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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
F
ACULDADE DE FARMÁCIA
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Análise química, avaliação da atividade antioxidante e obtenção de culturas in
vitro de espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul
ANA PAULA MACHADO BERNARDI
PORTO ALEGRE, 2007.
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2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
F
ACULDADE DE FARMÁCIA
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Análise química, avaliação da atividade antioxidante e obtenção de culturas in
vitro de espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul
Orientador: Profa. Dr. Gilsane Lino von Poser
Co-orientador: Profa. Dr. Sandra Beatriz Rech
Tese apresentada por Ana Paula
Machado Bernardi para obtenção do
TÍTULO DE DOUTOR em Ciências
Farmacêuticas
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3
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, em
nível de Doutorado, da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul e aprovada em 09/04/2007, pela Banca Examinadora constituída por:
Profa. Dr. Alexandra Latini
Universidade Federal de Santa Catarina
Prof. Dr. Arthur Germano Fett Neto
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dr. José Angelo Silveira Zuanazzi
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
B523a
Bernardi, Ana Paula Machado
Análise química, avaliação da atividade antioxidante e obtenção d
e
culturas in vitro de espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul
/
Ana Paula Machado Bernardi – Porto Alegre, UFRGS : 2007. - xxii, 342 p.
:
il., gráf., tab.
Tese (doutorado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós
-
Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Hypericum. 2. Guttiferae. 3. Atividade antioxidante. 4. Composto
fenólicos. I. Von Poser, Gilsane Lino. II. Rech, Sandra Beatriz. III. Título.
CDU: 615.322:582.824
Bibliotecárias responsáveis:
Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira, CRB 10/480
Heloísa do Canto Canabarro, CRB 10/1036
4
Descobri como é bom chegar quando se tem paciência,
e para chegar onde quer que seja,
aprendi que não é preciso dominar a força, mas a razão.
É
PRECISO, ANTES DE MAIS NADA, QUERER.
Amyr Klink
5
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelas oportunidades que cruzaram e que ainda hão de cruzar em meu
caminho.
À querida professora Dr. Gilsane Lino von Poser, pela amizade, confiança e
orientação iniciados com a iniciação científica e fortalecidos com a pós-graduação.
À querida professora Dr. Sandra Beatriz Rech, igualmente pela amizade,
orientação e dedicação no auxílio ao desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores Dr. Eduardo Lissi, pela oportunidade de desenvolvimento de
parte deste trabalho no Departamento de Ciencias Químicas da Facultad de Química y
Biología da Universidad de Santiago de Chile, e Dr. Raquel Bridi, cujos conhecimentos
dos mecanismos antioxidantes foram imprescindíveis para o entendimento dos
resultados apresentados.
Ao querido botânico Dr. Sérgio Bordignon, pela identificação do material
vegetal utilizado neste trabalho e, principalmente, pela alegria e bons momentos
compartilhados na época das coletas.
À querida amiga Natasha Maurmann, pela sempre disponível ajuda nos
experimentos de cultivo in vitro, e auxílio nas análises estatísticas.
Aos meus grandes amigos do coração Alexandre Ferraz, Carolina Nör e
Daniela Albring, pela troca de conhecimentos, amizade e terapia em grupo realizada
durante os momentos difíceis.
Às minhas amigas especiais e autênticas “gnosetes” Camila Sebben, Ana
Cristina Fonseca e Liziane da Luz, pela alegria e descontração de sempre, cuja
amizade iniciada na faculdade foi fortalecida pela iniciação científica.
7
Às queridas amigas e incansáveis ajudantes, Juliana Hass, Kênia Figueredo, e
Jéssica Nunes, pelo auxílio dedicado para a realização dos experimentos.
À grande amiga Marga, pelos cuidados dedicados desde o meu nascimento,
pela torcida ao meu sucesso e pelos ensinamentos cristãos e palavras de apoio durante
os momentos de necessidade.
Aos meus amados padrinhos, tio Neri e tia Vanda, pela torcida de minhas
conquistas e pelo orgulho sempre declarado.
À minha família chilena, Pedro, Nicole e Valentina, pelos dois meses de casa,
comida e alegria, em Santiago do Chile, durante minha estadia para a realização dos
experimentos, e pela confiança ao me permitirem fazer parte da família Molina.
Um agradecimento especial ao meu amor, Matias Molina, por acreditar que o
amor é paciente e esperar o término dessa tese para que a distância não seja mais algo
presente em nossas vidas e, principalmente, pela confiança e crédito sempre
depositado em mim.
Finalmente, agradeço à minha família. Vó e mana, que acompanharam o meu
desenvolvimento acadêmico de perto, sempre com orgulho de minhas conquistas e
vitórias e suportando as alterações de humor provocadas por momentos difíceis. Tia
Vera, pela dedicação e comidinhas gostosas sempre preparadas com muito amor. Pai e
mãe, pelo amor dedicado ao longo do meu crescimento, pela oportunidade do ensino
de qualidade, pelo incentivo ao estudo em uma universidade federal, e pelo respeito
nas minhas decisões.
8
SUMÁRIO
L
ISTA DE FIGURAS................................................................................... xiii
L
ISTA DE TABELAS.................................................................................. xvii
R
ESUMO................................................................................................. xix
A
BSTRACT.............................................................................................. xxi
1 I
NTRODUÇÃO GERAL............................................................................... 1
2 C
APÍTULO 1 – ANÁLISE FITOQUÍMICA DE HYPERICUM TERNUM A. ST. HIL. E
HYPERICUM MYRIANTHUM CHAM. & SCHLTDL............................................
7
2.1 I
NTRODUÇÃO........................................................................................... 9
2.2 O
BJETIVOS.............................................................................................. 10
2.3
REVISÃO................................................................................................. 11
2.3.1 Generalidades sobre o gênero.............................................................. 11
2.3.2 Aspectos botânicos............................................................................... 12
2.3.2.1 Taxonomia............................................................................................. 12
2.3.2.2 Morfologia.............................................................................................. 13
2.3.3 Aspectos químicos................................................................................ 13
2.3.3.1 Constituição química............................................................................. 14
2.3.3.1.1 Quinonas policíclicas............................................................................. 14
2.3.3.1.2 Xantonas............................................................................................... 15
2.3.3.1.3 Benzofenonas....................................................................................... 16
2.3.3.1.4 Benzopiranos........................................................................................ 17
2.3.3.1.5 Derivados de floroglucinol..................................................................... 17
2.3.3.1.6 Flavonóides........................................................................................... 18
2.3.3.1.7 Ácidos fenólicos.................................................................................... 20
2.3.3.1.8 Taninos.................................................................................................. 20
2.3.3.1.9 Óleos voláteis........................................................................................ 20
2.4 M
ATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 21
2.4.1 Material Vegetal.................................................................................... 21
2.4.2 Preparação dos extratos....................................................................... 22
2.4.3 Análise cromatográfica.......................................................................... 22
2.4.4 Isolamento e purificação....................................................................... 23
2.4.5 Identificação dos produtos.................................................................... 24
9
2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 25
2.5.1 Análise da constituição química de Hypericum ternum e de
Hypericum myrianthum.........................................................................
25
2.5.1.1 Análise cromatográfica qualitativa das frações de Hypericum ternum. 25
2.5.1.1.1 Partes aéreas........................................................................................ 25
2.5.1.1.2 Raízes................................................................................................... 26
2.5.1.2 Isolamento de compostos fenólicos de Hypericum ternum................... 26
2.5.1.3 Análise estrutural das substâncias isoladas......................................... 27
2.5.1.3.1 Substância HT1 .................................................................................... 27
2.5.1.3.2 Substância HT2..................................................................................... 29
2.5.1.3.3 Substância HT3..................................................................................... 30
2.5.1.3.4 Substância HT4…………………………………………..………………… 32
2.5.1.3.5 Substâncias HT5, HT6 e HT7............................................................... 34
2.5.1.3.6 Substância HTR1.................................................................................. 36
2.5.1.4 Análise cromatográfica qualitativa das frações de Hypericum
myrianthum............................................................................................
41
2.5.1.4.1 Partes aéreas........................................................................................ 41
2.5.1.4.2 Raízes.................................................................................................. 42
2.5.1.5 Isolamento de compostos fenólicos de Hypericum myrianthum........... 42
2.5.1.6 Análise estrutural das substâncias isoladas......................................... 42
2.5.1.6.1 Substância HM1.................................................................................... 43
2.5.1.6.2 Substância HM2.................................................................................... 44
2.5.1.6.3 Substância HMR1................................................................................. 44
2.5.1.6.4 Substância HMR2................................................................................. 45
2.6 C
ONCLUSÕES.......................................................................................... 47
3 C
APÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE ESPÉCIES DE
HYPERICUM.............................................................................................
49
3.1 I
NTRODUÇÃO........................................................................................... 51
3.2 O
BJETIVOS ............................................................................................. 52
3.3 R
EVISÃO................................................................................................. 52
3.3.1
Mecanismos antioxidantes.................................................................... 52
3.3.2
Antioxidantes de origem natural............................................................ 54
3.3.3 Compostos fenólicos............................................................................. 55
10
3.3.4 Atividade antioxidante de espécies de Hypericum................................ 57
3.4 M
ATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 69
3.4.1 Preparação dos extratos....................................................................... 70
3.4.2 Obtenção de substâncias purificadas................................................... 70
3.4.3 Determinação de fenóis totais............................................................... 71
3.4.4 Avaliação do potencial antioxidante total (TRAP)................................. 72
3.4.5 Avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila (ORAC-
PGV)......................................................................................................
74
3.4.6 Avaliação da capacidade de reação com 2,2 difenil-1-picril-hidrazil
(DPPH
).................................................................................................
75
3.4.6.1 Ensaio bioautográfico............................................................................ 75
3.4.6.2 Ensaio espectrofotométrico................................................................... 76
3.4.7 Análise estatística dos resultados......................................................... 76
3.5 R
ESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 77
3.5.1 Rendimento dos extratos...................................................................... 77
3.5.2 Determinação de fenóis totais............................................................... 77
3.5.3 Avaliação do potencial antioxidante total (TRAP)................................. 80
3.5.4 Avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila (ORAC-
PGV)......................................................................................................
85
3.5.5 Avaliação da capacidade de reação com 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
(DPPH
).................................................................................................
89
3.5.6 Avaliação da correlação entre o conteúdo de compostos fenólicos e
a capacidade antioxidante...................................................................
104
3.6 C
ONCLUSÕES.......................................................................................... 105
4 C
APÍTULO 3 – CULTURA IN VITRO DE CÉLULAS E TECIDOS DE ESPÉCIES DE
HYPERICUM NATIVAS DO RIO GRANDE DO SUL.........................................
109
4.1 I
NTRODUÇÃO.......................................................................................... 111
4.2 O
BJETIVOS............................................................................................. 111
4.3 R
EVISÃO................................................................................................. 112
4.3.1 Cultura in vitro....................................................................................... 112
4.3.2 Regeneração e propagação de espécies do gênero Hypericum.......... 115
4.3.3 Produção de metabólitos secundários por células ou tecidos de
espécies de Hypericum cultivadas in vitro............................................
118
4.3.3.1 Quinonas policíclicas............................................................................ 119
4.3.3.2 Xantonas............................................................................................... 122
4.3.3.3 Flavonóides .......................................................................................... 124
4.3.3.4 Floroglucinóis....................................................................................... 126
11
4.3.3.5 Outros metabólitos secundários........................................................... 127
4.4 M
ATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 128
4.4.1 Procedimentos gerais........................................................................... 128
4.4.2 Material vegetal..................................................................................... 129
4.4.3 Estabelecimento do cultivo in vitro........................................................ 129
4.4.3.1 Seleção e preparação dos explantes.................................................... 129
4.4.3.2 Composição dos meios de cultura........................................................ 130
4.4.3.3 Indução da regeneração in vitro de segmentos apicais........................ 131
4.4.3.4 Avaliação da concentração de sais do meio de cultivo........................ 132
4.4.3.4.1 Estudo da cinética de crescimento in vitro de Hypericum
polyanthemum......................................................................................
132
4.4.3.5 Aclimatação das plântulas.................................................................... 132
4.4.3.5.1 Estudo da ontogenia de Hypericum polyanthemum
aclimatizada..........................................................................................
133
4.4.3.6 Indução e estabelecimento de culturas de calos.................................. 134
4.4.3.7 Análise de crescimento dos calos......................................................... 135
4.4.4 Análise fitoquímica do material vegetal obtido por cultivo in
vitro.......................................................................................................
135
4.4.4.1 Análise cromatográfica......................................................................... 135
4.4.4.2 Avaliação da presença de taninos........................................................ 136
4.4.4.3 Análise química das raízes de Hypericum campestre e Hypericum
polyanthemum micropropagadas..........................................................
136
4.4.4.3.1 Análise cromatográfica.......................................................................... 136
4.4.4.3.2 Análise espectroscópica....................................................................... 137
4.4.4.4 Análise estatística dos resultados......................................................... 137
4.5 R
ESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 137
4.5.1 Regeneração in vitro de espécies de Hypericum.................................. 137
4.5.2 Avaliação da concentração de sais do meio de cultivo no
desenvolvimento in vitro de espécies de Hypericum............................
143
4.5.3 Estudo da cinética de crescimento in vitro de Hypericum
polyanthemum.......................................................................................
147
4.5.4 Aclimatização das plântulas.................................................................. 148
4.5.4.1 Estudo da ontogenia de Hypericum polyanthemum
aclimatizada..........................................................................................
152
4.5.5 Indução e estabelecimento das culturas de calos................................ 154
4.5.6 Análise fitoquímica do material vegetal obtido por cultivo in vitro......... 159
12
4.5.6.1 Análise cromatográfica e caracterização de substâncias tanantes...... 160
4.5.6.2 Análise das raízes de Hypericum campestre e Hypericum
polyanthemum micropropagadas..........................................................
162
4.6 C
ONCLUSÕES.......................................................................................... 165
5 C
APÍTULO 4 – DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA
ANALÍTICA PARA
QUANTIFICAÇÃO DE BENZOPIRANOS EM EXTRATO N-
HEXANO DE HYPERICUM POLYANTHEMUM..................................................
169
5.1 I
NTRODUÇÃO........................................................................................... 171
5.2 O
BJETIVOS.............................................................................................. 171
5.3 R
EVISÃO................................................................................................. 172
5.3.1 Validação de metodologia analítica...................................................... 172
5.3.2 Benzopiranos........................................................................................ 174
5.4 M
ATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 176
5.4.1 Material vegetal..................................................................................... 176
5.4.2 Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de
benzopiranos em extrato n-hexano de Hypericum polyanthemum.......
177
5.4.2.1 Preparação da solução extrativa........................................................... 177
5.4.2.2 Condições cromatográficas................................................................... 177
5. 4.2.3 Validação do método de doseamento de benzopiranos por CLAE...... 178
5.4.2.3.1 Avaliação da linearidade....................................................................... 178
5.4.2.3.1.1 Curva padrão dos benzopiranos........................................................... 178
5.4.2.3.2 Determinação dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)........ 179
5.4.2.3.3 Teste de Repetibilidade........................................................................ 179
5.4.2.3.4 Teste de Precisão intermediária........................................................... 180
5.4.2.3.5 Teste de recuperação........................................................................... 180
5.4.3 Quantificação de benzopiranos em diferentes órgãos de Hypericum
polyanthemum in natura, micropropagada e aclimatizada....................
181
5.4.4 Análise estatística dos resultados......................................................... 181
5.5 R
ESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 181
5.5.1 Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de
benzopiranos em extrato n-hexano de Hypericum polyanthemum.......
181
5.5.2 Quantificação de benzopiranos em diferentes órgãos de Hypericum
polyanthemum in natura, micropropagada e aclimatizada....................
189
5.5.2.1 Hypericum polyanthemum in natura..................................................... 190
5.5.2.2 Hypericum polyanthemum micropropagada......................................... 192
5.5.2.2.1 Avaliação da influência da concentração de sais do meio de cultivo
13
na produção de benzopiranos............................................................... 193
5.5.2.2.2 Estudo da cinética de produção de benzopiranos in vitro..................... 194
5.5.2.3 Hypericum polyanthemum aclimatizada............................................... 195
5.5.2.3.1 Estudo da ontogenia de Hypericum polyanthemum aclimatizada........ 196
5.6 C
ONCLUSÕES......................................................................................... 206
6 D
ISCUSSÃO GERAL................................................................................. 209
7 C
ONCLUSÕES GERAIS............................................................................. 215
8 R
EFERÊNCIAS......................................................................................... 219
9 A
NEXOS.................................................................................................. 245
10 B
IOGRAFIA............................................................................................ 339
14
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1: Teor de compostos fenólicos, expresso em miligramas de quercetina
por grama de extrato seco (EQ/g) em extratos e frações de espécies de
Hypericum...............................................................................................................
78
Figura 2.2: Intensidade de quimioluminescência, medida após adição de
concentrações crescentes dos extratos brutos metanólicos de espécies de
Hypericum e quercetina...........................................................................................
81
Figura 2.3: (A) Efeito na intensidade de quimioluminescência, promovido por
extratos brutos metanólicos de espécies de Hypericum e quercetina; (B)
Percentual de inibição da quimioluminescência, no tempo de 900 s......................
83
Figura 2.4: (A) Efeito na intensidade de quimioluminescência, promovido por
carifenona A, carifenona B, quercetina e trolox. (B) Percentual de inibição da
quimioluminescência, no tempo de 700 s...............................................................
84
Figura 2.5: Consumo de PGV, na ausência (controle) e presença de trolox,
quercetina e dos flavonóides guaijaverina, hiperosídeo e isoquercitrina................
87
Figura 2.6: Consumo de PGV, na ausência (controle) e presença dos extratos
brutos metanólicos de espécies de Hypericum.......................................................
88
Figura 2.7: Consumo do radical DPPH
, por extratos brutos metanólicos e
frações metanólicas e n-hexânicas de H. carinatum e H. caprifoliatum,
respectivamente......................................................................................................
92
Figura 2.8: Consumo do radical DPPH
por extratos brutos metanólicos e
frações metanólicas e n-hexânicas de H. myrianthum e H. polyanthemum,
respectivamente......................................................................................................
93
Figura 2.9: Consumo do radical DPPH
pelos flavonóides guaijaverina,
hiperosídeo, isoquercitrina e 3-metil quercetina......................................................
94
Figura 2.10: Consumo do radical DPPH
pelos derivados de floroglucinol
hiperbrasilol B, japonicina A, e uliginosina B e benzofenonas carifenona A e
carifenona B............................................................................................................
95
Figura 2.11: Comparação entre consumo do radical DPPH• (consumo total,
consumo aos 50 s e consumo aos 600 s) para os diferentes extratos das
espécies de Hypericum...........................................................................................
97
Figura 2.12: Comparação entre consumo do radical DPPH• (consumo total,
consumo aos 50 s e consumo aos 600 s) para os extratos bruto MeOH e frações
n-hexano e MeOH das espécies de Hypericum......................................................
98
Figura 2.13: Comparação entre consumo do radical DPPH• (consumo total,
consumo aos 50 s e consumo aos 600 s) para as substâncias isoladas................
99
Figura 2.14: Percentual de consumo total do radical DPPH
por quercetina.........
101
Figura 3.1: H. ternum micropropagada em meio MU sem adição de reguladores
de crescimento........................................................................................................
139
Figura 3.2: H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum micropropagadas
em meio MU sem adição de reguladores de crescimento.....................................
140
Figura 3.3: H. campestre micropropagada em meio MU suplementado com 0,2
mg/L de BAP e 1,0 mg/L de 2,4-D e em meio MU, sem adição de reguladores
de crescimento........................................................................................................
141
Figura 3.4: Aspecto das raízes de plântulas de H. campestre e H.
15
polyanthemum, cultivadas em meio MU e em meio MS 25% e MU, mantidas no
mesmo meio de cultura por de três meses.............................................................
143
Figura 3.5: Análise de crescimento de espécies de Hypericum micropropagadas
em meios MS 25%, MS 100% e MU......................................................................
145
Figura 3.6: Análise de crescimento de H. polyanthemum micropropagada em
meio MU, durante o período de 6 a 14 semanas...................................................
147
Figura 3.7: H. ternum aclimatizada, após 6 semanas de crescimento em sala
climatizada...............................................................................................................
149
Figura 3.8: H. carinatum aclimatizada, após 8 semanas de cultivo a campo......... 149
Figura 3.9: H. campestre aclimatizada, após 8 semanas de cultivo a campo....... 149
Figura 3.10: H. caprifoliatum aclimatizada, após 6 semanas de crescimento em
sala climatizada.......................................................................................................
150
Figura 3.11: H. myrianthum aclimatizada, após um ano de transferência ex-vitro. 150
Figura 3.12: H. polyanthemum aclimatizada, após 6 semanas de crescimento
em sala climatizada e 16 semanas de cultivo em campo.......................................
150
Figura 3.13: Análise da produção de biomassa de H. polyanthemum
aclimatizada durante o período de 18 semanas, considerando o tempo de
manutenção, antes da transferência para condição ex vitro...................................
151
Figura 3.14: Proporção de partes aéreas, botões florais, flores e frutos em H.
polyanthemum aclimatizada, durante o período de 14 a 22 semanas....................
152
Figura 3.15: Diferentes estágios de ontogênese floral de H. polyanthemum
aclimatizada.............................................................................................................
153
Figura 3.16: Análise do peso fresco e peso seco das diferentes partes
reprodutivas de H. polyanthemum aclimatizada......................................................
153
Figura 3.17: Análise de crescimento dos calos de H. myrianthum em meio MU
suplementado com 2,4-D/CIN; 2,4-D/BAP e 2,4-D/CIN/ANA, representado
através do índice de crescimento............................................................................
155
Figura 3.18: Análise de crescimento dos calos de H. polyanthemum em meio
MU suplementado com 2,4-D/CIN; 2,4-D/BAP e 2,4-D/CIN/ANA, representado
através do índice de crescimento............................................................................
156
Figura 3.19: Aspecto dos calos de H. polyanthemum cultivados em meio MU
suplementado com 2,4-D/CIN; 2,4-D/BAP e 2,4-D/CIN/ANA, sob fotoperíodo de
16 h..........................................................................................................................
157
Figura 3.20: Aspecto dos calos de H. ternum cultivados em meio MU
suplementado com 2,4-D/CIN.................................................................................
157
Figura 3.21: Espectro de absorção na região do UV do extrato das raízes de H.
polyanthemum e da amostra purificada..................................................................
164
Figura 4.1: Perfil cromatográfico obtido por CLAE do extrato n-hexano das
flores de H. polyanthemum in natura e dos benzopiranos HP1, HP2 e HP3..........
182
Figura 4.2: Curvas padrão de HP1 (A), HP2 (B) e HP3 (C), obtidas por CLAE..... 185
Figura 4.3: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexano de
diferentes órgãos de H. polyanthemum in natura, em diferentes épocas de
coleta.......................................................................................................................
191
Figura 4.4: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexano de
plântulas de H. polyanthemum micropropagado em diferentes meios de cultura...
193
Figura 4.5: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexano de
plântulas de H. polyanthemum cultivadas em meio MU, em diferentes estágios
16
de desenvolvimento................................................................................................. 195
Figura 4.6: Teor de benzopiranos HP1 (A), HP2 (B) e HP3 (C) em extrato n-
hexano de flores totais e partes aéreas de H. polyanthemum aclimatizada em
diferentes épocas de desenvolvimento...................................................................
197
Figura 4.7: Teor de benzopiranos totais em extrato n-hexano de partes aéreas
(A) e flores totais (B) de H. polyanthemum aclimatizada em diferentes épocas de
desenvolvimento......................................................................................................
199
Figura 4.8: Teor de benzopiranos HP1 (A), HP2 (B) e HP3 (C) em extrato n-
hexano de H. polyanthemum aclimatizada em diferentes estágios de
desenvolvimento reprodutivo...................................................................................
200
Figura 4.9: Teor de benzopiranos totais em extrato n-hexano de H.
polyanthemum aclimatizada em diferentes estágios reprodutivos..........................
201
Figura 4.10: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexano de
flores totais e partes aéreas de H. polyanthemum com 18 semanas de
aclimatização, considerando o período de cultivo in vitro.......................................
205
17
18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1a: Valores máximos de absorção no UV da substância HT1................. 287
Tabela 1.1b: Valores máximos de absorção no UV da substância HT2................. 288
Tabela 1.1c: Valores máximos de absorção no UV da substância HT3................. 289
Tabela 1.1d: Valores máximos de absorção no UV da substância HT5................. 290
Tabela 1.1e: Valores máximos de absorção no UV da substância HT6................. 291
Tabela 1.1f: Valores máximos de absorção no UV da substância HT7.................. 292
Tabela 1.1g: Valores máximos de absorção no UV da substância HM1................ 293
Tabela 1.2: Dados de RMN de
13
C dos compostos HT1, HT2, HT5, HT6 e
HT7...........................................................................................................................
294
Tabela 1.3: Dados de RMN de
1
H dos compostos HT1, HT2, HT5, HT6 e
HT7..........................................................................................................................
295
Tabela 1.4: Dados de RMN de
13
C e de
1
H do composto HT3............................... 296
Tabela 1.5: Dados de RMN de
13
C e de
1
H do composto HT4............................... 296
Tabela 1.6: Contantes de acoplamento do H1’ anomérico…………………............ 35
Tabela 1.7: Dados de RMN de
1
H do composto HTR1 e das substâncias
estruturalmente relacionadas isouliginosina B, drumondina C e hiperbrasilol
B...............................................................................................................................
297
Tabela 1.8: Dados de RMN de
13
C do composto HTR1, isolado e das
substâncias estruturalmente relacionadas isouliginosina B, drumondina C e
hiperbrasilol B..........................................................................................................
298
Tabela 1.9: Dados de RMN de
13
C e de
1
H do composto HMR2............................ 299
Tabela 2.1: Dados sobre a coleta do material vegetal e registro em
herbário....................................................................................................................
70
Tabela 2.2: Rendimento em porcentagem das frações n-hexânica,
diclorometânica e metanólica das espécies de Hypericum.....................................
77
Tabela 2.3: Valores de absorvância obtidos para quercetina nas soluções
padrão, analisadas por espectrofotometria no UV...................................................
78
Tabela 2.4: Índices ORAC-PGV, expresso em µMol de Trolox/g de extrato seco
(ET/g), obtidos para extratos brutos metanólicos das espécies de Hypericum
avaliadas através do ensaio com PGV....................................................................
86
Tabela 3.1: Dados sobre a coleta do material vegetal e registro em
herbário....................................................................................................................
129
Tabela 3.2: Composição dos meios de cultura MS e MU...................................... 131
Tabela 3.3: Meios de cultura utilizados para indução de calogênese das
espécies de Hypericum............................................................................................
134
Tabela 3.4: Indução da regeneração in vitro de segmentos apicais de espécies
de Hypericum em meio MU suplementado com diferentes concentrações de
reguladores de crescimento.....................................................................................
138
Tabela 3.5: Análise da calogênese de H. polyanthemum....................................... 156
Tabela 4.1: Áreas dos picos de HP1 nas soluções padrão analisadas por CLAE.. 183
Tabela 4.2: Áreas dos picos de HP2 nas soluções padrão analisadas por CLAE.. 183
Tabela 4.3: Áreas dos picos de HP3 nas soluções padrão analisadas por CLAE.. 184
Tabela 4.4: Valores de limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
obtidos para os benzopiranos HP1, HP2 e HP3......................................................
186
19
Tabela 4.5: Teores de HP1, em solução extrativa de H. polyanthemum,
analisadas por CLAE, nos testes para avaliação da repetibilidade e precisão
intermediária............................................................................................................
187
Tabela 4.6: Teores de HP2, em solução extrativa de H. polyanthemum,
analisadas por CLAE, nos testes para avaliação da repetibilidade e precisão
intermediária............................................................................................................
187
Tabela 4.7: Teores de HP3, em solução extrativa de H. polyanthemum,
analisadas por CLAE, nos testes para avaliação da repetibilidade e precisão
intermediária............................................................................................................
188
Tabela 4.8: Valores dos percentuais de recuperação de HP1, HP2 e HP3, em
solução extrativa de H. polyanthemum....................................................................
188
Tabela 4.9: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexano de
plântulas de H. polyanthemum micropropagada subdivididas em folhas, ramos e
raízes.......................................................................................................................
192
Tabela 4.10: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexano de H.
polyanthemum aclimatizada subdivididas em folhas, ramos e raízes.....................
196
20
RESUMO
Aproximadamente vinte espécies do gênero Hypericum (Guttiferae) têm ocorrência
natural no Brasil, e concentram-se principalmente na região Sul do País. Considerando
a importância deste gênero como fonte de substâncias com variadas atividades
biológicas, tais como analgésica, antidepressiva, antimicrobiana, antiviral,
antiproliferativa, entre outras, o presente trabalho teve como objetivos analisar a
constituição química e o potencial antioxidante de espécies de Hypericum, desenvolver
protocolos para manutenção de algumas espécies nativas através de culturas de
tecidos e células e validar metodologia para quantificação de benzopiranos em H.
polyanthemum proveniente de cultivo a campo, in vitro e aclimatizado. Utilizando-se
métodos cromatográficos e espectroscópicos, foram isolados e identificados o ácido
fenólico ácido 5-O-cafeoil-1-metoxi-quínico e os flavonóides 3,7-dimetil-quercetina, 3-O-
metil-quercetina, I3,II8-biapigenina, guaijaverina, isoquercitrina e hiperosídeo, todos
derivados da quercetina e obtidos da fração acetato de etila das partes aéreas de H.
ternum. Ainda desta espécie, porém da fração n-hexano das raízes, obteve-se o
derivado de floroglucinol uliginosina B. De H. myrianthum foram isolados e identificados
os flavonóides quercetina e hiperosídeo, da fração metanólica das partes aéres, bem
como os derivados de floroglucinol japonicina A e uliginosina B, fração n-hexano das
raízes. Através do método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, foram quantificados os
teores de fenólicos totais das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e
H. polyanthemum, verificando-se teores variando entre 37,40 a 228,36 mg EQ/g de
extrato seco. Utilizando as técnicas de TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant
Parameter), ORAC-PGV (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e reação
bioautográfica e espectrofotométrica com radicais DPPH
(2,2 difenil-1-picril-hidrazil)
evidenciou-se que extratos brutos metanólicos, e frações metanólicas e n-hexânicas
das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum H. myrianthum e H. polyanthemum, bem
como produtos isolados de espécies de Hypericum nativas do Estado apresentam
potencial antioxidante. A regeneração in vitro foi obtida em meio Murashige & Skoog
modificado (MU) para as espécies H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H.
myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum utilizando diferentes combinações e
concentrações dos reguladores de crescimento 6-benzilamino-purina (BAP), ácido
21
naftaleno-acético (ANA) e ácido 2,4 dicloro-fenóxi-acético (2,4-D). Plântulas dessas
espécies foram posteriormente aclimatizadas com sucesso, sendo cultivadas a campo.
As espécies micropropagadas demonstraram perfis químicos qualitativamente similares
aos apresentados pelas plantas desenvolvidas no campo, de modo que o cultivo in vitro
apresenta-se como uma alternativa interessante aos métodos convencionais de
produção de biomassa para extração de metabólitos secundários bioativos. Culturas de
calos foram estabelecidas em meio MU para H. myrianthum, H. polyanthemum e H.
ternum, utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de
crescimento cinetina (CIN), BAP, ANA e 2,4-D. Considerando-se as importantes
atividades biológicas de produtos obtidos de H. polyanthemum foi estabelecida uma
metodologia para quantificação, através da técnica de CLAE, de benzopiranos no
extrato apolar desta planta, espécie de ocorrência restrita. A validação analítica foi
avaliada conforme o preconizado por normas reconhecidas internacionalmente, com
análise dos parâmetros linearidade, seletividade, precisão (repetibilidade e precisão
intermediária), exatidão e limites de detecção e quantificação, demonstrando resultados
coerentes com os exigidos pela legislação vigente. Foram evidenciadas variações no
teor de benzopiranos na planta micropropagada, aclimatizada e desenvolvida a campo,
provavelmente devido a fatores, que vão desde a regulação endógena de processos
fisiológicos até variações sazonais no cultivo.
Palavras-chaves: Hypericum, compostos fenólicos, atividade antioxidante, cultivo in
vitro, aclimatização, benzopiranos.
22
ABSTRACT
Chemical analysis, evaluation of the antioxidant activity and development of in
vitro cultures of Hypericum species native of Rio Grande do Sul.
Approximately twenty species of Hypericum genus (Guttiferae) are native of Brazil,
occurring mainly in the South region. Considering the importance of the genus as a
source of compounds with different biological activities, such as analgesic,
antidepressant, antimicrobial, antiviral, antiproliferative, among others, the objectives of
this work were to evaluate the phytochemistry and antioxidant potential of some
Hypericum species, to develop protocols for the maintenance of the species through in
vitro cultures and to validate a technique to quantify the benzopyrans in H.
polyanthemum grown in field, in vitro and acclimatized plants. Chromatographic and
spectroscopic techniques were used for the isolation and identification of the phenolic
acid 5-O-caffeoyl-1-methyl ester-quinic acid and the flavonoids quercetin 3,7-dimethyl
ether, quercetin 3-methyl ether, I3,II8-biapigenin, guaijaverin, isoquercitrin and
hyperoside, all of them quercetin derivatives and obtained from ethyl acetate fraction of
H. ternum aerial parts. From n-hexane fraction of the roots of this species the
phloroglucinol derivative uliginosin B was obtained. The flavonoids quercetin and
hyperoside (from aerial parts of methanolic fraction), and the phloroglucinol derivatives
japonicin A and uliginosin B (from n-hexane fraction of roots) were isolated from H.
myrianthum. Total phenol concentration ranging from 37.40 to 228.36 mg QE/g dry
extract (Folin–Ciocalteu colorimetric method) in H. caprifoliatum, H. carinatum, H.
myrianthum and H. polyanthemum was measured. The antioxidant potential of the
extracts obtained from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H.
polyanthemum and isolated compounds was determined using TRAP (Total Radical-
trapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGR (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
and bioautographic and spectrofotometric reaction with DPPH
(2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl radical techniques. In vitro regeneration of H. campestre, H. caprifoliatum,
H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum was obtained in
Murashige & Skoog modified medium (MU) supplemented with differents combinations
and concentrations of the growth regulators 6-benzylaminopurine (BAP),
-naphthalene-
23
acetic acid (ANA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Plantlets were
acclimatizated and transferred to open field. The micropropagated species showed
chemical pattern qualitatively similar to field grown plants, demonstrating that the in vitro
cultures are an alternative to conventional methods for biomass production of bioactive
secondary metabolites. Callus cultures of H. myrianthum, H. polyanthemum and H.
ternum were established in MU medium using different combinations and
concentrations of kinetin (CIN), BAP, ANA and 2,4-D. Considering the important
biological activities of the benzopyrans isolated from H. polyanthemum, an HPLC
quantification methodology was established. Analytical validation was performed
according to international rules (linearity, selectivity, precision, accuracy, detection and
quantitation limits) showing results coherent with those required by the current
legislation. Variation of the benzopyrans concentration was observed among the
micropropagated plantlet, acclimatizated and field grown plants, probably due to factors
as endogenous regulation of physiological process and seasonal variation of the culture.
Key-words: Hypericum, phenolic compounds, antioxidant activity, in vitro culture,
acclimatization, benzopyrans.
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
2
3
Estudos científicos na área de produtos naturais vêm sendo desenvolvidos há
séculos. No entanto, apesar do considerável volume de pesquisas existentes na
identificação de produtos de origem vegetal, esta área permanece com seu potencial
parcialmente explorado. Apenas uma pequena parcela das espécies vegetais estimadas
mundialmente foi investigada quanto a sua constituição química e uma fração ainda
menor submetida a estudos biológicos (HAMBURGUER & HOSTETTMANN, 1991;
VERPOORTE, 1998; BALUNAS & KINGHORN, 2005; JONE et al., 2006).
Muitos pesquisadores têm direcionado seus estudos para espécies nativas do
Brasil, com a perspectiva de encontrar propriedades semelhantes às de plantas
exóticas do mesmo gênero já utilizadas na terapêutica. Dentro deste contexto,
pesquisas envolvendo espécies do gênero Hypericum têm sido desenvolvidas, uma vez
que, no mercado farmacêutico atual, preparações a base de Hypericum perforatum vêm
sendo responsáveis por uma parcela significativa das vendas de fitoterápicos em todo o
mundo (B
ILIA et al., 2002; LAWVERE & MAHONEY, 2005).
Aproximadamente vinte espécies deste gênero têm ocorrência natural no
Brasil, e concentram-se principalmente na Região Sul do país (R
OBSON, 1990). Algumas
das espécies nativas do Rio Grande do Sul foram avaliadas quanto à constituição
química, verificando-se a produção de compostos fenólicos, tais como xantonas (R
OCHA
et al., 1994), benzofenonas (B
ERNARDI et al., 2005), benzopiranos (FERRAZ et al., 2001),
floroglucinóis
(ROCHA et al., 1995; FERRAZ et al., 2002a; NÖR et al., 2004), flavonóides e
taninos (D
ALL’AGNOL et al., 2003), bem como ausência de hipericina e derivados
(F
ERRAZ et al., 2002b), consideradas juntamente com hiperforina, as substâncias
marcadoras químicas de Hypericum perforatum (B
ILIA et al., 2002; LAWVERE & MAHONEY,
2005).
Além disso, algumas propriedades farmacológicas vêm sendo reveladas por
estudos biológicos. Dentre essas destacam-se os benzopiranos de H. polyanthemum,
para os quais foi demonstrado ação antiproliferativa (F
ERRAZ et al., 2005c), citotóxica
frente às células envolvidas no processo de angiogênese (N
ÖR, 2006) e antimicrobiana
4
(DALL’AGNOL et al., 2005), além da atividade inibitória da monoamino oxidase (IMAO)
inicialmente investigada (G
NERRE et al., 2001). Dentre os derivados de floroglucinol
isolados, uliginosina B de H. myrianthum (F
ERRAZ et al., 2002a), H. carinatum e H.
polyanthemum (N
ÖR et al., 2004) apresentou atividade antimicrobiana (DALL’AGNOL et
al.,
2005); hiperbrasilol B, presente em H. caprifoliatum, H.connatum (NÖR et al., 2004) e
H. brasiliense (R
OCHA et al., 1995), assim como japonicina A, isolada de H. myrianthum
(D
ALL’AGNOL et al., 2005), também possuem ação antimicrobiana (ROCHA et al., 1995;
DALL’AGNOL et al., 2005). Além dos produtos isolados, muitos extratos e frações vêm
apresentando atividades interessantes, como antidepressiva (D
AUT et al., 2000; VIANA et
al., 2005) antiviral (S
CHMITT et al., 2001; FRITZ et al., 2006), analgésica (VIANA et al.,
2003), antifúngica (F
ENNER et al., 2005) e antiproliferativa (FERRAZ et al., 2005b), de
modo que a continuidade nos estudos, tanto químicos quanto biológicos, dessas
espécies de Hypericum torna-se necessária.
Recentemente, muitos trabalhos têm avaliado os efeitos benéficos de
compostos fenólicos como antioxidantes naturais, contribuindo para a captura de
radicais livres (Z
HENG & WANG, 2001; PAREJO et al., 2003; CAI et al., 2004; MILIAUSKAS et
al., 2004; Š
KERGET et al., 2005; KATALINIC et al., 2006). Uma vez que o gênero
Hypericum apresenta abundância nessa classe de substâncias, é interessante também
avaliar o potencial antioxidante das espécies nativas, bem como dos produtos isolados
das mesmas.
Apesar do considerável número de trabalhos envolvendo avaliação química e
farmacológica das espécies nativas, dentre as espécies brasileiras verificou-se cultivo in
vitro apenas para Hypericum brasiliense (C
ARDOSO & DE OLIVEIRA, 1996), planta a partir
da qual foram isoladas xantonas com atividade antifúngica e IMAO (R
OCHA et al., 1994),
e floroglucinóis com atividade antimicrobiana (R
OCHA et al., 1995; ROCHA et al., 1996).
A crescente demanda pela utilização de plantas na cura ou prevenção de
doenças, bem como a exploração das mesmas visando a obtenção de substâncias de
interesse, tem resultado em uma intensa exploração da flora nativa, o que pode levar a
5
reduções das populações naturais dessas espécies, colocando-as em risco de extinção.
O extrativismo vegetal resulta no desaparecimento de germoplasmas ainda não
estudados, o que pode significar a perda de componentes químicos interessantes que
poderiam tornar-se novos fármacos (F
RANÇA, 2003). Desta forma, é relevante o
desenvolvimento de métodos que possibilitem a propagação de plantas, bem como o
melhoramento e conservação das mesmas. O cultivo in vitro dessas espécies nativas
aparece então como uma opção para a obtenção de matéria-prima de interesse
farmacêutico e redução do extrativismo predatório.
Considerando a importância do gênero Hypericum como fonte de substâncias
com diferentes atividades biológicas, a variedade de compostos fenólicos verificados
nas espécies nativas do Rio Grande do Sul, bem como a possibilidade de conservação,
propagação de espécies e produção de metabólitos secundários através do cultivo in
vitro, o presente trabalho tem como objetivos gerais analisar a constituição química e o
potencial antioxidante de espécies de Hypericum, assim como a possibilidade de
manutenção de algumas espécies nativas através de culturas de tecidos e células.
Visando um ordenamento dos assuntos abordados, este trabalho encontra-se
dividido em 4 capítulos. O primeiro contém dados sobre a avaliação química de H.
ternum A. St. Hil e de H. myrianthum Cham. & Schltdl. No segundo capítulo é abordada
a avaliação do potencial antioxidante de extratos e compostos fenólicos isolados das
espécies nativas. O terceiro capítulo trata do desenvolvimento de protocolos para
estabelecimento do cultivo in vitro das espécies H. campestre Cham. & Schltdl., H.
caprifoliatum Cham. & Schltdl., H. carinatum Griseb., H. myrianthum Cham. & Schltdl.,
H. polyanthemum Klotzsch ex Reichardt e H. ternum A. St. Hil. No quarto capítulo
encontram-se descritas a validação de metodologia para quantificação de benzopiranos
em H. polyanthemum por CLAE, bem como a análise dos teores dessas substâncias em
plantas proveniente de diferentes cultivos.
6
7
2.
CAPÍTULO 1
ANÁLISE FITOQUÍMICA DE HYPERICUM TERNUM A. ST. HIL. E
HYPERICUM MYRIANTHUM CHAM. & SCHLTDL.
8
9
2.1 INTRODUÇÃO
Os compostos fenólicos pertencem a um grupo de substâncias que inclui uma
grande diversidade de estruturas, simples e complexas. O termo fenólico pode ser
definido quimicamente como uma estrutura que possui pelo menos um anel aromático
no qual, ao menos um hidrogênio encontra-se substituído por um grupamento hidroxila,
incluindo funções derivadas, como éster, metiléter, glicosídeos, entre outros. No
entanto, uma definição puramente química de fenóis como metabólitos secundários de
plantas não é totalmente satisfatória, sendo necessário considerar a origem
biossintética para a classificação dessas substâncias. Cada classe de composto
apresenta ampla variação estrutural, principalmente pela presença de diferentes
substituintes em um esqueleto aromático comum. Muitas classes de polifenóis
encontrados na natureza apresentam-se como derivados dos grupos catecol (1),
resorcinol (2), hidroquinona (3), pirogalol (4) ou floroglucinol (5) (H
ARBORNE, 1989;
C
ARVALHO et al., 2003; SOOBRATTEE et al., 2005).
(1) (2) (3)
(4) (5)
No gênero Hypericum, essa diversidade de estruturas fenólicas é ilustrada pela
grande maioria de metabólitos secundários produzidos por plantas desse grupo. A
ocorrência desse tipo de substância em Hypericum abrange desde compostos fenólicos
amplamente distribuídos, como os derivados de ácidos cinâmicos, flavonóides e
taninos, como também compostos fenólicos de distribuição restrita, como
naftodiantronas, xantonas, derivados de floroglucinol, sendo também encontrados, mais
recentemente, benzopiranos e benzofenonas.
OH
OH
HO
OH
OH
OH
HO
OH
OH
HO
OH
OH
10
Em função das promissoras propriedades biológicas que essas substâncias
vêm demonstrando, o gênero Hypericum tem sido alvo de muitas pesquisas,
direcionadas para o estudo fitoquímico e farmacológico de muitas de suas espécies.
Dentre as espécies ainda pouco trabalhadas, destaca-se Hypericum ternum A.
St. Hil., um sub-arbusto nativo do Rio Grande do Sul. Esta planta foi avaliada,
juntamente com outras espécies do gênero, quanto à constituição química de seu óleo
volátil (F
ERRAZ et al., 2005a) e quanto ao teor de substâncias tanantes (DALL’AGOL et al.,
2003). Estudos biológicos detectaram atividades antifúngica (FENNER et al., 2004) e
antiproliferativa (F
ERRAZ et al., 2005b) para as frações apolares dessa espécie. No
entanto, não há estudos envolvendo uma avaliação mais detalhada da sua composição
química. Em função disso evidencia-se o interesse em analisar a constituição química
dessa espécie.
Hypericum myrianthum Cham. & Schltdl., outra espécie nativa, é uma planta
sub-arbustiva bastante ramificada desde a base. Seu nome faz referência às
inflorescências terminais multifloras, sendo proveniente do grego myrios (inúmeros) e
anthos (flor) (J
IMÉNEZ, 1980; ROBSON, 1990). Desta espécie foram obtidos os derivados
de floroglucinol uliginosina B (F
ERRAZ et al., 2002a) e japonicina A (DALL’AGNOL et al.,
2005), que em estudos bioautográficos apresentaram atividade antimicrobiana
(D
ALL’AGNOL et al., 2005). No entanto, apesar de H. myrianthum já ter sido investigada
quimicamente, essa espécie ainda demonstra a presença de compostos fenólicos
minoritários na fração apolar, bem como apenas trabalhos preliminares avaliando sua
composição química polar, o que motiva o estudo dessa planta.
2.2
OBJETIVOS
Caracterização, isolamento, purificação e elucidação estrutural de substâncias
fenólicas presentes nos extratos apolares e polares das partes aéreas e raízes de
Hypericum ternum A. St. Hil. e Hypericum myrianthum Cham. & Schltdl.
11
2.3 REVISÃO
2.3.1 Generalidades sobre o gênero
O nome Hypericum deriva de duas palavras de origem grega, hyper que
significa “sobre”, e eikon traduzida como “imagem”, referindo-se às plantas colocadas
pelos gregos, em épocas remotas, sobre suas figuras religiosas para espantar espíritos
malignos e proteger contra possessões demoníacas (R
OBSON, 1977).
A espécie H. perforatum L. era conhecida, na antiguidade, como uma planta
com propriedades sobrenaturais, sendo posteriormente atribuídas a ela propriedades
medicinais (H
OBBS, 1990). O nome perforatum deriva do latim, baseado na aparência
perfurada das folhas quando estas são visualizadas contra a luz, em função da
presença de glândulas translúcidas. Acredita-se que o nome popular dado a esta
espécie, erva-de-São-João, seja decorrente da época de floração do vegetal, sendo
suas flores tradicionalmente coletadas para a festa de São João Baptista, no dia 24 de
junho (B
ILIA et al., 2002). Além disso, há referências ao fato de que os pigmentos
vermelhos, liberados por atrito das flores e botões, foram associados ao sangue de São
João Baptista (V
EROTTA, 2003).
O uso das espécies deste gênero é relatado desde o século II a.C., sendo o
nome Hypericum originalmente documentado por Hipócrates, Dioscórides, Galeno e
Plínio, que descreveram propriedades medicinais para estas plantas (R
OBSON, 1977;
B
ILIA et al., 2002; VEROTTA, 2003).
Há muito tempo espécies de Hypericum vêm sendo utilizadas popularmente.
Desde a época de Paracelso têm sido empregadas para o tratamento de desordens
psíquicas, sendo por séculos usado na medicina tradicional européia para ansiedade,
neuroses e depressão (BILIA et al., 2002). Relatos informam que H. perforatum era
empregado desde a Grécia antiga para o tratamento de inflamações do trato
geniturinário, contra dismenorréia e como agente emenagogo, diurético e antimalárico.
12
Além destes usos, Hypericum sp. era comumente empregado em dispepsias, úlceras e
neuralgias (BOMBARDELLI & MORAZZONI, 1995; WHO, 2002). H. perforatum foi
abandonado como remédio durante os séculos XVIII e XIX, retornando o seu uso
medicinal e sendo descrito em muitas farmacopéias no início do século XX (VEROTTA,
2003).
Exemplos de outras espécies do gênero empregadas tradicionalmente para a
cura ou alívio de enfermidades incluem: H. androsaemum, em preparações com uso
diurético e anti-hepatotóxico (V
ALENTÃO et al., 2002), H. brasiliense, H. connatum, H.
caprifoliatum e outras espécies relatadas nativas da região sul do Brasil, utilizadas
popularmente como adstringentes e para tratamento de distúrbios dermatológicos
(J
IMÉNEZ, 1980; MENTZ et al., 1997).
2.3.2 Aspectos botânicos
2.3.2.1 Taxonomia
A família Guttiferae apresenta cerca de 1200 espécies, distribuídas em 50
gêneros de larga distribuição nas regiões tropicais e subtropicais do planeta
(C
RONQUIST, 1981). Dentre esses, o gênero Hypericum (subfamília Hypericoideae; tribo
Hypericeae) abrange aproximadamente 450 espécies, acomodadas em 36 diferentes
seções taxonômicas, sendo também encontrado nas regiões temperadas do hemisfério
norte (R
OBSON, 1977; ROBSON, 1981; BENNETT & LEE, 1989; ROBSON, 2003).
Guttiferae divide-se em 6 sub-famílias, sendo Hypericoideae considerada por
alguns taxonomistas como uma família distinta, devido ao grau de diversidade
morfológica que apresenta. Porém, a presença de xantonas em muitas espécies desse
grupo sustenta a sua inclusão nesta família, caracterizada pela presença dessa classe
de metabólitos secundários. O gênero Hypericum apresenta características tão distintas
em sua subfamília que, por vezes, é considerado como uma família independente,
denominada Hypericaceae (C
RONQUIST, 1981; ROBSON, 1981; BENNETT & LEE, 1989).
13
2.3.2.2 Morfologia
As plantas do gênero Hypericum apresentam, de modo geral, inflorescências
terminais ou, raramente, axilares, unifloras ou cimosas. As flores são hermafroditas,
actinomorfas, apresentando cálice de cinco, ou raramente quatro, sépalas desiguais,
imbricadas ou valvadas, e corolas com 4-5 pétalas assimétricas amarelas, vermelhas ou
alaranjadas. As folhas são opostas, raramente verticiladas, sésseis ou curtamente
pecioladas, simples e inteiras (J
IMÉNES, 1980; ROBSON, 1981).
O gênero é caracterizado pela presença de diferentes tipos de estruturas
secretoras, incluindo glândulas translúcidas, glândulas negras e canais secretores.
Porém, nem sempre todas estas estruturas estão presentes nas espécies de
Hypericum, e a sua presença e/ou freqüência variam com os órgãos do vegetal.
Caracterizam-se por ser local de síntese e/ou acúmulo de substâncias biologicamente
ativas, sendo importantes na discriminação entre os táxons (R
OBSON, 1977; ROBSON,
1981; C
ICCARELLI et al., 2001; ROBSON, 2003; KORNFELD et al., 2007). Enquanto
glândulas pálidas estão presentes em todas as espécies, isso não ocorre de modo
equivalente para glândulas negras, que apresentam restrita dispersão, sendo sua
ocorrência um forte indicativo da presença de hipericina e derivados nessa estrutura
glandular (R
OBSON, 1977; ROBSON, 1981; ROBSON, 2003). As espécies nativas do Brasil
pertencem às seções Brathys e Trigynobrathys, e assim como outras plantas desse
mesmo grupo são caracterizadas pela ausência de glândulas negras (R
OBSON, 1990).
2.3.3 Aspectos químicos
Hypericum perforatum caracteriza-se por ser a espécie mais conhecida, sendo
amplamente investigada na última década devido a sua utilização na produção de
extratos para preparação de fitoterápicos, empregados no tratamento de depressão
leve a moderada. De fato, a erva-de-São-João, como é conhecida popularmente, tem
se tornado uma alternativa de tratamento para pacientes depressivos por apresentar
eficácia clínica comparável a antidepressivos clássicos, como fluoxetina e sertralina
14
(KASPER, 2001; BILIA et al., 2002; VEROTA, 2003).
As naftodiantronas hipericina e pseudo-hipericina foram inicialmente
consideradas como responsáveis pela atividade antidepressiva de H. perforatum
(B
UTTERWECK et al., 1998). Porém, outros estudos sugerem essa atividade para os
flavonóides (B
UTTERWECK et al., 2000; NÖLDNER & SCHÖTZ, 2002), e principalmente para
hiperforina, um derivado de floroglucinol (C
HATTERJEE et al., 1998; MÜLLER et al., 2001).
2.3.3.1 Constituição química
Estudos com outras espécies do mesmo gênero têm sido estimulados pelo
grande interesse científico e valor econômico agregado a H. perforatum, encontrando-
se como característica química comum a presença de compostos fenólicos (K
ARTNIG et
al., 1989; K
ITANOV & NEDIALKOV,1998; HU et al., 2000; DALL’AGNOL et al., 2003;
C
ROCKETT et al., 2005).
2.3.3.1.1 Quinonas policíclicas
As naftodiantronas hipericina (6) e pseudo-hipericina (7) são os principais
constituintes desta classe de substâncias, encontradas em espécies de Hypericum e
aparentemente restritas às plantas deste gênero, sendo importantes do ponto de vista
quimiotaxonômico (K
ITANOV, 2001; CROCKETT et al., 2005).
Estudos fitoquímicos revelaram a presença de hipericina em muitas espécies
do gênero, tais como H. barbatum, H. bithynicum, H. glandulosum, H. hirsutum, H.
humifusum, H. maculatum, H. montanum, H. perforatum, H. tetrapterum e H.
tomentosum e ausência dessa substância em H. calycinum, H. olympicum e H. patulum
(K
ARTNIG et al., 1989; KARTNIG & GÖBEL, 1992; KARTNIG et al., 1996; KITANOV, 2001;
C
ROCKETT et al., 2005), bem como nas espécies H. brasiliense, H. caprifoliatum, H.
carinatum, H. connatum, H. cordatum, H. myrianthum, H. piriai e H. polyanthemum,
nativas do Sul do Brasil (F
ERRAZ et al., 2002b).
15
OH
OOH
HO
HO
CH
3
OH O
OH
R
2.3.3.1.2 Xantonas
O grande valor taxonômico de xantonas na família Guttiferae tem despertado
interesse nessa classe de compostos (B
ENNET & LEE, 1989; KITANOV & NEDIALKOV,
1998).
No gênero Hypericum a presença de xantonas é bastante relatada, sendo estes
compostos encontrados em todos os órgãos desses vegetais (N
IELSEN & ARENDS, 1979;
CARDONA et al., 1990; RATH et al., 1996). A família Guttiferae apresenta agliconas
xantônicas e derivados C-glicosilados, não possuindo derivados O-glicosilados. A
maioria das agliconas desta família é do tipo prenilada, que podem se apresentar com
cadeia aberta ou ciclizada, formando o derivado benzopirânico correspondente (K
USTER
& ROCHA, 2003).
Mangiferina (8) é o derivado C-glicosilado de maior ocorrência em Hypericum
(B
ENNET & LEE, 1989). Embora um grande número de xantonas tenha sido encontrado
em mais de 100 espécies pertencentes a diferentes subfamílias de Guttiferae, a
presença desta substância, bem como de seu isômero isomangiferina (9) tem sido
relatada apenas para os gêneros Hypericum e Cratoxylum, ambos pertencentes ao
táxon Hypericoideae (K
ITANOV & NEDIALKOV, 1998).
