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YOUSSEF BACILA SADE
Clonagem, expressão e purificação de uma proteína da superfamília TCTP
(Translationally Controlled Tumor Protein) a partir de biblioteca de cDNA da
glândula produtora de veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)
CURITIBA
2009
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YOUSSEF BACILA SADE
Clonagem, expressão e purificação de uma proteína da superfamília TCTP
(Translationally Controlled Tumor Protein) a partir de biblioteca de cDNA da
glândula produtora de veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)
Dissertação apresentada como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre em Biologia
Celular e Molecular, Programa de Pós-Graduação
do Departamento de Biologia Celular, Setor de
Ciências Biológicas da Universidade Federal do
Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga
Co-orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Andrea Senff-Ribeiro
CURITIBA
2009
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Sade, Youssef Bacila
Clonagem, expressão e purificação de uma proteína da superfamília TCTP
(Translationally Controlled Tumor Protein) a partir de biblioteca de cDNA da
glândula produtora de veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia) –
Curitiba, 2009. 90 p.
Dissertação (Mestrado) – Programa de pós-graduação em Biologia Celular e
Molecular, Departamento de Biologia Celular, Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná.
1. TCTP 2. Fator de Liberação de Histamina 3. Aranha-marrom 4. Loxosceles
intermedia 5. Veneno
À minha mãe, que dedicou sua vida aos
filhos e possibilitou a minha formação. Espero
que estas palavras possam retribuir ao menos
uma fração do amor incondicional que você
sempre demonstrou por mim.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga, pela oportunidade
oferecida para trabalhar com o grupo do Laboratório de Matriz Extracelular e
Biotecnologia de Venenos e pelos mais de seis anos de convívio, amizade e
aprendizado.
À minha co-orientadora Prof
a
. Dr
a
. Andrea Senff-Ribeiro, pela influência
determinante que teve no início da minha carreira científica e pelo exemplo de
profissionalismo. O seu trabalho de doutorado foi a primeira defesa de tese que
assisti e o que tenho até hoje como um exemplo a ser seguido.
Ao Prof. Dr. Waldemiro Gremski, pelo exemplo de dedicação de uma vida à
ciência e por todos seus esforços a favor do Programa de Pós-Graduação em
Biologia Celular e Molecular da UFPR.
À Prof. Dr. Olga Meiri Chaim, minha grande amiga e verdadeira orientadora
da minha vida profissional e pessoal. Muito obrigado por todos os anos de
aprendizado ao seu lado.
Ao Prof. Dr. Silvio Marques Zanata, pela grande amizade e por ser uma fonte
inesgotável de cultura.
À Prof. Dr. Marcia Helena Appel, amiga e um grande exemplo profissional e
pessoal. Muito obrigado por todos os conselhos ao longo destes anos.
Ao Prof. Dr. Rafael Bertoni da Silveira, pelo auxílio essencial e pela dedicação
de anos ao Laboratório de Matriz Extracelular que permitiu a concretização de
muitos projetos do grupo.
Aos colegas do IBMP, pelo acolhimento com que sempre acolheram todos de
nosso laboratório e pelo exemplo de profissionalismo. Em especial ao Prof. Dr.
Stenio Perdigão Fragoso, elo exemplo de profissionalismo e competência e por
aceitar fazer parte da banca de avaliação deste trabalho.
A todos os professores do Departamento de Biologia Celular da UFPR, em
especial à Prof. Dr. Maria Cristina Leme Godoy dos Santos, por ter acompanhado
todo o meu trabalho desde o projeto, passando pelos relatórios, e por aceitar fazer
parte da banca de avaliação deste trabalho. Obrigado pelos inúmeros conselhos
profissionais nas aulas e avaliações, ao menos um deles foi determinante em minha
vida pessoal.
A todos os professores do Departamento de Patologia Básica da UFPR, em
especial à Prof
a
. Dr
a
. Larissa Magalhães Alvarenga pela colaboração com os
trabalhos do Laboratório de Matriz Extracelular, contribuição ao estudo de toxinas e
por aceitar fazer parte da banca de avaliação deste trabalho. Obrigado também à
Prof
a
. Dr
a
. Juliana Ferreira Moura pelos trabalhos desenvolvidos em conjunto com o
grupo do laboratório.
À Luiza Helena Gremski, por sua amizade, paciência, auxílio técnico e
intelectual. Também pelo exemplo pessoal e profissional.
À Dilza Trevisan Silva, pela amizade incondicional e pelo companheirismo no
laboratório durante todos estes anos. Você é um exemplo de dedicação à ciência,
família e amigos.
À Daniele Moreira Chaves, pela amizade e exemplo de superação pessoal e
profissional.
À Valéria Pereira Ferrer, pela amizade, alegria e exemplo de força de
vontade.
Aos amigos do Laboratório de Matriz Extracelular: Kátia, Jenifer, Fernando
Hitomi, Thiago, Fernanda, Isabela, Mariana e Gabriel. Muito obrigado pela amizade
e por todos os momentos que dividimos no laboratório. Cada um de vocês tem uma
parcela nesse trabalho, seja por sugestões, por trabalho físico ou mesmo por uma
palavra de apoio. Obrigado.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Neurobiologia, pelo auxílio constante
e troca de informações essenciais para que este trabalho pudesse ser concluído.
À secretária da Pós-Graduação, Marlene de Camargo, pela ajuda sempre
fundamental.
A todos os funcionários do Biotério do Setor de Ciências Biológicas da UFPR.
À CAPES, CNPq, Fundação Araucária e SETI, pelo apoio financeiro aos
projetos do Laboratório de Matriz Extracelular.
A todos meus amigos do curso de Farmácia da UFPR e do curso de Química
Ambiental do CEFET-PR, a amizade e companheirismo de vocês foram
fundamentais para que eu passasse por muitas etapas de minha vida.
Aos meus familiares, em especial aos meus irmãos Bruno e Carla e meus
sobrinhos Felipe e Leonardo. Obrigado por entenderem muitas de minhas ausências
e pelo apoio em todos os momentos de minha vida.
Por fim, à minha esposa Mariah, pelo apoio em muitos momentos deste
trabalho, sempre com alegria e palavras de carinho e estímulo. É muito
tranqüilizante saber que você estará ao meu lado nas etapas futuras da minha vida.
“Trabalhar um pouco para aumentar o
acervo geral de conhecimento é um objetivo de
vida tão respeitável quanto qualquer outro
propósito semelhante."
Charles Robert Darwin
RESUMO
Aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas como aranhas-marrons, são
responsáveis por acidentes em todo o mundo, com grande importância clínica no Sul
do Brasil. Os venenos destas aranhas são compostos por diversas toxinas, entre
elas proteínas, responsáveis pelo quadro conhecido como loxoscelismo, que se
manifesta em sintomas cutâneos e/ou sistêmicos. O quadro cutâneo é o mais
comum e pode levar ao desenvolvimento de uma lesão necrótica com espalhamento
gravitacional, resultado de uma inflamação exacerbada que envolve a participação
de mastócitos e eventos histaminérgicos. Na biblioteca de cDNA da glândula de
veneno de Loxosceles intermedia foi identificada uma seqüência que codifica uma
proteína da superfamília TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein). As
funções desta proteína ainda não são totalmente entendidas, mas demonstrou-se
que ela atua no ambiente extracelular como um fator de liberação de histamina e
está ligada a respostas alérgicas em indivíduos parasitados por nematódeos e
protozoários. O alinhamento da proteína TCTP de L. intermedia com homólogas de
outros organismos revelou um alto grau de conservação da proteína, especialmente
em resíduos de aminoácidos relacionados com a interação com GTPases
monoméricas. A análise filogenética mostrou que a proteína de L. intermedia esta
agrupada com proteínas TCTP presentes na saliva de carrapatos e para as quais já
foi demonstrada a atividade de liberação de histamina. Para investigar a função
desta proteína no veneno de aranha-marrom, foi realizada a clonagem do cDNA que
codifica a proteína em pET 14b e a expressão da proteína recombinante em
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. A TCTP recombinante foi expressa como uma
proteína fusionada com um His-Tag N-Terminal. A purificação envolveu dois passos
de cromatografia, o primeiro em resina Ni
2+
-NTA agarose e o segundo em resina
DEAE-Agarose. Com a proteína recombinante purificada foram produzidos
anticorpos utilizados em um ensaio de Western Blot que evidenciou a presença da
proteína TCTP no veneno de L. intermedia. Os dados do trabalho sugerem que a
proteína possa estar envolvida nos efeitos nocivos do veneno de aranha-marrom,
sendo necessários ensaios biológicos para avaliar a atividade desta proteína no
veneno e seu possível papel como um fator de liberação de histamina.
Palavras-chave: TCTP, veneno, aranha, Loxosceles, histamina
ABSTRACT
Loxosceles genus spiders, known as brown spiders, are responsible for accidents all
over the world and have clinical importance in the South of Brazil. The venom of
these spiders is made up of several toxins, including proteins, which are responsible
for the clinical pattern called loxoscelism, which involves cutaneous and/or systemic
symptoms. Cutaneous reactions are more frequent and may lead to the development
of a necrotic lesion with gravitational spreading, resulting from a dysregulated
inflammatory response that involves the participation of mast cells and histaminergic
events. On the cDNA library of Loxosceles intermedia venom gland was identified a
sequence encoding a protein of the TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein)
superfamily. Functions of this protein are still unclear, but it was shown that it can act
as a histamine releasing factor in the extracellular environment, being related to
allergic responses in patients parasitized by nematodes and protozoan parasites.
Sequence alignment of L. intermedia TCTP protein with homologous in other
organisms revealed a high degree of conservation, specially in amino acids residues
related to the interaction with monomeric GTPases. Phylogenetic analysis showed
that L. intermedia TCTP protein is grouped with proteins that are present in tick’s
saliva and for which was demonstrated the activity of histamine releasing. To study
the function of this protein in the venom of brown spiders, the cDNA that codes the
protein was cloned into pET 14b and the expression of the recombinant protein was
carried out in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. TCTP recombinant protein was
expressed as a fusion protein with an N-Terminal His-Tag. Protein purification had
two chromatographic steps, the first in Ni
2+
-NTA agarose resin and the latter in
DEAE-Agarose resin. With the purified recombinant proteins, antibodies were
produced and used in a Western Blot assay that showed the presence of TCTP
protein in L. intermedia venom. The data of this work suggest that the protein is
involved in the noxious effects of brown spider venom and biological assays are
necessary to evaluate the activity of this protein in the venom, as well as its role as a
possible histamine releasing factor.
Keywords: TCTP, venom, spider, Loxosceles, histamine
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – ARANHA-MARROM (GÊNERO Loxosceles) ......................................... 20
FIGURA 2 – LESÃO DERMONECRÓTICA CAUSADA POR PICADA DE ARANHA-
MARROM (Loxosceles reclusa) .................................................................................. 23
FIGURA 3 – CONSERVAÇÃO, ESTRUTURA SECUNDÁRIA E MAPEAMENTO
FUNCIONAL DA PROTEÍNA TCTP ........................................................................... 35
FIGURA 4 – ESTRUTURA DA PROTEÍNA TCTP ...................................................... 36
FIGURA 5 – CONSERVAÇÃO DA PROTEÍNA TCTP DE Loxosceles intermedia .... 53
FIGURA 6 – FILOGENIA DA PROTEÍNA TCTP ........................................................ 55
FIGURA 7 - CLONAGEM DA PROTEÍNA TCTP DE Loxosceles intermedia ............. 58
FIGURA 8 – PCR DA REAÇÃO DE LIGAÇÃO ........................................................... 60
FIGURA 9 – PCR DE COLÔNIA ................................................................................. 61
FIGURA 10 – TESTE DE INDUÇÃO DA EXPRESSÃO ............................................. 62
FIGURA 11 – PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TCTP RECOMBINANTE EM RESINA
Ni
2+
-NTA AGAROSE ................................................................................................... 64
FIGURA 12 – PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TCTP RECOMBINANTE ................... 67
FIGURA 13 – IMMUNOBLOTTING PARA IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TCTP
NO VENENO DE ARANHA-MARROM ....................................................................... 69
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APS – Persulfato de amônio
BCIP – 5-bromo-4-cloro-indolil-fosfato
BOD – Biological Oxygen Demand
BSA – Soroalbumina bovina
cDNA – DNA complementar
DNA – Ácido desoxirribonucléico
dNTPs – Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA – Ácido etilenodiaminotetra-acético
ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EST – Expressed Sequence Tag
IgG – Imunoglobulina do tipo G
IPTG – Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
LB – Luria-Bertani
mRNA – RNA mensageiro
NBT – Nitro blue tretrazolium
Ni
2+
NTA – Níquel ácido nitrilo-triacético
PBS – Phosphate buffer saline
PCR – Reação em cadeia da polimerase
RNA – Ácido ribonucléico
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrphoresis
TCTP – Translationally Controlled Tumor Protein
TEMED – N,N,N’N’-dimetilaminoetano
UFPR – Universidade Federal do Paraná
L – Litro
mL – Mililitro
µL – Microlitro
M – Mol por litro
mM – Milimol por litro
µM – Micromol por litro
g – Grama
mg – Miligrama
µg – Micrograma
nm – Nanômetros
V – Volts
kDa – Quilodalton
mA – Miliampére
pH – Potencial de hidrogênio iônico
pI – Ponto isoelétrico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16
1.1 Objetivo Geral ........................................................................................................ 19
1.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 19
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 20
2.1 Aranha-marrom e Loxoscelismo ......................................................................... 20
2.1.1 Aranha-marrom ................................................................................................ 20
2.1.2 Epidemiologia do loxoscelismo ........................................................................ 22
2.1.3 Manifestações clínicas no loxoscelismo .......................................................... 23
2.1.4 Diagnóstico do loxoscelismo ............................................................................ 26
2.1.5 Tratamento do loxoscelismo ............................................................................ 27
2.2 Venenos Loxoscélicos .......................................................................................... 29
2.3 TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) .............................................. 33
2.3.1 O gene da proteína TCTP e características de seus mRNAs .......................... 34
2.3.2 Conservação e estrutura da proteína TCTP .................................................... 35
2.3.3 Interação com proteínas G monoméricas ........................................................ 38
2.3.4 Regulação do ciclo celular ............................................................................... 38
2.3.5 Ligação ao íon cálcio ....................................................................................... 39
2.3.6 Atividade antiapoptótica e câncer .................................................................... 40
2.3.7 A proteína TCTP como um fator de liberação de histamina ............................ 40
3 MATERIAIS E MÉTODOS
............................................................................................. 44
3.1 Reagentes .............................................................................................................. 44
3.2 Animais .................................................................................................................. 44
3.3 Extração do Veneno por Eletrochoque ............................................................... 45
3.4 Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida ......................................... 45
3.5 Dosagem de Proteínas pelo Método de Bradford .............................................. 46
3.6 Construção do Vetor de Expressão de TCTP ..................................................... 46
3.7 Transformação Bacteriana ................................................................................... 47
3.8 PCR de Colônia ..................................................................................................... 48
3.9 Miniprep para Sequenciamento ........................................................................... 48
3.10 Alinhamento e Análise Filogenética .................................................................... 48
3.11 Expressão da Proteína TCTP Recombinante ..................................................... 49
3.12 Purificação da Proteína TCTP Recombinante .................................................... 50
3.13 Produção de Anticorpos anti-TCTP ..................................................................... 51
3.14 Western Blot .......................................................................................................... 51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 53
4.1 Análises da Sequência da Proteína TCTP de Loxosceles intermedia .............. 53
4.2 Clonagem da Proteína TCTP de L. intermedia ................................................... 58
4.3 Expressão e Purificação da Proteína TCTP Recombinante .............................. 63
4.4 Immunoblotting para detecção da Proteína TCTP no Veneno .......................... 69
5 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 72
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 74
ANEXOS ................................................................................................................................ 86
16
1 INTRODUÇÃO
Aranhas-marrons, gênero Loxosceles, são as causadoras de maior número
de acidentes com animais peçonhentos no Paraná, sendo responsáveis por mais de
50% dos casos notificados. São aranhas que, deslocadas de seu ambiente natural,
passaram a viver dentro de casas e em locais de armazenamento de entulhos. Nos
domicílios, são encontradas normalmente dentro de calçados, roupas e atrás de
móveis ou quadros. Não são aranhas agressivas, mas quando ameaçadas
defendem-se com a inoculação de veneno de forma indolor, com a percepção do
acidente somente horas depois de ocorrido (DA SILVA et al., 2004; APPEL et al.,
2005).
O veneno de aranha-marrom é composto por diversas toxinas que, quando
inoculadas, geram um quadro chamado loxoscelismo. Usualmente, o acidente pode
evoluir na forma cutânea e/ou sistêmica (DA SILVA et al., 2004). O chamado quadro
cutâneo, caracterizado pelo aparecimento de sinais como vermelhidão, coceira e
dor, culminando muitas vezes na formação de uma lesão necrótica na pele, com
espalhamento gravitacional a partir do ponto da picada e a presença de uma região
mais esbranquiçada ao redor da ulceração, chamada placa-marmórea. Já no quadro
sistêmico, conhecido também por quadro cutâneo-visceral, podem ocorrer distúrbios
hematológicos, danos renais e, em raros casos, morte (CHAIM et al., 2006;
PETERSON, 2006).
Atualmente, diversos grupos de pesquisa estão empenhados na caracterização
de componentes do veneno e no desenvolvimento de metodologias terapêuticas
mais eficazes no tratamento do loxoscelismo. A produção de proteínas
recombinantes do veneno da aranha representou um grande avanço na
determinação da atividade de toxinas do veneno e o transcriptoma da glândula de
veneno abre novas possibilidades de investigação (FERNANDES-PEDROSA et al.,
2008; SENFF-RIBEIRO et al., 2008). Além disso, proteínas do veneno de aranha-
marrom apresentam um grande potencial biotecnológico, sendo que suas aplicações
incluem o estudo de processos inflamatórios, aplicação como pesticidas,
ferramentas para o desenvolvimento de imunoterápicos e drogas com atuação sobre
o sistema nervoso central. O entendimento molecular das toxinas do veneno e da
sua ação no organismo influenciará diretamente o tratamento de pacientes e o
desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas (SENFF-RIBEIRO et al., 2008).
