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ARMANDO RODRIGUES LOPES PEREIRA NETO
ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DE FIBROBLASTOS
GENGIVAIS CULTIVADOS SOBRE DIFERENTES
TIPOS DE MEMBRANAS REABSORVÍVEIS
Florianópolis
2010
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1
ARMANDO RODRIGUES LOPES PEREIRA NETO
ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DE FIBROBLASTOS
GENGIVAIS CULTIVADOS SOBRE DIFERENTES
TIPOS DE MEMBRANAS REABSORVÍVEIS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Odontologia do Centro de Ciências
da Saúde da Universidade Federal de Santa
Catarina, como requisito para a obtenção do título
de MESTRE em ODONTOLOGIA, área de
concentração Implantodontia.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
Co-orientador: Profa Dra. Cláudia Maria Oliveira
Simões.
Florianópolis
2010
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Armando Rodrigues Lopes Pereira Neto
Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de “Mestre em
Odontologia”, área de concentração Implantodontia, e aprovada em sua forma final
pelo Programa de Pós-graduação em Odontologia.
Florianópolis, 09 de abril de 2010
________________________________________
Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
- Coordenador do Programa-
BANCA EXAMINADORA:
_______________________________________
Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
-Orientador-
_______________________________________
Prof. Dr. Adriano Maia Corrêa
-Membro-
_______________________________________
Profa. Dra. Cláudia Maria Oliveira Simões
-Membro-
3
“Um pouco de ciência nos afasta de Deus.
Muito, nos aproxima.”
Luis Pasteur
4
DEDICATÓRIA
Aos meu pais, Célio e Célia, por
todo o apoio e confiança depositados em
mim sempre. Saibam que tudo o que
procuro realizar na minha vida é para
que se orgulhem de mim, sei que a
estrada é longa, mas com vocês do meu
lado tenho certeza que tudo será mais
fácil. Amo vocês.
5
AGRADECIMENTOS
À Deus pai, porque tudo, absolutamente tudo que conquistei durante a minha
vida foi porque Ele permitiu. Continue sempre do meu lado meu Senhor.
Ao Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini, meu orientador e amigo, por todo
conhecimento a mim transmitido durante o mestrado, pelas oportunidades, pela
paciência durante todos os dias do nosso convívio e pelas orientações completamente
indispensáveis para a conclusão do mestrado, que contribuíram para minha formação
na Implantodontia e Periodontia e fizeram com que definitivamente me apaixonasse
pela carreira acadêmica.
Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Cardoso, pela sabedoria repassada e por ter
aberto minha cabeça para a constante busca de conhecimento dentro da
Implantodontia, por me ensinar a confiar em mim e por mostrar que apenas com
muito trabalho e dedicação chegarei em algum lugar.
Ao Prof. Dr. Marco Aurélio Bianchini, pela atenção e confiança e por estar
disponível para qualquer tipo de questionamento sempre que necessário, se tornando
indispensável para a conclusão desta etapa de minha vida.
A Profa. Dra. Cláudia Maria Oliveira Simões, pela oportunidade de adquirir
conhecimento dentro da cultura celular animal e, principalmente, por ter possibilitado
que esta pesquisa se realizasse dentro do LVA. Espero que este seja apenas o primeiro
de muitos trabalhos que realizaremos juntos. O meu muito obrigado!
A amiga Ariadne, porque simplesmente sem você este trabalho não teria
acontecido. Obrigado por todo o conhecimento passado a mim, pelo voto de
confiança depositado. Tenha certeza que serei grato pelo resto de minha vida pela
ajuda. Um agradecimento também ao seu marido Neto, que participou ativamente de
todo o desenrolar desse trabalho.
Ao amigo e Prof. Dr. Cesar Augusto Magalhães Benfatti, por sempre estar
disposto a ajudar quem precisasse e por todos os conselhos e oportunidades que me
6
ajudaram a concluir esse curso de pós-gradução. Nossa amizade é verdadeira e ainda
perdurará por anos.
Aos colegas do curso de Mestrado, Gustavo, Ernesto, João, Newton, Pamela
e Daniel, nossa convivência não foi fácil, rimos, brigamos, nos estressamos, mas
construímos uma amizade sincera de qual me orgulho muito e sou bastante feliz por
tê-la conquistado.
Aos professores Gláucia, Diego, Wilson (Titi), Zendron, por todos os
ensinamentos transmitidos e pelos momentos de descontração que fizeram com que
me sentisse em casa dentro do UFSC.
Aos colegas do curso de Doutorado Boff, Elisa, Moira, Rodrigo e André
(Alemão), pelas dicas e experiências transmitidas que fizeram com que eu
conseguisse crescer dentro da nossa profissão.
Aos residentes do CEPID José, Monique, Rosana e Letícia, vocês são o
combustível do CEPID. Obrigado por toda ajuda dispensada nesse período.
As funcionárias Gisella, Mirian e Dolores, vocês representam muito bem o
nosso ambiente de trabalho e são diretamente responsáveis por este ser tão prazeroso.
A Baumer, em nome do Aguedo, por ter cedido os materiais para a realização
desta dissertação.
As amigas do Laboratório LVA Isa, Franci, Jéssi, Naira e Mari, somente
graças a ajuda de vocês consegui desenvolver toda parte experimental desse trabalho
e considero que nos tornamos além de colegas, bons amigos.
Ao amigo Daniel Romeu Benchimol de Resende, você foi responsável por eu
cursar este mestrado. Seus ensinamentos me tornaram apto a concluir esta etapa.
Considero-o como um irmão.
7
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ...............................................................................................................8
Resumo...............................................................................................................9
Abstract............................................................................................................10
CAPÍTULO II ............................................................................................................11
1 - Introdução...................................................................................................12
CAPÍTULO III ..........................................................................................................15
1 - Artigo versão em Português........................................................................16
2 - Artigo versão em Inglês..............................................................................36
CAPÍTULO IV ..........................................................................................................56
1 - Bibliografia Consultada.............................................................................57
CAPÍTULO V ............................................................................................................58
1 - Metodologia Expandida..............................................................................59
2 - Produção Científica durante o Mestrado...................................................68
8
CAPÍTULO I
9
PEREIRA-NETO, Armando Rodrigues Lopes. Análise do comportamento de
fibroblastos gengivais cultivados sobre diferentes tipos de membranas
reabsorvíveis. 2010. 69f. Dissertação (Mestrado em Odontologia – Área de
concentração Implantodontia) – Curso de Pós Graduação em Odontologia,
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
RESUMO
Cirurgias para reconstrução de tecido mole que utilizam material autógeno
aumentam a morbidade e o riscos de complicações com a segunda área cirúrgica.
Como alternativa para eliminar esses inconvenientes, a engenharia tecidual busca
encontrar um arcabouço ideal para carrear células e fatores de crescimento
responsáveis pela criação de tecidos em ambiente in vitro. Dessa forma o objetivo
deste estudo é analisar quatro membranas absorvíveis como potencial arcabouço para
a engenharia de tecidos. Foram utilizados fibroblastos humanos gengivais
provenientes de cultura primária. Quatro membranas foram utilizadas: Osseoguard
®
,
Genderm
®
, ácido poli(ácido lactico-co-glicólico) (PLGA) e ácido poli(ácido lactico-
co-glicólico) associado com hidroxiapatita (PLGA+HA). Testes de proliferação,
análise da degradação através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), teste de
viabilidade celular (MTT) e análise do pH do meio de cultura foram os métodos
utilizados para avaliar as membranas. Os índices de proliferação não foram
estatisticamente significativos entre grupos, contudo todas as membranas
possibilitaram a proliferação celular. A análise do MEV mostrou que as membranas
com base polimérica (PLGA e PLGA + HA) apresentam características mais
apropriadas a arcabouços para engenharia tecidual. Os níveis de viabilidade celular
diminuíram e os níveis de pH foram similares para todos os grupos exceto o PLGA
que se apresentou ácido. A membrana de PLGA + HA é a que apresenta melhores
características biológicas e estruturais para funcionar como arcabouço para a
engenharia de tecidos.
10
PEREIRA-NETO, Armando Rodrigues Lopes. Course Analysis of gingival
fibroblasts cultured on different types of biodegradable membranes. 2010. 69f.
Dissertação (Mestrado em Odontologia – Área de concentração Implantodontia) –
Curso de Pós Graduação em Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis.
ABSTRACT
Soft tissue reconstruction using autogenous material increases morbidity and
risk of complications with the second surgical area, the donor site. As an alternative to
eliminate these drawbacks, tissue engineering seeks to find an ideal scaffolds to wash
cells and growth factors that are responsible for a tissue environment fabrication in
vitro. Thus the aim of this study is to analyze four absorbable membranes as a
potential scaffold for tissue engineering. Human gingival fibroblasts (HGF) from
primary cell culture were used. Four types of bioabsorbable membranes were used as
cell carrier: OsseoGuard
®
, Genderm
®
, poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and poly
(lactic-co-glycolic) acid associated with hydroxyapatite (PLGA+HA). Proliferation
assays, degradation analysis by scanning electron microscopy (SEM) cell viability
assay (MTT) and pH analysis of the culture mediums were used to evaluate the
membranes. The proliferation index was not statistically significant between groups,
yet all the membranes allowed cell proliferation. The SEM analysis showed that the
membranes based on polymers (PLGA and PLGA HA) have more appropriate
scaffolds characteristics for tissue engineering. The level of cell viability decreased
and the pH levels were similar for all groups except that PLGA. The PLGA+HA
membrane has the best biological and structural functions as a scaffold for tissue
engineering.
