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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Doenças Infecciosas e Parasitárias
ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN
VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM
FALCIPARUM
CAROLINA DE BUSTAMANTE FERNANDES
Rio de Janeiro
2009
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ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE
RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS
DE PLASMODIUM FALCIPARUM
CAROLINA DE BUSTAMANTE FERNANDES
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
(Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade
de Medicina, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Aplicadas à Infectologia
Orientador: Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis
Rio de Janeiro
Maio/2009
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Bustamante, Carolina
Análise de marcadores moleculares e de resistência in vitro às
quinoleínas em isolados de Plasmodium facilparum. – Rio de Janeiro:
UFRJ / Faculdade de Medicina, 2009.
xv, 202 f. : il. ; 31 cm.
Orientador: Mariano Gustavo Zalis
Dissertação (Mestrado) – UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa
de Pós-Graduação em Medicina – Doenças Infecciosas e Parasitárias,
2008.
Referências Bibliográficas: f. 109-124
1. Antimaláricos. 2. Resistência. 3.Plasmidium falciparum. 4.pfcrt.
5. pfmdr1 – Tese. I. Bustamante, Carolina. II. Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação
em Medicina – Doenças Infecciosas e Parasitárias. III. Título.
ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN
VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM
FALCIPARUM
Carolina de Bustamante Fernandes
Orientador: Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia
Aprovada por:
__________________________________________
Presidente, Prof. Dr.
__________________________________________
Prof. Dr.
__________________________________________
Prof. Dr.
Maio/2009
ii
A meus pais, Marcio Fernandes e Glaucia
Bustamante, que desde sempre me conduziram ao
caminho do saber.
À minha família, em especial minha irmã Luisa e
minha avó Ivana pelo constante apoio e estímulo no
meu desenvolvimento pessoal. Ao meu namorado,
Marco, pela dedicação, amor e incentivo.
iii
AGRADECIMENTOS
Essa tese foi construída e realizada com o apoio infinito de diversas pessoas
e instituições. Deixo aqui meus sinceros agradecimentos:
Ao Prof. Mariano Zalis, meu orientador, pela atenção, amizade, apoio e
paciência durante todos esses anos, agradeço por me ensinar que sempre é
possível ir além, mesmo tendo que dar um passo para trás a fim de alcançar dois à
frente.
Ao Laboratório de Infectologia e Parasitologia Molecular e a meus colegas
de trabalho que me acompanharam de perto nessa jornada, agradeço pelo apoio e
descontração de todos os dias. Sem dúvida, muitos se tornaram amigos e a esses
sou grata, em especial, à Zalona, pelo apoio incondicional de todas as horas, dentro
e fora do laboratório, por toda a ajuda nos procedimentos, correção da tese e pela
constante amizade. À Camomila, companheira desde o primeiro semestre da
faculdade, agradeço por todas as gargalhadas, descontração e pela amizade. A
Rafael, pela rabugice engraçada que sinto tanta falta, agradeço por toda ajuda na
parte estatística dessa tese. Ao querido Aspira, André, pela descontração de todos
os dias. Aos outros membros do laboratório, mesmo os que estão longe ou os que
traçaram outros caminhos: Anna Carla, Dani, Flávia, Luis, Martolina, Larissa, Camile,
Alex, Érica, Omaira, Babs.
À Elieth Mesquita e à minha segunda família de Porto Velho, que me
receberam de braços abertos, agradeço por todos os momentos e pelo
conhecimento que adquiri neste tempo.
iv
Ao Prof. Amilcar Tanuri e seu laboratório, onde realizei todo o
sequenciamento. Em especial à Monica e à Anna Flavia por toda paciência e ajuda.
À tia Wilma, secretária da DIP, por ajudar na elaboração da estrutura da
tese.
Ao seminário Laveran & Deane sobre malária, pela semana de intenso
aprendizado.
À pós-graduação em Medicina – Doenças Infecciosas e Parasitárias.
À minha família, por todos os conceitos divididos, ensinados e aprendidos,
pelo apoio e confiança em mim depositados em todos os momentos de minha vida.
Agradeço, em especial à minha avó, que mesmo na distância, está sempre em meu
pensamento e a meus irmãos, a constante alegria e muito amor.
Aos meus pais, pela confiança que possuem em mim, desde a minha
infância até os dias de hoje. São exemplos de determinação, dedicação,
honestidade, muita felicidade e amor. Agradeço por todos os momentos em que
estamos juntos, sempre nos passando segurança e tranqüilidade a fim de que
realizássemos todos os nossos objetivos.
À minha mãe, minha irmã e namorado pela paciência infinita na correção da
tese.
v
RESUMO
ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS
QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM
Carolina de Bustamante Fernandes
Orientador: Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia.
A malária é a doença parasitária de grande impacto na saúde pública, causando
aproximadamente 500 milhões de casos clínicos e um milhão de óbitos. A emergência de
parasitos resistentes representa um grande desafio para o controle da doença nas áreas
endêmicas. Estudos sugerem que mutações pontuais, principalmente em proteínas
transportadoras, são responsáveis pela redução da sensibilidade do parasito aos
antimaláricos. Um estudo realizado por Mu e cols (2003) demonstrou que 11 genes tiveram
uma associação significativa com a susceptibilidade in vitro à CQ e à QN de cepas de
laboratório. Dois destes genes, pfcrt e pfmdr1 já foram bem caracterizados, enquanto pouco
se conhece sobre os outros nove. Nesse estudo associamos os níveis de susceptibilidade in
vitro de P. falciparum às mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, PfA0590w (G2), PfE0775c
(G47) e Pf13-0271 (G7) de amostras coletadas em Porto Velho, Rondônia, Brasil e em
Ibadan, Nigéria. A avaliação da susceptibilidade in vitro à Cloroquina, Mefloquina,
Amodiaquina e Quinina foi realizada pelo microteste e a análise das mutações por
sequenciamento. Foi demonstrada resistência à Cloroquina em 96,5% dos isolados
brasileiros e em 22,1% dos isolados nigerianos e resistência à Amodiaquina em 15% dos
isolados brasileiros e 33,9% dos isolados nigerianos. As mutações K76T, N86Y, S263P e
S241A nos genes pfcrt, pfmdr1, G47 e G2, respectivamente, foram associados à resistência
à Cloroquina. Enquanto que mutações K76T, N86Y e N834N&1 no gene G7 foram
associadas à resistência à Amodiaquina. Além disso, foi observada resistência cruzada
entre as drogas Cloroquina e Amodiaquina e Amodiaquina e Mefloquina. Esse estudo
demonstrou um aumento da resistência à Amodiaquina no Brasil e na Nigéria, e uma
redução na susceptibilidade do parasito à Cloroquina no Brasil. Também ficou evidenciado
que mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 estão associadas à susceptibilidade à
Amodiaquina e à Cloroquina.
Palavras-chave: Antimaláricos, resistência, malária, falciparum, pfcrt, pfmdr1
Rio de Janeiro
Maio/2009
vi
ABSTRACT
ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AND OF IN VITRO RESISTANCE TO
QUINOLEINES FROM PLASMODIUM FALCIPARUM ISOLATES
Carolina de Bustamante Fernandes
Orientador: Prof. Mariano Gustavo Zalis
Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia
Malaria is a parasitic disease with major impact in the public health, causing
approximately 500 million clinical cases and a million of deaths. The emergence of resistant
parasites is one of the major challenges to control malaria in the endemic areas. The
literature describes punctual mutations, mainly in transporter proteins, as responsible for the
susceptibility decrease to antimalarial drugs. A study performed by Mu et. al. (2003) showed
that 11 genes had a significant association with in vitro resistance to CQ and QN. Two of
these genes, pfcrt and pfmdr1, are well characterized, albeit little is known about the other
nine genes. In this study we have associated the in vitro susceptibility levels with the
mutations in the pfcrt, pfmdr1, PfA0590w (G2), PfE0775c (G47) and Pf13-0271 (G7) genes
from P. falciparum samples collected at Porto Velho, Rondônia, Brasil and Ibadan, Nigeria.
The evaluation of the in vitro susceptibility was performed by microtest and the mutations
analysis by direct DNA sequencing of PCR products. Our in vitro test results showed
resistance to Chloroquine in 96.5% of the Brazilian isolates and in 22.1% of the Nigerian
isolates and resistance to Amodiaquine in 15% of the Brazilian isolates and in 33.9% of the
Nigerian isolates. The mutations K76T, N86Y, S263P and S241A in the Pfcrt, pfmdr1, G47
and G2 genes respectively were associated to Chloroquine resistance while the mutations
K76T, N86Y and N834N&1 in the G7 gene were associated to Amodiaquine resistance.
Furthermore it has been demonstrated cross resistance between Chloroquine and
Amodiaquine and Amodiaquine and Mefloquine. This study showed an increase resistance
to Amodiaquine in Brazil and Nigeria and susceptibility reduction to Chloroquine in Brazilian
parasites. Moreover it made evident that mutations in pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 genes are
associated to Amodiaquine and Chloroquine susceptibility.
Key words: Antimalarials, resistance, malaria, falciparum, pfcrt, pfmdr1
Rio de Janeiro
Maio/2009
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ........................................................ XII
1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................. 4
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO E VETOR ................................................................ 4
2.2 CICLO BIOLÓGICO DO P. falciparum ......................................................... 5
2.3 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA MALÁRIA ............................................ 7
2.4 TRATAMENTO DA MALÁRIA POR P.falciparum ..................................... 10
2.5 MECANISMOS DE AÇÃO DAS QUINOLEÍNAS ......................................... 15
2.6 SENSIBILIDADE AOS FÁRMACOS ........................................................... 19
2.7 DETERMINANTES MOLECULARES E MECANISMOS DE
RESISTÊNCIA AOS ANTIMALÁRICOS ..................................................... 21
2.7.1 Gene pfcrt e a resistência à Cloroquina .................................................. 23
2.7.2 Gene pfmdr1 e resistência a multidrogas ............................................... 29
2.7.3 Outros genes envolvidos na susceptibilidade às Quinoleínas ................ 33
3 JUSTIFICATIVA ............................................................................... 36
4 OBJETIVOS ..................................................................................... 38
5 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................... 39
5.1 ÁREA DE ESTUDO E CASUÍSTICA ........................................................... 39
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DO PARASITO ........................... 40
5.2.1 Preparo da suspensão das hemácias ..................................................... 40
5.2.2 Diluição dos antimaláricos ...................................................................... 41
5.2.3 Preparo das placas de microcultura ....................................................... 42
5.2.4 Contagem da parasitemina e determinação do IC
50
............................... 43
5.2.5 AVALIAÇÃO DAS MUTAÇÕES GENÉTICAS ............................................ 44
5.2.6 Extração do DNA Plasmodial ................................................................. 44
5.2.7 Amplificação do DNA .............................................................................. 45
5.2.8 Purificação do produto da amplificação .................................................. 48
5.2.9 Quantificação do produto purificado ....................................................... 48
5.2.10 Concentração de DNA dos produtos da purificação .............................. 49
5.2.11 Reação de Sequenciamento .................................................................. 49
5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................. 50
6 RESULTADOS ................................................................................. 51
6.1 QUIMIOSSENSIBILIDADE IN VITRO DAS AMOSTRAS............................ 51
6.1.1 Teste in vitro da CQ ................................................................................ 51
6.1.2 Teste in vitro da AQ ................................................................................ 53
6.1.3 Teste in vitro da QN ................................................................................ 55
viii
6.1.4 Teste in vitro da MQ ............................................................................... 57
6.2 AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA CRUZADA ENTRE OS
ANTIMALÁRICOS ....................................................................................... 58
6.3 ANÁLISE GENOTÍPICA .............................................................................. 62
6.3.1 Gene pfcrt ............................................................................................... 62
6.3.2 Gene pfmdr1 ........................................................................................... 64
6.3.3 Gene G7 ................................................................................................. 64
6.3.4 Gene G47 ............................................................................................... 65
6.3.5 Gene G2 ................................................................................................. 66
6.4 ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS AMOSTRAS ............................................ 67
6.5 CORRELAÇÃO ENTRE OS POLIMORFIMOS E OS VALORES DE
IC
50
IN VITRO .............................................................................................. 72
6.5.1 Correlação entre a atividade in vitro da CQ e os polimorfismos ............. 72
6.5.2 Correlação entre a atividade in vitro da AQ e os polimorfismos ............. 78
6.5.3 Correlação entre a atividade in vitro dos antimaláricos e os
polimorfismos pelo teste de Kruskal- Wallis ........................................... 86
7 DISCUSSÃO .................................................................................... 88
8 CONCLUSÃO ................................................................................. 107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................... 108
ANEXOS ............................................................................................... 125
ANEXO 1: Carta de colaboração com a Prof. Elieth Mesquita (CEPEM) ......... 125
ANEXO 2: Carta da aprovação do comitê de ética para as amostras da
Nigéria ....................................................................................................... 127
Anexo 3: Carta de coleboração com o Dr. Christian Happi, Nigéria ................ 128
Anexo 4: Manuscrito do artigo ............................................................................ 129
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
µL
Microlitro
µM
Micromolar
A
Alanina
ACTs
Artemisinine-based combination therapies - Combinação terapêutica com base em
derivados da Artemisinina
AQ
Amodiaquina
ART
Artemisinina
ASMQ
Artesunato-Mefloquina
ATP
Adenosina 5'-trifosfato
C
Cisteína
CDC
Center for Disease Control - Centro de Controle de Doenças
cols.
Colaboradores
CQ
Cloroquina
D
Ácido Aspártico
DDT
Dicloro-Difenil-Tricloroetano
DNA
Ácido Desoxiribonucleico
dNTP
Desoxirribonucleotídeos trifosfatados
E
Ácido Glutâmico
EDTA
Ethylenediamine tetraacetic acid - ácido etilenodiamino tetra-acético
F
Fenilalanina
H
Histidina
x
HF
Halofantrina
HXA
Hipoxantina tritiada
I
Isoleucina
IC
50
Concentração inibitória de 50% dos parasitos
K
Lisina
kb
Kilobase
kDa
kiloDalton
L
Leucina
Mb
Megabase
MDR
Multidrug resistance - resistência à múltiplas drogas
mL
Mililitro
mM
Milimolar
MQ
Mefloquina
N
Asparagina
nM
Nanomolar
OMS
Organização Mundial da Saúde
PCR
Polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase
pfcrt
Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter - transportador de
resistência à CQ do P. falciparum
pfmdr1
Plasmodium falciparum multidrug resistant - gene de resistência à multiplas drogas
do P. falciparum
pfmrp
Plasmodium falciparum multiresistent protein - Proteína de resistência múltipla do
P. falciparum
Pgh-1
Glicoproteína – 1
Q
Glutamina
xi
QN
Quinina
R
Arginina
RFLP
Restriction fragment length polymorphism - Polimorfismo do Tamanho do
Fragmento de Restrição
S
Serina
SNP
Single nucleotide polymorphism - Polimorfismo de único nucleotídeo
T
Treonina
TBE
Tris/Borato/EDTA
TCLE
Termo de consentimento livre e esclarecido
VD
Vacúolo digestivo
Y
Tirosina
xii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1
Ciclo do P. falciparum ……………….…………………..............……
6
Figura 2
Mapa de risco da malária na Amazônia Lega…...............…………
8
Figura 3
Proporção de casos de malária, por espécie de
plasmódio…………………………………………...............…………..
9
Figura 4
Casos de P. falciparum reportador na Nigéria ……………..............
10
Figura 5
Formação da hemozoína..…………………………………................
16
Figura 6
Formação da hemozoína no vacúolo
digestivo………………….…………..................................................
18
Figura 7
Complexo formado pela ligação da CQ e o grupo heme….............
19
Figura 8
Estrutura da proteína do pfcrt………………....................................
25
Figura 9
Representação da estrutura da Pgh-1………….................…….….
30
Figura 10
Figura esquemática da placa de teste in vitro……..........................
43
Figura 11
Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para CQ em nM...............................................................................
53
Figura 12
Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para AQ em nM...............................................................................
55
Figura 13
Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para QN em nM...............................................................................
56
Figura 14
Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para MQ em nM...............................................................................
58
Figura 15
Correlação entre os IC
50
s da AQ e da CQ no n total de
amostras…………...........................................................................
59
Figura 16
Correlação entre os IC
50
s da AQ e da CQ em amostras
do Brasil…………............................................................................
60
Figura 17
Correlação entre os IC
50
s da AQ e da CQ em amostras
da Nigéria…………..........................................................................
61
Figura 18
Correlação entre os IC
50
s da AQ e da MQ em amostras do
Brasil……….....................................................................................
62
Figura 19
Árvore filogenética das amostras com seqüencia dos
cinco genes………. .........................................................................
68
Figura 20
Ramo superior da árvore filogenética…………………….................
69
Figura 21
Ramo inferior da árvore filogenética ………………………..............
71
xiii
Figura 22
Gráfico de IC
50
para CQ das amostras brasileiras e
nigerianas e as mutações observadas nos genes G2,
G47, G7, pfcrt e pfmdr1……….......................................................
73
Figura 23
Gráfico de IC
50
para CQ das amostras nigerianas e as
mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e
pfmdr1………………………............................................................
75
Figura 24
Gráfico de IC
50
para CQ das amostras brasileiras e
as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e
pfmdr1………...................................................................................
77
Figura 25
Gráfico de IC
50
para AQ das amostras brasileiras e
nigerianas e as mutações observadas nos genes G2,
G47, G7, Pfcrt e Pfmdr1…………....................................................
80
Figura 26
Eletroferograma do seqüenciamento do pfcrt apresentando
duas bases na mesma posição.......................................................
82
Figura 27
Gráfico de IC
50
para AQ das amostras nigerianas e as
mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e
pfmdr1….........................................................................................
83
Figura 28
Gráfico de IC
50
para AQ das amostras brasileiras e
as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e
pfmdr1………...................................................................................
85
Tabela 1
Mutações em 15 códons associadas à resistência no gene pfcrt
e os haplótipos encontrados em diferentes regiões geográficas..
28
Tabela 2
Mutações e número de cópias do gene
pfmdr1
associados à
resistência à múltiplas drogas e os haplótipos encontrados em
diferentes regiões do mundo ........................................................ 32
Tabela 3
Concentração de cada droga e diluições......................................
41
Tabela 4
Limiares de resistência da CQ, AQ, QN e MQ .............................
44
Tabela 5
Sequência dos oligonucleotídeos..................................................
47
Tabela 6
Média, intervalo de confiança e Variação de IC
50
da CQ..............
51
Tabela 7
Média, IC 95% e variação do IC
50
da CQ em amostras
sensíveis e resistentes..................................................................
52
Tabela 8
Média, intervalo de confiança e Variação de IC
50
da AQ..............
54
Tabela 9
Média, IC 95% e variação do IC
50
da AQ em amostras
sensíveis e resistentes..................................................................
54
Tabela 10
Média, intervalo de confiança e variação de IC
50
da QN..............
56
xiv
Tabela 11
Média, intervalo de confiança e Variação de IC
50
da MQ..............
57
Tabela 12
Correlação das atividades in vitro da CQ, AQ, QN e MQ..............
59
Tabela 13
Haplótipos do gene pfcrt em amostras da Nigéria e do Brasil......
63
Tabela 14
Frequencia da mutação K76T do gene pfcrt no Brasil e na
Nigéria............................................................................................
63
Tabela 15
Frequencia da mutação N86Y do gene pfmdr1 no Brasil e na
Nigéria............................................................................................
64
Tabela 16
Frequencia da mutação 834N&1 do gene G7 no Brasil e na
Nigéria............................................................................................
65
Tabela 17
Haplótipos do gene G47 em amostras da Nigéria e do Brasil.......
66
Tabela 18
Freqüencia da mutação S437A do gene G2 no Brasil e na
Nigéria............................................................................................
66
Tabela 19
Resistência à CQ em função das mutações nos genes................
74
Tabela 20
Resistência à CQ em função das mutações nos genes em
amostras da Nigéria.......................................................................
76
Tabela 21
Resistência à AQ em função das mutações nos genes................
81
Tabela 22
Resistência à AQ em função das mutações nos genes em
amostras da Nigéria.......................................................................
84
Tabela 23
Teste de Kruskal-Wallis.................................................................
87
1 INTRODUÇÃO
A malária é uma doença infecciosa grave, causada por um protozoário do
gênero Plasmodium e transmitido através do repasto sanguíneo do mosquito-fêmea,
gênero Anopheles (Cowman e Crabb, 2006). É considerada uma das doenças
reemergentes mais graves, provocando cerca de 250 milhões de casos clínicos e
um milhão de óbitos ao ano, em todo o mundo. Afeta principalmente crianças abaixo
de cinco anos e estima-se que haja o óbito de uma criança a cada 40 segundos na
África (Sachs e Malaney, 2002). A malária é um problema que, não só atinge a
saúde da população, como também, incide diretamente no caráter sócio-econômico
dos países. Em regiões endêmicas, a doença ocasiona ausência do trabalho e
escolas, gerando estagnação econômica (Sachs e Malaney, 2002; Lewison e
Srivastava, 2008).
O parasito acomete o homem desde a pré-história. Provavelmente originário
do continente africano, acompanhou a saga migratória do ser humano pelas regiões
do Mediterrâneo, Mesopotâmia, Índia e Sudeste Asiático. Sua chegada às Américas,
ainda hoje, é motivo de especulações (Dobson, 1994).
Em 1880, o médico do exército francês Charles Alphonse Laveran, em
exercício na Argélia, foi o primeiro a descrever parasitos da malária no interior dos
glóbulos vermelhos humanos. Já em 1897, o médico britânico Ronald Ross, na
Índia, elucidou o modo de transmissão do parasito, ao encontrar o protozoário no
interior de um mosquito que exercera hematofagia em um portador da doença. O
ciclo completo do desenvolvimento do parasito, no homem e na fêmea do
Anopheles, foi descrito em seguida pelos pesquisadores italianos Amico Bignami,
2
Giuseppe Bastianelli e Batista Grassi, em estudos realizados entre 1898 e 1899
(Villalon et al., 2003).
Como não há vacina contra a malária, o controle da doença depende do uso
de antimaláricos e de medidas contra o vetor anofelino (Chatterjee et al., 2006). No
entanto, a emergência de parasitos resistentes à maior parte dos antimaláricos
disponíveis e mosquitos resistentes ao DDT (Dicloro-difenil-tricoloetano) tem se
revelado como o maior obstáculo na contenção da doença (Diallo et al., 1999).
Algumas drogas, como a cloroquina (CQ) e o Fansidar, não têm mais eficácia e
outras, como a mefloquina (MQ), amodiaquina (AQ) ou até mesmo a quinina (QN),
têm efeito reduzido sobre o parasito. Muito preocupante é o fato de que, em regiões
endêmicas, o parasito possa ser resistente a dois ou mais fármacos, fenômeno
conhecido como “resistência a multidrogas” (Wongsrichanalai et al., 2002).
O monitoramento de parasitas resistentes a determinado fármaco é um fator
determinante no controle da doença. Testes in vitro, onde o sangue do paciente
parasitado é exposto a concentrações precisas do composto, são utilizados para
determinar o grau de susceptibilidade do parasito à droga. Uma vez determinada
sua susceptibilidade, é possível monitorar o efeito do medicamento e assim
determinar a melhor escolha terapêutica para indivíduos de uma mesma região
(WHO, 2006).
O seqüenciamento possibilitou a busca por homologia de proteínas
transportadoras que pudessem estar associadas à resistência aos antimaláricos e à
identificação de marcadores moleculares, os quais permitem prever rapidamente a
resposta dos parasitos às drogas (Wernsdorfer e Noedl, 2003).
Estudos de mapeamento genético e associação de mutações com o perfil de
susceptibilidade in vitro identificaram mutações nos genes pfcrt e pfmdr1, que atuam
3
nas respostas do parasito aos antimaláricos (Reed et al., 2000; Johnson et al.,
2004). O fenótipo de resistência pode estar associado a apenas um gene
predominante, no qual há mutações críticas que elevam o IC
50
em testes in vitro - é
o caso do gene pfcrt. No entanto, pode ocorrer a interação de outros genes que
contribuem para a escala variada de resposta in vitro, encontrada entre amostras de
plasmódio (Su e Wootton, 2004). Em um estudo realizado por Mu e cols. (2003),
baseado em ensaios in vitro de resposta à CQ, foi encontrada variação quantitativa
de susceptibilidade associada aos alelos de genes codificadores de proteínas
transportadoras, incluindo o pfmdr1 em adição ao efeito do pfcrt (Mu et al., 2003).
Isto é, a correlação da resposta in vitro com os marcadores varia de acordo com a
origem geográfica dos isolados. Ou seja, em algumas regiões e possível observar
correlação entre certa droga e um marcador, no entanto, essa correlação pode não
ser encontrada em relação à mesma droga e o marcador em outras regiões. Esse
fato está possivelmente relacionado à seleção dos parasitos pelos antimaláricos
utilizados no esquema terapêutico de cada região. Sendo assim, os esquemas
terapêuticos de cada país selecionam uma coorte de marcadores moleculares
distintos de uma região à outra.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 AGENTE ETIOLÓGICO E VETOR
Os agentes etiológicos da malária são protozoários pertencentes ao filo
Apicomplexa, ordem Eucoccidiidae, subordem Haemosporinae, família Plasmodiae,
Gênero Plasmodium, com 172 espécies que infectam aves, répteis e mamíferos
(Levine, 1988). Cinco dessas espécies infectam naturalmente o homem:
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium
malariae e Plasmodium knowlesi (Singh et al., 2004).
Entre as cinco espécies de plasmódio, a malária que é causada por P.
falciparum, destaca-se como a forma mais maligna por ser responsável pela
aderência dos eritrócitos infectados ao endotélio vascular (citoaderência), causando
assim obstrução de pequenos vasos sanguíneos e complicações graves, como
malária cerebral (Heddini, 2002; Kirchgatter e Del Portillo, 2005). P. vivax é menos
letal, porém causa maior morbidade. É comum em áreas tropicais fora da África,
visto que a maioria da população africana não possui o antígeno Duffy na superfície
dos eritrócitos necessário para a invasão dessa espécie (Mendis et al., 2001). As
espécies P. vivax e P. ovale possuem a habilidade de permanecer latente como
hipnozoítos nos hepatócitos (Aguas et al., 2008). Por sua vez, as espécies P.
malariae e P. falciparum não formam hipnozoítos, mas podem persistir por décadas
no organismo do homem sem manifestar sintomas. A quinta espécie, P. knowlesi,
originalmente descrita como infectante apenas de macacos, provou-se, infectar
5
também os humanos, tendo sido vinculada como infecção natural do homem na
Malásia e no sudeste asiático (White, 2008a).
O plasmódio é transmitido ao homem através de vetores da ordem Díptera,
família Culicidae, gênero Anopheles. A espécie Anopheles darlingi é aquela de maior
abundância no Brasil. Esse mosquito possui alto grau de antropofilia e é capaz de
transmitir diferentes espécies de plasmódio (Povoa et al., 2000). Os anofelinos
utilizam como criadouros preferenciais as águas limpas, quentes, sombreadas e de
baixo fluxo, situação muito frequente na região amazônica (Deane et al., 1969). Na
Nigéria, os vetores de maior distribuição e eficiência são An.arabiensis e
An.gambiae (Matthews et al., 2007).
2.2 CICLO BIOLÓGICO DO P. falciparum
O parasito possui um ciclo biológico complexo em que a transmissão ocorre
através da fêmea do mosquito Anopheles. O parasito tem estágios sexuais
obrigatórios – os gametas masculinos fecundam os femininos no intestino
intermediário do mosquito. O zigoto representa o único estágio diplóide do ciclo
biológico do plasmódio. A meiose ocorre em até 3 horas após a fertilização e todos
os estágios subseqüentes no mosquito e no humano são haplóides (Sinden e
Hartley, 1985). Quando o mosquito ingere o sangue de um indivíduo infectado com
parasitos geneticamente distintos, a fertilização e a recombinação entre os parasitos
geram novos genótipos. A recombinação genética ocorre frequentemente em
regiões geográficas com alta taxa de transmissão de malária, ao contrário de regiões
onde essa taxa é baixa (Babiker et al., 1994; Paul et al., 1995).
6
O ciclo biológico do parasito possui três estágios, dois no humano (estágios
exo-eritrocítico e eritrocítico, ambos assexuados) e um no mosquito (estágio
sexuado ou esporogônico). As etapas do ciclo estão representadas na Figura 1.
Figura 1: Ciclo do P. falciparum. A infecção nos humanos inicia-se quando a fêmea
infectante do mosquito Anopheles, ao exercer hematofagia, inocula esporozoítos de
sua glândula salivar nos capilares da pele (1). Em 30 minutos, os esporozoítos
invadem os hepatócitos (2), onde se reproduzem assexuadamente, formando
milhares de merozoítos (3). De 7 a 14 dias, os merozoítos rompem o hepatócito e
são liberados na corrente sanguínea (4), onde invadem as hemácias (5) e sofrem
maturações morfologicamente distintas, compreendendo três fases,
respectivamente: trofozoíto jovem (6), trofozoíto (7) e esquizonte (8). Com a
maturação completa, os eritrócitos se rompem, liberando novos merozoítos na
corrente sanguínea (9). Em seguida, invadem novas hemácias, reiniciando o ciclo.
Após sucessivas gerações de merozoítos, algumas formas se diferenciam em
estágios sexuados, os gametócitos (10), que são formas infectantes para o
mosquito.
A infecção do vetor ocorre quando a fêmea do mosquito Anopheles, durante a
hematofagia em indivíduo infectado, ingere os gametócitos femininos e masculinos
(11). No estômago do mosquito, o gametócito masculino fecunda o gametócito
feminino, gerando o zigoto (12), o qual se alonga, gerando o oocineto (13) que
atravessa a parede estomacal (14) do inseto e se transforma em oocisto (15), cujo
conteúdo se divide para formar esporozoítos (17). Estes migram para a glândula
salivar do mosquito, estando assim prontos para infectarem um novo indivíduo
(CDC, 2004).
7
2.3 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA MALÁRIA
De acordo com os dados da OMS de 2008, a malária é difundida em
aproximadamente 100 países, localizados nas regiões tropicais e subtropicais do
planeta (WHO, 2008).
Cerca de um terço da população mundial está exposta ao risco de
transmissão da doença, sendo que 90% dos casos ocorrem na África subsaariana,
fazendo, principalmente, vítimas as crianças e gestantes (WHO, 2001). Em outros
países, os óbitos acorrem, geralmente, em pessoas não imunes e infectadas por P.
falciparum, que não tiveram diagnóstico e tratamento adequados (Baird, 2005).
O risco de aquisição da doença não é uniforme dentro de um mesmo país e é
frequentemente desigual entre locais situados em uma mesma região, além de
sofrer variações com as estações do ano e ao longo do tempo (CDC, 2004). A
densidade populacional do parasito nas regiões endêmicas é resultado de um
conjunto de fatores climáticos, tais como temperatura, umidade e pluviosidade,
condições estas essenciais à sobrevivência e multiplicação do mosquito transmissor.