Em uma avaliação de 36 espécies do gênero quanto à presença de
mangiferina e isomangiferina verificou-se a produção destas substâncias pela grande
(6) R=CH
3
(7) R=CH
2
OH
16
maioria das plantas investigadas, sendo o maior conteúdo de mangiferina observado
em H. aucheri, H. montanum, H. perfoliatum e H. rochelii, não sendo detectadas apenas
em H. empetrifolium e H. japonicum (K
ITANOV & NEDIALKOV, 1998).
(8) R1=glicose
R2= H
(9) R1= H
R2 = glicose
O
OR2
OH
R1
O
H
HO
HO
2.3.3.1.3 Benzofenonas
As benzofenonas são precursores biossintéticos de xantonas, de modo que a
presença dessa classe de metabólitos secundários é freqüente em Guttiferae devido à
ampla ocorrência de xantonas em espécies dessa família (B
ENNET & LEE, 1989; KITANOV
& NEDIALKOV, 2001).
A identificação de benzofenonas em plantas do gênero Hypericum não é
comum, sendo relatadas para poucas espécies, tais como H. annulatum
(KITANOV &
NEDIALKOV, 2001), H. androsaemum (SCHMIDT & BEERHUES, 1997; PETERS et al., 1998) e
H. scabrum (T
ANAKA et al., 2004).
De H. carinatum, espécie nativa do Rio Grande do Sul, foram isoladas duas
benzofenonas, denominadas de carifenona A (10) e carifenona B (11) (B
ERNARDI et al.,
2005).
(10) (11)
HO
O
OH
O
HO
O
O
OH
17
2.3.3.1.4 Benzopiranos
A ocorrência desta classe de substâncias é menos comum em Hypericum. Até
o momento, estes compostos foram identificados apenas em quatro espécies: H.
japonicum ((I
SHIGURO et al., 1990), H. revolutum (DÉCOSTERD et al., 1986), H. annulatum
(N
EDIALKOV & KITANOV, 2002) e na espécie nativa H. polyanthemum, da qual foram
isolados três compostos denominados 6-isobutiril-5,7-dimetoxi-2,2-dimetil-benzopirano
(HP1) (12), 7-hidroxi-6-isobutiril-5-metoxi-2,2-dimetil-benzopirano (HP2) (13) e 5-hidroxi-
6-isobutiril 7-metoxi-2,2-dimetil-benzopirano (HP3) (14).
(12) R=CH
3
e R’=CH3
(13) R=H e R’= CH
3
(14) R= CH
3
e R’=H
O
OR'
RO
O
2.3.3.1.5 Derivados de floroglucinol
Os derivados de floroglucinóis encontrados no gênero Hypericum pertencem a
dois grupos biogenéticos principais, os monoméricos (aromáticos ou não) e os
diméricos (com um ou ambos núcleos não aromáticos) (N
ÖR, 2006).
Muitos derivados prenilados de floroglucinol vêm sendo isolados das espécies
de Hypericum, podendo ser divididos em dois grupos estruturais, os poliprenilados
semelhantes à hiperforina (15) e ad-hiperforina (16) presentes em H. perforatum
(J
ENSEN et al., 2001; MÜLLER et al., 2001; JÜRGENLIEMK & NAHRSTEDT, 2002; CROCKETT et
al., 2005) e os dímeros, constituídos por uma unidade de floroglucinol ligada através de
uma ponte metilênica a uma unidade de ácido filicínico como, por exemplo, hiperbrasilol
B (17) e japonicina A, encontrados em espécies nativas do Brasil (R
OCHA et al., 1995;
R
OCHA et al., 1996; FERRAZ et al., 2002b; NÖR et al., 2004; DALL’AGNOL et al., 2005).
18
(15) R= CH
3
(16) R= CH
2
CH
3
HO
CH
2
OH
O
O
OH
O
OH
O
(17)
Recentemente, em um trabalho de revisão quimiotaxonômica foi evidenciado
que os derivados de floroglucinol podem ser considerados bons marcadores químicos
para o gênero Hypericum. As seções com espécies americanas nativas do Sul do Brasil
(Brathys e Trigynobrathys) demostram especialização nos derivados diméricos que são
restritos a esses táxons, o que pode ser resultante do seu isolamento geográfico, de
modo que derivados diméricos poderiam ser considerados marcadores taxonômicos
dessas seções (N
ÖR, 2006).
2.3.3.1.6 Flavonóides
O gênero Hypericum apresenta abundância nessa classe de substâncias,
sendo os flavonóides luteolina (18), canferol (19), quercetina (na forma de aglicona
livre), quercitrina, isoquercitrina, hiperosídeo e rutina (glicosídeos derivados da
quercetina) os produtos de maior freqüência nas espécies do gênero (K
ARTNIG et al.,
1996; D
IAS et al., 1998; BILIA et al., 2002; JÜRGENLIEMK & NAHRSTEDT, 2002; ZOU et al.,
2004; C
ROCKETT et al., 2005; ŠKERGET et al., 2005, SILVA et al., 2005a).
Estudos têm demonstrado uma preponderância de flavonóis em Hypericum,
sendo os glicosídicos da quercetina freqüentemente encontrados em muitas espécies.
No entanto, verifica-se uma menor ocorrência de flavonas e flavonas C-glicosiladas
(C
ALIE et al., 1983).
O
HO
OO
R
19
Em um estudo de taxonomia, CROCKETT e colaboradores (2005) analisaram o
extrato metanólico de setenta e quatro espécies de Hypericum, entre elas, H.
perforatum para verificar a presença de flavonóides. Foi verificado que, entre as
espécies analisadas, hiperosídeo caracteriza-se por ser a substância de maior
ocorrência, seguido de isoquercitrina, quercitrina, rutina, quercetina e amentoflavona,
presentes em 52, 48, 44, 17, 13 e 11 espécies, respectivamente. Embora essas
substâncias tenham sido relatadas para muitas espécies do gênero, padrões de
ocorrência destes compostos entre as espécies não parecem ter relevância
quimiotaxonômica, quando consideradas evidências morfológicas e moleculares.
Biflavonóides como amentoflavona (20) e biapigenina já foram isolados de
diversas espécies (B
ERGHÖFER & HÖLZL, 1987; KARTNIG et al., 1996; BILIA et al., 2002;
J
ÜRGENLIEMK & NAHRSTEDT, 2002; CROCKETT et al., 2005).
Derivados de quercetina e biflavonóides de apigenina são os principais
constituintes das flores de H. perforatum (B
ROLIS et al., 1998; TEKEL’OVÁ et al., 2000).
O
HO
OH
OH
OH
O
(18) (19)
O
OOH
OH
OH
O
OH
OHHO
O
(20)
OH
O
O
OH
OH
HO
20
2.3.3.1.7 Ácidos fenólicos
Representantes deste grupo como ácido caféico (21), bem como seus
derivados esterificados, ácidos clorogênico (22) e isoclorogênico, têm sido relatados
para diversas espécies de Hypericum, incluindo algumas das nativas do Rio Grande do
Sul (S
EABRA & ALVES, 1989; COULADIS et al., 2002; DALL’AGNOL et al., 2003; SILVA et al.,
2005a).
OH
OH
HOOC
(21)
HO OH
OH
HO
O
O
O
H
O
H
(22)
2.3.3.1.8 Taninos
Taninos são freqüentemente encontrados em espécies de Hypericum,
podendo-se verificar elevados teores que variam de 5 a 16%, com níveis aumentados
durante o período de floração. Dentre estes, os taninos condensados contendo 3 a 7
unidades de flavan-3-ol ou flavan-3,4-diol são os mais comuns (K
ARTNIG et al., 1989;
N
AHRSTEDT & BUTTERWECK, 1997; DALL’AGNOL et al., 2003).
A quantificação da fração tanante de algumas espécies nativas do Rio Grande
do Sul revelou os maiores teores de taninos para H. connatum (11,5%) e H. ternum
(16,7%) (D
ALL’AGNOL et al., 2003).
2.3.3.1.9 Óleos voláteis
As substâncias voláteis no gênero Hypericum são encontradas em pequenas
concentrações, que variam de 0,05 a 0,9%. Consistem principalmente de
21
hidrocarbonetos saturados, monoterpenos e sesquiterpenos (BARNES et al., 2001).
Dentre os constituintes do óleo volátil de Hypericum perforatum, verifica-se maior
abundância de 2-metil-octano e
-pineno, estando também presentes traços de
-
pineno, mirceno, limoneno, 2-metil-decano, n-alcanos (C
11
, C
16
e C
29
) e n-alcanóis (C
24
,
C
26
e C
28
) (NAHRSTEDT & BUTTERWECK, 1997).
Estudo recente com as espécies nativas do Rio Grande do Sul demonstrou a
presença de óxido de cariofileno como principal constituinte de H. connatum, bem como
nonano, undecano e o benzopirano HP1 como principais constituintes de H.
caprifoliatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, respectivamente, e
-cariofileno em
H. ternum e H. carinatum (F
ERRAZ et al., 2005a).
2.4
MATERIAIS E MÉTODOS
Os procedimentos de preparação do material vegetal e obtenção dos extratos,
bem como o isolamento e purificação de metabólitos secundários, foram realizados no
Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFRGS.
Os solventes e reagentes empregados no desenvolvimento deste trabalho
foram de procedência Nuclear
®
, Quimex
®
, Dinâmica
®
, Synth
®
e Merck
®
.
Para um melhor entendimento, um esquema da metodologia está apresentado
em anexo (Anexo I, página 247).
2.4.1 Material Vegetal
O material vegetal utilizado na análise fitoquímica consistiu nas partes aéreas
(folhas, ramos e flores) e raízes das espécies H. ternum e H. myrianthum. Estas
plantas, de ocorrência natural nos municípios de São Francisco de Paula e Paraíso do
Sul (Rio Grande do Sul), respectivamente, foram coletadas nessas localidades, durante
o período de floração do vegetal (entre os meses de dezembro a janeiro).
22
As amostras foram identificadas pelo botânico Dr. Sérgio Bordignon,
(Departamento de Botânica da ULBRA) e uma exsicata para registro do material vegetal
foi depositada no herbário do Departamento de Botânica do Instituto de Biociências da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, com números de registro Bordignon 1717
para H. ternum e Bordignon 1402 para H. myrianthum.
Após a coleta, o material vegetal foi selecionado, seco em ambiente arejado ao
abrigo da luz e triturado em moinho de facas.
2.4.2 Preparação dos extratos
O material vegetal seco (partes aéreas e raízes) foi submetido a fracionamento
por extração via maceração estática a frio, utilizando-se solventes em polaridade
crescente (n-hexano, diclorometano e metanol) por períodos de 24 horas até o
esgotamento. Após a eliminação do solvente, as frações n-hexânicas foram tratadas
com acetona para a remoção de cera (através de precipitação) e filtradas, sendo
novamente concentradas (R
OCHA et al., 1995).
Visando o isolamento de substâncias com características mais polares, a
fração metanólica das partes aéreas, após a eliminação do solvente, foi dissolvida em
água destilada, sendo essa porção aquosa particionada com acetato de etila.
A eliminação do solvente e concentração dos extratos foi realizada sob pressão
reduzida, em aparelho de evaporação rotatório Fisatom
®
, utilizando-se temperatura não
superior a 55°C. Depois de concentradas, as diferentes frações foram submetidas à
análise cromatográfica.
2.4.3 Análise cromatográfica
Extratos obtidos com as raízes e partes aéreas de H. ternum e H. myrianthum
foram previamente analisados quanto à constituição química através de cromatografia
23
em camada delgada (CCD) analítica, utilizando-se cromatofolhas de alumínio de gel de
sílica GF
254
Merck
®
. A visualização e análise dos cromatogramas foram efetuadas
através da utilização de luz ultravioleta (= 254 e 366 nm) e revelação através da
nebulização com reagentes cromogênicos, tais como anisaldeído sulfúrico (produtos
apolares) e reagente natural (produtos polares), com posterior aquecimento a 100
o
C,
até o desenvolvimento máximo de coloração.
Para análise cromatográfica das frações n-hexânica, diclorometânica e
metanólica, foram utilizados eluentes variando entre diclorometano: n-hexano (50:50-
60:40); diclorometano 100% e diclorometano:metanol (90:10-80:20) ou acetato de
etila:metanol:água 100:13,5:10), respectivamente.
2.4.4 Isolamento e purificação
Para o isolamento das substâncias foram realizados sucessivos processos
cromatográficos preparativos, sendo utilizado primeiramente coluna cromatográfica para
o fracionamento do extrato. As frações que continham produtos de interesse foram
reunidas e submetidas à CCD, para sua purificação.
Para a preparação de colunas cromatográficas foram utilizados como
adsorvente gel de sílica 60 Merck
®
, com tamanho de partícula de 63-200 μm (70-230
mesh).
Na cromatografia em camada delgada utilizou-se placas de vidro 20 x 20 cm,
preparadas no laboratório com auxílio de conjunto Desaga
®
, tendo como adsorvente gel
de sílica GF
254
Merck
®
, em espessura de 0,50 mm.
Para fracionamento através de coluna cromatográfica das frações n-hexânica e
metanólica das raízes de H. ternum foram utilizados gradientes entre n-hexano:
diclorometano e acetato de etila: metanol, respectivamente, como eluente.
24
Da mesma forma, para fracionamento da porção acetato de etila das partes
aéreas, foi utilizado como eluente um gradiente entre acetato de etila:metanol.
A análise das frações resultantes deste processo e dos produtos purificados foi
efetuada por CCD analítica da mesma forma descrita no item 2.4.3.
2.4.5 Identificação dos produtos
Na identificação e elucidação estrutural das substâncias isoladas foram
utilizados métodos espectroscópicos (espectroscopia na região do ultravioleta e
ressonância magnética nuclear de hidrogênio -RMN
1
H- e de carbono -RMN
13
C-).
Os espectros na região do UV foram obtidos em espectrofotômetro Hewlett
Packard
®
UV-VIS, modelo HP 8452-A, com varredura de diodos em série entre 200 e
400 nm. Essa análise foi realizada na Central Analítica da Faculdade de Farmácia da
UFRGS, em equipamento gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Pedro Ros Petrovick.
Os espectros de RMN de
1
H (400 ou 500 MHz) e de RMN de
13
C (100 ou 125
MHz) foram obtidos em espectrômetro Jeol
®
Eclipse 400 e Bruker
®
Avance 500,
respectivamente, através da colaboração com os professores Prof. Dr. Dominique
Guillaume da Faculté de Pharmacie de Amiens (França) e Prof. Dr. Jan Schripsema da
Universidade Estadual do Norte Fluminense (Rio de Janeiro).
Os espectros utilizados na elucidação estrutural dos compostos estão
apresentados em anexo (Anexo II, página 251).
25
2.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.5.1 Análise da constituição química de Hypericum ternum e de Hypericum
myrianthum
A determinação do perfil químico de uma determinada espécie vegetal fornece
informações importantes que podem ser fundamentais para a explicação do
comportamento ecológico do vegetal, e também de suas atividades biológicas. Visando
caracterizar os metabólitos secundários produzidos por H. ternum e H. myrianthum,
uma avaliação preliminar foi realizada através de cromatografia em camada delgada,
seguindo-se posteriormente com o isolamento de compostos fenólicos majoritários.
2.5.1.1 Análise cromatográfica qualitativa das frações de Hypericum ternum
2.5.1.1.1 Partes aéreas
Nas frações n-hexânica e diclorometânica, não foi possível visualizar a
presença de compostos fenólicos majoritários. Mesmo com a eliminação do material
ceroso presente nessas frações, através de processamento com acetona, pôde-se
observar no perfil cromatográfico a presença de grande quantidade de clorofilas e um
acúmulo de terpenóides, assinalados pela reação de coloração (rósea) típica frente ao
agente cromogênico anisaldeído sulfúrico. O perfil químico dessa planta diferencia-se,
então, daquele de outras espécies do gênero, uma vez que das frações n-hexânica e
diclorometânica muitos compostos fenólicos de interesse biológico foram isolados
(R
OCHA et al., 1994; ROCHA et al., 1995; ROCHA et al., 1996; FERRAZ et al., 2001; FERRAZ
et al., 2002a; N
ÖR et al., 2004).
Devido às dificuldades enfrentadas na tentativa de isolamento de substâncias a
partir dos extratos apolares das partes aéreas, buscou-se uma alternativa que
permitisse a obtenção de outras substâncias fenólicas dessa planta. Para tal, a fração
metanólica, foi solubilizada em água e posteriormente particionada com acetato de etila.
26
A observação do comportamento cromatográfico da fração acetato de etila mostrou
uma predominância de compostos fenólicos, que, juntamente com o grande rendimento
dessa fração em relação às demais, indica uma maior prevalência de compostos
fenólicos mais polares nessa planta. Na análise do perfil cromatográfico da fração
acetato de etila pode-se visualizar a presença de substâncias majoritárias com
características de flavonóides (coloração amarelo-esverdeada, após revelação com o
agente cromogênico anisaldeído sulfúrico). Posteriormente, essa fração foi, então,
submetida a técnicas cromatográficas visando o isolamento de substâncias.
2.5.1.1.2 Raízes
Na análise do perfil cromatográfico da fração n-hexânica observou-se a
presença de uma substância majoritária, apresentando comportamento semelhante ao
de derivados de floroglucinol, através do desenvolvimento de coloração marrom
avermelhada, quando revelada com o agente cromogênico anisaldeído sulfúrico,
seguido de aquecimento. Da mesma forma, no perfil cromatográfico da fração
metanólica evidenciou-se a presença de substâncias fenólicas, através da coloração
laranja formada pela reação com anisaldeído sulfúrico. Em função disso, essas duas
frações foram submetidas a cromatografias preparativas visando o isolamento de
substâncias.
2.5.1.2 Isolamento de compostos fenólicos de Hypericum ternum
Através de técnicas de cromatografia em coluna e cromatografia em camada
delgada preparativa foi possível o isolamento e purificação de 9 produtos, sendo HT1,
HT2, HT3, HT4, HT5, HT6 e HT7 provenientes da fração acetato de etila das partes
aéreas e HTR1 da fração n-hexânica das raízes. A substância HTR2 foi isolada da
fração metanólica das raízes, porém a purificação não promoveu quantidades
adequadas para a análise estrutural.
Dentre as substâncias isoladas da fração acetato de etila das partes aéreas
27
HT1, HT2, HT3 e HT4 foram purificadas por CCD preparativa de sílica gel, utilizando-se
como eluente CH
2
Cl
2
:MeOH (90:10), enquanto HT5, HT6 e HT7 foram obtidos
diretamente da coluna cromatográfica, em satisfatório grau de pureza, com misturas de
polaridade crescente de acetato de etila e metanol como eluente.
HTR1 e HTR2 foram purificadas por CCD preparativa de sílica gel, utilizando-se
como eluente diclorometano:n-hexano (60:40) e acetato de etila:n-hexano (80:20),
respectivamente.
2.5.1.3 Análise estrutural das substâncias isoladas
Através de dados espectroscópicos, comparados com os disponíveis na
literatura, foi possível a identificação das estruturas de HT1, HT2, HT3, HT4, HT5, HT6,
HT7 e HTR1, descritas a seguir. Os dados obtidos a partir dos espectros de UV, RMN
1
H
e de RMN
13
C estão apresentados em anexo (Anexo III, página 285) nas tabelas 1.1a,
1.1b, 1.1c, 1.1d, 1.1e, 1.1f, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.7 e 1.8.
2.5.1.3.1 Substância HT1
A interpretação dos espectros no UV da substância HT1 (tabela 1.1a) propõe a
estrutura de um flavonol tri-hidroxilado nas posições C5, C3’ e C4’, apresentando
também duas hidroxilas ocupadas nas posições C3 e C7. A primeira (C3) é evidenciada
pela posição da banda I (358 nm) do espectro de UV em metanol e pela estabilidade da
intensidade de absorção da banda I na presença de NaOH, e a segunda (C7) é
demonstrada pelo pequeno deslocamento batocrômico da banda II e presença de um
ombro em 420 nm no espectro de NaOAc.
Flavonóis contendo um grupamento 3-OH metilado ou glicosilado apresentam
um deslocamento hipsocrômico de 12 a 17 nm da banda I, em relação à mesma banda
do flavonol correspondente não metilado (no caso específico a quercetina, cujo
máxMeOH
=370), sendo a banda II não afetada de modo apreciável. Da mesma forma,
28
flavonóis que possuem 4’-OH livre e não possuem 3-OH ou 7-OH livres usualmente
apresentam um pronunciado ombro no lado de mais longo da banda I, na presença de
NaOAc (M
ABRY et al., 1970). O espectro metanólico aponta uma estrutura flavônica com
anel B orto di-hidroxilado tipicamente nas posições C3’ e C4’. Nesses casos, a banda II
apresenta um máximo de absorção entre 250 e 265 nm (banda II b), seguida de um
ombro entre 265-270 (banda II a) (V
OIRIN, 1983). Esse padrão de hidroxilação no anel B
foi confirmado pela adição de ácido bórico à solução metanólica na presença de acetato
de sódio, o que promoveu um deslocamento batocrômico de 20 nm da banda I, bem
como pelo desvio hipsocrômico da mesma banda, após adição de HCl, em relação ao
espectro AlCl
3
, resultante da decomposição do complexo ácido-lábil de cloreto de
alumínio formado com o grupo o-di-OH (M
ARKHAM, 1982). O deslocamento batocrômico
remanescente relativo ao espectro MeOH, com a adição de ácido à solução metanólica
já contendo AlCl
3
, foi indicativo da presença de 5-OH livre, uma vez que o complexo
formado entre AlCl
3
e as funções 4-ceto e 5-OH (e/ou 3-OH) é estável na presença de
ácido (M
ABRY et al., 1970).
Analisando-se o espectro de RMN de
13
C (tabela 1.2) verifica-se a presença de
17 sinais, podendo-se sugerir, pelo valor dos deslocamentos característicos, a presença
de um núcleo flavônico oxigenado nas posições C3, C4, C5, C7, C3’ e C4’, sendo as
posições C3 e C7 substituídas por grupamentos metoxila. Isso é evidenciado pelos
sinais em
H
3,82 e
H
3,89 ppm no espectro de RMN de
1
H (tabela 1.3), ambos
singletos correspondentes a 3H cada, e também pelos sinais em
C
60,5 e 56,7 ppm.
A partir dos resultados obtidos através das análises espectroscópicas, conclui-
se que a substância HT1 é o flavonóide 3,7-dimetil-quercetina (23), cujos dados
espectroscópicos estão de acordo com os relatados na literatura (M
ABRY et al., 1970;
J
AY et al., 1975; AGRAWAL et al., 1989; BOUKTAIB et al., 2002).
29
(23)
2.5.1.3.2 Substância HT2
Através da análise dos dados espectrais de ultravioleta da substância HT2
(tabela 1.1b), verifica-se que a mesma difere da substância HT1 apenas pela presença
de uma hidroxila livre em C7. Isso é evidenciado pelo deslocamento batocrômico de 18
nm da banda II, bem como pela ausência de um ombro no lado de mais longo da
banda I, após a adição de NaOAc na solução metanólica em análise
(MABRY et al.,
1970; W
OLLENWEBER, 1982). Confirma-se também mediante o aparecimento de um
ombro em 327 nm, na presença de NaOH, o que é indicativo de um grupamento
hidroxila livre nessa posição
(MARKHAM, 1982).
O espectro de RMN de
13
C (tabela 1.2) mostra 16 sinais, podendo-se sugerir,
pelo valor dos deslocamentos característicos, a presença de um núcleo flavônico
oxigenado nas posições C3, C4, C5, C7, C3’ e C4’, sendo a posição C3 substituída por
um grupamento metoxila. Isso é evidenciado pelo singleto correspondente a 3H em
H
3,98 ppm no espectro de RMN de
1
H (tabela 1.3), e também pelo sinal em
C
60,5 ppm
no espectro de RMN de
13
C.
A interpretação dos espectros de HT2 conduz à estrutura do flavonóide 3-metil-
quercetina (24), estando de acordo com os dados espectroscópicos descritos para essa
substância na literatura (N
AIR et al., 1978; VOIRIN, 1983; AGRAWAL et al., 1989).
O
OCH
3
OH
CH
3
O
OH O
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
30
(24)
2.5.1.3.3 Substância HT3
A interpretação dos espectros no UV da substância HT3 (tabela 1.1c) propõe a
estrutura de uma flavona, evidenciada através do espectro em metanol, cuja banda I
apresenta absorção máxima em 326 nm, sendo característica desse tipo de composto
(banda I entre 304-350 nm)
(MABRY et al., 1970).
Verifica-se ainda uma substituição 4’-OH no anel B, sugerida no espectro em
metanol através da presença de um único pico de absorção na banda II (270 nm) e
confirmada com a adição de NaOH à solução metanólica, o que promoveu um grande
deslocamento batocrômico da banda I (∆= 60 nm) no espectro de metanol, sem
diminuição na intensidade do pico de absorção.
Evidencia-se ainda a presença de hidroxila livre em C7, através do
deslocamento batocrômico de 8 nm da banda II, após a adição de NaOAc na solução
metanólica em análise
(MABRY et al., 1970; WOLLENWEBER, 1982). Confirma-se também
mediante o aparecimento de um ombro em 327 nm, na presença de NaOH, o que é
indicativo de um grupamento hidroxila livre nessa posição
(MARKHAM, 1982).
A ausência de um padrão de hidroxilação o-di-OH no anel B foi confirmada pela
adição de ácido bórico à solução metanólica na presença de acetato de sódio, o que
manteve o mesmo
máx
de absorção da banda I, em relação ao espectro MeOH (MABRY
O
OCH
3
OH
HO
OH O
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
31
et al., 1970; MARKHAM, 1982). Essa característica foi evidenciada ainda através do
espectro de AlCl
3
/HCl, onde observou-se a manutenção do deslocamento batocrômico
de 34 nm em relação ao espectro de metanol, indicando a ausência do complexo ácido-
lábil de cloreto de alumínio formado com grupos o-di-OH (M
ARKHAM, 1982).
Esse deslocamento batocrômico relativo ao espectro MeOH, com a adição de
ácido à solução metanólica já contendo AlCl
3
, foi indicativo da presença de 5-OH livre,
uma vez que o complexo formado entre AlCl
3
e as funções 4-ceto e 5-OH é estável na
presença de ácido. Verifica-se ainda o aparecimento de ombros nas bandas I e II no
espectro AlCl
3
/HCl, típicos de flavonas 5-hidroxiladas (MABRY et al., 1970).
Analisando-se o espectro de RMN de
13
C (tabela 1.4) verifica-se a presença de
24 sinais, sendo 8 sinais de (CH) e 16 (Cq) dos quais dois têm deslocamento químico
característico de carbonilas (
C
183,9 e 182,8 ppm). Pelo valor dos deslocamentos,
pode-se sugerir, a presença de um núcleo flavônico na forma dimérica oxigenado nas
posições C4, C5, C7 e C4’ em ambos os monômeros.
Observa-se ainda a presença de um sinal referente a 3 átomos de C e 4 sinais
referentes à dois átomos de C, o que completa o total de 30 carbonos, característico de
um dímero flavônico. Esses sinais sobrepostos são correspondentes aos pares de C-
2’/6’ e C-3’/5’ do anel B (em ambos os monômeros) que apresenta apenas uma
hidroxila em posição para em relação ao anel C, caracterizando a equivalência dos
deslocamentos químicos destes sinais, tanto no espectro de
13
C quanto no de
1
H.
A presença de quatro sinais no espectro de
1
H (tabela 1.4) com deslocamentos
químicos de
H
6,63; 7,32; 6,76 e 7,53 ppm (cada um correspondente a 2H, d, J =8,8
Hz), foram atribuídos aos H-2’/6’ e H-3’/5’ (monômeros I e II, respectivamente),
caracterizando a presença de um padrão de substituição p-OH em ambos os anéis B.
O dubleto em
H
6,47 ppm (J=1,8) correspondente à posição 8 demonstra a
presença de apenas um H meta acoplado, o que indica que a ligação entre os dímeros
32
de flavona ocorre nesta posição do monômero II, que apresenta um carbono
quaternário nesta posição (
C
101,2 ppm).
O espectro de HMBC foi importante na avaliação das correlações existentes
para atribuir os sinais referentes a cada monômero, bem como para avaliar a posição
da ligação entre os mesmos. Evidenciou-se as seguintes correlações entre
1
H e
13
C:
H/
C
7,53-129,1; 163,1 e 165,9 ppm -
H/
C
7,32-131,0; 161,3 e 165,9 ppm -
H/
C
6,76-
117,0; 123,2 e 163,1 ppm -
H/
C
6,63-116,1; 125,5 e 161,3 ppm -
H/
C
6,52-105,2;
123,2 e 165,9 e 182,8 ppm -
H/
C
6,47-100,4; 104,6; 159,6 e 167,2 ppm -
H/
C
6,26-
95,1; 101,2; 104,6; 105,2; 161,3; 162,8; 165,9 e 167,2 ppm.
A partir dos resultados obtidos através das análises espectroscópicas, conclui-
se que a substância HT3 é o biflavonóide I3,II8-biapigenina (25), cujos dados
espectroscópicos estão de acordo com os relatados na literatura (B
ERGHÖFER & HÖLZL,
1987; A
GRAWAL & BANSAL, 1989a; HANSEN et al., 1999).
OH
HO
HO
OH
O
O
O
O
OH
OH
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2''
3''
4''
5''
6' '
7' '
8' '
9''
10''
1'''
2'''
3'''
4' ''
5'''
6'''
(25)
2.5.1.3.4 Substância HT4
A substância HT4 foi isolada como um sólido marrom escuro. O espectro de
RMN de
1
H (tabela 1.5) sugere a presença de uma unidade derivada do ácido caféico
devido aos sinais dos grupos de hidrogênios olefínicos trans em
H
7,37 e 6,07 ppm
33
(com constantes de acoplamento J=16,1 e J=15,8 respectivamente), e dos sinais
correspondentes aos hidrogênios aromáticos em
H
7,01, 6,93 e 6,73 ppm. Os sinais
para três hidrogênios metínicos em
H
5,01, 3,88 e 3,61 ppm e para hidrogênios
metilênicos, na faixa de
H
1,93 a 2,12 ppm sugerem a presença de uma unidade
derivada do ácido quínico. Além disso, é possível evidenciar a presença de um
grupamento metoxila, devido ao sinal intenso observado em
H
3,58 ppm integrando em
três prótons. O espectro de HMBC demonstra a correlação entre os sinais
H
3,58 e
C
173,6 ppm, o que sugere a esterificação do ácido quínico por um grupamento metila.
A confirmação do grupo cafeoíl e do esqueleto do ácido metoxiquínico foi
baseada nos espectros de RMN de
13
C (tabela 1.5), especialmente pelos sinais
referentes ao grupamento carbonila da unidade cafeoíl em
C
165,4 ppm e ao
grupamento carboxila em
C
173,6 ppm, bem como ao sinal em
C
51,8 ppm,
correspondente à metoxila. Além disso, observa-se a presença de dois carbonos
metilênicos em
C
37,2 e 35,1 ppm e do carbono tetrassubstituído em
C
73,0 ppm. Os
dados de deslocamento químico da unidade metoxiquínica foram comparados e estão
de acordo com valores disponíveis na literatura (S
ADHU et al., 2006).
Na literatura, os valores das constantes de acoplamento entre os hidrogênios
da unidade ácido quínico, bem como as correlações a longa distância entre carbono e
hidrogênio, podem fornecer informações importantes em relação à posição da unidade
cafeoíl (P
AULI et al., 1998). Na elucidação desta estrutura foram encontradas
dificuldades em relação a essas informações, devido à baixa resolução do espectro e à
sobreposição dos sinais. Deste modo, sugere-se para HT4 a estrutura do ácido 5-O-
cafeoil-1-metoxi-quínico (26).
34
H
3
COOC
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
(26)
2.5.1.3.5 Substâncias HT5, HT6 e HT7
Através da análise dos dados espectrais de ultravioleta das substâncias HT5,
HT6 e HT7 (tabelas 1.1d, 1.1e e 1.1f), verifica-se que todas apresentam o mesmo
comportamento da substância HT2, quando submetidas ao tratamento com os
reagentes de deslocamento, apresentando, portanto, o mesmo padrão de substituição
do flavonóide 3-metil-quercetina.
No entanto, através dos dados espectrocópicos de RMN de
13
C e
1
H
(tabelas
1.2 e 1.3), é possível constatar que o grupamento metoxila não mais existe nessas
substâncias, sendo a hidroxila do C3 substituída por açúcares.
Em função de que os deslocamentos químicos dos carbonos de açúcares
ocorrem bem claros em relação ao dos carbonos do núcleo de um flavonóide, o
espectro de RMN de
13
C é utilizado para avaliação do açúcar ligado a um flavonóide
glicosilado (M
ARKHAM & MOHAN CHARI, 1982). Os dados de RMN de
13
C são de grande
importância no estabelecimento da natureza e posição do açúcar ligado, do tipo de
ligação, e até mesmo da configuração e conformação do açúcar (H
ARBORNE & WILLIAMS,
1982).
Para HT5 verifica-se no espectro de RMN de
13
C a presença de 20 sinais,
sendo 15 correspondentes ao núcleo flavônico e 5 relativos a ose ligada na posição 3,
conseqüentemente identificada como uma pentose (
C
104,7; 74,2; 72,9; 69,1; 66,9
35
ppm). Por comparação com os dados disponíveis na literatura verifica-se que se trata
de arabinose, na forma pirano (M
ARKHAM & MOHAN CHARI, 1982; MARKHAM, 1982;
A
GRAWAL & BANSAL, 1989b).
Para HT6 e HT7 observa-se pelos dados espectrais de
13
C além dos 15 sinais
relacionados com os carbonos da estrutura básica de um flavonóide, 6 sinais referentes
às hexoses substituintes do hidrogênio do grupamento -OH da posição 3 do flavonol (
C
104,5; 78,4; 78,1; 75,7; 71,2; 62,6 ppm e
C
105,4; 77,2; 75,1; 73,2; 70,0; 62,0 ppm).
Através de comparação com dados da literatura (M
ARKHAM & MOHAN CHARI, 1982;
M
ARKHAM, 1982; AGRAWAL & BANSAL, 1989b) concluiu-se tratar de glicose e galactose,
respectivamente, ambas em sua forma piranosídeo.
Com os dados do espectro de RMN de
1
H foi possível determinar a natureza da
ligação das oses na posição 3 dos flavonóis, através da constante de acoplamento do
H1’ (anomérico) (tabela 1.6), bem como confirmar a forma piranosídeo em todos os
açúcares em questão (M
ARKHAM et al., 1989).
HT5, HT6 e HT7 apresentam, nos respectivos espectros de
1
H, dubletos em
H
5,16; 5,28 e 5,18 ppm, referentes ao H1’ anomérico com constantes de acoplamento (J)
de 6,5; 7,7 e 7,4 Hz. Conseqüentemente, HT5, HT6 e HT7 são substituídas na posição
3 pelas oses
-L-arabinopiranosídeo,
-D-glicopiranosídeo e
-D-galactopiranosídeo,
respectivamente.
Tabela 1.6: Constantes de acoplamento do H1’ anomérico.
Constante de acoplamento (J)
Açúcar
-D
-D
piranosídeos 7-8 Hz 3-4 Hz glicose, galactose
furanosídeos 0-2 Hz 4-4,5 Hz
-L
-L
arabinose piranosídeo 2,5 Hz 8 Hz
furanosídeo 4 Hz 1Hz
36
Esses resultados indicam para HT5 a estrutura de guaijaverina (27), sendo os
dados espectroscópicos dessa amostra de acordo com os descritos na literatura para
essa substância (A
GRAWAL & BANSAL 1989b; FRAISSE et al., 2000).
A partir dos resultados obtidos através das análises espectroscópicas, conclui-
se que a substância HT6 é o flavonóide glicosilado isoquercitrina (28), cujos dados
espectroscópicos coincidem com os relatados na literatura (A
GRAWAL & BANSAL 1989b;
K
AZUMA et al., 2003).
Da mesma forma, a interpretação dos espectros de HT7 conduz à estrutura do
flavonóide glicosilado hiperosídeo (29) estando de acordo com os dados
espectroscópicos descritos para essa substância na literatura (A
GRAWAL & BANSAL
1989b; D
INI et al., 2004).
(27) R=
-L-arabinopiranosil
(28) R= β-D-glicopiranosil
(29) R= β-D-galactopiranosil
2.5.1.3.6 Substância HTR1
A avaliação dos espectros de RMN de
1
H e
13
C obtidos para o produto
codificado HTR1 revelou a presença de uma mistura de dois compostos majoritários,
em proporção de aproximadamente 1:1,3. Com os dados disponíveis foi possível a
elucidação de apenas uma das moléculas desta mistura.
Através dos dados de RMN de
1
H (tabela 1.7) verifica-se a presença de quatro
grupos de sinais. O primeiro grupo ocorre em campo alto onde os sinais de
H
1,20 e
1,21 ppm, ambos dubletos (J=6,7), correspondem aos hidrogênios dos grupamentos -
CH
3
das posições 9 e 12’; e os sinais
H
1,48 e 1,49 ppm (correspondentes à 12H e 6H,
O
OR
OH
HO
OH O
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
37
respectivamente) referem-se aos hidrogênios das metilas ligadas a C4 e C2’.
O segundo grupo, é composto por sinais com deslocamento químico de
H
3,51, 3,84-3,95 e 4,15-4,26 ppm, referentes a um singleto alargado e dois multipletos,
respectivamente, referentes aos hidrogênios da ponte metilênica; e aos hidrogênios das
posições 9 e 12’.
A presença de um grupamento vinílico é evidenciada pela ocorrência do par de
dubletos em
H
5,44 e 6,70 ppm. No quarto grupo de sinais do espectro verifica-se o
deslocamento de quatro sinais intensos em campo baixo (
H
10,01; 11,50; 16,22 e
18,76 ppm) que se referem às hidroxilas.
O sinal encontrado em campo muito baixo (
H
18,76 ppm) no espectro de RMN
de
1
H, refere-se ao sistema enolizável formado pela hidroxila de C5 e a carbonila da
posição C8, característico de floroglucinóis conjugados com unidades de ácido filicínico
(J
AYASURIYA et al., 1989, ISHIGURO et al., 1994; YAMAKI et al., 1994; ROCHA et al., 1995).
Um anel dimetilbenzopirano na molécula é indicado, no espectro de RMN de
1
H, pela presença de um par de dubletos em
H
5,38 e 6,64 ppm com J=10, 35 e 9,75
Hz (atribuídos aos hidrogênios vínilicos) e um singleto referente a duas metilas (
H
1,48
ppm). Outro sinal característico de dimetilbenzopiranos é verificado em
C
78,2 ppm no
espectro de RMN
de
13
C e refere-se ao carbono quaternário do anel pirano ligado a um
grupamento dimetila geminal (J
AYASURIYA et al.,1989; ROCHA et al., 1996).
Analisando os dados do espectro de RMN de
13
C (tabela 1.8) pode-se sugerir,
pelo valor dos deslocamentos característicos de carbonos aromáticos oxigenados (
C
155,4; 159,4 e 162,2 ppm) e (
C
171,6; 187,3 e 199,4 ppm), a presença de dois núcleos
com padrão de substituição de floroglucinol e ácido filicínico, respectivamente. O sinal
característico do núcleo dimetilbenzopirano é verificado em
C
78,1 ppm e refere-se ao
carbono quaternário do anel pirano ligado a um grupo dimetila geminal.
38
A posição das metilas geminais em C4 na porção ácido filicínico é confirmada
pelo deslocamento químico característico em
C
44,3 ppm. Quando nesta posição
encontram-se ligados grupamentos prenila, como nas substâncias drumondina D e
hiperbrasilol B, esse valor desloca-se para
C
49 ppm (JAYASURIYA et al.,1991; ROCHA et
al., 1996).
De acordo com estruturas similares relatadas na literatura, pode-se supor que o
sinal em
C
16,1 ppm, refere-se ao C7 da ponte metilênica ligando o ácido filicínico ao
grupo benzopirano (R
OCHA et al., 1995; ROCHA et al., 1996).
Através da análise do espectro de RMN de
13
C (APT) propõe-se para HTR1
uma estrutura constituída por 8 (CH
3
), 1 (CH
2
), 4 (CH) e 15 (Cq) dos quais, três
apresentam deslocamento químico característico de carbonilas (
C
199,4; 210,8 e
211,2 ppm) referentes a C1, C8 e C11’, nesta ordem.
Importantes correlações extraídas do espectro de HMBC foram fundamentais
para a determinação da posição dos substituintes de HTR1, bem como para avaliar
quais sinais desta mistura de compostos eram referentes à esta substância. Dentre
essas correlações:
H/
C
1,20;1,21/19,4; 39,0; 36,6 e 210 - 1,48/24,3; 27,9; 44,3; 78,2 e
124,6 - 1,49/25,9; 44,3; 171,6 e 199,4 - 3,51/107,1; 111,2; 159,4; 162,2 e 171,6 - 3,84 a
3,95/19,4 e 211,2; 4,15 a 4,26/ 19,4 - 5,44/27,9; 78,2; 103,5; 117,3 - 6,71/78,2; 124, 6;
155,4 e 159,4 - 10,01/44,3; 111,2 e 171,3 - 11,50/103,5; 107,1 e 159,4 - 16,22/103,5;
107,1 e 162,2 - 18,76/44,3; 107,6, 199,4 e 210,8 ppm.
A determinação da orientação da ciclização do anel pirano foi proposta a partir
do espectro de correlação a longa distância, HMBC, na qual se verificam os
acoplamentos entre o hidrogênio da hidroxila
H
11,50 ppm em C5’ com os
deslocamentos em
C
159,4 e 103,5 ppm, além das correlações dos hidrogênios da
ponte metilênica (
H
3,51 ppm) com os carbonos em
C
107,1; 111,2; 159,4 e 162,2.
Os demais deslocamentos químicos obtidos dos espectros de RMN de
1
H e
13
C
39
para HTR1 foram comparados com aqueles de substâncias estruturalmente
semelhantes como drumondina C, isouliginosina B e hiperbrasilol B (tabelas 1.7 e 1.8).
Em função dos dados apresentados, o produto HTR1 foi identificado como
uliginosina B (30).
(30)
Das partes aéreas de H. ternum foram isoladas, a partir da fração acetato de
etila, 7 substâncias sendo 6 delas identificadas como flavonóides derivados da
quercetina. Dentre essas, as agliconas livres 3-metil-quercetina e 3,7-dimetil-quercetina
não haviam sido anteriormente encontradas no gênero Hypericum, sendo relatadas
para plantas de famílias variadas.
Foi identicado ainda um derivado dimérico de flavona, I3,II8-biapigenina,
biflavonóide descrito em algumas espécies do gênero, tais como Hypericum perforatum
(B
ERGHÖFER & HÖLZL, 1986; BROLIS et al., 1998; HANSEN et al., 1999, TEKEL’OVÁ et al.,
2000), H. hyssopifolium (C
AKIR et al., 2003), H. triquetrifolium (COULADIS et al., 2002) e
H. calycinum (G
RONQUIST et al., 2001).
As outras três substâncias isoladas foram identificadas como sendo os
glicosídeos isoquercitrina e hiperosídeo (também conhecido por hiperina), comumente
encontrados em espécies de Hypericum (R
OCHA et al., 1995; COFORTI et al., 2002;
C
AKIR et al., 2003; CROCKETT et al., 2005) e guaijaverina, relatada apenas para H.
brasiliensis (R
OCHA et al., 1995) e H. perforatum (JURGENLIEMK & NAHRSTEDT, 2002). A
presença de hiperosídeo e isoquercitrina já havia sido caracterizada nessa espécie por
12'
9
11'
10'
9'
8'
7'
6'
5'4'
3'
2'
8
7
6
5
4
3
2
1
HOOH
O
O
OH
O
OH
O
40
cromatografia em camada delgada por DALL´AGNOL e colaboradores (2003).
Considerando ainda as partes aéreas desta planta, foi isolado, a partir da
fração acetato de etila, um derivado de ácido caféico, cujos dados sugerem a estrutura
do ácido 5-O-cafeoil-1-metoxiquínico. A ocorrência de ácidos fenólicos, principalmente
ésteres do ácido caféico é relatada para espécies do gênero Hypericum (S
EABRA &
ALVES, 1989; COULADIS et al., 2002; DALL’AGNOL et al., 2003; SILVA et al., 2005a).
Da fração apolar das raízes de H. ternum obteve-se o floroglucinol uliginosina B.
Este composto, encontrado apenas nas raízes dessa planta, foi previamente isolado das
partes aéreas de outras espécies de Hypericum, sendo todas pertencentes à seção
Trigynobrathys. Em contraste com os dados de N
AHRSTEDT e BUTTERWECK (1997), que
afirmaram que acilfloroglucinóis ocorrem exclusivamente nas partes reprodutivas das
plantas, muitos trabalhos demonstram esse tipo de substância nas partes aéreas e, como
aqui demonstrado, também presente nas raízes. Da mesma maneira, isouliginosina B foi
detectada nas raízes de H. brasiliense (A
BREU et al., 2004)
Uliginosina B foi primeiramente isolada a partir de H. uliginosum HBK (nome
válido H. thesiifolium HBK) (P
ARKER & JOHNSON, 1968; TAYLOR & BROOKER, 1969),
sendo encontrada também nas espécies nativas do Rio Grande do Sul H. myrianthum
(F
ERRAZ et al., 2002a), H. polyanthemum e H. carinatum (NÖR et al., 2004).
No gênero Hypericum, muitos floroglucinóis como os derivados
poliisoprenilados hiperforina e ad-hiperforina vêm sendo isolados. Estes parecem ter
importância taxonômica, pois essas substâncias são freqüentemente encontradas em
Hypericum além de espécies pertencentes a outros gêneros de Guttiferae, como Clusia
e Garcinia.
Por outro lado, derivados de floroglucinol conjugados ao ácido filicínico também
têm sido descritos para espécies de Hypericum, apresentando, porém, pequena
dispersão neste gênero. Sua ocorrência tem sido relatada para espécies das seções
41
Brathys (H. drumommdii) (JAYASURIYA et al., 1989; JAYASURIYA et al., 1991) e
Trigynobrathys, como H. uliginosum (P
ARKER & JOHNSON, 1968; TAYLOR & BROOKER,
1969), H. japonicum (I
SHIGURO et al., 1986; ISHIGURO et al., 1987), H. brasiliense (ROCHA
et al., 1995, R
OCHA et al., 1996), H. myrianthum (FERRAZ et al., 2002a), H.
polyanthemum e H. carinatum (N
ÖR et al., 2004), o que permite supor uma íntima
proximidade filogenética entre estas seções.
Devido ao fato de que todos os dímeros de floroglucinóis relatados para o
gênero Hypericum ocorrem apenas em espécies classificadas nestas duas seções, a
distribuição deste tipo de floroglucinol vem apontando para a possibilidade de se utilizar
estas substâncias como marcadores taxonômicos das seções Brathys e Triginobrathys
(N
ÖR, 2006).
2.5.1.4 Análise cromatográfica qualitativa das frações de Hypericum myrianthum
2.5.1.4.1 Partes aéreas
No cromatograma da fração n-hexânica foi possível verificar a presença de
duas bandas majoritárias, com o mesmo perfil cromatográfico das substâncias
uliginosina B e japonicina A, previamente isoladas das partes aéreas desta planta
(F
ERRAZ et al., 2002b; DALL’AGNOL et al., 2005). No entanto, observou-se ainda
substâncias minoritárias com características químicas semelhantes a estes dois
derivados diméricos de floroglucinol, quando submetidos à revelação com o reagente
cromogênico anisaldeído sulfúrico (coloração alaranjada). Desta maneira, métodos
cromatográficos preparativos foram aplicados a esta fração visando o isolamento destes
produtos.
A análise cromatográfica da fração metanólica evidenciou uma predominância
de compostos fenólicos, sendo as substâncias majoritárias com características de
flavonóides (coloração amarelo-alaranjada após revelação com o agente cromogênico
anisaldeído sulfúrico e fluorescente quando reveladas com reagente natural). Após esse
42
processo, este extrato foi submetido à cromatografia em coluna objetivando o
isolamento destas substâncias.
2.5.1.4.2 Raízes
O cromatograma da fração n-hexânica das raízes mostrou a presença de
compostos fenólicos com o comportamento cromatográfico característico de derivados
de floroglucinol. Verificou-se um padrão de produção nas raízes desta planta diferente
do encontrado para as partes aéreas, com predomínio de um composto, e outros
produtos minoritários. Em função disso, esta fração foi submetida à coluna
cromatográfica visando o isolamento destas substâncias.
2.5.1.5 Isolamento de compostos fenólicos de Hypericum myrianthum
Através de técnicas de cromatografia em coluna e cromatografia em camada
delgada preparativa foi possível o isolamento e purificação de 4 substâncias desta
espécie, sendo HM1 e HM2 obtidos da fração metanólica das partes aéreas e HMR1 e
HMR2, da fração apolar das raízes.
Da fração n-hexânica das partes aéreas foi isolado um derivado de
floroglucinol, em conjunto com as duas substâncias majoritárias uliginosina B e
japonicina A, previamente relatadas para esta espécie. No entanto, devido às
dificuldades de purificação deste composto, os espectros de RMN de
1
H e de
13
C não
apresentaram resolução suficiente para possibilitar a elucidação de sua estrutura.
2.5.1.6 Análise estrutural das substâncias isoladas
Através de dados espectroscópicos, comparados com os disponíveis na
literatura, foi possível a identificação das estruturas de HM1, HM2, HMR1 e HMR2,
descritas a seguir. Os dados obtidos a partir dos espectros de UV, RMN de
1
H e
13
C
estão apresentados em anexo (Anexo III, página 285) nas tabelas 1.1g e 1.9.
43
2.5.1.6.1 Substância HM1
Das primeiras frações da coluna cromatográfica realizada com a fração
metanólica das partes aéreas de H. myrianthum, isolou-se um produto amarelo, o qual
foi denominado de HM1. A caracterização de HM1 foi realizada através de
cromatografia em camada delgada comparativa e cromatografia em camada delgada
bidimensional, frente a diferentes padrões de flavonóides, o que indicou um perfil
cromatográfico semelhante ao da quercetina.
Para a confirmação da estrutura de HM1, foram obtidos espectros no UV
(tabela 1.1g). O espectro desta substância em metanol exibiu dois picos de absorção
majoritários na região de 240-400 nm, os quais se referem à banda I em 356 nm e à
banda II em 254 nm, respectivamente, típicas de flavonóis (M
ABRY et al., 1970;
M
ARKHAM, 1982).
A presença de um ombro próximo ao comprimento de onda mais longo da
banda II (270 nm) indica que as posições 3’ e 4’ do anel B são oxigenadas (M
ABRY,
1970). Esse padrão de hidroxilação no anel B foi confirmado pela adição de ácido
bórico à solução metanólica na presença de acetato de sódio, o que promoveu um
deslocamento batocrômico de 16 nm da banda I (M
ARKHAM, 1982).
O desvio batocrômico de 44 nm da banda I após a adição de NaOH em relação
ao espectro em MeOH, indica a presença de hidroxilas livres nas posições C4’ e C3
(M
ABRY et al., 1970). A hidroxila livre em C3 também pode ser comprovada pelo desvio
batocrômico de 50-60 nm da banda I, típico de 3-hidróxi- flavonas.
A partir dos resultados obtidos através das análises espectroscópicas, das
semelhanças destes com os espectros da quercetina padrão e sabendo-se que
derivados deste flavonol são comuns no gênero Hypericum, sugere-se a substância
HM1 sendo a quercetina (31) (N
AHRSTEDT & BUTTERWECK, 1997; CROCKETT et al., 2005).
44
6'
5'
4'
3'
2'
1'
9
8
7
6
5
4
3
2
1
HO
OH
O
OH
OH O
OH
(31)
2.5.1.6.2 Substância HM2
A substância HM2 caracterizou-se por ser o componente majoritário da fração
metanólica das partes aéreas de H. myrianthum, devido a sua precipitação espontânea
no extrato, sob a forma de grãos friáveis amarelos.
Para a sua purificação, a fração metanólica foi filtrada em funil de Büchner com
papel filtro e lavada com metanol. O precipitado recolhido foi, então, ressuspenso em
metanol e novamente precipitado em temperatura de 4ºC. O produto puro codificado de
HM2, foi analisado por CCD frente a diferentes padrões e detectou-se um perfil
cromatográfico semelhante ao do flavonóide hiperosídeo.
Para a confirmação da estrutura de HM2, foram obtidos espectros de UV desta
substância. O espectro em metanol, bem como aqueles resultantes do tratamento da
amostra com diferentes reagentes de deslocamento demonstraram o mesmo perfil da
substância hiperosídeo, isolada da espécie H. ternum e cuja discussão da elucidação
de sua estrutura encontra-se descrita no item 2.5.1.4.5 deste capítulo.
2.5.1.6.3 Substância HMR1
O composto codificado HMR1 e isolado da fração n-hexânica das raízes de H.
myrianthum mostrou o mesmo perfil cromatográfico e os mesmos sinais de
deslocamento químico nos espectros de RMN de
1
H e de
13
C de uliginosina B, um
45
derivado de floroglucinol ligado a uma molécula de ácido filicínico, também presente
nas partes aéreas desta planta (F
ERRAZ et al., 2002a). Esta substância foi isolada das
raízes de H. ternum, como descrito anteriormente, de modo que a descrição da
elucidação de sua molécula encontram-se apresentadas no item 2.5.1.4.6 deste
capítulo.
2.5.1.6.4 Substância HMR2
O composto HMR2 foi obtido como o constituinte majoritário da fração n-
hexânica das raízes de H. myrianthum. A avaliação dos espectros de RMN de
1
H e
13
C
revelou a presença de uma estrutura dimérica, constituída de duas unidades de ácido
filicínico ligadas através de uma ponte metilênica.
Analisando os dados do espectro de RMN de
13
C (tabela 1.9) pode-se sugerir,
pelo valor dos deslocamentos característicos de carbonos aromáticos oxigenados (
C
173,2; 187,6; 199,8; 210,5 ppm) a presença de dois núcleos com padrão de substituição
de ácido filicínico.
Através dos dados de RMN de
1
H (tabela 1.9) verifica-se a presença de um
sinal em campo muito baixo (
H
18,73 ppm), característico de um sistema enolizável
formado pela hidroxila de C5 e a carbonila da posição C8, comumente presente em
derivados de floroglucinol conjugados (J
AYASURIYA et al., 1989, ISHIGURO et al., 1994;
Y
AMAKI et al., 1994; ROCHA et al., 1995).
O singleto alargado em
H
3,32 ppm indica a presença de uma ponte metilênica
ligando os dois anéis aromáticos, característica dessas estruturas diméricas de
floroglucinol. Analisando-se o espectro de correlação a longa distância verificou-se
acoplamentos entre os hidrogênios correspondentes a esta ponte metilênica e os sinais
em
C
107,0; 110,8; 173,2 e 187,6 ppm, o que sugere uma estrutura dimérica simétrica.
De acordo com estruturas similares relatadas na literatura, pode-se supor que o sinal
em
C
18,1 ppm, refere-se ao C7 da ponte metilênica (ROCHA et al., 1995).
46
As correlações extraídas do espectro de HMBC foram importantes para a
determinação da posição dos substituintes de HMR2. Dentre essas, as de maior
relevância estão aqui listadas:
H/
C
1,16/18,7; 19,3; 36,6; 210,5 - 1,41/25,4; 44,5; 173,2;
199,8 - 1,46/24,3; 44,5; 173,2; 199,8 - 3,31/107,0; 110,8;173,2;187,6 - 4,15/18,7; 19,3.
Em ambos espectros (RMN de
1
H e de
13
C) verifica-se sinais de menor
intensidade correspondentes aos produtos formados devido ao tautomerismo ceto-
enólico
(ROCHA et al.,1995).
A partir dos resultados obtidos com a análise espectroscópica, conclui-se que a
substância HMR2 é o floroglucinol japonicina A (32), cujos dados coincidem com os
relatados na literatura (R
OCHA et al.,1995).