11
CAPÍTULO II
12
1 - INTRODUÇÃO
A perda de elementos dentais traz prejuízos funcionais, estéticos e, inclusive,
de autoestima ao indivíduo. Com essa perda, o tecido ósseo sofre uma remodelação,
que muitas vezes dificulta ou até impossibilita a reabilitação com implantes ósseo-
integráveis (DAMIEN; PARSON, 1991; EVIAN; HARRIS 2001). A fim de
compensar essa limitação, pode-se lançar mão de técnicas de reconstruções do tecido
ósseo e do tecido mole. O material “padrão-ouro” utilizado como substituto ósseo é o
autógeno, porque tal material é o único que desempenha as três funções essenciais
para a formação óssea: osteogênese, osteoindução e osteocondução. Esse tecido é
obtido de áreas intraorais, como corpo e ramo mandibular e mento, ou de áreas
extraorais, como a crista ilíaca e a calota craniana (CLAVERO; LUNDGREN, 2003).
Outra situação corriqueira na clínica odontológica são a presença de recessões
e de depressões vestibulares, e a ausência de mucosa ceratinizada, que trazem
problemas estéticos funcionais e dificultam a manutenção da higiene por parte do
paciente. Nessas situações, enxertos de tecido mole autógeno (conjuntivo subepitelial,
epitélio conjuntivo) são também o padrão-ouro de escolha e podem ser obtidos do
palato, de áreas edêntulas e da região retromolar (CLAVERO; LUNDGREN, 2003).
Os benefícios do material autógeno estão bem fundamentados para essas
técnicas de enxertia, porém com um grande prejuízo, a necessidade de uma segunda
área doadora. Consequentemente, há maior morbidade, associada a riscos inerentes a
áreas submetidas a intervenções cirúrgicas, como deiscências de sutura e hemorragias
(CLAVERO; LUNDGREN, 2003; GRIFFIN et al., 2006).
Com o propósito de eliminar a segunda área cirúrgica, a literatura apresenta
substitutos ósseos e de tecido mole como osso alógeno, matriz derivada do esmalte,
osso bovino liofilizado e matriz dérmica acelular. Todos estes materiais possuem
resultados fundamentados na literatura pertinente, porém com custo normalmente
elevado, dificuldade de obtenção e resultados difíceis de serem previstos (EL-
ASKARY; PIPCO, 2000; IMBERMAN, 2007; PRATA; LACERDA;
BRENTEGANI, 2007).
Dentro do processo de evolução dos tratamentos reconstrutivos, sejam eles de
tecido duro ou de tecido mole, encontra-se a engenharia tecidual (ASSAEL, 2003).
Tal técnica consiste na produção de um tecido no meio extracorpóreo e em sua
implantação no indivíduo. A utilização da engenharia tecidual está diretamente
13
relacionada a três bases de uma tríade: a) o cultivo de células capazes de produzir o
tecido que desejamos reconstruir, ou células capazes de se diferenciar em tipos
específicos (células-tronco), células essas que, no caso dos tecidos orais periodontais
e peri-implantares, são, principalmente, os fibroblastos e os osteoblastos; b) fatores de
crescimento que irão guiar a diferenciação/proliferação dos vários tipos celulares,
além de permitir a vascularização do material implantado; e c) um arcabouço de
material absorvível capaz de armazenar tanto a cultura de células quanto esses fatores
de crescimento (MUSCHLER; NAKAMOTO; GRIFFITH, 2004).
As técnicas que envolvem cultura celular são eficientes e indispensáveis para a
avaliação da efetividade bases deste tríade. Esse tipo de estudo tem como principal
vantagem a facilidade de padronização da amostra, pois o pH, a temperatura, a tensão
de CO
2
e de O
2
e a pressão de CO
2
podem ser controlados de maneira facilitada e
eficiente. Além dessa vantagem, o modelo de estudo de cultura de células possibilita a
obtenção de culturas idênticas e tem um custo baixo quando comparado com estudos
in vivo (FRESHNEY, 1990).
Ainda não se chegou a um consenso sobre qual biomaterial tem melhor
desempenho no processo de engenharia de tecidos. Entre os tipos de arcabouços
disponíveis, a literatura mostra uma enorme gama desses materiais, como
hidroxiapatita (HA), fosfato de cálcio, fosfato tricalcio, colágeno do tipo I, ácido poli-
lático (PLA), ácido poli-glicólico (PGA), dentre outros (MIYAMOTO et al., 1992).
Estes biomateriais têm papel importante na construção de arcabouço para a
engenharia de tecido ósseo e tecido mole em decorrência de suas propriedades físico-
químicas e biológicas, biocompatibilidade, taxas diferentes de degradação, fácil
absorção, controle de sua macro e microestrutura (tamanho de poros) e incorporação e
liberação de proteínas com certo grau de substantividade (IGNATIUS; CLAES, 1996;
LANSMAN et al., 2006; GÓMEZ et al., 2006).
Em virtude destas propriedades, desenvolveram-se alguns estudos clínicos a
fim de testar a capacidade de arcabouços variados no cultivo in vitro de tecido
gengival sadio, com células cultivadas do próprio indivíduo. Para isso, utilizaram-se
estruturas formadas de colágeno do tipo I bovino e de ácido hialurônico, associado ou
não ao colágeno gel (McGUIRE et al., 2008; PINI PRATO et al., 2003; MURATA et
al., 2008). Os resultados obtidos através desses estudos mostra excelente aplicação da
engenharia tecidual para casos de enxertia de tecido mole, tanto para enxertos
14
conjuntivos para recobrimento radicular quanto para enxertos gengivais livres para
aumento/ganho de faixa de gengiva ceratinizada.
Para esse tipo de procedimento, o tipo celular utilizado é uma linhagem de
fibroblastos, algumas vezes associados a queratinócitos. Dessa forma, o objetivo deste
trabalho foi analisar o comportamento de fibroblastos humanos obtidos através de
cultura primária de tecido gengival, cultivados sobre membranas de colágeno
comercialmente disponíveis e sobre membranas de PLGA e PLGA + HA e assim
elencar quais dessas membranas podem ser usadas em futuras aplicações clínicas para
a engenharia de tecido mole, tanto para reconstruções ao redor de dentes, quanto ao
redor de implantes.
15
CAPÍTULO III
16
1 - ARTIGO
ANÁLISE DO COMPORTAMENTO DE
FIBROBLASTOS GENGIVAIS
CULTIVADOS SOBRE DIFERENTES
TIPOS DE MEMBRANAS
REABSORVÍVEIS.
Este artigo está formatado sob as normas da revista Journal of Periodontology.
17
Análise do comportamento de fibroblastos gengivais cultivados sobre
diferentes tipos de membranas reabsorvíveis.
Armando Rodrigues Lopes Pereira Neto*
Ariadne Cristiane Cabral Cruz†
Cláudia Maria Oliveira Simões‡
Águedo Aragonez§
Ricardo de Souza Magini||
* Mestrando em Implantodontia, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
† Doutoranda em Biotecnologia, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
‡ Professora do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Universidade Federal
de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
§ Pós-doutorando em Implantodontia, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
|| Coordenador do Programa de Pós-graduação em Implantodontia, Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
Endereço de Correspondência
*Armando Rodrigues Lopes Pereira Neto
Rodovia Amaro Antonio Vieira 2463, apto 405C
88034-101 – Itacorubi, Florianópolis – SC - Brasil
Tel: (48) 3209-9172 – (48) 9944-9909
e-mail: armandopn@gmail.com
18
RESUMO
Introdução: Cirurgias para reconstrução de tecido mole que utilizam material
autógeno aumentam a morbidade e o riscos de complicações com a segunda área
cirúrgica. Como alternativa para eliminar esses inconvenientes, a engenharia tecidual
busca encontrar um arcabouço ideal para carrear células e fatores de crescimento
responsáveis pela criação de tecidos em ambiente in vitro. Dessa forma o objetivo
deste estudo é analisar quatro membranas absorvíveis como potencial arcabouço para
a engenharia de tecidos.
Material e Métodos: Foram utilizados fibroblastos humanos gengivais provenientes
de cultura primária. Quatro membranas foram utilizadas: Osseoguard
®
, Genderm
®
,
ácido poli(ácido lactico-co-glicólico) (PLGA) e ácido poli(ácido lactico-co-glicólico)
associado com hidroxiapatita (PLGA+HA). Testes de proliferação, análise da
degradação através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), teste de
viabilidade celular (MTT) e análise do pH do meio de cultura foram os métodos
utilizados para avaliar as membranas.
