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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
JANALLE ROCHA DOS SANTOS
BIOPROSPECÇÃO DE GEOPRÓPOLIS DE Melipona fasciculata SMITH
São Luís
2010
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JANALLE ROCHA DOS SANTOS
BIOPROSPECÇÃO DE GEOPRÓPOLIS DE Melipona fasciculata SMITH
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Maranhão (UFMA),
como parte dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Prof. Dra. Maria Nilce de Sousa
Ribeiro
Co-orientadora: Prof. Dra. Flávia Maria
Mendonça do Amaral
São Luís
2010
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A comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Ciências da
Saúde, em sessão pública, realizada no dia / / , considerou a candidata
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Nilce de Sousa Ribeiro
Doutora em Química Orgânica
(Orientadora)
Prof. Dra. Flávia Maria Mendonça do Amaral
Doutora em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(Co-orientadora)
Profa. Dra. Luce Maria Torres Brandão
Doutora em Química Orgânica
(Examinadora)
Profa. Dra. Denise Fernandes Coutinho
Doutora em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(Examinadora)
Profa. Dra. Maria do Socorro Cartagenes
Doutora em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(Examinadora)
São Luís
2010
À Deus.
À minha avó Isaura, minha grande
companheira, amiga, incentivadora,
exemplo de vida, de compaixão e
de amor ao próximo.
Às minhas mães: Ana e Linair, pelo
imenso amor que sempre me
dedicaram.
Ao Rodrigo por todo afeto, e por
acreditar que o amor pode
sobreviver ao tempo e a distância.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, razão do meu existir, Pai misericordioso, de
infinita bondade, pelo dom da vida, e por ter permitido que eu realizasse mais um sonho.
Obrigada Senhor!
À professora Maria Nilce de Sousa Ribeiro, por ter sido durante esses anos mais
que uma orientadora, uma grande amiga, que se preocupa, que elogia nas horas certas e
chama atenção quando necessário, o verdadeiro amigo é aquele capaz de falar a verdade.
Além disso, é um grande exemplo de superação e determinação a ser seguido. Obrigada
professora pelos ensinamentos, apoio, paciência, e pela oportunidade!
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal
do Maranhão.
À Capes pela concessão da bolsa de Mestrado.
À professora Flávia Maria Mendonça do Amaral pela co-orientação.
À professora Denise Coutinho e Natália Cardoso pela ajuda com a realização do
ensaio de citotoxicidade.
Ao professor Lívio Martins Costa Júnior, do Centro de Ciências Agrárias e
Ambientais/ UEMA, pelo ensaio carrapaticida.
À professora Cristina Andrade Monteiro, do laboratórios de micologia do Centro
Universitário do Maranhão (UniCeuma), pela realização dos ensaios antifúngicos.
Aos companheiros de laboratório: Richard, Mayara, Marisa, Bruno, Natália
Cardoso, Willanir e Christiane Azevedo pela ajuda com a execução de experimentos, e
principalmente por sermos uma família, onde um pode contar com o outro em qualquer
momento, pela maravilhosa convivência e pelo apoio, muito obrigada!
Aos colegas de turma do mestrado (2008-2010), pela amizade, pelos momentos de
alegria, e pelos dias de preocupação que passamos juntos, pois pudemos compartilhar alegrias
e anseios sendo solidários uns com os outros.
Aos meliponicultores da Baixada maranhense pela doação das amostras de
geoprópolis.
À minha avó Isaura, pelo exemplo de vida e de fé em Deus, pelos seus valiosos
ensinamentos, por agir segundo o evangelho, por me acalmar nos momentos de aflição, por
ter sido durante toda a minha vida o meu porto-seguro, por toda dedicação e carinho.
Obrigada vovó!
Ao meu avô Adonias pelos momentos felizes que me proporciona, pelas
brincadeiras de infância, pelo carinho a mim dedicado, e por me fazer sentir sempre uma
criança feliz, por sua alegria de viver. Um velho homem de coração jovem.
À minha querida mãe Ana, um símbolo de mulher guerreira, que nunca se deixou
abater pelas dificuldades que a vida lhe impôs, e mesmo nos momentos difíceis me ensinou o
caminho da verdade e da justiça, e que conquistas são obtidas através de esforço. Por ter
dedicado toda a sua vida e o seu tempo às suas filhas, pois sempre nos colocou em primeiro
lugar.
À minha mãe (n°2), tia Linair, por me mostrar o verdadeiro sentido da vida, pelos
ensinamentos, compreensão, e por sua generosidade, pelo apoio nas conquistas de cada sonho,
por proporcionar que eu chegasse até aqui, sem você esta jornada seria impossível. Agradeço
tamanho amor e dedicação.
À minha irmã Isabella, por ser irmã e amiga, pelo afeto e compreensão, por
sempre acreditar em mim, tendo-me como exemplo aumenta a responsabilidade de sempre
querer fazer melhor, e isto me faz crescer, espero nunca decepcioná-la. Sua determinação e
coragem na busca de seus objetivos me orgulham e me servem de inspiração.
À minha irmã Tuane, que tão menina foi submetida a uma batalha extrema após o
diagnóstico de uma doença incurável, acreditou na vida mesmo quando os médicos
afirmavam a impossibilidade de sua sobrevivência. Esta foi a maior vitória que já presenciei e
puder aprender que nada é impossível quando se tem fé. Tua fé nos salvou, obrigada por ter
acreditado e por estar aqui conosco!
À minha irmã Danielle, que merece um agradecimento especial, pois tanto me
apoiou durante a realização deste trabalho, pelas noites que ficava em minha companhia no
laboratório enquanto realizava processos cromatográficos quase intermináveis, pela sua
dedicação e zelo, por compartilhar dos momentos importantes da vida, Dani mesmo longe sei
que torces por mim. Muita obrigada irmã, você foi o melhor presente.
Ao meu noivo Rodrigo, por ser companheiro e compreensível, por me apoiar em
todas as decisões, e por ser uma pessoa extremamente íntegra em todas as suas atitudes, só
tenho a agradecê-lo pela dedicação, e a Deus por tê-lo colocado em minha vida.
Às minhas madrinhas Maria Helena e Regina, pelo carinho e atenção que sempre
me dedicaram.
A todos os meus primos, tios e amigos, pessoas que me apóiam e com as quais me
sinto mais forte.
Enfim a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
“O Senhor é o meu pastor e nada
me faltará”
Salmos 22:1
RESUMO
Os meliponíneos, abelhas sem ferrão, compreendem um diverso e abundante grupo de abelhas
sociais, que habitam regiões de clima tropical do planeta, especialmente a América do Sul. No
Brasil são conhecidas mais de 400 espécies de abelhas nativas, as quais são responsáveis em
90% pela polinização de vegetais nativos. Melipona fasciculata Smith (tiúba), cultivada há
séculos no Maranhão pela população indígena, produz mel, cera, pólen e geoprópolis, o qual é
formado pela coleta de material resinoso das plantas, misturado com cera produzida pelas
abelhas e terra. O trabalho teve por objetivo realizar bioprospecção (citotóxica, fungicida,
carrapaticida e antioxidante) do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona
fasciculata, assim como caracterizar e/ou identificar frações bioativas do respectivo extrato.
Os geoprópolis de tiúba foram coletados em meliponário na localidade de Cauaçu, município
de Palmeirândia, na Baixada maranhense, em março de 2008. Após análise sensorial o
material foi submetido à maceração em etanol 70% por 48h em temperatura ambiente, filtrado
para separação da terra e concentrado em evaporador rotativo, obtendo-se o extrato
hidrolacoólico de geopropolis (EHAGP). O extrato foi submetido a teste de citotoxicidade
frente à Artemia salina, teste carrapaticida, utilizando-se larvas de Rhipicephalus microplus,
teste de atividade antifúngica e antioxidante, pelo método qualitativo (CCD/Revelação com
DPPH) e quantitativo (método fotocolorimétrico in vitro de seqüestro de radical livre DPPH.
Do extrato foram determinados por método colorimétrico os teores de flavonóides, polifenóis
totais e ácidos fenólicos. O EHAGP foi fracionado através de métodos cromatográficos
monitorados pela atividade antioxidante. Os resultados demonstraram que o extrato
apresentou citotoxicidade frente à Artemia salina (DL
50
= 74,82 µg/mL), ausência de
atividade carrapaticida e antifúngica, mas com atividade antioxidante (55,73%). Os teores de
flavonóides, ácidos fenólicos e fenólicos totais do extrato foram respectivamente 1,84%,
13,08% e 14,92%. O fracionamento cromatográfico do EHAGP monitorado pela ação
antioxidante permitiu através de diferentes separações cromatográficas obtenção das
subfrações C
3
18 e C
3
20, com ação antioxidante. A subfração C
3
20 apresentou 0,17% de
flavonóides, 1,33% de ácidos fenólicos e 1,51% de fenólicos totais, e juntamente com a
subfração C
3
18 foi analisada por CLAE e CLAE/EM. A análise de CLAE/EM da subfração
C
3
20 apresentou picos com m/z majoritários, cujo m/z 314,8 permitiu identificar o flavonóide
kumatakenina, outros m/z como derivados da kumatakenina e outros componentes fenólicos,
os quais podem estar relacionados com ação antioxidante. Os resultados encontrados
demonstram um perfil de qualidade de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith do
município de Palmeirândia-MA, e ainda que o dados podem contribuir para composição do
padrão de qualidade para futura legislação para produtos de abelhas sem ferrão de áreas
tropicais.
Palavras-chave: Melipona fasciculata. Geoprópolis. Polifenóis. Flavonóides. Atividade
antioxidante.
ABSTRACT
Meliponines, stingless bees, comprehend a diverse and abundant group of social bees, which
inhabit tropical whether regions of the planet, especially South America. In Brazil, more than
400 species of native bees are known, which in 90% of the cases are responsible for the
pollination of native vegetables. Melipona fasciculata Smith (tiúba), cultivated for centuries
by the indigenous population of Maranhão, produces honey, beewas, pollen and geopropolis
(bee glue), which is formed by collecting resinous plant material mixed with the wax
produced by bees and soil. The study aimed to carry out (cytotoxic, fungicide, acaricidal and
antioxidant) bioprospecting in hydroalcoholic geopropolis extract of Melipona fasciculata, as
well as characterizing and/or identifying bioactive fractions of the respective extract.
Geopropolis samples of Melipona fasciculata were collected in beehives in the municipal
district of Palmeirândia in the State of Maranhão, in March, 2008. After the sensory analysis
the sample was submitted to maceration in 70% ethanol for 48 hours at ambient temperature,
filtered in order to separate soil and concentrated on rotary evaporator, obtaining the
hydroalcoholic extract geopropolis (EHAGP). The extract was submitted to bioassay of
toxicity with Artemia salina, acaricide test, using larvae of Rhipicephalus microplus, antifugal
assay and antioxidant, qualitative method (TLC/DPPH spray) and quantitatively
(photocolorimetric in vitro method for sequestering free radical DPPH). Concentration of
flavonoids, total phenols and phenolic acids were determined by colorimetric method. The
EHAGP was fractionated by chromatographic methods monitored by antioxidant activity. The
results showed that the extract had cytotoxicity on Artemia salina (LD
50
= 74,82 µg/mL ),the
absence of ticks and antifungal activity, but showed antioxidant activity (55,73%). The levels
of flavonoids, phenolic acids and total phenolics extract were respectively 1.84, 13.08 and
14.92%. The fractionation of EHAGP monitored by the antioxidant action allowed by
different chromatographic separations, obtaing the subfractions C
3
18 and C
3
20, with
antioxidant activity. C
3
20 subfraction showed 0.17% of flavonoids, phenolic acids 1.33% and
1.51% of total phenolics and along with C
3
18 subfraction was analyzed by HPLC and
HPLC/MS. HPLC / MS analysis of
C
3
20 subfraction showed majority
m
/z peaks,
whose m/
z
314.8 identified the flavonoid kumatakenina, and other m/z as kumatakenina derivatives and
other phenolic compounds, which may be related to the antioxidant activity of the extract. The
results demonstrate a quality profile of Melipona fasciculata Smith geopropolis from
Palmeirândia district, and also that the data may contribute to compose the quality standard of
a future legislation for products from stingless bees in tropical areas.
Keywords: Melipona fasciculata. Geopropolis. Polyphenols. Flavonoids. Antioxidant
Activity.
LISTA DE FIGURAS
p.
Figura 1 –
Figura 2 –
Figura 3 –
Figura 4 –
Figura 5 –
Figura 6 –
Figura 7 –
Figura 8 –
Figura 9 –
Figura 10 –
Figura 11 –
Figura 12 –
Figura 13 –
Figura 14 –
Figura 15 –
Quantidade de própolis brasileira (Kg) exportada no período de 2005 a
2007..................................................................................................................
Publicações científicas e patentes sobre própolis depositadas no CAS
no
período de 1872 a 1979.....................................................................................
Publicações científicas e Patentes sobre própolis no período de 1980 a 1999.
Distribuição de patentes sobre própolis por área de maior freqüência ............
Publicações científicas e Patentes sobre própolis no período de 2000 a
2008..................................................................................................................