OHHO
O
O
OHHO
O
O
1
2
3
4
6
7
8
9
5
Das partes aéreas de H. myrianthum foram isolados, a partir da fração
metanólica, dois flavonóides, comumente encontrados nas espécies deste gênero
(C
ROCKETT et al., 2005).
Segundo T
EKEL’OVÁ e colaboradores (2000), os flavonóides derivados da
quercetina em H. perforatum estão localizados principalmente nas sépalas e pétalas. H.
myrianthum é caracterizado pelas inflorescências numerosas, o que poderia explicar a
abundância em hiperosídeo nesta espécie.
Da fração apolar das raízes de H. myrianthum foram obtidos os floroglucinóis
uliginosina B e japonicina A, que já haviam sido descritos nas partes aéreas desta
planta (F
ERRAZ et al., 2002a; DALL’AGNOL et al., 2005). Estes dados, mais uma vez
(32)
47
contrariam a afirmação de NAHRSTEDT e BUTTERWECK (1997), de que acilfloroglucinóis
ocorrem exclusivamente nas partes reprodutivas das plantas.
2.6
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no estudo descrito neste capítulo 1 permitem concluir
que:
A análise cromatográfica das frações apolares das partes aéreas de H.
ternum revelou a presença de grande quantidade de clorofilas e um acúmulo de
terpenóides, sem compostos fenólicos majoritários. A observação do comportamento
cromatográfico da fração acetato de etila mostrou uma predominância de compostos
fenólicos, principalmente da classe dos flavonóides.
A partir da fração acetato de etila das partes aéreas de H. ternum, seis
flavonóides derivados da quercetina foram identificados. Destes 3,7-dimetil-quercetina e
3-metil-quercetina e o biflavonóide I3,II8-biapigenina encontram-se na forma de
aglicona livre, enquanto guaijaverina, isoquercitrina e hiperosídeo encontram-se como
glicosídeos. Desta mesma fração foi, ainda, identificado o ácido fenólico denominado
ácido 5-O-cafeoil-1-metoxi-quínico.
Na análise do perfil cromatográfico da fração n-hexânica das raízes desta
espécie, observou-se a presença de uma substância majoritária, apresentando
comportamento semelhante ao de derivados de floroglucinol, identificado como
uliginosina B.
A análise cromatográfica da fração metanólica das partes aéres de H.
myrianthum evidenciou uma predominância de compostos fenólicos, sendo as
substâncias majoritárias com características de flavonóides. Desta fração foram
isolados e identificados os flavonóides quercetina e hiperosídeo.
48
Na fração apolar das raízes de H. myrianthum verificou-se um padrão de
produção diferente do encontrado para as partes aéreas. Foi evidenciada a presença
majoritária de japonicina A, sendo também identificado uliginosina B, ambos derivados
diméricos de floroglucinol.
49
3. C
APÍTULO 2
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE ESPÉCIES DE HYPERICUM
50
51
3.1 INTRODUÇÃO
A produção de radicais livres ocorre continuamente em todas as células vivas,
como conseqüência de numerosos processos fisiológicos e bioquímicos. Durante o
metabolismo celular aeróbio há a geração de produtos secundários (radical ânion
superóxido - O
2

, radical hidroxila -
OH, peróxido de hidrogênio - H
2
O
2
) na ordem de 2
% dos produtos finais (água e gás carbônico). Esses intermediários da redução parcial
do oxigênio são conhecidos como espécies reativas de oxigênio (EROs), que possuem
reatividades químicas marcadamente acentuadas (C
HEESEMAN & SLATER, 1993;
H
ALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001; VALKO et al., 2006).
As células aeróbicas possuem mecanismos de defesa para proteger-se dos
danos causados pelas espécies reativas. Os danos podem ocorrer quando a produção
dessas substâncias excede sua eliminação através dos sistemas antioxidantes de
defesa. Este desequilíbrio entre a produção e a habilidade das células em inativar estas
espécies é chamado estresse oxidativo (H
ALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001; SIES, 2000).
Muitas evidências têm sugerido o envolvimento do estresse oxidativo na
fisiopatologia de várias doenças crônicas, tais como arteriosclerose, câncer, e doenças
neurodegenerativas (C
OOK & SAMMAN, 1996; BILICI et al., 2001; BEAL, 2002; EL SHERBINY
et al., 2003; C
AI et al, 2004; MARIANI et al., 2005; VALKO et al., 2006). Dessa forma, a
utilização de substâncias com capacidade antioxidante pode ser de grande relevância
na prevenção e terapêutica de doenças relacionadas com o aumento do estresse
oxidativo.
Apesar do uso terapêutico de plantas ser tão antigo quanto a própria espécie
humana, o conhecimento de suas propriedades antioxidantes é relativamente recente.
Observa-se nas últimas décadas um enorme crescimento da investigação científica
nessa área, envolvendo o efeito de extratos brutos, de frações purificadas ou de
componentes isolados (D
ESMARCHELIER et al., 1997; ZHENG & WANG, 2001; PAREJO et al.,
2003; S
ILVA et al., 2005b), destacando-se compostos fenólicos que, em muitos estudos,
52
têm demonstrado essa atividade (RICE-EVANS et al., 1997; NG et al., 2000; ŠKERGET et
al., 2005).
Para o gênero Hypericum, fonte abundante de substâncias fenólicas, a
atividade antioxidante de extratos ou substâncias purificadas tem sido recentemente
relatada em muitos publicações (H
UNT et al., 2001; VALENTÃO et al., 2002; HEILMANN et
al.,
2003; ATHANASAS et al., 2004; GAMIOTEA-TURRO et al., 2004; VALENTÃO et al., 2004;
SILVA et al., 2005a).
3.2
OBJETIVOS
Investigar o potencial antioxidante in vitro de extratos brutos metanólicos e
frações enriquecidas (n-hexânica, diclorometânica e metanólica) de quatro espécies de
Hypericum (H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum) nativas
do Rio Grande do Sul, bem como avaliar o teor de substâncias fenólicas totais
presentes nos extratos das espécies estudadas. Dentre as espécies de Hypericum
avaliadas por nosso grupo de pesquisa, estas são as que apresentam melhor potencial
farmacológico, o que motivou a escolha destas para essa etapa do trabalho.
Investigar o potencial antioxidante in vitro de compostos puros (benzopiranos
HP1, HP2 e HP3, benzofenonas carifenona A e carifenona B, derivados de floroglucinol
hiperbrasilol B, japonicina A e uliginosina B, e flavonóides guaijaverina, hiperosídeo,
isoquercitrina e 3-metil quercetina), sendo todas substâncias isoladas das espécies de
Hypericum nativas do Rio Grande do Sul.
3.3
REVISÃO
3.3.1
Mecanismos antioxidantes
Segundo H
ALLIWELL (2001), antioxidantes são substâncias que, quando
presentes em baixas concentrações em relação a substratos oxidáveis (carboidratos,
53
lipídios, ácidos nucléicos ou proteínas), retardam ou previnem de modo significativo a
oxidação dessas moléculas, através da inibição de reações oxidativas em cadeia de
diferentes maneiras.
Dentre as defesas antioxidantes endógenas desenvolvidas por organismos
aeróbios para reduzir o acúmulo intracelular de EROs, destacam-se:
Enzimas que cataliticamente removem radicais livres e outras espécies
reativas, tais como superóxido dismutases, catalases e peroxidases.
Metaloproteínas que minimizam a disponibilidade de agentes pró-oxidantes
(íons ferro e cobre e moléculas do grupo “hemo”), tais como transferrinas,
haptoglobinas, hemopexinas, metalotioneínas e ferritina.
Proteínas que protegem biomoléculas contra danos (inclusive danos
oxidativos) através de outros mecanismos, tais como proteínas choque térmico.
Agentes que atuam como “scavenger” de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio, ou seja, seqüestram ou neutralizam radicais livres oxidando-se nesse
processo, tais como glutationa,
-tocoferol, bilirrubina e ácido úrico (LARSON, 1988;
H
ALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001; MANCUSO et al., 2003; SUZUKI, 2007).
Antioxidantes exógenos ingressam no organismo humano através dos
alimentos, e atuam através de mecanismos não enzimáticos. O sistema endógeno de
defesa pode ser auxiliado favoravelmente com a introdução dessas substâncias por
meio da dieta (S
ILVA et al., 2005b; VALKO et al., 2006).
Em geral as reações antioxidantes envolvem passos múltiplos incluindo a
iniciação, propagação e terminação de radicais livres. Os antioxidantes classificam-se
em dois grupos de mecanismos: aqueles que inibem ou retardam a formação de
radicais livres a partir de seus precursores instáveis (iniciação) são chamados
antioxidantes preventivos; aqueles que interrompem a reação radicalar em cadeia
(propagação) chamam-se antioxidantes “chain-breaking”. Esse é o grupo mais estudado
de antioxidantes e o mecanismo pelo qual atuam é através da transferência de átomos
54
de hidrogênio. Especificamente, um antioxidante “chain-breaking” (AH) doa seu átomo
de hidrogênio lábil a radicais peroxila (ROO
)
muito mais rapidamente que ROO
reage
com o substrato. O radical A
formado é estável e é incapaz de continuar a autoxidação
da cadeia (O
U et al., 2001).
3.3.2 Antioxidantes de origem natural
A partir do início dos anos 80 tem aumentado consideravelmente o interesse na
busca de antioxidantes de origem natural para o emprego em produtos alimentícios ou
para uso farmacêutico, com o intuito de substituir antioxidantes de origem sintética
(Z
HENG & WANG, 2001; SOOBRATTEE et al., 2005). Além disso, este interesse deve-se
principalmente ao fato de que radicais livres estão relacionados ao desenvolvimento de
várias desordens orgânicas (W
ILLCOX et al., 2004). O consumo de substâncias
antioxidantes, pode produzir uma ação protetora efetiva contra os processos oxidativos
que naturalmente ocorrem no organismo (R
ICE-EVANS et al., 1997; ARREDONDO et al.,
2004).
As propriedades antioxidantes de substâncias de origem natural apresentam
várias perspectivas relacionadas ao cuidado da saúde humana. Estudos indicam que
muitos dos compostos antioxidantes presentes na dieta possuem atividades
antiinflamatória, antiaterosclerótica, antitumoral, antimutagênica, anticarcinogênica,
antibacteriana e antiviral. A prevenção do câncer, doenças cardiovasculares e
neurodegenerativas tem sido associada com a ingesta de frutas frescas, infusões e
vegetais ricos em antioxidantes naturais, o que sugere que um maior consumo de tais
compostos poderia diminuir o risco de mortalidade relacionado a essas enfermidades
(C
OOK & SAMMAN, 1996; DE RIJK et al., 1997; VELIOGLU et al., 1998; YOUDIM et al., 2002;
C
AI et al., 2004; WILLCOX et al., 2004; SOOBRATTEE et al., 2005; VALKO et al., 2006).
Além disso, embora poucas plantas medicinais sejam utilizadas como
“antioxidantes”, suas propriedades terapêuticas podem ser em parte devidas à
capacidade que as mesmas apresentam em neutralizar espécies reativas de oxigênio,
55
envolvidas no desenvolvimento de enfermidades para as quais a planta é indicada
(D
ESMARCHELIER et al., 1999; DESMARCHELIER et al., 2000). Na busca de novas
substâncias com ação antioxidante, muitas plantas têm sido avaliadas quanto a sua
capacidade de neutralização de radicais livres (D
ESMARCHELIER et al., 1997;
D
ESMARCHELIER et al., 2000; PAREJO et al., 2003; VELÁSQUEZ et al., 2003; CAI et al.,
2004; S
ILVA et al., 2005b).
Espécies vegetais podem apresentar uma ampla variedade de moléculas
capazes de inativar radicais livres, tais como compostos fenólicos (ácidos fenólicos,
flavonóides, quinonas, cumarinas, estilbenos, taninos, etc), compostos nitrogenados
(alcalóides, aminas), vitaminas (E, C), terpenóides (carotenóides), bem como muitos
outros metabólitos endógenos que exercem ação antioxidante (L
ARSON, 1988; VELIOGLU
et al., 1998; H
ALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001; DESMARCHELIER et al., 2000; NG et al.,
2000; Z
HENG & WANG, 2001; SOOBRATTEE et al., 2005; O’BRIEN et al., 2006).
3.3.3 Compostos fenólicos
Muitos estudos têm demonstrado uma relação direta entre a atividade
antioxidante e o conteúdo de substâncias fenólicas em plantas (V
ELIOGLU et al., 1998;
P
AREJO et al., 2003; MILIAUSKAS et al., 2004; KATALINIC et al., 2006). Polifenóis
apresentam estrutura química adequada para produzir ação antioxidante devido as
suas propriedades redox, uma vez que possuem anéis aromáticos com substituintes
hidroxílicos, que atuam como doadores de H ou elétrons, desempenhando um
importante papel na captação e neutralização de radicais livres, tais como o oxigênio
triplete e singlete e peróxidos (esquema 2.1) (R
ICE-EVANS et al., 1997; ZHENG & WANG,
2001).
R
OH
OH
OH
R
R*
RH
O
O
R
O
H
.
Esquema 2.1: Mecanismo de redução de substâncias fenólicas
56
Além disso, fenóis com dois grupamentos hidroxílicos adjacentes ou outros
substituintes com capacidades quelantes, podem ligar-se a íons de metal de transição,
tal como o ubíquo Fe
2+
dos sistemas biológicos, inibindo a reação de Fenton (esquema
2.2), uma importante fonte de EROs
(YOKOZAWA et al., 1997; HALLIWELL & GUTTERIDGE,
2001).
Esquema 2.2: Reação de Fenton
Compostos fenólicos podem prevenir o câncer através da ação antioxidante
e/ou modulação de muitas proteínas, podendo ainda inibir a carcinogênese atuando nos
processos moleculares de iniciação, promoção e progressão (Y
ANG et al., 2001).
Estudos com plantas utilizadas tradicionalmente na prevenção do câncer demonstraram
forte correlação entre a ação antioxidante destas espécies e o conteúdo de substâncias
fenólicas, revelando que ácidos fenólicos, flavonóides, taninos, cumarinas, lignanas,
estilbenos e curcuminóides são os componentes antioxidantes dominantes nas plantas
testadas (C
AI et al., 2004).
Em relação ao potencial antioxidante, os flavonóides constituem o grupo mais
representativo desta classe, para os quais muitos trabalhos destacam a relação
existente entre a sua estrutura química com a ação antioxidante (C
OOK & SAMMAN,
1996; R
ICE-EVANS et al., 1997; AMIC et al., 2003). Essas substâncias, abundantes em
frutas, vegetais e plantas medicinais, apresentam uma forte capacidade de neutralizar
radicais livres, além de serem considerados menos tóxicos do que antioxidantes
sintéticos tais como butil-hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-tolueno (BHT) (H
OLLMAN &
KATAN, 1997; PIETTA, 2000).
Estudos têm demonstrado que a peroxidação lipídica pode ser inibida por
H
2
O
2
+ e
-
OH + HO
-
Fe
2+
Fe
3+
+ e
-
______________________
Fe
2+
+ H
2
O
2
Fe
3+
+
OH + HO
-
57
flavonóides, que atuam como fortes moléculas seqüestrantes de ânion superóxido (O
2

)
e radical hidroxila (
OH) e quencher do oxigênio singlete (
1
O
2
), sendo esta atividade
intimamente associada com sua estrutura química, especialmente ao número de
grupamentos hidroxila ligados ao esqueleto básico e também a sua configuração. Tem
sido proposto que estes compostos atuam como doadores de átomos de hidrogênio ao
radical peroxila, inibindo, então, a autooxidação de ácidos graxos através da terminação
da reação em cadeia (C
OOK & SAMMAN, 1996; SOOBRATTEE et al., 2005). Estes
compostos podem ainda prevenir o dano oxidativo através de suas propriedades
quelantes de íons metálicos que participam da produção de EROs via reação de
Fenton, bem como mediante a inibição de enzimas tais como lipoxigenase,
cicloxigenase, xantina oxidase, entre outras (C
OOK & SAMMAN, 1996).
Considerando a crescente importância de plantas e de produtos naturais na
proteção contra danos promovidos pelo estresse oxidativo, espécies com elevados
teores de substâncias fenólicas estimulam o interesse da comunidade científica, como é
o caso das plantas do gênero Hypericum.
3.3.4 Atividade antioxidante de espécies de Hypericum
Nos últimos anos, estudos relatam atividade antioxidante para espécies de
Hypericum, o que é esperado, uma vez que a presença de compostos fenólicos é
comum nestas plantas. Hypericum perforatum é a espécie que apresenta o maior
número de trabalhos relacionados à investigação das propriedades antioxidantes,
principalmente na tentativa de relacionar esse efeito com a ação antidepressiva
associada a esta planta. Isso porque há muitas evidências de que alterações em lipídios
podem provocar a superprodução de EROs, e, em conseqüência, a atividade de
enzimas antioxidantes e a peroxidação lipídica, e que estes fenômenos podem estar
relacionados a fisiopatologia da depressão (B
ILICI et al., 2001; KHANZODE et al., 2003;
Y
ANIK et al., 2004)
As propriedades antioxidantes demonstradas por extratos de H. perforatum
58
podem ser em parte responsáveis por alguns efeitos terapêuticos atribuídos a esta
planta, nos quais a geração de radicais livres está implicada, tais como as propriedades
antiinflamatórias e a ação no sistema nervoso central (S
ILVA et al., 2005a). Vários
trabalhos demonstram a capacidade de diferentes extratos desta espécie em seqüestrar
radicais livres. O extrato hidroetanólico de H. perforatum padronizado em hipericinas
apresentou capacidade de reação com o radical estável DPPH
(2,2-difenil-1-picril-
hidrazil) (B
ENEDÍ et al., 2004; SILVA et al., 2005a).
Esta mesma ação foi verificada para um extrato enriquecido em flavonóides
(Z
OU et al., 2004; SILVA et al., 2005a), bem como para flavonóides isolados dessa
fração, que apresentaram atividade de modo dose-dependente. Nessa fração, a
presença majoritária dos flavonóides quercetina e hiperosídeo contribuiu para a
atividade antioxidante como scavenger de radicais DPPH
, superando o efeito
promovido por
-tocoferol. Além da ação frente a esses radicais, esta fração apresentou
forte capacidade de neutralizar radicais ânion superóxidos, gerados por oxidação do
NADH, bem como radicais hidroxila, evidenciado através do efeito inibitório na
degradação da desoxirribose induzida por essas espécies reativas (Z
OU et al., 2004).
Considerando um extrato hidroetanólico padronizado em hipericinas, a neutralização de
radicais hidroxila somente ocorreu em concentrações elevadas (B
ENEDÍ et al., 2004).
A habilidade de H. perforatum em exibir poder de redução e capacidade de
reação com radicais DPPH
sugere que seus componentes fitoquímicos atuem como
doadores de elétrons e podem reagir com radicais livres, convertendo-os a produtos
mais estáveis e terminar reações radicalares em cadeia (B
ENEDÍ et al., 2004).
Em um estudo visando verificar a capacidade da infusão aquosa de H.
perforatum em neutralizar radicais hidroxila, através do método do radical ABTS
+
(2,2’-
azinobis-3-etilbenzotiozolina-6-sulfonato), verificou-se considerável capacidade
antioxidante expressa em equivalentes de Trolox, correlacionada ao alto teor de
conteúdo fenólico desta infusão (I
VANOVA et al., 2005). Este estudo já havia sido
previamente conduzido por S
LOLEY e colaboradores (2000), onde extratos das folhas e
59
flores dessa planta demonstraram, através desse mesmo ensaio, capacidade em
neutralizar radicais livres, que foi correlacionada com o conteúdo de flavonóides, entre
eles quercetina e hiperosídeo. Esta atividade não foi correlacionada ao teor de
hiperforina e hipericina, observando-se que uma amostra com alto conteúdo em
hipericina, porém sem flavonóides, não apresentou capacidade de neutralizar radicais
hidroxila.
Para esta planta também é relatada ação na inibição da peroxidação lipídica
através de diferentes mecanismos, tanto em sistemas livres de células (H
UNT et al.,
2001; B
ENEDÍ et al., 2004; ZOU et al., 2004) quanto na presença de células (HUNT et al.,
2001; J
ANG et al., 2002; BENEDÍ et al., 2004; SILVA et al., 2005a), indicando que extratos
de H. perforatum possuem a habilidade de proteger o dano oxidativo neuronal
enzimático e não-enzimático.
Um extrato de H. perforatum enriquecido em flavonóides exibiu ação inibitória
na peroxidação do ácido linoléico, utilizando o método do tiocianato, bem como
preveniu de modo eficiente a peroxidação lipídica de lipossomas, induzida através do
radical hidroxila, gerado via reação de Fenton (sistema redox ácido ascórbico/cloreto
férrico), ou através do radical peroxila, gerado por ABAP, verificada através do ensaio
do ácido tiobarbitúrico. Além disso, demonstrou eficiente poder redutor, ação que pode
servir como um reflexo da atividade antioxidante
(ZOU et al., 2004). Da mesma maneira,
o extrato hidroetanólico (80%) e frações acetato de etila e butanólica, contendo
principalmente flavonóides glicosilados derivados da quercetina e agliconas de flores de
H. perforatum, (S
ILVA et al., 2005a), bem como extrato padronizado em hipericina
(B
ENEDÍ et al., 2004) exerceram efeito inibitório de maneira dose-dependente na
peroxidação lipídica em sinaptossomas corticais de rato, induzida através da reação de
Fenton, utilizando a formação de malondialdeído como índice do colapso oxidativo de
membranas lipídicas (ensaio do ácido tiobarbitúrico).
Esses mesmos autores demonstraram inibição pelo extrato hidroetanólico
padronizado em hipericina frente a peroxidação lipídica induzida através do sistema
60
NADPH, bem como inibição da atividade enzimática de xantina oxidase em
homogenatos de cérebros de ratos. Utilizando vários experimentos in vitro, foi
demonstrado proteção ao dano oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) em
linhagens celulares de feocromocitoma (PC12), através da avaliação da viabilidade
celular frente à citotoxicidade e apoptose induzida por H
2
O
2
(atividade enzimática de
lactato desidrogenase e caspase-3, bem como acúmulo de espécies reativas nas
células) (B
ENEDÍ et al., 2004). Esta ação na proteção contra a apoptose induzida por
H
2
O
2
também foi demonstrada em linhagens celulares (SK-N-MC) de neuroblastoma
humano (J
ANG et al., 2002).
HUNT e colaboradores (2001) avaliaram o efeito antioxidante de preparações
desta planta frente ao ânion superóxido. Extratos padronizados de H. perforatum, tanto
em hipericina (Nature Plus
®
), quanto em hiperforina (Movana
®
), dissolvidos em solução
aquosa alcalina, demonstraram significativa inibição na produção de peróxidos
induzidos através do sistema xantina/xantina oxidase in vitro, tanto em um meio livre de
células quanto em tecido vascular humano, através de uma relação dose-resposta
inversa, onde a concentração mais diluída promoveu a maior inibição na geração dos
radicais. Em concentrações elevadas (1:1) foi verificado um efeito pró-oxidante, que
acredita-se não ser exercido no organismo em doses normais, devido à diluição na
corrente sanguínea (H
UNT et al., 2001).
Estes autores postularam que os efeitos antioxidantes apresentados pelas
preparações de H. perforatum poderiam estar relacionados ao conteúdo de hipericina
uma vez que o extrato padronizado nesta substância pareceu apresentar propriedades
antioxidantes mais significativas (H
UNT et al., 2001). No entanto, para SILVA e
colaboradores (2005a) outros compostos, tais como derivados de ácidos fenólicos e
flavonóides, são mais relevantes para esta atividade, pois frações contendo hiperforina
e hipericinas foram inefetivas na redução da peroxidação lipídica, em todas as
concentrações testadas.
Da mesma forma que no trabalho desenvolvido por H
UNT e colaboradores
61
(2001), concentrações elevadas das frações acetato de etila, butanólica e aquosa de H.
perforatum, ricas em flavonóides e ácidos fenólicos demonstraram um comportamento
pró-oxidante, evidenciado pela diminuição da eficiência na proteção da peroxidação
lipídica em sinaptossomas corticais de rato, induzida pelo sistema ascorbato/Fe
+2
. No
entanto quando avaliado o extrato hidroetanólico esse efeito não foi evidenciado,
mesmo em altas concentrações (S
ILVA et al., 2005a).
Em um modelo animal, o tratamento de ratos com baixas concentrações do
extrato hidroetanólico (80%) desta planta resultou em um efeito neuroprotetor contra o
estresse oxidativo comum no estado de demência. Isto foi demonstrado através da
diminuição nas concentrações de malondialdeído no cérebro, uma vez que seu nível
elevado apresenta-se como um índice da peroxidação lipídica in vivo. Além disso, foi
observado aumento na concentração de glutationa cerebral, tripeptídeo que participa na
manutenção da homeostasia oxidante e a detoxificação de EROs em células cerebrais,
cuja depleção têm sido considerada um índice relevante do estresse oxidativo nas
células nervosas. O efeito protetor foi evidenciado ainda com uma diminuição na
atividade enzimática de glutationa peroxidase, uma vez que a expressão aumentada e
conseqüentemente a atividade das enzimas antioxidantes endógenas SOD e glutationa
peroxidase é indicativo de quadros oxidativos (E
L-SHERBIN et al., 2003). Da mesma
forma, utilizando camundongos para avaliar a participação do estresse oxidativo na
síndrome da fadiga crônica, o extrato de H. perforatum administrado oralmente reduziu
de modo significativo a peroxidação lipídica, evidenciado por avaliações bioquímicas
através do aumento na concentração de glutationa cerebral (S
INGH et al., 2002).
Muitos autores sugerem que em função da ação neuroprotetora, o extrato
padronizado de H. perforatum, utilizado como antidepressivo e possuindo propriedades
antioxidantes, apresenta uma vantagem em pacientes depressivos com desordens
induzidas por estresse oxidativo nas quais a geração de radicais livres está implicada
(H
UNT et al., 2001; JANG et al., 2002; EL SHERBINY et al., 2003; BENEDÍ et al., 2004).
Levando em consideração os vários trabalhos que avaliam os extratos de H.
62
perforatum frente à atividade antioxidante, é possível concluir que seus efeitos
neuroprotetores se relacionam ao conteúdo de compostos fenólicos, que apresentam
habilidade em atuar na neutralização de radicais livres. Como foi demonstrado, é
possível ainda inferir que esta ação está muito mais relacionada ao teor de flavonóides,
do que ao conteúdo de hipericina e hiperforina nos extratos.
Outras espécies do gênero têm apresentado, em muitos sistemas
experimentais, a capacidade de reação com espécies reativas de oxigênio, bem como
inibição ao dano oxidativo no DNA e peroxidação lipídica.
O extrato metanólico de H. triquetrifolium, bem como flavonóides isolados desta
espécie, apresentaram atividade antioxidante avaliada através dos métodos de
bioautografia com DPPH
e de inibição da peroxidação lipídica lipossomal (CONFORTI et
al., 2002; C
OULADIS et al., 2002a; COULADIS et al., 2002b). Outras cinco espécies do
gênero foram avaliadas quanto à proteção contra a peroxidação lipídica de lipossomas,
no ensaio do ácido tiobarbitúrico, demonstrando-se que extratos metanólicos de H.
triquetrifolium, H. empetrifolium e H. rumeliacum apresentaram ação similar à de
-
tocoferol
(COULADIS et al., 2002a).
A avaliação do potencial antioxidante de frações éter de petróleo, clorofórmica,
acetato de etila e aquosa de H. hyssopifolium, frente à inibição na produção de
peróxidos pelo ensaio do tiocianato demonstrou efeito pró-oxidante das frações acetato
de etila e aquosa. No entanto, todas apresentaram capacidade de reação com o radical
DPPH
, sendo a fração acetato de etila a mais ativa, e com maior conteúdo de
compostos fenólicos. Além disso, embora não tenha sido verificada ação inibitória sobre
peróxidos, da fração acetato de etila foram isoladas substâncias com essa atividade.
Isso pode ser explicado pela presença de muitos outros componentes na fração acetato
de etila, muitos dos quais podem atuar como pró-oxidantes, enquanto outros como
antioxidantes, sendo a soma dessas atividades determinante para o efeito exercido.
Nesse caso, há o predomínio de compostos pró-oxidantes, atividade exercida pela
fração (C
AKIR et al., 2003).
63
H. fasciculatum e H. styphelioides demonstraram efeito hepatoprotetor quando
avaliados frente à peroxidação lipídica hepática induzida por tetracloreto de carbono,
em ratos. A ação protetora das tinturas hidroalcóolicas (50%) destas plantas foi
evidenciada mediante avaliações bioquímicas, observando-se menores valores
sanguíneos das enzimas TGO e TGP, indicativas de danos hepáticos, e menor dano
visualizado por exame anatomopatológico nos grupos tratados com os extratos
(R
ODRIGUEZ et al., 2001).
Infusões aquosas de H. androsaemum também apresentaram efeito protetor
em hepatócitos isolados de ratos, contra danos oxidativos induzidos por hidroperóxido
de tert-butil (t-BHP), verificados através da avaliação da viabilidade celular e inibição da
peroxidação lipídica promovida por radicais peroxila e alcoxila gerados durante o
metabolismo hepático de t-BHP (V
ALENTÃO et al., 2004).
Foi demonstrado, ainda, para essa mesma infusão, atividade seqüestrante de
ânion superóxido e do radical hidroxila, bem como de ácido hipoclórico (HOCl), uma
potente ERO produzida no organismo por oxidação dos íons Cl
-
em neutrófilos, nos
sítios de inflamação (V
ALENTÃO et al., 2002). A ação antioxidante desta planta foi
relacionada ao conteúdo de fenólicos, tais como ácidos 3- e 5-cafeilquínicos, quercetina
e seus derivados glicosilados (V
ALENTÃO et al., 2002; VALENTÃO et al., 2004).
A capacidade de neutralizar o radical O
2

foi demonstrada tanto através de um
sistema de avaliação não enzimático, onde o radical é gerado por oxidação do NADH,
quanto em um modelo enzimático, onde o mesmo é gerado através do sistema
xatina/xantina oxidase (V
ALENTÃO et al., 2002). O efeito antioxidante da infusão deu-se
de modo concentração-dependente. No entanto, em concentrações elevadas foi
evidenciado um efeito pró-oxidante no ensaio para verificação da ação sobre os radicais
hidroxila, gerados através da reação de Fenton. Fenólicos com potencial de oxidação
menor que o do Fe
+3
e Cu
+2
e seus complexos podem reduzir esses metais, sendo
potencialmente pró-oxidantes, tendo em vista que o Fe
+2
e o Cu
+
participam da reação
de Fenton (V
ALENTÃO et al., 2002).
64
Extratos aquoso, metanólico e diclorometânico de H. jovis apresentaram
capacidade de reação com o radical DPPH
, sendo a fração metanólica mais ativa
nesse ensaio. Além disso, foi verificada ação inibitória na produção endógena de níveis
basais de EROs em fibroblastos humanos, sendo a fração diclorometânica mais efetiva
em reduzir a concentração de espécies reativas nessas células
(ATHANASAS et al.,
2004).
Além de extratos e frações enriquecidas, o potencial antioxidante vem sendo
demonstrado também para compostos fenólicos isolados das espécies do gênero. O
quadro (2.1) a seguir apresenta atividades relacionadas a algumas dessas substâncias.
65
Quadro 2.1: Atividades relacionadas ao potencial antioxidante de compostos fenólicos isolados das
espécies de Hypericum.
Espécie Substância Atividade
Hypericum
chinensis
3,4-diidroxi-1-metoxi-xantona
O
O
OCH3
OH
OH
Reatividade frente ao radical DPPH
(M
ASUDA et al., 2003).
Hypericum
styphelioides
5-O-desmetilpaxantonina
O
OH
OH
OH
O
HO
Atividade de captura do cátion radical ABTS
+
e de radicais peroxila, comparável à
quercetina e rutina (G
AMIOTEA-TURRO et al.,
2004).
Hypericum
styphelioides
6-desoxi-5-O-demetilpaxantonina
O
OH
OH
OH
O
Atividade de captura do cátion radical ABTS
+
e de radicais peroxila, comparável à
quercetina e rutina (G
AMIOTEA-TURRO et al.,
2004).
Hypericum
styphelioides
3,5-diidroxibenzofenona-4-
-D-glicosídeo
OH
O
HO
Gli
Moderada atividade de captura do cátion
radical ABTS
+
e de radicais peroxila
(G
AMIOTEA-TURRO et al., 2004).
Hypericum
styphelioides
3-geranil-1-(3-metilbutanoil)-floroglucinol
HO
O
H
OH
O
Moderada atividade de captura do cátion
radical ABTS
+
e de radicais peroxila
(G
AMIOTEA-TURRO et al., 2004).
Hypericum
jovis
HO
OH
OH
O
Ação inibitória na produção endógena de
níveis basais de EROs em fibroblastos
humanos, comparável ao Trolox (A
THANASAS
et al., 2004).
66
Continuação do quadro 2.1
Hypericum
jovis
hiperjovinol A
HO
OH
OH
O
OH
Ação inibitória na produção endógena de
níveis basais de EROs em fibroblastos
humanos, comparável ao Trolox. Prevenção
na produção de EROs em fibroblastos
humanos induzida exogenamente por H
2
O
2
(A
THANASAS et al., 2004).
Hypericum
perforatum
Hiperforina
O
HO
O
O
Proteção da lise oxidativa de células
polimorfonucleares humanas, estimulada por
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLF),
através da redução na formação de espécies
reativas, mas não quando as células foram
estimuladas com zimosan opsonizado, o que
sugere que atua sobre um mecanismo
específico de geração de radicais livres na
cascata oxidativa induzida por FMLF
(H
EILMANN et al., 2003).
Hypericum
papuanum
ialibinona E
O
O
O
HO
H
H
H
Proteção da lise oxidativa de células
polimorfonucleares humanas, estimulada por
FMLF, através da redução na formação de
espécies reativas, mas não quando as células
foram estimuladas com zimosan opsonizado.
Inativo frente ao radical DPPH
. Atividade
frente ao radical ânion superóxido
dependente da fonte de O
2

e do alvo de
ataque deste radical: inibição da produção de
radicais ânion superóxido nos sistemas
enzimáticos peroxidase/ H
2
O
2
e xantina
oxidase/hipoxantina; porém inativo na
proteção da atividade da fosfatase
calcineurina contra os efeitos inibitórios de
O
2

. Os dados sugerem que atua sobre o
mecanismo específico de geração de radicais
livres na cascata oxidativa induzida por
FMLF e não apenas por uma atividade
inespecífica de neutralização de espécies
reativas (H
EILMANN et al., 2003).
67
Continuação do quadro 2.1
Hypericum
papuanum
hiperguinona B
O
O
OH
O
Proteção da lise oxidativa de células
polimorfonucleares humanas, estimulada por
FMLF, através da redução na formação de
espécies reativas, mas não quando as células
foram estimuladas com zimosan opsonizado,
o que sugere que atua sobre um mecanismo
específico de geração de radicais livres na
cascata oxidativa induzida por FMLF. Inativo
frente ao radical DPPH
. Inativo na captação
de radicais ânion superóxido nos sitemas
enzimáticos peroxidase/ H
2
O
2
e xantina
oxidase/hipoxantina, bem como na proteção
da atividade da fosfatase calcineurina contra
os efeitos inibitórios de O
2

. Os dados
sugerem que atua sobre o mecanismo
específico de geração de radicais livres na
cascata oxidativa induzida por FMLF e não
apenas por uma atividade inespecífica de
neutralização de espécies reativas
(HEILMANN
et al., 2003).
Hypericum
triquetrifolium
Hypericum
hyssopifolium
quercetina-3-O-
- galactosídeo
OH
O
β
O- - D-galactosil
O
HO
OH
OH
Potente atividade antioxidante frente ao
radical DPPH
- método da bioautografia
(C
ONFORTI et al., 2002) e fotocolorimétrico
(C
AKIR et al., 2003) - e na proteção contra a
peroxidação lipídica de lipossomas, no ensaio
do ácido tiobarbitúrico (C
ONFORTI et al., 2002)
Inibição na peroxidação lipídica do ácido
linoléico, no ensaio do tiocianato (C
AKIR et al.,
2003).
Forte capacidade de neutralizar radicais ânion
superóxidos, gerados por oxidação do NADH.
Poder redutor (Z
OU et al., 2004).
Hypericum
triquetrifolium
canferol-3-O-glicosídeo
O
HO
OH
OH
O
β
O- - D-glicosil
Potente atividade antioxidante frente ao
radical DPPH
(método da bioautografia) e na
proteção contra a peroxidação lipídica de
lipossomas, no ensaio do ácido tiobarbitúrico
(C
ONFORTI et al., 2002).
Hypericum
triquetrifolium
(-)-epicatequina
O
H
OH
HO
OH
OH
O
Potente atividade antioxidante frente ao
radical DPPH
(método da bioautografia) e na
proteção contra a peroxidação lipídica de
lipossomas, no ensaio do ácido tiobarbitúrico.
A presença da –OH livre na posição 3
contribui fortemente para essa ação
(C
ONFORTI et al., 2002).
68
Continuação do quadro 2.1
Hypericum
triquetrifolium
Hypericum
hyssopifolium
I3,II8-biapigenina
OH
HO
HO
OH
O
O
O
O
OH
OH
Molécula com 6 hidroxilas fenólicas,
responsáveis pela atividade antioxidante:
frente ao radical DPPH
- método da
bioautografia (C
ONFORTI et al., 2002) e
fotocolorimétrico (C
AKIR et al., 2003); na
proteção contra a peroxidação lipídica de
lipossomas, verificada através do ensaio com
ácido tiobarbitúrico (C
ONFORTI et al., 2002),
comparável ao
-tocoferol (COULADIS et al.,
2002b); na inibição da produção de peróxidos
pelo ensaio do tiocianato (C
AKIR et al., 2003)
Hypericum
triquetrifolium
Hypericum
hyssopifolium
hipericina
OH
OOH
HO
HO
CH
3
CH
3
OH O
OH
Molécula com 6 hidroxilas fenólicas, com forte
inibição na produção de peróxidos pelo
ensaio do tiocianato (C
AKIR et al., 2003),
porém com baixa atividade na proteção
contra a peroxidação lipídica de lipossomas,
no ensaio do ácido tiobarbitúrico,
provavelmente devido a sua hidrofobicidade
(C
ONFORTI et al., 2002)
Baixa atividade frente ao radical DPPH
(C
AKIR et al., 2003).
Hypericum
triquetrifolium
ácido clorogênico
HO OH
OH
HO
O
O
O
H
OH
Potente atividade na proteção contra a
peroxidação lipídica de lipossomas, no ensaio
do ácido tiobarbitúrico (C
OULADIS et al.,
2002b).
Hypericum
triquetrifolium
Hypericum
hyssopifolium
Hypericum
perforatum
quercetina
O
H
OH
OH
O
OH
HO
O
Proteção contra a peroxidação lipídica de
lipossomas, no ensaio do ácido tiobarbitúrico
(C
OULADIS et al., 2002b). Inibição na
produção de peróxidos (ensaio do tiocianato).
Alta capacidade de reação com o radical
DPPH
(CAKIR et al., 2003; ZOU et al., 2004).
Forte capacidade de neutralizar radicais ânion
superóxidos, gerados por oxidação do NADH.
Elevado poder redutor (Z
OU et al., 2004).
Proteção hepática contra a citotoxicidade
induzida por hidroperóxido de tert-butil (t-
BHP), verificados através da avaliação da
viabilidade celular e inibição da peroxidação
lipídica promovida por radicais peroxila e
alcoxila gerados durante o metabolismo
hepático de t-BHP (V
ALENTÃO et al., 2004).
69
Continuação do quadro 2.1
Hypericum
triquetrifolium
Hypericum
perforatum
rutina
OH
O
O
HO
OH
OH
O- -L -rutinosil
Potente atividade na proteção contra a
peroxidação lipídica de lipossomas, no ensaio
do ácido tiobarbitúrico (C
OULADIS et al.,
2002b). Forte capacidade de reação com o
radical DPPH
; Forte capacidade de
neutralizar radicais ânion superóxidos,
gerados por oxidação do NADH. Poder
redutor (Z
OU et al., 2004).
Hypericum
hyssopifolium
quercetina-3-O--arabinofuranosídeo
OH
O
O
HO
OH
OH
O- -L -arabinofuranosi
l
Potente atividade frente ao radical DPPH
e
capacidade de inibição da produção de
peróxidos pelo ensaio do tiocianato (C
AKIR et
al., 2003)
Hypericum
hyssopifolium
quercetina-3-O-
-D-galactopiranosídeo-7-O-
-
D-glicopiranosídeo
O-
O
O
OH
O
OH
OH
-D-galactosil
D-Glicosil-
-
Inibição na produção de peróxidos pelo
ensaio do tiocianato. Alta capacidade de
reação com o radical DPPH
(CAKIR et al.,
2003)
3.4
MATERIAIS E MÉTODOS
Os procedimentos para avaliação do potencial antioxidante foram realizados no
Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sob
supervisão dos professores Dr. Raquel Bridi e Dr. Carlos Severo Dutra Filho e no
Departamento de Ciencias Químicas da Facultad de Química y Biología da Universidad
de Santiago de Chile sob supervisão do professor Dr. Eduardo G. Lissi.
Para um melhor entendimento, um esquema da metodologia está apresentado
como anexo (Anexo IV, página 301).
70
3.4.1 Preparação dos extratos
As espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum,
avaliadas em relação ao potencial antioxidante, foram coletadas em diferentes
localidades do Rio Grande do Sul durante o período de floração dos vegetais, entre os
meses de setembro a março. As exsicatas para a devida identificação e registro do
material vegetal foram depositadas no herbário do Departamento de Botânica do
Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (tabela 2.1).
Tabela 2.1: Dados sobre a coleta do material vegetal e registro em herbário.
Espécie Local e Data de coleta ICN
H. caprifoliatum Cham. & Schltdl. Morro Santana, Porto Alegre
novembro 2004
Bordignon 1400
H. carinatum Griseb. Glorinha
dezembro, 2004
Bordignon 1520
H. myrianthum Cham. & Schltdl. Paraíso do Sul
dezembro, 2004
Bordignon 1402
H. polyanthemum Klotzsch ex
Reichardt.
Guaritas, Caçapava do Sul
novembro, 2004
Bordignon 1429
As partes aéreas das plantas secas sob ambiente arejado sem incidência de
luz solar direta, trituradas em moinho de facas, foram divididas em duas porções para
preparo do extrato bruto e das frações. O extrato bruto foi obtido submetendo uma
porção do material vegetal seco à extração com metanol, por maceração estática (3 x
24 horas). Em paralelo, a outra parte da amostra foi fracionada por extração em
aparelho de Soxhlet (5 x 6 horas), utilizando-se solventes em polaridade crescente (n-
hexano, diclorometano e metanol). A eliminação do solvente foi realizada em
evaporador rotatório de pressão reduzida, em temperatura não superior a 55°C.
3.4.2 Obtenção de substâncias purificadas
As substâncias a serem analisadas foram obtidas mediante isolamento a partir
da planta de origem. Para tal, a metodologia utilizada foi a previamente descrita na
literatura. Os benzopiranos HP1 (12), HP2 (13) e HP3 (14) foram isolados de H.
polyanthemum (F
ERRAZ et al., 2001); as benzofenonas carifenona A (10) e carifenona B
(11) de H. carinatum (B
ERNARDI et al., 2005), os floroglucinóis japonicina A (32) e
71
uliginosina B (30) de H. myrianthum (FERRAZ et al., 2002a; DALL’AGNol et al., 2004) e
hiperbrasilol B (17) de H. caprifoliatum (N
ÖR et al., 2004) e os flavonóides guaijaverina
(27), hiperosídeo (29), isoquercitrina (28) e 3-metil quercetina (24), isolados de H.
ternum, como descrito previamente no capítulo 1.
3.4.3 Determinação de fenóis totais
As concentrações de fenóis totais nos extratos bruto metanólico, e frações
metanólica, diclorometânica e n-hexânica de H. caprifoliatum, H. carinatum, H.
myriantthum e H. polyanthemum foram determinadas de acordo com o método
colorimétrico de Folin-Ciocalteau (S
INGLETON & ROSSI, 1965), utilizando quercetina
como substância de referência (I
VANOVA et al., 2005). O reagente de FOLIN-CIOCALTEAU
é formado por uma solução de íons poliméricos complexos formados a partir dos ácidos
fosfomolíbdico e fosfotúngstico, que oxida fenolatos e com sua redução forma
complexos de cor azul (S
INGLETON & ROSSI,1965). Brevemente, a amostra (em diluição
apropriada para a medida espectrofotométrica) foi oxidada com 5 mL do reagente de
Folin-Ciocalteu 0,2 N (Merck
®
2N diluído em água destilada 1:10) sendo essa reação
neutralizada com volumes variáveis de solução saturada de carbonato de sódio (7,5 %),
necessário para completar o volume final de reação em 10 mL. Esta mesma mistura,
substituindo-se o reagente de Folin-Ciocalteu por água destilada, foi utilizada como
branco no espectrofotômetro. Após incubação por 45 minutos à temperatura ambiente,
a absorvância da solução de coloração azul resultante do processo foi medida a =765
nm em espectrofotômetro UV-visível Hewlett Packard 8451ª. A quantificação foi
realizada com base em uma curva padrão de quercetina (soluções metanólicas nas
concentrações de 0; 0,65; 1,30; 1,95; 3,25 e 6,5 µg/mL) e os resultados foram
expressos como equivalentes de quercetina (EQ/g: miligramas de quercetina por
grama de extrato seco, utilizando para o cálculo a seguinte equação (2.1):
(2.1) C=cV/m
Onde, “C” é o conteúdo total de fenólicos presente na amostra (mg de
72
quercetina /g de extrato seco); “c” é a concentração de quercetina estabelecida através
da curva padrão (mg/mL), “V” é o volume final de reação (mL) e “m” é a massa de
extrato utilizado na leitura de absorvância (g) (M
ILIAUSKAS et al., 2004).
3.4.4 Avaliação do potencial antioxidante total (TRAP)
A medida do TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter), que avalia a
capacidade antioxidante total de misturas complexas, foi realizada segundo L
ISSI e
colaboradores (1992), com algumas modificações. Este é um método sensível e
reprodutível, podendo ser utilizado para determinar a capacidade antioxidante de
misturas, tais como extratos de plantas (D
ESMARCHELIER et al., 1997).
Esta determinação foi realizada pela medida da intensidade de
quimioluminescência do luminol induzida na presença de radicais peroxila formados
pela decomposição térmica de 2,2´-azobis-(2-amidinopropano) (ABAP) (esquema 2.3)
(L
ISSI et al., 1992; EVELSON et al., 2001).
RN
NR
2R
.
2ROO
.
+ LH
2
ROOH + LH
.
R
.
N
2
.
R
37
O
C-N
2
2O
2
Esquema 2.3: Mecanismo de quimioluminescência do luminol
A adição de misturas complexas de antioxidantes, tais como fluidos biológicos
e extratos de plantas a uma solução contendo radicais peroxila produzidos pelo ABAP,
leva a uma diminuição na quimioluminescência, por determinado período, denominado
tempo de indução, que é proporcional à concentração de antioxidantes presentes na
amostra (L
ISSI et al., 1992).
A mistura de reação (3 mL) foi constituída por uma solução contendo a fonte de
radicais livres (ABAP 10 mM) em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,4 e 10 µL da
solução de luminol (4 mM, preparada em NaOH 0,1 M), utilizado como amplificador do
sinal de quimiloluminescência. Os tubos utilizados para o ensaio permaneceram vazios
no escuro por pelo menos 30 minutos. Após a contagem basal de luminescência dos
73
tubos vazios por 80 segundos (contagens a cada 20 segundos), adicionou-se a mistura
de reação, sendo a leitura realizada por mais 80 segundos, sendo essa medida
considerada o valor inicial.
Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) (33), um análogo
hidrossolúvel de
-tocoferol, e quercetina foram utilizados como substâncias
antioxidantes de referência. Amostras foram testadas separadamente (10 µL) usando-
se diferentes concentrações de trolox, quercetina (320, 160, 120 e 80 M), carifenona
A, carifenona B, uliginosina B (1,0 e 0,5 mg/mL) e extratos brutos das espécies H.
caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum (1,0; 0,75; 0,5; 0,25 e
0,125 mg/mL). Os resultados foram expressos considerando a concentração final na
mistura de reação. As amostras testadas foram dissolvidas em tampão fosfato de sódio
50 mM pH 7,4 contendo 10% de tween 80 (compostos isolados), ou em metanol
(extratos brutos e quercetina). O efeito dos solventes foi analisado no procedimento
experimental, não ocorrendo diferença entre a quimioluminescência produzida pelo
solvente e a quimioluminescência basal.
O
Me
Me
Me
Me
HO
COOH
(33)
A medida de quimioluminescência foi realizada em cintilador Wallac 1409,
como contagens a cada 20 segundos, por um período que promovesse o retorno da
quimioluminescência a valores superiores a 20 % dos valores iniciais. Estes foram
posteriormente transformados em contagens por minuto (CPM).
74
3.4.5 Avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila (ORAC-PGV)
A avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila e determinação do
índice ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) foi realizada segundo a
metodologia descrita L
ÓPEZ-ALARCÓN & LISSI (2006). Os radicais peroxila foram gerados
mediante a termólise de ABAP, utilizando pirogalol vermelho (PGV) como molécula
alvo.
Esse ensaio mede a habilidade de compostos antioxidantes em competir com o
PGV na captura de radicais peroxila, onde substâncias de maior reatividade inibem o
consumo de PGV. Esse consumo é monitorado mediante um declínio na absorvância
da molécula alvo, quando incubado na presença de uma fonte de radical. Soluções de
extratos brutos metanólicos das espécies de Hypericum foram preparadas em metanol
imediatamente antes do uso (H. caprifoliatum 2,5 mg/mL; H. carinatum, H. myrianthum e
H. polyanthemum 5 mg/mL). Os resultados foram expressos considerando a
concentração final das amostras na mistura de reação. Dentre as substâncias puras
isoladas avaliou-se os flavonóides glicosilados guaijaverina, hiperosídeo e
isoquercetrina, na concentração final de 100 µM, preparadas em metanol
imediatamente antes do uso. Soluções estoque de ABAP (600 mM) e de PGV (0,1 mM)
foram preparadas diariamente em tampão fosfato:metanol (60:40) 75 mM a pH 7,4. A
mistura contendo ABAP (10 mM) e PGV (5 µM), em tampão fosfato:metanol (60:40) (75
mM) a pH 7,4, com (25 µL), ou sem (controle) a amostra avaliada ou a substância
referência como antioxidante (trolox e quercetina) (volume final de 3,0 mL) foi incubada
a uma temperatura de 37°C, em cubeta termostatizada de espectrofotômetro UV-visível
Hewlett Packard 8453. O consumo de PGV, associado a sua incubação na presença de
ABAP foi avaliado a partir de uma diminuição progressiva da absorvância (A),
observada no comprimento de onda de 540 nm. Valores de (A/A
0
), onde A
0
=
absorvância inicial, foram plotados em função do tempo. Para a obtenção do índice
ORAC foram calculadas áreas sobre a curva (ASC), onde a integração foi representada
até o tempo em que (A/A
0
) alcançava um valor 0,2. Os resultados finais foram
calculados através da equação 2.2, e expressos como equivalentes de trolox (ET/g:
75
Mol de trolox por grama de extrato seco). É importante salientar que o valor de ORAC
é independente da concentração de antioxidante avaliada, uma vez que observa-se
uma relação linear entre a ASC obtida e a concentração de amostra antioxidante
avaliada.
(2.2) ORAC= (ASC
Amostra
- ASC
0
)/(ASC
Trolox
- ASC
0
) X [Trolox]/[Amostra]
Onde, “ASC
Amostra
” é a área sobre a curva na presença da amostra avaliada,
integrada entre o tempo zero e 80% do consumo da molécula alvo (PGV), “ASC
0
” é a
área sobre a curva do controle e “ASC
Trolox”
é a área sobre a curva na presença de
trolox.
3.4.6 Avaliação da capacidade de reação com 2,2 difenil-1-picril-hidrazil (DPPH
)
3.4.6.1 Ensaio bioautográfico
O ensaio com DPPH
foi realizado preliminarmente como um método rápido de
screening, utilizando bioautografia em placas de CCD (C
ONFORTI et al., 2002). Através
dessa técnica é possível uma avaliação da atividade antioxidante das amostras
testadas, em função da capacidade das mesmas em neutralizar o radical livre estável
DPPH
, de coloração violeta, e cuja redução promove a formação de coloração
amarela, devido a formação de difenil-picril-hidrazina. Para tanto, utilizou-se 20 µL de
uma solução 20 mg/mL das frações n-hexânica, diclorometânica e metanólica,
aplicadas em placas cromatográficas de sílica gel. O sistema eluente foi constituído de
n-hexano:diclorometano (60:40) para a fração n-hexânica, diclorometano:metanol
(95:5) para a fração diclorometânica acetato de etila:metanol:água (100:13,5:10) para a
fração metanólica. Após a eluição e secagem das placas, essas foram nebulizadas com
solução de DPPH
0,2% e examinadas alguns minutos após a nebulização. Compostos
com capacidade de redução do DPPH
apareceram como manchas amarelas contra o
fundo de cor violeta.
76
3.4.6.2 Ensaio espectrofotométrico
A avaliação qualitativa e quantitativa da atividade antioxidante frente ao radical
DPPH
foi realizada através de medidas espectrofotométricas do consumo do radical,
na presença de substâncias antioxidantes (B
RAND-WILLIAMS et al., 1995). Para tanto,
alíquotas de 25 L de soluções etanólicas dos extratos e frações, em diferentes
concentrações, bem como volumes variáveis de solução etanólica dos compostos
purificados (para a obtenção de uma concentração final de análise entre 12,5 e 400 M)
foram adicionados em cubetas contendo solução etanólica 60 M do radical (controle)
(Coeficiente de absorção molar
517nm
: 11500 M
-1
cm
-1
), com volume final de reação de 3,0
mL. A medida de absorvância foi realizada em espectrofotômetro UV-visível Hewlett
Packard 8453, iniciando imediatamente após a mistura das soluções. O decréscimo de
absorvância foi avaliado a =517 nm e em temperatura de 25°C, com um tempo total de
reação de 600 segundos para todas as amostras. Etanol foi utilizado como branco no
espectrofotômetro. Quercetina foi utilizada como substância antioxidante de referência.
Os dados experimentais da cinética de consumo de DPPH
na presença das amostras
avaliadas foram ajustados para avaliar a quantidade total de compostos antioxidantes
em extratos, frações e produtos isolados (do consumo extrapolado a tempo infinito) e o
percentual de compostos de alta e baixa reatividade presentes.
3.4.7 Análise estatística dos resultados
Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos
como a média ± desvio padrão. A significância estatística dos resultados foi
determinada por análise de variância One-Way (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey,
utilizando o software para cálculos estatísticos SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) 12.0
®
. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
77
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.5.1 Rendimento dos extratos
O rendimento das frações n-hexânica, diclorometânica e metanólica das quatro
espécies de Hypericum avaliadas em relação à atividade antioxidante estão
apresentados na tabela 2.2. Para os cálculos de rendimento empregou-se a massa
seca de material vegetal. Dentre os extratos brutos metanólicos, H. polyanthemum
apresentou o maior rendimento. Considerando o fracionamento, a fração metanólica
apresentou o maior rendimento em todas as espécies, seguindo uma ordem crescente
para H. myrianthum, H. caprifoliatum, H. carinatum e H. polyanthemum. A fração de
menor rendimento foi a diclorometânica da espécie H. caprifoliatum (p<0,0001).
Tabela 2.2: Rendimento em porcentagem dos extratos brutos metanólicos e frações metanólicas,
diclorometânicas e n-hexânicas das espécies de Hypericum.