Resultados: Os índices de proliferação não foram estatisticamente significativos entre
grupos, contudo todas as membranas possibilitaram a proliferação celular. A análise
do MEV mostrou que as membranas com base polimérica (PLGA e PLGA + HA)
apresentam características mais apropriadas a arcabouços para engenharia tecidual.
Os níveis de viabilidade celular diminuíram e os níveis de pH foram similares para
todos os grupos exceto o PLGA que se apresentou ácido.
Conclusão: A membrana de PLGA + HA é a que apresenta melhores características
biológicas e estruturais para funcionar como arcabouço para a engenharia de tecidos.
19
1 - INTRODUÇÃO
A perda de elementos dentais traz prejuízos funcionais, estéticos e, inclusive,
de autoestima ao indivíduo. Com essa perda, o tecido ósseo sofre uma remodelação,
que muitas vezes dificulta ou até impossibilita a reabilitação com implantes ósseo-
integráveis
1-3
. A fim de compensar essa limitação, pode-se lançar mão de técnicas de
reconstruções do tecido ósseo e do tecido mole. O material autógeno é o “padrão-
ouro” utilizado para tais procedimentos.
Uma situação corriqueira na clínica odontológica é a presença de recessões e
de depressões vestibulares e a ausência de mucosa ceratinizada, que trazem problemas
estéticos funcionais e dificultam a manutenção da higiene por parte do paciente.
Nessas situações, enxertos de tecido mole (conjuntivo subepitelial, epitélio
conjuntivo) podem ser realizados com material obtido do palato, de áreas edêntulas e
da região retromolar
4
.
Os benefícios do material autógeno estão bem fundamentados para essas
técnicas de enxertia, porém com a necessidade de uma segunda área doadora, que
representa grande prejuízo. Conseqüentemente, há maior morbidade, associada a
riscos inerentes a áreas submetidas a intervenções cirúrgicas, como deiscências de
sutura e hemorragias
4,5
.
Alternativas para evitar esse aumento de morbidade estão sendo pesquisadas.
Um substituto para tecido mole autógeno é a matriz dérmica acelular. Porém, com
grau de contração imprevisível e alto custo
6
. Grande atenção tem sido dispensada à
engenharia de tecidos, por meio da qual um arcabouço de material absorvível serve
como carreador para células associadas a fatores de crescimento.
Ainda não se chegou a um consenso sobre qual biomaterial tem melhor
desempenho no processo de engenharia de tecidos. Entre os tipos de arcabouços
disponíveis, a literatura mostra uma enorme gama desses materiais, como
hidroxiapatita (HA), fosfato de cálcio, fosfato tricálcio, colágeno do tipo I, ácido poli-
lático (PLA), ácido poli-glicólico (PGA), dentre outros
7
. Estes biomateriais têm papel
importante na construção de arcabouço para a engenharia de tecido ósseo e tecido
mole em decorrência de suas propriedades físico-químicas e biológicas,
biocompatibilidade, taxas diferentes de degradação, fácil absorção, controle de sua
macro e microestrutura (tamanho de poros), e incorporação e liberação de proteínas
com certo grau de substantividade
8-11
. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar
20
o comportamento de fibroblastos humanos obtidos através de cultura primária de
tecido gengival, cultivados sobre membranas de colágeno comercialmente disponíveis
e sobre membranas de PLGA e PLGA + HA. E assim elencar quais dessas
membranas podem ser usadas em futuras aplicações clínicas para a engenharia de
tecido mole, tanto para reconstruções ao redor de dentes, quanto ao redor de
implantes.
2 - MATERIAL E MÉTODOS
2.1 - Membranas absorvíveis
Foram utilizados quatro tipos de membranas absorvíveis, duas já disponíveis
no mercado – Genderm
®
(Baumer, Mogi Mirim, SP, Brasil) e Osseoguard
®
(Biomet
3i, Palm Beach, Florida, EUA) – e duas membranas-testes, uma produzida de
copolímero de poli(ácido lactico-co-glicólico) (PLGA) e outra de PLGA associado a
hidroxiapatita (PLGA + HA).
2.2 - Preparação das membranas de PLGA + HA e PLGA
Os arcabouços foram obtidos pela técnica de evaporação de solvente. O
copolímero de poli(ácido lactico-co-glicólico) – PLGA (Boehringer Ingelheim), na
proporção 82:18 (m:m), foi dissolvido em clorofórmio (Merck) (10% m/v) a
temperatura ambiente. Após a dissolução completa do polímero, partículas de
sacarose (Synth) (30% m/v) com tamanho inferior a 1.000 μm foram adicionados,
bem como as partículas de hidroxiapatita (20% m/v) (Genius, Baumer, Mogi Mirin,
Brasil). Essa solução foi vertida em moldes de 6cm
2
. Após a evaporação de solvente à
temperatura ambiente, a sacarose foi removida usando-se álcool poli-vinílico (PVA).
As membranas de PLGA foram fabricadas da mesma maneira, com exceção da adição
de partículas de HA.
2.3 – Caracterização das membranas
As membranas foram metalizadas em um suporte (Shimagzuc – 50TM) e a
presença de poros e formato da superfície foram examinadas usando microscopia
eletrônica de varredura (JSM-6390LV, JEOL, Tóquio, Japão). As micrografias foram
obtidas nos aumentos 1000, 1500, 2000 e 2500x. O tamanho dos poros foi
21
determinado usando um programa de análise de imagem (Digimizer
®
versão 3.7.0
Medical Software Brolkstraat, Bélgica).
Para analisar a degradação das membranas, colocou-se as mesmas em
cavidades de placas de 96 cavidades juntamente com 300µl de meio DMEM e
incubou-se a 37
o
C e 5% de CO
2
. Posteriormente a 48 e 72h removeu-se o meio de
cultura, lavou-se as membranas com PBS e desidratou-se com banho de álcool (50 –
100%). As membranas desidratadas foram processadas conforme o descrito acima
para microscopia eletrônica de varredura.
2.4 - Cultura Primária
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em Seres
Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC sob o número 021/09. O
tecido gengival saudável foi obtido de um paciente submetido a cirurgia de cunha
distal no Centro de Ensino e Pesquisa em Implantes Dentários (CEPID) da UFSC. A
amostra de 20mm
2
foi acondicionada para transporte em PSA 4% em solução salina
de fosfato tamponada (PBS). Em condições assépticas a amostra foi lavada por 2
vezes com PBS e, posteriormente, em condições assépticas o tecido epitelial foi
removido com o auxílio de cabo de bisturi nº 3 e lâmina cirúrgica nº 15, em placas de
Petri de 60mm de diâmetro, que continham 5ml do meio de cultura. Após a
desepitelização, a amostra foi fragmentada em 15 partes (explantes) de
aproximadamente 1mm
2
. Os explantes foram colocados garrafas de cultura de 25cm
2
com meio Dulbecco (DMEM; Cultilab, Campinas, Brasil) suplementado com 1% de
antibiótico e antifúngico (PSA) e 10% soro fetal bovino (SFB; Gibco, São Paulo,
Brasil) e foram mantidos a 37
o
C e 5% de CO
2
. O meio de cultura foi trocado 2 vezes
por semana e o crescimento celular foi avaliado diariamente por meio de microscópio
de fase invertida (40x a 200x, Olympus, Japão). Quando as células atingiram 70%
confluência os explantes foram removidos e lavou-se duas vezes com PBS. As células
foram tratadas com uma solução de tripsina EDTA (solução de tripsina 0,25% e 0,1%
de glicose dissolvida em 1mM de EDTA-salinos; Sigma-Aldrich Co.). A enzima foi
inativada com a adição de DMEM/SFB. Realizou-se subcultura na proporção de 1:1.
Fibroblastos humanos gengival da 6
a
passagem foram utilizados em todos os
experimentos deste estudo.
22
2.5 Teste de Proliferação
Para determinar a proliferação celular, os fibroblastos foram semeados a uma
densidade de 5 x 10
4
células por cavidades, em placas de cultura contendo 12
cavidades. Em 1, 2, 4, 6 e 7 dias, as células foram tripsinizadas, e a contagem de
células foi realizada no contador de células automatizado (Countess™, Invitrogen,
Carlstad, EUA).
2.6 Teste de Citotoxicidade
Os tempos experimentais adotados foram 19h, 72h e 8 dias. Fibroblastos
foram utilizados para avaliar a citotoxicidade das membranas por meio do teste MTT
[3 - (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-difenil tetrazolium bromide] (Sigma Aldrich, St
Louis, MO, EUA) de ensaio colorimétrico
12,13
com pequenas modificações.