Distribuição das patentes brasileiras sobre própolis por área de indexação no
período de 1995 a 2008.....................................................................................
Fracionamento cromatográfico (coluna seca-
C1) do extrato hidroalocoólico
de geoprópolis de MeIipona fasciculata (EHAGP)..........................................
Fracionamento cromatográfico (coluna seca - C2) da
Fração A3+4, derivada
do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata
(EHAGP)..........................................................................................................
Fracionamento cromatográfico (coluna úmida – C3) da sub
fração
C2B+C2C, derivada do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de
Melipona
fasciculata(EHAGP).........................................................................................
Antifungigrama do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)frente
às spécies: A – Candida albicans; B- Candida glabrata, C- Candida
tropicalis; D: Candida parapsilosis...............................................................
Cromatograma das subfrações C
3
1 a C
3
24 ....................................................
Cromatograma da subfração C
3
18 obtido através da técnica CLAE/UV.......
Cromatograma da subfração C
3
20 obtido através da técnica CLAE/UV.......
Estrutura química da kumatakenina................................................................
Estrutura química de flavonóide derivado da kumatakenina .........................
22
23
25
25
26
27
36
37
38
45
49
50
50
51
51
LISTA DE TABELAS
p.
Tabela 1 –
Tabela 2 –
Tabela 3 –
Tabela 4 –
Tabela 5 –
Tabela 6 –
Tabela 7 –
Tabela 8 –
Tabela 9 –
Nomenclatura das subfrações derivadas de C3 antes e após as uniões...........
Local de coleta, peso e características sensoriais de geoprópolis de
Melipona fasciculata GP “in natura”.............................................................
Rendimento extrativo, caraterísticas sensoriais e perfil químico do extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)................
Índice de letalidade de Artemia salina quando submetidas ao extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)................
Eficácia do teste de sensibilidade larvar em papel impregnado com extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)...............
Atividade antioxidante (%)* do extrato hidroalcólico da geopropólis de
Melipona fasciculata (EHAGP), pelo método de sequestro do radical livre
estável DPPH
.
..................................................................................................
Valores percentuais de ácidos fenólicos, flavonóides e fenólicos totais
do extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)................
Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides e ácidos fenólicos
Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides, ácidos fenólicos e
atividade antioxidante do extrato hidroalcólico de geoprópolis de Melipona
fasciculata (EHAGP)......................................................................................
Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides e ácidos fenólicos
da subfração C
3
20 derivada do extrato hidroalcólico de geoprópolis de
Melipona fasciculata EHAGP.........................................................................
38
40
41
43
44
46
47
47
49
SUMÁRIO
p.
1
1.1
1.2
1.3
2
2.1
2.2
3
3.1
3.2
3.3
3.3.1
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.2.1
3.4.2.2
3.4.3
3.4.3.1
3.4.3.2
3.4.3.3
3.4.4
3.4.4.1
3.4.4.2
3.4.5
3.4.6
INTRODUÇÃO
...............................................................................................
Própolis e geoprópolis .....................................................................................
Panorama Atual sobre Mercado e Comercialização de Própolis......................
Publicações científicas e patentes sobre própolis.............................................
OBJETIVOS ..................................................................................................
Objetivo geral ..................................................................................................
Objetivos específicos .......................................................................................
MATERIAL E MÉTODOS ..........................................................................
Coleta e acondicionamento de geoprópolis .....................................................
Análise sensorial de geoprópolis in natura .....................................................
Obtenção do extrato hidroalcoólicos................................................................
Análise sensorial do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona
fasciculata (EHAGP) .......................................................................................
Biosprospecção do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona
fasciculata (EHAGP) .......................................................................................
Avaliação da citoxicidade do extrato hidroalcoólico de geoprópolis
(EHAGP)...............................................................................................
...........
Atividade carrapaticida ....................................................................................
Obtenção dos carrapatos ..................................................................................
Teste de sensibilidade larvar ............................................................................
Atividade antifúngica .......................................................................................
Microorganismos .............................................................................................
Padronização do inoculo ..................................................................................
Teste de verificação da atividade antifúngica do extrato .................................
Atividade antioxidante .....................................................................................
Analise qualitativa via CCD/ borrifação com DDPH ......................................
Análise quantitativa .........................................................................................
Abordagem química do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP).......
Determinação da concentração total de flavonóides do extrato
hidroalcoó
lico de geoprópolis (EHAGP) e da subfração C
3
20
.......................
14
14
19
23
28
28
28
29
29
29
29
30
30
30
30
30
31
31
31
32
32
33
33
33
34
34
3.4.7
3.4.8
3.4.9
3.4.9.1
3.4.9.2
3.4.9.3
3.4.10
3.4.10.1
3.4.10.2
4
5
Determinação da concentração de polifenóis totais do extrato hidroalcoólico
de geoprópolis (EHAGP) e da subfração C
3
20 ................................................
Determinação da concentração de ácidos fenólicos do extrato hidroalcoólico
de geoprópolis (EHAGP) e da subfração C
3
20 ................................................
Fracionamento biomonitorado e purificação das frações e de constituintes
químicos do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP).........................
Cromatografia em coluna seca .........................................................................
Cromatografia em camada delgada .................................................................
Cromatografia em coluna úmida .....................................................................
Análise por CLAE e CLAE-EM ......................................................................
Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR).............
Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa acoplada a
espectômetro de massa (CLAE-EM)................................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................
CONCLUSÃO ................................................................................................
REFERÊNCIAS .............................................................................................
ANEXO ...........................................................................................................
35
35
35
35
37
37
39
39
39
40
53
54
70
1 INTRODUÇÃO
1.1 Própolis e Geoprópolis
As abelhas são insetos sociais, que surgiram há mais de 40 milhões de anos,
juntamente com o desenvolvimento das flores. São dentre os insetos, os polinizadores mais
eficientes devido a sua consistência e fidelidade à coleta, além disso, possuem
reconhecimento de cor e memória de odor, possibilitando assim a perpetuação de espécies
vegetais através da polinização (APICULTURA, 2004).
Segundo a classificação de Silveira et al. (2002), as abelhas sociais pertencem à
família Apidae, e encontram-se divididas em duas subfamílias: Meliponinae, conhecidas
como abelhas indígenas sem ferrão, que são amplamente distribuídas em regiões de clima
tropical e Apinae, tendo Apis mellifera L. como a espécie mais conhecida e estudada.
Dentre os produtos originados pelas abelhas, tais como mel, geléia real, pólen,
própolis, geoprópolis entre outros, a própolis vem merecendo especial atenção, devido às suas
propriedades terapêuticas diversificas (GHISALBERTH, 1979; BURDOCK, 1998). Própolis
é uma resina de coloração e consistência variada produzida pelas abelhas, a partir da mistura
de substâncias coletadas de diferentes partes das plantas, como brotos, botões florais e
exsudados resinosos, com as secreções produzidas em seu organismo. É utilizada para fechar
pequenas frestas da colméia, protegê-la contra a invasão de insetos, microorganismos e
embalsamar insetos mortos (GHISALBERTI, 1979; SALATINO et al., 2005).
O uso de extratos de própolis na medicina popular data de 300 a.C. (DA SILVA et
al., 2006). Os egípcios conheciam as propriedades anti-putrefativas da própolis e empregavam
para embalsamar cadáveres. Além disso, foi reconhecida por suas propriedades medicinais
por médicos gregos e romanos como Aristóteles, Dioscorides, Plínio e Galeno (CASTALDO;
CAPASSO, 2002). Na África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente
utilizada devido às suas propriedades cicatrizantes e na segunda guerra mundial foi
empregada em várias clínicas soviéticas (PEREIRA et al., 2002).
No Brasil, o interesse pela própolis aconteceu somente na década de 80 com o
trabalho pioneiro de Ernesto Ulrich Breyer, demonstrando em seu livro, “Abelhas e saúde”, as
propriedades terapêuticas da própolis e sua utilização como antibiótico natural (LIMA, 2006).
Estudos têm demonstrado diversas atividades biológicas de própolis, tais como antibacteriana
(BURDOCK, 1998; KUJUMGIEV et al., 1999; MANTOVANI et al., 2008; CABRAL et al.,
2009; LIBERIO et al., 2009), antiinflamatória (ORSI et al., 2000; KOSALEC et al., 2005),
antifúngica (KUJUMGIEV et al., 1999; ; SFORCIN et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2006;
KALOGEROPOULOS et al., 2009) antioxidante (KUMAZAWA et al., 2000; DA SILVA et
al., 2006; CABRAL et al., 2009), entre outras.
A atividade farmacológica da própolis está diretamente relacionada à sua
composição química, onde já foram identificados mais de 300 compostos incluindo
flavonóides, ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos e cetonas, terpenóides, fenilpropanóides,
esteróides, aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos, dentre outros
compostos (ROCHA et al., 2003; OZKUL et al., 2004; HU et al., 2005; HAYACIBARA et
al., 2005). Sendo também relatada a presença de constituintes inorgânicos tais como o cobre,
manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e silício (MARCUCCI, 1996).
A composição química deste produto é bastante complexa e variada, estando
intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada região visitada pelas abelhas
(MARCUCCI; BANKOVA, 1999; PARK et al., 2002) e com o período de coleta da resina
(ROCHA et al., 2003). Além disso, a variabilidade genética das abelhas rainhas também
influencia na composição química (PARK et al., 1998).
O conhecimento sobre a origem geográfica e, principalmente, a origem vegetal,
aliada à fenologia da planta hospedeira, se faz importante no controle de qualidade e até
mesmo na padronização das amostras de própolis para uma efetiva aplicação terapêutica
(GUZMÁN, 2005).
Na Europa, América do Norte e Oeste da Ásia, a fonte dominante de própolis é o
exsudado do botão de álamo, Populus sp (MARKHAM et al., 1996; WOLLENWEBER;
BUCHMANN, 1997), desta maneira uma menor variação da composição química é observada
nestas regiões (temperadas), onde seus principais compostos bioativos são os compostos
fenólicos, em especial os flavonóides (KOENING, 1985; BURDOCK, 1998; BANKOVA,
2005).
Entretanto, na América do Sul a espécie vegetal do gênero Populus não é nativa,
existindo uma grande diversidade vegetal para a retirada de resina, o que dificulta a correlação
da própolis com a fonte produtora.
Desta maneira a amplitudade das atividades biológicas da própolis é maior em
áreas tropicais do planeta, refletindo a diversidade vegetal destas regiões. Assim, as própolis
brasileiras de Apis mellifera puderam ser agrupadas em 12 grupos distintos, de acordo com a
composição química e atividades biológicas (PARK et al., 2004; CABRAL, et al., 2009).
Atualmente um novo tipo de própolis de
Apis mellifera
proveniente
de colméias
encontradas ao longo das praias e dos rios do nordeste do Brasil
, teve sua origem botânica
identificada como uma espécie de leguminosa, Dalbergia ecastophyllum. Esta própolis,
denominada de "própolis vermelha" por causa da sua coloração vermelha intensa, foi
classificada como o 13º tipo de própolis brasileira, não se enquadrando nos 12 tipos
previamente classificados, e tem demonstrado várias atividades biológicas em ensaios in vitro,
com destaque para atividade antibacteriana (DAUGSCH, 2007; ALENCAR et al., 2007;
CABRAL et al., 2009).
Própolis contém substâncias de alta atividade antioxidante como flavonóides e
outros compostos fenólicos (BURDA- OLESZEK, 2001). Artepillina C, composto da classe
dos fenólicos é o principal componente da própolis verde de Apis mellifera, cuja origem
botânica é Baccharis dracunculifolia, e possui uma habilidade muito grande de sequestrar
radicais livres (PAREDES-GUZMAN et al., 2003; SHIMIZU et al., 2004).
Outras espécies de abelha produzem própolis, entre elas os meliponíneos, abelhas
sem ferrão, que compreendem um diverso e abundante grupo de abelhas sociais, habitam
regiões de clima tropical do planeta, especialmente a América do Sul. No Brasil são
conhecidas mais de 400 espécies de abelhas nativas, as quais são responsáveis em 90% pela
polinização de vegetais nativos (KERR, 1987; BIESMEIJER et al., 1997).
Estas abelhas além de serem fundamentais na polinização da flora nativa,
produzem mel, polén, própolis e geoprópolis, o qual é formado pela coleta de material
resinoso das plantas, misturado com cera produzida pelas abelhas e terra (KERR, 1987;
CASTALDO; CAPASSO, 2002).
Geoprópolis e produtos oriundos deste são usados popularmente para tratar
fraqueza, hemorróidas, gastrites, tosses e promover cicatrização (KERR, 1987).
Os estudos científicos de produtos meliponículas são escassos quando
comparados aos dados de produtos de abelhas com ferrão, principalmente de própolis de Apis
mellifera (GHISALBERTH, 1979; KERR, 1987; BANKOVA; POPOVA, 2007). No entanto,
nos últimos anos tem ocorrido maior interesse por pesquisas com produtos de abelhas sem
ferrão, tanto em relação à sua composição química, como atividade biológica.
