ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
NÚCLEO DE PESQUISAS EM PLANTAS MEDICINAIS – NPPM
“Prof. Paulo Humberto Moreira Nunes”
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
(NÍVEL MESTRADO)
ATIVIDADE CITOTÓXICA E ANTIVIRAL DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE
PLANTAS DA FAMÍLIA Combretaceae SOBRE A REPLICAÇÃO DE DENGUE
VÍRUS 3 EM CÉLULAS C6/36
DÉBORA CAVALCANTE BRAZ
TERESINA, 2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
1
B827a Braz, Débora Cavalcante
Atividade antiviral dos extratos etanólicos de plantas da
família Combretaceae sobre a replicação de Dengue vírus 3 em
células C6/36/ Débora Cavalcante Braz. – Teresina, 2009.
87f. ;il.
Dissertação (Mestrado em Farmacologia) –
Universidade
Federal do Piauí.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho.
1. Antiviral. 2. Dengue vírus. 3. Combretaceae.
I. Coelho, Luiz Felipe Leomil – orient. II. Título
CDD – 616.0/94
ads:
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
NÚCLEO DE PESQUISAS EM PLANTAS MEDICINAIS – NPPM
“Prof. Paulo Humberto Moreira Nunes”
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
(NÍVEL MESTRADO)
ATIVIDADE ANTIVIRAL DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE PLANTAS DA
FAMÍLIA Combretaceae SOBRE A REPLICAÇÃO DE DENGUE VÍRUS 3 EM
CÉLULAS C6/36
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, do
Núcleo de Pesquisas em Plantas Medicinais do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Piauí, visando a obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho
TERESINA
2009
ii
3
DÉBORA CAVALCANTE BRAZ
ATIVIDADE CITOTÓXICA E ANTIVIRAL DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DE
PLANTAS DA FAMÍLIA Combretaceae SOBRE A REPLICAÇÃO DE DENGUE
VÍRUS 3 EM CÉLULAS C6/36
Dissertação aprovada em__________________________de 2009.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Maria José dos Santos Soares
Presidente da Banca
Universidade Federal do Piauí
___________________________________________________
Prof. Dr. Alessandro de Lima
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí
_____________________________________________________
Prof. Dr. Fernando Aécio de Amorim Carvalho
Universidade Federal do Piauí
iii
4
AGRADECIMENTOS
________________________________________________
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, à Deus por me guiar a este importante momento da minha
vida, pela força e garra tanto nos momentos felizes quanto nos momentos tristes.
À minha mãe pelo exemplo de dedicação e por me apoiar e aconselhar nos
instantes de fraqueza!
Ao meu irmão Danilo, meu melhor amigo, por estar sempre à disposição!
Ao meu namorado Beck, meu lindo, por me entender quando irritada!
A uma grande amiga de “coração puro” Elisângela, que conheci no mestrado e que
me ajudou nos momentos finais.
A Kátia Machado, uma pesquisadora exemplar!
Ao Diego Sávio por me “atrapalhar” em alguns experimentos!
Professora Dra. Mariana Helena Chaves por fornecer os extratos para realização
dos nossos experimentos.
Professor Dr. Benedito Borges, sem o qual não teríamos as fotomicrografias do
efeito citotóxico dos extratos.
Professora Dra. Erna Geessien Kroon por fornecer a amostra do Dengue vírus 3 e
as células C6/36.
A todas as Doutoras e Doutores do Núcleo de Plantas Medicinais.
A professora Dra. Maria José por representar meu orientador.
Ao meu orientador Dr. Luiz Felipe Leomil Coelho pela paciência e pelo grande
aprendizado obtido no Laboratório de Microbiologia da UFPI.
Agradeço a todos que participaram deste importante momento de minha vida!
v
6
RESUMO
________________________________________________
7
RESUMO
Este estudo mostra o potencial in vitro de extratos brutos de três plantas
pertencentes à Família Combretaceae na replicação de Dengue vírus 3 (DEN-3) em
células C6/36. As concentrações máximas não tóxicas dos extratos etanólicos das
folhas de Terminalia fagifolia Mart. et Zucc e da casca do caule de Terminalia
brasiliensis Camb. e Combretum leprosum Mart., foram determinadas utilizando
células C6/36 cultivadas na presença dos respectivos extratos em diferentes
concentrações. Os resultados indicaram toxicidade nas concentrações mais altas
(50 mg/mL, 5 mg/mL, 1 mg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL) em todos os extratos
estudados. O efeito citotóxico foi caracterizado por morte celular e aumento no
volume celular e nuclear, sendo, mais intenso em Combretum leprosum. A atividade
antiviral dos extratos foi medida através da diminuição do efeito citopático do
Dengue vírus em células C6/36 (formação de sincícios) quando comparado ao
controle de vírus, após a determinação da concentração máxima não tóxica dos
extratos (100 µg/mL). Todos os extratos etanólicos estudados apresentaram efeitos
antivirais significativos nas diluições mais altas (75, 50 e 25 µg/mL). O extrato
derivado da casca de Combretum leprosum Mart apresentou uma inibição de 100,
95 e 85 % da formação de sincícios nestas concentrações. O extrato de Terminalia
fagifolia Mart. et Zucc apresentou uma inibição de 100, 98 e 70% nas concentrações
de 75 , 50 e 25 µg/ml respectivamente. Já o extrato de T. brasiliensis Camb se
mostrou menos eficaz em inibir a formação do efeito citopático, pois apresentou uma
inibição de 95% na concentração de 75 µg/mL, 66% na concentração de 50 µg/mL e
35% na concentração de 25 µg/mL. As concentrações de 10 e 1 µg/mL
apresentaram atividades antivirais significativas somente no extrato de Terminalia
fagifolia Mart. (50 e 23% respectivamente). Estudos futuros serão realizados in vitro
e in vivo utilizando os componentes majoritários de cada extrato, para determinar e
identificar o mecanismo de ação desta substância com atividade antiviral presente
nos extratos etanólicos de plantas da família Combretaceae.
vii
8
ABSTRACT
________________________________________________
9
ABSTRACT
This study reports the in vitro inhibitory potential of crude extract of three
plants belong to the Family Combretaceae on the replication of dengue virus type 3
(DEN-32) in C6/36 cells. The maximum non toxic concentration of ethanolic extracts
from the leaves of Terminalia fagifolia Mart. et Zucc and bark of Terminalia
brasiliensis Camb. and Combretum leprosum Mart. were determined using C6/36
cells. The results showed toxicity at higher concentrations (50 µg/mL, 5 µg/mL, 1
µg/mL, 500 µg/mL e 250 µg/mL) in all extracts studied. The cytotoxicity effect was
characterized by cell death and increase in cell and nuclear volume. The antiviral
activity of the extracts was measured by reducing the cytopathic effect of dengue
virus in C6/36 cells (formation of syncytium) compared to control virus. All ethanol
extracts studied showed significant antiviral effects in the higher dilutions (50 mg/mL,
5 mg/mL, 1 mg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL). The extract derived from the bark of
Combretum leprosum Mart showed an inhibition of 100, 95 and 85% of syncytium
formation in these concentrations. The extract derived from Terminalia fagifolia Mart.
et Zucc showed an inhibition of 100, 98 and 70% when C6/36 cells were treated with
75 , 50 e 25 500 µg/mL e 250 µg/mL. The extract derived from T. brasiliensis Camb
was less effective in inhibiting the formation of cytopathic effect, because it presents
95, 66 and 33 percent of inhibition when cells were treated with 75 , 50 e 25 500
µg/mL e 250 µg/mL. Only the extract derived from T. fagifolia Mart. showed
significant antiviral activity at the concentration of 10 and 1 500 µg/mL and 250
µg/mL (50 and 23% respectively). Future studies will be performed in vitro and in vivo
using the major components of each extract to determine and identify the mechanism
of action of this substance with antiviral activity present in ethanol extracts of plants
of Combretaceae family.
ix
10
LISTA DE FIGURAS
________________________________________________
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Morfologia e estrutura da partícula do Dengue vírus.................................23
Figura 02: Ciclo de replicação do Dengue vírus ........................................................27
Figura 03: Determinação da Concentração Máxima não Tóxica (CMNT) dos extratos
etanólicos de folhas de T. fagifolia e da casca do caule de T. brasiliensis e C.
leprosum ....................................................................................................................51
Figura 04: Fotomicrografia representativas da Atividade Citotóxica dos extratos
etanólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T. brasiliensis e C.
leprosum ....................................................................................................................52
Figura 05: Fragmentação de DNA induzido por concentrações tóxicas dos extratos
etanólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T. brasiliensis e C.
leprosum ....................................................................................................................54
Figura 06: Atividade Antiviral dos extratos etanólicos de folhas de T. fagifolia e das
cascas do caule de T. brasiliensis e C. leprosum .....................................................56
Figura 07: Fotomicrograficas representativas da Atividade Antiviral dos extratos
etnólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T. brasiliensis e C.
leprosum.....................................................................................................................57
xi
12
LISTA DE TABELAS
________________________________________________
13
Tabela 01: Citotoxicidade de extratos Plantas da Família Combretaceae do Nordeste
Brasileiro em células C6/36........................................................................................53
Tabela 02: Atividade antiviral e extratos Plantas da Família Combretaceae do
Nordeste Brasileiro contra Dengue virus....................................................................58
xiii
14
LISTA DE ABREVIATURAS
________________________________________________
15
LISTA DE ABREVIATURAS
DENV: Dengue vírus
NS1: Proteína não estrutural 1
NS2A: Proteína não estrutural 2A
NS2B: Proteína não estrutural 2B
NS3: Proteína não estrutural 3
NS4A: Proteína não estrutural 4A
NS4B: Proteína não estrutural 4B
NS5: Proteína não estrutural 5
FD: Febre do Dengue
FHD: Febre Hemorrágica do Dengue
HIV1: Vírus da imunodeficiência humana 1
HIV2: Vírus da imunodeficência humana 2
CMNT: Concentração máxima não tóxica
TCID
50
: Dose infectiva para 50% do tecido em cultura
DMSO: Dimetilsulfóxido
ECP: Efeito citopático
bp: Pares de bases
xv
16
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO .....................................................................................................19
1.1 - Família Combretaceae ......................................................................................19
1.2 - Dengue vírus .....................................................................................................22
1.2.1 - Partícula Viral, Genoma e Proteínas Virais.....................................................22
1.2.2 - Ciclo de Replicação.........................................................................................25
1.2.3 - Manifestações Clínicas da Dengue ................................................................27
1.2.4 – Epidemiologia, Prevenção e Tratamento da Dengue ....................................29
1.3 - Fármacos com Atividade Antiviral para Dengue ...............................................32
2 – JUSTIFICATIVA ..................................................................................................36
3 – OBJETIVOS ........................................................................................................40
3.1 – Objetivo Geral ...................................................................................................41
3.2 – Objetivo Específico ...........................................................................................41
4 – METODOLOGIA ..................................................................................................42
4.1 - Coleta das folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de C. leprosum e T.
brasiliensis..................................................................................................................43
4.2 – Obtenção dos extratos etanólicos das cascas do caule de C. leprosum e T.
brasiliensis e folhas de T. fagifolia..............................................................................43
4.3 – Cultura Celular ..................................................................................................43
4.4 – Produção de Dengue vírus 3 ............................................................................44
4.5 – Titulação de Dengue vírus 3 .............................................................................44
4.6 – Identificação do efeito citotóxico dos extratos etanólicos das cascas do caule
de C. leprosum e T. brasiliensis e das folhas de T. fagidolia sobre as células
....................................................................................................................................45
4.7 – Avaliação da Citotoxicidade dos extratos etanólicos das folhas de T. fagifolia e
das cascas do caule de C. leprosum e T. brasiliensis................................................46
4.8 – Teste de Fragmentação do DNA ......................................................................46
xvi
17
4.9 – Análise in vitro do efeito Antiviral dos extratos etanólicos das cascas do caule
de C. leprosum e T. brasiliensis e das folhas de T. fagifolia......................................47
5 – RESULTADOS ....................................................................................................48
5.1 – Determinação da Concentração Máxima Não Tóxica dos extratos etanólicos
das cascas do caule de C. leprosum e T. brasiliensis e das foilhas de T. fagifolia
sobre células C6/36....................................................................................................49
5.2 – Atividade Antiviral dos extratos etanólicos das folhas de T. fagifolia e das
cascas do caule de T. brasiliensis e C. leprosum sobre a replicação do Dengue vírus
....................................................................................................................................55
6 – DISCUSSÃO .......................................................................................................59
7 – CONCLUSÕES ...................................................................................................71
8 – REFERENCIA BIBLIOGÁFICA ...........................................................................73
xvii
18
INTRODUÇÃO
________________________________________________
19
1 – INTRODUÇÃO
1.1 Família Combretaceae
Nos últimos anos os estudos etnofarmacológicos têm crescido na
comunidade científica brasileira, uma conseqüência do número expressivo de
espécies de plantas medicinais conhecidas da caatinga, região do Nordeste do país.
No entanto são necessários estudos fitoquímicos e farmacológicos que comprovem
os efeitos potenciais descritos pelas populações desta região. Além disso, inúmeros
países têm formulado estratégias para uso de plantas medicinais como fonte para o
desenvolvimento de novos fármacos (ALBUQUERQUE et al. 2007).
A família Combretaceae, pentencente a ordem Myrtifloral, consiste de
apenas 18 gêneros distribuídos nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, mais
precisamente na caatinga e cerrado, biomas característicos do Nordeste brasileiro.
São plantas caracterizadas como lenhosas, arbustivas com folhas inteiras e flores
pequenas. O gênero com maior número de espécies é o Combretum com
aproximadamente 370 espécies. As espécies pertencentes a este gênero são
amplamente usadas na medicina popular. Dentre os gêneros cultivados destaca-se
também o gênero Terminalia com aproximadamente 200 espécies. Destas
espécies se obtem taninos e corantes muito apreciados. Os taninos são compostos
fenólicos de grande interesse econômico e ecológico, são responsáveis pela
adstringência de muitos frutos e produtos vegetais. Esta característica é
conseqüência da sua capacidade (formar complexos) de precipitação das
glicoproteínas salivares, podendo também com esta atividade inibir o crescimento
microbiano (GOLA; NEGRI; CAPPELLETTI, 1965; JOLY, 1993; MCGAW et al. 2001;
SIMPSON; OGORZALY, 2001; MONTEIRO; ALBUQUERQUE; ARAÚJO, 2005).
Terminalia brasiliensis Camb. é uma espécie que se encontra dispersa da
Bahia até São Paulo, Minas Gerais e Goiás. Esta planta caracteriza-se
botanicamente como uma árvore regular de até 12 metros com folhas alternas,
oblongas, coriáceas; flores pequenas, pálidas, dispostas em espigas. O fruto é do
20
tipo sâmara oblonga, pubescente, contendo sementes fusiformes. Economicamente
produz matéria tintorial e fornece madeira de lei para construção civil, marcenaria e
carpintaria. Conhecida vulgarmente como amêndoa-brava (Ceará), cerne-amarelo
(São Paulo), capitão-do-campo (Piauí), canoé-de-Botão, chunava, mussambé,
mirindiba-do-rio, bagre, merindiba, araçá-d’água na Bahia e merindiba, imbú-d’anta
nos estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais. As cascas do caule desta espécie
são usadas na forma de lambedor, no tratamento de males do estômago e em casos
de diarréia (CORRÊA, 1974).
Combretum leprosum Mart. é uma espécie que se encontra distribuída do
Piauí à Bahia. Esta planta caracteriza-se como um arbusto lenhoso, bastante
ramificado, com folhas opostas, pecioladas, inteiras, ovadas ou oblongas, agudas na
base, membranosas e escabrosas. Suas flores estão dispostas em panículas
terminais pequenas e amarelas. O fruto é do tipo sâmara, aveludado e pequeno.
Tem sido utilizado popularmente na forma de decoctos ou infusos como
hemostática, sudorífica, calmante (folhas e entrecascas do caule), antiofídica (casca
do caule), antiasmática (folhas e frutos), antidiarreica, ou ainda no tratamento de
tosses e coqueluches (raiz), além de atividade antinociceptiva e atividade
antiulcerogênica (CORRÊA, 1974; MACGAW et al, 2001; PIETROVSKI et al., 2006;
NUNES et al. 2009).
Terminalia fagifolia Mart. et Zucc é uma espécie que se encontra presente
nos estados do Piauí, Bahia, Minas Gerais e Goiás. A planta carateriza-se
botanicamente como uma árvore de folhas curto-pecioladas, fasciculadas, ovadas
ou elípticas, águas, mucronadas, membranosas e sérico-vilhosas na abaxial. As
flores estão dispostas em espigas axilares compostas, mais curtas do que as folhas.
O fruto é do tipo sâmara, elíptico, estriado, bialado e grande. Economicamente
fornece madeira para carpintaria e sua casca exsuda resina vermelha (CORRÊA,
1974).
