( PDF ) Análise da região promotora dos genes 1,3-ß-glicana sintase e quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

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Daniella de Sousa Moraes

Análise da região promotora dos genes 1,3-β-glicana

sintase e quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

Brasília, DF

2009

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Daniella de Sousa Moraes

Análise da região promotora dos genes 1,3-β-glicana

sintase e quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

Dissertação apresentada ao Departamento de Biologia

Celular do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade de Brasília, como requisito parcial à

obtenção do grau de mestre em Biologia Molecular.

Orientador: Prof. Dr. Marcio José Poças Fonseca

Co-Orientadora: Profª. Dra. Ildinete Silva Pereira

Brasília DF,

2009

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Daniella de Sousa Moraes

Análise da região promotora dos genes 1,3-β-glicana

sintase e quitina sintase 4 de Paracoccidioides brasiliensis

Banca Examinadora

Prof. Dr. Aldo Henrique Fonseca Pacheco Tavares - Universidade Católica de Brasília

Prof. Dr. Cezar Martins de Sá - Universidade de Brasília

Prof. Dr. Túlio César Ferreira (suplente) - Universidade de Brasília

Brasília, DF

2009

iv



"Feliz aquele que transfere o que sabe

e aprende o que ensina."

Cora Coralina



v



Este trabalho é dedicado aos meus pais, Tiana e Luiz, que

me ofereceram o amor e suporte necessário para que eu

chegasse até aqui, e ao meu marido, Diogo, pelo amor e

apoio durante a realização deste desafio.

vi



AGRADECIMENTOS

Aos professores e colegas do Laboratório de Biologia Molecular da UnB, onde tive a

oportunidade de realizar este projeto, aprender e amadurecer.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular da Universidade de Brasília.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

Ao professor Marcio José Poças Fonseca, pelo apoio e compromisso dedicado à

orientação deste trabalho.

À professora Ildinete Silva Pereira, sempre solícita e atenciosa, por ter me recebido no

Laboratório de Biologia Molecular, pelo respeito e auxílio.

Aos membros do Lab3, que por lá passaram ou ainda estão: Bárbara, Calliandra,

Eveline, Letícia, Lorena, Luana, Luís, Marciano, Natasha e Thiago. Colegas que se tornaram

amigos, que desde ceder um poço em um gel para eletroforese a contribuir com valiosas

sugestões, se mostraram companheiros e membros de um grupo unido. Obrigada à Letícia,

Lorena e Thiago também por terem colaborado no desenvolvimento deste projeto.

À Dona Ivanilde, Dona Fátima e ao Thompson, pela responsabilidade e presteza que

tornam a rotina do laboratório eficiente.

À Ana, por ser atenciosa e pela competência no Departamento de Biologia Celular.

Ao grupo de virologia em que participei dos projetos de iniciação científica, pelo

aprendizado e amizade. Obrigada à professora Cláudia Renata (in memoriam), Claudiner,

Daniela, Eduardo, Margareti, Natália, Nazle, Patrícia, Regina, Tainá e Verônica.

Aos meus amados pais, Tiana e Luiz, que me ensinaram lições para construir uma vida

com dignidade e simplicidade, por serem minha referência e meu porto-seguro.

Ao meu marido, Diogo, que me incentivou e apoiou desde a escolha pelas Ciências

Biológicas até a decisão de realizar este trabalho. Nos momentos mais difíceis, esteve ao meu

lado e me ensinou a ter perseverança.

Aos meus irmãos, familiares e amigos, que mesmo sem compreenderem este trabalho,

se interessam e torcem por mim.

Agradeço a Deus e à Nossa Senhora pelas bênçãos, por me fortalecerem e me

iluminarem durante esta etapa, onde aprendi não só sobre ciência, mas também sobre

superação de obstáculos. Obrigada por ter colocado em meu caminho pessoas tão especiais,

que estão comigo nos momentos de dificuldade e também nos momentos de conquista.

vii



SUMÁRIO



RESUMO X

ABSTRACT XI

LISTADEFIGURAS XII

LISTADETABELAS XIV

LISTADESIGLASEABREVIATURAS XV

1–INTRODUÇÃO 1

1.1–ParacoccidioidesbrasiliensiseParacoccidioidomicose 1

1.2–ParedeCelulardeFungos 4

1.2.1–ParedeCelulardeParacoccidioidesbrasiliensis 4

1.2.2–ParedeCelulardeFungoseVirulência 5

1.3–GenesdeParedeCelular 8

1.3.1–1,3‐β‐glicanasintase 8

1.3.2–Quitinasintase4 10

1.4–EstudodePromotoreseAbordagensExperimentais 14

1.4.1–EnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforética(EMSA) 15

1.4.2–SistemadeGeneRepórterlacZ 17

1.5–UtilizaçãodeAspergillusnidulanscomoHospedeiroHeterólogoparaEstudodaRegulaçãodaExpressão

Gênica 18



2–OBJETIVOS 21

2.1–ObjetivoGeral 21

2.2–ObjetivosEspecíficos 21

viii



3–MATERIAISEMÉTODOS 22

3.1–SoluçõeseSoluçõesTampão 22

3.1.1–SoluçõesparaMeiosdeCulturadeA.nidulans 22

3.1.2–SoluçõesTampãoparaTransformaçãodeA.nidulans 23

3.1.3–SoluçõesparaExtraçãodeDNATotaldosTransformantesdeA.nidulans 25

3.1.4–SoluçõesparaExtraçãodeProteínasdeP.brasiliensis 26

3.1.5–SoluçõesparaEletroforeseemGeldePoliacrilamidaDesnaturante‐SDS‐PAGE 26

3.1.6–SoluçõesparaoEnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforética(EMSA) 28

3.2–MeiosdeCultura 28

3.3–LinhagensMicrobiológicas 31

3.3.1–Escherichiacoli 31

3.3.2–Aspergillusnidulans 31

3.3.3–Paracoccicidioidesbrasiliensis 31

3.4–VetorGeneRepórter 32

3.5–SistemadeGeneRepórterlacZparaAnálisedaRegiãoPromotoradogene1,3‐β‐glicanasintasedeP.

brasiliensis 33



3.5.1–PreparaçãodeCélulasdeE.coliTermo‐Competentes 33

3.5.2–TransformaçãodeE.colicomoVetorGeneRepórter 33

3.5.3–PreparaçãodePlasmídeosemLargaEscala 34

3.5.4–DigestãodoVetorGeneRepórter 34

3.5.5–PreparaçãodeProtoplastoseTransformaçãodeA.nidulanscomoVetorGeneRepórter 35

3.5.6–EnsaiodeEstabilidadeMitótica 36

3.5.7–ExtraçãodeDNATotaldosTransformantesdeA.nidulans 37

3.5.8–ReaçãoemCadeiadaPolimerase(PCR)paraAmplificaçãodeumFragmentodoPromotordoGene

Pbfks1dosTransformantesdeA.nidulans 37



3.5.9–EnsaioemPlacadaAtividadedeβ‐galactosidase 38

3.6–EnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforéticaparaAnálisedaRegiãoPromotoradosGenes1,3‐β‐

glicanasintaseequitinasintase4deP.brasiliensis 38



3.6.1–ExtraçãodeProteínasdeP.brasiliensis 38

3.6.2–ProduçãoePurificaçãodoDomíniodeLigaçãoaoDNAdaProteínaPacCdeP.brasiliensis 39

3.6.3–EletroforeseemGeldePoliacrilamidaDesnaturante‐SDS‐PAGE 41

3.6.4–AnálisedaSeqüênciaPromotoradosGenesPbfks1ePbchs4eDesenhodasSondasparaEMSA 42

3.6.5–EnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforética(EMSA) 43

ix



3.7–AnálisedaExpressãodoGene1,3‐β‐glicanasintase 47

4–RESULTADOSEDISCUSSÃO 51

4.1.–AnálisedaRegiãoPromotoradoGenequitinasintase4deP.brasiliensis 51

4.1.1–ProduçãodaProteínaRecombinantePacCPb‐GSTparaAnálisedoPromotordoGenePbchs4 53

4.1.2–EnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforética(EMSA):sondaPbchs4(a) 54

4.1.3–EnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforética(EMSA):sondaPbchs4(b) 64

4.2–AnálisedaRegiãoPromotoradoGene1,3‐β‐glicanasintasedeP.brasiliensis 67

4.2.1–EnsaiodeRetardodaMobilidadeEletroforética(EMSA):sondaPbfks1(a) 68

4.2.2–AnálisedaExpressãodoGene1,3‐β‐glicanasintasedeP.brasiliensis 72

4.2.3–SistemadeGeneRepórterlacZparaAnálisedaRegiãoPromotoradoGene1,3‐β‐glicanasintasedeP.

brasiliensis 73



5–CONCLUSÃO 78

6–PERSPECTIVAS 79

7–REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS 80



x



RESUMO

Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), é

um fungo termodimórfico que cresce como micélio à temperatura ambiente e se diferencia

para levedura em culturas a 37°C e no tecido do hospedeiro. A transição dimórfica de P.

brasiliensis está associada com alterações na parede celular. Quando o fungo se diferencia de

micélio para levedura, o conteúdo de quitina é aumentado e a composição de glicana é

alterada, reduzindo o conteúdo de 1,3-β-glicana e aumentando o conteúdo de 1,3-α-glicana.

Em P. brasiliensis, um homólogo do gene de 1,3-β-glicana sintase (Pbfks1) e seis genes de

quitina sintase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6) foram identificados. Em

nosso estudo, nós investigamos a região promotora dos genes Pbfks1 e Pbchs4. Por meio de

ensaio de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA), analisamos sondas referentes aos

promotores desses dois genes e identificamos prováveis sítios regulatórios. A análise da

região promotora do gene Pbfks1 indica um TATA Box que pode ser funcional, e sugerimos

que o promotor do gene Pbchs4 possa estar sendo regulado pelo elemento de resposta ao

estresse (STRE). Além disso, demonstramos também que o domínio de ligação ao DNA de

PacC de P. brasiliensis reconhece um sítio descrito para PacC de A. nidulans, porém, a

proteína não reconheceu uma variação na seqüência consenso presente no promotor do gene

Pbchs4. Observamos que uma sonda referente ao promotor do gene Pbchs4 que contém um

sítio para o fator de transcrição CreA não interage com o domínio de ligação ao DNA de

CreA de Humicola grisea, mas apresenta interações DNA-proteína específicas nas fases de

micélio e levedura. Adicionalmente, resultados de RT-PCR em tempo real revelaram que o

gene Pbfks1 é mais expresso em meio com acetato do que em meio com glicose como fonte

de carbono. Portanto, o trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa fornece dados que

podem contribuir para a compreensão da regulação dos promotores dos genes 1,3-β-glicana

sintase e quitina sintase 4 em P. brasiliensis.

xi



ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM),

is a thermal dimorphic fungus which grows as a mycelium at room temperature and

differentiates to yeast in cultures at 37°C and in the host tissue. The dimorphic transition of P.

brasiliensis is associated with changes in the cell wall. When the fungus differentiates from

mycelium to yeast, the chitin content is increased and the composition of glucan changes,

reducing the 1,3-β-glucan content and enhancing the content of 1,3-α-glucan. In P.

Brasiliensis, one homologous of 1,3-β-glucan synthase gene (Pbfks1) and six genes of chitin

synthase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6) were identified. In our study,

we investigated the promoter region of Pbfks1 and Pbchs4 genes. By means of

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), we analyzed probes referring to promoters of

these two genes and we identified probable regulatory sites. The analysis of the promoter

region of the Pbfks1 gene indicates one TATA Box that could be functional, and we propose

that the Pbchs4 promoter may be regulated by the stress responsive elements (STRE).

Furthermore, we also demonstrated that the PacC DNA binding-domain of P. brasiliensis

recognizes one A. nidulans’s PacC described site, nevertheless, the protein didn’t recognize

one variation in the consensus sequence in the Pbchs4 promoter. We observed one Pbchs4

promoter probe with one CreA transcription factor site doesn’t interact with the CreA DNA

bind-domain of Humicola grisea, but shows specific DNA-protein interactions in mycelium

and yeast phases. Additionally, results of Real Time RT-PCR disclosed that Pbfks1 gene is

more expressed in medium with acetate then in medium with glucose as a carbon source.

Therefore, the work developed in our research group provides data which may contribute for

the comprehension of 1,3-β-glucan synthase and chitin synthase 4 promoters’ regulation in P.

brasiliensis.

xii



LISTA DE FIGURAS



Figura 1.

Produção de 1,3-

-glicana e quitina na parede celular.

Figura 2. Filograma de quitina sintases de fungos.

Figura 3. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética de uma

seqüência da região promotora do gene Pbchs4 com

extratos protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis.

Figura 4. Esquema ilustrativo do Ensaio de Retardo da Mobilidade

Eletroforética.

Figura 5. Esquema ilustrativo do sistema de gene repórter lacZ.

Figura 6. Agrupamento das espécies de fungos, de acordo com a

proposta do Fungal Genome Initiative (FGI).

Figura 7. Esquema dos vetores da série pAN923.

Figura 8. Conformação head-to-head dos genes Pbchs4 e Pbchs5.

Figura 9. Seqüência nucleotídica da região intergênica dos genes

Pbchs4 e Pbchs5 (número de acesso no GenBank

EF654132).

Figura 10. Perfil eletroforético em SDS-PAGE (12%) da proteína

recombinante PacCPb-GST, corado com Comassie Blue.

Figura 11. Sonda Pbchs4(a).

Figura 12. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando

a sonda Pbchs4(a) com a proteína recombinante PacCPb-

GST.

Figura 13. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética para teste

da funcionalidade da proteína recombinante PacCPb-GST.

Figura 14. Comparação dos sítios de ligação para PacC presentes nas

sondas 1, 3 e 4 de H. grisea e na sonda Pbchs4(a).

Figura 15. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando

as sondas Pbchs4(a) mutadas e extrato protéico de micélio

de P. brasiliensis.

Figura 16. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando

as sondas Pbchs4(a) mutadas e extrato protéico de

levedura de P. brasiliensis.

xiii



Figura 17. Sonda Pbchs4(b).

Figura 18. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando

a sonda Pbchs4(b) e com extratos protéicos de micélio ou

levedura de P. brasiliensis, ou a proteína recombinante

CreAHg-GST.

Figura 19. Seqüência nucleotídica da região promotora do gene

Pbfks1 (número de acesso no GenBank AF148715).

Figura 20. Sonda Pbfks1(a).

Figura 21. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando

as sondas Pbfks1(a) mutadas e extrato protéico de micélio

ou levedura de P. brasiliensis.

Figura 22. Análise eletroforética em gel de agarose 0,8% corado com

brometo de etídeo (0,5 μg/mL) da digestão do vetor gene

repórter (vetor 42B da série pAN923) contendo a região

promotora do gene Pbfks1.

Figura 23. Análise eletroforética em gel de agarose 0,8% corado com

brometo de etídeo (0,5 μg/mL) da amplificação de um

fragmento do promotor do gene Pbfks1 a partir do DNA

dos fungos transformantes.

xiv



LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Distribuição dos principais componentes da parede celular

de P. brasiliensis.

Tabela 2. Sítios analisados na região promotora dos genes Pbfks1 e

Pbchs4.

Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados na PCR para amplificação de

um fragmento do promotor do gene Pbfks1 dos

transformantes de A. nidulans.

Tabela 4.

Sondas utilizadas em EMSA.

Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados na RT-PCR em Tempo Real.

Tabela 6. Análise da diferença entre os níveis de transcrito do gene

Pbfks1 em micélio e em levedura de P. brasiliensis.

Tabela 7. Análise da diferença entre os níveis de transcrito do gene

Pbfks1 em glicose e em acetato de sódio.



xv



LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

aa aminoácido

cDNA DNA complementar

CHS gene que codifica a quitina sintase em fungos; ocorrem variações dessa

nomenclatura e número de genes identificados, de acordo com os

autores citados ao longo deste trabalho

CreAHg-GST domínio de ligação ao DNA da proteína CreA de H. grisea fusionado à

GST

DEAE dietilaminoetil

DNA ácido desoxirribonucléico

DNase desoxirribonuclease

dNTP desoxirribonucleotídeo

DTT ditiotreitol

EDTA ácido etilenodiaminotetracético

EMSA Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética

et al. et alii (e outros)

FAM fluoróforo carboxifluoresceína

FGI Fungal Genome Initiative

FKS gene que codifica a 1,3-β-glicana sintase em fungos; ocorrem variações

dessa nomenclatura e número de genes identificados, de acordo com os

autores citados ao longo deste trabalho

g grama

g unidade de medida da força centrífuga

GlcNac N-acetilglicosamina

GST glutationa S-transferase

h hora

HEPES N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfônico

HOG High Osmolarity Glycerol

HSE Elemento de Resposta ao Choque Térmico

HSP proteína de choque térmico

IPTG isopropil- β-D-tiogalactopiranosídeo

Kb quilobase

xvi



KDa quilodalton

lacZ gene de E. coli que codifica a enzima β-galactosidase

LB Luria-Bertani (meio de cultura LB)

M Molar

mA miliamper

MAP quinase proteíno quinase ativada por mitógeno

Mb megabase

mg miligrama

mL mililitro

mM milimolar

min minuto

mRNA RNA mensageiro

ng nanograma

OD densidade óptica

ONPG o-nitrofenil-β-D- galactopiranosídeo

ORF região aberta de leitura

PABA ácido paraminobenzóico

PacCPb-GST domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P. brasiliensis

fusionado à GST

pb pares de base

Pbchs gene que codifica a qutina sintase de P. brasiliensis; foram identicados

seis genes que codificam quitina sintases em P. brasiliensis (Pbchs1,

Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e Pbchs6)

Pbfks1 gene que codifica a 1,3-β-glicana sintase identificado em P.

brasiliensis

PCM paracoccidioidomicose

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

PEG polietilenoglicol

pH potencial hidrogeniônico

PKC proteína quinase C

PMSF fluoreto fenil metil sulfonil

poli(dI-dC) polímero sintético de deoxiinosina e deoxicitidina (utilizado como

competidor inespecífico em EMSA)

xvii



p/v massa/volume

RNA ácido ribonucléico

RNase ribonuclease

rpm rotações por minuto

rRNA RNA ribossômico

RT-PCR amplificação por PCR de um produto de transcrição reversa (cDNA)

SDS dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

(condições desnaturantes)

seg segundo

STRE Elemento de Resposta ao Estresse

TBP TATA Binding Protein

TE tampão Tris-EDTA

TEB tampão Tris-EDTA-borato

TEMED N,N,N’, N’-tetrametil etilenodimetilamina

TESS Transcription Element Search System

Tm Melting Temperature

TNF Fator de Necrose Tumoral

TRIS tris-(hidroximetil)-aminometano

V Volts

v/v volume/volume

X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo

YPD Yeast Peptone Dextrose (meio YPD)

μg micrograma

μL microlitro

μm micrômetro

μM micromolar

1X concentração para uso

25X vinte e cinco vezes concentrado

50X cinquenta vezes concentrado

100X cem vezes concentrado



1



1 – INTRODUÇÃO

1.1 – Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioidomicose

O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose

(PCM), uma micose humana endêmica na América Latina. A PCM afeta principalmente a

população de áreas rurais e ocorre predominantemente no Brasil, Colômbia e Venezuela

(Franco et al., 1993). No Brasil, onde as maiores taxas de incidência ocorrem nas regiões Sul,

Sudeste e Centro-Oeste, a PCM destacou-se como a oitava causa de mortalidade por doença

predominantemente crônica entre as doenças infecciosas e parasitárias, e apresentou a mais

elevada taxa de mortalidade entre as micoses sistêmicas (Coutinho et al., 2002). Estima-se

que entre dois a três indivíduos a cada 100 mil habitantes adoeçam de PCM na América

Latina anualmente. No Brasil, espera-se que de quatro a seis mil novos casos ocorram a cada

ano (revisto por Telles, 2008).

A PCM apresenta uma multiplicidade de manifestações clínicas, ocorrendo desde a

forma cutânea às formas sistêmicas, atacando diversos tecidos. Primeiramente os pulmões são

comprometidos, e a micose pode se disseminar para outros órgãos e sistemas. Lesões

secundárias aparecem freqüentemente em mucosas, linfonodos, adrenais e pele (Brummer et

al., 1993). O diagnóstico da PCM pode ser realizado por microscopia para identificação do P.

brasiliensis ou por testes sorológicos, usualmente para detecção da glicoprotéina gp43

(Fornajeiro et al., 2005), mas ferramentas moleculares para amplificação de fragmentos

genômicos gerados por uma ampla variedade de isolados de P. brasiliensis também podem

ser incorporadas ao diagnóstico (San-Blas et al., 2005). Tanto a apresentação clínica da

micose como o curso da doença variam de paciente para paciente. Dessa forma, a PCM pode

assumir a forma crônica ou aguda, e o tratamento é usualmente prolongado. As drogas

eficazes contra a paracoccidioidomicose compreendem três grupos: anfotericina B, compostos

sulfanilamídicos e o grupo de drogas azólicas (revisto por Palmeiro et al., 2005). Na ausência

dos medicamentos a doença pode ser fatal.