Mesmo nas regiões tropicais e subtropicais não ocorre transmissão em locais
de grande altitude, em estações frias, nos desertos, em algumas ilhas do Oceano
Pacífico onde não há vetor e em lugares onde a transmissão foi erradicada
(Costantini et al., 1996).
Em regiões temperadas, como Estados Unidos da América (EUA) e Europa,
houve erradicação bem sucedida da malária. Entretanto, o vetor Anopheles ainda
está presente, sendo um potencial transmissor à população, se porventura
imigrantes ou turistas chegarem contaminados a esses países (CDC, 2004).
8
No Brasil, a malária é a mais expressiva das endemias (Brasil/MS/FNS/SVS,
2005). Cerca de 99% dos casos clínicos estão concentrados na Amazônia Legal
Brasileira, onde residem apenas 12% da população (Figura 2). Os Estados de maior
incidência de malária são Amazonas (38%), Pará (25%) e Acre (22%), seguidos de
Roraima (7%), Rondônia (5%), Maranhão (1%), Amapá (1%) e Mato Grosso (1%),
com cerca de 460 mil casos reportados no ano de 2007 (Brasil/MS/FNS/SVS, 2008).
Ver figura 2.
Figura 2: Mapa de risco da malária na Amazônia Legal, 2007. Baixo risco:
IPA < 10; médio risco IPA 10-49; alto risco IPA ≥ 50 (Brasil-MS/FNS/SVS,
2005).
No Brasil, há transmissão de três espécies do parasito: P. vivax, P. falciparum
e P. malariae (Brasil/MS/FNS/SVS, 2008). As infecções causadas por P. vivax são
predominantes (79,6%) Figura 3. Houve redução dos casos de malária por P.
falciparum de 25% em 2006, para 19% em 2007, provavelmente devido à ação
rápida no tratamento e no diagnóstico realizado pelo governo e à alteração do
esquema terapêutico para o tratamento da malária causada por P.falciparum (Brasil
9
– MS/FNS/SVS, 2005). Além disso, o controle de P. falciparum ocorre de forma mais
fácil porque essa espécie produz gametócitos mais tardiamente do que P. vivax
(Price et al., 2007).
Figura 3: Proporção de casos de malária, por espécie de
plasmódio. Amazônia Legal, 2007. F+V = Infecção mista por P.
falciparum e P. vivax (Brasil – MS/FNS/SVS, 2008).
A Nigéria está localizada na África Ocidental e possui a maior densidade
populacional do continente africano – as Nações Unidas estimam que a população,
em 2005, era de 141 milhões. Suas maiores cidades encontram-se localizadas nas
terras baixas do sul, a parte central do país é composta por colinas e planaltos e o
norte consiste de terras baixas áridas. Seus países limítrofes são Benim, Níger,
Chade e Camarões. Em comparação, sua área geográfica é pouco maior que o
estado de Mato Grosso.
A floresta e os bosques se localizam principalmente no terço sul do país, que
é afetado por chuvas sazonais oriundas do Oceano Atlântico entre junho e
setembro. À medida que segue para norte, o país se torna mais seco e a vegetação
10
mais semelhante à da savana. O terço norte do país está incluído na região semi-
árida do Sahel, que marca o limite sul do deserto do Saara.
O país demarca um quarto de todos os casos de malária da África. Em 2007,
houve cerca de três milhões de casos e 10.300 óbitos, a maioria causada por P.
falciparum. A transmissão ocorre de forma perene no sul do país e de forma sazonal
no norte (Figura 4).
Figura 4. Casos reportados/1000 na Nigéria.
2.4 TRATAMENTO DA MALÁRIA POR P.falciparum
Na ausência de uma vacina antimalárica até a presente data, o controle da
doença depende, quase que exclusivamente, da quimioterapia (Chatterjee et al.,
2006), portanto, o diagnóstico rápido, seguido de tratamento imediato são os
11
principais componentes da estratégia de controle da doença (WHO, 2005). A
eficácia dessa intervenção é dependente dos antimaláricos, que devem ser seguros,
eficazes, disponíveis e aceitos pela população em risco (Talisuna et al., 2004). O
uso racional desses compostos não só reduz o risco de sintomas graves e encurta o
tempo da doença, como também contribui para a redução do desenvolvimento de
parasitos resistentes (WHO, 2000).
Os antimaláricos são baseados em produtos naturais ou compostos sintéticos
produzidos a partir da década de 40 do século passado e são específicos para cada
etapa do ciclo de vida do plasmódio. Existem fármacos chamados eritrocíticos, que
atuam nas formas presentes nas hemácias. Já os compostos gametocíticos
eliminam as formas sexuadas do parasita no indivíduo infectado, impedindo que o
hospedeiro transmita a doença para novos mosquitos. Existem ainda os fármacos
que agem sobre a forma hepática do parasito, os hipnozoítas.
O antimalárico mais antigo e conhecido no ocidente é a QN, composto
extraído da casca de várias espécies de árvores, do gênero Cinchona e natural do
Peru. A casca era transformada em pó e servida em forma de bebida para curar a
doença. Após a conquista do império Inca, a QN foi levada pelos espanhóis para a
Europa e teve seu composto ativo isolado, em 1820, pelos químicos franceses
Pierre Pelletier e Joseph Caventou, sendo sintetizado em laboratório na década de
40 (Foley e Tilley, 1998).
A QN faz parte da família das quinoleínas, que incluem as 4-
aminoquinoleínas, as 8-aminoquinoleínas e os alcoóis quinoleínicos (Steck et al.,
1948). Durante a segunda guerra mundial, o fornecimento da droga foi interrompido
devido às sucessivas invasões de regiões que cultivavam a Cinchona, o que
estimulou a substituição da droga pela CQ (Coatney, 1949). Produzida desde 1934,
12
a CQ foi considerada o “fármaco perfeito”, altamente eficaz contra as formas
eritrocíticas de P. falciparum, de baixo custo e ausente de efeitos colaterais (White et
al., 1992). Devido a seu sucesso, a partir de 1946, passou a ser utilizada
extensivamente em todas as regiões endêmicas de malária. A droga era utilizada
como tratamento empírico, para qualquer febre e adicionada indiscriminadamente ao
sal de cozinha como profilaxia. Com o uso abusivo, muitas vezes em concentrações
sub-letais para o parasito e a alta pressão seletiva exercida pela droga, foram
reportados os primeiros casos de falha terapêutica no final da década de 50
(Wellems, 1991). Os focos de resistência iniciais foram reportados em 1957, 1959 e
1960, em três lugares geograficamente distantes: Tailândia, Colômbia e Brasil,
respectivamente. A partir desses focos iniciais, os parasitos resistentes se
alastraram para o sul do continente americano e para o sudeste Asiático. Da
Tailândia, difundiram-se para o Ocidente, atingindo o continente africano no final dos
anos 70 (Cowman e Foote, 1990). Desde então, a disseminação da resistência à CQ
foi lenta e está estabelecida, atualmente, na maioria das regiões onde existe
malária. No entanto, ao longo do tempo, outras drogas foram desenvolvidas e
passaram a substituir a CQ (Peters, 1985).
A AQ foi introduzida em algumas regiões em 1951 e a Sulfadoxina-
Pirimetamina (SP), em outras em 1957. Contudo, no início dos anos 70 foram
reportados diversos casos de resistência a essas drogas. A MQ, um composto
derivado do quinino, foi produzido, na mesma década, pelo exército norte americano
com o objetivo principal de combater a resistência dos parasitos aos fármacos
utilizados à época da guerra do Vietnã (Oduola et al., 1987). Quando a MQ passou a
ser administrada em larga escala, surgiram os primeiros casos de falha terapêutica à
droga (Nosten et al., 1991). A MQ é um composto que se liga às proteínas
13
plasmáticas, portanto, tem meia-vida longa, permanecendo em concentrações sub-
terapêuticas no sangue, o que facilita a seleção de parasitos resistentes (White,
2004). Verificou-se também o fenômeno de resistência à droga em lugares onde
esta nunca havia sido utilizada, sendo esse um possível fenômeno da pressão
seletiva de outros fármacos (White, 1994).
Os chineses, com o intuito também de proteger seu exército na guerra do
Vietnã e de conseguir uma vantagem em relação ao exército norte-americano,
desenvolveram em 1967 um projeto com o extrato de uma erva medicinal, a
Artemisia annua, utilizada para o tratamento de febres desde 340 a.C (Wright, 2005).
Em 1970, foi isolada a Artemisinina ou Quinghaosu e a partir dela foram sintetizados
vários análogos como o Artesunato e o Arteméter. Esses compostos têm ação
esquizonticida e atividade gametocida, limitando assim a transmissão da doença
para outros hospedeiros (Hyde, 2002). As drogas também são ativas contra
parasitos resistentes aos outros antimaláricos e sua aplicação no tratamento da
malária é cada vez mais crescente. Não há relatos de falha terapêutica nos
derivados da Artemisinina, contudo, foram reportados alguns isolados de P.
falciparum da China e do Vietnã, com sensibilidade in vitro reduzida (Faye et al.,
2007).
A rápida disseminação de parasitos resistentes a todos os antimaláricos, em
sua maioria utilizados como monoterapias, induziu os países a reverem seus
esquemas terapêuticos. Ficou então estabelecido que o tratamento contra a malária
devesse ser realizado com a combinação de dois antimaláricos, em regime
terapêutico denominado de ACTs (Artemisinin-based combination therapies) (Olliaro
et al., 1996; White e Olliaro, 1996; White et al., 1999a). Os novos esquemas
terapêuticos seriam baseados na combinação de um composto derivado da
14
artemisinina com outro antimalárico de ação distinta. A utilização de um único
fármaco no tratamento da malária ocasiona a seleção e a disseminação de parasitos
resistentes. Já a combinação de dois antimaláricos que atingem alvos diferentes no
parasito, é mais eficiente e diminui a probabilidade de surgimento de cepas
resistentes (White, 2004).
No Brasil, o esquema terapêutico para P. falciparum foi alterado
recentemente. Até o ano de 2007, eram utilizados os antimaláricos QN associados
com doxiciclina como primeira escolha terapêutica, seguido de MQ como segunda
escolha para malária não grave. Devido à disseminação de parasitos resistentes, o
Brasil aderiu à campanha da OMS para usar a combinação de antimaláricos. A partir
de 2007, passou a utilizar o Coartem, combinação entre arteméter e lumefantrina,
esse último antimalárico análogo à QN. O laboratório estadual, ligado à Fundação
Oswaldo Cruz, lançou uma nova combinação de artesunato e de MQ, denominada
de ASMQ, que também será utilizada no combate da malária na América Latina e na
Ásia.
Em 2003, o esquema terapêutico para tratar infecções por P. falciparum não
complicadas, na Nigéria, ainda era de CQ, mesmo havendo falha terapêutica em
cerca de 15%. A segunda escolha terapêutica era AQ para os casos de falha
terapêutica com CQ. De 2003 em diante, o país adotou a política de combinação de
antimaláricos da ONU (Organização das Nações Unidas), com a utilização, desde
então, de arteméter-lumefantrina ou de artesunato-amodiaquina (WHO, 2005; WHO,
2008). No entanto, a distribuição desses medicamentos não é governamental e
muitos médicos ainda prescrevem a CQ devido ao seu baixo custo, já que a
população nigeriana em sua maioria é de baixa renda.
15
2.5 MECANISMOS DE AÇÃO DAS QUINOLEÍNAS
Os principais antimaláricos são classificados de acordo com o seu alvo no
parasito. As quinoleínas têm como alvo a síntese de hemozoína no vacúolo digestivo
(Geary et al., 1986). A SP age em enzimas da rota bioquímica de síntese do DNA
(Ferone, 1977). Ainda não foi estabelecido ao certo o alvo da artemisinina e seus
derivados; acredita-se que seja um inibidor da Ca
2+
ATPase do retículo
sarcoplasmático (Dyer et al., 1996). Os antibióticos, como a tetraciclina e a
doxiciclina, agem no plastídeo, uma estrutura homóloga aos cloroplastos de plantas
presente no parasito (Dahl e Rosenthal, 2008).
O parasita da malária adquire a hemoglobina do hospedeiro para manter seu
ciclo biológico. Essa molécula é uma fonte de aminoácidos e extremamente
abundante no citoplasma dos eritrócitos humanos, é capturada do citoplasma do
eritrócito pela invaginação da membrana, formando uma vesícula de transporte
(Yayon et al., 1984). Esse processo ocorre através de uma estrutura tubular
periférica denominada citostomo. As membranas, em duplicidade, formam uma
vesícula de transporte, que posteriormente se fundem ao vacúolo digestivo (Figura
5).
16
Figura 5: Formação da hemozoína. A invaginação do citoplasma pelo
Citostomo (C) forma a vesícula de transporte (VT) que posteriormente irá
fundir-se ao vacúolo digestivo. MVP = Membrana do vacúolo parasitóforo; MP
= membrana plasmática; RER = retículo endoplasmático rugoso; N= núcleo;
CG = Complexo de Golgi; P = Plastídeo; M = Mitocôndria; h= heme; H =
hemozoína (Bustamante et al., 2009).
No vacúolo digestivo, a hemoglobina é digerida pela ação de proteases
aspárticas (Plasmepsina I, II, IV) e histoaspárticas (Egan e Ncokazi, 2004). A reação
de catálise culmina na liberação de peptídeos que posteriormente são degradados
no citoplasma do parasito, originando aminoácidos necessários à sua sobrevivência.
Outro composto originário da digestão da hemoglobina é o heme,
(Ferridoprotoporfirina IX), um composto extremamente tóxico que se intercala na
membrana do vacúolo digestivo, causando aumento da permeabilidade, estresse
oxidativo e a morte do parasito (Eggleson et al., 1999; Kumar e Bandyopadhyay,
2005). Para evitar os danos causados pelo heme, o plasmódio desenvolveu um
mecanismo de detoxificação através da formação de hemozoína, o pigmento
malárico (Egan et al., 2002).
17
Estudos recentes mostram que a digestão da hemoglobina pode ser iniciada
antes da fusão entre a vesícula de transporte e o vacúolo digestivo. A análise da
ultra-estrutura do parasito, na microscopia eletrônica conjunta dos estudos químicos,
demonstrou a digestão da hemoglobina e a formação da hemozoína, além de indicar
que a vesícula de transporte possui pH ácido, criado por bombas de prótons, ideal
para iniciar a digestão da hemoglobina (Hempelmann e Egan, 2002). O heme,
originário da digestão, forma um complexo com as proteínas da membrana da
vesícula interna e assim desestabiliza a estrutura de camada dupla, ocasionando
permeabilidade do vacúolo digestivo (Schmitt et al., 1993). A membrana interna é
sacrificada para prover um ambiente hidrofóbico ideal na nucleação da hemozoína,
assim como a formação de ligações de ferro-carboxilato dos dímeros de beta
hematina (Hempelmann, 2007). O complexo formado pelo heme e a membrana
interna também serve de molde para o crescimento do cristal de hemozoína (Egan,
2008). Esse processo é conhecido por biocristalização, em que ocorre um grande
esforço de controle da nucleação e do crescimento de cristais (Figura 6).
18
Figura 6: Formação da hemozoína no vacúolo digestivo. A VT se funde ao
vacúolo digestivo liberando hemoglobina no citoplasma, que é degradada
por catálise (1). Da reação são liberados peptídeos (3a), heme (3b) e os
fragmentos de membrana (2). Os fragmentos da membrana interna da VT
irão formar um ambiente lipofílico ideal para a formação da hemozoína (4).
O grupo heme forma dímeros (5) e por biocristalização ocorre a formação
da hemozoína (6,7,8) (Bustamante et al., 2009).
As aminoquinoleínas e seus derivados interagem com a formação da
hemozoína, inibindo ou diminuindo a formação desse cristal (Egan et al., 2000; Egan
e Ncokazi, 2005). A CQ pode interagir com os dímeros de heme, formando um
complexo heme-CQ (Figura 7) e uma vez formado o complexo, a biocristalização é
bloqueada com a permanência do heme em sua forma livre e tóxica, causando
estresse oxidativo e a consequente morte do parasito (Loria et al., 1999; Kumar e
Bandyopadhyay, 2005). A QN também afeta a formação da hemozoína, porém,
causa um decréscimo da formação e não o bloqueio da formação, como faz a CQ
19
(Egan e Ncokazi, 2005). Pouco se sabe sobre a ação da MQ e da AQ, mas acredita-
se que o mecanismo de ação seja semelhante ao da CQ e QN.
Figura 7: A. Complexo formado pela ligação da CQ e o grupo
heme. B. Estrutura química da CQ (Egan, 2006)
2.6 SENSIBILIDADE AOS FÁRMACOS
A ineficácia crescente de muitos quimioterápicos empregados habitualmente
no tratamento da malária, caracterizando resistência em P. falciparum, é um fato
amplamente documentado por estudos já realizados em diversas partes do mundo
(WHO, 2001). Com a disseminação de parasitos resistentes, especialmente à CQ
em diversas regiões, o problema da eficácia terapêutica na malária emergiu como
uma questão de saúde pública de grande relevância, já que causa disseminação da
doença em novas áreas e sua reemergência, onde antes havia sido erradicada
(Talisuna et al., 2004).
O monitoramento da susceptibilidade dos parasitas a um determinado
composto é um fator determinante no controle da malária. Com esse conhecimento,
pode-se aplicar o melhor protocolo terapêutico, garantindo, assim, a cura da doença
20
e a interrupção da pressão seletiva sobre parasitas resistentes ao fármaco utilizado
previamente (WHO, 2001)
Os métodos tradicionais de avaliação da sensibilidade de P. falciparum a
antimaláricos se baseiam, sobretudo, em testes in vitro e/ou in vivo. Os testes in vivo
consistem no tratamento de um grupo de indivíduos parasitados, com concentrações
pré-determinadas da droga, seguido de monitoramento da resposta clínica e/ou
parasitológica durante um determinado período. O teste permite a avaliação das
interações entre parasito e hospedeiro, refletindo uma situação clínica e
epidemiológica real. No entanto, pode apresentar problemas éticos de
acompanhamento do paciente por todo o processo e no controle individual de
ingestão do medicamento. Os testes in vitro, por sua vez, baseiam-se na coleta de
sangue de um paciente parasitado, de onde os parasitas são expostos às
quantidades precisas de um determinado composto em uma placa de microcultura.
O teste avalia o grau de inibição de crescimento e/ou morte parasitária, refletindo o
nível de susceptibilidade dos parasitas a um determinado fármaco e a uma
determinada concentração. Os testes in vitro são laboriosos, porque requerem uma
estrutura de laboratório, muitas vezes incomum em campo; é um teste invasivo de
coleta de sangue de pacientes, difíceis de serem reproduzidos, e que não considera
a questão da policlonalidade das amostras (WHO, 2005).
Durante a última década, a procura de métodos alternativos que permitam
prever, rapidamente, a resposta dos parasitas aos antimaláricos, tem sido
primariamente centrada na procura de marcadores moleculares que possibilitam, a
partir de uma reação em cadeia da polimerase (PCR), ou seguida de incubação com
uma enzima de restricção (PCR-RFLP) ou de sequenciamento, a detecção da(s)
mutação(ões) causadora(as) da resistência a um determinado composto.
21
2.7 DETERMINANTES MOLECULARES E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
AOS ANTIMALÁRICOS
A disponibilidade da sequência completa de nucleotídeos de P. falciparum
possibilitou a aplicação de diversas metodologias baseadas no genoma do parasito.
Este contém ~23 megabases (Mb) de nucleotídeos responsáveis por codificarem
~5400 genes localizados em 14 cromossomos. O parasito também possui um
plastídeo circular de 3 kilobases (kb) e genoma mitocondrial de 6 kb.
Aproximadamente, 60% dos genes preditos codificam proteínas hipotéticas, o que
caracteriza um desafio aos pesquisadores que desejam decifrar a função do gene e
sua interação com as proteínas. Até o momento, foram utilizadas diversas técnicas
para decifrar a função gênica do parasito - micro-arranjos, expressão gênica,
sequenciamento, transformação gênica, entre outros - e todas essas técnicas vêm
incrementando o conhecimento sobre os mecanismos de resistência do parasito aos
antimaláricos (Gardner et al., 2002).
Os eventos genéticos que conferem resistência aos antimaláricos são
espontâneos e raros, e acredita-se que sejam independentes do uso da droga: o
fármaco apenas irá selecionar os parasitos que forem resistentes. Esses eventos
são mutações no gene ou mudanças no seu número de cópias. Tanto um quanto
outro estão relacionados ao alvo da droga no parasito, podendo afetar uma bomba
de influxo/efluxo, alterando a concentração do antimalárico no parasito (White,
2004).
Em modelos experimentais, as mutações que conferem resistência podem ser
selecionadas ao se expor um grande número de parasitos a concentrações sub-
terapêuticas da droga. A resistência, então, é selecionada em concentrações da
22
droga suficientes para eliminar parasitos sensíveis, mas não os resistentes (Peters,
1984). As características farmacocinéticas dos antimaláricos podem influenciar na
seleção de parasitos resistentes, já que muitas drogas (lumefantrina, halofantrina,
atovaquona e MQ) são lipofílicas, hidrofóbicas e apresentam absorção variada, o
que ocasiona a existência de concentrações diferentes da droga no organismo de
um indivíduo, facilitando, assim, a seleção da resistência (White, 1992; White et al.,
1999b). A meia-vida da droga, também, é outro fator importante na seleção de
parasitos resistentes. Dessa maneira, quanto maior a meia-vida de uma droga,
maior será a probabilidade de parasitos recém adquiridos encontrarem uma
concentração parcialmente efetiva (isto é, seletiva) da droga (Watkins e Mosobo,
1993). Alguns antimaláricos, como a artemisinina e seus derivados, nunca
apresentam concentração intermediária que selecione parasitos, porque tais drogas
são rapidamente eliminadas, o que já não ocorre em outras, como a MQ, pois há
eliminação em semanas ou meses. A resistência do parasito a um fármaco também
pode ocorrer de forma cruzada, isto é, quando a tolerância adquirida pelo parasito a
um composto, ocorre como resultado da exposição direta de outro, de estrutura
química semelhante (White, 2004).
A resistência aos antimaláricos se dissemina, porque é uma vantagem para a
sobrevivência do parasito na presença de um fator adverso do ambiente (droga) e,
portanto, resulta em maior chance de transmissão de parasitos resistentes do que
sensíveis. A probabilidade da transmissão dos resistentes, previamente
selecionados, irá depender da capacidade de adaptação sobre o estresse no
tratamento do parasito, já que a mutação pode ocasionar uma desvantagem na
fitness do parasito (White et al., 1999b). Outro fator que altera a probabilidade de
transmissão dos parasitos resistentes é o nível de imunidade do indivíduo. Uma
23
pessoa infectada com plasmódio pode possuir uma população tanto de resistentes,
quanto de sensíveis a certo antimalárico, mas uma vez que o indivíduo é tratado, a
droga pode exterminar os sensíveis, restando apenas os resistentes. A pequena
população de parasitos restantes pode ser por sua vez, eliminada pela ação do
sistema imunológico do indivíduo. Outro fator que altera a probabilidade da
transmissão dos parasitos resistentes é a competição intra-específica entre os
sensíveis e os resistentes coexistentes em um mesmo indivíduo (White, 2004).
A literatura descreve a importância das mutações e da superexpressão de
certos transportadores, principalmente daqueles que pertencem à superfamília ABC,
na resistência aos antimaláricos (Peel, 2001; Bodo et al., 2003; Klokouzas et al.,
2003)
2.7.1 Gene pfcrt e a resistência à Cloroquina
Desde que parasitos da malária desenvolveram resistência à CQ, houve
grande empenho para a melhor compreensão dos mecanismos biológicos e
moleculares da resistência. Os parasitos resistentes à CQ acumulam menos droga
do que os sensíveis, conseqüentemente, a menor concentração da droga no vacúolo
digestivo não bloqueia a formação da hemozoína e o parasito sobrevive, mesmo se
o indivíduo estiver se tratando com CQ (Sanchez et al., 2003). No caso dos
parasitos sensíveis, a CQ permanece acumulada no vacúolo digestivo, devido a um
mecanismo de captura de prótons, em que essa droga, como base fraca, se difunde
passivamente através de membranas. A CQ, ao entrar em contato com gradientes
de pHs ácidos, torna-se mono ou diprotonada (Kumar e Bandyopadhyay, 2005).
Uma vez possuindo carga, a droga passa a ser impermeável às membranas e
24
permanece acumulada no vacúolo digestivo (Homewood et al., 1972). A CQ também
possui alta afinidade de ligação ao heme, o que explica a alta concentração da
mesma em parasitos resistentes e, uma vez presa no vacúolo digestivo, a droga
pode atingir concentrações milimolares (Chou et al., 1980; Bray et al., 1999). Como
parasitos resistentes acumulam menos droga do que os sensíveis, os pesquisadores
passaram a especular a possibilidade de a CQ estar sendo repelida do vacúolo
digestivo de parasitos resistentes, fenômeno este atribuído a uma proteína na
membrana do vacúolo digestivo, codificada pelo gene pfcrt (Sanchez et al., 2005;
Bray et al., 2006; Sanchez et al., 2007a). A descoberta deste gene foi realizada
através de um experimento de cruzamento genético entre uma cepa do parasito
resistente e uma sensível (Wellems et al., 1990). A partir de então, identificou-se um
segmento de ~330kb no cromossomo 7, responsável pela segregação da resistência
à CQ (Su et al., 1997). Estudos subsequentes foram capazes de caracterizar um
gene de 13 exons, codificando uma proteína de 48 kDA de 10 domínios
transmembranares neste cromossomo a que denominaram de pfcrt (P. falciparum
CQ Resistance Transporter) Ver figura 8 (Fidock et al., 2000; Cooper et al., 2002;
Martin e Kirk, 2004).
25
Figura 8: Estrutura da proteína codificada pelo gene pfcrt. Os pontos pretos, o
vermelho e o amarelo representam as mutações associadas à resistência. Cada
uma possui a numeração do códon onde é encontrada. Os pontos brancos
representam a sequencia de aminoácido e em azul estão definidos os domínios
transmembranares (Valderramos e Fidock, 2006).
O alelo resistente do gene pfcrt transfectado em uma cepa sensível à CQ foi
capaz de reduzir a sensibilidade e o acúmulo da droga no vacúolo digestivo, fato
este que estabeleceu o papel central do gene pfcrt na resistência a CQ (Johnson et
al., 2004). Ao longo do tempo, uma série de mutações foi associada ao fenótipo de
resistência, no entanto, a substituição de uma lisina (K) por uma treonina (T) no
códon 76 (K76T), destaca-se, por ser considerada uma mutação crucial que
discrimina parasitos resistentes dos sensíveis. Uma vez que o parasito possua o
alelo Lys76 (K76), jamais apresentará susceptibilidade acima de 100 nanomolar
(nM), ou será resistente à CQ. Os que possuem o alelo 76Thr (76T), geralmente,
têm fenótipo de resistência, no entanto, alguns estudos reportaram a presença
dessa mutação em parasitos sensíveis. Acredita-se que essa observação seja
26
resultado da interação de duas ou mais mutações, a do códon 76 e uma outra no
códon 163 (Ser163Arg), por exemplo (Cooper et al., 2002; Johnson et al., 2004).
Outros polimorfismos nos códons Ala220Ser (A220S), Asp326Ser, Ile356Thr e
Arg371Ile do gene pfcrt, também, foram associados à resistência in vitro à CQ, junto
com outras 15 mutações encontradas em isolados de campo e parasitos
selecionados in vitro (Jiang et al., 2006). Embora a mutação A220S seja menos
freqüente do que a K76T, ela é altamente prevalente entre parasitos CQR (Durrand
et al., 2004).
Existem três modelos que explicam o mecanismo de resistência do gene pfcrt:
efluxo da CQ através de um transportador dependente de energia; escapamento da
droga por um poro na membrana do vacúolo digestivo contra seu gradiente de
concentração; e um poro que permite o movimento passivo de formas protonadas da
droga para fora do vacúolo digestivo.
O modelo proposto por Johnson e cols. (2004), no qual o gene pfcrt é um
canal por onde a CQ escapa do vacúolo digestivo, sugere que parasitos sensíveis
contendo lisina (K76), um aminoácido de carga positiva no códon 76 do gene pfcrt,
repelem a CQ, pois esta, também de carga positiva, consequentemente bloqueia a
saída da droga da membrana do vacúolo digestivo (Johnson et al., 2004). Quando a
lisina é substituída pela treonina no códon 76, a carga positiva é perdida e a CQ
escapa do vacúolo digestivo e, portanto, de seu alvo heme. Quando a CQ é
adicionada à solução de parasitos junto com a Halofantrina (HF), uma base fraca e
muito lipofílica, sua concentração decai completamente, já que a HF se liga com
maior afinidade ao heme, indicando que o mecanismo de captura de prótons não é o
único atuando na alta concentração da CQ no vacúolo digestivo (Bray et al., 2006).
27
Em contraste, outro modelo sugere a aquisição de um processo de efluxo
dependente de energia, expelindo a droga do vacúolo. Sanchez e cols. (2003)
compararam o acúmulo da CQ no exterior e interior do vacúolo digestivo e a cinética
de absorção dessa droga em parasitos resistentes e sensíveis e concluíram que os
parasitos resistentes são capazes de acumular CQ no vacúolo digestivo por um
processo conhecido como trans-estimulação, sugerindo um mecanismo dependente
de energia, possivelmente, envolvendo Adenosina 5'-trifosfato (ATP) (Sanchez et al.,
2003; Sanchez et al., 2005; Sanchez et al., 2007b). A trans-estimulação é bloqueada
pelo Verapamil e ocorre também quando a CQ pré-carregada no parasito é
substituída por outros antimaláricos como AQ e QN e pelo bloqueador de cálcio
Quinidina.
Contrariando os modelos anteriores, Bray e cols. (2006) propuseram um
terceiro, ao investigar o acoplamento energético do processo de efluxo da CQ (Bray
et al., 2006), no qual não ocorre nenhum efeito no efluxo da droga quando os
parasitos resistentes são privados de glicose ou diante da presença de um inibidor
eletroquímico de gradiente de prótons. O esperado nessa situação seria uma
redução do efluxo da droga, se o gene pfcrt estivesse agindo como uma bomba ou
como um transportador dependente de energia, o que não ocorreu. Então, concluiu-
se que a força energética estaria na forma de gradiente de próton eletroquímico
através da membrana do vacúolo digestivo, já que, ao se colapsar esse gradiente,
parasitos sensíveis e resistentes apresentaram acúmulo semelhante da droga no
vacúolo digestivo. O modelo sugere, portanto, que o gene pfcrt é um poro aquoso
que permite o extravaso passivo de formas protonadas da droga.