Os extratos de espécies do gênero Combretum e Terminalia destacam-se
pelas atividades anti-inflamatória, antihelmíntica, anti-esquitosomal, antimicrobiana
(gonorréia, sífilis), antiviral (Herpes vírus 1, Vírus da Imunodeficiência Humana tipo
1), antifúngica, no combate a diarréia e a hipertensão, além de anti-tumoral contra
21
linhagem de células modificadas da mama, ovário, próstata, tecido ósseo. As
espécies destes gêneros, principalmente, Combretum são conhecidas por conter
poderosos componentes anti-tumorais como as combretastatinas (PETTIT et al.
1996 ; MCGAW et al., 2001; SALEEM et al., 2002; FYHRQUIST et al., 2002; CIRLA;
MANN, 2003; BESSONG et al., 2005; CHEN ; LI, 2006 ; FYHRQUIST et al., 2006;
MAREGESI et al., 2008).
Quanto à atividade antiviral vários estudos mostram atividade significativa de
extratos produzidos a partir de espécies da família Combretaceae contra vírus de
DNA e RNA. Alguns estudos mostram que o extrato metanólico das folhas de
Combretum micranthum apresentam atividade antiviral contra HIV-1 e HIV-2 nas
concentrações de 2 µg/mL e 4 µg/mL, respectivamente (FERREA et al., 1993).
Outros estudos mostram que extratos derivados de Terminalia alata são ativos
contra Poliovirus e Sindbis vírus (TAYLOR et al., 1996; OJEWOLE, 2008).
Os extratos metanólico e aquoso em concentrações de 50 e 100 µg/mL de
Terminalia mollis inibiu fortemente Herpes simplex vírus tipo 1, enquanto que
Combretum adenogenium apenas seu extrato aquoso a 100 µg/mL apresentou
expressiva atividade antiviral (MAREGESI et al., 2008).
Extrato aquoso acetona dos galhos de Guiera senegalensis apresentou
atividade antiviral contra Fowpox vírus em culturas de células embrionárias da pele
da galinha, resultado dependente da duração do ensaio e da quantidade de vírus
aplicada. Assim, em quatro dias de ensaio a uma concentração de 10.000 pfu inibiu
100% do efeito citopátco em 15,6 µg/mL do extrato (LAMIEN et al. 2005).
O componente 2-O-galoylpunicalagin isolado das folhas de Terminalia triflora
mostrou atividade inibitória sobre a DNA polimerase e RNase H de transcriptase
reversa do HIV-1 (0.21 µM) sem afetar a proliferação e viabilidade celular em doses
abaixo de 40 µM (CRUCHUGA et al., 2007).
Os extratos metanólicos das folhas de Combretum hatmannianum inibiram
totalmente a enzima transcriptase reversa HIV-1 em uma concentração de 66 µg/mL
22
em culturas celulares de adenocarcinma humano e mioblastos da musculatura
esquelética de ratos (ALI et al., 2002).
Tais pesquisas demonstram a presença de compostos com atividade antiviral
em plantas da família Combretaceae. No entanto, não existem relatos que abordem
a atividade de plantas pertencentes a esta família contra a replicação do Dengue
vírus sorotipo 3, fato que ressalta a importância desta pesquisa para o meio
científico.
1.2 – Dengue vírus
1.2.1 – Partícula Viral, Genoma e Proteínas Virais
O Dengue vírus (DENV) pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivirus.
Esta família engloba um grande grupo de patógenos virais que causam graves
doenças em humanos e animais. O DENV é um virus icosaédrico envelopado que
mede aproximadamente 40 a 50 nanômetros. Externamente ao capsídeo viral,
formado pela proteína do capsídeo (proteína C), encontra-se um envelope lipídico,
que contém duas proteínas estruturais glicosiladas denominadas de proteína de
membrana (M) e de envelope (E) (Figura 1). O genoma do DENV consiste de um
RNA de fita única polaridade positiva de aproximadamente 10,7 kilobases (kb). A
tradução do RNA resulta em uma poliproteína que libera, após clivagens, três
proteínas estruturais (C, prM e E) e sete não estruturais envolvidas na replicação do
genoma e clivagem da poliproteína (NS1, NS2a e NS2b, NS3, NS4a e NS4b e NS5)
(QI; ZHANG; CHI, 2008).
23
Figura 1: Morfologia e estrutura da partícula do Dengue virus: A) Microscopia eletronica do
DENV. B) Representação esquemática do Dengue virus, indicando a localização das proteínas
estruturais e genoma viral. Fonte: (RICE,1996).
Estruturalmente, a proteína do envelope (E) é caracterizada como uma
proteína de membrana tipo I, sendo a maior proteína de superfície da partícula viral.
A proteína E apresenta 3 domínios, denominados de I, II e III. O domínio I está
localizado na parte central da proteína e é responsável pela estrutura da mesma. O
dominio II é responsavel pelo processo de dimerização da proteína E e ainda
contém um peptídeo de fusão hidrofóbico, importante no processo de replicação do
DENV. O dominio III é o responsavel pela ligação do virion ao receptor celular
(FIELDS et al. 2001; CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006). A proteína E é responsável
pela adesão do virion maduro à superfície celular como também pelo processo de
fusão vírus-membrana celular. Esta proteína é considerada o maior alvo dos
anticorpos neutralizantes anti-dengue (MAZUMDER et al., 2007; WHITEHEAD et al.,
2007; QI; ZHANG; CHI, 2008).
A proteína precursora de membrana (prM) é uma proteína com peso
molecular de 26 Kilodaltons (Kda). A proteína prM está envolvida na modelagem da
proteína E durante o processo de maturação do DENV, quando o virion está sendo
transportado pelo Complexo de Golgi. Nesta etapa do ciclo de replicação, a proteína
prM sofre clivagem pela protease celular denominada de furina, que resulta em um
rearranjo das proteínas M e E na superfície do vírions, produzindo assim virions
24
maduros e infecciosos. A terceira proteína estrutural da partícula viral, denominada
de proteína do capsídeo (C) é uma proteína dimérica que apresenta um peso
molecular de aproximadamente 11 Kda. Ela apresenta resíduos básicos localizados
nas porções carboxi e amina terminal, os quais possívelmente atuam na sua ligação
ao RNA genômico (FIELDS et al. 2001; CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006; QI, ZHANG;
CHI, 2008).
A proteína não estrutural 1 (NS1) é uma glicoproteína que apresenta
diferentes formas estruturais e funções. A proteína NS1 pode ser encontrada livre no
meio extracelular (forma solúvel) como também associadas à membranas celular e
do retículo endoplasmático. A NS1 é a segunda proteína mais imunogênica do
DENV e pode ser detectada até 8 dias após o início dos sintomas da doença, o que
implica esta proteína no desenvolvimento de testes diagnósticos rápidos para
dengue (CRABTREE; KINNEY; MILLER, 2005; KUMARASAMY et al., 2007;
NOISAKRAN et al. 2008). Já as proteínas NS2A e NS2b estão associadas à a
membrana do retículo entoplasmático, onde provavelmente participam da replicação
viral. Acredita-se que a proteína NS2B forma um complexo estável não covalente,
através do seu resíduo 47, com o domínio serina protease na porção N-terminal de
NS3, atuando desta forma, como um co-fator essencial para a atividade desta
enzima (WENGLER, 1991; FIELDS et al. 2001; ERBEL et al. 2006; LESCAR et al.,
2008).
A proteína NS3 é considerada uma das proteínas não estruturais mais
importantes para processo de replicação do DENV, pois possui atividades de serina
protease implicada no processamento pós-traducional do polipeptídeo viral e
atividades de helicase/ATPase e RNA trifosfatase envolvidas na replicação do RNA
viral (CHAMBERS et al. 1990; PREUGSCHAT; YAO; STRAUSS, 1990; WENGLER,
1991; AMBERG; RICE, 1999; QI; ZHANG; CHI, 2008; LESCAR et al., 2008).
Estudos demonstram que os domínios protease e helicase de NS3 parecem estar
envolvidos na morte da célula hospedeira por apoptose, um processo de auto-
destruição comum em muitas viroses. É importante porque mantém a sobrevivência
da célula hospedeira durante a replicação, permitindo, assim, a produção de
quantidades suficientemente elevadas da progênie viral e também por facilitar a
25
liberação do vírus da célula hospedeira promovendo a rápida instalação da infecção
(TEODORO; BRANTON, 1997; RAMANATHAN et al. 2006).
As proteínas NS4A e NS4B são proteínas relativamente hidrofóbicas com
segmentos transmembrânicos. Baseado na sua distribuição subcelular e interação
com NS1, NS4A parece auxiliar a replicação do RNA, possivelmente, atuando na
transição da síntese do RNA de fita positiva para negativa através do intermediário
NS3-NS4A e por ancorar na membrana celular os elementos envolvidos na
replicação. NS4B apresenta uma distribuição ampla, pois provavelmente encontra-
se no núcleo, em locais de replicação do RNA modulando este processo via
interação com NS3, em toda extensão da membrana celular e nas faces
citoplasmática e luminal do retículo endoplasmático tornando-se um candidato ideal
para mediar interações entre estes dois compartimentos. Foi ainda demonstrado que
NS4A e NS4B interferem com a resposta antiviral do hospedeiro por inibirem a via
de sinalização do interferon beta (IFN-β) e gamma (IFN-у). (LOBIGS, 1992 ; FIELDS
et al. 2001; QU ; MCMULLAN ; RICE, 2001; CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006;
UMAREDY et al. 2006).
A proteína não estrutural NS5 é a maior e mais conservada entre os flavivirus.
Esta apresenta na sua porção C-terminal um domínio RNA polimerase enquanto sua
porção N-terminal possui um domínio metiltransferase que promove metilações
sequenciais em guanina N-7 e ribose 2’-OH durante formação do cap viral, etapa
crítica para a replicação viral ou outros passos envolvidos neste ciclo. Mutações na
enzima metiltransferase diminuem significativamente a replicação do flavivirus,
possivelmente devido a tradução viral de genomas contendo RNA cap não metilado.
(FIELDS et al., 2001; RAY et al., 2006; ZHOU et al. 2007; BHATTACHARYA;
ANSARI ; STRINKER, 2009).
1.2.2 – Ciclo de Replicação
O ciclo de replicação do DENV se inicia após a adsorção da partícula viral ao
receptor existente na membrana celular da célula hospedeira (Figura 2). Após esta
etapa, ocorre um processo de endocitose mediada por receptor, o qual resulta na
formação de uma vesícula endossomal. A acidificação do pH endossomal promove a
26
trimerização da proteína E, o que leva à exposição de um peptídeo de fusão e
conseqüente fusão do envelope viral com a membrana celular. Este processo
culmina com a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma aonde este irá se
dissociar em proteína C e RNA (YU et al, 2008).
Uma vez que o RNA viral é liberado no citoplasma, este RNA será
rapidamente traduzido em uma poliproteína que é, subsequentemente, co-
processado por proteases virais e celulares. Esse processo resulta na síntese das
três proteínas estruturais (C, prM e E) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). As proteínas não estruturais serão responsáveis
pela replicação do genoma viral e as estruturais serão direcionadas e inseridas na
membrana do retículo endoplasmático (WHITEHEAD et al, 2007).
Após a replicação do genoma viral, ocorre a montagem de partículas virais
imaturas na superfície do reticulo endoplasmático (ER). As partículas virais imaturas
serão posteriormente transportadas pelo sistema de transporte do Golgi (TGN), onde
sofrerão mais tardiamente o processo de maturação. Neste processo a proteína prM
será clivada, em sua região N-terminal, pela protease celular furina em uma partícula
viral madura, a qual é subsequentemente liberada por exocitose (QI; ZHANG; CHI,
2008).
27
Figura 2: Ciclo de replicação do DENV. Etapas do ciclo: A.- adsorção da partícula viral à célula
hospedeira; B.- endocitose mediada por receptor, fusão do envelope viral com a membrana do
endossoma e liberação do nucleocapsídeo viral; C -tradução e processamento da poliproteína; D-
replicação do RNA associado à membrana; E - morfogênese do vírion em vesículas intracelulares; F -
transporte do vírion e fusão da vesícula na membrana plasmástica; G- liberação do vírion no meio
extracelular. Fonte: Perera et al., 2008.
1.2.3 – Manifestações Clínicas da Dengue
Dentre as manifestações clínicas mais comuns causadas pela infecção pelo
DENV, podemos citar a febre do dengue (FD) e a febre hemorrágica da dengue
(FDH). Os indivíduos com FD podem apresentam febre, dor de cabeça, dores
oculares, mialgias, prostação, manchas na pele, linfoadenopatia e leucopenia. A FD
inicia-se com febre alta, cefaléia intensa (muitas vezes retro-orbital), náuseas,
vômitos, mialgia, artralgia, leucopenia e graus variados de trombocitopenia e, se
presentes, os fenômenos hemorrágicos são leves do tipo epixtase e gengivorragia.
Os pacientes que não apresentarem complicações estarão recuperados após uma
semana do início da doença. (SEFURO et al., 2000; KURANE, 2007).
Já as formas mais graves da dengue (FHD) podem apresentar, além dos
sintomas citados acima para a FD, plaquetopenia, hemoconcentração, presença de
sangramento espontâneo, insuficiência circulatória e choque, podendo levar o
28
paciente a óbito (RIGAU-PEREZ et al., 1998; KALAYANAROOJ et al., 1997; OISHI
et al., 2007). A FHD apresenta manifestações hemorrágicas como petéquias,
equimoses, epixtase, gengivorragia, metrorragia e hemorragia digestiva alta. Deve-
se ressaltar que a ocorrência de extravasamento do plasma representada por
derrame pleural, ascite e elevação do hematócrito em até 20% dos valores normais
a diferencia da FD (SEFURO et al., 2000; KURANE, 2007).
A FHD pode ou não estar associada a Sindrome do Choque da Dengue
(SCD), que ocorre antes ou mesmo sem a instalação dos fenômenos hemorrágicos.
O quadro clínico grave caracteriza-se por dor abdominal contínua, vômitos
persistentes, hepatomegalia dolorosa, presença de derrames cavitários,
sangramentos importantes, elevação súbita do hematócrito (mais de 20% em 24
horas). A insuficiência circulatória, consequência do extravasamento plasmático,
manifesta-se pela presença de agitação ou letargia, pulso rápido e fraco, taquicardia,
hipotensão, pele fria e pegajosa, sudorese profunda, oligúria e choque grave. Se o
tratamento não for iniciado prontamente o óbito ocorre em 4 a 6 horas, caso seja
superado, a recuperação do paciente ocorre em 2 a 3 dias (SEFURO et al., 2000).
O extravasamento de plasma é a característica patofisiológica mais
importante na FHD. A infecção das células endoteliais pelo Dengue vírus leva a uma
rápida expressão de citocinas, mediadores químicos e receptores celulares que são
responsáveis por este fenômeno (HALSTEAD, 1988; WHITEHEAD et al., 2007;
HALSTEAD, 2007; OISHI et al., 2007).
Dentre os fatores de risco para desenvolvimento da dengue e de sua forma
mais grave (FHD), estão os fatores geográficos e socioeconômicos, os inerentes ao
próprio vírus e os pertencentes ao hospedeiro. Como fatores geográficos e
socieconômicos mais importantes estão a más condições de higiene e urbanização
aliadas a um clima favorável ao desenvolvimento do vetor (RIBEIRO; SOUSA;
ARAÚJO, 2007).
Em relação aos fatores de risco pertencentes ao DENV, estudos
demonstram que determinados sorotipos e/ou genótipos estão mais relacionados
com a gravidade dos sintomas (AÑEZ, 2007). A análise da diversidade genética de
29
várias amostras de DENV indica que os genótipos originados da Ásia são mais
virulentos do que os genótipos Americanos e do Pacífico Sul, e, portanto, podem
levar mais facilmente ao desenvolvimento da FHD (COLOGNA; ARMSTRONG;
RICO-HESSE, 2005; GREEN; ROTHMAN, 2006; CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006).
Além dos fatores citados acima, é claro o papel do hospedeiro no
desenvolvimento da FHD. Estudos indicam que o fator mais importante para o
desenvolvimento da FHD é a presença de anticorpos não-neutralizantes que
favorecem a infecção do DENV nas células susceptíveis (Antibody-dependent
enhancement). Este fenômeno acontece em uma infecção secundária causada por
um sorotipo diferente, onde os anticorpos produzidos na infecção primária
favorecem, no momento atual, a infecção de células que possuem receptor para
Imunoglobulina do tipo FCγRII. O aumento da replicação do DENV contribui para o
aumento da viremia, o que leva a uma extensa injúria tecidual, ativação de
complemento, secreção de citocinas, aumento da permeabilidade vascular, e
apoptose (OISHI et al., 2007; WHITEHEAD et al., 2007; KURANE, 2007). Apesar de
o componente imunológico ser considerado de extrema importância, várias
evidências sugerem que a variabilidade genética do hospedeiro também influencia a
pré-disposição ao desenvolvimento da FHD. Estas evidências surgiram a partir de
um estudo que constatou que a raça negróide é mais resistente ao desenvolvimento
de FHD do que a raça caucasiana (DE LA C SIERRA et al., 2006; DE LA C SIERRA;
KOURI; GUZMÁN, 2007).