2



A PCM foi descrita por Adolfo Lutz no Brasil em 1908 e, em 1930, Floriano Paulo de

Almeida identificou e designou seu agente etiológico, o P. brasiliensis. Análises

filogenéticas, baseadas em rDNA 28S, permitiram a classificação de P. brasiliensis na família

Onygenaceae, pertencente à ordem Onygenales (filo Ascomycota). Embora seja classificado

como um ascomiceto, a fase sexual de P. brasiliensis não foi demonstrada morfologicamente

(Bagagli et al., 2008). Observa-se uma extensa variabilidade genética entre os isolados de P.

brasiliensis. Matute et al. (2006) sugerem que existam pelo menos três espécies filogenéticas

de P. brasiliensis, das quais duas são espécies monofiléticas (PS2, composta por isolados da

Venezuela e Brasil, e PS3, composta por isolados da Colômbia), e uma espécie parafilética

(S1, com ampla abrangência nas áreas endêmicas). O Pb01, objeto de estudo deste trabalho, é

um isolado clínico que diverge dessas três espécies filogenéticas descritas. A análise

filogenética de isolados que se assemelham ao genótipo de Pb01, isolados denominados

“Pb01-like”, permitiu agrupar esses isolados em um grupo filogenético distinto dos grupos

S1, PS2 e PS3, e sugere-se a descrição formal de uma nova espécie para esse grupo,

denominada Paracoccidioides lutzii (Teixeira, 2009). Recentemente, o genoma do isolado

Pb01, de aproximadamente 32 Mb, foi seqüenciado pelo Broad Institute

(www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.htmL), estimando-se

cerca de 9 mil genes.

O P. brasiliensis é um fungo dimórfico. Essa classificação é baseada na habilidade de

transição entre duas morfologias distintas, associadas a uma condição ambiental específica.

Os fungos dimórficos de importância médica são Blastomyces dermatitidis, Candida albicans,

Coccidioides immitis, Coccidioides posadasii, Histoplasma capsulatum, P. brasiliensis,

Penicillium marneffei e Sporothrix schenckii (revisto por Chaffin et al., 1998 e Rappleye e

Goldman, 2006). O fungo P. brasiliensis cresce na forma de levedura em culturas a 37°C e no

tecido do hospedeiro, e na temperatura ambiente ocorre na forma micelial. Sugere-se que o

habitat de P. brasiliensis seja o solo, onde o fungo existe como saprófita. A infecção é

adquirida pela via respiratória por meio da inalação de estruturas da forma micelial, que

sofrem transição para a forma de levedura no tecido do hospedeiro (Brummer et al., 1993;

Restrepo et al., 2007).

A PCM é mais freqüente em homens expostos ao habitat do fungo pelo trabalho

agrícola. Em mulheres, a infecção é rara em função do papel protetor do hormônio estrogênio

3



(revisto por Palmeiro et al., 2005). O estrógeno inibe a transição de micélio para levedura in

vitro, e estudos in vivo corroboram os dados epidemiológicos e in vitro ao observar que os

hormônios femininos bloqueiam a transição dimórfica, promovendo resistência à doença

(Aristizabal et al., 1998). Em P. brasiliensis, a transição dimórfica é essencial para o

estabelecimento da doença visto que linhagens incapazes de se diferenciarem em levedura são

avirulentas (Franco et al., 1993). Observa-se que a transformação para a fase de levedura é

um fator chave para o processo invasivo no hospedeiro, razão pela qual é fundamental o

conhecimento dos eventos metabólicos e mecanismos regulatórios envolvidos na transição

dimórfica.

A transição dimórfica em P. brasiliensis é governada predominantemente pela

temperatura e é precedida por alterações moleculares. A identificação de genes

diferencialmente expressos e/ou genes requeridos para o dimorfismo é importante para a

compreensão dos eventos que ocorrem no estabelecimento da infecção e doença. A análise do

transcriptoma de P. brasiliensis realizada por Felipe et al. (2005), cobrindo aproximadamente

80% do genoma, revelou diferenças na expressão gênica nas fases de micélio e levedura, com

um padrão de expressão diferencial de genes associados ao metabolismo, ciclo celular, síntese

da parede celular e vias de transdução de sinal, tendo sido identificados novos genes que

podem estar associados à virulência. A transição dimórfica de P. brasiliensis está

correlacionada com alterações na composição, organização e estrutura da parede celular.

Observa-se que quando o fungo se diferencia de micélio para levedura ocorre um aumento no

conteúdo de quitina e alteração na composição de glicana, de modo que diminui o conteúdo

de 1,3-β-glicana e aumenta o de 1,3-α-glicana (Kanetsuna et al., 1972). Portanto, estudos

sobre a regulação da expressão dos genes associados à síntese da parede celular podem

contribuir para a compreensão dos eventos que ocorrem na transição dimórfica e na

patogênese do fungo.

4



1.2 – Parede Celular de Fungos

1.2.1 – Parede Celular de Paracoccidioides brasiliensis

A parede celular de P. brasiliensis apresenta um papel essencial na patobiologia do

fungo, pois está diretamente relacionada a mudanças morfogenéticas durante a transição

dimórfica. Uma estratégia direcionada para a compreensão da morfogênese do fungo é o

estudo dos seus componentes estruturais. A distribuição dos principais componentes da

parede celular de P. brasiliensis está apresentada na tabela 1.

Tabela 1. Distribuição dos principais componentes da parede celular de P. brasiliensis –

Observam-se diferenças significativas dos componentes entre as formas de micélio e levedura

de P. brasiliensis.

Dados retirados de Kanetsuna et al., 1969; Kanetsuna et al., 1972.

A forma de levedura apresenta um conteúdo maior de quitina do que a forma micelial,

enquanto que a forma micelial apresenta um maior conteúdo de proteínas do que a forma de

levedura. Não há diferenças significativas na quantidade de lipídios e glicanas entre as duas

formas. Observa-se que a composição da parede celular de B. dermatitidis é similar à

composição da parede celular de P. brasiliensis (Kanetsuna et al., 1969). Em C. albicans, a

1,3-β-glicana constitui de 47 a 60% do peso da parede celular, e a quitina de 0,6 a 9,0%

(Chaffin et al., 1998). Em P. brasiliensis, a 1,3-α-glicana predomina na forma de levedura,

enquanto que na fase de micélio predomina a 1,3-β-glicana. A síntese de 1,3-α-glicana em

uma cultura decresce rapidamente após a mudança de temperatura de 37°C para 20°C, e a

síntese de 1,3-β-glicana é aumentada (Kanetsuna et al., 1972). Em B. dermatitidis, a 1,3-α-

glicana também é prevalente na levedura, enquanto que a 1,3-β-glicana é prevalente no

micélio (Kanetsuna e Carbonell, 1971). Em P. brasiliensis, outro polissacarídeo de glicose

5



encontrado na forma micelial é a galactomanana (Kanetsuna et al., 1972), responsável pelas

propriedades antigênicas da parede celular.

San Blas e San Blas (1982) realizaram preparações de micélio e levedura de P.

brasiliensis que foram submetidas a tratamentos com diversos detergentes na tentativa de

solubilizar a glicana sintase da membrana, obtendo-se maior sucesso nas preparações de

levedura do que nas preparações de micélio, corroborando as observações de que as estruturas

de ambas as formas são diferentes.

1.2.2 – Parede Celular de Fungos e Virulência

Antes vista como uma estrutura rígida, inerte e dedicada à proteção celular, a parede

celular de fungos é agora vista como uma estrutura dinâmica e amplamente interativa. A

mobilidade dos componentes da parede celular e sua resposta às condições externas são

reconhecidas como propriedades dessa complexa estrutura. Além disso, vários componentes

têm sido caracterizados na parede celular, como glicoesfingolipídeos, proteínas de choque

térmico, fosfatases, histonas e antígenos transientes (Nimrichter et al., 2005).

A parede celular de fungos é uma estrutura sujeita a mudanças, e sua composição e

organização estrutural são reguladas durante o ciclo celular, em resposta a alterações

ambientais e ao estresse. A quitina e 1,3-β-glicana representam os principais componentes da

parede celular de fungos. Esses polissacarídeos contrapõem a pressão de turgor dentro da

célula e determinam sua morfologia (revisto por San-Blas e Nino-Vega, 2008). A figura 1

apresenta um esquema da formação da parede de celular com seus polímeros principais,

quitina e 1,3-β-glicana, que se apresentam interconectados nessa estrutura celular.

6



Figura 1. Produção de 1,3-β-glicana e quitina na parede celular – Os polímeros de 1,3-β-

glicana e de quitina são interconectados. Retirado de Latgé, 2007.

A parede celular de fungos apresenta função tanto de proteção como de agressão. Em

sua ação de proteção atua como uma barreira inicial que está em contato com o ambiente

hostil encontrado pelos fungos. Se removida ou comprometida, o fungo não sobrevive, a

menos que esteja osmoticamente protegido. A ação agressiva deve-se ao fato de que a parede

celular pode apresentar moléculas hidrolíticas e tóxicas, que podem ser requeridas para a

invasão em determinados ambientes. Além disso, sua estrutura rígida é proveitosa para a

penetração em substratos que são colonizados ou invadidos (Latgé, 2007).

Na parede celular de fungos pode ocorrer deposição de melanina. A habilidade de

fungos patogênicos em produzir melanina é associada à virulência, e já foi detectada em P.

brasiliensis, S. schenckii, H. capsulatum, B. dermatitidis, C. posadasii, Cryptococcus

neoformans e Aspergillus fumigatus. A melanização parece contribuir para a virulência

reduzindo a susceptibilidade aos mecanismos de defesa do hospedeiro e às drogas

antifúngicas (Taborda et al., 2008). Em ensaios com macrófagos de murinos, Silva et al.

(2006) observaram que leveduras melanizadas de P. brasiliensis foram fracamente

fagocitadas, mesmo na presença do sistema complemento. Além desse fator associado à

virulência, um importante antígeno transiente expresso na parede celular de P. brasiliensis é a

glicoproteína gp43, que é sintetizada e transportada para a parede celular, onde permanece por

um certo tempo e é posteriormente secretada no meio (revisto por Nimrichter et al., 2005). A

glicoproteína gp43 é um receptor para laminina e está envolvida nos mecanismos de adesão

durante a infecção (Hanna et al., 2002). Popi et al. (2002) demonstraram ainda que gp43 inibe

7



a atividade fungicida de macrófagos e sugerem seu papel no mecanismo de evasão no

estabelecimento da infecção primária em hospedeiros susceptíveis.

O reino fungi é incrivelmente diverso e seus membros podem habitar uma ampla

variedade de nichos. Entretanto, poucas espécies são patogênicas para os humanos.

Transições morfogenéticas são freqüentemente requeridas para expressão de virulência

(revisto por San Blas e Nino-Vega, 2008). O dimorfismo, crescimento em temperaturas

elevadas, aderência a células do hospedeiro, componentes da parede celular, proteinases,

lipases, fosfolipases e outros são considerados potenciais fatores de virulência importantes no

processo invasivo (revisto por Tavares et al., 2005). O mercado mundial para agentes

antifúngicos foi estimado em 11,9 bilhões de dólares em 2007 (West, 2007). Entretanto, as

drogas atuais são reconhecidas por sua inabilidade em atuar rapidamente, toxicidade e

espectro limitado. Há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de novos agentes

antifúngicos. Além disso, existe uma incidência crescente de resistência aos antifúngicos

disponíveis, como o fluconazol (Birren et al., 2003). Devido ao fato de que a parece celular

atua na proteção do fungo e, além disso, muitos de seus componentes não são presentes em

humanos, a parede celular é um alvo atrativo para drogas.

Nessa perspectiva, estudos sobre a parede celular, assim como sobre as enzimas

envolvidas na biossíntese da parede, fornecem informações valiosas para o desenvolvimento

de drogas antifúngicas. As glicanas presentes na parede celular desempenham um importante

papel na virulência em P. brasiliensis. Klimpel e Goldman (1988) relataram que em H.

capsulatum linhagens avirulentas apresentaram um conteúdo de 1,3-α-glicana cerca de mil

vezes menor do que nas linhagens virulentas. Também foi demonstrado que linhagens

avirulentas de P. brasiliensis induzem uma reposta do sistema de defesa do hospedeiro maior

do que as linhagens virulentas, e que a 1,3-β-glicana induz a atração de neutrófilos

polimorfonucleares e macrófagos durante a resposta inflamatória mediante a indução do fator

de necrose tumoral (TNF) (Silva et al., 1994). Essas observações indicam que a alteração de

1,3-β-glicana para 1,3-α-glicana na transição dimórfica de micélio para levedura proteja o

fungo contra o sistema de defesa do hospedeiro. Além da observação da alteração no

conteúdo de glicana, o aumento acentuado do conteúdo de quitina na levedura de P.

brasiliensis também requer atenção, e reconhece-se que genes envolvidos na biossíntese da

parede podem apresentar função na transição dimórfica.

8



1.3 – Genes de Parede Celular

1.3.1 – 1,3-β -glicana sintase

A 1,3-β-glicana é o principal polímero da parede celular de fungos, e é sintetizada a

partir de UDP-glicose pela enzima 1,3-β-glicana sintase. A atividade catalítica de 1,3-β-

glicana sintase é regulada por uma GTPase da superfamília Ras, a Rho1-GTPase, e pela

proteína quinase C (PKC). Rho1-GTPase é uma subunidade regulatória de 1,3-β-glicana

sintase, que estimula a sua atividade. Essa subunidade também regula a integridade da parede

celular por meio de uma via de sinalização, ligando-se e ativando PKC (revisto por Zhao et

al., 1998).

Em S. cerevisiae, a síntese de 1,3-β-glicana ocorre na membrana plasmática por meio

da atividade dos produtos de dois genes homólogos, FKS1 e FKS2. A seqüência nucleotídica

de FKS1 codifica uma proteína integral de membrana (Fks1p) de 215 kDa. A seqüência

nucleotídica de FKS2 também codifica uma proteína integral de membrana (Fks2p) de 217

kDa, que apresenta 88% de identidade com Fks1p. A análise da expressão do gene FKS1 de S.

cerevisiae revelou que sua transcrição é regulada durante o ciclo celular, predominando

durante o crescimento em glicose, e sendo reduzida quando a glicose é substituída por acetato

de sódio. Já a expressão do gene FKS2 é reprimida por glicose e induzida por Ca

feromônios, sendo essencial para a esporulação, que ocorre em fontes pobres de carbono,

como o acetato de sódio (Douglas et al., 1994; Mazur et al., 1995). Zhao et al. (1998)

demonstraram que a expressão do gene FKS2 também é induzida em temperaturas elevadas, e

que a indução em fontes pobres de carbono é uma resposta à repressão por glicose, sob o

controle do repressor transcricional Mig1p.

Em C. albicans, o gene GSC1 foi descrito por Mio et al. (1997) como responsável por

codificar uma unidade catalítica da 1,3-β-glicana sintase, codificando uma proteína predita de

210 kDa (Gsc1p), com cerca de 72% de identidade com as proteínas homólogas em S.

cerevisiae. Além de GSC1, C. albicans apresenta outro gene que pode estar relacionado à 1,3-

β-glicana sintase, denominado GSL1. Apesar de ter uma ORF correspondente a apenas 57%

da ORF de GSC1, a proteína predita (Gsl1) apresenta 54% de identidade com Gsc1p. Tanto

9



GSC1 como GSL1 são expressos na fase de levedura de C. albicans, e quando o crescimento

da hifa foi induzido, os níveis de mRNA declinaram. Em Neurospora crassa, foi identificada

uma proteína descrita como subunidade de 1,3-β-glicana sintase (Shimoler et al., 2003). Em

Aspergillus nidulans e em Schizosaccharomyces pombe, um único homólogo do gene 1,3-β-

glicana sintase foi descrito, denominados fksA (Kelly et al., 1996) e cps1 (Inshiguro et al.,

1997), respectivamente. Em A. nidulans, o gene fksA codifica uma proteína predita (FksAp)

de 229 kDa, que apresenta elevado grau de conservação em tamanho e identidade com as

proteínas homólogas em S. cerevisiae (Kelly et al., 1996). Em S. pombe, o gene cps1 codifica

uma proteína predita que apresenta 55% de identidade com as homólogas em S. cerevisiae.

Mutações no gene que codifica essa proteína provocaram hipersensibilidade a drogas descritas

como inibidores da síntese de 1,3-β-glicana e também à temperatura (Inshiguro et al., 1997).

Kellner et al. (2004) caracterizaram um homólogo do gene 1,3-β-glicana sintase em C.

posadasii (FKS1), cuja proteína predita apresenta alto grau de conservação com as 1,3-β-

glicana sintases de fungos filamentosos. O gene FKS1 de C. posadasii é expresso em níveis

similares em micélio e em culturas no início da formação das esférulas, e decresce quando as

esférulas estão maduras. Em Cryptococcus neoformans, o gene FKS1 apresenta similaridade

com os homólogos de outros fungos e parece ser a única cópia nesse organismo, sendo

essencial para a viabilidade (Thompson et al., 1999). Em Yarrowia lipolytica, o gene 1,3-β-

glicana sintase (YlFKS1) codifica uma proteína de 1.961 aa, que apresenta uma alta

homologia com as 1,3-β-glicana sintases em C. albicans, S. pombe, A. nidulans, C.

neoformans e P. brasiliensis. A análise de expressão do gene YlFKS1 em diferentes condições

afetando a parede celular não revelou diferenças significativas, mas foi demonstrado que

YlFKS1 é essencial para o crescimento, sugerindo que este é também o único homólogo em Y.

lipolytica (León et al., 2002). Em Fusarium solani, foi clonado e seqüenciado o gene FsFKS1,

que codifica uma proteína predita de 220 kDa, também com alto grau de similaridade (75 -

88%) às proteínas homólogas em Neurospora crassa, P. brasiliensis, A. fumigatus e S.

cerevisiae (Há et al., 2006).

Em P. brasiliensis, Pereira et al. (2000) caracterizaram um homólogo do gene 1,3-β-

glicana sintase. O gene Pbfks1 (número de acesso no GenBank AF148715) apresenta uma

ORF de 5.942 pb, interrompida por dois íntrons, o primeiro próximo à extremidade 5’ e o

segundo próximo à extremidade 3’ do gene. Em seus experimentos para analisar a estrutura de

genes de 1,3-β-glicana sintase de diferentes isolados de P. brasiliensis, Okamoto et al. (2006)

10



detectaram a expressão do gene Pbfks1 a partir da extração de RNA de culturas de levedura e

observaram que sete dos oito isolados analisados apresentam estruturas gênicas semelhantes a

respeito da posição dos introns, que geralmente é conservada em genes homólogos. De acordo

com Pereira et al. (2000), a seqüência deduzida de 1.926 aa constitui uma proteína predita de

212 kDa, que apresentou mais de 85% de similaridade à proteína FksAp de A. nidulans, e

71% de similaridade às proteínas Fks1p e Fks2p de S. cerevisiae. Análises computacionais de

1,3-β-glicana sintase de P. brasiliensis sugerem uma estrutura similar a uma proteína integral

de membrana, apresentando cerca de 16 hélices transmembrana, conforme as 1,3-β-glicana

sintases descritas. O putativo domínio catalítico predito é localizado no citoplasma e é

hidrofóbico, limitado por dois domínios compostos por seis e dez hélices hidrofóbicas. Apesar

de ter sido caracterizado um gene, outros dois fragmentos foram identificados e podem estar

relacionados a 1,3-β-glicana sintase. Experimentos de RT-PCR sugerem que transcritos de

Pbfks1 não são detectados em células crescidas em glicose, comportamento semelhante ao

que Mazur et al. (1995) relataram para FKS2 de S. cerevisiae (Pereira et al., 2000).

Uma classe de antifúngicos que inibem a síntese de 1,3-β-glicana sintase é formada

por lipopeptídeos conhecidos como equinocandinas e pnemocandinas (Onishi et al., 1999), e

vários organismos têm sido descritos como susceptíveis a essas drogas (Douglas et al., 1994;

Kelly et al., 1996). Arendrup et al. (2008) relataram que isolados de A. fumigatus que

apresentaram redução da suscetibilidade à caspofungina, droga pertencente à classe de

equinocandina, expressaram altos níveis de 1,3-β-glicana sintase em relação aos isolados

susceptíveis. Visto que a síntese de 1,3-β-glicana é importante para a estrutura da parede

celular, um maior conhecimento da regulação de 1,3-β-glicana sintase em P. brasiliensis será

de fundamental importância e poderá fornecer informações sobre a biologia desse fungo

patogênico.

1.3.2 – Quitina sintase 4

A quitina sintase é um proteína transmembrana que cataliza a polimerização de N-

acetilglicosamina (GlcNAc), a partir de UDP-GlcNAc do citoplasma, em cadeias de

polissacarídeo, constituido a quitina da parede celular. A síntese de quitina em fungos é um

processo complexo regulado por uma família multigênica. Baseado em diferenças em regiões

11



conservadas, as quitina sintases foram organizadas em sete classes, dentro de duas divisões.

Em P. brasiliensis, foram identificados seis genes de quitina sintase: Pbchs1 (classe I),

Pbchs2 (classe II), Pbchs3 (classe IV), Pbchs4 (classe VII), Pbchs5 (classe V) e Pbchs6

(classe VI) (revisto por San-Blas e Nino-Vega, 2008).