Compostos fenólicos de geoprópolis de cinco espécies de abelhas da Venezuela
foram descritos por Tomas-Barberan et al. (1993), onde predominam substâncias do tipo
benzofenonas preniladas.
Bankova et al. (1998), descrevem a constituição química de geoprópolis brasileiro
(estados do Piauí e Paraná) de três diferentes abelhas espalhadas no Brasil, Melipona
compressipes, Melipona quadrifasciata anthidioides e Tetragona clavipes, onde identificaram
mais de cinqüenta compostos, das classes dos ácidos graxos, ácidos aromáticos, flavonóides,
diterpenos e triterpenos.
Nogueira et al. (2004a), demonstraram as características organolépticas, assim
como a presença de flavonóides, terpenos e saponinas em geoprópolis de tiúba, cultivadas em
municípios do Estado do Maranhão.
Dualibe (2004) e Dualibe et al. (2007) em trabalhos experimentais com o
bochecho da solução do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de tiúba, diminuíram em 48,5%
o número de colônias de Streptococcus mutans, na saliva de pacientes, atuando como auxiliar
no tratamento e na prevenção da cárie.
Maciel (2005) utilizando extrato hidroalcoólico de geoprópolis observou
atividade antimicrobiana in vitro contra patógenos orais, permitindo o uso do extrato de
geoprópolis como métodos auxiliares no tratamento das doenças periodontais.
As própolis de abelhas sem ferrão, Tetragonisca angustula, Nannotrigona
testaceicornis, Scaptotrigona sp., Partamona, Melipona sp, mostraram-se altamente eficazes
contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli (FERNANDES JR et al., 2001; MIORIN et
al., 2003).
De acordo com Velikova et al. (2000a) a própolis da abelha Melipona
quadrifasciata apresenta atividade moderada contra Staphylococcus aureus.
Farnesi (2007) verificou atividade antifúngica (Tricophyton rubrum) de própolis
de três espécies de abelhas sem ferrão, Melipona quadrifasciata, Melipona fasciculata e
Scaptotrigona sp, duas destas coletadas no estado do Maranhão, além disso a própolis de
Melipona quadrifasciata demonstrou atividade antibacteriana (Micrococcus luteus,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa).
Gomes et al. (2003) e Gomes (2005) demonstraram em camundongos as
atividades analgésica, antiinflamatória e antiendematogênica do extrato hidroalcoólico de
geoprópolis da Melipona fasciculata Smith (tiúba).
Nogueira et al. (2004a), Costa et al. (2004) e Machado (2008) demonstraram as
atividades biológicas (analgésica e antiinflamatória) assim como características físicas e
físico-químicas de extratos de geoprópolis de tiúba no município de Arari – MA.
Extratos hidroalcoólicos de geoprópolis de Melipona fasciculata da região da
Baixada Maranhense tem cheiro, odor e sabor característicos, são ricos em substâncias
químicas das classes dos compostos fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides) e triterpenos,
segundo Nogueira et al. (2004b) e Dutra (2006).
Adelmann (2005) verificou maior concentração de compostos fenólicos e maior
atividade antioxidante em própolis oriundas de Apis mellifera em relação às própolis de
meliponíneos.
Dutra (2006) e Dutra et al. (2008) analisaram extratos hidroalcoólicos de
geoprópolis de Melipona fasciculata, de três regiões geográficas do Maranhão, encontraram
predominância de substâncias das classes dos compostos fenólicos e triterpenos. Os teores de
fenóis e flavonóides encontrados estão acima do mínimo exigido pela legislação brasileira
para a própolis de Apis mellifera produzidas no Brasil. Os perfis cromatográficos dos extratos
indicaram composição e concentração química diferentes entre as amostras, sugerindo que as
vegetações visitadas pelas abelhas são diferentes.
Dutra et al. (2007) e Catanhede (2008) demonstraram concentração de polifenóis
e flavonóides e citotoxicidade de geopropólis de Melipona fasciculata da região da Baixada
maranhense e Cerrado maranhense.
Própolis de Tetragonisca angustula (jataí), abelha sem ferrão, coletados no
nordeste e sudeste brasileiro, foram analisados por EM/ESI (espectrometria de massas com
ionização por eletospray) , e demonstraram constância na composição química de própolis,
diferentemente da própolis de Apis melifera, cuja composição química é altamente
dependente da região geográfica. Os dados sugerem que a abelha jataí utilize como fonte
vegetal a espécie Sehinus terebenthifolius, planta encontrada em todo o Brasil (SAWAYA et
al., 2006).
Araújo (2007) e Assunção (2008) demonstraram atividade antitumoral de extratos
hidroalcoólicos de própolis e geoprópolis de abelhas sem ferrão, Scaptotrigona sp e
Melipona fasciculata, cultivadas no Maranhão.
Araújo (2009) verificou que o extrato hidroalcóolico de geoprópolis de Melipona
fasciculata apresentou baixa toxicidade em camundongos submetidos a tratamento oral com
doses elevadas, porém induziu toxicidade hepática em tratamento subcrônico.
Farias (2009) avaliou o efeito do tratamento com extrato hidroalcoólico (EH) de
própolis de Scaptotrigona aff postica (tubi) na inflamação de vias aéreas em modelo murino
de asma experimental, verificando reversão completa da patologia.
Própolis de Scaptotrigona sp cultivada no Maranhão, S. depilis e S. bipunctata,
cultivadas em São Paulo, mensalmente coletadas no período de um ano, demonstraram
atividade antioxidante com DE
50
de 43 µg/mL a 100 µg/mL, assim como essa variação é
dependente da espécie de abelha, área geográfica e espécies vegetais visitadas pelas abelhas
(SAWAYA et al., 2009).
Azevedo (2009) detectou alto teor de compostos polifenólicos em geoprópolis de
Melipona fasciculata da Baixada maranhense, e correlacionou com elevada capacidade
antioxidante.
Os efeitos terapêuticos da própolis e geoprópolis de abelhas sem ferrão têm sido
atribuídos às diversas classes de polifenóis, diterpenos e triterpenos, que as compõem
(BANKOVA; POPOVA, 2007; NOGUEIRA, 2008). Estando relacionados com a localização
geográfica e flora visitada pelas abelhas.
A Amazônia é a detentora da maior diversidade de meliponíneos, em especial as
do gênero Melipona (SILVEIRA et al., 2002). No estado do Maranhão Melipona fasciculata
já vem sendo cultivada há séculos pela população indígena para a produção de mel, sendo
também produtora de geoprópolis.
O governo do estado do Maranhão, nos últimos anos inseriu a apicultura e a
meliponicultura dentro dos arranjos produtivos como áreas estratégicas, para desenvolver e
alavancar a agricultura familiar do estado (Programa de Desenvolvimento da Apicultura do
Estado do Maranhão – BNB, 2001). Essas atividades são consideradas, hoje, uma das grandes
opções para a região nordestina, especialmente para a Baixada maranhense, por sua
localização geográfica, possuindo vários ecossistemas, por explorar o potencial nativo da
flora, e por gerar trabalho e renda ao homem do campo.
A Baixada maranhense localiza-se na porção noroeste do estado do Maranhão,
abrangendo extensas áreas sujeitas a inundações periódicas, caracterizando-se pela transição
entre os climas úmidos da Amazônia e semi-árido do noroeste, com grandes precipitações nos
meses de janeiro a maio, e estiagem de julho a dezembro (BRASIL, 1973). A região é
formada pela tensão ecológica ente as formações de cocais ao sul, cerrado a leste, floresta
amazônica a oeste, e sistemas marinhos ao norte (BRASIL, 1984).
1.2 Panorama Atual sobre Mercado e Comercialização de Própolis
O mercado de produtos de abelhas está avaliado em mais de US$ 360 milhões
anuais, com expectativas demonstradas em pesquisas, podendo crescer para cerca de US$ 1
bilhão/ ano (O MERCADO, 2008).
Em todo o mundo tem crescido o interesse por produtos naturais de abelhas de
alta qualidade (SEBRAE, 2008), entre estes produtos incluí-se a própolis, que é utilizada em
diversos países para finalidades variadas (alimentícia, cosmética, farmacológica, entre outras).
Entre os problemas tratados com própolis incluem mau hálito (halitose), eczema, infecções na
garganta, abcessos, inflamações, úlceras e infecções urinárias (PEREIRA et al., 2002).
O consumo de própolis no mundo é estimado em cerca de 700-800 toneladas/ano
(DA SILVA et al., 2006), sendo os maiores produtores China, Brasil, Estados Unidos,
Austrália e Uruguai, segundo SEBRAE (2008), contudo dados apontam o Brasil como o
terceiro produtor mundial, sendo superado pela China e Rússia respectivamente (BNDES,
2007; NUNES et al., 2008). Nota-se a falta de estatísticas oficiais sobre o volume de própolis
produzido anualmente no Brasil, o que é exportado e o que é consumido pelo mercado
interno. Existem apenas avaliações de produtores e exportadores que situam a produção
brasileira entre 49 e 150 toneladas anuais (LUSTOSA et al., 2008).
No mercado interno, o preço da própolis situa-se entre R$ 20-100,00/kg com
média de R$ 50,00/kg dependendo da origem e da qualidade do produto, sendo sua demanda
embasada em suas propriedades cosméticas e terapêuticas. O Japão é o principal mercado
importador da própolis brasileira, absorvendo cerca de 80% da produção (EMBRAPA, 2009).
O que se tem verificado é que o baixo volume e a falta de cuidado na coleta e no
acondicionamento têm feito com que própolis brasileira de algumas regiões tenham o seu
preço reduzido quando da prospecção de negócios. Tais problemas podem ser mitigados com
a difusão de tecnologias de coleta e pela concentração em entrepostos de cooperativas e
associações (NETO; NETO, 2005).
Atualmente, a própolis é usada como um remédio popular e está disponível na
forma de cápsulas, como extrato (hidroalcoólico ou glicólico), como enxaguatório bucal, na
forma de pó, entre outras (CASTALDO; CAPASSO, 2002; SOARES et al., 2006). Também é
empregada em cosméticos e na indústria alimentícia na forma de alimentos funcionais
(SFORCIN et al., 2000; ALENCAR et al., 2005; LUSTOSA et al., 2008).
No Brasil, a maioria dos produtos comercializados à base de própolis é oriunda de
própolis de abelhas africanizadas, notadamente de Apis mellifera, e possui registro no
Ministério da Agricultura (baseados na Instrução Normativa nº 3 de 19/01/2001), devendo
assim ser rotulada de acordo com suas propriedades nutricionais.
Devido à demanda pelo registro de produtos com indicações terapêuticas
contendo, como substância ativa a própolis ou produtos associados, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) classificou os produtos contendo própolis como
medicamentos opoterápicos. Estes são medicamentos de origem animal à base de vitaminas
e/ou minerais e/ou aminoácidos, isoladas ou associadas entre si, com pelo menos um dos
componentes acima dos limites nutricionais estabelecidos pela Portaria n° 33 (BRASIL,
1998), posteriormente revogada pela Resolução RDC nº. 269 (BRASIL, 2005; NUNES et al.,
2008).
No Brasil já foram classificadas 13 tipos distintos de própolis de Apis mellifera,
com destaque comercial para a própolis verde (PARK et al., 2002; PARKK et al., 2004;
DAUGSCH, 2007).
Os estados de São Paulo e Minas Gerais são produtores de própolis verde,
conhecida internacionalmente como green propolis, rica em derivados prenilados do ácido
cumárico (BANKOVA; MARCUCCI, 1999), cuja a principal fonte vegetal utilizada pela
abelha Apis mellifera é a espécie Baccharis dracunculifolia D.C. (alecrim do campo). Esta
própolis devido à sua coloração característica, origem botânica e propriedades
farmacológicas, desperta grande interesse no mercado externo em relação a outros tipos de
própolis brasileiras.
O Japão é o principal importador de própolis verde, sendo amplamente consumida
neste país como suplemento alimentar e na profilaxia de doenças.
Dados da Federação de Apicultores de Minas Gerais revelam que a própolis
produzida no Estado é considerada a melhor do mundo no mercado japonês, onde o
quilograma do produto saltou de US$ 5.00 para US$ 200.00 nos últimos anos (PEREIRA et
al., 2002).
A própolis de alecrim-do-campo constitui, portanto, um produto tipicamente
brasileiro e, devido ao fato de ser altamente eficaz no combate a uma série de microrganismos
(BASTOS, 2001; PARK et al., 2000; MARCUCCI et al., 2001; PEREIRA et al., 2002;
FERRONATTO et al., 2007; LONGHINI et al., 2007; PACKER; LUZ, 2007; SIMÕES et al.,
2008), é altamente valorizada no mercado internacional, sendo que, somente no Japão,
movimenta um mercado da ordem de setecentos milhões de dólares ao ano (NASCIMENTO,
2005; NASCIMENTO et al., 2008).
Como pode ser visualizado na Figura 1, em 2005 o Brasil exportou 264 kg de
própolis faturando com isso 30.454,00 dólares, destes US$ 30,242.00 foram obtidos com
exportações para o Japão, o produto obteve neste ano cotação máxima de US$ 116.68/ Kg,
sendo o estado de São Paulo responsável por toda a exportação contabilizada neste ano
(SEBRAE, 2007).