1.2.4 – Epidemiologia, Prevenção e Tratamento da Dengue
No Brasil mais de 200 tipos diferentes de arbovírus foram isolados, sendo
que pelo menos 40 deles causam doenças graves em humanos. Dentre estes
podemos citar vírus pertencentes à família Alphaviridae, Togaviridae, Bunyaviridae,
Reoviridae, Rhabdoviridae e Flaviviridae (FIGUEIREDO, 2006). Os membros da
família Flaviviridae, mais especificamente o Dengue vírus e o Febre Amarela vírus
são as arboviroses emergentes mais importantes no Brasil. A dengue é atualmente
endêmica em 112 países da África, Américas, Mediterrâneo, Sudeste Asiático e
Pacifico Oeste. Estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS) indicam que
30
40% da população mundial (2,5 bilhões de pessoas) vivem em áreas de risco para
dengue (WHITEHEAD et al., 2007).
Até o presente momento foram descritos 4 diferentes sorotipos do DENV
denominados de DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Estes sorotipos são
antigenicamente e sorologicamente distintos (HALSTEAD, 1988; HENCHAL;
PUTNAK, 1990; RICO-HESSE, 2003; HALSTEAD, 2007). O DENV é transmitido ao
hospedeiro vertebrado (homem) através da picada de mosquitos fêmeas infectadas
do genero Aedes sp. O Aedes aegypti é o vetor mais importante das epidemias de
dengue, espécie originária da África, mas que encontrou condições favoráveis ao
seu desenvolvimento e colonização em terras americanas, dificultando, assim, sua
extinção. Outra espécie considerada um vetor potencial, mas ainda não incrimidado
por surtos de dengue no Brasil é o Aedes albopictus. (GOMES et al., 2005; SERPA
et al., 2006; SINGHI; KISSOON; BANSAL, 2007).
Estes vetores apresentam comportamento semelhante no que se refere à
freqüência de suas formas imaturas nos diversos criadouros artificiais como ralos,
vasos com plantas e latas, garrafas e plásticos. Este alto índice provavelmente se
deve à grande concentração de utensílios e demais objetos utilizados pelas donas
de casa no seu dia-a-dia, e à forma inadequada na hora do descarte desse material,
o que faz com que os programas de controle dirijam suas ações para esses
depósitos. (SILVA et al., 2006).
A dengue é considerada uma doença negligenciada, pois acomete
populações pobres, de regiões desfavorecidas e politicamente pouco expressivas
(FRANCO-PAREDES et al., 2007). O Brasil é uma das regiões mais afetadas no
Mundo sendo responsável por aproximadamente 60% das notificações nas
Américas. A presença de um clima favorável ao desenvolvimento do vetor
(temperaturas elevadas associadas à presença de chuvas) e às más condições de
urbanização e sanitárias, torna o Brasil um foco para a transmissão da dengue.
Assim, como outros países, o Brasil tem apresentado nos últimos anos, um aumento
considerável no número de casos de FD e FHD (SCHMIDT et al., 2008).
31
A dengue representa uma das mais sérias doenças infecciosas do mundo, as
áreas em que representa um problema de saúde pública têm se expandido, como é
observado nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente no
Suldeste e Sul da Ásia, nas Américas Central e Sul e no Caribe. Aproximadamente
2,5 bilhões de pessoas são passíveis de infecção e destes estima-se que 100
milhões de casos de dengue ocorrerão anualmente, a partir dos quais,
aproximadamente, 500.000 casos de FHD serão reportados com taxa de fatalidade
de 1 a 5%. Em 2005, houve cerca de 320.000 casos de dengue nas Américas dos
quais, 15.253 eram de dengue hemorrárico, com 80 mortes registradas. Somente no
Brasil aconteceram cerca de 2/3 dos casos e metade dos óbitos (KURANE, 2007;
SINGHI; KISSOON; BANSAL, 2007). No Nordeste, a dengue é um problema de
saúde pública desde o início dos anos 90 quando as epidemias da doença tornaram-
se mais frequentes. No Piauí, em 2000 um período de alta atividade do dengue vírus
foi iniciado com consequente aumento do número de casos, os quais tendem a
comportamento epidêmico nos períodos de janeiro a junho por ser o período
chuvoso (CASTRO et al., 2003; RIBEIRO; SOUSA; ARAÚJO, 2007).
Atualmente, a principal forma de diminuir o número de casos de dengue são
as campanhas publicitárias que procuram conscientizar a população, com um
sentido educacional, para evitar o acúmulo de água em reservatórios como, por
exemplo, pneus, caixas d’água, pois proporcionam aumento de criadouros para a
eclosão de ovos. Também contribuem para a manutenção de populações desse
mosquito, mesmo em períodos não favoráveis como nos meses de baixas
precipitações. Isto pode ser comprovado pelo fato da transmissão transovariana não
ser um fator decisivo na persistência do vírus em meio urbano, por ocorrer em uma
frequência muito baixa e a existência de hospedeiro infectado ser muito mais
frequente (FORATTINI; BRITO, 2003; SILVA et al., 2006; ZEIDLER, 2008).
Existem muitos desafios a serem contornados na dengue. Em primeiro lugar,
ainda não estão disponíveis drogas antivirais e vacinas para dengue. Segundo, os
esforços para o combate do vetor do DENV são ineficientes e, portanto, não
conseguem conter o aparecimento de novas epidemias. Terceiro, a dengue
necessita de uma eficiente vigilância epidemiológica que deve envolver estratégias
entomológicas, clínicas e laboratoriais que forneçam dados consistentes para o
32
direcionamento das políticas públicas de saúde para o combate à doença.
(FARRAR et al., 2007).
Devido a inexistência de terapia antiviral específica o tratamento paliativo
baseia-se, principalmente, no controle da febre e da pressão arterial. É administrado
comumente paracetamol, procurando evitar salicilatos e anti-inflamatórios, pois
esses predispõe o paciente a hemorragias. É necessário a reposição de fluidos,
utilizando ringer lactato, colóides e/ou plasma dependendo da gravidade do quadro
(SINGHI; KISSOON; BANSAL, 2007).
Além da carência de testes diagnósticos mais rápidos e sensíveis, a dengue
ainda não possui nenhuma vacina disponível no mercado. A vacina ideal para
dengue deve induzir proteção contra os quatro sorotipos de DENV. A proteção
contra somente um ou dois sorotipos é indesejável, pois pode aumentar o risco de
desenvolvimento de FHD em infecções subseqüentes por outros sorotipos. Assim, é
indispensável que as vacinas para dengue venham a conter uma mistura
tetravalente de doses apropriadas de cada sorotipo, que possam induzir uma
imunidade eficiente e duradoura contra os quatro sorotipos. Atualmente, as vacinas
mais promissoras de DENV são baseadas em vírus vivos atenuados (WHITEHEAD
et al., 2007).
1.3 – Fármacos com Atividade Antiviral para Dengue
A comunidade científica aspira pelo descobrimento de drogas antivirais, tanto
sintéticas como naturais, contra o DENV, considerado um problema mundial de
saúde. As pequisas em desenvolvimento exploram supostas drogas que possam
bolquear e/ou inibir as funções exercidas pelo virus e pela célula durante a infecção.
Os mecanismos de ação destas substâncias envolvem a inibição da entrada do vírus
na célula, da replicação viral, do processamento pós-traducional da poliproteína
viral, das proteínas NS1, do complexo NS2-NS3, helicase NS3, NS3 protease, NS5
metiltransferase, NS5 RNA polimerase dependente de RNA, além daquelas com
33
ação anti-inflamatória e antiapoptótica. (GHOSH; BASU, 2008; SAMPATH;
PADMANABHAN, 2009).
Os componentes carragenina, heparan sulfato e seus derivados e
polissacarídeos sulfatados tem provado exercer excelente atividade antiviral in vitro
através do bloqueio da ligação e a internalização do vírus. A intensidade deste
efeito pode variar com o sorotipo viral, a célula infectada e peso molecular do
composto utilizado, pois quanto menor o tamanho maior a probabilidade de ligação
às proteínas plasmáticas aumentando seu tempo de meia-vida e,
consequentemente, a biodisponibilidade. Evidências indicam que a carragenina
bloqueia eventos pós-adsorção, por meio de sua associação com a proteína E,
impedindo assim, a liberação do nucleocapsídeo do endossoma no citoplasma
(TALARICO et al, 2005; LEE et al, 2006; TALARICO; DAMONTE, 2007).
A castanospermine, um alcalóide natural, e derivados iminoaçúcares são
inibidores das α-glicosidases do retículo endoplasmático. Estas enzimas promovem
a glicosilação na região N terminal e o dobramento de algumas proteínas virais
como prM, E e NS1. Como resultado da atividade destas drogas temos uma menor
taxa de replicação, secreção de partículas virais e, principalmente, menor
infectividade do DENV. A glicosilação é um passo essencial para a atividade de
NS1, que participa da replicação viral (WU et al. 2002; CRABTREE; KINNEY;
MILLER, 2005; WHITBY et al. 2005).
A ribavarina, um antiviral de amplo espectro in vitro e in vitro, é um análogo
de nucleosídeo classificado como pró-droga por ser convertida por fosforilação em
seu metabólito nucleotídeo, a ribavarina trifosfato, cuja atividade antiviral se dá pela
inibição enzimática no sítio ativo, além disso, apresenta menor probabilidade de
desenvolver resistência durante a terapia. O seu mecanismo de ação não é
completamente entendido, pois pode inibir algumas viroses (hepatite e dengue) por
mecanismos diferentes como a inibição da inisina monofosfato deidrogenase que
depleda guanosina trifosfato intracelular, inibição da RNA polimerase, ou por induzir
mutações em virus de RNA (DIAMOND; ZACHARIAH; HARRIS, 2002; PARKER,
2005; SAMPATH; PADMANABHAN, 2009).
34
Com relação ao DENV, existem controvérsias entre os cientistas sobre a
atividade da ribavarina, pois alguns estudos tem mostrado fraca atividade, já que
experimentos in vitro comprovam que apenas concentrações elevadas, acima de
100 µg/mL apresentam significante efeito inibitório. Outros já afirmam que em um
futuro próximo poderá ser usada, isolada ou em combinação, para o tratamento das
flaviviroses. Existem indícios de que a ribavarina pode dificultar o desenvolvimento
de febre hemorrágica, pois sobre o Hantavírus, que também provocar tal sintoma, a
ribavarina promoveu uma diminuição das complicações renais e reverção da anemia
hemolítica. Assim, há necessidade de mais pesquisas relacionadas a sua atividade
in vivo contra o dengue virus (DIAMOND; ZACHARIAH; HARRIS, 2002; CRANCE et
al. 2003 ; CLERQ, 2004; RUSNAK et al., 2009).
O ácido micofenólico, mais utilizado como um agente imunossupressor, tem
mostrado amplo espectro antiviral contra as flaviviroses, mas não ativo contra o
Vírus da Hepatite C. É um inibidor não nucleosídico da inosina monosfato
deidrogenase, que previne células humanas in vitro de infecções pelo DENV ao
reduzir significativamente os níveis de RNA viral, de antígeno viral intracelular e da
progenie infecciosa do vírus. O mecanismo envolvido provavelmente está
relacionado com os baixos níveis de guanosina intracelular que afeta a replicação
viral (DIAMOND; ZACHARIAH; HARRIS, 2002).
Os antibióticos também tem apresentado atividade antiviral. A minociclina,
uma tetraciclina de segunda geração semisintética representa um novo potencial
terapêutico para prevenir e controlar as complicações neurológicas do vírus da
encefalite japonesa e um candidato ideal para testes clínicos em humanos. Ela atua
inibindo fatores pró-inflamatórios como as citocinas Interleucina 6 (IL-6), fator de
necrose tumoral α, interferon-γ, além de inibir a caspase 3, a quinase N terminal c-
Jun (JNK) que lhe atribuem uma atividade antiapoptótica. Estes efeitos são
independentes da sua conhecida atividade antimicrobiana e também conferem uma
possível atividade antiviral contra o dengue vírus (MICHAELIS et al. 2007; MISHRA;
BASU, 2008).
Portanto, existem vários alvos possíveis para controlar a replicação de DENV
fato baseado na hipótese de que as proteínas não estruturais não estão limitadas
35
apenas a replicação, mas também regulam a montagem da partícula viral o que
enaltece o uso de todas as proteínas envolvidas na replicação e montagem do vírus
como alvos promissores para os antivirais. (LI et al. 2008; MURRAY; JONES; RICE,
2008).
36
JUSTIFICATIVA
_____________________________________
37
2 – JUSTIFICATIVA
A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico
alternativo de grande aceitação pela população e vem crescendo junto à
comunidade médica, desde que sejam utilizadas plantas cujas atividades biológicas
tenham sido investigadas cientificamente, comprovando sua eficácia e segurança. A
partir de então, tornou-se cada vez mais necessário o estudo com plantas para
investigação de possíveis ações farmacológicas e obtenção de novas moléculas
bioativas. É evidente que existe um grande potencial terapêutico na biodiversidade
de nosso país e que uma das formas de explorar esta biodiversidade são os
produtos naturais extraídos de plantas e animais (GAZZANEO, 2005;
ALBUQUERQUE, 2006).
O Brasil é um país que apresenta um enorme potencial biotecnológico pelo
fato de abrigar diversos ecossistemas naturais complexos. Dentre os ecossitemas
naturais que se destacam neste aspecto está o Cerrado. Esse ecossistema é
segundo maior bioma brasileiro, estende-se por uma área de cerca de 2 milhões de
km², abrangendo oito estados do Brasil Central: Minas Gerais, Goiás, Tocantins,
Bahia, Maranhão, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Piauí e o Distrito Federal
(RATTER; RIBEIRO; BRIDGEWATER, 1997; OLIVEIRA; MARQUES, 2002). É
cortado por três das maiores bacias hidrográficas da América do Sul, com índices
pluviométricos regulares que lhe propiciam sua grande biodiversidade, a qual tem
um grande potencial para a produção de fármacos com diversas atividades
biológicas. Apesar do potencial terapêuico da biodiversidade do sertão, somente
uma pequena porção da sua fauna e flora foram estudadas de forma a identificar as
atividades biológicas dos compostos bioativos extraídos destas fontes naturais. O
Estado do Piauí apresenta a quarta maior extensão de cerrado fornecendo, portanto,
significativa diversidade vegetal a ser explorada.
Dentre as atividades biológicas apresentadas por estes produtos naturais, se
destaca o uso destes bioprodutos no tratamento de doenças infecciosas. Vários
compostos com atividade anti-microbiana já foram isolados de plantas e secreções
38
animais. Os principais grupos de compostos com propriedades antimicrobianas,
extraídos de plantas incluem: terpenóides e óleos essenciais (TORSSEL, 1989);
alcalóides (FESSENDEN, 1982); lectinas e polipeptídios (TERRAS et al.,1993;
ZHANG; LEWIS, 1997) e substâncias fenólicas e polifenóis, que são: fenóis simples,
ácidos fenólicos, quinonas (STERN et al., 1996), flavonas, flavonóis e flavonóides
(FESSENDEN, 1982), tanino (SCALBERT, 1991) e cumarinas (O’KENNEDY;
THORNES, 1997).
O Núcleo de Pesquisa em Plantas Medicinais da Universidade Federal do
Piauí com o objetivo de comprovar estudos etnobotânicos de C. leprosum avaliou a
atividade antinociceptiva a partir do extrato etanólico (EE) das cascas do caule e de
suas frações aquosa (FA) e hidroalcoólica (FH) nos modelos da formalina,
capsaicina e contorções abdominais e observaram que esta atividade envolve o
sistema serotoninérgico e adrenérgico, mas não o opióide (LOPES, L.S. et al. 2008).
O mecanismo de ação da FH envolve o sistema do óxido nítrico, porém não envolve
a participação de receptores da adenosina ou muscarínicos, além disso, a ação dos
sistemas serotoninérgico e adrenérgicos através dos receptores 5HT2A e alfa 2,
respectivamente (LOPES, L.S. et al. 2009).
As doenças infecciosas representam um grande problema de saúde pública
no mundo, no Brasil e principalmente na Região Nordeste. A emergência e re-
emergência de doenças de origem viral, bacteriana e parasitária acoplada ao
aumento da resistência de alguns patogénos aos fármacos existentes e/ou a
inexistência de fármacos para combate às estas infecções indicam a necessidade de
descobrir e desenvolver novas drogas efetivas para combater estas doenças.
