesses
aspectos são difíceis, devido ao grande número de isolados existentes (mais de
60.000) e cada caso deve ser analisado separadamente (GLARE & O’CALLAGHAM,
2000).
Com relação a parasitoides, espécies de Trichogramma Westwood (Hymenoptera,
Trichogrammatidae) são, as mais estudadas e utilizadas em todo o mundo, pela sua
eficiência, facilidade de criação em laboratório e ao fato de que diversas espécies de
Trichogramma já foram coletadas em mais de 200 hospedeiros, pertencentes a mais
de 70 famílias e oito ordens de insetos (HASSAN 1993, ZUCCHI & MONTEIRO
66
1997). Com relação ao Brasil, sua importância é relevante devido ao potencial de
controle de pragas em diversas culturas (PINTO, 1997). Em todo o mundo, 28
espécies de Trichogramma são liberadas em plantações (HASSAN, 1988).
A interação desses dois agentes de controle é bastante comum em programas de
MIP, como na cultura do tomate no México, na Colômbia e no Brasil (TRUMBLE e
ALVARADO-RODRIGUEZ, 1993; HAJI et al., 2002). Embora os efeitos prejudiciais
dos bioinseticidas à base de Bt sobre os inimigos naturais sejam mínimos e/ou
significativamente menores que os dos agrotóxicos, eles não podem ser
desprezados e estudos são necessários em regiões nas quais essas táticas são
empregadas em conjunto ou tem potencial de uso (GLARE & O’CALLAGHAM,
2000).
Vários aspectos podem ser analisados a partir do estudo das interações resultantes
entre parasitoides e patógenos. Dentre eles podem ser citados: suscetibilidade a
bactérias por lagartas parasitadas (NEALIS & VAN FRANKENHUYZEN 1990),
possibilidade de transmissão do patógeno no momento da postura de ovos (BELL et
al. 1974), influência do patógeno na biologia do parasitoide (AHMAD et al. 1978,
SALAMA et al. 1982), influência do patógeno na biologia do hospedeiro (WESELOH
et al. 1983) e habilidade do parasitoide em distinguir entre lagartas do hospedeiro
infectadas ou não (LÓPEZ & FERRO 1995, ULPAH & KOK 1996).
Com isso, este trabalho avalia os efeitos de diferentes isolados de Bt, sobre a
linhagem Tp 16 de Trichogramma pretiosum Riley em ovos de S. frugiperda.
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Entomologia do Núcleo de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo Fitossanitário de Pragas e
Doenças (NUDEMAFI), do Centro de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade
Federal do Espírito Santo (CCA-UFES), em Alegre, ES.
67
Criação de Trichogramma pretiosum. Para a criação da linhagem selecionada,
foram utilizados recipientes de vidro (14 x 7 cm), em cujas paredes internas foram
colocadas gotículas de mel para a alimentação dos adultos. Esses frascos foram
fechados com plástico filme de PVC, a fim de evitar a fuga dos parasitoides, e
perfurados com alfinete entomológico número 0 para a aeração dos frascos. Para a
manutenção dos parasitoides, foram oferecidos ovos do hospedeiro alternativo, A.
kuehniella (Zeller), colados em retângulos de cartolina azul celeste (2,5 cm x 10 cm),
com goma arábica e inviabilizados pela exposição à lâmpada germicida, por um
período de 45 minutos (PARRA et al., 1989).
Criação de Spodoptera frugiperda - A criação foi estabelecida em tubos de vidro
(8,5 x 2,5 cm) contendo dieta artificial (BURTON e PERKINS, 1972), temperatura de
25 ± 1ºC, 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 14h. Inicialmente, lagartas de
2º instar foram individualizadas nos tubos até a fase de pupa. Posteriormente, foram
retiradas e acondicionadas em gaiolas cilíndricas de PVC (20 cm de diâmetro x 20
cm de altura) nas condições descritas anteriormente até a emergência dos adultos.