Resumidamente, os fibroblastos foram semeados a uma densidade de 1,5 x 10
5
células
por poço em placas de 96 poços preenchidas com 300μl de meio de cultura. As placas
foram incubadas por 24h a 37 ºC e 5% de CO
2
. Os discos de 5mm de diâmetro de
cada uma das membranas testadas foram colocados nos poços. Após os tempos
experimentais, as percentagens de células viáveis foram determinadas. Para tanto, o
meio foi removido, e 50ml de solução de MTT (1 mg/ml) foram adicionados. As
placas foram reincubadas por 4h. Depois disso, a solução de MTT foi removida,
100μl de DMSO foram adicionados para dissolver os cristais de formazan, e as placas
foram gentilmente agitadas, de modo que os cristais ficassem completamente
dissolvidos. As absorbâncias foram medidas por meio do espectrofotômetro (Infinite
M200, TECAN, Áustria GmbH, Grödig, Áustria), com comprimento de onda da
ordem de 540nm, e as percentagens de células viáveis foram calculados em relação
aos controles, não tratados. Duas repetições foram feitas para as amostras.
2.7 - Análise do pH do meio
O pH foi determinado no sobrenadante de todas as amostras destinadas ao
teste de viabiliadade celular, com tiras de indicador de pH (Merck, Whitehouse
Station, NJ, E.U.A.)
2.8 - Análise Estatística
A reprodutibilidade intraexaminador do tamanho de poro foi testada com
coeficiente de correlação intraclasse (ICC). Comparações entre os grupos foram
23
submetidas a uma análise de variância não paramétrica (ANOVA), com as diferenças
avaliadas pelo teste de Student Newman-Keuls post-hoc. Intervalo de confiança de
95% foi aprovado (ρ<0,05). Todas as análises foram realizadas utilizando-se o
software GraphPad InStat 3, versão 3.10 para Windows
©
(Graph Pad Software Inc, La
Jolla, CA, EUA).
3 - RESULTADOS
3.1 – Caracterização das membranas
A análise visual do das imagens obtidas por meio do MEV mostram um
padrão de entrelaçados característicos das membranas de colágeno (Genderm
®
e
Osseoguard
®
). As imagens das membranas-testes (PLGA e PLGA+HA) apresentam
características diferentes, com um grau de porosidade que se manteve padrão durante
o período de degradação testado (Fig. 1). O ICC foi de 90%. As membranas de PLGA
apresentaram uma área média de 4,10µm
2
+1,14. Após os períodos de 48 e 72h os
valores foram da ordem de 6,50µm
2
+2,04 e 3,19µm
2
+0,69, respectivamente. Os
valores para área das membranas de PLGA+HA para controle, 48 e 72h foram
6,61µm
2
+1,76, 6,73µm
2
+1,58 e 9,95µm
2
+2,24. Não observou-se diferença (ρ>0,05)
nos tamanhos dos poros entre o grupo de PLGA e PLGA + HA, em nenhum período
avaliado. Para o grupo PLGA, observou-se diferença significativa (ρ<0,001) entre 72
e 48h, bem como 0 e 48h. Para o grupo PLGA + HA houve diferença significativa
(ρ<0,001) entre 0 e 72h, bem como 48 e 72h (Gráfico 1)
3.2 - Teste de Proliferação
Os resultados obtidos para proliferação quando comparados apenas os tempos
experimentais mostraram para 1, 2, 4, 6, 7d valores de 112%+86,47, 85%+20,20,
142%+36,88, 167%+0,43 e 60%+37,57, respectivamente. Os valores de proliferação,
nos períodos de 1, 2, 4, 6 e 7d, foram de 216, 100, 157, 100 e 28% para Genderm
®
;
Para Osseoguard
®
, foram de 150, 85, 71, 442 e 85%; Para PLGA, de 50, 57, 185, 28 e
28%; e para a membrana de PLGA+HA, os valores foram 33, 100, 128, 100 e 100%.
A análise de variância realizada por meio do ANOVA mostrou que não houve
diferença significativa entre os grupos durante os tempos experimentais (Gráficos 2 e
3).
24
3.3 - Teste de Citotoxicidade
Os resultados de citoxicidade celular foram de 31, 40, 64, e 26%, para as
membranas Genderm
®
, Osseoguard
®
, PLGA e PLGA+HA, respectivamente. A
diferença entre a citotoxicidade dos diferentes grupos não foi significativa (ρ>0,05).
Os resultados, quando comparados os grupos experimentais nos tempos de 19h, 72h e
8 dias foram 0, 18 e 75% no grupo Genderm
®
. Para Osseoguard
®
, foram 36, 0 e 85%.
Para a membrana PLGA foram 0, 97 e 94%; enquanto que para as membranas de
PLGA+HA foram 0, 10 e 66%. As diferenças foram significativas (ρ<0,05) entre os
períodos experimentais de 72h e 8 dias, bem como entre 19h e 8 dias (Gráficos 4 e 5).
3.4 - Análise do pH do meio
A membrana de PLGA apresentou pH 4 em 24 e 72h, e pH 5 em 96 e 120h. A
membrana Genderm
®
apresentou pH 8, 9, 9 e 9 em 24, 72, 96 e 120h,
respectivamente. A membrana Osseoguard
®
apresentou pH 9 em todos os tempos
experimentais. A membrana de PLGA+HA apresentou pH 8, 8, 9 e 9 em 24, 72, 96 e
120h, respectivamente (Gráfico 6).
4 - DISCUSSÃO
O processo de cultura celular está bem fundamentado na literatura. Suas
vantagens sobre outros tipos de modelos de estudo com a finalidade de testar
produtos, especialmente em animais, vão além das questões éticas. Passa pela
praticidade, baixo custo e facilidade de controlar variáveis, controle, muitas vezes,
difícil de ser realizado em outros modelos experimentais
14,15
. Dessa forma, foi
escolhido esse tipo de pesquisa, com a finalidade de avaliar o comportamento de
células presentes no tecido gengival sobre tipos de membranas que podem servir de
arcabouços para a engenharia de tecidos moles orais.
A engenharia tecidual está baseada na tríade células, arcabouço e fatores de
crescimento
16
. O arcabouço escolhido deve ser capaz de agregar os outros fatores, de
forma que possibilite a formação tecidual sem que haja alteração nas funções normais
do tecido
17
. Assim, este trabalho busca associar células presentes nos tecidos
25
gengivais a um arcabouço, para observar a influência desse material na viabilidade e
na proliferação celular.
Para a realização deste estudo, com finalidade de se desenvolver um carreador
para engenharia de tecidos gengival, foi eleita a utilização de fibroblastos gengivais
originados de cultura primária. Foram escolhidos fibroblastos da sexta passagem, por
apresentarem alta viabilidade e não apresentarem danos no DNA
18
. No futuro, ao
reconstruírem-se tecidos específicos para cada paciente doador de células, evitar-se-á
qualquer tipo de contaminação cruzada e aumentar-se-á a taxa de sucesso em virtude
de o material ter origens autógenas.
Essas células possuem com principais vantagens a facilidade de manuseio em
ambiente de cultura celular, grande capacidade de proliferação e fácil obtenção. Nesta
pesquisa, a escolha do cultivo de fibroblastos gengivais, eliminando os queratinócitos,
reside no fato demonstrado por Löe et al. (1971)
19
de que a ceratinização do epitélio
bucal é controlada por estímulos morfogenéticos do tecido conjuntivo subepitelial
ricos nesse tipo celular. Dessa forma, a cultura de fibroblastos existentes no tecido
conjuntivo da mucosa ceratinizada foi a primeira opção de cultivo.
A disposição estrutural do arcabouço para engenharia tecidual deve possuir
características específicas. Os arcabouços devem apresentar resistência mecânica,
para possibilitar adesão celular; precisam ser biocompatíveis e ser reabsorvidos pelo
organismo sem provocar qualquer tipo de alteração, seja ela funcional ou estrutural,
nas áreas adjacentes; devem possuir porosidade capaz de permitir migração e
povoamento celular; e devem possibilitar adesão e proliferação celular, além de ser
capazes de carrear fatores de crescimento
17,20,21
. Com os resultados obtidos por meio
da análise do MEV, observou-se que as membranas comercialmente disponíveis
(Osseoguard
®
e Genderm
®
) apresentam uma estrutura semelhante a uma fibra têxtil,
com fibras entrelaçadas e com ausência de porosidades, fatores indispensáveis para
criação in vitro de tecido gengival. Por outro lado, essa estrutura apresenta adjetivos
essenciais para a formação de barreiras responsáveis por impedir a migração de
células indesejáveis para procedimentos regenerativos (regeneração tecidual guiada e
regeneração óssea guiada)
22,23
.
Os poros foram medidos apenas das membranas que os apresentavam (PLGA
e PLGA+HA). Os resultados mostraram que porosidades de ambas as membranas
aumentaram em 48h. Esse aumento também foi observado no período de 72h com
membranas de PLGA+HA, porém em leve escala. Já a membrana de PLGA
26
apresentou uma redução drástica do tamanho dos poros. Este dado pode estar
relacionado a um possível preenchimento dos poros por partículas liberadas polímero
durante o processo de degradação. A adição de HA não alterou o tamanho dos poros
(p>0.05). Contudo os resultados estatísticos para comparações entre os tempos
experimentais mostrou diferenças estatisticamente significativas no grupo da
membrana PLGA e na PLGA+HA.