Em 2006 este valor saltou para US$ 88,980.00 (exportação de 5.650,0 kg de
própolis), correspondendo o Japão a 55,40% deste montante (SEBRAE, 2007), no entanto
neste ano própolis obteve sua menor cotação (US$ 15.75/ Kg). Isto ocorreu em função da
origem e do tipo de própolis, pois neste ano o maior exportador foi o estado do Piauí (5.000
Kg) que arrecadou US$ 36,250.00, já o estado de São Paulo exportou apenas 509 kg, e obteve
lucro maior que o Piauí faturando US$ 49,298.00, desta forma a própolis piauiense foi
comercializada a US$ 7.25/kg enquanto a paulista a US$ 96.85/ Kg.
Em 2007 houve diminuição da exportação de própolis, e o lucro caiu 57,28% em
relação a 2006, arrecandando o Brasil US$ 38,020.00.
Anos
Figura1: Quantidade de própolis brasileira (Kg) exportada no período de 2005 a 2007
.
A própolis brasileira tem características organolépticas peculiares, baixo teor de
metais pesados, além de diversas propriedades farmacológicas, justificando o interesse
japonês neste produto (PEREIRA et al., 2002).
Todos os estados brasileiros praticam a criação de abelhas de forma racional, em
maior ou menor proporção, dada à expansão do número de enxames nativos e de apiários,
apoiada na grande quantidade e variedade da flora apícola brasileira. Soma-se a esse processo,
o aparecimento de diversas empresas especializadas na venda de insumos e acessórios para
criação de abelhas, além da criação de diversas linhas de pesquisa sobre o tema em seus
vários centros de pesquisa espalhados pelo país (NUNES et al., 2008).
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
2005 2006 2007
Quantidade de própolis (Kg)
Devido à diversidade de propriedades farmacológicas e uso nas indústrias de
cosméticos, alimentícia, entre outras, aliada a grande aceitação no mercado, além da
divulgação de inúmeros estudos científicos sobre a própolis, tem-se verificado o aumento do
número de pedidos de patentes de própolis, fenômeno este que tem ocorrido em todos os
continentes, merecendo especial atenção os países asiáticos, que possuem a maioria das
patentes.
1.3 Publicações científicas e patentes sobre própolis
Em levantamento bibliográfico realizado no Chemical Abstracts (CAS) até o ano
de 2008, já foram indexadas 3958 publicações científicas sobre própolis. A primeira
publicação e primeira patente datam de 1872 (US 129204), trata-se de um trabalho americano
que relata uma mistura contendo cera de abelhas e própolis, utilizada para melhorar
fabricação de recipientes de madeira utilizados para armazenamento de ácidos
(ARCHDEACON, 1872).
Até 1979 havia apenas 36 patentes e 249 publicações registradas no CAS, sendo
82 destas pertencentes a grupos de pesquisas da Rússia (Figura 2). A Romênia até então
Países
Figura 2: Publicações científicas e patentes sobre própolis depositadas no CAS no
período de 1872 a 1979.
Legenda: 1= Rússia; 2= Impossível avaliar; 3= EUA; 4= Alemanha; 5= Romênia; 6= França;
7=Ucrânia; 8= Polônia; 9= Bulgária; 10= Dinamarca; 11= Tchecoslováquia
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Publicações
Patentes
Nº de publicações e patentes
liderava o ranking com 11 patentes seguida da Rússia com 8. Percebe-se o domínio dos países
europeus na pesquisas com própolis até então.
Nas décadas de 80 e 90 ocorreu um grande aumento no interesse global pela
própolis, sendo registrados no CAS 1133 trabalhos científicos e um total de 482 patentes.
Pereira et al. (2002) relataram um comportamento de crescimento quase exponencial do
número total de publicações sobre própolis, observando-se um aumento substancial nas
décadas de 80 e 90. Neste contexto surgem os países asiáticos, sendo o Japão o maior
representante, que publicou seu primeiro trabalho em 1985, bem como sua primeira patente
(uma solução à base de própolis com atividade antibacteriana), e em menos de 20 anos, já
havia se tornado o segundo país em número de publicações, perdendo apenas para a Rússia
(205 publicações) e o primeiro em posses de patentes (30%), como pode ser visualizado na
Figura 3.
Com o início do domínio Asiático ocorre também mudanças na forma de
divulgação dos trabalhos, até 1979 dava-se principalmente sobre a forma de artigos e as
patentes não chegavam a 15% total de publicações, já nos anos 80 e 90 passaram a representar
mais de 42%.
Há alguns anos a literatura científica já vinha relatando as propriedades biológicas
da própolis tais como: antibacteriana (LINDENFELSER, 1967; VALDEZ et al., 1989),
antiprotozoária (SCHELLER et al., 1977), antiinflamatória (GHISALBERTH, 1979),
citotóxica (BAN et al., 1983), antifúngica (VALDES et al., 1987), antiviral (AMOROS et al.,
1992), entre outras. Justificando-se assim o grande interesse de pesquisas com própolis, com
isso esse produto natural despertou o interesse mundial e ganhou grande valor de mercado,
onde segundo Pereira et al. (2002) um frasco de extrato alcoólico que era vendido no Brasil
por cerca de 5 a 10 reais chegou a custar 150 dólares em Tóquio.
Figura 3: Publicações
científicas
Legenda
: 1= Rússia; 2= Japão; 3= China; 4= Romênia; 5= Alemanha; 6= França; 7= Polônia; 8=
Hungria; 9= Coréia; 10= Brasil
Na Europa a própolis é considerada como
países como Japão ou Estados Unidos, é classificada como aditivo alimentar de baixa
restrição (GREENAWAY
al.
, 2000), isso pode explicar o fato de a maioria das patentes
alimentos ou química de alimentos, diferentemente dos países europeus e do Brasil, onde a
maioria das patentes relaciona
principais áreas relacionadas à patentes de p
Figura 4: Distribuição
de patentes sobre própolis por área de maior freqüência.
Legenda
: 1= China; 2= Japão; 3= Rússia; 4= Coréia; 5= Romênia; 6= Alemanha; 7= Brasil
0
50
100
150
200
250
1 2
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2
Nº de publicações e patentes
Distribuição percentual de
patentes por área
Países
científicas
e Patentes sobre própolis no período de 1980 a
: 1= Rússia; 2= Japão; 3= China; 4= Romênia; 5= Alemanha; 6= França; 7= Polônia; 8=
Hungria; 9= Coréia; 10= Brasil
Na Europa a própolis é considerada como
um produto medicinal e em outros
países como Japão ou Estados Unidos, é classificada como aditivo alimentar de baixa
restrição (GREENAWAY
et., 1991; MARCUCCI, 1995;
BURDOCK, 1998;
, 2000), isso pode explicar o fato de a maioria das patentes
japonesas serem relacionadas a
alimentos ou química de alimentos, diferentemente dos países europeus e do Brasil, onde a
maioria das patentes relaciona
–
se com a aplicação farmacêutica. A Figura 4 demonstra as 3
principais áreas relacionadas à patentes de p
rópolis e seus respectivos países detentores.
Países
de patentes sobre própolis por área de maior freqüência.
: 1= China; 2= Japão; 3= Rússia; 4= Coréia; 5= Romênia; 6= Alemanha; 7= Brasil
3 4 5 6 7
3 4 5 6 7
e Patentes sobre própolis no período de 1980 a
1999.
: 1= Rússia; 2= Japão; 3= China; 4= Romênia; 5= Alemanha; 6= França; 7= Polônia; 8=
um produto medicinal e em outros
países como Japão ou Estados Unidos, é classificada como aditivo alimentar de baixa
BURDOCK, 1998;
BANKOVA et
japonesas serem relacionadas a
alimentos ou química de alimentos, diferentemente dos países europeus e do Brasil, onde a
se com a aplicação farmacêutica. A Figura 4 demonstra as 3
rópolis e seus respectivos países detentores.
de patentes sobre própolis por área de maior freqüência.
: 1= China; 2= Japão; 3= Rússia; 4= Coréia; 5= Romênia; 6= Alemanha; 7= Brasil
8 9 10
Publicações
Patentes
Óleos essenciais
e cosméticos
Alimentos e
química de
alimentos
Insumos
farmacêuticos
De 2000 a 2008 foram contabilizados 2576 publicações cinetíficas sobre própolis
no CAS, sendo a maioria destas pertencentes à China (715), o que reflete a nova potência
econômica mundial e o poderio chinês, com 523 patentes (figura 5) de um total de 1322,
destacando-se as patentes na área farmacêutica. A primeira publicação chinesa relata os
efeitos farmacológicos e aplicação clínica de própolis (ZHIBIN, 1982). Desta forma a China
que iniciou as pesquisas com própolis somente na década de 80, desbancou Rússia, e Japão
tanto no número de publicações, quanto na quantidade de patentes.
Países
Figura 5: Publicações científicas e Patentes sobre própolis no período de 2000 a 2008
Legenda: 1= China, 2= Japão, 3= Rússia, 4= Coréia, 5= Brasil, 6= Alemanha, 7= Itália, 8= Ucrânia, 9= França,
10= Polônia, 11= Romênia.
O Brasil teve seu primeiro trabalho científico publicado em 1984, relatando a
atividade antibacteriana de própolis contra Staphylococcus aureus, em comparação a outros
antibióticos (SZEWCZAK et al., 1984). Já a primeira patente brasileira foi depositada
somente em 1995, tratando-se de um gel dental contendo própolis em sua formulação,
indicado para promover a limpeza dos dentes e prevenir gengivites (ITICE, 1995).
Até o ano de 2008, foram indexados 73 trabalhos científicos brasileiros sobre
própolis no CAS, inúmeros destes com informações concentradas nos estudos químicos e
biológicos da própolis. Portanto o Brasil é considerado um dos líderes em números de
publicações, no entanto observa-se apenas 31 patentes depositadas no mesmo período (Figura
6).
Pereira et al. (2002) relatam que o reduzido número de patentes brasileiras,
reflete-se ao fato da universidade brasileira não ter o hábito de proteger suas atividades de
0
100
200
300
400
500
600
700
800
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
PUBLICAÇÃO
PATENTE
Nº de publicações e patentes
pesquisa por meio de patentes, ao contrário do Japão que d
em relação à publicação de trabalhos. A distribuição de todas patentes brasileiras de acordo
com área de indexação está ilustrada na Figura 6, onde observamos que as patentes contendo
própolis predominam nas áreas dos insum
alimentos.
Figura 6:
Distribuição das patentes b
período de 1995 a 2008.
Considerando a importância dos produtos apícolas de abelha com e sem ferrão, e
que no estado do Maranhão
produz geopró
polis, o qual
presente trabalho visa realizar bioprospecção do geoprópolis de
cultivada na Baixada maranhense, como forma de demonstrar a potencialidade biológica deste
produto natural.
0
2
4
6
8
10
12
14
Q u a n tidad e d e pa ten tes
pesquisa por meio de patentes, ao contrário do Japão que d
eposita maior número de patentes
em relação à publicação de trabalhos. A distribuição de todas patentes brasileiras de acordo
com área de indexação está ilustrada na Figura 6, onde observamos que as patentes contendo
própolis predominam nas áreas dos insum
os farmacêuticos, óleos essenciais e cosméticos, e
Áreas das patentes brasileiras
Distribuição das patentes b
rasileiras sobre própolis por área de indexação no
Considerando a importância dos produtos apícolas de abelha com e sem ferrão, e
que no estado do Maranhão
a meliponicultura, atravé
s do cultivo de abelhas sem ferrão,
polis, o qual
possui características farmacológicas e químicas
presente trabalho visa realizar bioprospecção do geoprópolis de
Me
cultivada na Baixada maranhense, como forma de demonstrar a potencialidade biológica deste
Insumos farmacêuticos
Óleos essenciais e cosméticos
Alimentos e química de
alimentos
Biorreguladores agroquímicos
Métodos Bioquímicos
Ligas metálicas
Detergenetes e agentes ativos
de superfície
eposita maior número de patentes
em relação à publicação de trabalhos. A distribuição de todas patentes brasileiras de acordo
com área de indexação está ilustrada na Figura 6, onde observamos que as patentes contendo
os farmacêuticos, óleos essenciais e cosméticos, e
rasileiras sobre própolis por área de indexação no
Considerando a importância dos produtos apícolas de abelha com e sem ferrão, e
s do cultivo de abelhas sem ferrão,
possui características farmacológicas e químicas
próprias, o
Me
lipona fasciculata,
cultivada na Baixada maranhense, como forma de demonstrar a potencialidade biológica deste
Insumos farmacêuticos
Óleos essenciais e cosméticos
Alimentos e química de
alimentos
Biorreguladores agroquímicos
Métodos Bioquímicos
Ligas metálicas
Detergenetes e agentes ativos
de superfície
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Realizar bioprospecção do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona
fasciculata Smith
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar o efeito citotóxico, eficiência carrapaticida, atividade antifúngica e
ação antioxidante dos extratos hidroalcóolicos de geoprópolis de Melipona fasciculata;
• Determinar qualitativa e quantitativamente os teores de polifenóis presentes no
extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith;
• Identificar frações e/ou substâncias isoladas do extrato hidroalcoólico de
geoprópolis de Melipona fasciculata Smith;
• Indicar parâmetros para agregar valores ao geopropólis de Melipona
fasciculata, como forma de contribuir para o desenvolvimento do agronegócio no Estado do
Maranhão.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta e acondicionamento de geoprópolis
Os geoprópolis de Melipona fasciculata Smith foram coletados em meliponário da
localidade Cauaçu, no município de Palmeirândia da Baixada maranhense, durante o mês de
março de 2008, utilizando-se espátula esterilizada na parte interna da colméia e
acondicionados em frasco de vidro escuro esterilizados e codificados como GP (NOGUEIRA,
2005; DUTRA, 2006).