As gaiolas foram fechadas na parte superior com tecido tipo “tule” e forradas
internamente com papel, que serviu de substrato para a oviposição. Os adultos
foram alimentados com solução aquosa de mel a 10%. As posturas foram retiradas
diariamente para serem utilizadas nos experimentos e para manutenção da criação.
Obtenção e Multiplicação dos Isolados de B. thuringiensis (Bt) - Os isolados de
Bt foram multiplicados em meio de cultura BHI (Infusão de Cérebro e Coração) a 28º
C, 250 rpm e 72 horas para o crescimento das colônias. Após esse processo, as
colônias foram transferidas para tubos Falcon com 20mL de água destilada e
esterilizada e centrifugados por 20 minutos por três vezes (5.000 rpm) para retirada
do meio de cultura e toxinas indesejáveis. Após a última centrifugação, o material de
cada isolado foi ressuspenso em água destilada estéril e a concentração foi ajustada
para 3 x 10
8
esporos/mL
-1
com auxílio de câmara de Neubauer
e microscópio óptico.
Experimento 1 (Mel com Bt p/ alimentação do parasitoide): Para cada isolado de
Bt analisado, assim como para a testemunha foram individualizadas 20 fêmeas recém
emergidas do parasitoide, em tubos de Duran, contendo uma gotícula de mel
68
inoculado com diferentes isolados de Bt, 676 e 984, em suas paredes (proporção
1:1), sendo cada fêmea considerada uma repetição. A cada 24 horas, foi oferecida
para cada fêmea uma cartela de cartolina azul celeste (2,5 x 0,5cm) contendo 25
ovos do hospedeiro colados com goma arábica a 10%. Os tubos foram
posteriormente fechados com plástico filme de PVC. Para a testemunha foi oferecida
gotícula de mel sem Bt.
Experimento 2 (cartela mergulhada no Bt): Para cada isolado de Bt analisado
foram individualizadas 20 fêmeas recém emergidas do parasitoide, em tubos de
Duran, contendo uma gotícula de mel puro a 10%, em suas paredes para alimentação
do inimigo natural. A cada 24 horas, foi oferecida para cada fêmea uma cartela de
cartolina azul celeste (2,5 x 0,5cm) contendo 25 ovos do hospedeiro colados com
goma arábica a 10%. A cartela foi imersa em suspensão contendo 3 x 10
8
esporos/mL de Bt e seca em capela de fluxo para retirar o excesso de água. Os tubos
foram posteriormente fechados com plástico filme de PVC. Para a testemunha foi
oferecida cartela com ovos do hospedeiro sem Bt.
Os experimentos foram mantidos em câmaras climatizadas reguladas, até a
emergência dos descendentes, quando foram avaliados o parasitismo diário,
acumulado e total e a longevidade dos indivíduos.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, sendo os
resultados, submetidos à análise de variância, e as médias comparadas pelo teste
de Tukey, a 5% de probabilidade. A sobrevivência foi comparada pelo método de
distribuição de Weibull (SGRILLO, 1982).
69
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O parasitismo diário de T. pretiosum em ovos de S. frugiperda sofreu alterações
devido à presença do Bt no alimento, conforme pode ser observado pela tendência
das linhas em todos os tratamentos (Figura 1). Nos tratamentos cujas cartelas com
ovos do hospedeiro foram mergulhadas em Bt, constatou-se que o parasitismo foi
abaixo de 12 ovos parasitados por dia. Já nos tratamentos com Bt adicionado ao
mel, é possível verificar que o parasitismo diário apresentou valores de 10 e 5 ovos
parasitados por dia para os isolados 676 e 984, respectivamente. O tratamento
testemunha alimentado somente com mel foi o que apresentou o maior resultado de
parasitismo com 15 ovos parasitados por fêmea, indicando que o Bt influenciou o
parasitóide. Como observado na Figura 1, houve uma maior concentração de
postura do parasitoide nos primeiros dias. A partir do terceiro dia ocorreu queda no
parasitismo com algumas oscilações ao decorrer do período (Figura 1). Esta
tendência é reforçada pela Tabela 1, que mostra a diferença estatística entre os
isolados de Bt com número total de ovos parasitados por T. pretiosum tratados com
B. thuringiensis. Quando alimentado com mel + Bt, apresentou diferença estatística
entre os isolados comparados à testemunha. Para os isolados em que a cartela foi
mergulhada no Bt, o número total de ovos parasitados não diferiram estatisticamente
entre si (Tabela 1).