Espécie Bruto
(% ± dp, n=3)
Metanólica
(% ± dp, n=3)
Diclorometânica
(% ± dp, n=3)
n-Hexânica
(% ± dp, n=3)
H. caprifoliatum
27,02 ± 1,37
c
21,70 ± 1,23
d
0,68 ± 0,10
h
2,66 ± 0,18
fgh
H. carinatum
33,61 ± 1,14
ab
27,54 ± 1,94
c
2,76 ± 0,51
fgh
2,23 ± 0,27
fgh
H. myrianthum
27,71 ± 2,32
c
15,25 ± 1,44
e
1,23 ± 0,29
gh
4,47 ± 0,31
f
H. polyanthemum
36,12 ± 1,06
a
32,18 ± 1,29
b
2,04 ± 0,14
fgh
3,37 ± 0,18
fg
a,b,c,d,e,f,g,h
Letras diferentes correspondem a valores estatisticamente diferentes (ANOVA seguida do teste
de Tukey; p<0,01).
3.5.2 Determinação de fenóis totais
Considerando as altas concentrações de substâncias fenólicas presentes em
diversos produtos naturais com ação antioxidante, os teores de fenólicos totais dos
extratos brutos metanólicos e das frações foram comparados para uma avaliação prévia
sobre o possível potencial antioxidante das mesmas.
Os resultados obtidos através do método de Folin-Ciocalteau para a
quantificação de compostos fenólicos presentes nas espécies de Hypericum analisadas
estão apresentados na figura 2.1. Os valores correspondem a uma média de 3
78
experimentos, obtidos com base na curva padrão de quercetina, e estão expressos em
EQ/g. A curva padrão (y = 0,1375x + 0,0417) mostrou-se linear na faixa de
concentração empregada, apresentando coeficiente de determinação de 0,9993. A
tabela 2.3 apresenta as absorvâncias médias encontradas para o padrão quercetina,
nas diferentes concentrações.
0
50
100
150
200
250
H. caprifoliatum H. carinatum H. myrianthum H. polyanthemum
mg Quercetina/g extrato seco
a
c c
b
a
a
d
c
b
b b
b
a
c
d c
Figura 2.1: Teor de compostos fenólicos, expresso em miligramas de quercetina por grama de extrato
seco (EQ/g) em extratos. e frações de espécies de Hypericum. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c,d
Considerando o mesmo extrato avaliado, letras diferentes correspondem a valores estatisticamente
diferentes (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( Bruto; MeOH; CH
2
Cl
2
; n-hexano)
Tabela 2.3: Valores de absorvância obtidos para quercetina nas soluções padrão, analisadas por
espectrofotometria no UV.
Concentração
(g/mL)
Absorvância
(média ± dp, n=3)
0 0,0418 ± 0,016
0,65 0,1208 ± 0,001
1,30 0,2235 ± 0,002
1,95 0,3095 ± 0,003
3,25 0,5023 ± 0,002
6,50 0,9288 ± 0,050
Os polifenóis apresentam-se como uma classe de substâncias amplamente
distribuída no reino vegetal, podendo estar presentes em altas concentrações em
determinados gêneros e espécies (H
ARBORNE, 1993). Entre as espécies de Hypericum
avaliadas o teor de substâncias fenólicas variou entre 37,40 a 228,36 mg EQ/g extrato
seco, sendo estes extremos encontrados dentro de uma mesma espécie, H. carinatum,
para fração n-hexânica e extrato bruto metanólico, respectivamente. A fração
79
metanólica de H. myrianthum e H. caprifoliatum foi a mais rica nessa classe de
substâncias, contrariando os resultados encontrados para as outras espécies, onde o
extrato bruto metanólico foi superior (H. carinatum) ou equivalente (H. polyanthemum) a
essa fração. O maior conteúdo de fenólicos nessa fração metanólica em relação ao
extrato bruto dessas duas espécies pode ser devido à presença de compostos não
fenólicos menos polares (tais como terpenóides) que estariam somando massa no
extrato bruto metanólico dessas duas espécies. Além disso, essas duas espécies
apresentam a particularidade de ocorrer precipitação expontânea de hiperosídeo em
suas frações metanólicas, devido ao elevado teor dessa substância na planta. A
purificação e concentração desse tipo de composto mediante o processo de
fracionamento poderia contribuir, portanto, para o maior conteúdo destes na fração
metanólica. O menor conteúdo de substâncias fenólicas foi verificado para as frações n-
hexânicas de H. polyanthemum e H. carinatum e fração diclorometânica desta última
espécie (p<0,0001).
A fração n-hexânica de H. polyanthemum apresentou um dos menores teores
de fenólicos, o que pode ser explicado pela presença majoritária dos benzopiranos
HP1, HP2 e HP3 (F
ERRAZ et al., 2001) nesse extrato, cujas estruturas apresentam
apenas uma ou nenhuma hidroxila fenólica.
Z
HENG & WANG (2001) determinaram o teor de fenólicos de um extrato aquoso
bruto de H. perforatum em 2,78 mg de equivalentes em ácido gálico, porém por grama
de peso fresco da planta. Quando avaliado o extrato metanólico dessa planta, obteve-
se um teor de 191 mg de ácido gálico por grama de extrato (Š
KERGET et al., 2005). Os
teores de fenólicos totais em extratos aquoso e etanólico de dezoito espécies de
Hypericum foram determinados utilizando pirocatecol como substância de referência.
Os autores verificaram teores variando entre 10,73 g de pirocatecol/g de planta para a
espécie H. lydum e 54,28 g de pirocatecol/g de planta para H. androsaemum, ambos
em extratos etanólicos. No entanto, considerando o extrato aquoso, o maior teor foi
observado para a espécie H. heterophyllum (45,31 g de pirocatecol/g de planta) (O
ZEN
et al., 2005).
80
De acordo com SINGLETON & ROSSI (1965), vários compostos fenólicos
apresentam diferentes respostas nesse ensaio. A resposta molar desse método é
aproximadamente proporcional ao número de grupamentos hidroxila presentes em uma
amostra, mas a capacidade redutora é aumentada quando duas hidroxilas fenólicas
encontram-se em orientação orto ou para na molécula (F
RANKEL et al., 1995).
3.5.3 Avaliação do potencial antioxidante total (TRAP)
O mecanismo da quimioluminescência do luminol, induzida através da
termólise de ABAP é dirigido pela produção de radicais derivados do luminol gerados
pela reação do luminol com radicais peroxila. A capacidade de uma amostra em inibir a
quimioluminescência induzida por luminol pode, então, ser relacionada a sua
capacidade em capturar radicais derivados do luminol (L
ISSI et al., 1992).
A intensidade da quimioluminescência dos radicais luminol formados foi
empregada para monitorar o potencial antioxidante total de extratos brutos metanólicos
das espécies de Hypericum e substâncias isoladas das mesmas, utilizando trolox e
quercetina como substâncias de referência.
A adição dos extratos com capacidade antioxidante promoveu uma diminuição
na quimioluminescência, por um determinado período (tempo de indução - TI),
proporcional à concentração de antioxidantes presentes nessa amostra (figura 2.2).
Como é possível verificar na figura (2.3), o decaimento na quimioluminescência
após a adição dos extratos das plantas e de quercetina no meio de reação, mostra-se
qualitativamente diferente do decaimento obtido empregando trolox. Esse
comportamento pode ser resultado da presença de antioxidantes eficientes e não
eficientes no extrato, e também devido à presença de hidroxilas mais ou menos reativas
na molécula de quercetina (D
ESMARCHELIER et al., 1997; DESMARCHELIER et al., 1999).
Enquanto a velocidade do decaimento inicial está relacionada com a presença de
antioxidantes eficientes na amostra, a variação na quimioluminescência medida após
81
um longo período pode estar relacionada ao total de antioxidantes (eficientes e não
eficientes) presentes na amostra (D
ESMARCHELIER et al., 1997).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920 1220 1520 1820
Time (s)
CPM % (CPM/CPM0)
C
[C] (mg/mL) TI (s)
_
________________
2,50 *
1,67 *
0,83 990
0,42 380
* QL não voltou a 20% do valor inicial
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920 1220 1520 1820
Time (s)
CPM % (CPM/CPM0)
B
y = 701.26x - 90.21
R
2
= 0.9887
0
1000
2000
0123
Concentração (µg/mL)
TI (s)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920 1220 1520 1840
Tempo (s)
CPM % (CPM/CPM0)
A
y = 687.11x - 278.04
R
2
= 0.9724
0
1000
2000
0123
Concentração (µg/mL)
TI (s)
82
Continuação da figura 2.2
Figura 2.2: Intensidade de quimioluminescência (contagens por minuto), medida após a adição de
concentrações crescentes dos extratos brutos metanólicos de H. caprifoliatum (A), H. carinatum (B), H.
myrianthum (C) e H. polyanthemum (D), bem como de quercetina (E) (-- 3,33; -- 2,5; -U- 1,67; -c-
0,83; -¯- 0,42 g extrato seco/mL; -¡- 1,1; -- 0,53; -S- 0,4 e -§- 0,27 M).
Comparando-se os extratos brutos metanólicos das quatro espécies avaliadas,
na concentração final de 1,67 g/mL, verificou-se que H. myrianthum apresenta uma
maior capacidade de capturar os radicais peroxila formados (figura 2.3). Ao comparar a
inibição da quimioluminescência no tempo de 900 segundos (próximo ao tempo de
indução promovido por trolox na concentração final de 1,1 M = 925 s), verificou-se que
o extrato de H. myrianthum apresenta o mesmo potencial antioxidante de quercetina e
de trolox, ambos na concentração de 1,1 M. A redução na intensidade da
quimioluminescência pelos extratos brutos de H. carinatum, H. polyanthemum e H.
caprifoliatum, nessa mesma concentração final de 1,67 g/mL, foi superior à inibição da
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920 1220 1520 1820
Tempo (s)
CPM % (CPM/CPM0)
D
y = 629.43x - 124.54
R
2
= 0.9849
0
1000
2000
3000
0123
Concentração (µg/m L)
TI (s)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920 1220 1520 1820
Tempo (s)
CPM % (CPM/CPM0)
E
y = 1585.5x - 205.43
R
2
= 0.9999
0
1000
2000
00.511.5
Concentração (µM)
TI (s)
83
quimioluminescência promovida por 0,53 M de quercetina (p<0,0001).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920 1220 1520 1820
Tempo (s)
CPM (CPM/CPM0)
Hpoly Hcapri Hmyri Hc ari Trolox 1,1 µM Quercetina 1,1 µM Quercetina 0,53 µM
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Hpoly Hcapri Hmyri Hcari Querc 0,53 µM Querc 1,1 µM Trolox 0,32 mM
% de Inibição QL
a
c
b
a a
e
d
B
Figura 2.3: (A) Efeito na intensidade de quimioluminescência (CPM), após a adição de 1,67 mg/mL
extratos brutos metanólicos de H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, bem
como quercetina nas concentrações de 0,53 e 1,1 M e trolox na concentração de 0,53 M. (B)
Percentual de inibição da quimioluminescência, no tempo de 900 s. Hpoly: H. polyanthemum; Hcapri: H.
caprifoliatum; Hmyri: H. myrianthum; Hcari: H. carinatum; Querc: quercetina. Os dados representam a
média ± dp.
a,b,c,d,e
Letras diferentes correspondem a valores estatisticamente diferentes (ANOVA seguida
do teste de Tukey; p<0,05).
Dentr as substâncias isoladas avaliadas quanto ao potencial antioxidante, as
benzofenonas A e B apresentaram capacidade em inibir a quimioluminescência. A
figura 2.4 mostra o efeito de carifenona A (5,33 e 10,7 M), carifenona B (10,7 M),
quercetina (0,53 e 1,1 M) e trolox (0,53 M) nas medidas do TRAP. Pode ser
visualizado que ambas benzofenonas exibiram atividade sequestrante dos radicais
peroxila, manifestado na redução da intensidade da luminescência. Carifenona A e B na
concentração de 10,7 M apresentaram uma inibição da quimioluminescência
84
equivalente a de 1,1 M de quercetina, substância considerada como potente agente
antioxidante. Uliginosina B não apresentou capacidade antioxidante através desse
método. Estes resultados estão publicados no periódico Journal of Natural Products, em
artigo intitulado “Benzophenones from Hypericum carinatum” (Anexo V, página 305).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
20 320 620 920
Tempo (s)
CPM (CPM/CPM0)
Carifenona A 10,7 µM Carifenona A 5,33 µM Carifenona B 10,7 µM
Quercetina 1,1 µM Quercetina 0,53 µM Trolox 0,53 µM
A
0
25
50
75
100
Carif A 10,7 µM Carif A 5,33 µM Carif B 10,7 µM Querc 0,53 µM Querc 1,1 µM Trolox 0,53 µM
% de Inibição QL
a
c
b
a aa
B
Figura 2.4: (A) Efeito na intensidade de quimioluminescência (CPM), após a adição de carifenona A (5,33
e 10,7 M), carifenona B (5,33 M), quercetina (0,53 e 1,1 M) e trolox (0,53 M). (B) Percentual de
inibição da quimioluminescência, no tempo de 700 s. Carif A: carifenona A; Carif B: carifenona B; Querc:
quercetina. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c
Letras diferentes correspondem a valores
estatisticamente diferentes (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
Devido ao perfil observado para o decaimento na quimioluminescência, após a
adição das amostras avaliadas, é possível concluir que o potencial antioxidante dos
extratos metanólicos das espécies de Hypericum deve-se à presença de antioxidantes
de alta e de baixa reatividades, sendo esses últimos em maior concentração.
85
3.5.4 Avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila (ORAC-PGV)
Dentre as técnicas amplamente utilizadas na avaliação da atividade
antioxidante, destaca-se a metodologia de ORAC, desenvolvida por C
AO e
colaboradores (1993), através da qual é possível a obtenção do índice ORAC, que está
relacionado à capacidade de uma molécula com ação antioxidante em retardar o
consumo de uma molécula alvo. Esse consumo é monitorado através da diminuição de
fluorescência da molécula alvo empregada (ficoeritrina, fluoresceína e c-ficocianina)
quando esta é incubada na presença de uma fonte de radical livre. A avaliação da
capacidade de reação com radicais peroxila foi realizada segundo metodologia proposta
por L
ÓPEZ-ALARCÓN & LISSI (2006), que apresenta um diferencial em relação a
metodologia clássica, uma vez que se baseia na medida da absorvância para monitorar
o consumo de pirogalol vermelho, utilizado como molécula alvo. A relação linear entre a
ASC e a concentração de antioxidante foi avaliada utilizando diferentes concentrações
de trolox, obtendo-se o coeficiente de determinação de 0,9974 para a equação da reta
y=412,12 + 26,4x. Através da integração das áreas sobre as curvas de decaimento na
absorvância de PGV, foi possível quantificar a capacidade de inibição dos radicais
peroxila pelas amostras em análise, expresso através do índice de ORAC-PGV (tabela
2.4).
A figura 2.5 mostra o consumo de PGV (5 µM), monitorado pela diminuição de
absorvância dessa substância a =540 nm, induzido por sua incubação na presença de
ABAP (10 mM), ambos na ausência (controle) e presença de concentrações crescentes
de trolox (A), 10 µM de quercetina (B) e 100 µM dos flavonóides guaijaverina (C),
hiperosídeo (D) e isoquercitrina (E). Na figura 2.6 estão ilustradas as curvas de
decaimento na absorvância de PGV na presença dos extratos brutos metanólicos de H.
caprifoliatum (A), H. carinatum (B), H. myrianthum (C) e H. polyanthemum (D).
86
Tabela 2.4: Índices ORAC-PGV, expresso em µMol de Trolox/g de extrato seco (ET/g), obtidos para
extratos brutos metanólicos das espécies de Hypericum avaliadas através do ensaio com PGV (dp:
desvio padrão).
Amostra ORAC-PGV (ET/g dp n=3)
Hypericum caprifoliatum
820,3 79,1
a
Hypericum carinatum
347,36 24,60
b
Hypericum myrianthum
260,91 63,67
b
Hypericum polyanthemum
239,76 33,00
b
a,b
Letras diferentes são significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey;
p<0,01).
Dentre as 4 espécies avaliadas, o maior índice de ORAC foi verificado para o
extrato bruto de H. caprifoliatum, sendo significativamente diferente das outras espécies
avaliadas H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum (p<0,0001).
Os flavonóides guaijaverina, hiperosídeo e isoquercitrina, testados na
concentração de 100 µM, não promoveram a proteção do consumo de PGV. Isso foi
evidenciado através da ASC obtida na presença dos flavonóides, estatisticamente
equivalente à ASC do controle, como pode ser visualizado na figura 2.6, onde a cinética
do consumo de PGV na presença dos flavonóides é similar a do controle. A ausência de
atividade dos flavonóides estudados contrasta com a alta atividade apresentada por
quercetina. Provavelmente, estas diferenças podem estar relacionadas com a
substituição na posição 3 destes derivados da quercetina. Estes resultados estão de
acordo com aqueles encontrados quando rutina foi avaliada nesse mesmo sistema
utilizando pirogalol vermelho como molécula alvo (L
ÓPEZ-ALARCÓN & LISSI, 2006). Em
geral, flavonóides contendo múltiplos grupamentos hidroxila apresentam alta atividade
antioxidante contra radicais peroxila. No entanto, glicosídeos, tais como rutina,
naringina e hesperidina, usualmente apresentam baixos valores de ORAC (R
OBARDS et
al., 1999). Devido ao fato de que a concentração de 100 µM é considerada elevada, em
relação às concentrações de trolox utilizadas, e a não proteção pelos flavonóides, em
100 µM, ao consumo de PGV, estes foram avaliados apenas nesta concentração.
87
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
Trolox 10 M
Trolox 30 M
Trolox 40 M
Trolox 50 M
A/A
0
Tempo (s)
A
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
B
A/A
0
Controle
Quercetina 10 M
Tempo (s)
0 200 400 600 800 1000 1200
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
Guaijaverina 100 M
A/A
0
Tempo (s)
C
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
Hiperosídeo 100 M
A/A
0
Tempo (s)
D
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
Isoquercetrina 100 M
A/A
0
Tempo (s)
E
Figura 2.5: Consumo de PGV, monitorado pela diminuição de absorvância a =540 nm, na ausência
(controle) e presença de concentrações crescentes de trolox (A), 10 µM de quercetina (B) e 100 µM dos
flavonóides guaijaverina (C), hiperosídeo (D) e isoquercitrina (E).
88
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
H. caprifoliatum 20,83 g/mL
A/A
0
Tempo (s)
A
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
H. carinatum 41,67 gmL
A/A
0
Tempo (s)
B
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
H. myrianthum 41,67 gmL
A/A
0
Tempo (s)
C
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
H. polyanthemum 41,67 gmL
A/A
0
Tempo (s)
D
Figura 2.6: Consumo de PGV, monitorado pela diminuição de absorvância a =540 nm, na ausência
(controle) e presença de 25 µL dos extratos brutos metanólicos de H. caprifoliatum (20,83 g/mL) (A), H.
carinatum (41,67 g/mL) (B) H. myrianthum (41,67 g/mL) (C) e H. polyanthemum (41,67 g/mL) (D).
Um índice ORAC de 16,77 µM de ET/g de peso fresco, obtido com (R)-
ficoeritrina como molécula alvo, foi obtido para o extrato bruto aquoso de H. perforatum
(Z
HENG & WANG, 2001). O valor de índice de ORAC é fortemente dependente da
molécula alvo empregada. A eficiência da amostra avaliada nessa metodologia é
consideravelmente menor na proteção de PGV do que com o uso de outras moléculas
alvo, uma vez que nessas condições experimentais, a competição pelos radicais
peroxila é dificultada pois a substância em análise não inibe o consumo da molécula
alvo, mas apenas reduz a taxa deste consumo (L
ÓPEZ-ALARCÓN & LISSI, 2006). O uso de
PGV como molécula alvo amplia a escala do índice ORAC (L
ÓPEZ-ALARCÓN & LISSI,
89
2006), de modo que os valores obtidos para as espécies estudadas são relativamente
maiores do que o valor encontrado para H. perforatum por Z
HENG & WANG (2001).
3.5.5 Avaliação da capacidade de reação com 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH
)
O modelo para avaliação da atividade antioxidante utilizando DPPH
é baseado
na capacidade do radical livre estável 2,2-difenil-1-picril-hidrazil em reagir com
substâncias doadoras de hidrogênio (2.3), incluindo compostos fenólicos (R
OGINSKY &
LISSI, 2005), sendo um método amplamente utilizado e relativamente rápido quando
comparado a outras técnicas (S
ÁNCHEZ-MORENO et al., 1998; MENSOR et al., 2001).
(2.3) DPPH
+ [AH]
n
DPPH-H + [A
]
n
O novo radical formado (A
) pode seguir a interação radical-radical para gerar
moléculas estáveis, através da colisão de radicais com a abstração de um átomo de um
radical para outro (2.4), embora essas reações secundárias sejam dificultadas. O
consumo de DPPH
é, portanto, um índice para estimar a capacidade antioxidante na
captura de radicais livres presentes no meio. No ensaio espectrofotométrico, a
absorvância a 517 nm diminui como um resultado de uma alteração na coloração
violeta característica para amarelo, uma vez que o radical é capturado por antioxidantes
presentes na amostra através da doação de um átomo de hidrogênio para formar a
molécula estável DPPH-H (E
SPÍN et al., 2000).
(2.4) DPPH
+ A
DPPH
-A
A
+ A
A-A
Neste trabalho, realizou-se preliminarmente um ensaio bioautográfico por CCD
com as amostras testadas, para avaliação de sua capacidade de reação com o radical
DPPH
. As amostras utilizadas para essa análise foram obtidas através do
fracionamento do material vegetal com solventes em polaridade crescente (n-hexano,
diclorometano e metanol), com a finalidade de avaliar a natureza das substâncias
90
responsáveis pela atividade antioxidante. Compostos isolados das espécies nativas
também foram avaliados. Após nebulização do cromatograma com uma solução de
DPPH
, compostos com capacidade antiradical apareceram como bandas amarelas.
Através da análise verificou-se a presença de compostos antioxidantes em todas as
frações de Hypericum. Valores de fator de retenção (Rf) das bandas foram comparados
com o de substâncias isoladas. Na fração metanólica foi verificada a presença de
flavonóides, sendo hiperosídeo uma das principais substâncias responsáveis pela
atividade antioxidante desta fração, nas quatro espécies estudadas. Nas frações n-
hexânica e diclorometânica observou-se bandas com fraca atividade antioxidante.
Posteriormente, foram realizadas cinéticas do consumo do radical DPPH
para
extratos e frações de espécies de Hypericum, bem como de produtos isolados das
mesmas, uma vez que foi verificada a capacidade de reação com o radical DPPH
,
através da bioautografia. As cinéticas de consumo foram ajustadas através de
regressão não-linear a uma equação de decaimento bi-exponencial (2.5) com a qual se
obtiveram os valores de A1, T1, A2 e T2, a partir dos quais foram calculados os
parâmetros consumo total (A1 + A2), consumo 50s (Abs
inicial
- Abs
50s
) e consumo 600s
(Abs
inicial
- Abs
600s
).
(2.5) y= y
0
+ A1 exp
(-x/T1)
+ A2 exp
(-x/T2)
Onde, A1 representa o consumo de DPPH
por antioxidantes de alta
reatividade; T1
-1
é uma medida da reatividade dos antioxidantes de alta reatividade; A2
representa o consumo de DPPH
por antioxidantes de baixa reatividade; T2
-1
é uma
medida da reatividade dos antioxidantes de baixa reatividade; A1 + A2 representa a
concentração total de compostos capazes de reagirem com DPPH
; Consumo aos 50 s
é uma medida dos antioxidantes de alta reatividade e se relaciona com A1; Consumo
aos 600 s proporciona uma estimativa de A1 + A2.
O perfil cinético do consumo de radicais DPPH
apresentou duplo
comportamento. Nos primeiros segundos observou-se um rápido decaimento da
91
absorvância e, posteriormente, um decaimento mais lento. DPPH
reage com
compostos doadores de hidrogênio através da equação 2.3, o que pode explicar por
que os dados experimentais podem ser melhor ajustados em uma equação bi-
exponencial, uma vez que o subíndice “n” na equação está relacionado à presença de
dois grupos de antioxidantes (alta e baixa reatividades) que diferem em suas
velocidades (rápida e lenta) para neutralizar o radical (E
SPÍN et al., 2000). Em função
disso, arbitrariamente foram avaliados os parâmetros de consumo rápido e lento do
radical DPPH
nos tempos de 50 e 600 segundos, respectivamente.
A adição das amostras na solução de DPPH
induziu uma rápida diminuição
na
absorvância a =517 nm. Nas figuras 2.7 e 2.8 estão representadas as curvas de
decaimento, obtidas durante o consumo do radical DPPH
ao agregar diferentes
concentrações do extrato bruto metanólico e das frações metanólicas e n-hexânicas das
espécies de Hypericum em análise. Os resultados da fração diclorometânica não são
apresentados pois não foram representativos devido a grande quantidade de clorofila
presente nesta fração, o que interferia nas análises. As figuras 2.9 e 2.10 mostram as
cinéticas obtidas ao agregar diferentes concentrações dos flavonóides guaijaverina,
isoquercitrina, hiperosídeo e 3-metil quercetina, dos derivados de floroglucinol
hiperbrasilol B, japonicina A e uliginosina B, bem como das benzofenonas carifenona A
e B. O consumo de radicais DPPH
pelas amostras avaliadas resultou em um padrão
similar nas curvas de decaimento da absorvância do radical versus tempo, sendo este
consumo dependente da concentração de amostra adicionada no meio de reação.
92
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
A
Hcari bruto MeOH
10,4 g/mL
20,8 g/mL
Absorvância
570nm
Tempo (s)
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
A'
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hcapri bruto MeOH
20,8 g/mL
41,7 g/mL
62,5 g/mL
83,3 g/mL
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
B
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hcari MeOH
10,4 g/mL
20,8 g/mL
41,7 g/mL
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
B'
Hcapri MeOH
20,8 g/mL
41,7 g/mL
Absorvância
570nm
Tempo (s)
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hcari n-hexano
41,7 g/mL
83,3 g/mL
125 g/mL
166,7 g/mL
250,0 g/mL
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C'
Hcapri n-hexano
20,8 g/mL
41,7 g/mL
83,3 g/mL
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Figura 2.7: Consumo do radical DPPH
(60 M), monitorado pela diminuição de absorvância a =517 nm,
ao agregar diferentes concentrações dos extratos brutos metanólicos (A, A’) e das frações metanólicas
(B, B’) e n-hexânicas (C,C’) de H. carinatum e H. caprifoliatum, respectivamente.
93
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
A
Hmyri bruto MeOH
20,8 g/mL
41,7 g/mL
62,5 g/mL
83,3 g/mL
Absorvância
570nm
Tempo (s)
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
A'
Tempo (s)
Absorvância
570nm
Hpoly bruto MeOH
20,8 g/mL
41,7 g/mL
83,3 g/mL
166,7 g/mL
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
B
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hmyri MeOH
10,4 g/mL
20,8 g/mL
41,7 g/mL
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
B'
Hpoly MeOH
41,7 g/mL
83,3 g/mL
125 g/mL
Absorvância
570nm
Tempo (s)
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Hmyri n-hexano
41,7 g/mL
83,3 g/mL
C
Absorvância
570nm
Tempo (s)
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C'
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hpoly n-hexano
83,3 g/mL
166,7 g/mL
250,0g/mL
333,3 g/mL
500,0g/mL
Figura 2.8: Consumo do radical DPPH
(60 M), monitorado pela diminuição de absorvância a =517 nm,
ao agregar diferentes concentrações dos extratos brutos metanólicos (A, A’) e das frações metanólicas
(B, B’) e n-hexânicas (C,C’) de H. myrianthum e H. polyanthemum, respectivamente.
94
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Guaijaverina
12,5 M
25,0M
50,0M
A
0 100 200 300 400 500 600
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
B
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hiperosídeo
25,0 M
50,0 M
100,0 M
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Isoquercitrina
25,0 M
50,0 M
100,0 M
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Absorvância
570nm
3-metil quercetina
25,0 M
50,0 M
100,0 M
Tempo (s)
D
Figura 2.9: Consumo do radical DPPH
(60 M), monitorado pela diminuição de absorvância a =517 nm,
ao agregar diferentes concentrações dos flavonóides guaijaverina (A), hiperosídeo (B), isoquercitrina (C)
e 3-metil quercetina (D).
95
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Hiperbrasilol B
50,0 M
100,0 M
200,0 M
400,0 M
A
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Japonicina A
50,0 M
100,0 M
200,0 M
400,0 M
B
0 100 200 300 400 500 600
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C
Tempo (s)
Absorvância
570nm
Uliginosina B
50 M
100 M
200 M
400 M
0 100 200 300 400 500 600
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
D
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Carifenona A
50,0 M
100,0 M
200,0 M
0 200 400 600 800 1000 1200
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
E
Carifenona B
100,0 M
400,0 M
Absorvância
570nm
Tempo (s)
Figura 2.10: Consumo do radical DPPH
(60 M), monitorado pela diminuição de absorvância a =517
nm, ao agregar diferentes concentrações dos derivados de floroglucinol hiperbrasilol B (A), japonicina A
(B), e uliginosina B (C) e das benzofenonas carifenona A (D) e carifenona B (E).
96
Foram realizadas leituras com diferentes concentrações de amostra, tanto para
os produtos isolados quanto para as misturas complexas. As medidas foram realizadas
em triplicatas apenas com concentrações que promovessem um decaimento da
absorvância do DPPH
próximo aos 50%, ou que pudessem ser utilizadas para medidas
de comparação entre os diferentes extratos ou entre as substâncias. Os dados obtidos
para as amostras em estudo que foram utilizadas para medidas de comparação estão
apresentados em anexo (Anexo VI, página 311) nos quadros 2.2, 2.3, 2.4 e 2.5.
A quantidade de DPPH
removida do meio, acompanhada pela diminuição na
absorvância da solução do radical, é proporcional à atividade da amostra, sendo
possível, portanto, assumir que o consumo de DPPH
é equivalente à capacidade
antioxidante pelas substâncias presentes na amostra (E
SPÍN et al., 2000). O percentual
de consumo do radical DPPH
foi calculado de acordo com a equação 2.6.
(2.6) %Consumo= [(Consumo*)/Abs
0
]X100;
*Consumo Total= A1 + A2; Consumo 50s= Abs
0
-Abs
50s
; Consumo 600s= Abs
0
-Abs
600s
Onde, Abs
0
é a absorvância do controle a t=0s, Abs
50s
é a absorvância após
50s de reação e
Abs
600s
é a absorvância após 600 s de reação.
O percentual de consumo total, de consumo 50 s e de consumo 600 s foi
comparado entre os diferentes extratos de uma mesma planta (figura 2.11), entre o
mesmo extrato de diferentes plantas (figura 2.12), bem como entre as substâncias
isoladas (figura 2.13).
97
0
25
50
75
100
Bruto MeOH 41,7 µg/mL n-Hexano 41,7 µg/mL MeOH 41,7 µg/mL
Hypericum caprifoliatum
% de Consumo de DPPH
A
a
a
b
c
b
c
a
b
c
0
25
50
75
100
Bruto MeOH 20,8 µg/mL n-Hexano 166,7 µg/mL MeOH 20,8 µg/mL
Hypericum carinatum
% de Consumo de DPPH
B
a
b
a
b
c
c a
b
c
0
25
50
75
100
Bruto MeOH 41,7 µg/mL n-Hexano 41,7 µg/mL MeOH 41,7 µg/mL
Hypericum myrianthum
% de Consumo de DPPH
C
a
a
b b
c
c
a
b
c
0
25
50
75
100
BrutoMeOH 41,7 µg/mL n-Hexano 500 µg/mL MeOH 41,7 µg/mL
Hypericum polyanthemum
% de Consumo de DPPH
D
b
b
a
a
b b
Figura 2.11: Comparação entre consumo do radical DPPH
(consumo total, consumo aos 50 s e consumo
aos 600 s) para os diferentes extratos das plantas H. carinatum, H. caprifoliatum, H. myrianthum e H.
polyanthemum. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c
Considerando o mesmo tempo de reação, letras
diferentes correspondem a valores estatisticamente diferentes (ANOVA seguida do teste de Tukey;
p<0,05).
( Consumo total; Consumo 600 s; Consumo 50 s)
98
0
25
50
75
100
H. caprifoliatum H. carinatum H. polyanthemum H. myrianthum
Bruto MeOH (20,8 µg/mL)
% de Consumo de DPPH
A
b
b
b
c
a
a a
c
c
c
c
c
0
25
50
75
100
H. caprifoliatum H. myrianthum H. carinatum* H. polyanthemum**
n-Hexano (41,7 µg/mL, *166,7 µg/mL, **500 µg/mL)
% de Consumo de DPPH
B
b
b,c
a
a
a
b
c
c
a,b a,b
b
b
0
25
50
75
100
H. caprifoliatum H. carinatum H. polyanthemum H. myrianthum
MeOH 41,7 µg/mL
% de Consumo de DPPH
C
b
b
a
a
a
b
c
c
d
d
j
c
c
Figura 2.12: Comparação entre consumo do radical DPPH
(consumo total, consumo aos 50 s e consumo
aos 600 s) para os extratos bruto MeOH e frações n-hexânica e MeOH das espécies de Hypericum.
Os
dados representam a média ± dp.
a,b,c
Considerando o mesmo tempo de reação, letras diferentes
correspondem a valores estatisticamente diferentes (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( Consumo total; Consumo 600 s; Consumo 50 s)
99
0
25
50
75
100
hiperosídeo isoquercitrina guaijaverina 3-metil
quercetina
25 µM
% de Consumo de DPPH
a
a
a
b,c
b
b
b
b
b
c
c c
0
25
50
75
100
hiperbrasilol B japonicina A uliginosina B carifenona A carifenona B
100 µM
% de Consumo de DPPH
b
c
b
a
b
b d
a
c
a
b
d
c
b
a
Figura 2.13: Comparação entre consumo do radical DPPH
(consumo total, consumo aos 50 s e consumo
aos 600 s) para as substâncias isoladas, sendo os flavonóides, avaliados na concentração de 25 M e
entre floroglucinóis e benzofenonas, na concentração de 100 M. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c
Considerando o mesmo tempo de reação, letras diferentes correspondem a valores estatisticamente
diferentes (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( Consumo total; Consumo 600 s; Consumo 50 s)
Os resultados obtidos demonstram que todos os componentes isolados,
extratos e frações, com exceção dos benzopiranos, apresentaram atividade
antioxidante em maior ou menor proporção, medida em termos de consumo do radical
DPPH
.
Para H. myrianthum e H. caprifoliatum a maior atividade antioxidante, medida
através da capacidade de reação com o radical DPPH
foi verificada para a fração
metanólica. Dentre as frações metanólicas das plantas avaliadas, a menor atividade foi
verificada para H. polyanthemum. Baseado no mecanismo de redução da molécula de
100
DPPH
e no conhecimento prévio da constituição química das espécies avaliadas, é
possível inferir que a ação antioxidante apresentada pela fração metanólica deve-se, ao
menos em parte, à presença de substâncias com grupamentos hidroxila disponíveis,
tais como os flavonóides (M
ENSOR et al., 2001; SILVA et al., 2005a).
A fração n-hexânica demonstrou a menor atividade em neutralizar radicais
DPPH
, principalmente para as espécies H. polyanthemum e H. carinatum, cujas
concentrações necessárias para a obtenção de uma atividade semelhante a de H.
caprifoliatum e H. myrianthum foi muito superior. No entanto, H. carinatum apresentou a
maior atividade para o extrato bruto, sendo essa atividade principalmente devida a
compostos fenólicos mais polares, uma vez que a avaliação da fração n-hexânica
mostrou baixa atividade para a mistura de compostos lipofílicos dessa planta. No
entanto, o maior consumo do radical pelo extrato bruto desta planta, em relação à
fração metanólica, sugere um possível efeito sinérgico da fração polar com as
substâncias mais apolares. Além disso, o extrato bruto desta espécie apresentou o
maior conteúdo de fenólicos totais, podendo sugerir uma correlação entre a atividade
antioxidante deste extrato e a composição química do mesmo.
Nas quatro espécies avaliadas, o extrato bruto apresentou a maior proporção
de antioxidantes de alta reatividade, evidenciado pelo maior consumo do radical DPPH
nos primeiros 50 s de reação. Dentre estas, H. carinatum apresentou a maior proporção
desse tipo de substâncias. Todos os extratos brutos metanólicos apresentaram um
consumo de cerca de 50% do consumo total nos primeiros 50 s de reação, o que indica
que de todas as plantas são extraídas com esse solvente substâncias de alta
reatividade com o radical DPPH
. O percentual consumido nos primeiros 50 s diminuiu
com o fracionamento, indicando a possibilidade de ocorrência de uma interação entre
compostos mais polares e compostos apolares.
Entre os compostos isolados (figura 2.13), verificou-se maior atividade
antioxidante para os flavonóides guaijaverina, hiperosídeo e isoquercitrina. Dentre
esses, guaijaverina apresentou maior reatividade, sendo hiperosídeo e isoquercitrina
101
similares na capacidade de reagir com o DPPH
. A atividade do flavonóide 3-metil
quercetina foi comparável a das outras classes de substâncias fenólicas avaliadas
nesse trabalho. Considerando o percentual de consumo total do radical DPPH
apresentado pela substância de referência quercetina (figura 2.14), todas as
substâncias avaliadas apresentaram atividade consideravelmente inferior a este
flavonóide.
A atividade antioxidante de flavonóides está correlacionado a sua estrutura
química (C
OOK & SAMMAN, 1996; RICE-EVANS et al., 1996; YOKOZAWA et al., 1997; SON &
LEWIS, 2002; SOOBRATTEE et al., 2005; TSIMOGIANNIS & OREOPOULOU, 2006). Em geral, a
capacidade de neutralizar radicais livres e a atividade antioxidante depende da estrutura
molecular do flavonóide e do padrão de substituição de grupamentos hidroxila doadoras
de hidrogênio (número e posição), uma vez que essas propriedades influenciam na
disponibilidade de hidrogênios fenólicos e na possibilidade de estabilização, via ponte
de hidrogênio ou deslocalização eletrônica, do radical fenoxila resultante
(AMIC et al.,
2003).
0
25
50
75
100
6,25 9,38 12,5 25
Quercetina (µM)
% de Consumo de DPPH
Figura 2.14: Percentual de consumo total do radical DPPH
, avaliado em concentrações crescentes de
quercetina.
Considerando os flavonóis, classe de flavonóides avaliada nesse trabalho, a
presença de uma -OH livre na posição C-3 aumenta a capacidade antioxidante, que é
consideravelmente reduzida com a glicosilação ou metoxilação deste grupamento. Da
mesma maneira, hidroxilas nas posições C-5 e C-7 do anel A e C-3’ e C-4’ do anel B
102
parecem contribuir para a atividade antioxidante (COOK & SAMMAN, 1996; RICE-EVANS et
al., 1996; A
MIC et al., 2003). Os quatro flavonóides avaliados no presente trabalho são
derivados da quercetina, diferindo entre si com relação à substituição na posição C-3,
onde guaijaverina, hiperosídeo e isoquercitrina apresentam açúcar e 3-metil quercetina
um grupamento metoxila. O açúcar ligado na posição C-3 parece afetar a capacidade
neutralizadora de radicais livres em flavonóis através de alterações na distribuição
eletrônica e da participação na deslocalização de elétrons, ou ainda através de
mecanismos desconhecidos
(YOKOZAWA et al., 1997).
Apesar de ser bem estabelecido que a presença da posição 3 livre em
flavonóides é importante para a ação antioxidante, quercetina-3-O-
-
arabinofuranosídeo, cuja posição 3 está protegida por uma pentose, diferindo de
guaijaverina (quercetina-3-O-
-arabinopiranosídeo) apenas na conformação do anel do
açúcar, apresentou maior capacidade de reação com o radical DPPH
em relação à
quercetina e também ao hiperosídeo (C
AKIR et al., 2003). Segundo YOKOZAWA e
colaboradores (1997), a configuração da molécula de flavonóis e flavonas, sejam
agliconas ou glicosídeos, parece ser importante na determinação de sua atividade
antioxidante.
Segundo vários autores, a capacidade de neutralização de radicais livres por
compostos fenólicos aumenta com o número total de grupamentos hidroxilas,
provavelmente devido a perda de um hidrogênio vulnerável e estabilidade do radical
assim formado devido à ressonância eletrônica. No entanto, apenas japonicina A
apresentou uma atividade significativamente superior quando comparada com os outros
derivados de floroglucinol e benzofenonas, cujas estruturas químicas possuem 4 e 2
hidroxilas fenólicas, respectivamente. Considerando ainda este aspecto, através do
ensaio de TRAP, verificou-se atividade antioxidante apenas para carifenona A e
carifenona B, onde simultaneamente avaliou-se a atividade do floroglucinol uliginosina
A, com baixa capacidade de reagir com radicais peroxila, gerados por ABAP. Utilizando
o ensaio de DPPH
, garcinol, uma benzofenona poliisoprenilada, apresentou forte
atividade antioxidante, com ação superior a de
-tocoferol (YAMAGUCHI et al., 2000).
103
A avaliação do consumo de DPPH
nos estágios rápido e lento pode revelar a
contribuição de diferentes grupos funcionais na reação de captura do radical livre
(T
SIMOGIANNIS & OREOPOULOU, 2006). Carifenona A apresentou um maior consumo de
DPPH
nos primeiros 50 s (76,9%), o que pode indicar a presença de grupamentos
hidroxila altamente reativos. Apesar de essa substância apresentar estrutura isômera a
de carifenona B, nesta última verificou-se menor capacidade antioxidante.
Os benzopiranos HP1 e HP3 não apresentaram atividade frente ao radical
DPPH
na máxima concentração de trabalho (400 M). O composto HP2 apresentou um
leve consumo de radical no ensaio espectrofotométrico e uma fraca atividade no ensaio
bioautográfico, onde apenas HP2 promoveu a alteração da cor violeta característica do
DPPH
para amarelo.
A fração n-hexânica de H. polyanthemum apresentou um consumo de DPPH
próximo aos 50% apenas com 500 µg/mL, uma concentração 10 vezes superior à essa
mesma fração de H. caprifoliatum e H. myrianthum e 3 vezes superior a de H.
carinatum. Esse comportamento pode estar relacionado à presença majoritária dos
benzopiranos HP1, HP2 e HP3 na fração n-hexânica (F
ERRAZ et al., 2001). Essa fraca
atividade pode ser, então, devida à presença do floroglucinol uliginosina B, cujo teor é
baixo nessa planta. Da mesma maneira, H. carinatum não apresentou boa atividade
para a fração n-hexânica, de onde foram extraídas as benzofenonas, provavelmente
devido à baixa concentração dessas substâncias na planta. A boa atividade
antioxidante da fração n- hexânica para H. myrianthum e H. caprifoliatum pode estar
relacionada a presença majoritária de derivados de floroglucinol extraídos por esse
solvente nessas plantas, como japonicina A, hiperbrasilol B e uliginosina A (F
ERRAZ et
al., 2002a; D
ALL’AGNol et al., 2004; NÖR et al., 2004) bem como a substâncias não
identificadas ou então interações sinérgicas (Z
HENG & WANG, 2001).
3.5.6 Avaliação da correlação entre o conteúdo de compostos fenólicos e a
capacidade antioxidante
104
Em geral, extratos ou frações com alta atividade antioxidante e capacidade de
neutralizar radicais livres apresentam um alto conteúdo de substâncias fenólicas. Ao
submeter os resultados (ação antioxidante e conteúdo de fenólicos) de todos os
extratos e frações de cada espécie à análise de regressão, pode-se verificar uma
correlação linear entre esses dois parâmetros em muitos trabalhos (Z
HENG & WANG,
2001; P
AREJO et al., 2003; CAI et al., 2004; KATALINIC et al., 2006).
Flavonóides derivados da quercetina, ácidos fenólicos e taninos são os
componentes predominantes das frações metanólicas das espécies de Hypericum
nativas do RS (D
ALL’AGNOl et al., 2003), e as propriedades antioxidantes dessas
substâncias fenólicas já vem sendo descritas na literatura (C
ONFORTI et al., 2002; CAKIR
et al., 2003; Z
OU et al., 2004; LIU et al., 2005). No entanto, houve uma baixa correlação
linear entre a atividade antioxidante, expressa em percentual de DPPH
consumido, e o
conteúdo de fenólicos totais para o extrato bruto (R
2
= 0,6635) e para a fração
metanólica (R
2
= 0,3816). Em relação à fração n-hexânica, não houve correlação linear
(R
2
= 0,0028). Essa discordância entre a atividade antioxidante de extratos vegetais e o
conteúdo de substâncias fenólicas já foi previamente relatado (M
AILLARD & BERSET,
1995; H
EINONEN et al., 1998; AKOWUAH et al., 2004; ŠKERGET et al., 2005).
A atividade antioxidante de extratos vegetais não é limitada às substâncias
fenólicas. A presença de diferentes componentes no extrato, tais como açúcares e
outros compostos que funcionam como doadores de H, podem erroneamente contribuir
para a concentração de fenólicos totais determinada através do método de Folin-
Ciocalteau (A
KOWUAH et al., 2004). Além disso, métodos para a avaliação da atividade
antioxidante de extratos não eliminam a possibilidade de interações entre substâncias e
efeitos sinérgicos ou inibitórios com o sistema utilizado. O sinergismo de flavonóides
com tocoferóis e ácido cítrico já foi descrito (Š
KERGET et al., 2005; DAWIDOWICZ et al.,
2006). Desse modo, não há uma simples relação entre a concentração de fenólicos
totais e a atividade antioxidante quando compara-se extratos de plantas
(AKOWUAH et
al., 2004;
ŠKERGET et al., 2005).
105
3.6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no estudo descrito neste capítulo 2 permitem concluir
que:
Considerando o fracionamento do processo de extração, a fração metanólica
apresentou o maior rendimento em todas as espécies, seguindo uma ordem crescente
para H. myrianthum, H. caprifoliatum, H. carinatum e H. polyanthemum. As frações
diclorometânica e n-hexânica apresentaram rendimentos similares entre si.
Considerando o mesmo extrato avaliado, os maiores teores de fenólicos
totais foram evidenciados para o extrato bruto de H. carinatum, para a fração
metanólica de H. myrianthum, para a fração diclorometânica de H. polyanthemum e
para a fração n-hexânica de H. myrianthum. Dentre as espécies avaliadas, H. carinatum
foi a única cujo teor de fenólicos totais do extrato bruto foi superior aos demais extratos
da planta.
No ensaio de TRAP, o extrato bruto metanólico da espécie H. myrianthum
apresentou a maior capacidade de capturar os radicais peroxila formados. Na
concentração final de 1,67 g/mL, esse extrato apresenta o mesmo potencial
antioxidante de quercetina e de trolox, ambos na concentração de 1,1 M.
Nesse mesmo ensaio, o efeito dos extratos brutos de H. carinatum, H.
polyanthemum e H. caprifoliatum, na concentração final de 1,67 g/mL, foi superior à
inibição da quimioluminescência promovida por 0,53 M de quercetina.
As substâncias carifenona A e B, na concentração de 10,7 M, apresentaram
no ensaio de TRAP, uma inibição da quimioluminescência equivalente à de 1,1 M de
quercetina. Uliginosina B não apresentou capacidade antioxidante através desse
método.
106
O maior índice de ORAC-PGV foi verificado para o extrato bruto de H.
caprifoliatum (820,3 ET/g extrato seco).
No ensaio de ORAC-PGV, os flavonóides guaijaverina, hiperosídeo e
isoquercetrina, testados na concentração de 100 µM, não promoveram a proteção do
consumo de PGV.
A presença de compostos antioxidantes foi evidenciada em todas as frações
das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, quando
avaliadas através da capacidade de reação com o radical DPPH
, no ensaio
bioautográfico por CCD. Hiperosídeo foi considerada uma das principais substâncias
responsáveis pela atividade antioxidante da fração metanólica nas quatro espécies
estudadas. Substâncias com fraca atividade antioxidante foram detectadas nas frações
n-hexânica e diclorometânica, através desta técnica bioautográfica.
Considerando os extratos avaliados no ensaio espectrofotométrico as frações
metanólicas de H. myrianthum e H. caprifoliatum apresentaram a maior atividade
antioxidante, medida através da capacidade de reação com o radical DPPH
. Dentre as
frações metanólicas das plantas avaliadas, a menor atividade foi verificada para H.
polyanthemum.
A fração n-hexânica demonstrou a menor atividade em neutralizar radicais
DPPH
, principalmente para as espécies H. polyanthemum e H. carinatum.
H. carinatum foi a única espécie cujo extrato bruto apresentou a maior
atividade em neutralizar radicais DPPH
em comparação à fração metanólica,
principalmente devido a compostos fenólicos mais polares.
Nas quatro espécies avaliadas, principalmente na espécie H. carinatum, o
extrato bruto apresentou a maior proporção de antioxidantes de alta reatividade frente
ao radical DPPH
. O percentual consumido nos primeiros 50 s diminuiu com o
107
fracionamento, indicando a possibilidade de ocorrência de uma interação entre
compostos mais polares e compostos apolares.
Dentre as substâncias isoladas, a maior capacidade de reação com DPPH
foi evidenciada para os flavonóides guaijaverina, hiperosídeo e isoquercitrina.
Guaijaverina apresentou maior reatividade, sendo hiperosídeo e isoquercitrina similares
na capacidade de reagir com esse radical, indicando uma possível interferência do
açúcar ligado na posição C-3 na capacidade neutralizadora de radicais livres em
flavonóis.
Japonicina A apresentou uma atividade antioxidante frente ao radical DPPH
significativamente superior quando comparada com hiperbrasilol B, uliginosina B,
carifenona A e carifenona B.
Carifenona A apresentou um maior consumo de DPPH
nos primeiros 50 s de
reação (76,9%), inferindo a presença de grupamentos hidroxila altamente reativos.
Os benzopiranos, HP1 e HP3 não apresentaram atividade na máxima
concentração de trabalho (400 M). O composto HP2 apresentou um leve consumo de
radical DPPH
no ensaio espectrofotométrico e bioautográfico.
Uma baixa correlação linear foi evidenciada entre a atividade antioxidante,
expressa em percentual de DPPH
consumido, e o conteúdo de fenólicos totais para o
extrato bruto (R
2
= 0,6635) e para a fração metanólica (R
2
= 0,3816). Em relação à fração
n-hexânica, não houve correlação linear (R
2
= 0,0028).
108
109
4. CAPÍTULO 3
CULTURA IN VITRO DE CÉLULAS E TECIDOS DE ESPÉCIES DE HYPERICUM
NATIVAS DO RIO GRANDE DO SUL
110
111
4.1 INTRODUÇÃO
Os promissores resultados biológicos revelados para extratos e substâncias
isoladas das espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul, têm ocasionado
uma crescente demanda por estas plantas, visando a continuidade nos estudos
iniciados. No entanto, as espécies de Hypericum brasileiras apresentam uma
distribuição restrita, com pequenas populações dispersas ou, ainda, restritas a uma
única localidade (R
OBSON, 1990; VON POSER et al., 2006). Conseqüentemente, a
exploração da flora nativa pode levar a reduções drásticas das populações naturais
dessas espécies, colocando-as em risco de extinção.
Desta forma, métodos de cultivo in vitro que possibilitem a propagação e
conservação das espécies de Hypericum apresentam-se como uma opção para a
obtenção de matéria-prima de interesse e redução do extrativismo.
Estudos de cultivo in vitro haviam sido realizados com uma única espécie
brasileira. Protocolos para a propagação em massa, bem como para indução de calos
visando a obtenção de metabólitos secundários foram desenvolvidos para H. brasiliense
(C
ARDOSO & DE OLIVEIRA, 1996).
H. polyanthemum é uma das espécies nativas do Rio Grande do Sul que se
encontra criticamente ameaçada, estando incluída na lista de espécies do sul do Brasil
em extinção (
VON POSER et al., 2006). Considerando o aspecto ecológico e,
principalmente, as propriedades biológicas relacionadas aos extratos e produtos
isolados dessa planta, esse trabalho está direcionado a um estudo mais detalhado
desta espécie.
4.2
OBJETIVOS
Estabelecimento de protocolos de micropropagação in vitro para as espécies H.
campestre Cham. & Schltdl., H. caprifoliatum Cham. & Schltdl., H. carinatum Griseb., H.
112
myrianthum Cham. & Schltdl., H. polyanthemum Klotzsch ex Reichardt e H. ternum A.
St. Hil.
Avaliar a influência da concentração de sais do meio de cultivo no
desenvolvimento in vitro das espécies micropropagadas H. campestre, H. carinatum, H.
myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum.
Avaliar a influência de reguladores de crescimento na indução de calos em
culturas in vitro das espécies H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum.
Análise química comparativa, através de cromatografia em camada delgada,
entre as substâncias produzidas in vitro pelas culturas de células e tecidos e as
substâncias produzidas pelas espécies H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H.
myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum, desenvolvidas in natura.
Análise química das raízes de H. campestre e de H. polyanthemum mantidas
sob cutivo in vitro durante período superior a três meses, sem transferência para meio
de cultura fresco.
4.3
REVISÃO
4.3.1 Cultura in vitro
A biotecnologia vegetal utiliza como recurso a capacidade que as plantas
apresentam de regenerar-se totalmente a partir de suas células ou tecidos. Segundo a
teoria da totipotencialidade proposta por GOTTLIEB HABERLANDT, cada célula é
autônoma, contendo o potencial necessário para originar um organismo inteiro. Essa
habilidade de totipotência permite que as células somáticas vegetais se dividam, se
diferenciem em plântulas e expressem capacidades bioquímicas especializadas quando
cultivadas sob condições apropriadas (FRANÇA, 2003).
113
A cultura de calos e a suspensão celular envolvem a manutenção de células
desorganizadas em um meio nutritivo. No entanto, órgãos vegetais diferenciados
podem desenvolver-se em cultura, sem perda da integridade (G
EORGE, 1993). O calo se
apresenta como uma massa celular indiferenciada, formado quando as células vegetais
multiplicam-se continuamente e de modo desorganizado (B
ARRUETO CID, 2001). A
indução do crescimento de um calo e de sua subseqüente diferenciação e
organogênese é efetuada pelo controle das condições, manipulação de nutrientes e
aplicação de reguladores de crescimento no meio de cultura (R
AMACHANDRA RAO &
RAVISHANKAR, 2002).
A micropropagação é assim denominada devido ao emprego de porções de
tecido bastante pequenas como explantes, como é chamado o material vegetal
removido da planta íntegra e utilizado para dar início a uma cultura in vitro de células ou
tecidos (G
RATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Utilizada freqüentemente para a obtenção de
clones que mantêm todas as características da planta-mãe, a regeneração de plântulas
in vitro através da cultura de brotos apresenta-se como uma técnica especialmente
vantajosa para a preservação de genótipos produtores de compostos medicinais (R
OUT
et al., 2000; F
RANÇA, 2003).
O sucesso do cultivo in vitro de diferentes plantas depende de inúmeros
fatores. Por essa razão, cada espécie em particular requer um protocolo de
micropropagação diferenciado, visto que ocorre variabilidade na resposta morfogenética
in vitro não apenas entre espécies do mesmo gênero, mas também entre genótipos da
mesma espécie (G
RATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; ROUT et al., 2000). Cada espécie ou
clone apresenta características únicas, determinadas por fatores genéticos, de modo
que as necessidades para seu cultivo in vitro também tendem a ser únicas. A
capacidade de regeneração e crescimento in vitro parece estar associada não apenas
ao genótipo, mas também à atividade fisiológica na planta matriz, sob o controle de
diversos fatores endógenos (G
RATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Dentre os fatores que afetam esse processo pode-se incluir influências
114
ambientais, como intensidade luminosa e qualidade da luz empregada, temperatura e
umidade relativa, bem como a composição do meio nutriente. A literatura apresenta
diferentes meios de cultura, como os meios de White, MS (M
URASHIGE & SKOOG, 1962)
e B5 (G
AMBORG et al., 1968), que possuem diferenças quanto à composição e
concentração dos componentes. O meio MS, juntamente com o B5, é usado na cultura
de tecidos da grande maioria das espécies, podendo apresentar algumas modificações,
tanto qualitativas quanto quantitativas (C
ALDAS et al., 1998). Além dos nutrientes
básicos, reguladores de crescimento são necessários para iniciar e manter a divisão
celular (R
EINERT & YEOMAN, 1982; ROUT et al., 2000; RAMACHANDRA RAO & RAVISHANKAR,
2002).