O município de Palmeirândia possui área geográfica de 525,64 Km
2
,
dividida em
3 distritos e 95 localidades. De acordo com dados do Censo 2007, Palmeirândia possui 18.105
habitantes e densidade demográfica de 35,2 hab/Km
2
, com latitude de 02º 38
'
43” e longitude
44º 53' 42” (IBGE, 2007).
3.2 Análise sensorial de geoprópolis in natura
Os geoprópolis GP foram submetidos à análise sensorial de: aroma, cor e sabor
(MARCUCCI, 1998; BRASIL, 2001).
3.3 Obtenção do extrato hidroalcoólico
Os geoprópolis (GP) foram turbolizados, em álcool etílico a 70%, macerados por
48h, e logo depois, filtrados para separação da parte inorgânica (terra). A solução extrativa
obtida foi concentrada em evaporador rotativo e o extrato foi seco até peso constante. Foi
determinada a percentagem de extrativos (NOGUEIRA, 2005; DUTRA, 2006; DUTRA et al.,
2008). O extrato hidroalcoólico de geoprópolis foi codificado como EHAGP, acondicionado
em frasco âmbar e mantido sobre refrigeração.
3.3.1 Análise sensorial do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata
(EHAGP)
O EHAGP foi submetido à análise sensorial de aroma, cor e sabor (MARCUCCI,
1998; BRASIL, 2001).
3.4 Bioprospecção do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata
(EHAGP)
3.4.1 Avaliação da citoxicidade do extrato hidroalcoólico de geoprópolis
(EHAGP)
O bioensaio foi realizado com ovos de Artemia salina, de acordo com o
método de Meyer et al. (1982), com algumas modificações. Os ovos foram
incubados em salina sintética, em estado de saturação de oxigênio e em
temperatura ambiente. Após 48 horas, as larvas foram separadas dos ovos
remanescentes e incubadas por mais 24 horas nas mesmas condições. Em seguida,
estas larvas foram colocadas em soluções dos extratos hidroalcoólicos de
geoprópolis nas concentrações de 10 µg/mL , 100 µg/mL e 1000 µg/mL por 24 horas.
Após esse período houve a contagem das larvas sobreviventes.
Os ensaios foram realizados em triplicatas. Para obtenção da DL
50
, foi utilizada a
regressão linear. Cada teste foi acompanhado de controle negativo, contendo apenas as larvas
em salina sintética mantidas sob as mesmas condições descritas para o extrato hidroalcoólico
de geoprópolis e do controle positivo com dicromato de potássio.
3.4.2 Atividade carrapaticida
3.4.2.1 Obtenção de carrapatos
Fêmeas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus ingurgitadas foram coletadas de
bezerros mestiços, Holandês X Zebu, naturalmente infestados, e alocadas em estufa BOD,
com temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa ≥ 80%, por 15 dias para a postura. Os ovos
(0,2g equivalente aproximadamente a 4000 ovos) foram coletados e acondicionados em
seringas descartáveis modificadas, e novamente levadas à estufa por 15 dias para a eclosão
das larvas.
3.4.2.2 Teste de sensibilidade larvar
Foram utilizadas larvas com idade de 14 a 21 dias de eclosão. O teste de
sensibilidade sobre larvas de R. (B.) microplus foi realizado de acordo com Stone; Haydock
(1962) e adaptações de Leite (1988). Cerca de 156 a 214 larvas de carrapato foram colocadas
entre dois papéis de filtro (2 X 2 cm cada), e impregnado com 0,4 mL do extrato EHAGP
(250 mg/mL), formando um “sanduíche”. Este sanduíche foi colocado dentro de um envelope
de papel filtro não impregnado, com pregadores plásticos. O envelope foi acondicionado em
estufa a 27 ºC e UR ≥ 80%, durante 24 horas quando as larvas vivas e mortas foram contadas.
Foram realizadas quatro repetições, utilizando como controle negativo etanol 70% e como
contole positivo cipermetrina (50 mg/mL). Os resultados do teste de sensibilidade larvar
foram corrigidos de acordo com a fórmula de Abbott (1925).
3.4.3 Atividade antifúngica
3.4.3.1 Microrganismos
Os microrganismos utilizados foram isolados clínicos obtidos de vários materiais
procedentes de um laboratório particular de São Luís, os quais foram previamente
identificados (Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida
parapsilosis) e estocados no Laboratório de Micologia do Centro Universitário do Maranhão,
durante o mês de janeiro de 2010.
3.4.3.2. Padronização do inóculo
As cepas ficaram mantidas em meio agar Sabouraud dextrose-cloranfenicol a uma
temperatura de 4ºC, sendo os repiques de 24 horas feitos em meio BHI (Brooth Heart Infusion
- Acumedia Manufactures) ou em meio RPMI-1640 líquido e incubados a 37 ºC em estufa
BOD utilizados para os testes. Após crescimento, os inóculos fúngicos foram padronizados
para aproximadamente 10
6
UFC/mL de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de
McFarland (CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002).
3.4.3.3. Teste para verificação da atividade antifúngica do extrato
Os isolados clínicos foram inoculados em meio líquido BHI (Brain Heart Infusion
- Acumedia Manufactures) e incubados a 37°C/24h, em estufa bacteriológica, a fim de se
obter uma turvação equivalente a 0,5 da escala de McFarland, correspondendo a uma
concentração de 10
6
células/mL (CLSI, 2002). Os ensaios de avaliação da atividade
antifúngica do extrato de geoprópolis foram conduzidos utilizando cavidades em placas
proposto por McGinnis (1980) e com recomendações do CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute – NCCLS, 2002). Utilizou-se placas de Petri de 100 x 20 mm de diâmetro,
nas quais foram colocados 20 mL de ágar Sabouraud Dextrose (CRITERION Dehidrated
Culture Media) fundido e preparado segundo recomendações do fabricante sobre o qual, após
solidificação e incubação por 24hs a 37ºC em estufa bacteriológica, foram inoculados por
semeadura (SHADOMY; ESPINEL-INGROFF, 2000) 100 µL da solução padrão dos
inóculos, com auxílio de swabs estéreis. Alíquotas de 50 µL das soluções de extrato diluídas
foram adicionadas em perfurações de aproximadamente 6mm de diâmetro feitas no meio de
cultura sólido com cânulas de vidro estéreis. As soluções do extrato para uso foram
preparadas diluindo-se as mesmas em Tampão Fosfato 0,1M pH 7,4 a 5% de etanol P.A,
realizando-se diluições seriadas de 1:4, 1:6, 1:8. As soluções foram esterilizadas por filtração
imediatamente antes do uso por meio de uma unidade filtrante estéril 0,22 µm (Millipore)
(BENOUDIA et al., 1988, SHADOMY et al., 1995; McGINNIS, 1980).
O controle positivo foi preparado usando-se solução do fungicida fluconazol em
concentrações de 1µg/mL para C. albicans e Candida parapsilosis, 4 µg/mL para C.
tropicalis e 32 µg/mL para C. glabrata segundo recomendações do CLSI (2002). A solução
de fluconazol foi preparada em tampão fosfato 0,1M pH 7,4 a 5% de etanol P.A, segundo
recomendações utilizadas rotineiramente como padrão em estudos de atividade
antimicrobiana do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002).
Utilizou-se tampão fosfato 0,1M pH 7,4 no seu estado original como controle negativo.
A atividade antifúngica do extrato foi verificada através da medição do halo de
inibição (mm) do crescimento fúngico causado pelo extrato.
Os testes foram realizados em triplicatas e após 24 horas de incubação a 37°C,
realizadas as medições dos diâmetros dos halos formados. Se o extrato apresentasse indução
da formação de halos seria então diluído e suas respectivas diluições usadas em testes de
microdiluição para estabelecimento da CIM (Concentração Inibitória Mínima) (Clinical and
Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002).
3.4.4 Atividade Antioxidante
3.4.4.1. Análise qualitativa via CCD/ Revelação com DPPH
O EHAGP foi submetido à cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando
como adsorvente sílica gel 60 GF
254
(MERCK), e como eluente hexano/ acetona (8:2), A placa
foi ativada em estufa a 110º C, durante 2 horas, e eluída em cuba cromatográfica (COLLINS,
et al., 1997). O cromatograma foi visualizado em lâmpada ultra-violeta - UV (254 e 366 nm),
e revelado com borrifamento de solução de DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazil) 5%, para
vizualização do perfil dos componentes com atividade sequestrante de radical livre.
(WAGNER; BLANDT, 1995).
3.4.4.2. Análise quantitativa
A dosagem de atividade antioxidante foi realizada pelo método fotocolorimétrico
in vitro de sequetro do radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazil), segundo Brand-
Willians et al. (1995). As amostras foram preparadas a partir da solução dos extratos
hidroalcóolicos de geopropólis com concentração de 500 µg/mL. As diluições foram
realizadas em concentrações de 10, 25, 50, 100
µg/mL. A cada diluição preparada adicionou-
se 1mL da solução de DPPH (40 µg/mL em etanol) a 3,0 mL de soluções dos extratos diluídos
em etanol. Os brancos foram feitos para cada concentração, que ao invés do DPPH,
adicionou-se apenas 1 mL de etanol aos extratos diluídos nas mesmas concentrações das
amostras. O controle negativo foi preparado com 1 mL de DPPH e 3,0 mL de etanol. Como
controle positivo foi utilizado solução padronizada de rutina que possui alta capacidade
antioxidante. A solução de DPPH possui uma coloração roxa intensa e a ação antioxidante de
um extrato pode ser visualizada pelo progressivo descoloramento da solução, ao final do qual
a mesma torna-se amarelada. Trinta minutos após a adição de DPPH às amostras, foi realizada
a leitura em espectrofotômetro de UV-Vis em 517nm. O decréscimo nos valores de
densidade ótica das amostras foi correlacionado aos do controle e estabelecida a percentagem
de descoloração do radical DPPH, expressa pela equação:
%de inibição = (Absorbância controle – Absorbância amostra) x 100
Absorbância controle
3.4.5 Abordagem química do extrato hidroalcóolico de geoprópolis EHAGP
O EHAGP foi submetido à abordagem química para verificação de compostos das
classes dos fenólicos, alcalóides e terpenos (MATOS, 1997).
3.4.6 Determinação da concentração total de flavonóides do extrato hidroalcoólico de
geoprópolis EHAGP e da subfração C
3
20
A concentração de flavonóides foi determinada utilizando o método colorimétrico
com cloreto de alumínio (AlCl
3
) para formar o complexo, usando espectrofotômetro Cary 50
UV-Vis a 425 nm. Concentrações de quercetina (Merck) foram usadas como padrões e os
resultados obtidos foram expressos como grama (g) de quercetina por 100 mL de extrato
hidroalcoólico de geoprópolis (%). (WOISKY; SALATINO, 1998; CHAILLOU et al, 2004;
FUNARI; FERRO, 2006).
3.4.7 Determinação da concentração de polifenóis totais do extrato hidroalcoólico de
geoprópolis EHAGP e da subfração C
3
20
A concentração dos polifenólicos totais foi determinada utilizando o reagente de
Folin-Ciocalteau e carbonato de sódio a 20%, usando espectrofotômetro Cary 50 UV-Vis a
760 nm. Concentrações de ácido gálico foram usadas como padrões (WOISKY; SALATINO,
1998; CHAILLOU et al, 2004; FUNARI; FERRO, 2006).
As determinações espectrométricas obtidas (3.4.6 e 3.4.7) foram realizadas em
triplicata e os resultados obtidos expressos como média ± desvio padrão.
3.4.8 Determinação da concentração de ácidos fenólicos do extrato hidroalcoólico de
geoprópolis EHAGP e da subfração C
3
20
A concentração de ácidos fenólicos foi determinada pela diferença entre as
quantidades dosadas de flavonóides e fenólicos totais (WOISKY, 1996).