Em C. albicans a quitina é sintetizada por quatro quitina sintases, codificadas pelos

genes CaCHS1 (classe II), CaCHS2 e CaCHS8 (classe I), e CaCHS3 (classe IV). S.cerevisiae

apresenta três genes de quitina sintases, CHS1 (classe I), CHS2 (classe II) e CHS3 (Class IV)

(revisto por Munro et al., 2007).

Nino-Vega et al. (2004) caracterizaram o gene quitina sintase 4 de P. brasiliensis

(número de acesso no GenBank EF654132), que apresenta uma ORF de 5.322 pb,

interrompida por três íntrons. A análise da seqüência deduzida de 1.744 aa revelou a presença

de dois domínios distintos, sendo um domínio N-terminal com 30% de homologia com o

domínio myosin motor-like, e um domínio C-terminal com 68% de homologia com o domínio

quitina descrito para algumas quitina sintases da classe V. Entretanto, diferente das quitina

sintases de classe V, Pbchs4 não apresenta assinaturas características do domínio myosin

motor-like. Além disso, apesar do domínio quitina apresentar homologia com outras quitinas

de classe V, foi considerado que a quitina sintase 4 de P. brasiliensis pertence a uma outra

classe, denominada classe VII. A figura 2 mostra um filograma elaborado com quitina

sintases de fungos, indicando o posicionamento de Pbchs4 na classe VII.

12



Figura 2. Filograma de quitina sintases de fungos – As seqüências foram alinhadas usando

CLUSTAL W. Apenas o domínio C-terminal da quitina sintase foi utilizado para enzimas das

classes V e VII. Duas divisões e sete classes são apresentadas. Quitina sintases representativas

de todas as classes são mostradas. As seqüências foram obtidas no Gen-Bank. Ca, Candida

albicans; Wd, Wangiella dermatitidis; An, Aspergillus nidulans; Ao, Aspergillus oryzae; Bg,

Blumeria graminis; Gg, Glomerella graminicola; Um, Ustilago maydis; Pb, Phycomyces

blakesleeanus; Ci, Coccidioides immitis; Pbr, Paracoccidioides brasiliensis; Nc, Neurospora

crassa; Sc, Saccharomyces cerevisiae; Af, Aspergillus fumigatus; Mg, Magnaporthe grisea.

Modificado de Nino-Vega et al., 2004.

Em P. brasiliensis, apesar do maior conteúdo de quitina ser encontrado na forma de

levedura, os níveis de mRNA de Pbchs4 são maiores na forma de micélio. Nino-Vega et al.

(2000) analisaram a expressão dos genes Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4 e Pbchs5, e

verificaram que todos, exceto Pbchs3, são mais expressos na forma de micélio. O gene

Pbchs3 não foi expresso em níveis detectáveis.

Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, Sant’Ana (2008) demonstrou que

uma seqüência da região promotora de Pbchs4 que contém um sítio para o fator de transcrição

13



PacC, que regula a expressão gênica em resposta ao pH, e dois elementos de resposta ao

estresse (STRE), interage com extratos protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis. Foi

observada uma interação DNA-proteína específica nas fases de micélio e levedura e outra

interação micélio específica, conforme mostra a figura 3.

Figura 3. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética de uma seqüência da região

promotora do gene Pbchs4 com extratos protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis

– 1: sonda livre; 2: sonda + extrato protéico da forma de levedura, indicando uma interação;

3: sonda + extrato protéico da forma de levedura + competidor específico 50X; 4: sonda +

extrato protéico da forma de micélio, indicando uma interação similar à observada para a fase

de levedura e outra interação micélio específica; 5: sonda + extrato protéico da forma de

micélio + competidor específico 50X. Modificado de Sant’Ana (2008).

Esses resultados sugerem que essa região possa estar atuando na regulação

transcricional do gene quitina sintase 4 de P. brasiliensis, mas não determinaram se a

interação ocorre no sítio para PacC ou nos elementos de resposta ao estresse.

Em S. cerevisiae, apesar da quitina corresponder a uma pequena fração da parede

celular, o comprometimento na regulação da síntese desse componente pode afetar

profundamente o padrão de crescimento e morfologia da levedura. Além disso, o

comprometimento de outros genes da via de biossíntese da parede celular provoca o aumento

da deposição de quitina na parede (Popolo et al., 1997). Munro et al. (2007) relataram que a

regulação dos genes que codificam quitina sintases em C. albicans é controlada por PKC,

Calcineurina/Ca

e pela via HOG MAP quinase.

14



Em S. cerevisiae, a principal estratégia para lidar com a alta osmolaridade externa é o

aumento da concentração de glicerol. O acúmulo de glicerol é um mecanismo adaptativo que

permite às células adquirir água do ambiente e recuperar a pressão de turgor. A via HOG

MAP quinase responde ao estresse osmótico, e sua ativação induz a expressão de genes

requeridos para a adaptação osmótica, incluindo genes da biossíntese do glicerol (Albertin et

al., 1994). É proposto que a via HOG MAP quinase também está envolvida na regulação da

estrutura da parede celular de S. cerevisiae (Kapteyn et al., 2001) e C. albicans (Eisman et al.,

2006). Também já foi demonstrado que em C. albicans mutantes para caucineurina são mais

susceptíveis à caspofungina, sugerindo que a caucineurina está envolvida na via de

sinalização de resposta a danos na parede (Sanglard et al., 2003), e que em S. cerevisiae a

perda da função de PKC, que ativa a via de MAP quinase durante o estresse térmico, provoca

a lise celular (Kamada et al., 1995).

Por meio de ensaios de gene repórter lacZ, foi demonstrado que a expressão de quitina

sintases de C. albicans em mutantes para genes da via HOG MAP quinase, da via PKC MAP

quinase e calcineurina é alterada na presença de equinocandinas, que inibem a síntese de 1-3-

β-glicana sintase (Walker et al., 2008). Lenardon et al. (2009) analisaram os promotores dos

genes de quitina sintases de classe I de C. albicans e evidenciaram a presença de sítios para o

fator de transcrição Rlm1, e sugerem que a via de sinalização da integridade da parede celular

mediada por PKC pode atuar por meio desses elementos nesse organismo. Portanto, a síntese

de quitina parece estar regulada em resposta a danos causados na parede celular.

1.4 – Estudo de Promotores e Abordagens Experimentais

Na transcrição do mRNA, a etapa de iniciação é o principal ponto de regulação. Em

eucariotos, a iniciação da transcrição é governada pela RNA polimerase II e por fatores de

transcrição basais, que direcionam a transcrição basal, e também por fatores regulatórios que

se ligam em sítios a montante do sítio de iniciação e regulam a taxa de transcrição (revisto por

Conaway e Conaway, 1993). O complexo processo desenvolvido pela célula é regulado em

resposta a um sinal particular, que pode gerar a expressão gênica numa célula específica, num

determinado tempo, ou em certas condições ambientais. O reconhecimento de mudanças nas

condições do ambiente e a habilidade de se adaptar são essenciais para a viabilidade da célula.

A regulação da expressão gênica em resposta a um sinal particular pode ser modulada por

15



ativadores (revisto por Kodadek et al., 2006) ou repressores transcricionais (revisto por Rojo,

2001). A análise da maquinaria transcricional de um gene refere-se à delimitação da região

regulatória, o promotor, e à caracterização ou identificação dos fatores transcricionais que

nela atuam. A tabela 2 apresenta os sítios na região promotora dos genes 1,3-β-glicana sintase

e quitina sintase 4 de P. brasiliensis estudados neste trabalho.

Tabela 2. Sítios analisados na região promotora dos genese Pbfks1 e Pbchs4 – As

seqüências consenso reconhecidas pelos fatores de transcrição PacC, CreA e FacB e os

elementos de resposta ao choque térmico e ao estresse são apresentadas na fita molde e na fita

complementar. O sítio para o TATA Box é variável, e corresponde a seqüências ricas em

adenina e timina.

Fontes:

Espeso et al., 1997;

Cubero e Scazzocchio, 1994;

Todd et al., 1998;

Butler et al.,

2002;

Santoro et al., 1998;

Mager e Kuijiff, 1995.

Além da análise computacional da seqüência regulatória, o estudo de promotores

utiliza diversas outras metodologias, como o sistema de gene repórter lacZ e o ensaio de

retardo da mobilidade eletroforética (EMSA), utilizadas também neste trabalho.

1.4.1 – Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética (EMSA)

O ensaio de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA), metodologia também

conhecida como band shift, é uma das mais importantes abordagens experimentais para o

estudo da regulação da expressão gênica. A técnica é empregada para verificar se um extrato

16



protéico, proteína purificada ou proteína recombinante interage com uma determinada

seqüência de DNA. A estratégia fundamenta-se no fato de que a mobilidade eletroforética de

um ácido nucléico altera-se quando uma proteína se liga a ele. O ensaio detecta a formação in

vitro do complexo DNA-proteína e, para detectar o complexo, a sonda de DNA pode ser

marcada com radioatividade ou fluorescência. Nos ensaios clássicos, a proteína e o ácido

nucléico são incubados e a solução é submetida à eletroforese não desnaturante em gel de

poliacrilamida ou agarose. Em geral, o complexo DNA-proteína migra mais lentamente do

que o ácido nucléico livre.

Fragmentos clonados de DNA contendo cerca de 50 - 400 pb ou oligonucleotídeos

sintéticos de 20 - 70 nucleotídeos funcionam bem em EMSA, e apesar do DNA fita-dupla ser

freqüentemente utilizado, o DNA fita-simples também pode ser eficiente. Embora os longos

fragmentos de DNA apresentem seqüências regulatórias mais abrangentes, oligonucleotídeos,

que em geral contêm menos sítios de ligação, geram informações mais específicas. A escolha

das condições de obtenção do extrato protéico é governada pelo objetivo do estudo, e o

extrato protéico total ou nuclear é muito útil para a análise de elementos regulatórios do

promotor de um gene, embora a utilização de proteínas purificadas e proteínas recombinantes

revelem informações importantes sobre as interações (revisto por Laniel et al., 2001).

As interações DNA-proteína detectadas por EMSA não são necessariamente

específicas. Para discriminar um evento de ligação inespecífico de um específico são

realizados ensaios de competição. Nesses experimentos são utilizadas sondas não marcadas

(competidores específicos), idênticas às sondas marcadas. Se a interação inicial entre a sonda

marcada e a proteína for específica, o competidor específico adicionado à reação em

quantidades crescentes e superiores à sonda marcada irá se ligar preferencialmente à proteína,

e a visualização do complexo DNA-proteína será reduzida (revisto por Lin e Barbosa, 2002).

A figura 4 apresenta um esquema simplificado do princípio do EMSA.

17



Figura 4. Esquema ilustrativo do Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética – 1:

sonda livre; 2: sonda + proteína, ilustrando o complexo DNA-proteína, com maior massa

molecular; 3 e 4: sonda + proteína + competidor específico em concentração crescente,

ilustrando a redução da vizualização do complexo DNA-proteína, visto que a sonda marcada

tende a ficar na forma livre em função da competição com a sonda não marcada.

1.4.2– Sistema de Gene Repórter lacZ

O sistema de gene repórter é um método utilizado para se estudar a expressão gênica

permitindo avaliar o efeito que uma seqüência regulatória, artificialmente inserida a montante

do gene repórter, exerce sobre a transcrição deste último. A produção de proteína sintetizada

sob várias condições deve refletir a habilidade da seqüência regulatória inserida em promover

a transcrição. Os sistemas de gene repórter utilizados no estudo da expressão gênica incluem

os que codificam enzimas como cloranfenicol acetil-transferase, luciferase de vaga-lume,

fosfatase alcalina, proteína fluorescente verde e β-galactosidase bacteriana (revisto por Lin e

Barbosa, 2002).

A enzima β-galactosidase, codificada pelo gene lacZ da Escherichia coli, é um dos

sistemas repórter mais empregados para caracterizar sistemas regulatórios. A figura 5

apresenta o esquema ilustrativo do sistema gene repórter lacZ.

18



Figura 5. Esquema ilustrativo do sistema de gene repórter lacZ – A seqüência do

promotor em estudo sob a regulação de fatores de transcrição promove a transcrição do gene

lacZ, que codifica a proteína repórter β-galactosidase. O substrato X-gal presente no meio em

que o organismo transformado está sendo cultivado produz uma coloração azul ao ser clivado

pela β-galactosidase.

Conforme observamos na figura 6, no sistema de gene repórter lacZ a expressão desse

gene é governada pelo promotor em estudo, e a detecção da atividade de β-galactosidase pode

revelar a atividade promotora em diferentes condições.

1.5 – Utilização de Aspergillus nidulans como Hospedeiro Heterólogo para Estudo da

Regulação da Expressão Gênica

A transformação de microrganismos é uma importante estratégia para o estudo da

expressão gênica. Espécies de Aspergillus podem ser utilizadas como sistemas de expressão

para proteínas heterólogas, e utiliza-se a complementação homóloga de um marcador

auxotrófico. Para esse fim, freqüentemente são utilizados os genes pyrA de A. níger e argB de

A. nidulans, ambos considerados bons marcadores (revisto por Lenouvel et al., 2002). Em

nosso grupo de pesquisa, temos disponível uma linhagem de A. nidulans argB

, que apresenta

uma mutação no gene argB que a torna incapaz de ser cultivada em meio sem arginina.

A transformação eficiente de A. nidulans é uma ferramenta já descrita. Tilburn et al.

(1983) relataram a transformação de uma linhagem de A. nidulans que apresentava uma

deleção no gene da acetamidase. A transformação foi realizada mediante a incubação de

protoplastos, na presença de polietilenoglicol e CaCl

, com DNA plasmidial contendo o gene

19



funcional de acetamidase, sendo observada a integração desse DNA no genoma dos

transformantes. Além disso, o sistema de expressão da β-galactosidase, codificada pelo gene

lacZ de E. coli, também já foi descrito com sucesso em A. nidulans (van Gorcom et al., 1986),

demonstrando a viabilidade da fusão de seqüências regulatórias ao lacZ para estudos de

expressão gênica nesse hospedeiro. Punt et al. (1990) utilizaram o sistema de gene repórter

lacZ em A. nidulans e, realizando mutações no promotor, identificaram elementos na

seqüência promotora do gene gpdA desse organismo envolvidos na ativação transcricional. A

atividade da β-galactosidase foi mensurada a partir de extratos protéicos obtidos dos

transformantes cultivados em meio mínimo, sendo possível associar a atividade da β-

galactosidase a diferentes deleções no promotor.

É importante considerar também que há fatores inerentes ao sistema heterólogo que

podem interferir nos ensaios realizados, visto que o hospedeiro pode apresentar mecanismos

de regulação diferentes do modelo estudado. Em estudo realizado por Hsu et al. (2008), duas

das cinco construções utilizando o sistema gene repórter lacZ para analisar a expressão de

genes de lipases de C. albicans não induziram a atividade de β-galactosidase, sugerindo que

os fatores regulatórios necessários para expressão dos genes de C. albicans não estariam

presentes no hospedeiro, S. cerevisiae.

A. nidulans é um fungo ascomiceto, assim como P. brasiliensis. Ambos se apresentam

em clados relativamente próximos, conforme mostra o agrupamento de espécies de fungos

proposto pelo Fungal Genome Initiative (FGI) (Figura 6).

20



Figura 6. Agrupamento das espécies de fungos, de acordo com a proposta do Fungal

Genome Initiative (FGI) – A topologia da árvore representa a classificação de proximidade

entre os taxons selecionados. Os ramos não representam a divergência evolucionária. A.

nidulans e P. brasiliensis estão indicados pelas setas vermelhas. Modificado de Birren, 2003.

A indisponibilidade de um protocolo eficiente e reprodutível para transformação

genética de P. brasilienisis, a viabilidade de transformação de A. nidulans e a eficácia do

sistema gene repórter lacZ nesse organismo, a disponibilidade de uma linhagem argB

para

utilização de um marcador auxotrófico, e a relativa proximidade entre A. nidulans e P.

brasiliensis sustentaram nossa escolha por A. nidulans como hospedeiro heterólogo para

estudo da regulação da expressão gênica.

21



2 – OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

Os estudos de promotores são importantes para compreensão dos mecanismos de

regulação da transcrição. Não há dados disponíveis sobre a estrutura e regulação de

promotores de P. brasiliensis, de forma que a caracterização da seqüência promotora dos

genes 1,3-β-glicana sintase (Pbfks1) e quitina sintase 4 (Pbchs4) é objetivo deste trabalho, que

poderá agregar informações sobre a biologia desse fungo patogênico.

2.2– Objetivos Específicos

1) Avaliar a atividade promotora do gene Pbfks1 utilizando o sistema de gene repórter

lacZ em A. nidulans, verificando diferenças na produção da β-galactosidase quando os

transformantes são crescidos em diferentes fontes de carbono;

2) Avaliar a expressão do gene Pbfks1 em culturas de micélio e levedura, e em diferentes

fontes de carbono;

3) Avaliar se os sítios de ligação identificados na região promotora dos genes Pbfks1 e

Pbchs4 interagem com fatores de transcrição presentes nos extratos protéicos de

micélio e levedura de P. brasiliensis;

4) Avaliar se o sítio de ligação para o fator de transcrição PacC identificado na região

promotora do gene Pbchs4 é funcional e interage com a proteína recombinante que

contém o domínio de ligação ao DNA desse fator de transcrição.

22



3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Soluções e Soluções Tampão

3.1.1 – Soluções para Meios de Cultura de A. nidulans

Solução de Elementos Traço

.10H

O 104,80 μM

CuSO

.5H

O 1,60 mM

FeSO

.7H

O 2,57 mM

MoO

.2H

O 3,30 mM

ZnSO

.7H

O 27,80 μM

O volume foi completado com H

O destilada, e o pH ajustado para 2,0.

Solução de Sais

KCl 0,35 M

MgSO

.7H

O 0,04 M

0,56 M

Solução de Elementos Traço 50,00 mL

O volume foi completado com H

O destilada, e a solução autoclavada a 120°C,

durante 15 minutos.

Soluções Estoque de Suplementos (100X)

Cada um dos suplementos foi dissolvido em H

O bidestilada, e todas as soluções

esterilizadas por filtração em membrana de nitrocelulose com poros de 0,2 μm (Millipore). As

soluções foram preparadas nas seguintes concentrações (100X):

23



Solução Estoque de Tartarato de Amônio 9,20% (p/v)

Solução Estoque de Ácido Paraminobenzóico 0,02% (p/v)

Solução Estoque de D-biotina 0,01% (p/v)

Solução Estoque de L-metionina 2,98% (p/v)

Solução Estoque de Arginina 5,30% (p/v)

3.1.2 – Soluções Tampão para Transformação de A. nidulans

O volume das soluções foi completado com H

O destilada. A esterilização foi

realizada por filtração em membrana de nitrocelulose com poros de 0,2 μm (Millipore). As

soluções foram preparadas nas seguintes concentrações:

Solução A (para Tampão de Transformação 1)

MgSO

1,2 M

HPO

10,0 mM

Solução B (para Tampão de Transformação 1)

MgSO

1,2 M

NaH

10,0 mM

Tampão de Transformação 1

MgSO

1,2 M

10,0 mM

Para o preparo do tampão de transformação 1 misturou-se 80 mL da solução A com

aproximadamente 20 mL da solução B, até atingir o pH 5,8.

24



Tampão de Transformação 2

Sorbitol 0,6 M

Tris-HCl 100,0 mM

Ajustou-se o pH para 7,0.

Tampão de Transformação 3

Sorbitol 1,0 M

Tris-HCl 10,0 mM

Ajustou-se o pH para 7,5.

Tampão de Transformação 4

Sorbitol 1,0 M

Tris-HCl 10,0 mM

CaCl

10,0 mM

Ajustou-se o pH para 7,5.

Tampão de Transformação 5

PEG 8000 60,0 % (p/v)

Tris-HCl 10,0 mM

CaCl

10,0 mM

Ajustou-se o pH para 7,5.

25



3.1.3 – Soluções para Extração de DNA Total dos Transformantes de A. nidulans

Solução de Sais (extração de DNA)

Tris-HCl pH 7,5 100,0 mM

EDTA 5,0 mM

NaCl 1,4 M

DTT 1,0 mM

Imediatamente antes da utilização, adicionar RNAse para a concentração final de 100

g/mL.

Clorofil

Clorofórmio 24,0 v

Álcool Isoamílico 1,0 v

A solução foi homogenizada repetidas vezes com Tris-HCl 100 mM pH 7,6.

Clorofane

Fenol (equilibrado em pH 7,6) 1,00 v

Clorofórmio 1,00 v

ß-hidroxiquinolina 0,05% (p/v)

Equilibrou-se a solução com Tris-HCl 100 mM pH 7,6.

