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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - MESTRADO
LAURA MOREIRA DE ANDRADE REIS
ANÁLISE MOLECULAR DO GENE RECEPTOR DE ANDROGÊNIOS
EM GÊMEAS COM SÍNDROME DE INSENSIBILIDADE COMPLETA
ANDROGÊNICA
São Luís
2010
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LAURA MOREIRA DE ANDRADE REIS
ANÁLISE MOLECULAR DO GENE RECEPTOR DE ANDROGÊNIOS EM GÊMEAS
COM SÍNDROME DE INSENSIBILIDADE COMPLETA ANDROGÊNICA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da
Universidade Federal do Maranhão, para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Orientadora: Profª. Dra. Emygdia Rosa do
Rêgo Barros Pires Leal
Mesquita.
São Luís
2010
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Reis, Laura Moreira de Andrade
Análise Molecular do gene receptor de androgênios em
gêmeas com Síndrome de Insensibilidade Completa
Androgênica / Laura Moreira de Andrade Reis. ___ 2010.
62 folhas.
Impresso por computador (fotocópia).
Orientadora: Emygdia Rosa do Rêgo Barros Pires Leal
Mesquita.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Maranhão,
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2010.
1. Androgênios – Análise molecular 2. Diferenciação sexual –
Anomalias 3. Síndrome de Insensibilidade Completa
Androgênica 4. Mutações I. Título.
CDU: 577.175.6
LAURA MOREIRA DE ANDRADE REIS
ANÁLISE MOLECULAR DO GENE RECEPTOR DE ANDROGÊNIOS EM GÊMEAS
COM SÍNDROME DE INSENSIBILIDADE COMPLETA ANDROGÊNICA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da
Universidade Federal do Maranhão, para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Aprovada em: 20/05/2010
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Profª. Dra. Emygdia Rosa Leal Mesquita (Orientadora)
Doutora em Genética Molecular Humana
Universidade Federal do Maranhão
___________________________________________________
Profª. Dra. Cristina de Andrade Monteiro
Doutora em Genética
Instituto Federal do Maranhão
___________________________________________________
Profª. Dra. Maria Bethânia da Costa Chein
Doutora em Medicina (Ginecologia)
Universidade Federal do Maranhão
___________________________________________________
Prof. Dr. Manuel dos Santos Faria
Doutor em Endocrinologia
Universidade Federal do Maranhão
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, razão de tudo.
Aos meus pais, Elvina Maria e Luis Henrique, que sempre me mostraram
o valor da educação, sendo os maiores responsáveis pelas vitórias que conquistei e
por ter chegado até aqui de cabeça erguida.
À minha madrinha, segunda mãe, Luíza Sá, que devotou seu amor por
mim durante uma vida inteira, sempre presente em todos os momentos de minha
trajetória.
Aos meus irmãos, Álvaro Henrique, Luís Henrique e à minha cunhada
Jéssica Kiara, pelo amor, carinho, compreensão e amizade.
Ao meu marido, Pablo Reis, pela força e companheirismo; por ter
formatado esta dissertação; assistido às prévias de minhas apresentações (mesmo
sem entender nada, pois sua formação é Direito), pelas noites em claro enquanto eu
escrevia e por ter me ajudado a não desistir nos momentos mais críticos.
À minha outra família, João Henrique, Maria Ivonete, Alyce Kelly, Alyne
Bianka, Adriana Silveira e Gilanielton Andrade, pela convivência diária, pelo
aconchego e por me receberem com tanto carinho. Aos meus comprades Kercyo
Wembley e Kairo Clay, pela amizade e companheirismo ao longo desses anos.
Aos meus pequenos amores Renata Andrade, Leonardo Henrique,
Pollyana Letícia e Emanuelle Reis, pelo carinho, pela inocência e pela alegria que
me proporcionaram.
À Dra Ana Lígia, pelas aulas de clínica médica, pelo companheirismo e
por me transmitir calma e serenidade nos momentos mais difíceis; ao Msc. Marcelo
Andrade, que apesar de não poder ter sido meu co-orientador agiu como tal, sempre
me acompanhando nessa longa e difícil jornada.
Aos doutores Lívio Martins e Manuel Faria, pelas valiosas sugestões na
banca de qualificação que contribuíram para a melhoria deste estudo, pelos
ensinamentos e por acreditarem nesse trabalho.
Em especial, à Profa. Dra. Emygdia Rosa, por me conceder mais esta
oportunidade em trabalhar com genética e biologia molecular, pela atenção dada
sempre que precisei tirar as dúvidas, que não foram poucas; pela maneira como
conduziu a orientação deste trabalho, com experiência e sempre com muito carinho,
pela paciência e principalmente pelo entusiasmo.
Ao Doutor Gutemberg Araújo, que possibilitou o desenvolvimento deste
estudo, reconhecendo o valor da pesquisa científica no Estado do Maranhão.
À Dra. Maria Bethânia e à Dra. Cristina Monteiro, membros da banca de
defesa, que contribuíram de forma valiosa para o aperfeiçoamento deste trabalho,
pela gentileza, carinho e atenção.
À minhas grandes amigas, Jarlene Nina, Andréya Márcya, Emanuela
Rodrigues e Letícia Cardoso e as amigas de infância Ediane Leão, Elaine Leão,
Larissa Vidigal, Mariana Queiroz, Ester Queiroz, Ilca Chaves e Renata Aguiar.
À todos os meus familiares, em especial às minhas avós Zeca e Zizé (in
memoria), ao avô Álvaro Cândido (in memoria), aos meus tios-avós Annibal Andrade
e Maria Amélia Andrade; aos meus tios paternos e maternos e aos primos que
fizeram parte intensamente de minha infância.
Em especial aos amigos Alexsandro dos Santos, Bruno Almeida e
Sulayne Araújo, que estiveram ao meu lado durante os experimentos de laboratório
e que ajudaram bastante de diferentes formas, mas com contribuições igualmente
importantes.
Aos professores, supervisores e alunos do CINTRA.
Aos colegas da UFMA e da UEMA, Patrícia Azevedo, Raquel Fonteles,
Israel Nascimento, Gabriel Vasconcelos, Gildevan Lopes, Emílio Júnior, Aldenise
Martins, Ariane Chaves, Roberta Cantanhêde e Dayanne Chaves.
À todos os colegas do Laboratório de Estudos Genômicos e de
Histocompatibilidade - LEGH, Fernando Patrício, Fábio França, Ellen Caroline,
Patrícia Ribeiro, Roxana Veras, Fabiano Monteles, Fernanda Ferreira, Cícero Júnior,
Carol Malcher, Maxwellem de Jesus, Leidyane Guimarães, Amanda Vidal, Max
Diego e Milton Júnior que ao longo desta jornada, souberam ser amigos leais.
Aos meus colegas da Vigilância em Saúde Ambiental – VISA, do
município de São Luís, Ana Tereza, Cristiane Arcângela, Damásio Bulcão, Larize
Kelly, Luciana Bastos, Fúlvia Maranhão, Odiléia Silva, Sérgio Luís, Thayanne
D’Angelis e Walteir Caldas, por compartilharem diariamente as aflições e conquistas
nessa minha nova jornada.
À todos os colegas do mestrado, em especial, Geísa Beltrão, Ahirlan
Castro, Afonso Abreu, Janalle Rocha, Ademilton Costa e Ricardo Villar.
À FAPEMA pelo apoio financeiro.
Para meus amigos e minha família
Para nós, foi um grande alívio compreender a
Síndrome de Insensibilidade aos Androgênios -
AIS, pois muitos sentimentos de “ser diferente”
desapareceram, nos ajudando a saber que a
nossa condição incomum tem um nome e que há
outras pessoas no mundo que sabem o que é
sofrer com os efeitos dessa síndrome. Parece ser
mais fácil aceitar a verdade do que meias-
verdades e perguntas sem respostas. Afinal, é o
nosso corpo!
Kylie e Jocelyn
(pacientes AIS)
RESUMO
A síndrome de insensibilidade completa aos androgênios (CAIS) é uma doença com
herança recessiva ligada ao cromossomo X, que afeta pacientes com cariótipo 46,
XY, causada por uma alteração no gene receptor de androgênios. Essa alteração
bloqueia a resposta aos hormônios masculinos durante o desenvolvimento fetal e
após o nascimento, tornando o indivíduo insensível à presença de androgênios.
Foram estudadas duas gêmeas monozigóticas com cinco anos de idade. As
pacientes foram atendidas em uma Clínica particular de Endocrinologia
apresentando ausência de útero e anexos, cariótipo 46, XY, genitália externa
feminina e já haviam sido submetidas à gonadectomia sem exames hormonais
prévios. A análise molecular do gene receptor de androgênios (AR) revelou uma
mutação do tipo nonsense no exon 5, levando à substituição de uma citosina por
uma timina na posição 752 da proteína receptora androgênica. Mutações que
interferem prematuramente na transcrição do gene AR, como a que foi descrita
nesse estudo, originam proteínas truncadas que não podem se ligar aos
androgênios, resultando em CAIS. Esse é o terceiro caso de CAIS em gêmeas
monozigóticas com investigação molecular na literatura.
Palavras-chave: Anomalias da diferenciação sexual. Síndrome de insensibilidade
completa aos androgênios. Receptor de androgênios. Mutação.
ABSTRACT
Complete androgen insensitivity syndrome (CAIS) is a X-linked recessive disorder,
that affects patients with 46, XY, karyotype, caused by mutations in the androgen
receptor gene (AR). This change prevents the response to male hormones, during
fetal development and after birth, making the individual insensitive to the presence of
androgens. We studied two five year-old monozygotic twin-sisters. Pacients were
treated in private Practice of Endocrinology and presented absence of Müllerian duct
derived structures, 46, XY karyotype, female external genitalia and were submitted to
gonadectomy previously without prior hormonal tests. The molecular analysis
identified a nonsense mutation in androgen receptor gene of exon 5 that changed a
cytosine to a timine at position 752 of androgen receptor protein. Mutations like
premature termination codons that interfere AR gene transcription, as described in
this study, give rise to truncated proteins can not bind to androgen resulting in CAIS.
This is the third case of CAIS occurence in monozygotic twins with molecular
investigation in the literature.
Key-words: Disorders of Sex Development; Complete androgen insensitivity
syndrome; Androgen receptor; Mutation.
.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Eletroferogramas indicando a substituição de uma citosina por uma
timina no nucleotídeo 2616 do exon 5 que corresponde à posição
752 da proteína AR ...........................................................................
