( PDF ) Análise citogenética e morfométrica em populações de Rhinella pombali (Baldissera Jr., Caramaschi e Haddad, 2004) e Rhinella crucifer (Wied-Neuwied, 1821) (Anura, Bufonidae)

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DIEGO

JOSÉ

SANTANA

SILVA

ANÁLISE CITOGENÉTICA E MORFOMÉTRICA EM POPULAÇÕES DE

Rhinella pombali (BALDISSERA JR., CARAMASCHI E HADDAD, 2004) E

Rhinella crucifer (WIED-NEUWIED, 1821) (ANURA, BUFONIDAE)

VIÇOSA

MINAS

GERAIS

–

BRASIL

2010

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-Graduação

em Biologia Animal, para obtenção do título

de Magister Scientiae.

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DIEGO

JOSÉ

SANTANA

SILVA

ANÁLISE CITOGENÉTICA E MORFOMÉTRICA EM POPULAÇÕES DE

Rhinella pombali (BALDISSERA JR., CARAMASCHI E HADDAD, 2004) E

Rhinella crucifer (WIED-NEUWIED, 1821) (ANURA, BUFONIDAE)

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-Graduação

em Biologia Animal, para obtenção do título

de Magister Scientiae.

APROVADA: 22 de fevereiro de 2010

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O Diego não passa batido, passa batendo

(Ana Paula Motta)

Tem horas que a gente se pergunta

Por que é que não se junta tudo numa coisa só?

(Fernando Anitelli)

A vida é um picadeiro, e se não formos os palhaços

seremos sempre meros espectadores...

iii

Ao Mário e à Carmen. Por mais que HERÓIS, serem PAIS!

GRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, que apesar de ter muitos nomes, de uma forma única, sei que

foi uma força presente sempre na minha vida, e que de certa forma mostrou uma direção

em meio ao caos, colocando tudo ao seu devido tempo, mesmo quando eu achava que

não.

À minha família! Razão principal da minha vontade de vencer e querer mais. Aos

meus pais, Mário & Carmen, que NUNCA deixaram seu girino perdido à deriva, e

SEMPRE me apoiaram nas minhas decisões (mesmo quando loucas), pois acreditam o

quão grande posso ser. E aos meus irmãos, Christiane e Mário Lucas, 2/3 meus, os

outros dois mosqueteiros, e principalmente, meus amigos com os quais eu sei que vou

poder sempre contar.

Ao Jorge Dergam, por aceitar me orientar (que desafio hein!), mas por realmente

estar presente sentadinho na sua cadeira podendo sempre que possível ouvir meus

pedidos de socorro e puxando minha orelha nos momentos certos.

Ao Renato Feio, além de co-orientador, amigo e parceiro de boteco nas horas

vagas, por tantas conversas enriquecedoras, e por me acolher quando graduando ao

Museu e me apresentar ao mundo das pesquisas com anfíbios.

À Gisele Lessa, além de professora, ter se tornado uma pessoa tão jóia na minha

vida acadêmica e uma “mãezona” no museu, atendendo também muitas das minhas

“pentelhações”.

Aos membros da banca, pela gentileza de participar com a árdua tarefa de

contribuir com a temida “arguição”.

Ao Rubens Pazza e ao Pierre por cederem seu laboratório e seu tempo para tirar

algumas fotos de cromossomos.

Aos curadores Antônio J. S. Argolo (UESC), Luisa M. Sarmento-Soares

(MBML), Rose Mary (CHUFJF), Guarino R. Colli (UnB), Luciana B. Nascimento

(MCNAN-PUC) pelo empréstimo de material aos seus cuidados; e a José P. Pombal

Júnior (MNRJ) pela recepção no Museu Nacional quando fui analisar a série tipo de R.

pombali.

Aos Professores Mirco Solé (UESC) e Natan M. Maciel (UFG) pelo envio de

alíquotas de tecidos.