Tampão TE

Tris-HCl pH 8,0 10,0 mM

EDTA 1,0 mM

26



3.1.4 – Soluções para Extração de Proteínas de P. brasiliensis

Tampão de Lise

HEPES pH 7,5 25,0 mM

KCL 50,0 mM

MgCl

5,0 mM

EDTA 0,1 mM

Glicerina (v/v) 10,0 % (v/v)

DTT 0,5 mM

PMSF 1,0 mM

Pepstatina 1,0 μM

Leupeptina 0,6 μM

O DTT e os inibidores de protease PMSF, Pepstatina e Leupeptina foram adicionados

no momento da utilização do tampão.

Tampão de Eluição do Extrato Protéico

HEPES pH 7,9 25,0 mM

KCl 50,0 mM

MgCl

50,0 mM

EDTA 1,0 mM

DTT 1,0 mM

O DTT foi adicionado no momento da utilização do tampão

3.1.5 – Soluções para Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Desnaturante - SDS-PAGE

Solução de Policrilamida 30% (p/v)

Diluiu-se em H

O destilada acrilamida e bisacrilamida na proporção de 29:1,

respectivamente.

27



Tampão de amostra (2X)

Tris-HCl 200,0 mM pH 6,8

SDS 4,0% (v/v)

β-mercaptoetanol 4,0% (v/v)

Glicerol 20,0% (v/v)

Azul de bromofenol 0,1% (p/v)

Foram preparadas alíquotas de 1 mL, estocadas a -20°C.

Tampão de corrida (5X)

Tris Base 125,00 mM

Glicina 0,96 M

SDS 0,50 % (p/v)

Solução corante

Azul brilhante de Comassie R-250 0,25 % (p/v)

Metanol 30,00 % (v/v)

Ácido acético glacial 7,00 % (v/v)

Dilui-se em H

O destilada e filtrou-se em papel de filtro.

Solução descorante

Metanol 30,0 % (v/v)

Ácido acético glacial 7,0 % (v/v)

28



3.1.6 – Soluções para o Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética (EMSA)

Solução de Poliacrilamida

Acrilamida e bisacrilamida foram diluídas em H

O Milli Q na proporção de 30,00:0,36

(p/v), respectivamente, e a solução filtrada em membrana de nitrocelulose com poros de 0,45

μm (Millipore).

Solução de Alta Concentração de Sal para Purificação da Sonda

Tris Base 0,06 g

EDTA 0,02 g

NaCl 4,30 g

O volume foi completado com H

O destilada para 50 mL.

TEB 10X

Tris Base 54,0 g

Ácido Bórico 27,5 g

EDTA 15,0 g

O volume foi completado com H

O destilada para 500 mL, e ajustou-se o pH para 8,

(com Tris ou ácido bórico).

3.2 – Meios de Cultura

Meio LB

Extrato de Levedura 0,5 % (p/v)

Peptona de Caseína 1,0 % (p/v)

NaCl 1,0 % (p/v)

29



O volume foi completado com H

O destilada, e o pH ajustado para 7,0. Para meio

sólido, foi utilizado 1,4% (p/v) de ágar. A esterilização foi realizada em autoclave a 120°C,

durante 15 minutos.

Meio Fava-Neto

Protease peptona 0,3 % (p/v)

Peptona 1,0 % (p/v)

Extrato de carne 0,5 % (p/v)

NaCl 0,5 % (p/v)

Glicose 4,0 % (p/v)

Extrato de levedura 0,5 % (p/v)

Ágar 1,6 % (p/v)

O volume foi completado com H

O destilada, e o pH ajustado para 7,0. A esterilização

foi realizada em autoclave a 120°C, durante 15 minutos.

Meio YPD

Extrato de levedura 1,0 % (p/v)

Peptona de Caseína 2,0 % (p/v)

Glicose 2,0 % (p/v)

O volume foi completado com H

O destilada, e o pH ajustado para 7,2. A esterilização

foi realizada em autoclave a 120°C, durante 15 minutos.

Meio Mínimo para A. nidulans

Solução de Sais 2,0 % (v/v)

Glicose 1,0 % (p/v)

30



O volume foi completado com água de torneira, e o pH ajustado para 6,8. Para meio

sólido, foi utilizado 2% (p/v) de ágar. A esterilização foi realizada em autoclave a 120°C,

durante 15 minutos.

Meio Mínimo Base para Transformação de A. nidulans

Solução de Sais 2,0 % (v/v)

Glicose 1,0 % (p/v)

Sacarose 1,0 M

Ágar 2,0 % (p/v)

O volume foi completado com água de torneira, e o pH ajustado para 6,8. A

esterilização foi realizada em autoclave a 120°C, durante 15 minutos.

Meio Mínimo de Cobertura para Transformação de A. nidulans

Solução de Sais 2,00 % (v/v)

Glicose 1,00 % (p/v)

Sacarose 1,00 M

Agarose 0,35 % (p/v)

O volume foi completado com água de torneira, e o pH ajustado para 6,8. A

esterilização foi realizada em autoclave a 120°C, durante 15 minutos.

Meio Completo para A. nidulans

Solução de Sais 2,00 % (v/v)

Glicose 1,00 % (p/v)

Caseína hidrolisada 0,15 % (p/v)

Peptona 2,00 % (p/v)

Extrato de levedura 0,05 % (p/v)

31



O volume foi completado com água de torneira, e o pH ajustado para 6,8. A

esterilização foi realizada em autoclave a 120°C, durante 15 minutos.

3.3 – Linhagens Microbiológicas

3.3.1 – Escherichia coli

Para a transformação com o vetor gene repórter para preparação de plasmídeos em

larga escala foi utilizada a linhagem bacteriana E. coli XL10-Gold. Para a expressão do

domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P. brasiliensis foi utilizada a linhagem

bacteriana Escherichia coli BL21(DE3). Células termo-competentes das duas linhagens foram

previamente preparadas.

3.3.2 – Aspergillus nidulans

A linhagem de A. nidullans utilizada para transformação com o vetor gene repórter foi

a argB

: pabaA1, biA1, methG1, argB. Essa linhagem apresenta o gene argB mutado, o que

impossibilita o crescimento do fungo na ausência de arginina. O fungo foi cultivado em meio

mínimo ágar suplementado com tartarato de amônio, ácido paraminobenzóico, D-biotina, L-

metionina e arginina, todos na concentração final de 1X, e incubado a 30°C durante

aproximadamente 4 dias, até a esporulação. Os transformantes mitoticamente estáveis foram

mantidos nas mesmas condições, mas sem suplementação de arginina.

3.3.3 – Paracoccicidioides brasiliensis

Para obtenção de culturas de levedura e de micélio de P. brasiliensis, foi utilizado o

estoque de levedura do isolado Pb01 disponível no Laboratório de Biologia Molecular da

UnB. Foi feito um inóculo de leveduras na concentração final de 10

células/mL em meio

YPD, e a cultura foi crescida a 37°C sob agitação de 250 rpm, por uma semana. Para obtenção

de micélio, o mesmo inóculo de leveduras foi realizado, mantendo-se a cultura a 24°C por

32



uma semana para ocorrência da transição dimórfica, com um cultivo adicional de uma semana

para o crescimento do micélio.

3.4 – Vetor Gene Repórter

O vetor gene repórter 42B da série pAN923, utilizado na transformação de A. nidulans

neste trabalho, foi construído por van Gorcom et. al. (1986). O plasmídeo contém um sítio

para a enzima de restrição Bam HI que permite a clonagem do inserto de interesse a montante

do gene lacZ de E. coli. Após a transformação da linhagem argB

de A. nidulans, o vetor que

carrega o gene argB é integrado com uma alta eficiência ao lócus argB do genoma,

geralmente como uma cópia única (van Gorcom, 1986). A figura 7 apresenta em esquema do

vetor gene repórter utilizado em nosso trabalho.

Figura 7. Esquema dos vetores da série pAN923 – Fragmentos de promotores podem ser

clonados a montante do lacZ. Linhas espessas representam DNA de Aspergillus; linhas finas

representam DNA de E. coli. B, Bam HI; Bg, Bgl II; E, Eco RI; H, Hind III; N, Nru I; P, Pst I;

S, Sal I; Sp, Sph I; X, Xho I; Xb, Xba I. Retirado de van Punt et al., 1990.

Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, com a participação de Thiago

Daison e Carine Pessoa, foram desenhados oligonucleotídeos para a amplificação da região

promotora dos genes 1,3-β-glicana sintase (Pbfks1) e de quitina sintase 4 (Pbchs4) de P.

brasiliensis, criando nas extremidades 5’ e 3’ sítios para a enzima de restrição Bam HI. As

33



seqüências foram clonadas no vetor pGEM-T, seqüenciadas e transferidas para o vetor gene

repórter 42B da série pAN923, a montante do gene lacZ.

3.5 – Sistema de Gene Repórter lacZ para Análise da Região Promotora do gene 1,3-β-

glicana sintase de P. brasiliensis

3.5.1 – Preparação de Células de E. coli Termo-Competentes

Foi feito um pré-inóculo de uma colônia individual de E. coli XL10-Gold em 5 mL de

meio LB com ampicilina a 100 μg/mL, incubado por 18 horas a 37°C sob agitação de 250

rpm. A partir do pré-inóculo, foi feito um inóculo de 500 μL em 50 mL de meio LB, com

incubação a 37°C sob agitação de 250 rpm até atingir a OD

600

de 0,2 a 0,3 (início da fase

exponencial de crescimento bacteriano). Coletou-se a cultura por centrifugação a 5.000 g a

4°C por 10 minutos, descartando-se o sobrenadante e ressuspendendo-se o sedimento com

suave agitação em 10 mL de solução de CaCl

100 mM e glicerol 15% gelada. Todo o

procedimento foi realizado mantendo a suspensão de células no gelo. O material foi

submetido a uma centrifugação nas mesmas condições anteriores. Ressuspendeu-se o

sedimento em 1 mL da solução CaCl

100 mM e glicerol 15% gelada. Foram feitas alíquotas

de 100 μL para estocagem a -80°C.

3.5.2 – Transformação de E. coli com o Vetor Gene Repórter

A transformação da linhagem XL10-Gold de E. coli com o vetor gene repórter

contendo a região promotora do gene Pbfks1 foi realizada por choque térmico. A 100 μl de

células competentes adicionou-se gentilmente 50 ng do plasmídeo e incubou-se no gelo por 1

hora. Posteriormente, as células foram incubadas em banho a 42°C por 90 segundos e,

imediatamente após esse período, foram transferidas para o gelo. Adicionou-se 1 mL de meio

LB à mistura de transformação, que foi incubada a 37°C sob agitação de 250 rpm por 1 hora.

Foram semeados 200 μL da solução de transformação e o restante do material foi

centrifugado a 3.000 g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células

ressuspendidas em 350 μL de meio LB, semeando-se 200 μL e 150 μL da ressuspensão. As

três semeaduras foram feitas em meio LB ágar contendo ampicilina a 100 μg/mL, com

34



posterior incubação em estufa a 37°C por 16 horas. Os clones selecionados foram inoculados

em 5 mL de meio LB contendo ampicilina a 100 μg/mL e incubados a 37°C sob agitação de

250 rpm por 16 horas. Posteriormente, para estocagem a -80°C, foram utilizados 500 μL de

cultura armazenados com 500 μL de glicerol 70% estéril.

3.5.3– Preparação de Plasmídeos em Larga Escala

A partir das células transformadas com o vetor gene repórter contendo a região

promotora do gene Pbfks1, foi realizada uma preparação de plasmídeos em larga escala. Foi

feito um pré-inóculo de 10 μL das células armazenadas em glicerol em 5 mL de meio LB,

contendo ampicilina a 100 μg/mL, e incubou-se a 37°C sob agitação de 250 rpm por 16 horas.

Posteriormente, foi feito um inóculo de 400 μL da cultura crescida a partir do pré inóculo em

500 mL de meio LB, contendo ampicilina a 100 μg/mL, e incubou-se a 37°C sob agitação de

250 rpm por 16 horas. A preparação de plasmídeos em larga escala foi feita utilizando-se o

Plasmid Maxi Kit (QIAGEN), conforme instruções do fabricante. O DNA plasmidial obtido

na preparação foi posteriormente utilizado para a transformação genética de A. nidulans.

3.5.4 – Digestão do Vetor Gene Repórter

O produto obtido na preparação de plasmídeos em larga escala foi digerido com a

enzima de restrição Bam HI (Promega) para confirmação do perfil de restrição, esperando-se

a liberação do inserto correspondente ao fragmento do promotor do gene Pbfks1 clonado no

vetor gene repórter. A reação de digestão foi realizada em um volume final de 20 μL,

contendo 1 μg do vetor, 10 unidades da enzima Bam HI e 1X do tampão da enzima. A reação

foi incubada em banho à 37°C por 3 horas. A digestão foi analisada por eletroforese em gel de

agarose 0,8% corado com brometo de etídeo 0,5 μg/mL.

35



3.5.5 – Preparação de Protoplastos e Transformação de A. nidulans com o Vetor Gene

Repórter

Para preparação de protoplastos, os esporos de A. nidulans crescido em placa contendo

o meio mínimo foram coletados com Tween 80 0,01%. Foi feito um inóculo de 10

esporos

em 250 mL de meio mínimo suplementado com as soluções de tartarato de amônio, ácido

paraminobenzóico, D-biotina, L-metionina e arginina, todos na concentração final de 1X, com

posterior incubação a 30°C sob agitação de 250 rpm por 16 horas. O micélio foi coletado por

filtração em tecido estéril e lavado com água de torneira autoclavada gelada, e em seguida

ressuspendido em 10 mL de Tampão de Transformação 1 pré-resfriado. O micélio foi

submetido a uma vigorosa agitação em tubo Falcon a fim de desfazer os grumos e otimizar o

acesso das enzimas às células na etapa posterior. Após ser transferido para frasco Erlenmeyer,

adicionou-se 2 mL de solução estéril de Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum

(SIGMA) a 20 mg/mL em Tampão de Transformação 1, e 300 μL de solução de albumina

sérica bovina estéril a 10 mg/mL, também em Tampão de Transformação 1. Após incubação

de 5 minutos no gelo, o micélio foi incubado a 30°C sob agitação de 250 rpm por 2 horas,

sendo ressuspendido com pipeta de 5 mL a cada 30 minutos para otimizar a lise da parede

celular. A formação dos protoplastos foi observada ao microscópio óptico. Após o período de

incubação, foi feita uma filtração em gaze e posteriormente outra em lã de vidro para

aumentar o grau de pureza da solução de protoplastos, removendo restos de micélio. Os

protoplastos foram então transferidos para tubo Corex, e adicionados cuidadosamente 10 mL

de Tampão de Transformação 2. As centrifugações posteriores foram realizadas em rotor

swing-out na centrífuga SORVAL (RC-5 Super Speed Refrigerated). Foi realizada uma

centrifugação a 670 g por 10 minutos a 4°C para formação de um gradiente, de forma a obter

os protoplastos na interface do tampão. Os protoplastos foram coletados utilizando-se pipeta

Pasteur de vidro e transferidos para um novo tubo Corex. Foram adicionados 15 mL de

Tampão de Transformação 3 seguindo-se uma centrifugação a 1.200 g por 10 minutos a 4°C.

O sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado duas vezes em 15 mL de Tampão de

Transformação 4, submetido a centrifugação de 1.200 g por 10 minutos a 4°C.

Posteriormente, os protoplastos foram ressuspendidos em um volume apropriado de Tampão

de Transformação 4 de modo a se obter uma concentração de 10

a 10

protoplastos/μL.

36



Para a transformação genética de A. nidulans, 10 μg de vetor gene repórter contendo a

região promotora do gene Pbfks1, previamente dissolvidos em Tampão de Transformação 4,

foram misturados cuidadosamente com 100 μL da solução de protoplastos. Foram

adicionados 50 μL de Tampão de Transformação 5 e a mistura foi realizada gentilmente, com

posterior incubação no gelo por 20 minutos. Mais 0,5 mL de Tampão de Transformação 5

foram adicionados cuidadosamente, e em seguida foi feita uma nova incubação à temperatura

ambiente por 20 minutos. A solução de transformação foi centrifugada a 13.000 g por 5

minutos, e o sobrenadante removido por aspiração. Uma nova centrifugação a 13.000 g por 1

minuto foi realizada para remoção do tampão remanescente. A transformação foi

ressuspendida em 200 μL de Tampão de Transformação 4 e adicionada a 3 mL de meio

mínimo de cobertura fundido e mantido a 45°C. O meio foi vertido sobre placas de meio

mínimo base e incubado em estufa a 30°C por 3-4 dias para crescimento dos transformantes.

Para transformação com o vetor do sistema gene repórter, e também para a transformação

com vetor sem inserto como controle, o meio mínimo de cobertura e o meio mínimo base

foram suplementados com as soluções de tartarato de amônio, ácido paraminobenzóico, D-

biotina, L-metionina e arginina, todos na concentração final de 1X. Para o teste da viabilidade

de protoplastos, o protocolo de transformação foi realizado sem adição de DNA, e os meios

suplementados com todos os requerimentos auxotróficos descritos acima, acrescentando-se

arginina.

3.5.6 – Ensaio de Estabilidade Mitótica

A fim de selecionar transformantes mitoticamente estáveis, foram realizadas 4

semeaduras em meio mínimo ágar sem arginina, alternadas por semeaduras em meio mínimo

ágar com arginina. Dessa forma, espera-se selecionar os transformantes que tenham integrado

o DNA plasmidial no genoma, visto que mantiveram a marca de seleção na ausência de

pressão seletiva. Os suplementos tartarato de amônio, ácido paraminobenzóico, D-biotina, L-

metionina foram utilizados na concentração final de 1X, assim como a arginina, quando

necessário.

37



3.5.7 – Extração de DNA Total dos Transformantes de A. nidulans

Para extração de DNA total, os esporos dos transformantes crescidos em placas

contendo o meio mínimo foram inoculados em 50 mL de meio completo e incubados sob

agitação de 250 rpm, a 30°C, durante a noite.

O micélio foi filtrado e macerado com N

líquido em gral e pistilo de porcelana. Foram

adicionados 500 μL de solução de sais e o material foi submetido a uma vigorosa agitação.

Posteriormente, o macerado foi incubado a 75°C por 10 minutos, e novamente submetido a

uma agitação. Foram adicionados 500 μL de clorofane, e após a homogeneização o material

foi centrifugado 13.000 g por 10 minutos. A fase aquosa foi coletada e foi adicionado 1 mL de

clorofil, com centrifugação nas mesmas condições anteriores. A extração com o clorofil foi

realizada 2 vezes . O DNA foi precipitado em 1 mL de isopropanol e resuspendido em tampão

TE.

3.5.8 – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para Amplificação de um Fragmento do

Promotor do Gene Pbfks1 dos Transformantes de A. nidulans

Para a confirmação da transformação de A. nidulans com o vetor gene repórter

contendo a região promotora do gene Pbfks1, o DNA extraído dos transformantes foi

submetido a uma PCR. Utilizou-se um conjunto de iniciadores específicos para a amplificação

de um fragmento do promotor do gene Pbfks1 (tabela3).

Tabela 3. Oligonucleotídeos utilizados na PCR para amplificação de um fragmento do

promotor do gene Pbfks1 dos transformantes de A. nidulans – As sequências dos

oligonucleotídeos forward e reverse são apresentadas.

Os oligonucleotídeos foram desenhados a partir do DNA genômico de P. brasiiensis, e apresentam

sítios artificialmente inseridos para a enzima de restrição Bam HI requeridos para a clonagem no vetor

gene repórter. A Tm (melting temperature) foi obtida pela ferramenta Oligo Analyser, disponível em

http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

38



A reação de PCR foi realizada em um volume final de 25 μL, contendo 1 μL de DNA

extraído (item 3.5.7), 0,2 mM de dNTPs; 0,8μM dos iniciadores específicos para o promotor,

0,5 U da enzima Taq polimerase (CENBIOT), 1X de tampão da enzima (CENBIOT), e 2,0

mM de cloreto de magnésio (CENBIOT). As reações foram submetidas ao seguinte programa

no termociclador: 1) 94°C/2 min; 2) 94°C/40 seg; 3) 55°C/40 seg; 4) 72°C/1 min; 5) 30

repetições a partir do passo 2; 6) 72°C/5 min; 7) 4°C (fim da PCR).

Os produtos da PCR foram analisados em eletroforese em gel de agarose 0,8% corado

com brometo de etídeo (0,5 μg/mL).

3.5.9 – Ensaio em Placa da Atividade de β-galactosidase

Os transformantes de A. nidulans que apresentaram resultado positivo na amplificação

de um fragmento do promotor d o gene Pbfks1 foram submetidos ao ensaio em placa para

detecção da atividade de β-galactosidase. Os transformantes foram cultivados em meio

mínimo ágar suplementado com tartarato de amônio, ácido paraminobenzóico, D-biotina, L-

metionina, todos na concentração final de 1X, e incubados a 30°C durante aproximadamente

24 horas para obtenção de micélio. Posteriormente, pequenos fragmentos de micélio foram

transferidos com ajuda de palito estéril para as placas contendo meio mínimo ágar sem

glicose, com acréscimo dos suplementos descritos acima e X-gal a 40 μg/mL. Foram testadas

como fontes de carbono: glicose e acetato de sódio na concentração final de 2%. Cada fonte

de carbono foi adicionada ao meio durante a preparação das placas. Os transformantes foram

incubados a 30°C por aproximadamente 3 dias.