A proliferação celular foi avaliada por meio da coloração com azul de tripano
e contagem em contador automatizado. Os dados foram contabilizados em
porcentagens com relação ao controle celular. Entre os grupos testados, os dados não
apresentaram diferenças significativas, o que mostra que as membranas de polímero
possibilitam uma proliferação celular semelhante à das duas comercialmente
disponíveis. Esses achados corroboram outros trabalhos em que polímeros
possibilitam a proliferação celular, tanto para fibroblastos quanto para células do
tecido ósseo
24-26
. A adição de HA ao polímero, nesse momento, não alterou os
resultados quando comparado com a membrana que não apresentava essa estrutura, o
que difere do trabalho realizado por Sui et. al (2007)
27
em que a adição de HA ao
polímero PLLA possibilitou maior crescimento de osteoblastos quando comparado ao
grupo sem HA. Essa diferença parece estar relacionada ao tipo celular, já que a HA
está é um componente do tecido ósseo e por isso a maior afinidade a osteoblastos. Por
fim, vale ressaltar que, mesmo não apresentando resultados estatisticamente
significativos, membrana polimérica acrescida de HA mostrou valores absolutos
melhores que sua similar sem a presença de HA.
Vários trabalhos utilizaram membranas de colágeno como as utilizadas neste
estudo e comumente os resultados para proliferação de fibroblastos foi melhor nesse
tipo de material
28-31
. Tais dados fizeram com que estas membranas fossem escolhidas
para um controle. Os resultados para o teste de proliferação corroboram com os
obtidos por outros autores
32
que utilizaram fibroblastos de pele e não houve diferença
entre membranas de colágeno, quitosana e celulose. Outros autores
24
avaliaram a
biocompatibilidade de membranas reabsorvíveis e não-reabsorvíveis em fibroblastos
humanos do ligamento periodontal e células semelhantes a osteoblastos em culturas
de células. Seus resultados reportaram que as membranas de colágeno apresentaram
alta biocompatibilidade, enquanto que as de PTFE (poli-tetra-fluoretileno) e ácido
polilático induziram reações citotóxicas de leve a moderada.
27
A proliferação celular obteve resultados inferiores em 7 dias nos grupos
Genderm
®
, Osseguard
®
e PLGA se comparados com as taxas de proliferação das
primeiras 24h. Possivelmente isto ocorreu em virtude da inibição de proliferação por
contato celular. Quando se aproximaram de 7d, um alto grau de confluência foi
alcançado o que pode ter ocasionado a diminuição das taxas de proliferação nesses
grupos. O grupo de PLGA+HA, manteve os níveis de proliferação em 6 dias e 7 dias,
possivelmente ocasionado pelo mesmo motivo.
O nível de proliferação celular deve ser associado a resultados da viabilidade
dessas células. Nesse estudo foi realizado um teste que se baseia na atividade
mitocondrial da célula (MTT). Os resultados mostram que não houve diferenças entre
os grupos avaliados. Porém o os menores valores para viabilidade foram os
apresentados pela membrana de PLGA. Os resultados para as membranas de colágeno
e a membrana de PLGA + HA foram bem semelhantes. Esta semelhança também foi
observada nos resultados dos teste de variação do pH. A membrana de PLGA
apresentou valores mais baixos para o pH. O que parece explicar o resultados obtidos
na avaliação da viabilidade celular. A presença da HA funciona como “solução
tampão” graças a suas propriedades de manter o meio, como descrito em outros
trabalhos
33,34
. O que também foi observado é alcalinização de todos os meios de todos
os grupos, inclusive do controle. Isto ocorre pela liberação e degradação de proteínas
presente no meio.
Avaliando-se os resultados de viabilidade celular obtidos comparando-se os
tempos experimentais notou-se grande queda nos valores com o passar do tempo. A
diferença entre 72h e 8d foi estatisticamente significativa (ρ<0,05). O mesmo foi
observado quando comparados os resultados de 19h e 8d (ρ<0,05). Esses resultados
estão de acordo com os apresentados por Alpar et. al (2000)
24
que também estudaram
membranas de colágeno e membranas de polímeros.
Pode-se concluir que a membrana de PLGA + HA apresenta características
mais consistentes para servir de arcabouço para a engenharia tecidual. As membranas
de colágeno comercialmente disponíveis apresentaram condições similares a
membrana de PLGA + HA, contudo sua característica física impossibilita a utilização
desta como arcabouço.
28
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31
LEGENDAS DAS FIGURAS
Fig 1 – Imagens obtidas por meio do MEV mostra o padrão de degradação das
memabranas em meio de cultura durante os tempos avaliados (Controle, 48 e 72h)
Gráfico 1 – Efeito da degradação na área dos poros das membranas de PLGA,
PLGA+HA. Valores expressos em percentuais. Os dados são reportados como média
± DP (n = 3). A diferença entre a porosidade das duas membrana não foi significativa
(ρ> 0,05). ANOVA e Student-Newman-Keuls post hoc. Média do controle 48h e 72h.
Gráfico 2 – A proliferação celular, expressa em porcentagem de células viáveis em
relação ao número de células semeadas em cada período experimental. Os dados são
reportados como média ± DP (n = 4). A diferença entre a proliferação celular na
membrana de diferentes grupos não foi significativa (ρ> 0,05). ANOVA e Student-
Newman-Keuls post hoc
Gráfico 3 – Porcentagem de proliferação celular de cada uma das membranas em
relação ao grupo controle durantes os tempos experimentais 1, 2, 4, 6, e 7d. Não
houve diferença significativa estatisticamente (ρ> 0,05).
Gráfico 4 - Viabilidade da cultura de células com Genderm
®
, OsseoGuard
®
, PLGA,
PLGA membranas HA.Valores expressos em percentuais. Os dados são reportados
como média ± DP (n = 3). A diferença entre a citotoxicidade de diferentes grupos de
membrana não foi significativa (ρ> 0,05). ANOVA e Student-Newman-Keuls post
hoc. Média de 19h, 72h, e 8 dias.
Gráfico 5 - Viabilidade de células de cultura com Genderm
®
, OsseoGuard
®
, PLGA,
PLGA membranas HA.Valores expressos em percentuais. Os dados são reportados
como média ± DP (n = 3). (*) A diferença entre a citotoxicidade em 8 dias e 19h foi
significativa (ρ <0,05). (*) A diferença entre a citotoxicidade em 8 dias e 72h foi
significativa (ρ <0,05). Não houve diferença significativa entre 72h e 19h (ρ>
0,05). ANOVA e Student-Newman-Keuls post hoc.
Gráfico 6 – Variação do pH do meio de cultura com a presença das membranas e do
grupo controle.
32
LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS
Fig. 1
33
Gráfico 1
Gráfico 2
34
Gráfico 3
Gráfico 4
35
Gráfico 5
Gráfico 6
36
2 - MANUSCRIPT
COURSE ANALYSIS OF GINGIVAL
FIBROBLASTS CULTURED ON
DIFFERENT TYPES OF
BIODEGRADABLE MEMBRANES.
This manuscript if formatted according with the author’s guidelines of the Journal of Periodontology.
37
Course analysis of gingival fibroblasts cultured on different types of
biodegradable membranes.
Armando Rodrigues Lopes Pereira Neto*
Ariadne Cristiane Cabral Cruz†
Cláudia Maria Oliveira Simões‡
Águedo Aragonez§
Ricardo de Souza Magini||
* DDS, Graduate Student, Department of Dental Implantology, Federal University of
Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brazil.
† MSc, PhD Student, Biotechnology Department, Federal University of Santa
Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brazil.
‡ PhD, Head Professor, Biotechnology Department, Federal University of Santa
Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brazil.
§ PhD, Post-doctorate Student, Department of Dental Implantology, Federal
University of Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brazil.
|| PhD, Head Professor, Department of Dental Implantology, Federal University of
Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brazil.
Responsible for Correspondence
*Armando Rodrigues Lopes Pereira Neto
Amaro Antonio Vieira Street 2463, apartment 405C
ZIP CODE 88034-101 – Itacorubi, Florianópolis – SC - Brazil
Tel: + 55 48 3209-9172 – + 55 48 9944-9909
e-mail: armandopn@gmail.com
38
ABSTRACT
Background: Soft tissue reconstruction using autogenous material increases
morbidity and risk of complications with the second surgical area, the donor site. As
an alternative to eliminate these drawbacks, tissue engineering seeks to find an ideal
scaffolds to wash cells and growth factors that are responsible for a tissue
environment fabrication in vitro. Thus the aim of this study is to analyze four
absorbable membranes as a potential scaffold for tissue engineering.