A dengue é um dos mais sérios problemas de saúde mundial. O Brasil é uma
das regiões mais afetadas sendo responsável por aproximadamente 60% das
notificações nas Américas. Portanto, diante deste quadro complexo é essencial
produzir conhecimentos que permitam nortear o desenvolvimento de drogas
antivirais para Dengue. Uma provável fonte de compostos com atividade antiviral
são os produtos naturais originados de plantas do Cerrado Piauiense. As plantas
desta família apresentam constituição rica em triterpenos e flavonóides, compostos
com ampla atividade antiviral.
39
Baseado nesta informação e na falta de substâncias com atividade antiviral
para a dengue, propõe-se neste trabalho, investigar a atividade antiviral sobre a
replicação de Dengue vírus utilizando plantas da Família Combretaceae do Meio
Norte do Brasil.
40
OBJETIVOS
_____________________________________
41
3 – OBJETIVOS
3.1 – Objetivo Geral
• Avaliar a atividade antiviral dos Extratos etanólicos de Combretum leprosum
Mart., Terminalia brasiliensis Camb. e Terminalia fagifolia Mart. et Zucc
pertencentes à família Combretaceae contra a multiplicação de Dengue vírus.
3.2 – Objetivos Específicos
1) Analisar a atividade citotóxica dos extratos etanólicos de Combretum
leprosum Mart., Terminalia brasiliensis Camb. e Terminalia fagifolia Mart. et Zucc em
células C6/36.
2) Analisar in vitro a atividade antiviral dos extratos etanólicos de Combretum
leprosum Mart., Terminalia brasiliensis Camb. e Terminalia fagifolia Mart. et Zucc
contra a multiplicação do Dengue virus 3 (DENV -3) em células C6/36.
42
METODOLOGIA
_____________________________________
43
4- METODOLOGIA
4.1 – Coleta das folhas de T. fagifolia e cascas do caule de T. brasiliensis e C.
leprosum.
As folhas de T. fagifolia foram coletadas em setembro de 2002 na cidade de
Floriano-Pi, as cascas do caule de C. leprosum e de T. brasiliensis foram coletadas
em setembro de 2006 em Teresina-Pi e setembro de 2002 em Nazaré do Piauí,
respectivamente. As três espécies foram identificadas pela Dra. Gardene Maria de
Souza do Herbário Graziela Barroso – UFPI, onde se encontram as exsicatas sob os
números 18061, 6216 e 10340, respectivamente.
4.2 – Obtenção dos extratos etanólicos das cascas do caule de C. leprosum, T.
brasiliensis e das folhas de T. fagifolia.
O material das espécies coletadas foi moído isoladamente em moinhos de
facas de Marconi. As folhas da espécie T. fagifolia e cascas do caule de T.
brasiliensis e C. leprosum foram secas ao ar, moídas obtendo-se as seguintes
massas 111g, 1196 g e 1300 g, que foram extraídas 6 vezes com etanol a
temperatura ambiente. O etanol foi extraído em evaporador rotativo de Fisaton 802D
e a secagem completa dos extratos que continham água foi realizada em liofillizador
constituído de Micro Modulyo Edwards acoplado a uma bomba de alta vácuo
Valpump VLP80 Savant. Após estes processos foram obtidos 111g, 78 g e 123 g e o
rendimento foi de 6%, 100% e 100% dos extratos das folhas de T. fagifolia e cascas
do caule de T. brasiliensis e C. leprosum, respectivamente.
4.3 – Cultura celular
As células C6/36 são derivadas de larvas de mosquito Aedes albopictus, e
foram gentilmente cedidas pela Professora Erna Geessien Kroon da Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG). Foram cultivadas em meio Leibowitz-15 (L-15,
Cultilab, Brasil), contendo 20 µg/ml de gentamicina, 50 µg/ml de fungizona, 20 µg/ml
44
de ciprofloxacina e 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantida em estufa tipo
“Biologic Oxigen Demand” (B.O.D.) à 28ºC. Para repiques das monocamadas
fechadas, o meio de cultivo foi desprezado e as células lavadas com solução fosfato
tamponada (PBS) pH 7,0 e homogeneizadas. Em seguida, as células foram
ressuspensas em meio de cultivo celular e distribuídas em garrafas de 25 cm
2
.
4.4 – Produção de Dengue vírus 3
Neste estudo utilizou-se uma amostra de Dengue vírus 3 (DENV-3-Am25)
isolada a partir de soro de um paciente com FHD. Esta amostra foi gentilmente
cedida pelo Dra. Erna Gessein Kroon do Laboratório de Vírus da Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG).
A amostra Dengue vírus 3 (DENV 3) foi inoculada com uma multiplicidade de
infecção (M.O.I) de 0,1 em células C6/36. Após a infecção, as células foram
visualizadas diariamente, ao microscópico óptico, até apresentarem efeito citopático
(ECP), caracterizado pela formação de sincícios quando comparadas com as células
controle. O sobrenadante destas células infectadas foi então coletado e clarificado
por centrifugação a 4ºC, 15 minutos e 2000 rotações por minuto (rpm). Após a
centrifugação para remoção do debris celular, o sobrenadante foi coletado
novamente, aliquotado e congelado a -70ºC.
4.5 - Titulação de Dengue vírus 3
Para a determinação do título viral foi empregada a técnica de microdiluição
para a determinação da dose infectante para 50% das câmaras ou TCID
50
(“Tissue
Culture Infective Dose”). O sobrenadante contendo as partículas virais foi
descongelado e diluído seriadamente na razão de 10 até a diluição de 10
-5
. Estas
diluições foram utilizadas para a infecção de células C6/36 cultivadas em placas com
96 poços contendo monocamadas confluentes deste tipo celular (10.000
células/poço). A infecção de cada poço foi realizada com 100 µL da diluição, sendo
que para cada diluição do vírus foram utilizadas oito poços (octoplicata). Igual
número de poços contendo apenas células foi utilizado como controle, em seguida
as placas foram incubadas a 28ºC em estufa B.O.D. por cerca de 7 dias até o
aparecimento do efeito citopático característico de DENV nesta células (sincícios).
45
Para cada diluição foi determinado o número de poços positivos (apresentaram
ECP) e negativos (ausência de ECP). Com base nestes dados o TCID
50
foi
calculado segundo o método de REED e MUENCH (REED e MUENCH, 1938)
descrito por LENNETT e SCHMIDT (1979). Inicialmente é necessário calcular a
distância proporcional (DP) entre os dados referentes às diluições utilizadas e
posteriormente corrigir pelo logaritmo do fator da dliuição empregado. Como a
diluição foi realizada na razão de 10, o fator de correção é 1 (log
10
= 1). O cálculo do
TCID
50
foi realizado atraves da soma do logaritimo negativo da diluição que rendeu a
taxa de infecção mais próxma de 50% e a distância proporcional. Esta soma deve
ser multiplicada pelo logaritmo do fator de diluição (no caso 1).
DP = (% de poços positivos na diluição mais próxima de 50%) - 50%
---------------------------------------------------------------------------
__
Log TCID50 =
(DP + log da diluição mais próxima de 50%) X (log do fator de diluição)
4.6 – Identificação do efeito citotóxico dos extratos etanólicos da cascas do
caule de C. leprosum e T. brasiliensis e das folhas de T. fagifolia sobre células
C6/36.
O teste de citotoxicidade dos extratos brutos de C. leprosum, T.brasiliensis e
T. fagifolia teve por objetivo a determinação da concentração máxima não tóxica
(CMNT) em células C6/36. A CMNT foi determinada pela observação de alterações
morfológicas nas células e/ou pela morte celular através da microscopia de Luz
invertida (BARTH; SCHATZMAYR, 1992). Para isto, as células cultivadas em placas
de 6 poços foram expostas as seguintes concentrações de cada extrato 50 mg/mL, 5
(% de poços
positivos na diluição
mais próxima de
50%)
(% de poços
positivos na diluição
abaixo da que
obteve um valor
próximo a de 50%
de positividade)
46
mg/mL, 1 mg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 100 µg/mL. Durante sete dias registraram-
se as alterações celulares através da análise microscópica.
4.7 - Avaliação da Citotoxicidade dos extratos etanólicos das folhas de T.
fagifolia e das cascas do caule de C. leprosum e T. brasiliensis.
A citotoxicidade também foi avaliada através do teste de viabilidade celular
usando o método 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromide (MTT)
(Mosmmann, 1983). Diluições seriadas dos extratos foram adicionadas a
monocamadas de células C6/36 em placas de 96 poços (1x10
5
células/poço) e estas
foram incubadas por 72 horas a 28ºC. Para o ensaio MTT o meio foi removido das
células após as 72 horas de incubação e 25 µl da solução de MTT (Sigma) (2mg/ml)
preparada em tampão fosfato salina (PBS) foi adicionado a cada poço e as placas
incubadas por 90 minutos a 28ºC. A solução de MTT foi removida e 130 µl de DMSO
foram adicionados a cada poço para dissollver os cristais de formazan. Após agitar
gentilmente as placas por 15 minutos os cristais foram dissolvidos e a absorbância
foi lida em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 495 nm. A
porcentagem de citotoxicidade foi calculada utilizando a seguinte fórmula: [(A-
B)/Ax100], onde A e B são as absorbâncias do controle e das células tratadas,
respectivamente. A concentração citotóxica de 50% dos extratos foi estimada
através de curvas concentração-efeito após análise de regressão linear.
4.8 – Teste de fragmentação de DNA.
O teste de fragmentação de DNA foi realizado de forma a verificar a influência
destes extratos na indução da morte apotótica e necrótica. Para a análise da morte
celular provocada por concentrações tóxicas dos extratos de C. leprosum, T.
brasiliensis e T. fagifolia,placas de 24 poços contendo monocamadas de células
C6/36 foram tratadas com as concentrações de 1000 µg/mL, 100 µg/mL e 10 µg/mL
dos extratos por 24 horas. Após o tempo de tratamento, o meio de cultura foi retirado
e a monocamada de célula lavada duas vezes com PBS pH 7,0.
47
Para extração do DNA, as monocamadas foram incubadas por 30 minutos a
10°C com 0,5mL de tampão lítico hipotônico TTE (10mM Tris, 0,25% Triton x 100,
1mM EDTA). O DNA foi extraído através da adição de 0,5 mL de uma solução de
álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (1:25:24). Em seguida, foi adicionado acetato de
sódio 3M, pH 5,2, no volume de 1:20, e etanol a 96
o
, a –20
o
C, durante a noite, no
volume de 1:2. O DNA foi sedimentado após a centrifugação por 15 minutos a 4°C
13500 rpm. O sedimento de DNA foi lavado duas vezes em etanol a 70%, seco à
temperatura ambiente e ressuspenso em TE [Tris-HCl a 10 mM (pH 7,4) e EDTA a
1mM] submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,0%, durante 100 minutos, a
60V. O gel foi corado com brometo de etídio e fotografado sob transiluminação
ultravioleta.
4.9 – Análise in vitro do efeito antiviral dos extratos das cascas do caule de C.
leprosum de T. brasiliensis e das folhas de T. fagifolia.
A análise in vitro do efeito antiviral dos extratos e frações de C. leprosum, T.
brasiliensis e T. fagifolia também foi realizada em células C6/36. Após a obtenção de
placas de 24 poços contendo monocamadas confluentes de células C6/36 (100.000
células/poço), estas foram infectadas com 10.000 TCID de DENV-3 e
homogeneizadas a cada quinze minutos durante 1 hora para facilitar a adsorção
viral. Após este intervalo, o meio contendo o vírus foi retirado, a monocamada
lavada com PBS pH 7.0 e então foram adicionadas diluições dos extratos nas
concentrações de 75, 50, 25 e 10 µg/mL. As monocamadas foram visualizadas
diariamente até a formação de efeito citopático no controle de vírus (câmaras
infectadas somente com o DENV-3. A atividade antiviral foi determinada através
comparação do efeito citopático nas células tratadas com a cocncetração dos
extratos com o controle de vírus. A concentração antiviral de 50% (EC
50
) foi definida
como a concentração que é necessária para inibir 50% do efeito citopático induzido
pelo vírus e foi calculada atrvés da curva concentração-efeito após análise de
regressão linear. O índice de seletividade foi determinado como a taxa de CC
50
para
a viabilidade celular e EC
50
para a replicação do vírus (MOSSMANN, 1983).
48
RESULTADOS
_____________________________________
49
5- RESULTADOS
5.1 – Determinação da concentração máxima não tóxica dos extratos
etanólicos das cascas do caule de C. leprosum e T. brasilienses e das folhas
de T. fagifolia sobre as células C6/36.
O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antiviral sobre a replicação de
Dengue vírus utilizando espécies da Família Combretaceae do Meio Norte do Brasil.
As concentrações máximas não tóxica (CMNT) dos extratos etanólicos das folhas de
T. fagifolia e da casca do caule de T. brasiliensis e C. leprosum, foram determinadas
utilizando células C6/36 cultivadas na presença dos respectivos extratos em
diferentes concentrações. A CMNT foi determinada através da observação da morte
celular e alterações morfológicas das células. Os resultados indicaram citotoxicidade
nas concentrações mais altas (50 mg/mL, 5 mg/mL, 1 mg/mL, 500 µg/mL e 250
µg/mL) em todos os extratos estudados (Figura 3).
O efeito citotóxico foi caracterizado por morte celular e aumento no volume
celular e nuclear, sendo, entretanto, mais intenso em C. leprosum (Figura 4). Já na
concentração de 100 µg/mL (Figuras 3 e 4) não foi evidenciado nenhum efeito
citotóxico visível nos três extratos estudados sendo, portanto, a CMNT. Conforme
mostrado na Figura 4, as concentrações mais elevadas dos extratos, acima de 100
µg/mL, foram extremamente tóxicas às monocamadas de células C6/36, induzindo a
destruição da monocamada celular após 24 horas do tratamento.
Apesar da análise das alterações morfológicas ser um parâmetro confiável, o
ensaio MTT através da CC
50
permitiu definir especificamente a concentração de
cada extrato capaz de lisar 50% das células do meio de cultura. Assim, C. leprosum
apresentou menor CC
50
(165 µg/mL) em comparação com T. fagifolia e T.
bralisiensis que apresentaram CC
50
de 167 e 177, respectivamente (Tabela 01).
Para verificar se o tratamento prolongado afetaria a viabilidade celular,
diversas concentrações abaixo da CMNT de 100 µg/mL (Figura 3) foram testadas a
50
fim de analisar a viabilidade celular em 24, 48, 72 e 120 horas após o tratamento.
Conforme demonstrado para o tempo de 24 horas de tratamento, todas as
concentrações testadas não induziram nenhuma alteração celular mesmo após 120
horas após tratamento (dado não mostrado).
51
Figura 3: Determinação da Concentração Máxima não Tóxica (CMNT) dos
extratos etanólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T.
brasiliensis e C. leprosum. Células C6/36 foram tratadas com diferentes
concentrações dos extratos etanólicos e após 24 horas a citotoxicidade foi medida
através da morte celular ou alterações morfológicas.
52
Figura 4: Fotomicrografias representativas da Atividade Citotóxica dos
extratos etanólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T.
brasiliensis e C. leprosum em células C6/36 tratadas com 1000, 100 e 10 µg/ml
dos respectivos extratos. Aumento: 400X.
53
Tabela 01: Citotoxicidade de extratos Plantas da Família Combretaceae do
Nordeste Brasileiro em células C6/36.
Planta Parte da
planta
testada
Uso popular CC
50
a
(µg/mL)
C. leprosum
Casca do
caule
Antidiarrêica 165 ± 7,9
T. brasiliensis
Folhas
Antiespasmódica,
Antidiarrêica
177 ± 11,0
T. fagifolia Casca do
caule
Afta, antitumoral 167 ± 9,3
a: Os resultados são expressos como medias (± SD) de três experimentos
separados.
Após o tratamento das células C6/36 com as concentrações tóxicas, acima de
100 µg/mL, dos extratos etanólicos das plantas testadas, foi verificado que todas
apresentaram um aumento de volume, seguidas por vacuolização e lise celular
(Figura 4). Ao analisar a influência dos extratos sobre o DNA celular em gel de
agarose observamos que os extratos etanólicos das folhas de T. fagifolia e da casca
de T. brasiliensis e C. leprosum, na concetração de 1000 µg/ml induziram uma
fragmentação do DNA, gerando um arraste no gel de agarose (Figura 5).
Interessantemente, apesar de não ser detectado uma intensa fragmentação de DNA
nas células tratadas com a concentração de 100 µg/ml, foi detectada, após o
tratamento com todos os extratos, uma banda intensa de baixo peso molecular. Já
na concentração de 10 µg/ml não houve fragmentação de DNA em nenhum dos
extratos, de forma semelhante ao controle de células e as células tratadas com
DMSO.