17
Achados histopatológicos em pele de coelhos inoculada com veneno de
Loxosceles intermedia revelaram a presença de trombose em vasos sanguíneos
decorrente da deposição de redes de fibrina. Além disso, foi descrita também a
degeneração do endotélio de vasos e infiltração de células inflamatórias. O músculo
esquelético também sofre a infiltração de neutrófilos, com a presença de edema e
mionecrose. Ocorre ainda a destruição da epiderme, necrose e hemorragia
(OSPEDAL et al., 2002).
Alguns componentes do veneno foram descritos como os principais
envolvidos no desenvolvimento dos quadros cutâneo e sistêmico. No veneno estão
presentes enzimas relacionadas com a degradação tecidual no local da picada.
Entre elas, metaloproteases, serinoproteases e hialuronidases. Estas facilitam a
penetração dos componentes do veneno e podem causar o espalhamento
gravitacional e distúrbios hemorrágicos (DA SILVA et al., 2004). Outras enzimas, as
fosfolipases D, estão relacionadas com o desenvolvimento da dermonecrose, lesão
renal e hemólise intravascular. Estas mesmas proteínas foram relacionadas com
aspectos inflamatórios do veneno, como aumento na permeabilidade vascular e
formação de edema. Entretanto, certos eventos iniciais no desenvolvimento da
inflamação ainda permanecem obscuros. Mediadores inflamatórios liberados no
local da picada ainda não foram bem caracterizados, dificultando o entendimento da
resposta tecidual em um primeiro contato com o veneno (CHAIM et al., 2006;
RIBEIRO et al., 2007).
Recentemente, trabalhos relacionaram o papel de mastócitos e de receptores
de histamina com a atividade inflamatória do veneno. A histamina é uma bioamina
classicamente envolvida com o desenvolvimento de quadros de inflamação aguda e
reações de hipersensibilidade. Além da presença de histamina no veneno, foi
sugerido que outros componentes podem estar envolvidos na liberação de histamina
de mastócitos (RATTMANN et al., 2008; PALUDO et al., 2009).
Na prática clínica são utilizados medicamentos que inibem granulócitos, como
a dapsona. Esta inibição evita a ativação de polimorfonucleares que causam a
destruição tecidual em uma resposta imune exacerbada. Além da dapsona, no
tratamento do loxoscelismo também são utilizados anti-histamínicos. Juntos, estes
fatos sugerem a ação presença de um componente histaminérgico no veneno, o
qual pode causar a liberação de histamina de maneira direta ou indireta (HOGAN;
BARBARO; WINKEL, 2004; PAULI et al., 2006). De fato, são descritas em alguns
18
pacientes reações cutâneas localizadas, como exantema, além de reações alérgicas
e de hipersensibilidade em resposta ao veneno de aranha-marrom (PIPPIRS et al.,
2009).
Até o momento, não foi descrita uma toxina do veneno que cause a liberação
direta de histamina. Entretanto, os dados na literatura sugerem a presença de um ou
mais componentes termolábeis envolvidos com a sinalização mediante receptores
histamínicos e promovendo a liberação de histamina a partir de mastócitos isolados.
A caracterização de um destes componentes pode representar um avanço no
tratamento inicial de acidentes envolvendo aranhas-marrons (PALUDO et al., 2009).
Nosso grupo produziu uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno de
Loxosceles intermedia, onde foi identificada uma seqüência que codifica uma
proteína da superfamília TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein), com alto
grau de identidade com proteínas TCTP de carrapatos. Esta proteína foi identificada
na saliva do carrapato Dermacentor variabilis e apresentou atividade de liberação de
histamina em linhagem celular basofílica RBL-2H3, utilizadas como modelo de
estudo de vias de sinalização em mastócitos (MULENGA et al., 2003).
Rattmann et al. (2008) demonstraram que o veneno de L. intermedia
apresenta efeitos dependentes de mastócitos e de histamina. Eventos iniciais da
inflamação, como o aumento da permeabilidade vascular, foram relacionados com a
participação de receptores histaminérgicos e serotoninérgicos. Experimentos com
aorta de coelho mostraram que o veneno de aranha-marrom é capaz de causar a
liberação regulada de mediadores dos mastócitos, principalmente a histamina,
responsável por induzir a vasodilatação. Posteriormente, Paludo et al. (2009)
identificaram a presença de histamina no veneno em quantidades suficientes para
exercer efeitos inflamatórios. Apesar disso, o veneno dialisado, sem a presença de
histamina, ainda era capaz de exercer certo efeito inflamatório dependentes de
histamina, decorrente de algum outro componente presente no veneno agindo
diretamente sobre os mastócitos (RATTMANN et al., 2008; PALUDO et al., 2009).
Tendo em vista o exposto acima, é relevante a pesquisa de uma proteína que
seja capaz de atuar sobre mastócitos gerando efeitos inflamatórios no acidente
loxoscélico. A TCTP pode ser uma das moléculas responsáveis por efeitos iniciais
de inflamação no envenenamento, podendo ser vista como um possível alvo
terapêutico para evitar a progressão da lesão dermonecrótica e dos efeitos
sistêmicos do veneno.
19
1.1 Objetivo Geral
Clonagem, expressão e purificação de uma proteína da superfamília TCTP
identificada na biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha-marrom
(Loxosceles intermedia).
1.2 Objetivos Específicos
• Clonagem da sequência codificadora da proteína TCTP identificada na
biblioteca de cDNA da glândula de veneno de L. intermedia.
• Expressão da proteína TCTP em sistema heterólogo (Escherichia coli).
• Purificação da proteína TCTP por meio de técnicas cromatográficas.
• Produção de anticorpos policlonais anti-TCTP em coelhos para utilização em
imunoensaio.
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aranha-marrom e Loxoscelismo
2.1.1 Aranha-marrom
Aranhas são animais artrópodes quelicerados que surgiram possivelmente no
período Carbonífero, sendo que o registro fóssil mais antigo conhecido é de 300
milhões de anos atrás. Morfologicamente, são animais que possuem o corpo dividido
em um prosoma (cefalotórax) não segmentado, onde estão localizados os olhos, as
quelíceras, glândula de veneno e pedipalpos, e a partir do qual partem 4 pares de
patas. Ligado ao prosoma está o opistosoma (abdômen), região que possui na
extremidade as glândulas responsáveis pela produção do material que compõe a
teia. Cada quelícera está dividida em duas partes, o segmento basal e uma porção
mais rígida, a presa, que possui comumente um poro, formado a partir do ducto da
glândula de veneno (RASH; HODGSON, 2002; BRUSCA; BRUSCA, 2003).
São divididas em dois grupos de acordo com a posição de suas quelíceras:
Migalomorfa (quelíceras partem do cefalotórax paralelas ao eixo do corpo do animal
e a presa é direcionada para baixo) e Araneomorfa (quelíceras verticais
perpendiculares ao corpo do animal que, junto com as presas, movem-se como
pinças). Em todo o mundo já foram descritas cerca de 40 mil espécies, divididas em
aproximadamente 3.500 gêneros dentro de 110 famílias, porém apenas algumas
representam verdadeiros riscos aos seres humanos (RASH; HODGSON, 2002;
CORZO; ESCOUBAS, 2003).
Apesar de algumas aranhas perigosas serem encontradas no grupo das
Migalomorfas, tais como os gêneros Atrax, Trechona e Harpactirella, no grupo
Araneomorfa são encontradas os gêneros das aranhas mais venenosas: Latrodectus
(viúva-negra), Loxosceles (aranha-marrom) e Phoneutria (armadeira). Estes gêneros
são responsáveis por diversos casos graves de envenenamento, sendo descritas
mortes relacionadas aos acidentes envolvendo os gêneros Loxosceles, Latrodectus
e Atrax (ESCOUBAS; DIOCHOT; CORZO, 2000; RASH; HODGSON, 2002).
As aranhas do gênero Loxosceles pertencem ao filo Arthropoda, subfilo
Chelicerata, classe Arachnida, ordem Araneae, sub-ordem Araneomorfa e família
Sicariidae. São popularmente denominadas de aranhas-marrons, em função da
coloração que varia de marrom claro a escuro, ou aranhas-violino, em função de
uma marca semelhante ao instrumento presente no dorso do prosoma do animal. Os
21
machos possuem corpo menor e pernas relativamente mais longas do que as
fêmeas (FIGURA 1). Possuem hábitos noturnos, são sedentárias e não agressivas.
Preferindo a escuridão, algumas vivem sob pedras, troncos de árvores, restos
vegetais, telhas e tijolos empilhados, mas podem adquirir hábitos intradomiciliares
sob condições especiais. Estas aranhas possuem grande capacidade de adaptação,
suportando amplas variações de temperatura (8 a 43 °C), bem como longos
períodos sem água e comida (DA SILVA et al., 2004; SENFF-RIBEIRO et al., 2008).
FIGURA 1 – ARANHA-MARROM (GÊNERO Loxosceles)
Dois animais do gênero Loxosceles. O gênero apresenta marcado dimorfismo sexual. A
fêmea (A) possui corpo maior e pernas mais curtas em relação ao macho (B). Os
animais apresentam coloração que varia de marrom claro a escuro e apresentam no
dorso um sinal com formato semelhante ao de um violino contendo os 3 pares de olhos
(seta, no detalhe em B). Adaptado de: Instituto Butantan, disponível no site
<http://www.butantan.gov.br/portal/Ensino>, acessado entre os dias 20/09 e 01/10 de
2009 e de PETERSON, 2006.
As espécies dentro deste gênero alimentam-se de pequenos insetos, sendo
que o veneno possui neurotoxinas com a função de paralisar e matar a presa.
Tecem teias irregulares com a aparência de algodão. Possuem três pares de olhos,
sendo um par central e dois pares laterais, disposição característica das aranhas do
gênero Loxosceles. Reproduzem-se com facilidade e podem viver de 3 a 7 anos,
sobrevivendo até 276 dias sem alimento. Esta grande capacidade de adaptação
explica o fato de que grande número de indivíduos podem ser encontrados mesmo
em condições adversas (DOS SANTOS et al., 2000; DA SILVA et al., 2004).
O veneno é produzido em uma glândula que possui epitélio secretor revestido
por membrana basal e duas camadas de músculo estriado, uma interna e outra
externa. As células do epitélio secretório são ricas em vesículas contendo veneno,
22
Apesar de alguns autores destacarem que o veneno é produzido por células
apócrinas, a morfologia das glândulas e das células indica que o tipo de secreção é
holócrina. O volume de veneno inoculado pela aranha é em torno de 4 µL e dados a
respeito da quantidade de proteínas descrevem que cerca de 60 a 100 µg de
proteínas são inoculados no momento da picada (DOS SANTOS et al., 2000; DA
SILVA et al., 2004).
2.1.2 Epidemiologia do loxoscelismo
O gênero Loxosceles é amplamente distribuído pelo mundo, sendo
encontrado na América do Norte, Central e do Sul, Europa, África, Ásia e Oceania.
No Brasil são encontradas sete espécies deste gênero, porém apenas três delas
estão envolvidas com o envenenamento humano: Loxosceles intermedia,
Loxosceles gaucho e Loxosceles Laeta. O acidente envolvendo este tipo de aranha,
denominado Loxoscelismo, apresentou um grande aumento no número de
notificações na década de 90, passando a ser considerado um problema de saúde
pública (SEZERINO et al., 1998; DA SILVA et al., 2004). A aranha normalmente não
é violenta, e acidentes ocorrem geralmente em função de uma reação de defesa da
aranha quando é comprimida por um indivíduo no ato de vestir roupas ou durante o
sono. A grande maioria dos acidentes ocorre em períodos de maior calor, sendo
descritos aumentos no número de casos entre outubro e março ou entre setembro e
fevereiro (SEZERINO et al., 1998; MÁLAQUE et al., 2002).
No Brasil, o loxoscelismo é mais freqüente na região Sul do País, que
contabilizou entre 1990 e 1993, 95% dos casos envolvendo aranhas do gênero
Loxosceles. Na cidade de Curitiba (PR) e região metropolitana são relatados em
torno de dois a três mil casos por ano. Apesar de a espécie L. laeta possuir uma
distribuição geográfica mais ampla e ser encontrada nos mesmos locais que a L.
intermedia, esta última responde por grande parte dos acidentes na região sul do
País (GONÇALVES DE ANDRADE; LOURENÇO; TAMBOURGI, 2000; MÁLAQUE
et al., 2002). O desenvolvimento de hábitos intradomiciliares, alterações climáticas e
a grande mobilidade e tolerância para conviver com o filhote, favorecem a
proliferação da L. intermedia em diferentes ambientes, o que ajuda a explicar o
maior número de casos envolvendo esta espécie (MARQUES-DA-SILVA; FISCHER,
2005).
23
Dados mais atuais do Sistema de Informação de Agravos de Notificação
(SINAN) do Ministério da Saúde mostram que acidentes com aranhas estão em
terceiro lugar na lista de acidentes com animais peçonhentos notificados no período
de 2001 a 2008, representando 18,55% do total de acidentes notificados com gênero
do animal identificado. O Estado do Paraná concentra 47,86% de todos os casos
envolvendo aranhas, sendo o primeiro estado em número de acidentes envolvendo
este tipo de animal e o segundo estado em número de acidentes com animais
peçonhentos, ficando atrás apenas de Minas Gerais. No mesmo período, do total de
acidentes com aranhas, considerando-se somente as notificações com identificação
do animal, o gênero Loxosceles responde por 65,33% dos casos. Dos acidentes
com estes animais, o Sul do país contabiliza 94,33% das notificações e o Paraná
75,80%. Curitiba e Região Metropolitana são responsáveis por 59,21% das
notificações nacionais de acidentes com Loxosceles e por 78,12% das notificações
estaduais envolvendo estes animais (SINAN, 2009).
Os dados do SINAN mostram que o menor número de acidentes com
aranhas-marrons em Curitiba ocorre no inverno. O mês de julho geralmente
apresenta o menor número de casos. A partir da primavera os casos voltam a subir,
tendo seu pico no verão, em janeiro e fevereiro. Em Curitiba, 61% dos acidentes
com Loxosceles ocorrem com mulheres, e a maioria dos casos (75,32%),
considerando homens e mulheres, foram considerados leves. No período de 2001 a
2006, apenas 4 óbitos foram registrados na cidade de Curitiba em decorrência de
acidentes com aranhas-marrons. Grande parte dos acidentes (41,05%) ocorreu com
adultos jovens na faixa de 20 a 39 anos e 23,46% na faixa de 40 a 59 anos (SINAN,
2009).
2.1.3 Manifestações clínicas no loxoscelismo
O grande número de notificações no sul e sudeste do país fez com que o
quadro clínico desenvolvido pelos pacientes acidentados fosse bem caracterizado
pelo Ministério da Saúde. O quadro desenvolvido no envenenamento pode evoluir
clinicamente de duas formas: quadro cutâneo (87 – 98% dos casos) e a forma
sistêmica (1 – 13% dos casos) (FUNASA, 2001). A evolução do loxoscelismo
depende de diversos fatores como: da espécie agressora, sexo, estágio de
desenvolvimento e do animal, além da quantidade de veneno inoculada. Andrade et
24
al. (1999) verificou que a fração do veneno de 35 kDa, associada com os eventos
tóxicos do veneno, está presente nas aranhas em sua forma ativa a partir do terceiro
instar. A partir deste estágio, até a idade adulta, esta fração do veneno apresenta
atividade crescente. Características dos pacientes como idade, sexo e local da
picada também determinam a evolução clínica nos casos de envenenamento
(GUILHERME; FERNANDES; BARBARO, 2001) .
O quadro cutâneo ou dermonecrótico caracteriza-se por um ponto
avermelhado e pouco dolorido no local da picada, que evolui para uma lesão
necrótica na pele com espalhamento gravitacional, em torno de 12 a 48 horas após
a picada (FIGURA 2) (APPEL et al., 2005; MILLER; ORTEGON; MCDANIEL, 2007).
A lesão característica começa a manifestar-se a partir de 6 horas com dor em
queimação, abscesso, pontos de hemorragia e áreas pálidas em função da isquemia
(placa marmórea). Existe ainda a ocorrência de edema e eritema, cuja intensidade
varia em função do tecido atingido (HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
Observações de biópsias da pele de indivíduos acidentados mostram intenso
infiltrado inflamatório, trombose, hemorragia, eritema, dermatite e necrose da derme
e epiderme. Dentro de 3 a 7 dias a lesão pode evoluir para uma grande úlcera auto-
limitada. Em alguns casos, é necessária uma cirurgia reparadora no local da lesão
(SEZERINO et al., 1998; DA SILVA et al., 2004; APPEL et al., 2005).
FIGURA 2 – LESÃO DERMONECRÓTICA CAUSADA POR PICADA DE ARANHA-
MARROM (Loxosceles reclusa)
Loxoscelismo cutâneo em decorrência de acidente envolvendo aranha-marrom (Loxosceles
reclusa). É possível observar a progressão da lesão, desde o dia de o início da lesão até
sua cura (A – C). Em A, é possível observar a placa marmórea, com pontos de hemorragia
e regiões mais pálidas em razão da isquemia, além do característico espalhamento
gravitacional. Em B, a lesão já instalada, com necrose tecidual e abcesso no centro,
circundada por um halo branco isquêmico e mais externamente a coloração violácea
devido ao eritema. Em C, a cicatrização dois meses e meio após a picada. Adaptado de:
MILLER; ORTEGON; MCDANIEL, 2007.