35
LISTA DE SIGLAS
AIS
Síndrome de insensibilidade aos androgênios (androgen insensitivity
syndrome)
AR
Receptor de androgênios (androgen receptor)
CAIS
Síndrome de insensibilidade completa aos androgênios (complete
androgen insensitivity syndrome)
cDNA
DNA complementar (complementary DNA)
DBD
Domínio de ligação ao DNA (DNA binding domain)
DSD
Anomalias da diferenciação sexual - ADS (disorders of sex development)
DHT
Dihidrotestosterona (dihydrotestosterone)
HAM
Hormônio anti-Mülleriano (anti-Müllerian hormone)
hCG
Gonadotrofina coriônica humana (human chorionic gonadotropin)
Insl3
Insulina 3 (insulin-like factor 3)
LBD
Domínio de ligação aos androgênios (ligand binding domain)
LH
Hormônio luteinizante (luteinizant hormone)
MAIS
Síndrome de insensibilidade discreta aos androgênios (mild androgen
insensitivity syndrome)
NTD
Domínio amino-terminal (N-terminal domain)
PAIS
Síndrome de insensibilidade parcial aos androgênios (parcial androgen
insensitivity syndrome)
SRY
Região de determinação sexual no cromossomo Y (sex-determining region
on the Y chromosome)
T
Testosterona (testosterone)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................12
1.1 Anomalias da diferenciação sexual..............................................................12
1.2 Androgênios ...................................................................................................12
1.3 Etapas da diferenciação sexual masculina..................................................13
1.3.1 Determinação do sexo cromossômico........................................................13
1.3.2 Determinação do sexo gonadal..................................................................14
1.3.3 Diferenciação da genitália interna e externa ..............................................14
1.4 Cromossomo Y e gene SRY ..........................................................................15
1.5 Síndrome de insensibilidade aos androgênios ...........................................15
1.6 Síndrome de insensibilidade completa aos androgênios...........................16
1.7 Gene receptor de androgênios .....................................................................18
1.7.1 Domínios da proteína AR ...........................................................................19
1.7.2 Mutações no gene AR................................................................................20
JUSTIFICATIVA.....................................................................................................22
2 OBJETIVOS...........................................................................................................23
2.1 Geral ................................................................................................................23
2.2 Específico .......................................................................................................23
3 CAPÍTULO 1..........................................................................................................24
ABSTRACT............................................................................................................25
3.1 Introdução.......................................................................................................25
3.2 Material e Métodos .........................................................................................27
3.2.1 Pacientes....................................................................................................27
3.2.2 Análise de mutações no gene AR ..............................................................27
3.2.3 Comitê de Ética ..........................................................................................28
3.3 Resultados e Discussão ................................................................................28
Agradecimentos ...................................................................................................30
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................35
REFERÊNCIAS.........................................................................................................36
APÊNDICE................................................................................................................42
APÊNDICE A – Heredograma...................................................................................43
ANEXOS ...................................................................................................................44
ANEXO A – Instruções para autores.........................................................................45
ANEXO B – Cariótipo da paciente 1..........................................................................58
ANEXO C – Cariótipo da paciente 2 .........................................................................59
ANEXO D – Biópsia da gônada da paciente 2 ..........................................................60
ANEXO E – Ultrassonografia de abdômen total da paciente 1 .................................61
ANEXO F – Ultrassonografia de abdômen total da paciente 2 .................................62
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Anomalias da diferenciação sexual
A síndrome de insensibilidade aos androgênios é uma doença causada
pela presença de mutações no gene receptor de androgênios (AR – Androgen
receptor), localizado em Xq11-12, que afeta indivíduos 46, XY. O defeito molecular
causa uma variedade fenotípica relacionada à diferenciação sexual, desde
infertilidade com ginecomastia até um fenótipo feminino completo (CAIS – Complete
androgen insensitivity syndrome) (DEEB, 2005; RADPOUR, 2009).
O termo “anomalias da diferenciação sexual” (ADS) foi definido no
Consenso de Chicago em 2005, e inclui condições congênitas nas quais o
desenvolvimento do sexo cromossômico, gonádico ou anatômico é atípico. O termo
pseudohermafroditismo masculino, intersexo e sexo reverso que anteriormente
eram utilizados, não eram bem aceitos pelos pacientes e o consenso para as
desordens do intersexo recomendou essa nova nomenclatura (DAMIANI; GUERRA-
JÚNIOR, 2007; MENDONÇA et al., 2009).
As anomalias da diferenciação sexual do tipo 46, XY são definidas como
uma condição de masculinização incompleta da genitália externa fetal em um
indivíduo 46, XY, cariotipicamente normal. Diversas desordens genéticas resultam
em anomalia da diferenciação sexual 46, XY, como distúrbios da determinação
gonadal, distúrbios da função testicular, distúrbios dos tecidos-alvo dependentes de
androgênios ou causa idiopática (BROWN et al., 1988; DAMIANI; GUERRA-
JÚNIOR, 2007).
Dentre as etiologias dos distúrbios dos tecidos-alvo dependentes de
androgênios estão a deficiência da 5α-redutase tipo 2 e a síndrome de
insensibilidade aos androgênios (DAMIANI et al., 2001).
1.2 Androgênios
Os androgênios são importantes hormônios esteróides responsáveis pela
expressão do fenótipo masculino, atuando na diferenciação sexual, no
desenvolvimento e manutenção dos caracteres sexuais secundários e na iniciação e
manutenção da espermatogênese (BRINKMANN, 2001).
13
Dentre os androgênios mais importantes estão a testosterona (T –
testosterone), diretamente envolvida no desenvolvimento e diferenciação das
estruturas derivadas dos ductos de Wolff, e a 5α-dihidrotestoterona (DHT –
dihydrotestosterone), um derivado da testosterona relacionado ao desenvolvimento
da próstata e da uretra prostática a partir do seio urogenital e com a masculinização
da genitália externa (GUERRA-JÚNIOR; HACKEL, 2002).
Para desempenharem suas funções fisiológicas, tanto a T como a DHT
ligam-se ao mesmo receptor no núcleo das células-alvo, denominado receptor de
androgênios, originado o complexo hormônio-receptor. Esse complexo sofre uma
mudança conformacional onde ocorre dimerização, fosforilação, transporte nuclear,
ligação à sequência específica do DNA em várias regiões promotoras ou
reguladoras do gene, e consequente regulação da transcrição dos genes-alvo de
resposta aos androgênios (ZUCCARELLO et al., 2008; NICHOLS et al., 2009).
1.3 Etapas da diferenciação sexual masculina
A diferenciação sexual masculina normal depende da progressão de
estágios distintos do desenvolvimento que envolve o estabelecimento do sexo
cromossômico masculino no momento da fertilização, a ativação de uma cascata de
genes indutores da diferenciação da gônada primitiva bipotencial em testículo e a
diferenciação da genitália interna e externa mediada por hormônios ou fatores
testiculares. Até a 6ª semana de gestação, independente do sexo cromossômico, os
embriões apresentam gônadas primordiais bipotenciais, genitália externa
indiferenciada e dois conjuntos de ductos genitais internos: os ductos de Wolff e os
ductos de Müller (QUIGLEY, 1995; MELO et al., 2005).
1.3.1 Determinação do sexo cromossômico
O primeiro estágio de determinação sexual é a determinação do sexo
cromossômico, que ocorre no momento da fertilização (46, XY).
14
1.3.2 Determinação do sexo gonadal
A progressão da gônada embrionária indiferenciada em testículo para
determinação do sexo gonadal é mediada pela região de determinação sexual no
cromossomo Y- gene SRY (Sex-determining region on the Y chromosome),
iniciando-se na 6ª ou 7ª semana de gestação (MELO et al., 2005).
1.3.3 Diferenciação da genitália interna e externa
A diferenciação das genitálias interna e externa no sexo masculino é um
processo dependente da produção de hormônios sexuais pelo testículo. No sexo
feminino esse processo independe dos hormônios ovarianos. Portanto, a
diferenciação sexual é gônada-dependente apenas nos homens (DOMENICE et al.,
2002).
O desenvolvimento do fenótipo masculino (incluindo a descida testicular
até a bolsa escrotal) requer a produção normal de três hormônios testiculares:
hormônio anti-mülleriano (AMH – anti-Müllerian hormone), androgênios e fator de
insulina 3 (Insl3 – insulin-like factor 3). Por outro lado, no sexo feminino, a ausência
da produção desses hormônios determina a diferenciação sexual feminina
(DOMENICE et al., 2002).
As células de Sertoli, presentes nos testículos, secretam o AMH, que
promove a apoptose das células dos ductos de Müller evitando que se diferencie em
fímbrias, tubas uterinas, útero e terço proximal da vagina. Já as células de Leydig,
iniciam a produção de testosterona, para diferenciação da genitália interna,
estimuladas pela gonadotrofina coriônica humana (hCG – human chorionic
gonadotropin), induzindo a diferenciação dos ductos de Wolff em epidídimo, ducto
deferente, vesículas seminais e ducto ejaculatório entre a 9ª e 13ª semanas de
gestação (QUIGLEY, 1995; DAMIANI et al., 2001; PATRÃO et al., 2009).
Enquanto isso, a conversão da T em DHT pela enzima 5α-redutase tipo 2,
leva à masculinização da genitália externa. Sob a ação da DHT, o tubérculo genital
se diferencia em glande do pênis, as pregas urogenitais em corpo do pênis, as
pregas lábio-escrotais em bolsa escrotal e o seio urogenital em próstata
(DOMENICE et al., 2002).
15
Distúrbios da produção ou ação dos androgênios durante esse período
crítico de diferenciação resultam em resistência hormonal e falha na completa
masculinização da genitália interna e externa (GUERRA-JÚNIOR; HACKEL, 2002).
1.4 Cromossomo Y e gene SRY
A determinação testicular foi inicialmente relacionada à existência do gene
SRY, localizado no braço curto do cromossomo Y, que foi identificado a partir do
mapeamento de sequências Y- específicas em indivíduos portadores de alterações
estruturais desse cromossomo (MELO et al., 2005).
Entretanto, a identificação do gene SRY como determinante do sexo
masculino, não esclareceu totalmente o problema da determinação gonadal, porque
logo ficou aparente que o controle da gonadogênese é um processo muito mais
complexo, e que deve haver um número indefinido de genes autossômicos ou
ligados ao X que atuam antes (upstream genes) e depois (downstream genes) da
determinação testicular (DAMIANI et al., 2001).
Um exemplo disso é o gene receptor de androgênios, que está situado no
cromossomo X. Defeitos nesse gene estão diretamente envolvidos em três situações
patológicas: síndrome de insensibilidade aos androgênios (AIS – androgen
insensitivity syndrome), atrofia muscular bulbo-espinhal e câncer de próstata
(CORRÊA et al., 2005).
1.5 Síndrome de insensibilidade aos androgênios
A Síndrome de Insensibilidade aos androgênios (AIS) é causada por uma
alteração em um gene que bloqueia a resposta aos hormônios masculinos durante o
desenvolvimento fetal e após o nascimento, tornando o indivíduo insensível à
presença de androgênios. O desenvolvimento masculino que deveria ocorrer na
presença de um gene normal é impossível e o corpo pode responder aos hormônios
feminizantes, variando desde infertilidade com ginecomastia até fenótipo feminino
completo (LUBAHN et al., 1989; WARNE, 1997; DEEB et al., 2005).
É uma doença com herança recessiva ligada ao cromossomo X, que afeta
pacientes com cariótipo 46, XY, e está associada a mutações dentro da linhagem
germinativa do gene AR, classificando-se em três fenótipos clínicos: completa (CAIS
16
– complete androgen insensitivity syndrome), parcial (PAIS – partial androgen
insensitivity syndrome) ou discreta (MAIS – mild androgen insensitivity syndrome)
(BRINKMANN, 2001; MOONEY et al., 2003; SCOTT et al., 2006).
1.6 Síndrome de insensibilidade completa aos androgênios
CAIS é caracterizada por um fenótipo externo completamente feminino,
exceto pela redução ou ausência de pêlos pubianos e axilares. PAIS apresenta uma
gama de fenótipos que variam desde um fenótipo externo feminino com algum grau
de virilização, como cliteromegalia ou fusão labial, até um fenótipo externo masculino
com variadas anormalidades na genitália externa, o qual inclui hipospadias,
microfalo e criptorquidismo. MAIS apresenta virilização e fertilidade reduzidas, mas
possui um fenótipo externo masculino normal (RAJENDER et al., 2008; TADOKORO
et al., 2009).
Existe uma tendência intrínseca das estruturas, tanto gonadais quanto dos
ductos internos e da genitália externa, a seguir um caminho para o sexo feminino.
Assim, a diferenciação para o sexo masculino exige a atuação ativa, em momentos
decisivos, de fatores envolvidos no processo de diferenciação sexual (DAMIANI et
al., 2001).