3.6 – Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética para Análise da Região

Promotora dos Genes 1,3-β-glicana sintase e quitina sintase 4 de P. brasiliensis

3.6.1 – Extração de Proteínas de P. brasiliensis

As culturas de levedura e de micélio (item 3.3.3) foram centrifugadas a 3.000 g por 5

minutos, e o sobrenadante descartado. As células foram maceradas com nitrogênio líquido em

39



gral e pistilo de porcelana, e imediatamente foram adicionados 4 mL de tampão de lise. O

material foi submetido a uma vigorosa agitação em tubo Falcon com pérolas de vidro a fim de

otimizar a quebra da parede celular. Posteriormente, o material foi sonicado na potência de

70% com 2 pulsos de 59 segundos, com 3 repetições, mantendo-se a preparação sempre no

gelo. Em seguida, foi adicionado (NH

)

na concentração final de 0,4 M, e o material

submetido a uma centrifugação a 25.000 g por 90 minutos, a 4°C. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi coletado e adicionou-se (NH

)

em pó na concentração final de 0,405

g/mL, seguindo-se uma nova centrifugação a 7.600 g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante

foi descartado e o precipitado ressuspendido em 2 mL de tampão de eluição do extrato

protéico. A coluna de dessalinização (PD 10 column Pharmacia Biotech) foi equilibrada com

25-30 mL de tampão de lise, tomando-se o cuidado de não deixar a coluna secar. Os 2 mL da

preparação de extrato protéico foram então aplicados na coluna. O material foi eluído com 3,5

mL do tampão de lise, e as frações coletadas em tubo eppendorf contendo glicerol na

concentração final na ordem de 20%.

3.6.2 – Produção e Purificação do Domínio de Ligação ao DNA da Proteína PacC de P.

brasiliensis

Para a produção da proteína recombinante PacCPb-GST (39,2 kDa: 13,2 kDa do

domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P. brasiliensis + 26 kDa da proteína

Glutationa-S-transferase), a clonagem do domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P.

brasiliensis no vetor de expressão foi realizada previamente por Thiago de Melo em nosso

grupo de pesquisa, de acordo com as seguintes especificações: a região correspondente ao

domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P.brasiliensis foi amplificada a partir do

cDNA de P.brasiliensis (o iniciador foward apresentava um sítio de Bam HI e o iniciador

reverse um sítio de Xho I). O amplicon de P.brasiliensis possui 349 pb. O inserto foi clonado

inicialmente no pGEM-T, seqüenciado e subclonado no vertor de expressão pGEX-4T2, por

meio de uma clonagem direcionada Bam HI/Xho I.

Preparo de células competentes e transformação

Para a produção da proteína recombinante PacCPb-GST foi utilizada a linhagem

bacteriana E. coli BL21(DE3). Esta linhagem bacteriana não possui marca de seleção.

40



Portanto, os meios de cultivo para manutenção da cultura e para a preparação de células

competentes foram preparados sem antibiótico. Para transformação com o vetor de expressão

pGEX-4T2 (contendo a construção PacCPb-GST), as alíquotas de células competentes de

BL21(DE3) foram preparadas na hora, não se utilizando estoques congelados. Utilizou-se o

protocolo padrão para preparação de células competentes e transformação por choque térmico

(semelhante aos itens 3.5.1 e 3.5.2).

Seleção dos clones produtores

Foram preparadas placas de meio LB ágar, uma contendo ampicilina (100 µg/mL) e a

segunda contendo ampicilina e 1 mM de IPTG. Os clones transformantes foram semeados nas

duas placas, e estas armazenas a 37ºC por 6-7 horas. Os clones que apresentaram menor

crescimento na placa com IPTG, mas que cresceram normalmente na placa apenas com

ampicilina, foram selecionados para o pré–inóculo (4 clones). Os pré-inóculos foram

realizados em frasco de cultura contendo 4 mL de meio LB suplementado com ampicilina

(100 µg/mL), e incubados a 37 ºC por 6 horas, sob agitação. Foram transferidos 50 µL do pré-

inóculo para frasco contendo 50 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 µg/mL),

com posterior incubação sob agitação a 250 rpm, a 37 ºC durante a noite. Em 250 mL de meio

LB (em frasco de 1.000 mL), suplementado com ampicilina (100 µg/mL), foram inoculadas

as bactérias crescidas durante a noite (escolhidos 2 dos 4 inóculos da noite anterior) para uma

600

= 0,2 – 0,3. Os inóculos foram incubados a 37 ºC até que a OD

600

atingisse 0,6. A

indução da expressão protéica foi feita pela adição de IPTG 0,1 mM final, com incubação a

30ºC por 5 horas, sob agitação de 250 rpm. As culturas foram centrifugadas a 3.000 g a 4 ºC,

por 10 minutos.

Equilíbrio da Coluna de GST-Sefarose (GE Healthcare) – GSTrap FF 1mL

A coluna foi lavada com 25 mL de tampão de equilíbrio [PBS pH 7,3 (NaCl 140 mM;

KCl 2,7 mM; Na

HPO

10 mM; KH

1,8 mM)] a uma taxa de 2 mL/min. O sedimento de

células obtido a partir dos clones produtores foi ressuspendido em 4 mL de tampão de

equilíbrio, adicionando-se inibidores de protease (Pepstatina 1 µM, Leupeptina 2 µM, PMSF

10 µM) imediatamente antes do uso, e transferido para tubo de centrífuga de 40 mL.

Adicionou-se 0,1 V de uma solução de 10 mg/mL de lisozima em 25mM de Tris-HCl pH 8.0.

41



Foi realizada uma sonicação da solução nas seguintes condições: potência 40%, pulse on: 59

segundos, pulse off: 2 segundos, mantendo-se o tubo no gelo. O procedimento foi repetido 2

vezes. A suspensão foi centrifugada a 2.350 g por 10 min, a 4 ºC. O sobrenadante foi filtrado

em membrana de 0,45 µM e transferindo para tubo Falcon novo. Uma alíquota do lisado

celular foi guardada para análise posterior em gel de policacrilamida.

Recuperação das proteínas recombinantes

A solução de proteínas filtrada foi aplicada na coluna de GST-sefarose a uma taxa de

0,5-1 mL/min. Sugere-se, caso a solução esteja muito viscosa, que a amostra seja diluída em

PBS contendo os inibidores de protease (conforme a etapa seguinte). A coluna foi lavada com

20 mL de PBS contendo inibidores de protease (Pepstatina 1 µM, Leupeptina 2 µM, PMSF 10

µM), adicionados imediatamente antes do uso. A lavagem da coluna foi feita a uma taxa de 1

mL/min. As proteínas foram eluídas com 5-10 mL de Tampão de Eluição (Tris-HCl 50 mM,

pH 8,0; Glutationa reduzida 10 mM), contendo inibidores de protease (Pepstatina 1 µM,

Leupeptina 2 µM, PMSF 10 µM), adicionados imediatamente antes do uso. As frações foram

coletadas em tubo tipo eppendorf contendo glicerol (a concentração final de glicerol deve ser

da ordem de 20%). As alíquotas foram estocadas a -80°C. A análise das proteínas foi feita em

gel de poliacrilamida SDS-PAGE.

3.6.3 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Desnaturante - SDS-PAGE

A análise de proteínas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE foi realizada conforme as

condições descritas por Azevedo et al., 2003. A preparação do gel de poliacrilamida foi

realizada de acordo com o seguinte protocolo:

Reagente

Gel Separador 12% Gel Concentrador 5%

O destilada 3,30 mL 3,40 mL

Acrilamida/Bisacrilamida 30% (29:1) 4,00 mL 0,83 mL

Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 2,50 mL -

Tris-HCl 1,0 M pH 6,8 - 0,63 mL

SDS 10% 100,00 µL 50,00µL

TEMED 4,00 µL 5,00 µL

Persulfato de amônio 10% 100,00 µL 50,00 µL

42



Para montagem do gel, primeiramente foi realizada a polimerização do gel separador,

(preenchendo aproximadamente 2/3 da placa), cobrindo a superfície com butanol. Após a

polimerização, o butanol foi descartado e a placa lavada com H

O destilada. Em seguida, foi

realizada a polimerização do gel concentrador. Após a polimerização, a cuba foi preenchida

com tampão de corrida 1X e os poços do gel foram lavados exaustivamente com esse tampão

a fim de retirar resíduos de poliacrilamida não polimerizada. As amostras de proteínas foram

fervidas em tampão de amostra 1X por 5 minutos, e aplicadas no gel. A eletroforese procedeu

a 25 mA até que o azul de bromofenol, presente no tampão de amostra, começasse a sair da

placa. Após a corrida eletroforética, o gel foi mantido na solução corante durante a noite.

Posteriormente, o gel foi lavado com solução descorante, trocando-se a solução até que a

resolução do gel fosse satirfatória para vizualização.

3.6.4 – Análise da Seqüência Promotora dos Genes Pbfks1 e Pbchs4 e Desenho das

Sondas para EMSA

A análise da seqüência promotora dos genes Pbfks1 (número de acesso no GenBank

AF148715) e de Pbchs4 (número de acesso no GenBank EF654132) foi realizada visando a

busca de sítios para os fatores de transcrição PacC, CreA e FacB, e também para os elementos

de resposta ao estresse (STRE) e para os elementos de resposta ao choque térmico (HSE).

Submetemos a seqüência dos oligonucleotídeos utilizados como sondas para análise no site

TESS (Transcription Element Search System, disponível em http://www.cbil.upenn.edu/cgi-

bin/tess/tess). Essa ferramenta prediz sítios de ligação para fatores de transcrição presentes na

seqüência submetida, utilizando os bancos de dados TRANSFAC, JASPAR, IMD, e/ou

CBIL-GibbsMat. O resultado fornecido pelos bancos de dados foi analisado para triagem em

busca de sítios que de fato sejam relevantes para o organismo em estudo, visto que os

resultados fornecem sítios para fatores de transcrição de diversos organismos.

Para cada sonda referente à região promotora dos genes Pbfks1 ou Pbchs4, foram

sintetizados 2 oligonucleotídeos senso, sendo um marcado com fluorescência para uso nas

reações e outro não marcado para ensaios de competição específica; e um oligonucleotídeo

anti-senso para realização do anelamento com as sondas senso. Para o ensaio de competição

com sondas mutadas também foram desenhados oligonucleotídeos senso e anti-senso, ambos

não marcados com fluorescência. Em nossos ensaios, também testamos sondas de Humicola

43



grisea referentes ao promotor do gene PacC desse organismo (HgPacC). A tabela 4 apresenta

as sequências dos oligonucleotídeos utilizados em EMSA.

Tabela 4. Sondas utilizadas em EMSA - Sequências dos oligonucleotídeos utilizados nos

ensaios de retardo da mobilidade eletroforética. Os oligonucleotídeos indicados por FAM

foram marcados com fluoróforo carboxifluoresceína.

As sondas de H. grisea foram gentilmente cedidas por Thiago de Melo.

3.6.5 – Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética (EMSA)

Eletroforese

A preparação do gel de poliacrilamida para os ensaios de retardo da mobilidade

eletroforética foi realizada de acordo com o seguinte protocolo:

Poliacrilamida 30,36% 7,500 mL

Glicerina 50% 7,500 mL

TEB 10X 1,125 mL

O destilada 22,500 mL

Persulfato de amônio 25% 100,000 μL

TEMED 25,000 μL

44



Para montagem do gel e corrida eletroforética empregou-se o sistema SE 600

Electroforesis Unit (Amershan Biosciences). Após a polimerização do gel, a cuba foi

preenchida com TEB 0,25X, os poços do gel lavados exaustivamente com esse tampão a fim

de retirar resíduos de poliacrilamida não polimerizada, e realizou-se uma pré-corrida a 500 V

durante 15 minutos. Visando manter a temperatura baixa durante a eletroforese, o sistema foi

resfriado com auxílio de uma coluna de água fria, com dispositivo apropriado conectando

uma fonte de água com a cuba de eletroforese. Posteriormente, as reações foram aplicadas no

gel, aplicando-se azul de bromofenol em um poço para acompanhamento visual da corrida. A

eletroforese procedeu a 500V até que o azul de bromofenol migrasse por aproximadamente 10

cm. Após a corrida eletroforética, o gel foi analisado no scanner Typhoon 9210 (Molecular

Dynamics) de acordo com os seguintes parâmetros: filtro: fluoresceína 526SP, intensidade de

1000 V, sensibilidade: alta, pixel size de 200 microns e plano focal plane.

Anelamento

Sonda marcada

O oligonucleotídeo senso marcado com fluorescência e o oligonucleotídeo anti-senso

foram diluídos em H

O MilliQ na concentração final de 1μg/μL. A reação de anelamento das

sondas foi realizada de acordo com o seguinte protocolo:

Oligonucleotídeo senso 0,5 μL (0,5 μg)

Oligonucleotídeo anti-senso 0,5 μL (0,5 μg)

Tampão de Anelamento (Tris-HCl 1 M, pH 7,7) 6,0 μL

O MilliQ 23,0 μL

Para os ensaios de competição específica ou com sondas mutadas, os

oligonucleotídeos foram diluídos em H

O MilliQ na concentração final de 5μg/μL. A reação

de anelamento das sondas foi realizada de acordo com o seguinte protocolo:

45



Competidores 25 X

Oligonucleotídeo senso 2,5 μL (12,5 μg)

Oligonucleotídeo anti-senso 2,5 μL (12,5 μg)

Tampão de Anelamento (Tris-HCl 1M, pH 7,7) 6,0 μL

O MilliQ 19,0 μL

Competidores 50 X

Oligonucleotídeo senso 5,0 μL (25,0 μg)

Oligonucleotídeo anti-senso 5,0 μL (25,0 μg)

Tampão de Anelamento (Tris-HCl 1M, pH 7,7) 6,0 μL

O MilliQ 14,0 μL

As reações de anelamento foram incubadas em água fervente por cinco minutos e

mantidas no banho até que a temperatura diminuísse naturalmente, atingindo a temperatura

ambiente.

Purificação da sonda marcada com fluorescência

A purificação da sonda marcada (após anelamento) foi realizada para remoção de

contaminações com oligonucleotídeos de fita simples, autoanelados e produtos de degradação.

Os 30 μL de oligonucleotídeos anelados foram divididos em 3 alíquotas, e aplicados no gel de

poliacrilamida, conforme as condições descritas para a eletrofore dos ensaios de retardo da

mobilidade eletroforética. Aplicou-se azul de bromofenol em um poço para acompanhamento

visual da corrida. A corrida eletroforética procedeu-se até que o azul de bromofenol migrasse

por aproximadamente 2/3 do gel, para que houvesse uma melhor separação da sonda anelada

dos resíduos de contaminação,

Após a corrida, o gel foi marcado a cada 1 cm utilizando-se uma lâmina de bisturi e

analisado em scanner Typhoon 9210 (Molecular Dynamics) de acordo com os seguintes

parâmetros: filtro fluoresceína 526SP, intensidade de 1000 V, sensibilidade média, pixel size

de 200 microns e plano focal plane. Com auxílio das marcações previamente realizadas, a

46



região correspondente à sonda anelada foi localizada, excisada do gel, transferida para um

colchão de agarose 1%, e coberta com agarose fundida. Após a solidificação da agarose, foi

feito um corte na agarose logo abaixo dos fragmentos de poliacrilamida e encaixou-se um

fragmento de membrana DEAE celulose (Sartobind Membrane Adsorbers, Sartorius),

utilizando agarose fundida para selar essa região perfurada. O gel foi coberto com TEB 0,5X.

Para a migração da sonda da poliacrilamida para a membrana DEAE celulose, foi realizada

uma eletroforese a 90 V por 80 minutos. Após a migração da sonda para a membrana, esta foi

transferida para um tubo eppendorf de 1,5 mL, submersa em 250 μL de solução de alta

concentração de sal e incubada a 45°C durante 20 minutos. A solução contendo a sonda eluída

foi transferida para novo tubo, repetindo-se a eluição com a mesma membrana e nova solução

de alto sal. Os dois volumes foram agrupados e a sonda precipitada com 1 mL de etanol 100%

gelado, com incubação a -20ºC durante a noite. Seguiu-se uma centrifugação a 13.000 g por

30 minuto, lavagem com etanol 70% gelado e secagem ao ar. A sonda precipitada foi

ressuspendida em 30 μL de H

O Milli Q. Para confirmação da purificação da sonda, 1 μL foi

aplicado no gel de poliacrilamida. Aplicou-se azul de bromofenol em um poço para

acompanhamento visual da corrida. A eletroforese procedeu a 500V até que o azul de

bromofenol migrasse por aproximadamente 10 cm. Após a corrida eletroforética, o gel foi

analisado no scanner Typhoon 9210 (Molecular Dynamics) de acordo com os seguintes

parâmetros: filtro: fluoresceína 526SP, intensidade de 600 V, sensibilidade: média, pixel size

de 200 microns e plano focal plane.

Reação do EMSA

A reação foi realizada de acordo com o seguinte protocolo:

Sonda anelada e purificada 1 μL

KCl 1M 2 μL

ZnCl

50μM 1 μL

poli(dI-dC) 1μg/mL 1 μL

Espermidina 80mM 1 μL

O Milli Q 4 μL

47



Para reações utilizando competidores específicos ou sondas mutadas, foi realizada a

mesma reação, adicionando-se 1 μL do competidor 25X ou 50X, ou 2 μL do competidor 50X

para ensaio com competidor 100X, ajustando-se o volume de H

O Milli Q.

Foram adicionados à mistura de reação o extrato protéico ou proteína recombinante,

ajustando-se o valor final da reação para 20 μL. A reação foi incubada no gelo durante 10-15

minutos, e aplicou-se no gel de poliacrilamida para a corrida eletroforética, conforme as

condições descritas.

Para os ensaios com extrato protéico, foram utilizados 1,8 μg de proteína. Além dos

extratos protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis e da proteína recombinante

PacCPb-GST, os ensaios de retardo da mobilidade eletroforética realizados neste trabalho

também utilizaram a proteína recombinante CreAHg-GST, correspondente ao domínio de

ligação ao DNA da proteína CreA de H. grisea fusionado à GST. A proteína recombinante

CreAHg-GST foi gentilmente cedida por Thiago de Melo, membro do nosso grupo de

pesquisa.

3.7 – Análise da Expressão do Gene 1,3-β-glicana sintase



A expressão do gene 1,3-β-glicana sintase foi investigada por meio da técnica de RT-

PCR em tempo real. Analisamos os níveis de transcrito do gene Pbfks1 a partir de RNA de P.

brasiliensis cultivado nas formas de micélio e levedura. Avaliamos também os níveis de

transcrito do gene Pbfks1 a partir de RNA obtido de culturas de levedura crescidas em glicose

2% ou acetato de sódio 2% como fontes de carbono, por um período de 5 horas.

Os RNAs de P. brasiliensis obtidos de culturas crescidas nas diferentes fontes de

carbono e os RNA da forma micelial foram gentilmente cedidos por Lorena Derengowski

(Derengowski et al., 2008), membro do nosso grupo de pesquisa. Para este trabalho,

realizamos a extração de RNA de P. brasiliensis cultivado na forma de levedura, conforme

descrito a seguir.

48



Extração de RNA (material RNase free)

As células da cultura de levedura de P. brasiliensis (item 3.3.3) foram coletadas em

tubo do tipo eppendorf (com capacidade para 1,5 mL) e centrifugadas a 2.000 g por 5

minutos. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento de células foi adicionado 1 mL do

reagente Trizol (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante. A mistura trizol-

células foi transferida a um tubo do tipo eppendorf (com capacidade para 2 mL) contendo

micro-pérolas de vidro (SIGMA) cobrindo o fundo do tubo. A lise das células foi realizada

por vigorosa agitação por 20 minutos. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 13.000 g

por 1 minuto para baixar as pérolas de vidro e os restos celulares, com o sobrenadante sendo

transferido a um novo tubo eppendorf. Ao lisado celular, adicionou-se 200 μL de clorofórmio,

seguido de agitação vigorosa. Após centrifugação a 15.000 g por 30 minutos a 4°C, a fase

aquosa foi transferida a um novo tubo eppendorf, onde foram adicionados 500 μL de

isopropanol. O material foi homogenizado e incubado à temperatura ambiente por 10 miutos.

Após a incubação, a amostra foi centrifugada a 15.000 g por 15 min a 4°C, e o sobrenadante

foi descartado. O sedimento foi lavado com 1 mL de etanol 75%, deixando-se secar à

temperatura ambiente. O sedimento foi ressuspendido em 50 μL de H

O Milli Q.

Tratamento do RNA com DNase (material RNase free)

Os RNAs obtidos de culturas crescidas nas diferentes fontes de carbono (glicose e

acetato) e os RNAs da forma micelial e leveduriforme de P. brasiliensis foram submetidos ao

tratamento com DNase I livre de RNAse (Invitrogen), a fim de eliminar qualquer traço

residual de contaminação por DNA genômico.

Após verificação da integridade dos RNAs por eletroforese em gel de agarose 0,8%, o

material foi quantificado por espectrofotometria (Genequant, Amersham Pharmacia Biotech).