25
Análises histológicas de tecidos sob efeito do veneno de aranha-marrom
mostram a presença de infiltrado leucocitário, hemorragia, dermatite, eritema,
inflamação e necrose da derme e epiderme. Nas primeiras horas já são observados
efeitos como edema, grande presença de leucócitos e deposição intravascular de
rede de fibrina com o surgimento de trombos. Em 12 horas já é vista a
desorganização das células da derme e infiltração leucocitária nas fibras de músculo
esquelético. A partir de 24 horas ocorre desorganização das fibras de colágeno,
destruição de vasos sanguíneos e necrose muscular e dérmica (OSPEDAL et al.,
2002). A ação do veneno como um ativador de células endoteliais, estimulando a
liberação de moléculas pró-inflamatórias e a adesão de polimorfonucleares, leva a
uma resposta inflamatória descontrolada que resulta nas lesões dermonecróticas
(PATEL et al., 1994). Outros sintomas manifestam-se juntamente com o quadro
local, tais como: febre, dores de cabeça, prurido, petéquias, exantema, náuseas e
vômitos (DA SILVA et al., 2004).
A segunda forma de evolução do loxoscelismo é o envolvimento sistêmico, o
chamado quadro cutâneo-visceral. Ocorre em menor parte dos casos, geralmente
em acidentes causados pela espécie Loxosceles laeta, com maior gravidade em
crianças e idosos, podendo ser fatal (MÁLAQUE et al., 2002; HOGAN; BARBARO;
WINKEL, 2004; APPEL et al., 2005). Normalmente os sintomas aparecem em entre
48 e 72 horas após a picada, porém existem relatos de casos de manifestação do
loxoscelismo sistêmico 24 horas após o acidente (HOGAN; BARBARO; WINKEL,
2004). Os principais sintomas do quadro sistêmico são distúrbios hemolíticos, além
do comprometimento local e as manifestações sistêmicas já descritas acima. Pode
ocorrer lesão renal, coagulação intravascular disseminada, hemólise intravascular,
aumento da bilirrubina indireta, icterícia e trombocitopenia. Quadros sistêmicos
podem ainda evoluir para uma insuficiência renal aguda, maior responsável pelas
mortes relacionadas ao loxoscelismo (DA SILVA et al., 2004; CHAIM et al., 2006).
Alterações hepáticas também já foram descritas, com aumento dos níveis séricos de
enzimas hepáticas e alterações do metabolismo do fígado de animais tratados com
veneno de aranha-marrom e a enzima fosfolipase D (DE OLIVEIRA CHRISTOFF et
al., 2008).
O quadro de injúria renal já foi descrito como sendo resultado dos distúrbios
da hemostase e da reação inflamatória exacerbada em resposta ao veneno, porém
foi descrito que componentes do veneno podem ligar-se diretamente a estruturas
26
renais, causando o dano renal de maneira direta (TAMBOURGI et al., 1998; CHAIM
et al., 2006). Análises histológicas em rins de camundongos (animais que não
desenvolvem lesão dermonecrótica) tratados com veneno de aranha-marrom
mostraram eritrócitos presentes na cápsula de Bowman, colapso glomerular, morte
de células no epitélio tubular, bem como deposição de material protéico no lúmen
dos túbulos renais e, por fim necrose tubular (LUCIANO et al., 2004). Foi
demonstrada a ação direta sobre tecido renal de uma isoforma da ezima fosfolipase
D. A enzima foi capaz de provocar alterações na estrutura renal semelhantes
àquelas causadas pelo veneno total, além de ligar-se a células renais com efeito
citotóxico dependente de sua atividade catalítica (CHAIM et al., 2006; KUSMA et al.,
2008).
2.1.4 Diagnóstico do loxoscelismo
O diagnóstico de picadas de aranhas do gênero Loxosceles geralmente é
feito baseado nos sintomas apresentados pelo paciente e pela evolução da lesão,
uma vez que a picada geralmente não é sentida e, frequentemente, então a aranha
não é capturada. Ainda não existem ensaios laboratoriais para diagnóstico de
envenenamento por Loxosceles disponíveis comercialmente, portanto parâmetros
laboratoriais como hemoglobinúria, hemoglobina sérica, bilirrubina indireta, lactato
desidrogenase, creatina quinase, entre outros, são essenciais para o diagnóstico e
avaliação da severidade do envenenamento (HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
Foi descrito um ensaio de inibição de hemaglutinação, utilizando exudatos de
lesões dermonecróticas, baseado na capacidade de o veneno inibir a
hemaglutinação de eritrócitos previamente tratados com veneno. Apesar da alta
sensibilidade e especificidade, o teste não chegou a ser testado em humanos e
mostrou-se insatisfatório para o diagnóstico laboratorial (BARRETT; ROMINE-
JENKINS; BLICK, 1993). Em contrapartida, vários ensaios de ELISA (Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay) para o diagnóstico laboratorial do loxoscelismo já
foram descritos (SENFF-RIBEIRO et al., 2008). A presença de veneno em biópsia
das lesões e no soro dos pacientes pode ser detectada vários dias após o acidente,
porém são necessárias mais análises de correlação clínica para que estes ensaios
venham a ser eficientemente utilizados e, então, disponibilizados comercialmente
(DA SILVA et al., 2004; HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
27
Muitas condições clínicas são erroneamente diagnosticadas como acidente
loxoscélico, portanto deve ser realizado diagnóstico diferencial para uma série de
doenças como vasculite, infecções bacterianas e herpes, entre outras. O diagnóstico
precoce da picada abre caminho para evitar o desenvolvimento da lesão, porém,
após certa evolução da dermonecrose, o tratamento é apenas sintomático (APPEL
et al., 2005; SWANSON; VETTER, 2006).
2.1.5 Tratamento do loxoscelismo
Diversos tratamentos são descritos para o loxoscelismo, porém o tratamento
clássico inclui a administração de Dapsona, Ácido Acetilsalicílico e antibióticos.
Apesar de seus efeitos adversos, a administração precoce de Dapsona pode reduzir
a dor e o desenvolvimento da lesão dermonecrótica, pois atua como um inibidor da
degranulação de polimorfonucleares. Apesar dos diversos estudos, a eficácia
terapêutica da Dapsona no tratamento do loxoscelismo não é certa. Assim mesmo, o
medicamento continua a ser prescrito por médicos nos Estados Unidos e no Brasil.
Neste, o tratamento com Dapsona 50 – 100 mg/dia é preconizado pelo Ministério da
Saúde (FUNASA, 2001; HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
A utilização de corticóides é muito discutida, porém é consenso que os
corticóides sejam de preferência administrados nos casos sistêmicos, o que é feito
no Brasil. Entretanto, quando a aranha é identificada como sendo L. intermedia ou L.
laeta deve-se iniciar o tratamento com Prednisona, mesmo sem a existência de uma
lesão aparente. O papel imunossupressor dos corticóides teria importância
fundamental na redução da resposta imune exacerbada gerada pelo
envenenamento (DA SILVA et al., 2004; HOGAN; BARBARO; WINKEL, 2004).
O tratamento com soro antiloxosceles iniciou-se no Brasil no início de 1960,
com a produção de anticorpos de cavalo que reconhecem o veneno de Loxosceles.
Apesar disso, ainda existem discordâncias a respeito da efetividade do soro como
agente neutralizante do veneno e do período ideal para sua administração (HOGAN;
BARBARO; WINKEL, 2004). No Brasil estão disponíveis dois tipos de soro:
antiloxoscélico (anticorpos produzidos contra venenos de L. intermedia, L. gaucho e
L. laeta) e antiaracnídico (feito a partir de uma mistura de venenos de aranhas, L.
gaucho e Phoneutria nigriventer, e de escorpiões, Tityus serrulatus e Tityus
bahiensis). Peru e México também produzem comercialmente o soro antiloxoscélico
28
(PAULI et al., 2006). A utilização do soro, muitas vezes combinado com corticóides
ou Dapsona, aparenta ser segura, sendo que são verificadas reações anafiláticas
leves (urticária e náuseas) em apenas 20% dos casos (MÁLAQUE et al., 2002).
No Brasil o soro é utilizado como tratamento em aproximadamente 60% dos
casos. Em contraste, no estado do Paraná no período de 1990 a 1995 em apenas
11,9% dos casos foi utilizado o soro. A utilização do soro é indicada pelo Ministério
da Saúde somente nas 36 primeiras horas após a picada e dependendo do grau de
severidade do acidente. A opção por este tratamento fica a cargo dos estados,
baseados em suas experiências clínicas (FUNASA, 2001). Enquanto no Paraná o
soro só é utilizado nas primeiras 24 horas e em casos considerados moderados e
graves, em São Paulo o soro é utilizado em 70% dos casos. Por exemplo, no
Hospital Vital Brasil, no Instituto Butantan, o soro é utilizado para lesões cutâneas
até 72 horas após a picada e em caso de comprometimento sistêmico a soroterapia
é sempre utilizada, independente do momento da picada (PAULI et al., 2006).
O grande problema na administração do soro antiveneno é a demora do
paciente em procurar auxílio médico, uma vez que a picada não é percebida de
imediato e a eficácia do soro é tempo-dependente. Muitas vezes o paciente procura
atendimento médico entre 24 e 72 horas após a picada, quando os sintomas locais
já estão instalados e, muitas vezes, em estado avançado (PAULI et al., 2006).
Apesar de não existirem estudos que permitam correlacionar o tipo de tratamento
com a evolução dos casos de loxoscelismo, estudos em modelos animais mostram
que a aplicação do soro antiveneno possui potencial terapêutico. A administração do
soro minimiza os efeitos cutâneos e sistêmicos do envenenamento, quando
empregada até 12 horas após a picada. A utilização de soro até 48 horas após a
picada mostrou efeito na redução da área da lesão dermonecrótica (PAULI et al.,
2006; PAULI et al., 2009).
Alguns autores descrevem a possibilidade do uso de Tetraciclina tópica para
o tratamento e neutralização da lesão dermonecrótica causada pela picada de
aranha-marrom. Apesar do pouco entendimento a respeito de seu mecanismo na
inibição da lesão, a Tetraciclina agiria por um mecanismo não antimicrobiano ligando
metais divalentes e inibindo a ação de metaloproteases endógenas cuja expressão
seria estimulada pela ação do veneno sobre a pele (KING, 2007). A utilização de
antibióticos também é indicada para prevenção de infecções secundárias por
29
patógenos presentes na pele ou mesmo nas presas da aranha (HOGAN;
BARBARO; WINKEL, 2004).
Alguns autores sugerem o uso de anti-histamínicos para o tratamento do
loxoscelismo, apesar da eficácia no tratamento ser controversa (ANDERSON, 1997;
WENDELL, 2003; PAULI et al., 2006). Enquanto a administração tópica de anti-
histamínicos parece ineficaz, o uso parenteral do medicamento foi relacionado com
a atenuação das manifestações cutâneas 12 horas após o inicio do tratamento
(SCHENONE, 2003; YIGIT et al., 2008). Apesar de não ser um protocolo no Brasil, a
administração de anti-histamínicos no tratamento do loxoscelismo esta de acordo
com trabalhos que relacionam efeitos inflamatórios iniciais do veneno com eventos
dependentes de receptores de histamina. A utilização de anti-histamínicos teria
efeito reduzindo a degranulação de mastócitos e, consequentemente, a quantidade
de histamina liberada no acidente com a aranha-marrom. Mesmo com todas as
evidências, ainda não foi identificada no veneno uma molécula que promova a
liberação de histamina a partir de mastócitos, o que embasaria ainda mais o
tratamento com anti-histamínicos (RATTMANN et al., 2008; PALUDO et al., 2009).
2.2 Venenos Loxoscélicos
A utilização do veneno pelas aranhas aparenta ter sido um acontecimento
precoce na história evolutiva desta ordem. A grande função do veneno é paralisar e
matar a presa, ainda que possua provavelmente a função secundária de iniciar a
digestão externa da vítima. Uma função de defesa contra predadores também não
pode ser descartada, uma vez que algumas aranhas só injetam o veneno quando
em perigo. Aranhas do gênero Loxosceles utilizam o veneno para matar suas
presas, mas também podem utilizá-lo como um mecanismo de defesa quando
comprimidas, motivo pelo qual ocorrem os acidentes com seres humanos. Todas as
aranhas, com exceção da família Uloboridae, possuem todo o aparato para
produção e injeção de um veneno geralmente composto por proteínas com ação
tóxica e enzimática, além de peptídeos e compostos orgânicos e inorgânicos (RASH;
HODGSON, 2002; CORZO; ESCOUBAS, 2003).
O veneno de Loxosceles é composto basicamente por enzimas e moléculas
biologicamente ativas produzidas por glândulas situadas no cefalotórax da aranha.
30
No veneno são encontradas proteínas de alta massa molecular pouco expressas e
um grande conteúdo de proteínas de baixa massa molecular. Os venenos das
espécies L. laeta, L. intermedia e L. reclusa possuem o mesmo perfil eletroforético,
apresentando as principais bandas entre 30 e 35 kDa. A análise proteômica do
veneno destas três espécies confirmou a presença de inúmeras proteínas com
diferentes pontos isoelétricos nesta região. Além disso, o perfil eletroforético em gel
bidimensional revela que o veneno de L. intermedia possui mais componentes de
baixa massa molecular (14 a 25 kDa) do que o veneno das outras espécies
avaliadas. Polipeptídios (3 a 8 kDa) podem estar envolvidos com a neurotoxicidade
do veneno, o que facilitaria a captura de insetos. Estudos de identificação e
caracterização das toxinas presentes no veneno de Loxosceles revelaram a
presença de metaloproteases, fosfolipases D, hialuronidases, serino-proteases, além
de fosfatase alcalina e 5’-fosfohidrolase ribonucleotidica (VEIGA et al., 2000; DA
SILVA et al., 2004; DE CASTRO et al., 2004; MACHADO et al., 2005).
O grande conteúdo de proteases levantou a questão a respeito da pureza do
veneno, uma vez que a extração por eletrochoque poderia causar a liberação do
conteúdo estomacal causando a contaminação do veneno proveniente da glândula.
No veneno de L. intermedia extraído por eletrochoque foram identificadas duas
serino-proteases específicas, fato que sugere a ausência de contaminantes
estomacais, uma vez que o esperado seria a presença de proteases de amplo
espectro no caso de contaminação. Posteriormente, proteases já descritas
anteriormente foram identificadas no veneno obtido diretamente das glândulas de
aranhas do gênero Loxosceles. Foi demonstrada também a similaridade do
conteúdo protéico dos venenos obtidos pelos dois métodos. Juntos, os dados
minimizam a interferência da egesta como contaminante do veneno analisado em
laboratório, o que não pode ser descartado quando são considerados os acidentes
envolvendo a aranha (VEIGA et al., 2000; DA SILVEIRA et al., 2002).
Uma vez que a função do veneno é paralisar e matar a presa, grande parte de
seus componentes são toxinas que atuam no sistema nervoso. Até o momento, as
neurotoxinas identificadas nos venenos de aranhas pertencem a um dos três grupos:
proteínas, polipeptídios e acilpoliaminas. Proteínas de alta massa molecular (cerca
de 110 kDa), como as latrotoxinas, são responsáveis pela liberação de
neurotransmissores. As acilpoliaminas possuem alta atividade inseticida, causando a
paralisação de insetos mediante bloqueio da transmissão neuromuscular.
31
Polipeptídios, com massa entre 3 e 8 kDa têm como alvo canais iônicos de
membrana (ESCOUBAS; DIOCHOT; CORZO, 2000; RASH; HODGSON, 2002).
No veneno de Loxosceles intermedia foram identificados três componentes
relacionados com sua atividade inseticida. A partir da sequência aminoacídica
parcial foi possível clonar os inseticidas a partir do cDNA da glândula de veneno de
aranha-marrom (L. intermedia). Assim, foi possível obter as sequências que
codificam três diferentes polipeptídios inseticidas (LiTx 1, 2 e 3), com peso molecular
entre 5,6 – 7,9 kDa. As análises filogenéticas sugerem que estes polipeptídios atuem
em canais de sódio e cálcio (DE CASTRO et al., 2004).
Dos componentes presentes no veneno de Loxosceles intermedia, as
proteínas melhor caracterizadas são as pertencentes à família de toxinas
dermonecróticas ou família Loxtox, e estão envolvidas com os efeitos mais tóxicos
do veneno. Esta família é composta por 6 grupos de proteínas, separadas com base
na análise filogenética das toxinas descritas por diversos autores. As proteínas desta
família são expressas na glândula de veneno de Loxosceles, possuem diversas
regiões conservadas, apresentam resíduos de aminoácidos conservados em seu
sítio catalítico, exibem um peptídeo sinal hidrofóbico e possuem massa molecular
em torno de 30 a 33 kDa. A nomenclatura das proteínas da família deve ser feita
utilizando o termo Loxtox (Lox, de Loxosceles e tox, de toxina), acrescentando a
inicial do segundo nome da espécie e uma numeração adequada. (KALAPOTHAKIS
et al., 2007).
As toxinas dermonecróticas são encontradas em diversas espécies do gênero
Loxosceles e são enzimas do tipo fosfolipase D. Muitas delas estão envolvidas com
a formação da lesão dermonecrótica, indução de resposta inflamatória, hemólise,
agregação plaquetária, citotoxicidade, aumento da permeabilidade vascular,
nefrotoxicidade e letalidade. O mecanismo de ação destas toxinas ainda não foi
totalmente esclarecido, mas acredita-se que a hidrólise de lipídios, gerando
mediadores como ceramida-1-fosfato e ácido lisofosfatídico, possa ativar
determinadas vias de sinalização, causando alterações fisiopatológicas e os efeitos
deletérios destas toxinas (KUSMA et al., 2008; SENFF-RIBEIRO et al., 2008;
CHAVES-MOREIRA et al., 2009).
Outros componentes do veneno possivelmente relacionados com a atividade
tóxica são as metaloproteases. Primeiramente descritas no veneno de L. intermedia,
foram caracterizadas como sendo moléculas de baixa massa molecular com
32
atividade fibronectinolítica e fibrinogenolítica (20-28 kDa) e gelatinolítica (32-35 kDa).