3.4.9 Fracionamento biomonitorado e purificação das frações e de constituintes químicos
do extrato hidroalcoólico de geoprópolis EHAGP
3.4.9.1 Cromatografia em Coluna Seca
O EHAGP (7,4g) foi submetido a fracionamento (cromatografia em coluna seca),
utilizando coluna plástica empacotada com 110g de sílica gel 60 (0,040-0,063 mm) MERCK
a 10%, eluída com hexano/acetona 8:2 (Coluna 1). Ao término da eluição a coluna 1 foi
cortada em 09 fragmentos, cada fragmento extraído com acetona, posteriormente etanol e
filtrados fornecendo as subfrações codificadas de A
1
a A
9
. Estas foram submetidas à
cromatografia em camada delgada (CCD) conforme item 3.4.9.2, para obtenção de perfil
cromatográfico e unidas com base nas suas semelhanças cromatográficas, fundamentadas nos
valores de R
f
das manchas separadas, sua coloração e intensidade relativa, conforme
vizualização em lâmpada UV (256 e 366 nm), revelação com reagente Folin – Ciocalteau,
solução de DPPH e iodo sublimado, conforme Figura 7.
Figura 7: Fracionamento cromatográfico (coluna seca – C1) do extrato hidroalocoólico de
geoprópolis de MeIipona fasciculata (EHAGP).
As subfrações A1 e A2 foram eliminadas, pois não apresentaram massa. A fração
A 3+4 (2,0 g) foi submetida a fracionamento por cromatografia em coluna seca (coluna 2),
utilizando 98g de sílica gel 60 (0,040-0,063 mm) MERCK a 10%, e como eluente hexano/
acetona (8:2). A coluna foi fragmentada em 10 subfrações codificadas como C
2
1 - C
2
10, as
quais foram extraídas com acetona e etanol, filtradas e submetidas a CCD, (COLLINS, 1997).
As placas cromatográficas foram reveladas com DPPH (na busca de substâncias bioativas
antioxidantes), reagente de Folin-Ciocateau (busca de compostos fenólicos), conforme Figura
8.
EHAGP
(7,40g)
A1
A2
A3
A4
A9
A8
A7
A6
A5
A6
0,53g
A 3+4
2,00g
ELIMINADOS
A5
0,78 g
A7
0,68g
A8
0,76g
A9
3,22g
CC Seca, Sílica gel 60
Hexano/acetona 8:2
Figura 8: Fracionamento cromatográfico (coluna seca - C2) da Fração A3+4, derivada do
extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP).
3.4.9.2 Cromatografia em camada delgada
Frações e subfrações derivadas de EHAGP foram submetidas à cromatografia em
camada delgada (CCD), utilizando como adsorvente sílica gel 60 GF
254+366
(MERCK), e como
eluente hexano/ acetona (8:2), ou hexano/ acetona (9:1). As placas foram ativadas em estufa a
110º C, durante 2 horas, e eluídas em cubas cromatográficas. Os cromatogramas foram
visualizados em lâmpadas UV (254 e 366 nm), e reveladas com iodo sublimado, e/ou
reagente de Folin- Ciocalteau, e/ou solução de DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazil) (WAGNER;
BLADT, 1995; COLLINS, et al., 1997;).
3.4.9.3 Cromatografia em Coluna Úmida (CCU)
A3+4
(2,05g)
C
2
C
2
3
C
2
4
C
2
9
C
2
8
C
2
7
C
2
6
C
2
5
C
2
A
(0,08 g)
C
2
C
(0,27 g)
CC Seca/ Sílica
gel 60
C
2
6
(0,44 g)
C
2
B
(0,86 g)
C
2
1
C
2
1
A subfração C
2
B+C
2
C foi submetida à CCU, utilizando 40 g sílica gel 60 (0,040-
0,063 mm, MERCK, eluída com hexano/acetona em sistema de crescente polaridade obtendo-
se 24 subfrações (codificadas C
3
1 a C
3
24). Estas foram submetidas à CCD (conforme intem
3.6.2), vizualizadas em lâmpada UV (254 e 366 nm) reveladas com reagente Folin –
Ciocalteau e solução de DPPH. Com base nos cromatogramas obtidos, fundamentados nos
Rfs das substâncias, as subfrações foram unidas em 14 subfrações ( tabela 1) conforme Figura
9.
Figura 9: Fracionamento cromatográfico (coluna úmida – C3) da subfração C2B+C2C,
derivada do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP).
Tabela 1: Nomenclatura das subfrações derivadas de C3 antes e após as uniões
Subfrações
Nomenclatura após uniões
C
3
1+C
3
2+C
3
3+C
3
4 C
3
A
C
3
5+C
3
6 C
3
B
C
3
7+C
3
8 C
3
C
C
3
9+C
3
10+C
3
11+C
3
12+C
3
13 C
3
D
C
3
14 C
3
14
C
3
15+C
3
16+C
3
17 C
3
E
C
3
18 C
3
18
C
3
19 C
3
19
C
3
20 C
3
20
C
3
21 C
3
21
C
2
B+C
2
C
(1,14 g)
Obtenção de
24
subfrações
(C
3
1 a C
3
24)
C
3
17
0,10g
C
3
E
0,08g
C
3
14
0,10g
C
3
D
0,12g
C
3
C
0,06g
C
3
B
0,35g
C
3
A
0,02g
C
3
18
0,09g
C
3
19
0,10g
C
3
20
0,09g
C
3
21
0,08g
C
3
22
0,01g
C
3
23
0,01g
C
3
24
0,003g
CC Úmida/
Sílica gel 60
Hexano/acet
ona
Sistema
crescente
polaraidade
C
3
22 C
3
22
C
3
23 C
3
23
C
3
24 C
3
24
3.4.10. Análise por CLAE e CLAE-EM:
3.4.10.1 Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR):
As subfrações C
3
18 e C
3
20 foram submetidas à CLAE-FR em cromatógrafo
líquido (Surveyer Finnigan LC), utilizando coluna THERMO (100 x 4,6 mm; tamanho de
partícula 3 µm), acoplado a detector de UV. As amostras foram solubilizadas em etanol
(10mg/mL) e desgaseificadas em ultrassonicador, filtradas com filtro de 0,22 µm (Millipore) e
injetadas no sistema CLAE. A coluna foi eluída usando gradiente linear de água e ácido
fórmico (solvente A) e acetonitrila (solvente B), mantendo 80% do solvente B e 20% do
solvente A em 15 minutos, 60% do solvente B em 30 minutos, 40% do solvente B em 45
minutos e 20% do solvente B em 60 minutos, com vazão foi de 1,0 mL/ min.
3.4.10.2 Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (CLAE-EM):
A subfração C
3
20 foi diluída em etanol e 20 µL da solução foram analisados em
euipamento SHIMADZU, dotado de detector de arranjo fotidiodo acoplado a espectrômetro
de massas ESQUIRE 3000 PLUS, BRUKER DALTONICS via fonte de ionização por
eletrospray (ESI). Os espectros de UV foram obtidos na faixa de 270 a 450 nm. Foi utilizada
uma coluna de fase reversa C18, Zorbax-5B-RP-18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), e como fase móvel
água/ácido acético (19:1 v/v) (solvente A) e metanol grau CLAE (solvente B). A vazão foi de
120 uL/ min, a temperatura mantida a 35ºC. O gradiente aplicado foi 20% do solvente B em
15 minutos, 40% do solvente B em 30 minutos, 60% do solvente B em 45 minutos, 80% do
solvente B em 60. O tempo de varredura total foi 60 minutos, realizado na Central analítica da
Universidade de São Paulo, em São Paulo-SP. A identificação dos constituintes foi feita por
comparação dos respectivos espectros de massas com espectros da literatura.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os geoprópolis denominados GP foram coletados na localidade Cauaçu no
município de Palmeirândia – MA , Baixada maranhense, e em análise sensorial apresentaram-
se como fragmentos de resíduos de diferentes tamanhos, com granulometria heterogênea,
inodoros, insípidos e com coloração marrom, conforme tabela 2.
Tabela 2. Local de coleta, peso e características sensoriais de geoprópolis de Melipona
fasciculata GP “in natura”.
Geoprópolis
Local da
Coleta
Peso (g)
Características sensoriais
Odor Cor Sabor
GP
Palmeirândia/
Cauaçu
2083,4 Inodoro Marrom Insípido
Legenda: GP: Geoprópolis
Dutra et al. (2008) analisaram amostras de geoprópolis coletadas nos municípios
de São Bento, Arari e São João Batista, da Baixada maranhense, em agosto de 2003, e
demonstraram que os mesmos são inodoros, amargos e de coloração marrom escura.
O rendimento extrativo foi de 1,46%, e o extrato hidroalcoólico apresentou sabor
amargo, coloração marrom, e odor balsâmico (tabela 3).
Segundo Dutra et al. (2008) a predominância de terra na geoprópolis “in natura”
é o fator que não permite uma diferenciação sensorial, mas nos extratos hidroalcoólicos, livres
de terra, observa-se diferenças principalmente no odor.
Estudos realizados por Dutra (2006) e Dutra et al. (2008) em extratos de
geoprópolis de Melipona fasciculata da Baixada maranhense, demonstraram rendimentos
extrativos variando de 1,1 - 5,83 %. Azevedo (2009) analisando amostras de geoprópolis da
mesma região verificou variações de rendimentos extrativos de 0,72 - 3,03%, já Batista
(2008) em geoprópolis do Cerrado maranhense obteve variação de extrativos de 0,24 a
10,02%. Cunha e Ribeiro (2009) obtiveram rendimentos extrativos de 1,77% a 10,68% em
geoprópolis da Baixada maranhense.
Azevedo (2009) realizou análises sensoriais de 13 extratos de geoprópolis de M.
fasciculata da Baixada Maranhense, observando a predominância de coloração marrom, sabor
amargo (61,5 %), e aroma resinoso (69,3%). Abreu et al. (2007) e Abreu (2008) em estudos
semelhantes com geoprópolis de abelhas sem ferrão (M. fasciculata Smith) da região do
Cerrado maranhense obtiveram características similares. Cunha e Ribeiro (2009) observaram
em estudos com geoprópolis da Baixada maranhense extratos com colorações variando de
amarelo-claro à marrom escuro.
Tomás-Barberán et al. (1993) estudaram a relação entre a cor dos extratos
metanólicos de própolis de Apis mellifera e sua composição, indicando que extratos
avermelhados escuros continham grandes quantidades de compostos fenólicos, enquanto os
incolores não continham substâncias fenólicas. Os extratos amarelos apresentaram compostos
fenólicos, mais em pequenas quantidades quando comparados com os extratos escuros.
As características sensoriais e granulometria são parâmetros para a identidade e
controle de qualidade de própolis de Apis mellifera (BRASIL, 2001), os quais dependem da
procedência e da origem botânica (MARCUCCI, 1996).
A abordagem química do EHAGP mostrou a presença fortemente positiva de
compostos fenólicos e triterpenos (Tabela 3).
Tabela 3. Rendimento extrativo, caraterísticas sensoriais e perfil químico do extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP).
Legenda: (+) Presença: + + + fortemente positivo; + + positivo; + fracamente positivo; (-) Ausência.
EHAGP= Extrato hidroalcoólico de geoprópolis
Nogueira et al. (2004), Nogueira (2005), Marques (2006), Abreu et al. (2006),
Dutra et al. (2008), Azevedo (2009) e Cunha e Ribeiro (2009) verificaram a predominância de
compostos fenólicos, flavonóides e triterpenos em amostras de geoprópolis de abelhas sem
ferrão (Melipona fasciculata Smith), originárias do estado do Maranhão.
Velikova et al. (2000a), isolaram 3 compostos terpênicos em própolis de
Melipona quadrifasciata anthididioides, coletada no estado do Paraná, sendo um deles
responsável por sua atividade antibacteriana.
Extrato Rendimento
Características sensoriais Perfil químico
Odor Cor Sabor
Comp.
fenólicos
Triterpenos Alcalóides
EHAGP 1,46% Balsâmico Marrom Amargo +++ +++ _
Bankova et al. (1998) analisaram amostras de geoprópolis de 3 espécies de
abelhas indígenas onde identificaram mais de 50 compostos, em sua grande maioria da classe
dos compostos fenólicos e terpenos.
Vários estudos têm relacionado a composição química de geoprópolis à flora
visitada pelas abelhas, no Brasil onde existe uma maior diversidade florística estas
apresentam-se com variadas composições químicas, associadas à localização geográfica e
espécie de abelha.
O Brasil é considerado um dos países de maior biodiversidade do mundo,
caracterizada nos seus principais biomas que são: mata atlântica, floresta amazônica, cerrado,
caatinga e pantanal. Essa megadiversidade encontra-se associada a uma riqueza de
diversidade cultural com forte influência da cultura indígena, africana e européia, marcando
fundamentalmente o conhecimento popular sobre o uso e manejo de recursos naturais para
fins terapêuticos até o presente momento. A utilização de biodiversidade pelo homem
confunde-se com a sua própria existência, a domesticação de espécies úteis está diretamente
associada à civilização. A busca de novos produtos oriundos da diversidade biológica
(bioprospecção), permite agregar valor à espécies desconhecidas ou pouco valorizadas.