As condições de tratamento com DNAse I, para um volume final de 70 μL de reação, foram: 7

μg do RNA, tampão da DNAse I 1X; 7 U da enzima DNAse I. O tratamento foi realizado a

37ºC por 30 minutos, parando-se a reação pela adição de 7 μL do tampão de inativação da

enzima e aquecendo-a a 65ºC por 10 minutos. Após precipitação padrão com etanol e acetato

de sódio (Sambrook e Russel, 2001), o RNA total tratado com DNAse I foi novamente

analisado por eletroforese em gel de agarose 0,8% e quantificado. Uma última verificação,

49



para determinação de uma possível contaminação residual com DNA genômico, foi feita pela

metodologia de PCR (item 3.5.8), utilizando o RNA como materail genético da reação. Como

controle positivo da reação foi empregado DNA genômico de P. brasiliensis.

Transcrição Reversa (material RNase free)

Após tratamento do RNA com DNAse I, o cDNA foi sintetizado a partir de 2 μg de

RNA total de cada amostra. A essa quantidade de RNA total foi adicionado 0,5 μg do

iniciador OligodT18, ajustando-se o volume com H

O Milli Q para 11,5 μL. A mistura foi

incubada a 70ºC por 10 minutos, seguido de resfriamento imediato por incubação no gelo. À

amostra foram adicionados 12,5 μL do MIX, contendo os seguintes reagentes em suas

concentrações finais: tampão da transcriptase reversa 1X; DTT 200 mM; dNTPs 10 mM. Em

seguida, a reação foi incubada a 42ºC por 2 minutos, sendo adicionado ao sistema 200 U da

enzima transcriptase reversa (SuperScript III, Invitrogen) e incubando-se a 42ºC por mais uma

hora.

PCR em Tempo Real (material RNase free)

A reação de PCR foi preparada em um volume final de 10,0 μL, utilizando-se 0,2 μM

de cada iniciador para amplificação do cDNA de 1,3-β-glicana sintase (tabela 5), 2,0 μL da

diluição 1:8 do cDNA, e 5,0 μL de Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Para

análise do controle interno, foram utilizados iniciadores que amplificam um fragmento do

gene constitutivo L34 de P. brasiliensis (tabela 5), que codifica a proteína ribossomal L34. As

reações foram submetidas ao seguinte programa no termocicldor: 1) 50ºC/2 min; 2) 95ºC/5

min; 3) 95ºC/3 seg; 4) 60ºC/30 seg; 5) Repetir passos 3 e 4 quarenta vezes. Todas as

amplificações foram feitas no equipamento 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied

Biosystems). A análise da expressão do gene 1,3-β-glicana sintase foi realizada pelo método

∆∆Ct.

50



Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados na RT-PCR em Tempo Real – As sequências dos

oligonucleotídeos forward e reverse para amplificação de um fragmento do gene Pbfks1 e do

controle interno são apresentadas.

A Tm (melting temperature) foi obtida pela ferramenta Oligo Analyser, disponível em

http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/

51



4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. – Análise da Região Promotora do Gene quitina sintase 4 de P. brasiliensis

A quitina representa um dos principais componentes da parede celular de fungos, e sua

síntese é regulada por uma família multigênica de quitina sintases. Em P. brasiliensis, foram

identificados seis genes de quitina sintase (Pbchs1, Pbchs2, Pbchs3, Pbchs4, Pbchs5 e

Pbchs6) (San-Blas e Nino-Vega, 2008). Observa-se que nesse organismo os genes Pbchs4 e

Pbchs5 apresentam a conformação head-to-head, conforme mostra a figura 8.

Figura 8. Conformação head-to-head dos genes Pbchs4 e Pbchs5 – Os sítios de iniciação

da transcrição de Pbchs4 e Pbchs5 apresentam uma distância de aproximadamente 3,7 Kb.

Por apresentaram a conformação head-to-head, sugere-se que os genes Pbchs4 e

Pbchs5 possam apresentar uma regulação transcricional em comum, conforme é proposto

para os genes de quitina sintase csmA e csmB de A. nidulans, que apresentam essa

conformação e são expressos nas mesmas condições osmóticas (Takeshita et al., 2006).

Portanto, foi realizada a análise computacional da região intergênica dos genes Pbchs4 e

Pbchs5. A figura 9 mostra os prováveis sítios de ligação para fatores de transcrição

localizados na seqüência nucleotídica entre esses dois genes.

52



Figura 9. Seqüência nucleotídica da região intergênica dos genes Pbchs4 e PbrCHS5

(número de acesso no GenBank EF654132) – Os sítios de iniciação da tradução estão em

negrito (CAT: Pbchs4; ATG: Pbchs5). Os sítios putativos para o TATA Box estão

sublinhados. Foram destacadas as seqüências consenso dos sítios para os fatores de

transcrição PacC, em vermelho, CreA, em amarelo, em verde claro os elementos de resposta

ao estresse (STRE) e em azul os elementos de resposta ao choque térmico (HSE).

TGATAGCTTCGCGAATTCGTATCTTATACGGCACGAAGATATGGCGGATTACCAAAGGAGGCCCTTGC -67

GAACGGCGCGAACAGGTGAGAATAGGGATACTTTATCCGGCCCCATCCAACACTTGGTTCCGGTATACCT -137

TTAGCCCTGGCGAGGGGAAAAAAAGGGGGGAGGAGGGCCGTTTCCCTAGCAAAGACAAAGGCAACCCGAC -207

TTGCGTGAGAGATCCGGAACCCCGTTTTACAATCTCGTCGCCCGGTGTGGGTTGTTGGTTGGTTGAACAA -277

ATTGAGCTTCACGGAGCGAAACAAGGGTTCGAAGGCGATGGGTGTAAACAATAGCGAGAGACGAAGGACG -347

GTCACGCCCAAACGAATGTGTGATGAGCACCTCCTCGCGAGCACAGCAAGATGCAAAGACCAGTATAGCG -417

AACCACGAAAAAGAGAGACCAAGGAGGAGGTTGGTGGGAGCAACTGAACTGGAGGGAAGAAAAGTGAAGG -487

GGTAGGTAAAGCACAACAGCAGGATACATCAAGTGCTGTGTGTATGGTACTGTACGGTACGCGTCCAGAG -557

ACAGGGCGGTTTTGTAAACAACGGCTTAGTACCGGCCAAACAAAACATACTTCTAGTTACAGAGTGTAAA -627

CCAAAGTAAATTAAATATAGTTACAACGCACCCATGGATACTTTCACCACATGCTCTGGAGAACTTGGGA -697

TCAACATCAAATGATTCTGTTGGGGACTCAAGTGAATCTGTGGGAACAAAGCGTGGTTTACCAGGCTGGG -767

CTGTAACCGGGACGAATGTGCGTTTAAAACCCCCGCATCCCGCGAATGGGCTTGTTCCTGTGTCAGACTC -837

TCTCTCTCTTCATCGCAGTTTGGCTGAATCTTATTCCCACGACTCCCGTAATAAACCAATGACGCTTGGA -907

CGGGCGAAAACAGCACATACACAACCCCCAAGGCCCGGGTGTTGTCTTTATTGGAATGGATCAAACCCAC -977

AGCCAATCAGCACCCCTGATTTGCGGAATAGCGCTCCAGTTCTTGTTGGCCGTCCCAAGACAAGCCGGCG -1047

ATGGAAGACCGGGGGTCTCTAGCAATTGGTTCAAGGTCGCCATCTCTCTGGCCTGAAATCCAGTACGGTA -1117

GTTACAGCTACAGGAAGGGGGGGAATCTTTTGTTCTGAGAACTGCCGAACCAACAACATGGCACCAAGGA -1187

ATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATCGTCGGTTGTGGGGCCACGGTCTGTA -1257

ATCGGTATTTAAACATCCAGCATGTAATTAATGTATTATGGTACCATACAGAGGGTACGGAGGAAGAAGA -1327

GTTCCGGATTACGCAGACCATACAGTTTCCGTACAATTTTCCCTCCATTTTCTGGCGGCGAATAAGTTAC -1397

GGCTTCCCCCTGCTTCTGGAAAGAGAAGCAGACGAAGATCTCGCAATCCTAATCCATGGTAAATATATAT -1467

ATAATATAGTTAAGCACAGGATGCCGCCCCCTCCATTTGAGCTCCTGGTATTCCCCCGATGTTGTTTTTA -1537

ACTTCTCAACAAACCCTGCTGTTTGAGCAATCAGTGGTTGTCAGTTATCCCGGCAGCGGACGATACCGCG -1607

ATCACCACCCGTTATTGATCTGTGTTTATTATTATTATTATTATTATCATCATCATCATTATTGTCAACT -1677

GTCTCCCGCACGCCCATACCGGGTTGAAATATGGAGCATTCAAGATGAGCCTGAAGATCTATGACACTGA -1747

CACTGGACGGACGGACGTACTCTGAAAACGTCCCCGAGAGACTCTTCCTTGGGCGTCAGGTTGTTAGTAA -1817

CACAGTTCTGATGCTTAAAGTATGTCTGCCGTCATGAATAGAGTTCGGGTCCTGTCTGTAAAACTCCACC -1887

ACTCACATCAAGCAGATCAATGGCTGTCTCTGAAACAGGGCAGTCGCTCCACCGCCAACTAATAATTTAT -1957

CACCGTTCTACCAACCGTCCCATCTCTCGACGTTGGTAAGACACACGAAGCGCTCTGCCGGGTATGTAAA -2027

CGTATGTAAATGTATGTAAAATATGTAAATGTATGTATGTATGTATGGTAAAATGAGACAGCGTCTGCTC -2097

TCATCATCCACATCTCCAATACAGGTTCCTTTCGTCGTTTTGCCAGCTTCGAAGCCTTTTTCGGGCTGTG -2167

AGAGCACCGAAAGAACCCGTGGGCCCCTGGACCCTCCCCTCTCATGGTCCCGGAAAATGCTATTATTACT -2237

AGGAATCAGACTGGGCGGTGTTCGGGGGAACATGTGGTAAAAAAGTCTCAACTAGAGACCCCACCATGGA -2307

ATGGTGTGTTGGCGAAGTGGCAAGGGGAGTCGTAGTTAATCGGCTGCGCCATGACACAAACCCCCCTCCA -2377

TTGGGCCAGCATCATCATCATCATTCATCATACTCCCAGTAACCACTGGTACACATGCTTTAAAAAACAG -2447

TCTGTATGTTGTGTATGCTGTGTTTCAAGAGCTTGCAACAATGATCAGCAATAATACCTCCAAACCTCCC -2517

CCCCCCACAGCGGTGGTCCAAAAGAATGAAAAAAGAACTTCAATGGAAAATAGATCCCAGTATGTTGCAG -2587

ATAATTGCCCCTGTAGGTACTCACCCCACCCCCCCGGGACCTGGAATTGCTTCTTTACCACCGTCTCCAT -2657

GTAAGAAGTATCATTTATCGTTGTCACCGAGACGTTACTGGTTTTTCCTGCTGAAGATTGGTGCCGCCCA -2727

ACAGGCATCCCGGCTAGACGGGCCCAAAAATAGACTGGGGCAGCCACTTGTCTCGGATCACGAACACCCA -2797

TCCCCATCGTCCTTGGACCTGGCTGTTAGAGGAAAATCTTGCCTTGGCGGGATGACTCCAGGCTGTTCTC -2867

TGGCCTGGCGAAGAGGGCTTTCCACTGCGAGTCAGGAACCTACCCTGGTTATCATTAAGGCTGTGGTAGT -2937

ATATATATTTATATTTATATTTATATTTATATATTACTTGATGATTCTTTTTTCCCCGAGGACCGAAAAG -3007

GGCTGTTGACGAAGGGAACCCGATACTGTATGTAACATGACGAGGGTATTGCGTATATACATACATACGT -3077

ACATACGTACATACATACGATACAGTATAGATTACTCCACAATACGGGGTTGGTTGGTTTACAACTTACC -3147

CTTTCGGGCGGTGTCTTGTTTCTGCCCTGTTCCCCTGCCTGGTCTTCCGCGTCCCCAGTCAAAACCACTC -3217

ACTCACTTAGTTCCTCGATCCGACCTCGTTTCGTTTTGTTCGTTCGTTCTCTCACTTTCTTTACTTTGTT -3287

TTGGTATTTTTTTGTTTATTTTTTTTTATTCCTGACTCTCCTCCAGCCTGAGCATACTGGGGCAGCCTCG -3357

GTATCACTCGTTTTCTTTTTTATTGAATATTGTCTTGCTTTTTTGGGCTCTTGCCTTCCCTTCTCCTGGA -3427

AGCCCCATCCATCCGCTCTGCGTCCGGATCGAAACAGTCCCTCGCTCGGGAGAGTTCTCGTTTCTCGGTC -3497

TTCGTCGTGCTTCTTCTGTCCATTCTTTACCAAGCTGACAAGAGCATCTTAATCTTTGCTTAATTCATCG -3567

AGAAGCCCGTTCATTGAGCTGTGGCCGAGTTTTCCCAGTTGGCGGATCCTCTCGTGTTGTCTTGAACAAC -3637

TTTCAAATGTCTGGATACGGCTCGGATACCTAAGAGAGAAATTGTGCCTTTTTTTCTAGCCTGGACAGTC -3707

GCTCGTATA

CAGTCGTTATTGCTGCCGGGTTAGACGTCTTTCGTTCCAAGTCCGACGGCCTTCGCGCCTG -3777

ATATTCGATCTTTTCGCC

G -3798

53



Na região intergênica dos genes Pbchs4 e Pbchs5 foram encontrados quatro sítios para

o fator de transcrição PacC, que regula a expressão gênica em resposta ao pH. Para o fator de

transcrição CreA, que media a repressão gênica na presença de glicose, foram localizados 18

sítios. Foram identificados 13 elementos de resposta ao estresse (STRE) e nove elementos de

resposta ao choque térmico (HSE).

4.1.1 – Produção da Proteína Recombinante PacCPb-GST para Análise do Promotor do

Gene Pbchs4

Para investigar se o fator de transcrição PacC estaria atuando na regulação

transcricional do gene Pbchs4 produzimos a proteína recombinante PacCPb-GST, para sua

posterior utilização em EMSA. Para realização dessa análise, foi realizada em E. coli a

expressão do domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P. brasiliensis fusionado com

a protéina glutationa S-transferase (GST). Em seguida, a proteína recombinante foi purificada

utilizando-se uma coluna de GST-Sefarose. A utilização do domínio de ligação ao DNA de

fatores de transcrição é amplamente empregada em ensaios de retardo da mobilidade

eletroforética. Recentemente, Rauscher et al. (2006) utilizaram os domínios de ligação ao

DNA das proteínas Ace1, Ace2, Hap2/3/5 e Xyr1 fusionados à GST para avaliar o

envolvimento desses fatores na regulação da região promotora do gene que codifica a

xilanase1 em Trichoderma reesei.

A figura 10 mostra o perfil do extrato protéico total de E. coli antes da purificação e as

frações da proteína recombinante PacCPb-GST purificada. Observa-se uma banda entre os

marcadores de 30 e 40 kDa correspondente à proteína recombinante PacCPb-GST, cujo

tamanho esperado é de 39,2 kDa.

54



Figura 10. Perfil eletroforético em SDS-PAGE (12%) da proteína recombinante

PacCPb-GST, corado com Comassie Blue – Extrato protéico total de E. coli após indução

da expressão de PacCPb-GST. As frações de cromatografia em coluna de GST-Sefarose estão

destacadas, indicando a proteína recombinante PacCPb-GST parcialmente purificada de 39,2

kDa (GST = 26 kDa; domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de P. brasiliensis = 13,2

kDa). M: Marcador Bench Mark Protein Ladder (Invitrogen). Foram aplicados 8 μL de cada

fração de cromatografia.

4.1.2 – Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética (EMSA): sonda Pbchs4(a)

A figura 11 mostra uma seqüência da região promotora do gene quitina sintase 4 de P.

brasiliensis utilizada como sonda em nossos experimentos, denominada sonda Pbchs4(a). A

sonda apresenta dois elementos de resposta ao estresse (STRE), um sítio para o fator

regulatório PacC, e um TATA Box putativo.

Figura 11. Sonda Pbchs4(a) – Seqüência do oligonucleotídeo senso utilizado como sonda

em EMSA. Em verde destacam-se os elementos de resposta ao estresse (STRE). Em vermelho

destaca-se um sítio de ligação para o fator de transcrição PacC. O TATA Box putativo

encontra-se sublinhado e foi identificado pela ferramenta TESS, disponível em

http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess

55



Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, Sant’Ana (2008) demonstrou que a

sonda Pbchs4(a) interage com extratos protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis. Foi

observada uma interação DNA-proteína específica nas fases de micélio e levedura e outra

interação micélio específica (ver figura 3, página 12). Para investigar se o fator de transcrição

PacC estaria atuando nessas interações, realizamos o ensaio de retardo da mobilidade

eletroforética com a sonda Pbchs4(a) após incubação com a proteína recombinante PacCPb-

GST. Entretanto, não foi observada a interação da sonda com o domínio de ligação ao DNA

de PacC de P. brasiliensis (figura 12).

___________________________________________________________________________

Sonda Pbchs4(a): CCCTCCTCC

TTTTTTT

GGCTAAAGG

___________________________________________________________________________

Figura 12. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando a sonda Pbchs4(a)

com a proteína recombinante PacCPb-GST – (A) 1: sonda Pbchs4(a) livre; 2: sonda

Pbchs4 + PacCPb-GST. Foi utilizado 1,0 μg de proteína recombinante. (B) Seqüência da

sonda Pbchs4(a), destacando em negrito os dois sítios para STRE(s) (CCCT) e o sítio para

PacC (GCCAGG). Sublinhado encontra-se um putativo TATA Box.

56



O ensaio de retardo da mobilidade eletroforética utilizando a sonda Pbchs4(a) com a

proteína recombinante PacCPb-GST foi repetido nas mesmas condições utilizadas no ensaio

anterior e também testando 2,0 μg de PacCPb-GST, mas novamente não observamos

nenhuma interação (dados não mostrados). Para avaliar a funcionalidade da proteína

recombinante PacCPb-GST produzida neste trabalho, realizamos o ensaio de retardo da

mobilidade eletroforética com sondas correspondentes ao promotor de PacC de H. grisea que

contêm sítios para o fator de transcrição PacC. A figura 13 mostra o teste da funcionalidade

de PacCPb-GST.

___________________________________________________________________________

Sonda 1 H. grisea: CCCTCAGCCCCACGCGT

CCCCACGGCCCCGCACGCACA

Sonda 3 H. grisea: CCAAGAACT

CGCGCCTTTG

Sonda 4 H. grisea: GCACCG

GTCTCCGTTTCTCCTCGACCGTC

CATTCCC

___________________________________________________________________________

Figura 13. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética para teste da funcionalidade

da proteína recombinante PacCPb-GST – (A)1: sonda 1 de H. grisea + PacCPb-GST; 2:

sonda 3 de H. grisea + PacCPb-GST; 3: sonda 4 de H. grisea + PacCPb-GST. Foram

utilizados 2,0 μg de proteína recombinante. (B) Seqüências das sondas de H. grisea,

destacando em negrito os sítios para PacC.

57



As sondas de H. grisea testadas com PacCPb-GST são consideradas funcionais por

interagirem com o domínio de ligação ao DNA da proteína PacC de H. grisea (dados do

nosso grupo de pesquisa). Conforme observamos na figura 13, as sondas 1, 3 e 4 de H. grisea

interagem também com a proteína recombinante PacCPb-GST. Esses resultados comprovam a

funcionalidade da proteína recombinante PacCPb-GST, sugerindo que o sítio para o fator de

transcrição PacC identificado na sonda Pbchs4(a) não é funcional.

O fator de transcrição PacC regula a expressão de genes em resposta ao pH. Em A.

nidulas, em pH alcalino e neutro, PacC ativa genes requeridos para essa condição, incluindo

sua própria expressão, e reprime genes expressos em condições ácidas (Tilburn et al., 1995).

A sua ativação ocorre em pH alcalino a neutro e requer duas clivagens proteolíticas (Diez et

al., 2002), mas esse processamento não é requerido para a ligação ao DNA, embora determine

a localização nuclear do fator de transcrição in vivo (Orejas et al., 1995). Observa-se que em

C. albicans, o gene PHR2, homólogo de PHR1 nesse organismo e que codifica uma β-

glicosidase da parede celular, é expresso preferencialmente em pH ácido, regulação oposta ao

observado para PHR1, e reprimido em pH alcalino de forma dependente de Rim101p,

homólogo de PacC em C. albicans (Muhlschlegel e Fonzi, 1997). Aguiar (2006) demonstrou

que em P. brasiliensis o gene que codifica PacC é expresso tanto em condições alcalinas

como ácidas, sugerindo que sua regulação ocorre em nível pós-transcricional.

Em A. nidulans, o sítio de ligação para PacC é dado pela seqüência consenso

GCCARG, onde R pode ser “A” ou “G”. Qualquer substituição de base resulta em uma

substancial ou completa perda de ligação (Espeso et al., 1997). Ao compararmos as sondas de

H. grisea com a sonda Pbchs4(a), observamos que todas as sondas de H. grisea apresentam

“A” na posição cinco, enquanto que na sonda Pbchs4(a) essa posição é constituída por “G”

(figura 14).