Os cinco haplótipos de aminoácidos encontrados nos códons 72 a 76 do pfcrt
estão relacionados com a origem geográfica do parasito (Tabela 1). Parasitos
28
sensíveis possuem haplótipo Cys-Val-Met-Asn-Lys (CVMNK) e são encontrados em
quase todas as regiões do mundo. Os parasitos resistentes que possuem haplótipo
Cys-Val-Ile-Glu-Thr (CVIET) são originários da África e da Ásia. No sudeste asiático,
por sua vez, são encontrados parasitos com o haplótipo Cys-Val-Ile-Asp-Thr
(CVIDT), no Pacífico se encontram dois haplótipos diferentes: Cys-Val-Ile-Lys-Thr
(CVIKT) e Ser-Val-Met-Asn-Thr (SVMNT) e por fim, há, nas Américas, o haplótipo
SVMNT (Su et al., 1999; Wootton et al., 2002; Chen et al., 2003)
Linhagem 72 74 75 76 97 144 148 160 194 220 271 326 333 356 371
CQS
C M N K H A L L I A Q N T I R
(HB3, Honduras)
CQR
Dd2 (Indochina)
C I E T H A L L I S E S T T I
734 (Cambodia) C I D T H F I L T S E N S I R
2300 (Indonesia)
C I K T H A L L I S E S T I I
PH2 (Filipinas S M N T H T L Y I A Q D T I R
América do Sul 7G8 (Brasil)
S M N T H A L L I S Q D T L R
e os haplótipos encontrados em diferentes regiões geográficas
Tabela 1: Mutações em 15 códons associados à resistência no gene pfcrt
Sudeste Asiático
Pacífico
Posição do pfcrt e o aminoácido codificante
Região
Todas
Ásia e África
CQR = Resistentes à Cloroquina e CQS = Sensíveis à Cloroquina (Valderramos e
Fidock, 2006).
Como os experimentos moleculares vieram depois de um longo período de
pressão da CQ, é difícil saber qual era o genoma do parasito antes do uso da droga.
Ao modificar o esquema terapêutico, muitos países retiraram a pressão desse
antimalárico sobre os parasitos, portanto, tem-se observado um aumento da
prevalência do haplótipo sensível à CQ, possivelmente devido a uma perda na
fitness do parasito causada pelas mutações no gene (Temu et al., 2006).
O gene pfcrt também pode estar envolvido na resposta a outros antimaláricos,
como QN, AQ e MQ. Cooper e cols. (2007) realizaram um experimento em que
expuseram parasitos sensíveis (linhagem 106/1) a doses letais de CQ e observaram
29
a sobrevivência de parasitos com novas mutações (K76N ou K76I), que mais tarde,
apresentaram, não apenas um aumento de 8 a 12 vezes no IC
50
, como também, um
aumento na sensibilidade à QN e redução de sensibilidade à Quinidina (Cooper et
al., 2007). Em outro experimento, em que o alelo de um parasito sensível à CQ
(linhagem GC03) foi substituído por um alelo de uma linhagem resistente, observou-
se aumento da susceptibilidade à QN e à MQ (Sidhu et al., 2002). Outro estudo
reporta que os polimorfismos no gene pfcrt também podem atuar na resposta à AQ
(Echeverry et al., 2007).
2.7.2 Gene pfmdr1 e resistência a multidrogas
O fenótipo de resistência às múltiplas drogas foi originalmente identificado em
linhagens de células cancerígenas e está associado à super expressão de certos
transportadores da superfamília ABC (Borst et al., 1999; Bodo et al., 2003). Um
desses transportadores é conhecido como MDR (resistência à multidrogas) e
codifica uma proteína denominada de P-glicoproteína (Pgh), responsável por
eliminar drogas e manter a concentração do composto citotóxico abaixo do nível letal
(Bodo et al., 2003). A extrusão da droga é mediada por hidrólise de ATP, sugerindo
a dependência de energia na ação da Pgh (Deeley e Cole, 1997). O MDR não é
seletivo e pode reconhecer a estrutura de substratos não relacionados e translocar
muitos compostos hidrofóbicos distintos (Zeng et al., 1999).
Devido à similaridade de redução do acúmulo da CQ em parasitos resistentes
e células tumorais, pesquisadores procuraram por homologia entre os dois genomas
e identificaram um ortólogo em P. falciparum, posteriormente denominado de pfmdr1
(Peel, 2001; Klokouzas et al., 2003), que é um gene codificador da proteína Pgh-1
30
de ~162kDA, localizada na membrana do vacúolo digestivo (Figura 9). O domínio de
ligação do ATP da Pgh-1 está localizado na porção do citoplasma do vacúolo
digestivo, surgindo o transporte de substratos na direção do vacúolo digestivo (Foote
et al., 1989; Wilson et al., 1993)
Com o objetivo de caracterizar as propriedades de transporte da Pgh-1 e sua
interação com os antimaláricos, Saliba e cols. (2008) avaliaram a expressão de
cinco diferentes formas polimórficas do gene em oocistos de Xenopus laevis (Saliba
et al., 2008). Concluíram que a proteína é apta a translocar CQ, QN e HF e o
transporte varia entre o haplótipo selvagem e seus variantes polimórficos. O
haplótipo selvagem transporta CQ e QN, mas não HF, enquanto que seus variantes
transportam HF, mas não CQ e QN para o vacúolo digestivo, indicando que
polimorfismos no gene pfmdr1 alteram a especificidade do substrato na proteína
(Volkman et al., 1993).
Figura 9: Representação da estrutura da Pgh-1. codificada pelo gene
pfmdr1, uma transportadora da família ABC, com 12 domínios
transmembranares representados em azul. Os pontos brancos simbolizam
os aminoácidos da seqüencia e as mutações associadas à resistência
estão representadas por pontos vermelhos. Cada um destes pontos
vermelhos têm sua localização numerada. (Valderramos e Fidock, 2006).
31
O gene pfmdr1 foi ainda associado à susceptibilidade à MQ, QN, CQ e ART.
Reed e cols. (2000) realizaram experimentos de transformação e de permuta alélica
para examinar o papel das mutações na susceptibilidade a diversas drogas. Foram
geradas diferentes linhagens, com combinações distintas de três mutações
(Ser1034Cys, Asn1042Asp e Asp1246Tyr). A inserção do alelo, contendo as três
mutações na linhagem sensível à CQ, não alterou a susceptibilidade à droga,
indicando que as mutações no gene pfmdr1 são insuficientes para conferir
resistência à CQ. Entretanto, a transfecção do alelo não mutante na linhagem 7G8
(CQR), resultou numa redução drástica do IC
50
da CQ, implicando que, embora as
mutações no gene não sejam suficientes para conferir resistência à CQ, podem agir
na modulação do nível da resistência. Além disso, a remoção das três mutações da
linhagem 7G8 resultou na reversão da sensibilidade à QN. No entanto, a transfecção
das mesmas, na linhagem 7G8, originou parasitos resistentes à MQ e
contrariamente, aumentou a sensibilidade à ART, indicando correlação entre
mutações no gene pfmdr1 e a susceptibilidade à MQ e à ART. No mesmo
experimento, a inserção de uma única mutação (Asp1246Tyr) foi capaz de aumentar
mais ainda o IC
50
à MQ e HF (Reed et al., 2000).
A tabela 2 indica os códons mutantes do gene pfmdr1 e a respectiva mudança
de aminoácidos em parasitos oriundos de diversas regiões do mundo:
32
Número
de cópias
Região Linhagem (Origem) 86 184 1034 1042 1246
Todas Tipo selvagem (3D7, Holanda) N Y S N D 1
Ásia e África FCB (Sudeste Asiático) N Y S N D ≥2
K1 (Tailândia) Y Y S N D 1
América do Sul 7G8 (Brasil) N F C D Y 1
Posição do aminoácido no pfmdr1
Tabela 2: Mutações e número de cópias do gene pfmdr1 associados à
resistência à múltiplas drogas e os haplótipos encontrados em diferentes
regiões do mundo
O tipo selvagem é encontrado em todas as regiões do mundo (Todas) enquanto que
os mutantes podem ser encontrados na Ásia, África e América do Sul. Tabela
adaptada de Fidock e cols. (2000) (Fidock et al., 2000).
Alguns estudos também encontraram associação entre a presença da
mutação Asn86Tyr (N86Y) e a resistência à CQ em isolados africanos. O alelo Ans
86 (N86), inclusive, está envolvido na tolerância in vivo à lumefantrina e pode,
portanto, funcionar como um marcador molecular (Sisowath et al., 2005; Sisowath et
al., 2007). Por fim, em um estudo na América do Sul realizado por Zalis e cols.
(1998), encontrou-se uma forte correlação entre mutações no gene pfmdr1 e
resistência à CQ, porém não à QN (Zalis et al., 1998).
A amplificação ou super expressão do gene pfmdr1 influencia a
susceptibilidade a diferentes antimaláricos (Price et al., 2004). Observou-se que a
amplificação gênica tem papel importante na resistência: o aumento do número de
cópias do gene é um grande determinante da resistência in vitro e in vivo à MQ,
podendo também determinar a sensibilidade a ART in vitro e capaz de influenciar o
aumento do IC
50
da QN. Em outro estudo, Jiang e cols. (2008) estudaram o número
de cópias e sua correlação com a resposta às drogas, e verificaram que esse
comportamento está associado ao aumento do IC
50
de ART e MQ e diminuição do
IC
50
de CQ (Jiang et al., 2008).
33
2.7.3 Outros genes envolvidos na susceptibilidade às Quinoleínas
Diferentes clones de P. falciparum, contendo os mesmos alelos e com o
mesmo perfil polimórfico, possuem uma vasta gama de susceptibilidade aos
antimaláricos, indicando, portanto, a ação de outros genes na resistência dos
parasitos. Foi verificado que quanto maior é o IC
50
, maior é o acúmulo de mutações
no genoma do parasito na resistência a CQ e a QN. Em outro estudo, Ferdig e cols.
(2004) encontraram a ação de um novo gene (Pgnhe-1), além do gene pfcrt e do
gene pfmdr1 atuando na resistência à QN (Ferdig et al., 2004).
Como proteínas transportadoras estão associadas com a resistência a drogas
em diversos microorganismos, Mu e cols. (2003), procuraram por transportadores no
genoma de P. falciparum e encontraram 49 destes em 97 linhagens oriundas de
diferentes regiões geográficas. Em sua análise, Mu e cols. (2003). associaram 11
transportadores ligados à resposta à QN e a CQ (pfcrt, Pfmdr-1 e PFA0590w PF13-
0271, PF14-0292, PF08-0078, PF14-0321, PFE0775c, PF14-0260, PF14-0133,
PFL0620c). No mesmo estudo, os autores também perceberam que a combinação
das mutações nos 11 transportadores é responsável por diferentes níveis de
susceptibilidade às drogas. Uma observação interessante, no mesmo experimento,
foi a associação entre padrões de polimorfismos e a suscetibilidade de parasitos de
regiões geográficas distintas (Mu et al., 2003). Isto é, enquanto algumas mutações
apresentaram associação com a resposta à QN e/ou CQ em parasitos africanos, a
mesma associação foi muito fraca ou nula em parasitos de outras regiões
geográficas, o que indica a importância da pressão da droga exercida nos parasitos
oriundos de diferentes políticas de tratamento adotadas pelos países. Assim sendo,
34
essa pressão seleciona uma combinação de mutações, podendo estar associadas à
suscetibilidade às drogas em algumas regiões e não em outras.
Anderson e cols. (2005), utilizando uma abordagem estatística diferente,
analisaram a associação entre os polimorfismos previamente descritos por Mu e
cols. (2003) e a susceptibilidade à droga em isolados coletados de pacientes da
Tailândia. Ao contrário do estudo de Mu e cols. (2003), não encontraram nenhuma
associação entre os nove novos transportadores e a resposta à QN e CQ. Essa não-
correlação pode ser devida à origem geográfica das amostras. Em adição, foi
encontrada associação entre o gene G7 com a suscetibilidade ao Artesunato
(Anderson et al., 2005).
Estudos recentes encontraram associação entre o gene pfmrp (G2) e a
susceptibilidade à QN (Mu et al., 2003; Klokouzas et al., 2004; Ursing et al., 2006;
Henry et al., 2008a). Esse gene codifica uma transportadora da família ABC e tem
papel importante no transporte de glutationa na membrana plasmática do parasito, e
a redução na susceptibilidade à CQ e à QN foi significantemente associada às
mutações nos códons 191 e 437 (His191Tyr e Ser337Ala) (Henry et al., 2008a).
Ferdig e cols. (2004) identificaram um papel importante do cromossomo 13 na
resistência a QN, assim como o efeito do cromossomo 9 que interage com o
cromossomo 13. Um segmento nesse cromossomo contém um gene que codifica
uma permutadora de Na
+
/H
+
, a Pfnhe-1, associada à regulação do pH na
transmembrana do vacúolo digestivo e do citosol. O número de repetições da
sequência de aminoácidos Asp-Asn-Asn-Asn-Asp (DNNND) na proteina Pfnhe-1
está relacionado com a susceptibilidade à QN. Estudos subseqüentes examinaram o
pH do citosol e do vacúolo digestivo e a atividade da proteína Pfnhe-1 em diferentes
linhagens de parasitos, observando-se que o pH do citosol elevado está associado
35
com o aumento da atividade da proteína Pfnhe-1 e com o elevado nível de
resistência à QN, devido a interação entre os cromossomos 13 e 9. Essa
associação, por sua vez, não foi identificada em relação à CQ (Ferdig et al., 2004).
3 JUSTIFICATIVA
A compreensão dos mecanismos de resistência aos antimaláricos é
fundamental no entendimento da ação das drogas, no desenvolvimento de novos
alvos terapêuticos e na descoberta de biomarcadores que servem como uma
ferramenta no diagnóstico e na epidemiologia molecular da resistência do parasito
aos antimaláricos.
A capacidade de resistência a drogas em parasitos retrata um grande
impasse na quimioterapia da malária. Este fenótipo, frente a diferentes classes de
drogas citotóxicas, está freqüentemente associado com as mutações em um ou mais
membros de proteínas da superfamília ABC que são transportadoras
transmembranas dependentes de energia. Estes transportadores incluem a proteína
Pgh-1, codificada pelo gene pfmdr1. A fim de verificar se outros transportadores
também poderiam estar associados ao fenótipo de resistência às drogas, Su e cols.
(dados não publicados) procuraram por estas proteínas no genoma do plasmódio e
identificaram 22 mutações em sete proteínas transportadoras. Em seguida, foi
realizado o teste in vitro para CQ e QN e observou-se que quanto maior era o IC
50
,
maior era a freqüência de mutações, havendo consideravelmente mais mutações em
parasitos resistentes do que em sensíveis.
Em seguida, Mu e cols. (2003) identificaram nove novos transportadores,
além do pfcrt e do pfmdr1 com associação à resposta in vitro à CQ e à QN.
Verificou-se que essa associação variava de acordo com a origem geográfica das
amostras, sendo mais significativa em algumas regiões do que em outras. O gene
G2, por exemplo, teve associação significativa à resposta in vitro à CQ na Ásia, mas
37
não nas Américas; o gene G7 foi associado à resposta in vitro à CQ na África, no
entanto não houve esta associação nas Américas. As amostras estudadas por Mu e
cols. (2003) eram provenientes de cepas de laboratório, que permaneceram sem a
pressão seletiva da droga em cultivo. O número pequeno de amostras
geograficamente semelhantes dificulta o estudo da relação entre as mutações
genéticas e a resposta in vitro em cada região endêmica. Portanto, é necessário um
estudo que, em lugar de cepas de laboratório, utilize isolados de campo originários
de duas regiões geograficamente distintas, que tiveram pressão seletiva de
antimaláricos diferentes.
Em nosso estudo as amostras foram selecionadas no Brasil e na Nigéria, por
serem países que tiveram escolhas terapêuticas distintas até 2007. Foram
selecionados os marcadores moleculares pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 para análise
de relação das mutações genéticas e da resposta in vitro, não apenas à CQ e à QN,
mas também à MQ e à AQ. A associação das mutações com a susceptibilidade in
vitro a essas duas últimas drogas não foi analisada em outros estudos. Como são
quinoleínas e, portanto, estruturalmente semelhantes, é possível obter-se uma
associação significativa entre as mutações e a resposta in vitro a essas drogas.
Embora o tratamento de P. falciparum de primeira linha tenha sido modificado
no Brasil e na Nigéria, a compreensão dos mecanismos de resistência aos
antimaláricos ainda é escasso, principalmente em relação a outros antimaláricos
diferentes da CQ. Portanto, a melhor compreensão de genes associados à
resistência a todos os antimaláricos pode realçar o entendimento dos mecanismos
moleculares envolvidos na resistência e a descoberta de biomarcadores que atuam
como ferramentas de diagnóstico da resistência aos antimaláricos.
4 OBJETIVOS
O principal objetivo do presente estudo é determinar se os níveis de
resistência do P. falciparum aos antimaláricos in vitro estão associados às
combinações de mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 em duas
coleções de plasmódio obtidas no Brasil e na Nigéria.
Os objetivos específicos desse trabalho são:
• Determinar a presença das mutações K76T (pfcrt), N86Y (pfmdr1), S437A
(G2), N834N&1 (G7) e V241L e S263P (G47) em isolados de P. falciparum
obtidos dos pacientes.
• Comparar a freqüência das mutações com o perfil de susceptibilidade in
vitro dos antimaláricos CQ, AQ, MQ e QN.
• Associar as combinações polimórficas dos cinco genes ao perfil de
susceptibilidade in vitro.
• Comparar o perfil de susceptibilidade e a associação das mutações entre
Nigéria e Brasil.
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 ÁREA DE ESTUDO E CASUÍSTICA
Esse é um estudo retrospectivo a partir de uma coleção de 150 amostras de
um banco de dados do Centro de Pesquisa de Patologias Tropicais –
CEPEM/IPEPATRO, em Porto Velho, Rondônia e do Laboratório de Pesquisa de
Malária da Universidade de Medicina do Ibadan, em Ibadan, Nigéria. As amostras do
CEPEM foram coletadas entre 2006 e meados de 2008, como parte de um banco de
dados do projeto “Interações Moleculares do Receptor da Célula Vermelha com
Ligantes de P. falciparum" (CEP n˚ 045/06), bem como, de outro projeto:
“Determinantes Moleculares da Resistência de P. falciparum a drogas antimaláricas”
(CEP n˚ 046/06). Em anexo, segue a carta de colaboração com a Prof. Elieth de
Afonso Mesquita do CEPEM (Anexo 1).
As amostras nigerianas foram coletadas entre 2006 e 2007 como parte do
projeto “Molecular determinants of drug response and resistance in P. falciparum
from Africa and South America” aprovado pelo UI/UCH Institutional Review Committe
da Universidade do Ibadan, na Nigéria. Em anexo, segue a carta de aprovação do
projeto pelo comitê de ética (Anexo 2) e a carta de colaboração com o Dr. Christian
Happi (Anexo 3).
40
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DO PARASITO
O teste in vitro dos parasitos provenientes do Brasil e da Nigéria foi realizado
pelo método de microteste com incorporação de hipoxantina tritiada (HXA), em
ambos os países, segundo protocolo previamente estabelecido (Desjardins et al.,
1979). Os parasitos da Nigéria foram testados, apenas, para os antimaláricos CQ e
AQ, já que usualmente não possuem QN e MQ para o teste in vitro enquanto que,
os do Brasil tiveram o teste in vitro realizado com os antimaláricos CQ, AQ, QN e
MQ. Todos os fármacos foram obtidos do Walter Reed Army Institute of Research,
Washington, EUA. O teste in vitro foi realizado diretamente após a coleta de sangue
do paciente, sem adaptação do parasito em cultivo.
5.2.1 Preparo da suspensão das hemácias
A coleta de sangue do paciente se procedeu por punção venosa com tubo
vacuntainer contendo heparina. Em seguida o tubo vacuntainer foi centrifugado para
a separação do plasma das hemácias. O plasma foi retirado do tubo e o sangue
posteriormente lavado duas vezes com meio de cultivo RPMI 1640 (Roswell Park
Memorial Institute médium). Após a lavagem, 250 µL de sangue foram adicionados a
um microtubo de 1,5 mL e 100 µL foram adicionados ao papel de filtro (Whatman
International Maidstone, UK). Outra alíquota de 700 µL foi adicionada a um tubo
falcon de 15 mL para o teste in vitro. Nesse tubo foram adicionados 13,3 mL de meio
RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes,
Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 0,5% de Albumax e também sangue não
parasitado do tipo O negativo para o ajuste da parasitemia para 1% e hematócrito de
41
1,5%.
5.2.2 Diluição dos antimaláricos
Os antimaláricos CQ e QN foram solubilizadas a 1mg/mL em água MilliQ a
fim de se preparar o filtrado. A MQ e a AQ foram solubilizados a uma 1mg/mL, em
Metanol (Metanol Absoluto, Biolab, BR). Após esse procedimento, realizou-se uma
diluição das drogas de 1:4 em meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato
de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina e Gentamicina para a
preparação da solução mãe. Após essa diluição, realizou-se a preparação da
solução estoque, em que se diluiu o filtrado em 1:10 com meio RPMI 1640 da Gibco,
adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina,
Gentamicina e 10% de Albumax. Para MQ e AQ foi realizada novamente uma
diluição 1:10 com meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e
L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 10% de Albumax. A
tabela com a concentração das drogas em cada procedimento de diluição encontra-
se e a seguir (tabela 3).
Tabela 3: Concentração de cada droga em cada diluíção
Diluição
CQ
QN
MQ
AQ
Peso molecular
515,9g
361g
414,77g
464,8g
[ ] no filtrado
1mg/mL
1938 µM
2770 µM
2410,9 µM
2151 µM
[ ] na solução mãe
4x
484,5 µM
692,5 µM
692,74 µM
537,75 µM
[ ] na solução estoque 1
10x
48,45 µM
69,25 µM
60,27 µM
53,77 µM
[ ] na solução estoque 2
10x
NR
NR
6,027 µM
5,377 µM
NR – não realizado. [ ] - concentração
42
5.2.3 Preparo das placas de microcultura
Após a preparação da solução estoque dos antimaláricos, as placas de 96
poços foram preparadas com a droga em duplicata e o sangue parasitado do
paciente. A solução estoque do antimalárico foi adicionada nos primeiros poços
(poços A) em duplicata e a droga foi diluída em 1:3 em cada poço seguinte (B, C, D,
E, F e G) a fim de se obter diluições seriadas dos antimaláricos. A concentração final
variou de 6,64 a 4845 nM para Cloroquina, de 9,49 a 6925 nM para Quinina, de
0,826 a 602,7 nM para Mefloquina e de 0,736 a 537 nM para Amodiaquina. A última
fileira de poços (H) foi reservada para o controle do crescimento do parasito, não
possuindo, assim, adição de qualquer um dos fármacos. Após a adição dos
antimaláricos foi adicionada em cada poço as suspensões de hemácias preparadas
anteriormente (parasitemia de 1% e hemotócrito de 1,5%), inclusive na última fileira
de poços. As placas foram incubadas por 48 horas em microaerofilia a 37°C. A HXA
foi utilizada para estimar o crescimento do parasito. Para tanto, 50 µL de HXA foi
adicionado em cada poço, 24 horas após o início do experimento.
Ao final de 48 horas, a placa foi congelada a – 20 °C para a lise celular. Após
a transferência dos parasitos para um filtro de fibra de vidro utilizando um coletor de
células, foi determinada a quantidade de HXA incorporada no parasito com o uso do
contador Liquid Cintilation Wallac Beta Plate 1205 (Perkin-Elmer). A figura 10
apresenta o desenho da placa com a concentração dos antimaláricos em cada poço.
O experimento e as concentrações utilizadas foram baseados em estudos realizados
anteriormente (Zalis et al., 1998; Vieira et al., 2004).
43
Figura 10: Acima, Placa de 96 poços com a disposição dos fármacos e
suas concentrações finais em cada poço. Abaixo, direita, placa de
microteste com os fármacos nas concentrações finais e o sangue do
paciente. À esquerda, Placas em condições de microaerofilia na estufa a
37°C. SD: Sem droga; CTRL, controle.
5.2.4 Contagem da parasitemina e determinação do IC
50
A concentração inibitória de crescimento 50% (IC
50
) é uma medida de
efetividade do composto de inibir uma função biológica. A medida quantitativa indica
o quanto da droga é necessário para inibir o crescimento biológico do parasito pela
metade. Ou seja, o IC
50
corresponde à concentração que inibe 50 % do crescimento
do parasito e é determinado através da curva dose-resposta obtida do experimento
in vitro.
Os limiares in vitro de resistência aos antimaláricos que discriminam parasitos
sensíveis dos resistentes foram considerados de acordo com a literatura e seus
Placa de 96 poços com as concentrações e as disposições das drogas em nM
Cloroquina
Quinina
Mefloquina
Amodiaquina
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
4845
4845
SD
6925
6925
SD
602,7
602,7
SD
537
537
SD
B
1615
1615
SD
2308
2308
SD
200,9
200,9
SD
179
179
SD
C
538,3
538,3
SD
769,4
769,4
SD
66,96
66,96
SD
59,66
59,66
SD
D
179,4
179,4
SD
256,4
256,4
SD
22,32
22,32
SD
19,88
19,88
SD
E
59,81
59,81
SD
85,49
85,49
SD
7,44
7,44
SD
6,629
6,629
SD
F
19,93
19,93
SD
28,49
28,49
SD
2,48
2,48
SD
2,209
2,209
SD
G
6,64 6,64
SD
9,49 9,49
SD
0,826 0,826
SD
0,736 0,736
SD
H
CTRL
CTRL
SD
CTRL
CTRL
SD
CTRL
CTRL
SD
CTRL
CTRL
SD
44
valores encontram-se na tabela 4.
Drogas
Limiar de resistência (nM)
Referências
CQ 100 Wellems e Plowe (2001)
AQ 30 Pradines e cols. (2006)
QN 500 Basco e cols. (1994)
MQ 30 Hatin e cols. (1992)
Tabela 4: Limiares de resistência da CQ, AQ, QN e MQ
5.2.5 AVALIAÇÃO DAS MUTAÇÕES GENÉTICAS
5.2.6 Extração do DNA Plasmodial
Para a extração do DNA genômico, foi utilizado o sangue impregnado em
papel de filtro Whatman, de 5,5cm de diâmetro (Whatman International Maidstone,
UK), doado pela Prof. Elieth Mesquita, do Centro de Pesquisa de Patologias
Tropicais e pelo Dr. Christian Happi, da Universidade de Medicina do Ibadan.
O DNA plasmodial foi extraído, utilizando-se o método fenol-clorofórmio com
lise por saponina a 0,05% (Cox-Singh et al., 1995). Do papel de filtro, foi removido
um fragmento de, aproximadamente, 3 mm, com a utilização de uma tesoura estéril.
O fragmento foi, em seguida, reduzido em tamanhos menores e adicionado a uma
solução de PBS 1x com 0,05% de Saponina, por 2 horas a 37°C. Retirou-se o
sobrenadante e adicionou-se o tampão de lise (40 mM de Tris-HCl pH 8,0, 80 mM de
EDTA, pH 8,0, SDS a 0,2% e 150 μL de Proteinase K), por 2 horas, a 37°C, para a
remoção das proteínas. Após a fragmentação e digestão das proteínas da amostra,
foi adicionado fenol-clorofórmio (Invitrogen) v/v na amostra, para a desnaturação das
45
proteínas restantes. Depois de sucessivas centrifugações para a remoção dos
resíduos, o sedimento restante foi ressuspedido em 50μL de H
2
O MiilliQ. Aplicou-se
2 μL do produto, em gel de agarose a 2% (Ultra Pure Agarose, Invitrogen), contendo
solução de brometo de etídeo (5 μL/mL em TBE). As bandas foram fracionadas por
eletroforese, a 90 volts, por 40 minutos e visualizadas com luz ultravioleta (Fluo-Link,
Fluogen) e posteriormente armazenadas a -20°C.
5.2.7 Amplificação do DNA
Foram desenhados oligonucleoídeos específicos para a região que contém a
mutação descrita por Mu e cols. (2003). Os oligonucleotídeos foram diluídos a 50
pmoles com água MilliQ. Utilizou-se a técnica de “nested-PCR”com Taq polimerase
Platinum (Invitrogen, BR).
A reação com a Taq polimerase Platinum (Invitrogen, BR) foi realizada para
um volume final de 50 μL. Na reação, foi adicionado Tampão 1x (20 mM Tris-HCL –
pH 8,0, 0,1 mM de EDTA, 1 mM DTT, 50% (v/v) glycerol), 0,25 mM de dNTP
(Invitrogen, BR), 1,5 mM de Cloreto de Magnésio, 50 pmol do oligonucleotídeo
“forward” (específico para cada gene), 50pmol do oligonucleoídeo “reverse”
(específico para cada gene), 2,5 U de Taq polimerase e 3 μL de DNA da extração
descrita acima. Para a reação de nested, foi utilizado o mesmo protocolo, alterando-
se apenas o volume DNA, agora amplicon, para 1 μL. Esse protocolo foi utilizado
para amplificação de todos os genes, alterando apenas a ciclagem do termociclador
para cada um dos genes.
46
Para o gene pfcrt, foram utilizados os oligonucleotídeos CRTP1 e CRTP2 na
primeira amplificação e CRTD1 e CRTD2 na segunda, com a intenção de se verificar
o perfil polimórfico do lócus 72 ao 76. A ciclagem do termociclador foi de 95°C para
desnaturação, por 3 minutos; 45 ciclos de 95°C, por 30 segundos; 56°C por 30
segundos e 60°C por 60 segundos e temperatura final de extensão de 60°C por 5
minutos para o primeiro nested. A segunda amplificação teve sua ciclagem de 95°C
para desnaturação por 3 minutos, 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 48°C por 30
segundos e 65°C por 60 segundos e temperatura final de extensão de 65°C por 5
minutos (Djimde et al., 2001).
O gene pfmdr1 teve seu fragmento amplificado pelos oligonucleotídeos MDR1
e MDR2 para a primeira amplificação seguida dos oligonucleotídeos MDR3 e MDR4.
Essas regiões cobriam o lócus 86 do gene para a observação do polimorfismo
N86Y. As temperaturas do termociclador foram ajustadas em 95°C por 5 minutos, 45
ciclos de 95°C por 30 segundos, 45°C por 30 segundos e 65°C por 45 segundos e
finalmente extensão de 72°C por 5 minutos para ambas as amplificações (Duah et
al., 2007) .
O gene G2 foi amplificado com os oligonucleotídeos G2bFext e G2bRext na
primeira amplificação e com os oligonucleotídeos G2bFin e G2bRin na segunda
amplificação, no intuito de se verificar a presença da mutação S437A (Mu et al.,
2003).
O gene G7 foi amplificado com os oligonucleotídeos G7Fex e G7Rex na
primeira amplificação e G7Fin e G7Rin na segunda amplificação para a observação
da presença de uma inserção de Asparagina no locus 834 (N834N&1) (Mu et al.,
2003).
47
O gene G47 foi amplificado, utilizando-se na primeira amplificação os
oligonucleotídeos G47Fex e G47Rex e na segunda, os oligonucleotídeos G47Fin e
G47Rin para a observação das mutações no locus V241L e S263P (Mu et al., 2003).
A tabela 5 apresenta a sequência dos oligonucleotídeos de todos os genes.