Na síndrome de insensibilidade completa aos androgênios os testículos
secretam normalmente testosterona na vida fetal e na puberdade. Porém, tanto a
genitália quanto os outros órgãos-alvo não respondem aos androgênios. Além disso,
o eixo hipotálamo-hipofisário também não tem sensibilidade aos androgênios,
levando a um aumento do hormônio luteinizante (LH – luteinizant hormone). Esse
hormônio causa, na puberdade, grandes incrementos da produção de estradiol pelo
testículo. É por isso que a AIS também é conhecida como Síndrome de Feminização
Testicular (DAMIANI et al., 2001; GUERRA-JÚNIOR; HACKEL, 2002).
O primeiro relato foi publicado em 1953 pelo obstetra Jhon Morris, que a
denominou inicialmente como Síndrome de Morris. Nesse estudo, ele descreveu 82
casos que apresentaram ausência de ductos genitais internos (os ductos de Wolff
regridem pela falta de ação da testosterona e os de Müller, pela ação normal do
hormônio anti-mülleriano), vagina em fundo cego e genitália externa feminina
normal, exceto pela frequente presença de gônadas inguinais ou labioescrotais
(MORRIS, 1953; QUIGLEY, 1995; SOLARI et al., 2008).
17
CAIS é, portanto, caracterizada pela presença de genitália externa
feminina, vagina curta terminando em fundo cego, genitália interna com ausência
dos derivados dos ductos de Wolff e de Müller, desenvolvimento de ginecomastia na
puberdade e ausência de pêlos pubianos ou axilares. Os testículos estão localizados
no abdômen ou canal inguinal, ou menos frequentemente nos grandes lábios. Na
histologia, os testículos apresentam características de testículos criptórquicos, sem
espermatogênese (CORRÊA et al., 2005).
Indivíduos com a forma completa de AIS têm excelente feminização na
puberdade, com mamas normais ou aumentadas, contornos corporais femininos e
ausência de acne, devido à produção de estrógeno pelos testículos e pela
aromatização periférica da testosterona. A idade de início do desenvolvimento das
mamas ainda não foi muito estudada, mas se têm relatos de desenvolvimento tardio
em algumas pacientes, com o início mais consistente com o da puberdade em
homens (MELO, et al. 2005; GALANI et al., 2008).
Devido à atuação normal das células de Sertoli nessas pacientes, o HAM
é produzido pelos testículos resultando na inibição do desenvolvimento do útero e
tubas uterinas. Os androgênios, o receptor de androgênios e o hormônio Insl3 são
importantes no processo de descida dos testículos, sendo que o Insl3, produzido
pelas células de Leydig, controla a primeira fase de descida das gônadas via
crescimento do gubernáculo, da região intra-abdominal para a região inguinal,
enquanto que os androgênios controlam a descida final das gônadas para dentro da
bolsa escrotal (RADPOUR et al., 2007; OAKES et al., 2008).
É por isso que essas pacientes apresentam frequentemente gônadas
inguinais palpáveis, devido a não absorção dos androgênios, os quais são
responsáveis pela segunda etapa de descida dos testículos.
CAIS é uma condição rara, com prevalência estimada entre 1:20.000 e
1:99.000 nascidos do sexo masculino. Apesar do padrão de herança ser recessivo
ligado ao cromossomo X, cerca de 30% das mutações são esporádicas (mutação de
novo). A taxa de incidência de CAIS em uma criança com hérnia inguinal
premenarca é de 1,1%, enquanto que 80-90% das garotas com CAIS desenvolvem
eventualmente uma hérnia inguinal. Não existe na literatura nenhum estudo
relatando diferença na prevalência baseada na etnia ou geografia (OAKES et al,
2008; MENDONÇA et al., 2009).
18
O diagnóstico preciso requer uma investigação clínica, hormonal, exames
de imagem e análise molecular e é de grande importância para auxiliar na
determinação do gênero e no tratamento em geral, podendo ser realizado intra-
útero, pela discrepância entre o cariótipo 46, XY, e a genitália externa feminina, ao
nascimento ou durante a infância, pela presença de massa inguinal ou labioescrotal,
ou ainda na puberdade por amenorréia primária e escassez de pêlos. A ausência de
útero pode ser confirmada pela ultrassonografia pélvica (GUERRA-JÚNIOR;
HACKEL, 2002; OAKES et al., 2008; GALANI et al., 2008).
Embora as taxas de disgerminoma e gonadoblastoma em disgenesia
gonadal XY e disgenesia gonadal mista 46, XY; 45, XO sejam de 15-30%, a
ocorrência de tumores antes da puberdade em CAIS é raro, pois os testículos são
normais (exceto pela sua localização) e não disgenéticos. Estudos recentes revelam
uma incidência de 0,8% de tumores em CAIS e 5,5% em todos os pacientes AIS.
(RAJPERT-DEMEYTES, 2006; OAKES et al., 2008).
Embora não haja consenso na literatura, alguns autores defendem que
devido à baixa incidência de tumores, a recomendação é remover as gônadas
somente após o término espontâneo da puberdade, ou seja, em crianças com CAIS
nenhuma terapia imediata é necessária, desde que haja a preservação de pelo
menos uma das gônadas. Entretanto, se exames histopatológicos demonstrarem
indícios de carcinoma ou neoplasias antes da puberdade ou se forem fisicamente ou
esteticamente desconfortáveis para a paciente, os testículos deverão ser removidos
e a puberdade induzida por hormônios exógenos (OAKES et al., 2008).
Em pacientes adultas com as mamas já desenvolvidas, o procedimento
mais indicado é a gonadectomia. Carcinoma in situ e seminoma são as neoplasias
mais frequentemente relatadas em pacientes CAIS depois dos 18 anos e atinge
cerca de 33% aos 50 anos de idade. Depois da retirada das gônadas, deve ser feita
a reposição hormonal com estrogênio via oral ou transdermal (COOLS et al., 2006;
CHEIKHELARD et al., 2008).
1.7 Gene receptor de androgênios
O DNA complementar (cDNA – complementary DNA) que codifica o gene
AR humano foi clonado em 1988 e localizado no braço longo do cromossomo X,
mais precisamente em Xq11-12. Esse gene faz parte de uma família de fatores de
19
transcrição nuclear que inclui os receptores de estrógeno, do hormônio tireoidiano,
da vitamina D, do ácido retinóico, de glicocorticóide, de mineralocorticóide e da
progesterona (BROWN et al., 1988; YONG et al., 2003; CORRÊA et al., 2005;
SCOTT et al., 2006).
O gene AR possui 8 exons e codifica uma proteína de 110KDa com cerca
de 919 aminoácidos. A proteína está organizada em quatro domínios estruturais
principais: um domínio amino-terminal regulador da transcrição (NTD – N-terminal
domain) um domínio de ligação ao DNA (DBD – DNA binding domain) com clássicos
dedos de zinco na região proximal e distal, uma região dobradiça (hinge) e um
domínio de ligação aos androgênios (LBD – ligand binding domain) (CORRÊA et. al.,
2005).
1.7.1 Domínios da proteína AR
O domínio amino-terminal é codificado pelo exon 1 e está principalmente
envolvido na regulação da transcrição dos genes-alvo. Corresponde a mais da
metade da proteína AR, sendo o domínio menos homólogo e o mais variável no
tamanho. Isso se deve à presença de duas regiões altamente polimórficas de
poliglutamina (CAG) e poliglicina (GGN) (MELO et al., 2005).
A expansão da repetição CAG para 40-65 resíduos está associada à
atrofia muscular bulbo espinhal (Doença de Kennedy) e parece não afetar a
afinidade de ligação aos androgênios, mas pode causar diminuição na atividade
transcricional do receptor. Foi proposto que a atividade transcricional do AR é
inversamente proporcional à extensão de repetição de glutaminas (RAJENDER et
al., 2008).
O domínio de ligação ao DNA é codificado pelos exons 2 e 3, sendo a
parte mais conservada da molécula receptora, a qual determina a especificidade da
interação do AR com o DNA. O DBD consiste de dois grupos de zinco: um está
envolvido diretamente na ligação ao DNA para o reconhecimento específico do
elemento de resposta ao androgênio, enquanto que o outro está implicado na
interação proteína-proteína e serve como unidade de estabilização para a
dimerização de duas moléculas receptoras (GALANI et al., 2008).
O domínio de ligação aos androgênios é composto pela porção 3’ do exon
4 juntamente com os exons 5, 6, 7 e 8. Além disso, essa região está também
20
envolvida na localização do núcleo, dimerização do receptor e interação com outras
proteínas. Entre o DBD e o LDB está a região dobradiça (hinge) (codificada pela
região 5’ do exon 4), a qual contém a maior parte do sinal de ligação ao AR nuclear
e controla a transferência do AR do citoplasma para o seu sítio de ação no núcleo
(GALANI et al., 2008).
1.7.2 Mutações no gene AR
Cerca de 300 mutações diferentes no gene AR já foram descritas na
literatura e podem ser divididas em duas categorias principais: a primeira
compreende as mutações que interrompem ou alteram substancialmente a
sequência primária da proteína e podem ser causadas pela introdução de codons de
parada prematura (stop codon), por inserções ou deleções de nucleotídeos que
conduzem a alteração no quadro de leitura (frameshift), por alterações no
mecanismo de splicing do RNA, ou ainda por deleções de grandes segmentos do
gene; a segunda categoria compreende as mutações que levam a substituição de
aminoácidos isolados na proteína receptora (AHMED et al., 2000; GUERRA-
JÚNIOR; HACKEL, 2002).
Quando mutações esporádicas ocorrem depois do estágio zigótico,
resultam em mosaicismo somático, acarretando em diferentes proporções de células
contendo as proteínas do tipo selvagem e mutante em vários tecidos do mesmo
indivíduo. A presença de mosaicismo tem um importante impacto para pacientes
com AIS, tornando possível a virilização após o nascimento (KOHLER et al., 2005).
Nos pacientes CAIS não é esperado que epidídimo e vasos deferentes
estejam presentes devido à inatividade completa do gene AR. Entretanto, estruturas
derivadas dos ductos de Wolff já foram descritas em pacientes CAIS portadoras de
mosaicismo. Estudos demonstraram que mutações de alteração da matriz de leitura,
stop codon prematuros e mutações na região do domínio de ligação ao DNA foram
associadas à ausência de ductos de Wolff, enquanto que pacientes que
apresentaram estruturas remanescentes desses ductos tinham um substituição
simples em um único aminoácido (HANNEMA et al., 2004).
A deleção completa do gene receptor de androgênios foi encontrada em
apenas 1% dos pacientes e deleções parciais em 7%. Anormalidades em splicings e
terminação prematura de codons foram relatadas em 2% e 7% respectivamente. A
21
mutação mais comum é a do tipo sentido trocado (missense), em torno de 80%. A
maioria das mutações ocorrem nos exons 2-8, com um grande número de mutações
relatadas em ambos os exons 5 e 7, pouquíssimas no exon 1, e nenhuma na região
hinge (NICHOLS et al., 2009).
As substituições de nucleotídeos que causam a mudança de um
aminoácido na proteína do AR podem ser divididas em duas grandes categorias: 1)
mutações no domínio de ligação ao DNA, originando ARs mutantes, que se ligam
normalmente aos androgênios, mas apresentam capacidade diminuída de ligação às
sequências dos genes de resposta aos andrógenos; e 2) mutações no domínio de
ligação aos androgênios, resultando em uma variedade de alterações na capacidade
do AR de ligar-se a esses hormônios. Em uma pequena proporção destas mutações,
o AR mutante torna-se totalmente incapaz de ligar-se aos androgênios,
provavelmente por alterações na estrutura da proteína (MELO et al., 2005).
O impacto funcional observado em mutações no gene AR depende do
locus exato na sequência do gene. Mutações no NTD (exon 1 do gene) não ocorrem
frequentemente e a grande maioria resulta em stop codon ou terminação prematura
devido à alteração da matriz de leitura por uma inserção ou deleção de nucleotídeos.