Posteriormente foram descritas metaloproteases nos venenos de L. laeta, L. gaucho
e Loxosceles rufescens. Recentemente foi descrita a identificação de uma
metaloprotease do tipo astacina (dependente de zinco) no veneno de L. intermedia,
com massa molecular próxima de 29 kDa, semelhante à massa de metaloproteases
descritas anteriormente para esta espécie. A atividade dessas metaloproteases está
possivelmente relacionada a distúrbios hemostáticos decorrentes tais como
hemorragia da derme, injúria de vasos sanguíneos e como um fator de
espalhamento gravitacional (característico do loxoscelismo) e sistêmico, facilitando a
penetração dos outros componentes do veneno (DA SILVEIRA; WILLE et al., 2007;
SENFF-RIBEIRO et al., 2008).
As hialuronidases também estão possivelmente relacionadas com os efeitos
nocivos do veneno de aranha-marrom. Foram descritas hialuronidases de diferentes
massas moleculares em diferentes espécies do gênero Loxosceles (no caso da L.
intermedia foram descritas duas hialuronidases, com massas de 41 e 43 kDa). A
enzima possui atividade de hidrolase e é capaz de degradar ácido hialurônico e
condroitin sulfato, presentes na matriz extracelular, funcionando como um fator de
espalhamento do veneno. Da mesma maneira, proteases que degradam
componentes da matriz extracelular ou de membranas basais podem estar
envolvidas com distúrbios hemorrágicos, agravamento da lesão dermonecrótica e
aumento da permeabilidade vascular. Também são descritas na literatura duas
serino-proteases (85 e 95 kDa) com atividade gelatinolítica, possivelmente
relacionadas com a atividade tóxica do veneno de L. intermedia (DA SILVA et al.,
2004; DA SILVEIRA; CHAIM et al., 2007).
Todos os componentes descritos agem de maneira sinérgica para produzir o
efeito nocivo do veneno. Os mecanismos pelos quais ocorre a lesão celular e
tecidual não são totalmente conhecidos, bem como os mediadores inflamatórios
envolvidos no acidente com a aranha-marrom. Diversos autores destacam o papel
da histamina e mastócitos em eventos inflamatórios, causando vasodilatação,
aumento da permeabilidade vascular e infiltração de neutrófilos. Assim, os eventos
inflamatórios iniciais provocados pelo veneno de aranha-marrom poderiam estar
relacionados com a degranulação de mastócitos e com o conteúdo de histamina no
veneno, suficiente para induzir respostas inflamatórias (RATTMANN et al., 2008;
PALUDO et al., 2009).
33
2.3 TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein)
A proteína TCTP, do inglês Translationally Controlled Tumor Protein, foi
identificada no final dos anos 80, por três grupos diferentes que pesquisavam
proteínas reguladas a nível traducional. À época, a proteína foi chamada por
diferentes nomes (P21, Q23 e P23). Atualmente, alguns autores ainda enfatizam
alguma atividade específica da proteína ao nomeá-la: fortilina, relacionado com sua
atividade antiapoptótica, e HRF (do inglês histamine releasing factor), que enfatiza a
atividade extracelular da proteína. Entretanto, o nome TCTP é o mais utilizado
atualmente na literatura, e sugerido como um nome menos específico. Nas últimas
três décadas, diversos grupos passaram a mostrar interesse no entendimento da
função biológica desta proteína, uma vez que ela possui diversas propriedades
biológicas e seu papel nos organismos não é bem esclarecido (GACHET et al.,
1999b; BOMMER; THIELE, 2004).
Esta proteína de baixa massa molecular (aproximadamente 20 kDa) é
amplamente expressa em diversos organismos e em 26 tecidos humanos, o que
aponta para um papel fundamental em vias bioquímicas ou de sinalização. De fato, a
proteína TCTP é essencial para o desenvolvimento embrionário e proliferação
celular em camundongos e em Drosophila. Além disso, ela possui a capacidade de
ligar cálcio e estabilizar microtúbulos, sendo esta propriedade relacionada com um
possível envolvimento no controle do ciclo celular (BOMMER; THIELE, 2004;
HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
Extracelularmente, é capaz de degranular mastócitos provocando a liberação
de histamina, normalmente em pacientes parasitados ou com alergia. Esta liberação
de histamina pode ser dependente ou independente de IgE e acredita-se que possa
existir a participação de um receptor específico de TCTP que leva à ativação dos
mastócitos. Um fato curioso é que, apesar de ser encontrada em fluídos biológicos
de pacientes asmáticos ou parasitados e na saliva de carrapatos, o mRNA que
codifica a proteína não codifica um peptídeo sinal de secreção e até o momento
nenhuma proteína precursora foi descrita. Acredita-se que esta proteína seja
secretada com auxílio de uma proteína transmembrana, utilizando um via não-
34
clássica de secreção, chamada de exossomos (BHEEKHA-ESCURA et al., 2000;
HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
A proteína TCTP possui um alto grau de conservação em todo o reino animal.
Aproximadamente 50% de todos seus resíduos de aminoácidos são conservados. O
grau de conservação desta proteína em plantas é semelhante. As TCTPs de
eucariotos possuem alto grau de identidade e são totalmente conservadas em
espécies do mesmo gênero. Não existe descrição de uma proteína semelhante em
bactérias, indicando que o seu surgimento ocorreu após a separação entre
procariotos e eucariotos. Além disso, a análise filogenética da proteína TCTP mostra
que a sua evolução reflete a história evolutiva dos organismos eucariotos.
(VENUGOPAL, 2005; HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
2.3.1 O gene da proteína TCTP e características de seus mRNAs
O gene da proteína TCTP, chamado TPT1, foi estudado em coelhos e foi
descrito que o gene é organizado em cinco íntrons e seis éxons, totalizando cerca
de 3820 pares de base. O promotor flanqueia a região 5’, distante 1200 pares de
base e possui a TATA Box na posição -30, bem como sítio para ligação de fatores
de transcrição. A transcrição do gene gera dois RNAs mensageiros de diferentes
tamanhos (com diferentes regiões 3’-UTR, formadas por poliadenilação alternativa),
sendo o mRNA longo mais estável e menos abundante em tecidos humanos,
quando comparado ao mRNA curto. A região 5’-UTR do mRNA possui uma região
rica em pirimidina (THIELE et al., 1998; THIELE et al., 2000). Foi demonstrado ainda
que alterações nos níveis de cálcio intracelular podem estimular a transcrição do
gene TPT1 e também regular a tradução do mRNA (XU; BELLAMY; TAYLOR,
1999). Diversas outras situações já foram relacionadas com a expressão do gene
TPT1, tais indução do crescimento celular, ciclo circadiano, ativação de macrófagos,
resposta a diferentes tipos de estresse e indução de apoptose (BOMMER et al.,
2002).
Estudos da estrutura do mRNA codificador da proteína TCTP revelaram que
ele forma uma estrutura secundária extensa. Esta estrutura secundária foi
relacionada com a ativação do eIF4E (fator eucariótico de iniciação da tradução), da
quinase p70
S6K
(que fosforila a proteína ribossomal S6) e com a ativação de uma
35
quinase dependente de RNA dupla-fita (PKR). A ativação desta última suprime a
tradução do mRNA de TCTP. Portanto, fica claro que a estrutura secundária do
mRNA regula outros componentes celulares envolvidos na tradução deste RNA. Os
mecanismos moleculares de regulação da tradução ainda não foram totalmente
compreendidos, porém é consenso que a proteína TCTP é regulada nos níveis
traducional e transcricional (BOMMER et al., 2002; BOMMER; THIELE, 2004). O
gene da proteína em plantas ainda não foi estudado, mas foi demonstrado que a
proteína TCTP possui papel fundamental na regulação do crescimento
(BERKOWITZ et al., 2008).
Alguns autores destacam a possibilidade de que a TCTP possa estar presentes
em dois pools celulares, um relacionado com a proliferação celular e outro
relacionado com a comunicação celular e liberação de histamina. Esta hipótese é
reforçada pela evidência de que o gene desta proteína em mamíferos é transcrito
em dois diferentes mRNAs, e que estes aparecem em proporções desiguais em
diferentes tecidos. Existem outras possibilidades, como a existência em alguns
animais de mais de um gene para TCTP ou a ocorrência de splicing alternativo.
Porém, o fato de que animais que possuem um único gene codificando TCTP podem
ou não secretar a proteína deixa claro que a diferente expressão tecidual e a
regulação da sua localização são fatores determinantes da função (THIELE et al.,
2000; AMZALLAG et al., 2004; HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
2.3.2 Conservação e estrutura da proteína TCTP
A análise da estrutura secundária da seqüência de TCTP de diferentes grupos
taxonômicos mostra que resíduos de aminoácidos totalmente conservados estão
localizados principalmente em um lado do núcleo de segmentos em conformação β ,
sugerindo que esta região possa ser relevante para interações moleculares da
proteína. Foi mapeado o domínio de ligação a microtúbulos, semelhante ao domínio
presente na proteína MAP-1B (proteína de associação a microtúbulos), contendo
predominância de resíduos de ácido glutâmico e lisina. Também foi mapeado um
novo sítio de ligação a cálcio, diferente dos sítios comumente associados à ligação
do metal. Tanto o sítio de ligação a microtúbulos como o sítio de ligação a cálcio são
coincidentes e estão em uma porção α-hélice da proteína entre os resíduos 79 – 123
(numeração para seqüência protéica de TCTP de rato), sendo esta a porção mais
36
básica e carregada da proteína (FIGURA 3) (GACHET et al., 1999b; KIM et al.,
2000; BOMMER; THIELE, 2004).
FIGURA 3 – CONSERVAÇÃO, ESTRUTURA SECUNDÁRIA E MAPEAMENTO FUNCONAL
DA PROTEÍNA TCTP
Alinhamento das proteínas TCTP de Schizosaccharomyces pombe, Pisum sativum,
Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster e Mus musculus. A numeração é
referente à seqüência de S. pombe. Resíduos conservados estão destacados em vermelho.
Resíduos da seqüência de camundongo envolvidos na ligação de microtúbulos em MAP-1B
estão destacados em azul. As regiões de ligação a microtúbulos e de ligação a cálcio estão
indicadas por uma barra azul e verde, respectivamente. Resíduos de Serina fosforilados
pela quinase Plk estão destacados em verde. Elementos da estrutura secundária de TCTP
de S. pombe estão localizados acima do alinhamento, sendo folhas β representadas por
flechas amarelas e α-hélices representadas por barras laranjadas. As assinaturas TCTP1 e
TCTP 2 estão indicadas por barras cor-de-rosa (BOMMER; THIELE, 2004).
A estrutura do sítio de ligação a cálcio de TCTP humana determinada por
ressonância magnética nuclear mostrou que o sítio de ligação a cálcio é maior do
que o previamente determinado. Existe a participação de resíduos Asn131, Gln133 e
Asp150, conservados em espécies contendo proteínas TCTP ligantes de cálcio
(FENG et al., 2007). Existem ainda duas seqüências consenso: a assinatura TCTP1
([IFAED] - [GA] - [GASF] - N - [PAK] - S - [GTA] - E - [GDEVCF] - [PAGEQV] -
[DEQGAV]), na região do loop móvel que une dois segmentos da folha β C, e a
assinatura TCTP2 ([FLIV] - x(4) - [FLVH] - [FY] - [MIVCT] - G - E - x(4,7) - [DENP] -
[GAST] - x - [LIVM] - [GAVI] – x(3) - [FYWQ]), que contém resíduos conservados de
um segmento da folha β A e da folha β D bem como do loop que une as duas folhas.
37
A região C-terminal (102 – 172) que contém a assinatura TCTP2 é responsável pela
interação da proteína TCTP com a uma porção citoplasmática da bomba Na
+
-K
+
ATPase e inibindo sua atividade (THAW et al., 2001; JUNG et al., 2004).
Até o momento, foram determinadas as estruturas terciárias de TCTP em
solução de Schizosaccharomyces pombe e Homo sapiens (por Espectroscopia de
Ressonância Magnética Nuclear) e a estrutura cristalográfica de TCTP de
Plasmodium knowlesi e Homo sapiens (Difração de Raio-X) (THAW et al., 2001;
FENG et al., 2007; HINOJOSA-MOYA et al., 2008). A análise destas estruturas
revela que a proteína é composta por 4 folhas beta (A – D) e 3 α-hélices (H1, H2 e
H3). As hélices H2 e H3 estão compactadas formando um grampo que contém
aminoácidos dos sítios de ligação a microtúbulos e cálcio (FIGURA 4).
FIGURA 4 – ESTRUTURA DA PROTEÍNA TCTP
Estrutura secundária e terciária da proteína TCTP. Em A, um esquema de como estão
organizados os elementos da estrutura secundária da proteína TCTP. A proteína possui
quatro folhas β (A – D), representadas por setas, e três α -hélices (H1, H2 e H3),
representadas por retângulos. Em B, a estrutura tridimensional da proteína TCTP, onde
estão apontadas por setas as regiões onde se localizam as assinaturas TCTP1 e
TCTP2, bem como o domínio mais básico da molécula na α -hélice H2. Adaptado de:
THAW et al., 2009.
A análise destas estruturas revela que a proteína é composta por 4 folhas β e 3
α-hélices, sendo que regiões pertencentes a 3 folhas β e uma α-hélice apresentam
similaridade estrutural com chaperonas Mss4, ligante de proteínas Rab quando livre
de nucleotídeos. Esta proteína é classificada como uma GFC (do inglês, guanine
nucleotide-free chaperones). Foi postulado que três resíduos de aminoácidos
conservados (Glu12, Leu74 e Glu134, sendo que neste caso a numeração é para
38
seqüência de TCTP de S. pombe) estão envolvidos na ligação da proteína TCTP a
proteínas G, sugerindo que o controle da proliferação pela TCTP ocorra através de
interação com GTPases (THAW et al., 2001).
2.3.3 Interação com proteínas G monoméricas
Foi descrito que em Drosophila a TCTP atua como um GEF (do inglês, guanine
exchange factor) ou uma proteína acessória para ativação da GTPase Rheb, um
importante componente da via de sinalização da proteína mTOR, que tem papel
central no controle do ciclo e da proliferação celular (HSU et al., 2007). A mesma
atividade foi descrita para proteínas Mss4. Entretanto, a atividade de GEF foi
questionada por outros autores, em função da modesta taxa de troca de
nucleotídeos e pelo fato de que alterações nos níveis de TCTP não afetam algumas
proteínas na via mTOR em que a Rheb está presente, como seria esperado. A
atuação da proteína TCTP como um GEF da Rheb ainda é muito controversa e
recentemente Dong et al. (2009) sugeriram o mecanismo molecular desta possível
função biológica da proteína, afirmando que a TCTP acelera a troca GDP-GTP da
Rheb e regula positivamente a via mTOR (REHMANN et al., 2008; WANG et al.,
2008; DONG et al., 2009).
Outro exemplo da interação com proteínas G é seu envolvimento inibindo
fatores de alongamento na síntese protéica eEF1A e eEF1Bbeta (CANS et al., 2003;
LANGDON; VONAKIS; MACDONALD, 2004). É sugerido que proteínas TCTP
secretadas com atividade de liberação de histamina não possuem conservação nos
aminoácidos responsáveis pela ligação a proteínas G. Porém, a análise de
seqüências de proteínas TCTP sabidamente liberadoras de histamina não corrobora
esta hipótese, pois é evidenciada a liberação de histamina mesmo por proteínas que
possuem os três resíduos Glu12, Leu74 e Glu134 conservados (HINOJOSA-MOYA
et al., 2008).
2.3.4 Regulação do ciclo celular
Entre as possíveis funções da proteína TCTP está a regulação do ciclo celular.
Durante o ciclo celular, a proteína permanece ligada a microtúbulos e desliga do
fuso mitótico após a metáfase. Antes da entrada da célula no ciclo celular ocorre um
39
grande aumento na concentração de TCTP, que permanece estável durante as
fases G1, S e G2. É possível observar a proteína ligada ao fuso mitótico durante a
mitose, sendo que da anáfase em diante não é mais observada ligação aos
microtúbulos. Além disso, células que superexpressam a proteína TCTP têm sua
morfologia alterada e crescimento reduzido. Durante a mitose, a TCTP é fosforilada
por uma pólo-quinase (Plk), sendo que em camundongos os sítios de fosforilação da
TCTP foram identificados como sendo dois resíduos de serina. A ação da pólo-
quinase causa o desligamento da TCTP do fuso mitótico no final da metáfase e
possui um papel fundamental na progressão da anáfase. Por suas propriedades de
estabilização dos microtúbulos, a TCTP superexpressa em células leva a uma
redução no crescimento celular e alterações de morfologia. É sugerido ainda que a
TCTP possa servir como uma proteína mediadora da interação entre microtúbulos
do citoesqueleto e mitocôndrias (GACHET et al., 1999a; YARM, 2002;
RINNERTHALER et al., 2006).
2.3.5 Ligação ao íon cálcio
Além das propriedades descritas anteriormente, a TCTP foi descrita como uma
nova proteína ligadora de cálcio. Os sítios de ligação do metal foram identificados e
não possuem homologia com regiões já descritas de proteínas ligadoras de cálcio. O
primeiro sítio foi descrito para a TCTP de rato, na região entre os aminoácidos 81 e
112. Estudos estruturais mostraram que os aminoácidos Asn131, Gln133 e Asp150
(numeração relativa à proteína TCTP de Homo sapiens) podem formar um sítio de
coordenação para o metal, o que poderia ser feito por qualquer aminoácido Glx e
Asx. Este sítio não coincide com a região descrita primeiramente e é possível que a
diferença dos dois trabalhos resida no fato de que os primeiros autores trabalharam
com a proteína desnaturada para determinação da região ligante de cálcio. O estudo
da estrutura do sítio sugere que é fundamental a disposição tridimensional dos
aminoácidos Glx e Asx para que ocorra a ligação ao íon cálcio. Apesar de um estudo
sugerir o papel da TCTP no transporte de cálcio em células de trofoblastos e de
acreditar-se que a ligação ao cálcio pode estar relacionada com o controle do ciclo
celular, nada mais preciso foi descrito (KIM et al., 2000; ARCURI et al., 2005; FENG
et al., 2007; HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
40
2.3.6 Atividade antiapoptótica e câncer
A atividade antiapoptótica da TCTP fez com que alguns autores a chamassem
de fortilina. Esta proteína é capaz de interagir e estabilizar a proteína Mcl-1 (da
família das proteínas Bcl-2, que regulam a ativação de procaspases), homóloga da
própria Bcl-2, que liga Bax e inibe a liberação do citocromo c da mitocôndria.