Gene Nome Seqüencia do oligonucleotídeo
Pfcrt CRTP1 5'CCGTTAATAATAAATACACGCAG 3’
CRTP2 5'CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC 3’
CRTD1 5'TGTGCTCATGTGTTTAAACTT 3’
CRTD2 5'CAAAACTATAGTTACCAATTTTG 3’
pfmdr1 MDR1 5’CGCGCGTTGAACAAAAAGAGTACCGCTG 3’
MDR2 5'GGGCCCTCGTACCAATTCCTGAACTCAC 3'
MDR3 5’TTTCCGTTTAAATGTTTACCTGC 3’
MDR4 5’CCATCTTGATAAAAAACACTTCTT 3’
G2 g2bFex 5'ATTTATAATATTATGTTTC 3'
g2bRex 5'TTTCTTCTTTCTTATTTAATC 3'
g2bFin 5'CAATGATACTATTTGAATTT 3'
g2bRin 5'CTTATTAATCTATCTTTTA 3'
G7 g7Fex 5'GTAATGTGAAGAATATCTA 3'
g7Rex 5' TTGAAGCTTGAATCATTTGTTTATC 3'
g7Fin 5' CAAATCCAAATATTACGAAAA 3'
g7Rin 5' AGTATCTTGTGGTACGACACTT 3'
G47 g47Fex 5' GTATAGATATTAAAGATGCC 3'
g47Rex 5'CATATTTTCAAATACACTCGCCAT 3'
g47Fin 5'GATGCCAAAGAAAAAGAACG 3'
g47Rin 5'GACCAGAAGAATGAAATACATCCA 3'
Tabela 5: Sequência dos oligonucleotídeos
Os ciclos térmicos foram semelhantes para os três genes (G2, G7 e G47),
sendo apenas alterada a temperatura de hibridização: 95°C por 5 minutos para
desnaturação, 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 49°C para G2, 50°C para G7 e
55°C para G47 por 30 segundos e 70°C por 30 segundos, finalizando com 70°C por
5 minutos de extensão.
48
Após a amplificação, 2 μL do produto de cada amostra foi aplicado em gel de
agarose a 2% (Ultra Pure Agarose, Invitrogen), contendo solução de brometo de
etídeo (5 μL/mL em TBE – Tris-base, ácido bórico e EDTA). As bandas foram
fracionadas por eletroforese a 90 volts por 40 minutos e visualizadas em um
transiluminador (Fluo-Link, Fluogen).
5.2.8 Purificação do produto da amplificação
A purificação do produto de PCR foi realizada com o método de colunas do kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, UK). As amostras que
apresentaram apenas uma banda no gel foram purificadas diretamente com o kit, as
amostras que tiveram mais de uma banda foram fracionadas em gel de agarose a
2% (Ultra Pure Agarose, Invitrogen) e coradas com brometo de etídeo (5 μL/mL em
TBE). A banda correspondente ao amplicon foi retirada do gel por incisão, utilizando
bisturi estéril e, após separação por eletroforese a 90 volts por 40 minutos, foi
retirada e armazenada em microtubo a -20°C ou imediatamente purificada com o kit.
5.2.9 Quantificação do produto purificado
A concentração ideal para o seqüenciamento das amostras é de 100 nM de
DNA por reação, portanto, é necessário o conhecimento da concentração de cada
amostra a fim de se ajustar os volumes da reação de seqüenciamento. Por esse
motivo, 2μL do produto purificado foram aplicados em gel de agarose a 1% (Ultra
Pure Agarose, Invitrogen) para a quantificação, utilizando o Low DNA Mass Ladder
(Invitrogen, UK) (Plasmídios com fragmentos de 100 a 2000pb em tampão de 10 mM
Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA). O produto é composto de bandas de tamanhos e
49
pesos conhecidos, produzindo, assim, fragmentos contendo 100, 60, 40, 20, 10 e
5ng de DNA. A quantificação foi realizada através da comparação da intensidade da
emissão de luz das bandas purificadas com a emissão das bandas do kit por
inspeção visual.
5.2.10 Concentração de DNA dos produtos da purificação
As amostras que não possuíam concentração mínima de 10ng/μL de DNA
foram concentradas no SpeedVac® Concentrator (Savant, EUA) a 30°C, por 40
minutos. Esse equipamento concentra as amostras pelo sistema a vácuo.
Posteriormente, o produto concentrado foi ressuspenso em 13 μL de H
2
0 MilliQ e re-
quantificado.
5.2.11 Reação de Sequenciamento
As amostras foram sequenciadas, utilizando-se um sequenciador automático
ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer com o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing. Para a reação, foram utilizados 6μL de Tampão, 2μL de BigDye, 1μL de
iniciador “forward”, H20 MilliQ e 100ng de DNA para volume final de 20μL (kit BigDye
Terminator – Applied Biossystem, EUA). O produto, posteriormente, foi precipitado
com etanol e isopropanol (MLR, EUA) e diluído em formamida (Applied Biosystems,
EUA).
As sequências foram montadas pelo software Sequencing Analysis 3.7
(Applied Biosystems) e, por alinhamento, através do programa Mutation Surveyor
(Softgenetics, LLC.) e FinchTV (Geospiza).
50
5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foi criado um banco de dados em planilha Excel, contendo as mutações e os
valores de IC
50
. Os testes de média, os intervalos de confiança e os intervalos da
amostra foram calculados pelo suplemento xlstat (Microsoft). A análise filogenética
foi realizada a partir do programa CLC Workbench da CLCbio, utilizando o critério
UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean ) para a construção
da árvore filogenética. A correlação dos valores de IC
50
entre os antimaláricos foi
medida através do coeficiente de determinação (r
2
) e a correlação entre os valores
de IC
50
e as mutações foi calculada pelo teste de Kruskal-Wallis. A correlação entre
os antimaláricos foi calculada pelo exato de Fisher, utilizando tabelas 2x2. O cálculo
da prevalência foi realizado por odds ratio utilizando o programa MedCalc (Versão
10.3.2.0). A significância estatística foi determinada por p < 0,05.
6 RESULTADOS
6.1 QUIMIOSSENSIBILIDADE IN VITRO DAS AMOSTRAS
6.1.1 Teste in vitro da CQ
O teste in vitro para CQ apresentou como resultado, valores de IC
50,
variando
de 6,56 nM a 1.400 nM, com média de 241,3 nM em 88 amostras provenientes de
ambos os países. Dessas amostras, 47 (53,4%) eram sensíveis e 41 (46,6%)
resistentes à droga (Tabela 6). A média do IC
50
da CQ das amostras provenientes
do Brasil foi nove vezes maior do que a média do IC
50
das amostras nigerianas.
Média (IC 95%)
Variação de IC
50
n (nM) (nM) R%
Nigéria 59 66,2 (54,8-77,5) 6,56 - 197,2 22.10%
Brasil 29 597,6 (437,8 - 757,4) 58,8 - 1.400 96.50%
Total 88 241,3 (167,5 - 315,1) 6,56 - 1.400 46.59%
Tabela 6: Média, intervalo de confiança e Variação de IC
50
da CQ
IC = Intervalo de confiança; n = número de amostra.
Das 59 amostras nigerianas, 46 (77,9%) eram sensíveis à CQ e 13 (22,1%),
apresentaram valores acima do limiar de sensibilidade (100 nM). As sensíveis
variaram de 6,56 a 99,67 nM com média de 48,3 nM. As resistentes tiveram variação
de 100,46 a 197,2 nM e média de 129,3 nM.
52
Nas 29 amostras brasileiras, apenas 1 (3,5%) apresentou ser sensível à
droga e 28 (96,5%) possuíam fenótipo de resistência. A variação foi de 58,8 a 1.400
nM, com média de 597,6 nM e as resistentes variaram de 113 a 1.400 nM, com
média de 616,9 nM (tabela 7).
Média (IC 95%)
Variação de IC50
Média (IC 95%) Variação de IC50
Origem n nM nM n nM nM
Nigéria
46
48,3 (40,2 - 56,4)
6,56 - 99,67 13 129,3 (111,46 - 147,1) 100,46 - 197,2
Brasil 1 58.8 58.8 28 616,9 (456,1 - 777,7) 113 - 1.400
Sensíveis
Resistentes
Tabela 7: Média, IC 95% e variação do IC
50
da CQ em amostras sensíveis
e resistentes
Legenda: IC = Intervalo de confiança; n = número de amostra.
A partir dos valores de IC
50
da CQ foi criado um gráfico da distribuição das
amostras (Figura 11).
53
Figura 11: Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para CQ em nM.
As linhas mais escuras representam o limiar de sensibilidade para CQ (100 nM)
(Wellems e Plowe, 2001).
6.1.2 Teste in vitro da AQ
Os valores de IC
50
obtidos no teste in vitro para AQ variaram de 1,25 a 88,79
nM e tiveram média de 21,9 nM em 79 amostras analisadas. Dessas, 56 (70,9%)
eram sensíveis à droga e 23 (29,1%), mostraram-se resistentes. As amostras
sensíveis variaram de 1,25 a 29 nM, com média de 12,3 nM e as resistentes de
30,24 a 88,79 nM, com média de 45,4 nM (tabela 8). As amostras da Nigéria tiveram
valores de IC
50
de AQ 1,5 vezes maiores do que as amostras do Brasil.
54
Média (IC 95%)
Variação de IC
50
n (nM) (nM) R%
Nigéria 59 24,2 (19,1-29,3) 1,25 - 88,79 33.90%
Brasil 20 15,2 (10,2 - 20,2) 3,7 - 39,7 15.00%
Total 79 21,9 (17,85 -25,98) 1,25 - 88,79 29.10%
Tabela 8: Média, intervalo de confiança e Variação de IC
50
da AQ
IC = Intervalo de confiança; n = número de amostra.
Foram analisadas 59 (74,6%) amostras provenientes da Nigéria e 20
(35,4%), do Brasil. Trinta e nove (66,1%) amostras da Nigéria eram sensíveis à AQ e
20 (33,9%) eram resistentes. As sensíveis variaram de 1,25 a 27,87 nM, com média
de 12,5 nM e as resistentes de 30,24 a 88,79 nM, com média de 46,9 nM. Das 20
amostras provenientes do Brasil, 17 (85%) eram sensíveis e 3 (15%) eram
resistentes. As sensíveis variaram de 3,7 nM a 29 nM, com média de 11,8 nM e as
resistentes de 31,5 a 39,7 nM, com média de 34,9 nM (tabela 9).
e resistentes
Média (IC 95%)
Variação de IC
50
Média (IC 95%) Variação de IC
50
Origem n nM nM n nM nM
Nigéria
39 12,5 (9,9 -15,1) 1,25 - 27,87 20 46, 9 ( 40 - 53,90) 20,24 - 88,79
Brasil 17 11,8 (8,2 - 15,2) 3,7 - 29 3 34,9 (24,3 - 45,5) 31,5 - 39,7
Sensíveis
Resistentes
Tabela 9: Média, intervalo de confiança e variação do IC
50
de AQ em amostras
IC = Intervalo de confiança; n = número de amostra.
55
A partir dos valores de IC
50
da AQ foi criado um gráfico da distribuição das
amostras provenientes da Nigéria e do Brasil (figura 12).
Figura 12: Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para AQ em nM.
As linhas mais escuras representam o limiar de sensibilidade da AQ (30 nM)
(Childs et al., 1989).
6.1.3 Teste in vitro da QN
As amostras provenientes do Brasil foram testadas in vitro para QN. Como
esse antimalárico não é usualmente utilizado nas placas de microteste na Nigéria,
não foram obtidos dados de IC
50
em amostras provenientes deste país. Os valores
de IC
50
variaram de 25,5 a 310 nM, com média de 130,5 nM nas amostras do Brasil.
Todas eram sensíveis (tabela 10).
56
Média (IC 95%)
Variação de IC
50
Origem n nM nM
Brasil 20 130,5 (89,4 - 171,5) 25,5 - 310
Sensíveis
Tabela 10: Média, intervalo de confiança e variação
do IC
50
de QN
IC = Intervalo de confiança; n = número de amostra.
A partir dos valores de IC
50
da QN foi criado um gráfico da distribuição das
amostras (figura 13)
Figura 13: Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
para QN em nM. A
linha mais escura representa o limiar de sensibilidade para QN (500 nM) (Basco et
al., 1994).
57
6.1.4 Teste in vitro da MQ
As amostras brasileiras foram testadas in vitro para MQ. Este antimalárico,
assim como a QN, não é adicionado à placa de microteste na Nigéria, portanto as
amostras nigerianas não possuíam valores de IC
50
para MQ. Já nas amostras
brasileiras o IC
50
variou de 2,6 a 206 nM, com média de 39,9 nM. Treze (65%)
amostras apresentaram fenótipo de sensibilidade e 7 (35%) apresentaram fenótipo
de resistência (tabela 11). As amostras sensíveis variaram de 2,6 a 22,3 nM, com
média de 11, 3nM e as resistentes, de 31 a 206 nM, com média de 92,6 nM.
Média (IC 95%) Variação de IC50 Média (IC 95%) Variação de IC50
Origem n nM nM n nM nM
Brasil 13 11,5 (7,5 - 15,6) 2,6 - 22,3 7 92,6 (21,6 - 163,3) 31 - 206
Sensíveis
Resistentes
Tabela 11: Média, intervalo de confiança e variação do IC
50
de MQ
Legenda: IC = Intervalo de confiança; n = número de amostra.
A partir dos valores de IC
50
da MQ foi criado um gráfico da distribuição das
amostras (figura 14).
58
Figura 14: Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC
50
de MQ em nM. As
linhas mais escuras representam o limiar de sensibilidade para MQ (30nM) (Hatin et
al., 1992).
6.2 AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA CRUZADA ENTRE OS ANTIMALÁRICOS
A correlação pareada das atividades in vitro da CQ, AQ, QN e MQ foi
analisada com o propósito de avaliar a resistência cruzada entre estes antimaláricos
(tabela 12). A estimativa dessa correlação foi determinada através do coeficiente de
correlação de Pearson (r) e do coeficiente de determinação (r
2
). A correlação foi
analisada em um total de amostras (n total) e nos países em separado (origem -
Nigéria ou Brasil)
59
Origem n r
r
2
p
Cloroquina Amodiaquina n total 79 0.46 0.21 <0,001
Cloroquina Quinina Brasil 20 0.28 0.078 0.23
Cloroquina Mefloquina Brasil 20 0.29 0.008 0.22
Amodiaquina Quinina Brasil 20 -0.18 0.003 0.44
Amodiaquina Mefloquina Brasil 20 0.71 0.51 <0,001
Quinina Mefloquina Brasil 20 0.002 <0,001 0.99
Cloroquina Amodiaquina Nigéria 59 0.88 0.77 <0,001
Cloroquina Amodiaquina Brasil 20 0.47 0.22 0.036
Par de drogas
Tabela 12: Correlação das atividades in vitro da CQ, AQ, QN e MQ
n = número de amostras; r = coeficiente de correlação; r
2
= coeficiente de
determinação; p = p valor.
Uma correlação positiva significativa (p <0,05) foi obtida entre os
antimaláricos AQ e CQ e AQ e MQ. A AQ e a CQ apresentaram uma baixa
correlação (r
2
= 0,21) em amostras de ambos os países (Figura 15).
Figura 15: Correlação entre os IC
50
s da AQ e da CQ no n total de amostras
60
Após a divisão dessas amostras de acordo com suas origens, o coeficiente de
determinação manteve-se baixo (r
2
= 0,22) em amostras provenientes do Brasil
(Figura 16).
Figura 16: Correlação entre os IC
50
s da AQ e da CQ em amostras do Brasil
No entanto, o coeficiente de determinação apresentou-se alto (r
2
= 0,77) em
amostras da Nigéria (Figura 17).
61
Figura 17: Correlação entre os IC
50
s da AQ e da CQ no em amostras da Nigéria
O coeficiente de determinação entre AQ e MQ também foi alto (r
2
=0,51) nas
amostras provenientes do Brasil (figura 18).
62
Figura 18: Correlação entre os IC
50
s da AQ e da MQ em amostras do Brasil
Não houve observação de resistência cruzada entre os antimaláricos CQ e
QN, CQ e MQ, AQ e QN e QN e MQ.
6.3 ANÁLISE GENOTÍPICA
6.3.1 Gene pfcrt
O sequenciamento do pfcrt foi realizado para a observação dos haplótipos
nos códons 72-76. Obteve-se a seqüencia de 133 amostras que apresentaram
quatro haplótipos distintos: CVMNK, CVMNT, SVMNT e CVIET. O haplótipo CVIET
foi observado em 65 (48,9%) amostras, o haplótipo CVMNK foi observado em 25
(18,8%) amostras, CVMNT em três (2,2%) e SVMNT em 40 (63,1%) amostras. Das
133 amostras, 92 eram provenientes da Nigéria, onde somente os haplótipos
63
CVMNK, CVMNT e CVIET foram observados. As 41 amostras provenientes do Brasil
apresentaram os haplótipos SVMNT e CVIET. As proporções dos alelos de cada
país podem ser observadas na tabela 13.
Tabela 13: Haplótipos do pfcrt em amostras da Nigéria e do Brasil
Códon do pfcrt
72 73 74 75 76 Nigéria Brasil Total
C V M N K 25 (27,2%) 0 (0%) 65
C V M N T 3 (3,3%) 0 (0%) 40
C V I E T 64 (69,5%) 1 (2,4%) 25
S V M N T 0 (0%) 40 (97,6%) 3
41 92 133
Total
Origem
A mutação no códon 76 (K76T), associada previamente à resistência a CQ,
foi observada nas 41 (100%) amostras brasileiras e em 67 (72,8%) amostras
nigerianas (tabela 14). Vinte e cinco (27,2%) amostras nigerianas apresentaram o
códon selvagem (K76).
Tabela 14: Frequencia da mutação K76T do pfcrt no Brasil e na Nigéria
Códon
76 Nigéria Brasil Total
K 25 (27,2%) 0 (0%) 25
T 67 (72,8%) 41 (100%) 108
Total 92 41 133
Origem
64
6.3.2 Gene pfmdr1
O sequenciamento de 147 amostras resultou em 103 amostras contendo N e
44, Y no códon 86. Nenhuma amostra brasileira apresentou a mutação N86Y. Das
106 amostras nigerianas, 62 (58,5%) eram N86 e 44 (41,5%) 86Y. (Tabela 15).
Tabela 15: Frequencia da mutação N86Y do pfmdr1 no Brasil e na Nigéria
Códon
86 Nigéria Brasil Total
N 62 (58,5%) 41 (100%) 103
Y 44 (41,5%) 0 (0%) 44
Total 106 41 147
Origem
6.3.3 Gene G7
O gene G7 possui uma inserção de uma asparagina no codon 834 (834N&1)
associada à susceptibilidade das amostras aos antimaláricos CQ e QN (Mu et al.,
2003). O sequenciamento de 107 amostras resultou em 60 (56%) amostras
selvagens (N834) e 47 (44%) mutantes. Foram sequenciadas 78 amostras
nigerianas e 29 amostras brasileiras. Das amostras nigerianas, 37 (47,4%) eram
selvagens e 41 (52,6%), mutantes. Das 29 brasileiras, 23 (79,3%) eram selvagens e
6 (20,7%), mutantes (Tabela 16).
65
Tabela 16: Frequencia da mutação N834N&1 do G7 no Brasil e na Nigéria
Códon
834 Nigéria Brasil Total
N 37 (47,4%) 23(79,3%) 60
N&1 41(52,6%) 6(20,7%) 47
Total 78 29 107
Origem
6.3.4 Gene G47
No gene G47 foram encontradas duas mutações, V241L e S263P. A primeira
já havia sido descrita por Mu e cols. (2003) e associada à resistência à CQ e à QN,
principalmente em isolados asiáticos (Mu et al., 2003). Não foi encontrada nenhuma
referência na literatura sobre a mutação S263P, sendo esta observada pela primeira
vez neste estudo. A partir de 134 amostras (104 nigerianas e 30 brasileiras),
obtiveram-se quatro haplótipos distintos: VS, VP, LS e LP. Do total de 134 amostras,
96 (71,6%) possuíam VS; 25 (18,6%), VP; 10 (7,5%), LS e 3 (2,3%), LP. Das
amostras nigerianas, 69 (67%) eram VS; 23 (22,3%) eram VP; 9 (8,7%) eram LS e 3
(2,0%) eram LP. Das 30 amostras brasileiras, 27 (90%) possuíam o haplótipo VP;
duas (6,6%) o VS e uma (3,4%), o LS. O haplótipo LP não foi observado em
amostras brasileiras (Tabela 17)
66
Tabela 17: Haplótipos do G47 em amostras da Nigéria e do Brasil
241 263 Nigéria Brasil Total
V S 69 (67%) 27 (90%) 96
V P 23 (22,3%) 2 (6,6%) 25
L S 9 (8,7%) 1 (3,4%) 10
L P 3 (2,0%) 0 (0%) 3
104 30 134
Total
Origem
Códon
6.3.5 Gene G2
No gene G2 foi observada a mutação A437S. A partir da sequencia de 139
amostras, obteve-se 119 (85,6%) selvagens e 20 (14,4%) mutantes. Das 100
nigerianas, 97 (97%) eram selvagens e 3 (3%), mutantes. Das 39 brasileiras, 21
(53,8%) eram selvagens e 18 (46,2%), mutantes (tabela 18).
Tabela 18: Frequencia da mutação S437A do G2 no Brasil e na Nigéria
Códon
437 Nigéria Brasil Total
S 97 (97%) 21 (53,8%) 119
A
3 (3%) 18 (46,2%) 20
Total 100 39 139
Origem
67
6.4 ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS AMOSTRAS
A partir das amostras que apresentaram sequencia para os cinco genes,
criou-se um alinhamento dos haplótipos seguido da construção de uma árvore
filogenética, utilizando-se o critério UPGMA do programa científico CLC Main
Workbench 5.02. (Figura 19). Na base de cada ramo está representado o haplótipo
dos cinco genes. O primeiro nucleotídeo (Y ou N) corresponde ao gene pfmdr1 e os
quatro nucleotídeos seguintes correspondem ao gene pfcrt (CMNT, SMNT, CMNK e
CIET). Logo após o gene pfcrt, encontra-se o gene G7 representado por três ou
quatro Asparaginas seguidas (NNN ou NNNN). Em seguida, encontra-se o perfil
genético do gene G47 (VS, VP, LS ou LP) e, por fim, o gene G2 representado por A
ou S.
68
Figura 19: Árvore filogenética das amostras com seqüencia dos cinco genes. BRA =
Brasil; NIG = Nigéria. O haplótipo está representado ao lado de cada ramo.
69
A árvore filogenética dividiu-se em basicamente dois ramos. O primeiro
contendo amostras com o perfil polimórfico CIET do codon 72-76 do gene pfcrt,
variando entre os outros genes (Figura 20).
Figura 20: Ramo superior da árvore filogenética contendo os haplótipos obtidos da
seqüencia dos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e G2. Estes haplótipos foram organizados do
seguinte modo: o primeiro aminoácido N ou Y corresponde ao gene pfmdr1; os quatro
aminoácidos seguintes (CIET) correspondem ao haplótipo do gene pfcrt. Em seguida
encontra-se a inserção da N no gene G7 (NNN ou NNNN), os haplótipos do gene G47
(VS,VP, LS ou LP) e, por fim, os aminoácidos A ou S do gene G2.
Todas as amostras deste ramo possuem o haplótipo CIET do pfcrt. As amostras foram
subdivididas em três ramos menores, em que o primeiro e o segundo se diferenciam,
principalmente, devido à mutação no gene pfmdr1. O primeiro contém amostras selvagens
(N86) e o segundo as amostras mutantes (N86Y). Na terceira subdivisão do ramo, as
amostras foram segmentadas de acordo com a mutação V241L do gene G47. O ramo
contém amostras nigerianas e uma brasileira (89BRA) BRA = Brasil; NIG = Nigéria.
70
As amostras do segundo ramo foram segmentadas em duas, uma contendo
SMNT/CMNK, também do gene pcrt, e a outra, CMNT. As brasileiras, por
apresentarem pouca variação genética nos cinco genes, ficaram concentradas
próximas umas às outras, com exceção da amostra 89BRA que, ao contrário das
demais, possuía perfil CVIET nos codons 72-74 do gene pfcrt, e ficou localizada no
primeiro ramo. A maioria das amostras provenientes do Brasil apresentou o
haplótipo NSMNTNNNVSS. As outras amostras se diferenciaram, apenas, pelas
mutações nos genes G2, G7 e G47. As amostras nigerianas se distribuíram ao
longo de toda a árvore por apresentarem grande variação genética (Figura 21).
71
Figura 21: Ramo inferior da árvore filogenética contendo os haplótipos obtidos da
sequencia dos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e G2. Estes haplótipos foram
organizados do seguinte modo: o primeiro aminoácido N ou Y corresponde ao gene
pfmdr1; os quatro aminoácidos seguintes (CIET) correspondem ao haplótipo do
gene pfcrt. Em seguida encontra-se a inserção da N no gene G7 (NNN ou NNNN),
os haplótipos do gene G47 (VS,VP, LS ou LP) e por fim os aminoácidos A ou S do
gene G2.
As amostras foram subdivididas em três ramos menores. O primeiro contém
amostras com o haplótipo CMNK e CMNT do gene pcrt. O segundo contém o
haplótipo SMNT do gene pfcrt e o terceiro apenas as amostras que contêm o
haplótipo. O ramo contém amostras nigerianas e brasileiras. As provenientes do
Brasil se encontram agrupadas em sub-ramos muito próximos uns aos outros. BRA
= Brasil; NIG = Nigéria.
72
6.5 CORRELAÇÃO ENTRE OS POLIMORFIMOS E OS VALORES DE IC
50
IN
VITRO
6.5.1 Correlação entre a atividade in vitro da CQ e os polimorfismos
Os polimorfismos observados nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e G2 foram
associados aos níveis de IC
50
das amostras (Figura 22). No gráfico obtido desta
associação, cada amostra foi representada por um losango azul e distribuída de
acordo com seu IC
50,
e as mutações foram representadas por quadrados, triângulos
e círculos de cores diferentes. Apenas as mutações foram representadas no gráfico.
A linha vermelha representa o limiar de resistência.
As duas amostras com os menores valores de IC
50
- 6,56 nM e 12,10 nM,
respectivamente - são as únicas que não contêm mutação em nenhum dos genes
analisados no estudo. As com IC
50
acima destes valores contêm, no mínimo, uma
mutação. A prevalência das mutações em amostras resistentes é 1,85 vezes maior
do que a prevalência de mutações em amostras sensíveis (OR = 1,85; IC95% = 1,15
– 2,97; p = 0,01).
73
Figura 22: Gráfico de IC
50
para CQ das amostras brasileiras e nigerianas e as
mutações observadas nos genes G2, G47, G7, Pfcrt e Pfmdr1
74
A tabela 19 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade da amostra à CQ. Não
foi possível estabelecer uma correlação significativa entre a presença das mutações
N86Y (pfmdr1), 834N&1 (G7), V241L (G47) e S263P (G47) e S347A (G2) e o
fenótipo de resistência ao antimalárico CQ (valores de p na tabela 19). No entanto, a
presença da mutação K76T do gene pfcrt e S347A do gene G2 apresentou
associação com a resistência à CQ. (p= <0,0001 e p=0,005, respectivamente).
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 32 71.1% 33 67.3% 0.8
86Y 13 28.9% 16 32.7%
pfcrt K76 13 31.0% 0 0.0%
< 0,0001
76T 29 69.0% 41 100.0%
G7 N834 23 59.0% 21 67.7% 0.5
834N&1 16 41.0% 10 32.3%
G47 V241 42 89.4% 30 90.9% 1
241L 5 10.6% 3 9.1%
S263 40 83.3% 24 72.7% 0.2
263P 8 16.7% 9 27.3%
G2 S437 42 95.5% 28 71.8% 0.005
437A 2 4.5% 11 28.2%
Tabela 19: Resistência à CQ em função das mutações nos genes
Sensível
Resistente
Amostras
n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A fim de se avaliar a associação das mutações com o fenótipo da
susceptibilidade in vitro de cada país em separado, as amostras foram divididas de
acordo com a sua origem. As brasileiras tiveram baixa variabilidade genética e
pequeno número amostral, portanto não foi possível obter uma associação
significante entre as mutações e o fenótipo de resistência. No entanto, essa
associação foi possível nas amostras provenientes da Nigéria (Figura 23).
75
Figura 23: Gráfico de IC
50
para CQ das amostras nigerianas e as
mutações observadas nos genes G2, G47, G7, Pfcrt e Pfmdr1
76
A prevalência de mutações nas amostras resistentes foi 2,36 vezes maior do
que a prevalência de mutações nas amostras sensíveis (OR = 2,36; IC95% = 1,32 –
4,21; p = 0,0036).
A tabela 20 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade à droga em amostras
nigerianas. Não foi possível estabelecer uma correlação significante entre a as
mutações N834&1 (G7), V241L (G47), e S347 (G2) e o fenótipo de resistência à CQ
(valores de p na tabela 20). No entanto, as mutações N86Y do gene pfmdr1, K76T
do gene pfcrt e S263P do gene G47 tiveram uma associação estatisticamente
significante (p=0,005, p=0,02 e p=0,003, respectivamente) com a resistência à CQ.
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 32 66.7% 3 21.4% 0.005
86Y 16 33.3% 11 78.6%
pfcrt K76 0 0.0% 13 33.3% 0.02
76T 13 100.0% 26 66.7%
G7 N834 16 42.1% 9 69.2% 0.12
834N&1 22 57.9% 4 30.8%
G47 V241 41 89.1% 12 85.7% 0.6
241L 5 10.9% 2 14.3%
S263 39 84.8% 6 42.9% 0.003
263P 7 15.2% 8 57.1%
G2 S437 41 95.3% 12 100.0% 1
437A 2 4.7% 0 0.0%
Tabela 20: Resistência à CQ em função das mutações nos genes em
Sensível
Resistente
amostras da Nigéria
Amostras
Legenda: n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A respeito das amostras brasileiras (figura 24), apenas uma apresentou
77
sensibilidade à CQ. A mutação N86Y não foi observada nas amostras. Todas as
amostras possuíam a mutação K76T.
Figura 24: Gráfico de IC
50
para CQ das amostras
brasileiras e as mutações observadas nos genes G2, G47,
G7, Pfcrt e Pfmdr1
78
6.5.2 Correlação entre a atividade in vitro da AQ e os polimorfismos
Os polimorfismos observados nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e G2 foram
associados aos níveis de IC
50
para AQ (Figura 22). Trinta e quatro amostras
apresentaram fenótipo de sensibilidade e 16, fenótipo de resistência à AQ.
A prevalência de mutações nas amostras resistentes foi 2,63 vezes maior do
que a prevalência de mutações nas amostras sensíveis (OR = 2,63; IC95% = 1,6 –
4,3; p = 0,0001).