O LBD, o qual é codificado por menos da metade do gene AR, é o local da maioria
das mutações já identificadas e em sua vasta maioria são substituições simples de
bases (GALANI et al., 2008).
O reconhecimento da alteração molecular do gene AR permite que sejam
realizados estudos pré ou pós-natais para a detecção de portadores da alteração, ou
seja, mulheres heterozigotas e homens hemizigotos (afetados). Uma mulher
portadora tem 50% de risco de ter, entre os filhos do sexo masculino, um menino
afetado e entre as filhas, há 50% de risco de serem portadoras (GUERRA-JÚNIOR;
HACKEL, 2002).
A presença de famílias com mais de uma paciente afetada é
conseqüência, possivelmente, da ausência de um diagnóstico prévio. O diagnóstico
precoce é importante para o aconselhamento genético correto e oportuno, bem
como para a utilização de uma terapia adequada (SOLARI et al., 2008).
22
JUSTIFICATIVA
A elucidação da ação dos androgênios mediada pelos receptores
permite uma melhor compreensão dos processos fisiológicos, particularmente no
período da maturação e desenvolvimento sexual, bem como para a fertilidade
masculina. Além disso, auxilia no esclarecimento de defeitos associados à
diferenciação sexual e/ou infertilidade.
CAIS é considerada uma doença rara, e é de grande importância estudá-
la, pois contribuirá para identificar a base molecular em famílias, tendo implicações
no tratamento clínico e aconselhamento genético dos indivíduos e familiares.
No Brasil, apesar de dezenove mutações distintas no AR já terem sido
descritas em 31 pacientes brasileiros, apenas um caso já foi descrito em gêmeas
monozigóticas. No Maranhão, este é o primeiro caso de investigação molecular em
pacientes com Síndrome de insensibilidade completa aos androgênios.
Este estudo faz parte de um projeto de pesquisa mais amplo intitulado
“Estudo molecular do gene receptor de androgênios em famílias brasileiras com
insensibilidade aos androgênios” envolvendo outros pesquisadores, como médicos
endocrinologistas, geneticistas e alunos do doutorado da Rede Nordeste de
Biotecnologia – RENORBIO, e vem sendo desenvolvido no Laboratório de Estudos
Genômicos e de Histocompatibilidade - LEGH. O caso índice levou à investigação
clínica e molecular em outros membros da família ainda em estudo (Apêndice A).
23
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Investigar a presença de mutações no gene AR em duas pacientes
gemelares homozigóticas com suspeita clínica de Síndrome de Insensibilidade
Completa aos Androgênios.
2.2 Específico
• Analisar os exons 5, 6 e 7 do gene AR das pacientes através do
sequenciamento automático;
• Fazer a correlação genótipo-fenótipo das pacientes.
24
3 CAPÍTULO 1
Artigo formatado conforme instruções da revista The Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism (Anexo A). Fator de Impacto: 6.325
MUTAÇÃO R752X NO GENE RECEPTOR DE ANDROGÊNIOS EM GÊMEAS
1
MONOZIGÓTICAS COM SÍNDROME DE INSENSIBILIDADE COMPLETA AOS
2
ANDROGÊNIOS
3
R752X MUTATION IN THE ANDROGEN RECEPTOR GENE IN MONOZYGOTIC TWINS
4
WITH COMPLETE ANDROGEN INSENSITIVITY SYNDROME
5
Laura Moreira de Andrade Reis
∗
, Emygdia Rosa do Rêgo Barros Pires
Leal Mesquita
∗
†
6
∗
Laboratório de Estudos Genômicos e de Histocompatibilidade.
7
†
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão.
8
Título abreviado: Mutação R752X no gene AR em gêmeas com CAIS.
9
Palavras-chaves: anomalias da diferenciação sexual; síndrome de insensibilidade completa aos
10
androgênios; mutação no receptor de androgênios.
11
Número de palavras: 2.269
12
Autora: Laura Moreira de Andrade Reis, Laboratório de Estudos Genômicos e de
13
Histocompatibilidade – LEGH, Hospital Universitário da Universidade Federal do Maranhão –
14
HUUFMA, Unidade Materno Infantil/Cobertura. Rua dos Prazeres, 215 – Centro. São Luís – MA
15
CEP: 65020-468 Fone: (098) 2109-1265 Fax: (098) 2109-1258. Email: lauramareis@gmail.com
16
Sinopse: Análise molecular por sequenciamento no gene receptor de androgênios em gêmeas
17
monozigóticas revelou a mutação stop codon R752X como causa de CAIS.
18
25
ABSTRACT
19
Context: Complete androgen insensitivity syndrome (CAIS) is a X-linked recessive disorder, that
20
affects patients with 46, XY, karyotype, caused by mutations in the androgen receptor gene (AR). This
21
change prevents the response to male hormones, during fetal development and after birth, making the
22
individual insensitive to the presence of androgens.
23
Objective: The aim of this study was to
investigate the presence of mutations in the androgen receptor
24
gene and correlate genotype and fenotype in patients with clinical suspicion of complete androgen
25
insensitivity syndrome.
26
Design: Case report of monozygotic twins with R752X mutation in CAIS.
27
Setting: This study was conducted in private Practice of Endocrinology.
28
Patients: We studied two five years-old monozygotic twin-sisters that were submitted to
29
gonadectomy, with 46, XY, karyotype, female external genitalia and absence of Müllerian duct
30
derived structures.
31
Results: The molecular analysis identified a nonsense mutation in ligand-binding domain at codon
32
752 of exon 5 of AR gene that changed an arginine (CAG) to a stop codon (TAG) at position 2616 of
33
androgen receptor protein.
34
Conclusions: Mutations like premature termination codons that interfere AR gene transcription, as
35
described in this study, give rise to truncated proteins that can not bind to androgen receptor resulting
36
in CAIS. This is the third case of CAIS occurrence in monozygotic twins with molecular investigation
37
in the literature.
38
Key-words: disorders of sex development; complete androgen insensitivity syndrome; androgen
39
receptor mutation.
40
3.1 Introdução
41
As anomalias da diferenciação sexual do tipo 46, XY, são definidas como uma condição de
42
masculinização incompleta da genitália externa fetal em um indivíduo cariotipicamente normal.
43
Diversas desordens genéticas resultam em anomalia da diferenciação sexual 46, XY, tais como,
44
distúrbios da determinação gonadal, da função testicular e dos tecidos-alvo dependentes de
45
androgênios (1). Os androgênios mais importantes são a testosterona (T), diretamente envolvida no
46
26
desenvolvimento e diferenciação das estruturas derivadas dos ductos de Wolff e a 5α-
47
dihidrotestoterona (DHT), um derivado da T relacionado ao desenvolvimento da próstata e da uretra
48
prostática a partir do seio urogenital e com a masculinização da genitália externa (2). Uma das
49
etiologias dos distúrbios dos tecidos-alvo dependente de androgênios é a síndrome de insensibilidade
50
aos androgênios (AIS) (3). É uma doença com herança recessiva ligada ao cromossomo X, que afeta
51
pacientes com cariótipo 46, XY, e está associada a mutações dentro da linhagem germinativa do gene
52
receptor de androgênios (AR), classificando-se em três fenótipos clínicos: completa (CAIS), parcial
53
(PAIS) ou discreta (MAIS) (4, 5, 6). O primeiro relato de CAIS foi publicado em 1953 com a
54
descrição de 82 casos pelo obstetra Jhon Morris, que a denominou inicialmente como Síndrome de
55
Morris (9). CAIS é, portanto, caracterizada pela presença de genitália externa feminina, vagina curta
56
terminando em fundo cego, genitália interna com ausência dos derivados dos ductos de Wolff e de
57
Müller, desenvolvimento de ginecomastia na puberdade e ausência de pêlos pubianos ou axilares. Os
58
testículos estão localizados no abdômen ou canal inguinal, ou menos frequentemente nos grandes
59
lábios e histologicamente apresentam-se criptórquicos, sem espermatogênese (10, 11). A prevalência
60
de CAIS é estimada entre 1:20.000 e 1:99.000 nascidos do sexo masculino. Apesar do padrão de
61
herança recessivo ligado ao cromossomo X, cerca de 30% das mutações são esporádicas (mutações de
62
novo) e 80-90% das pacientes com CAIS desenvolvem eventualmente uma hérnia inguinal. A taxa de
63
incidência de CAIS em uma criança com hérnia inguinal premenarca é de 1,1%. Não existe na
64
literatura nenhum estudo relatando diferença na prevalência baseada na etnia ou geografia (7, 8). O
65
DNA complementar (cDNA) que codifica o gene AR humano foi clonado em 1988 e localizado no
66
braço longo do cromossomo X, mais precisamente em Xq11-12. Esse gene faz parte de uma família de
67
fatores de transcrição nuclear que inclui os receptores de estrógeno, do hormônio tireoidiano, da
68
vitamina D, do ácido retinóico, de glicocorticóide, de mineralocorticóide e da progesterona (6, 11, 12,
69
13). O gene AR possui 8 exons e codifica uma proteína de 110KDa com cerca de 919 aminoácidos. A
70
proteína está organizada em quatro domínios estruturais principais: domínio amino-terminal regulador
71
da transcrição (NTD), domínio de ligação ao DNA (DBD) com clássicos dedos de zinco na região
72
proximal e distal, uma região dobradiça (hinge) e um domínio de ligação aos androgênios (LBD) (11).
73
O impacto funcional observado em mutações no gene AR depende do locus exato na sequência do
74
27
gene. Mutações no NTD (exon 1 do gene) não ocorrem frequentemente e a grande maioria resulta em
75
stop codon ou terminação prematura devido à alteração da matriz de leitura por uma inserção ou
76
deleção de nucleotídeos. O LBD, o qual é codificado por menos da metade do gene AR, é o local da
77
maioria das mutações já identificadas. Mutações nos exons 5 e 7 são as mais frequentes e em sua
78
grande maioria são substituições simples de bases (14). CAIS é considerada uma doença rara, e
79
estudá-la contribuirá para identificar a base molecular em famílias, tendo implicações no tratamento
80
clínico e aconselhamento genético dos indivíduos e familiares. Foram estudados os aspectos clínicos e
81
moleculares de duas pacientes brasileiras com de síndrome de insensibilidade completa aos
82
androgênios confirmada pela identificação de uma mutação no gene AR.
83
3.2 Material e Métodos
84
3.2.1 Pacientes
85
Duas pacientes gêmeas monozigóticas de 5 anos de idade, com genitália externa feminina normal,
86
foram atendidas em uma Clínica particular de Endocrinologia. As pacientes haviam sido avaliadas
87
inicialmente por um cirurgião pediátrico e submetidas a ultrassonografia pélvica que revelou gônadas
88
em canal inguinal. As análises cromossômicas realizadas a partir de metáfases de linfócitos de sangue
89
periférico, com a técnica de bandamento G e resolução de 400 bandas, revelaram o cariótipo 46, XY,
90
em ambas as pacientes (Anexos B e C). Com a confirmação de tecido testicular no material de biópsia
91
(Anexo D) as pacientes foram submetidas à gonadectomia. A ultrassonografia de abdômen total
92
revelou ausência de útero e anexos (Anexos E e F). Dessa forma, procedeu-se a uma investigação
93
molecular para CAIS.