Material and Methods: Human gingival fibroblasts (HGF) from primary cell culture
were used. Four types of bioabsorbable membranes were used as cell carrier:
OsseoGuard
®
, Genderm
®
, poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and poly (lactic-co-
glycolic) acid associated with hydroxyapatite (PLGA+HA). Proliferation assays,
degradation analysis by scanning electron microscopy (SEM) cell viability assay
(MTT) and pH analysis of the culture mediums were used to evaluate the membranes.
Results: The proliferation index was not statistically significant between groups, yet
all the membranes allowed cell proliferation. The SEM analysis showed that the
membranes based on polymers (PLGA and PLGA HA) have more appropriate
scaffolds characteristics for tissue engineering. The level of cell viability decreased
and the pH levels were similar for all groups except that PLGA.
Conclusion: The PLGA+HA membrane has the best biological and structural
functions as a scaffold for tissue engineering.
39
1 - INTRODUCTION
Tooth loss harms functional, aesthetic, and even self-esteem problems. With
this loss, the bone undergoes remodeling process can difficulty or even impossibility
the patient rehabilitation with osseointegrated dental implant
1-3
. To solve this
limitation, hard and soft tissue reconstructions techniques have been chosen. The
"gold standard" graft material used for these procedures is autogenous tissue.
A common scenario in dental practice is the presence of gingival recessions,
buccal depressions, and the absence of keratinized mucosa. These clinical situations
bring us functional and aesthetic problems, and make it difficult to maintain oral
hygiene by the patient. In such situations, soft tissue grafts (subepithelial, epithelial
tissue) can be performed from the palate, edentulous areas and retromolar region
donor site
4
. The benefits of autogenous material is well-founded in grafting
techniques, however, there is greater morbidity associated with the second surgery
site, as suture dehiscence and bleeding
4,5
.
Alternatives to avoid the second surgery site are being researched. A
replacement for autogenous soft tissue graft is an acellular dermal matrix. However,
the contraction degree is unpredictable and the material is expensive
6
. Great attention
has been devoted to tissue engineering, whereby an absorbable scaffold is use as a cell
carrier associated with growth factors. There are no consensus on which biomaterial
has better performance in the process of tissue engineering. There are many types of
scaffolds available, as hydroxyapatite (HA), calcium phosphate, tricalcium phosphate,
type I collagen, poly-lactic acid (PLA), poly-glycolic acid (PGA), and others
7
. Some
properties of these biomaterials play an important role in the development of bone and
soft tissue engineering, as physico-chemical properties, biological characteristics,
biocompatibility, degradation, absorption, pore size, and incorporation and release of
proteins
8-11
.
Therefore, the aim of this study was to analyze the human fibroblasts behavior
obtained from primary culture of gingival tissue, seeded on commercially available
collagen membranes and on PLGA and PLGA+HA membranes. And also to list
which of these membranes can be used in future clinical applications for soft tissue
engineering, for reconstructions, both around teeth and implants.
40
2 - MATERIALS AND METHODS
2.1 - Biodegradable membranes
Four types of absorbable membranes were used as cells carrier. Two are
commercially available: Genderm
®
(Baumer, Mogi Mirim, SP, Brazil) and
OsseoGuard
®
(Biomet 3i, Palm Beach, Florida, USA) and two tests membranes
produced of poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and other poly (lactic-co-glycolic)
acid associated with hydroxyapatite (PLGA+HA).
2.2 - Fabrication of PLGA+HA and PLGA membranes
Biodegradable membranes were obtaining by a solvent casting technique.
Poly(lactic-co-glycolic acid) PLGA (Böehringer Ingelheim) in proportions 82/18
(m/m) was dissolved in chloroform (Merck) (10% w/v). After complete dissolution
sucrose (Synth) (30% w/v) particles size less than 1000 μm and hydroxyapatite
particles (Genius-Baumer) (20% w/v) were added. After solvent casting at room
temperature, the sucrose was removed using poly(vinyl alcohol) (PVA). Similar
supports without hydroxyapatite were also investigated.
2.3 - Scanning Electron Microscopy (SEM)
The membranes were gold coated in an ion sputter (Shimadzu C-50TM) and
the microstructure (shape and surface) was examined using SEM (JSM T330TM
JEOL, Tokyo, Japan) with three replicates. Electron micrographs were obtained at
50x, 200x, 1000x and 10000x magnification to measure the pore size, to determine
the internal pore morphology and the surface scaffold. The porous size was measured
using image analysis software (Digimizer® version 3.7.0, MedCal software
Broekstraat, Belgium). The X-ray diffraction (XRD) (Bruker-AXS D5000, Madison,
WI, USA) spectrum was measured by the powder diffraction method using CuK
α
radiation with a wavelength of 1.54056 Å and scanning range 2θ = 1- 40°, step time
of 2 sec and 0.02
o
of step size (Laboratory of X-Ray Diffraction, Instituto de
Geociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul)
41
2.4 - Cell Culture
The Ethics Research Committee of Federal University of Santa Catarina –
UFSC, under a protocol number of 021/09, approved this study. Healthy gingival
tissue was obtained from a patient undergoing distal wedge surgery, at the Center for
Teaching and Research in Dental Implants (CEPID) of UFSC. A sample of 20mm
2
was packed for transport in PSA 4% supplemented with phosphate-buffered saline
solution (PBS). Under aseptic conditions, the sample was washed 2 times with PBS
and then epithelial tissue was removed with the aid of cable knife 3 and surgical blade
n
o
. 15, in a 60mm diameter Petri dishes, containing 5ml of culture medium. After
scarification, the sample was fragmented in 15 pieces (explants) of approximately
1mm
2
. The explants were suspended in 25cm
2
culture bottles with Dulbecco medium
(DMEM; Cultilab, Campinas, Brazil) supplemented with 1% antibiotic and antifungal
(PSA) and 10% fetal calf serum (FCS, Gibco, São Paulo, Brazil) and were maintained
at 37
o
C and 5% CO
2
. The culture medium was changed 2 times a week and cell
growth was evaluated by inverted phase microscope every day (40x to 200x,
Olympus, Japan). When the cells reached 70% confluence, the explants were removed
and washed twice with PBS solution. Cells were treated with a trypsin EDTA solution
(trypsin 0.25% and 0.1% glucose dissolved in 1 mM EDTA-saline, Sigma-Aldrich
Co.). The enzyme was inactivated by adding DMEM / FCS. Subculture was carried
out at a ratio of 1:1. Human gingival fibroblasts from the 6th passage were used in all
experiments of this study.
2.5 - Cell proliferation assay
To determine cell proliferation, gingival fibroblasts at passage 6 were seeded
at a density of 5 x 10
4
cells per well in a 12-well tissue culture plates. Cells were
trypsinized at days 1, 2, 4, 5, 6, 7, and cell counting was performed at the same
automated cell counter (Countess™, Invitrogen, Carlstad, USA).
2.6 - Determination of citotoxicity of biodegradable membranes by MTT
assay
Experimental times used were 19h, 72h e 8d. Gingival fibroblasts were used to
assess the cytotoxicity and cell viability of all the biodegradable membranes by MTT
[3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (Sigma Aldrich, St
Louis, MO, USA) colorimetric assay
12,13
with minor modifications. Briefly, human
42
gingival fibroblasts were seeded at a density of 1,5 x 10
5
cell per well in 96-well
plates filled with 300µL of cell culture medium. The plates were incubated for 24h at
37°C and 5% CO
2
. The 5mm discs of biodegradable membranes were placed in the
wells. The percentages of viable cells were determined after 1, 3 and 7 days of
incubation. The medium was removed and 50µL of MTT solution (1mg/mL) was
added. The plates were reincubated for 4h. After that, the MTT solution was removed,
100µL of DMSO was added to dissolve formazan crystals and the plates were gently
shaken, whereby crystals were completely dissolved. The absorbances were measured
(Infinite M200, TECAN Austria GmbH, Grödig, Austria) at a wavelength of 540nm,
and the percentages of viable cells were calculated when compared to untreated
controls. Two replicates were done for samples and negative controls.
2.7 - pH supernatants determination
The pH was determinate in supernatants of all tested samples (with and
without cylindrical discs of membranes) with pH indicator strips (Merck, Whitehouse
Station, NJ, USA).
2.8 - Statistical Analysis
Comparisons among groups were tested with Non-parametric one-way
analysis of variance (ANOVA) with differences assessed using the Student Newman–
Keuls post hoc test and a confidence interval of 95% was adopted (ρ<0.05). All
analyses were performed using a software program (GraphPad InStat 3, version 3.10,
Windows version, Graph Pad Software Inc, La Jolla, CA, USA).