Dentre os reguladores de crescimento, as citocininas desempenham papel
fundamental no crescimento e morfogênese em cultura de tecidos, estimulando a
divisão celular, bem como a indução e proliferação de brotações adventícias (G
EORGE &
SHERRINGTON, 1984). As citocininas, em especial a 6-benzilamino-purina (BAP),
produzem crescimento das gemas laterais e das folhas, e antagonizam os efeitos das
auxinas, como o ácido indol-acético (AIA), ácido indol-butírico (AIB) e ácido naftaleno-
acético (ANA). As auxinas também são responsáveis pelo crescimento, inibindo o
desenvolvimento das gemas laterais (R
AVEN et al., 1985). Quantidades excessivas
dessas substâncias promovem crescimento de calos. O ácido 2,4 dicloro-fenóxi-acético
(2,4-D), uma auxina sintética, tende a estimular a produção de calos, mesmo em baixas
concentrações, e o AIB é muito eficaz para o enraizamento. As giberelinas, como o
ácido giberélico, são úteis ao alongamento do caule, mas são pouco utilizadas
(G
RATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Técnicas de biotecnologia celular vegetal vêm sendo desenvolvidas para a
propagação, regeneração e melhoramento de plantas, destacando-se entre elas a
micropropagação, embriogênese somática, cultura de calos, cultura de células em
suspensão, cultura de ápices caulinares, anteras ou raízes. Esses métodos de cultivo in
vitro de células, tecidos e órgãos vegetais em meios nutritivos, estão sendo amplamente
utilizados para a propagação de um grande número de espécies de plantas, sendo
115
muitas das quais de uso medicinal (ROUT et al., 2000; RAMACHANDRA RAO &
RAVISHANKAR, 2002).
Após o desenvolvimento de protocolos de cultivo in vitro, a aclimatização
constitui uma etapa fundamental na produção de plantas obtidas por cultura de tecidos,
uma vez que as condições de cultura in vitro modificam características bioquímicas,
anatômicas e morfológicas das plantas, alterando os processos fisiológicos normais
(N
ETO et al., 2004).
Em função das potenciais atividades biológicas agregadas aos extratos ou
produtos isolados das espécies do gênero Hypericum, estudos têm sido direcionados
ao desenvolvimento de culturas in vitro, como uma alternativa para multiplicação e para
produção de metabólitos secundários destas espécies (C
ARDOSO & DE OLIVEIRA, 1996;
K
ARTNIG et al., 1996; BAIS et al., 2002; MCCOY & CAMPER, 2002; MURCH et al., 2002;
ZOBAYED et al., 2004; GADZOVSKA et al., 2005; COUCEIRO et al., 2006).
4.3.2 Regeneração e propagação de espécies do gênero Hypericum
O desenvolvimento de um processo de propagação in vitro apresenta três
estágios. Nos sistemas de micropropagação, o estágio I envolve a seleção de
explantes, desinfestação e cultura em meio nutritivo sob condições assépticas. No
estágio II ocorre a multiplicação dos propágulos mediante sucessivas subculturas em
meio próprio para multiplicação. Finalmente, o estágio III é caracterizado pela
transferência das partes aéreas produzidas para um meio de enraizamento, que induz a
formação de raízes adventícias nas partes aéreas provenientes da multiplicação,
permitindo o posterior transplantio das plantas obtidas para substrato ou solo,
mantendo-se uma condição ex vitro (B
HOJWANI & RAZDAN, 1992; GEORGE, 1993;
GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Este esquema permite alterações conforme as
características de cada espécie. Pode ser necessária uma fase adicional de
alongamento das partes aéreas antes do enraizamento. Também é possível eliminar a
etapa de enraizamento in vitro através da manipulação das partes aéreas como
116
microestacas, as quais enraízam diretamente no substrato de transplantio
(G
RATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
O uso mais popular da micropropagação é como uma alternativa aos métodos
convencionais de propagação vegetativa, com o objetivo de aumentar a taxa de
multiplicação. Através desta técnica, plantas inteiras podem ser formadas a partir de
pequenos explantes. Esta taxa de proliferação e multiplicação não pode ser esperada
por qualquer um dos métodos de propagação in vivo. Uma vantagem da propagação
por cultura in vitro é que o ciclo de multiplicação é muito curto (2-6 semanas), e cada
ciclo resulta em um aumento logarítmico no número de brotos (B
HOJWANI & RAZDAN,
1992). Além disso, a multiplicação das plantas em culturas pode continuar durante o
ano inteiro, independente de época e de variações sazonais (WARREN, 1991).
Inicialmente, os estudos envolvendo a aplicação de técnicas de cultura in vitro
ao gênero foram direcionados a H. perforatum, o que é justificado por ser esta a
espécie que mais se destaca quanto às propriedades farmacológicas de seus extratos e
constituintes. Mais recentemente, outras espécies também têm sido exploradas nesse
sentido.
H. perforatum tem sido micropropagada com sucesso utilizando como fonte de
explante plântulas obtidas em condições assépticas (Z
DUNEK & ALFERMANN, 1992;
MURCH et al., 2002; GADZOVSKA et al., 2005; COUCEIRO et al., 2006), tecidos organizados
removidos da planta matriz (P
RETTO & SANTAREM, 2000; MCCOY & CAMPER, 2002;
SANTARÉM & ASTARITA, 2003) e também através de organogênese indireta, a partir de
calos iniciados in vitro (K
IRAKOSYAN et al., 2000a; PRETTO & SANTARÉM, 2000; PASQUA et
al., 2004; G
ADZOVSKA et al., 2005).
C
ELLAROVÁ e colaboradores (1992) desenvolveram um eficiente sistema para
regeneração de plantas a partir de culturas in vitro de tecidos de H. perforatum. Esses
autores observaram uma variabilidade aumentada de várias características
morfológicas, bem como aumento no conteúdo de hipericinas (C
ELLAROVÁ et al., 1994)
117
nas plantas regeneradas.
Z
OBAYED e SAXENA (2003) compararam o potencial de regeneração de H.
perforatum, utilizando diferentes tipos de explantes (folhas, raízes, brotos, hipocótilo,
extremidades de brotos e ramos) obtidos de sementes germinadas em condições de luz
e escuro. Este estudo demonstrou claramente a variabilidade de regeneração desta
espécie em função apenas do material utilizado para iniciar a cultura, uma vez que
posteriormente todas foram mantidas sob as mesmas condições. Dentre os explantes
testados, a maior freqüência de organogênese foi obtida utilizando-se os brotos.
Explantes obtidos a partir de raízes produziram o segundo maior número de
regenerantes, sendo a regeneração afetada pela luminosidade utilizada para
germinação das sementes. Enquanto explantes de raízes obtidos de sementes
cultivadas sob luz apresentaram um número de regenerantes significativamente
maiores do que aqueles obtidos de sementes germinadas no escuro, o inverso foi
observado para todos os outros explantes analisados.
Estudos também demonstram o cultivo in vitro como uma opção para a
multiplicação e conservação de outras espécies do gênero, tais como H. erectum
(Y
AZAKI & OKUDA, 1990), H. canariense (MEDEROS, 1991; MEDEROS et al., 1997), H.
foliosum (M
OURA, 1998), H. patulum (BARUAH et al., 2001), e H. brasiliense (CARDOSO &
DE OLIVEIRA, 1996).
H. patulum foi regenerado com sucesso a partir de culturas de brotos desta
planta em meio MS, suplementado com 6-benzilaminopurina e cinetina, sendo a melhor
formação de brotos alcançada com a adição de vitaminas (tiamina, pantotenato de
cálcio e biotina). Após enraizamento e transferência para solo, as culturas foram
mantidas por longo período com morfologia normal, demonstrando-se a possibilidade
de propagação desta espécie (B
ARUAH et al., 2001).
Muitas pesquisas estão sendo desenvolvidas para propagação in vitro de H.
perforatum, porém a maioria descrevendo protocolos de cultivo para uma escala
118
laboratorial. Entretanto, pesquisas vêm sendo realizadas para a regeneração em larga
escala desta espécie utilizando-se culturas hidropônicas (M
URCH et al., 2002) e culturas
de raízes em meio líquido em um sistema de biorreator (Z
OBAYED & SAXENA, 2004),
demonstrando fontes alternativas para obtenção de biomassa de H. perforatum, as
quais poderão ser utilizadas para extração de metabólitos secundários desta espécie.
4.3.3 Produção de metabólitos secundários por células ou tecidos de espécies de
Hypericum cultivadas in vitro
O uso de culturas vegetais in vitro tem sido amplamente discutido como uma
fonte para a produção de substâncias de origem natural, sendo o cultivo em larga
escala uma alternativa tecnologicamente viável para produção comercial de metabólitos
secundários de importância para a indústria (VERPOORTE, 2000; RAMACHANDRA RAO &
RAVISHANKAR, 2002). Em função disso, estudos visando a avaliação da produtividade in
vitro de espécies de Hypericum têm sido relatados.
Como descrito anteriormente, as espécies de Hypericum nativas do Rio Grande
do Sul não apresentam hipericina na sua composição. No entanto, a maioria dos
trabalhos envolvendo a análise de metabólitos secundários em culturas in vitro
descreve a avaliação da produção de hipericina e seus derivados, uma vez que essas
substâncias foram por muito tempo consideradas as principais responsáveis pela
atividade antidepressiva de H. perforatum (W
AGNER & BLADT, 1994; BUTTERWECK et al.,
1998). Além disso, apresentam atividade antiviral (M
ERUELO et al., 1988; WOOD et al.,
1990; A
XARLIS et al., 1998) e inibidora da MAO (SUZUKI et al., 1984; THIEDE & WALPER,
1994), bem como propriedades citotóxicas e antitumorais (V
ANDENBOGAERDE & DE
WITTE, 1995; AGOSTINIS et al., 2002; MARTÍNEZ-POVEDA et al., 2005).
Devido à grande freqüência de xantonas em Hypericum, muitos trabalhos
encontrados na literatura descrevem o estabelecimento de culturas de algumas
espécies desse gênero, com o objetivo de estudar o metabolismo biossintético dessas
substâncias, o que têm conduzido ao isolamento de xantonas de estruturas inéditas ou
119
de ocorrência não descrita em Hypericum (ISHIGURO et al., 1993; ISHIGURO et al., 1995).
Trabalhos mais recentes têm relatado a produção in vitro de derivados de floroglucinóis,
principalmente de hiperforina
(MURCH et al., 2002; SIRVENT & GIBSON, 2002; KOSUTH et
al., 2003;
PASQUA et al., 2004; KLINGAUF et al., 2005), uma vez que atualmente essa
substância é considerada o principal componente envolvido na atividade antidepressiva
de H. perforatum (M
EDINA et al., 2006).
4.3.3.1 Quinonas policíclicas
A produção in vitro das naftodiantronas hipericina e pseudo-hipericina por
culturas de espécies do gênero Hypericum têm sido investigada com maior freqüência
entre os trabalhos descritos na literatura, verificando-se produção tanto por cultivo de
células (K
ARTNIG & GÖBEL, 1992; KARTNIG et al., 1996; BAIS et al., 2002; CONCEIÇÃO et
al.,
2006) quanto por plântulas regeneradas (ZDUNEK & ALFERMANN, 1992; KIRAKOSYAN et
al., 2000a; K
IRAKOSYAN et al., 2000b; SIRVENT & GIBSON, 2002; SANTARÉM & ASTARITA,
2003; C
OUCEIRO et al., 2006). No entanto, PASQUA e colaboradores (2004) acreditam
que a síntese de hipericina e derivados não ocorra em culturas de células
indiferenciadas, como nas suspensões celulares e nas culturas de calos, sendo
essencial a diferenciação dos órgãos.
A análise de culturas celulares de H. perforatum e H. maculatum, mantidas em
meio MS modificado, revelou em um primeiro momento, uma pequena produção de
hipericina (cerca de 1 % do teor das plantas desenvolvidas in natura), sendo que
pseudo-hipericina não foi produzida em quantidades detectáveis (K
ARTNIG & BRANTNER,
1990). Estudos posteriores, com diferentes subtipos destas mesmas espécies,
revelaram uma extrema variabilidade nas concentrações dessas substâncias, embora
todas as amostras tenham sido submetidas às mesmas condições de cultivo in vitro
(K
ARTNIG & GÖBEL, 1992; KARTNIG et al., 1996).
É comum verificar-se uma produção de pseudo-hipericina significativamente
maior que a de hipericina tanto nas culturas de células em suspensão quanto em
120
culturas de brotos (KARTNIG & GÖBEL, 1992; KARTNIG et al., 1996; KIRAKOSYAN et al.,
2000a). Este padrão de produção de naftodiantronas também é verificado nas plantas
de cultivo in natura, onde, em geral, as concentrações de pseudo-hipericina são
maiores que as de hipericina (U
MEK et al., 1999).
Pesquisas utilizando a regeneração de plântulas de H. perforatum a partir de
culturas celulares demonstram que o conteúdo total de hipericina e pseudo-hipericina
em diferentes estruturas celulares correlaciona-se com o grau de diferenciação celular e
alcança os maiores valores durante a morfogênese foliar (K
IRAKOSYAN et al., 2000a), de
modo que plântulas regeneradas demonstram maior produção de pseudo-hipericina do
que os calos (K
ARTNIG et al., 1996; SANTARÉM & ASTARITA, 2003). As plântulas
regeneradas apresentaram glândulas negras similares às presentes nas folhas da
planta íntegra, o que demonstra que a biossíntese de hipericina está relacionada com a
morfogênese e formação dessas estruturas celulares (Z
DUNEK & ALFERMANN, 1992;
KIRAKOSYAN et al., 2000a; KIRAKOSYAN et al., 2000b).
Demonstrou-se também que o crescimento de células em suspensão e a
produção de hipericina são regulados pelas condições de cultivo. As culturas mantidas
sob luz permanente apresentaram menor acúmulo deste metabólito, quando
comparadas com as submetidas ao crescimento no escuro (B
AIS et al., 2002; WALKER et
al., 2002).
Estudos relacionados à estimulação da produção destes metabólitos
secundários através do uso de elicitores em H. perforatum também têm sido relatados
(K
IRAKOSYAN et al., 2000b; WALKER et al., 2002; CONCEIÇÃO et al., 2006). A elicitação é
utilizada para induzir a expressão de genes associados a enzimas responsáveis pela
síntese de metabólitos secundários (R
OBERTS & SHULER, 1997). A aplicação exógena de
elicitores nas culturas in vitro é utilizada para o estudo da resposta da planta ao ataque
de microrganismos ou insetos, bem como para aumentar a produção biotecnológica de
metabólitos secundários (B
OURGAUD et al., 2001; RAMACHANDRA RAO & RAVISHANKAR,
2002).
121
Diferentes elicitores foram avaliados quanto à estimulação da biossíntese de
quinonas policíclicas em culturas de brotos de H. perforatum. A adição de extrato de
levedura ao meio de cultura inibiu a produção de hipericina e pseudo-hipericina, bem
como o crescimento dos brotos. No entanto, a adição de manano, estimulou a síntese
de ambas as substâncias, sendo o aumento na produção de pseudo-hipericina maior do
que na de hipericina. A utilização de
-1,3-glicano e de pectina não demonstrou efeito
sobre a produção de hipericina, porém estas substâncias estimularam a produção de
pseudo-hipericina de maneira menos significativa, quando comparado com o efeito
obtido pelo manano. Além disso, não foi observada qualquer inibição no crescimento
das culturas com a adição de manano,
-1,3-glicano ou pectina (KIRAKOSYAN et al.,
2000b).
Com a adição dos elicitores ácido jasmônico, ácido salicílico e parede celular
de Phytophthora cinnamoni em culturas de células em suspensão de H. perforatum,
apenas ácido jasmônico levou a um aumento na produção de biomassa, bem como na
produção de hipericina. O crescimento celular foi verificado tanto para culturas mantidas
sob condição de luminosidade quanto para as submetidas a escuro total, porém as
culturas submetidas ao escuro apresentaram crescimento celular e acúmulo de
hipericina superior. Nas concentrações testadas, nem o ácido salicílico (50-200 M)
nem elicitores presentes na parede celular de P. cinnamoni (0,1-0,5%) intermediaram a
elicitação desse metabólito de interesse (W
ALKER et al., 2002).
Avaliando a possibilidade de esses compostos fenólicos serem parte de algum
sistema específico de defesa mediado por metil jasmonato ou ácido salicílico, S
IRVENT &
GIBSON (2002) utilizaram culturas de meristemas de H. perforatum para verificar o efeito
da aplicação exógena destes elicitores na produção de hipericinas. Deste modo foi
constatado que a produção dessas substâncias aumentou em resposta a ambos os
elicitores. Estes mesmos autores avaliaram o efeito de Colletotrichum gloeosporioides,
um fungo patogênico para H. perforatum, em plantas cultivadas em casa de vegetação,
verificando nível duas vezes maior de hipericinas nas plantas inoculadas com os
esporos fúngicos. Um estudo avaliando a elicitação de culturas de células em
122
suspensão de H. perforatum por esse mesmo patógeno, não resultou na acumulação
de hipericinas (C
ONCEIÇÃO et al., 2006)
Estudos de otimização de parâmetros físicos e químicos para a obtenção de
biomassa e de maiores teores de metabólitos secundários têm sido relatados. Em
culturas de plântulas de H. perforatum em bioreator, foi verificado que o aumento da
concentração de sacarose no meio de cultivo levou à diminuição da biomassa e à
manutenção dos teores de hipericina e de pseudo-hipericina (Z
OBAYED et al., 2003). Foi
verificado ainda que
plantas de H. perforatum cultivadas a campo em solo com baixa
concentração de nitrogênio (B
RISKIN et al., 2000, 2001), bem como plântulas mantidas
sob a presença de níquel (M
URCH et al., 2003) e cromo (TIRILLINI et al., 2006) no meio
de cultura, apresentaram aumento na concentração de hipericinas.
Considerando a variabilidade na produção de hipericinas em diferentes
materiais vegetais, recentemente foi avaliada a influência da época de coleta, da
temperatura de cultivo e da origem do germoplasma em H. perforatum mantido sob
condição ex-vitro após micropropagação, verificando-se uma significativa variação no
teor destas substâncias (C
OUCEIRO et al., 2006).
4.3.3.2 Xantonas
A produção de xantonas do tipo 1,3,6,7- e 1,3,5,6-oxigenadas foi descrita para
culturas de calos e suspensões celulares de H. perforatum. A acumulação destes
metabólitos apresentou-se fortemente influenciada pela suplementação do meio de
cultura com reguladores do crescimento. A maior produção de xantonas foi verificada
em culturas de calos mantidas em meio acrescido de ácido 2,4-D e cinetina (CIN). A
produção de xantonas foi reduzida com a substituição de cinetina por BAP, porém este
efeito foi atenuado quando ambas estavam presentes no meio. Além disso, verificou-se
uma relação linear positiva entre as concentrações de ANA analisadas (variando de 4,5
a 22,5 µM) e a acumulação de xantonas pelas culturas. Porém, a produção de 1,3,5,6-
xantonas foi semelhante em todas as concentrações de ANA avaliadas (D
IAS et al.,
123
2001).
A análise de extratos obtidos a partir de culturas celulares in vitro da espécie H.
patulum tem levado ao isolamento de diversas xantonas, tais como garcinona B (34),
toxiloxantona B (35),
-mangostina (36), e 1,3,6,7-tetra-hidróxi-8-(3-metil-2-butenil)-9H-
xanten-9-ona (37) (I
SHIGURO et al., 1993; ISHIGURO et al., 1995)
(34) R1=H; R2= ; R3=H (36) R1= ; R2=
(35) R1=R2=R3= H (37) R1= ; R2=H
Além dos estudos direcionados ao padrão biossintético dos calos de H.
patulum, o tratamento das culturas por elicitores do tipo levedura demonstrou a redução
de 1,3,6,7-tetra-hidroxi-8-(3-metil-2-butenil)-9H-xanten-9-ona e
-mangostina (sem o
anel cromeno), bem como aumento na produção de toxiloxantona e garcinona B. Isto
demonstra uma resposta induzida por estresse ambiental estimulando a ciclização do
grupamento isoprenila ou a ativação de enzimas ciclases que catalizam a
transformação de prenila em cromeno (I
SHIGURO et al., 1995).
H. androsaemum é outra espécie do gênero cujas culturas celulares
apresentam acúmulo desta classe de metabólitos. Estudos com culturas celulares desta
planta mantidas em meio L
INSMAIER-SKOOG (LS) demonstraram-se pouco eficientes na
biossíntese de metabólitos secundários, enquanto as células cultivadas em meio B5
(G
AMBORG) apresentaram produção de um notável espectro de xantonas na forma de
agliconas ou glicosídeos. Esse dado evidenciou a influência da composição do meio de
cultura no padrão de produção in vitro de metabólitos secundários (S
CHMIDT et al.,
O
OHO
R
1
OOH
OR
2
R
3
O
OHO
HO OH
R
2
HO
R
1
124
2000). Os meios MS/LS ou B5 apresentam na sua composição nitrato e amônio como
fontes de nitrogênio, com diferenças relacionadas à proporção de amônio/nitrato e à
concentração total de nitrogênio, o que têm demonstrado afetar de modo marcante a
produção de metabólitos secundários (R
AMACHANDRA RAO & RAVISHANKAR, 2002).
A manutenção das culturas sob ausência total de luz demonstrou aumento no
crescimento celular, bem como no conteúdo de xantonas. No entanto, a formação
dessas substâncias em culturas celulares de H. androsaemum é inibida pela luz
(S
CHMIDT et al., 2000).
O estudo da indução de compostos fenólicos em culturas de células em
suspensão de H. perforatum elicitadas com Colletotrichum gloeosporioides demonstrou
um aumento de 12 vezes na concentração de xantonas, quando as células foram
tratadas previamente com metil jasmonato (100 M) ou com ácido salicílico (25 M)
(C
ONCEIÇÃO et al., 2006).
4.3.3.3 Flavonóides
A produção dessa classe de metabólitos secundários por culturas in vitro de
algumas espécies do gênero Hypericum também tem sido relatada. Trabalhos com
culturas celulares em suspensão de H. perforatum, H. maculatum, H. tomentosum, H.
bithynicum, H. glandulosum e H. balearicum demonstraram produção de flavonóides,
assim como na planta de desenvolvimento in natura (K
ARTNIG et al., 1996).
A análise de culturas de calos e brotos de H. erectum demonstrou a produção
dos glicosídeos flavônicos hiperosídeo e quercitrina. Foi demonstrada a presença de
maiores teores dessas substâncias nas culturas de brotos, quando comparado com a
cultura de células indiferenciadas, porém este conteúdo foi inferior ao encontrado na
planta desenvolvida in natura (Y
AZAKI & OKUDA, 1990).
A produção de flavonóides também foi constatada em culturas de calos de H.
125
perforatum (DIAS et al., 1998). No entanto, segundo PASQUA e colaboradores (2004), a
produção in vitro de flavonóides em H. perforatum parece estar relacionada com
estágios mais desenvolvidos de crescimento, uma vez que rutina, quercetina e
hiperosídeo não foram detectados em culturas de calos, e sim apenas em culturas de
brotos com 10-12 cm de altura.
Suspensões celulares estabelecidas a partir de calos provenientes de plântulas
obtidas assepticamente, em meio MS/2 líquido contendo BAP (10
-6
M) e ANA (10
-7
)
demonstraram produção do mesmo grupo de flavonóides previamente relatados para as
espécies desse gênero. Diferentes variedades de H. perforatum e de H. maculatum,
assim como as espécies H. bithynicum e H. glandulosum produziram, em
concentrações variáveis, a aglicona quercetina e seus heterosídeos rutina, hiperosídeo,
isoquercitrina e quercitrina, bem como os biflavonóides amentoflavona e I3,II8-
biapigenina. Para a espécie H. balearicum verificou-se produção de todas as
substâncias anteriormente citadas, exceto de I3,II8-biapigenina. As culturas de H.
tomentosum produziram apenas quercitrina e amentoflavona, enquanto H. olympicum
produziu apenas amentoflavona. Dentre as espécies analisadas, as culturas celulares
de H. perforatum e de H. maculatum demonstraram a melhor produção desses
metabólitos secundários. Além disso, regenerantes de H. perforatum demostraram
maior produção de quercitrina e amentoflavona do que calos (K
ARTNIG et al., 1996).
O extrato metanólico de uma biomassa de calos liofilizados de H. perforatum
apresentou na sua constituição os flavonóides luteolina, luteolina 5-glicosídeo, luteolina
3’-glicosídeo, luteolina 5,3’-dimetiléter e 6-C-prenil luteolina. Essas substâncias
produzidas in vitro apresentaram estrutura química diferente e acumularam-se em
menor quantidade, quando comparados com os flavonóides usualmente produzidos por
essa mesma espécie quando cultivada in natura. A ocorrência de flavonóides prenilados
em H. perforatum ainda não havia sido relatada, de modo que a produção de 6-C-prenil
luteolina por cultura de calos dessa espécie demonstra a produção de um flavonóide
não usualmente produzido pelas plantas cultivadas a campo (D
IAS et al., 1998).
126
No estudo realizado por CONCEIÇÃO e colaboradores (2006) avaliando a
elicitação sobre culturas de células em suspensão de H. perforatum, observou-se que o
padrão de produção de flavonóides foi alterado. O pré-tratamento das culturas com
metil jasmonato ou com ácido salicílico e posteriormente com Colletotrichum
gloeosporioides reduziu o acúmulo de flavonóides, enquanto essas substâncias não
foram detectadas em células expostas apenas ao elicitor fúngico. Foi evidenciado ainda
que as células expostas apenas a metil jasmonato produziram flavonas, uma classe de
flavonóides que não foi detectada nos outros tratamentos.
4.3.3.4 Floroglucinóis
Avaliando-se a produção de hiperforina por culturas in vitro de H. perforatum na
forma de células em suspensão e calos, bem como brotos e raízes regeneradas, foi
demonstrado que apenas as plântulas regeneradas a partir dos calos foram capazes de
sintetizar esta substância, sendo o seu conteúdo aumentado durante o desenvolvimento
foliar (P
ASQUA et al., 2004).
A síntese de floroglucinóis foi estudada com o cultivo in vitro de plântulas de H.
perforatum em estágios de desenvolvimento iniciais, verificando-se a produção de
hiperforinas. No entanto, foram verificadas variações significativas no conteúdo dessas
substâncias quando avaliadas diferentes plântulas originadas de sementes de uma
mesma planta-mãe, demonstrando a influência genética no acúmulo de hiperforinas
(K
OSUTH et al., 2003).
A indução da produção de hiperforina por elicitores químicos e bióticos em
culturas in vitro de meristemas apicais de H. perforatum foi recentemente avaliada.
Demonstrou-se um aumento nas concentrações de hiperforina quando as plântulas
foram tratadas tanto com ácido salicílico (1 mM) ou metil-jasmonato (50 M), quanto
com o patógeno Colletotrichum gloeosporioides (S
IRVENT & GIBSON, 2002). No entanto,
em culturas de células em suspensão de H. calycinum, os teores de hiperforinas não
foram afetados pela adição de metil-jasmonato e jasmonil-isoleucina (100 M/L).
127
A investigação do extrato clorofórmico de células de H. patulum cultivadas em
suspensão levou ao isolamento e elucidação estrutural de um novo derivado de
floroglucinol, que foi denominado paglucinol (38) (I
SHIGURO et al., 1998).
(38)
A avaliação da produção de floroglucinóis em culturas de células em
suspensão de H. calycinum mantidas no escuro demonstrou o acúmulo de ad-
hiperforina em teores cerca de dez vezes maiores aos de hiperforina. Essas
substâncias não haviam sido previamente detectadas em culturas diferenciadas nesta
espécie. As culturas foram mantidas na ausência de luz, uma vez que foi evidenciado
que a luz reprime a formação destes derivados de floroglucinol, como previamente
observado por S
CHMIDT e colaboradores (2000) na produção de xantonas em culturas
celulares de H. androsaemum. Esse sistema de cultura celular de H. calycinum foi
utilizado, ainda, como ferramenta para o estudo do metabolismo biossintético desses
derivados de floroglucinol (K
LINGAUF et al., 2005).
Estudos envolvendo a otimização de parâmetros físicos e químicos para a
obtenção de maiores teores nos derivados de floroglucinol também vêm sendo
realizados. Em culturas de plântulas de H. perforatum em bioreator, foi evidenciado um
aumento na produção de hiperforina com a utilização de sacarose na concentração de
45 g/L (Z
OBAYED et al., 2003).
4.3.3.5 Outros metabólitos secundários
A presença de taninos em culturas in vitro de espécies do gênero também é
relatada para células em suspensão de H. perforatum e H. maculatum (K
ARTNIG &
HO
OHO
OH
128
BRANTNER, 1990). Culturas de calos e brotos de H. erectum demonstraram produção de
taninos condensados e compostos relacionados, tais como epicatequina e seus
derivados condensados. Demonstrou-se maiores teores destes polifenóis nos tecidos
diferenciados, sendo o conteúdo superior ao encontrado nas plantas desenvolvidas in
natura (Y
AZAKI & OKUDA, 1990). A análise de calos de H. patulum também revelou
síntese de epicatequina (I
SHIGURO et al., 1997).
Além da ocorrência dos compostos fenólicos já relatados no decorrer deste
trabalho, verificou-se produção de ácido oleanólico e
-sitosterol por culturas de células
em suspensão de H. patulum (I
SHIGURO et al., 1997).
4.4
MATERIAIS E MÉTODOS
O desenvolvimento e aplicação dos protocolos de cultivo in vitro foram
realizados no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Faculdade de Farmácia da
UFRGS, sob orientação da Prof. Dr. Sandra Beatriz Rech.
Para um melhor entendimento, um esquema da metodologia está apresentado
como anexo (Anexo VII, página 317).
4.4.1 Procedimentos gerais
Os equipamentos utilizados rotineiramente no laboratório foram um agitador
orbital Innova 2350 New Brunswick
, Capela de Fluxo Laminar Trox do Brasil
FHL 449
e autoclave Phenix
.
Os reagentes empregados no desenvolvimento deste trabalho foram de
procedência Nuclear
®
, Gibco BRL
®
, Sigma
®
, Jansen Química
®
e Merck
®
.
129
4.4.2 Material vegetal
O material vegetal utilizado para o desenvolvimento dos protocolos de cultivo in
vitro consiste nos ápices dos ramos (aproximadamente 0,5 cm) das espécies H.
campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum e H.
ternum. As espécies foram coletadas em diferentes localidades do Rio Grande do Sul
durante o período de floração dos vegetais. As exsicatas para a devida identificação e
registro do material vegetal foram depositadas no herbário do Departamento de
Botânica do Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(tabela 3.1).
Tabela 3.1: Dados sobre a coleta do material vegetal e registro em herbário.
Espécie Local e Data de coleta ICN
H. campestre Cham. & Schltdl. Guaritas, Caçapava do Sul
novembro, 2005
Bordignon 1894
H. caprifoliatum Cham. & Schltdl. Morro Santana, Porto Alegre
Março e julho, 2004
Bordignon 1400
H. carinatum Griseb. Glorinha
dezembro, 2003
Bordignon 1520
H. myrianthum Cham. & Schltdl. Paraíso do Sul
dezembro, 2003
Bordignon 1402
H. polyanthemum Klotzsch ex
Reichardt.
Guaritas, Caçapava do Sul
setembro, 2003
Bordignon 1429
H. ternum A. St. Hil. São Francisco de Paula
janeiro, 2003
Bordignon 1717
4.4.3 Estabelecimento do cultivo in vitro
Para o desenvolvimento in vitro foram utilizados métodos de cultivo através da
regeneração de plântulas via micropropagação e culturas de calos.
4.4.3.1 Seleção e preparação dos explantes
Ápices caulinares do vegetal recém coletado foram submetidos aos processos
de lavagem e desinfestação e, então, selecionados para obtenção de explantes
adequados ao cultivo.
130
Inicialmente, o material coletado foi mantido em água corrente abundante e,
posteriormente, em água destilada para uma lavagem superficial e eliminação de
partículas de poeira e outras fontes de contaminação.
Após a realização do processo de lavagem, partiu-se para a desinfestação, que
foi efetuada sob condições assépticas, em capela de fluxo laminar horizontal e
utilizando-se vidraria previamente esterilizada. O material vegetal foi imerso em
diferentes soluções esterilizantes (etanol comercial 70°GL; hipoclorito de sódio a 1,5%)
e enxagüado sucessivas vezes com água destilada estéril até a completa remoção do
agente desinfetante.
Concluída a desinfestação, meristemas apicais do vegetal foram isolados
assepticamente em câmara de fluxo laminar, utilizando-se bisturis e pinças estéreis.
4.4.3.2 Composição dos meios de cultura
Foram utilizados para o estabelecimento do cultivo in vitro o meio de cultura
contendo sais e vitaminas de M
URASHIGE & SKOOG (1962), bem como sua forma
modificada (M
AURMANN,
2006), denominado MU, contendo 75% dos macro-nutrientes:
KH
2
PO
4
; KNO
3
; CaCl
2
.2H
2
O; MgSO
4
.7H
2
O; (NH
4
)
2
NO
3
; 75% dos micro-nutrientes:
NaH
2
EDTA.2H
2
O; ZnSO
4
.7H
2
O; FeSO
4
.7H
2
O; H
3
BO
3
; MnSO
4
.7H
2
O; 150% dos micro-
nutrientes: Na
2
MoO
4
.2H
2
O; KI; CuSO
4
.5H
2
O; CoCl
2
.6H
2
O e 150% de meso-inositol,
conforme descrito na tabela 3.2, acrescido de 30 g/L de sacarose, 6 g/L de ágar como
agente gelificante e suplementado com diferentes combinações de concentrações de
auxinas e citocininas como reguladores de crescimento. O pH do meio foi ajustado para
5,8 antes da autoclavagem do meio a 121°C por 20 minutos.
131
Tabela 3.2: Composição dos meios de cultura MS e MU.
Sais utilizados MS (g/L) M∆ (g/L)
Inorgânicos
KH
2
PO
4
0,17 0,1275
KNO
3
1,9 1,4250
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,00025 0,000374
NaH
2
EDTA.2H
2
O 0,0373 0,027975
CaCl
2
. 2H
2
O 0,44 0,330
MgSO
4
. 7H
2
O 0,3737 0,2775
ZnSO
4
. 7H
2
O 0,0086 0,00645
KI 0,00083 0,001425
FeSO
4
. 7H
2
O 0,0278 0,021
(NH
4
)
2
NO
3
1,65 1,24
CuSO
4
. 5H
2
O 0,000025 0,0000375
H
3
BO
3
0,0062 0,00465
MnSO
4
. 7H
2
O 0,0223 0,012675
CoCl
2
. 6H
2
O 0,000025 0,0000375
Orgânicos
Meso-inositol 0,1 0,15
Piridoxina-HCl 0,0005
0,0005
Tiamina-HCl 0,0001
0,0001
Ác. Nicotínico 0,00005
0,00005
Glicina 0,002 0,002
4.4.3.3 Indução da regeneração in vitro de segmentos apicais
Foram testadas quatro concentrações (0,04; 0,2; 0,4 e 1 mg/L) de BAP isoladas
e combinadas com 0,2 mg/L de ANA ou, ainda, a combinação de 1 mg/L de 2,4-D e 0,2
mg/L de BAP. O meio de cultura MU sem adição de reguladores de crescimento foi
utilizado como tratamento controle. Após o isolamento dos explantes, esses foram
seccionados e transferidos para frascos de 175 mL contendo 25 mL de meio MU e
mantidos a 25° C, com fotoperíodo de 16 horas (fluxo de fótons de 45 mol.m
-2
.s
-1
).
Para regeneração dos brotos induzidos in vitro em plântulas completas, os
brotos desenvolvidos no melhor tratamento foram subculturados para os diferentes
meios de indução avaliados e, quando necessário, para o meio MU sem a adição de
reguladores de crescimento e para o mesmo meio suplementado com AIA (0,5 ou 1
mg/L) ou com ANA (0,5 ou 1 mg/L). A avaliação de desenvolvimento foi realizada ao
final de quarenta e cinco de cultivo, com a observação do número médio de brotos e de
raízes por explante. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado
com duas repetições com quinze explantes para cada tratamento.
132
4.4.3.4 Avaliação da concentração de sais do meio de cultivo
Com a finalidade de otimizar o desenvolvimento in vitro das espécies de
Hypericum estudadas, plântulas mantidas a ciclos de 45 dias em meio M∆ sólido foram
subculturadas para este mesmo meio M∆, para o meio MS com sua concentração
íntegra de sais, bem como para meio contendo 25% da concentração de sais do MS.
No momento do subcultivo, todos explantes tinham 4 folhas e permaneceram nas
mesmas condições descritas no item 4.4.3.3. Após o cultivo destas plântulas durante
três ciclos de 45 dias no novo meio, foram determinados os seguintes parâmetros de
crescimento:
massa fresca, após as plântulas serem secas em papel filtro;
número de brotos e de raízes;
comprimento dos brotos e das raízes.
4.4.3.4.1 Estudo da cinética de crescimento in vitro de Hypericum polyanthemum
Para avaliação do desenvolvimento in vitro de H. polyanthemum em meio MU,
foram medidos os parâmetros de crescimento massa fresca (após as plântulas serem
secas em papel filtro), massa seca e massa seca das partes aéreas (após liofilização de
48 horas). Este estudo foi realizado durante o período de 6 a 14 semanas, sem
subcultura para meio nutriente fresco, tendo como principal propósito avaliar a relação
entre o crescimento desta espécie e a produção de benzopiranos em meio sólido. Para
tanto, as plântulas coletadas foram armazenadas para posterior quantificação de
benzopiranos, que encontra-se descrita no capítulo 4.
4.4.3.5 Aclimatização das plântulas
A aclimatização de plântulas desenvolvidas nos tratamentos foi iniciada após
um ano de cultivo in vitro. Plântulas cultivadas por 6 a 8 semanas em meio MU sem
adição de reguladores de crescimento foram retiradas do ágar, lavadas com água
133
destilada para retirada dos resíduos, e transplantadas para potes plásticos contendo
como substratos vermiculita expandida (Plant Max, Eucatex
) e solo não fertilizado,
misturados na proporção de 2:1 (solo:vermiculita). Estes foram previamente
esterilizados em autoclave, e cobertos por filme de PVC, para evitar estresse hídrico
nas primeiras semanas de transplantio.
O experimento foi realizado em sala climatizada, com temperatura de
25 5
o
C, sob fotoperíodo de 16 h, aproximadamente com intensidade luminosa de 70
mol.m
-2
.s
-1
, durante 30 dias. Posteriormente, estas foram trasferidas para potes
plásticos (13 cm de diâmetro X 11 cm de altura) contendo terra vegetal para jardim
(Adubāo
®
) e transferidas para campo, no Departamento de Agrometereologia da
Faculdade de Agronomia (UFRGS), com a colaboração do Prof. Dr. Luís Mauro Rosa. A
irradiação luminosa medida foi de 500 mol.m
-2
.s
-1
no nível da planta, em dias
ensolarados sem nuvens com o sensor Quantum Li-cor
. As plantas foram irrigadas
com água e a temperatura, nas suas variações máxima e mínima, registradas
diariamente. Foram utilizados doze explantes para cada tratamento e ao final do
experimento, foi avaliado o percentual de sobrevivência das plantas.
4.4.3.5.1 Estudo da ontogenia de Hypericum polyanthemum aclimatizada
Plantas aclimatizadas desta espécie foram coletadas em diferentes estágios de
desenvolvimento, para avaliação da proporção de partes vegetativas e reprodutivas.
Este estudo foi realizado com plantas desenvolvidas na primavera, durante o período de
14 a 22 semanas, sendo quinzenalmente coletadas partes vegetativas, inflorescências
e frutos, quando disponíveis.
Após a coleta do material (sempre próximo a 9 h da manhã), os indivíduos
foram pesados e esse material foi liofilizado e armazenado para a posterior
quantificação de benzopiranos.
134
4.4.3.6 Indução e estabelecimento de culturas de calos
Concluída a desinfestação e/ou isolamento dos explantes (segmentos foliares
e/ou caulinares provenientes de plantas in natura ou plântulas micropropagadas), estes
foram colocados em frascos de vidro de 175 mL contendo 25 mL de meio MU
suplementado com diferentes combinações de concentrações de auxinas (2,4-D e/ou
ANA) e citocininas (BAP ou cinetina) (tabela 3.3) com delineamento de blocos ao acaso,
perfazendo 10 repetições de cada combinação e incubados a 25°C na ausência de
intensidade luminosa ou com fotoperíodo de 16 horas (45 mol.m
-2
.s
-1
). Os calos foram
subculturados a cada 30 dias para os mesmos meios de cultura.
Tabela 3.3: Meios de cultura utilizados para indução de calogênese das espécies de Hypericum.
Meio MU
2,4-D
(mg/L)
ANA
(mg/L)
cinetina
(mg/L)
BAP
(mg/L)
1,0 - - -
1,0 - 0,2
1,0 - 0,5 -
1,0 - - 0,2
1,0 - - 0,5
2,0 - - -
2,0 - 0,2 -
2,0 - 0,5 -
2,0 - - 0,2
2,0 - - 0,5
- 0,2 - -
- 0,2 0,2 -
- 0,2 0,5 -
- 0,2 - 0,2
- 0,2 - 0,5
- 1,0 - -
- 1,0 0,2 -
- 1,0 0,5 -
- 1,0 - 0,2
- 1,0 - 0,5
- 2,0 - -
- 2,0 0,2 -
- 2,0 0,5 -
- 2,0 - 0,2
- 2,0 - 0,5
1,0 0,2 0,2 -
135
4.4.3.7 Análise de crescimento dos calos
A percentagem dos explantes que induziram calogênese, bem como os
aspectos dos calos desenvolvidos in vitro foram avaliados após 30 dias de cultivo. Os
calos desenvolvidos nos melhores tratamentos foram pesados (peso fresco) e
transferidos individualmente para frascos contendo o mesmo meio de cultura. O
desenvolvimento foi verificado pelo índice de crescimento de cada amostra (IC = peso
final do calo subtraído do peso inicial do calo, dividido pelo peso inicial), realizado em
três avaliações independentes após 6 meses de desenvolvimento in vitro dos calos.
4.4.4 Análise fitoquímica do material vegetal obtido por cultivo in vitro
4.4.4.1 Análise cromatográfica
A análise dos metabólitos secundários produzidos pelas culturas in vitro foi
efetuada por cromatografia em camada delgada analítica empregando-se as mesmas
condições de análise utilizadas para o estudo químico da planta desenvolvida in natura.
Para preparação dos extratos, o material vegetal in natura e cultivado in vitro
foi liofilizado e submetido a extrações sucessivas de 20 minutos até o esgotamento,
com solventes em polaridade crescente (n-hexano, diclorometano e metanol) em banho
de sonicador. Os extratos foram reunidos e evaporados até secura sob pressão
reduzida.
Para análise cromatográfica das frações n-hexânica e metanólica das espécies
H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, e H. ternum, foram
utilizados eluentes variando entre diclorometano: hexano (50:50-60:40); diclorometano:
metanol (90:10-80:20) ou acetato de etila:metanol:água 100:13,5:10), respectivamente.
A visualização e análise dos cromatogramas foram efetuadas através da utilização de
luz ultravioleta (= 254 e 366 nm) e revelação através da nebulização com reagentes
cromogênicos, tais como anisaldeído sulfúrico (produtos apolares) e reagente natural
136
(produtos polares), com posterior aquecimento a 100
o
C, até o desenvolvimento máximo
de coloração.
4.4.4.2 Avaliação da presença de taninos
A presença de taninos nos extratos aquosos das plântulas micropropagadas foi
verificada pelo método de precipitação com solução de gelatina 1%. A caracterização
foi realizada mediante reação com solução aquosa de FeCl
3
1%.
4.4.4.3 Análise química das raízes de Hypericum campestre e Hypericum
polyanthemum micropropagadas
As raízes das plântulas destas duas espécies foram separadas, e após a
remoção do meio de cultura aderido ao material vegetal com papel filtro, estas foram
secas e submetidas à extração com solução metanol/HCl 1% a 5°C sob o abrigo da luz,
durante um período de 20 horas. Posteriormente, o extrato foi concentrado através de
evaporador rotatório sob pressão reduzida a menos de 40°C.
Considerando a suspeita do acúmulo de antocianinas nas raízes e a
sensibilidade dessa classe de substâncias frente a variações no pH, avaliou-se a
influência do pH sobre o extrato solubilizado em metanol, utilizando-se ácido clorídrico
concentrado e amônia concentrada.
4.4.4.3.1 Análise cromatográfica
A avaliação do comportamento cromatográfico do extrato das raízes de H.
polyanthemum e H. campestre foi realizada utilizando-se cromatografia em papel filtro
Whatman n°1 e em cromatofolhas de celulose microcristalina. Foram utilizados três
diferentes sistemas eluentes: HCl:água (1:99), BAW (n-butanol: ácido acético:água,
4:1:5; porção sobrenadante), e Forestal (ácido acético: ácido clorídrico conc.: água
(30:3:10). Após a secagem dos cromatogramas, os valores de Rf foram calculados e o
137
pigmento foi isolado do papel extraído do papel utilizando solução metanol/HCl 1%,
sendo mantido a 5°C.
4.4.4.3.2 Análise espectroscópica
Os espectros de absorção na região do UV-VIS foram obtidos em
espectrofotômetro Hewlett Packard
®
UV-VIS, modelo HP 8452-A, com varredura de
diodos em série entre 200 a 600 nm. Foram analisados os picos máximos de absorção
da solução metanol/HCl (0,01%) e a ocorrência de deslocamentos no comprimento de
onda, com a adição de AlCl
3
, tanto para o extrato das raízes quanto para a substância
extraída do papel após cromatografia.
4.4.4.4 Análise estatística dos resultados
Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram
expressos como a média ± desvio padrão. A significância estatística dos resultados foi
determinada por análise de variância One-Way (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey,
utilizando o software para cálculos estatísticos SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) 12.0
®
. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
4.5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.5.1 Regeneração in vitro de espécies de Hypericum
A regeneração in vitro das espécies de Hypericum analisadas foi induzida em
ápices caulinares isolados das plantas desenvolvidas in natura, em meio MU, livre de
reguladores de crescimento, ou suplementado com diferentes combinações de BAP e
ANA. A tabela 3.4 mostra os resultados obtidos no estágio de iniciação das culturas.
138
Tabela 3.4: Indução da regeneração in vitro de segmentos apicais de espécies de Hypericum em meio
MU suplementado com diferentes concentrações de reguladores de crescimento.
Reguladores de
crescimento (mg/L)
H. ternum
# (01/2003)
H. polyanthemum
# (09/2003)
H. carinatum
# (12/2003)
H. myrianthum
# (12/2003)
H. caprifoliatum
# (07/2004)
H. campestre
# (11/2005)
0,0
+
- - - - -
0,04 BAP
+ - - + - -
0,2 BAP
* + + + - -
0,4 BAP
* + + + - -
1,0 BAP
* - - - - -
0,04 BAP + 0,2 ANA
* +
+ - - -
0,2 BAP + 0,2 ANA
* +
+ + - -
0,4 BAP + 0,2 ANA
* + + + + -
0,2 BAP + 1,0 2,4-D
* * * * * +
* Meios não testados
# época de início das culturas
A freqüência organogênica entre as espécies de Hypericum em estudo, bem
como o número de brotos induzidos, variaram de acordo com os reguladores de
crescimento utilizados.
Para H. ternum, a indução dos novos brotos a partir de segmentos apicais foi
verificada em meio MU sem a adição de reguladores de crescimento e promovida com
a adição de 0,04 mg/L BAP, sendo visível o crescimento das gemas axilares uma
semana após a inoculação do explante em ambos os meios analisados.
A regeneração
em plântulas completas ocorreu nos mesmos meios utilizados para indução da
formação de brotos a partir dos ápices caulinares, verificando-se melhor proliferação no
meio suplementado com BAP. No entanto, a formação de raízes foi favorecida no meio
MU livre de reguladores de crescimento. Em função disso, os brotos cultivados no meio
suplementado com 0,04 mg/L BAP foram transferidos para o meio MU, com a
manutenção das plântulas formadas (figura 3.1). A baixa resposta ao enraizamento no
meio suplementado com BAP parece estar relacionada ao efeito inibidor das citocininas
na formação de raízes, enquanto o desenvolvimento de brotos foi significativamente
promovido por este regulador de crescimento, conhecido por induzir a formação de
brotos e uma alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação
(C
ALDAS et al., 1998).
139
Figura 3.1: H. ternum micropropagada em meio MU sem adição de reguladores de crescimento.
A formação de brotos e de raízes no mesmo meio de cultura elimina o passo de
transferência de meio na propagação desta espécie, reduzindo o tempo total e custos
necessários para a regeneração de plantas, sendo um sistema de micropropagação
muito conveniente para a rápida produção de plantas. Esse comportamento foi
previamente relatado para H. brasiliense, outra espécie nativa do estado, onde a
indução e proliferação de brotos, bem como o enraizamento, deu-se no mesmo meio
MS sem adição de reguladores de crescimento, resultando em plântulas completas
(C
ARDOSO & DE OLIVEIRA, 1996).
Para o estabelecimento de culturas in vitro de H. carinatum, H. myrianthum e H.
polyanthemum, considerando o tipo de hormônio, bem como as diferentes
concentrações avaliadas, a suplementação do meio MU com 0,4 mg/mL de BAP foi a
mais eficiente em promover a diferenciação e a proliferação dos brotos. Em função
disso, os brotos desenvolvidos nesse tratamento foram utilizados para induzir a
regeneração de plântulas completas. Brotos das três espécies foram transferidos para
meio MU sem adição de reguladores de crescimento, onde desenvolveram raízes e se
mantiveram normalmente (figura 3.2).
140
(A) (B) (C)
Figura 3.2: H. carinatum (A), H. myrianthum (B) e H. polyanthemum (C) micropropagadas em meio MU
sem adição de reguladores de crescimento.
Nenhuma resposta organogênica foi jobtida em explantes de H. caprifoliatum,
coletados em março de 2004. Estes foram inoculados em todos os meios avaliados,
não verificando-se a indução de brotos. Entre os fatores que afetam a organogênese
inclui-se o estágio de crescimento da planta matriz, o tipo de explante, o meio de cultura
e reguladores de crescimento utilizados, bem como as condições de cultura (F
LICK et
al., 1983). Em uma segunda tentativa, explantes de plantas coletadas em julho do
mesmo ano desenvolveram-se em meio MU suplementado com 0,4 mg/L BAP e 0,2
mg/L ANA, e foram, posteriormente, transferidos para meio MU, sem adição de
reguladores de crescimento, originando plântulas completas. Entretanto, as mesmas
não sobreviveram após 4 subculturas, possivelmente pela necessidade de manutenção
dos hormônios de crescimento no meio de cultura.
A indução de brotos a partir de segmentos apicais de H. campestre foi
verificada apenas em meio MU, suplementado com 0,2 mg/L de BAP e 1,0 mg/L de
2,4-D, observando-se ainda a indução de calos neste meio. Este mesmo meio foi o que
apresentou melhor desenvolvimento in vitro para o estabelecimento de culturas de calos
em H. perforatum (B
AIS et al., 2002). Os brotos cultivados no meio MU suplementado
com 0,2 mg/L de BAP e 1,0 mg/L de 2,4-D, foram transferidos para este meio na
ausência de reguladores de crescimento, originando plântulas completas (figura 3.3).
141
.
(A) (B)
Figura 3.3: H. campestre micropropagada em meio MU suplementado com 0,2 mg/L de BAP e 1,0 mg/L
de 2,4-D (A) e em meio MU, sem adição de reguladores de crescimento (B).
Entre as espécies regeneradas, o enraizamento deu-se com a transferência
dos brotos para meio de cultura livre de reguladores de crescimento, sem a
necessidade de adição de AIA ou de ANA, normalmente utilizados para induzir a
formação de raízes. A presença de meso-inositol em concentração mais elevada no
meio MU poderia explicar essa característica. Essa substância apresenta potencial
efeito na homeostasia de auxinas, uma vez que uma das formas de armazenamento de
AIA endógeno seria na forma de conjugados com meso-inositol (L
JUNG et al., 2002). O
enraizamento de plântulas de H. perforatum em meio sem adição de auxinas também
foi relatado (G
ADZOVSKA et al., 2005).
Muitos trabalhos envolvendo cultivo in vitro de espécies do gênero consideram
o meio de M
URASHIGE & SKOOG como o mais adequado para a regeneração dessas
plantas. Em 1991, M
EDEROS, desenvolvendo a micropropagação de H. canariense
considerou o meio MS suplementado com BA (6-benzil adenina) e ANA como o mais
efetivo para propagar a espécie. Da mesma maneira, muitos brotos adventícios foram
obtidos com a inoculação de explantes de H. perforatum em meio MS suplementado
com BAP (C
ELLÁROVA et al., 1992).
O efeito das auxinas e citocininas na indução e multiplicação de brotos tem sido
142
demonstrado para espécies de Hypericum. Entre os trabalhos envolvendo
micropropagação de plantas do gênero, a maior eficiência na diferenciação de
explantes em brotos, em meios suplementados com um único regulador de
crescimento, foi verificada com a utilização de BAP (C
ELLÁROVÁ et al., 1992), TDZ
(tidiazuron) (M
URCH et al., 2000) ou BA (PRETO & SANTARÉM, 2000; SANTARÉM &
ASTARITA, 2003) para H. perforatum e BA para H. foliosum (MOURA, 1998).
Na utilização de TDZ para indução de brotos adventícios a partir de hipocótilos
de H. perforatum, M
URCH e colaboradores (2000) demonstraram a maior eficiência com
a utilização dessa citocinina, em comparação ao BA. No entanto, S
ANTARÉM e ASTARITA
(2003) verificaram que a adição de TDZ ao meio de cultura resultou na menor
freqüência organogênica e número médio de brotos por explante (segmentos nodais),
indicando que a resposta organogênica pode estar relacionada ao explante inicial usado
para micropropagação.
Os melhores resultados utilizando uma combinação entre citocininas e auxinas
ocorreram em meios suplementados com BA e ANA, para H. canariense (M
EDEROS,
1991), H. foliosum (M
OURA, 1998) e H. perforatum (SANTARÉM & ASTARITA, 2003). Para a
última espécie também foi relatado para regeneração o uso de BAP combinada com
AIA, a partir de brotos germinados de sementes em condições assépticas (Z
DUNEK &
ALFERMANN, 1992) e a partir de segmentos nodais, gemas axilares e folhas (MCCOY &
CAMPER, 2002). Através de organogênese indireta, calos obtidos de anteras de H.
perforatum foram induzidos à formação de brotos utilizando-se BAP e ANA
simultaneamente (K
IRAKOSYAN et al., 2000a). De fato, BAP sozinha ou em combinação
com ANA foi relatada como sendo eficiente em promover a diferenciação de brotos em
muitas espécies (B
LAKESLEY & CONSTANTINE, 1992).