Inicialmente, Zhang et al. (2002) sugeriram que a Mcl-1 seria uma chaperona da
proteína TCTP, estabilizando-a. Entretanto, trabalhos posteriores mostraram que a
proteína TCTP liga-se a Mcl-1 e a estabiliza por impedir sua degradação pela via de
ubiquitinação. Portanto, a chaperona seria a TCTP, que quando não é expressa,
impede que a proteína Mcl-1 seja dobrada de maneira correta, acelerando sua
degradação pela via de ubiquitinação dependente de proteossomo. Outra hipótese é
que a TCTP atue como um co-fator de Mcl-1, permitindo sua atividade biológica (LI;
ZHANG; FUJISE, 2001; ZHANG et al., 2002; LIU et al., 2005).
Apesar de ter sido nomeada uma proteína de tumor, a TCTP pode ser
encontrada em diversos tecidos normais. Sua expressão tende a ser aumentada em
alguns tipos de tumores e a proteína já foi indicada como candidata a marcador
tumoral ou alvo terapêutico em câncer pulmonar, colorretal, hepático e ósseo (KIM et
al., 2008; NIFOROU et al., 2008; ZHU et al., 2008; SLABY et al., 2009). Além disso,
o silenciamento do gene da proteína TCTP por siRNA em células de câncer de
próstata reduz o crescimento celular e induz a apoptose (GNANASEKAR et al.,
2009). Foi ainda verificada a redução da expressão da proteína TCTP em células de
câncer de cólon em resposta ao tratamento com Oxilaplatin (YAO et al., 2009). A
proteína TCTP também foi identificada como um possível alvo da droga Artemisina
(fármaco antimalárico e tóxico para células cancerosas) capaz de alquilar e inativar a
proteína presente no citoplasma de Plasmodium falciparum (BHISUTTHIBHAN;
MESHNICK, 2001; EFFERTH, 2007; TELERMAN; AMSON, 2009).
2.3.7 A proteína TCTP como um fator de liberação de histamina
Cerca de dez anos após sua identificação, a proteína TCTP foi descrita como
uma molécula que possui a capacidade de liberar histamina de basófilos e foi
chamada de fator de liberação de histamina (HRF). Este foi encontrado no plasma
de pacientes alérgicos na fase tardia e agranulócitos de pacientes com dermatite
41
atópica. Posteriormente, verificou-se que a proteína não possuía somente a
capacidade de liberar histamina, mas também induzia a liberação de interleucinas de
basófilos (IL-4 e IL-13) e eosinófilos (IL-8). Além disso, no ambiente extracelular, a
TCTP funciona como um fator de crescimento e de ativação de linfócitos do tipo B
(MACDONALD et al., 1995; KANG et al., 2001; MACDONALD et al., 2001).
A princípio, acreditava-se que a TCTP agia como um fator de liberação de
histamina apenas de basófilos de doadores humanos que possuíam em sua
superfície um tipo específico de IgE, denominado então IgE+. Moléculas de IgE que
não causavam liberação de histamina dependente de TCTP foram denominadas
IgE-. Assim, acreditava-se que a liberação de histamina em basófilos dependia da
ligação da proteína TCTP a moléculas de IgE na superfície. Posteriormente,
verificou-se que mesmo células que não expressavam receptor de IgE em sua
superfície sofriam ação do fator de liberação de histamina, mostrando que existe
uma via independente de IgE na liberação de histamina mediada por TCTP.
Atualmente, a hipótese mais difundida é de que a proteína TCTP possui seu próprio
receptor em basófilos, o que ainda não foi demonstrado (MACDONALD et al., 1995;
WANTKE et al., 1999; VONAKIS et al., 2008).
Até os dias de hoje, o mecanismo pelo qual a TCTP induz a liberação de
histamina é pouco conhecido. Análises de citometria de fluxo revelaram que a
proteína liga-se à superfície de basófilos humanos de doadores responsivos ou não
à TCTP. O tratamento de basófilos com TCTP inicia um processo de sinalização
semelhante ao mediado por IgE, pela ativação da enzima Syk quinase com
fosforilação de MEK e ERK, entretanto sem a fosforilação do receptor de IgE e por
uma via diferente da que é induzida por IL-3. A degranulação de basófilios em
resposta à proteína TCTP depende ainda de PIP3, ativação de PI3K e Akt
(VONAKIS et al., 2008).
O aumento da expressão de TCTP foi relacionado com diversos eventos de
sinalização intracelular. Foi demonstrada a fosforilação do receptor de fator de
crescimento EGFR, sugerindo-se que esta ativação seja mediada por Src quinase
em razão da inativação da bomba Na
+
-K
+
ATPase, como ocorre no tratamento de
células com oubaína. A ativação do EGFR gera a conseqüente ativação das vias
que envolvem Ras/Raf/Erk, PI3K/Akt e PLC-γ/PKC. Como evidenciado em tumores,
a superexpressão de TCTP é um estímulo à sobrevivência celular. A via PI3K/Akt
está relacionada com a redução da apoptose, e a inibição de Akt aumenta a
42
apoptose mesmo em células com a expressão de TCTP aumentada (KIM; JUNG;
LEE, 2009).
Além de ser encontrada em pacientes com alergia, a proteína TCTP com
atividade liberadora de histamina é secretada por diversos nematódeos no
organismo hospedeiro, induzindo eosinofilia e liberação de histamina a partir de
basófilos. Estes dados sugerem que a TCTP está envolvida com a resposta
inflamatória em indivíduos parasitados. Parasitas como Schistossoma mansoni,
Brugia malayi e Wuchereria bancrofti possuem a capacidade de secretar a proteína
TCTP no organismo hospedeiro (GNANASEKAR et al., 2002; RAO et al., 2002).
Além destes, o Plasmodium falciparum, causador da malária, também secreta
TCTP no organismo hospedeiro e a TCTP recombinante de P. falciparum é capaz de
causar a liberação de histamina de basófilos e de IL-8 de eosinófilos. Acredita-se
que a TCTP possa ter um papel na proliferação celular do P. falciparum, bem como
sua capacidade de liberar histamina possa auxiliar o parasita em dispersão pelo
organismo hospedeiro. Sabe-se que a droga artemisinina, utilizada para o
tratamento da malária, liga-se diretamente à proteína TCTP e que cepas resistentes
à droga apresentam maior expressão desta proteína (WALKER et al., 2000;
MACDONALD et al., 2001).
Em artrópodes, a proteína TCTP já foi descrita em 62 espécies. O maior
número de proteínas descritas está na classe dos insetos, sendo que apenas na
família Drosophilidae já foram encontradas 14 proteínas. Na classe dos aracnídeos
foram descritas 9 proteínas TCTP, sendo 8 de carrapatos e apenas duas em
aranhas, uma delas da aranha Lycosa singoriensis e outra na aranha-marrom
Loxosceles laeta. Mulenga et al. (2003) demonstraram que a proteína TCTP é
expressa em diversos tecidos do carrapato Dermacentor variabilis, inclusive na
glândula salivar. A partir da biblioteca de cDNA desta glândula, foi clonada e
expressa uma proteína TCTP recombinante que mostrou-se capaz de liberar
histamina a partir da linhagem celular basofílica RBL-2H3. A saliva do carrapato, na
qual foi demonstrada a presença da proteína TCTP, também possuiu atividade de
liberação de histamina. Posteriormente, o mesmo grupo de pesquisadores mostrou
que outros três carrapatos (Dermacentor andersoni, Boophilus microplus e
Amblyomma americanum) expressam a proteína TCTP, todas com alto grau de
similaridade com a TCTP de D. variabilis (MULENGA et al., 2003; MULENGA;
AZAD, 2005). Uma TCTP com atividade liberadora de histamina também foi
43
identificada no carrapato de galinhas Dermanyssus gallinae e foi utilizada como alvo
dos anticorpos em uma potencial vacina (BARTLEY et al., 2009).
Em carrapatos, a função de liberação de histamina da proteína TCTP pode
estar envolvida com a alimentação, aumentando a vasodilatação e facilitando a
ingestão de sangue, mas esta hipótese não é um consenso (BARTLEY et al., 2009).
Com base nos dados de que a proteína TCTP de diversos parasitas é secretada no
organismo hospedeiro fundamenta-se a hipótese de que ela possa estar envolvida
em processos patológicos na resposta do hospedeiro e na resistência dos parasitas
a drogas. O alto grau de conservação da proteína desde eucariotos unicelulares até
plantas e animais sugere que a atividade de citocina foi adquirida tardiamente na
história evolutiva da proteína (BOMMER; THIELE, 2004).
Os dados da literatura mostram que a proteína TCTP no ambiente extracelular
pode apresentar uma atividade do tipo citocina. Apesar de ser uma proteína
citoplasmática, ela é secretada por uma via não clássica ainda pouco estudada.
Apesar da grande quantidade de dados gerados a respeito das funções desta
proteína, suas funções, tanto como citocina quanto como proetína housekeeping,
ainda não são completamente entendidas. O estudo da proteína TCTP em outros
animais pode ajudar na compreensão de sua função celular, bem como revelar
novas características desta proteína.
44
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes
Os sais, compostos orgânicos, ácidos e solventes orgânicos utilizados no
trabalho foram adquiridos da Merck (Darmstad, Alemanha). Da Sigma (St. Louis,
EUA) foram adquiridos a Soro Albumina Bovina, β-mercaptoetanol, marcadores de
massa molecular utilizados nos géis de poliacrilamida, adjuvante de Freund
completo e incompleto, além dos anticorpos anti-IgG de coelho conjugados com
fosfatase alcalina utilizados no ensaio de Western Blot. A imunoglobulina G (IgG)
antiveneno utilizada no Western Blot foi produzida em coelhos neozelandeses por
nosso laboratório. Os reativos BCIP e NBT, bem como o brometo de etídio, utilizado
para visualização de géis de DNA, foram adquiridos da Promega (Madison, EUA).
Da GibcoBRL (Bethesda, EUA) foram adquiridos Glicina, Tris, Acrilamida e bis-
Acrilamida (para preparo da solução de poliacrilamida), TEMED e Dodecil Sulfato
de Sódio (SDS). O corante Azul de Coomassie Brilhante R-250 foi adquirido da
Amresco (Solon, EUA). Para quantificação de proteínas, foi adquirido da Bio-Rad
(Hercules, EUA) o reativo Dye Reagent Concentrate, contendo corante Azul de
Coomassie, Ácido Fosfórico e Metanol. Da empresa Fermentas (Burlington, Canadá)
foram adquiridos os reagentes para biologia molecular: marcadores de massa
molecular, enzimas Pfu e Taq polimerase, ligase e enzimas de restrição XhoI e
BamHI, juntamente com os tampões necessários, além dos dNTPs e do IPTG. Os
oligonucleotídeos utilizados nas reações de PCR foram produzidos sob encomenda
pela Bioneer (Daejeon, Coréia do Sul). Para o cultivo de bactérias foram utilizados
no preparo dos meios de triptona, extrato de levedura e ágar-ágar adquiridos da
HiMedia (Mumbai, Índia). Os antibióticos ampicilina e cloranfenicol foram adquiridos
da USB (Cleveleand, EUA). A agarose e a resina Ni
2+
-NTA agarose foram adquiridas
da Invitrogen (Carlsbad, EUA).
3.2 Animais
Para extração de veneno foram utilizadas aranhas adultas da espécie
Loxosceles intermédia coletadas em Curitiba e Região Metropolitana e mantidas em
condições apropriadas no Laboratório de Matriz Extracelular e Biotecnologia de
Venenos da Universidade Federal do Paraná.
45
Para produção de anticorpos foram utilizados coelhos neozelandeses
pesando entre 2 e 3 kg. Os animais foram fornecidos pelo Biotério do Setor de
ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná. A utilização dos animais foi
aprovada pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da UFPR, sob o
número de protocolo 340 (Em anexo).
3.3 Extração do Veneno por Eletrochoque
O veneno Loxosceles intermedia foi obtido pela aplicação de eletrochoque de
15 V no cefalotórax da aranha e coleta do veneno liberado por micropipeta. Um pool
do veneno de diferentes aranhas foi diluído com tampão PBS para uma
concentração de 2 mg/mL e congelado a -20 °C até o uso (FEITOSA et. al, 1998).
3.4 Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida
Eletroforeses foram realizadas em géis de poliacrilamida (12,5 %) contendo
detergente aniônico Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-PAGE) em condições redutoras
ou não. Os géis foram preparados utilizando o aparato comercial Mini-PROTEAN 3
(Bio-Rad, Hercules, EUA). A solução de poliacrilamida, contendo os catalisadores
APS e TEMED, foi colocada entre placas de vidro e isolada com uma camada de
isobutanol. Após a polimerização, foi removida a camada de água e isobutanol
acima do gel com auxílio de papel filtro. A solução de empacotamento, contendo 5%
de poliacrilamida e os catalisadores, foi colocada acima do gel e nela foi posicionado
o pente para formação dos poços. Após a polimerização, o pente foi removido e os
poços secos com auxílio de papel filtro. A separação das proteínas foi obtida
mediante aplicação de corrente de 25 mA constante, até a separação total das
proteínas. Os géis foram corados em solução contendo Azul de Coomassie Brilhante
R-250 (Amresco, Ohio, EUA) 0,25%, metanol 50% e ácido acético 10% em água
deionizada, durante 10 minutos à temperatura ambiente sob agitação constante. A
descoloração foi realizada com metanol 50% em água deionizada, com sucessivas
trocas da solução de metanol (HARLOW; LANE, 1988).
46
3.5 Dosagem de Proteínas pelo Método de Bradford
A dosagem de proteínas foi realizada pelo método de Azul de Coomassie,
descrito por Bradford (1976), adaptado para leitura em leitor de placas de 96 wells
(Meridian ELX 800). O método baseia-se na diferença de coloração em que o Azul
de Coomassie pode se encontrar. Ao ligar-se a proteínas, o reativo passa da
coloração vermelha para azul, sendo sua absorbância determinada em 595 nm. A
curva padrão foi construída com diferentes quantidades (0,25 µg – 2,00 µg) de Soro
Albumina Bovina e as amostras foram diluídas para entrarem na região de
linearidade da curva. O volume total de cada ponto da curva e das amostras foi de
20 µL. O reativo para dosagem de proteínas Dye Reagent Concentrate foi diluído
adicionando uma parte do reativo em 4 partes de água. Foram adicionados 200 µL
do reativo diluído em cada ponto da curva e nas amostras, e após 5 minutos de
incubação foi determinada a absorbância em 595 nm. Os pontos da curva e as
amostras foram lidos em duplicatas.
3.6 Construção do Vetor de Expressão de TCTP
Com base nos clones presentes na biblioteca de cDNA da glândula de
veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia) produzida em nosso laboratório
(CHAIM et al., 2006), foi realizada uma busca de possíveis sequências que
codificassem proteínas com potencial biotecnológico ou possivelmente relacionadas
com os efeitos nocivos do veneno de aranha-marrom. Utilizando o programa de
alinhamento local BLAST (disponível no site <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>) foi
identificada a seqüência completa codificadora de uma proteína da superfamília
TCTP. Após a pesquisa bibliográfica, decidiu-se pela expressão da proteína, uma
vez que ela poderia esta envolvida com a liberação de histamina em resposta ao
veneno da aranha. Para a clonagem da sequência em um vetor de expressão, foram
desenhados primers específicos para adição dos sítios de restrição XhoI e BamHI às
extremidades da seqüência presente em vetor pSPORT. Foi realizada reação de
PCR para amplificação da seqüência e inserção dos sítios utilizando a enzima Pfu
Polimerase. Para esta reação foram utilizados tampão para Pfu Polimerase (1X)
contendo MgSO
4
, dNTPs (0,2 mM), primers específicos (0,4 µM), cDNA em
pSPORT (100 ng) e enzima Pfu Polimerase (1,25 U/50 µL). A mistura foi incubada
47
em termociclador (My Cycler – Thermal Cycler Bio-Rad, Hercules, EUA) no seguinte
protocolo: 1 ciclo a 94 °C/ 2 min; 35 ciclos a 94 °C/ 30 s – 50 °C/ 30 s – 72 °C/1 min;
1ciclo 72 °C/ 10 min; 1 ciclo de espera a 4 °C/ infinito. O produto desta reação foi
analisado em gel de agarose 2% com brometo de etídio (0,5 µg/mL) em tampão TAE
(Tris 40 mM, acetato de sódio 20 mM e EDTA 1 mM), sendo a corrida eletroforética
realizada em cuba horizontal a 5 V/cm. A visualização do gel foi feita em aparelho de
análise de imagens Chemidoc – XRS e software Quantity One – SW (Bio-Rad,
Hercules, EUA). A banda correspondente à seqüência de interesse foi recortada
com auxílio de bisturi e o DNA extraído com kit de extração de DNA (PerfectPrep
Gel Extractio Kit, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). O fragmento extraído foi
digerido seqüencialmente com as enzimas XhoI e BamHI a (0,5 U/µg DNA, 16h a 37
°C) e inserido em vetor pET14b, também digerido com as mesmas enzimas nas
mesmas condições. A reação de ligação foi feita utilizando: tampão ligase (1X); T4
DNA ligase (3 U/ μl); inserto e vetor provenientes da digestão. O volume final da
reação foi de 20 μl e a ligação feita durante 16 h a 4 °C. Após a ligação, a enzima
ligase foi inativada com a incubação do produto final da reação a 65 °C durante 5
minutos.
