43
Os parâmetros cinéticos foram calculados e estão apresentados na tabela 5.
A trombina é 20 a 30 vezes mais eficiente na hidrólise dos substratos de 26 aa com
relação aos substratos menores. A enzima apresentou a mesma preferência de
resíduos de aminoácidos em P
3
´, sendo a arginina o melhor resíduo, enquanto que o
ácido aspártico foi o pior resíduo. Já os resíduos prolina e alanina resultaram numa
eficiência média. Esta grande diferença na eficiência catalítica entre os substratos
está, principalmente, no tempo de renovação da enzima que é 50 vezes menor para
os substratos de 11 aa, enquanto que os valores de K
m
não apresentam uma
diferença significativa para ambos.
Tabela 5. Parâmetros cinéticos da trombina com os substratos fluorogênicos e seus
moduladores. Experimento realizado com 0,05 a 2,2 µM dos substratos, 0,36 nM de
trombina. Cinética com a presença dos moduladores foi realizada com 250 µM de
glicirrizina e 15 nM de botrojaracina em pH 7,5 à 37 °C (Cada ponto é a média ±SD
de 3 experimentos independentes).
No ensaio enzimático na presença de glicirrizina e botrojaracina, inibidores
que se ligam ao exosítio 1, estes inibiram a atividade catalítica da enzima somente
para os substratos maiores. A eficiência catalítica diminuiu cerca de 2 a 3 vezes para
ambas moléculas. Entretanto, a análise dos parâmetros cinéticos mostra que estes
inibidores atuam por mecanismos diferentes. Enquanto a botrojaracina aumentou o
26aa (P
3
´) K
m
(µM) K
cat
(s
-1
) K
cat
/K
m
(µM
-1
s
-1
)
K
m
(µM) K
cat
(s
-1
) K
cat
/K
m
(µM
-1
s
-1
)
K
m
(µM) K
cat
(s
-1
) K
cat
/K
m
(µM
-1
s
-1
)
Glicirrizina Botrojaracina
-R-
-P-
-A-
-D-
-R-
-P-
-A-
-D-
1,2 ± 0,3 18 ± 2,6 16 ± 2,5
1,3 ± 0,2 14 ± 0,9 11 ± 0,7
0,6 ± 0,05 7,0 ± 0,9 10 ± 1,2
1,2 ± 0,12 6,0 ± 0,9 5,0 ± 0,9
1,8 ± 0,16 7,7 ± 0,9 4,5 ± 0,8
2,3 ± 0,6 4,4 ± 0,8 2,1 ± 0,2
2,2 ± 0,4 5,6 ± 1,1 2,7 ± 0,6
1,6 ± 0,1 2,8 ± 0,2 1,8 ± 0,2
2,5 ± 0,4 16,8 ± 2,7 6,9 ± 0,7
2,3 ± 0,1 11 ± 0,7 5,0 ± 0,1
2,2 ± 0,2 9,2 ± 1,7 4,2 ± 0,8
3,4 ± 0,8 8,3 ± 1 2,4 ± 0,4
11aa (P
3
´)
0,42 ± 1e
-2
0,34 ± 3e
-2
0,8 ± 1e
-1
0,52 ± 1e
-2
0,15 ± 2e
-2
0,35 ± 7e
-2
0,63 ± 9e
-2
0,21 ± 1e
-2
0,33 ± 3e
-2
0,69 ± 1e
-1
0,13 ± 1e
-2
0,2 ± 3e
-2
0,38 ± 3e
-2
0,4 ± 3e
-2
1,0 ± 1e
-1
0,56 ± 6e
-2
0,2 ± 2e
-2
0,36 ± 5e
-2
0,53 ± 5e
-2
0,17 ± 3e
-2
0,33 ± 6e
-2
0,57 ± 5e
-2
0,14 ± 8e
-3
0,24 ± 3e
-2
0,35 ± 3e
-2
0,5 ± 5e
-2
1,4 ± 2e
-1
0,51 ± 2e
-2
0,2 ± 2e
-2
0,46 ± 5e
-2
0,55 ± 1e
-2
0,16 ± 2e
-2
0,3 ± 3e
-2
0,55 ± 3e
-2
0,15 ± 2e
-2
0,3 ± 4e
-2
26aa (P
3
´) K
m
(µM) K
cat
(s
-1
) K
cat
/K
m
(µM
-1
s
-1
)
K
m
(µM) K
cat
(s
-1
) K
cat
/K
m
(µM
-1
s
-1
)
K
m
(µM) K
cat
(s
-1
) K
cat
/K
m
(µM
-1
s
-1
)
Glicirrizina Botrojaracina
-R-
-P-
-A-
-D-
-R-
-P-
-A-
-D-
1,2 ± 0,3 18 ± 2,6 16 ± 2,5
1,3 ± 0,2 14 ± 0,9 11 ± 0,7
0,6 ± 0,05 7,0 ± 0,9 10 ± 1,2
1,2 ± 0,12 6,0 ± 0,9 5,0 ± 0,9
1,8 ± 0,16 7,7 ± 0,9 4,5 ± 0,8
2,3 ± 0,6 4,4 ± 0,8 2,1 ± 0,2
2,2 ± 0,4 5,6 ± 1,1 2,7 ± 0,6
1,6 ± 0,1 2,8 ± 0,2 1,8 ± 0,2
2,5 ± 0,4 16,8 ± 2,7 6,9 ± 0,7
2,3 ± 0,1 11 ± 0,7 5,0 ± 0,1
2,2 ± 0,2 9,2 ± 1,7 4,2 ± 0,8
3,4 ± 0,8 8,3 ± 1 2,4 ± 0,4
11aa (P
3
´)
0,42 ± 1e
-2
0,34 ± 3e
-2
0,8 ± 1e
-1
0,52 ± 1e
-2
0,15 ± 2e
-2
0,35 ± 7e
-2
0,63 ± 9e
-2
0,21 ± 1e
-2
0,33 ± 3e
-2
0,69 ± 1e
-1
0,13 ± 1e
-2
0,2 ± 3e
-2
0,38 ± 3e
-2
0,4 ± 3e
-2
1,0 ± 1e
-1
0,56 ± 6e
-2
0,2 ± 2e
-2
0,36 ± 5e
-2
0,53 ± 5e
-2
0,17 ± 3e
-2
0,33 ± 6e
-2
0,57 ± 5e
-2
0,14 ± 8e
-3
0,24 ± 3e
-2
0,35 ± 3e
-2
0,5 ± 5e
-2
1,4 ± 2e
-1
0,51 ± 2e
-2
0,2 ± 2e
-2
0,46 ± 5e
-2
0,55 ± 1e
-2
0,16 ± 2e
-2
0,3 ± 3e
-2
0,55 ± 3e
-2
0,15 ± 2e
-2
0,3 ± 4e
-2