O parasitismo foi afetado quando os parasitoides foram alimentados com mel + Bt,
apresentando número total de ovos de 18,70 e 35,15 ovos parasitados por fêmea,
nos isolados 984 e 676, respectivamente (Tabela 1). O número total de ovos
parasitados foi maior para a testemunha, que diferiu dos demais com 55,30 ovos
parasitados por fêmea (Tabela 1).
A queda do parasitismo em T. pretiosum é uma característica dessa espécie, pois
esse parasitoide concentra as posturas nos primeiros dias de vida (PRATISSOLI,
1995; POLANCZYK et al., 2006). Diferentemente dos resultados deste estudo,
Polanczyk et al., (2006), estudando a interação entre os inimigos naturais, Bt e
Trichogramma, observaram que os isolados de Bt testados e a espécie de Bt
kurstaki não apresentaram efeitos negativos que possam reduzir o percentual de
parasitismo de Trichogramma pratissolii e T. pretiosum, quando fornecidos como
suplemento alimentar para os parasitoides. Carvalho et al. (2001) verificaram em sua
70
pesquisa que o Bt não influenciou o parasitismo de T. pretiosum quando aplicado
sobre os ovos de A. kuehniella.
O parasitismo acumulado de T. pretiosum em ovos de S. frugiperda alcançou o
índice de 80% em torno do sexto dia nos tratamentos 676 Bt, 676 mel + Bt e na
testemunha alimentada apenas com mel, sétimo dia para o tratamento testemunha
mergulhada em água, oitavo dia para o tratamento 984 Bt e no nono dia para o
tratamento 984 mel + Bt (Figura 1). Alguns autores, relatando sobre a interação de
Bt e Trichogramma, obtiveram resultados diferentes aos obtidos neste trabalho.
Pratissoli et al. (2006) mostraram que o Bt fornecido como suplemento alimentar
para T. pratissoli em ovos de A. kuehniella não afetou o parasitismo. Contudo, esses
autores verificaram uma aceleração do parasitismo do parasitoide estudado
sugerindo que sob algum tipo de pressão externa, como o Bt, o parasitoide tende a
parasitar o mais rápido possível para garantir a sobrevivência de sua prole. Neste
trabalho esta aceleração não ocorreu. Santos Junior (2009), por sua vez, observou
que Bt oferecido na alimentação a T. pretiosum em ovos de Helicoverpa zea não foi
prejudicial ao desenvolvimento do Trichogramma.
O processo de parasitismo consiste em uma série de estágios interconectados
(VINSON, 1976). Uma vez que o hospedeiro é encontrado, ele poderá ser
inspecionado para que se avalie sua identidade, condição e disponibilidade no que
se refere ao local de oviposição. Baseado em dicas sensoriais adquiridas antes ou
durante o contato, o parasitoide determina a aceitabilidade do hospedeiro. Antes de
tentar ovipositar em um hospedeiro potencial, a fêmea de Trichogramma caminha
para trás e para frente sobre o hospedeiro, enquanto o toca continuamente com sua
antena. Se o hospedeiro for aceito, o parasitoide assume uma postura de perfuração
e começa a aprofundar o córion do hospedeiro com seu ovipositor. Se o hospedeiro
é rejeitado o ovipositor é retirado antes da deposição no ovo do hospedeiro
(WAJNBERG & HASSAN, 1994).