3.7 Transformação Bacteriana
A construção foi então transformada em cepa bacteriana Escherichia coli
DH5α quimiocompetente. Todos os materiais utilizados no procedimento foram
previamente refrigerados. À uma alíquota de 100 μl contendo bactérias E. coli DH5α
competentes foi adicionado 1 μl do produto da reação de ligação realizada
anteriormente. As bactérias foram colocadas em tubos de polipropileno e levadas ao
gelo por 30 minutos, com leve homogeneização em alguns momentos.
Posteriormente, o tubo foi passado para banho-maria a 42 °C por 90 segundos e
novamente colocado no gelo por 2 minutos. Após o choque térmico foram
adicionados 900 μl de meio SOC (triptona 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 0,5
g/L, KCl 2,5 mM, MgCl
2
10 mM, MgSO
4
10 mM e glicose 0,2 M) para recuperação
das bactérias. O tubo foi mantido a 37 °C por uma hora sob agitação leve. Após a
recuperação, as bactérias foram plaqueadas em meio LB ágar (triptona 10 g/L,
extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L e agar-ágar 15 g/L) suplementado com
ampicilina (100 μg/mL) e incubadas a 37 °C em incubadora do tipo BOD, por 16h.
48
3.8 PCR de Colônia
Para identificar as colônias que incorporaram a construção, foi realizado PCR
de colônia com primers específicos. Cada colônia escolhida foi recolhida com auxílio
de palito de madeira estéril e colocada em tubo de PCR. Para amplificação do
fragmento, foi realizada reação de PCR nas seguintes condições: Tampão Taq DNA
polimerase (1X); dNTPs (0,2 mM); MgCl2 (1,5 mM); primer específico reverse e
primer T7 promoter (0,2 mM); Taq Polimerase (1,25 U/50 μl). A mistura foi incubada
em termociclador no protocolo a seguir: 1 ciclo a 95 °C/5 min; 35 ciclos a 95°C/30s –
50°C/30s – 72 °C/1min; 1ciclo 72 °C/10 min; 1 ciclo de espera a 4 °C/ infinito. O
produto do PCR foi analisado em gel de agarose 2%.
3.9 Miniprep para Sequenciamento
Os clones transformados escolhidos foram inoculados em 10 mL de meio LB
contendo ampicilina e incubados por 16h a 37 °C em incubadora do tipo Shaker,
com agitação vigorosa. A partir da cultura bacteriana obteve-se o sedimento
bacteriano que foi processado por miniprep (QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAGEN,
Valencia, EUA) para extração dos plasmídios para reação de seqüenciamento. Para
o PCR de seqüenciamento foi utilizado o DYEnamic ET Terminator Cycle
Sequencing Kit (GE Healthcare, Piscataway, EUA), utilizando a miniprep descrita
anteriormente como molde e primers específicos e primers T7 e T7 Terminator. O
seqüenciamento foi realizado em seqüenciador automático ABI Prism 377 (Applied
Biosystems, Foster City, EUA). As seqüências obtidas foram analisadas e então
escolhidos os clones para transformação em cepa de expressão. A sequência
nucleotídica obtida foi traduzida e analisada no programa ProtParam (disponível no
site: < http://www.expasy.ch/tools/protparam.html>) para predição de peso molecular
e ponto isoelétrico da proteína.
3.10 Alinhamento e Análise Filogenética
A análise filogenética da proteína TCTP de Loxosceles intermedia foi
construída com base em 29 sequências de proteínas TCTP de diferentes
organismos obtidas no banco de dados GenBank (acesso no site:
49
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein>). As espécies e os números
de acesso das sequências utilizadas foram os seguintes: Giardia lamblia
(XP_768559), Leishmania major (CAJ05086), Trypanosoma cruzi (XP_806523),
Entamoeba histolytica (XP_656616), Plasmodium falciparum (NP_703454),
Plasmodium knowlesi (P84152), Schistosoma mansoni (AAL11633),
Schizosaccharomyces pombe (NP_594328), Candida albicans (EAK99010), Hydra
vulgaris (Q94587), Homo sapiens (AAG17927), Bos Taurus (XP_589936), Pan
troglodytes (XP_513682), Mus musculus (NP_033455), Rattus norvegicus
(XP_576332), Wuchereria bancrofti (AAK71499), Brugia malayi (P90697),
Caenorhabditis elegans (CAB02099), Drosophila melanogaster (AAF54603), Apis
mellifera (XP_623154), Aedes aegypti (Q1HR79), Dermacentor andersoni
(AAY67699), Dermacentor variabilis (AAL75585), Ixodes scapularis (AAY66972),
Boophilus microplus (AAY67698) e Amblyomma americanum (AAY67700). O
alinhamento das proteínas foi realizado no programa ClustalX2 no modo de
alinhamento múltiplo. A árvore filogenética foi construída com auxílio do programa
MEGA 4.0 a partir do alinhamento gerado anteriormente pelo programa ClustalX2.
Na construção da árvore foi utilizado o método de Máxima Parcimônia e a árvore
consenso foi obtida a partir de 1000 replicatas e enraizada com a seqüência da
proteína TCTP de Giardia lamblia, organismo mais próximo de um ancestral
eucarioto (HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
3.11 Expressão da Proteína TCTP Recombinante
A proteína TCT foi expressa como uma proteína de fusão, contendo um His-
Tag N-Terminal para possibilitar sua purificação. As construções corretas
confirmadas por seqüenciamento foram transformadas em cepas bacterianas de
expressão E. coli BL21(DE3) pLysS competentes e as bactérias plaqueadas em
meio LB Agar contendo ampicilina (100 μg/mL) e cloranfenicol (34 μg/mL). Os clones
transformados foram identificados por PCR de colônia, como descrito anteriormente.
Um teste piloto de expressão foi realizado para determinar o tempo ótimo de
expressão e a concentração ideal do indutor IPTG. Uma colônia isolada foi inoculada
em 10 mL de meio LB contendo ampicilina e cloranfenicol incubada por 37 °C
durante 16h. Esta cultura foi inoculada na diluição 1:100 em 50 mL de meio LB com
os antibióticos, e o crescimento monitorado pela determinação da absorbância em
50
550 nm. Quando as culturas atingiram a absorbância
entre 0,4 e 0,6 foi adicionado o
indutor IPTG em diferentes concentrações (0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2,5 e 5,0 mM) e
coletadas amostras em diferentes tempos (0,5; 1; 2; 3; 4; 5 e 6h) de expressão a 30
°C . As amostras foram analisadas por eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5% em
condições redutoras (5% de β-mercaptoetanol).
Para expressão em larga escala, uma colônia isolada contendo a construção
foi inoculada em 10 mL de meio LB contendo ampicilina e cloranfenicol e incubada
por 16h a 37 °C em incubadora do tipo shaker, com agitação vigorosa. A cultura
saturada foi inoculada na diluição de 1:100 em 1 litro de meio LB contendo
antibióticos. Quando a cultura atingiu absorbância
entre 0,4 e 0,6 foi adicionado o
indutor IPTG na concentração de 0,1 mM e a cultura incubada por 4 h a 23 ºC. A
temperatura mais baixa possibilita o aumento na solubilidade da proteína
recombinante. A cultura foi centrifugada (9000 x g, 9 minutos) e ressuspendida em
40 mL de tampão de ligação (fosfato sódico 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, imidazol
10 mM e lisozima 1 mg/mL). A suspensão bacteriana foi congelada a -80 °C por 16h.
3.12 Purificação da Proteína TCTP Recombinante
A purificação da proteína recombinante expressa foi realizada por
cromatografia de afinidade em resina Ni
2+
-NTA. A suspensão de células foi
descongelada e lisada por 6 ciclos de 10s de sonicação a baixa intensidade. O
lisado foi centrifugado (9000 x g, 15 minutos) e o sobrenadante incubado por 1h a 4
°C com 1 mL de resina Ni
2+
-NTA agarose em agitação moderada. A suspensão foi
empacotada em coluna plástica e lavada exaustivamente com o tampão de lavagem
(fosfato sódico 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM), sendo a absorbância
em 280 nm
monitorada durante todo o procedimento de purificação. A proteína foi
eluída quando a absorbância
atingiu 0,01, utilizando-se tampão de eluição (fosfato
sódico 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM). O eluato foi analisado por
eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e a proteína obtida
dialisada contra PBS pH 7,2.
Uma vez que a proteína obtida não se encontrava pura, o eluato da
cromatografia de afinidade foi dialisado contra tampão Bis-Tris (Bis-Tris 20 mM, 10
mM NaCl, pH 7,2) e ligado em resina trocadora de ânions DEAE-Agarose Bio-Gel
(Bio-Rad, Hercules, EUA) por 30 minutos a 4 °C em agitação moderada. A
51
suspensão foi empacotada em coluna de vidro e a eluição realizada mediante
incremento na concentração de cloreto de sódio, sendo o pico da eluição na
concentração de 25 mM de NaCl. A ligação e a eluição da proteína foram
monitoradas pela leitura da absorbância em 280 nm e alíquotas da proteína
purificada foram analisadas por eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5% sob
condições redutoras. A proteína purificada foi dialisada contra PBS pH 7,2.
3.13 Produção de Anticorpos anti-TCTP
Para verificar a presença da proteína TCTP no veneno bruto de L. intermedia,
foram produzidos anticorpos anti-TCTP. Para isso, a proteína recombinante
purificada emulsionada com adjuvante completo de Freund foi injetada em coelhos
em 3 pontos de aplicação (sendo uma aplicação subcutânea e duas
intramusculares), num total de 20 μg de proteína. Foram realizados mais 3 reforços,
com intervalo de duas semanas entre cada um e utilizando adjuvante de Freund
incompleto. Doze dias após a última imunização, o sangue foi coletado da veia
auricular em tubos de vidro. Os tubos de vidro permaneceram em incubadora do tipo
BOD a 37 °C durante uma hora, para a formação de coágulo. A retração do coágulo
foi obtida pela manutenção dos tubos em refrigerador a 4 °C durante 16 h. A
presença de anticorpos no soro analisada por Western Blot.
3.14 Western Blot
O ensaio de Western Blot foi realizado para identificar a presença da proteína
de TCTP no veneno de aranha-marrom. Após eletroforese em SDS-PAGE 12,5%, as
proteínas foram transferidas do gel para membranas de nitrocelulose (Whatman,
Dassel, Alemanha) com aplicação de voltagem constante (25 V) por 16 horas em
tampão de transferência. As membranas de nitrocelulose foram cortadas em fitas e
bloqueadas com PBS contendo caseína por 1 hora à temperatura ambiente. Para
detecção da proteína TCTP no veneno, fitas contendo 40 µg de veneno de aranha-
marrom foram incubadas com soro de coelhos pré-imunes e hiperimunes à proteína
TCTP recombinante (1:2000) por 2 horas à temperatura ambiente. Para verificar a
reatividade de IgG anti-veneno com a proteína TCTP, fitas contendo 5 µg da
proteína TCTP recombinante foram incubadas com 25 µg/mL de IgG de coelhos pré-
52
imunes e hiperimunes ao veneno de aranha marrom. Em seguida, as membranas
foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de coelho na diluição
1:1000, conjugado à fosfatase alcalina. Para revelação é utilizado um substrato para
enzima fosfatase alcalina, o composto BCIP. Após a remoção do grupamento fosfato
pela enzima, o BCIP forma um dímero insolúvel na reação com composto NBT
(Promega, Madison, EUA) (HARLOW; LANE, 1988).
53
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análises da Sequência da Proteína TCTP de Loxosceles intermedia
Analisando-se as sequências presentes na biblioteca de cDNA da glândula de
veneno da aranha marrom (Loxosceles intermedia), foi identificada uma sequência
que codifica uma proteína da superfamília TCTP (Translationally Controlled Tumor
Protein). Além de suas funções de regulação do ciclo celular, é conhecida a ação
desta proteína como fator de liberação de histamina no ambiente extracelular. Como
já destacado anteriormente, alguns autores relacionaram os efeitos nocivos do
veneno à sua ação histaminérgica (BOMMER; THIELE, 2004; RATTMANN et al.,
2008; PALUDO et al., 2009). Juntos, estes dados baseiam a hipótese de que a
proteína TCTP, produzida na glândula de veneno da aranha marrom, seja inoculada
juntamente com o veneno, causando danos teciduais relacionados à liberação de
histamina. A seqüência protéica obtida a partir da tradução da sequência de TCTP
presente na biblioteca de cDNA possui alto grau de identidade com proteínas
homólogas de parasitas como Plasmodium falciparum, Schistosoma mansoni e o
carrapato Dermacentor variabilis, todas já descritas como fatores de liberação de
histamina (FIGURA 5).
O alinhamento da sequência da proteína TCTP de Loxosceles intermedia com
a sequência de proteínas TCTP de outros 13 organismos mostra que a proteína
TCTP é muito conservada em diferentes espécies. Dos 172 aminoácidos que
compõem a proteína, 9 estão em posições totalmente conservadas e outros 19
estão em posições em que ocorre conservação ou substituição conservativa. A
proteína TCTP de aranha marrom apresenta conservados os aminoácidos
relacionados com a ligação a GTPases e aminoácidos total ou parcialmente
conservados nos sítios de ligação a microtúbulos e a cálcio. A proteína apresenta
aminoácidos do tipo Glx e Asx no sítio de coordenação do íon cálcio (Asp129,
Gln131 e Glu148), além de conservação nos aminoácidos do sítio de ligação a cálcio
descrito inicialmente. Este fato sugere que a capacidade de ligar cálcio pode estar
preservada na proteína TCTP de L. intermedia. Entretanto, foi demonstrado que
proteínas TCTP de carrapatos que possuem o sítio de coordenação conservado são
incapazes de ligar cálcio, indicando que a conformação do sítio é crucial para a
capacidade de interação com o íon (FIGURA 5) (FENG et al., 2007).
FIGURA 5 – CONSERVAÇÃO DA PROTEÍNA TCTP DE Loxosceles intermedia
Alinhamento da proteína TCTP de Loxosceles intermedia com homólogas de diferentes organismos, realizado no programa ClustalX2.
As proteínas das seguintes espécies foram descritas como fatores de liberação de histamina: Dermacentor variabilis, Homo sapiens,
Schistosoma mansoni e Plasmodium falciparum. Aminoácidos conservados são destacados em preto e substituições conservativas
estão destacadas em cinza. Com um asterisco estão marcados os aminoácidos envolvidos em interações com proteínas G. As serinas
(S) destacadas em vermelho são sítio de fosforilação pela enzima pólo-quinase (Plk). As posições das assinaturas TCTP1 e TCTP2
estão indicadas com um traço. O sítio de ligação a microtúbulos (MTB) é indicado por uma barra em cor preta. O sítio de ligação a
cálcio (CaB) está indicado com uma barra na cor cinza.
A conservação dos aminoácidos necessários para interação com proteínas G
ocorre na maioria dos organismos, inclusive na proteína TCTP de L. intermedia
(Glu12, Leu74 e Glu136), o que sugere que a atividade de regulação do crescimento
e proliferação celular pela proteína TCTP é amplamente difundida. Ainda assim,
proteínas TCTP que apresentam a conservação destes aminoácidos podem possuir
atividade de liberação de histamina, como é o caso das proteínas de Homo sapiens,
Plasmodium falciparum e Dermacentor variabilis. A conservação dos 3 resíduos não
é condição suficiente para a interação com proteínas G, pois a molécula deve estar
estruturada de maneira que os três aminoácidos formem uma superfície para o
encaixe de GTPases. Assim, não é possível postular uma determinada atividade da
proteína TCTP com base apenas em sua estrutura primária antes de ensaios
biológicos, ainda mais pelo fato de que esta proteína pode apresentar diferentes
atividades no ambiente extra e intracelular (HINOJOSA-MOYA et al., 2008). Neste
caso, a expressão da proteína TCTP recombinante de L. intermedia é de grande
importância para que possam ser realizados ensaios que irão auxiliar na
determinação da função biológica da proteína na aranha e em seu veneno.
A análise do alinhamento das sequências de TCTP mostra que os sítios de
fosforilação pela pólo-quinase (Plk) são conservados somente nas proteínas TCTP
de camundongo, rato e homem, que são próximas em termos evolutivos. De fato, foi
descrita interação desta enzima com proteínas TCTP de camundongo e homem,
sendo que a fosforilação da proteína causa seu desligamento dos microtúbulos e
permite a progressão da mitose, especificamente na passagem da metáfase para
anáfase. A sequencia da TCTP de L. intermedia não possui os dois sítios de
fosforilação conservados e nenhuma de suas serinas é um sítio para fosfosrilação
pela Plk [E-G-(A/E)-(I/G)-(D/T)-(D/E)-S-(L/T)-(I/V)]. Isto indica que em aranha
marrom, bem como em outros organismos, esta proteína não parece estar envolvida
diretamente com a estabilização dos microtúbulos durante o ciclo celular (YARM,
2002).
A análise filogenética mostrou que a proteína TCTP de L. intermedia tende a
ficar agrupada com as proteínas TCTP de carrapatos, já descritas como fatores de
liberação de histamina (FIGURA 6). Em carrapatos, a atividade de liberação de
histamina foi descrita primeiramente na espécie Dermacentor variabilis. Esta
proteína foi identificada por Western Blot na saliva do animal e sua proteína
56
recombinante foi capaz de promover a liberação de histamina em linhagem celular
basofílica RBL-2H3 (MULENGA et al., 2003).
FIGURA 6 – FILOGENIA DA PROTEÍNA TCTP
Árvore filogenética gerada pelo programa MEGA a partir do alinhamento das proteínas
TCTP de diferentes organismos feito no programa ClustalX2. Somente ramos com valor
de corte superior acima de 50% são mostrados. Clados com valores inferiores foram
unidos. A árvore foi enraizada com a sequência da proteína TCTP de Giardia lamblia. A
filogenia da proteína é consistente com a classificação dos eucariotos, e sugere a origem
57
prematura de um ortólogo da proteína na historia evolutiva deste super-reino. A posição
da proteína TCTP de Loxosceles intermedia está destacada em vermelho, mostrando um
agrupamento com proteínas TCTP de carrapatos caracterizadas como fatores de
liberação de histamina.