58



Figura 14. Comparação dos sítios de ligação para PacC presentes nas sondas 1, 3 e 4 de

H. grisea e na sonda Pbchs4(a) – A seqüência do sítio de ligação para PacC está em negrito,

com a base na posição 5 grifada em vermelho.

Apesar da substituição de “A” por “G” na quinta posição ser descrita como tolerada

em A. nidulans, nossos resultados revelaram que o domínio de ligação ao DNA do fator de

transcrição PacC de P. brasiliensis não interage com o sítio presente na sonda Pbchs4(a), que

apresenta “G” na posição cinco. Entretanto, esta proteína recombinante é capaz de reconhecer

sondas de H. grisea que apresentam o sítio GCCAAG, que contém “A” nessa posição. BaeK

et al. (2006) sugerem que, em C. albicans, Rim101p se liga ao sítio GCCAAG

AA, seqüência

que engloba o sítio GCCAAG reconhecido por PacC de P. brasiliensis neste trabalho, mas

também sugere que pequenas divergências são toleradas. Ramón e Fonzi (2003) relataram que

no promotor de PHR1 de C. albicans o sítio não requer “G” na primeira posição e Rim101p

reconhece a seqüência CCAAGAA. Entretanto, para o promotor PHR2 de C. albicans, um

sítio requer “G” na primeira posição e em outro sítio Rim101p também é capaz de reconhecer

apenas a seqüência CCAAGAA (Baek et al.,2006).

59



Na região intergênica de Pbchs4 e Pbchs5, foram localizados quatro sítios para o fator

de transcrição PacC de acordo com a seqüência consenso descrita para A. nidulans. Desses,

três apresentam “G” na posição cinco e um apresenta “A” nessa posição. Embora o sítio para

PacC analisado no promotor de Pbchs4 não seja funcional, consideramos que o seu papel na

regulação dos genes de quitina sintase requer investigação. Para sobreviver e proliferar, os

microrganismos precisam se adaptar a mudanças no pH ambiental. O pH do ambiente afeta

profundamente a biologia do fungo, influenciando o metabolismo, o desenvolvimento

morfológico e a virulência de patógenos. Essas respostas derivam, em parte, da alteração da

expressão de genes, e muitos desses genes codificam proteínas secretadas ou da superfície

celular, que estão diretamente expostas ao ambiente (Denison, 2000).

Sant’Ana (2008) demonstrou que a sonda Pbchs4(a) apresenta retardo da mobilidade

eletroforética quando incubada com extratos protéicos de micélio e levedura de P.

brasiliensis. Os nossos ensaios com a proteína recombinante PacCPb-GST revelaram que essa

interação não ocorre no sítio de ligação para PacC presente nessa sonda. Visto que a sonda

Pbchs4(a) também apresenta elementos de resposta ao estresse, sugerimos que esses

elementos possam estar envolvidos na regulação do gene quitina sintase 4 de P. brasiliensis.

A definição dos sítios na seqüência promotora onde os fatores de transcrição se ligam são pré-

requisitos essenciais para a compreensão de como essas proteínas modulam a expressão do

gene (Read et al., 2009). Mutações e deleções podem ser introduzidas nas sondas para

verificar quais sítios são importantes para estabelecer a interação DNA-proteína. Nessa

perspectiva, a partir da sonda Pbchs4(a) produzimos duas sondas mutadas a fim de anular um

sítio em STRE e o putativo TATA Box. Realizamos o ensaio de retardo da mobilidade

eletroforética com a sonda Pbchs4(a) e extrato protéico de micélio, utilizando como

competidores a sonda mutada ou em STRE ou a sonda mutada no putativo TATA Box

(figura15).

60



___________________________________________________________________________

Sonda Pbchs4(a): CCCTCCTCC

TTTTTTT

GGCTAAAGG

Competidor Mut1(TATA): CCCTCCTCCCCCCCCCCCCTCCCCTCGCCAGGGCTAAAGG

Competidor Mut2(STRE): CCCTCCTCCCCCCTTTTTTGGGAAAAGCCAGGGCTAAAGG

___________________________________________________________________________

Figura 15. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando as sondas

Pbchs4(a) mutadas e extrato protéico de micélio de P. brasiliensis – (A) 1: sonda

Pbchs4(a) livre; 2: sonda Pbchs4(a) + extrato de micélio; 3, 4 e 5: sonda Pbchs4(a) + extrato

de micélio + competidor específico 25X, 50X e 100X, respectivamente; 6, 7 e 8: sonda

Pbchs4(a) + extrato de micélio + competidor Mut1(TATA) 25X, 50X e 100X,

respectivamente; 9, 10 e 11: sonda Pbchs4(a) + extrato de micélio + competidor Mut2(STRE)

25X, 50X e 100X, respectivamente. (B) Seqüência da sonda Pbchs4(a), destacando em

negrito os dois sítios para STRE (CCCT) e o sítio para PacC (GCCAGG), e sublinhado

encontra-se um putativo TATA Box. Nas sondas Pbchs4(a) mutadas, os sítios modificados

encontram-se em duplo sublinhado.

61



Conforme observamos na figura 15, a sonda Pbchs4(a) apresenta três retardos da

mobilidade eletroforética quando incubada com extrato de micélio (poço 2). O complexo de

menor massa molecular não havia sido detectado nos ensaios de Sant’Ana (2008). Essa é uma

interação específica, visto que é abolida nas reações com os competidores específicos, e

parece não estar associada aos sítios de STRE e TATA Box. O complexo de maior massa

molecular também é específico e abolido pelos competidores, e parece não estar relacionado

aos sítios de STRE e TATA Box. O complexo intermediário é gradativamente abolido na

presença dos competidores específicos (poços 3, 4 e 5), devido à competição no ensaio.

Observa-se também que quando o competidor em que o putativo TATA Box encontra-se

modificado (poços 6, 7 e 8), o complexo intermediário também é reduzido, demonstrando que

essa sonda funciona como competidor da interação. Esse resultado revela que essa interação

não está associada ao TATA Box, já que mesmo com a mutação nesse sítio, a sonda é capaz

de competir pelo fator que está provocando o retardo. Essa mesma interação não é abolida na

presença do competidor em que STRE está modificado (poços 9, 10 e 11), demonstrando que

a mutação não está atuando como competidor, e que portanto o sítio de STRE continua

ocupado na sonda selvagem. Esse resultado sugere que a interação está ocorrendo no

elemento de resposta ao estresse.

Posteriormente, realizamos o ensaio de retardo da mobilidade eletroforética com a

sonda Pbchs4(a) e extrato protéico de levedura, também utilizando como competidores a

sonda mutada ou em STRE ou a sonda mutada no putativo TATA Box (figura16).

62



___________________________________________________________________________

Sonda Pbchs4(a): CCCTCCTCC

TTTTTTT

GGCTAAAGG

Competidor Mut1(TATA): CCCTCCTCCCCCCCCCCCCTCCCCTCGCCAGGGCTAAAGG

Competidor Mut2(STRE): CCCTCCTCCCCCCTTTTTTGGGAAAAGCCAGGGCTAAAGG

___________________________________________________________________________

Figura 16. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando as sondas

Pbchs4(a) mutadas e extrato protéico de levedura de P. brasiliensis – (A) 1: sonda

Pbchs4(a) livre; 2: sonda Pbchs4(a) + extrato de levedura; 3, 4 e 5: sonda Pbchs4(a) + extrato

de levedura + competidor específico 25X, 50X e 100X, respectivamente; 6, 7 e 8: sonda

Pbchs4(a) + extrato de levedura + competidor Mut1(TATA) 25X, 50X e 100X,

respectivamente; 9, 10 e 11: sonda Pbchs4(a) + extrato de levedura + competidor

Mut2(STRE) 25X, 50X e 100X, respectivamente. (B) Seqüência da sonda Pbchs4(a),

destacando em negrito os dois sítios para STRE (CCCT) e o sítio para PacC (GCCAGG), e

sublinhado encontra-se um putativo TATA Box. Nas sondas Pbchs4(a) mutadas, os sítios

modificados encontram-se em duplo sublinhado.

63



Conforme observamos na figura 16, a sonda Pbchs4(a) apresenta um retardo da

mobilidade eletroforética quando incubada com extrato de levedura (poço 2). Essa interação é

específica e corresponde ao complexo intermediário observado no ensaio com extrato de

micélio (figura 16, poço 2). Assim como no ensaio com extrato de micélio, no ensaio com

extrato de levedura o complexo também é gradativamente abolido na presença do competidor

em que o putativo TATA Box encontra-se modificado (poços 6, 7 e 8). Visto que mesmo com

a modificação essa sonda atua como competidor, esse resultado novamente revela que essa

interação não está associada ao sítio TATA Box. Nesse ensaio com extrato de levedura, a

interação também não é abolida na presença do competidor em que STRE está modificado

(poços 9, 10 e 11), indicando que a modificação desse sítio anula a competição. Esse

resultado novamente sugere que a interação está ocorrendo em STRE.

Observamos que a sonda Pbchs4(a) apresenta duas interações micélio específicas, e

uma interação específica comum entre as fases de micélio e levedura. Demonstramos que essa

interação está relacionada ao STRE. Freitas e Bertolini (2004) produziram sondas mutadas em

que o sítio STRE do promotor de um gene de N. crassa foi alterado de CCCCT para

AAAAG, impedindo a formação do complexo DNA-proteína em EMSA. Em nosso trabalho

modificamos o sítio STRE e os dois nucleotídeos adjacentes, alterando a seqüência

TCCCCTC para GGGAAAA, e observamos que essa alteração impede a formação da

interação e a sonda mutada não atua como competidor. Esses resultados indicam que esse sítio

está envolvido na interação observada na fase de micélio e levedura. O elemento de resposta

ao estresse foi identificado no promotor de genes que respondem a uma ampla variedade de

sinais de estresse, tais como estresse nutricional, térmico, osmótico e oxidativo (Mager e

Kuifjiff, 1995). Em S. cerevisiae, o elemento de resposta ao estresse é regulado pelas

proteínas Msn2p e Msn4p. Martinez-Pastor et al. (1996) realizaram mutações nos genes

MSN2 e MSN4 de S. cerevisiae, e demonstraram que duplo-mutantes apresentaram um

aumento da sensibilidade a condições severas de estresse. Além disso, o grupo demonstrou

por meio de EMSA que o domínio de ligação ao DNA das proteínas Msn2p e Msn4p se liga

aos sítios de STRE no promotor de HSP12. Schuller et al. (1994) observaram ainda que a

indução por estresse osmótico do gene CTT1 de S. cerevisiae, que codifica uma catalase

citosólica, é mediada por STRE e regulada pela via HOG MAP quinase. Consideramos que a

investigação do papel funcional de STRE na regulação do gene Pbchs4 poderá fornecer dados

para uma maior compreensão da regulação da biossíntese e manutenção da parede celular.

64



4.1.3 – Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética (EMSA): sonda Pbchs4(b)

A figura 17 mostra uma seqüência de uma outra região do promotor do gene quitina

sintase 4 de P. brasiliensis utilizada como sonda em nossos experimentos, denominada sonda

Pbchs4(b). A sonda apresenta um sítio para o fator regulatório CreA, que reprime a expressão

gênica na presença de glicose.

Figura 17. Sonda Pbchs4(b) – Seqüência do oligonucleotídeo senso utilizado como sonda

em EMSA. Em amarelo destaca-se o sítio de ligação para o fator de transcrição CreA.

Avaliamos se a sonda Pbchs4(b) interage com a proteína recombinante CreAHg-GST,

correspondente ao domínio de ligação ao DNA da proteína CreA de H. grisea fusionada com

GST. Neste ensaio também avaliamos se os fatores de transcrição presentes nos extratos

protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis interagem com a sonda Pbchs4(a),conforme

mostrado na figura 18.

65



___________________________________________________________________________

Sonda Pbchs4(b): CTTTTCTTCC

GTTCAGTTGCT

___________________________________________________________________________

Figura 18. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando a sonda Pbchs4(b)

com extratos protéicos de micélio ou levedura de P. brasiliensis, ou a proteína

recombinante CreAHg-GST– (A) 1: sonda Pbchs4(b) livre; 2: sonda Pbchs4(b) + extrato

de micélio; 3 e 4: sonda Pbchs4(b) + extrato de micélio + competidor específico 25X e 50X,

respectivamente; 5: sonda Pbchs4(b) + extrato de levedura; 6 e 7: sonda Pbchs4(b) + extrato

de levedura + competidor específico 25X e 50X, respectivamente; 8: sonda Pbchs4(b) +

CreAHg-GST. Foi utilizado 1,0 μg de proteína recombinante. (B) Seqüência da sonda

Pbchs4(b). Em negrito destaca-se o sítio para CreA.

Conforme mostra a figura 18, a sonda Pbchs4(b) apresenta três retardos da mobilidade

eletroforética quando incubada com extrato de micélio (poço2), e verificamos que essas

interações são específicas visto que na presença de concentrações crescentes do competidor

específico a formação desses complexos com a sonda marcada com fluorescência é reduzida

(poços 3 e 4). Observamos uma interação específica da sonda Pbchs4(b) quando incubada

com extrato de levedura, pois ela também é diminuída na presença de competidores

específicos (poços 6 e 7). Entretanto, sugerimos que essa interação não ocorre no sítio para

CreA, visto que a sonda Pbchs4(b) não interage com a proteína recombinante CreAHg-GST

(poço 8). O fator de transcrição CreA reconhece a seqüência consenso SYGGRG (S=C ou G,

Y=C ou T e R=A ou G), embora nem todas as possibilidades derivadas a partir dessa

66



seqüência consenso funcionem como sítio de ligação e alguns sítios sejam contexto-

dependentes (Cubero e Scazzocchio, 1994). Ensaios demonstraram que CreA de A. nidulans

pode reconhecer seqüências compostas por 6 nucleotídeos divergentes da seqüência consenso,

porém, a ligação a esses sítios atípicos está relacionada à proximidade de um segundo sítio

para CreA, o que estabilizaria o complexo DNA-proteína (Espeso e Penalva, 1994). Em nosso

trabalho, observamos que o domínio de ligação ao DNA de H. grisea não reconheceu o sítio

CTCCAG no promotor do gene Pbchs4. Ressaltamos que CreAHg-GST é considerada

funcional (dados do nosso grupo de pesquisa), mas devemos considerar a hipótese de que

CreA de H. grisea e CreA de P. brasiliensis podem apresentar afinidades de ligação distintas.

Entretanto, análises genéticas indicam que esse mecanismo regulatório é altamente

conservado entre os fungos. Vautard et al. (1999) relataram que o fator de transcrição CRE1

de Sclerotinia sclerotiorum apresenta 59% de similaridade e complementa funcionalmente

CreA de A. nidulans.

Os resultados de EMSA sugerem que o sítio para CreA da sonda Pbchs4(b) não é

funcional e, portanto, não demonstram o envolvimento do fator de transcrição CreA nas

interações obtidas entre a sonda Pbchs4(b) e os extratos de proteína de micélio e levedura de

P. brasiliensis. Todavia, consideramos que a utilização do domínio de ligação ao DNA da

proteína CreA de P. brasiliensis nos ensaios contribuirá para a análise dessa investigação. A

proteína CreA é relacionada à proteína Mig1p, o fator de transcrição que media a repressão

por glicose em genes de S. cerevisiae, e é necessária para a total repressão de genes de A.

nidulans envolvidos na via de utilização de etanol (Panozzo et al., 1998). Em A. nidulans,

quando o fungo é crescido em glicose, o gene creA é ativamente transcrito e traduzido. Essa

proteína repressora, ao se ligar na seqüência promotora, atua como competidor pelos sítios de

fatores de transcrição ativadores (revisto por Poças-Fonseca, 2000). Ensaios de gene repórter

revelaram que a atividade do gene lacZ controlada pelo promotor do gene quitina sintase 4 é

reprimida na presença de glicose (Sant’Ana, 2008). Portanto, visto que identificamos na

região intergênica de Pbchs4 e Pbchs5 18 sítios potenciais para o fator de transcrição CreA,

consideramos que o papel de CreA na regulação do gene quitina sintase 4 requer investigação

adicional.

67



4.2 – Análise da Região Promotora do Gene 1,3-β-glicana sintase de P. brasiliensis

A 1,3-β-glicana representa um dos principais componentes da parede celular de

fungos, e sua síntese é regulada pela enzima 1,3-β-glicana sintase. Em P. brasiliensis, foi

caracterizado um gene que codifica uma 1,3-β-glicana sintase (Pereira et. al., 2000),

denominado Pbfks1. A análise da região promotora do gene Pbfks1 revelou sítios de ligação

putativos para fatores de transcrição, destacados na figura 19:

Figura 19. Seqüência nucleotídica da região promotora do gene Pbfks1 (número de

acesso no GenBank AF148715) – O sítio de iniciação da tradução está em negrito. Os sítios

putativos para o TATA Box estão sublinhados. Foram destacadas as seqüências consenso

dos sítios putativos para os fatores de transcrição PacC, em vermelho, CreA, em amarelo,

FacB, em verde escuro, em verde claro os elementos de resposta ao estresse (STRE) e em

azul os elementos de resposta ao choque térmico (HSE).

Na região promotora do gene Pbfks1 foram encontrados três sítios para o fator de

transcrição PacC, que regula a expressão de genes em resposta ao pH. Também foram

identificados dois sítios para o fator de transcrição CreA, que reprime a expressão gênica na

presença de glicose, e quatro sítios para o fator de transcrição FacB, requerido para

crescimento em meio com fonte de dois carbonos, como acetato. Localizamos também três

elementos de resposta ao estresse (STRE) e quatro elementos de resposta ao choque térmico

(HSE).

-1235 GTCCGGTTGCATGCAGCCACCCCAGCTGTATAGGGCCCAGCCACGGCAGAAAACATCGGCATACCTGTTTAA

-1163 TTTACCTGAAAAGTTACGTACTCGGGAAATACCTGGAATACCTGTGAATAATACCTCCGTGCCTGAGCCCAT

-1091 TATTGGCTGATTCTGTCAATCCCTTACTTGGTATAATGTTCTGTCTGGTTGTTCTTGTGTATGTCAGTTTTG

-1019 TTGCAGATGTTTCTTTTTTTTCACTTCCCGCGTCCTCTCTCTTCTCCTCCTCCTCCTTTCGCCTTCGCTGCG

-947 ACCACCAACTTTTATTTTATTTTATGTTTCTTGACCACACTCTCTTTTTGTCTTCCTTTCGGTTTTGTCTCT

-875 CTCCCTCTCTCTCTGTTTACCTTTCTCACTCGTTCAACGGGTAACCAGGAGGGTCGTGAGAGCCAAGCAGCC

-803 CTGACACATTCTAATACCGGAGTGCCACGCTTGGCAGATCATTTTGCCTGTGCCGCCTCCTGTCGTTGCTGT

-731 TGCTGCTGCGACCGTACCTTCCTCGTCTGAGGCCTGCACTATTGGCTGCGTAACCACAACTTCACTCGTTTC

-659 ACAACAAATAATAATATCGAAAGGGGATACAAACGTCTTCTTCTTTCGTCTTCTTGTTTATCCTTCTTCCTC

-587 CTCCTCCTCCTCCTCCTCCCTCCCCCAATTCCCGTATCTTGTTGCTGCATTCTTTGCATCATCAATCGCTTG

-515 TTAGGTCCCACCCCCTGGAACCGTTGTCCCTTTTACCTGGCGTGTTGACCACCCACCCCTTCCTCCTCACAT

-443 CACTCTCTCGAATCGGTTTCGACCGTCAACTCTCTCTTATCCGGTTTCCAATTACGAGCTACACCTCTCTCC

-371 TATATAGCCCGTCGAAGGAAGAAGAGAAATAAAAGCAGGAAATCCTCGCGGTCTCATCTTTGTGTTGCGTTG

-299 CGTTGCTCTTGCTGTTTGCTTTGCTTCGCTGGCTTTGTTTACTTTCGTTTGACAATCGATTTGCGAGTACAC

-227 CACGACCGTTAACTACCAGGAATATCTTTCTTTTGCTTTTTCTGTCGACGGATTTTCCTTGCTTTTTGACAT

-155 CAGAGTTAATGGGTATGATAATATTATA

ACGTAAGCTTTCTTCTTGCTTGGGAGGGATTCGATTAGCTGATT

-83 GCGTGGTTGGAAATTCAAATTGGCTGACCAAGTTGCATCTATTGCCGCCCTACAGTCGAGAAATTTGAATTG

-11 TCCGTTTAACC

G

68



4.2.1 – Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética (EMSA): sonda Pbfks1(a)



A figura 20 mostra a seqüência de uma região do promotor do gene 1,3-β-glicana

sintase de P. brasiliensis utilizada como sonda em nossos experimentos, denominada sonda

Pbfks1(a). A sonda apresenta um elemento de resposta ao choque térmico (HSE) e um

putativo TATA Box.

Figura 20. Sonda Pbfks1(a) – Seqüência do oligonucleotídeo senso utilizado como sonda em

EMSA. Em azul destaca-se o elemento de resposta ao choque térmico. O putativo TATA Box

encontra-se sublinhado.