Agradeço especialmente também à Priscila S. Hote, pela ajuda inestimável com a

morfometria dos espécimes, mesmo quando solicitada para me acompanhar ao Rio de

Janeiro pra analisar a série tipo. Pri, sei que você é gostosa, sexy, inteligente e, não

menos importante, humilde. Mesmo assim, aumentando um pouquinho seu ego:

MUITO OBRIGADO!

Ao Mário R. Moura, pela ajuda inestimável com as análises estatísticas e sempre

me atendendo, mesmo que por e-mail ou por um telefonema apressado pedindo socorro.

À Sarah, que mesmo na minha fase final do mestrado, me ajudou tanto via online,

cumprindo compromissos meus, me apaziguando, ouvindo muito minhas “encheções” e

não menos importante, trazendo sempre um sorriso no rosto deixando meu dia melhor.

A toda FAMÍLIA do Museu de Zoologia João Moojen, que me acompanharam

nos desesperos, pindaíbas, alegrias, festas, bebedeiras, choros... amigos sempre

presentes (herpetólogos ou não): Manú, Henriqueta, São-Pedro, Finin, Eliana, Jussa,

Mário, Zé, Johny, Sarah, Larissa, Ana Paula, Robertão, Renatinha, Ana Bárbara,

Joãozinho, Vitim, Maria Clara, Rodolfo, Renato, Gisele, Rômulo.

Ao Henrique e ao Emanuel (Manú) pela amizade sincera, pelo companheirismo e

por tornarem-se verdadeiros irmãos dentro do museu.

À Patrícia da Silva Santos (Patricinha) pela ajuda gigantesca na coleta dos

espécimes de Caratinga e região, e por sua amizade tão valiosa para mim e por

colaborar tanto para o meu crescimento pessoal e profissional.

Ao Roberto Dantas pelo incrível auxílio no Espírito Santo, indo ao Museu Mello

Leitão por um excelente concerto de Heavy Metal em Vitória. Muito Obrigado

Robertão, ajuda fundamental neste trabalho.

Ao pessoal do “Beagle” (Laboratório de Sistemática Molecular), do presente e do

passado, amigos e parceiros pra tempo bom ou ruim, sempre se esquivando do maluco

desastrado aqui, agradeço muito ao Hilton, Néia, Jacobina, Lucioni, Fred, Udson,

Gisele, Ana Paula, Lucas.

À todos que me ajudaram nas coletas, ou coletaram, ou do nada aparecia uma

sacola com um sapo dentro com meu nome de manhã cedinho no museu. São tantas

pessoas que não lembro o nome de todos, muito obrigado.

Aos meus eternos amigos do G.H.A.E. pela paciência, pelo apoio, pela “zoação”,

pela “chapação” também, pelos reveillons, músicas, alegrias e loucuras.

À República “Os Largado”, por tantas festas e farras, e terminando minha estadia,

sei que tenho mais uma família que posso contar sempre. Hoje grandes amigos e amiga.

Tenho certeza que me esqueci de mencionar muuuuuuuuuitas pessoas, que com

certeza contribuíram para a conclusão desta dissertação. A estes, perdoem essa cabeça

esquecida, mesmo assim, meu muito obrigado.

Aos tantos sapos, que sem os quais não teria o “por que” dessa pesquisa e um

motivo real pela qual estar fazendo pesquisa.

À UFV e ao Programa de Biologia Animal pelo aprendizado e a oportunidade.

vii

IOGRAFIA

Diego José Santana Silva, 2º filho de Mário José Pereira da Silva e Carmen

Côrtes Santana Silva, nasceu em Muriaé, Minas Gerais, em 18 de junho de 1985.

Concluiu o Ensino Médio em dezembro de 2003, na Escola Estadual Dr.