79
Figura 25: Gráfico de IC
50
para AQ das amostras brasileiras e
nigerianas e as mutações observadas nos genes G2, G47,
G7, Pfcrt e Pfmdr1
80
As duas amostras com os menores valores de IC
50
- 1,35 e 1,37nM,
respectivamente – foram as que não apresentaram nenhuma mutação. Com
exceção da amostra de IC
50
de 2,30 nM (quarta amostra da esquerda para direita na
figura 26). Esta amostra contém duas bases localizadas na mesma posição (a
adenosina e a citosina) (figura 25).
Figura 26: Eletroferograma do seqüenciamento do gene pfcrt apresentando duas
bases na mesma posição. A. Amostra com apenas uma base na posição 76. B.
Amostra com as duas bases na mesma posição (adenosina e citosina).
A tabela 21 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade à AQ.
B
A
81
Não foi possível estabelecer uma correlação significante entre a presença das
mutações, V241L (G47), S263P (G47) e S347 (G2) e o fenótipo de resistência ao
antimalárico CQ (valores de p na tabela 21). No entanto, as mutações K76T do gene
pfcrt, N86Y do gene pfmdr1 e N834&1 do gene G7 apresentaram associação
significante com o fenótipo de resistência à AQ (p=0,0001; p=0,007; p=0,03,
respectivamente).
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 41 82.0% 8 33.3% 0.0001
86Y 9 18.0% 16 66.7%
pfcrt K76 13 25.5% 0 0.0% 0.007
76T 38 74.5% 22 100.0%
G7 N834 32 72.7% 9 42.9% 0.03
834N&1 12 27.3% 12 57.1%
G47 V241 31 88.6% 17 81.0% 0.22
241L 4 11.4% 4 19.0%
S263 42 84.0% 13 61.9% 0.06
263P 8 16.0% 8 38.1%
G2 S437 44 84.6% 19 86.4% 1
437A 8 15.4% 3 13.6%
Tabela 21: Resistência à AQ em função das mutações nos genes
Sensível
Resistente
Amostras
Legenda: n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A fim de se avaliar a associação das mutações com o fenótipo da
susceptibilidade in vitro de cada país, as amostras foram separadas de acordo com
a sua origem. As brasileiras tiveram baixa variabilidade genética e pequeno número
amostral, portanto não foi possível obter uma associação significante entre as
mutações e o fenótipo de resistência. No entanto, essa associação foi possível nas
82
amostras provenientes da Nigéria (figura 27).
No que tange às amostras nigerianas, a prevalência de mutações nas
amostras resistentes foi 2,86 vezes maior do que nas amostras sensíveis (OR =
2,86; IC95% = 1,67 – 4,89; p = 0,0001).
83
Figura 27: Gráfico de IC
50
para AQ das amostras nigerianas e
as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, Pfcrt e
Pfmdr1
84
A tabela 22 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade à AQ em amostras
provenientes da Nigéria. Pôde-se observar uma correlação significante entre a
presença das mutações N86Y do gene pfmdr1 e K76T do gene pfcrt com o fenótipo
de resistência à AQ (p=0,0001 e p=<0,0003, respectivamente) Essa correlação não
se apresentou significante nas mutações V241L (G47), S263P (G47) e S347 (G2).
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 29 76.3% 5 23.8% 0.0003
86Y 9 23.7% 16 76.2%
pfcrt K76 13 39.4% 0 0.0%
< 0,0001
76T 20 60.6% 19 100.0%
G7 N834 20 66.7% 8 40.0% 0.08
834N&1 10 33.3% 12 60.0%
G47 V241 36 92.3% 17 81.0% 0.22
241L 3 7.7% 4 19.0%
S263 32 82.1% 12 60.0% 0.11
263P 7 17.9% 8 40.0%
G2 S437 34 94.4% 19 100.0% 0.6
437A 2 5.6% 0 0.0%
Tabela 22: Resistência à AQ em função das mutações nos genes em
Sensível
Resistente
amostras da Nigéria
Amostras
Legenda: n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A respeito das amostras brasileiras, a mutação N86Y não foi observada nas
amostras. Todas as amostras possuíam a mutação K76T.
85
Figura 28: Gráfico de IC
50
para AQ das amostras brasileiras
e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, Pfcrt e
Pfmdr1
86
6.5.3 Correlação entre a atividade in vitro dos antimaláricos e os polimorfismos
pelo teste de Kruskal- Wallis
Para verificar se houve correlação entre as mutações nos genes e os perfis
de susceptibilidade in vitro, realizou-se o teste Kruskal-Wallis. Nesta análise, as
amostras não foram divididas de acordo com o seu fenótipo de susceptibilidade
(sensível ou resistente) e, sim, segundo o valor crescente de IC
50,
e foram também
analisadas conforme seu haplótipo. Já no gene pfcrt, por exemplo, não foi avaliada a
mutação K76T e, sim, seus haplótipos (CVIET, CVMNT, CVMNK E SVMNT). O
mesmo ocorreu com o gene G47 de haplótipos: VS, VP, LS e LP. Como o número
de observações é pequeno e não se pôde garantir a premissa da normalidade para
análise de variância, optou-se pelo teste não paramétrico (Kruskal-Wallis). Então,
inicialmente, os testes foram realizados, combinando-se os dados do Brasil e da
Nigéria, sendo em seguida realizada a análise específica de cada país.
Na análise, observou-se correlação de mutações nos genes pfcrt e G2 com
baixa susceptibilidade in vitro a CQ (p= <0,0001 e p=0,008, respectivamente),
quando analisadas amostras sem distinção de origem. Ao realizar-se tal distinção,
apenas os genes pfcrt e pfmdr1 apresentaram correlação com as amostras da
Nigéria (p=0,0002 e p=0,0022). Não foi possível realizar a correlação entre amostras
brasileiras devido à baixa variabilidade genética. Em relação à correlação da
susceptibilidade da AQ com os genes, observou-se p-valores menores que 0,005 em
relação aos genes pfcrt e pfmdr1 no número total de amostras ou quando analisadas
apenas as amostras nigerianas. O número total das amostras, também, apresentou
correlação entre a mutação no gene G7 e a AQ (p=0,003), fato não observado ao se
distinguir as origens das amostras (Tabela 23).
87
CQ AQ
Gene Total Nigéria Brasil Total Nigéria Brasil
pfmdr1 0.7 0.0002 ND < 0,0001 0.0002 ND
pfcrt <0,0001 0.0022 ND 0.0001 0.0007 ND
G7 0.9 0.1 0.7 0.03 0.1 0.3
G47 0.6 0.17 0.2 0.2 0.2 0.9
G2 0.008 0.9 0.2 0.6 0.8 0.9
Tabela 23: Teste de Kruskal-Wallis
Legenda: ND = Não determinado. Valores em p-valor
7 DISCUSSÃO
A resistência aos antimaláricos contribuiu para um aumento substancial na
mortalidade e morbidade da malária em diversos países no mundo (White, 1999a). A
CQ foi o antimalárico mais utilizado como primeira linha terapêutica nos últimos 40
anos, devido ao seu efeito contra as formas do P. falciparum e ao seu baixo custo e
toxicidade (Arya, 2002). Este medicamento é de fácil produção e sua estrutura
química estável permite o estoque e transporte mesmo em condições climáticas
extremas. O uso da CQ no Brasil foi abandonado na década de 80, mas na Nigéria,
foi utilizado no tratamento da malária por tempo superior ao Brasil, possivelmente
devido a seu baixo custo e aparecimento mais tardio da resistência em comparação
a outras regiões endêmicas no mundo (Ogungbamigbe et al., 2007). O preço deste
fármaco é o mais acessível, custando US$ 0,07 dólares por comprimido, enquanto
os outros antimaláricos podem custar entre $0,082 (SP) e $ 2,5 dólares (Coartem).
Em um país, onde 70% da população vive na pobreza, o preço de antimaláricos
mais efetivos é impraticável (Molyneux et al., 2005). No entanto, o governo da
Nigéria, através de fundos gerados pela OMS, passou a substituir gradativamente a
CQ pela combinação de artesunato- AQ ou arteméter-lumefantrina a partir de 2003
(WHO, 2005). A falha terapêutica à CQ na Nigéria foi documentada ocorrendo na
faixa de 31 a 39% da população, uma taxa muito superior à recomendada (10%)
pela OMS para a mudança na política de tratamento (Kabanywanyi et al., 2007;
Ojurongbe et al., 2007). O teste in vitro em nosso estudo demonstrou 25,4% de
resistência à CQ nos parasitos oriundos da Nigéria.
89
No Brasil, onde a CQ não é utilizada há mais de 15 anos para o tratamento da
malária por P. falciparum, nenhum parasito sensível à droga foi demonstrado em
estudos anteriores (Zalis et al., 1998; Cerutti Junior et al., 1999; Vieira et al., 2001;
Gonzalez et al., 2003; Vieira et al., 2004). O teste in vitro para esta droga, em
amostras brasileiras, demonstrou resistência in vitro em 97,5 % dos parasitas
analisados. Neste estudo, um parasito apresentou sensibilidade à CQ,
representando possivelmente um aumento da suscetibilidade a esta droga no país.
A média de IC
50
da CQ em isolados brasileiros foi cerca de nove vezes superior à
média de IC
50
dos isolados nigerianos. Como na América do Sul são encontrados
como principais agentes etiológicos P. vivax e P. falciparum, este resultado pode ser
interpretado pelo uso desta droga no tratamento da malária por P. vivax, exercendo
uma pressão constante em P. falciparum.
Recentemente tem-se observado um declínio da resistência e a consequente
reemergência de parasitos sensíveis à droga. No Malaui houve declínio da
resistência in vitro de 50% para 1%, após 12 anos sem o uso da CQ (Laufer et al.,
2006). Na China, a resistência in vitro dos parasitos era 97,9% em 1981 e decaiu
para 60,9% em 1991 (Liu et al., 1995). Este declínio da resistência e a consequente
emergência de parasitos sensíveis ocorre, possivelmente, pela perda da fitness
associada a várias mutações adquiridas pelas populações de parasitas durante a
pressão da droga. Estas mutações, por sua vez, ocasionam um custo biológico extra
no metabolismo do parasito, resultando em uma diminuição na geração de
descendentes. Com a remoção da pressão exercida pela CQ, mutações associadas
à resistência se tornaram uma desvantagem ao parasito e, devido à seleção natural,
a população de parasitos com códons selvagens passou a prevalecer
90
gradativamente sobre a população de parasitos mutantes (Hastings e Donnelly,
2005; Hayward et al., 2005; Walliker et al., 2005).
A identificação da associação do gene pfcrt com a resistência a CQ
representou um dos grandes avanços no conhecimento da resistência aos
antimaláricos (White, 2004). A substituição de uma Lisina (K) por uma Treonina (T)
no códon 76 (K76T) tem sido encontrada em todos os parasitos resistentes e
fortemente associada à resistência do parasito à CQ (Fidock et al., 2000; Anderson
et al., 2005). A prevalência desta mutação foi monitorada no Malaui após a
substituição da CQ por outros antimaláricos e observou-se um declínio da
prevalência da mutação de 85% em 1992 para 13% em 2000 (Kublin et al., 2003). O
mesmo ocorreu em outro estudo onde a prevalência da K76T que decaiu de 17% em
1998 para 2% em 2000 (Mita et al., 2003). Estes estudos sugeriram um decréscimo
de 5% na fitness do parasito causado pela mutação K76T. Abdel-Muhsin e cols.
(2003). acompanharam a frequência de alelos do gene pfcrt em uma coorte de
habitantes residentes de uma vila no Sudão durante as estações secas de 1999 e
2000, quando não havia transmissão de malária e o uso da CQ era muito limitado
(Abdel-Muhsin et al., 2003). No final de cada estação seca, puderam observar que
houve um declínio da prevalência da mutação K76T, sugerindo mais uma vez, a
desvantagem seletiva da mutação.
Ao contrário do que ocorreu no Malaui, onde a sensibilidade à CQ retornou
em 99% dos pacientes tratados com a droga, o declínio da resistência pode ocorrer
de forma lenta ou gradual. Um decréscimo parcial da resistência à CQ foi observado
na China, Guiana Francesa e Camboja (Lim et al., 2003; Durrand et al., 2004; Wang
et al., 2005; Legrand et al., 2008). A manutenção de graus substanciais dessa
resistência em países não africanos, após a descontinuação do tratamento com CQ,
91
reflete no fato de que nem toda a pressão da droga foi removida dessas regiões. A
CQ permanece prescrita no tratamento da malária por P. vivax, responsável pela
maior frequência de casos em países como Brasil e Guiana Francesa (Legrand et
al., 2008). Portanto, nos países onde ainda ocorre o uso da CQ para o tratamento de
outras espécies de plasmódio, espera-se encontrar um declínio lento e gradual da
resistência.
Em diversas regiões, a redução da prevalência da mutação K76T não está
associada ao declínio da resistência e é possível encontrar a mutação em parasitos
sensíveis (Lim et al., 2003). No Camboja, embora a resposta in vitro à CQ esteja
associada com a mutação K76T, esta correlação não é perfeita, já que a mutação foi
constatada em 15 dos 17 isolados sensíveis à CQ (Durrand et al., 2004). Na Índia,
esta mutação foi detectada em todos os isolados obtidos de pacientes com
resistência in vivo à CQ, no entanto, sua presença foi confirmada em 96% dos
pacientes com sensibilidade in vivo ao fármaco (Vinayak et al., 2003). Em nosso
estudo, a mutação K76T esteve presente em 26 dos 39 isolados sensíveis e foi
fortemente associada à resistência a CQ nos parasitos provenientes de ambos os
países (p < 0,0001) e nos parasitos oriundos apenas da Nigéria (p = 0,02). Esta
associação da mutação K76T com a resistência à CQ já era esperada e é
amplamente descrita em diversos estudos. A prevalência da mutação em isolados
sensíveis foi descrita em um estudo de resistência in vivo na Nigéria. No Brasil não
havia sido reportado ainda nenhum isolado sensível.
Esta prevalência da mutação K76T em parasitos sensíveis, mesmo após a
ausência da pressão da CQ, pode ocorrer, devido a mutações compensatórias que
superam a perda da fitness do parasito (Walliker et al., 2005). Em um experimento
realizado por Rosario e cols.(1978) um inóculo contendo P. chabaudi resistentes e
92
sensíveis à CQ foi infectado em camundongos e após alguns ciclos, os mutantes
eram mais prevalentes do que os sensíveis. Mesmo quando o inóculo consistia de
90% de parasitos sensíveis e 10% de resistentes, os resistentes ainda prevaleciam
sobre os sensíveis (Rosario, 1978). Alguns parasitos resistentes a CQ (linhagens
FCB e Dd2), aparentemente, estão bem adaptados em cultivo apesar da ausência
da pressão da CQ, sugerindo a ação de mutações compensatórias ou adaptativas
que superam as mudanças deletérias dos genes associados à resistência (Walliker
et al., 2005). Estas mutações compensatórias parecem ocorrer tipicamente na
seleção da droga para minimizar o custo biológico da aquisição de uma mutação. A
seleção exercida pela CQ em P. falciparum pode ter conduzido a um conjunto de
alelos que modula o nível de resistência e estabiliza as funções biológicas básicas
da célula.
Essas mutações adicionais podem estar embutidas no gene que já sofreu
uma mutação de resistência ou na modificação de outras proteínas envolvidas em
funções biológicas semelhantes. Em um experimento realizado por Jiang e cols.
(2008) onde a expressão de diversos genes na presença e na ausência da pressão
da CQ foi analisada, verificou-se que a mutação K76T afetava indiretamente certas
funções normais envolvidas na invasão e no crescimento do parasito. Além do mais,
alguns transportadores como o PfVP2 estariam atuando na compensação dessa
perda fisiológica do parasita (Jiang et al., 2008).
Um exemplo prático da ação de uma mutação adaptativa na resistência à CQ
está representada no modelo proposto por Johnson e cols (2004) para o mecanismo
de ação do gene pfcrt. A lisina no códon 76 do gene pfcrt adiciona uma carga
positiva na membrana interna do vacúolo digestivo, bloqueando o efluxo da CQ
diprotonada. Na substituição da lisina por uma treonina, um aminoácido neutro, a
93
carga positiva no gene pfcrt é perdida, permitindo o efluxo da CQ do vacúolo
digestivo. Quando o gene pfcrt possui uma outra mutação, a S163R, além da
mutação K76T, observa-se o acúmulo da CQ, provavelmente porque a R (Arginina),
um aminoácido de carga positiva, restaura a perda desta carga perdida no vacúolo
digestivo e bloqueia o efluxo da CQ (Johnson et al., 2004). Em nosso estudo,
postulamos que, em um momento inicial, a mutação K76T pode causar uma perda
de fitness no parasito. No entanto, após a pressão de uma determinada droga, os
parasitos adquirem mutações compensatórias que minimizaram o custo biológico
causado por esta mutação inicial.
Em relação ao gene pfcrt, não há como prever se a presença da mutação
K76T em parasitos sensíveis no Brasil e na Nigéria ocorre devido à compensação da
fitness pela ação das mutações compensatórias. Ou se as populações parasitárias
na Nigéria estão em uma fase de transição onde os alelos selvagens do gene pfcrt
ainda estão competindo com os mutantes, e ainda não se sobrepuseram em
prevalência, visto que a pressão da CQ foi removida apenas recentemente. Apesar
da CQ não ser utilizada há mais de 15 anos na Venezuela e no Brasil, não foi
observada a re-emergência do alelo selvagem nestes países, possivelmente porque
não existem mais parasitos com estes alelos na região amazônica (Contreras et al.,
2002).
Além da mutação K76T, foram observados, nesse estudo, quatro haplótipos
distintos nos códons 72 a 76 do gene pfcrt. Nos isolados brasileiros, foram
constatados apenas dois haplótipos, SVMNT em maior prevalência (97,6%) e CVIET
em apenas um isolado (3,4%). O haplótipo CVIET, após ter sido originado no
sudeste asiático no final da década de 1950, disseminou-se até a África, entre 1970
e 1980, e possivelmente, foi trazido para a América do Sul nos últimos 20 anos.
94
Vieira e cols. (2004), após genotiparem os isolados brasileiros, verificaram
que CVIET não formava um agrupamento (cluster) com nenhum outro haplótipo
analisado no estudo, concluindo assim, a recente introdução deste alelo na
população da América do Sul (Vieira et al., 2004), o que provavelmente ocorreu
devido às frequentes migrações asiáticas e principalmente africanas ao Brasil. Entre
os isolados provenientes da Nigéria foram encontrados os haplótipos CVIET,
CVMNT e o haplótipo selvagem CVMNK, dos quais o haplótipo CVIET é mais
prevalente (69,5%) seguido de CVMNK (27,2%), e, por fim, de CVMNT (3,3%). Na
Nigéria seria possível a associação do declínio da resistência com o declínio da
prevalência da mutação K76T, porque o haplótipo selvagem é comum na região. Os
parasitos selvagens poderiam, por sua vez, competir com os mutantes devido ao
déficit de fitness presente neles. Já no Brasil, o haplótipo selvagem nunca foi
encontrado.
Outros transportadores, além do gene pfcrt, também apresentaram
associação com a resistência ou com o nível de suscetibilidade dos parasitos à CQ e
outras drogas antimaláricas (Mu et al., 2003). O gene pfmdr1, há algum tempo, foi
foco de interesse como um possível gene atuando na resistência à CQ. No entanto,
seu papel na resistência ao fármaco ainda não é claro. A associação da mutação
N86Y com a resistência é controversa: alguns experimentos realizados na Malásia,
Indonésia, Guiné-Bissau, Nigéria e África subsaariana demonstraram a presença da
mutação em isolados resistentes à CQ. Entretanto, estudos realizados na Uganda,
Laos, Camarões, África do Sul, Brasil e Peru não demonstraram a relevância desta
mutação na previsão da resposta in vivo à CQ. A análise de isolados africanos
demonstrou a alta prevalência da mutação N86Y no gene pfmdr1 e sua associação
positiva com a resistência à CQ (Adagu et al., 1995; Basco et al., 1995).
95
Em nosso estudo, todas as amostras brasileiras analisadas não apresentaram
a mutação N86Y, embora tal mutação tenha sido observada em 41,5% das amostras
nigerianas. Não houve associação significante entre a mutação e a resistência in
vitro quando analisadas as amostras provenientes do Brasil e da Nigéria. Contudo,
os isolados nigerianos apresentaram esta associação com a resposta in vitro à CQ
(p = 0,005). Esses dados são condizentes com os achados de Mu e cols. (2003) que
encontraram uma associação da resposta à CQ, apenas em isolados da Ásia e da
África, mas não das Américas. Quando analisadas amostras dos continentes juntos,
esta associação não foi significante, possivelmente porque nenhum isolado brasileiro
possui a mutação N86Y. Tal mutação também é ausente ou rara em isolados
provenientes de outros países da América do Sul.
Outros transportadores da superfamília ABC, além do gene pfmdr1, foram
associados aos elevados níveis de IC
50
da CQ e da QN (Mu et al., 2003; Anderson
et al., 2005). Recentemente, demonstrou-se que o gene G2, localizado no
cromossomo 1 de P. falciparum, tem um papel no efluxo da glutationa e dos
antimaláricos CQ e QN . Este gene contribui para a resposta do parasito a múltiplas
drogas, possivelmente por bombeá-las para fora do parasito (Raj et al., 2009). Duas
mutações presentes no gene foram associadas à resistência à CQ e à QN: a Y191H
e a S437A (Mu et al., 2003; Henry et al., 2008b). A freqüência destas mutações em
isolados africanos é muito baixa e, portanto, não há dados estatísticos de sua
importância no continente. Entretanto, a mutação Y191H foi associada à CQ em
isolados asiáticos e a mutação S437A em isolados sul americanos (Mu et al., 2003).
Nesse estudo, foi analisada apenas a mutação S437A. A sua prevalência em
isolados nigerianos mostrou-se baixa (3%) e, conseqüentemente, não houve
correlação com a resposta in vitro à CQ (p = 1). No entanto, quando analisadas
96
amostras de ambos os países, a mutação S437A apresentou associação à resposta
in vitro à droga no total de amostras. Esse estudo é o primeiro que associou esta
mutação em isolados de campo.
Mu e cols. (2003), os primeiros a descreverem o gene G2, utilizaram cepas de
laboratório e Anderson e cols. (2005). não encontraram a associação da mutação
em isolados da Tailândia (Mu et al., 2003; Anderson et al., 2005). A associação
aparentemente ocorre em apenas algumas regiões, possivelmente devido à política
diferenciada de antimaláricos prescritos pelos países. No Brasil, quando a CQ
perdeu sua eficácia, o esquema terapêutico foi modificado para a combinação da
QN com a doxiciclina (Legrand et al., 2008). Na África, a CQ permaneceu em uso
até recentemente, mesmo com altas taxas de falha terapêutica. Na Tailândia uma
vasta gama de antimaláricos foi utilizada no tratamento: MQ, SP, AQ e QN. O G2
está fortemente associado à resposta à QN, portanto a pressão deste antimalárico
no Brasil pode ter selecionado a mutação, causando não apenas uma maior
prevalência em isolados brasileiros (46,2%), como também a sua associação com a
resposta aos antimaláricos QN e CQ.
A mutação S263P do gene G47 também apresentou correlação com a
resposta à CQ. O gene G47, assim como o gene G2, é um transportador da
superfamília ABC, e está localizado no cromossomo 5 e sua mutação V241L foi
associada à resposta à CQ por Mu e cols. (2003). Esta mutação não apresentou
correlação com a resposta in vitro à CQ em nosso estudo. Sua prevalência mostrou-
se baixa entre as amostras: 11,5% na Nigéria e 3,3% no Brasil. Entretanto, foi
observada uma nova mutação, nunca antes descrita, no códon 263 deste gene:
S263P. A prevalência da S263P é maior do que da V241L. Entre as amostras
nigerianas, esta mutação foi observada em 26 isolados (25%) e no Brasil apenas em
97
dois (6,6%). Sua associação com a resistência à CQ mostrou-se significante (p =
0,003) em isolados provenientes da Nigéria. O transportador G7 não apresentou
correlação com resposta in vitro à CQ nos isolados provenientes do Brasil e da
Nigéria.
Recentemente, a Nigéria modificou sua política de tratamento de P.
falciparum para a combinação de artesunato e AQ ou arteméter e lumefantrina. O
artesunato e o arteméter são compostos derivados da artemisinina e agem como
esquizonticidas rápidos, podendo também eliminar os gametócitos bloqueando a
transmissão da malária (Happi et al., 2006b; WHO, 2006). Estes compostos não
foram utilizados anteriormente no tratamento na Nigéria, mas a AQ era prescrita no
caso de falha terapêutica em pacientes tratados com CQ. Apesar disso, vem-se
constatando uma elevação da falha terapêutica à AQ (White, 2008b). Em 2001,
apenas 4,8% dos pacientes não respondiam ao tratamento com AQ; em 2005, a
falha terapêutica elevou-se para 13% entre os pacientes (Ogungbamigbe et al.,
2007; Ogungbamigbe et al., 2008).. Em outros países da África como Burkina Faso e
São Tomé do Príncipe, a resistência in vivo à AQ é de 9 e 10%, respectivamente
(Zongo et al., 2005).
Infelizmente, não é possível estabelecer associação entre os resultados dos
testes in vitro com os in vivo da AQ, como ocorre com a CQ. Em um estudo onde a
resistência in vitro à AQ era de 5,4%, a equivalente in vivo mostrou-se 40,5%
resistente (Aubouy et al., 2004).
Brasseur e cols. (2005) demonstraram que a resistência in vivo era duas
vezes superior à resistência in vitro (Brasseur et al., 1995).. Em contraste, Basco e
cols. (2001) encontraram taxas de falhas terapêuticas menores do que as
resistências do teste in vitro (Basco, 1991). Essa falta de associação entre as
98
respostas in vitro e in vivo pode estar relacionada com o limiar de sensibilidade à
AQ, que não é bem estabelecido, podendo variar de 15, 30 a 60 nM (Childs et al.,
1989). Recentemente, Pradines e cols. (2006) realizaram um estudo onde sugerem
um limiar de sensibilidade de 30 nM, já que foi observada uma maior correlação
entre os marcadores moleculares e a AQ quando o limiar era estabelecido neste
valor (Pradines et al., 2001; Pradines et al., 2006).. Seguindo o trabalho de Pradines
e cols. (2006) utilizamos o limiar de sensibilidade de 30 nM para o teste in vitro para
AQ e constatamos 33,9% e 15% de isolados resistentes na Nigéria e no Brasil
respectivamente. A média de IC
50
na Nigéria apresentou-se 2,2 vezes superior à
média de IC
50
de isolados brasileiros, o que não é de surpreender porque a AQ foi
utilizada no tratamento da malária por P. falciparum na Nigéria, e nunca no Brasil
como primeira linha terapêutica.
A presença de isolados resistentes no Brasil, onde nunca houve o uso da AQ
e a alta incidência de isolados resistentes à AQ na Nigéria pode ser explicada pela
resistência cruzada constatada entre a AQ e a CQ. A resistência cruzada é um
fenômeno onde microorganismos resistentes a certas drogas também apresentam
resistência a outras drogas que possuem os mecanismos de ação e mecanismos
moleculares semelhantes (Ochong et al., 2003). Essa correlação existe
principalmente em agentes com estruturas químicas similares e que tenham os
mesmos sítios de ligação. A resistência cruzada entre CQ e AQ pode ocorrer,
porque ambas fazem parte da mesma classe, as 4-aminoquinoleínas, e diferem
entre si apenas por um anel aromático p-hidroxianilino, presente na cadeia da AQ
(Ringwald et al., 1998). A AQ inibe competitivamente o acúmulo da CQ e vice versa,
sugerindo mecanismos de acúmulo similares entre as drogas. Como a CQ, a AQ é
uma base fraca e, portanto, acumula-se no vacúolo digestivo, devido à captura
99
iônica, e é também capaz de se ligar ao heme e, assim, atuar na inibição da
formação da hemozoína (Hawley et al., 1996).
Uma correlação positiva entre os IC
50
s de dois antimaláricos sugere o
fenômeno de resistência cruzada in vitro (Dow et al., 2004). No entanto, a relação
entre resistência in vitro e in vivo irá depender do nível de resistência e do
coeficiente de correlação (r
2
) (Pradines et al., 2006). Para que dois compostos
estejam envolvidos no mesmo mecanismo de ação que poderia assim induzir
resistência cruzada entre eles, o r
2
deve ser maior do que 0,5 (Ochong et al., 2003).
Nesse estudo, foi observada uma correlação positiva fraca entre os antimaláricos
AQ e CQ em amostras analisadas dos dois países (r
2
= 0,21), ou mesmo quando as
amostras brasileiras foram separadas deste total (r
2
= 0,22). Entretanto, a correlação
foi alta entre AQ e CQ em amostras provenientes apenas da Nigéria (r
2
= 0,77). A
maior correlação encontrada na Nigéria pode ser devido às diferentes políticas de
tratamento adotadas em cada país. A CQ não é utilizada no tratamento da malária
por P. falciparum há décadas, enquanto que, apenas recentemente, essa droga foi
retirada da Nigéria e ainda hoje é prescrita em algumas regiões do país (Happi et al.,
2006a). Portanto, a CQ permaneceu exercendo pressão exclusiva em P. falciparum
por muito mais tempo na Nigéria do que no Brasil. A AQ nunca foi utilizada no Brasil
para o tratamento de primeira linha e, no entanto, foi utilizada na Nigéria como
alternativa à resistência à CQ, exercendo também pressão nos parasitos e, logo,
podendo aumentar a correlação entre os dois antimaláricos na Nigéria. Contudo, a
resistência cruzada explica por que, apesar da AQ nunca ter sido usada no Brasil,
foram observados 15% de parasitos resistentes à droga no país.
Outra correlação positiva significante entre os IC
50
s foi observada entre AQ e
MQ (r
2
= 0,51 e p = < 0,001) em isolados brasileiros. Não é possível prever se esta
100
correlação entre os IC
50
s é indicativa de mecanismos de ação semelhantes ou de
resistência cruzada. A MQ é uma quinoleína pertencente à classe da 8-
aminoquinolinas (Karle e Karle, 1991). Sua estrutura se difere da AQ e da CQ, já
que possui um núcleo quinolínico aclopado a uma cadeia amino-alcool. A estrutura
da MQ é mais similar à QN do que às 4-aminoquinoleínas (Carroll et al., 1976).
Tanto a MQ quanto a QN inibem competitivamente o acúmulo da CQ e da AQ,
sugerindo mecanismos similares de acúmulo no parasito e são bases muito mais
fracas do que a AQ, tornando-se monoprotonadas, ao invés de diprotonadas no
vacúolo digestivo (Evans e Havlik, 1996). Altas concentrações da MQ no vacúolo
digestivo são capazes de bloquear a polimerização do grupo heme em hemozoína
(Zhang et al., 1999).
Estudos, avaliando a ultra-estrutura do parasito, demonstram alterações
morfológicas no vacúolo digestivo, após o tratamento com MQ, muito similares aos
da AQ e da CQ (Saxena et al., 1989). A MQ também forma ligações com o heme, no
entanto, esta ligação e seu acúmulo no vacúolo digestivo é menor do que o da CQ.