3 - RESULTS
3.1 - Scanning Electron Microscopy (SEM)
The visual analysis through SEM observations shows an interwoven pattern of
collagen membranes (Genderm
®
OsseoGuard
®
). The images of test membranes
(PLGA and PLGA+HA) had different characteristics. A degree of porosity that
remained standard during the degradation test (Fig. 1). The ICC was 90%. The
membranes of PLGA showed an average area of 4.10µm
2
+1.14. After periods of 48
and 72h values were around 6.50µm
2
+2.04 and 3.19µm
2
+0.69, respectively. The
43
values for membranes PLGA + HA to control sample, 48 and 72 hours were
6.61µm
2
+1.76, 6.73 microm2 +1.58 and 9.95 microm2 +2.24. No difference was
observed in pore sizes between the group of PLGA and PLGA + HA, in any study
period (ρ> 0.05). For the PLGA group, there was significant difference (ρ <0.001)
between 72 and 48, and 0 and 48h. For the PLGA + HA group was significant
difference (ρ <0.001) between 0 and 72 and 48 and 72h (Fig. 2)
3.2 - Cell proliferation assay
Cell proliferation expressed as percentage of viable cells in relation with the
number of cells plated in each experimental period 1, 2, 4, 6, 7d. Data are reported as
mean ± SD (n=4). Values of 112% +86.47, +20.20% 85, 142% +36.88, 167% +0, 43
and 60% +37.57, respectively. The values from proliferation at 1, 2, 4, 6 and 7d, were
216, 100, 157, 100 and 28% for Genderm
®
; For Osseoguard
®
, were 150, 85, 71, 442
and 85%. For PLGA, 50, 57, 185, 28 and 28%, and the membrane of PLGA + HA,
the values were 33, 100, 128, 100 and 100%. The variance analysis performed using
the ANOVA showed no significant difference between the groups during the
experimental period (Fig. 3 and 4).
3.3 - Determination of citotoxicity of biodegradable membranes by MTT
assay
The results from cytotoxicity assay expressed as percentage were 31, 40, 64,
and 26% for the membranes Genderm
®
, OsseoGuard
®
, PLGA and PLGA + HA,
respectively. The difference between the cytotoxicity of different membranes groups
was not significant (ρ> 0.05). The results, when compared membranes groups from
19h, 72h and 8 days were 0, 18 and 75% in group Genderm
®
. From OsseoGuard
®
were 36, 0 and 85%. For the PLGA membrane were 0, 97 and 94%, while for the
membranes of PLGA + HA were 0, 10 and 66%. The differences were significant (ρ
<0.05) between the experimental periods of 72 hours and 8 days, and between 19h
and 8 days (Figures 5 and 6).
3.4 - pH supernatants determination
The PLGA membrane showed pH value 4 in 24 and 72, and 5 at 96 and 120h.
Genderm
®
membrane showed pH value 8, 9, 9 and 9 in 24, 72, 96 and 120h,
respectively. OsseoGuard
®
membrane showed pH value 9 in all experimental times.
44
The membrane of PLGA + HA showed pH value of 8, 8, 9 and 9 in 24, 72, 96 and
120h, respectively (Fig. 7)
DISCUSSION
The process of cell culture is well documented in the literature and has
advantages over other types of study design in order to test products, especially in
animals, go beyond the ethical aspects. Replaced by practicality, low cost and ease
control of variables, witch is often difficult to be realized in other experimental
models
14,15
. It was chosen this study design, in order to evaluate the performance of
gingival cells on different types of biodegradable membranes, that can be used as
scaffolds for oral soft tissue engineering.
Tissue engineering is based on the triad of cells, scaffolds and growth
factors
16
. The scaffold chosen should enable tissue formation without altering the
normal functions of tissue
17
. This paper aims to seed cells present in the gingival
tissues into a scaffold and observe the material influence on cells viability and
proliferation. It was used gingival fibroblasts originated from primary
culture. Fibroblasts seeded were from sixth passage. This choice was made because
the high viability and absence of DNA damage at this passage
18
. The resources are
trying to make possible, in the future, rebuild tissues using specific patient's donor
cells, in order to prevent any cross-contamination and increase the success rate.
These fibroblasts have major advantages, as easy handling in an environment
of cell culture, great proliferation capacity, and accessibility. This study worked with
gingival fibroblasts, eliminating keratinocytes, beacuse the keratinization of oral
epithelium is controlled by morphogenetic subepithelial connective tissue stimuli
19
.
Thus, the existing culture of fibroblasts in the connective tissue of keratinized mucosa
was the first choice of seeding.
The structural layout of the scaffold for tissue engineering must have specific
characteristics, and the scaffold should provide mechanical strength to enable cell
adhesion; must be biocompatible; be reabsorbed by the body without causing any
changes, whether structural or functional, in adjacent areas; must have porous to
allow cellular migration and settlement, and must allow cell adhesion and
proliferation as well as being able to adduce and release growth factors
17,20,21
. The
45
results obtained by analyzing the SEM images were that the membranes commercially
available (OsseoGuard
®
and Genderm
®
) have a microstructure similar to a textile
fiber with woven fibers and the absence of porosity. The presence of porous is an
essential aspect for in vitro tissue engineering. On the order hand, this structure has
essential adjectives for guide tissue barriers. These structures are responsible for
preventing the undesirable migration of cells in regenerative tissue procedures
(guided tissue regeneration and guided bone regeneration)
22,23
.
The pores were measured only in the membranes PLGA and PLGA+HA. The
results showed that porosity of both membranes increased at 48h. This was also
observed at the 72 hours period of PLGA membranes with HA, but in a mild scale.
Since then the PLGA membrane showed a drastic reduction in the size of pores. This
finding may be related to a possible pores filling by polymer particles released during
the degradation process. The addition of HA did not alter the pore size (p> 0.05). But
the statistical results for comparisons between experimental times showed statistically
significant differences in the membrane group in PLGA microspheres and HA.
Cell proliferation was assessed by trypan blue staining assay and counting
were performed in automated counter. The data were recorded as percentages relative
to control cells. Among the groups tested, the data showed no significant differences,
indicating that the polymer membranes enable a cellular proliferation values similar to
the two commercially available ones. These findings corroborate with other studies
that investigated which polymers cell proliferation, both fibroblasts and osteoblasts-
like cells
24-26
. The addition of HA particles to the polymer scaffold at that time did not
alter the results compared with the membrane that did not have this structure, which
differs from the research of Sui et. al (2007)
27
. Their results showed that the addition
of HA to PLLA polymer increased the osteoblasts growth when compared to those
without HA. This difference seems to be related to cell type, since the HA is a
component of bone tissue and therefore this cells must have greater affinity to it.
Finally, it is noteworthy that, while it was not observed statistically significant results,
polymer membrane plus HA showed greater values than their similar without the
presence of HA.
Several studies used collagen membranes as this one. The results from
fibroblasts proliferation showed better values when seeded on this type of material
28-
31
. This is the reason that these membranes were chosen for a control group. Results
for the proliferation test corroborate with those obtained by other authors
32
using skin
46
fibroblasts. There was no difference between collagen, chitosan membranes and
cellulose. Other authors
24
evaluated biocompatibility of resorbable and non-
absorbable membranes in human fibroblasts, periodontal ligament cells and
osteoblasts-like cells cultures. Their findings reported that the collagen membranes
showed high biocompatibility, while those of PTFE (poly-tetra-fluoroethylene) and
polylactic acid induced cytotoxity reactions of mild to moderate scale.
Cell proliferation results obtained at 7 days in groups Genderm ®, Osseguard
® and PLGA were lower rates than that obtained from cell proliferation at the first 24
hours. Possibly, this was due to the inhibition of proliferation by cell contact. When
approached 7d, a high degree of confluence has been reached which may have caused
the lower rates of proliferation in these groups. The group of PLGA+HA, maintained
the levels of proliferation in 6 days and 7 days, possibly caused by the same reason.
The level of cell proliferation must be associated with results of viability assays of
these cells. In this study we performed a test based on the cell mitochondrial activity
(MTT). The results show that there were no differences between the groups. On the
other hand, the lower values for viability were presented by the PLGA membrane.
The results from HA membranes and collagen microspheres membranes were quite
similar. This similarity was also observed in the pH supernatants determination.
PLGA membrane showed lower values for pH. It seems to explain the results from
cell viability assay. The presence of the HA acts as a "buffer solution" because of its
properties to maintain the environment, as described elsewhere
33,34
. It was also
observed alkalinization of the culture medium of all tested groups, including the
control group. This occurred because of the release and degradation of proteins
present in the culture medium.
Evaluating the results from cell viability obtained by comparing the
experimental periods showed a great decline in values over time. The difference
between 72h and 8d was statistically significant (ρ <0.05). The same was observed
when comparing the results of 19h and 8d (ρ <0.05). These results are consistent with
those presented by Alpar et. al (2000)
24
, who also studied collagen membranes and
polymer membranes.
It can be concluded that the PLGA+HA membrane has more consistent
characteristics to be used as a scaffold for tissue engineering. Commercially available
collagen membranes showed similar conditions to PLGA+HA membrane, however its
47
physical microstructure makes it impossible to use these membranes as a tissue-
engineering scaffold.
48
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51
FIGURE LEGENDS
Fig 1 – SEM images of the degradation pattern of membranes in culture during the
experimental times periods (control, 48 and 72h).