Assim como para H. foliosum (M
OURA, 1998), o aumento na concentração de
citocinina no cultivo das espécies de Hypericum avaliadas nesse trabalho não
promoveu melhores resultados. Para todas as espécies avaliadas, a suplementação do
meio com 1 mg/L de BAP resultou na formação de brotos incompletos, apresentando
143
um aspecto de calos esverdeados, não sendo, portanto, adequado para regeneração in
vitro dessas plantas. Em H. perforatum a suplementação do meio com 1 mg/L de
citocinina (BA ou BAP) tem resultado em resposta organogênica e formação de brotos
(C
ELLÁROVÁ et al., 1992; PRETTO & SANTARÉM, 2000; SANTARÉM & ASTARITA, 2003;
GADZOVSKA et al., 2005). No entanto, a utilização de altas concentrações de BA (2,5 a 5
mg/l) induziu a formação de calos em culturas de H. perforatum, enquanto níveis abaixo
de 0,05 mg/mL de BA não foram efetivos na multiplicação dos explantes desta espécie
(G
ADZOVSKA et al., 2005).
Uma particularidade foi evidenciada durante a micropropagação de H.
campestre e de H. polyanthemum, onde após 3 meses de manutenção no mesmo meio
de cultura verifica-se uma alteração na coloração das raízes desenvolvidas in vitro. As
raízes, inicialmente verdes e amarronzadas, adquirem uma cor vermelha intensa (figura
3.4). Foi observada inclusive a presença de raízes adventícias com esse mesmo
aspecto nos tufos de partes aéreas. A análise química das raízes encontra-se descrita
no item 4.5.6.2.
Figura 3.4: Aspecto das raízes de plântulas de H. campestre (A) e H. polyanthemum (B), cultivadas em
meio MU (A, direita) e em meio MS 25% (A, esquerda) e MU (B), durante um período de três meses,
mantidas no mesmo meio de cultura.
4.5.2 Avaliação da concentração de sais do meio de cultivo no desenvolvimento in
vitro de espécies de Hypericum
Visando avaliar a influência da concentração de sais do meio de cultivo, após a
A
B
144
regeneração das plântulas de H. campestre, H. carinatum, H. myrianthum, H.
polyanthemum e H. ternum mantidas a ciclos de 45 dias em meio MU sólido, estas
foram transferidas para este mesmo meio MU, para o meio MS com sua concentração
íntegra de sais, bem como para meio contendo 25% da concentração de sais do MS.
A variação da concentração de sais no meio de cultura influenciou o
desenvolvimento in vitro de H. myrianthum não sendo observado desenvolvimento de
plântulas em meio MS 100%. Os parâmetros analisados em plântulas cultivadas em
meio MS 25% e em meio MU não variaram significativamente (figura 3.5 C). Plântulas
de H. campestre demonstraram desenvolvimento nos três meios estudados, sendo o
maior número de brotos (8,5 ± 1,29) observado no cultivo em meio MS 25%, enquanto o
maior número de raízes (28,5 ± 7,76) e raízes mais compridas (4,9 ± 0,945) foram
verificados no cultivo em meio MU. Os demais parâmetros analisados não variaram
significativamente (figura 3.5 A). Plântulas de H. carinatum demonstraram
desenvolvimento nos três meios estudados, sendo a maior massa fresca observada no
cultivo em meio MS 25% (258,02 ± 23,92), seguido do meio MU (216,7 ± 16,83) e do
meio MS 100% (198,62 ± 42,43). Brotos mais compridos (10,6 ± 1,53) e o maior
número de raízes (11,67 ± 1,75) foram observados no cultivo em meio MS 25%,
enquanto raízes mais compridas (4,9 ± 1,65) foram verificadas no cultivo em meio MU
(figura 3.5 B). Plântulas de H. ternum demonstraram desenvolvimento nos três meios
estudados, sendo que em meio MS 25% apresentaram brotos de maior comprimento (9
± 1,22 cm), enquanto as cultivadas em meio MS 100% apresentaram raízes mais
longas (5,8 ± 2,6 cm). Os demais parâmetros analisados não variaram
significativamente (figura 3.5 E). Plântulas de H. polyanthemum demonstraram
desenvolvimento nos três meios estudados, sendo a maior massa seca observada no
cultivo em meio MS 25% (37,19 ± 2,09), seguido do meio MU (34,16 ± 5,41) e do meio
MS 100% (22,30 ± 3,51). Além disso, não ocorreram diferenças significativas na
produção de biomassa das partes aéreas. O maior número de raízes (11,00 ± 1,79) foi
observado no cultivo em meio MU, enquanto raízes mais compridas (3,56 ± 0,38) foram
verificadas no cultivo em meio MS 100% (figura 3.5 D). O teor de benzopiranos em
plântulas de 45 dias cultivadas nos três meios foi também avaliado, sendo descrito no
145
capítulo 4.
0
10
20
30
40
Número de brotos Comprimento de
brotos
Número de raizes Comprimento de
raizes
Hypericum campestre
(unidade/cm)
a
b
b
a
a
b
b
a a,b
A
0
10 0
200
300
MS 25% MS 100% M∆
Massa fresca (mg)
A
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
Número de brotos Comprimento de
brotos
Número de raizes Comprimento de
raizes
Hypericum carinatum
(unidade/cm)
b
a
c
a,b
b
a
a
b
a
B
0
100
200
300
MS 25% MS 100% M∆
Massa fresca (mg)
a,b b
a
B
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
Número de brotos Comprimento de
brotos
Número de raizes Comprimento de
raizes
Hypericum myrianthum
(unidades/cm)
C
0
50
100
150
MS 25% M∆
Massa fresca (mg)
C
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
Número de brotos Comprimento de
brotos
Número de raizes Comprimento de
raizes
Hypericum polyanthemum
(unidades/cm)
a,b
a
b
a
a,b b
D
0
50
100
150
200
250
Massa fresca Massa seca Massa seca
partes aéreas
Massa (mg)
a,b a
b
D
146
Continuação da figura 3.5
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
Número de b rotos Comprimento de
brotos
Número de raizes Comprimento de
raizes
Hypericum ternum
(unidades/cm)
a
b
b
b
a
a,b
E
0
100
200
300
400
MS 25% MS 100% M∆
Massa fresca (mg)
E
Figura 3.5: Análise de crescimento de H. campestre (A), H. carinatum (B), H. myrianthum (C), H.
polyanthemum (D) e H. ternum (E) micropropagadas em meios : MS 25%; MS 100%; MU,
representado através dos parâmetros número e comprimento dos brotos, número e comprimento de
raízes e massa. Os dados representam a média ± dp.
a,b
Considerando a mesma variável, diferentes
letras são significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
Pode-se observar que o meio MU estimulou a formação de raízes de modo
significativo em H. polyanthemum. Apesar de isso não ser evidenciado de modo
significativo nas outras espécies, é possível observar uma tendência ao melhor
enraizamento neste meio de cultivo. Como já discutido anteriormente, isso pode ser
explicado pela concentração aumentada de meso-inositol (0,15 g/L) no meio MU, em
relação ao meio MS (0,1 g/L), uma vez que este participa na homeostasia de auxinas
(L
JUNG et al., 2002), importantes na indução de raízes.
Durante o desenvolvimento de um protocolo de multiplicação in vitro para H.
foliosum, M
OURA (1998) avaliou diferentes meios de cultura, verificando os melhores
resultados para o meio composto por sais de M
URASHIGE & SKOOG diluídos em 2/5 da
formulação original. Segundo a autora e outros trabalhos referenciados, a performance
desse meio poderia ser explicada pela diluição dos nutrientes, uma vez que
concentrações iônicas altas podem apresentar um efeito inibitório no crescimento de
algumas espécies. Utilizando o meio MS/2, P
ASQUA e colaboradores (2004)
demonstraram que a utilização de meio MS diluído 50 % foi adequado para a indução
de calos, estabelecimento de cultura de células em suspensão e regeneração de
plântulas de H. perforatum. Em condições salinas, o potencial osmótico do meio é um
dos fatores que mais influencia a absorção de água pelas plantas através do sistema
radicular. Portanto, uma alta concentração de sais solúveis pode afetar negativamente o
147
desenvolvimento das plantas, podendo causar a perda de água, devido ao potencial
hídrico do meio ser mais negativo que o do suco celular, levando à desidratação e até à
morte das plantas. Para as espécies de Hypericum avaliadas neste trabalho, observa-
se que a concentração salina do meio de cultivo influenciou apenas no desenvolvimento
de H. myrianthum e de H. carinatum.
4.5.3 Estudo da cinética de crescimento in vitro de Hypericum polyanthemum
O desenvolvimento in vitro de H. polyanthemum cultivada em meio MU, foi
monitorado durante o período de 6 a 14 semanas, em relação aos parâmetros de
crescimento massa fresca, massa seca e massa seca das partes aéreas.
Foi evidenciado que as plântulas apresentaram crescimento máximo (1,56 ±
0,35 g de massa fresca) após 12 semanas de cultivo (figura 3.6), desacelerando o
desenvolvimento na semana subseqüente. Cabe ressaltar que foi observada alteração
na coloração das raízes das plântulas cultivadas in vitro após esse período, conforme
descrito em 4.5.1 (figura 3.4). Entretanto, não houve diferença significativa entre a
massa seca de plântulas cultivadas in vitro por 12 e 14 semanas.
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
6 semanas 8 semanas 10 semanas 12 semanas 14 semanas
Massa (mg)
a
a
d
d
c
b
a
c c
b
a
c c
b
a
Figura 3.6: Análise de crescimento de H. polyanthemum micropropagada em meio MU, durante o
período de 6 a 14 semanas, representado através da massa fresca, massa seca e massa seca das partes
aéreas. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c,d
Considerando a mesma variável avaliada, diferentes
letras são significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( massa fresca; massa seca; massa seca das partes aéreas).
148
O teor de benzopiranos produzidos por estas plântulas foi avaliado, para
verificar uma possível correlação entre o crescimento desta espécie e a produção de
metabólitos secundários, sendo este estudo descrito no capítulo 4.
4.5.4 Aclimatização das plântulas
A aclimatização de plântulas regeneradas foi iniciada após um ano de cultivo in
vitro, com o transplantio das mesmas, cultivadas por 6 semanas em meio MU sem
adição de reguladores de crescimento, para substrato contendo uma mistura de
vermiculita expandida:solo não fertilizado. Após o endurecimento por 30 dias em sala
climatizada, essas foram tranferidas para terra vegetal de jardim e cultivadas a campo.
Para a espécie H. polyanthemum foi realizado o transplantio de plântulas cultivadas in
vitro por 6, 8, 12 e 14 semanas.
Na fase de aclimatização, um dos grandes problemas na produção de mudas
pelo cultivo in vitro é a dificuldade de readaptação das plantas ao ambiente ex vitro.
Quando se trabalha em grande escala, mesmo com um percentual relativamente
pequeno de morte dessas plantas, isso pode significar um prejuízo econômico
considerável devido ao alto investimento e emprego de mão-de-obra nessa técnica. Na
fase de aclimatização, é imprescindível a manutenção da umidade e temperaturas
amenas. Dentre os fatores que podem influenciar as respostas das plantas na fase de
aclimatização, destaca-se o substrato, através de suas características físicas, químicas
e biológicas. Outro fator que assume grande influência durante a fase de aclimatização
da maioria das espécies é a concentração da solução nutritiva usada na irrigação
(C
ARVALHO & AMÂNCIO, 2002; NETO et al., 2004; WALTERS, 2005).
A aclimatização das espécies foi realizada com sucesso, obtendo-se uma taxa
de sobrevivência de 95 a 97 % para as espécies H. ternum (figura 3.7), H. carinatum
(figura 3.8), H. campestre (figura 3.9), H. caprifoliatum (figura 3.10) e H. myrianthum
(figura 3.11). Para a espécie H. polyanthemum (figura 3.12), o percentual de
sobrevivência foi influenciado pelo tempo de manutenção das plântulas sob cultivo in
149
vitro, antes da transferência ex-vitro. As plantas cultivadas a campo mostraram-se
vigorosas e não foram atacadas por fungos e/ou pragas.
Figura 3.7: H. ternum aclimatizada, após 6 semanas de crescimento em sala climatizada.
Figura 3.8: H. carinatum aclimatizada, após 8 semanas de cultivo a campo.
Figura 3.9: H. campestre aclimatizada, após 8 semanas de cultivo a campo.
150
Figura 3.10: H. caprifoliatum aclimatizada, após 6 semanas de crescimento em sala climatizada.
(A) (B)
Figura 3.11: H. myrianthum aclimatizada, após um ano de transferência ex-vitro (A). Detalhe da flor de H.
myrianthum aclimatizada (B).
(A) (B) (C)
Figura 3.12: H. polyanthemum aclimatizada, após 6 semanas de crescimento em sala climatizada (A);
aclimatizada após 16 semanas de cultivo em campo (B). Detalhe da flor de H. polyanthemum
aclimatizada (C).
151
O cultivo in vitro das plântulas de H. polyanthemum no mesmo meio de cultura
por até 12 semanas garantiu a sobrevivência quando da transferência ex vitro. Após
este período, as plantas mantiveram-se viáveis na etapa de transferência para substrato
em ambiente climatizado, mas não resistiram às condições de cultivo a campo.
Plântulas cultivadas in vitro por 8 semanas, produziram 10,27 ± 2,39 g de biomassa
após 18 semanas de cultivo a campo, enquanto as cultivadas in vitro por 12 semanas
geraram 20,49 ± 6,22 g (figura 3.13). O acrécimo de 4 semanas no tempo de cultivo in
vitro das plântulas garantiu o dobro da biomassa, oferecendo diretrizes para futuros
experimentos.
Figura 3.13: Análise da produção de biomassa de H. polyanthemum aclimatizada durante o período de
18 semanas, considerando o tempo de manutenção das plântulas in vitro, antes da transferência para
condição ex vitro. Os dados representam a média ± dp.
a,b
Diferentes letras são significativamente
diferentes entre si (Teste t-student; p<0,05).
Dentre as espécies aqui trabalhadas este é o primeiro relato de cultivo através
da aclimatização das espécies de Hypericum nativas. No entanto, devido ao potencial
terapêutico de H. caprifoliatum, uma dissertação de mestrado foi desenvolvida com o
objetivo de cultivo sustentado com sementes, para a conservação desta espécie.
Sementes desta planta foram caracterizadas, sendo avaliadas a germinação e a
propagação sexuada. Os resultados indicaram necessidade de luz, superação de
dormência e temperatura inferior a 25°C para germinação de H. caprifoliatum, sendo
possível sua propagação sexuada (K
REIMEIER, 2005).
0
5
10
15
20
25
30
2 meses cultivo in vitro/18
semanas aclimatizada
3 meses cultivo in vitro/18
semanas aclimatizada
Massa fresca (g)
b
a
152
4.5.4.1 Estudo da ontogenia de Hypericum polyanthemum aclimatizada
Para este estudo, foi realizada a análise da biomassa de diferentes partes de
H. polyanthemum cultivada in vitro por 8 semanas e, posteriormente, cultivada a campo,
no período de agosto/06 a janeiro/07, com avaliações quinzenais durante o período de
14 a 22 semanas (figura 3.14). Ao longo deste período foi observado uma diminuição
progressiva na proporção das partes vegetativas, e um aumento das partes
reprodutivas da planta.
Os primeiros botões florais foram visíveis após 14 semanas de transferência
ex-vitro. Da mesma maneira, plantas de H. perforatum, aclimatizadas em um sistema
hidropônico, após 14 a 16 semanas produziram flores (M
URCH et al., 2002).
Foram verificados diferentes estágios de ontogênese floral, que foram
classificados como botões florais fechados (completamente verdes) e abertos (com as
primeiras pétalas amarelas visíveis), flores abertas, flores senescentes e frutos (figura
3.15) (massa fresca e massa seca de cada órgão individual apresentadas na figura
3.16). Para avaliar a relação entre a produção dos compostos bioativos com o
desenvolvimento do vegetal, foi realizada a quantificação dos benzopiranos nas partes
vegetativas e nos diferentes estágios reprodutivos de H. polyathemum aclimatizada.
Esses resultados estão apresentados no capítulo 4.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
14 sem 16 sem 18 sem 20 sem 22 sem 24 sem
Partes vegetativas Botões Flores Frutos
Figura 3.14: Proporção de partes vegetativas, botões florais, flores e frutos em H. polyanthemum
aclimatizada, durante o período de 14 a 22 semanas.
153
Figura 3.15: Diferentes estágios de ontogênese floral de H. polyanthemum aclimatizada: botões florais
fechados (A), botões florais abertos (B), flores (C), flores senescentes (D) e frutos (E).
0
5
10
15
20
25
30
Botões
fechados
Botões
abertos
Flores Flores
fenecentes
Frutos
Massa (mg)
a
d
b
b,c
c
b,c
a,b a
b,c
c
Figura 3.16: Análise do peso fresco e peso seco das diferentes partes reprodutivas de H. polyanthemum
aclimatizada. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c
Considerando a mesma variável, diferentes letras
são significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( Massa fresca; Massa seca).
A análise da biomassa de H. polyanthemum cultivada in vitro por 12 semanas
e, posteriormente, cultivada a campo, no período de setembro/06 a janeiro/07, com
avaliação realizada após 18 semanas de cultivo a campo, demonstrou que as plantas
apresentaram 94,5 % de partes vegetativas e 5,4 % de inflorescências, proporção
distinta da verificada nas plantas cultivadas in vitro por 8 semanas no mesmo período
de cultivo a campo (78 % de partes vegetativas e 22% de inflorecências). Pode-se
inferir que a variação da massa de inflorescências ocorre em função das temperaturas
mais elevadas verificadas durante o período de cultivo a campo das plantas mantidas in
vitro por 12 semanas (mínimas de 18 ± 4 °C e máximas de 28 ± 8 °C) em comparação
A
C
B
D
E
154
com as temperaturas de cultivo a campo das plantas mantidas in vitro por 8 semanas
(mínimas de 14 ± 4 °C e máximas de 24 ± 5 °C).
A temperatura é caracterizada como um dos principais fatores ambientais que
influencia o processo fisiológico, especialmente fotossíntese e crescimento, das plantas
(Z
OBAYED et al., 2005). Estudos realizados com H. perforatum relatam a influência da
temperatura na germinação das sementes e desenvolvimento da planta, demonstrando
melhores resultados em temperaturas mais amenas (S
OUTHWELL & BURKE, 2001;
Z
OBAYED et al., 2005; COUCEIRO et al., 2006).
A quantificação dos benzopiranos nas partes vegetativas e flores totais de H.
polyathemum aclimatizada durante o período de 18 semanas, considerando o tempo de
manutenção in vitro foi também realizada. Esses resultados estão apresentados no
capítulo 4.
4.5.5 Indução e estabelecimento das culturas de calos
A otimização da proliferação celular in vitro é o primeiro passo para o
estabelecimento de culturas em larga escala e produção de metabólitos secundários.
Com esse objetivo, culturas de calos de H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum
foram estabelecidas.
Discos foliares de H. myrianthum in natura, foram inoculados em meio MU
suplementado com 1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de cinetina; 1 mg/mL de 2,4-D, 0,2
mg/mL de cinetina e 0,2 mg/mL de ANA ou com 1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de BAP
resultando na indução de calos, independentemente da condição de luminosidade. A
análise de crescimento dos calos desta espécie evidenciou um maior índice de
crescimento quando estes foram cultivados em meio suplementado com 2,4-D/CIN
(figura 3.17).
155
0
2
4
6
8
10
12
2,4-D/CIN 2,4-D/BAP 2,4-D/CIN/ANA
Índice de crescimento
(mg peso seco)
a
b
b
Figura 3.17: Análise de crescimento dos calos de H. myrianthum em meio MU suplementado com 2,4-
D/CIN (1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de cinetina); 2,4-D/BAP (1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de BAP);
2,4-D/CIN/ANA (1 mg/mL de 2,4-D, 0,2 mg/mL de cinetina e 0,2 mg/mL de ANA), representado através do
índice de crescimento. Os dados representam a média ± dp.
a,b
Diferentes letras são significativamente
diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
Os calos obtidos constituem-se em uma massa de células indiferenciadas,
apresentando coloração inicial amarelo-claro passando a amarelo-marrom. Quando
mantidos no mesmo frasco de cultivo por períodos longos, os calos adquirem uma
coloração rósea.
Segmentos caulinares e foliares provenientes de plântulas de H. polyanthemum
micropropagadas foram inoculados em meio MU com diferentes combinações de
reguladores de crescimento. Após 30 dias do início da cultura, observou-se que seis
tratamentos demonstraram calogênese (tabela 3.5). O melhor desenvolvimento foi
obtido na presença de 1,0 mg/L de 2,4-D, 0,2 mg/L de CIN e 0,2 mg/L de ANA (figura
3.18), verificando-se que a combinação de duas auxinas e uma citocinina induziu a
proliferação celular, como anteriormente relatado em culturas de calos de H. perforatum
(P
ASQUA et al., 2004). Entre os tratamentos avaliados no cultivo de calos de H.
polyanthemum, verificou-se maior produção de biomassa com a utilização de folhas
como explante, mantidas sob fotoperíodo de 16 horas e diferenças no aspecto dos
mesmos em relação à condição de luminosidade e aos reguladores de crescimento
utilizados (figuras 3.18 e 3.19). Isso também foi observado para H. perforatum, onde
156
calos induzidos no escuro apresentaram-se friáveis e amarelos, e quando na presença
de luz, verdes e compactos (P
RETTO & SANTARÉM, 2000).
Tabela 3.5: Análise da calogênese de H. polyanthemum
Combinação de
reguladores de
crescimento
Concentração
(mg/L)
Explantes
Freqüência
da formação
de calos (%)
Aparência do calo
Luz Escuro Luz Escuro
Folhas
100 86
Marron
esverdeados
Amarelo claro
2,4-D/CIN
1,0/0,2
Entre-nós 100 100
Marron
esverdeados
Amarelo claro
com pontos
marrons
Folhas 90 88 Verdes Amarelo claro
2,4-D/ BAP
1,0/0,2
Entre-nós 100 - Verdes -
Folhas 80 100
Amarelo com
pontos
marrons
Amarelo claro
com pontos
marrons
2,4-D/CIN/ANA
1,0/0,2/0,2
Entre-nós 100 100
Amarelo com
pontos
marrons
Amarelo claro
com pontos
marrons
0
1
2
3
4
5
2,4-D/BAP 2,4-D/CIN 2,4-D/CIN/ANA
Índice de Crescimento
(mg peso seco)
b
a
c
c,d
c,d
d
A
0
1
2
3
4
5
2,4-D/BAP 2,4-D/CIN 2,4-D/CIN/ANA
Índice de crescimento
(mg peso seco)
a
a,b
b,c
c,d d
B
c,d
Figura 3.18: Análise de crescimento dos calos de H. polyanthemum em meio MU suplementado com
2,4-D/CIN (1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de cinetina); 2,4-D/BAP (1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de
BAP); 2,4-D/CIN/ANA (1 mg/mL de 2,4-D, 0,2 mg/mL de cinetina e 0,2 mg/mL de ANA), representado
através do índice de crescimento. (A) Indução de calogênese a partir de folhas ( Claro; Escuro). (B)
Indução de calogênese no claro a partir de folhas ou segmentos nodais ( Folhas; Segmentos nodais).
Os dados representam a média ± dp.
a,b
Diferentes letras são significativamente diferentes entre si
(ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
157
Figura 3.19: Aspecto dos calos de H. polyanthemum cultivados em meio MU suplementado com A) 1
mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de cinetina; B) 1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de BAP e C) 1 mg/mL de
2,4-D, 0,2 mg/mL de cinetina e 0,2 mg/mL de ANA), sob fotoperíodo de 16 h.
Culturas de calos de H. ternum foram estabelecidas a partir de folhas apicais
de plântulas micropropagadas em meio MU, sem a adição de reguladores de
crescimento mantidas in vitro por 12 meses. Os explantes foliares, inoculados em meio
MU suplementado com 6 combinações de concentrações da auxina 2,4-D (1,0 e 2,0
mg/L ) e da citocinina cinetina (0,0; 0,2 e 0,5 mg/L), demonstraram calogênese em
todos os tratamentos com adição de reguladores de crescimento, após 30 dias do início
da cultura. Entretanto, nem todos os tratamentos mantiveram o crescimento de calos.
Desse modo, após oito meses do início de cultura, somente no tratamento com a adição
de 1,0 mg/L de 2,4-D e 0,2 mg/L de cinetina, independente da intensidade luminosa,
houve um contínuo crescimento de células. Os calos obtidos constituem-se em uma
massa de células indiferenciadas, com aspecto pulverulento e de coloração inicial
amarelo-claro passando a amarelo-marrom (figura 3.20).
Figura 3.20: Aspecto dos calos de H. ternum cultivados em meio MU suplementado com 1 mg/mL de
2,4-D e 0,2 mg/mL de cinetina.
Algumas espécies do gênero Hypericum têm sido utilizadas para obtenção de
A B C
158
culturas de calos. Os trabalhos visam não apenas os calos propriamente ditos, mas
também a obtenção de culturas de células em suspensão, que são normalmente
iniciadas com a transferência de calos friáveis para um meio nutritivo líquido.
O cultivo de células vegetais tem se apresentado como uma alternativa viável
aos métodos convencionais de produção de biomassa para extração de metabólitos
secundários bioativos. Além disso, culturas in vitro podem ser estabelecidas
objetivando-se o estudo da biossíntese dessas substâncias (B
OURGAUD et al., 2001).
Essas duas abordagens têm sido relatadas para o estabelecimento de culturas
celulares das espécies de Hypericum.
Em H. patulum, culturas de calos foram estabelecidas a partir de flores
cultivadas no escuro na presença de 2,4-D e cinetina (I
SHIGURO et al., 1993; ISHIGURO et
al., 1995; I
SHIGURO et al., 1997; ISHIGURO et al., 1998). Yasaki e Okuda (1990) obtiveram
calos de H. erectum em meio Linsmaier-Skoog suplementado com AIA e BA. Utilizando
segmentos nodais de H. brasiliense como explantes, a combinação de citocininas e
auxinas não promoveu o crescimento de calos, obtidos apenas na presença de 2,4-D
ou de ANA, isoladamente, sob um fotoperíodo de 16 horas (C
ARDOSO & DE OLIVEIRA,
1996). No entanto, para H. perforatum, o cultivo de folhas na presença de 2,4-D como
único regulador de crescimento não resultou na formação de calos dessa espécie
(P
RETTO & SANTARÉM, 2000), sendo induzida calogênese apenas com a combinação de
2,4-D com BA ou cinetina (P
RETTO & SANTARÉM, 2000; DIAS et al., 2001; BAIS et al.,
2002). Ainda em H. perforatum, calos foram estabelecidos com a suplementação
combinada de BA e ANA (K
ARTNIG et al., 1996, KIRAKOSYAN et al., 2000a), cinetina e
ANA (D
IAS et al., 1998), TDZ e ANA (SANTARÉM & ASTARITA, 2003) e também BAP e AIA
(M
CCOY & CAMPER, 2002).
Culturas de calos de H. androsaemum foram induzidas e mantidas a partir de
segmentos caulinares, inoculados em meio MS suplementado com diferentes
combinações de auxina e citocininas (ANA/CIN; ANA/BA; 2,4-D/CIN; 2,4-D/BA e 2,4-
D/BA/CIN), sendo a produção de biomassa estimulada pelo aumento na concentração
159
de ANA, na presença de CIN (DIAS et al., 2000). Outras espécies do gênero também
foram avaliadas, H. bithynicum, H. glandulosum, H. balearicum, H. olympicum e H.
maculatum, demonstrando-se indução e manutenção de culturas celulares dessas
espécies em meio MS suplementado com BAP e ANA (K
ARTNIG et al., 1996).
Com isso mostra-se, então, que a resposta a diferentes reguladores de
crescimento pode ser variável entre plantas de um mesmo gênero, o que explica os
diferentes comportamentos das culturas de tecidos e células das espécies de
Hypericum avaliadas nesse trabalho. Além disso, cabe ressaltar que a variabilidade
fisiológica e química existente entre as plantas também afeta o comportamento das
mesmas em cultura.
Nesse trabalho, demonstrou-se o estabelecimento de protocolos de
micropropagação de H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. polyanthemum, H.
myrianthum e H. ternum, e a indução de calos das últimas três espécies, possibilitando,
assim, a manutenção do germoplasma dessas espécies, bem como a investigação da
produção in vitro dos metabólitos de interesse farmacológico.
4.5.6 Análise fitoquímica do material vegetal obtido por cultivo in vitro
Sistemas de cultivo in vitro têm sido empregados como uma ferramenta efetiva
para a obtenção de vegetais geneticamente uniformes, que podem ser utilizados como
fonte de matéria-prima para obtenção de metabólitos secundários de plantas (FERREIRA
et al., 1998; ROUT et al., 2000; FRANÇA, 2003). Esse método torna-se de grande
importância para a obtenção de produtos de interesse cujas concentrações na planta
são baixas, sem que haja a necessidade de uma grande quantidade de matéria-prima
vegetal, ou até mesmo quando a fonte vegetal do metabólito alvo apresenta limitações
e/ou dificuldades no cultivo a campo, ou seu período de desenvolvimento é longo. Essa
tecnologia ainda permite a obtenção de substâncias sob condições controláveis e
reprodutíveis, independentemente de variações sazonais ou localização geográfica,
uma vez que o cultivo de tecidos vegetais in vitro pode minimizar os efeitos de
160
alterações ambientais, conseguindo-se um maior controle sobre as condições de
temperatura, luz e nutrientes (STAFFORD & WARREN, 1991; ROUT et al., 2000; BOTTA et
al., 2001; FRANÇA, 2003).
Como demonstrado na revisão bibliográfica, em muitas espécies de Hypericum
esse recurso tem sido utilizado. Considerando as atividades biológicas que vem sendo
demonstradas para as substâncias isoladas das espécies nativas do Rio Grande do Sul,
foi realizada uma avaliação comparativa da produtividade das espécies de Hypericum
desenvolvidas através do cultivo in vitro neste trabalho.
4.5.6.1 Análise cromatográfica e caracterização de substâncias tanantes
A avaliação química do material vegetal obtido por cultivo in vitro foi realizada
mediante comparação cromatográfica com as plantas desenvolvidas em campo.
Na análise qualitativa das frações n-hexânica das plântulas micropropagadas
observou-se a produção de compostos apolares com comportamento cromatográfico de
terpenos e derivados de floroglucinol. Assim como na planta desenvolvida em campo,
as plântulas de H. ternum apresentaram produção apenas de substâncias com
características de terpenóides. No entanto, as plântulas de H.myrianthum e H.
campestre apresentaram produção de derivados de floroglucinol.
Na análise cromatográfica da fração n-hexânica de H. myrianthum
micropropagada pode-se verificar a presença de substâncias com comportamento
cromatográfico semelhante ao dos floroglucinóis uliginosina B e japonicina A,
evidenciado pelo mesmo valor de Rf, bem como desenvolvimento de mesma coloração
após revelação com anisaldeído sulfúrico quando comparado com amostras autênticas
desses derivados de floroglucinóis. No entanto, na fração n-hexânica das raízes das
plântulas desta espécie verifica-se apenas a presença de traços de japonicina A.
H. campestre in natura apresentou a produção de substâncias com esse
161
mesmo comportamento cromatográfico, sendo uliginosina B produzida por plântulas
micropropagadas desta espécie.
Na análise da fração n-hexânica o de H. carinatum micropropagada evidenciou-
se a presença de apenas traços de substâncias com comportamento cromatográfico
das benzofenonas carifenona A e carifenona B.
Em plântulas de H. polyanthemum verificou-se a presença de substâncias com
comportamento cromatográfico dos benzopiranos HP1, HP2 e HP3, substâncias
majoritárias da fração n-hexânica da planta desenvolvida in natura.
Nas frações metanólicas, verificou-se produção similar de compostos fenólicos
presentes nas plantas desenvolvidas em campo, tais como flavonóides e ácidos
fenólicos.
Todas as plântulas micropropagadas apresentaram traços de taninos nos seus
extratos aquosos, indicado por turvação do extrato após adição de algumas gotas de
solução de gelatina 1%. Os taninos produzidos foram caracterizados como
condensados devido ao desenvolvimento de coloração esverdeada após reação com
cloreto férrico 1%. A caracterização e o conteúdo de taninos das plantas desenvolvidas
em campo foi determinado previamente por D
ALL’AGNOL e colaboradores (2003), sendo
evidenciado um acúmulo de taninos condensados nessas espécies, e o menor
conteúdo verificado para H. myrianthum (5,1%) e o maior para H. ternum (16,7%).
As espécies micropropagadas demonstraram perfis qualitativos similares aos
apresentados pelas plantas desenvolvidas no campo. Nesse sentido, o cultivo in vitro
das espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul apresenta-se como uma
alternativa interessante aos métodos convencionais de produção de biomassa para
extração de metabólitos secundários bioativos.
162
4.5.6.2 Análise das raízes de Hypericum campestre e Hypericum polyanthemum
micropropagadas
Antocianinas são pigmentos hidrossolúveis, na forma de glicosídeos de
antocianidinas, a forma aglicona dessa classe de substâncias. A cor de pigmentos
vegetais está associada à sua estrutura química, e a sua coloração em meio ácido ou
básico depende justamente das modificações ocorridas na molécula, quando a mesma
é submetida a diferentes valores de pH (S
TRACK & WRAY, 1989).
Verificando-se a influência do pH, mediante o tratamento da solução metanólica
do extrato das raízes de H. campestre e H. polyanthemum micropropagadas com
solução de HCl e NH
3
concentrados, foi possível evidenciar a presença de antocianinas
nos extratos, devido à alteração na coloração da solução. Em pH ácido, verificou-se a
formação de uma coloração vermelha intensa, enquanto na presença de pH alcalino,
observou-se a formação de uma coloração esverdeada.
Considerando a possibilidade de estas substâncias estarem presentes nas
partes aéreas das culturas cujas raízes apresentaram coloração vermelha, e também
de estas serem liberadas para o meio de cultura, foi avaliada a influência do pH nestas
amostras. Foi verificada ausência de antocianinas nas mesmas, uma vez que não
houve alteração na coloração das soluções com o tratamento ácido e básico. Da
mesma forma, foram analisadas partes aéreas e raízes das plantas cultivadas em
campo, verificando-se ausência destas substâncias.
Em diferentes pH as antocianinas se encontram em diferentes formas e
apresentam cores diversas. Em meio ácido as antocianinas se encontram na forma de
sais de oxônio e são geralmente de cor vermelha brilhante. Com o aumento do pH das
soluções, as antocianinas passam a ter uma estrutura quinoidal, púrpura, e em meio
alcalino a cor muda para azul
(STRACK & WRAY, 1989).
As cromatografias com os eluentes BAW e Forestal mostraram a presença de
163
uma única banda rósea no cromatograma. Utilizando-se como eluente água:HCl (99:1)
não ocorreu eluição das amostras, que permaneceram muito próximas ao ponto de
aplicação, evidenciando a possibilidade de tratar-se de antocianidina. De acordo com
S
TRACK & WRAY (1989) seis estruturas de antocianidinas são encontradas mais
comumente na natureza: pelargonidina, cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina e
malvidina. Os valores de Rf da banda nos eluentes BAW e Forestal foram comparados
com dados de Rf da literatura (H
ARBORNE, 1998). Após o tratamento dos
cromatogramas com vapor de amônia, a coloração rósea da banda tornou-se azul
esverdeada. Os valores de Rf encontrados foram 0,59 em BAW e 0,60 em Forestal.
Estes valores de Rf e a coloração desenvolvida após o tratamento dos cromatogramas
com vapor de amônia sugerem a presença da antocianidina malvidina (34) nos extratos
das raízes em análise.
OH
OH
HO
OMe
OH
OMe
+
O
(34)
Para analisar esta hipótese foram realizadas análises espectroscópicas na
região do ultravioleta-visível. O pico máximo de absorção observado foi em =530 nm
(MeOH:HCl 0,1%), para o extrato das raízes de H. polyanthemum (figura 3.21 A) e em
=528 nm (MeOH:HCl 0,1%), para a amostra purificada (extraída do papel após eluição
cromatográfica) (figura 3.21 B). Após a adição de AlCl
3
, a coloração de ambas as
soluções permaneceu a mesma, não ocorrendo deslocamento batocrômico do espectro
de absorção. Com isso evidenciou-se a ausência de hidroxilas vicinais na estrutura da
substância em análise, reforçando a possibilidade de tratar-se da antocianidina
malvidina.
164
200 300 400 500 600 700
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
A
MeOH:HCl 0,1%
MeOH:HCL 0,1% + AlCl
3
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
200 300 400 500 600 700
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
MeOH:HCl 0,1%
MeOH:HCL 0,1% + AlCl
3
B
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
Figura 3.21: Espectro de absorção na região do UV-VIS do extrato das raízes de H. polyanthemum (A) e
da amostra purificada (B).
A presença de antocianinas em culturas de micropropagação não é relatada
para espécies de Hypericum. Neste trabalho, não evidenciou-se a produção destes
compostos em plantas desenvolvidas a campo, de modo que a presença destas
substâncias nas raízes de H. polyanthemum e H. campestre e nos calos de H.
myrianthum pode ser um indicativo de estresse no ambiente de cultivo, promovido pelo
esgotamento e secamento do meio de cultura, uma vez que o aparecimento das
mesmas é observado em material cultivado in vitro por um período de três meses, sem
a realização de subcultura.
Muitas espécies vegetais, aciânicas quando crescem em condições normais,
produzem antocianinas na presença de altos teores de açúcar, ou quando deficientes
em certos metais, bem como em resposta a ataques por patógenos. Sabe-se ainda que
a deficiência de importantes minerais, tais como fósforo e nitrogênio, também resulta
em um aumento no teor de antocianinas ou produção por plantas que naturalmente não
acumulam esses pigmentos (H
RAZDINA, 1982).
Fazendo uma comparação através de observação visual das raízes de H.
campestre, verificou-se que raízes mantidas em meio MS 25% apresentaram uma maior
produção de antocianinas, em relação às raízes mantidas em meio MU. Isso pode ser
devido à composição de nitrogênio presente no meio de cultura. Acredita-se que a
165
produção de antocianinas é melhorada quando o nitrogênio total (NH
4
+
/NO
3
-
) é um fator
limitante ao crescimento (S
ATO et al., 1996).
4.6
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no estudo descrito neste capítulo 3 permitem concluir
que:
A regeneração in vitro das espécies H. campestre, H. caprifoliatum, H.
carinatum, H. myriantum, H. polyanthemum e H. ternum foi induzida a partir de apices
caulinares em meio MU.
A indução dos novos brotos em H. ternum foi verificada em meio MU sem a
adição de reguladores de crescimento e promovida com a adição de 0,04 mg/L BAP. A
regeneração em plântulas completas ocorreu em ambos os meios, com melhor taxa de
proliferação dos brotos no meio suplementado com BAP e enraizamento favorecido no
meio MU livre de reguladores de crescimento.
A diferenciação e a proliferação dos brotos nas culturas in vitro de H.
carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum deu-se de modo mais eficiente em meio
MU suplementado com 0,4 mg/mL de BAP. Brotos das três espécies foram transferidos
para meio MU sem adição de reguladores de crescimento, onde desenvolveram raízes,
sendo regeneradas em plântulas completas.
A diferenciação e a proliferação dos brotos nas culturas in vitro de H.
caprifoliatum ocorreu em meio MU suplementado com 0,4 mg/L BAP e 0,2 mg/L ANA.
O enraizamento e regeneração em plântulas completas deu-se com a transferência
desses brotos para meio MU, sem adição de reguladores de crescimento. Após quatro
subculturas não houve sobrevivência das plântulas mantidas in vitro.
A indução de brotos a partir de segmentos apicais de H. campestre foi
166
verificada apenas em meio MU, suplementado com 0,2 mg/L de BAP e 1,0 mg/L de
2,4-D, com formação de calos. Os brotos induzidos nesse tratamento, foram
transferidos para meio MU, na ausência de reguladores de crescimento,
proporcionando o enraizamento e formação de plântulas completas.
Para todas as espécies avaliadas, a suplementação do meio MU com 1 mg/L
de BAP resultou na formação de brotos incompletos, apresentando um aspecto de
calos esverdeados, inadequados para regeneração in vitro dessas plantas.
A manutenção de plântulas de H. campestre e de H. polyanthemum, sem
subcultura no mesmo meio MU durante um período superior a três meses, induziu a um
quadro de estresse, evidenciado pela coloração vermelha intensa das raízes das
plântulas e caracterização da produção de antocianinas. A análise cromatográfica e
espectrofotométrica sugere a presença da antocianidina malvidina nos extratos das
raízes em análise.
A concentração de sais do meio de cultivo (MS 25%, MS 100% e MU)
promoveu diferentes respostas, entre as espécies, nos parâmetros de crescimento in
vitro avaliados. Com exceção de H. myrianthum, que não se desenvolveu no meio MS
100%, as plântulas adaptaram-se à nova condição de cultivo. Em relação ao parâmetro
de massa fresca, apenas para a espécie H. carinatum ocorreu diferença significativa,
evidenciando-se o maior aumento de biomassa no meio MS 25%. O meio MU
estimulou a formação de raízes de modo significativo em H. polyanthemum,
observando-se, ainda, nesse meio uma tendência ao melhor enraizamento nas outras
espécies.
Plântulas de H. polyanthemum cultivada em meio MU apresentaram
crescimento máximo após 12 semanas de cultivo in vitro.
A aclimatização das espécies foi realizada com sucesso, obtendo-se uma
taxa de sobrevivência de 95 a 97 % para as espécies H. ternum, H. carinatum, H.
167
campestre, H. caprifoliatum e H. myrianthum. Para a espécie H. polyanthemum, o
percentual de sobrevivência foi influenciado pelo tempo de manutenção das plântulas
sob cultivo in vitro, antes da transferência ex-vitro.
A análise da biomassa de diferentes partes de H. polyanthemum aclimatizada
durante o período de 14 a 22 semanas revelou uma diminuição progressiva na
proporção das partes vegetativas, e um aumento das partes reprodutivas da planta.
Os primeiros botões florais de H. polyanthemum aclimatizada foram visíveis
após 14 semanas de transferência ex-vitro. Diferentes estágios de ontogênese floral
foram verificados, classificados como botões florais fechados (completamente verdes) e
abertos (com as primeiras pétalas amarelas visíveis), flores abertas, flores senescentes
e frutos.
O período de manutenção de plântulas de H. polyanthemum, sob cultivo in
vitro, influencia na biomassa e proporção de partes aéres e flores de plantas
aclimatizadas durante 18 semanas. Entretanto, avaliações em diferentes épocas do
ano são necessárias para a confirmação dos resultados obtidos.
Calos de H. myrianthum foram induzidos a partir de discos foliares em meio
MU suplementado com 1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de cinetina; 1 mg/mL de 2,4-D,
0,2 mg/mL de cinetina e 0,2 mg/mL de ANA ou com 1 mg/mL de 2,4-D e 0,2 mg/mL de
BAP, independentemente da condição de luminosidade, com maior índice de
crescimento em meio MU suplementado com 2,4-D/CIN.
Calos de H. polyanthemum foram induzidos a partir de segmentos caulinares
e foliares provenientes de plântulas micropropagadas. O melhor desenvolvimento foi
obtido em meio MU, na presença de 1,0 mg/L de 2,4-D, 0,2 mg/L de CIN e 0,2 mg/L de
ANA, com maior produção de biomassa utilizando folhas como explante, mantidas sob
fotoperíodo de 16 horas.
168
Calos de H. ternum foram induzidos a partir de folhas apicais de plântulas
micropropagadas em todos os tratamentos avaliados, com manutenção do crescimento
celular apenas na presença de 1,0 mg/L de 2,4-D e 0,2 mg/L de cinetina, independente
da intensidade luminosa.
A resposta a diferentes reguladores de crescimento apresenta variações
entre espécies do gênero Hypericum, cuja variabilidade química existente entre as
plantas influencia no comportamento das mesmas sob cultivo in vitro.
As espécies micropropagadas demonstraram padrões de produtividade
similares aos apresentados pelas plantas desenvolvidas a campo.
O cultivo in vitro das espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul
apresenta-se como uma alternativa interessante aos métodos convencionais de
produção de biomassa para extração de metabólitos secundários bioativos.
169
5. CAPÍTULO 4
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA
QUANTIFICAÇÃO DE BENZOPIRANOS EM EXTRATO N-HEXÂNICO
DE
HYPERICUM POLYANTHEMUM
170
171
5.1 INTRODUÇÃO
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através de
sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade está sendo cada vez mais
reconhecida e exigida. Para garantir que um novo método analítico gere informações
confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada
validação (R
IBANI, 2004).
Como já apresentado no decorrer deste trabalho, Hypericum polyanthemum é
uma espécie nativa que vêm despertando interesse pelo nosso grupo de pesquisa
devido ao seu potencial terapêutico. Desta forma, é importante o desenvolvimento de
métodos que permitam a padronização do material vegetal proveniente desta planta.
Nesse sentido, o cultivo de modo controlado, bem como a avaliação da
produção de metabólitos secundários, mostram-se de grande importância para
obtenção de matéria-prima de alto padrão de qualidade e uniformidade.
Os produtos
mais abundates isolados desta planta e aos quais vêm sendo atribuídas diversas
atividades biológicas são derivados benzopirânicos, presentes no extrato lipofílico da
espécie (F
ERRAZ et al., 2001; GNERRE et al., 2001; VIANA et al., 2003; DALL’AGNOL et al.,
2005; FERRAZ et al., 2005b,c; NÖR, 2006).
5.2
OBJETIVOS
Estabelecimento e otimização de um sistema de análise por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) para extrato n-hexânico de H. polyanthemum.
Validação de metodologia para a quantificação dos benzopiranos HP1, HP2 e
HP3 em extrato n-hexânico de H. polyanthemum.
Análise química comparativa entre H. polyanthemum de desenvolvimento in
natura, micropropagada e aclimatizada.
172
5.3 REVISÃO
5.3.1 Validação de metodologia analítica
A validação de métodos analíticos é o processo que confirma o emprego de um
procedimento analítico para um teste específico, visando comprovar que o método é
apropriado para a finalidade pretendida (S
HABIR, 2003).
Os métodos cromatográficos, em especial a técnica de CLAE, vêm sendo
selecionados para utilização de análises de extratos vegetais, por apresentarem a
capacidade de realizar separações que permitem a análise qualitativa e quantitativa de
substâncias. Esta técnica apresenta uma variedade de parâmetros passíveis de
modificações pelo operador, para otimizar o procedimento de separação dos
constituintes de uma amostra complexa. Entre os principais fatores encontram-se o
eluente que compõe a fase móvel, o tamanho e preenchimento das colunas
cromatográficas, a disponibilidades de diferentes tipos de detectores, entre outros.
Aliados ao desenvolvimento de metodologias analíticas quantitativas utilizando
CLAE estão os procedimentos de validação, onde órgãos regulamentadores, como o
ICH (I
NTERNATIONAL HARMONIZATION CONFERENCE, 1996), Farmacopéia Americana (THE
U
NITED STATES PHARMACOPEIA, 2005) e ANVISA (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA
SANITÁRIA; BRASIL, 2003) estabelecem normas para sua a realização, garantindo assim
a confiabilidade nos resultados obtidos.
Os principais parâmetros de performance analítica que devem ser avaliados na
validação de um método para preparações de origem vegetal são exatidão, precisão,
seletividade/especificidade, linearidade, robustez e estabilidade da substância a ser
quantificada (ICH, 1996; B
RASIL, 2003; THE UNITED, 2005).
A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados obtidos e o
valor verdadeiro ou mais provável. Freqüentemente é expressa como percentual de
173
recuperação.
A precisão representa o grau de concordância entre uma série de análises,
resultantes da aplicação repetida do método a amostras homogêneas. Pode ser
avaliada através do coeficiente de variação (CV %), que corresponde ao desvio padrão
relativo. A precisão pode ser avaliada pelo grau de repetibilidade, precisão intermediária
ou reprodutibilidade. A repetibilidade é avaliada em função dos valores encontrados
após a análise de uma única amostra em um laboratório por um único analista, no
mesmo equipamento. A precisão intermediária é medida através dos resultados obtidos
de uma amostra analisada em diferentes dias, diferentes operadores ou em diferentes
equipamentos. A reprodutibilidade é avaliada pela análise em diferentes laboratórios.
A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de
avaliar, de forma inequívoca, as substância em exame na presença de componentes
que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. O mesmo
significado tem sido freqüentemente utilizado para o termo especificidade (R
IBANI,
2004). Apesar do termo mais adequado para o parâmetro seja seletividade, o ICH
(1996) e a Farmacopéia Americana (T
HE UNITED, 2005) consideram especificidade
como o termo correto. Este parâmetro pode ser expresso como desvio percentual em
relação a uma quantidade conhecida de substância incorporada na amostra (ICH,
1996).
A linearidade representa a capacidade do método em produzir resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância em análise, dentro de uma
determinada faixa de aplicação, que deve possuir no mínimo cinco concentrações no
intervalo de 80-120%. O comportamento dos resultados obtidos deve ser descrito por
uma equação linear e avaliado por métodos estatísticos apropriados, como por
exemplo, o cálculo de regressão pelos métodos dos mínimos quadrados e análise de
variância (ANOVA).
Robustez é a capacidade intrínseca do método de fornecer resultados
174
reprodutíveis quando submetido a pequenas modificações das condições
experimentais.
5.3.2 Benzopiranos
Devido ao desenvolvimento de metodologia para quantificação de benzopiranos
presentes no extrato lipofílico de H. polyanthemum, foi realizada uma breve revisão sobre
essa classe de compostos.
Através da revisão realizada, foi possível perceber que a ocorrência de
benzopiranos em Guttiferae não é freqüente como na família Asteraceae. Entretanto, a
produção destas substâncias é esperada, pois para a biossíntese dos mesmos é
necessária a ciclização de um radical prenila vicinal a uma hidroxila aromática. No gênero
Hypericum, tanto o radical prenila, quanto derivados de floroglucinol (fonte de hidroxilas
aromáticas) são abundantes.
Benzopiranos têm sua estrutura caracterizada pela presença de um anel
aromático ligado a um núcleo pirano o qual pode ser formado por duas vias distintas.
Os produtos presentes no gênero Hypericum pertencem à rota biossintética clássica, na
qual a prenila é fundamental para a ciclização formando um núcleo benzopirânico (35).
A outra via foi relatada para cromenos de Myrtaceae que estruturalmente se
diferenciam dos demais pela ausência da dimetila geminal em
ao oxigênio do
heterociclo (36). Neste caso, segundo propõem os autores, sua formação biossintética
é originada a partir de eugenol ou floro-acetofenona e não de floroglucinóis prenilados,
como ocorre na via clássica (M
ENUT et al., 2000).
(35) (36)
OH
O
CH
3
O
OCH
3
CH
3
O
O
OCH
3
175
Os derivados dimetil-benzopirânicos relatados para espécies de Hypericum são
sarolactona (37), isolada de H. japonicum
(ISHIGURO et al., 1990) 8-isobutiril-5,7-di-
hidroxi-6-metil-2,2-dimetilcromeno (38), isolado de H. revolutum (D
ÉCOSTERD et al.,
1986) e 5,7-di-hidroxi-3-metilcromona (39) isolado de H. annulatum (N
EDIALKOV &
KITANOV, 2002) bem como os objetos de estudo deste capítulo, HP1, HP2 e HP3,
isolados de H. polyanthemum, cujas estruturas já foram apresentadas no decorrer do
trabalho.
(37) (38) (39)
Estas três substâncias vêm despertando a atenção do nosso grupo de
pesquisa devido às propriedades biológicas demonstradas, nos diferentes ensaios
realizados.
Inicialmente, caracterizou-se o efeito inibitório de HP3 sobre as enzimas
monoamino oxidase A e B em preparações de mitocôndrias de cérebro de ratos
(G
NERRE et al., 2001). Dando continuidade aos estudos com esses produtos,
evidenciou-se o efeito antimicrobiano promissor de HP1 e HP3 (D
ALL’AGNOL et al.,
2005).
Além disso, foi demonstrado que HP1, HP2 e HP3 apresentam ação
antiproliferativa frente a HT-29 (células de carcinoma de cólon humano), H-460 (células
de carcinoma de pulmão) e U-373 (glioma maligno humano) (F
ERRAZ et al., 2005b,c).
Estas substâncias apresentam citotoxicidade significativa e mostram-se capazes de
alterar a distribuição do ciclo celular (F
ERRAZ et al., 2005c). Mais recentemente, foi
evidenciado que os benzopiranos de H. polyanthemum apresentam efeito citotóxico
O
ORO
O
OR
O
OH
HO
O
HO
OH
O
O
176
dose-dependente frente a células de endotélio vascular, envolvidas no processo de
angiogênese. HP2 e HP3 apresentam ainda efeito de indução de apoptose e
modificação no fluxo do ciclo celular (N
ÖR, 2006).
5.4
MATERIAIS E MÉTODOS
A validação de metodologia analítica para a quantificação de benzopiranos em
extrato n-hexânico de H. polyanthemum foi realizada na Central Analítica da Faculdade
de Farmácia da UFRGS, em equipamento CLAE, gentilmente cedido pela Profa. Dr.
Teresa Dalla Costa.
Para um melhor entendimento, um esquema da metodologia está apresentado
como anexo (Anexo VIII, página 321).
5.4.1 Material vegetal
O material vegetal utilizado para o desenvolvimento desta etapa do trabalho foi
constituído de partes aéreas (folhas, ramos e flores) e raízes da espécie H.
polyanthemum coletada nas Guaritas, município de Caçapava do Sul (Rio Grande do
Sul), entre os meses de outubro a novembro. As exsicatas para a devida identificação e
registro do material vegetal foram depositadas no herbário do Departamento de
Botânica do Instituto de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(Bordignon 1429).
Para a avaliação do teor de benzopiranos no material obtido por cultivo in vitro
foram utilizadas plântulas de H. polyathemum , desenvolvidas nas condições descritas
no capítulo 3. Da mesma maneira, foi utlizado o material vegetal em vários estágios de
desenvolvimento, obtido através da aclimatização desta espécie.
177
5.4.2 Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de
benzopiranos em extrato n-hexânico de Hypericum polyanthemum
Devido às propriedades biológicas atribuídas aos benzopiranos presentes na
fração apolar de H. polyanthemum, tornou-se interessante avaliar a produção in vitro
destes compostos. Nesse sentido, foi desenvolvido um procedimento para quantificação
dessas substâncias no extrato n-hexânico desta espécie.
5.4.2.1 Preparação da solução extrativa
Para obtenção dos extratos, o material vegetal em análise foi liofilizado, sendo
posteriormente triturado com o auxílio de gral e pistilo. Cada amostra de 50 mg foi
submetida a quinze extrações sucessivas de 20 minutos, com 5 mL de n-hexano cada,
em banho de ultrasonicador. Os extratos de cada amostra foram reunidos e evaporados
até secura sob pressão reduzida. O resíduo seco obtido foi redissolvido em 5 ml de
metanol grau CLAE em balão volumétrico. Essa solução resultante foi filtrada (filtro com
poros de 0,22 m, Merck®), sendo posteriormente analisada em cromatógrafo líquido.
5.4.2.2 Condições cromatográficas
A análise cromatográfica de benzopiranos foi realizada utilizando cromatógrafo
a líquido de alta eficiência Waters
®
gerenciado por software Millennium
®
(versão 32,2),
empregando-se uma bomba Waters
®
600, injetor automático Waters
®
717 e detector de
absorvância dual Waters
®
2487. A análise foi realizada utilizando-se coluna Waters
Nova-Pack
®
C18 (3,9 x 150 mm) com partículas de 4 μm de diâmetro nominal,
adaptada a uma pré-coluna Waters Nova-Pack
®
C18 60A (3,9 x 20 mm).