Olavo Tostes em Muriaé, Minas Gerais. Em fevereiro de 2004 iniciou o curso de

Ciências Biológicas na Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras “Santa Marcelina”

também em Muriaé. Durante a graduação foi estagiário no Museu de Zoologia João

Moojen e do Beagle - Laboratório de Sistemática Molecular da UFV. Em 15 de

Dezembro de 2007 graduou-se Licenciado em Ciências Biológicas. Em fevereiro de

2008 ingressou no curso de Mestrado em Biologia Animal, na Universidade Federal de

Viçosa, defendendo a dissertação em março de 2010.

viii

UMÁRIO

ESUMO

................................................................................................................ ix

BSTRACT

............................................................................................................ xi

NTRODUÇÃO

ERAL

......................................................................................... 01

RTIGOS

IENTÍFICOS

...................................................................................... 07

Santana, D.J. & Dergam, J.A. Citogenética de Rhinella crucifer (Wied-

Neuwied, 1821) e R. pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad,

2004) (Anura, Bufonidae) no sudeste do Brasil.........................................

Santana, D.J.; Hote, P.S.; Feio, R.N. & Dergam, J.A. Análise morfométrica de

populações de Rhinella pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad,

2004)...........................................................................................................

3.C

ONCLUSÕES

ERAIS

........................................................................................ 53

RESUMO

SILVA, Diego José Santana, M. Sc,.Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de 2010.

Análise citogenética e morfométrica em populações de Rhinella pombali

(Baldissera Jr., Caramaschi e Haddad, 2004) e Rhinella crucifer (Wied-

Neuwied, 1821) (Anura, Bufonidae). Orientador: Jorge Abdala Dergam dos

Santos. Co-Orientadores: Renato Neves Feio e Gisele Mendes Lessa Del Giudice.

Separada recentemente de R. crucifer, R. pombali é uma espécie restrita ao Estado

de Minas Gerais. Embora uma revisão sistemática tenha sido feita há pouco tempo,

algumas inconsistências taxonômicas e geográficas seriam esperadas devido à grande

variação morfológica das espécies do grupo de R. crucifer. Neste trabalho descrevemos

o cariótipo, assim como os padrões Banda C e Ag-NOR de Rhinella crucifer e R.

pombali. Ambas espécies pertencentes ao grupo de R. crucifer, que não possuíam

cariótipo nem padrões de bandeamento descritos, particularmente porque o cariótipo

descrito de R. crucifer em outros trabalhos trata-se na verdade de R. ornata. As espécies

analisadas apresentaram número diplóide 2n=22, comum à família Bufonidae, com os

blocos de heterocromatina constitutiva localizadas na região centromérica dos

cromossomos podendo ocorrer uma marcação intersticial em alguns pares. As regiões

organizadoras de nucléolo encontraram-se nos braços curtos do sétimo par

cromossômico, assim como observado para R. ornata e outras espécies de Rhinella na

América do Sul. Não foram encontrados padrões espécie-específico para os indivíduos

analisados. Para os estudos morfométricos, baseamos nosso trabalho no estudo da

morfologia externa e em 25 caracteres morfométricos de 10 unidades taxonômicas

operacionais para verificar o nível de variação interpopulacional destes taxa e definir

possíveis variações em gradientes geográficos. Apresentamos também dados de

dimorfismo sexual para a espécie. Analisando aspectos regionais de simpatria de R.

pombali com outras espécies do grupo nos estados do Espírito Santo e do Rio de

Janeiro, percebemos algumas inconsistências quanto ao registro geográfico nesses

locais. Vemos que a espécie apresenta acentuado dimorfismo morfométrico e algumas

diferenças morfológicas separando machos e fêmeas. Nas análises populacionais entre

as 10 UTOs, foi verificado que não há separação significativa entre elas, não

apresentando também tendências de separação.

ABSTRACT

SILVA, Diego José Santana, M. Sc,.Universidade Federal de Viçosa, February, 2010.

Cytogenetic and morphometric analysis in populations of Rhinella pombali

(Baldissera Jr., Caramaschi e Haddad, 2004) and Rhinella crucifer (Wied-

Neuwied, 1821) (Anura, Bufonidae). Adviser: Jorge Abdala Dergam dos Santos.