94
3.2.2 Análise de mutações no gene AR
95
O DNA genômico de sangue periférico das gêmeas foi extraído segundo Kit comercial EZ-DNA
96
(Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Após a extração, foi feita a amplificação do DNA para a
97
identificação das mutações no gene AR para os exons 5, 6 e 7 (regiões hot spots do gene AR)
98
utilizando-se PCR simples previamente descrita por Radpour et al., 2007 com modificações (15). O
99
tamanho dos fragmentos amplificados corresponde respectivamente a 235, 234 e 219 pb. Foram
100
realizadas reações de PCR em um volume final de 25µl, sendo 100ng de DNA, GoTaq Flexi DNA
101
[0,06 U/µl de GoTaq DNA Polimerase, tampão 5x Colorless pH 8.5 sem magnésio, MgCl
2
0,6mM
102
28
(Promega, Madison, Wisconsin)], dNTP’s 0,8mM (Amresco, Sólon, Ohio) e 0,8pmol de cada primer
103
(Invitrogen, São Paulo). Os ciclos de temperatura consistiram de 95
0
C por 5 min, seguidos de 35
104
ciclos de 94
0
C por 1 min, temperatura de anelamento de 57
0
C por 1 min (para os três exons), extensão
105
a 72
0
C por 1 min e extensão final de 72
0
C por 1 min. Os produtos de PCR foram purificados através
106
do Kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). Em seguida, fez-se a diluição
107
desses produtos com concentração inicial de 100ηg para uma concentração final de 50ηg e a reação de
108
sequenciamento com o kit BigDyeTerminator v1.1, v3.1 (Applied Biosystems, Warrington, Reino
109
Unido). O DNA foi precipitado com Isopropanol/Etanol, as amostras foram ressupendendidas em
110
formamida e sequenciadas no ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City,
111
Califórnia). Os eletroferogramas foram analisados com o programa SeqScape v2.5 (Applied
112
Biosystems, Foster City, Califórnia) comparando-se a sequência padrão do gene AR com os resultados
113
obtidos no sequenciamento.
114
3.2.3 Comitê de Ética
115
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Hospital
116
Universitário da Universidade Federal do Maranhão – HUUFMA, recebendo o parecer
117
consubstanciado nº 001421/2008-10.
118
3.3 Resultados e Discussão
119
A mãe das pacientes relatou que uma das filhas (paciente 1) havia se queixado de dores abdominais
120
aos 2 anos de idade e ao ser submetida a uma biópsia descobriu que o exame era compatível com
121
testículo. Sem nenhuma investigação de malignidade nas gônadas e sem investigação prévia dos níveis
122
séricos de testosterona, precursores da testosterona e dihidrotestosterona (DHT) a paciente 1 foi
123
submetida à gonadectomia e logo após, a irmã (paciente 2) também foi submetida à mesma cirurgia.
124
Portanto, quando as pacientes foram atendidas, apresentavam ao exame físico genitália externa
125
feminina normal, sem nenhum grau de virilização, cariótipo 46, XY sem mosaicismo e
126
ultrassonografia de abdômen total com ausência de útero e anexos. Na família observam-se, na mesma
127
geração, dois irmãos normais com cariótipo 46, XY. As duas irmãs gêmeas monozigóticas tinham
128
quadro clínico compatível com o diagnóstico de anomalia da diferenciação sexual pela forma completa
129
da síndrome de insensibilidade aos androgênios (CAIS). Por causa destas características fez-se a
130
29
investigação molecular para o gene AR. Procedeu-se à análise molecular utilizando-se DNA genômico
131
obtido a partir de leucócitos de sangue periférico. O seqüenciamento dos exons 5, 6 e 7 do gene AR
132
revelou a substituição de uma citosina por uma timina no nucleotídeo 2616 do exon 5, resultando na
133
troca do aminoácido arginina por um codon de parada prematura na posição 752 da proteína AR
134
(figura 1). A identificação em ambas de uma mutação do tipo nonsense, R752X, na região de ligação
135
ao hormônio do receptor androgênico confirmou o diagnóstico de CAIS em nível molecular. Com
136
relação à presença de CAIS em gêmeas monozigóticas, somente dois casos clínicos com investigação
137
molecular foram descritos na literatura. Mongan e colaboradores (16) descreveram em 2002, duas
138
mutações missense de novo, F856L e S865P, no exon 7 do gene AR em gêmeas monozigóticas com a
139
forma completa de AIS. Estudos evidenciaram que a mutação F856L se comporta de forma
140
semelhante ao receptor wild type (tipo selvagem), sem prejuízo na capacidade de ligação ou ativação
141
da transcrição. Entretanto, a mutação S865P abole completamente a capacidade de ligação e a ativação
142
da transcrição do AR, justificando assim a forma completa de AIS nestas pacientes. Em 2005, Corrêa
143
e colaboradores (11) descreveram duas gêmeas com 20 anos de idade, em que ambas relataram telarca
144
aos 13 anos e pubarca aos 16, com desenvolvimento neuropsicomotor normal, desenvolvimento sexual
145
secundário feminino com presença de gônadas palpáveis bilaterais na região inguinal e uma mutação
146
missense P766A, no exon 5. A região LBD que compreende os exons 4 a 8 é considerada um hot spot
147
para mutações nesse gene, principalmente os exons 5 e 7 (17). Apesar do grande número de mutações
148
já descritas na literatura (cerca de 300 mutações diferentes) (18), apenas cinco casos com essa mesma
149
mutação haviam sido descritos previamente. Pinsky e colaboradores (19) descreveram primeiramente
150
a mutação R752X em 1992, seguido de Brinkman e colaboradores (20) em 1995. Yaegashi e
151
colaboradores (21) descreveram em 1999, a mutação R752X em uma paciente de 12 anos de idade
152
com cariótipo 46, XY, genitália externa feminina normal e presença de testículos na região inguinal.
153
Esta mesma paciente relatou que tinha uma prima com amenorréia primária. Melo e colaboradores
154
(22) descreveram em 2003, a mutação R752X em uma paciente com 14 anos, história familiar
155
positiva, amenorréia primária, mamas bem desenvolvidas e testículos na região abdominal. Ledig e
156
colaboradores (23) descreveram em 2005, uma paciente CAIS com sexo de criação feminino e história
157
familiar negativa. Neste mesmo codon (752) só foram descritas até o momento duas substituições do
158
30
aminoácido arginina: por stop codon em cinco famílias e por glicina em outras sete (24). Em todos os
159
casos relatados, a forma clínica é sempre de CAIS, sugerindo uma importante participação do
160
aminoácido arginina no codon 752 na ação do AR. O fato desse codon se situar na região corresponde
161
ao domínio de ligação aos androgênios, que é responsável pela interação andrógeno-receptor, sendo
162
fundamental para a ação androgênica, é compatível com o grave comprometimento da função
163
androgênica nas pacientes descritas. Matias e colaboradores (25) descreveram em 2000, a estrutura
164
específica de interação com o domínio de ligação aos androgênios humanos e relataram que a Arg752
165
é responsável pela estabilização do receptor de androgênios através da ligação entre um hidrogênio, o
166
anel-A do ligante e a Arg752. A substituição de um único nucleotídeo é muito mais frequente, quando
167
comparada à freqüência de deleções e inserções no gene AR. Quando estas mutações resultam em
168
alteração do splicing do RNAm e codon de parada prematura na proteína AR, ocasionam grandes
169
alterações na estrutura do receptor e são sempre responsáveis por CAIS (26). A mutação R752X
170
nonsense detectada nesse estudo foi a causa de CAIS. Todas as mutações nonsense descritas no banco
171
de dados de mutação no gene AR (24) resultaram em CAIS, independentemente da sua localização. A
172
mutação nonsense gerou uma proteína truncada mediante substituição do aminoácido arginina por stop
173
codon, ocasionando a terminação prematura do codon e incluindo uma grande parte do domínio LBD,
174
região responsável pela dimerização e transativação do ligante dependente (27). Concluindo, foram
175
estudadas duas gêmeas monozigóticas com a forma clínica completa da síndrome de insensibilidade
176
aos androgênios com a detecção da mutação nonsense R752X contida na região de ligação aos
177
androgênios, sendo consistente com o diagnóstico clínico de CAIS. Dezenove mutações distintas no
178
AR já haviam sido descritas em 31 pacientes brasileiros portadores de AIS. Apesar de mutações neste
179
gene serem bastante frequentes, este é o terceiro caso de diagnóstico molecular em gêmeas com AIS,
180
sendo o segundo no Brasil, e a sexta família descrita com essa mutação na literatura mundial.
181
Agradecimentos
182
Agradecemos ao suporte financeiro da FAPEMA.
183
31
Referências
184
1 Damiani D, Guerra-júnior G 2007 New definitions and classifications of the intersexual states: in
185
which the Chicago Consensus has contributed to the state of the art? Arq. Bras. Endocrinol Metab 51
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18 Tadokoro R, Bunch T, Schwabe JWR, Hughes IA, Murphy JC 2009 Comparison of the
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generation of a termination codon and truncated form of the androgen receptor, causes complete
254
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255
34
Figura 1 – Eletroferogramas indicando a substituição de uma citosina por uma timina no
nucleotídeo 2616 do exon 5 que corresponde à posição 752 da proteína AR. A - Sequência
referência. B - Sequência de um indivíduo normal. C e D Sequências das pacientes 1 e 2,
respectivamente.
35
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As anomalias da diferenciação sexual têm-se constituído em um
formidável desafio quanto ao diagnóstico e a conduta, colocando o paciente, os
familiares e os profissionais da equipe de saúde na difícil situação de definir a
melhor opção quanto ao gênero de criação.
A detecção de mutações como a que foi achada neste estudo,
contribuem de forma a elucidar a relação entre a mutação no domínio de ligação aos
androgênios e CAIS. A ação androgênica tem uma importante influência na
identificação do sexo, visto que pacientes com CAIS são geneticamente 46, XY, mas
apresentam sexo feminino ao nascimento, são criadas como meninas e mantêm o
sexo social na puberdade e vida adulta.
Pesquisas como esta podem fornecer uma resposta sobre mecanismos
moleculares e hereditários para os pacientes e familiares, além de contribuir para um
valioso acervo de dados sobre AIS, introduzindo novos testes diagnósticos e
possibilitando uma terapêutica mais adequada de acordo com o perfil genético de
cada paciente.
A identificação de portadores de mutações no gene AR é de importância
clínica para o aconselhamento genético eficiente para os indivíduos afetados e seus
familiares.
Em conclusão, foram descritos os casos de duas gêmeas monozigóticas
portadoras da forma clínica completa da síndrome de insensibilidade aos
androgênios (CAIS), confirmadas através de investigação molecular com mutação
stop codon R752X contida na região de ligação aos androgênios.
36
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42
APÊNDICE
43
APÊNDICE A – Heredograma
44
ANEXOS
45
ANEXO A – Instruções para autores do periódico The Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism.
Instructions to Authors for The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism
Purpose and Scope
The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism (JCEM) publishes original research articles,
reviews, and other special features related to endocrinology and metabolism in humans and human
tissue.
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The Endocrine Society's mission is to advance excellence in endocrinology and be an integrative force
in scientific research and medical practice. Such progress depends on integrity in the conduct of
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Endocrinology & Metabolism (information at http://www.endo-society.org/awards/JournalAwards/
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or figure/table legends. The word count must be noted on the title page, along with the number of
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tables and 40 references. The Journal has a special interest in publishing results of major prospective
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weeks. Authors who wish to request consideration by Endocrine Trials Express should contact the
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straightforward, negative or confirmatory results. These manuscripts should be no longer than 1800
words and include no more than two figures and tables and 20 references.
• Clinical Reviews and other Reviews should address topics of importance to clinical
endocrinologists and endocrine clinical investigators, including scholarly updates regarding the
molecular and biochemical basis for normal physiology and disease states; the state-of-the-art in
46
diagnosis and management of endocrine and metabolic disorders; and other topics relevant to the
practice of clinical endocrinology. Authors considering the submission of uninvited reviews should
contact the editors in advance to determine whether the topic that they propose is of current potential
interest to the Journal. These manuscripts should be no longer than 4000 words and include no more
than four figures and tables and 120 references. Authors should include a brief section describing the
search strategies used to obtain information for the review.