As características físico-químicas é outro fator que pode afetar a aceitação e
adaptação das espécies e/ou linhagens, o que interferiria nas características
biológicas, e na sua agressividade, comprometendo a qualidade do parasitóide
produzido e sua eficiência a nível de campo (BIGLER, 1994; MONJE et al., 1999),
71
características intrínsecas do ovo, como a qualidade nutricional, pode ter sido o
principal fator no processo de aceitação do hospedeiro (SHIPP et al., 1998;
PRATISSOLI E PARRA, 2000; 2001).
Tabela 1. Número de total de ovos de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae)
parasitados por Trichogramma pretiosum (Hymenoptera, Trichogrammatidae) tratados com
Bacillus thuringiensis.
PARASITISMO
24 horas
72 horas
Total
TRAT
MEL
CARTELA
MEL
CARTELA
MEL
CARTELA
Test
14,90 ± 1,17 A
5,90 ± 0,91 B
37,10 ± 2,43 A
15,30 ± 1,69 B
55,30 ± 4,77 A
31,20 ± 4,20 A
676
10,10 ± 1,11 B
11,00 ± 1,15 A
27,75 ± 3,03 A
26,15 ± 3,00 A
35,15 ± 4,23 B
32,85 ± 4,18 A
984
4,75 ± 0,65 C
8,31 ± 1,20 A
8,53 ± 0,90 B
18,36 ± 2,00 B
18,70 ± 3,03 B
30,35 ± 3,93 A
72
Figura 1 – Parasitismo diário e acumulado de Trichogramma pretiosum
(Hymenoptera, Trichogrammatidae) em ovos de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera,
Noctuidae) tratados com diferentes isolados de Bacillus thuringiensis.
A longevidade em todos os tratamentos mostrou a mesma tendência, pois a
sobrevivência seguiu uma distribuição normal não sendo observada queda
acentuada como mostra a distribuição de Weibull (Figura 2). Pratissoli et al. (2006)
obtiveram resultados semelhantes para T. pratissoli.
Test Bt
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Parasitismo diário
0
5
10
15
20
25
Parasitismo acumulado (%)
0
20
40
60
80
100
Par. diário
Par. acumulado
Test M
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Parasitismo diário
0
5
10
15
20
25
Parasitismo acumulado (%)
0
20
40
60
80
100
Par. diário
Par. acumulado
676 Bt
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10
Parasitismo diário
0
5
10
15
20
25
Parasitismo acumulado (%)
0
20
40
60
80
100
Par. diário
Par. acumulado
676 M
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10
Parasitismo diário
0
5
10
15
20
25
Parasitismo acumulado (%)
0
20
40
60
80
100
Par. diário
Par. acumulado
984 Bt
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Parasitismo diário
0
5
10
15
20
25
Parasitismo acumulado (%)
0
20
40
60
80
100
Par. diário
Par. acumulado
984 M
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Parasitismo diário
0
5
10
15
20
25
Parasitismo acumulado (%)
0
20
40
60
80
100
Par. diário
Par. acumulado
73
A emergência dos parasitoides foi afetada pelos isolados 676 e 984 quando
acrescidos ao alimento, pois nos dois casos, inicialmente, a emergência ficou abaixo
de 85%, número considerado ideal por NAVARRO (1998), diferindo da testemunha
que obteve sua viabilidade em torno de 89,88% (Tabela 3). Os ovos do hospedeiro
tratados com o isolado 984, quando parasitados pelo Trichogramma apresentaram
maior percentagem de emergência em relação à testemunha e ao isolado 676. De
acordo com Pratissoli (2006), os tratamentos não afetaram o parasitismo, razão
sexual e a longevidade, porém em alguns tratamentos foi observado efeito indireto
sobre a emergência da progênie, o que implicaria a necessidade de mais liberações
massais do parasitoide para alcançar resultados positivos.