O Maranhão por ser um estado de transição geográfica, com características
climáticas peculiares e grande diversidade florística, favorece a distribuição de abelhas sem
ferrão em seu território, seus produtos (própolis, geoprópolis, mel, cera, entre outros) são
utilizados há séculos pelos índios, e popularmente para tratar inúmeras doenças ou como
alimento, no entanto existem poucos estudos que avaliem a citotoxicidade de própolis de
abelha sem ferrão, bem como os geoprópolis produzidos por meliponíneos.
O bioensaio com larvas de Artemia salina, um crustáceo encontrado em águas
salinas e salobras de todo o mundo, é considerado simples, eficiente e de baixo custo
(ALMEIDA, 2002). É utilizado como screening para determinação de atividades biológicas,
como anticancerígenas, inseticida e antimalárica, monitorando os princípios responsáveis por
essas ações e também para determinar a toxicidade de produtos (OJALA et al., 1999;
MATTHEWS, 1995). Desta forma foi avaliada a citotoxidade de EHAGP frente ao
microcrustacéo Artemia salina, como forma de triagem, com o objetivo de conhecer a
potencialidade de ação biológica do extrato, conforme dados da Tabela 4.
Tabela 4. Índice de letalidade de Artemia salina quando submetidas ao extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)
AMOSTRA
% DE LETALIDADE EM 24 HORAS
DL
50
µg/mL
10
µg/mL
100
µg/mL
1000
µg/mL
EHAGP 3,03 67,63 100 74,82
Dicromato de
potássio
70 100 100 <1
Legenda: DL
50
= dose letal 50%; resultado obtido por regressão linear com médias das triplicatas, dicromato de
potássio= controle positivo.
O extrato EHAGP apresentou DL
50
de 74,82 µg/mL. Com base nos critérios
estabelecidos por Meyer et al. (1982) as amostras com DL
50
< 1000 µg/mL são ativas,
enquanto aquelas que apresentarem DL
50
> 1000 µg/mL são consideradas inativas e Dolabela
(1997) considera o produto com DL
50
≤ 80 µg/mL altamente tóxico,
DL
50
entre 80 e 250 µg/mL
moderadamente tóxico, e acima de 250 µg/mL atóxico ou levemente tóxico, c
onclui-se, portanto,
que o EHAGP foi ativo.
Catanhede et al. (2007) e Catanhede (2008) demonstraram elevada citotoxicidade
em amostras de geoprópolis oriundas do Cerrado e da Baixada maranhense, em ensaio com
Artemia salina. Santos (2008) apresentou resultados semelhantes com geoprópolis da Baixada
maranhense, verificando elevado efeito citotóxico em 13 das 14 amostras em estudo.
Velikova et al. (2000b), analisaram 21 amostras de própolis produzidas por
diferentes espécies de meliponíneos, e verificaram que aquelas ricas em terpenos (diterpenos),
apresentaram elevada citotoxidade frente à Artemia salina.
A demanda por produtos orgânicos e naturais cresce a cada ano, os consumidores
exigem cada vez mais, produtos ausentes de resíduos tóxicos e medicamentosos, assim têm-se
realizado inúmeros estudos na busca de informações sobre o uso dos recursos naturais que
possam ser utilizados no combate a ectoparasitas, em especial ao carrapato bovino
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (ALBUQUERQUE; OLIVEIRA, 2007).
O EHAGP foi submetido ao teste de sensibilidade larvar, para verificação de sua
efetividade no combate ao Rhipicephalus Boophilus microplus (espécie de carrapato bovino,
que pode transmitir inúmeras doenças ao rebanho e causar perdas econômicas ao
agropecuarista). O EHAGP não obteve efetividade frente às larvas do parasito testado,
conforme descrito na tabela 5.
Tabela 5. Eficácia do teste de sensibilidade larvar em papel impregnado com extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)
AMOSTRA ENSAIO VIVO MORTO % MORT.
%MORT TOT.
EHAGP
(250 mg/mL)
1 166 4 2,35
1,87
2 156 2 1,27
3 214 5 2,28
4 185 3 1,60
Álcool 70%
1 130 0 0,00
1,13
2 129 2 1,53
3 100 0 0,00
4 130 4 2,99
Legenda: % Mort= percentual de mortalidade, %Mort tot.= percentual de mortalidade total
Pacheco et al. (2006), utilizando extrato hidroalcoólico de própolis (1; 1,5; 2,0;
2,5% ) não obteveram efetividade no controle de R. (Boophilus) microplus e consideraram
baixas estas concentrações, sugerindo a realização de estudos com concentrações mais
elevadas. Já Oliveira et al. (2004) utilizaram extrato de própolis contra o curuquerê-da-couve
(Ascia monuste) e só obteveram resultado significativo a uma concentração de 25%.
Para o controle efetivo de fungos e bactérias é fundamental o conhecimento sobre
a biologia dos patógenos, os seus mecanismos de virulência e os processos de interação com o
hospedeiro. Além disso, o relato cada vez mais freqüente de linhagens resistentes aos
antifúngicos e antibióticos disponíveis no mercado torna necessárias investigações sobre
outras substâncias que atuem de maneira mais específica possível contra fungos e bactérias
(FARNESI, 2007).
A atividade antifúngica do EHAGP frente aos microorganismos Candida
albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida parapsilosis, está demonstrada na
Figura 10. O extrato não apresentou efetividade na inibição do crescimento fúngico.
Velikova et al. (2000b), em estudo com própolis e geoprópolis de meliponíneos
verificaram fraca atividade dos extratos contra Candida albicans, e baixa ou nenhuma
atividade contra E. coli. Farnesi (2007) observou efetividade do extrato hidroalcoólico
geoprópolis de Melipona fasciculata contra o fungo Trichophyton rubrum, e inatividade
frente ao Aspergilus nidulans.
Figura 10: Antifungigrama do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)frente às
espécies: A – Candida albicans; B- Candida glabrata, C- Candida tropicalis; D: Candida
parapsilosis.
Legenda: 1=Tampão Fosfato 0,1M a 5% de etanol P.A; 2= EHAGP diluído1: 4; 3=EHAGP diluído 1:6; 4=
EHAGP diluído 1:8; 5= Fluconazol.
Processos oxidativos produzem radicais livres que causam muitos problemas para
a saúde humana como câncer, doenças degenerativas do coração e são relatadas como
causadoras de envelhecimento (SCHELLER et al., 1994; MORAES, 2007), diabetes,
cataratas, imunodeficiência, rugas entre outros (DORMANDY, 1989; FULIANG et al., 2005;
OGETURK et al., 2005).
A atividade antioxidante do extrato hidroalcoólico EHAGP, foi analisada através
do método fotocolorimétrico in vitro de seqüestro de radical livre DPPH (2,2-difenil-1-
picrilidrazil), que apresentou atividade antioxidante em todas as concentrações testadas, cujos
valores variaram de 9,7 a 55,73%, conforme dados da tabela 6.
A
B
C D
2
1
4
3
5
1
2
3
4
5
3
1
2
5
2
3
4
1
5
Tabela 6. Atividade antioxidante (%)* do extrato hidroalcólico da geopropólis de Melipona
fasciculata (EHAGP), pelo método de sequestro do radical livre estável DPPH
.
Legenda *(% inibição) para cada uma das concentrações após a média de três análises ± desvio padrão,
**
Controle positivo: soluções padronizadas de rutina nas mesmas concentrações que os extratos.
Os polifenóis são reportados como os mais abundantes e efetivos antioxidantes
em amostras de própolis (SCHELLER et al., 1990; KUMAZAWA et al., 2004). Vários
autores têm relacionado à atividade antioxidante dos extratos hidroalcóolicos de própolis ao
seu elevado teor de flavonóides (BASKOTA et al., 1998; BANKOVA; POPOVA, 2007).
Própolis e geoprópolis contêm substâncias de alta atividade antioxidante como
flavonóides e outros compostos fenólicos (BURDA; ORLESZEK, 2001; MOREIRA et al.,
2008; AZEVEDO, 2009).
Da Silva et al. (2006) relacionaram atividade antioxidante de própolis de Apis
mellifera de diferentes regiões brasileiras, com os teores de flavonóides, sugerindo que os
flavonóides desempenham um importante papel na atividade antioxidante das própolis
brasileiras.
Segundo Kumazawa et al. (2004) os fenólicos totais são considerados os
principais responsáveis pela atividade antioxidante em própolis.
Estudos realizados por Moreira et al. (2008), demonstraram que os extratos de
própolis de Apis mellifera que apresentavam maiores concentrações de fenólicos totais,
apresentavam também maior atividade antioxidante pelo método de seqüestro de radical livre
DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazil).
Azevedo (2009) demonstrou relação entre atividade antioxidante de extratos
hidroalcoólicos de geoprópolis de M. fasciculata e seus constituintes fenólicos. Os extratos
com maior concentração de compostos fenólicos apresentaram também maior atividade
antioxidante. Cunha e Ribeiro (2009) verificaram elevada atividade antioxidante, bem como
elevados teores de polifenóis em geoprópolis da Baixada maranhense.
Sawaya et al. (2009) em estudos com própolis oriundos de abelhas sem ferrão do
gênero Scaptotrigona, verificaram baixa atividade antioxidante quando comparadas às
atividade antioxidantes de própolis produzidas por Apis mellifera no Brasil.
AMOSTRA 10µg/mL 25µg/mL 50µg/mL 100µg/mL
EHAGP
9,70± 0,99 20,92 ±1,27 29,53 ±1,08 55,73 ±3,44
**
RUTINA
94,54±0,12 94,52±0,15 94,94±0,64 95,52±0,78
Os teores de flavonóides e fenólicos totais encontrados no extrato EHAGP foram
respectivamente 1,84 e 14, 92% (Tabela 7). Estes valores são considerados elevados (acima
de 0,25% e 0,50% respectivamente) segundo a legislação brasileira para a caracterização de
qualidade e identidade de extrato hidroalcoólico de própolis de Apis mellifera (BRASIL,
2001). Ressalta-se a falta de legislação brasileira para produtos de abelhas sem ferrão.
Tabela 7. Valores percentuais de ácidos fenólicos, flavonóides e fenólicos totais do extrato
hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP).
Legenda:
a
Resultados representam médias ± desvio padrão (n = 3),
b
Expressos como equivalente de quercetina
c
Expressos como equivalente de ácido gálico.
Azevedo (2009) obteve em extratos hidroalcoólicos de geopropólis de M.
fasciculata, da Baixada maranhense, variações dos teores de fenólicos totais entre 11,28 e
40,18%, para os ácidos fenólicos os valores variaram de 9,26 a 38,43%. Abreu et al. (2006) e
Abreu (2008), em análises de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith (tiúba) do Cerrrado
maranhense, demonstraram teores de flavonóides variando de 0,17 a 2,67%, e os teores de
polifenóis totais variando de 14,14 a 67,46%, já Cunha e Ribeiro (2009) obtiveram teores de
flavonóides que variaram de 0,04 a 1,85% e de polifenóis de 7,36 a 36,95%, em extratos
hidroalcoólicos obtidos por processo de maceração em geoprópolis da Baixada maranhense.
Nogueira (2008) observou variação de 0,37 a 0,65% dos teores de flavonóides
nos extratos hidroalcoólicos de própolis de Scaptotrigona aff postica (abelha sem ferrão,
conhecida popularmente como tubi), e cujo própolis foi coletado em meliponário no
município de Barra do Corda – MA.
Tabela 8. Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides, ácidos fenólicos e atividade
antioxidante do extrato hidroalcólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP).
Legenda: *(% inibição) para cada uma das concentrações após a média de três análises ± desvio padrão
a
Resultados representam médias ± desvio padrão (n = 3) ,
b
Expressos como equivalente de quercetina,
c
Expressos como equivalente de ácido gálico.
EXTRATO
FLAVONÓIDES
TOTAIS(%)
a,b
FENÓLICOS
TOTAIS(%)
a,b
ÁCIDOS
FENÓLICOS
TOTAIS(%)
a,c
EHAGP
1,84 ± 0,02
14,92± 0,37
13,08 ± 0,35
EXTRATO
*
ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE
100 µg/mL
FLAVONÓIDES
TOTAIS
(%)
a,b
FENÓLICOS
TOTAIS
(%)
a,b
ACIDOS
FENÓLICOS
TOTAIS
(%)
a,c
EHAGP
55,73 ±3,44
1,84 ± 0,02
14,92± 0,37
13,08 ± 0,35
Nossos resultados (tabela 8) corroboram com os dados de Azevedo (2009) para
extratos hidroalcoólicos de geoprópolis de M. fasciculata, e com os de própolis de Apis
mellifera coletados no Brasil (DA SILVA et al., 2006).
Considerando os resultados da bioprospecção (antioxidante) e dados químicos do
extrato, realizamos o fraciomanento biomonitorado do EHAGP, buscando isolar frações e/ou
substâncias antioxidantes da classe dos polifenóis (Figura 7).
De acordo com fracionamento obtido do EHAGP (Figura 7) e análises dos
cromatogramas das frações A
3+4
a A
9
reveladas separadamente com solução de DPPH e
reagente de Folin-Ciocalteau, observamos a presença de manchas com forte coloração
azulada (reação entre as substâncias presentes na placa e o reagente de Folin-Ciocalteau)
característica de compostos polifenóis em todas as frações derivadas da coluna 1, assim como
coloração amarela indicando forte atividade antioxidante em placa (reação entre as
substâncias presentes na placa com radical livre DPPH, de coloração violeta).