• Clinical Case Seminars are descriptions of a case or small number of cases revealing novel and
important insights into a condition's pathogenesis, presentation, and/or management. The case report is
to be accompanied by a concise scholarly review of the literature regarding relevant aspects of the
disorder. These manuscripts should be 2400 words or less, with no more than four figures and tables
and 30 references.
• Extensive Clinical Experiences are learned descriptions of substantial clinical experience with a
specific endocrine or metabolic disorder, or class of disorders, by a single clinical endocrinologist or
facility. This experience should expose novel aspects of the condition's presentation, diagnosis, natural
history, and/or treatment. These manuscripts should be no longer than 3600 words and include no
more than four figures and tables and 40 references.
• Position and Consensus Statements related to the endocrine and metabolic health standards and
healthcare practices may be submitted by professional societies, task forces, and other consortia. All
such submissions will be subjected to peer review, must be modifiable in response to criticisms, and
will be published only if they meet the Journal's usual editorial standards. These manuscripts should
typically be no longer than 3600 words and include no more than six figures and tables and 120
references.
• Controversies in Clinical Endocrinology describe and justify different approaches to diagnosis
and/or management of patients with an endocrine or metabolic condition. This feature typically
consists of a pair of manuscripts authored by two individuals who thoughtfully describe their
respective clinical perspectives on a problem, their related practices, and the rationale and evidence
supporting them. The entire manuscript should be no longer than 2400 words and include no more
than two figures and tables and 30 references.
• Images in Endocrinology are to be comprised of a single figure or two closely related figures that
illustrate the value of visual information in clinical diagnosis of endocrine and metabolic disorders,
with a caption that is 50 words or less, an accompanying commentary that is 250 words or less, and
five or fewer references.
• Commentaries are essentially uninvited editorials, which should concisely address and take a
well-reasoned position on a timely issue of importance to clinical endocrinologists and/or endocrine
clinical investigators. These manuscripts should be no longer than 1200 words with no more than 10
references; no figures or tables are permitted.
• Letters to the Editor may be submitted in response to work that has been published in the
Journal. Letters should be short commentaries related to specific points of agreement or disagreement
with the published work. Letters are not intended for presentation of original data unrelated to a
published article. Letters can only be submitted electronically via the Journal website, by clicking on
the link entitled "Submit a Letter to the Editor" on the abstract page or the article itself. Letters should
be no longer than 500 words with no more than five complete references, and may not include any
figures or tables.
Manuscript Submission Procedures
JCEM only uses electronic manuscript submission at Rapid Review (https://www.rapidreview.com/
tes/CALogon.jsp).
If this is your first submission through E-Review, click on "New to Rapid Review?" to create an
author account. If you already have an account from a previous submission, enter your username and
47
password to submit a new or revised manuscript. If you have forgotten your username and/or
password, e-mail the editorial office (sherman@endo-society.org) for assistance.
Note that your author account is the same for JCEM, Endocrinology, Molecular Endocrinology, and
Endocrine Reviews. Authors should be aware that in submitting a manuscript for consideration by
JCEM, they are submitting their paper to The Endocrine Society Central Journals Office database,
which is accessible by the Editors-in-Chief of all the Society's journals.
All submissions must include:
• A cover letter requesting that the manuscript be evaluated for publication in JCEM and any
information relevant to your manuscript. Elsewhere on the submission form authors may suggest up to
five specific reviewers and/or request the exclusion of up to three others.
• Completed Copyright Assignment & Affirmation of Originality form. This form should be faxed
to the Editorial Office at 301-951-2617 and should include the manuscript number in the space
provided on the form.
• At least three key terms
• Completed Disclosure of Potential Conflict of Interest form. The corresponding author must
acquire all of the authors' completed disclosure forms and fax them, together, to the editorial office
along with the Author Disclosure Summary. Revised manuscripts will not be processed until all
signatures and the summary are received.
• Authors are encouraged to submit a PDF for the initial submission. See the instructions on the
JCEM homepage. If you do submit original files, E-Review will create a PDF of your files, but it may
take some time depending on the size of the files.
Manuscript Preparation
General Format
The Journal requires that all manuscripts be submitted in a single-column format that follows these
guidelines:
• All text should be double-spaced with 1-inch margins on both sides using 11-point type in Times
Roman font.
• All lines should be numbered throughout the entire manuscript and the entire document should be
paginated.
• All tables and figures must be placed after the text and must be labeled. Submitted papers must be
complete, including the title page, abstract, figures, and tables. Papers submitted without all of these
components will be placed on hold until the manuscript is complete.
• Authors are encouraged to cite primary literature rather than review articles in order to give credit
to those who have done the original work.
Title Page
The title page should include the following:
• Full title (a concise statement of the article's major contents)
• Authors' names and institutions. At least one person must be listed as an author; no group
authorship without a responsible party is allowed. A group can be listed in the authorship line, but
only on behalf of a person or persons. All group members not listed in the authorship line must be
listed in the Acknowledgments.
• Abbreviated title of not more than 40 characters for page headings
• At least three key terms for indexing and information retrieval
• Word count (excluding abstract, figure captions, and references)
48
• Corresponding author's e-mail and ground mail addresses, telephone and fax numbers
• Name and address of person to whom reprint requests should be addressed
• Any grants or fellowships supporting the writing of the paper
• Disclosure summary (see Disclosure of Potential Conflict of Interest form for instructions)
• Clinical Trial Registration Number, if applicable
• A precis, describing in 25 words or less the most important aspect of the paper, should be included
Structured Abstracts
All Original Articles, Brief Reports, Clinical Reviews, Clinical Case Seminars, Consensus and
Position Statements, Controversies in Endocrinology, and Extensive Clinical Experiences should be
submitted with structured abstracts of no more than 250 words. All information reported in the abstract
must appear in the manuscript. The abstract should not include references. Write the abstract with a
general medical audience in mind. Please use complete sentences for all sections of the abstract.
Detailed instructions on writing Structured Abstracts are at http://jcem.endojournals.org/misc/
Structured_Abstracts.shtml.
NOTE: Abstracts must include all of the headings shown for each type of paper. There may be a
delay in processing your manuscript if no structured abstract is included.
Reports of Original Data (i.e., Original Articles and Brief Reports) should include an abstract with
the following headings. Parts of the abstract may be written as phrases. Each section should include
the following content:
1. Context. The abstract should begin with 1-2 sentences explaining the clinical (or other) importance
of the study question.
2. Objective. State the precise objective or study question addressed in the report. If more than one
objective is addressed, the main objective and only key secondary objectives should be stated. If a
hypothesis was tested, it should be stated.
3. Design. Describe the basic design of the study, years of study performance, and duration of
follow-up. If applicable, include the study name (eg, the Framingham Heart Study).
4. Setting. Describe the study setting, for example, general community, a primary care or referral
center, private or institutional practice, or ambulatory or hospitalized care.
5. Patients or Other Participants. State the clinical disorders, number, eligibility criteria, key
sociodemographic features, and method of selection of patients. If matching is used for comparison
groups, characteristics matched should be specified. In follow-up studies, the proportion of
participants who completed the study must be indicated. In intervention studies, the number of patients
withdrawn because of adverse effects should be given.
6. Intervention(s). The key features of any interventions should be described, including their method
and duration. The intervention should be named by its most common clinical name, and
nonproprietary drug names should be used.
7. Main Outcome Measure(s). Indicate the primary study outcome measurement(s) planned before
data collection began. If the manuscript does not report the main planned outcomes of a study, this
should be stated and the reason indicated. State clearly if the hypothesis being tested was formulated
during or after data collection.
8. Results. The main outcomes of the study should be provided and quantified, including confidence
intervals or P values. For comparative studies, confidence intervals should relate to the differences
between groups. If relevant, indicate whether observers were blinded to patient groupings, particularly
for subjective measurements. If differences for the major study outcome measure(s) are not significant,
the clinically important difference sought should be stated and the confidence interval for the
difference between the groups should be given. When risk changes or effect sizes are given, absolute
49
values should be indicated. Studies of screening and diagnostic tests should report sensitivity,
specificity, and likelihood ratio. If predictive value or accuracy is given, prevalence or pretest
likelihood should be given as well. All randomized controlled trials should include the results of
intention-to-treat analysis, and all surveys should include response rates.
9. Conclusions. Provide only conclusions directly supported by the results, along with implications
for clinical practice; avoid speculation and overgeneralization. Indicate whether additional study is
required before the information should be used in usual clinical settings. Give equal emphasis to
positive and negative findings of equal scientific merit.
Introduction
The article should begin with a brief introductory statement that places the work to follow in historical
perspective and explains its intent and significance.
Materials and Methods
These should be described and referenced in sufficient detail for other investigators to repeat the work.
The source of hormones, unusual chemicals and reagents, and special pieces of apparatus should be
stated. For modified methods, only the modifications need be described.
Results and Discussion
The Results section should briefly present the experimental data in text, tables, and/or figures. For
details on preparation of tables and figures, see below. The Discussion should focus on the
interpretation and significance of the findings with concise objective comments that describe their
relation to other work in that area. The Discussion should not reiterate the Results.
Acknowledgments
The Acknowledgments section should include the names of those people who contributed to a study
but did not meet the requirements for authorship. The corresponding author is responsible for
informing each person listed in the acknowledgment section that they have been included and
providing them with a description of their contribution so they know the activity for which they are
considered responsible. Each person listed in the acknowledgments must give permission – in writing,
if possible – for the use of his or her name. It is the responsibility of the corresponding author to
collect this information.
References
References to the literature should be cited in numerical order (in parentheses) in the text and listed in
the same numerical order at the end of the manuscript on a separate page or pages. The author is
responsible for the accuracy of references. The number of references cited should be limited, as
indicated above for each category of submission. Appropriate recent reviews should be cited whenever
possible.
Examples of the reference style that should be used are given below. Further examples will be found
in the articles describing the Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals
(Ann Intern Med.1988; 208:258-265, Br Med J. 1988; 296:401-405). The titles of journals should be
abbreviated according to the style used in the Index Medicus.
Journal articles and abstracts: List all authors. The citation of unpublished observations, of personal
communications, and of manuscripts in preparation or submitted for publication is not permitted in the
bibliography. Such citations should be inserted at appropriate places in the text, in parentheses and
without serial number, or be presented in the footnotes. The citation of manuscripts accepted for
publication but not yet in print is permitted in the bibliography provided the DOI (Digital Object
Identifier) and the name of the journal in which they appear are supplied. Listing a manuscript as "in
press" without a DOI and journal title is not permitted. If references to personal communications are
made, authors are encouraged to keep written proof of the exchange. If it is necessary to cite an
abstract because it contains substantive data not published elsewhere, it must be designated at the end
of the reference [e.g., 68:313 (Abstract)].
50
Books: List all authors or editors.
Sample References
1. Binoux M, Hossenlopp P 1986 Insulin-like growth factor (IGF) and IGF-binding proteins:
comparison of human serum and lymph. J Clin Endocrinol Metab 67:509-514
2. MacLaughlin DT, Cigarros F, Donahoe PK 1988 Mechanism of action of Mullerian inhibiting
substance. Program of the 70th Annual Meeting of The Endocrine Society, New Orleans, LA,
1988, p 19
3. Bonneville F, Cattin F, Dietemann J-L 1986 Computed tomography of the pituitary gland.
Heidelberg: Springer-Verlag; 15-16
4. Burrow GN 1987 The thyroid: nodules and neoplasia. In: Felig P, Baxter JD, Broadus AE,
Frohman LA, eds. Endo crinology and metabolism. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 473-507
For general aid in the preparation of manuscripts, authors should consult: CBE Style Manual: A Guide
for Authors, Editors and Publishers. 5th ed. Bethesda, MD: Council of Biology Editors; 1983.