54
Figura 5: Fragmentação de DNA induzido por concentrações tóxicas dos
extratos etanólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T.
brasiliensis e C. leprosum. Células C6/36 foram tratadas com diferentes
concentrações dos extratos etanólicos e após 24 horas o DNA foi extraído e
submetido a uma eletroforese em gel de agarose a 1,0%. PM: Padrão de peso
molecular 100 bp, CC: Controle de Células e DMSO: dimetilsulfoxido. Os números
indicam a concentração dos extratos em µg/mL.
55
5.2 – Atividade antiviral dos extratos etanólicos das folhas de T. fagifolia e das
cascas do caule de T. brasiliensis e C. leprosum sobre a replicação de Dengue
vírus.
Após a determinação da CMNT de 100 µg/mL por vizualização microscópica e
testes de citotoxicidade por MTT, foram realizados ensaios biológicos para a
determinação da atividade antiviral destes extratos sobre a replicação de DENV-3.
As células foram então, visualizadas diariamente, ao microscópico óptico, até
apresentarem efeito citopático (ECP), caracterizado pela formação de sincícios. A
atividade antiviral dos extratos foi medida através da diminuição do efeito citopático
do Dengue vírus em células C6/36 (formação de sincícios) quando comparado ao
controle de vírus. Todos os extratos etanólicos estudados apresentaram efeitos
antivirais significativos nas diluições mais altas 75, 50 e 25 µg/mL (Figura 6).
Conforme demonstrado na figura 6, todos os extratos etanólicos estudados
apresentaram efeitos antivirais significativos nas diluições mais altas (75, 50 e 25
µg/mL). O extrato derivado da casca de C. leprosum apresentou uma inibição de
100, 95 e 85% da formação de sincícios nestas concentrações. O extrato de T.
fagifolia apresentou uma inibição de 100, 98 e 70% nas concentrações de 75, 50 e
25 µg/mL, respectivamente. Já o extrato de T. brasiliensis se mostrou menos eficaz
em inibir a formação do efeito citopático, pois apresentou uma inibição de 95% na
concentração de 75 µg/mL, 66% na concentração de 50 µg/mL e 35% na
concentração de 25 µg/mL. As concentrações de 10 e 1 µg/mL apresentaram
atividades antivirais significativas somente no extrato de T. fagifolia (50 e 23%
respectivamente). Na figura 07 pode-se obervar a ausência de efeito citopático
(sincícios) nos três extratos em comparação com DMSO e o controle de vírus. A
análise da curva dose-resposta por regressão linear levou a determinação do EC
50
dos extratos analisados. A concentração do extrato capaz de inibir 50% do ECP
produzido pelo vírus foram 26,98 µg/mL; 34,89 µg/mL e 12,28 µg/mL para as
espécies C. leprosum, T. brasiliensis e T. fagifolia. Nesta mesma ordem, o índice de
seletividade obtido (IC
50
) foi de 6,11; 5,07 e 13,59 como observado na tabela 02.
*
56
Figura 06: Atividade Antiviral dos extratos etanólicos de folhas de T. fagifolia e
das cascas do caule de T. brasiliensis e C. leprosum. Células C6/36 foram
infectadas com 10.000 TCID
50
de DENV-3 e posteriormente tratadas com diversas
concetrações dos extratos etanólicos. A atividade antiviral é expressa em
porcentagem de ECP em comparação com o controle de vírus (células não
tratadas). Para os experimentos com DMSO foi utilizado o mesmo volume de DMSO
correspondente ao utilizado nos extratos para atingir a concentração teste.
57
Figura 07: Fotomicrografias representativas da Atividade Antiviral dos extratos
etanólicos de folhas de T. fagifolia e das cascas do caule de T. brasiliensis e C.
leprosum. Células C6/36 infectadas com o DENV-3 e tratadas com 75µg/mL dos
extratos demonstram a capacidade dos mesmos em inibir o efeito citopático
representado pela ausência dos sincícios. Aumento 400X. Setas: Sincícios induzidos
pela replicação de DENV-3.
58
Tabela 02: Atividade antiviral e extratos Plantas da Família Combretaceae do Nordeste
Brasileiro contra Dengue virus.
Planta Parte da
planta
testada
Uso Popular CC
50
a
(µg/mL)
EC
50
a
(µg/mL)
Índice de
Seletividade
b
(CC
50
/IC
50
)
C.
leprosum
Casca do
caule
Antidiarrêica 165 ± 7,9 26,98 ± 3,7 6,11
T.
brasiliensis
Folhas
Antiespasmódica
Antidiarrêica
177 ± 11,0 34,89 ± 13,7
5,07
T. fagifolia Casca do
caule
Afta, antitumoral 167 ± 9,3 12,28 ± 13,1 13,59
a: Os resultados são expressos como medias (± SD) de três experimentos
separados.
b: O índice de seletividade foi determinado como taxa média de CC
50
para a
viabilidade celular e EC
50
média para a replicação do vírus.
59
DISCUSSÃO
_____________________________________
60
6 – DISCUSSÃO
A inexistência de fármacos antivirais disponíveis para o tratamento da
infecção por DENV contribui a cada ano para o aumento no número de casos
registrados, principalmente, em regiões pobres. Desta forma, este estudo tem como
objetivo verificar a atividade antiviral sobre a replicação de DENV em células C6/36
de extratos derivados de plantas do Cerrado Piauiense. Estudos utilizando plantas
da família Combretaceae já comprovaram atividade antiviral contra HIV-1 e HHV-1 e
HHV-2. (CHENG; LIN, C.; LIN, T., 2002; ASSAMI et al., 2003).
Para determinação da atividade antiviral é necessário antes, determinar a
CMNT da substância a ser testada nas células que serão utilizadas para os estudos
de atividade antiviral. O efeito citotóxico dos extratos utilizados nas concentrações
mais altas (50 mg/mL, 5 mg/mL, 1 mg/mL, 500 µg/mL e 250 µg/mL) foi caracterizado
por morte celular e aumento no volume celular e nuclear (Figura 03). A intensidade
dos efeitos variou entre os extratos, sendo mais evidente a citotoxicidade em C.
leprosum, seguida de T. fagifolia e T. brasiliensis. Dado também comprovado pela
CC
50
, visto que, uma menor concentração (Tabela 01) de C. leprosum provocou
alterações morfológicas mais evidentes (Figura 04) em um mesmo número de
células quando comparado com as outras espécies. Estes resultados são
semelhantes aos obtidos por Fyhrquist et al. (2006), que observaram que a
toxicidade é variável entre as espécies dos gêneros Combretum e Terminalia e ao
compará-los, Combretum mostrou-se mais tóxico.
A caracterização das alterações morfológicas permitiu determinar a
concentração máxima não tóxica obtida para os três extratos em 100 µg/mL (Figura
3). Os parâmetros identificados foram o aumento do volume celular acompanhado
de aumento do núcleo e nucléolo, vacuolização e lise da membrana com
conseqüente extravasamento celular (Figura 4). Até o presente momento, não
existem artigos publicados relacionados à citotoxicidade dos referidos extratos em
células C6/36. Entretanto, Tshikalange, Meyer e Hussein (2005) inspecionaram a
61
citotoxicidade de Terminalia seriacea, espécie da mesma família, em células VK (rim
de macaco) obtendo como efeito a perda da organização celular em monocamadas,
a formação de vacúolos citoplasmáticos e diminuição do volume celular.
A citotoxicidade observada pode ser atribuída às elevadas concentrações dos
vários componentes presentes nos extratos brutos estudados como triterpenos,
esteróides, taninos e flavonóides (ARAÚJO, 2005; AYRES, 2008). Isso é suportado
pelo fato que o aumento da concentração está diretamente relacionado com o
aumento da citotoxicidade como observado facilmente na Figura 03. Vários estudos
também têm mostrado uma atividade dose-dependente de vários destes
componentes (KO et al, 2000; WANG; CHEN; YANG, 2001; MARTINO et al., 2004;
Assim, estas substâncias podem apresentar uma ação citotóxica e antiviral
dependendo da dose empregada.
Inúmeros estudos têm atribuído a citotoxicidade in vitro dos extratos
pertencentes à família Combretaceae às Combretastatinas, substâncias que têm
sido isoladas de várias plantas desta família. Tais espécies são C. Cafrrum, C.
herenoense, T. brevipes, C. forskholii, A. leiocorpus, G. senegalensis e G. indica.
Consideradas drogas de considerável interesse contemporâneo as combretastatinas
caracterizam-se pela toxicidade, principalmente do componente Combretastatin A-4,
um agente anti-mitótico que se liga rapidamente a tubulina no sítio de ligação da
colchicina inibindo, portanto, a polimerização da tubulina. (CIRLA; MANN, 2003;
HALL et al, 2008). No entanto, até o presente momento as combretastatinas não
foram isoladas de plantas cultivadas no Piauí, fato relacionado com uma
comprovada variação dos constituintes químicos com o período e com a região de
cultivo (Chaves relato pessoal).
A citotocixidade in vitro dos extratos em estudo resulta de um conjunto de
alterações morfológicas, bioquímicas e no perfil de fragmentação do DNA, que estão
associadas aos processos de morte celular amplamente associados à apoptose e/ou
à necrose. (BORTNER; OLDENBURG; CIDLOWSKI, 1995). Visando sugerir o tipo
de morte celular envolvida avaliamos o perfil eletroforético de fragmentação do DNA
e as alterações morfológicas.
62
No pocesso apoptótico é possível identificar, dependendo do tipo celular, três
tipos de dano ao DNA, tais lesões correspondem às fragmentações de elevado peso
molecular, aquelas que culminam em um arraste no gel de agarose e na clivagem do
DNA internucleossomal (SCHWARTZ et al, 1993; BORTNER; OLDENBURG;
CIDLOWSKI, 1995; KO et al., 2000). O processo segue com as alterações
morfológicas que são a presença de vacúolos citoplasmáticos, diminuição do volume
celular devido primariamente a perda de água pela célula, a ruptura da membrana
nuclear, desintegração e condensação da cromatina (BORTNER; OLDENBURG;
CIDLOWSKI, 1995; BORTNER; CIDLOWSKI, 1998; IYER, 1998; RAMANATHAN et
al, 2006).
O processo necrótico é definido como um processo passivo que resulta na
perda da homeostase celular e caracteriza-se inicialmente pela desintegração do
DNA em fragmentos de elevado peso molecular seguido por fragmentos de baixo
peso molecular caracterizando o arraste no gel de agarose e promovem alterações
morfológicas como o aumento do volume das organelas e da célula, e
extravasamento do conteúdo intracelular no meio extracelular (SCHWARTZ et al,
1993; HIGUCHI, 2003). Ghosh et al. (2008) também utilizaram como padrão
eletroforético para definir necrose o arraste no gel de agarose. Portanto, os dois
processos de morte celular podem apresentar um padrão de fragmentação do DNA
semelhante dificultando, assim, a determinação de um perfil eletroforético específico
para a apoptose e para a necrose, ressaltando a importânia da análise das
alterações morfológicas.
Várias pesquisas têm relacionado à toxicidade dos extratos de plantas
sobre o DNA com os tipos de morte celular abordados. Chen et al (2009) exploraram
a citotoxicidade de polifenóis isolados (ellagitaninos) dos extratos das folhas secas
de T. calamansanai em células HL-60 e identificaram muitos corpos apoptóticos a 50
µg/mL e um perfil de fragmentação eletroforético do DNA condizente com o
processo apoptótico a uma concentração de 100 µg/mL.
Sakagami et al (1995) observaram que uma variedade de taninos,
principalmente, os hidrolisados induziram a fragmentação do DNA
internucleossomal (um padrão característico da apoptose) em células HL-60.
63
Fyhrquist et al. (2006) também afirmam que 4,3 µg/mL do extrato das folhas de C.
fragans pode induzir apoptose devido a fragmentação do DNA em células cancerosa
HeLa. Wang, Chen e Yang (2000) afirmam que cuphiin D1 (CD1), um tanino
hidrolisado macrocíclico isolado de Cuphea hyssopifolia, induz a apoptose em
células HL-60 em uma concentração de 16 µM. Já em 2001, o mesmo grupo de
pesquisa também atribuiu a um tanino macrocíclico hidrolisado camelliin B, isolado
de Gordinia axillares, a apoptose em células HeLa tratadas com concentrações de
50 e 100 µg/mL.
KO et al. (2000) encontraram evidências óbvias de que flavonóides isolados
da raiz de Sophora flavescens promovem morte apoptótica em concentrações que
variam de 25 a 50 µM em células HL-60 e HepG2. McGaw et al. (2001) também
afirmam que os extratos de espécies de Combretum causam dano ao DNA em uma
concentração de 100 mg/mL dos extratos metanólico, acetona e acetato de etila.
Portanto, a análise da fragmentação do DNA de células tratadas com diferentes
concentrações dos extratos é indispensável em um estudo que envolva toxicidade in
vitro.
Em vista disto, analisamos qualitativamente (figura 05) o dano inicial ao DNA
das células C6/36 cultivadas em diferentes concentrações dos extratos (1000 µg/mL,
100 µg/mL e 10 µg/mL). A eletroforese em gel de agarose demonstra que na
concentração de 1000 µg/mL ocorreu uma fragmentação do DNA em fragmentos de
diferentes pesos moleculares, o que por sua vez culminou em um arraste no gel de
agarose. A figura 05 mostra claramente a presença de uma banda mais intensa no
início do arraste na concentração de 100 µg/mL, seguidos por fragmentos de pesos
moleculares variados evento que pode ser conseqüência da indução de uma morte
necrótica sofrida pelas células C6/36 na presença de elevadas concentrações dos
extratos. Além destes achados identificamos o aumento do volume do citoplasma
com a presença de vacúolos, aumento do núcleo e do nucléolo e lise da membrana
liberando o conteúdo intracelular no meio (Figura 04). Estas características foram
também relatadas por Gómez-Angelats, Bortner e Cidlowski (2000), grupo que
atribuiu estas alterações morfológicas ocorridas durante o processo necrótico à
incapacidade da célula de produzir ATP, interrompendo os mecanismos de
64
transporte iônico através da membrana plasmática que são necessários para manter
o volume normal da célula.
Na concentração de 100 µg/mL (figura 4) não identificamos alterações
morfológicas, através de análise em microscopia de luz invertida, até 72 horas de
tratamento, o que nos conduziu a defini-la como a concentração máxima não tóxica
(CMNT). No entanto, observamos em todos os extratos uma banda intensa de
fragmentação de baixo peso molecular (Figura 05). Higuchi (2003) afirma que a
fragmentação do DNA ocorre em duas etapas na apoptose, primeiramente, o DNA é
clivado em fragmentos de 50 a 300 Kpb e, em seguida, são subsequentemente
clivados em fragmentos menores denominados oligonucleossomos (etapa exclusiva
da apoptose). Assim, o perfil de fragmentação do DNA na concentração de 100
µg/mL, em todos os extratos, como apresentado na figura 05 leva a crer que nesta
concentração a célula inicia o processo apoptótico devido provavelmente a
fragmentação do DNA em elementos de baixo peso molecular, os
oligonucleossomos, característica não observada na necrose. Ko et al (2000)
também obtiveram uma clivagem do DNA internucleossomal extraído de células HL-
60 tratadas com flavonóides extraídos do extrato metanólico de Sophora flavescens.
Wang, Chen e Yang (2001) também observaram que nesta mesma concentração
(100 µg/mL) do tanino hidrolisado camelliin B isolado de Gordonia axillaris induziu
apoptose.
Marlangue et al (1996) afirmam que as células podem sofrer mais de um
processo de morte celular. Saleem et al. (2002), observaram que baixas
concentrações do extrato de T. chebula são capazes de dar início a via celular que
promove apoptose enquanto elevadas concentrações dos extratos tem efeito tóxico
direto, que leva a rápida morte celular necrótica. Portanto, acreditamos que um
mesmo tipo de célula pode sofrer os dois processos de morte celular dependendo da
concentração do extrato no meio de cultivo. Assim, na concentração de 1000 µg/mL
houve possivelmente morte necrótica enquanto em 100 µg/mL ocorre indução da
morte apoptótica. Os resultados de Ko et al (2000) também mostram que nas
concentrações entre 25 e 50 µg/mL as células sofrem morte apoptótica e acima de
50 µg/mL morte necrótica.
65
Outro estudo realizado por SCHWAARTZ et al (1993), vão além ao propor
que a apoptose pode preceder a necrose. HIGUCHI (2002) afirma que o ácido
araquidônico converte apoptose em necrose levando ao aumento das
fragmentações de elevado peso molecular e redução de fragmentações do DNA
internucleossomal, exclusivas do processo apoptótico. Informação de grande
relevância que nos permitiu considerar a concentração do extrato como um fator
determinante para definir o processo de morte celular ao influenciar (direcionar) as
vias bioquímicas específicas de cada um deles.