Visando encontrar um sistema simples e eficaz na separação e quantificação
dos benzopiranos nas amostras de H. polyanthemum foram testados diferentes
sistemas eluentes. O sistema mais adequado para a análise foi constituído de uma
mistura de acetonitrila (grau analítico para CLAE) e água ultrapura (Milli-Q) (60:40),
178
com um regime de eluição isocrático. A fase móvel utilizada foi previamente filtrada em
membrana hidrofóbica (Millipore
®
) de 0,45 m de diâmetro nominal de poro e 13 mm de
diâmetro, e desgaseificada por 15 minutos em banho de ultrasom. O sistema foi
mantido com purga de gás hélio durante as análises. O fluxo de eluição utilizado foi de
1 mL/min e o volume de injeção de 20 L. A sensibilidade do detector foi de 0,05 AUFS
e a detecção foi realizada em =270 nm, em temperatura ambiente.
5.4.2.3 Validação do método de doseamento de benzopiranos por CLAE
A metodologia para quantificação de benzopiranos no extrato n-hexânico das
flores de H. polyanthemum in natura foi validada segundo normas do ICH (1996), da
Farmacopéia Americana (T
HE UNITED, 2005) e da RE 899 (BRASIL, 2003). Os
parâmetros de performance analítica avaliados na validação do método foram
linearidade, seletividade, precisão (repetibilidade e precisão intermediária), exatidão e
limites de detecção e quantificação.
5.4.2.3.1 Avaliação da linearidade
A linearidade do método foi avaliada empregando-se análise de regressão aos
resultados das curvas padrão obtidas para os benzopiranos HP1, HP2 e HP3. Os
parâmetros considerados foram o coeficiente de determinação (R
2
), a equação da reta
obtida pelo método dos mínimos quadrados, os limites de confiança do intercepto e do
coeficiente angular, bem como a análise de variância (ANOVA) da regressão linear.
5.4.2.3.1.1 Curva padrão dos benzopiranos
Os benzopiranos HP1, HP2 e HP3 utilizados como substâncias de referência
foram isolados e purificados do extrato n-hexânico das partes aéreas de H.
polyanthemum, conforme metodologia descrita por
FERRAZ e colaboradores (2001). Os
compostos foram identificados por comparação cromatográfica com substâncias
autênticas, seguida de confirmação por ressonância magnética nuclear de hidrogênio
179
(RMN de
1
H) e de carbono (RMN de
13
C).
Para confecção das curvas padrão foram preparadas soluções metanólicas de
cada um dos benzopiranos, utilizando-se diferentes concentrações (1,95; 3,91; 7,81;
15,63; 31,25; 62,5; 125,0; 250,0; 500,0 g/mL). Cada solução foi filtrada (filtro com
poros de 0,22 m, Merck
®
), sendo posteriormente injetada em triplicata, utilizando-se os
parâmetros cromatográficos descritos no item 5.4.4.2.2. O experimento foi realizado em
três dias consecutivos.
A média das injeções foi obtida após integração dos picos correspondentes a
cada benzopirano, que foram utilizadas para a construção de um gráfico de área versus
concentração, obtendo três curvas respostas. Foram considerados o desvio padrão e
coeficiente de variação percentual para cada uma das soluções.
5.4.2.3.2 Determinação dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram determinados a
partir das curvas padrão dos benzopiranos e calculados segundo as equações (4.1 e
4.2).
(4.1) LD = 3,3 x dp/Ic
(4.2) LQ = 10 x dp/Ic
Onde, dp representa o desvio padrão médio do intercepto de três curvas
padrão, e Ic corresponde à média da inclinação das três curvas.
5.4.2.3.3 Teste de Repetibilidade
A resposta à repetibilidade foi avaliada em relação aos picos correspondentes
aos benzopiranos no extrato n-hexânico das flores de H. polyanthemum in natura,
partindo-se de 6 alíquotas a 100 % da solução extrativa preparadas conforme item
180
5.4.4.2.1. As injeções ocorreram em triplicata, em um mesmo dia, seguindo os
parâmetros cromatográficos descritos no item 5.4.4.2.2. Os resultados foram expressos
em coeficiente de variação percentual.
5.4.2.3.4 Teste de Precisão intermediária
A avaliação da precisão intermediária foi realizada através da repetição do
experimento descrito no item 5.4.4.2.3.2.1, utilizando-se três alíquotas da solução
extrativa, injetadas em triplicata durante cinco dias consecutivos. A partir dos resultados
foi possível avaliar a precisão intra-dia e entre-dias, através do coeficiente de variação
percentual.
5.4.2.3.5 Teste de recuperação
Para realização do teste de recuperação foram adicionadas alíquotas de 50, 75
e 100 L de cada benzopirano (solução 125 g/mL) à solução extrativa em análise.
Cada solução extrativa adicionada foi preparada em triplicata, e injetada no
cromatógrafo seguindo os parâmetros do item 5.4.4.2.2. O percentual de recuperação
foi determinado através da equação (4.3):
(4.3) R%= [C
ad
- C
nad
)/C
p
].100
Onde,
C
ad
: Concentração do benzopirano de interesse na solução extrativa
adicionada;
C
nad
: Concentração do benzopirano de interesse na solução extrativa controle;
C
p
: Concentração da solução padrão adicionada à amostra.
181
5.4.3 Quantificação de benzopiranos em diferentes órgãos de Hypericum
polyanthemum in natura, micropropagada e aclimatizada
O processamento do material vegetal utilizado para a quantificação, bem como
a preparação dos extratos e condições cromatográficas utilizadas estão descritos nos
itens 5.4.2.1 e 5.4.2.2.
5.4.4 Análise estatística dos resultados
Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram
expressos como a média ± desvio padrão. A significância estatística dos resultados foi
determinada por análise de variância One-Way (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey,
utilizando o software para cálculos estatísticos SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences) 12.0
®
. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
5.5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.5.1 Desenvolvimento de metodologia analítica para quantificação de
benzopiranos em extrato n-hexânico de Hypericum polyanthemum
A cromatografia líquida de alta eficiência tornou-se uma das metodologias
analíticas mais amplamente utilizadas na análise quantitativa, devido à possibilidade de
separar os constituintes de uma amostra complexa e quantificá-los, com simplicidade e
confiabilidade (S
WARTZ & KRULL, 1997).
Para a validação de métodos analíticos, tanto o ICH (1996) quanto a
Farmacopéia Americana (T
HE UNITED, 2005) reconhecem que não há a necessidade de
avaliar todos os parâmetros de performance analítica. O tipo de método e seu
respectivo uso determinam quais os parâmetros relevantes para o desempenho do
processo analítico (S
WARTZ & KRULL, 1997). Para este estudo, tratando-se de uma
matriz biológica complexa, como é o caso de soluções extrativas vegetais, foram
182
realizados os testes de linearidade e faixa de variação, seletividade, precisão
(repetibilidade e precisão intermediária), exatidão e limites de detecção e quantificação.
Entre os sistemas cromatográficos testados para a análise por CLAE, foi
selecionado o sistema isocrático constituído de acetonitrila e água (60:40) como fase
móvel, com fluxo de 1 mL/min, coluna em fase reversa C
18
como fase estacionária
e
detecção em =270 nm. A identificação dos benzopiranos no extrato n-hexânico de H.
polyanthemum foi realizada através de comparação entre os tempos de retenção
obtidos para as amostras autênticas. Nessas condições cromatográficas, os
benzopiranos apresentaram tempos de retenção de 9,1 min (HP
1
), 12,9 min (HP
2
) e
21,6 min (HP
3
) As análises realizadas no mesmo dia apresentaram tempos de retenção
que tiveram um CV% entre 0,2 e 1,4 % (HP1); 0,2 e 1,1 (HP2); 0,2 e 1,8 % (HP3) e nas
verificações realizadas em diferentes dias apresentaram CV% de 1,5 a 2,5% (HP1); 1,7
a 2,5 % (HP2); 1,5 a 3,2 (HP3). Este sistema permitiu uma separação adequada para a
análise dos benzopiranos, em tempo relativamente curto (tempo de análise de 25 min).
O perfil cromatográfico do extrato n-hexânico das flores de H. polyanthemum in
natura, bem como de cada benzopirano isoladamente, analisados conforme descrito na
metodologia pode ser visualizado na figura 4.1, em sobreposição.
Figura 4.1: Perfil cromatográfico obtido por CLAE do extrato n-hexânico das flores de H. polyanthemum
in natura e dos benzopiranos HP1, HP2 e HP3. Condições cromatográficas: fase móvel acetonitrila:água
(60:40); fluxo de 1 mL/min, volume de injeção 20 L
e detecção em =270 nm.
HP2
HP1
HP3
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
O
O
OCH
3
H
3
CO
O
O
OCH
3
HO
O
O
H
3
CO
OH
183
A avaliação da linearidade constitui um dos principais requisitos para a
validação de uma metodologia analítica. Segundo as normas do ICH (1996), os ensaios
de linearidade podem ser realizados pela diluição de uma solução padrão estoque em
ao menos cinco diferentes concentrações.
A linearidade do método foi avaliada para os benzopiranos HP1, HP2 e HP3,
através do desenvolvimento de curvas padrão. Para a obtenção da curva padrão de
HP1 foram utilizadas soluções de concentração variando entre 15,6 a 250,0 g/mL, e
para obtenção da curva padrão de HP2 e HP3 foram utilizadas soluções de
concentração variando entre 3,9 a 62,5 g/mL. As tabelas 4.1, 4.2 e 4.3 apresentam as
áreas dos picos referentes aos benzopiranos, nas diferentes concentrações, bem como
os coeficientes de variação percentual (CV %) para ponto da curva.
Tabela 4.1: Áreas dos picos de HP1 nas soluções padrão analisadas por CLAE.
Concentração
(g/mL)
Área do pico
(mVs
-1
± dp, n = 3)
CV %
15,6 531090 ± 6320,5 1,19
31,3 1061595 ± 13198,9 1,24
62,5 2134320 ± 6492,4 0,30
125,0 4304419 ± 18091,6 0,42
250,0 8270829 ± 22966,8 0,28
Tabela 4.2: Áreas dos picos de HP2 nas soluções padrão analisadas por CLAE.
Concentração
(g/mL)
Área do pico
(mVs
-1
± dp, n = 3)
CV %
3,9 493504,7 ± 11723,7 2,38
7,8 1001647 ± 4140,9 0,41
15,6 1997628 ± 12872,5 0,64
31,3 4021604 ± 107525,3 2,67
62,5 8012257 ± 437192 5,46
184
Tabela 4.3: Áreas dos picos de HP3 nas soluções padrão analisadas por CLAE.
Concentração
(g/mL)
Área do pico
(mVs
-1
± dp, n = 3)
CV %
3,9
517596 23829,6 4,60
7,8
913641,3 12969 1,42
15,6
1932220 21942,2 1,14
31,3
3499042 35340,8 1,01
62,5
7164405 217313,5 3,03
As equações da reta obtida foram:
HP1: y= 33070x + 56790 (n=3, R
2
= 0,9995)
HP2: y= 128333x - 2900,5 (n=3, R
2
= 1)
HP3: y= 113088x + 66398 (n=3, R
2
= 0,9992)
Onde, y representa a área do pico (mVs
-1
) e x representa a concentração dos
respectivos benzopiranos (g/mL).
A representação gráfica das curvas padrão obtidas com os dados das tabelas
4.1, 4.2 e 4.3 pode ser visualizada na figura 4.2.
Na avaliação dos resultados da análise de regressão linear, o coeficiente de
determinação (R
2
), que representa o grau de associação entre a variável independente
(x) e a variável dependente (y), deve ser o mais próximo possível de 1, o que significa
que existe forte correlação entre as variáveis. Os coeficientes de determinação (R
2
)
0,9995 (obtido para HP1), 1 (obtido para HP2) e 0,9992 (obtido para HP3) demonstram
a forte relação verificada entre a concentração do respectivo benzopirano e a resposta
do equipamento (área do pico).
Os erros sistemáticos constantes foram descartados pela inclusão do zero
entre os limites de confiança (LC) do intercepto (b) das curvas padrão de HP1 (LC
inferior
=
-21815,9 e LC
superior
=135395,8); HP2 (LC
inferior
= -211219,1 e LC
superior
=205418,1 e HP3
(LC
inferior
= -66653,3 e LC
superior
=199450,3).
185
0 50 100 150 200 250
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
A
y = 33070x + 56790
R
2
= 0,9995
Área (mVs
-1
)
Concentração de HP1 (g/mL)
0 10203040506070
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
B
y = 128333x - 2900,5
R
2
= 1
Área (mVs
-1
)
Concentração de HP2 (g/mL)
0 10203040506070
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
C
y = 113088x + 66398
R
2
= 0,9992
Área (mVs
-1
)
Concentração de HP3 (g/mL)
Figura 4.2: Curvas padrão de HP1 (A), HP2 (B) e HP3 (C), obtidas por CLAE.
186
Através do valor de p, proveniente do teste “t”, para a inclinação (HP1: 6,3X10
-
23
; HP2: 2,9X10
-17
e HP3: 4,5X10
-19
) rejeitou-se a hipótese nula, que sugere a inclinação
sendo constante ou igual a zero. Nesse sentido, incrementos na concentração de cada
benzopirano provocaram um aumento linear da resposta, expressa como áreas do pico.
Esta hipótese também foi avaliada na ANOVA da regressão linear, onde verificou-se
valores de F significativos para
=0,01 (HP1: 536333,3; HP2: 2762,6; HP3: 8764,6),
comprovando existir uma relação linear entre as variáveis.
Os resultados descritos para a linearidade da curva padrão de HP1, HP2 e HP3
foram adequados, podendo-se afirmar que o método proposto possui linearidade na
faixa de concentração de trabalho utilizada para cada benzopirano.
O limite de detecção (LD) é dado como a menor concentração de analito na
amostra que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada nas condições
experimentais. Já o limite de quantificação (LQ) é dado como a menor concentração do
analito na amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis (ICH,
1996).
Os limites de detecção e de quantificação foram calculados com base nas
equações 4.1 e 4.2, apresentadas na metodologia. Os valores encontrados para estes
parâmetros nas condições experimentais utilizadas estão demonstrados na tabela 4.4.
Tabela 4.4: Valores de limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) obtidos para os
benzopiranos HP1, HP2 e HP3
Benzopirano LD = 3,3 x dp/Ic
(g/mL)
LQ = 10 x dp/Ic
(g/mL)
HP1 0,17 0,52
HP2 0,74 2,26
HP3 1,44 4,36
Os reduzidos valores obtidos para LD e LQ de HP1 e HP2 demonstram a
sensibilidade do método analítico para essas substâncias. Apesar de o valor de LQ ser
mais elevado para HP3, este ainda se revela adequado para a aplicação do método a
187
extratos vegetais.
A seletividade do método proposto foi avaliada pela análise dos cromatogramas
da solução extrativa das flores da planta desenvolvida em campo. Como demonstrado
na figura 35, os picos de HP1, HP2 e HP3 apresentam-se com resolução satisfatória em
relação aos demais constituintes do extrato, indicando que a seletividade é adequada.
Com a finalidade de avaliar a precisão do método de quantificação dos
benzopiranos por CLAE foram realizados os testes de repetibilidade e precisão
intermediária (intra e inter-dias) para a solução extrativa. As tabelas 4.5, 4.6 e 4.7
apresentam os resultados obtidos nessa análise.
Tabela 4.5: Teores de HP1, em solução extrativa de H. polyanthemum, analisadas por CLAE, nos testes
para avaliação da repetibilidade e precisão intermediária.
HP1
(g% dp) CV %
Repetibilidade*
1,68 0,006
0,37
Precisão intra-dia
Dia 1
1,70 0,058
3,39
Dia 2
1,75 0,034
1,97
Dia 3
1,70 0,036
2,12
Dia 4
1,77 0,041
2,31
Dia 5
1,71 0,045
2,64
Precisão inter-dias 1,73 ± 0,032 1,87
* Resultados da média de seis alíquotas, cada uma injetada em triplicata.
Tabela 4.6: Teores de HP2, em solução extrativa de H. polyanthemum, analisadas por CLAE, nos testes
para avaliação da repetibilidade e precisão intermediária.
HP2 (g% dp) CV %
Repetibilidade*
0,22 0,002 0,78
Precisão intra-dia
Dia 1
0,22 0,006
2,58
Dia 2
0,23 0,005
2,13
Dia 3
0,22 0,004
1,99
Dia 4
0,23 0,006
2,63
Dia 5
0,23 0,006
2,88
Precisão inter-dias
0,23 0,004
1,85
* Resultados da média de seis alíquotas, cada uma injetada em triplicata.
188
Tabela 4.7: Teores de HP3, em solução extrativa de H. polyanthemum, analisadas por CLAE, nos testes
para avaliação da repetibilidade e precisão intermediária.
HP3 (g% dp) CV %
Repetibilidade*
0,96 0,005
0,56
Precisão intra-dia
Dia 1
0,98 0,026
2,62
Dia 2
0,99 0,024
2,46
Dia 3
0,97 0,020
2,08
Dia 4
1,00 0,020
2,02
Dia 5
0,98 0,021
2,11
Precisão inter-dias
0,98 0,013
1,33
* Resultados da média de seis alíquotas, cada uma injetada em triplicata.
As variações encontradas entre os resultados obtidos, podem ser consideradas
satisfatórias visto que os valores de coeficiente de variação percentual estão abaixo do
limite estabelecido de 5% aceito para matrizes complexas, como é o caso de soluções
extrativas vegetais (Brasil, 2003), constatando-se que o método demonstra elevada
precisão.
A exatidão do método foi determinada através do teste de recuperação, onde
uma faixa de concentração específica foi estabelecida e quantidades conhecidas dos
padrões HP1, HP2 e HP3 foram adicionados na solução extrativa. Estes valores estão
especificados na tabela 4.8, que mostra ainda o teor de benzopirano recuperado, que
foi calculado com a utilização da equação 4.3.
Tabela 4.8: Valores dos percentuais de recuperação de HP1, HP2 e HP3, em solução extrativa de H.
polyanthemum.
Concentração (g/mL)
Benzopirano
Adicionada Recuperada
Taxa de
recuperação
(%)
Média
(% ± dp)
CV %
0,0125 0,0128 102,68
0,0188 0,0194 103,50
HP1
0,0250 0,0254 101,63
102,61(0,94
0,92
0,0125 0,0126 101,06
0,0188 0,0187 99,88
HP2
0,0250 0,0255 102,17
101,03 1,14
1,13
0,0125 0,0127 101,85
0,0188 0,0193 103,13
HP3
0,0250 0,0253 101,08
102,02 1,04
1,02
189
O método proposto demonstrou boa exatidão para os três benzopiranos
avaliados, visto que os resultados de recuperação situam-se entre os limites de 95 e
105% preconizados pelo ICH (1996). Além disso, os coeficientes de variação percentual
demonstram a precisão nos resultados, considerados de grande relevância, em se
tratando de uma matriz complexa, como é o caso de um extrato vegetal.
Os parâmetros de performance analítica avaliados demonstraram resultados
coerentes com os exigidos pela legislação vigente, de modo que considera-se validado
o método para a quantificação de HP1, HP2 e HP3 no extrato n-hexânico de H.
polyanthemum, através de CLAE. Com isso, torna-se possível garantir a confiabilidade
dos resultados obtidos e ressalta-se a aplicabilidade para a determinação dessas
substâncias em material proveniente do cultivo in vitro desta espécie.
5.5.2 Quantificação de benzopiranos em diferentes órgãos de Hypericum
polyanthemum in natura, micropropagada e aclimatizada
A investigação da presença e determinação dos teores de HP1, HP2 e HP3
presentes em diferentes órgãos de plantas cultivadas a campo, micropropagadas e
aclimatizadas foi realizada através de CLAE, segundo metodologia analítica descrita
anteriormente.
As curvas padrão de cada benzopirano foram utilizadas para a obtenção da
concentração individual destas substâncias nos extratos n-hexânicos provenientes de
diferentes órgãos de H. polyanthemum, bem como de diferentes estágios de
desenvolvimento desta planta. O método possibilitou a quantificação simultânea de
HP1, HP2 e HP3, que apresentaram separação satisfatória, tendo a comprovação da
sua identidade realizada através da coincidência dos tempos de retenção após co-
injeção da solução padrão dos benzopiranos juntamente com o extrato vegetal.
A análise revelou que os três benzopiranos acumulam-se nas partes aéreas da
planta, sendo os teores de HP1, HP2 e HP3 variáveis em função do estágio de
190
desenvolvimento do vegetal.
Visando uma organização na apresentação dos resultados, estes foram
divididos conforme a origem do material vegetal: H. polyanthemum in natura,
micropropagada e aclimatizada.
5.5.2.1 Hypericum polyanthemum in natura
A avaliação do teor de benzopiranos na planta in natura foi realizada com
material vegetal obtido de coletas a campo realizadas em novembro de 2004 e em
outubro de 2006. Visando verificar diferenças na produção de HP1, HP2 e HP3 em
relação às diferentes partes do vegetal, a planta coletada em novembro de 2004 foi
dividida em folhas, ramos, flores e raízes. Porém, para a planta coletada em outubro de
2006, foram avaliadas as partes vegetativas como um todo, uma vez que normalmente
não há subdivisão em folhas e ramos para a preparação dos extratos, e as flores,
devido ao maior teor de benzopiranos totais encontrado neste órgão.
Como é possível evidenciar na figura 4.3, os três benzopiranos se acumulam
nas partes vegetativas e flores. Nas raízes, foi verificado apenas a presença de HP3, de
modo que não foram coletadas raízes para análise em 2006. Observa-se ainda uma
forte variação no teor de HP1, HP2 e HP3, considerando apenas as flores. Enquanto
nas flores coletadas em novembro de 2004, a maior concentração foi verificada para
HP3 (1,43 ± 0,07 g %), seguida de HP2 (1,12 ± 0,11 g %) e HP1 (0,37 ± 0,03 g %), na
coleta de 2006, os maiores teores foram encontrados para HP1 (1,67 ± 0,04 g %),
seguido de HP3 (0,95 ± 0,03 g %) e de HP2 (0,22 ± 0,007 g %). Em um trabalho semi-
quantitativo, verificando a presença dessas substâncias nas flores de diferentes
espécies de Hypericum, N
ÖR e colaboradores (2007) evidenciaram este mesmo padrão
de produção, onde HP1 acumula-se em maior proporção, seguido por HP3 e HP2.
191
0
0.5
1
1.5
2
Folhas Ramos Flores Raízes Partes
vegetativas
Flores
In Natura (coleta Nov/04) In Natura (coleta Out/06)
Teor de benzopiranos (g%)
a
b
a
c
c
b
b
c
a
a
b
c
c
a
b
b
Figura 4.3: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexânico de diferentes órgãos de H.
polyanthemum in natura, em diferentes épocas de coleta. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c
Considerando o mesmo órgão avaliado, diferentes letras são significativamente diferentes entre si
(ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( HP1; HP2; HP3).
Muitos trabalhos, não apenas dentro do gênero Hypericum, demonstram a
variabilidade na composição de compostos bioativos, em função da localização
geográfica, condições de cultivo e estágio de desenvolvimento do vegetal. L
EE e
colaboradores (2007) verificaram variação na concentração de alcalóides produzidos
por Lupinus leucophyllus desenvolvido a campo, quantificados em plantas coletadas
durante três anos consecutivos.
Espécies de Hypericum coletadas em diferentes regiões, épocas ou horários de
coleta comumente apresentam variações no teor de metabólitos secundários (B
ÜTER et
al., 1998; Ç
IRAK et al., 2006; COUCEIRO et al., 2006), de modo que a variabilidade na
concentração de benzopiranos podem ser explicados devido a estes fatores. Em
relação às partes vegetativas, a proporção entre estas substâncias permaneceram
similares.
192
5.5.2.2 Hypericum polyanthemum micropropagada
Plântulas de H. polyanthemum micropropagadas em meio MU por 45 dias
foram subdivididas em folhas, ramos e raízes, com o objetivo de verificar o padrão de
produção destes compostos nos diferentes órgãos cultivados in vitro. Foi verificado que
todos os três metabólitos acumulam-se nas folhas das plântulas. No entanto, apenas
HP1 e HP3 foram acumulados em teores quantificáveis nos ramos, enquanto nas
raízes há produção de apenas HP3 (tabela 4.9).
Tabela 4.9: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexânico de plântulas de H.
polyanthemum micropropagada subdivididas em folhas, ramos e raízes.
HP1 (g % ± dp) HP2 (g % ± dp) HP3 (g % ± dp)
Folhas 0,09 ± 0,002
a
0,0025 ± 0,0002
e
0,02 ± 0,0002
b
Ramos 0,007 ± 0,001
d
- 0,015 ± 0,0002
c
Raízes - - 0,008 ± 0,003
d
a,b,c,d,e
Letras diferentes correspondem a valores estatisticamente diferentes (ANOVA seguida do teste de
Tukey; p<0,01).
Considerando as partes aéreas como um todo, os maiores teores verificados
foram de HP1, seguido de HP3 e de HP2. Nesta avaliação, as plântulas foram
coletadas após 45 dias de cultivo in vitro. No entanto, no estudo da cinética de
produção de benzopiranos in vitro (item 5.5.2.2.2), as plântulas mantidas por um
período de 45 dias apresentaram nas partes aéreas teores consideravelmente
superiores aos aqui verificados, porém mantendo esse mesmo padrão de produção
(HP1>HP3>HP2). Cabe ressaltar que as plântulas avaliadas nas diferentes análises
foram obtidas de explantes provenientes de diferentes coletas a campo, caracterizando
a influência do germoplasma na produção dos metabólitos secundários. Recentemente
a influência genética na produção de compostos bioativos de duas linhagens de H.
perforatum micropropagada foi avaliada. A análise química das mesmas demonstrou
teores de hipericina e de pseudo-hipericina 6 e 14 vezes superiores, respectivamente,
em uma das linhagens, principalmente devido a variações anatômicas e morfológicas
verificadas entre elas (K
ORNFELD et al., 2007).
193
5.5.2.2.1 Avaliação da influência da concentração de sais do meio de cultivo na
produção de benzopiranos
Como apresentado no capítulo 3, o desenvolvimento in vitro de plântulas de H.
polyanthemum foi avaliado em meio MU sólido e em meio MS com a concentração
íntegra de sais ou a 25 %.
As plântulas de H. polyanthemum se desenvolveram e produziram
benzopiranos nos três meios de cultura avaliados. No entanto, houve variação no
acúmulo de HP1, HP2 e HP3, como é possível evidenciar na figura 4.4. Em todos os
meios avaliados a produção de HP1 foi superior, seguida de HP3 e HP2. Não houve
diferença significativa na produção de HP1 e de HP3 quando as plântulas foram
cultivadas nos meio MU e MS 25%. Apenas para a substância HP2, verificou-se maior
produção no meio MS 25%, em relação ao meio MU. A produção dessas substâncias
foi afetada consideravelmente com o cultivo em meio MS 100%, onde houve uma
redução no teor dos três benzopiranos. Nesta análise, a produção de benzopiranos foi
avaliada nas partes aéreas como um todo.
0
0.25
0.5
0.75
1
HP1 HP2 HP3
Teor (g%)
b
a a
b
a
c
b
a
a
Figura 4.4: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexânico de plântulas de H.
polyanthemum micropropagado em diferentes meios de cultura. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c
Considerando o mesmo benzopirano, diferentes letras são significativamente diferentes entre si (ANOVA
seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( MU; MS 25%; MS 100%)
194
O efeito exercido na produção de benzopiranos por plântulas mantidas sob
cultivo no meio MS 100% provavelmente pode ser devido à ação de fosfato inorgânico,
cuja concentração neste meio é superior à presente nos meios MU e MS 25%.
Concentrações aumentadas deste ânion exercem uma influência negativa na
biossíntese de muitos metabólitos secundários em culturas vegetais in vitro (B
ONDAREV
et al., 2003).
Considerando o meio MU utilizado neste trabalho, o aumento na concentração
dos micronutrientes I, Mo, Cu e Co foi baseada na ausência de efeitos desses
componentes no crescimento de calos de tabaco, avaliados em várias concentrações
no estudo original de M
URASHIGE & SKOOG (1962), sendo estes importantes para
modular o metabolismo sem afetar o crescimento. Como evidenciado no capítulo 3 (item
4.5.2), o crescimento das plântulas de H. polyanthemum não foi significativamente
afetado pelo maior conteúdo destes micronutrientes no meio MU.
5.5.2.2.2 Estudo da cinética de produção de benzopiranos in vitro
Plântulas de H. polyanthemum cultivadas em meio MU em diferentes estágios
de desenvolvimento foram avaliadas quinzenalmente, durante o período de 6 a 14
semanas, em relação ao aumento de biomassa, descrito no capítulo 3, e em relação à
produção de benzopiranos.
Verificou-se que a maior produção de HP1, HP2 e de HP3 ocorreu nas
plântulas cultivadas in vitro por 12 semanas (figura 4.5), associada ao maior pico de
produção de biomassa observada neste mesmo período (capítulo 3, item 4.5.3, figura
3.6). A manutenção das plântulas por 14 semanas promoveu uma diminuição na
produção de benzopiranos.
195
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
6 semanas 8 semanas 10 semanas 12 semanas 14 semanas
Teor (g%)
c
b
a
c b b,c b,c
a
d
c
c
a
b
b b
Figura 4.5: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexânico de plântulas de H.
polyanthemum cultivadas em meio MU, em diferentes estágios de desenvolvimento. Os dados
representam a média ± dp.
a,b,c,d
Considerando o mesmo benzopirano avaliado, diferentes letras são
significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( HP1; HP2; HP3).
5.5.2.3 Hypericum polyanthemum aclimatizada
Plantas de H. polyanthemum aclimatizadas por 8 semanas na primavera foram
subdivididas em folhas, ramos e raízes, com o objetivo de verificar o padrão de
produção destes compostos nos diferentes órgãos após transferência para cultivo ex-
vitro. Nesta avaliação, as plantas aclimatizadas não apresentavam flores, de modo que
um estudo detalhado das partes reprodutivas foi realizado em um segundo momento.
Foi verificado que todos os três metabólitos acumulam-se nas folhas e ramos do vegetal
e apenas HP3 é acumulado nas raízes (tabela 4.10).
Enquanto nas folhas o benzopirano HP1 mostrou-se em maior concentração
(0,71 ± 0,001 g %), nos ramos a maior produção foi evidenciada para HP3 (0,096 ±
0,012 g %). Considerando as partes vegetativas como um todo, os maiores teores
verificados foram de HP1, seguido de HP3 e de HP2.
196
Tabela 4.10: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexânico de H. polyanthemum
aclimatizada subdivididas em folhas, ramos e raízes.
HP1 (g % ± dp) HP2 (g % ± dp) HP3 (g % ± dp)
Folhas 0,71 0,001
a
0,073 0,001
d
0,14 0,002
b
Ramos 0,015 0,006
f
0,037 0,001
e
0,096 0,012
c
Raízes - - 0,15 0,007
b
a,b,c,d,e
Letras diferentes correspondem a valores estatisticamente diferentes (ANOVA seguida do teste de
Tukey; p<0,01).
5.5.2.3.1 Estudo da ontogenia de Hypericum polyanthemum aclimatizada
Visando verificar uma possível relação entre a produção dos compostos
bioativos com o desenvolvimento do vegetal, plantas aclimatizadas foram avaliadas
quinzenalmente durante o período de 14 a 22 semanas quanto à produção dos
benzopiranos durante o curso de desenvolvimento vegetativo e reprodutivo.
O acúmulo de benzopiranos ao longo do desenvolvimento do vegetal
apresentou um padrão diferenciado para HP1, HP2 e HP3 (figura 4.6). Na etapa de 14
semanas não havia flores abertas, de modo que utilizou-se os botões florais fechados
para medidas de comparação.
Como é possível ser observado na figura 4.6 A, não houve diferença
significativa na produção de HP1, avaliada em flores totais, durante o período de 14
(1,56 ± 0,11 g %) a 20 (1,48 ± 0,10 g %) semanas. No entanto, evidenciou-se um
decaimento no teor desta substância na vigésima segunda semana (0,95 ± 0,007 g %).
Considerando as partes vegetativas, observou-se um pico de produção de HP1 (1,44 ±
0,06 g%) na décima oitava semana de aclimatização.
Considerando as flores totais, o período de aclimatização de 14 semanas foi
favorável ao acúmulo de HP2 (figura 4.6 B), provavelmente devido ao maior conteúdo
dessa substância nos botões florais fechados (figura 4.9). Ao longo do período de
aclimatização avaliado, observou-se um declínio na produção dessa substância, o que
pode ser explicado pelo aumento na proporção de botões florais abertos e flores
197
(capítulo 3, item 4.5.4.1, figura 3.14), que apresentam menores teores de HP2. A maior
produção desse benzopirano nas partes vegetativas (0,21 ± 0,02 g%) ocorreu após 16
semanas de aclimatização.
O benzopirano HP3 apresentou a maior diferença observada na produção em
flores totais e partes vegetativas (figura 4.6 C). O acúmulo dessa substância foi
consideravelmente superior nas flores totais, em relação às partes vegetativas. No
entanto, considerando o período de aclimatização avaliado, a maior produção de HP3
foi verificada entre a décima oitava e vigésima semana, tanto nas flores (0,96 ±
0,04 g
% e 0,99 ±
0,02 g %, respectivamente) quanto nas partes vegetativas (0,30 ± 0,01 g %
e 0,2916 ± 0,004 g %, respectivamente).
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
14 semanas 16 semanas 18 semanas 20 semanas 22 semanas
Teor de HP2 (g%)
Botões fechado
s
c
a,b
a
b,c
c
b,c
a,b
a
B
d
d
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
14 semanas 16 semanas 18 semanas 20 semanas 22 semanas
Teor HP1 (g%)
b
a
a,b
b
Botões fechados
A
c
a a
a
a
b
198
Continuação da figura 4.6
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
14 semanas 16 semanas 18 semanas 20 semanas 22 semanas
Teor de HP3 (g%)
a
a
c
b
a a
b
Botões fechados
c
C
a
c
b
Figura 4.6: Teor de benzopiranos HP1 (A), HP2 (B) e HP3 (C) em extrato n-hexânico de flores totais e
partes vegetativas de H. polyanthemum aclimatizada em diferentes épocas de desenvolvimento. Os
dados representam a média ± dp.
a,b,c,d
Considerando a mesma porção do vegetal, diferentes letras são
significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
Botões fechados; Flores totais; Partes vegetativas
Avaliando-se o teor de benzopiranos totais no extrato n-hexânico de H.
polyanthemum aclimatizada verificou-se uma produção crescente desses compostos ao
longo de 18 e 20 semanas de aclimatização, nas partes vegetativas e reprodutivas do
vegetal, respectivamente, ocorrendo uma diminuição dos teores dos metabólitos tanto
nas partes vegetativas quanto nas partes reprodutivas do vegetal na semana
subseqüente (figura 4.7).
H. perforatum produz os metabólitos secundários de interesse farmacêutico em
maior concentração nas flores do que nas folhas (S
OUTHWELL & CAMPBELL, 1991;
SOUTHWELL & BOURKE, 2001; ÇIRAK et al., 2006), da mesma maneira que em H.
polyanthemum, onde verificou-se que após 18 semanas de cultivo a campo as plantas
produziram teores totais de 1,93 g % e 2,51 g % de benzopiranos nas partes
vegetativas e reprodutivas do vegetal, respectivamente.
199
0
0.5
1
1.5
2
2.5
14 semanas 16 semanas 18 semanas 20 semanas 22 semanas
Teor de benzopiranos totais (g%)
b
a
a,b
b
A
c
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
14 semanas 16 semanas 18 semanas 20 semanas 22 semanas
Teor de benzopiranos totais (g%)
B
b
a
a
a
a
Figura 4.7: Teor de benzopiranos totais em extrato n-hexânico de partes vegetativas (A) e flores totais
(B) de H. polyanthemum aclimatizada em diferentes épocas de desenvolvimento. Os dados representam
a média ± dp. Considerando a mesma variável, diferentes letras são significativamente diferentes entre si
(ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( HP1; HP2; HP3).
A acumulação dos três benzopiranos durante o curso de desenvolvimento floral
mostrou um padrão diferenciado (figura 4.8). Enquanto os maiores teores de HP1 e de
HP2 foram evidenciados nos botões florais fechados, para HP3 a maior concentração
foi apresentada durante o fenecimento floral.
200
Figura 4.8: Teor de benzopiranos HP1 (A), HP2 (B) e HP3 (C) em extrato n-hexânico de H.
polyanthemum aclimatizada em diferentes estágios de desenvolvimento reprodutivo. Os dados
representam a média ± dp. Considerando a mesma variável, diferentes letras são significativamente
diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
0
0.5
1
1.5
2
Botões
fechados
Botões
abertos
Flores Flores
senescentes
Frutos
Teor de HP1 (g%)
a
a,b
b
b
A
c
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Botões
fechados
Botões
abertos
Flores Flores
senescentes
Frutos
Teor de HP2 (g%)
a
b b
b
B
c
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Botões
fechados
Botões
abertos
Flores Flores
senescentes
Frutos
Teor de HP3 (g%)
a
b, c
b
c
C
b
201
Considerando o conteúdo total dos três benzopiranos nos diferentes estágios
reprodutivos de H. polyanthemum, verifica-se que a maior produção destas substâncias
é evidenciada durante os botões florais fechados (com maior acúmulo de HP1) e flores
senescentes (com maior acúmulo de HP3) (figura 4.9). HP1 caracteriza-se por ser o
único benzopirano, dentre os três produzidos por H. polyanthemum, de coloração
branca, enquanto HP3 apresenta uma coloração amarela intensa. O maior acúmulo de
HP3 nas flores senescentes poderia, então, contribuir para a coloração destas, uma vez
que de todos os estágios florais avaliados, estas são as que apresentam a maior
intensidade de cor amarela observada. Acredita-se, ainda, que esses compostos,
juntamente com derivados de floroglucinol, atuem como guias marcadoras para a
polinização por insetos (N
ÖR et al., 2007).
O menor conteúdo de benzopiranos totais foi verificado durante o estágio de
frutificação, assim como previamente relatado para o conteúdo de hipericina em H.
aviculariifolium, H. maculatum, H. perforatum e H. pruinatum (K
IREEVA & SHARANOV,
1999; Ç
IRAK et al., 2006).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Botões fechados Botões abertos Flores Flores senescentes Frutos
Teor de benzopiranos totais (g%)
a
b
b
a
c
Figura 4.9: Teor de benzopiranos totais em extrato n-hexânico de H. polyanthemum aclimatizada em
diferentes estágios reprodutivos. Os dados representam a média ± dp.Considerando a mesma variável,
diferentes letras são significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
HP1; HP2 e HP3
Alguns trabalhos vem sendo desenvolvidos com espécies de Hypericum com o
intuito de relacionar a produção de metabólitos secundários com diferentes estágios
202
ontogênicos de desenvolvimento das plantas (BUTER et al., 1998; KIREEVA & SHARANOV,
1999; T
EKEL’OVÁ et al., 2000; ABREU et al. 2004; ÇIRAK et al., 2006).
Estudos com H. brasiliense avaliaram a produção de metabólitos secundários
em diferentes estágios de desenvolvimentos vegetativo, florescimento e frutificação
desta planta, bem como em diferentes partes do vegetal. Os autores demonstraram que
ocorreu uma acumulação preferencial de substâncias, dependendo do estágio de
desenvolvimento. Enquanto a maior concentração de compostos fenólicos (1,5-di-
hidroxi-xantona, isouliginosina B, rutina e quercetina) foi encontrada durante o estágio
de florescimento, a de terpenóides (ácido betulínico) foi durante a frutificação (A
BREU et
al. 2004).
Considerando o conteúdo de hipericinas em diferentes estágios de
desenvolvimento ontogênicos, verifica-se um aumento gradual em correlação com o
desenvolvimento e florescimento, nas espécies H. aviculariifolium, H. maculatum, H.
perforatum e H. pruinatum (K
IREEVA & SHARANOV, 1999 TEKEL’OVÁ et al., 2000; ÇIRAK et
al., 2006).
O máximo conteúdo de taninos em H. perforatum foi observado durante o
estágio vegetativo, declinando com o florescimento. No entanto, em H. maculatum o
teor de taninos aumentou com o progresso da fase vegetativa à fase de florescimento
(K
IREEVA & SHARANOV, 1999). Segundo TEKEL’OVÁ e colaboradores (2000), em H.
perforatum, foi demonstrada maior concentração de hiperforina nos frutos imaturos.
Considerando os flavonóides, foi demonstrado um aumento nos teores dessas
substâncias desde botões florais pequenos até flores abertas.
Considerando o peso seco de cada órgão individual (capítulo 3, item 4.5.4.1,
figura 3.16) a maior massa é evidenciada para as flores abertas, cujo peso seco médio
é de 3,68 ± 0,5 mg, seguida de flores senescentes (3,14 ± 0,8 mg). O menor peso seco
observado foi para botões fechados (1,84 ± 0,5 mg). Nesse sentido, cabe ressaltar que
embora os botões fechados apresentem maiores teores de HP1 e de HP2, esses são
203
os que apresentam menor massa individual, de modo que, visando a obtenção de
benzopiranos, acredita-se que a melhor época para a coleta destas plantas seja aquela
onde a maior proporção de flores (abertas ou senescentes) esteja presente. No entanto,
estudos para avaliar a produção de outros metabólitos de interesse, tal como o derivado
de floroglucinol uliginosina B, são necessários para avaliar o período ideal para coleta
de H. polyanthemum. A proporção de diferentes tecidos vegetais pode afetar a eficácia
de preparações de H. perforatum, como o percentual de flores e frutos presentes em
produtos comerciais, onde é possível variações que abrangem 0 a 50 % destas partes
reprodutivas, dentro de diferentes etapas de desenvolvimento do vegetal (M
URCH et al.,
2002).
O teor dos benzopiranos nas partes vegetativas e flores totais de H.
polyathemum aclimatizada durante o período de 18 semanas, considerando o tempo de
manutenção in vitro (8 ou 12 semanas) apresentou diferenças significativas (figura
4.10). A produção de HP1, HP2 e de HP3 foi consideravelmente superior nas partes
vegetativas e flores totais de plantas transferidas para condição ex vitro após 2 meses
de manutenção in vitro. Embora tenha sido observado que plântulas mantidas no
mesmo meio de cultura por 3 meses apresentaram a maior produção de benzopiranos,
os resultados aqui apresentados indicam a influência da manutenção de um mês extra
sob cultivo in vitro nas plantas aclimatizadas. Entretanto, deve-se considerar a maior
biomassa obtida nas plantas que foram mantidas in vitro por 3 meses (capítulo 3, item
4.5.4, figura 3.13) e salientar que foi observada uma variação de temperatura durante o
período de cultivo a campo. Enquanto para plantas mantidas in vitro por 12 semanas
verificou-se mínimas de 18 ± 4 °C e máximas de 28 ± 8 °C, para plantas mantidas in
vitro por 8 semanas foi registrado mínimas de 14 ± 4 °C e máximas de 24 ± 5 °C.
Nesse sentido, estudos posteriores com avaliações em diferentes épocas do ano são
necessários para a conclusão desses resultados.
A subcultura de material micropropagado para meio nutriente fresco é uma
prática importante para a manutenção das culturas, uma vez que, com o passar do
tempo, os nutrientes do meio são gradualmente consumidos e, ao mesmo tempo,
204
ocorre uma diminuição da umidade relativa no ambiente de cultivo, levando à perda de
água no meio de cultura (R
OUT et al., 2000). Cabe ressaltar que as plântulas mantidas
sob 3 meses in vitro apresentaram evidências de uma condição estressante,
demonstrada pela produção de antocianinas, que, apesar de não interferir na produção
de benzopiranos na planta micropropagada, parece influenciar a produção desses após
a transferência para condição ex vitro. Além disso, foi observado, ainda, que plantas
mantidas in vitro por um período superior a 12 semanas mantiveram-se viáveis na etapa
de transferência para substrato em ambiente climatizado, mas não resistiram às
condições de cultivo a campo.
Além disso, o estágio de desenvolvimento das plantas e as condições de
crescimento podem influenciar de modo significativo nos fatores que determinam a
qualidade da matéria-prima vegetal, tais como o teor de substâncias de interesse e
acúmulo de biomassa. O metabolismo primário e secundário competem na sua
biossíntese por precursores comuns, de modo que a concentração de metabólitos
secundários pode ser alterado em resposta à estimulação ou restrição do metabolismo
primário. Todas as classes de metabólitos secundários podem ser influenciadas por
fatores bióticos e abióticos, tais como luz, fertilização, fenologia e estresse hídrico
(G
RAY et al., 2003)
Estudos avaliando o efeito do estresse hídrico e de temperatura no conteúdo
de constituintes ativos de H. brasiliense demonstraram que o estresse hídrico aumentou
os níveis de todos os compostos analisados, particularmente compostos fenólicos. Por
outro lado, a resposta a diferentes temperaturas variou de acordo com o produto
avaliado e as plantas mantidas em câmeras de crescimento indicaram que uma baixa
intensidade luminosa pode influenciar na produção dessas substâncias (A
BREU &
MAZZAFERA, 2005).
205
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
Partes
vegetativas
Flores
Totais
Partes
vegetativas
Flores
Totais
Partes
vegetativas
Flores
Totais
HP1 HP2 HP3
Teor (g%)
c
b
a a
c
b a
c
b
d
a
c
Figura 4.10: Teor de benzopiranos HP1, HP2 e HP3 em extrato n-hexânico de flores totais e partes
vegetativas de H. polyanthemum com 18 semanas de aclimatização, considerando o período de cultivo in
vitro. Os dados representam a média ± dp.
a,b,c,d
Considerando o mesmo benzopirano, diferentes letras
são significativamente diferentes entre si (ANOVA seguida do teste de Tukey; p<0,05).
( 2 meses de cultivo in vitro antes do transplantio; 3 meses de cultivo in vitro antes do transplantio)
Essas variações encontradas na produção de metabólitos secundários por H.
polyanthemum micropropagada, aclimatizada e desenvolvida a campo pode ser
explicada por muitos fatores, que vão desde a regulação endógena de processos
fisiológicos até características ambientais de cultivo (A
BREU et al. 2004; ÇIRAK et al.,
2006).
BUTER e colaboradores (1998) avaliando parâmetros bioquímicos e
agronômicos de sete linhagens de H. perforatum cultivadas em três diferentes
localidades, por dois anos consecutivos, observaram uma influência significativa do
ambiente e de fatores genéticos na época de florescimento, comprimento das plantas e
produção de biomassa. Além disso foram observadas variações no teor de metabólitos
secundários (hiperforina, hipericina, pseudo-hipericina, quercetina, hiperosídeo, rutina,
amentoflavona e biapigenina) em flores. Segundo os autores, as condições climáticas,
os diferentes estágios fisiológicos das plantas avaliadas, bem como a influência
genética, poderiam contribuir para as variações encontradas na produção de
metabólitos secundários.
206
Estudos avaliando a produção in vitro de H. perforatum demonstraram que
plântulas derivadas de material proveniente de cultivo a campo ou de cultivo controlado
em casa de vegetação são boas fontes para obtenção desses metabólitos secundários.
No entanto, enquanto a produção de hipericinas foi seis vezes superior em plântulas
mantidas in vitro, os teores de hiperforina foram inferiores aos daqueles encontrados
em plantas cultivadas a campo ou em casa de vegetação (K
IRAKOSYAN et al., 2003;
K
IRAKOSYAN et al., 2004).
Da mesma maneira, este trabalho demonstra que o material proveniente de
cultivo in vitro e aclimatização de H. polyanthemum apresenta-se como uma fonte
sustentada para a obtenção de HP1, HP2 e HP3. Parte dos resultados aqui
apresentados estão publicados no periódico Acta Physiologiiae Plantarum, em artigo
intitulado “Benzopyrans in Hypericum polyanthemum Klotzsch ex Reichardt cultured in
vitro” (Anexo IX, página 325).
5.6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no estudo descrito neste capítulo 4 permitem concluir
que:
Os parâmetros de performance analítica avaliados para a quantificação de
HP1, HP2 e HP3 no extrato n-hexânico de H. polyanthemum, através de CLAE,
demonstraram resultados coerentes com os exigidos pela legislação vigente,
considerando a técnica validada.
HP1, HP2 e HP3 acumulam-se nas partes vegetativas e flores de H.
polyanthemum, sendo os teores variáveis em função do estágio de desenvolvimento do
vegetal
Nas raízes de H. polyanthemum, ocorre produção apenas de HP3,
independente do estágio de desenvolvimento da planta.
207
O teor de benzopiranos em plantas cultivadas a campo é influenciado por
fatores geográficos e ambientais, bem como estágio de desenvolvimento apresentado
na época de coleta.
Plântulas de H. polyanthemum produziram benzopiranos nos meios de
cultura MS 25 %, MS 100 % e MU, apresentando variações no acúmulo de HP1, HP2 e
HP3, sob a influência da concentração de sais do meio de cultivo. A produção dessas
substâncias foi afetada consideravelmente com o cultivo em meio MS 100%, onde
houve uma redução no teor dos três benzopiranos.
No estudo da cinética de produção de benzopiranos in vitro, verificou-se que
a maior produção de HP1, HP2 e de HP3 ocorreu nas plântulas cultivadas in vitro por
12 semanas associada ao pico de produção de biomassa observada neste mesmo
período.
O acúmulo de benzopiranos em H. polyanthemum aclimatizada apresentou
um padrão diferenciado para HP1, HP2 e HP3 durante o período de 14 a 22 semanas
sob condição ex-vitro. Considerando as flores totais, a produção de HP1 deu-se de
modo constante no período de 14 a 20, observando-se um decaimento no teor desta
substância na vigésima segunda semana. O período de aclimatização de 14 semanas
foi favorável ao acúmulo de HP2 nas flores totais, ocorrendo um declínio no teor desse
benzopirano nas semanas subseqüentes. O acúmulo de HP3 foi superior no período de
aclimatização de 18 a 20 semanas, tanto nas flores quanto nas partes vegetativas. Para
HP1 e HP2, observou-se maior produção na décima oitava semana e décima sexta
semanas de aclimatização, respectivamente.
Uma produção crescente no teor de benzopiranos totais foi observada ao
longo de 18 e 20 semanas de aclimatização de H. polyanthemum, nas partes
vegetativas e reprodutivas do vegetal, respectivamente, ocorrendo uma diminuição nos
teores dos metabólitos na semana subseqüente.
208
A acumulação dos três benzopiranos durante o curso de desenvolvimento
floral mostrou um padrão diferenciado, onde os maiores teores de HP1 e de HP2 foram
evidenciados nos botões florais fechados, e para HP3, durante o fenecimento floral. O
menor conteúdo de benzopiranos totais foi verificado durante a frutificação.
Visando a obtenção de benzopiranos, acredita-se que a melhor época para a
coleta de H. polyanthemum, seja aquela onde a maior proporção de flores (abertas ou
senescentes) esteja presente.
As variações encontradas na produção de metabólitos secundários por H.
polyanthemum micropropagada, aclimatizada e desenvolvida a campo pode ser
explicada por fatores como a regulação endógena de processos fisiológicos e
características ambientais de cultivo.
O material proveniente de cultivo in vitro e aclimatização de H. polyanthemum
apresenta-se como uma fonte sustentada para a obtenção de HP1, HP2 e HP3.
209
6. DISCUSSÃO GERAL
210
211
Motivados pelas evidências a respeito da eficácia de fitoterápicos obtidos de H.
perforatum e da crescente difusão de seu uso, muitos trabalhos têm sido desenvolvidos
visando a análise fitoquímica e biológica de diversas espécies desse gênero.
Desta forma, este trabalho vem complementar o estudo das espécies de
Hypericum nativas do Rio Grande do Sul, iniciados nesta Faculdade no ano 2000.
Durante este período, muitos trabalhos foram publicados, decorrentes de duas teses de
doutorado e seis dissertações de mestrado.
Como já bastante discutido durante o desenvolvimento deste trabalho, a
fitoquímica das espécies de Hypericum é marcada pela ocorrência de compostos
fenólicos, incluindo desde substâncias apolares (como benzopiranos, benzofenonas,
xantonas e floroglucinóis) até compostos polares (como ácidos fenólicos, flavonóides e
taninos) (R
OCHA et al., 1994; ROCHA et al., 1995; FERRAZ et al., 2001; FERRAZ et al.,
2002a; D
ALL’AGNOL et al., 2003; NÖR et al., 2004; BERNARDI et al., 2005).
De fato, o trabalho aqui apresentado confirma a forte tendência ao acúmulo de
substâncias fenólicas no gênero Hypericum. Das espécies avaliadas, H. ternum e H.
myrianthum, foram isolados das frações apolares os derivados de floroglucinol
uliginosina B e japonicina A, bem como os flavonóides quercetina, 3,7-dimetil-
quercetina, 3-metil-quercetina, guaijaverina, isoquercitrina e hiperosídeo, o biflavonóide
I3,II8-biapigenina e o ácido fenólico ácido 5-O-cafeoil-1-metoxi-quínico, todos
provenientes das frações polares.
Derivados de floroglucinol são substâncias muito comuns nesse gênero. No
entanto, dentre as espécies de Hypericum nativas do estado não se verifica derivados
poliprenilados semelhantes a hiperforina e ad-hiperforina. Dentre essas, é comum a
ocorrência de derivados diméricos contendo uma unidade floroglucinol conjugada ao
ácido filicínico. Esse grupo de substâncias apresenta uma pequena dispersão no
gênero, sendo relatado apenas para espécies pertencentes às seções Brathys e
Trigynobrathys, das quais fazem parte as espécies de Hypericum nativas do Brasil,
212
podendo-se inferir uma significância taxonômica para esses produtos (NÖR, 2006).
Da mesma maneira, observa-se uma preponderância de flavonóis em
Hypericum, principalmente de derivados da quercetina (C
ALIE et al., 1983), sendo
hiperosídeo encontrado com grande freqüência
(CROCKETT et al., 2005). No entanto,
apesar da ocorrência destes compostos entre as espécies do gênero, essa
característica parece não ter relevância quimiotaxonômica, quando consideradas
evidências morfológicas e moleculares (C
ROCKETT et al., 2005).
Flavonóides, assim como compostos polifenólicos em geral, são caracterizados
por apresentarem potencial antioxidante (Z
HENG & WANG, 2001; PAREJO et al., 2003; CAI
et al., 2004; M
ILIAUSKAS et al., 2004; ŠKERGET et al., 2004; KATALINIC et al., 2006), o que
motivou a avaliação de extratos, frações e substâncias isoladas de quatro espécies de
Hypericum nativas do Rio Grande do Sul quanto à capacidade de neutralizar radicais
livres. Foi observado que as espécies apresentam elevados teores de fenólicos totais,
principalmente nos extratos brutos e frações metanólicas, onde compostos polifenólicos
como taninos, flavonóides e ácidos fenólicos apresentam-se como os componentes
majoritários (D
ALL’AGNOL et al., 2003). De fato, em relação às frações n-hexânicas
avaliadas, extratos brutos e frações metanólicas, caracterizadas por uma grande
proporção de compostos fenólicos polares, apresentaram a maior capacidade em
neutralizar radicais DPPH
. Da mesma maneira, foi demonstrada maior atividade
antioxidante neste ensaio para os flavonóides avaliados.
O estudo da atividade antioxidante de espécies de Hypericum nativas do
estado apresentadas neste trabalho, caracteriza-se por uma avaliação preliminar do
potencial destas espécies na neutralização de radicais livres. Devido à complexidade
dos processos de oxidação e de antioxidação, são necessários métodos
complementares que expressem o perfil antioxidante de uma amostra de forma mais
completa (Z
OU et al., 2004).
Considerando os promissores resultados biológicos revelados para extratos e
213
substâncias isoladas das espécies de Hypericum nativas do Rio Grande do Sul
evidencia-se a necessidade de aprofundar os estudos iniciados, nas diferentes
atividades biológicas avaliadas. No entanto, estudos sobre o potencial medicinal de
uma espécie demanda o contínuo suprimento de material botânico.