Com base na atividade antioxidante e presença de compostos polifenólicos a
fração A3+4 (apresentou spots distanciados) foi submetida à CC seca (Figura 2) obtendo-se
10 subfrações, (C
2
1
a C
2
10), as quais após analises por CCD/Revelação com reagente Folin-
Ciocalteau, soluação de DPPH a 10%, radiação UV e Iodo sublimado, que permitiram uniões,
resultando em 4 subfrações : C
2
A, C
2
B, C
2
C, C
2
6. Estas foram monitoradas com solução de
DPPH 10% e reagente de Folin-Ciocalteau.
Com base nas análises dos cromatogramas, monitorados pela presença de
atividade antioxidante e compostos fenólicos, realizamos fracionamento das subfrações
C
2
B+C
2
C unidas.
O fracionamento cromatográfico da subfração C
2
B+C
2
C forneceu inicialmente 24
subfrações, finalizando 14 subfrações após as uniões, conforme cromatograma demonstrado
na Figura 11 o qual demonstra a presença de compostos polifénolicos em diversas subfrações.
As subfrações C
3
18 e C
3
20 (apresentaram atividade antioxidante e presença de
polifenóis) foram selecionadas para análise em cromatografia líquida de alta eficiência, Além
disso, foi realizada quantificação dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides e ácidos
fenólicos da subfração C
3
20 apresentando rendimentos respectivos de 1,51%, 0,17%, e
1,33%, conforme dados da Tabela 9.
Tabela 9: Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides e ácidos fenólicos da
subfração C
3
20 derivada do extrato hidroalcólico de geoprópolis de Melipona fasciculata
EHAGP.
a
Resultados representam médias ± desvio padrão (n = 3) ,
b
Expressos como equivalente de quercetina,
c
Expressos como equivalente de ácido gálico.
A análise dos cromatogramas obtidos a 254 nm varridos em 60 minutos
demonstraram semelhança de constituintes na varredura em 37
a 42
minutos, porém a
subfração C
3
20 apresentou um pico majoritário em 50
minutos, que não está presente na C
3
18.
Ambas subfrações foram comparadas com padrões de ácidos fenólicos (ácido
caféico, cinâmico, ferúlico, gálico e siríngico) e flavonóides (quercitina, rutina e
pinocembrina) existentes no nosso laboratório, não coincidindo com a identificação das
substâncias presentes nas subfrações.
SUBFRAÇÃO
FLAVONÓIDES
TOTAIS(%)
a,b
FENÓLICOS
TOTAIS(%)
a,b
ÁCIDOS
FENÓLICOS
TOTAIS(%)
a,c
C
3
20 0,17 ± 0,03 1,51± 0,39 1,33± 0,38
Figura11
:
Cromatograma das subfrações C
3
1 a C
3
24, Alíquota: 10mL, Fase móvel:
hexano/ acetona 8: 2, Fase estacionária: sílica gel G, Revelador: (A) Radiação UV, (B)
Reagente Folin-Ciocalteau.
C
3
18 C
3
20
C
3
18 C
3
20
Figura 12: Cromatograma da subfração C
3
18 obtido através da técnica CLAE/UV
Figura 13: Cromatograma da subfração C
3
20 obtido através da técnica CLAE/UV
A subfração C
3
20, foi analisada através da técnica de CLAE/EM, com ESI
(ionização por eletrospray) de modo negativo, obtendo-se espectros de modo negativo na
faixa de 100 a 1000 m/z, como não foram obtidos íons intensos com m/z acima de 900, os
“fingerprintes” foram apresentados em m/z 100 a 900.
As análises dos espectros de massas demonstraram m/z majoritários pela
abundância relativa de íon [M – 1]
-
, em 12 a 46 minutos, sendo eles: 328,8; 645,2; 659,2;
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1,132
1,512
1,648
2,178
2,707
6,063
8,117
8,683
10,087
10,523
12,127
13,845
15,730
16,663
16,880
17,790
19,363
20,623
21,783
22,057
22,158
24,250
25,262
25,915
26,503
27,857
28,838
30,432
31,930
33,677
34,147
34,477
34,747
35,507
36,562
38,055
38,682
39,398
40,108
40,787
41,812
42,787
43,050
44,013
44,450
45,387
45,832
46,498
46,940
47,272
47,670
48,145
48,873
49,280
49,837
50,363
51,088
51,367
51,527
51,887
52,443
52,792
53,365
53,543
54,065
54,370
54,907
55,892
56,422
56,580
57,158
57,882
58,200
58,827
Surveyor UV/VIS-254nm
A18 gradiente agua acd formico actn 1
Retention Time
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0,430
0,798
1,123
1,517
1,653
2,180
3,657
5,717
5,973
11,630
12,665
13,868
14,817
17,747
18,557
19,023
20,977
22,023
22,100
22,633
25,343
27,843
29,752
30,123
30,437
31,063
31,350
31,990
33,403
33,870
34,183
34,418
34,730
35,188
36,122
37,672
38,332
40,458
42,395
42,665
44,037
44,998
45,468
46,145
46,587
46,935
47,365
47,847
48,595
48,980
49,565
50,068
50,933
51,778
52,515
53,103
53,343
53,887
54,247
54,755
55,543
55,862
56,525
56,972
57,807
58,857
Surveyor UV/VIS-254nm
j 20 c3 20
Retention Time
659,1; 733. Alguns destes foram selecionados para obtenção de LC/EM/EM, dos quais ainda
não obtivemos os resultados espectrais.
Foi possível observar, através de comparação com dados da literatura, que o m/z
314,8 é compatível com a fórmula molecular C
17
H
14
O
6
, característica do flavonóide 3,7-di-O-
metil-canferol (kumatakenina), sendo este comumente encontrado em espécies vegetais da
família Solonaceae (SILVA et al., 2003 e SILVA et al., 2009).
Figura 14: Estrutura química da kumatakenina
O m/z 328,8 foi compatível com a fórmula molecular C
18
H
16
O
6
(possivelmente
um derivado metilado da kumatakenina), Figura 15.
Figura 15: Estrutura química de flavonóide derivado da kumatakenina
Lengenda: R = CH
3
ou R = H
OMe
MeO
O
O
OH
OH
OMe
MeO
O
O
OH
OH
O - R
O
-
R
No entanto as confirmações destas substâncias dependem de obtenção de
espectro de massas LC/MS/MS dos respectivos m/z, comparação com padrão autêntico, ou
isolamento.
Os outros m/z provavelmente estão relacionados a flavonóides glicosilados, em
função dos elevados valores de m/z dos mesmos, e também com dímeros de ácidos fenólicos.
A Kumatakenina é uma flavona, que já foi isolada de partes aéreas de Solanum
paludosum, Solanum jabrense, Solanum paraibanum, Solanum pubescens e Solanum
rhytidoandrum (SILVA et al., 2003).
Espécies vegetais da família Solonaceae são amplamente distribuídas no
Maranhão, bem como na região da Baixada maranhense (AGRA; BHATTACHARYYA,
1999).
Kerr et al. (1986/1987) em estudo com Melipona fasciculata no estado do
Maranhão, verificou que este meliponíneo utiliza várias espécies vegetais para a coleta de
pólen, dentre elas plantas da família Solonaceae, especialmente do gênero Solanum.
Outros trabalhos realizados com abelhas do gênero Melipona, verificaram a
presença e/ou predominância de pólen de espécies vegetais do gênero Solanum coletados por
campeiras (ABSY; KERR, 1977; MARQUES-SOUZA et al., 1995; BEZERRO;
MACHADO, 2003; DA SILVA et al, 2004; SOUSA et al., 2009).
Martins (2008) em levantamento da ocorrência de tipos polínicos coletados por
campeiras de Melipona fasciculata, no período de outubro/2006 a setembro/2007, no
povoado de Cauaçu, município de Palmerândia, na Baixada ocidental maranhense, observou
que nos meses de fevereiro e março/2007, predominaram 12% e 25% dos tipos polínicos
das espécies Solanum jurubeba Rich e Solanum grandiflorum Ruiz&Pav, da família
Solanaceae.
Estes dados fortalecem nossas perspectivas sobre a presença dos flavonóides
kumatakenina e seus derivados no geoprópolis (GP), pois demonstram que meliponíneos em
especial a Melipona fasciculata, visitam espécies vegetais da família Solanaceae, as quais são
ricas em flavonóides e outros compostos fenólicos, para a coleta de pólen, néctar e resina.
Os dados físicos, químicos e biológicos obtidos do geoprópolis de Melipona
fasciculata, do município de Palmeirândia da Baixada maranhense, demonstram um perfil de
qualidade para esse produto natural, e podem contribuir para agregar valor ao mesmo.
5. CONCLUSÃO
Os dados físicos, químicos e biológicos demonstram perfil de qualidade de
geoprópolis de Melipona fasciculata Smith da Baixada maranhense, que apresentou-se com
odor balsâmico, sabor amargo e com coloração marrom, presença de compostos fenólicos e
triterpenos, com teor de fenólicos e flavonóides totais de 14,92% e 1,84% respectivamente,
atividade citotóxica (Artemia salina) e antioxidante, e possível presença do flavonóide
kumatakenina e seus derivados com análises em CLAE.
Esses dados podem contribuir para o estabelecimento de parâmetro químico
fundamental para a padronização deste produto e composição de futura legislação para
abelhas sem ferrão.
Considerando que a região da Baixada maranhense, com flora diversificada,
produz geoprópolis de Melipona fasciculata (tiúba), com padrão de qualidade, torna-se
necessária a incrementação da meliponicultura nesta região, como forma de alavancar o
desenvolvimento sustentável no estado do Maranhão, contribuindo para a melhoria das
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ANEXO
Amostra: C
3
20
Equipamento: Esquire 3000 Plus Bruker Daltonics
Capillary: 4000V
Nebulizer: 29 psi
Dry Gas: 7.5 l/min
Dry Temp: 35°C
Fluxo para massa de 120uL/min
0 10 20 30 40 50 T i m e [m in]
0.0
0.5
1.0
1.5
7
x10
Intens.
645.2
-MS, 1 2.0m in #596
0
2
4
6
8
4
x10
Intens.
100 200 300 40 0 500 600 700 800 900 m/z
328 .8
659.2
681.2
733.2
929.3
-M S , 1 2 .5m i n # 6 2 3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5
x10
Inte n s.
100 20 0 3 0 0 400 50 0 6 00 70 0 8 0 0 90 0 m /z
328.8
659.1
681.2
733.2
-MS, 13.0min #645
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
328.9
659.1
681.2
855.3
-MS, 15.7min #784
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
571.2
613.2
-MS, 18.9-19.8min #(948-999)
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
314.8
631.2
653.2
761.2
895.3
-MS, 21.0min #1065
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
629.2
715.2
761.3
-MS, 21.5min #1091
0
1
2
3
4
5
6
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
715.3
761.3
887.3
-MS, 21.8min #1112
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
613.2
655.1
757.2
-MS, 23.2min #1187
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
671.1
715.3
761.2
-MS, 24.0min #1228
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
613.1
671.1
715.3
761.2
833.1
-MS, 24.3min #1250
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
487.1
555.2
633.1 715.3
757.2
779.3
-MS, 25.1min #1291
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
501.2
523.0
601.0 637.0
715.3
-MS, 26.7min #1383
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
601.2
647.1
715.3
751.3
801.2
897.3
-MS, 27.1min #1402
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
517.1
617.1
743.2
-MS, 28.0min #1456
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
6
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
597.2
743.2
-MS, 28.5min #1482
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
6
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
296.9
399.0
537.1
617.3
637.1
697.3
719.3
771.3
799.4
899.3
-MS, 29.6min #1543
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
617.2
697.2
743.3
-MS, 30.8min #1612
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
6
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
519.1
601.2
701.3
747.3
819.1
-MS, 31.2min #1636
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
413.0
601.2
701.3
737.3
827.4
897.4
919.4
967.3
-MS, 31.5min #1649
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
601.1
617.1
687.3
-MS, 32.2min #1692
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 m/z
585.2
617.2
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687.3
726.3
755.0
-MS, 33.5min #1759
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
5
x10
Intens.
300 400 500 600 700 m/z
519.1
601.1
687.2
729.3
-MS, 34.5min #1817
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
584.1 653.1
903.4
925.4
-MS, 35.6min #1876
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
469.1
599.1 653.2
815.3
939.6
-MS, 36.6min #1932
0
1
2
3
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
601.1
811.4
907.4
-MS, 37.4min #1972
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
935.5
-MS, 38.1-38.5min #(2012-2037)
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
585.1
-MS, 41.5-41.7min #(2192-2204)
0
2
4
6
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
171.7
519.2
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687.3
779.2
-MS, 44.4min #2350
0.0
0.5
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x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
519.1
617.3
687.3
715.3
779.3
-MS, 45.6min #2417
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
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659.3
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933.3
-MS, 48.2min #2554
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0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
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