Tables
Tables must be constructed as simply as possible and be intelligible without reference to the text. Each
table must have a concise heading. A description of experimental conditions may appear together with
footnotes at the foot of the table. Tables must not simply duplicate the text or figures. The width of the
table must be designed to occupy one or two journal columns, with no more than four table columns or
8-10 table columns, respectively.
Figures and Legends
Please review the detailed instructions for preparing digital art at http://art.cadmus.com/da/index.jsp.
E-mail queries can be sent to digitalart@cadmus.com. All figures must display the figure number.
Sizing the figure: The author is responsible for providing digital art that has been properly sized,
cropped, and has adequate space between images. Plan the size of the figure to fill 1, 1.5, or 2 columns
in the printed journal (see chart below for dimensions). In most cases, figures should be prepared for
1-column width. Produce original art at the size it should appear in the printed journal. (Note for
PowerPoint users: The sizing instructions do not apply if you are submitting PowerPoint files for print
production in E-Review. On the submission page, check boxes to indicate that the figures are the
correct size and resolution.)
1 column = 18 picas, 7.5 cm, 3.0 in
1.5. columns = 30 picas, 12.5 cm, 5.0 in
2 columns = 38 picas, 16.0 cm, 6.5 in
Lettering: At 100% size, no lettering should be smaller than 8 point (0.3 cm high) or larger than 12
point (0.4 cm high). Use bold and solid lettering. Lines should be thick, solid, and no less than 1-point
rule. Avoid the use of reverse type (white lettering on a darker background). Avoid lettering on top of
shaded or textured areas. Titles should be clear and informative. Keep wording on figures to a
minimum, and confine any explanation of figures to their separate-page legends. Label only one
vertical and one horizontal side of a figure. Freehand lettering or drawing is unacceptable.
Color Figures: Figures should now be submitted as RGB (red, green, blue) format. Saving color
figures to this format will be more convenient for authors as RGB is the standard default on most
programs. Color images will be preserved as RGB up until the time of printing and will be posted
online in their original RGB form. Using RGB color mode for online images will be a significant
improvement for figures that contain fluorescent blues, reds, and greens. Therefore the online journal
will accurately reflect the true color of the images the way the author intended. For print, the images
will be converted to CMYK through an automated color conversion process.
Shading: Avoid the use of shading, but if unavoidable, use a coarse rather than a fine screen setting
(80-100 line screen is preferred). Avoid 1-20% and 70-99% shading; make differing shades vary by at
51
least 20%, i.e., 25%, 45%, 65%. Instead of shading, denote variations in graphs or drawings by cross-
hatching; solid black; or vertical, horizontal, or diagonal striping. Avoid the use of dots.
Grouped figures: For grouped figures, indicate the layout in a diagram. Place grouped figures so that
they can be printed in 1 column width with uniform margins. Indicate magnification in the legends and
by internal reference markers in the photographs. Their length should represent the fraction or multiple
of a micrometer, appropriate to the magnification.
Graphs: Graphs with axis measures containing very large or small numbers should convert to easily
readable notations. Example: For an ordinate range of "counts per minute" values from 1,000 to
20,000, the true value may be multiplied by 10
-3
(scale would read from 1 to 20) and the ordinate axis
display "cpm (×10
-3
)." Similarly, for a Scatchard plot with values ranging from 0.1 to 2 femtomolar
(10
-15
m), the scale may run from 0.1 to 2 with the abscissa labeled "m (×10
-15
)." Three-dimensional
bar graphs will not be published if the information they refer to is only two-dimensional.
Supplemental Data
Supplemental Data allows authors to enhance papers in JCEM by making additional substantive
material available to readers. Supplemental Data may take the form of figures, tables, datasets,
derivations, or videos, and is published only in JCEM online; it does not appear in the printed version
of the journal. Authors who wish to include Supplemental Data should state so in the cover letter when
the manuscript is submitted.
Supplemental Data files should be submitted through Rapid Review at the time of manuscript
submission, and will be reviewed along with the manuscript. The files should be uploaded in the field
marked "Upload Supplemental Data Files", and should NOT be attached with the manuscript and
figure files. Authors should refer to the Supplemental Data in the manuscript at an appropriate point in
the text or figure/table legend.
The file formats listed below may be used for Supplemental Data. Provide a brief description of each
item in a separate HTML or Word file (i.e., figure or table legends, captions for movie or sound clips,
etc.). Do not save figure numbers, legends, or author names as part of an image. File sizes should not
exceed 5 MB. Images should not exceed 500 pixels in width or height. Do not use tabs or spaces for
Word or WordPefect tables; please use the table functions available within these word processing
programs to prepare tables. For web pages, provide a complete list of files and instructions for creating
directories.
.htm, HTML*
.jpg, JPEG image*
.gif, Graphical image
.pdf, Adobe Portable Document Format
.xls, MS Excel Spreadsheet
.mov, Quick Time
.wav, Sound
.doc, MS Word 6 documents**
.txt, Plain ASCII*
*These files can be viewed directly on standard web browsers.
**MS Word may be used for text only.
Units of Measure
Results should be expressed in metric units. Système Internationale (SI units) must be added in
parentheses. Temperature should be expressed in degrees Celsius (e.g., 28 C) and time of day using
the 24-hour clock (e.g., 0800 h, 1500 h).
52
Standard Abbreviations
All nonstandard abbreviations in the text must be defined immediately after the first use of the
abbreviation. The list of Standard Abbreviations is given in the link.
Editorial Policies and Guidelines
Prior Publication
Failure to notify the editor that some results in the manuscript are being or have been previously
published will result in placement of a notice in the journal that the authors have violated the Ethical
Guidelines for Publication of Research in The Endocrine Society Journals. The journal publishes
original research and review material. Material previously published in whole or in part shall not be
considered for publication. This includes materials published in any form of mass communication. At
the time of submission, authors must divulge in their cover letter all prior publications or postings of
the material in any form of media. Abstracts or posters displayed for colleagues at scientific meetings
need not be reported. Other postings of any part of the submitted material on web pages, as well as
those essential for participation in required registries will be evaluated by the Editor-In-Chief, who
shall determine if those postings are material enough to constitute prior publication.
Authorship Criteria
An author should have participated in either the conception, planning, or execution of the work, the
interpretation of the results and the writing of the paper. An acknowledgment accompanying the paper
is appropriate recognition for others who have contributed to a lesser extent, e.g., provision of clones,
antisera or cell lines, or reading and reviewing manuscripts in draft. The signature of each author on
the Affirmation of Originality and Copyright Release form that must be submitted with the manuscript
indicates that all authors have had a part in the writing and final editing of the report, all have been
given a copy of the manuscript, all have approved the final version of the manuscript, and all are
prepared to take public responsibility for the work, sharing responsibility and accountability for the
results.
Guidelines for considering authors of non-research articles who have a potential COI
The editors of The Endocrine Society's journals appreciate the importance of assuring unbiased
authorship of editorials, reviews, and other non-research features involving selection of evidence to be
discussed and perspectives to be presented. Consequently, special care is taken in choosing authors for
such articles to assure their views are balanced and unencumbered, and that the Society's policies on
disclosure of conflicts of interest are implemented.
Obligations of Reviewers
The critical and confidential review of manuscripts is an essential element of research publications.
Every scientist has an obligation to contribute to the peer review process by serving as a reviewer.
Among the obligations of reviewers is the commitment to providing an expert, critical, and
constructive scientific and literary appraisal of research reports in their fields of knowledge, skills, and
experience in a fair and unbiased manner. In order to facilitate the prompt sharing of scientific results,
it is also the obligation of each reviewer to complete their assignments promptly, within the editor's
deadline. Should a delay in their review occur, the reviewer has the obligation to notify the editor at
once. Reviewers should not review a manuscript if: 1) they do not think that they are competent to
assess the research described, 2) they believe there is a conflict of interest or personal or professional
relationship with the author(s) that might bias their assessment of the manuscript, or (3) there is any
other situation that could bias their review. Employment at the same institution as one of the authors
does not automatically represent a conflict. Having previously reviewed the article for another journal
does not disqualify a reviewer, although the editor should be informed so the reviewer's perspective
can be considered. In circumstances when reviewers need to recuse themselves, they should notify the
editor promptly, preferably with an explanation. If reviewers are uncertain whether they should recuse
themselves, they should consult with the editor.
The reviewer should strive to provide accurate, detailed, and constructive criticisms, and the review
should be supported by appropriate references, especially if unfavorable. The reviewer should also
53
note whether the work of others is properly cited. If the reviewer notes any substantial resemblance of
the manuscript being reviewed to a published paper or to a manuscript submitted at the same time to
another journal, they should promptly report this to the editor.
No part of the manuscript under review should ordinarily be revealed to another individual without the
permission of the editor. If a reviewer consults a colleague on a particular point, this fact, and the
name of the collaborator or consultant, should be reported to the editor, preferably in advance. With
these exceptions, a reviewer must obtain through the editor written permission from the authors to use
or disclose any of the unpublished content of a manuscript under review.
Experimental Subjects
To be considered, all clinical investigations described in submitted manuscripts must have been
conducted in accordance with the guidelines in The Declaration of Helsinki and must have been
formally approved by the appropriate institutional review committees or its equivalent. All
manuscripts must indicate that IRB approval was acquired; and that when informed consent was
required by the IRB, that this was obtained from subjects in experiments involving humans.
Investigators must disclose potential conflict of interest to study participants and should indicate in the
manuscript that they have done so. The study populations should be described in detail. In many
studies details of age, race, and sex are important. However, subjects must be identified only by
number or letter, not by initials or names. Photographs of patients' faces should be included only if
scientifically relevant. Authors must obtain written consent from the patient for use of such
photographs. For further details, see the Ethical Guidelines.
Experimental Animals
A statement confirming that all animal experimentation described in the submitted manuscript was
conducted in accord with accepted standards of humane animal care, as outlined in the Ethical
Guidelines, should be included in the manuscript.
Clinical Trials Registration
For clinical trial reports to be considered for publication in the Journal, the Endocrine Society requires
their prospective registration, as endorsed by the International Conference of Medical Journal Editors.
We recommend use of www.clinicaltrials.gov. The Society's full Position Statement on Clinical Trials
Registration is at the following web site: http://jcem.endojournals.org/misc/ClinicalTrials.pdf. All
trials beginning after January 1, 2007 must have been prospectively registered before enrollment of the
first subject. All trials begun before that date must be retroactively registered before submission.
Please note that the Clinical Trial Registration number should be provided clearly on the title page of
the manuscript.
Genetic and Genome-Wide Association Studies
To ensure rigor in genetic and genome-wide association studies and permit readers to assess their
biological and clinical significance, submitted manuscripts describing such work should generally
conform to the following study design criteria, which will be applied by the Journal's reviewers and
editors in their evaluations.
Sample Size and Multiple Testing: Studies should include sufficient samples to have the power to
detect an effect. In addition, since multiple hypotheses are often tested (e.g., multiple SNPs,
substratification, and multiple phenotypes), analyses and interpretations should account for the
influence of such multiple testing on the findings' biological and clinical significance.
Validation Samples: The most rigorous association studies should include both a testing (or training)
sample set and an independent validation series.
Functional Data: Functional data strengthen association data if the functional assay(s) have
demonstrable relevance to the associated phenotype. In some instances, association studies with a
single testing sample set and highly relevant functional data may be acceptable without an independent
validation series.
54
Single Genetic Marker (e.g., SNP) versus Whole Gene/Genome Studies: Single SNP studies are
acceptable when the particular SNP has strong prior claims for involvement in the phenotype of
interest. However, it is desirable to examine genetic variation at least across and flanking the gene of
interest when this is feasible.
Negative Association Studies: Well-designed and executed association studies that demonstrate
significant negative findings will be considered if the gene in question has clear relevance to disease
pathogenesis or has been implicated in prior published association studies.