Em S. cerevisiae, a síntese de 1,3-β-glicana é realizada pelos produtos de dois genes

homólogos, FKS1 e FKS2. Foi observado que o mRNA de FKS2 de S. cerevisiae aumenta

quando a temperatura é alterada de 23°C para 39°C (Zhao et al., 1998). Ishihara et al. (2007)

realizaram construções moleculares para expressar Fks1p e Fks2p sob a regulação do

promotor de FKS1 ou do promotor de FKS2 em linhagens mutantes fks1/fks2. Após a

exposição à temperatura de 55°C, foi verificada a viabilidade dos esporos. As linhagens que

expressaram Fks1p e Fks2p sob a regulação do promotor FKS2 apresentaram sensibilidade

térmica similar às linhagens selvagens, enquanto que as linhagens onde as proteínas foram

expressas sob a regulação do promotor FKS1 apresentaram sensibilidade semelhante aos

mutantes não transformados. Esses resultados mostram que o promotor de FKS2 parece

responder ao choque térmico, visto que direcionou a expressão de 1-3-β-glicana sintase em

resposta ao aumento de temperatura. No promotor de FKS2 de S. cerevisiae não há HSE

dentro de uma seqüência de pelo menos 1 kb a montante do sítio de iniciação da tradução

(Zhao et al, 1998). É proposto por Kim et al. (2008) que a atividade transcricional de FKS2

em S. cerevisiae requer a formação de um complexo entre Mpk1, componente da cascata

MAP quinase, e Swi4/Swi6, dois componentes do fator transcricional SBF.

A análise com a ferramenta TESS não localizou sítios para Swi4/Swi6 no promotor do

gene Pbfks1, mas nossa análise revelou a presença de quatro elementos de resposta ao choque

69



térmico. Yamamoto et al. (2005) relataram que em S. cerevisiae a proteína HSF, fator de

transcrição de resposta ao choque térmico, é necessária para a resposta ao choque térmico

induzindo não apenas a transcrição de HSPs, mas também de genes que codificam proteínas

envolvidas em uma diversidade de processos celulares, tais como degradação, geração de

energia, metabolismo de carboidratos e manutenção da integridade da parede celular. Para

investigar o papel de HSE na regulação do promotor do gene 1,3-β-glicana sintase de P.

brasiliensis, selecionamos a seqüência correspondente à sonda Pbfks1(a) que contém um

elemento de resposta ao choque térmico para realização do ensaio de retardo da mobilidade

eletroforética.

Realizamos o EMSA com a sonda Pbfks1(a) e extratos protéicos de micélio e

levedura, utilizando como competidores a sonda mutada ou em HSE ou a sonda mutada no

putativo TATA Box (figura21).

70



___________________________________________________________________________

Sonda Pbfks1(a): ATTACGAGCTACACCTCTCTCCTATATAGCCCGT

Competidor Mut1(TATA): ATTACGAGCTACACCTCTCTCCCCCCCCGCCCGTCGAAGGAAGAAGAGAAAT

Competidor Mut2(HSE): ATTACGAGCTACACCTCTCTCCTATATAGCCCGTCGCCGGCCGCCGAGCCAT

___________________________________________________________________________

Figura 21. Ensaio de Retardo da Mobilidade Eletroforética utilizando as sondas

Pbfks1(a) mutadas e extrato protéico de micélio ou levedura de P. brasiliensis – (A) 1:

sonda Pbfks1(a) livre; 2: sonda Pbfks1(a) + extrato de micélio; 3 e 4: sonda Pbfks1(a) +

extrato de micélio + competidor específico 25X e 50X, respectivamente; 5 e 6: sonda

Pbfks1(a) + extrato de micélio + competidor Mut1(TATA) 25X e 50X, respectivamente; 7 e

8: sonda Pbfks1(a) + extrato de micélio + competidor Mut2(HSE) 25X e 50X,

respectivamente; 9: sonda Pbfks1(a) + extrato de levedura; 10 e 11: sonda Pbfks1(a) + extrato

de levedura + competidor específico 25X e 50X, respectivamente; 12 e 13: sonda Pbfks1(a) +

extrato de levedura + competidor Mut1(TATA) 25X e 50X, respectivamente; 14 e 15: sonda

Pbfks1(a) + extrato de levedura + competidor Mut2(HSE) 25X e 50X, respectivamente. (B)

Seqüência da sonda Pbfks1(a), destacando em negrito o HSE, e sublinhado encontra-se um

putativo TATA Box. Nas sondas Pbfks1(a) mutadas, os sítios modificados encontram-se em

duplo sublinhado.

71



Conforme observamos na figura 21, a sonda Pbfks1(a) apresenta um retardo da

mobilidade eletroforética quando incubada com extrato de micélio (poço 2) e com extrato de

levedura (poço 9). Observamos que para as duas condições, o retardo é gradativamente

abolido na presença do competidor em que o HSE encontra-se modificado (poços 7, 8, 14 e

15). Sakuray e Takemori (2007) demonstraram que a alteração de GAA por GCC em uma das

unidades repetitivas de HSE do promotor de um gene de S. cerevisiae reduz drasticamente a

atividade transcricional em ensaios de gene repórter. Em nosso trabalho, modificamos o sítio

CGAAGGAAGAAGAGAAA para CGCCGGCCGCCGAGCC. Entretanto, observamos que

mesmo com essa modificação a sonda continuou atuando como competidor. Visto que a

modificação desse sítio não interfere no ensaio de competição, esse resultado revela que essa

interação não está associada ao HSE. Observamos ainda que a interação não é abolida na

presença do competidor em que o putativo TATA Box está modificado (poços 5, 6, 12 e 13),

indicando que a modificação desse sítio impede a competição. Esse resultado sugere que a

interação está ocorrendo no TATA Box.

O TATA Box é um elemento presente na estrutura do promotor onde se liga a proteína

TPB (TATA Binding Protein) para que o complexo de iniciação da transcrição seja formado.

A seqüência consenso para o TATA Box é TATAAA, mas observa-se que uma ampla

variedade de seqüências pode atuar como TATA Box in vivo (revisto por Butler et al., 2002).

TBP é uma subunidade do fator de transcrição basal TFIID, e em S. cerevisiae essa

subunidade foi purificada preferencialmente como um único polipeptídeo do que como um

complexo multiprotéico. Em geral, o TATA Box é localizado entre 25 a 30 pb a montante do

sítio de iniciação da transcrição, e mutações no TATA Box podem reduzir ou abolir a

atividade promotora (revisto por Smale e Kadonaga, 2003). Porém, observa-se que o TATA

Box não é um componente universal dos promotores e que não apenas TBP, mas também

fatores a ele associados podem mediar a iniciação da transcrição governada pela RNA

polimerase II (revisto por Muller et al., 2007). Entretanto, a dificuldade de identificação de

motivos funcionais compromete a compreensão da estrutura e função promotora na regulação

do respectivo gene. Nessa perspectiva, a identificação de elementos funcionais no promotor

do gene Pbfks1 poderá contribuir para a compreensão da regulação de promotores em P.

brasiliensis.

72



4.2.2 – Análise da Expressão do Gene 1,3-β-glicana sintase de P. brasiliensis

Em P. brasiliensis, o conteúdo de 1,3-β-glicana é maior na parede celular de micélio,

enquanto que o conteúdo de 1,3-α-glicana é superior na parede celular de levedura

(Kanetsuna et al., 1972). Marques et al. (2004) relataram que nesse organismo a expressão de

1,3-α-glicana sintase é maior na levedura do que no micélio. Nesse sentido, analisamos os

níveis do transcrito do gene 1,3-β-glicana sintase nas fases de micélio e levedura de P.

brasilienses utilizando a técnica de RT-PCR em Tempo Real. Os resultados estão

apresentados na tabela 6.

Tabela 6. Análise da diferença entre os níveis de transcrito do gene Pbfks1 em micélio e

em levedura de P. brasiliensis – A análise da expressão foi realizada por RT-PCR em Tempo

Real utilizando RNA obtido de culturas de micélio e levedura de P. brasiliensis. Como

controle interno, foi realizada a amplificação do gene constitutivo L34 de P. brasiliensis. A

análise dos dados de amplificação foi realizada utilizando-se o método ∆∆Ct.

Conforme observamos na tabela 6, os níveis do transcrito do gene Pbfks1 foram

maiores na fase micelial do que na fase de levedura. Esses resultados sugerem que a

expressão do gene Pbfks1 está correlacionada com a síntese de 1,3-β-glicana, visto que na

parede celular de P. brasiliensis esse polímero predomina na forma de micélio.

Observamos que a região promotora do gene Pbfks1 apresenta dois sítios para o fator

de transcrição CreA, que reprime a expressão gênica na presença de glicose, e quatro sítios

para o fator de transcrição FacB, requerido para crescimento em meio com acetato como fonte

de carbono. Nessa perspectiva, verificamos também os níveis do transcrito do gene 1,3-β-

glicana sintase em culturas de P. brasiliensis quando o fungo foi crescido em glicose ou em

acetato de sódio por um período de 5 horas (tabela 7).

73



Tabela 7. Análise da diferença entre os níveis de transcrito do gene Pbfks1 em glicose e

acetato de sódio – A análise da expressão foi realizada por RT-PCR em Tempo Real

utilizando RNA obtido de culturas de levedura de P. brasilienis crescidas em glicose ou

acetato 2%, por um período de cinco horas. Como controle interno, foi realizada a

amplificação do gene constitutivo L34 de P. brasiliensis. A análise dos dados de amplificação

foi realizada utilizando-se o método ∆∆Ct.

Observamos na tabela 7 que os níveis do transcrito do gene 1,3-β-glicana sintase

foram maiores após o crescimento em acetato de sódio. Mazur et al. (1995) relataram que em

S.cerevisiae os níveis de mRNA de FKS2 são maiores quando o fungo é crescido em acetato

de sódio do que quando crescido em glicose. Dessa forma, sugerimos que o gene 1,3-β-

glicana sintase de P. brasiliensis apresenta um comportamento transcricional semelhante ao

descrito para FKS2 de S. cerevisiae.

Pereira et al. (2000) relataram que os níveis de mRNA de Pbfks1 não foram detectados

por RT-PCR em culturas crescidas em meio com glicose. Nossos resultados demonstraram

que a expressão de Pbfks1, apesar que após um período de cinco horas foi maior em acetato,

também ocorre na presença de glicose. Ressaltamos que a RT-PCR em Tempo Real é uma

metodologia que apresenta maior sensibilidade e, por isso, pode justificar a divergência na

detecção dos transcritos.

4.2.3 – Sistema de Gene Repórter lacZ para Análise da Região Promotora do Gene 1,3-

β-glicana sintase de P. brasiliensis

4.2.3.1 - Confirmação da Clonagem da Região Promotora do Gene Pbfks1 no Vetor

Gene Repórter

Para avaliar a atividade do promotor do gene Pbfks1, realizamos a transformação de A.

nidulans com o vetor gene repórter contendo a região promotora do gene Pbfks1. Para

confirmação da clonagem do inserto no vetor gene repórter, esse vetor foi digerido com a

enzima de restrição Bam H1. Após a digestão, o vetor gene repórter liberou o inserto de

74



aproximadamente 800 pb (Figura 22), correspondente ao fragmento de DNA clonado. Dessa

forma, confirmamos que o vetor utilizado contém o inserto de nosso interesse.

Figura 22. Análise eletroforética em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo

(0,5 μg/mL) da digestão do vetor gene repórter (vetor 42B da série pAN923) contendo a

região promotora do gene Pbfks1 – M: marcador de massa molecular (1 Kb Plus DNA

Ladder); 1: vetor intacto; 2: digestão do vetor com a enzima de restrição Bam H1, indicando

um fragmento de DNA de aproximadamente 800 pb correspondente à região promotora do

gene Pbfks1 clonada no vetor gene repórter.

4.2.3.2 - Confirmação da Transformação de A. nidulans com o Vetor Gene Repórter

Contendo a Região Promotora do Gene Pbfks1

Após a transformação de A. nidulans com o vetor gene repórter contendo a região

promotora do gene Pbfks1 e obtenção de transformantes estáveis mitoticamente, foi realizada

a extração de DNA total dos transformantes. Empregamos a técnica de PCR para amplificar

um fragmento do promotor do gene Pbfks1, a fim de confirmar a transformação. A figura 23

apresenta a análise eletroforética dos produtos obtidos pela PCR.

75



Figura 23. Análise eletroforética em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo

(0,5 μg/mL) da amplificação de um fragmento do promotor do gene Pbfks1 a partir do

DNA dos fungos transformantes – M: marcador de massa molecular (100 pb DNA Ladder);

1, 2 e 3: amplificação a partir do DNA total dos transformantes B, C e D, respectivamente; 4:

C-, correspondente à reação de PCR sem adição de DNA; 5: PCR a partir do DNA da

linhagem argB

de A. nidulans

(linhagem não transformada); 6: PCR a partir do DNA do

fungo transformado com vetor sem conter o promotor do gene Pbfks1 como inserto.

Observamos na figura 23 a amplificação de um fragmento de DNA de

aproximadamente 800 pb, correspondente ao promotor do gene Pbfks1 presente no DNA dos

transformantes B, C e D. Verificamos também que o DNA do fungo transformado com vetor

sem conter o promotor do gene Pbfks1 como inserto, assim como o DNA da linhagem argB

de A. nidulans (linhagem não transformada), não apresentam amplificação correspodente ao

promotor do gene Pbfks1, conforme o esperado. Dessa forma, confirmamos transformação de

A. nidulans com o vetor gene repórter contendo a região promotora do gene Pbfks1.

4.2.3.3 - Análise da Atividade Promotora do Gene Pbfks1 em Diferentes Fontes de

Carbono

Avaliamos a atividade promotora do gene Pbfks1 utilizando o sistema de gene repórter

lacZ em A. nidulans para verificar diferenças na produção da β-galactosidase quando os

transformantes foram crescidos em glicose e acetato de sódio como fontes de carbono.

Entretanto, não detectamos a atividade de β-galactosidase nos ensaios em placa (dados não

mostrados).

76



Em S. cerevisiae, as proteínas Fks1p e Fks2p, codificadas pelos genes FKS1 e FKS2,

respectivamente, parecem ter regulações opostas. Durante o crescimento em glicose, a

expressão de FKS1 é alta e a de FKS2 é baixa; durante a esporulação, em que a principal fonte

de carbono é o acetato, a expressão de FKS1 é baixa e a de FKS2 é alta. Mazur et al. (1995)

mostraram que a expressão de FKS2 em S. cerevisiae predomina durante o crescimento em

acetato, e que os níveis de mRNA decrescem quando o acetato é substituído por glicose.

Nossos resultados de RT-PCR em Tempo Real sugerem um comportamento de Pbfks1

semelhante ao observado para FKS2 de S. cerevisiae, visto que os níveis do transcrito do gene

1,3-β-glicana sintase de P. brasiliensis foram maiores em meio contendo acetato do que em

meio contendo glicose. Segundo Zhao et al. (1998), a repressão por glicose em FKS2 de S.

cerevisiae é aparentemente regulada por Mig1p, homólogo de CreA. Foram identificados dois

sítios de ligação para Mig1p no promotor de FKS2, ambos dentro de uma região necessária

para a indução de FKS2 em fontes pobres de carbono em ensaios de gene repórter. Além

disso, mutantes que não expressam Mig1p apresentaram expressão de FKS2 em níveis

elevados quando cultivados em meio contendo glicose. Observamos que o promotor do gene

Pbfks1 apresenta dois sítios para o fator de transcrição CreA, e ressaltamos que foram

identificados quatro sítios para o fator de transcrição FacB, requerido para crescimento em

meio contendo acetato como fonte de carbono.

A atividade da β-galactosidase pode ser detectada pela visualização em placa da

coloração azul dos transformantes, ou pela quantificação em meio líquido, em que os ensaios

enzimáticos detectam a atividade de β-galactosidase na presença do substrato o-nitrofenil-β-

D- galactopiranosídeo (ONPG). O sistema de gene repórter lacZ é atualmente amplamente

empregado, e tem revelado dados sobre a regulação de genes de Candida sp. (BaeK et al.,

2006; Hsu et al., 2008; Lenardon et al., 2008; Walker et al., 2008), de S. cerevisiae (Zhao et

al., 2008) e A. nidulans (Hynes et al., 2006). Entretanto, observa-se que a realização de

ensaios em meio líquido é predominante. A quantificação enzimática da proteína repórter

fornece uma estimativa da produção da proteína regulada pelo promotor em estudo mesmo em

concentrações baixas, e permite a realização de comparações precisas das diferenças da

atividade promotora em diferentes condições. Em nosso trabalho, realizamos a transformação

de A. nidulans com o vetor gene repórter lacZ contendo o promotor do gene Pbfks1,

confirmamos a transformação por meio da seleção de clones mitoticamente estáveis que

apresentaram a marca de seleção auxotrófica, e verificamos por PCR a presença do promotor

77



do gene Pbfks1 no DNA dos transformantes. Realizamos o ensaio piloto para detecção da

atividade de β-galactosidase em placa, mas nossos resultados são preliminares, e

consideramos que a padronização de ensaios quantitativos poderão elucidar a atividade

promotora do gene Pbfks1 no sistema de gene repórter lacZ.

78



5 – CONCLUSÃO

Em nosso trabalho, analisamos a região promotora dos genes Pbchs4 e Pbfks1.

Por meio de EMSA, verificamos que a sonda Pbchs4(b), que contém um sítio para o

fator de transcrição CreA, não interage com o domínio de ligação ao DNA da proteína CreA

de H. grisea, mas apresenta interações DNA-proteína específicas com proteínas do extrato

protéico total obtido a partir das fases de micélio e levedura. Demonstramos também que a

sonda Pbchs4(a), que contém sítio para o fator de transcrição PacC e dois elementos de

resposta ao estresse (STRE), não interage com o domínio de ligação ao DNA da proteína

PacC de P. brasiliensis. A sonda Pbchs4(a) apresenta o nucleotídeo “G” na posição cinco da

seqüência consenso reconhecida por PacC de A. nidulans. Embora a substituição de “A” por

“G” nessa posição seja descrita como tolerada nesse organismo, PacC de P. brasiliensis não

reconheceu esse sítio no promotor Pbchs4, mas demonstramos que a proteína recombinante

PacCPb-GST é capaz de reconhecer sondas de H. grisea que apresentam o sítio GCCAAG,

que apresenta “A” na quinta posição. Além disso, ensaios com sondas mutadas sugerem que

uma interação específica que ocorre entre a sonda Pbchs4(a) e extratos protéicos das fases de

micélio e levedura envolva o motivo STRE. Observamos que a sonda Pbfks1(a), que contém

um elemento de resposta ao choque térmico (HSE) e um TATA Box, apresenta uma interação

DNA-proteína específica com extratos protéicos das fases de micélio e levedura. Ensaios com

sondas mutadas sugerem que essa interação possa estar ocorrendo no TATA Box e não no

HSE.

Em ensaios de gene repórter lacZ para análise do promotor do gene Pbfks1 não foi

possível detectar a atividade em placa de β-galactosidase, mas resultados de RT-PCR em

Tempo Real revelaram que o transcrito do gene Pbfks1 é mais abundante em meio contendo

acetato do que em meio contendo glicose como fonte de carbono, sugerindo um

comportamento semelhante ao descrito para FKS2 de S. cerevisiae.

A análise dos promotores dos genes Pbfks1 e Pbchs4 realizada pelo nosso grupo de

pesquisa fornece dados pioneiros sobre o estudo de promotores de P. brasiliensis, e a

continuação dessas investigações poderão contribuir para a compreensão da regulação da

79



expressão gênica nesse patógeno, particularmente no tocante à biossíntese e remodelação da

parede celular.

6 – PERSPECTIVAS

Î Avaliar a atividade do gene repórter lacZ em meio líquido utilizando glicose e acetato

para verificar o efeitos dessas fontes de carbono na atividade promotora do gene

Pbfks1;

Î Avaliar se os sítios para CreA e FacB identificados na região promotora do gene

Pbfks1 interagem com extratos protéicos de micélio e levedura de P. brasiliensis para

determinar o possível papel desses fatores na regulação do promotor, visto que por

meio de RT-PCR em Tempo Real observamos que o transcrito do gene Pbfks1 é maior

em meio contendo acetato do que em meio contendo glicose como fonte de carbono;

Î Avaliar qual é o sítio de ligação presente na sonda Pbchs4(b) que está interagindo com

proteínas dos extratos protéicos de micélio e levedura;

Î Avaliar a atividade do gene repórter lacZ em meio líquido em condições de estresse

osmótico para verificar o efeito dessa condição na atividade promotora do gene

Pbchs4, e compreender a regulação no elemento de resposta ao estresse proposta neste

trabalho;

Î Avaliar se o sítio GCCAAG, que apresenta o nucleotídeo “A” na posição 5 e foi

identificado na região intergênica dos genes Pbchs4 e Pbchs5, interage com PacCPb-

GST, a fim de elucidar a(s) seqüência(a) que pode(em) ser reconhecida(s) por PacC de

P. brasiliensis.

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7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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