Apesar disto, a MQ é um inibidor mais potente do que a CQ e a AQ em parasitos
sensíveis, indicando a ação de outros transportadores que não os mesmos que a
CQ (Begum et al., 2002). Muitos estudos indicam a ação da proteína transportadora
Pgh-1 na resposta do parasito à MQ (Ruetz et al., 1996; Duraisingh e Cowman,
2005; Rohrbach et al., 2006). A correlação positiva da MQ e da AQ pode ter ocorrido
porque ambos antimaláricos têm o gene pfmdr1 como mesmo alvo. Não há relatos
desta associação em outros estudos.
A mutação N86Y no gene pfmdr1 foi associada à resposta à AQ em
Madagascar, Burkina Faso, África Oriental e Tanzânia (Best Plummer et al., 2004;
Happi et al., 2006a; Jalousian et al., 2008). A mesma correlação não foi significativa
101
na Colômbia, Sudão e Quênia. Em nosso estudo houve uma correlação significativa
entre a mutação e a resposta in vitro à AQ (p=0,0001) (Legrand et al., 2008;
Rungsihirunrat et al., 2009).
Além do gene pfmdr1, o gene pfcrt também apresentou correlação com a
resistência à AQ (p = 0,007). O fato da resposta à AQ estar associada à mutação
K76T reitera a possibilidade da resistência cruzada com a CQ por possuírem os
mesmos alvos e mecanismos de ação. A mutação no gene G7 também foi
associada à resposta à AQ (p = 0,03). Este gene está localizado no cromossomo 13,
é um transportador da família ABC e possui uma inserção de uma N no códon 834
do gene. O gene G7 foi associado à resistência à CQ por Mu e cols. (2003) e ao
Artesunato por Anderson e cols (2005). Entretanto, sua associação com a AQ nunca
foi descrita anteriormente.
Em nosso estudo, não foi possível associar as mutações com as respostas in
vitro em isolados brasileiros, devido ao baixo número amostral e porque tais isolados
apresentaram baixa variabilidade genética. A mutação N86Y do gene pfmdr1 não é
encontrada em isolados brasileiros e é muito rara em alguns países da América do
Sul. O alelo selvagem do gene pfcrt também é ausente no Brasil. As mutações no
gene G47, apesar de presentes nos isolados brasileiros, têm baixa prevalência no
país: 3,3% de V241L e 6,6% de S263P. A mutação 834N&1 no gene G7 e a
mutação S437A no gene G2 foram mais prevalentes, porém, o baixo número
amostral de amostras brasileiras não possibilitou uma análise estatística significante.
A baixa variabilidade genética nas amostras brasileiras já foi descrita
anteriormente através de antígenos polimórficos e de microsatélites (Wootton et al.,
2002; Su et al., 2007; Winzeler, 2008).. A genotipagem por micrisatélites de
parasitas da África e do Sudeste Asiático demonstraram uma grande diversidade
102
populacional devido a transmissão intensa, favorecendo a recombinação genética.
Já na América do Sul a diversidade mostrou-se menor, porque a transmissão é bem
mais baixa que na África, tornando-se assim uma infecção quase clonal (Wootton et
al., 2002)..
Na Nigéria, a espécie P. falciparum é responsável por 90% dos 3 milhões de
casos de malária. No Brasil, esta espécie é responsável por 19,3% de 460 mil casos,
significando que na Nigéria há 30 vezes mais casos do que no Brasil e, portanto,
uma transmissão muito mais intensa (WHO, 2008)..
Outro fator atuante na variabilidade genética além da taxa de transmissão é a
pressão seletiva da droga, capaz de reduzir a variabilidade dos nucleotídeos
próximos à região do genoma onde ocorreu a mutação de resistência (Wootton et
al., 2002). Esse fenômeno denominado de “selective sweeps” ou Varredura Seletiva
ocorre quando uma nova mutação favorece o parasito (resistência a uma droga) em
relação a outros da população (Wootton et al., 2002). Uma forte seleção pode
resultar em uma região no genoma onde os haplótipos são positivamente
selecionados e passam a ser os únicos encontrados em uma população, reduzindo,
portando, a variabilidade genética naquela região do cromossomo (Su et al., 2007).
Esse fenômeno ocorreu provavelmente através da pressão seletiva da CQ no gene
pfcrt. Foi constatado que os parasitos sensíveis com o haplótipo CVMNK possuem
uma variabilidade genética muito superior aos parasitos resistentes. No Brasil, além
da baixa transmissão que confere menor variabilidade genética ao parasito, ainda
houve a pressão intensa da CQ, causando assim uma variabilidade muito inferior
àquela encontrada na África e, ainda, a baixa variabilidade genética inicial em
conjunto com a intensa pressão da droga pode ter eliminado os parasitos com
haplótipo de sensibilidade à droga do país (Wootton et al., 2002).
103
O teste in vitro para Quinina demonstrou 100% de sensibilidade dos parasitos
provenientes do Brasil. Zalis e cols. (1998) demonstraram que parasitas isolados de
uma região endêmica de malária, na Amazônia, apresentaram valores de IC
50
abaixo do limiar de sensibilidade, porém com uma redução na suscetibilidade dos
parasitos à esta droga (Zalis et al., 1998). Estudos anteriores já haviam reportado a
redução no tempo de eliminação do parasito no sangue. Em 1995, 10% das
infecções por P.falciparum não responderam ao tratamento com QN. Cerutti e cols.
(1999) encontraram 3,3% de parasitos resistentes à QN, indicando mais uma vez a
redução da sensibilidade dos parasitos a este antimalárico. Esta redução,
provavelmente, corresponde à evolução natural da resistência dos parasitos à QN,
devido à pressão do antimalárico utilizado extensivamente como primeira escolha no
tratamento da malária por P. falciparum (Cerutti et al., 1999).
O teste in vitro para Mefloquina, utilizada como segunda escolha terapêutica
até 2007, demonstrou a existência de 35% de parasitos resistentes ao antimalárico.
A resistência à MQ foi inicialmente descoberta na fronteira entre a Tailândia e o
Camboja na década de 80. O aparecimento da resistência, possivelmente, está
relacionado ao uso anterior da QN para o tratamento, por possuírem estruturas
químicas semelhantes. A MQ, como monoterapia, perdeu sua efetividade no
tratamento da malária na fronteira da Tailândia e do Camboja, embora ainda seja
eficaz em 75% dos tratamentos da malária por P. falciparum em regiões endêmicas,
próximas à fronteira (Cowman e Foote, 1990). No Brasil, o primeiro parasito
resistente in vitro a MQ foi descrito em 2001 por Calvosa e cols. (2001) e alguns
casos de falha terapêutica foram reportados na Região Amazônica. Porém, a
extensão da resistência na América do Sul ainda é muito menor se comparada à do
sudeste asiático. Possivelmente porque no Brasil a MQ foi utilizada como segunda
104
escolha no tratamento, enquanto que no sudeste asiático foi amplamente utilizada
por um longo período (Calvosa et al., 2001). Como é um composto de meia vida
longa e pode permanecer em concentrações sub-terapêuticas no plasma do
indivíduo, a emergência de parasitos resistentes somada à pressão seletiva intensa
da droga em concentrações sub-terapêuticas, causou uma disseminação da
resistência no sudeste asiático (Wellems et al., 1991). No Brasil, como não ocorre
essa pressão extensiva, a resistência se resume a apenas alguns focos. Na África a
falha terapêutica à MQ é muito rara, e apenas alguns isolados foram descritos com
baixa susceptibilidade à droga.
Muitas questões ainda permanecem desconhecidas em relação às mudanças
genotípicas e fenotípicas dos parasitos sob pressão das drogas. Em nosso estudo
verificamos que a média de IC
50
da CQ em isolados brasileiros é nove vezes
superior à média de IC
50
dos parasitos nigerianos. Isso pode ser explicado no Brasil
pela pressão da droga em uma população com homogeneidade nas mutações que
conferem baixa susceptibilidade à CQ. Quando essa população de baixa
variabilidade genética, porém com mutações que conferem resistência, são
submetidas à pressão seletiva da droga, toda uma população pode expressar um só
fenótipo in vitro com alto IC
50,
como é visto em nosso estudo com as amostras
brasileiras. As amostras africanas, por possuírem uma alta variabilidade genética
que expressa sensibilidade e resistência ao mesmo tempo, conferem uma
variabilidade no fenótipo in vitro para CQ. A média desses IC
50
s numa população
com fenótipos variados será sempre menor que um grupo homogêneo resistente.
Além do mais, a CQ utilizada no tratamento de outras espécies do plasmódio exerce
uma pressão constante sob uma população inteira de parasitos independente de
espécies.
105
Durante a última década, os progressos no conhecimento da base molecular
da resistência de P. falciparum a diversos antimaláricos têm sido bastante
significativos. A utilização de ferramentas moleculares no diagnóstico da resistência
ainda está em fase inicial. A identificação de novos marcadores moleculares é
importante para a detecção prévia da resistência, facilitando a implementação de
medidas preventivas adequadas. A compreensão dos mecanismos de resistência e
da biologia da quimiorresistência é, portanto, fundamental para uma ação efetiva no
controle da doença.
No caso da CQ, a mutação K76T no gene pfcrt era um marcador de
resistência que podia ser utilizado para prever a susceptibilidade do parasito à
droga. No entanto, essa correlação não é perfeita, porque a mutação também é
detectada em parasitos sensíveis, tanto em experimentos in vivo quanto in vitro.
Embora o gene pfcrt também esteja associado à resposta in vitro e in vivo à outros
antimaláricos, como AQ e QN, esta associação nem sempre é significante. O papel
do gene pfmdr1 na resistência à CQ ainda não é bem estabelecido e sua correlação
com a resistência varia de região para região. Alguns estudos associam a mutação
N86Y do gene pfmdr1 à resistência à AQ, outros não encontram tal associação.
Diversos outros marcadores foram associados à resposta in vitro aos antimaláricos,
no entanto, a associação destes com a resistência in vivo ainda é desconhecida.
Nesse estudo foi detectada a associação das mutações K76T do gene pfcrt, N86Y
do gene pfmdr1, S263P do gene G47 e S437A do gene G2 com a resposta à CQ e
as mutações K76T do gene pfcrt, N86Y do gene pfmdr1 e N834&1 do gene G7 à
resposta à AQ. No entanto não é possível prever se as novas mutações terão papel
de marcador molecular in vivo ou mesmo se estão associadas à resposta aos
antimaláricos em apenas algumas regiões. A resposta in vivo é muito mais complexa
106
do que a in vitro, pois não depende exclusivamente das características intrínsecas
do parasito, mas também de diversos fatores do hospedeiro, como sua imunidade e
a farmacocinética da droga.
A alteração da política de tratamento substituindo a monoterapia pela
combinação de antimaláricos é realmente importante na contenção da resistência,
porque reduz a probabilidade da emergência de parasitos resistentes a dois
fármacos de alvos distintos. Embora o esquema terapêutico mundial tenha sido
alterado recentemente, muitos compostos utilizados na combinação são
estruturalmente semelhantes aos já utilizados. A lumefantrina, utilizada na
combinação com o arteméter no Coartem, é estruturalmente semelhante à Quinina,
que por um longo período exerceu pressão nos parasitos brasileiros. Outros, como a
AQ e a MQ foram utilizados por um longo tempo em diversos países. A resistência
cruzada destes antimaláricos com a CQ e a crescente taxa de falha terapêutica
constatada pode ser alarmante porque, mesmo que utilizados em combinação com
outros antimaláricos, diversos parasitos já foram previamente selecionados pela
resistência.
Recentemente foi constatado um decréscimo na susceptibilidade dos
parasitos à Artemisinina e seus derivados. Mesmo com a probabilidade de
emergência da resistência, utilizando a combinação de medicamentos de alvos
distintos ser muito pequena, a probabilidade de surgir parasitos resistentes não é
nula. Sendo assim, o conhecimento prévio dos mecanismos de resistência e da
biologia da quimiorresistência, em conjunto com o constante monitoramento da
susceptibilidade dos parasitos, são fundamentais para contornar os possíveis
problemas do advento da resistência aos combinados.
8 CONCLUSÃO
O monitoramento da sensibilidade in vitro dos isolados de P. falciparum é
importante para o controle da disseminação da resistência do parasito aos
antimaláricos. Esse estudo demonstrou que a espécie P. falciparum ainda
permanece resistente à CQ no Brasil, embora tenha sido constatado um parasito
sensível à CQ, o que indica uma possível redução da resistência à droga em
isolados brasileiros. Já na Nigéria, observou-se a presença de 22,1% de parasitos
resistentes. Apesar da AQ nunca ter sido utilizada no tratamento da malária por P.
falciparum no Brasil, foi constatada 15% de resistência à droga em isolados
brasileiros, indicando uma possível resistência cruzada entre CQ e AQ (r
2
=0,22). Na
Nigéria, ocorreu o uso desse fármaco no caso de falha terapêutica à CQ. Foram,
portanto, observados 33,9% de parasitos resistentes à AQ. A alta taxa de resistência
a esse fármaco também pode ser explicada pela resistência cruzada (r
2
=0,77).
As mutações nos genes que codificam proteínas transportadoras estão
associadas à variação da susceptibilidade de diversos microorganismos às drogas.
Nesse estudo analisamos cinco genes associados ao transporte de moléculas
através da membrana do parasito. Os genes pfcrt e pfmdr1 já foram previamente
associados à susceptibilidade do parasito à CQ e outros fármacos como QN, MQ e
AQ. Nesse estudo constatamos que as mutações K76T no gene pfcrt e N86Y no
gene pfmdr1 estão associadas à susceptibilidade dos isolados à CQ e à AQ. Além
dessas, as mutações S263P no gene G47 e S241A no gene G2 foram associadas à
resistência à CQ e a mutação N843N&1 foi associada à resistência à AQ.
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ANEXOS
ANEXO 1: Carta de colaboração com a Prof. Elieth Mesquita (CEPEM)
126
127
ANEXO 2: Carta da aprovação do comitê de ética para as amostras da Nigéria
128
Anexo 3: Carta de coleboração com o Dr. Christian Happi, Nigéria
129
Anexo 4: Manuscrito do artigo
Título: ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN
VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM
Autores: Carolina Bustamante e Mariano Zalis
Resumo:
A malária é a doença parasitária de grande impacto na saúde pública,
causando aproximadamente 500 milhões de casos clínicos e um milhão de óbitos. O
surgimento de parasitos resistentes representa um grande desafio para o controle da
doença. Estudos sugerem que mutações pontuais, principalmente em proteínas
transportadoras, são responsáveis pela redução da sensibilidade do parasito aos
antimaláricos. Um estudo realizado por Mu e cols (2003) demonstrou que 11 genes
tiveram uma associação significativa com a susceptibilidade in vitro à CQ e à QN de
cepas de laboratório. Dois destes genes, pfcrt e pfmdr1 já foram bem caracterizados,
enquanto pouco se conhece sobre os outros nove. Nesse estudo associamos os
níveis de susceptibilidade in vitro de P. falciparum às mutações nos genes pfcrt,
pfmdr1, PfA0590w (G2), PfE0775c (G47) e Pf13-0271 (G7) de amostras coletadas
em Porto Velho, Rondônia, Brasil e em Ibadan, Nigéria. A avaliação da
susceptibilidade in vitro à Cloroquina, Mefloquina, Amodiaquina e Quinina foi
realizada pelo microteste e a análise das mutações por sequenciamento. Foi
demonstrada resistência à Cloroquina em 96,5% dos isolados brasileiros e em
22,1% dos isolados nigerianos e resistência à Amodiaquina em 15% dos isolados
brasileiros e 33,9% dos isolados nigerianos. As mutações K76T no gene pfcrt, N86Y
no gene pfmdr1, S263P no gene G47 e S241A no gene G2 foram associados à
resistência à Cloroquina. Enquanto que mutações K76T no gene pfcrt, N86Y no
130
gene pfmdr1 e N834N&1 no gene G7 foram associadas à resistência à
Amodiaquina. Além disso, foi observada resistência cruzada entre as drogas
Cloroquina e Amodiaquina e Amodiaquina e Mefloquina. Esse estudo demonstrou
um aumento da resistência à Amodiaquina no Brasil e na Nigéria, e uma redução na
susceptibilidade do parasito à Cloroquina no Brasil. Também ficou evidenciado que
mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 estão associadas à
susceptibilidade à Amodiaquina e à Cloroquina.
Introdução:
A malária é uma doença infecciosa grave, causada por um protozoário do
gênero Plasmodium e transmitido através do repasto sanguíneo do mosquito-fêmea,
gênero Anopheles (Cowman e Crabb, 2006). É considerada uma das doenças
reemergentes mais graves, provocando cerca de 250 milhões de casos clínicos e
um milhão de óbitos ao ano, em todo o mundo. Afeta principalmente crianças abaixo
de cinco anos e estima-se que haja o óbito de uma criança a cada 40 segundos na
África (Sachs e Malaney, 2002). A malária é um problema que, não só atinge a
saúde da população, como também, incide diretamente no caráter sócio-econômico
dos países. Em regiões endêmicas, a doença ocasiona ausência do trabalho e
escolas, gerando estagnação econômica (Sachs e Malaney, 2002; Lewison e
Srivastava, 2008).
Como não há vacina contra a malária, o controle da doença depende do uso
de antimaláricos e de medidas contra o vetor anofelino (Chatterjee et al., 2006). No
entanto, a emergência de parasitos resistentes à maior parte dos antimaláricos
disponíveis e mosquitos resistentes ao DDT (Dicloro-difenil-tricoloetano) tem se
revelado como o maior obstáculo na contenção da doença (Diallo et al., 1999).
Algumas drogas, como a cloroquina (CQ) e o Fansidar, não têm mais eficácia e
131
outras, como a mefloquina (MQ), amodiaquina (AQ) ou até mesmo a quinina (QN),
têm efeito reduzido sobre o parasito. Muito preocupante é o fato de que, em regiões
endêmicas, o parasito possa ser resistente a dois ou mais fármacos, fenômeno
conhecido como “resistência a multidrogas” (Wongsrichanalai et al., 2002).
O monitoramento de parasitas resistentes a determinado fármaco é um fator
determinante no controle da doença. Testes in vitro, onde o sangue do paciente
parasitado é exposto a concentrações precisas do composto, são utilizados para
determinar o grau de susceptibilidade do parasito à droga. Uma vez determinada
sua susceptibilidade, é possível monitorar o efeito do medicamento e assim
determinar a melhor escolha terapêutica para indivíduos de uma mesma região
(WHO, 2006).
O seqüenciamento completo do genoma do P. falciparum possibilitou a
busca por homologia de proteínas transportadoras que pudessem estar associadas
à resistência aos antimaláricos e à identificação de marcadores moleculares, os
quais permitem prever rapidamente a resposta dos parasitos às drogas (Wernsdorfer
e Noedl, 2003). Estudos de mapeamento genético e associação de mutações com o
perfil de susceptibilidade in vitro identificaram mutações nos genes pfcrt e pfmdr1,
que atuam nas respostas do parasito aos antimaláricos (Reed et al., 2000; Johnson
et al., 2004). O fenótipo de resistência pode estar associado a apenas a um gene
predominante, no qual há mutações críticas que elevam o IC
50
em testes in vitro - é
o caso do gene pfcrt. No entanto, também pode ocorrer a interação de outros genes
que contribuem para a escala variada de resposta in vitro, encontrada entre
amostras de plasmódio (Su e Wootton, 2004). A fim de verificar se outros
transportadores também poderiam estar associados ao fenótipo de resistência às
drogas, Su e cols. (dados não publicados) procuraram por essas proteínas no
132
genoma do plasmódio e identificaram 22 mutações em sete proteínas
transportadoras. Em seguida, foi realizado o teste in vitro para CQ e QN e observou-
se que quanto maior era o IC
50
, maior era a freqüência de mutações nesses
transportadores, havendo consideravelmente mais mutações em parasitos
resistentes do que em sensíveis. Em seguida, (Mu et al., 2003) identificaram nove
novos transportadores, além do gene pfcrt e do gene pfmdr1 com associação à
resposta in vitro à CQ e à QN. Verificou-se que essa associação variava de acordo
com a origem geográfica das amostras, sendo mais significativa em algumas regiões
do que em outras. O G2, por exemplo, teve associação significativa à resposta in
vitro à CQ na Ásia, mas não nas Américas; o G7 foi associado à resposta in vitro à
CQ na África, no entanto não houve esta associação nas Américas. As amostras
estudadas por Mu e cols. (2003) eram provenientes de cepas de laboratório, que
permaneceram sem a pressão seletiva da droga em cultivo. O número pequeno de
amostras geograficamente semelhantes dificulta o estudo da relação entre as
mutações genéticas e a resposta in vitro em cada região endêmica. Portanto é
necessário um estudo que, em lugar de cepas de laboratório, utilize isolados de
campo originários de regiões geograficamente distintas, que tiveram pressão
seletiva de antimaláricos diferentes.
Em nosso estudo as amostras foram selecionadas no Brasil e na Nigéria,
por serem países que tiveram escolhas terapêuticas distintas até 2007. Foram
selecionados os marcadores moleculares pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 para análise
de relação das mutações genéticas e da resposta in vitro, não apenas à CQ e à QN,
mas também à MQ e à AQ. A associação das mutações com a susceptibilidade in
vitro a essas duas últimas drogas não foi analisada em outros estudos. Como são
quinoleínas e, portanto, estruturalmente semelhantes, é possível obter-se uma
133
associação significativa entre as mutações e a resposta in vitro a essas drogas.
Nesse estudo, determinamos a presença das mutações K76T (pfcrt), N86Y (pfmdr1),
S437A (G2), N834N&1 (G7) e V241L e S263P (G47) em isolados de P. falciparum
provenientes do Brasil e da Nigéria e comparamos a freqüência das mutações com o
perfil de susceptibilidade in vitro dos antimaláricos CQ, AQ, MQ e QN.
Materiais e métodos:
Amostras
Esse é um estudo retrospectivo a partir de uma coleção de 150 amostras de
um banco de dados do Centro de Pesquisa de Patologias Tropicais –
CEPEM/IPEPATRO, em Porto Velho, Rondônia e do Laboratório de Pesquisa de
Malária da Universidade de Medicina do Ibadan, em Ibadan, Nigéria. As amostras do
CEPEM foram coletadas entre 2006 e meados de 2008, como parte de um banco de
dados do projeto “Interações Moleculares do Receptor da Célula Vermelha com
Ligantes do P. falciparum" (CEP n˚ 045/06), bem como, de outro projeto:
“Determinantes Moleculares da Resistência do P. falciparum a drogas antimaláricas”
(CEP n˚ 046/06). As amostras nigerianas foram coletadas entre 2006 e 2007 como
parte do projeto “Molecular determinants of drug response and resistance in P.
falciparum from Africa and South America” aprovado pelo UI/UCH Institutional
Review Committe da Universidade do Ibadan, na Nigéria. Foi analisado um total de
109 amostras nigerianas e 41 amostras brasileiras.
Teste in vitro
O teste in vitro dos parasitos provenientes do Brasil e da Nigéria foi realizado
pelo método de microteste com incorporação de hipoxantina tritiada (HXA), em
ambos os países, segundo o protocolo de (Desjardins et al., 1979). Os parasitos da
Nigéria foram testados, apenas, para os antimaláricos CQ e AQ, já que usualmente
134
não possuem QN e MQ para o teste in vitro enquanto que, os do Brasil tiveram o
teste in vitro realizado com os antimaláricos CQ, AQ, QN e MQ. Todos os fármacos
foram obtidos do Walter Reed Army Institute of Research, Washington, EUA. O teste
in vitro foi realizado diretamente após a coleta de sangue do paciente, sem
adaptação do parasito em cultivo.
A coleta de sangue do paciente se procedeu por punção venosa com tubo
vacuntainer contendo heparina. Em seguida o tubo vacuntainer foi centrifugado para
a separação do plasma das hemácias. O plasma foi retirado do tubo e o sangue
posteriormente lavado duas vezes com meio de cultivo RPMI 1640 (Roswell Park
Memorial Institute médium). Após a lavagem, os parasitos foram ressuspendidos em
meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato,
Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 0,5% de Albumax e também
sangue não parasitado do tipo O negativo para o ajuste da parasitemia para 1% e
hematócrito de 1,5%.
A diluição das drogas foi realizada de 1:4 em meio RPMI 1640 da Gibco,
adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina
e Gentamicina para a preparação da solução mãe. Após essa diluição, realizou-se a
preparação da solução estoque, em que se diluiu o filtrado em 1:10 com meio RPMI
1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes,
Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 10% de Albumax. Para MQ e AQ foi
realizada novamente uma diluição 1:10 com meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado
de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina,
Gentamicina e 10% de Albumax. A tabela com a concentração das drogas em cada
procedimento de diluição encontra-se e a seguir (tabela 3).
Os antimaláricos CQ e QN foram solubilizadas a 1mg/mL em água MilliQ a
135
fim de se preparar o filtrado. A MQ e a AQ foram solubilizados a uma 1mg/mL, em
Metanol (Metanol Absoluto, Biolab, BR). Após esse procedimento, foram preparadas
soluções estoques e diluições seriadas das drogas. A concentração final de cada
droga variou de 6,64 a 4845 nM para Cloroquina, de 9,49 a 6925 para Quinina, de
0,826 a 602,7 nM para Mefloquina e de 0,736 a 537 nM para Amodiaquina. Foram
adicionados 50 µL de cada antimalárico na placa e 200 µL de sangue do paciente
(parasitemia de 1% e hemotócrito de 1,5%), nos poços A a G. N poço H foi
adicionado apenas o sangue do paciente sem droga. As placas foram incubadas por
48 horas em microaerofilia a 37°C. A HXA foi utilizada para estimar o crescimento do
parasito. Para tanto, 50 µL de HXA foi adicionado 24 horas após o início do
experimento em cada poço.
Ao final de 48 horas, a placa foi congelada a – 20 °C para a lise celular. Após
a transferência dos parasitos para um filtro de fibra de vidro utilizando um coletor de
células, foi determinada a quantidade de HXA incorporada no parasito com o uso do
contador Liquid Cintilation Wallac Beta Plate 1205 (Perkin-Elmer).
A concentração inibitória de crescimento 50% (IC
50
) é uma medida de
efetividade do composto de inibir uma função biológica. A medida quantitativa indica
o quanto da droga é necessário para inibir o crescimento biológico do parasito pela
metade. Ou seja, o IC
50
corresponde à concentração que inibe 50 % do crescimento
do parasito e é determinado através da curva dose-resposta obtida do experimento
in vitro.
Os limiares in vitro de resistência aos antimaláricos que discriminam parasitos
sensíveis dos resistentes foram considerados de acordo com a literatura: 100 nM
(CQ), 30 nM (AQ), 500 nM (QN) e 30 nM (MQ).
136
Extração do DNA
O DNA plasmodial foi extraído, utilizando-se o método fenol-clorofórmio com
lise por saponina a 0,05% (Cox-Singh et al., 1995). Do papel de filtro, foi removido
um fragmento de, aproximadamente, 3mm, com a utilização de uma tesoura estéril.
O fragmento foi, em seguida, reduzido em tamanhos menores e adicionado a uma
solução de PBS 1x com 0,05% de Saponina, por 2 horas a 37°C. Retirou-se o
sobrenadante e adicionou-se o tampão de lise (40mM de Tris-HCl pH 8,0, 80mM de
EDTA, pH 8,0, SDS a 0,2%e 150 μL de Proteinase K), por 2 horas, a 37°C, para a
remoção das proteínas. Após a fragmentação e digestão das proteínas da amostra,
foi adicionado fenol-clorofórmio (Invitrogen) v/v na amostra, para a desnaturação das
proteínas restantes. Depois de sucessivas centrifugações para a remoção dos
resíduos, o sedimento restante foi ressuspedido em 50μL de H
2
O MiilliQ.
Análise de polimorfismos
A reação com a Taq polimerase Platinum (Invitrogen, BR) foi realizada para
um volume final de 50 μL foi adicionado Tampão 1x (20 mM Tris -HCL – pH 8,0, 0,1
mM de EDTA, 1 mM DTT, 50% (v/v) glycerol), 0,25Mm de dNTP (Invitrogen, BR) ,
1,5 mM de Cloreto de Magnésio, 50 pmol do oligonucleotídeo “forward” (específico
para cada gene), 50pmol do oligonucleoídeo “reverse” (específico para cada gene),
2,5 U de Taq polimerase e 3 μL de DNA da extração descrita acima, obtendo-se um
volume final de 25 μL. Para o segundo nested, foi utilizado o mesmo protocolo do
primeiro, alterando-se apenas o volume DNA, para 1 μL
O gene pfcrt foi sequenciado utilizando o protocolo previamente descrito por
Djimde e cols. (Djimde et al., 2003). Para tanto foram utilizados os iniciadores
137
CRTP1 (5’CCGTTAATAATAAATACACGCAG 3’) e CRTP2
(CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC 3’) na primeira amplificação e CRTD1
(TGTGCTCATGTGTTTAAACTT 3’) e CRTD2 (CAAAACTATAGTTACCAATTTTG 3’)
na segunda, com a intenção de se verificar o perfil polimórfico do lócus 72 ao 76 do
pfcrt. A ciclagem do termociclador foi de 95°C para desnaturação, por 3 minutos; 45
ciclos de 95°C, por 30 segundos; 56°C por 30 segundos e 60°C por 60 segundos e
temperatura final de extensão de 60°C por 5 minutos para o primeiro nested. A
segunda amplificação teve sua ciclagem de 95°C para desnaturação por 3 minutos,
30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 48°C por 30 segundos e 65°C por 60 segundos
e temperatura final de extensão de 65°C por 5 minutos
O gene pfmdr1 teve seu fragmento amplificado pelos iniciadores MDR1
(5’CGCGCGTTGAACAAAAAGAGTACCGCTG 3’) e MDR2
(GGGCCCTCGTACCAATTCCTGAACTCAC) para a primeira amplificação seguida
dos iniciadores MDR3 e MDR4. Essas regiões cobriam o lócus 86 do gene para a
observação do polimorfismo N86Y. As temperaturas do termociclador foram
ajustadas em 95°C por 5 minutos, 45 ciclos de 95°C por 30 segundos, 45°C por 30
segundos e 65°C por 45 segundos e finalmente extensão de 72°C por 5 minutos
para ambas as amplificações (Duah et al., 2007) .
O gene G2 foi amplificado com os oligonucleotídeos G2bFext (5'-
ATTTATAATATTATGTTTC-3') e G2bRext (5'-TTTCTTCTTTCTTATTTAATC-3') na
primeira amplificação e com os oligonucleotídeos G2bFin (5'-
CAATGATACTATTTGAATTT-3') e G2bRin (5'-CTTATTAATCTATCTTTTA-3') na
segunda amplificação, no intuito de se verificar a presença da mutação S437A (Mu
et al., 2003).
138
O gene G7 foi amplificado com os oligonucleotídeos G7Fex (5'-
GTAATGTGAAGAATATCTA-3') e G7Rex(5'-TTGAAGCTTGAATCATTTGTTTATC-
3') na primeira amplificação e G7Fin(5'-CAAATCCAAATATTACGAAAA-3')e
G7Rin(5'-AGTATCTTGTGGTACGACACTT-3') na segunda amplificação para a
observação da presença de uma inserção de Asparagina no locus 834 (834&1) (Mu
et al., 2003).