Em observações de campo, verifica-se que as espécies de Hypericum aqui
estudadas ocorrem predominantemente em beiras de estrada, como planta ruderal,
onde há a presença de luz. Este habitat é muito vulnerável à eliminação das plantas por
roçadas constantes. Por outro lado, quando colhidos extrativamente, há o risco de
comprometimento da qualidade, em função da deposição de poeira e de resíduos
tóxicos, oriundos dos pneus e do escapamento de veículos que transitam nas estradas,
ou de agroquímicos aplicados em lavoura, que acabam atingindo estas plantas.
A diversidade genética que estas espécies, por serem plantas silvestres,
apresentam, bem como as potencialidades terapêuticas as caracterizam como espécies
promissoras na indústria de fitoterápicos, de modo que o cultivo de modo controlado é
de grande importância para obtenção de matéria-prima de alto padrão de qualidade e
uniformidade.
Nesse sentido, o desenvolvimento de protocolos para micropropagação e
cultivo de modo controlado apresentado para as espécies avaliadas nesse trabalho
torna-se de grande importância para investigações futuras. O uso de plantas
propagadas através do cultivo in vitro e aclimatização como fonte de matéria-prima para
estudos fitoquímicos e farmacológicos vêm aumentado consideravelmente (R
OUT et al.,
2000).
Esta técnica apresenta vantagens, quando comparada aos métodos
convencionais de propagação, incluindo a produção de um grande número de plantas
em um curto período de tempo e em espaço reduzido, além de permitir a produção
contínua durante o ano sem a influência de variações sazonais. Estas plantas
constituem-se então como fontes renováveis permitindo o suprimento sem a
214
necessidade de reacessar a fonte de material vegetal em seu habitat natural (ROUT et
al., 2000).
Dentre as espécies de Hypericum nativas do Estado, H. polyanthemum se
destaca devido ao potencial terapêutico, demonstrado por extratos apolares e por
substâncias isoladas desta planta. Em função da necessidade de padronizar o material
vegetal proveniente desta espécie foi realizada uma avaliação mais detalhada sobre o
cultivo in vitro e aclimatização desta espécie, bem como sobre a produção de
benzopiranos HP1, HP2 e HP3.
Verificou-se a influência de muitos fatores sobre o acúmulo de benzopiranos
nos diferentes estágios de desenvolvimento avaliados em H. polyanthemum.
Considerando a produção de metabólitos secundários em espécies de Hypericum,
muitos trabalhos demonstram variações no acúmulo de compostos bioativos,
decorrentes de coletas em diferentes regiões, épocas ou horários (B
ÜTER et al., 1998;
Ç
IRAK et al., 2006; COUCEIRO et al., 2006), de diferentes germoplasmas (KOSUTH et al.,
2003; K
ORNFELD et al., 2007), de diferentes estágios de desenvolvimento ontogenético
(B
UTER et al., 1998; KIREEVA & SHARANOV, 1999; TEKEL’OVÁ et al., 2000; ABREU et al.
2004; Ç
IRAK et al., 2006), bem como de diferentes parâmetros físicos e químicos
impostos às condições de cultivo (B
RISKIN et al., 2000; SCHMIDT et al., 2000; MURCH et
al., 2003;
ZOBAYED et al., 2003; ABREU & MAZZAFERA, 2005; TIRILLINI et al., 2006).
215
7. CONCLUSÕES GERAIS
216
217
No decorrer deste trabalho, verificou-se que as espécies de Hypericum
avaliadas apresentam um acúmulo de compostos fenólicos de diferentes polaridades,
evidenciado tanto pelas substâncias isoladas de H. ternum e H. myrianthum, quanto
pela quantificação de fenólicos totais presentes nas frações de H. caprifoliatum, H.
carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum. A presença desses compostos fenólicos
contribui para a atividade antioxidante demonstrada por extratos e frações purificadas
destas quatro espécies.
Considerando a manutenção sustentada das espécies de Hypericum nativas
do Rio Grande do Sul, o cultivo in vitro e aclimatização apresentam-se como uma
alternativa interessante aos métodos convencionais de produção de biomassa para
extração de metabólitos secundários bioativos.
Além disso, fatores genéticos e sazonais afetam a produção de biomassa, bem
como a produção de metabólitos secundários em H. polyanthemum. Em função disso,
acredita-se que a disponibilidade de material genético superior, juntamente com
métodos agrotecnológicos de melhoramento, tornam-se um fator importante para uma
futura produção a campo bem-sucedida.
218
219
8. REFERÊNCIAS
220
221
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245
9. ANEXOS
246
247
ANEXO I – Esquema da Metodologia descrita no Capítulo 1
248
249
Material Vegetal
Ambiente arejado e ao
abrigo de luz direta
Partes aéreas Hypericum ternum
Raízes Hypericum myrianthum
Seleção
Secagem
Trituração Moinho de facas
Extração Fracionamento
n-Hexano
CH
2
Cl
2
MeOH
Maceração estática a frio
Ciclos de 24h até esgotamento
Eliminação do solvente/ Concentração dos extratos
Evaporador rotatório
Pressão reduzida
Temperatura < 55°C
Tratamento com acetona
(Remoção de cera)
Dissolução em H
2
O
Partição com AcOEt
Fração
n-Hexano
Fração
AcOEt
Fração
CH
2
Cl
2
Eliminação do solvente/ Concentração dos extratos
Análise Cromatográfica
Fase estacionária: sílica gel GF
254
Fase móvel: CH
2
Cl
2
: n-hexano (1:1-3:2);
CH
2
Cl
2
100% e CH
2
Cl
2
:MeOH (90:10-
80:20) ou AcOEt:MeOH:H
2
O
100:13,5:10)
Cromatografia em coluna
CCD preparativa
Isolamento e Purificação
Identificação dos produtos
Espectroscopia na região do UV
e RMN
1
H e
13
C
250
251
ANEXO II – Espectros de UV e de RMN
1
-
H e RMN
13
-
C utilizados
para a elucidação das substâncias isoladas
252
253
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
256
358
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT1 MeOH
HT1 MeOH + NaOH
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
256
358
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT1 MeOH
HT1 MeOH + AlCl
3
HT1 MeOH + AlCl
3
+ HCl
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
256
358
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT1 MeOH
HT1 MeOH + NaOAc
HT1 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Espectros de UV da substância HT1
O
OCH
3
OH
CH
3
O
OH O
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
254
Espectro de RMN-H
1
de HT1 em MeOD a 500 MHz
255
Espectro de RMN-
13
C de HT1 em MeOD a 125 MHz
256
Espectro de correlação HMQC de HT1 em MeOD a 500/125 MHz
257
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
256
356
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT2 MeOH
HT2 MeOH + NaOH
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
256
356
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT2 MeOH
HT2 MeOH + AlCl
3
HT2 MeOH + AlCl
3
+ HCl
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
256
356
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT2 MeOH
HT2 MeOH + NaOAc
HT2 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Espectros de UV da substância HT2
O
OCH
3
OH
HO
OH O
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
258
Espectro de RMN-
1
H de HT2 em MeOD a 500 MHz
259
Espectro de RMN-
13
C de HT2 em MeOD a 125 MHz
260
Espectro de correlação HMQC de HT2 em MeOD a 500/125 MHz
261
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
270
332
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT3 MeOH
HT3 MeOH + NaOH
200 300 400 500
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
270
332
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT3 MeOH
HT3 MeOH + AlCl
3
HT3 MeOH + AlCl
3
+ HCl
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT3 MeOH
HT3 MeOH + NaOAc
HT3 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Espectros de UV da substância HT3
OH
HO
HO
OH
O
O
O
O
OH
OH
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1'
2'
3'
4'
5'
6'
2''
3''
4' '
5''
6' '
7' '
8''
9' '
10''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
262
Espectro de RMN-
1
H de HT3 em MeOD a 400 MHz
263
Espectro de RMN-
13
C (APT) de HT3 em MeOD a 100 MHz
264
Espectro de correlação HMBC de HT3 em MeOD a 400/100 MHz
O
O
OH
HO
OH
OH
HO
OH O
O
265
Espectro de RMN-
1
H de HT4 em DMSO-d6 a 400 MHz
O
O
OH
OH
OH
OH
H
3
COOC
OH
266
Espectro de RMN-
13
C (APT) de HT4 em DMSO-d6 a 100 MHz
267
Espectro de correlação HMQC de HT4 em DMSO-d6 a 400/100 MHz
268
Espectro de correlação HMBC de HT4 em DMSO-d6 a 400/100 MHz
H
3
COOC
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
269
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
258
358
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT5 MeOH
HT5 MeOH + NaOH
6'
5'
4'
3'
2'
1'
10
9
8
7
6
5
4
3
2
HO O
O
OH
O
OH
OAra
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
258
358
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT5 MeOH
HT5 MeOH + AlCl
3
HT5 MeOH + AlCl
3
+ HCl
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
258
358
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT5 MeOH
HT5 MeOH + NaOAc
HT5 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Espectros de UV da substância HT5
270
Espectro de RMN-
1
H de HT5 em MeOD a 500 MHz
271
Espectro de RMN-
13
C de HT5 em MeOD a 125 MHz
272
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
256
356
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT6 MeOH
HT6 MeOH + NaOH
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
256
356
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT6 MeOH
HT6 MeOH + AlCl
3
HT6 MeOH + AlCl
3
+ HCl
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
256
356
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT6 MeOH
HT6 MeOH + NaOAc
HT6 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Espectros de UV da substância HT6
6'
5'
4'
3'
2'
1'
10
9
8
7
6
5
4
3
2
HO O
OH
OH
O
OH
OGli
273
Espectro de RMN-
1
H de HT6 em MeOD a 500 MHz
274
Espectro de RMN-
13
C de HT6 em MeOD a 125 MHz
275
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
258
360
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT7 MeOH
HT7 MeOH + NaOH
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
258
360
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT7 MeOH
HT7 MeOH + AlCl
3
HT7 MeOH + AlCl
3
+ HCl
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
258
360
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
HT7 MeOH
HT7 MeOH + NaOAc
HT7 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Espectros de UV da substância HT7
6'
5'
4'
3'
2'
1'
10
9
8
7
6
5
4
3
2
HO O
OH
OH
O
OH
OGal
276
Espectro de RMN-
1
H de HT7 em MeOD a 500 MHz
277
Espectro de RMN-
13
C de HT7 em MeOD a 125 MHz
278
Espectro de RMN-
1
H de HTR1 em CDCl
3
a 400 MHz
12'
9
11'
10'
9'
8'
7'
6'
5'4'
3'
2'
8
7
6
5
4
3
2
1
HOOH
O
O
OH
O
OH
O
279
Espectro de RMN-
13
C (APT) de HTR1 em CDCl
3
a 100 MHz
280
Espectro de correlação de HMBC de HTR1 em CDCl
3
a 400/100 MHz
281
200 300 400 500
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
254
356
HM1 MeOH
HM1 MeOH + NaOH
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
6
'
5
'
4
'
3
'
2
'
1
'
9
8
7
6
5
4
3
2
1
HO
OH
O
OH
OH O
OH
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
254
356
HMXY MeOH
HMXY MeOH + AlCl
3
HMXY MeOH + AlCl
3
+ HCl
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
200 300 400 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
254
356
HM1 MeOH
HM1 MeOH + NaOAc
HM1 MeOH + NaOAc + H
3
BO
3
Absorvância
Comprimento de onda (nm)
Espectros de UV da substância HM1
282
Espectro de RMN-
1
H de HMR2 em CDCl
3
a 400 MHz
283
Espectro de RMN-
13
C de HMR2 em CDCl
3
a 100 MHz
284
Espectro de correlação HMBC de HMR2 em CDCl
3
a 400/100 MHz
5
OHHO
O
O
OHHO
O
O
285
ANEXO III – Tabelas contendo os dados obtidos a partir dos
espectros de UV, RMN
1
H e de RMN
13
C para as substâncias
isoladas
286
287
Tabela 1.1a: Valores máximos de absorção no UV da substância HT1
Máximos (nm) Desvios (nm)
Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH Ia Ib
358, 296 sh
IIa IIb
268 sh, 256
- - Banda I: flavonol com hidroxila em C3 substituída
Banda II a e b: substituição orto-di-OH no anel B (C3’ e
C4’)
MeOH + NaOH 390 300 sh, 268 +32 +12 Ausência de 7-OH livre
Deslocamento batocrômico na ordem de 40-65 nm da
banda I, sem diminuição na intensidade da absorção
confirma a presença de 4’-OH livre e ausência de 3-OH
livre
MeOH + AlCl
3
430, 330 sh,
302 sh
276 +72 +20 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
400, 364,
299 sh
268 -30 (em relação ao
espectro AlCl
3
)
+42 (em relação ao
espectro MeOH)
+12 Deslocamento hipsocrômico da banda I, em relação ao
espectro AlCl
3
, indica a presença de di-hidroxilação em
orto no anel B.
Deslocamento batocrômico na ordem de 35-55 nm da
banda I para banda Ia, em relação ao espectro metanol, é
indicativo de 5-OH livre e confirma substituição em 3-OH.
MeOH + NaOAc 420 sh, 362
298 sh
262 +4 +6 Presença de 7-OH substituída ou ausência de -OH em C7,
uma vez que apenas deslocamentos batocrômicos na
ordem de 8-20 nm da Banda II confirmam 7-OH livre.
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
378, 298 sh 264 +20 (em relação ao
espectro MeOH)
+8 Deslocamento batocrômico na ordem de 12-30 nm da
banda I confirma a presença de orto-di-OH no anel B
288
Tabela 1.1b: Valores máximos de absorção no UV da substância HT2
Máximos (nm) Desvios (nm)
Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH Ia Ib
356, 294 sh
IIa IIb
267 sh, 256
- - Banda I: flavonol com hidroxila em C3 substituída
Banda II a e b: substituição orto-di-OH no anel B (C3’ e
C4’)
MeOH + NaOH 404, 327 sh 272 +48 +16 O aparecimento de uma nova banda ou ombro, entre 320-
335 nm, é indicativo da presença de 7-OH livre.
Deslocamento batocrômico na ordem de 40-65 nm da
banda I, sem diminuição na intensidade da absorção
confirma a presença de 4’-OH livre e ausência de 3-OH
livre
MeOH + AlCl
3
424, 326 sh,
302 sh
276 +68 +20 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
400, 360,
299 sh
276 sh, 268 -24 (em relação ao
espectro AlCl
3
)
+44 (em relação ao
espectro MeOH)
+12 Deslocamento hipsocrômico da banda I, em relação ao
espectro AlCl
3
, indica a presença de di-hidroxilação em
orto no anel B.
Deslocamento batocrômico na ordem de 35-55 nm da
banda I para banda Ia, em relação ao espectro metanol, é
indicativo de 5-OH livre e confirma substituição em 3-OH.
MeOH + NaOAc 378, 324 sh 274 +22 +18 Deslocamento batocrômico da banda II, na ordem de 8-20
nm indica hidroxila livre em C7.
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
378, 299 sh 264 +22 (em relação ao
espectro MeOH)
+8 Deslocamento batocrômico na ordem de 12-30 nm da
banda I confirma a presença de orto-di-OH no anel B
289
Tabela 1.1c: Valores máximos de absorção no UV da substância HT3
Máximos (nm) Desvios (nm) Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH 326 270 - - Banda I: flavona
Banda II: substituição por apenas uma -OH no anel B (C4’)
MeOH + NaOH 386 282 +60 +12 O aparecimento de um ombro, entre 320-335 nm, é
indicativo da presença de 7-OH livre.
Deslocamento batocrômico na ordem de 40-65 nm da
banda I, sem diminuição na intensidade da absorção
confirma a presença de 4’-OH .
MeOH + AlCl
3
340 282 +14 +12 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
Ia, Ib
340, ~390 sh
Ia, Ib
282, ~300 sh
+14 +12 Manutenção do deslocamento batocrômico da banda I, em
relação ao espectro AlCl
3
, indica ausência de di-
hidroxilação em orto no anel B.
Deslocamento batocrômico da banda I, em relação ao
espectro metanol, é indicativo de 5-OH livre.
MeOH + NaOAc ~360 sh 276 +34 +8 Deslocamento batocrômico da banda II, na ordem de 8-20
nm indica hidroxila livre em C7.
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
326 274 - +4 Manutenção do deslocamento batocrômico da banda I, em
relação ao espectro MeOH confirma ausência de orto-di-
OH no anel B
290
Tabela 1.1d: Valores máximos de absorção no UV da substância HT5
Máximos (nm) Desvios (nm)
Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH Ia Ib
358, 299 sh
IIa IIb
268 sh, 258
- - Banda I: flavonol com hidroxila em C3 substituída
Banda II a e b: substituição orto-di-OH no anel B (C3’ e
C4’)
MeOH + NaOH 406, 325 sh 272 +48 +14 O aparecimento de uma nova banda ou ombro, entre 320-
335 nm, é indicativo da presença de 7-OH livre.
Deslocamento batocrômico na ordem de 40-65 nm da
banda I, sem diminuição na intensidade da absorção
confirma a presença de 4’-OH livre e ausência de 3-OH
livre
MeOH + AlCl
3
414, 303 sh 268 +56 +10 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
400, 364
301 sh
268 -14 (em relação ao
espectro AlCl
3
)
+42 (em relação ao
espectro MeOH)
+10 Deslocamento hipsocrômico da banda I, em relação ao
espectro AlCl
3
, indica a presença de di-hidroxilação em
orto no anel B.
Deslocamento batocrômico na ordem de 35-55 nm da
banda I para banda Ia, em relação ao espectro metanol, é
indicativo de 5-OH livre e confirma substituição em 3-OH.
MeOH + NaOAc 370, 325 sh 270, 256 sh +12 +12 Deslocamento batocrômico da banda II, na ordem de 8-20
nm indica hidroxila livre em C7.
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
378, 299 sh 264 +20 (em relação ao
espectro MeOH)
+6 Deslocamento batocrômico na ordem de 12-30 nm da
banda I confirma a presença de orto-di-OH no anel B
291
Tabela 1.1e: Valores máximos de absorção no UV da substância HT6
Máximos (nm) Desvios (nm)
Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH Ia Ib
356, 298 sh
IIa IIb
266 sh, 256
- - Banda I: flavonol com hidroxila em C3 substituída
Banda II a e b: substituição orto-di-OH no anel B (C3’ e
C4’)
MeOH + NaOH 406, 324 sh 272 +50 +16 O aparecimento de uma nova banda ou ombro, entre 320-
335 nm, é indicativo da presença de 7-OH livre.
Deslocamento batocrômico na ordem de 40-65 nm da
banda I, sem diminuição na intensidade da absorção
confirma a presença de 4’-OH livre e ausência de 3-OH
livre
MeOH + AlCl
3
414, 303 sh 270 +58 +14 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
402, 358
301 sh
268 -12 (em relação ao
espectro AlCl
3
)
+46 (em relação ao
espectro MeOH)
+12 Deslocamento hipsocrômico da banda I, em relação ao
espectro AlCl
3
, indica a presença de di-hidroxilação em
orto no anel B.
Deslocamento batocrômico na ordem de 35-55 nm da
banda I para banda Ia, em relação ao espectro metanol, é
indicativo de 5-OH livre e confirma substituição em 3-OH.
MeOH + NaOAc 378, 324 sh 274 +22 +18 Deslocamento batocrômico da banda II, na ordem de 8-20
nm indica hidroxila livre em C7.
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
378, 300 sh 266 +22 (em relação ao
espectro MeOH)
+10 Deslocamento batocrômico na ordem de 12-30 nm da
banda I confirma a presença de orto-di-OH no anel B
292
Tabela 1.1f: Valores máximos de absorção no UV da substância HT7
Máximos (nm) Desvios (nm)
Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH Ia Ib
360, 299 sh
IIa IIb
268 sh, 258
- - Banda I: flavonol com hidroxila em C3 substituída
Banda II a e b: substituição orto-di-OH no anel B (C3’ e
C4’)
MeOH + NaOH 410, 325 sh 274 +50 +16 O aparecimento de uma nova banda ou ombro, entre 320-
335 nm, é indicativo da presença de 7-OH livre.
Deslocamento batocrômico na ordem de 40-65 nm da
banda I, sem diminuição na intensidade da absorção
confirma a presença de 4’-OH livre e ausência de 3-OH
livre
MeOH + AlCl
3
414, 303 sh 268 +54 +10 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
400, 364,
302 sh
268 -14 (em relação ao
espectro AlCl
3
)
+40 (em relação ao
espectro MeOH)
+10 Deslocamento hipsocrômico da banda I, em relação ao
espectro AlCl
3
, indica a presença de di-hidroxilação em
orto no anel B.
Deslocamento batocrômico na ordem de 35-55 nm da
banda I para banda Ia, em relação ao espectro metanol, é
indicativo de 5-OH livre e confirma substituição em 3-OH.
MeOH + NaOAc 380, 324 sh 274 +20 +16 Deslocamento batocrômico da banda II, na ordem de 8-20
nm indica hidroxila livre em C7.
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
380 268 +20 (em relação ao
espectro MeOH)
+10 Deslocamento batocrômico na ordem de 12-30 nm da
banda I confirma a presença de orto-di-OH no anel B
293
Tabela 1.1g: Valores máximos de absorção no UV da substância HM1
Máximos (nm) Desvios (nm)
Solventes mais
reativos
Banda I Banda II Banda I Banda II
Conclusões
MeOH Ia Ib
356 292 sh
IIa IIb
270 sh 254
- - Banda I (352-385) e banda II (250-280): flavonol com
hidroxila livre em C3.
Banda II a e b: substituição orto-di-OH no anel B (C3’ e
C4’).
MeOH + NaOH 400 324 sh 266 +44 +12 Aparecimento de uma nova banda ou ombro entre 320-
335 nm, indica a presença de hidroxila livre em C-7.
Banda I: deslocamento batocrômico na ordem de 40-65
nm com diminuição na intensidade da absorção confirma
a presença de 4’-OH e 3-OH livres.
MeOH + AlCl
3
430 356
302 sh
270 +74 +16 -
MeOH + AlCl
3
+
HCl
422 354
304 sh 264 -8 (em relação ao
espectro AlCl
3
)
+66 (em relação ao
espectro MeOH)
+10 Banda I: deslocamento hipsocrômico em relação ao
espectro AlCl
3
, indica a presença de di-hidroxilação em
orto no anel B. Desvio batocrômico na ordem de 50-60
nm, em relação ao espectro metanol, indica a presença
de 3,5-di-OH
MeOH + NaOAc 354 330 sh 272 sh 254 -2 - -
MeOH + NaOAc
+ H
3
BO
3
374 290 sh 260 +16 (em relação ao
espectro MeOH)
+6 Banda I: Deslocamento batocrômico na ordem de 12-30
nm, em relação ao espectro metanol, confirma a presença
de orto-di-OH no anel B.
294
Tabela 1.2: Dados de RMN de
13
C (125 MHz) dos compostos HT1, HT2, HT5, HT6 e HT7, isolados da
fração acetato de etila das partes aéreas de H. ternum .
C HT1
C
(ppm)
HT2
C
(ppm)
HT5
C
(ppm)
HT6
C
(ppm)
HT7
C
(ppm)
C2 158,3 157,8 158,4 158,5 158,5
C3 139,8 139,5 135,7 135,6 135,6
C4 180,1 179,9 179,5 179,5 179,6
C5 167,2 162,9 163,0 163,1 163,0
C6 98,9 99,9 99,9 99,9 99,9
C7 169,8 166,2 165,9 165,9 166,0
C8 93,1 94,8 94,7 94,7 94,7
C9 162,8 158,3 158,7 159,1 158,9
C10 106,7 105,7 105,6 105,7 105,7
C1’ 127,7 122,9 123,1 123,2 122,9
C2’ 116,5 116,4 116,2 116,0 116,5
C3’ 146,8 146,4 145,9 145,9 145,8
C4’ 149,6 149,9 149,9 149,8 149,9
C5’ 115,9 116,8 117,5 117,6 117,8
C6’ 122,9 122,3 122,9 123,1 122,7
3-OCH
3
60,5 60,5 - - -
7- OCH
3
56,5 - - - -
C1’’ - - 104,7 104,5 105,4
C2’’ - - 74,2 75,7 73,2
C3’’ - - 72,9 78,1 75,1
C4’’ - - 69,1 71,2 70,0
C5’’ - - 66,9 78,4 77,2
C6’’ - - - 62,6 62,0
* Dados experimentais medidos em MeOD.
295
Tabela 1.3: Dados de RMN de
1
H (500 MHz) dos compostos HT1, HT2, HT5, HT6 e HT7, isolados da
fração acetato de etila das partes aéreas de H. ternum (J: constantes de acoplamento em Hz).
H HT1
H
(ppm)
HT2
H
(ppm)
HT5
H
(ppm)
HT6
H
(ppm)
HT7
H
(ppm)
H6 6,32 (s) 6,38 (s) 6,20 (s) 6,22 (s) 6,22 (s)
H8 6,58 (s) 6,55 (s) 6,39 (s) 6,41
(d, J=1,2)
6,42 (s)
H2’ 7,67 (s) 7,90 (s) 7,70 (s) 7,73
(d, J= 1,8)
7,86 (s)
H5’ 6,79
(d, J= 8,2)
7,01 (bs) 6,88
(d, J= 8,4)
6,89
(d, J=8,5)
6,88
(d, J= 8,2)
H6’ 6,91 (m) 7,70 (bs)
7,58
(dd, J= 1,1; 8,4)
7,61
(dd, J= 1,5; 8,7)
7,60
(d, J= 8,1)
3-OCH
3
3,82 (s) 3,98 (s) - - -
7- OCH
3
3,89 (s) - - - -
H1’’ - - 5,16
(d, J= 6,5)
5,28
(d, J= 7,7)
5,18
(d, J= 7,4)
H2’’ - - 3,92 (m) 3,50 (m) 3,85 (m)
H3’’ - - 3,67
(dd, J= 2,5; 8,3)
3,45
(t, J=8,9)
3,66 (bd)
H4’’ - - 3,84 (bs) 3,37
(t, J= (9,1)
3,58 (bs)
H5’’a - - 3,84 (bs) 3,24 (m) 3,49 (bs)
H5’’b - - 3,47 (d, J=10,8) - -
H6’’a - - - 3,74
(dd; J=1,8; 11,7)
3,58 (bs)
H6’’b - - - 3,59
(dd, J= 5,4; 12,0)
3,66 (bd)
* Dados experimentais medidos em MeOD.
296
Tabela 1.4: Dados de RMN de
13
C (100 MHz) e de
1
H (400 MHz) do composto HT3 , isolado da fração
acetato de etila das partes aéreas de H. ternum (J: constantes de acoplamento em Hz).
Posição
C (ppm)
H (ppm)
2 165,9 -
3 112,0 -
4 183,9 -
5 162,8 -
6 100,4 6,26 (s)
7 167,2 -
8 95,1 6,47 (d, J=1,8)
9 159,6 -
10 104,6 -
1’ 125,2 -
2’, 6’ 131,0 6,63 (d, J=8,8)
3’, 5’ 116,1 7,32 (d, J=8,8)
4’ 161,3 -
2’’ 165,9 -
3’’ 103,6 6,52 (s)
4’’ 182,8 -
5’’ 161,3 -
6’’ 100,5 6,26 (s)
7’’ 165,9 -
8’’ 101,2 -
9’’ 156,9 -
10’’ 105,2 -
1’’’ 123,2 -
2’’’, 6’’’ 129,1 6,76 (d, J=8,8)
3’’’, 5’’’ 117,0 7,53 (d, J=9,2)
4’’’ 163,1 -
* Dados experimentais medidos em MeOD.
Tabela 1.5: Dados de RMN de
13
C (100 MHz) e de
1
H (400 MHz) do composto HT4 , isolado da fração
acetato de etila das partes aéreas de H. ternum (J: constantes de acoplamento em Hz).
Posição
C (ppm)
H (ppm)
1 124,6 -
2 114,4 7,01 (s)
3 146,2 -
4 149,0 -
5 115,9 6,73 (d, J=8,0)
6 121,4 6,93 (d, J=8,0)
7 145,3 7,37 (d, J=16,1)
8 113,2 6,07 (d, J=15,8)
9 165,4 -
1’ 73,0 -
2’ ax 1,73-1,79 (m)
2’ eq
37,2
2,07-2,11 (m)
3’ 66,9 3,88 (m)
4’ 69,3 3,61 (m)
5’ 70,9 5,01 (m)
6’ax 1,93 (dd, J= 2,9; 13,6)
6’eq
35,1
2,12 (m)
7’ 173, 6 -
OCH
3
51,8 3,58 (s)
* Dados experimentais medidos em DMSO-d6.
297
Tabela 1.7: Dados de RMN de
1
H do composto HTR1, isolado da fração n-hexano das raízes de H.
ternum, e das substâncias estruturalmente relacionadas isouliginosina B, drumondina C e hiperbrasilol B
(J: constantes de acoplamento em Hz).
H
HTR1 (1)
δ
H
 (ppm)
Isouliginosina B (2)
δ
H
 (ppm)
Drummondina C (3)
δ
H
 (ppm)
Hiperbrasilol B (4)
δ
H
 (ppm)
4-CH
3
1,49 (s)
1,48 (s)
1,50 (s) 1,49 (bs) 1,51 (s)
H7 3,51 (bs) 3,52 (bm) 3,52 (bs) 3,55 (s)
H9 4,15-4,26 (m) 4,19 (m) - 4,19 (m)
9-CH
3
1,20 (d, J=6,7)* 1,17 (d, J=7) 2,74 (s) 1,17 (d, J=7)
2’-CH
3
1,48 (s) 1,55 (s) 1,49 (bs) 1,53 (s)
H3’ 5,44 (d, J=9,75) 5,46 (d, J=10) 5,44 (d, J=9,9) 5,59 (d, J=10)
H4’ 6,70 (d, J=10,35) 6,71 (d, J=10) 6,68 (d, J=9,9) 6,66 (d, J=10)
H12’ 3,84-3,95 (m) 4,05 (m) - 4,00 (m)
12’-CH
3
1,21 (d, J=6,7)* 1,17 (d, J=7) 2,69 (s) 1,20 (d, J=7)
3-OH 10,01 (s) 9,05 (s) 9,94 (s) 9,90 (s)
5-OH 18,76 (s) 18,80 (s) 18,42 (s) 18,80 (s)
5'-OH 11,50 (s) - 11,47 (s) 11,40 (s)
7'-OH 16,22 (s) 11,69 (s) 15,88 (s) 16,35 (s)
9'-OH - 14,14 (s) - -
H1’’ - - - 2,8-2,5 (m)
H2’’ - - - 4,60 (bt)
H3’’ - - - 1,31 (s)
3’’-CH
3
- - - 1,34 (s)
1-Dados experimentais de HTR1 medidos a 400 MHz em CDCl
3
2-Dados medidos a 200 MHz em CDCl
3
ROCHA et al.,1995.
3-Dados medidos a 300 MHz em CDCl
3
JAYASURIYA et al., 1989.
4-Dados medidos a 200 MHz em acetona-d
6
ROCHA et al.,1996.
*Os valores dos sinais assinalados podem estar trocados entre si
298
Tabela 1.8: Dados de RMN de
13
C (100 MHz) do composto HTR1, isolado da fração n-hexano das raízes
de H. ternum, e das substâncias estruturalmente relacionadas isouliginosina B, drumondina C e
hiperbrasilol B.
C
HTR1 (1)
δ
C
 (ppm)
Isouliginosina B (2)
δ
C
 (ppm)
Drummondina C (3)
δ
C
(ppm)
Hiperbrasilol B (4)
δ
C
 (ppm)
C1 199,4 199,1 198,7 199,2
C2 111,2 106,9 108,5 109,8
C3 171,6 170,0 171,8 170,7
C4 44,3 44,1 44,4 49,8
4-CH
3
24,3 24,5 24,8 22,8
25,4 25,0 - -
C5 187,3 187,2 187,3 188,5
C6 107,6 111,3 111,2 114,2
C7 16,1 17,0 16,8 17,9
C8 210,8 211,9 207,1 211,9
C9 36,6 36,8 29,3 37,2
9-CH
3
19,1 18,9 - 19,4
19,4 18,9 - 19,5
C2’ 78,2 80,5 78,2 79,2
2’-CH
3
27,9 27,7 28,2 27,8
27,9 27,7 27,9
C3’ 124,6 124,1 124,7 124,1
C4’ 117,3 117,1 117,2 117,5
C5’ 159,4 154,6 159,4 160,0
C6’ 107,1 104,9 106,0 107,2
C7’ 162,2 160,1 161,2 162,7
C8’ 103,7 105,7 104,8 104,3
C9’ 155,4 160,4 155,9 156,1
C10’ 103,5 102,1 103,6 104,2
C11’ 211,2 210,9 203,5 210,8
C12’ 39,0 39,5 32,2 39,7
12’-CH
3
19,1 19,2 - 18,9
19,4 19,2 - 19,8
C1’’ - - - 39,3
C2’’ - - - 118,2
C3’’ - - - 136,5
3’’-CH
3
- - - 17,5
1-Dados experimentais de HTR1 medidos a 100 MHz em CDCl
3
2-Dados medidos a 50 MHz em CDCl
3
ROCHA et al.,1995.
3-Dados medidos a 75 MHz em CDCl
3
JAYASURIYA et al., 1989.
4-Dados medidos a 50 MHz em acetona-d
6
ROCHA et al., 1996.
299
Tabela 1.9: Dados de RMN de
13
C (100 MHz) e de
1
H (400 MHz) do composto HMR2, isolado da fração
n-hexano das raízes de H. myrianthum (J: constantes de acoplamento em Hz).
Posição
C (ppm) 
H (ppm)
1 199,8 -
2 107,0 -
3 173,2 -
3-OH 12,31 (s)
4 44,5 -
4-CH
3
24,3 1,41 (s)
25,4 1,46 (s)
5 187,6
5-OH 18,73 (s)
6 110,8 -
7 18,1 3,32 (bs)
8 210,5 -
9 36,6 4,15 (sept, J=6,8)
9-CH
3
18,7 1,16 (d, J=6,8)
19,3 1,16 (d, J=6,8)
* Dados experimentais medidos em CDCl
3
.
300
301
ANEXO IV – Esquema da Metodologia descrita no Capítulo 2
302
303
Material Vegetal
Ambiente arejado e ao
abrigo da luz
Seleção
Secagem
Trituração Moinho de facas
Extração Fracionamento
n-Hexano
CH
2
Cl
2
MeOH
Soxhlet (5 X 6 h)
Eliminação do solvente/ Concentração dos extratos
Evaporador rotatório
Pressão reduzida
Temperatura < 55°C
Fração
n-Hexano
Fração
MeOH
Fração
CH
2
Cl
2
Maceração estática
a frio (3 X 24 h)
MeOH
Extrato bruto
metanólico
Determinação de Fenóis Totais - Método Colorimétrico de Folin- Ciocalteau
Avaliação da capacidade de reação com o radical 2,2 difenil-1-picrilidrazil - Método de DPPH *
Extrato bruto MeOH
n-hexano
Frações CH2Cl2
MeOH
Hypericum caprifoliatum
Hypericum carinatum
Hypericum myrianthum
Hypericum polyanthemum
Partes aéreas
Extrato bruto MeOH
Avaliação do potencial antioxidante - Método TRAP *
Avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila - Método ORAC
* Substâncias isoladas das espécies de Hypericum foram avaliadas através destas técnicas
304
305
ANEXO V – “Benzophenones from Hypericum carinatum”
306
307
308
309
310
311
ANEXO VI – Dados de consumo do radical DPPH
312
313
Quadro 2.2: Dados da cinética de consumo de DPPH
para os extratos brutos metanólicos e frações n-
hexano e metanólicas das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum,
obtidos através da equação de decaimento bi-exponencial y= y
0
+ A1 exp
(-x/T1)
+ A2 exp
(-x/T2)
. A
0
:
absorvância no tempo 0 seg; Abs
50s
: absorvância no tempo 50 seg; Abs
600s
: absorvância no tempo 600s.
Amostra (µg/mL) A0 Y0 A1 T1 A2 T2 A1 + A2 Abs
50s
Abs
600s
0,7321 0,4054 0,1200 12,48 0,1997 229,33 0,3197 0,5682 0,4199
0,6739 0,3499 0,1209 15,13 0,2003 264,35 0,3212 0,5204 0,3706
20,8
0,6704 0,3371 0,1213 12,00 0,2025 223,84 0,3238 0,5010 0,3510
0,6772 0,1873 0,1908 19,94 0,2912 257,73 0,4820 0,4426 0,2157
0,6915 0,2031 0,2055 20,83 0,2868 268,53 0,4923 0,4598 0,2333
Hcapri
bruto MeOH
41,7
0,6889 0,1998 0,1998 20,07 0,2907 273,67 0,4905 0,4585 0,2323
0,7200 0,3875 0,0944 44,90 0,2169 276,10 0,3113 0,5995 0,4122
0,7433 0,3963 0,0920 42,73 0,2362 268,95 0,3282 0,6209 0,4217
20,8
0,7334 0,3835 0,1089 52,52 0,2258 313,75 0,3347 0,6161 0,4169
0,6965 0,2367 0,0841 53,21 0,3671 260,74 0,4512 0,5726 0,2735
0,7006 0,2398 0,0893 55,33 0,3707 280,32 0,4600 0,5861 0,2834
Hcapri
n-hexano
41,7
0,6889 0,2183 0,0990 57,10 0,3829 315,10 0,4819 0,5863 0,2753
0,7156 0,4302 0,1028 8,52 0,1781 189,73 0,2809 0,5673 0,4377
0,6748 0,3832 0,1023 9,20 0,1929 200,02 0,2952 0,5339 0,3928
20,8
0,6932 0,4114 0,1014 9,95 0,1795 205,71 0,2809 0,5528 0,4211
0,6934 0,0677 0,1308 20,93 0,5015 419,79 0,6323 0,5249 0,1878
0,6863 0,0598 0,1298 18,54 0,4970 435,03 0,6268 0,5116 0,1849
Hcapri
MeOH
41,7
0,6889 0,0643 0,1315 21,15 0,4907 415,37 0,6222 0,5117 0,1800
0,6622 0,4267 0,0788 18,79 0,1545 205,29 0,2333 0,5533 0,4350
0,6752 0,4200 0,0772 21,64 0,1689 240,87 0,2461 0,5649 0,4340
20,8
0,6863 0,4499 0,0753 19,76 0,1513 199,89 0,2266 0,5737 0,4574
0,6752 0,3101 0,0747 18,49 0,2860 230,88 0,3607 0,5454 0,3314
0,6982 0,2997 0,0946 20,69 0,2973 225,22 0,3919 0,5463 0,3204
Hpoly bruto
MeOH
41,7
0,6989 0,3169 0,0893 21,33 0,2844 226,08 0,3737 0,5534 0,3369
0,6502 0,3172 0,0593 30,72 0,2706 298,60 0,3299
0,5577 0,3535
0,6337 0,3015 0,0566 32,08 0,2733 299,18 0,3299 0,5446 0,3383
Hpoly
n-hexano
500
0,6562 0,3034 0,0650 37,01 0,2780 319,98 0,3430 0,5580 0,3460
0,6856 0,3393 0,0540 18,97 0,2833 282,53 0,3373 0,5805 0,3732
0,6907 0,3107 0,0635 23,83 0,3037 272,26 0,3672 0,5712 0,3442
Hpoly
MeOH
41,7
0,6889 0,3245 0,0655 20,70 0,2887 294,82 0,3542 0,5740 0,3622
0,7006 0,4281 0,062 13,50 0,1955 198,47 0,2617 0,5817 0,4376
0,6898 0,4327 0,0606 14,82 0,1867 175,48 0,2473 0,5752 0,4388
20,8
0,6775 0,4196 0,0633 16,70 0,1932 210,70 0,2565 0,5752 0,4308
0,6607 0,2586 0,0759 13,49 0,3079 242,41 0,3838 0,5110 0,2845
0,6632 0,2622 0,0789 16,66 0,3084 254,38 0,3873 0,5195 0,2914
Hmyri bruto
MeOH
41,7
0,6762 0,2873 0,0849 18,94 0,2935 236,21 0,3784 0,5309 0,3104
0,7208 0,3816 0,0227 1,27 0,3161 202,07 0,3388 0,6284 0,3978
0,7347 0,3929 0,1014 43,27 0,2280 273,50 0,3294 0,6147 0,4183
Hmyri
n-hexano
41,7
0,6861 0,3391 0,0212 1,36 0,3269 208,36 0,3481 0,5963 0,3575
0,6893 0,3538 0,0638 25,14 0,2650 267,07 0,3288 0,5823 0,3818
0,6811 0,3544 0,0623 25,26 0,2609 263,13 0,3232 0,5788 0,3811
20,8
0,6860 0,3527 0,0597 20,37 0,2701 252,93 0,3298 0,5795 0,3779
0,6936 0,2171 0,0957 34,82 0,3835 322,02 0,4792 0,5682 0,2766
0,6898 0,2101 0,1043 43,50 0,3799 310,15 0,4842 0,5665 0,2650
Hmyri
MeOH
41,7
0,6917 0,2137 0,0913 40,14 0,3814 342,75 0,4727 0,5696 0,2799
0,6896 0,2092 0,1871 15,98 0,2980 170,65 0,4851 0,4397 0,2181
0,6759 0,1758 0,1737 16,78 0,3182 178,42 0,4919 0,4251 0,1868
Hcari
bruto MeOH
20,8
0,6867 0,1738 0,1920 16,16 0,3182 171,13 0,5102 0,4200 0,1834
314
Continuação do quadro 2.2
0,6833 0,3838 0,0674 36,08 0,2390 343,98 0,3064 0,6073 0,4256
0,7049 0,3876 0,0669 32,45 0,2553 321,29 0,3222 0,6204 0,4270
Hcari
n-hexano
166,7
0,6944 0,3761 0,0725 37,14 0,2463 346,44 0,3188 0,6082 0,4197
0,6697 0,2146 0,1140 16,41 0,3365 202,87 0,4505 0,4830 0,2321
0,7169 0,2567 0,1109 19,30 0,3432 224,05 0,4541 0,5396 0,2803
20,8
0,6731 0,2173 0,1128 17,67 0,3334 215,52 0,4462 0,4883 0,2379
0,6992 0,1149 0,1245 19,82 0,4540 199,63 0,5785 0,4783 0,1374
0,6889 0,1139 0,1153 18,54 0,4494 198,57 0,5647 0,4710 0,1358
Hcari MeOH
41,7
0,6833 0,1089 0,1114 20,05 0,4587 206,73 0,5701 0,4783 0,1341
Quadro 2.3: Parâmetros consumo total (CT), consumo 50 s ( C
50 s
), consumo 600 s (C
50 s
), percentual de
consumo aos 50 s (%C
50 s
) e percentual de consumo aos 600 s (%C
600 s
), ambos em relação ao consumo
total, obtidos com a cinética de consumo de DPPH
para os extratos brutos metanólicos e frações n-
hexano e metanólica das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum (dp:
desvio padrão). Estão demonstrados apenas os dados que foram utilizados para medidas de comparação
entre as substâncias.
Amostra (µg/mL)
CT
(µM dp)
C
50 s
(µM dp)
C
600 s
(µM dp)
%C
50 s
( dp)
%C
600 s
( dp)
20,8
28,0 0,2 14,1 0,7 27,1 0,7 50,5 2,2 97,0 2,1
Hcapri
bruto MeOH
41,7
42,5 0,5 20,2 0,2 39,9 0,2 47,6 1,0 93,9 1,5
20,8
28,2 1,0 10,4 0,2 27,4 0,6 37,0 1,8 97,2 2,4
Hcapri n-hexano
41,7
40,4 1,4 9,9 1,0 36,4 0,4 24,6 3,2 90,2 0,4
20,8
24,8 0,8 12,5 0,4 24,1 0,4 50,3 2,5 97,2 2,0
Hcapri MeOH
41,7
54,50 0,5 15,1 0,4 44,0 0,4 27,7 0,9 80,6 1,1
20,8
20,5 0,8 9,8 0,3 20,2 0,7 47,7 1,07 98,9 1,9
Hpoly
bruto MeOH
41,7
32,7 1,4 12,4 1,0 31,4 1,5 38,0 1,7 96,3 1,0
Hpoly n-hexano 500
29,1 0,6 8,1 0,4 26,2 0,7 27,9 0,7 90,0 0,6
Hpoly MeOH 41,7
30,7 1,3 9,8 0,7 28,6 1,5 32,1 0,8 93,1 1,1
20,8
22,2 0,7 9,7 0,7 22,1 0,7 43,7 3,3 99,4 2,6
Hmyri
bruto MeOH
41,7
33,3 0,4 12,7 0,3 32,3 0,5 38,1 0,9 96,8 1,1
Hmyri n-hexano 41,7
29,5 0,9 9,1 1,8 28,1 0,6 29,7 5,8 95,3 0,9
20,8
28,5 0,3 9,2 0,2 26,5 0,4 32,2 0,4 93,2 0,3
Hmyri MeOH
41,7
41,6 0,5 10,7 0,2 36,3 0,6 25,8 0,4 87,3 0.3
Hcari bruto MeOH 20,8
43,1 1,1 22,2 0,8 42,4 1,4 51,5 0,7 98,4 1,1
Hcari n-hexano 166,7
27,4 0,7 7,2 0,5 23,5 1,0 26,1 1,2 85,6 1,2
20,8
39,2 0,4 15,9 0,4 38,0 0,2 40,6 1,4 96,9 0,6
Hcari MeOH
41,7
49,7 0,6 18,6 0,7 48,3 0,6 37,5 1,4 97,2 0,8
315
Quadro 2.4: Dados referentes à cinética de consumo de DPPH
para substâncias isoladas de espécies
de Hypericum nativas do RS, obtidos através da equação de decaimento bi-exponencial y= y
0
+ A1 exp
(-
x/T1)
+ A2 exp
(-x/T2)
. A
0
: absorvância no tempo 0 seg; Abs
50s
: absorvância no tempo 50 seg; Abs
600s
:
absorvância no tempo 600 seg.
Amostra A0 Y0 A1 T1 A2 T2 A1 + A2 Abs
50s
Abs
600s
0,6782 0,3302 0,0567 33,34 0,2772 304,66 0,3339 0,5781 0,3689
0,6814 0,3362 0,0444 24,98 0,2946 279,65 0,3390 0,5886 0,3707
Hiperbrasilol B
100 µM
0,6902 0,3467 0,0481 28,56 0,2889 298,78 0,3370 0,5994 0,3855
0,6955 0,3019 0,0625 50,22 0,3164 355,37 0,3789 0,5999 0,3604
0,6731 0,2786 0,0699 52,49 0,3088 362,15 0,3787 0,5745 0,3375
Japonicina A
100 µM
0,6889 0,2983 0,0628 51,33 0,3178 373,47 0,3806 0,5600 0,3620
0,7604 0,4673 0,1070 7,8 0,1992 256,9 0,3062 0,6314 0,4866
0,7409 0,4544 0,0966 13,4 0,1953 277,7 0,2919 0,6198 0,4769
Uliginosina B
100 µM
0,7534 0,4598 0,0997 10,1 0,1989 286,3 0,2986 0,6276 0,4843
0,6673 0,3346 0,1895 11,1 0,1302 104,30 0,3197 0,4173 0,3350
0,6636 0,3387 0,1937 11,70 0,1283 104,86 0,3220 0,4210 0,3391
Carifenona A
100 µM
0,6532 0,3299 0,1855 10,50 0,1289 103,90 0,3144 0,4111 0,3303
0,6675 0,5500 0,0359 84,17 0,0821 740,09 0,1180 0,6466 0,5865
0,6636 0,5304 0,0374 85,73 0,0880 756,30 0,1254 0,6336 0,5702
Carifenona B
100 µM
0,6687 0,5468 0,0308 83,89 0,0911 773,90 0,1219 0,6492 0,5888
0,6546 0,3986 0,1346 18,46 0,1252 630,04 0,2598 0,5232 0,4469
0,6560 0,3749 0,1445 16,94 0,1333 588,17 0,2778 0,5049 0,4230
Hiperosídeo
25 µM
0,6886 0,4066 0,1462 16,33 0,1341 617,74 0,2803 0,5371 0,4574
0,6961 0,3821 0,1254 12,18 0,1872 850,61 0,3126 0,5607 0,4746
0,6658 0,3745 0,0990 9,78 0,1932 1085,06 0,2922 0,5599 0,4856
Isoquercitrina
25 µM
0,6889 0,3845 0,1128 11,64 0,1897 970,78 0,3025 0,5662 0,4867
0,6766 0,3687 0,1962 18,17 0,1079 184,13 0,3332 0,4635 0,3728
0,6831 0,3236 0,2315 14,18 0,1286 356,80 0,3601 0,4422 0,3475
Guaijaverina
25 µM
0,6889 0,3025 0,2549 16,30 0,1315 375,87 0,3864 0,42,95 0,3291
0,6960 0,5558 0,0898 11,51 0,0426 557,09 0,1324 0,5959 0,5703
0,6908 0,5389 0,0946 12,99 0,0561 734,78 0,1507 0,5933 0,5637
3-metil
quercetina
25 µM
0,6889 0,5367 0,0917 11,87 0,0544 599,62 0,1461 0,5903 0,5567
Quadro 2.5: Parâmetros consumo total (CT), consumo 50 s ( C
50 s
), consumo 600 s (C
50 s
), percentual de
consumo aos 50 s (%C
50 s
) e percentual de consumo aos 600 s (%C
600 s
), ambos em relação ao consumo
total, obtidos com a cinética de consumo de DPPH
para substâncias isoladas de espécies de Hypericum
nativas do RS (dp: desvio padrão). Estão demonstrados apenas os dados que foram utilizados para
medidas de comparação entre as substâncias.
Amostra
CT
(µM dp)
C
50 s
(µM dp)
C
600 s
(µM dp)
%C
50 s
( dp)
%C
600 s
( dp)
Hiperbrasilol B 100 µM
29,3 0,3 8,2 0,4 26,8 0,3 28,1 1,6 91,6 1,2
Japonicina A 100 µM
33,0 0,1 9,4 1,6 28,9 0,4 28,3 4,7 87,6 1,5
Uliginosina B 100 µM
26,1 0,9 10,9 0,5 23,4 0,6 41,8 0,5 89,9 0,7
Carifenona A 100 µM
27,7 0,4 21,3 0,3 28,4 0,4 76,9 1,4 102,5 1,6
Carifenona B 100 µM
10,6 0,3 2,0 0,5 7,3 0,7 19,2 4,1 69,3 4,6
Hiperosídeo 25 µM
23,7 1,0 12,6 1,0 19,5 1,2 52,9 2,0 82,1 2,0
Isoquercitrina 25 µM
26,3 0,9 10,6 1,3 17,5 1,8 40,1 3,6 66,6 4,6
Guaijaverina 25 µM
31,3 2,3 20,7 2,1 28,9 2,4 66,1 1,9 92,4 1,0
3-metil quercetina 25 µM
12,4 0,8 8,6 0,1 11,2 0,3 69,4 5,6 90,0 5,1
316
317
ANEXO VII – Esquema da Metodologia descrita no Capítulo 3
318
319
320
321
ANEXO IV – Esquema da Metodologia descrita no Capítulo 2
322
323
Material Vegetal
Ambiente arejado e ao
abrigo da luz
Seleção
Secagem
Trituração Moinho de facas
Extração Fracionamento
n-Hexano
CH
2
Cl
2
MeOH
Soxhlet (5 X 6 h)
Eliminação do solvente/ Concentração dos extratos
Evaporador rotatório
Pressão reduzida
Temperatura < 55°C
Fração
n-Hexano
Fração
MeOH
Fração
CH
2
Cl
2
Maceração estática
a frio (3 X 24 h)
MeOH
Extrato bruto
metanólico
Determinação de Fenóis Totais - Método Colorimétrico de Folin- Ciocalteau
Avaliação da capacidade de reação com o radical 2,2 difenil-1-picrilidrazil - Método de DPPH *
Extrato bruto MeOH
n-hexano
Frações CH2Cl2
MeOH
Hypericum caprifoliatum
Hypericum carinatum
Hypericum myrianthum
Hypericum polyanthemum
Partes aéreas
Extrato bruto MeOH
Avaliação do potencial antioxidante - Método TRAP *
Avaliação da capacidade de reação com radicais peroxila - Método ORAC
* Substâncias isoladas das espécies de Hypericum foram avaliadas através destas técnicas
324
325
ANEXO IX – “Benzopyrans in Hypericum polyanthemum Klotzsch
ex Reichardt cultured in vitro”
326
327
328
329
330
331
332
333
ANEXO X – Pareceres dos membros da Comissão Examinadora
334
335
336
337
338
339
10. B
IOGRAFIA
340
Dados Pessoais
Nome: Ana Paula Machado Bernardi
Data de nascimento: 05/12/1978
Naturalidade: Entre Ijuís – Rio Grande do Sul
Nacionalidade: Brasileira
Filiação: Mário Paulo Bernardi e Maria Lúcia Machado Bernardi
Dados Acadêmicos
1998/01: Ingresso no curso de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2000/01 – 2000/02: Monitoria da disciplina FAR01009 (Farmacognosia II) da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sob orientação da Profa. Dr. Raquel Bridi.
Órgão financiador: PIBIC-UFRGS
2001/01 – 2002/02: Bolsista de Iniciação Científica, vinculada ao projeto “Análise
química de espécies do gênero Hypericum nativas do Rio Grande do Sul”, sob
orientação da Profa. Dr. Gilsane Lino von Poser e desenvolvido no Laboratório de
Farmacognosia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Órgão financiador: PIBIC-UFRGS /CNPQ
2002/02: Obtenção do título de Farmacêutico pela Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
2003/01: Ingresso no curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, no
Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul.
Órgão finaciador: Bolsa de Mestrado CAPES
341
2004/02: Mudança de nível para o curso de Doutorado em Ciências Farmacêuticas, no
Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul.
Órgão finaciador: Bolsa de Doutorado CAPES
2004/02: Proficiência em língua estrangeira – Inglês
2006/01: Proficiência em língua estrangeira – Espanhol
P
UBLICAÇÕES
D
ALL’AGNOL, R.; FERRAZ, A.; BERNARDI, A. P.; ALBRING, D.; NÖR, C.; SARMENTO, L.; LAMB,
L.; HASS, M.; VON POSER, G.; SCHAPOVAL, E. E. S. Antimicrobial activity of some
Hypericum species. Phytomedicine, v. 10, p. 511-516, 2003.
B
ERNARDI, A. P. M.;FERRAZ, A. B. F.; ALBRING, D. V.; BORDIGNON, S. A. L.; SCHRIPSEMA, J.;
BRIDI, R.; DUTRA FILHO, C. S.; HENRIQUES, A. T.; VON POSER, G. Benzophenones from
Hypericum carinatum. Journal of Natural Products, v. 68, n. 5, p. 784-786, 2005.
F
ENNER, R.; SORTINO, M.; RATES, S. M. K.; DALL’AGNOL, R.; FERRAZ, A.; NOR, C.;
BERNARDI, A. P.; ALBRING, D.; SCHAPOVAL, E.; VON POSER, G. L.; ZACCHINO, S. Antifungal
activity of some Brazilian Hypericum species. Phytomedicine, v. 12, p. 236-240, 2005.
D
ALL’AGNOL, R.; FERRAZ, A.; BERNARDI, A. P.; ALBRING, D.; NÖR, C.; VON POSER, G.;
SCHAPOVAL, E. E. S. Bioassay guided isolation of antimicrobial benzopyrans and
phloroglucinol derivatives from Hypericum species. Phytoterapy Research, v. 19, p.
291-293, 2005.
B
ERNARDI, A. P. M.; MAURMANN, N.; RECH, S. B.; VON POSER, G. Benzopyrans in
Hypericum polyanthemum Klotzsch ex Reichardt cultured in vitro. Acta Physiologiae
Plantarum, disponível on line, 2007.
F
RITZ, D.; BERNARDI, A. P.; HAAS, J. S.; ASCOLI, B. M.; BORDIGNON, S. A. L.; VON POSER, G.
Germination and growth inhibitory effects of Hypericum myrianthum and H.
polyanthemum extracts on Lactuca sativa L. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.
17, n. 1, 2007.
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