A fragmentação observada na concentração de 100µg/mL está de acordo
com a afirmação anterior, assim, por se tratar de uma dose limítrofe entre a
toxicidade e o efeito terapêutico, ou seja, a dose máxima não tóxica, a apoptose não
evoluiria para necrose. Tal afirmação baseada no fato de que a fragmentação do
DNA uma etapa comum aos processos apoptótico e necrótico. Além disto, a
ausência de alterações morfológicas e a presença de fragmentação do DNA
induzem a afirmar que o processo de extração do DNA foi realizado no início da
apoptose. A concentração de 10 µg/mL (Figura 04) não provocou fragmentação
celular e alterações morfológicas, por ser uma dose muito baixa na qual não
observaríamos atividade citotóxica, mas atividade antiviral de 50% apenas em
T.fagifolia.
Os estudos em células C6/36 são de extrema importância para a triagem de
extratos com atividade antiviral sobre o DENV. Assim, após a determinação da
CMNT de 100 µg/mL (figura 3) através da análise morfológica e do CC
50
pelo ensaio
MTT (tabela 01) de 165, 167 e 177 µg/mL para os respectivos extratos etanólicos de
C. leprosum, T. fagifolia e T. brasiliensis estes foram testados em células C6/36
infectadas previamente com 10.000 TCID
50
do DENV para determinação da
atividade antiviral. Foram obtidos efeitos antivirais de forma dose dependente nas
concentrações de 25, 50 e 75 µg/mL, de acordo com a análise da inibição do efeito
citopático (formação de sincícios). Assim, os três extratos apresentaram maior
atividade antiviral (maior taxa de inibição do ECP) na concentração de 75 µg/mL
como observado nas figuras 06 e 07.
66
O EC50 (12,28 µg/mL) e o índice de Seletividade (13,59) de T. fagifolia como
observado na tabela 02 obtida no ensaio MTT nos permitu considerar esta espécie
como a que apresentou maior atividade antiviral, visto que, uma menor concentração
do extrato foi capaz de inibir 50% ECP em uma mesma cultura celular quando
comparado a C. leprosum e T. brasiliensis. E C. leprosum como a espécie que
apresentou maior citotoxicidade como observado na figura 04.
Apesar de sua importância para a saúde pública mundial, poucos estudos
realizam este tipo de abordagem em células C6/36 para triagem de extratos naturais
com atividade antiviral contra DENV. Os dois estudos relatados a seguir são os
únicos disponibilizados na literatura que analisaram a atividade antiviral de extratos
de plantas sobre este tipo celular e também utilizaram como parâmetro a ausência
de efeito citopático como determinante desta atividade.
Parida et al. (2002) analisaram a atividade antiviral de Azadirachta indica Juss
sobre a replicação do DENV sorotipo 2 em células C6/36 e também observaram um
efeito dose dependente. Sua CMNT foi de 1,897 mg/mL e 117µg/mL inibiu apenas
30% do ECP em concentrações de 1000 a 10000 TCID50. Enquanto isto, os
extratos da família Combretaceae a 75 µg/mL mostraram um potencial de inibição do
DENV-3 de 95 a 100% em uma concentração do vírus de 10000 TCID50. Assim,
uma menor concentração do extrato capaz de inibir, em uma maior porcentagem,
uma mesma concentração do vírus indica um maior potencial antiviral dos três
extratos da família Combretaceae em relação à Azadirachta indica Juss.
Muliawan et al (2006) avaliaram o potencial inibitório do extrato bruto de
Quercus lusitanica sobre a replicação do DENV sorotipo 2 em células C6/36 e
também obteveram uma atividade antiviral dose dependente. Sua CMNT foi de 250
µg/mL e a dose de 32 µg/mL inibiu 100% uma concentração do vírus de apenas 10
TCID50, diminuindo sua porcentagem de inibição a medida que aumentava a
concentração do vírus. A concentração de 75 µg/mL (Figuras 06 e 07) dos extratos
de C. leprosum, T. fagifolia e T. brasiliensis inibiram uma concentração de vírus de
aproximadamente 1000 vezes maior. Assim, os referidos extratos brutos da família
Combretacteae apresentam a maior atividade contra DENV sobre células C6/36.
67
Já foram descritos vários componentes com ampla atividade antiviral
derivados dos extratos de plantas da família Combretaceae. Aos triterpenos,
saponinas e taninos isolados de T. seriace foram atribuídas atividades
antibacteriana, antiinflamatória e inibitória sobre a enzima transcriptase reversa de
HIV-1. (ELDEEN, 2006). Extratos de C. hartmannianum inibiram totalmente a
referida enzima na concentração de 66 µg/mL, sendo os taninos responsáveis pelo
efeito. O tanino punicalagin também apresentou atividade específica contra HIV-1
em uma concnetração de 16 µg/mL (ASRES; BUCAR, 2005). A referida classe de
substâncias contribuiu para a atividade anti-HIV-1 do extrato aquoso das folhas de T.
triflora sobre as enzimas polimerase e ribonuclease nas concentrações de 1,6 µg/mL
e 1,8 µg/mL, respectivamente (MARTINO et al., 2002). Este mesmo grupo isolou os
taninos punicalin e 2-O-galloylpunicalin do referido extrato e obteve atividade
inibitória sobre transcriptase reversa HIV-1 de forma dose dependente em
concentrações a partir de 0,11 µg/mL e 0,10 µg/mL, respectivamente (MARTINO et
al. 2004). Um novo tanino derivado do ácido elágico isolado de C. yunnanensis inibiu
HIV-1 protease em uma concentração de 11 µg/mL (ASSAMI et al., 2003) . Os
taninos presentes em T. chebula inibiram a integrase de HIV-1 (AHN et al., 2002).
Um derivado do ácido elágico inibiu a protease HIV-1. Um tanino hidrolisado isolado
de T. arjuna, o casuarinin a 25 µM reduziu em mais de 100.000 vezes o título viral de
HHV-1 (CHENG; LIN, C.; LIN, T., 2002). O extrato acetona das folhas de C.
paniculatum exiviu elevada atividade antiviral contra HIV-2 a 3 µg/mL (ASRES et al.
2001).
Araújo e Chaves (2005) realizaram a primeira análise fitoquímica de T.
brasilensis e identificaram 12 triterpenóides, um esteróide e um tocoferol, além de
flavonóides e taninos. Foi constatado também que o perfil cromatográfico das folhas
é semelhante ao da casca do caule de T. brasiliensis utilizado em nosso estudo.
Ayres (2008) isolou da fase hidroalcóolica de T. fagifolia os componentes catequina
(tanino), sitosterol, tocoferóis, flavonóides e de C. leprosum isolou epicatequina
(tanino), lupeol, estimosterol e sitosterol. Destas substâncias destacam-se as
catequinas e epicatequinas pela sua atividade antioxidante.
Nakao, Takio e Ono (1998) em suas pesquisas bibliográficas definiram as
catequinas como unidades estruturais básicas dos taninos condensados presentes
68
em uma grande variedade de vegetais, ervas e chás, que apresentam atividades
antibacteriana, antiviral e anticâncer. Com base nisto observou em seus
experimentos que as catequinas e epicatequinas apresentam elevada atividade
antioxidante, mas em concentrações acima de 200 µg/mL provocavam toxicidade.
Dados semelhantes ao obtido neste trabalho, visto que, nas concentrações acima de
100 µg/mL (figura 3) os extratos brutos foram tóxicos para as células e
demonstrando, assim, um efeito depende da dose aplicada.
A atividade antiviral também pode estar relacionada com a capacidade de
alguns componentes dos extratos estudados em inibir a apoptose iniciada pelas
proteínas E e NS3 do DENV (TEODORO; BRANTON, 1997; SANTOS et al. 2000).
Assim, este processo lento de auto-destruição, poderia não ser acionado em
infecções pelo DENV, fato que dificultaria a replicação e liberação do vírus e,
consequentemente, progressão da doença.
O ácido chebulico e corilagin os principais antioxidante isolados de T.
catappa, além de taninos e triterpenos relatados em outras pesquisas, protegeram o
fígado da lesão provocada por galactosamine e lipopolissacarideos através da
supressão da geração de espécies reativas de oxigênio, seguida pela inibição da
apoptose representada pela inibição da fragmentação do DNA (KINOSHITA et al.,
2007). Adnyana et al. (2000) afirmam que triterpenos e catequinas de C.
quadrangulare contribuíram para atividade hepatoprotetora. Assim, sugerimos que a
atividade antiviral das catequinas e epicatequinas isoladas, respectivamente, de T.
fagifolia e C. leprosum tem relação direta com sua atividade antioxidante,
dificultando a fragmentação do DNA e, consequentemente, a morte celular induzida
pelo DENV-3.
Jassim e Naji (2003) propõem alvos relacionados a atividade antiviral sobre a
partícula viral destas substâncias identificadas. Os tripterpenos e saponinas se ligam
à membrana plasmática, enquanto os flavonódes bloqueiam a síntese do RNA e os
taninos inibem a replicação do RNA viral. Como, em geral, os extratos apresentam
componentes semelhantes como triterpenos, esteróides, taninos e flavonóides
(ARAÚJO, 2005; AYRES, 2008), podemos considerar que a atividade observada em
cada extrato resulta da ação conjunta dos constituintes identificados, fato que
69
explica a menor atividade de T. brasiliensis assim como a maior atividade de C.
leprosum, esta também relacionada com a epicatequina, enquanto que, a atividade
de T. fagifolia com a catequina.
Cheng, Lin, C. e Lin, T. (2002) investigaram a atividade antiviral do casuairin,
um tanino isolado da casca de T. arjuna Linn., contra HHV-2 e constatou que esta
substância inibe principalmente o ataque e penetração do vírus na célula, mas
também pode interferir em eventos tardios da infecção. Nossos experimentos
apontam para uma atividade antiviral dos extratos brutos contra o mecanismo de
replicação e/ou exocitose, principalmente, visto que o extrato foi adicionado após a
adsorção viral, no entanto, também podem interferir no ataque e penetração do
vírus. Parida et al (2002) também acreditam que o extrato bruto de Azadirachta
indica pode interferir em mais de uma etapa do ciclo viral.
Muliawan et al. (2003) foram mais específicos ao relacionar a menor
expressão de NS1, uma glicoproteína considerada essencial para a replicação viral,
com a maior inibição do ECP e, consequentemente, maior atividade antiviral do
extrato bruto de Quercus lusitanica contra DENV em células C6/36. Avaliando os
achados dos autores Li et al. (2008) e Murray, Jones e Rice (2008) nos quais todas
as proteínas estão envolvidas na replicação e montagem do vírus, consideramos as
proteínas estruturais e não estruturais como alvos potenciais dos componentes
presentes nos extratos etanólicos das plantas.
Jassim e Naji (2003) apóiam o fato que as pesquisas que almejam o
desenvolvimento de antivirais devem ter início com a determinação da atividade dos
extratos brutos para em seguida testar os componentes químicos isolados. Desta
forma há necessidade de isolar alguns componentes dos extratos de C. leprosum, T.
brasiliensis e T. falgifolia como os taninos, flavonóides, triterpenos, os possíveis
responsáveis pela atividade antiviral em células previamente infectadas, além das
catequinas e epicatequinas já isoladas de C. leprosum e T. fagifolia. Deve-se
também identificar quimicamente estes compostos e modificá-los (substituindo ou
adicionado átomos) para aumentar sua ação sobre seu alvo e diminuir o
desenvolvimento de resistência (LI et al. 2008).
70
Assim, os extratos derivados de C. leprosum, T. brasiliensis e T. fagifolia
promovem morte das células C6/36 de maneira dose dependente através,
inicialmente, do processo apoptótico identificado pela fragmentação do DNA em
concentrações maiores do que 100 µg/mL e com a persistência das células em um
meio com concentrações tóxicas este processo evolui para a necrose. Isso é
caracterizado morfologicamente pelo aumento do volume celular, do núcleo e do
nucléolo, presença de vacúolos citoplasmáticos e lise da membrana celular. E a
maior atividade antiviral de C. leprosum e T. fagifolia em relação a T. brasiliensis
resulta da ação conjunta de taninos, triterpenos, flavonóides presentes no extrato
etanólico, mas, provavelmente, da atividade dos componentes já isolados
epicatequina e catequina.
71
CONCLUSÕES
_____________________________________
72
7 – CONCLUSÕES
• Os extratos etanólicos de C. leprosum, T. brasiliensis e T. falgifolia são
tóxicos às células C6/36 em concentrações elevadas (acima de 100 µg/ml).
• Os extratos etanólicos de C. leprosum, T. brasiliensis e T. falgifolia
apresentam atividade antiviral contra a replicação de DENV-3 em células
C6/36.
73
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
_____________________________________
74
9 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADNYANA, K.; TEZUKA, Y.; BANSKOTA, A.; XIONG, Q.; TRAN, K.; KADOTA, S.
Quadranosides I-IV, New triterpene glucosides from the seeds of Combretum
quadrangulare. Journal of Natural Products. v. 63, n. 4, p. 496-500, 2000.
AHN, M.J.; KIM, C. Y.; LEE, J. S.; KIM, T. G.; KIM, S. H.; LEE, C. K.; LEE, B. B.;
SHIN, C. G.; HUH, H.; KIM, J. Inhibition of HIV-1 integrase by galloyl glucoses from
Terminalia chebula and flavonol glycoside gallates from Euphorbia pekinensis.
Planta Medica. v. 68, n. 5, p. 457-459, 2002.
ALBUQUERQUE, U. P. Re-examining hypotheses concerning the use and
knowledge of medicinal plants: a study in the Caatinga vegetation of NE Brazil.
Jounal of Ethnobiology and Ethnomedicine. v.2, n. 30, 2006.
ALBUQUERQUE, U. P.; MEDEIROS, P. M.; ALMEIDA, A. L. S.; MONTEIRO, J. M.;
NETO, E. M. F. L.; MELO, J. G.; SANTOS, J. P. Medicinal plants of the caatinga
(semi-arid) vegetation of NE Brazil: A quantitative approach. Journal of
Ethnopharmacology. v. 114, p. 325 -354, 2007.
ALI, H.; KÖNIG, G. M.; KHALID, S. A.; WRIGHT, A. D.; KAMINSKY, R. Evaluation of
selected Sudanese medicinal plantas for their in vitro activity against hemoflagellates,
selected bacteria, HIV-1-RT and tyrosine kinase inhibitory and for cytotoxicity.
Journal of Ethnopharmacology. v. 83, p. 219-228, 2002.
AMBERG, S.; RICE, C. M. Mutagenesis of the NS2B-NS3- mediated cleavage site in
the flavvirus capsid protein demonstrates a requirement for coordinated processing.
Journal of Virology, v. 73, n. 10, p. 8083-8094, 1999.
AÑEZ, G. Molecular evolution of dengue virus: a necessary field of research.
Investigación Clínica. v.48, p. 273-276, 2007.
ARAÚJO, D. S. Estudo químico e avaliação farmacológica da espécie Terminalia
brasiliensis CAMB. (Combretaceae). 2005, 110 f. Dissertação (Mestrado em
Química) – Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal do
Piauí, Teresina, 2005.
ARAÚJO, D. S.; CHAVES, M. H. Treiterpenóides pentacíclicos das folhas de
Terminalia brasiliensis. Química Nova, v. 28, n. 6, p.996-999, 2005.
ASRES, K.; BUCAR, F.; KARTNIG, T.; WITVROUW, M.; PANNECOUQUE, C.; DE
CLERCQ, E. Antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)
and type 2 (HIV-2) of ethnobotanically selected Ethiopian medicinal plants.
Phytotherapy Research. v.15, n.1, p. 62-69, 2001.
75
ASRES, K.; BUCAR, F. Anti-HIV activity against immunodeficiency virus type 1 (HIV-
I) and type II (HIV-II) of compounds isolated from the stem bark of Combretum molle.
Ethiopian Medical Journal. v. 43, n.1, p.15-20, 2005.
ASSAMI, Y.; OGURA, T.; OTAKE, N.; NISHIMURA, T.; XINSHENG, Y.; SAKURAI,
T.i; NAGASAWA, H.; SAKUDA, S.; TATSUTA; K. Isolation and synthesis of a New
Bioactive Ellagic acid derivate from Combretum yunnanensis. Journal of Natural
Products. v.66, n. 5, p. 729-731, 2003.
AYRES, M. C. C. Isolamento e monitoramento de substâncias antioxidantes de
Terminalia fagifolia e Combretum leprosum (Combretaceae). 2008. 150f.
Dissertação (Mestrado em Química) – Programa de Pós-graduação em Química,
Universidade Federal do Piauí, Teresina. 2008.
BARTH, O. M.; SCHATZMAYR, H. Brazilian dengue virus type 1 replication in
mosquito cell cultures. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. v.87, n.1, p. 1-7,
1992.