O gene G47 foi amplificado, utilizando-se na primeira amplificação os
oligonucleotídeos G47Fex(5'-GTATAGATATTAAAGATGCC'-3') e G47Rex(5'-
CATATTTTCAAATACACTCGCCAT-3') e na segunda, os oligonucleotídeos
G47Fin(5'-GATGCCAAAGAAAAAGAACG-3') e G47Rin(5'-
GACCAGAAGAATGAAATACATCCA-3') para a observação das mutações no locus
V241L e S263P (Mu et al., 2003).
Os ciclos térmicos foram semelhantes para os três genes (G2, G7 e G47),
sendo apenas alterada a temperatura de hibridização: 95°C por 5 minutos para
desnaturação, 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 49°C para G2, 50°C para G7 e
55°C para G47 por 30 segundos e 70°C por 30 segundos, finalizando com 70°C por
5 minutos de extensão.
As amostras foram sequenciadas, utilizando-se um sequenciador automático
ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer com o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing. Para a reação, foram utilizados 6μL de Tampão, 2μL de BigDye, 1μL de
iniciador “forward”, H20 MilliQ e 100ng de DNA para volume final de 20μL (kit BigDye
Terminator – Applied Biossystem, EUA). O produto, posteriormente, foi precipitado
com etanol e isopropanol (MLR, EUA) e diluído em formamida (Applied Biosystems,
EUA).
139
As sequências foram montadas pelo software Sequencing Analysis 3.7
(Applied Biosystems) e, por alinhamento, através do programa Mutation Surveyor
(Softgenetics, LLC.) e FinchTV (Geospiza).
Análise estatística
Foi criado um banco de dados em planilha Excel, contendo as mutações e os
valores de IC50. Os testes de média, os intervalos de confiança e os intervalos da
amostra foram calculados pelo suplemento xlstat (Microsoft). A análise filogenética
foi realizada a partir do programa CLC Workbench da CLCbio, utilizando o critério
UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean ) para a construção
da árvore filogenética. A correlação dos valores de IC50 entre os antimaláricos foi
medida através do coeficiente de determinação (r2) e a correlação entre os valores
de IC50 e as mutações foi calculada pelo teste de Kruskal-Wallis. A correlação entre
os antimaláricos foi calculada pelo exato de Fisher, utilizando tabelas 2x2. O cálculo
da prevalência foi realizado por odds ratio utilizando o programa MedCalc (Versão
10.3.2.0). A significância estatística foi determinada por p < 0,05.
Resultados:
Teste in vitro
O teste in vitro para CQ apresentou como resultado, valores de IC
50,
variando
de 6,56 nM a 1.400 nM, com média de 241,3 nM em 88 amostras provenientes de
ambos os países. Dessas amostras, 47 (53,4%) eram sensíveis e 41 (46,6%)
resistentes à droga. A média do IC
50
da CQ das amostras provenientes do Brasil foi
nove vezes maior do que a média do IC
50
das amostras nigerianas.
Das 59 amostras nigerianas, 46 (77,9%) eram sensíveis à CQ e 13 (22,1%),
140
apresentaram valores acima do limiar de sensibilidade (100 nM). As sensíveis
variaram de 6,56 a 99,67 nM com média de 48,3 nM. As resistentes tiveram variação
de 100,46 a 197,2 nM e média de 129,3 nM. Nas 29 amostras brasileiras, apenas 1
(3,5%) apresentou ser sensível à droga e 28 (96,5%) possuíam fenótipo de
resistência. A variação foi de 58,8 a 1.400 nM, com média de 597,6 nM e as
resistentes variaram de 113 a 1.400 nM, com média de 616,9 nM.
Os valores de IC
50
obtidos no teste in vitro para AQ variaram de 1,25 a 88,79
nM e tiveram média de 21,9 nM em 79 amostras analisadas. Dessas, 56 (70,9%)
eram sensíveis à droga e 23 (29,1%), mostraram-se resistentes. As amostras
sensíveis variaram de 1,25 a 29 nM, com média de 12,3 nM e as resistentes de
30,24 a 88,79 nM, com média de 45,4 nM. As amostras da Nigéria tiveram valores
de IC
50
de AQ 1,5 vezes maiores do que as amostras do Brasil.
Foram analisadas 59 (74,6%) amostras provenientes da Nigéria e 20
(35,4%), do Brasil. Trinta e nove (66,1%) amostras da Nigéria eram sensíveis à AQ e
20 (33,9%) eram resistentes. As sensíveis variaram de 1,25 a 27,87 nM, com média
de 12,5 nM e as resistentes de 30,24 a 88,79 nM, com média de 46,9 nM. Das 20
amostras provenientes do Brasil, 17 (85%) eram sensíveis e 3 (15%) eram
resistentes. As sensíveis variaram de 3,7 nM a 29 nM, com média de 11,8 nM e as
resistentes de 31,5 a 39,7 nM, com média de 34,9 nM.
As amostras provenientes do Brasil foram testadas in vitro para QN. Como
esse antimalárico não é usualmente utilizado nas placas de microteste na Nigéria,
não foram obtidos dados de IC
50
em amostras provenientes deste país. Os valores
de IC
50
variaram de 25,5 a 310 nM, com média de 130,5 nM nas amostras do Brasil.
Todas eram sensíveis.
As amostras brasileiras foram testadas in vitro para MQ. Este antimalárico,
141
assim como a QN, não é adicionado à placa de microteste na Nigéria, portanto as
amostras nigerianas não possuíam valores de IC
50
para MQ. Já nas amostras
brasileiras o IC
50
variou de 2,6 a 206 nM, com média de 39,9 nM. Treze (65%)
amostras apresentaram fenótipo de sensibilidade e 7 (35%) apresentaram fenótipo
de resistência. As amostras sensíveis variaram de 2,6 a 22,3 nM, com média de 11,
3nM e as resistentes, de 31 a 206 nM, com média de 92,6 nM.
Avaliação da resistência cruzada entre os antimaláricos
A correlação pareada das atividades in vitro da CQ, AQ, QN e MQ foi
analisada com o propósito de avaliar a resistência cruzada entre estes antimaláricos
(tabela 1). A estimativa dessa correlação foi determinada através do coeficiente de
correlação de Pearson (r) e do coeficiente de determinação (r
2
). A correlação foi
analisada em um total de amostras (n total) e nos países em separado (origem -
Nigéria ou Brasil)
Origem n r
r
2
p
Cloroquina Amodiaquina n total 79 0.46 0.21 <0,001
Cloroquina Quinina Brasil
20 0.28 0.078 0.23
Cloroquina Mefloquina Brasil 20 0.29 0.008 0.22
Amodiaquina Quinina Brasil 20 -0.18 0.003 0.44
Amodiaquina Mefloquina Brasil 20 0.71 0.51 <0,001
Quinina Mefloquina Brasil 20 0.002 <0,001 0.99
Cloroquina Amodiaquina Nigéria 59 0.88 0.77 <0,001
Cloroquina Amodiaquina
Brasil 20 0.47 0.22 0.036
Par de drogas
Tabela 1: Correlação das atividades in vitro da CQ, AQ, QN e MQ
n = número de amostras; r = coeficiente de correlação; r
2
= coeficiente de
determinação; p = p valor.
142
Uma correlação positiva significativa (p <0,05) foi obtida entre os
antimaláricos AQ e CQ e AQ e MQ. A AQ e a CQ apresentaram uma baixa
correlação (r
2
= 0,21) em amostras de ambos os países. Após a divisão dessas
amostras de acordo com suas origens, o coeficiente de determinação manteve-se
baixo (r
2
= 0,22) em amostras provenientes do Brasil. No entanto, o coeficiente de
determinação apresentou-se alto (r
2
= 0,77) em amostras da Nigéria. O coeficiente
de determinação entre AQ e MQ também foi alto (r
2
=0,51) nas amostras
provenientes do Brasil. Não houve observação de resistência cruzada entre os
antimaláricos CQ e QN, CQ e MQ, AQ e QN e QN e MQ.
Análise Genotípica
Gene pfcrt
O sequenciamento do pfcrt foi realizado para a observação dos haplótipos
nos códons 72-76. Obteve-se a seqüencia de 133 amostras que apresentaram
quatro haplótipos distintos: CVMNK, CVMNT, SVMNT e CVIET. O haplótipo CVIET
foi observado em 65 (48,9%) amostras, o haplótipo CVMNK foi observado em 25
(18,8%) amostras, CVMNT em três (2,2%) e SVMNT em 40 (63,1%) amostras. Das
133 amostras, 92 eram provenientes da Nigéria, onde somente os haplótipos
CVMNK, CVMNT e CVIET foram observados. As 41 amostras provenientes do Brasil
apresentaram os haplótipos SVMNT e CVIET. As proporções dos alelos de cada
país podem ser observadas na tabela 2.
143
Tabela 2: Haplótipos do pfcrt em amostras da Nigéria e do Brasil
Códon do pfcrt
72 73 74 75 76 Nigéria Brasil Total
C V M N K 25 (27,2%) 0 (0%) 65
C V M N T 3 (3,3%) 0 (0%) 40
C V I E T 64 (69,5%) 1 (2,4%) 25
S V M N T 0 (0%) 40 (97,6%) 3
41 92 133
Total
Origem
A mutação no códon 76 (K76T), associada previamente à resistência a CQ,
foi observada nas 41 (100%) amostras brasileiras e em 67 (72,8%) amostras
nigerianas (tabela 3). Vinte e cinco (27,2%) amostras nigerianas apresentaram o
códon selvagem (K76).
Tabela 3: Frequencia da mutação K76T do pfcrt no Brasil e na Nigéria
Códon
76 Nigéria Brasil Total
K 25 (27,2%) 0 (0%) 25
T 67 (72,8%) 41 (100%) 108
Total 92 41 133
Origem
Gene pfmdr1
O sequenciamento de 147 amostras resultou em 103 amostras contendo N e
44, Y no códon 86. Nenhuma amostra brasileira apresentou a mutação N86Y. Das
106 amostras nigerianas, 62 (58,5%) eram N86 e 44 (41,5%) 86Y. (Tabela 4).
144
Tabela 4: Frequencia da mutação N86Y do pfmdr1 no Brasil e na Nigéria
Códon
86 Nigéria Brasil Total
N 62 (58,5%) 41 (100%) 103
Y 44 (41,5%) 0 (0%) 44
Total 106 41 147
Origem
Gene G7
O gene G7 possui uma inserção de uma asparagina no codon 834 (834N&1)
associada à susceptibilidade das amostras aos antimaláricos CQ e QN (Mu et al.,
2003). O sequenciamento de 107 amostras resultou em 60 (56%) amostras
selvagens (N834) e 47 (44%) mutantes. Foram sequenciadas 78 amostras
nigerianas e 29 amostras brasileiras. Das amostras nigerianas, 37 (47,4%) eram
selvagens e 41 (52,6%), mutantes. Das 29 brasileiras, 23 (79,3%) eram selvagens e
6 (20,7%), mutantes (Tabela 5).
Tabela 5: Frequencia da mutação N834N&1 do G7 no Brasil e na Nigéria
Códon
834 Nigéria Brasil Total
N 37 (47,4%) 23(79,3%) 60
N&1 41(52,6%) 6(20,7%) 47
Total 78 29 107
Origem
145
Gene G47
No gene G47 foram encontradas duas mutações, V241L e S263P. A primeira
já havia sido descrita por Mu e cols. (2003) e associada à resistência à CQ e à QN,
principalmente em isolados asiáticos (Mu et al., 2003). Não foi encontrada nenhuma
referência na literatura sobre a mutação S263P, sendo esta observada pela primeira
vez neste estudo. A partir de 134 amostras (104 nigerianas e 30 brasileiras),
obtiveram-se quatro haplótipos distintos: VS, VP, LS e LP. Do total de 134 amostras,
96 (71,6%) possuíam VS; 25 (18,6%), VP; 10 (7,5%), LS e 3 (2,3%), LP. Das
amostras nigerianas, 69 (67%) eram VS; 23 (22,3%) eram VP; 9 (8,7%) eram LS e 3
(2,0%) eram LP. Das 30 amostras brasileiras, 27 (90%) possuíam o haplótipo VP;
duas (6,6%) o VS e uma (3,4%), o LS. O haplótipo LP não foi observado em
amostras brasileiras (Tabela 6)
Tabela 6: Haplótipos do G47 em amostras da Nigéria e do Brasil
241 263 Nigéria Brasil Total
V S 69 (67%) 27 (90%) 96
V P 23 (22,3%) 2 (6,6%) 25
L S 9 (8,7%) 1 (3,4%) 10
L P 3 (2,0%) 0 (0%) 3
104 30 134
Total
Origem
Códon
146
Gene G2
No gene G2 foi observada a mutação A437S. A partir da sequencia de 139
amostras, obteve-se 119 (85,6%) selvagens e 20 (14,4%) mutantes. Das 100
nigerianas, 97 (97%) eram selvagens e 3 (3%), mutantes. Das 39 brasileiras, 21
(53,8%) eram selvagens e 18 (46,2%), mutantes (tabela 7).
Tabela 7: Frequencia da mutação S437A do G2 no Brasil e na Nigéria
Códon
437 Nigéria Brasil Total
S 97 (97%) 21 (53,8%) 119
A 3 (3%) 18 (46,2%) 20
Total 100 39 139
Origem
Correlação entre os polimorfismos e os valores de IC
50
in vitro
Correlação entre a atividade in vitro da CQ e os polimorfismos
Os polimorfismos observados nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e G2 foram
associados aos níveis de IC50 das amostras. As duas amostras com os menores
valores de IC50 - 6,56 nM e 12,10 nM, respectivamente - foram as únicas que não
apresentaram mutação em nenhum dos genes analisados no estudo. As amostras
com IC50 acima destes valores contêm, no mínimo, uma mutação. A prevalência
das mutações em amostras resistentes é 1,85 vezes maior do que a prevalência de
mutações em amostras sensíveis (OR = 1,85; IC95% = 1,15 – 2,97; p = 0,01).
A tabela 8 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade da amostra à CQ. Não
foi possível estabelecer uma correlação significativa entre a presença das mutações
147
N86Y (pfmdr1), 834N&1 (G7), V241L (G47) e S263P (G47) e S347A (G2) e o
fenótipo de resistência ao antimalárico CQ. No entanto, a presença da mutação
K76T do gene pfcrt e S347A do gene G2 apresentou associação com a resistência à
CQ. (p= <0,0001 e p=0,005, respectivamente).
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 32 71.1% 33 67.3% 0.8
86Y 13 28.9% 16 32.7%
pfcrt K76 13 31.0% 0 0.0% < 0,0001
76T 29 69.0% 41 100.0%
G7 N834 23 59.0% 21 67.7% 0.5
834N&1 16 41.0% 10 32.3%
G47 V241 42 89.4% 30 90.9% 1
241L 5 10.6% 3 9.1%
S263 40 83.3% 24 72.7% 0.2
263P 8 16.7% 9 27.3%
G2 S437 42 95.5% 28 71.8% 0.005
437A 2 4.5% 11 28.2%
Tabela 8: Resistência à CQ em função das mutações nos genes
Sensível
Resistente
Amostras
n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A fim de se avaliar a associação das mutações com o fenótipo da
susceptibilidade in vitro de cada país em separado, as amostras foram divididas de
acordo com a sua origem. As brasileiras tiveram baixa variabilidade genética e
pequeno número amostral, portanto não foi possível obter uma associação
significante entre as mutações e o fenótipo de resistência. No entanto, essa
associação foi possível nas amostras provenientes da Nigéria.
148
A prevalência de mutações nas amostras resistentes foi 2,36 vezes maior do
que a prevalência de mutações nas amostras sensíveis (OR = 2,36; IC95% = 1,32 –
4,21; p = 0,0036).
A tabela 9 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade à droga em amostras
nigerianas. Não foi possível estabelecer uma correlação significante entre a as
mutações N834&1 (G7), V241L (G47), e S347 (G2) e o fenótipo de resistência à CQ
(valores de p na tabela 20). No entanto, as mutações N86Y do gene pfmdr1, K76T
do gene pfcrt e S263P do gene G47 tiveram uma associação estatisticamente
significante (p=0,005, p=0,02 e p=0,003, respectivamente) com a resistência à CQ.
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 32 66.7% 3 21.4% 0.005
86Y 16 33.3% 11 78.6%
pfcrt K76 0 0.0% 13 33.3% 0.02
76T 13 100.0% 26 66.7%
G7 N834 16 42.1% 9 69.2% 0.12
834N&1 22 57.9% 4 30.8%
G47 V241 41 89.1% 12 85.7% 0.6
241L 5 10.9% 2 14.3%
S263 39 84.8% 6 42.9% 0.003
263P 7 15.2% 8 57.1%
G2 S437 41 95.3% 12 100.0% 1
437A 2 4.7% 0 0.0%
Tabela 9: Resistência à CQ em função das mutações nos genes em
Sensível
Resistente
amostras da Nigéria
Amostras
Legenda: n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A respeito das amostras brasileiras, apenas uma apresentou sensibilidade à
149
CQ. A mutação N86Y não foi observada nas amostras. Todas as amostras
possuíam a mutação K76T.
Correlação entre a atividade in vitro da AQ e os polimorfismos
Os polimorfismos observados nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e G2 foram
associados aos níveis de IC
50
para AQ. Trinta e quatro amostras apresentaram
fenótipo de sensibilidade e 16, fenótipo de resistência à AQ.
A prevalência de mutações nas amostras resistentes foi 2,63 vezes maior do
que a prevalência de mutações nas amostras sensíveis (OR = 2,63; IC95% = 1,6 –
4,3; p = 0,0001). As duas amostras com os menores valores de IC
50
- 1,35 e 1,37nM,
respectivamente – foram as que não apresentaram nenhuma mutação. Com
exceção da amostra de IC
50
de 2,30 nM. Esta amostra contém duas bases
localizadas na mesma posição (a adenosina e a citosina).
A tabela 10 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade à AQ.
Não foi possível estabelecer uma correlação significante entre a presença das
mutações, V241L (G47), S263P (G47) e S347 (G2) e o fenótipo de resistência ao
antimalárico CQ (valores de p na tabela 21). No entanto, as mutações K76T do gene
pfcrt, N86Y do gene pfmdr1 e N834&1 do gene G7 apresentaram associação
significante com o fenótipo de resistência à AQ (p=0,0001; p=0,007; p=0,03,
respectivamente).
150
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 41 82.0% 8 33.3% 0.0001
86Y 9 18.0% 16 66.7%
pfcrt K76 13 25.5% 0 0.0% 0.007
76T 38 74.5% 22 100.0%
G7 N834 32 72.7% 9 42.9% 0.03
834N&1 12 27.3% 12 57.1%
G47 V241 31 88.6% 17 81.0% 0.22
241L 4 11.4% 4 19.0%
S263 42 84.0% 13 61.9% 0.06
263P 8 16.0% 8 38.1%
G2 S437 44 84.6% 19 86.4% 1
437A 8 15.4% 3 13.6%
Tabela 10: Resistência à AQ em função das mutações nos genes
Sensível
Resistente
Amostras
Legenda: n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A fim de se avaliar a associação das mutações com o fenótipo da
susceptibilidade in vitro de cada país, as amostras foram separadas de acordo com
a sua origem. As brasileiras tiveram baixa variabilidade genética e pequeno número
amostral, portanto não foi possível obter uma associação significante entre as
mutações e o fenótipo de resistência. No entanto, essa associação foi possível nas
amostras provenientes da Nigéria.
No que tange às amostras nigerianas, a prevalência de mutações nas
amostras resistentes foi 2,86 vezes maior do que nas amostras sensíveis (OR =
2,86; IC95% = 1,67 – 4,89; p = 0,0001).
A tabela 11 demonstra os polimorfismos nos genes pfcrt, pfmdr1, G7, G47 e
G2 agrupados de acordo com o fenótipo de susceptibilidade à AQ em amostras
provenientes da Nigéria. Pôde-se observar uma correlação significante entre a
151
presença das mutações N86Y do gene pfmdr1 e K76T do gene pfcrt com o fenótipo
de resistência à AQ (p=0,0001 e p=<0,0003, respectivamente) Essa correlação não
se apresentou significante nas mutações V241L (G47), S263P (G47) e S347 (G2).
Gene Códon e aminoácido n % n % p
pfmdr1 N86 29 76.3% 5 23.8% 0.0003
86Y 9 23.7% 16 76.2%
pfcrt K76 13 39.4% 0 0.0% < 0,0001
76T 20 60.6% 19 100.0%
G7 N834 20 66.7% 8 40.0% 0.08
834N&1 10 33.3% 12 60.0%
G47 V241 36 92.3% 17 81.0% 0.22
241L 3 7.7% 4 19.0%
S263 32 82.1% 12 60.0% 0.11
263P 7 17.9% 8 40.0%
G2 S437 34 94.4% 19 100.0% 0.6
437A 2 5.6% 0 0.0%
Tabela 11: Resistência à AQ em função das mutações nos genes em
Sensível
Resistente
amostras da Nigéria
Amostras
Legenda: n = número de amostras; % = porcentagem de cada alelo; p = p valor
A respeito das amostras brasileiras, a mutação N86Y não foi observada nas
amostras. Todas as amostras possuíam a mutação K76T.
Correlação entre a atividade in vitro dos antimaláricos e os polimorfismos pelo teste
Kruskal-Wallis
Para verificar se houve correlação entre as mutações nos genes e os perfis
152
de susceptibilidade in vitro, realizou-se o teste Kruskal-Wallis. Nesta análise, as
amostras não foram divididas de acordo com o seu fenótipo de susceptibilidade
(sensível ou resistente) e, sim, segundo o valor crescente de IC
50,
e foram também
analisadas conforme seu haplótipo. Já no gene pfcrt, por exemplo, não foi avaliada a
mutação K76T e, sim, seus haplótipos (CVIET, CVMNT, CVMNK E SVMNT). O
mesmo ocorreu com o gene G47 de haplótipos: VS, VP, LS e LP. Como o número
de observações é pequeno e não se pôde garantir a premissa da normalidade para
análise de variância, optou-se pelo teste não paramétrico (Kruskal-Wallis). Então,
inicialmente, os testes foram realizados, combinando-se os dados do Brasil e da
Nigéria, sendo em seguida realizada a análise específica de cada país.
Na análise, observou-se correlação de mutações nos genes pfcrt e G2 com
baixa susceptibilidade in vitro a CQ (p= <0,0001 e p=0,008, respectivamente),
quando analisadas amostras sem distinção de origem. Ao realizar-se tal distinção,
apenas os genes pfcrt e pfmdr1 apresentaram correlação com as amostras da
Nigéria (p=0,0002 e p=0,0022). Não foi possível realizar a correlação entre amostras
brasileiras devido à baixa variabilidade genética. Em relação à correlação da
susceptibilidade da AQ com os genes, observou-se p-valores menores que 0,005 em
relação aos genes pfcrt e pfmdr1 no número total de amostras ou quando analisadas
apenas as amostras nigerianas. O número total das amostras, também, apresentou
correlação entre a mutação no gene G7 e a AQ (p=0,003), fato não observado ao se
distinguir as origens das amostras (Tabela 12).
153
CQ AQ
Gene Total Nigéria
Brasil Total Nigéria Brasil
pfmdr1 0.7 0.0002 ND < 0,0001 0.0002 ND
pfcrt <0,0001 0.0022 ND 0.0001 0.0007 ND
G7 0.9 0.1 0.7 0.03 0.1 0.3
G47 0.6 0.17 0.2 0.2 0.2 0.9
G2 0.008 0.9 0.2 0.6 0.8 0.9
Tabela 12: Teste de Kruskal-Wallis
Legenda: ND = Não determinado. Valores em p-valor
Discussão:
A resistência aos antimaláricos contribuiu para um aumento substancial na
mortalidade e morbidade da malária em diversos países no mundo (White, 1999b). A
CQ foi o antimalárico mais utilizado como primeira linha terapêutica nos últimos 40
anos, devido ao seu efeito contra as formas do P. falciparum e ao seu baixo custo e
toxicidade (Arya, 2002). Este medicamento é de fácil produção e sua estrutura
química estável permite o estoque e transporte mesmo em condições climáticas
extremas. O uso da CQ no Brasil foi abandonado na década de 80, mas na Nigéria,
foi utilizado no tratamento da malária por tempo superior ao Brasil, possivelmente
devido a seu baixo custo e aparecimento mais tardio da resistência em comparação
a outras regiões endêmicas no mundo (Ogungbamigbe et al., 2007). O preço deste
fármaco é o mais acessível, custando US$ 0,07 dólares por comprimido, enquanto
os outros antimaláricos podem custar entre $0,082 (SP) e $ 2,5 dólares (Coartem).
Em um país, onde 70% da população vive na pobreza, o preço de antimaláricos
mais efetivos é impraticável (Molyneux et al., 2005). No entanto, o governo da
Nigéria, através de fundos gerados pela OMS, passou a substituir gradativamente a
CQ pela combinação de artesunato- AQ ou arteméter-lumefantrina a partir de 2003
154
(WHO, 2005). A falha terapêutica à CQ na Nigéria foi documentada ocorrendo na
faixa de 31 a 39% da população, uma taxa muito superior à recomendada (10%)
pela OMS para a mudança na política de tratamento (Kabanywanyi et al., 2007;
Ojurongbe et al., 2007). O teste in vitro em nosso estudo demonstrou 25,4% de
resistência à CQ nos parasitos oriundos da Nigéria.
No Brasil, onde a CQ não é utilizada há mais de 15 anos para o tratamento da
malária por P. falciparum, nenhum parasito sensível à droga foi demonstrado em
estudos anteriores (Zalis et al., 1998; Cerutti Junior et al., 1999; Vieira et al., 2001;
Gonzalez et al., 2003; Vieira et al., 2004). O teste in vitro para esta droga, em
amostras brasileiras, demonstrou resistência in vitro em 97,5 % dos parasitas
analisados. Neste estudo, um parasito apresentou sensibilidade à CQ,
representando possivelmente um aumento da suscetibilidade a esta droga no país.
A média de IC
50
da CQ em isolados brasileiros foi cerca de nove vezes superior à
média de IC
50
dos isolados nigerianos. Como na América do Sul são encontrados
como principais agentes etiológicos P. vivax e P. falciparum, este resultado pode ser
interpretado pelo uso desta droga no tratamento da malária por P. vivax, exercendo
uma pressão constante em P. falciparum.
Recentemente tem-se observado um declínio da resistência e a consequente
reemergência de parasitos sensíveis à droga. No Malaui houve declínio da
resistência in vitro de 50% para 1%, após 12 anos sem o uso da CQ (Laufer et al.,
2006). Na China, a resistência in vitro dos parasitos era 97,9% em 1981 e decaiu
para 60,9% em 1991 (Liu et al., 1995). Este declínio da resistência e a consequente
emergência de parasitos sensíveis ocorre, possivelmente, pela perda da fitness
associada a várias mutações adquiridas pelas populações de parasitas durante a
pressão da droga. Estas mutações, por sua vez, ocasionam um custo biológico extra
155
no metabolismo do parasito, resultando em uma diminuição na geração de
descendentes. Com a remoção da pressão exercida pela CQ, mutações associadas
à resistência se tornaram uma desvantagem ao parasito e, devido à seleção natural,
a população de parasitos com códons selvagens passou a prevalecer
gradativamente sobre a população de parasitos mutantes (Hastings e Donnelly,
2005; Hayward et al., 2005; Walliker et al., 2005).
A identificação da associação do gene pfcrt com a resistência a CQ
representou um dos grandes avanços no conhecimento da resistência aos
antimaláricos (White, 2004). A substituição de uma Lisina (K) por uma Treonina (T)
no códon 76 (K76T) tem sido encontrada em todos os parasitos resistentes e
fortemente associada à resistência do parasito à CQ (Fidock et al., 2000; Anderson
et al., 2005). A prevalência desta mutação foi monitorada no Malaui após a
substituição da CQ por outros antimaláricos e observou-se um declínio da
prevalência da mutação de 85% em 1992 para 13% em 2000 (Kublin et al., 2003). O
mesmo ocorreu em outro estudo onde a prevalência da K76T que decaiu de 17% em
1998 para 2% em 2000 (Mita et al., 2003). Estes estudos sugeriram um decréscimo
de 5% na fitness do parasito causado pela mutação K76T. (Abdel-Muhsin et al.,
2003). acompanharam a frequência de alelos do gene pfcrt em uma coorte de
habitantes residentes de uma vila no Sudão durante as estações secas de 1999 e
2000, quando não havia transmissão de malária e o uso da CQ era muito limitado
(Abdel-Muhsin et al., 2003). No final de cada estação seca, puderam observar que
houve um declínio da prevalência da mutação K76T, sugerindo mais uma vez, a
desvantagem seletiva da mutação.
Ao contrário do que ocorreu no Malaui, onde a sensibilidade à CQ retornou
em 99% dos pacientes tratados com a droga, o declínio da resistência pode ocorrer
156
de forma lenta ou gradual. Um decréscimo parcial da resistência à CQ foi observado
na China, Guiana Francesa e Camboja (Lim et al., 2003; Durrand et al., 2004; Wang
et al., 2005; Legrand et al., 2008). A manutenção de graus substanciais dessa
resistência em países não africanos, após a descontinuação do tratamento com CQ,
reflete no fato de que nem toda a pressão da droga foi removida dessas regiões. A
CQ permanece prescrita no tratamento da malária por P. vivax, responsável pela
maior frequência de casos em países como Brasil e Guiana Francesa (Legrand et
al., 2008). Portanto, nos países onde ainda ocorre o uso da CQ para o tratamento de
outras espécies de plasmódio, espera-se encontrar um declínio lento e gradual da
resistência.
Em diversas regiões, a redução da prevalência da mutação K76T não está
associada ao declínio da resistência e é possível encontrar a mutação em parasitos
sensíveis (Lim et al., 2003). No Camboja, embora a resposta in vitro à CQ esteja
associada com a mutação K76T, esta correlação não é perfeita, já que a mutação foi
constatada em 15 dos 17 isolados sensíveis à CQ (Durrand et al., 2004). Na Índia,
esta mutação foi detectada em todos os isolados obtidos de pacientes com
resistência in vivo à CQ, no entanto, sua presença foi confirmada em 96% dos
pacientes com sensibilidade in vivo ao fármaco (Vinayak et al., 2003). Em nosso
estudo, a mutação K76T esteve presente em 26 dos 39 isolados sensíveis e foi
fortemente associada à resistência a CQ nos parasitos provenientes de ambos os
países (p < 0,0001) e nos parasitos oriundos apenas da Nigéria (p = 0,02). Esta
associação da mutação K76T com a resistência à CQ já era esperada e é
amplamente descrita em diversos estudos. A prevalência da mutação em isolados
sensíveis foi descrita em um estudo de resistência in vivo na Nigéria. No Brasil não
havia sido reportado ainda nenhum isolado sensível.
