Materiais e Métodos
em gel de poliacrilamida de concentração 10%. Primeiro foi feito o gel de corrida
(4,2 ml H
2
O, 2,5 ml Lower Buffer (4x), 3,3 ml 30% acrilamida / 0,8% bisacrilamida,
33 l de Persulfato de Amônio 10% (APS), 17 l TEMED). Depois de polimerizado
o gel Lower, adicionou-se o gel de empilhamento (1140 l H
2
O, 500 l Upper
Buffer (4x), 340 l 30% acrilamida / 0,8%bisacrilamida, 20 l APS 10%, 2,7 l
Temed). Neste gel foi colocado o pente para criação dos canaletes de aplicação das
amostras. Polimerizado o gel, o pente foi retirado e os poços foram lavados,
mergulhando o gel no tampão de corrida (1x) (250 mM Tris base, 1,9 M glicina, 1%
SDS). Foram separadas 30 g de proteína e o mesmo volume de tampão de amostra
redutor (2x) (120 mM Tris 4x, 4% SDS, 0,01% bromophenol blue, 2 ml glicerol e
0,1M DTT).Também foram separados 6 l de marcador de peso. As amostras e o
marcador foram deixados no banho seco a 100°C por 5 minutos. As amostras foram
aplicadas no gel e corridas a 80 V por 3 a 3,5 horas (LAEMMLI et al. 1970).
Um dos géis foi corado com Coomassie Blue para controle de massa. O gel
de poliacrilamida foi colocado em recipiente coberto pela solução de comassie blue
(50% metanol, 40% água, 10% ácido acético, 0,05% comassie blue). Depois de
corado foi descorado com a solução descorante A (37,5 ml ácido acético, 227ml
metanol, 235,5 ml água) e depois com a solução B (36,5 ml ácido acético, 25 ml
metanol, 437,5 ml água). O gel depois de descorado foi fotografado e seco por 45
minutos a 80 °C (LAEMMLI et al. 1970).
3.2.4 Transferência das Amostras
Um segundo gel foi utilizado para transferir as proteínas presentes nele para
uma membrana de PVDF (Hydrophobic polyviniylidene difluoride, Amershan ). A