BESSONG, P. O.; OBI, C. L.; ANDRÉOLA, M.; ROJAS, L. B.; POUYÉGU, L.;
IGUMBOR, E.; MEYER, J.J. M.; QUIDEAU, S.; LITVAK, S.. Evaluation of selected
south african medicinal plants for inhibitory proprieties against human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and integrase. Journal of
Ethnopharmacology. v.99, p. 83-91, 2005.
BHATTACHARYA, D.; ANSARI, I. H.; STRINKER, R. The flaviviral methyltransferase
is a substrate of casein kinase 1. Virus research, v. 141, p. 101-104, 2009.
BORTNER, C.; CIDLOWSKI, J. A necessary role for cell shrinkage in apoptosis.
Biochemical Pharmacology, v.56, pp. 1549-1559, 1998.
BORTNER, C., OLDENBURG, N.; CIDLOWSKI, J. A. The role of DNA fragmentation
in apoptosis. Trends in cell biology. v.5, p. 21-25, jan. 1995.
CASTRO, J. A. F; ANDRADE, H. M.; MONTE, S. J. H.; SILVA, A. S.; GOMES, K. C.
B. L.; AMARAL, L. F. B. A.; CIPRIANO; F. O.; REGO, J. V.; ARAÚJO, M. A. M.;
FAUSTINO, S. K. M.; NOGUEIRA, R. M. R.; SCHATZMAYR, H. G.;
MIAGOSTOVICH, M. P. Dengue viruses activity in Piauí, Brazil. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz. v. 98, n.8, p. 1021-1023, 2003.
CHAMBERS, J. T.; HAHN, C. S.; GALLER, R.; RICE, C. M. Flavivirus genome
organization, expression, and replication. Annual Reviews Microbiology v. 44,
p.649-688, 1990.
CHEN, L.; HUANG, W.; LEE, L.; WANG, C. Ellagitannins from Terminalia
calamansanai induced apoptosis in Hl-60 cells. Toxicology in vitro. v.23, nº 4, p.
603-609, 2009.
76
CHEN, P.; LI, J. Chemopreventive effect of punicalagin, a novel tannin component
isolated from Terminalia catappa, on H-ras-transformed NIH3T3 cells. Toxicology
Letters. v. 163, p. 44-53, 2006.
CHENG, H.; LIN, C.; LIN, T. Antiherpes simples virus type 2 activity of casuarinin
from the bark of Terminalia arjuna Linn. Antiviral Research, v.55, n.3, p.447-455,
2002.
CIRLA, A.; MANN, J. Combretastatins: from natural products to drug discovery.
Natural Product Reports. v. 20, 558-564, 2003.
CLERQ, E. Antivirals and antiviral strategies. Nature reviews microbiology. v.2, p.
704-720, 2004.
CLYDE, K.; KYLE, J. L.; HARRIS, E. Recent advances in deciphering viral and host
determinants of dengue virus replication and pathogenesis. Journal of virology, v.
80, n. 23, p. 11418-11431, 2006.
COLOGNA R., ARMSTRONG P. M.; RICO-HESSE R. Selection for virulent dengue
viruses occurs in humans and mosquitoes. Journal of virology, v.79, p. 853-859,
2005.
CÔRREA, Pio. Dicionário das plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Imprensa
nacional,1974.
CRABTREE, M.B.; KINNEY, R.M.; MILLER, B.R. Deglycosylation of the NS1 protein
of dengue 2 virus, strain 16681: Construction and characterization of mutant viruses.
Archives of Virology, v.150, p.771-786, 2005.
CRANCE, J. M.; SCARAMOZZINO, N.; JOUAN, A.; GARIN, D. Interferon, ribavirin,
6-azauridine and glycyrrhizin : antiviral compounds active against pathogenic
flaviviruses. Antiviral Research. v.78, p.73-79, 2003.
CRUCHUGA, C.; ANSO, E.; FONT, M.; MARTINO, V. S.; ROUZAUT, A.;
MARTINEZ-IRUJO, Juan J. A new strategy to inibit the excision reaction catalysed by
HIV-1 reverse transcriptase: compounds that compete with the template-primer.
Biochemical Jounal. v. 405, p. 165-171, 2007.
DE LA C. SIERRA. B.; GARCÍA, G.; PÉREZ, A. B.; MORIER, L.; ALVAREZ, M.;
KOURÍ, G.; GUZMÁN, M. G. Ethnicity and difference in dengue virus-specific
memory T cell responses in Cuban individuals. Viral Immunology. v.19, p. 662-668,
2006.
DE LA C. SIERRA. B.; KOURÍ, G.; GUZMÁN, M. G. Race: a risk factor for dengue
hemorrhagic fever. Archive Virology. v.152, p. 533-542, 2007.
77
DIAMOND, M.; ZACHARIAH, M.; HARRIS, E. Mycophenolic acid inhibits Dengue
Virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology, v. 304, p. 211-221,
2002.
ELDEEN, I.; ELGORASHI, E. E.; MULHOLLAND, D. A.; STANDEN, Johannes, Van
Staden. Anolignan B: bioactive compound from the roots of Terminalia sericea.
Journal of Ethnopharmacology, v.103, p. 135-138, 2006.
ERBEL, P.; SCHIERING, N.; D’ARCY, A.; RENATUS, M.; KROEMER, M.; LIM, I.; YI,
Z.; KELLER, T.; VASUDEVAN, S., HOMMEL, U. Strucural basis for the activation of
flaviviral NS3 proteases from dengue and West Nile virus. Nature structural e
molecular biology. v.13, n.4, p. 372-373, 2006.
FARRAR, J.; FOCKS, D.; GUBLER, D.; BARRERA, R.; GUZMAN, M. G.; SIMMONS,
C.; KALAYANAROOJ, S.; LUM, L.; MCCALL, P.J.; LLOYD, L.; HORSTICK, O.;
DRANGER-DAYAL, R.; NATHAN, M. B.; KROEGER, A. Towards a global dengue
research agenda. Tropical medicine and international health. v. 12, n. 6, p. 695-
699, 2007.
FERREA, G.; CANESSA, A.; SAMPIETRO, F.; CRUCIANI, M.; ROMUSSI, G.
BASSETTI, D. In vitro activity of a Combretum micrathum extract against herpes
simplex virus types 1 and 2. Antiviral research. v. 21, n.4, p.317-325, 1993.
FESSENDEN, R. J. Organic chemistry. Boston: Willard Grant Pres, 1982.
FIELDS, B. N.; KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M.; CHANOCK, R. M.; MONATH, T. P.;
MELNICK, J. L.; ROIZMAN, B.; STRAUS, S. E. Fields Virology, 4 ed., Philadelphia:
Lippincott Williams e Wilkins, 2001.
FIGUEIREDO, L. T. M. Viral hemorrhagic fevers in Brazil. Revista da sociedade
brasileira de medicina tropical. v. 39, n.2, p. 203-210, 2006.
FORATTINI, O. P., BRITO, M. Household water reservoirs and control of Aedes
aegypti. Revista de saúde pública. v.37, n.5, p. 676-677, 2003.
FRANCO-PAREDES C.; JONES D.; RODRIGUEZ-MORALES A. J.; SANTOS-
PRECIADO J. I. Commentary: improving the health of neglected populations in Latin
America. BMC Public Health. v.7, p. 11, 2007.
FYHRQUIST, P.; MWASUMBI, L.; HAEGGSTRÖM, C. A.; VUORELA, H.;
HILTUNEN, R.; VUORELA, P. Ethnobotanical and antimicrobial investigation on
some species of Terminalia and Combretum (Combretaceae) growing in Tanzania.
Journal of Ethnopharmacology. v. 79, p. 169-177, 2002.
FYHRQUIST, P.; MWASUMBI, L.; VUORELA, P.; VUORELA, H.; HILTUNEN, R. ;
MURPHY, C.; ADLERCREUTZ, H. Preliminary antiproliferative effects of some
species of Terminalia, Combretum and Pteleopsis collected in Tanzania on some
human cancer cell lines. Fitoterapia. v.77, p. 358-366, 2006.
78
GAZZANEO, L. R. S. Knowledge and use of medicinal plants by local specialists in
an region of Atlantic Forest in the state of Pernambuco (Northeastern Brazil).
Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine. v.1, n.9, p.1-8, 2005.
GHOSH, D.; BASU, A. Present perspectives on flaviviral chemotherapy. Drug
Discovery Today, v. 13, n. 13-14, 2008.
GHOSH, J.; DAS, J.; MANNA, P.; SIL, P. Cytoprotective effect of arjunolic acid in
response to sodium fluoride mediated oxidative stress and cell death via necrotic
pathway. Toxicology in Vitro. v. 22, p. 1918-1926, 2008.
GOLA, G.; NEGRI, G.; CAPPELLETTI, C. Tratado de Botánica. 2 ed. Rio de
Janeiro: Labor, 1965.
GOMES, A. C.; SOUZA, J. M. P.; BERGAMASCHI, D. P.; SANTOS, J. L. F.;
ANDRADE, V. R.; LEITE, O. F.; RANGEl, O.; SOUZA, S. S. L.; GUIMARÃES, N. S.
N.; LIMA, V. L. C. Atividade antropofílica de Aedes aegypti e Aedes alopictus em
área sob controle e vigilância. Revista de Saúde Pública, v. 39, n. 2, p. 206-210,
2005.
GÓMEZ-ANGELATS, M.; BORTNER, C. D.; CIDLOWSKI, J. A. Cell volume
regulation in immune cell apoptosis. Cell Tissue Research. v. 301, p.33-42, 2000.
GREEN, S.; ROTHMAN, A. Immunopathological mechanisms in dengue and dengue
hemorrhagic fever. Current Opinion Infectious Diseases. v.19, p. 429-436, 2006.
HALL, J.; SCRIRAM, M.; STRECKER, T. E.; TIDMORE, J. K.; JELINEK, C. J.;
KUMAR, G. D.; HADIMANI, M. B.; PETTIT, G. R.; CHAPLIN, D. J.; TRAWICK, M. L.;
PINNEY, K. G. Desing, synthesis, biochemical, and biological evaluation of nitrogen-
containing trifluoro structural modifications of combretastatin A-4. Bioorganic e
medicinal chemistry letters, v. 18, p. 5146-5149, 2008.
HALSTEAD, S. B. Pathogenesis of Dengue: Challenges to Molecular Biology.
Science, v. 239, p. 476 – 480, 1988.
HALSTEAD, S. D. Dengue. Seminar. v.370, p. 1644-1652, 2007.
HENCHAL E. A.; PUTNAK J. R. The dengue viruses. Clinical Microbiology
Reviews. v.3, p. 376-396, 1990.
HIGUCHI, Y. Archidonic acid converts the glutathione depletion-induced apoptosis to
necrosis by promoting lipid peroxidation in glioma cells. Archive Biochemistry
Biophysics. v. 400, p. 133-140, 2002.
HIGUCHI, Y. Chromosomal DNA fragmentation in apoptosis and necrosis induced by
oxidative stress. Biochemical Pharmacology. v.66, p. 1527-1535, 2003.
79
IYER, S; CHAPLIN, D. J.; ROSENTHAL, D. S. ; BOULARES, H. ; LI, L.; SMULSON,
M. E. Induction of apoptosis in proliferating human endothelial cells by the tumor-
specific antiangiogenesis agent combretastatin A-4. Cancer Research, v. 58, n.15,
p. 4510-4514, 1998.
JASSIM, S. A. A.; NAJI, M. A. Novel antiviral agents: a medicinal plant perspective.
Journal of Applied Microbiology, v. 95, p.412-427, 2003.
JOLY, A. B. Botânica, introdução à taxonomia vegetal. 11 ed. Companhia editora
nacional. 1993.
KALAYANAROOJ S., VAUGHN, D. W.; NIMMANNITYA, S.; GREEN, S.;
SUNTAYAKORN, S.; KUNENTRASAI, N.; VIRAMITRACHAI, W.; RATANACHU-
EKE, S.; KIATPOLPOJ, S.; INNIS, B. L.; ROTHMAN, A. L.; NISALAK, A.; ENNIS, F.
A. Early clinical and laboratory indicators of acute dengue illness. Journal of
Infectious Diseases. v.176, p. 313-321, 1997.
KINOSHITA, S.; INOUE, Y.; NAKAMA, S.; ICHIBA, T.; ANIYA, Y. Antioxidant and
hepatoprotective actions of medicinal herb, Terminalia catappa L. from Okinawa
Island and its tannin corilagin. Phytomedicine. v. 14, p. 755-762, 2007.
KO, W. G.; KANG, T. H.; KIM, N. Y.; LEE, S.J.; KIM, Y. C.; KO, G. I.; RYU, S. Y.;
LEE, B. H. Flavandulyflavonoids: a new class of in vitro apoptogenic agents from
Sophora flavescens. Toxicology in vitro. v. 14, p. 429-433, 2000.
KUMARASAMY, V.; WAHAB, Abdul; CHUA, S. K.; HASSAN, Z.; CHEM, Y. K.;
MOHAMAD, M. CHUA, K. B. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-
capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue virus infection. Journal of
Virological Methods. v.140, p.75-79, 2007.
KURANE, I. Dengue hemorrhagic fever with special emphasis on
immunopathogenesis. Comparative Immunology microbiology e infectious diseases.
v. 30, p 329-340, 2007.
LAMIEN, C.; MEDA, A., MANS, J.; ROMIRO, M.; NACUOLMA, O. G.; VILJOEN, G.
J. Ihnibition of fowlpox virus by an aqueous acetone extracts from galls Guiera
senegalensis J. F. Gmel (Combretaceae). Journal of Ethopharmacology, v.96,
p.249-253, 2005.
LEE, E.; PAVY, M.; YOUNG, N.; FREEMAN, C.; LOBIGS, M. Antiviral effect of the
heparin sulfate mimetic, PI-88, against dengue and encephalitic flaviviruses.
Antiviral Research. v.69, p.31-38, 2006.
LENNETT, E. H., SCHMIDT, N. J. Diagnostic procedures for viral, rickettsial and
chlamydial infections. 5.ed. Washington: Interdisciplinary Books & Periodicals,1979.
LESCAR, J.; LUO, D.; XU, T.; SAMPATH, A.; LIM, S. P.; CANARD, B.;
VASUDEVAN, S. Towards the design of antiviral inhibitors against flaviviruses: the
case for the multifunctional NS3 protein from Dengue virus as a target. Antiviral
Research. v. 80, p. 94-101, 2008.
80
LI, Z.; KHALIQ, M.; ZHOU, Z.; POST, C. B.; KUHN, R. J.; CUSHMAN, M. Design,
synthesis, and biological evaluation of antiviral agents targeting flavivirus envelope
proteins. Journal of Medicinal Chemistry. v. 51, n.15, p. 4660-4671, 2008.
LOBIGS, M. Proteolytic processing of a Murray Valley encephalitis virus non-
structural polyprotein segment containing the viral proteinase: accumulation of a
NS3-NS4A precursor which requires mature NS3 for efficient processing. Journal of
General Virology, v. 73, p. 2305-2312, 1992.
LOPES, L. S.
;
PEREIRA. S.S.; MARQUES, R. B.; AYRES, M. C. C.; CHAVES M.
H.; ALMEIDA, F.R.C. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA FRAÇÃO
HIDROALCOÓLICA DE Combretum leprosum Mart. (Combretaceae). In: 41º
CONGRESSO BRASILEIRO DE FARMACOLOGIA E TERAPÊUTICA
EXPERIMENTAL, 2009, Ribeirão Preto, São Paulo.
LOPES, L. S.
;
PEREIRA. S.S.; MARQUES, R. B.; AYRES, M. C. C.; CHAVES M.
H.; ALMEIDA, F.R.C. INVESTIGAÇÃO PRELIMINAR DOS MECANISMOS
ENVOLVIDOS NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA FRAÇÃO HIDROALCOÓLICA
DO EXTRATO ETANÓLICO DE Combretum leprosum Mart. & Eicher
(Combretaceae). 40º CONGRESSO BRASILEIRO DE FARMACOLOGIA E
TERAPÊUTICA EXPERIMENTAL, 2008, Águas de Lindóia, São Paulo.
MAREGESI, S.M.; PIETERS, L.; NGASSAPA, O. D.; APERS, S.; VINGERHOETS,
R.; COS, P.; BERGHE, D. A.; VLIETINCK, A. J. Screening of some Tanzanian
medicinal plants from Bunda district for antibacterial, antifungal and antiviral
activities. Journal of Ethnopharmacology. v. 119, p. 58-66, 2008.
MARLANGUE, C. C. ; MARGAILL, I. ; REPRESA, A. ; POPOVICI, T. M. PLOTKINE ;
BEN-ARI, Y. Apoptosis e Necrosis after reversible focal Ischemia: An in situ DNA
fragmentation Analysis. Journal of Cerebral blood flow e metabolism. v. 16,
p.186-195, 1996.