Fig 2 – Effect of degradation of the membranes pores areas of PLGA,
PLGA+HA. Values expressed as percentages. Data are reported as mean ± SD (n =
3). The difference between the two membranes porous was not significant (ρ>
0.05). ANOVA and Student-Newman-Keuls post hoc. Average of experimental
(control, 48 and 72h).
Fig. 3 – Cell proliferation expressed as percentage of viable cells in relation with the
number of cells plated in each experimental period. Data are reported as mean ± SD
(n=4). The difference between cell proliferations at different membrane groups was
not significant (ρ>0.05). ANOVA and Student-Newman-Keuls post hoc test.
Fig. 4 – Cell proliferation expressed as percentage of viable cells of each membrane
group in relation with the number of cells plated in each experimental period. Data are
reported as mean ± SD (n=4). The difference between cell proliferations at different
membrane groups was not significant (ρ>0.05). ANOVA and Student-Newman-Keuls
post hoc test.
Fig. 5 - Cytotoxity of cells culture with Genderm, OsseoGuard, PLGA, PLGA-HA
membranes. Values expressed as percentage. Data are reported as mean ± SD (n=3).
The difference between cytotoxicity at different membrane groups was not significant
(ρ>0.05). ANOVA and Student-Newman-Keuls post hoc test. Average of 19h, 72h,
and 8 days.
Fig. 6 - Cytotoxity cells of culture with Genderm, OsseoGuard, PLGA, PLGA-HA
membranes. Values expressed as percentage. Data are reported as mean ± SD (n=3).
(*) The difference between cytotoxicity at 8 day and 19h was significant (ρ<0.05).
The difference between cytotoxicity at 8 day and 72h was significant (ρ<0.05). There
was no significant difference between 72h and 19h (ρ>0.05). ANOVA and Student-
Newman-Keuls post hoc test.
Fig. 7 – Changes in pH of culture medium in the presence of membranes and the
control group.
52
FIGURES AND TABLES LIST
Fig. 1
53
Fig. 2
Fig. 3
54
Fig. 4
Fig. 5
55
Fig. 6
Fig. 7
56
CAPÍTULO IV
57
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58
CAPÍTULO V
59
1 - METODOLOGIA EXPANDIDA
Fig. 1 – Tecidos conjuntivo e epitelial colhidos por meio de cirurgia de cunha distal.
60
Fig. 2 – Amostra dentro do tubo de 15ml acondicionada para transporte em PSA 4%
em solução salina de fosfato tamponada (PBS).
61
Fig. 3 - Os explantes de aproximandemente 1mm
2
colocados garrafas de cultura de
25cm
2
com meio DMEMsuplementado com 1% de antibiótico e antifúngico (PSA) e
10% soro fetal bovino e foram mantidos a 37
o
C e 5% de CO
2
62
Fig. 4 – Fibroblastos após treze dias da cultura primária.
63
Fig. 5 – Fibroblastos após 20 dias da cultura primária.
64
Fig. 6 – Placa de 96 cavidades com meios de cultura e membranas no dia 0.
65
Fig. 7 – Placa de 96 cavidades com meios de cultura e membranas após 48h. Notem
alteração de coloração do meio indicando pH ácido.
66
Fig. 8 – Kit utilizado para medir o pH dos meios de cultura.
67
INSERIR COMITE DE ETICA
68
2 - PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O MESTRADO
Lista de trabalhos publicados e/ou aceitos para a publicação durante o Mestrado
Malta DAMP, Pereira-Neto ARL, Mattevi GS, Ponte-Filho MX, Bosco VL, Rath IB
da S. O uso do termo de consentimento livre e esclarecido e o respeito à dignidade
humana. Revista Ciências da Saúde (UFSC) 27:7-12, 2008.
Siqueira AF, Cunha HA, Pereira-Neto ARL, Resende DRB, Nary-Filho H, Benfatti
CAM, Magini RS. O uso da prototipagem para planejamento de implantes
zigomáticos em maxila atrófica. Revista Dental Press de periodontia e implantologia,
3:62-70, 2009.
Pereira-Neto ARL, Benfatti CAM, Sella GC, Cordero EB, Souza JGO, Magini RS.
Previsibilidade na obtenção de estética e função com retalhos pediculados na
Implantodontia: revisão de literatura. Implant News, aceito para publicação 2010.
Souza JGO, Benfatti CAM, Bianchini MA, Pereira-Neto ARL, Magini RS. Estética e
previsibilidade do enxerto conjuntivo subepitelial no recobrimento radicular.
Perionews, aceito para publicação 2010.
Capítulo de Livro publicado
Pereira-Neto ARL, Souza-Junior JM, Bianchini MA. Importância da mucosa
ceratinizada na prevenção e tratamento das doenças peri-implantares. In: Sescad,
ABO. (Org). PRO-ODONTO IMPLANTE – Programa de atualização em
Implantodontia.. 1 ed. Porto Alegre: Artmed/Panamericana, 2010, v. 4-1, p. 137-168.
Artigos enviados para publicação
Bianchini MA, Fortes CF, Benfatti CAM, Pereira-Neto ARL, Bez LV, Buttendorf
AR. Non-surgical peri-implantitis treatment: A ten year clinical and radiographic
follow-up. Quintessence International, 2010.
Bianchini MA, Cordero EB, Sella GC, Bez LV, Perira-Neto ARL, Souza JGO. Injerto
gingival libre como mantenimiento de los tejidos peri implantares: reporte de caso
clínico. Acta Odontológica Venezolana, 2009.
Resumos Publicados em Anais de Eventos
Lucchiari-Junior NB, Magini RS, Cardoso AC, Bianchini MA, Andrade PCAR,
Lopes DK, Perira-Neto, ARL, Ely LMB. O papel da mucosa ceratinizada peri-
implantar na manutenção de saúde: estudo retrospectivo. Brazilian Oral Research,
23:314-314. 2009
Ely LMB, Boff LL, Oderich E, Bianchini MA, Lucchiari-Junior NB, Perira-Neto
ARL, Cordero EB, Sella GC. Avaliação da experiência de dor nas cirurgias de
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primeiro e segundo estágio de implantes dentários em 115 pacientes. 2009. Brazilian
Oral Research, 23:128-128, 2009
Lopes DK, Andrade PCAR, Bianchini MA, Souza JGO, Lucchiari-Junior NB,
Pereira-Neto ARL, Cordero EB, Benfatti CAM. Avaliação clínica e radiográfica da
condição de saúde peri-implantar em pacientes diabéticos. Brazilian Oral Research,
23:178-178, 2009
Pereira-Neto ARL, Bianchini MA, Benfatti CAM, Bez LV, Magini RS, Ferreira CF,
Pontual MAB. Bone promotion evaluation by associating bovine bone screws and
membrane. In: 87th General Session & Exhibition of the IADR, 2009, Miami. Journal
of Dental Research, 88 (A):2078, 2009
Bianchini MA, Ferreira CF, Benfatti CAM, Buttendorf AR, Cordero EB, Pereira-Neto
ARL, Lucchiari-Junior NB, Souza JGO. Gingival graft prior to and after delivery of
implant supported prostheses. In: 87th General Session & Exhibition of the IADR,
2009, Miami. Journal of Dental Research, 88(A):2873 2009
Andrade PCAR, Ribeiro CG, Cardoso AC, Leão MP, Sella GC, Benfatti CAM,
Pereira-Neto ARL. Influence of laboratory procedures on the UCLA abutments'
rotation degree. In: 87th General Session & Exhibition of the IADR, 2009, Miami.
Journal of Dental Research, 88(A):1224, 2009.
Lucchiari-Junior NB, Magini RS, Cordero EB, Bez LV, Lopes DK, Binchini MA,
Pereira-Neto ARL, Benfatti CAM. Análise microscópica de explantes de tecido
epitelial e conjuntivo após expansão: estudo in vivo. Brazilian Oral Research, 22:178-
178, 2008
Lopes DK, Benfatti CAM, Magini RS, Lucchiari-Junior NB, Pinto-Junior DS,
Pereiro-Neto ARL, Araújo MAR, Binchini MA. Análise dos efeitos tóxicos
dostratamentos de periimplantite em osteoblastos, sobre diferentes tipos de superfícies
de implantes. Brazilian Oral Research, 22:234-234, 2008.
Pereira-Neto ARL, Magalhães-Junior EB, Magini RS, Bianchini MA, Cordero
EB, Benfatti CAM, Andrade PCAR, Buttendorf AR. Análise da frequência de
ressonância de implantes zigomáticos submetidos a função imediata/precoce: estudo
clínico comparativo de 6 meses. Brazilian Oral Research, 22:235-235, 2008.
Cordero EB, Siqueira AF, Magini RS, Bianchini MA, Cardoso AC, Pereira-Neto
ARL, Sella GC, Fernandes MF. Ánalise pelo método dos elementos finitos de um
dispositivo para estabilização de implantes em áreas de pneumatização de seio
maxilar. Brazilian Oral Research, 22:263-263, 2008.
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