Os valores da razão sexual (Tabela 3), não foram significativos entre os isolados e
nem nos diferentes métodos de inoculação, obtendo valores acima de 0,90, sendo
superiores aos valores encontrados por Beserra et al., (2006), de 0,71 a 0,84 para T.
pretiosum em ovos de S. frugiperda, porém sem interferência do Bt, enfatizando que
o Bt não teve interferência nenhuma no parâmetro da razão sexual.
Outro parâmetro avaliado, que obteve resultados positivos, foi o número de
indivíduos/ovo que não apresentou diferença significativa em ambos os aspectos,
com valores entre 1,03 e 1,05 (Tabela 3), resultados considerados satisfatórios, pois
o aumento no número de adultos por hospedeiro, além de poder diminuir a
qualidade do indivíduo gerado, poderá refletir na eficiência de controle, já que
poderá resultar numa menor quantidade de ovos parasitados (BESERRA et al.,
2003).
Glare & O´Callagham (2000) afirmam que a presença da bactéria no trato digestivo
de insetos adultos, não implica no desenvolvimento da doença, pois são
necessários receptores para que ocorra a ligação da toxina com as células epiteliais
do intestino médio. Esses receptores são normalmente encontrados no intestino
médio das formas imaturas. Fazendo-se necessário assim um estudo mais
detalhado desses isolados, quanto a sua interação com Trichogramma pretiosum.
74
Tabela 2. Emergência (%), razão sexual e numero de indivíduos/ovo de Trichogramma
pretiosum em ovos de S. frugiperda, tratados com Bt. Temperatura de 25+1ºC, UR: 70+10%
e fotofase de 14h.
Viabilidade
Razão Sexual*
Ind/Ovo*
TRAT
MEL
CARTELA
MEL
CARTELA
MEL
CARTELA
Test
89,88 ± 3,83 A
74,85 ± 8,73 B
0,97 ± 0,01
0,97 ± 0,01
1,03 ± 0,01
1,05 ± 0,02
676
59,11 ± 7,04 B
66,88 ± 6,01 B
0,90 ± 0,00
0,99 ± 0,00
1,03 ± 0,01
1,04 ± 0,02
984
61,86 ± 5,24 B
87,16 ± 3,18 A
0,98 ± 0,01
0,98 ± 0,01
1,05 ± 0,02
1,03 ± 0,01
Médias (± EP) seguidas de mesma letra maiúscula na coluna, não diferem entre si pelo Teste de
Tukey, a 5%de probabilidade.
* Não há diferença estatística.
75
Figura 2 - Sobrevivência de Trichogramma pretiosum (Hymenoptera
Trichogrammatidae), alimentado com mel e diferentes isolados de Bt.
Test M
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Sobrevivência (%)
0
20
40
60
80
100
Sobrev. observada
Sobrev. estimada
R2 = 0,99
P < 0,0001
Test Bt
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Sobreviventes (%)
0
20
40
60
80
100
Observados
Estimados
676 M
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12
Sobrevivência (%)
0
20
40
60
80
100
Sobrev. observada
Sobrev. estimada
R2 = 0,98
P < 0,0001
676 Bt
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12
Sobrevivência (%)
0
20
40
60
80
100
Sobrev. observada
Sobrev. estimada
R2 = 0,99
P < 0,0001
984 M
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Sobrevivência (%)
0
20
40
60
80
100
Sobrev. observada
Sobrv. estimada
R2 = 0,99
P < 0,0001
984 Bt
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 10 12 14
Sobrevivência (%)
0
20
40
60
80
100
Sobrev. observada
Sobrev. estimada
R2 = 0,98
P < 0,0001
76
5.4 CONCLUSÃO
Os isolados de Bt testados, quando os ovos foram imersos em suspensão com Bt,
não têm efeitos negativos e foi observado aumento do parasitismo com o isolado
676.
Ambos os tratamentos causaram redução no parasitismo, quando os isolados de Bt
foram fornecidos via alimento para o Trichogramma.
77
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