MARTINO, V.S.; LÓPEZ, P.; MARTINEZ, I.; SANROMÁN, M.; CUEVES, M. T.;
SANTIAGO, E.; LASARTE, J. J.; FONT, M.; COUSSIO, J. D.; MONGE, A. Inhibitory
effect against polymerase and ribonuclease activities of HIV-reverse transcriptase of
the aqueous leaf extract of Terminalia triflora. Phytotherapy Research. v.16, n. 8, p.
778-780, 2002.
MARTINO, V.; MORALES, J.; MARTINEZ-IRUJO, J. J.; FONT, M.; MONGE, A.;
COUSSUO, J. Two ellagitannins from the leaves of Terminalia triflora with inhibitory
activity on HIV-1 reverse transcriptase. Phytotherapy Research. v.18, n. 8, p. 667-
669, 2004.
MAZUMDER R., HU Z. Z., VINAYAKA C. R., SAGRIPANTI J. L., FROST S. D.,
KOSAKOVSKY, P. S. L.; WU, C. H. Computational analysis and identification of
amino acid sites in dengue E proteins relevant to development of diagnostics and
vaccines. Virus Genes v.35, p. 175-186, 2007.
81
MCGAW, L. J.; RABE, T.; SPARG, S. G.; JÄGER, A. K.; ELOFF, J. N.; STANDEN, J.
Van. An investigation on the biological activity of Combretum species. Journal of
Ethnopharmacology. v. 75, p. 45-50, 2001.
MICHAELIS, M.; KLEINCSCHMIDT, M. C.; DOERR, H. W.; CINATL, J. Minocycline
inhibits West Nile virus replication and apoptosis in human neuronal cells. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy. v.60, p.981-986, 2007.
MISHRA, M. K.; BASU, A. Minocycline neuroprotects, reduces microglial activation,
inhibits caspase 3 induction, and viral replication following Japanese encephalitis.
Journal of Neurochemistry. v.105, p.1582-1595, 2008.
MONTEIRO, J. M.; ALBUQUERQUE, U. P.; ARAÚJO, E. L. Taninos: uma
abordagem da química à ecologia. Química Nova, v. 28, n. 5, p. 892-896, 2005.
MOSSMANN, T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal Immunology Methods.
V.65, p. 55-63, 1983.
MULIAWAN, S. Y.; KIT, L. S.; DEVI, S.; HASHIM, O.; YUSOF, R. Inhibitory potencial
of Quercus lusitanica extract on dengue vírus type 2 replications. Southeast Asian
Journal Tropical Medicine Plubic Health. v.37, p.132-135, 2006.
MURRAY, C.; JONES, C. T.; RICE, C. M. Architects of assembly: roles of
Flaviviridae non-structural proteins in virion morphogenesis. Nature reviews
microbiology. v. 6, p. 699-708, 2008.
NAKAO, M.; TAKIO, S.; ONO, K. Alkyl peroxyl radical-sacavenging activity of
catechins. Phytochemistry. v. 49, n. 8, p. 2379-2382, 1998.
NOISAKRAN, S.; DECHTAWEWAT, T.; AVIRUTHAN, P.; KINOSHITA, T.;
SIRIPANYAPHINYO, U.; PUTTIKHUNT, C.; KASINRERK, W.; MALASIT, P.;
SITTISOMBUT, N. Association of dengue virus NS1 protein with lipid rafts. Journal
of General Virology, v.89, p. 2492-2500, 2008.
NUNES, P.H. CAVALCANTI, P. M. S.; GALVÃO, S. M. P.; MARTINS, M. C. C.
Antiulcerogenic activity of Combretum leprosum. Pharmazie. v.64, n.1, p.58-62,
2009.
OISHI, K.; SAITO, M.; MAPUA, C. A.; NATIVIDAD, F. F. Dengue illness: clinical
features and pathogenesis. Journal of Infection Chemotherapy, v.13, p.125-133,
2007.
OJEWOLE, J. A. Cardiovascular effects of mollic acid glucoside, a 1α-
hydroxycycloartenoid saponin extractive from Combretum molle RBrG Don
(Combretaceae) leaf. Cardiovascular journal of Africa, v. 19, n. 3, 2008.
82
O’KENNEDY, R.; THORNES, R. D. Coumarins: biology, applications and mode of
action. New York: John Willey, 1997.
OLIVEIRA, P. S.; MARQUES, R. J. The Cerrados of Brazil: Ecology and Natural
History of a Neotropical Savanna. New York City: Columbia University, 2002.
PARIDA, M. M.; UPADHYAY, C.; PANDYA, G.; JANA, A. M. Inhibitory potencial of
neem (Azadirachta indica Juss) leaves on Dengue virus type-2 replication. Journal
of Ethnopharmacology, v. 79, p. 273-278, 2002.
PARKER, B. W. Metabolism and antiviral activity of ribavarin. Virus Research.
v.107, p.165-171, 2005.
PETTIT, G. R.; HOARD, M.; DOUBECK, D.; SCHMIDT, J.; PETTIT, R.; TACKETT,
L.; CHAPUIS, J. Antineoplastic agents 338. The cancer dell growth inhibitory
constituents of Terminalia arjuna (Combretaceae). Journal of Ethnopharmacology.
v. 53, p. 57-63, 1996.
PIETROVSKI, F. E.; ROSA, K. A.; FACUNDO, V. A.; RIOS, K.; MARQUES, M. C. A.;
SANTOS, A. R. S. Antinociceptive properties of the ethanolic extract and of the
triterpene 3β,6β,16β-trihidroxilup-20(29)-ene obtained from the flowers of
Combretum leprosum in mice. Pharmacology Biochemistry and Behavior. v.83,
p.90-99, 2006.
PREUGSCHAT, F.; YAO, C.; STRAUSS, J. H. In vitro processing of Dengue Vírus
type 2 Nonstructural Proteins NS2A, NS2B, and NS3. Journal of Virology, v. 64,
n.9, p. 4364-4374, 1990.
QI, R.; ZHANG, L.; CHI, C. Biological characteristics of dengue virus and potencial
targets for drug design. Acta Biochimica et biophysica sinica, v. 40, p. 91-101,
2008.
QU, L.; MCMULLAN, L. K.; RICE, C. M. Isolation and Characterization of
noncytopathic pestivirus mutants reveals a role for nonstrucutral protein NS4B in viral
cytopathogenicity. Journal of Virology, v. 75, n. 22, p. 10651-10662, 2001.
RAMANATHAN, M.; CHAMBERS, J. A.; PANKHONG, P.; CHATTERGOON, M.;
ATTATIPPAHOLHUN, W.; DANG, K.; SHAH, N.; WEINER, D. B. Host cell killing by
the West Nile virus NS2B-NS3 proteolytic complex: NS3 alone is sufficient to recruit
caspase-8-based apoptotic pathway. Virology, v. 345, p. 56-72, 2006.
RATTER, J. A.; RIBEIRO, J. F.; BRIDGEWATER, S. The Brazilian Cerrado
vegetation and Threats to its Biodiversity. Annals of Botany, v. 80, pp. 223-230,
1997.
RAY, D.; SHAH, A.; TILGNER, M.; GUO, Y.; DOG, H.; DEAS; T. S.; ZHOU, Y.; LI, H.;
SHI, P. West Nile Virus 5’-cap structure is formed by sequential guanine N-7 and
83
ribose 2’-OH methylations by nonstructural protein 5. Journal of Virology. v. 80,
n.17, p. 8362-8370, 2006.
RIBEIRO, P. C.; SOUSA, D. C.; ARAÙJO, T. M. E. Clinical-epidemiologic profile of
Dengue suspicious cases in a distinct in the south zone of Teresina, Pi, Brazil.
Revista Brasileira de Enfermagem, v.61, n.2, p.227-232, 2007.
RICO-HESSE R. Microevolution and virulence of dengue viruses. Advances in
Virus Research. v. 59, p; 315-341. 2003
RIGAU-PEREZ J. G., CLARK G. G., GUBLER D. J., REITER P., SANDERS E. J.;
VORNDAM A. V. Dengue and dengue haemorrhagic fever. Lancet v.352, p. 971-
977, 1998.
RUSNAK, J.; BYRNE, W. R.; CHUNG, K. N.; GIBBS, P. H.; KIM, T. T.; BOUDREAU,
E. F.;COSGRIFF, T.; PITTMAN, P.; KIM, K. Y.; ERLICHMAN, M. S.; REZVANI, D. F.;
HUGGINS, J. W. Experience with intravenous ribavirin in the treatment of
hemorrhagic fever with renal syndrome in Korea. Antiviral Research, v.81, p.68-76,
2009.
SAKAGAMI, H.; KURIBAYASHI, N.; IIDA, M.; SAKAGAMI, T.; TAKEDA, M.;
FUKUCHI, K; GOMI, K.; OHATA, H.; MOMOSE, K.; KAWAZOE, Y. Induction of DNA
fragmentation by tannin and lignin related substances. Anticancer Research. v. 15,
p. 2121-2128, 1995.
SALEEM, A.; HUSHEEM, M.; HÄRKÖNEN, P.; PIHLAJA, K. Inhibition of cancer cell
growth by crude extract and the phenolics of Terminalia chebula retz. fruit. Journal
of Ethnopharmacology. v. 81, p. 327-336, 2002.
SAMPATH, A.; PADMANABHAN, R. Molecular targets for flavivirus drug discovery.
Antiviral Research, v. 81, p. 6-15, 2009.
SANTOS, C. N. D.; FRENKIEL; M.; COURAGEOT, M.; ROCHA, C. F.; VAZIELLE-
FALCOZ, M.; WIEN, M; REY, F.; DEUBEL, V.; DESPREST, P. Determinants in the
Envelope E protein and viral RNA helicase NS3 that influence the induction of
apoptosis in response to infection with Dengue type 1 virus. Virology. v. 274, p. 292-
308, 2000.
SCALBERT, A. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry. v. 30, n. 12, p.
3875-3883, 1991.
SCHMIDT, B.; RIBNICKY, D.; POULEV, A.; LOGENDRA, S.; CEFALU, W.; RASKIN,
I. A natural history of botanical therapeutics. Metabolism Clinical and
experimental. v.57, 2008.
SCHWARTZ, L. M.; SMITH, S. W.; JONES, M. E. E.; OSBORNE, B. A. Do all
programmed cell deaths occur via apoptosis? Cell Biology. v. 90, p. 980-984, 1993.
84
SEFURO, J. C.; NOBRE, V.; RAYES, A.; MARCIAL, T. M.; LAMBERTUCCI, J. R.
Dengue: uma nova abordagem. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical, v. 33, p. 465-476, 2000.
SELIGMAN, S. J. Constancy and diversity in the flavivirus fusion peptide. Virology
Journal, v. 5, p. 1-27, fev. 2008.
SERPA, L. L. N.; COSTA, K. V. R.; VOLTOLINI, J. C.; KAKITANI, I. Variação sazonal
de Aedes aegypti e Aedes albopictus no município de Potim, São Paulo. Revista de
saúde pública, v. 40, n.6, p. 1101-1105, 2006.
SILVA, V. C. SCHERER, P. O.; FALCÃO, S. S.; ALENCAR, J.; CUNHA, S. P.;
RODRIGUES, I. M.; PINHEIRO, N. L. Diversity of oviposition containers and
buildings where Aedes albopictus and Aedes aegypti. Revista de Saúde Pública. v.
40, n. 6, p. 1106-1111, 2006.
SIMPSON, B. B.; ORGONZALY, M. C. Economic Botany, 3. ed. United States,
2001.
SINGHI, S.; KISSOON, N.; BANSAL; A. Dengue e dengue hemorrágico: aspectos do
manejo na unidade de terapia intensiva. Jornal de Pediatria, v. 83, n.2, 2007.
STERN, J. L.; HAGERMAN, A. E.; STEINBERG, P. D.; MASON, P. K. Phlorotannin-
protein interactions. Journal of Chemical Ecology, v.22, p.1887-1899, 1996.
TALARICO, B. L.; DAMONTE, B. E. Interference in dengue vírus adsorption and
uncoating by carrageenans. Virology. v.363, p.473-485, 2007.
TALARICO, L. B.; PUJOL, C. A.; ZIBETTI, R. G. M.; FARÍA, P. C. S.; NOSEDA, M.
D.; DUARTE, M. E. R.; DAMONTE, E. B. The antiviral activity of sulfated
polysaccharides against dengue virus is dependent on virus serotype and host cell.
Antiviral Research. v.66, p.103-110, 2005.
TAYLOR, R. S. L.; MANANDHAR, N. P.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. N.
Antivral activities of Neplase mecicinal plants. Journal of Ethnopharmacology.
v.52, p. 157-163, 1996.
TEODORO, J. G.; BRANTON, P. E. Regulation of apoptosis by viral gene products.
Journal of Virology. v. 71, n.3, p. 1739-1746,1997.
TERRAS; F., SCHOOFS, H.; THEVISSEN, K.; OSBORN, R. W.; VANDERLEYDEN,
J.; CAMMUE, B. Synergistic Enhancement of the Antifungal Activity of Wheat and
Barley Thionins by Radish and Oilseed Rape 2S Albumins and by Barley Trypsin
Inhibitors. Plant Physiology. v. 103, n. 4, p.1311-1319, 1993.
TORSSEL, B. G. Natural product chemistry. A mechanistic and biosynthetic
approach to secondary metabolism. New York: John Willey, 1989. 401p.
85
TSHIKALANGE, T. E.; MEYER, J. J. M.; HUSSEIN, A. A. Antimicrobial activity,
toxicity and the isolation of a bioactive compound from plants used to treat sexually
transmitted diseases. Journal of Ethnopharmacology. v.96, p.515-519, 2005.
UMAREDY, I.; CHAO, Al.; SAMPATH, A.; GU, F.; VASUDEVAN, S. Dengue virus
NS4B interacts with NS3 and dissociates it from single-stranded RNA. Journal of
General Virology, v. 87, p. 2605-2614, 2006.
WANG, C.; CHEN, L.; YANG, L. Cuphiin D1, the macrocyclic hydrolysable tannin
induced apoptosis in HL-60 cell line. Cancer Letters. v. 149, p. 77-83, 2000.
WANG, C.; CHEN, L.; YANG, L. Camelliin B induced apoptosis in HeLa cell line.
Toxicology. v.168, p. 231-240, 2001.
WENGLER, G.; CZAYA, G.; FARBER, P. M.; HEGEMANN, J. H. In vitro synthesis of
West Nile vírus proteins indicates that the amino-terminal segment of the NS3 protein
contains the active centre of the protease which cleaves the viral polyprotein after
multiple basic amino acids. Journal of General Virology. v. 72,p. 851-858, 1991.
WHITBY, K.; PIERSON, T. C.; GEISS, B.; LANE, K.; ENGLE, M.; ZHOU, Y.; DOMS,
R. W.; DIAMOND, M. S. Castanospermine, a Potent Inhibitor of Dengue Virus
Infection in vitro and in vivo. Journal of Virology. v.79,n.14, p.8698-8706, 2005.
WHITEHEAD, S. S.; BLANEY, J. E.; DURBIN, A. P.; MURPHY, B. R.. Prospects for
a dengue virus vaccine. Nature Reviews Microbiology. v.5, p. 518-528, 2007.
WU, S.; LEE, C.; LIAO, C.; DWEK, R.; ZITZMANN, N.; LIN, Y. Antiviral Effects of an
Iminosugar derivate on flavivirus infections. Journal of Virology. v.76, n.8, p.3596-
3604, 2002.
YU, I.; ZHANG, W.; HOLDAWAY, H. A.; LI, L.; KOSTYUCHENKO, V.; CHIPMAN, P.;
KUHN, R.; ROSSMANN, M.; CHEN, J. Structure of the immature Dengue Vírus at
low pH primes proteolytic maturation. Science. v. 319, 2008.
ZEIDLER, J. D.; ACOSTA, P. O. A.; BARRÊTO, P. P.; CORDEIRO, J. S. Dengue
virus in Aedes aegypti larvae and infestation dynamics in Roraima, Brazil. Revista
de Saúde Pública. v. 42, n. 6, pp. 986-991, 2008.
ZHANG, Y.; LEWIS, K. Fabatins: new antimicrobial plant peptides. FEMS Microbiol
Letters. v.149, n. 1, p. 59-64, 1997
.
ZHOU, Y.; RAY, D.; ZHAO, Y.; DONG, H.; REN, S.; LI, Z.; GUO, Y.; BERNARD, K.
A.; SHI, P.; LI, H. Structure e function of flavivirus NS5 methyltransferase. Journal of
Virology, v. 81, n. 8, p. 3891-3903, 2007.
86
ANEXO
_____________________________________
87
1- Artigo submetido ao Períodico Phytomedicine
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