A alimentação dos carrapatos duros, como o D. variabilis, é um processo
complexo que envolve a fixação do parasita em seu hospedeiro, o corte da epiderme
e inserção das partes bucais no local da ferida. A fixação do carrapato gera uma
resposta inflamatória e a migração de células de reparação (fibroblastos,
queratinócitos e células endoteliais) para o local da ferida. Os carrapatos podem
permanecer longos dias alimentando-se, e para isso precisam secretar no
organismo hospedeiro algumas moléculas que facilitem a sucção de sangue e
minimizem a resposta imunológica do hospedeiro (KRAMER et al., 2008). A
secreção de uma proteína que atua como um fator de liberação de histamina
aumentaria o fluxo de sangue no local da ferida e permitiria a rápida alimentação do
animal em alguns estágios de seu desenvolvimento (MULENGA et al., 2003).
Proteínas TCTP foram identificadas em outras três espécies de carrapatos:
Dermacentor andersoni, Boophilus microplus e Amblyomma americanum, todas com
alto grau de identidade com a TCTP descrita em D. variabilis (>90%) (MULENGA;
AZAD, 2005). Também foi identificada a secreção de proteínas TCTP por parasitas
no organismo hospedeiro, promovendo a liberação de histamina. Esta proteína é
amplamente conservada em diversos grupos taxonômicos e suas funções
biológicas, bem como sua capacidade de induzir a liberação de histamina, só
recentemente começaram a ser estudadas (HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
A árvore filogenética foi enraizada com a sequência da proteína de Giardia
lamblia, uma vez que alguns autores sugerem que este protozoário seria o mais
próximo de um eucarioto ancestral, por não possuir mitocôndrias e genes que
codifiquem para miosina, dineína e algumas proteínas do citoesqueleto, além de
possuir genes que codificam proteínas bacterianas e contar com uma maquinaria
metabólica simples. Apesar destas evidencias, ainda existem muitas controvérsias
com relação à posição da Giardia lamblia na filogenia dos eucariotos (KEELING,
2007; MORRISON et al., 2007).
A análise filogenética da proteína TCTP praticamente reflete a filogenia dos
eucariotos, apesar da limitação do pequeno número de sequências consideradas
(30). No início da árvore, observam-se organismos protozoários parasitas, os quais
58
são distantes filogeneticamente de seus hospedeiros, o que é também é descrito
mesmo quando são utilizados outros critérios para determinar a filogenia dos
eucariotos. Observa-se então uma grande politomia quando a proteína TCTP
diverge a partir dos protozoários, em decorrência da junção dos ramos com valores
de corte menores que 50%. Os fungos formam um clado único, próximo do cnidário
Hydra vulgaris e do platelminto Schistosoma mansoni. O agrupamento de
platelmintos com fungos em análises filogenéticas da proteína TCTP já foi descrito, e
acredita-se que possa ocorrer em razão de funções semelhantes da proteína nestes
organismos, apesar da grande distancia evolutiva entre eles (HINOJOSA-MOYA et
al., 2008). Dentro da politomia, os ramos formados são baseados em valores de
corte altos, e formam-se ramos distintos para plantas, mamíferos, nematódeos,
insetos e aracnídeos. A proteína TCTP de L. intermedia e de Ixodes scapularis, que
apresentam alto grau de identidade (69%), originou-se a partir de um mesmo
ancestral ortólogo, o qual deu origem também à proteína TCTP do carrapato
hematófago Dermacentor variabilis, que apresenta atividade de liberação de
histamina. Com base na árvore filogenética e nas funções já descritas da proteína
TCTP em diferentes organismos, não é possível inferir a função da proteína com
base na sua filogenia. Fica claro, entretanto, que a proteína surgiu cedo na história
evolutiva dos eucariotos e após a divergência entre este grupo e os procariotos, não
sendo encontrada uma proteína relacionada em bactérias (VENUGOPAL, 2005;
HINOJOSA-MOYA et al., 2008).
4.2 Clonagem da Proteína TCTP de L. intermedia
Uma vez identificada na biblioteca de cDNA da glândula de veneno de L.
intermedia a sequencia codificadora de uma proteína intimamente relacionada com
fatores de liberação de histamina, foram desenhados primers para clonagem da
proteína em um vetor de expressão. Os primers inseriram sítios de restrição para
enzimas XhoII e BamHI nas extremidades da sequencia amplificada a partir da
biblioteca de cDNA, permitindo sua clonagem em pET 14b, o vetor de expressão. Os
primers desenhados contem o sítio de restrição das enzimas, precedidos de
algumas bases para o melhor reconhecimento pela enzima de restrição (CCG no
caso da enzima XhoI e CG no caso da enzima BamHI), os códons de iniciação
(primer foward) e terminação (primer reverse), além de uma porção da sequência
59
alvo (cerca de 26 bases) para permitir o anelamento. A Tm (melting temperature)
dos primers foward e reverse foi de 66,6 °C e 67,9 °C, respectivamente (FIGURA 7).
FIGURA 7 - CLONAGEM DA PROTEÍNA TCTP DE Loxosceles intermedia
Sequência de nucleotídeos e aminoácidos da proteína TCTP glândula de veneno de L.
intermedia. Os primers desenhados para clonagens estão dentro das setas. Os sítios de
restrição das enzimas XhoI (primer foward) e BamHI (primer reverse) estão sublinhados. Os
códons de iniciação (ATG) e terminação (TAA) estão em negrito. A assinatura TCTP2 está
marcada pelo retângulo preto, com destaque para os aminoácidos conservados, em preto. A
assinatura TCTP1 está destacada pelo retângulo vermelho. No interior, o aminoácido circulado
(Glutamina) não é conservado em outros organismos, não permitindo a identificação da
assinatura na Base de Dados ProSite.
A sequência obtida a partir da biblioteca não contém peptídeo sinal que
direcione a proteína para o retículo endoplasmático, apesar de ser descrita a
secreção da proteína por diversos autores. Recentes trabalhos sugerem a secreção
por uma via alternativa ao complexo de Golgi, a via dos exossomos. Esta via foi
descrita em 1985, quando um trabalho baseado em microscopia eletrônica de
transmissão identificou vesículas que se desprendiam de reticulócitos levando em
suas membranas receptores de transferrina (PAN et al., 1985). Estas vesículas
passam pelo sistema de endomembranas, com a internalização de proteínas de
membrana em vesículas revestidas por clatrina. Forma-se então o endossomo inicial
e, após a fusão de várias vesículas e invaginações, os corpos multivesiculares,
contendo vesículas intraluminais. O destino destes pode ser a degradação via
lisossomo ou a fusão com a membrana, liberando as vesículas intraluminais, agora
chamadas exossomos (FÉVRIER; RAPOSO, 2004).
60
A proteína TCTP é uma proteína citosólica e apesar de não possuir peptídeo
sinal N-terminal é secretada por uma via independente do retículo endoplasmático e
complexo de Golgi. Amzallag et al. (2004) utilizando linhagens celulares
provenientes de seres humanos demonstrou que a secreção da proteína TCTP
ocorre possivelmente pela interação com a proteína transmembrana TSAP6, cuja
função ainda não é totalmente conhecida, mas parece estar relacionada com a
supressão tumoral e regulação da via endossomal. A proteína TSAP6 é essencial
para formação dos exossomos e parece exportar seletivamente algumas proteínas
através de vesículas (AMZALLAG et al., 2004; LESPAGNOL et al., 2008).
A tradução da sequência nucleotídica revelou somente a presença da
assinatura TCTP2, mas não da assinatura TCTP1, em função da presença de uma
Glutamina em uma posição conservada (Figura 3). As duas assinaturas são regiões
conservadas ainda não relacionadas com uma função específica da proteína TCTP.
Na assinatura TCTP2, está presente um aminoácido (Glu136) envolvido na interação
com proteínas G, além dos três (Asp129, Gln131 e Glu148) envolvidos na formação
de um sítio para coordenação do íon cálcio. Já a assinatura TCTP1 está presente
em um loop flexível da molécula que liga os dois segmentos da folha β C, sendo
crucial para a correta conformação da molécula. É possível que a substituição não
conservativa de uma alanina por uma glutamina não afete a conformação da folha β
C, uma vez que ocorre em uma região flexível da molécula e que comportaria a
maior cadeia lateral polar da glutamina sem grandes alterações estruturais. Análises
de predição da estrutura secundária e terciária não revelaram alterações em função
desta substituição, e uma análise mais conclusiva poderá ser feita quando for
descrita a implicação funcional da folha β C e do loop que une os dois segmentos da
folha.
Para avaliar a êxito da reação de ligação do inserto ao vetor, foi realizado
PCR do produto da ligação de com os primers específicos descritos anteriormente.
Neste caso, a amplificação pela reação de PCR foi suficiente para comprovar o
sucesso na reação de ligação, uma vez que a clonagem é direcional e o inserto só
poderá estar orientado em um sentido. O resultado desta reação de PCR foi
avaliado em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. A reação foi feita em
duplicata, e o gel mostra o marcador de massa molecular e as duas reações de
PCR. Nas duas reações de PCR ocorreu a amplificação de uma banda entre 500 e
600 pares de base, correspondente ao tamanho esperado de 536 pares de base.
61
Um pouco abaixo de 400 pares de base, nos poços correspondentes às duas
reações de PCR, pode ser vista uma banda mais fraca, provavelmente resultado de
uma amplificação inespecífica, uma vez que pode ocorrer um anelamento mais fraco
do primer com regiões do vetor (FIGURA 8).
FIGURA 8 – PCR DA REAÇÃO DE
LIGAÇÃO
PCR da reação de ligação com primers
específicos para TCTP. 1 marcador de
massa molecular; 2 e 3 produtos das
reações de PCR da ligação. A reação de
PCR foi feita em duplicata e é possível
observar nas duas reações a amplificação
de um produto na altura de 530 pares de
bases, correspondente ao tamanho do
inserto. Gel de agarose 1% corado com
brometo de etídio.
Constatada a ligação, foi realizado PCR de seqüenciamento para confirmação
da construção, a qual estava correta. O seqüenciamento da construção possibilita
verificar se o inserto foi inserido no quadro correto de leitura, além de ser possível
identificar possíveis trocas de bases que eventualmente possam ter ocorrido nas
reações de PCR durante o procedimento de subclonagem do inserto em pET14b a
partir do vetor pSPORT, utilizado na biblioteca de cDNA.
A construção foi inserida em cepa de expressão E. coli BL21 (DE3) pLysS por
eletroporação e foi realizado PCR de 48 colônias utilizando o primer T7 promoter e o
primer específico reverse. A amplificação do inserto ocorreu em 8 das colônias
testadas. Nas reações de PCR de colônia em que ocorreu a amplificação, podem
ser vistas 3 bandas. A mais alta, em torno de 700 pares de base, corresponde à
amplificação do inserto e uma pequena porção do vetor, uma vez que o primer
foward (T7 promoter) anela com o plasmídio. Logo abaixo, pode ser vista uma banda
fraca na altura de 500 pares de base, possivelmente em razão de amplificação
inespecífica, e outra abaixo de 100 pares de base, relativa ao RNA bacteriano. A
62
presença de outras bandas é comum no PCR de colônia, já que o DNA molde
utilizado está contaminado com todo material genético da bactéria (FIGURA 9).
FIGURA 9 – PCR DE COLÔNIA
PCR de colônia após transformação de bactérias quimiocompetentes. Clones 2, 5, 6,
12, 26, 32, 38, e 46 internalizaram a construção e apresentaram amplificação do
inserto. À esquerda é indicado o marcador de massa molecular. Gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio.
A baixa eficiência da transformação pode ser explicada pelo fato de que não
foi realizada a precipitação do produto da ligação antes da transformação. A
presença da enzima ligase reduz a eficiência da transformação, o que pode ser
minimizado com a inativação da enzima. Neste caso, o tempo e a temperatura de
inativação da enzima ligase podem não ter sido suficientes, resultando em uma
baixa eficiência na transformação. Além disso, a transformação por choque térmico
gera menos clones transformantes em relação a uma transformação realizada com
eletroporação. Apesar disso, as colônias positivas foram suficientes para o
prosseguimento. Cada clone teve o inserto seqüenciado e um deles (clone 12) foi
escolhido para expressão da proteína recombinante.
63
4.3 Expressão e Purificação da Proteína TCTP Recombinante
O clone 12, escolhido por possuir a construção correta, confirmada por
sequenciamento, foi utilizado para expressão da proteína recombinante. A massa da
proteína expressa ficou em torno de 23 kDa, correspondente à massa de 22,3 kDa
predita pelo programa Protparam para a TCTP mais o HisTag fusionado. Com base
no teste de indução, a concentração de indutor (IPTG) determinada foi de 0,1 mM e
o tempo de expressão de 4 horas (FIGURA 10). Apesar de os tempos de 5 e 6 horas
apresentarem visualmente uma banda da proteína visualmente maior em todas as
concentrações de IPTG, assim como a partir de 3h na concentração de IPTG 0,05
mM, a maior quantidade de proteína não se reflete em sua solubilidade, que fica
diminuída quando um excesso de proteína é expresso.
FIGURA 10 – TESTE DE INDUÇÃO DA EXPRESSÃO
Teste de indução para expressão da proteína TCTP recombinante. A proteína
foi expressa a 30 °C, em diferentes concentrações de IPTG (0,05; 0,1; 0,5; 1,0;
2,5 e 5,0 mM) e tempos (0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 e 6 horas). Na figura, em cada gel
estão indicadas as massas moleculares, os tempos e a concentração de IPTG.
A proteína TCTP recombinante apresenta massa de aproximadamente 23
kDa. SDS-PAGE 12,5% em condições redutoras.
64
Na literatura, a metodologia utilizada para expressão de proteínas
recombinantes da superfamília TCTP é muito variável. Grande parte dos autores
realiza a expressão da proteína em E. coli, produzindo proteínas fusionadas com a
cauda de 6 histidinas ou GST (glutathione-S-transferase) para permitir a purificação.
Os tempos de expressão variam de 3 a 24 horas em temperaturas de 16 a 37 ºC.
Apenas um grupo, a atividade de liberação de histamina da proteína TCTP de
humanos, realizou a expressão em células de insetos (BHEEKHA-ESCURA et al.,
2000; MACDONALD et al., 2001). A purificação de proteínas TCTP recombinantes
geralmente foi feita mediante apenas um passo de cromatografia, utilizando os tags
fusionados às proteínas. Em alguns casos foram utilizadas outras metodologias de
cromatografia para purificação das proteínas recombinantes, sempre após a
purificação por cromatografia de afinidade. Foi utilizada gel filtração em resina
Sephadex G75 e G50 (BHEEKHA-ESCURA et al., 2000; FENG et al., 2007; DONG
et al., 2009), cromatografia líquida (KIM et al., 2009) e cromatografia de troca iônica
em resina DEAE-Sepharose (KANG et al., 2001). Em um caso foram utilizadas três
etapas cromatográficas, com a cromatografia de afinidade seguida por cromatografia
de troca iônica em resina DEAE-Sephadex e por fim uma etapa de gel filtração em
resina Sephadex G50 (GACHET et al., 1999a).
A temperatura padrão para o teste de expressão é de 30 °C, porém o usual é
determinar a temperatura empiricamente. Assim, para a concentração de IPTG 0,1
mM e tempo de 4h, a melhor temperatura, determinada experimentalmente, foi de 23
°C. Nestas condições de expressão foi possível produzir em torno de 40 mg de
proteína a cada litro de cultura (dado não mostrado). Apesar da grande quantidade
de proteína produzida, a purificação em resina Ni
2+
-NTA agarose não foi satisfatória.
Em 5 µg de proteína purificada aplicadas no gel de poliacrilamida, podem ser
observadas duas bandas de contaminantes em torno de 70 e 30 kDa, além de
diversas bandas de contaminantes abaixo da proteína TCTP recombinante (FIGURA
11 – 5). No gel de purificação da proteína, é possível observar ainda que existe
pequena expressão basal da proteína pela bactéria no tempo 0h (FIGURA 11 –1). O
plasmídio pLysS reprime a expressão na ausência de IPTG, evitando que uma
proteína tóxica para a bactéria seja expressa sem a presença do indutor. No tempo
de 4h (FIGURA 11 –2), a quantidade de proteína expressa é grande, porém pode
ser observado que apenas parte dela é solúvel e está presente no lisado (FIGURA
65
11 –3). A ligação à resina de níquel é satisfatória, pois não é observada uma banda
considerável da proteína no void da cromatografia (FIGURA 11 –4).
FIGURA 11 – PURIFICAÇÃO
DA PROTEÍNA TCTP
RECOMBINANTE EM RESINA
Ni
2+
-NTA AGAROSE
À esquerda estão indicadas as
massas moleculares; 1 - cultura
bacteriana antes da expressão;
2 - cultura bacteriana 4 horas
após adição de IPTG; 3 - lisado
bacteriano contendo a fração
de proteínas solúveis; 4 - void
da cromatografia após
incubação do lisado com resina
Ni
2+
-NTA; 5 - proteína
recombinante eluída da resina.
A banda de baixa massa
presente em 3 e 4 corresponde
à enzima lisozima. SDS-PAGE
12,5% em condições redutoras.
A presença de contaminantes em preparados de proteínas recombinantes
não é incomum. Usualmente é necessário estabelecer quais contaminantes não
podem estar presentes, pois irão afetar os experimentos, e qual deve ser proporção
da proteína em relação aos contaminantes. Purificações utilizando IMAC
(Immobilized metal-ion affinity chromatography), como a cromatografia em resina
Ni
2+
-NTA agarose, geralmente geram produtos com pureza de 70 a 90%. É uma
metodologia simples e rápida, com o resultado de um grau de pureza relativamente
bom. A pureza da proteína recombinante produzida depende de diversos fatores
como o tipo de célula em que a proteína foi expressa, condições cromatográficas
como pH, concentração de sal e tensoativos, além da presença de proteínas que
interajam com a matriz ou com o metal (CROWE et. al., 1995; GUPTAA et. al.,
2003).