Microarray Expression Studies
Genome-wide expression studies require both technical validation and an independent validation
series. Technical validation entails application of a different technique (e.g., RT-PCR of single genes
or immunohistochemistry) to confirm the differential expression detected by genome-wide expression.
An independent validation series of samples should be utilized to confirm the differential expression
noted by genome-wide analysis of the initial testing sample set.
Nomenclature and Technical Requirements
The value of study data is enhanced if, where relevant, manuscripts:
•
Use standard terminology for variants, providing rs numbers for all variants reported. These can be
easily derived for novel variants uncovered by the study. Where rs numbers are provided, the details of
the assay (primer sequences, PCR conditions, etc.) should be described very concisely.
•
Describe measures taken to ensure genotyping accuracy, e.g., percentage of genotype calls,
number of duplicate samples that were genotyped, and percentage concordance.
•
Provide approved GDB/HUGO approved gene names, in the appropriate cases and italics.
•
Provide linkage disequilibrium (LD) relationships between typed variants.
•
Provide information and a discussion of departures from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE).
The calculation of HWE may help uncover genotyping errors and impact on downstream analytical
methods that assume HWE.
•
Provide raw genotype frequencies in addition to allele frequencies. It is also desirable to provide
haplotype frequencies.
•
Provide the criteria they have used to select tagSNPs.
•
Denote the boundaries considered when studying SNPs within a gene of interest. For example,
"gene X and 100 kb upstream of the first translational start site and 150 kb downstream of the stop
codon."
Manuscripts Reporting New Amino Acid or Nucleotide Sequence
Manuscripts reporting amino acid or nucleotide sequences of proteins with sequences already known
from other tissues or species will be considered only if they provide new biological insight.
Manuscripts dealing with partial sequence data are not likely to be considered. The Endocrine Society
has established policy that deals with submission of new protein or nucleic acid sequences. When a
manuscript is accepted that contains novel sequences, such sequences must be deposited in the
appropriate database (such as GenBank) and an accession number obtained before the manuscript is
sent to the printer. It is recommended that the following statement containing the assigned accession
number be inserted as a footnote: "These sequence data have been submitted to the
DDBJ/EMBL/GenBank databases under accession number Ul2345."
Standards for Steroid Nomenclature
The 3 major classes of mammalian sex hormones – androgens, estrogens, and progestins (or
progestagens or gestagens) - are defined by their biological activities, which are mediated via the well-
defined androgen, estrogen and progesterone (or progestin) receptors. The principal bioactive sex
steroid and natural ligand for each class is testosterone (or 5α-dihydrotestosterone), estradiol and
progesterone, respectively. Androgen(s), estrogen(s) and progestin(s) are classes of compounds with
55
hormonal activity, and not the names of individual steroids. Synthetic steroids or extracts can be
considered as members of a generic steroid class (androgens, estrogens, progestins), but are distinct
from the natural cognate ligand itself. Synthetic hormones or extracts of biological origin of each class
may also have agonist, antagonist or mixed bioactivity in one or more classes. Therefore, the terms
androgens, estrogens and progestins (or progestagens or gestagens) should be used when referring to
the class of hormones, whereas when a specific natural or synthetic steroid is being used or assayed,
the particular compound must be specified.
Apart from accepted trivial names, steroids should be named according to the systematic nomenclature
of the IUPAC convention on Nomenclature of Steroids (Moss et al Pure & Applied Chemistry
61:1783-1822, 1989) at first mention in a single footnote defining all letter abbreviations.
Subsequently, generic or trivial names or letter abbreviations, but not trade-names, should be used.
Examples of accepted trivial names include: cholesterol, estrone, 17α and 17β estradiol (estradiol is
also acceptably used as the trivial name for 17β estradiol), estriol, aldosterone, androsterone,
etiocholanolone, dehydroepiandrosterone, testosterone, 5α dihydrotestosterone, 5β
dihydrotestosterone, androstenedione, pregnenolone, progesterone, corticosterone,
deoxycorticosterone, cortisone, and cortisol.
Trivial names may be modified by prefixes or suffixes indicating substituents (as in 17-
hydroxyprogesterone for 17-hydroxy-4-pregnene-3,20-dione), double bonds (as in 7-
dehydrocholesterol for 5,7-cholestadien-3-ol) and epimeric configurations of functional groups
provided the locus of epimerization is indicated (as in 11-epicortisol for 11α21-trihydroxypregn-4-en-
3-one).
Manuscripts Reporting Novel Compounds
Manuscripts describing experiments with new compounds must provide their chemical structures. For
known compounds, the source and/or literature reference to the chemical structure and characterization
must be provided.
Validation of Data and Statistical Analysis
Assay validation: Bioassay and radioimmunoassay potency estimates should be accompanied by an
appropriate measure of the precision of these estimates. For bioassays, these usually will be the
standard deviation, standard error of the mean, coefficient of variation, or 95% confidence limits. For
both bioassays and radioimmunoassays, it is necessary to include data relating to within-assay and
between-assay variability. If all relevant comparisons are made within the same assay, the latter may
be omitted. Authors should be aware that the precision of a measurement depends upon its position on
the dose-response curve.
In presenting results for new assays, it is necessary to include data on the following: 1) within-assay
variability; 2) between-assay variability; 3) slope of the dose-response curve; 4) mid-range of the
assay; 5) least-detectable concentration (concentration resulting in a response two standard deviations
away from the zero dose response); 6) data on specificity; 7) data on parallelism of standard and
unknown and on recovery; and 8) comparison with an independent method for assay of the compound.
When radioimmunoassay kits are utilized or hormone measurements are conducted in other than the
authors' laboratories and the assay is central to the study, data regarding performance characteristics
should be included.
Pulse analysis: Data from studies of pulsatile hormone secretion should be analyzed using a validated,
objective pulse detection algorithm. The algorithm used should require that false-positive rates of
pulse detection be defined in relation to the measurement error of the data set being analyzed, and the
methods used to determine the measurement error should be described. The author(s) also should
describe the methods used: 1) to deal with missing or undetectable values; 2) to determine peak
frequency, interpeak interval, and pulse amplitude; and 3) for statistical comparisons of peak
parameters.
Data analysis: It is the author's responsibility to document that the results are reproducible and that the
differences found are not due to random variation. No absolute rules can be applied, but in general
56
quantitative data should be from no fewer than three replicate experiments. Appropriate statistical
methods should be used to test the significance of differences in results. The term "significant" should
not be used unless statistical analysis was performed, and the probability value used to identify
significance (e.g., P > 0.05) should be specified.
When several t tests are employed, authors should be aware that nominal probability levels no longer
apply. Accordingly, the multiple t test, multiple range test, or similar techniques to permit
simultaneous comparisons should be employed. Also, in lieu of using several t tests, it is often more
appropriate to utilize an analysis of variance (ANOVA) to permit pooling of data, increase the number
of degrees of freedom, and improve reliability of results. Authors should use appropriate
nonparametric tests when the data depart substantially from a normal distribution. Analysis of variance
tables should not be inserted in manuscripts. F values with the degrees of freedom as subscripts
together with the P values are sufficient.
In presenting results of linear regression analyses, it is desirable to show 95% confidence limits. When
data points are fitted with lines (as in Scatchard or Lineweaver-Burk plots), the method used for fitting
(graphical, least squares, computer program) should be specified. If differences in slopes and/or axis
intercepts are claimed for plotted lines, these should be supported by statistical analysis.
Authors should include in the manuscript a list of the software used for statistical analyses.
Digital Image Integrity
When preparing digital images, authors must adhere to the following guidelines as stated in the CSE's
White Paper on Promoting Integrity in Scientific Journal Publications:
•
No specific feature within an image may be enhanced, obscured, moved, removed, or introduced.
•
Adjustments of brightness, contrast, or color balance are acceptable if they are applied to the entire
image and as long as they do not obscure, eliminate, or misrepresent any information present in the
original.
•
The grouping of images from different parts of the same gel, or from different gels, fields, or
exposures must be made explicit by the arrangement of the figure (e.g., dividing lines) and in the
figure legend.
Deviations from these guidelines will be considered as potential ethical violations.
Note that this is an evolving issue, but these basic principles apply regardless of changes in the
technical environment. Authors should be aware that they must provide original images when
requested to do so by the Editor-in-Chief who may wish to clarify an uncertainty or concern.
[Please see paper of Rossner and Yamada (Journal of Cell Biology, 2004, 166:11-15), which was
consulted in developing these policy issues, for additional discussion, and the CSE's White Paper on
Promoting Integrity in Scientific Journal Publications, published by the Council of Science Editors,
2006.]
Publication and Production Guidelines
Proofs and Reprints
Proofs and a reprint order form are sent to the corresponding author unless the Editorial Office is
advised otherwise. The author should designate by footnote on the title page of the manuscript the
name and address of the person to whom reprint requests should be directed. Questions about reprints
should be referred to Cadmus Professional Communications at 410-819-3912 (direct) or 800-407-9190
(toll-free).
Page and Color Charges
There is no submission fee for The Endocrine Society journals.
There will be a charge of $95 per printed page for members of The Endocrine Society and $115 per
printed page for non-members. There will be a charge of $235 per color figure for members of The
Endocrine Society and $735 per color figure for non-members. Authors must submit usable digital art
57
that passes Cadmus's Rapid Inspector. Queries on page charges may be directed to Lisa Lee at Cadmus
Professional Communications 804-261-3043 (direct) or 804-266-2437 (fax).
NIH Deposits
For articles that were funded by NIH, accepted manuscripts will be submitted to PubMed Central.
These manuscripts will be made freely available online twelve months after print publication. NIH
will contact the author to confirm submission.
Wellcome Trust and MRC
The Wellcome Trust and the Medical Research Council (MRC) require electronic copies of any
research papers that are accepted for publication in a peer-reviewed journal, and are supported in
whole or in part by Wellcome Trust or MRC funding, be made available through PubMed Central as
soon as possible and in any event within 6 months of the journal publisher’s official date of final
publication. The Endocrine Society will offer authors supported by the Wellcome Trust and MRC the
option of meeting the publications requirements of the Trust and MRC by paying for the open access
option. The cost to authors is $3,000 and would presumably be paid by the Wellcome Trust or MRC.
Authors who wish to have their papers published with immediate access should contact the appropriate
Journal office upon acceptance of their paper. Upon receipt of payment, the final print version will be
deposited in PubMed Central for immediate open access. These articles will also be licensed using the
Creative Commons, Attribution, Non-commercial license 2.0.
Institutional Repositories and Other Archives
Authors may deposit the final PDF version of their manuscript in their institutional repository or other
archive 1 year following the date of print publication. Any deposits to be made prior to 1 year
following the date of print publication must be approved by the Publications Department of The
Endocrine Society.
Journal Facts for JCEM
Publisher: The Endocrine Society
Editor-in-Chief: Leonard Wartofsky
Editorial Board: JCEM Editorial Board
Impact Factor 2008: 6.325
5-Year Impact Factor 2008: 6.478
Frequency of Publication: Monthly
Print Journal Circulation: 9,250
Pages published per year: 5,000
Avg Acceptance Rate: 25%
ISSN (print journal): 0021-972X
ISSN (online): 1945-7197
Indexing: BIOSIS, Current Contents, Index Medicus, Elsevier BIOBASE / Current Awareness in
Biological Sciences, National Biological Service, EMBASE / Excerpta Medica, and Sociedad
Iberoamericana de Información Cientifica (SIIC), Global Health
Supplements: Contact Editorial Office
58
ANEXO B – Cariótipo da paciente 1
59
ANEXO C – Cariótipo da paciente 2
60
ANEXO D – Biópsia da gônada da paciente 1
61
ANEXO E – Ultrassonografia de abdômen total da paciente 1
62
ANEXO F – Ultrassonografia de abdômen total da paciente 2
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