157
Esta prevalência da mutação K76T em parasitos sensíveis, mesmo após a
ausência da pressão da CQ, pode ocorrer, devido a mutações compensatórias que
superam a perda da fitness do parasito (Walliker et al., 2005). Em um experimento
realizado por Rosario e cols.(1978) um inóculo contendo P. chabaudi resistentes e
sensíveis à CQ foi infectado em camundongos e após alguns ciclos, os mutantes
eram mais prevalentes do que os sensíveis. Mesmo quando o inóculo consistia de
90% de parasitos sensíveis e 10% de resistentes, os resistentes ainda prevaleciam
sobre os sensíveis (Rosario, 1978). Alguns parasitos resistentes a CQ (linhagens
FCB e Dd2), aparentemente, estão bem adaptados em cultivo apesar da ausência
da pressão da CQ, sugerindo a ação de mutações compensatórias ou adaptativas
que superam as mudanças deletérias dos genes associados à resistência (Walliker
et al., 2005). Estas mutações compensatórias parecem ocorrer tipicamente na
seleção da droga para minimizar o custo biológico da aquisição de uma mutação. A
seleção exercida pela CQ em P. falciparum pode ter conduzido a um conjunto de
alelos que modula o nível de resistência e estabiliza as funções biológicas básicas
da célula.
Essas mutações adicionais podem estar embutidas no gene que já sofreu
uma mutação de resistência ou na modificação de outras proteínas envolvidas em
funções biológicas semelhantes. Em um experimento realizado por Jiang e cols.
(2008) onde a expressão de diversos genes na presença e na ausência da pressão
da CQ foi analisada, verificou-se que a mutação K76T afetava indiretamente certas
funções normais envolvidas na invasão e no crescimento do parasito. Além do mais,
alguns transportadores como o PfVP2 estariam atuando na compensação dessa
perda fisiológica do parasita (Jiang et al., 2008).
158
Um exemplo prático da ação de uma mutação adaptativa na resistência à CQ
está representada no modelo proposto por Johnson e cols (2004) para o mecanismo
de ação do gene pfcrt. A lisina no códon 76 do gene pfcrt adiciona uma carga
positiva na membrana interna do vacúolo digestivo, bloqueando o efluxo da CQ
diprotonada. Na substituição da lisina por uma treonina, um aminoácido neutro, a
carga positiva no gene pfcrt é perdida, permitindo o efluxo da CQ do vacúolo
digestivo. Quando o gene pfcrt possui uma outra mutação, a S163R, além da
mutação K76T, observa-se o acúmulo da CQ, provavelmente porque a R (Arginina),
um aminoácido de carga positiva, restaura a perda desta carga perdida no vacúolo
digestivo e bloqueia o efluxo da CQ (Johnson et al., 2004). Em nosso estudo,
postulamos que, em um momento inicial, a mutação K76T pode causar uma perda
de fitness no parasito. No entanto, após a pressão de uma determinada droga, os
parasitos adquirem mutações compensatórias que minimizaram o custo biológico
causado por esta mutação inicial.
Em relação ao gene pfcrt, não há como prever se a presença da mutação
K76T em parasitos sensíveis no Brasil e na Nigéria ocorre devido à compensação da
fitness pela ação das mutações compensatórias. Ou se as populações parasitárias
na Nigéria estão em uma fase de transição onde os alelos selvagens do gene pfcrt
ainda estão competindo com os mutantes, e ainda não se sobrepuseram em
prevalência, visto que a pressão da CQ foi removida apenas recentemente. Apesar
da CQ não ser utilizada há mais de 15 anos na Venezuela e no Brasil, não foi
observada a re-emergência do alelo selvagem nestes países, possivelmente porque
não existem mais parasitos com estes alelos na região amazônica (Contreras et al.,
2002).
159
Além da mutação K76T, foram observados, nesse estudo, quatro haplótipos
distintos nos códons 72 a 76 do gene pfcrt. Nos isolados brasileiros, foram
constatados apenas dois haplótipos, SVMNT em maior prevalência (97,6%) e CVIET
em apenas um isolado (3,4%). O haplótipo CVIET, após ter sido originado no
sudeste asiático no final da década de 1950, disseminou-se até a África, entre 1970
e 1980, e possivelmente, foi trazido para a América do Sul nos últimos 20 anos.
Vieira e cols. (2004), após genotiparem os isolados brasileiros, verificaram
que CVIET não formava um agrupamento (cluster) com nenhum outro haplótipo
analisado no estudo, concluindo assim, a recente introdução deste alelo na
população da América do Sul (Vieira et al., 2004), o que provavelmente ocorreu
devido às frequentes migrações asiáticas e principalmente africanas ao Brasil. Entre
os isolados provenientes da Nigéria foram encontrados os haplótipos CVIET,
CVMNT e o haplótipo selvagem CVMNK, dos quais o haplótipo CVIET é mais
prevalente (69,5%) seguido de CVMNK (27,2%), e, por fim, de CVMNT (3,3%). Na
Nigéria seria possível a associação do declínio da resistência com o declínio da
prevalência da mutação K76T, porque o haplótipo selvagem é comum na região. Os
parasitos selvagens poderiam, por sua vez, competir com os mutantes devido ao
déficit de fitness presente neles. Já no Brasil, o haplótipo selvagem nunca foi
encontrado.
Outros transportadores, além do gene pfcrt, também apresentaram
associação com a resistência ou com o nível de suscetibilidade dos parasitos à CQ e
outras drogas antimaláricas (Mu et al., 2003). O gene pfmdr1, há algum tempo, foi
foco de interesse como um possível gene atuando na resistência à CQ. No entanto,
seu papel na resistência ao fármaco ainda não é claro. A associação da mutação
N86Y com a resistência é controversa: alguns experimentos realizados na Malásia,
160
Indonésia, Guiné-Bissau, Nigéria e África subsaariana demonstraram a presença da
mutação em isolados resistentes à CQ. Entretanto, estudos realizados na Uganda,
Laos, Camarões, África do Sul, Brasil e Peru não demonstraram a relevância desta
mutação na previsão da resposta in vivo à CQ. A análise de isolados africanos
demonstrou a alta prevalência da mutação N86Y no gene pfmdr1 e sua associação
positiva com a resistência à CQ (Adagu et al., 1995; Basco et al., 1995).
Em nosso estudo, todas as amostras brasileiras analisadas não apresentaram
a mutação N86Y, embora tal mutação tenha sido observada em 41,5% das amostras
nigerianas. Não houve associação significante entre a mutação e a resistência in
vitro quando analisadas as amostras provenientes do Brasil e da Nigéria. Contudo,
os isolados nigerianos apresentaram esta associação com a resposta in vitro à CQ
(p = 0,005). Esses dados são condizentes com os achados de Mu e cols. (2003) que
encontraram uma associação da resposta à CQ, apenas em isolados da Ásia e da
África, mas não das Américas. Quando analisadas amostras dos continentes juntos,
esta associação não foi significante, possivelmente porque nenhum isolado brasileiro
possui a mutação N86Y. Tal mutação também é ausente ou rara em isolados
provenientes de outros países da América do Sul.
Outros transportadores da superfamília ABC, além do gene pfmdr1, foram
associados aos elevados níveis de IC
50
da CQ e da QN (Mu et al., 2003; Anderson
et al., 2005). Recentemente, demonstrou-se que o gene G2, localizado no
cromossomo 1 de P. falciparum, tem um papel no efluxo da glutationa e dos
antimaláricos CQ e QN . Este gene contribui para a resposta do parasito a múltiplas
drogas, possivelmente por bombeá-las para fora do parasito (Raj et al., 2009). Duas
mutações presentes no gene foram associadas à resistência à CQ e à QN: a Y191H
e a S437A (Mu et al., 2003; Henry et al., 2008b). A freqüência destas mutações em
161
isolados africanos é muito baixa e, portanto, não há dados estatísticos de sua
importância no continente. Entretanto, a mutação Y191H foi associada à CQ em
isolados asiáticos e a mutação S437A em isolados sul americanos (Mu et al., 2003).
Nesse estudo, foi analisada apenas a mutação S437A. A sua prevalência em
isolados nigerianos mostrou-se baixa (3%) e, conseqüentemente, não houve
correlação com a resposta in vitro à CQ (p = 1). No entanto, quando analisadas
amostras de ambos os países, a mutação S437A apresentou associação à resposta
in vitro à droga no total de amostras. Esse estudo é o primeiro que associou esta
mutação em isolados de campo.
Mu e cols. (2003), os primeiros a descreverem o gene G2, utilizaram cepas de
laboratório e Anderson e cols. (2005). não encontraram a associação da mutação
em isolados da Tailândia (Mu et al., 2003; Anderson et al., 2005). A associação
aparentemente ocorre em apenas algumas regiões, possivelmente devido à política
diferenciada de antimaláricos prescritos pelos países. No Brasil, quando a CQ
perdeu sua eficácia, o esquema terapêutico foi modificado para a combinação da
QN com a doxiciclina (Legrand et al., 2008). Na África, a CQ permaneceu em uso
até recentemente, mesmo com altas taxas de falha terapêutica. Na Tailândia uma
vasta gama de antimaláricos foi utilizada no tratamento: MQ, SP, AQ e QN. O G2
está fortemente associado à resposta à QN, portanto a pressão deste antimalárico
no Brasil pode ter selecionado a mutação, causando não apenas uma maior
prevalência em isolados brasileiros (46,2%), como também a sua associação com a
resposta aos antimaláricos QN e CQ.
A mutação S263P do gene G47 também apresentou correlação com a
resposta à CQ. O gene G47, assim como o gene G2, é um transportador da
superfamília ABC, e está localizado no cromossomo 5 e sua mutação V241L foi
162
associada à resposta à CQ por Mu e cols. (2003). Esta mutação não apresentou
correlação com a resposta in vitro à CQ em nosso estudo. Sua prevalência mostrou-
se baixa entre as amostras: 11,5% na Nigéria e 3,3% no Brasil. Entretanto, foi
observada uma nova mutação, nunca antes descrita, no códon 263 deste gene:
S263P. A prevalência da S263P é maior do que da V241L. Entre as amostras
nigerianas, esta mutação foi observada em 26 isolados (25%) e no Brasil apenas em
dois (6,6%). Sua associação com a resistência à CQ mostrou-se significante (p =
0,003) em isolados provenientes da Nigéria. O transportador G7 não apresentou
correlação com resposta in vitro à CQ nos isolados provenientes do Brasil e da
Nigéria.
Recentemente, a Nigéria modificou sua política de tratamento de P.
falciparum para a combinação de artesunato e AQ ou arteméter e lumefantrina. O
artesunato e o arteméter são compostos derivados da artemisinina e agem como
esquizonticidas rápidos, podendo também eliminar os gametócitos bloqueando a
transmissão da malária (Happi et al., 2006b; WHO, 2006). Estes compostos não
foram utilizados anteriormente no tratamento na Nigéria, mas a AQ era prescrita no
caso de falha terapêutica em pacientes tratados com CQ. Apesar disso, vem-se
constatando uma elevação da falha terapêutica à AQ (White, 2008b). Em 2001,
apenas 4,8% dos pacientes não respondiam ao tratamento com AQ; em 2005, a
falha terapêutica elevou-se para 13% entre os pacientes (Ogungbamigbe et al.,
2007; Ogungbamigbe et al., 2008).. Em outros países da África como Burkina Faso e
São Tomé do Príncipe, a resistência in vivo à AQ é de 9 e 10%, respectivamente
(Zongo et al., 2005).
Infelizmente, não é possível estabelecer associação entre os resultados dos
testes in vitro com os in vivo da AQ, como ocorre com a CQ. Em um estudo onde a
163
resistência in vitro à AQ era de 5,4%, a equivalente in vivo mostrou-se 40,5%
resistente (Aubouy et al., 2004).
Brasseur e cols. (2005) demonstraram que a resistência in vivo era duas
vezes superior à resistência in vitro (Brasseur et al., 1995).. Em contraste, Basco e
cols. (2001) encontraram taxas de falhas terapêuticas menores do que as
resistências do teste in vitro (Basco, 1991). Essa falta de associação entre as
respostas in vitro e in vivo pode estar relacionada com o limiar de sensibilidade à
AQ, que não é bem estabelecido, podendo variar de 15, 30 a 60 nM (Childs et al.,
1989). Recentemente, Pradines e cols. (2006) realizaram um estudo onde sugerem
um limiar de sensibilidade de 30 nM, já que foi observada uma maior correlação
entre os marcadores moleculares e a AQ quando o limiar era estabelecido neste
valor (Pradines et al., 2001; Pradines et al., 2006).. Seguindo o trabalho de Pradines
e cols. (2006) utilizamos o limiar de sensibilidade de 30 nM para o teste in vitro para
AQ e constatamos 33,9% e 15% de isolados resistentes na Nigéria e no Brasil
respectivamente. A média de IC
50
na Nigéria apresentou-se 2,2 vezes superior à
média de IC
50
de isolados brasileiros, o que não é de surpreender porque a AQ foi
utilizada no tratamento da malária por P. falciparum na Nigéria, e nunca no Brasil
como primeira linha terapêutica.
A presença de isolados resistentes no Brasil, onde nunca houve o uso da AQ
e a alta incidência de isolados resistentes à AQ na Nigéria pode ser explicada pela
resistência cruzada constatada entre a AQ e a CQ. A resistência cruzada é um
fenômeno onde microorganismos resistentes a certas drogas também apresentam
resistência a outras drogas que possuem os mecanismos de ação e mecanismos
moleculares semelhantes (Ochong et al., 2003). Essa correlação existe
principalmente em agentes com estruturas químicas similares e que tenham os
164
mesmos sítios de ligação. A resistência cruzada entre CQ e AQ pode ocorrer,
porque ambas fazem parte da mesma classe, as 4-aminoquinoleínas, e diferem
entre si apenas por um anel aromático p-hidroxianilino, presente na cadeia da AQ
(Ringwald et al., 1998). A AQ inibe competitivamente o acúmulo da CQ e vice versa,
sugerindo mecanismos de acúmulo similares entre as drogas. Como a CQ, a AQ é
uma base fraca e, portanto, acumula-se no vacúolo digestivo, devido à captura
iônica, e é também capaz de se ligar ao heme e, assim, atuar na inibição da
formação da hemozoína (Hawley et al., 1996).
Uma correlação positiva entre os IC
50
s de dois antimaláricos sugere o
fenômeno de resistência cruzada in vitro (Dow et al., 2004). No entanto, a relação
entre resistência in vitro e in vivo irá depender do nível de resistência e do
coeficiente de correlação (r
2
) (Pradines et al., 2006). Para que dois compostos
estejam envolvidos no mesmo mecanismo de ação que poderia assim induzir
resistência cruzada entre eles, o r
2
deve ser maior do que 0,5 (Ochong et al., 2003).
Nesse estudo, foi observada uma correlação positiva fraca entre os antimaláricos
AQ e CQ em amostras analisadas dos dois países (r
2
= 0,21), ou mesmo quando as
amostras brasileiras foram separadas deste total (r
2
= 0,22). Entretanto, a correlação
foi alta entre AQ e CQ em amostras provenientes apenas da Nigéria (r
2
= 0,77). A
maior correlação encontrada na Nigéria pode ser devido às diferentes políticas de
tratamento adotadas em cada país. A CQ não é utilizada no tratamento da malária
por P. falciparum há décadas, enquanto que, apenas recentemente, essa droga foi
retirada da Nigéria e ainda hoje é prescrita em algumas regiões do país (Happi et al.,
2006a). Portanto, a CQ permaneceu exercendo pressão exclusiva em P. falciparum
por muito mais tempo na Nigéria do que no Brasil. A AQ nunca foi utilizada no Brasil
para o tratamento de primeira linha e, no entanto, foi utilizada na Nigéria como
165
alternativa à resistência à CQ, exercendo também pressão nos parasitos e, logo,
podendo aumentar a correlação entre os dois antimaláricos na Nigéria. Contudo, a
resistência cruzada explica por que, apesar da AQ nunca ter sido usada no Brasil,
foram observados 15% de parasitos resistentes à droga no país.
Outra correlação positiva significante entre os IC
50
s foi observada entre AQ e
MQ (r
2
= 0,51 e p = < 0,001) em isolados brasileiros. Não é possível prever se esta
correlação entre os IC
50
s é indicativa de mecanismos de ação semelhantes ou de
resistência cruzada. A MQ é uma quinoleína pertencente à classe da 8-
aminoquinolinas (Karle e Karle, 1991). Sua estrutura se difere da AQ e da CQ, já
que possui um núcleo quinolínico aclopado a uma cadeia amino-alcool. A estrutura
da MQ é mais similar à QN do que às 4-aminoquinoleínas (Carroll et al., 1976).
Tanto a MQ quanto a QN inibem competitivamente o acúmulo da CQ e da AQ,
sugerindo mecanismos similares de acúmulo no parasito e são bases muito mais
fracas do que a AQ, tornando-se monoprotonadas, ao invés de diprotonadas no
vacúolo digestivo (Evans e Havlik, 1996). Altas concentrações da MQ no vacúolo
digestivo são capazes de bloquear a polimerização do grupo heme em hemozoína
(Zhang et al., 1999).
Estudos, avaliando a ultra-estrutura do parasito, demonstram alterações
morfológicas no vacúolo digestivo, após o tratamento com MQ, muito similares aos
da AQ e da CQ (Saxena et al., 1989). A MQ também forma ligações com o heme, no
entanto, esta ligação e seu acúmulo no vacúolo digestivo é menor do que o da CQ.
Apesar disto, a MQ é um inibidor mais potente do que a CQ e a AQ em parasitos
sensíveis, indicando a ação de outros transportadores que não os mesmos que a
CQ (Begum et al., 2002). Muitos estudos indicam a ação da proteína transportadora
Pgh-1 na resposta do parasito à MQ (Ruetz et al., 1996; Duraisingh e Cowman,
166
2005; Rohrbach et al., 2006). A correlação positiva da MQ e da AQ pode ter ocorrido
porque ambos antimaláricos têm o gene pfmdr1 como mesmo alvo. Não há relatos
desta associação em outros estudos.
A mutação N86Y no gene pfmdr1 foi associada à resposta à AQ em
Madagascar, Burkina Faso, África Oriental e Tanzânia (Best Plummer et al., 2004;
Happi et al., 2006a; Jalousian et al., 2008). A mesma correlação não foi significativa
na Colômbia, Sudão e Quênia. Em nosso estudo houve uma correlação significativa
entre a mutação e a resposta in vitro à AQ (p=0,0001) (Legrand et al., 2008;
Rungsihirunrat et al., 2009).
Além do gene pfmdr1, o gene pfcrt também apresentou correlação com a
resistência à AQ (p = 0,007). O fato da resposta à AQ estar associada à mutação
K76T reitera a possibilidade da resistência cruzada com a CQ por possuírem os
mesmos alvos e mecanismos de ação. A mutação no gene G7 também foi
associada à resposta à AQ (p = 0,03). Este gene está localizado no cromossomo 13,
é um transportador da família ABC e possui uma inserção de uma N no códon 834
do gene. O gene G7 foi associado à resistência à CQ por Mu e cols. (2003) e ao
Artesunato por Anderson e cols (2005). Entretanto, sua associação com a AQ nunca
foi descrita anteriormente.
Em nosso estudo, não foi possível associar as mutações com as respostas in
vitro em isolados brasileiros, devido ao baixo número amostral e porque tais isolados
apresentaram baixa variabilidade genética. A mutação N86Y do gene pfmdr1 não é
encontrada em isolados brasileiros e é muito rara em alguns países da América do
Sul. O alelo selvagem do gene pfcrt também é ausente no Brasil. As mutações no
gene G47, apesar de presentes nos isolados brasileiros, têm baixa prevalência no
país: 3,3% de V241L e 6,6% de S263P. A mutação 834N&1 no gene G7 e a
167
mutação S437A no gene G2 foram mais prevalentes, porém, o baixo número
amostral de amostras brasileiras não possibilitou uma análise estatística significante.
A baixa variabilidade genética nas amostras brasileiras já foi descrita
anteriormente através de antígenos polimórficos e de microsatélites (Wootton et al.,
2002; Su et al., 2007; Winzeler, 2008).. A genotipagem por micrisatélites de
parasitas da África e do Sudeste Asiático demonstraram uma grande diversidade
populacional devido a transmissão intensa, favorecendo a recombinação genética.
Já na América do Sul a diversidade mostrou-se menor, porque a transmissão é bem
mais baixa que na África, tornando-se assim uma infecção quase clonal (Wootton et
al., 2002)..
Na Nigéria, a espécie P. falciparum é responsável por 90% dos 3 milhões de
casos de malária. No Brasil, esta espécie é responsável por 19,3% de 460 mil casos,
significando que na Nigéria há 30 vezes mais casos do que no Brasil e, portanto,
uma transmissão muito mais intensa (WHO, 2008)..
Outro fator atuante na variabilidade genética além da taxa de transmissão é a
pressão seletiva da droga, capaz de reduzir a variabilidade dos nucleotídeos
próximos à região do genoma onde ocorreu a mutação de resistência (Wootton et
al., 2002). Esse fenômeno denominado de “selective sweeps” ou Varredura Seletiva
ocorre quando uma nova mutação favorece o parasito (resistência a uma droga) em
relação a outros da população (Wootton et al., 2002). Uma forte seleção pode
resultar em uma região no genoma onde os haplótipos são positivamente
selecionados e passam a ser os únicos encontrados em uma população, reduzindo,
portando, a variabilidade genética naquela região do cromossomo (Su et al., 2007).
Esse fenômeno ocorreu provavelmente através da pressão seletiva da CQ no gene
pfcrt. Foi constatado que os parasitos sensíveis com o haplótipo CVMNK possuem
168
uma variabilidade genética muito superior aos parasitos resistentes. No Brasil, além
da baixa transmissão que confere menor variabilidade genética ao parasito, ainda
houve a pressão intensa da CQ, causando assim uma variabilidade muito inferior
àquela encontrada na África e, ainda, a baixa variabilidade genética inicial em
conjunto com a intensa pressão da droga pode ter eliminado os parasitos com
haplótipo de sensibilidade à droga do país (Wootton et al., 2002).
O teste in vitro para Quinina demonstrou 100% de sensibilidade dos parasitos
provenientes do Brasil. Zalis e cols. (1998) demonstraram que parasitas isolados de
uma região endêmica de malária, na Amazônia, apresentaram valores de IC
50
abaixo do limiar de sensibilidade, porém com uma redução na suscetibilidade dos
parasitos à esta droga (Zalis et al., 1998). Estudos anteriores já haviam reportado a
redução no tempo de eliminação do parasito no sangue. Em 1995, 10% das
infecções por P.falciparum não responderam ao tratamento com QN. Cerutti e cols.
(1999) encontraram 3,3% de parasitos resistentes à QN, indicando mais uma vez a
redução da sensibilidade dos parasitos a este antimalárico. Esta redução,
provavelmente, corresponde à evolução natural da resistência dos parasitos à QN,
devido à pressão do antimalárico utilizado extensivamente como primeira escolha no
tratamento da malária por P. falciparum (Cerutti et al., 1999).
O teste in vitro para Mefloquina, utilizada como segunda escolha terapêutica
até 2007, demonstrou a existência de 35% de parasitos resistentes ao antimalárico.
A resistência à MQ foi inicialmente descoberta na fronteira entre a Tailândia e o
Camboja na década de 80. O aparecimento da resistência, possivelmente, está
relacionado ao uso anterior da QN para o tratamento, por possuírem estruturas
químicas semelhantes. A MQ, como monoterapia, perdeu sua efetividade no
tratamento da malária na fronteira da Tailândia e do Camboja, embora ainda seja
169
eficaz em 75% dos tratamentos da malária por P. falciparum em regiões endêmicas,
próximas à fronteira (Cowman e Foote, 1990). No Brasil, o primeiro parasito
resistente in vitro a MQ foi descrito em 2001 por Calvosa e cols. (2001) e alguns
casos de falha terapêutica foram reportados na Região Amazônica. Porém, a
extensão da resistência na América do Sul ainda é muito menor se comparada à do
sudeste asiático. Possivelmente porque no Brasil a MQ foi utilizada como segunda
escolha no tratamento, enquanto que no sudeste asiático foi amplamente utilizada
por um longo período (Calvosa et al., 2001). Como é um composto de meia vida
longa e pode permanecer em concentrações sub-terapêuticas no plasma do
indivíduo, a emergência de parasitos resistentes somada à pressão seletiva intensa
da droga em concentrações sub-terapêuticas, causou uma disseminação da
resistência no sudeste asiático (Wellems et al., 1991). No Brasil, como não ocorre
essa pressão extensiva, a resistência se resume a apenas alguns focos. Na África a
falha terapêutica à MQ é muito rara, e apenas alguns isolados foram descritos com
baixa susceptibilidade à droga.
Muitas questões ainda permanecem desconhecidas em relação às mudanças
genotípicas e fenotípicas dos parasitos sob pressão das drogas. Em nosso estudo
verificamos que a média de IC
50
da CQ em isolados brasileiros é nove vezes
superior à média de IC
50
dos parasitos nigerianos. Isso pode ser explicado no Brasil
pela pressão da droga em uma população com homogeneidade nas mutações que
conferem baixa susceptibilidade à CQ. Quando essa população de baixa
variabilidade genética, porém com mutações que conferem resistência, são
submetidas à pressão seletiva da droga, toda uma população pode expressar um só
fenótipo in vitro com alto IC
50,
como é visto em nosso estudo com as amostras
brasileiras. As amostras africanas, por possuírem uma alta variabilidade genética
170
que expressa sensibilidade e resistência ao mesmo tempo, conferem uma
variabilidade no fenótipo in vitro para CQ. A média desses IC
50
s numa população
com fenótipos variados será sempre menor que um grupo homogêneo resistente.
Além do mais, a CQ utilizada no tratamento de outras espécies do plasmódio exerce
uma pressão constante sob uma população inteira de parasitos independente de
espécies.
Durante a última década, os progressos no conhecimento da base molecular
da resistência de P. falciparum a diversos antimaláricos têm sido bastante
significativos. A utilização de ferramentas moleculares no diagnóstico da resistência
ainda está em fase inicial. A identificação de novos marcadores moleculares é
importante para a detecção prévia da resistência, facilitando a implementação de
medidas preventivas adequadas. A compreensão dos mecanismos de resistência e
da biologia da quimiorresistência é, portanto, fundamental para uma ação efetiva no
controle da doença.
No caso da CQ, a mutação K76T no gene pfcrt era um marcador de
resistência que podia ser utilizado para prever a susceptibilidade do parasito à
droga. No entanto, essa correlação não é perfeita, porque a mutação também é
detectada em parasitos sensíveis, tanto em experimentos in vivo quanto in vitro.
Embora o gene pfcrt também esteja associado à resposta in vitro e in vivo à outros
antimaláricos, como AQ e QN, esta associação nem sempre é significante. O papel
do gene pfmdr1 na resistência à CQ ainda não é bem estabelecido e sua correlação
com a resistência varia de região para região. Alguns estudos associam a mutação
N86Y do gene pfmdr1 à resistência à AQ, outros não encontram tal associação.
Diversos outros marcadores foram associados à resposta in vitro aos antimaláricos,
no entanto, a associação destes com a resistência in vivo ainda é desconhecida.
171
Nesse estudo foi detectada a associação das mutações K76T do gene pfcrt, N86Y
do gene pfmdr1, S263P do gene G47 e S437A do gene G2 com a resposta à CQ e
as mutações K76T do gene pfcrt, N86Y do gene pfmdr1 e N834&1 do gene G7 à
resposta à AQ. No entanto não é possível prever se as novas mutações terão papel
de marcador molecular in vivo ou mesmo se estão associadas à resposta aos
antimaláricos em apenas algumas regiões. A resposta in vivo é muito mais complexa
do que a in vitro, pois não depende exclusivamente das características intrínsecas
do parasito, mas também de diversos fatores do hospedeiro, como sua imunidade e
a farmacocinética da droga.
A alteração da política de tratamento substituindo a monoterapia pela
combinação de antimaláricos é realmente importante na contenção da resistência,
porque reduz a probabilidade da emergência de parasitos resistentes a dois
fármacos de alvos distintos. Embora o esquema terapêutico mundial tenha sido
alterado recentemente, muitos compostos utilizados na combinação são
estruturalmente semelhantes aos já utilizados. A lumefantrina, utilizada na
combinação com o arteméter no Coartem, é estruturalmente semelhante à Quinina,
que por um longo período exerceu pressão nos parasitos brasileiros. Outros, como a
AQ e a MQ foram utilizados por um longo tempo em diversos países. A resistência
cruzada destes antimaláricos com a CQ e a crescente taxa de falha terapêutica
constatada pode ser alarmante porque, mesmo que utilizados em combinação com
outros antimaláricos, diversos parasitos já foram previamente selecionados pela
resistência.
Recentemente foi constatado um decréscimo na susceptibilidade dos
parasitos à Artemisinina e seus derivados. Mesmo com a probabilidade de
emergência da resistência, utilizando a combinação de medicamentos de alvos
172
distintos ser muito pequena, a probabilidade de surgir parasitos resistentes não é
nula. Sendo assim, o conhecimento prévio dos mecanismos de resistência e da
biologia da quimiorresistência, em conjunto com o constante monitoramento da
susceptibilidade dos parasitos, são fundamentais para contornar os possíveis
problemas do advento da resistência aos combinados.
Conclusão:
O monitoramento da sensibilidade in vitro dos isolados de P. falciparum é
importante para o controle da disseminação da resistência do parasito aos
antimaláricos. Esse estudo demonstrou que a espécie P. falciparum ainda
permanece resistente à CQ no Brasil, embora tenha sido constatado um parasito
sensível à CQ, o que indica uma possível redução da resistência à droga em
isolados brasileiros. Já na Nigéria, observou-se a presença de 22,1% de parasitos
resistentes. Apesar da AQ nunca ter sido utilizada no tratamento da malária por P.
falciparum no Brasil, foi constatada 15% de resistência à droga em isolados
brasileiros, indicando uma possível resistência cruzada entre CQ e AQ (r
2
=0,22). Na
Nigéria, ocorreu o uso desse fármaco no caso de falha terapêutica à CQ. Foram,
portanto, observados 33,9% de parasitos resistentes à AQ. A alta taxa de resistência
a esse fármaco também pode ser explicada pela resistência cruzada (r
2
=0,77).
As mutações nos genes que codificam proteínas transportadoras estão
associadas à variação da susceptibilidade de diversos microorganismos às drogas.
Nesse estudo analisamos cinco genes associados ao transporte de moléculas
através da membrana do parasito. Os genes pfcrt e pfmdr1 já foram previamente
associados à susceptibilidade do parasito à CQ e outros fármacos como QN, MQ e
173
AQ. Nesse estudo constatamos que as mutações K76T no gene pfcrt e N86Y no
gene pfmdr1 estão associadas à susceptibilidade dos isolados à CQ e à AQ. Além
dessas, as mutações S263P no gene G47 e S241A no gene G2 foram associadas à
resistência à CQ e a mutação N843N&1 foi associada à resistência à AQ.
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