Diversas estratégias foram usadas para tentar aumentar a pureza da proteína
recombinante purificada por cromatografia de afinidade em resina Ni
2+
-NTA.
Primeiramente, foi padronizada a relação entre a quantidade de resina e de proteína
recombinante. Um excesso de resina em relação à proteína recombinante resulta
66
em sítios livres para uma interação inespecífica com outras proteínas. A melhor
relação observada, resultando em uma proteína de maior pureza e menor perda da
proteína no void, foi de 1 mL de resina Ni
2+
-NTA para cada litro de cultura
ressuspendido em 40 mL de tampão de ligação. O pH da cromatografia pode ser um
ponto chave na remoção de contaminantes, uma vez que pHs alcalinos (acima de
8,0) facilitam a interação de proteínas com o metal. Em pHs mais baixo, apenas
proteínas que interagem fortemente com o metal permanecem ligadas. Inclusive a
eluição pode ser realizada com um gradiente de pH, fazendo com que uma fração
de alta pureza possa ser obtida. Foi realizada uma tentativa de eluição utilizando um
gradiente de passos de pH. Entretanto, ainda foi observada a presença de
contaminantes na proteína purificada e a precipitação em pHs abaixo de 6,0
(SAMBROOK & RUSSEL, 2001; CUTLER, 2004)..
A concentração de sal no tampão de cromatografia também influencia a força
e especificidade da ligação. Altas concentrações impedem interações menos
específicas, reduzindo a ligação de contaminantes. Foram utilizadas concentrações
crescentes de cloreto de sódio no tampão de ligação, até um total de 2 M. Porém,
concentrações mais altas de sal não reduziram a presença de contaminantes e
ocasionaram a perda da proteína no void. Por fim, foram adicionados ao tampão de
ligação substâncias que reduzem interações hidrofóbicas e inespecíficas, e,
conseqüentemente, a ligação dos contaminantes. O agente tensoativo OTG (octyl-β-
glucoside) foi utilizado para purificação, porém não foi efetivo na redução dos
contaminantes bacterianos. O glicerol, utilizado no tampão de ligação na
concentração de 30% (v/v) foi o mais efetivo para remoção dos contaminantes, e
poderá ser utilizado em purificações futuras (SAMBROOK & RUSSEL, 2001; CUTLER,
2004).
Em outra estratégia de purificação, foram utilizadas condições desnaturantes
na purificação, com incremento na pureza final. A proteína foi recuperada dos corpos
de inclusão a partir do pellet da cultura de bactérias, utilizando tampão desnaturante
(tampão de ligação contendo 8 M de uréia). A ligação da proteína à resina foi
realizada em tampão desnaturante e as lavagens realizadas com o mesmo tampão
contendo 20 mM de imidazol. A renaturação da proteína foi realizada na própria
coluna, com as seguintes etapas da lavagem realizadas sem a presença de uréia. A
eluição da proteína foi feita sem a utilização de uréia. Apesar da redução na
quantidade de contaminantes, a proteína purificada ainda apresentava bandas de
67
proteínas bacterianas. Como o processo de desnaturação e renaturação pode
resultar em uma proteína com uma conformação diferente da conformação nativa,
optou-se por não utilizar a purificação em condições desnaturantes.
Como a idéia de expressar proteína TCTP recombinante é utilizá-la em
ensaios que dependem diretamente da degranulação de mastócitos, sua pureza
deve estar em um nível aceitável (> 98%), uma vez que mesmo pequenas
quantidades de contaminantes bacterianos podem ligar-se a mastócitos causando
liberação de histamina. A maioria dos autores que trabalha com a expressão de
proteína TCTP recombinante não descreve problemas em sua purificação, sendo
que o número de autores que utiliza apenas a cromatografia de afinidade para
purificação é superior ao número de autores que utilizam mais de uma etapa
cromatográfica. Em alguns trabalhos que utilizaram a proteína TCTP como um fator
de liberação de histamina foi realizada a remoção de endotoxinas, especialmente
lipopolisacarídeos (LPS), com a passagem da proteína purificada em colunas de
polimixina B (BHEEKHA-ESCURA et al., 2000; KANG et al., 2001; MACDONALD et
al., 2001; VONAKIS et al., 2003). A interferência do LPS em ensaios de liberação de
histamina pode ainda ser descartada comparando-se a atividade da proteína
purificada com preparados protéicos fervidos (KANG et al., 2001; BARTLEY et al.,
2009), apesar de ser descrito que a quantidade de LPS presente na proteína TCTP
purificada por cromatografia de afinidade não seria suficiente para mimetizar os
efeitos da proteína TCTP (BHEEKHA-ESCURA et al., 2000).
A utilização da cromatografia de troca iônica foi útil para remoção dos
contaminantes observados no eluato proveniente da cromatografia de afinidade em
resina Ni
2+
-NTA. Após a purificação em resina DEAE-Agarose, não são mais
observadas bandas de contaminantes bacterianos quando 5 µg de proteína são
aplicados em gel de poliacrilamida 12,5%. É possível observar ainda que grande
parte da proteína TCTP recombinante ligou na resina DEAE-Agarose, sendo que
detectada uma pequena quantidade no void após incubação da proteína purificada
por cromatografia de afinidade com a resina de troca iônica (FIGURA 12).
68
FIGURA 12 – PURIFICAÇÃO DA
PROTEÍNA TCTP RECOMBINANTE
À esquerda estão indicadas as massas
moleculares; 1 - cultura bacteriana
antes da expressão; 2 - cultura
bacteriana 4 horas após adição de
indutor IPTG; 3 - lisado bacteriano
contendo a fração de proteínas
solúveis; 4 - void da cromatografia
após incubação do lisado com resina
Ni
2+
-NTA; 5 - proteína recombinante
eluída da resina Ni
2+
-NTA; 6 - void da
cromatografia após ligação da proteína
à resina DEAE-Agarose; 7 - proteína
eluída da resina DEAE-Agarose. SDS-
PAGE 12,5% em condições redutoras.
A resina de troca iônica DEAE-Agarose utilizada é composta por beads de
agarose contendo o grupamento funcional dietilaminoetil (DEAE). Funciona como
uma resina trocadora de anions fraca, por começar a perder sua carga em pHs
acima de 9,0. A proteína TCTP de L. intermedia possui ponto isoelétrico (pI) de 4,7,
de acordo com a predição do programa ProtParam. De fato, em pH abaixo de 6,0
inicia-se a precipitação da proteína e em pH 4,0 a proteína esta totalmente
precipitada, sendo possível sua renaturação com a elevação do pH. Assim, optou-se
por realizar a troca iônica em um pH acima de 6,0. Em pH acima do ponto
isoelétrico, a proteína encontra-se carregada negativamente, sendo assim
necessário o uso de uma resina com um grupamento trocador de ânions, como o
DEAE. Neste caso, o tampão de escolha deve possuir a mesma carga do
grupamento da resina de troca iônica, caso contrário o tampão irá participar do
processo de troca iônica causando alterações no pH e reduzindo a capacidade de
ligação da proteína. O tampão utilizado foi o Bis-Tris 20 mM, por possuir carga
negativa e capacidade de tamponamento em um pH menor que tampões contendo
Tris. O pH do tampão deve ser no mínimo uma unidade acima do ponto isoelétrico, e
como o pH deveria ser acima de 6,0 (neste pH já ocorre precipitação da proteína),
optou-se pelo pH 7,2. O tampão utilizado continha ainda 10 mM de cloreto de sódio,
pois em um teste com tubos observou-se que esta força iônica ainda permitia a
ligação da proteína, possivelmente reduzindo a ligação de contaminantes.
A eluição de proteínas ligadas em resinas trocadoras de ânions pode ser feita
com redução do pH ou com aumento da força iônica. Como uma redução no pH
69
poderia ocasionar precipitação da proteína, optou-se pela eluição com aumento
gradual na concentração de cloreto de sódio. O ideal em uma troca iônica é realizar
a eluição com um gradiente contínuo de concentração ou de pH, porém a eluição foi
feita em um gradiente de passos, em que o mesmo tampão com concentrações
crescentes de sal é aplicado sobre a amostra. Este tipo de eluição apresenta a
desvantagem de uma menor resolução, podendo fazer com que duas proteínas
sejam eluídas juntamente. A eluição em gradiente de passos foi satisfatória, uma
vez que a proteína obtida não apresentou os contaminantes presentes antes da
cromatografia de troca iônica. Estes contaminantes não aparecem no void após a
incubação da proteína com a resina DEAE-Agarose, o que sugere que os
contaminantes permanecem ligados na resina, sendo a proteína TCTP a primeira a
eluir em concentrações de 20 e 25 mM de cloreto de sódio.
4.4 Immunoblotting para detecção da Proteína TCTP no Veneno
O soro anti-TCTP recombinante foi produzido em coelhos durante três meses.
Ao final do processo de imunização, o soro foi testado por Western Blot em
diferentes diluições com tiras de nitrocelulose contendo a proteína TCTP
recombinante. Em diluições de 1:8000, o soro ainda foi capaz de reconhecer a
proteína TCTP recombinante, porém com uma reação fraca e pouco específica. A
diluição de 1:2000 apresentou boa sensibilidade, sendo a diluição escolhida para o
ensaio de Westen Blot. Para o reconhecimento da proteína TCTP no veneno, foi
preciso aumentar a sensibilidade incubando a tira de nitrocelulose com o soro
1:2000 por 16 horas a 4 °C.
No ensaio de Western Blot, foram utilizados anticorpos produzidos no
laboratório para verificar a presença da proteína TCTP no veneno de aranha marrom
extraído por eletrochoque e o reconhecimento da proteína TCTP recombinante por
imunoglobulinas antiveneno. Na fita contendo 40 µg de veneno, o soro de coelhos
imunizados com a proteína TCTP recombinante reconheceu uma proteína na altura
de 22 kDa, massa aproximada da predita pelo programa ProtParam. Já a IgG
purificada de coelhos imunizados com veneno de L. intermedia reagiu com a
proteína TCTP recombinante, revelando uma banda na mesma altura da banda
identificada no veneno. A reação foi específica e os anticorpos de coelhos pré-
70
imunes não tiveram reação com proteínas do veneno ou com a proteína
recombinante (FIGURA 13).
FIGURA 13 – IMMUNOBLOTTING PARA IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA TCTP NO
VENENO DE ARANHA-MARROM
À esquerda estão indicadas as massas moleculares. 1 e 2 – 5 µg de proteína TCTP
incubada com 25 µg/mL de IgG de coelhos pré-imunes (1) e hiperimunes (2) ao veneno de
aranha-marrom. 3 e 4 – 40 µg de veneno de aranha-marrom incubados com soro de coelhos
(1:2000) pré-imunes e hiperimunes (4) à proteína TCTP recombinante. As proteínas foram
separadas por SDS-PAGE 12,5% em condições redutoras e transferidas para membrana de
nitrocelulose. A revelação foi feita com anticorpos secundários conjugados com fosfatase
alcalina.
O resultado no ensaio de immunoblotting sugere a presença da proteína
TCTP no veneno de aranha-marrom. A massa de veneno utilizada foi alta quando
comparada com outros trabalhos que utilizaram a mesma estratégia para
identificação de proteínas dermonecróticas no veneno de L. intermedia, que
utilizaram apenas 2,5 µg de veneno para a reação de Western Blot (DA SILVEIRA et
al., 2006; APPEL et al., 2008). A maior quantidade de veneno é necessária, uma vez
que a proteína TCTP parece estar presente em pequena quantidade no veneno
analisado. A expressão da proteína TCTP é regulada na tradução, portanto existe a
possibilidade de que diferentes quantidades da proteína estejam presentes em
diferentes momentos da vida do animal. Entretanto, já foi descrita que as
fosfolipases D são um dos principais componentes do veneno, sendo detectadas
mais facilmente em uma quantidade menor de veneno (MACHADO et al., 2005).
71
Além disso, a proteína TCTP não é secretada pela via clássica do retículo
endoplasmático e complexo de Golgi. A presença da proteína TCTP no veneno deve
ocorrer pela sua secreção via exossomos ou pela secreção holócrina que ocorre na
glândula de veneno. Por possuir um papel intracelular e não ser uma proteína
dedicada à secreção, é compreensível a presença de pequenas quantidades da
proteína no veneno.
Mesmo estando presente em pequena quantidade no veneno, a proteína
TCTP pode ser responsável pela liberação de histamina observada nos eventos
inflamatórios desencadeados pelo envenenamento. Não foram descritos ensaios in
vivo utilizando a proteína como fator de liberação de histamina, porém em ensaios
utilizando basófilos e a linhagem celular basofílica RBL-2H3 a proteína TCTP foi
capaz de promover a liberação de histamina na concentração de 0,1 µg/mL e da
interleucina IL-8 na concentração de 1,8 µg/mL (MACDONALD et al., 2001;
MULENGA et al., 2003).
Já foi descrito que o veneno de aranha marrom possui um componente
termolábil e não dialisável, relacionado com a atividade histaminérgica do veneno. A
proteína TCTP de Loxosceles intermedia identificada na glândula de veneno da
aranha poderia ser estar envolvida com a ação histaminérgica do veneno, uma vez
que possui alto grau de identidade com fatores de liberação de histamina descritos
em diversas espécies. Ensaios in vitro avaliando a liberação de histamina a partir de
linhagem celular basofílica e análises in vivo de eventos relacionados com a
degranulação de mastócitos em resposta à proteína TCTP recombinante poderão
auxiliar a determinação da função desta proteína no veneno da aranha-marrom.
72
5 CONCLUSÕES
O presente estudo identificou uma proteína da superfamília TCTP, expressa
na glândula de veneno de aranha-marrom Loxosceles intermedia. Homólogas desta
proteína já foram descritas em diversos organismos eucariotos, porém este é o
primeiro trabalho a relatar a identificação, clonagem, expressão e purificação de um
homólogo da proteína TCTP em aranhas. Até o momento, haviam sido anotadas no
GenBank apenas duas ESTs, identificadas nos transcriptomas das aranhas Lycosa
singoriensis (aranha-de-jardim) e Loxosceles laeta. Como em outros organismos, a
proteína TCTP da aranha é muito conservada. O alinhamento com homólogas de
outros organismos revelou conservação nas regiões de suas assinaturas TCTP1 e
TCTP2, nos sítios de ligação a cálcio e microtúbulos e na superfície responsável
pela interação com proteínas G monoméricas com atividade de GTPase. A filogenia
da proteína TCTP está em acordo com a filogenia dos eucariotos, e a proteína de L.
intermedia parece estar relacionada com homólogas de carrapatos liberadoras de
histaminas.
A expressão e purificação da proteína TCTP recombinante foi padronizada
durante o estudo. Autores não relatam dificuldades na purificação da proteína
recombinante, porém alguns trabalhos apresentam mais de uma etapa
cromatográfica para a purificação da proteína. Neste estudo, a purificação da
proteína por utilizando cromatografia de afinidade e posterior troca iônica foi
suficiente para remover os contaminantes detectáveis em gel de poliacrialimida. A
remoção dos contaminantes é crucial para a continuidade dos estudos de atividade
da proteína. Com a produção de anticorpos, foi possível detectar a proteína no
veneno de L. intermedia. O papel desta proteína no veneno ainda permanece incerto
e poderá ser elucidado com ensaios biológicos em animais e linhagens celulares
relacionadas a mastócitos.
Diversos artigos relacionam o papel da TCTP como um fator de liberação de
histamina com a capacidade de a proteína liberar de maneira dose-dependente o
conteúdo de histamina presente na linhagem basofílica RBL-2H3. Apesar da
controvérsia a respeito do uso desta linhagem para o estudo de mastócitos, a
liberação de histamina por células RBL-2H3 é aceita como uma medida da atividade
HRF da proteína TCTP. Uma alternativa para o uso da linhagem RBL-2H3 é a
73
purificação de mastócitos peritoneais de camundongos ou ratos. A grande vantagem
no uso dos mastócitos é o maior conteúdo de histamina presente nestas células o
que facilitaria a determinação da atividade de liberação de histamina.
Eventos inflamatórios relacionados à histamina em resposta à TCTP também
poderão ser avaliados com a utilização de ensaios de formação de edema e
aumento da permeabilidade vascular. Até o momento, não foi descrita atividade HRF
in vivo da proteína TCTP. O tratamento de animais com a proteína TCTP e
antagonistas histamínicos permitirá elucidar farmacologicamente a ação da proteína,
bem como comparar o seu efeito biológico com a resposta inflamatória desenvolvida
no acidente com veneno de aranha-marrom.
Outra perspectiva de pesquisa é estudar uma das diversas funções biológicas
em que a TCTP está implicada. Os anticorpos produzidos em coelhos para a
detecção desta proteína poderão servir como um marcador em células tumorais. A
partir desta perspectiva, poderão ser implantadas novas metodologias para o estudo
da proteína, como siRNA e transfecção de células eucarióticas com vetores
contendo o gene da proteína TCTP. Estes ensaios permitirão determinar a influência
dos níveis de expressão da proteína no comportamento de células cancerosas,
abrindo caminho para o estudo de novas drogas que tenham esta proteína como
alvo.
74
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86
ANEXOS
Anexo I – Créditos Obtidos Durante o Mestrado
87
Anexo II – Artigos Publicados na Área de Loxoscelismo
2009
2008
88
Anexo III – Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal (UFPR)
89
Anexo V – Parecer Técnico CTNBio
90
Anexo VI – Participação em Congressos
2008 – 48ª Annual Meeting of the American Society for Cell Biology
2008 – XIV Congresso da Sociedade Brasileira de Biologia Celular
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