Co-Advisers: Renato Neves Feio and Gisele Mendes Lessa Del Giudice.

Rhinella pombali is a species recently separated from R. crucifer, and considered

restricted to the state of Minas Gerais, in southeastern Brazil. Although their

systematics was recently revised, it remains some taxonomic and geographical

inconsistencies, due mainly to morphological variation of the R. crucifer group. We

described the karyotypes (conventional staining, C and NOR-banding of Rhinella

crucifer and R. pombali, two species of the R. crucifer group. Both species had diploid

number 2n=22, characteristic of the family Bufonidae. Blocks of constitutive

heterochromatin were centromeric, and occasional interstitial C-bands were observed in

some chromosomes. NORs were located in the short arm of chromosome seven, as

observed in R. ornata and other South American species of Rhinella. For the

morphometric study, we analyzed the external morphology and 25 morphometrical

characters of specimens of R. pombali, distributed in 10 operational taxonomic units

(OTUs) to verify the interpopulational variation of this species and detect possible

variations along geographical gradients. Sexually dimorphic traits were also included.

The analysis of regional aspects of simpatry between R. pombali and other species of

the R. crucifer group in Espírito Santo and Rio de Janeiro states, led to some

inconsistencies for the expected geographical distribution of taxonomic characters. The

results indicate the existence of high level of morphometrical sexual dimorphism and

some morphological differences between males and females. The analyses of the 10

OTUs showed absence of significant levels of differentiation among them.

1. I

NTRODUÇÃO

ERAL

A ordem Anura é composta por mais de 5.679 espécies distribuídas em 59

famílias, presentes em todo globo, exceto na Antártida e em algumas ilhas oceânicas

(Frost et al. 2009). A família Bufonidae composta por 46 gêneros e 528 espécies (Frost,

2009), tem distribuição ampla ocorrendo em quase todos os continentes, com exceção

da Austrália, Nova Guiné e Madagascar, onde Rhinella marina foi recentemente

introduzida (Narvaes, 2003; Frost, 2009). Bufonidae forma um grupo monofilético

corroborado pelas seguintes sinapomofias:órgão de Bidder, glândulas paratóides,

cintura peitoral arcífera ou firmisterna modificada, ausência de dentes, presença de

esterno e vômer e de diapófises sacrais bastante dilatadas (McDiarmid, 1971; Pough et

al. 1998; Frost et al. 2006).

Recentemente, os anfíbios atuais têm sido objeto de estudos filogenéticos, os

quais resultaram em grandes mudanças taxonômicas dentro de todos os grupos (e.g.

Faivovich et al. 2005; Frost et al. 2006; Grant et al. 2006; Hedges et al. 2008;

Guayasamin et al. 2009). O nome Bufo, até pouco tempo apresentava cerca de mais de

200 espécies distribuídas em aproximadamente 40 grupos fenéticos, com ocorrência

cosmopolita (Frost, 1985), embora fosse um gênero reconhecidamente parafilético

(Duellman & Trueb, 1994).

Em 2006, Frost et al. sugeriram uma primeira proposta evolutiva para toda a

classe Amphibia, baseada principalmente em dados moleculares. Em sua hipótese

filogenética, o gênero Bufo foi desmembrado em diferentes gêneros, sendo as espécies

restritas à América do Sul distribuídas principalmente entre os gêneros Chaunus

Wagler, 1828, Rhaebo Cope, 1862 e Rhinella Fitzinger, 1826. Assim, o gênero Bufo

tem sua distribuição atual na região temperada da Eurásia e do sul do Japão ao Norte da

África, no oriente médio, nordeste de Mianmar e no norte do Vietnã. Grant et al. (2006),

forneceram uma outra grande revisão, e apresentaram outra proposta filogenética para

Amphibia. Porém, Bufonidae se mantém como proposto por Frost et al. (2006).No

entanto, Chaparro et al. (2007), descrevendo uma espécies arbórea de bufonídeo do Peru

(Rhinella manu), propõem uma análise filogenética baseada principalmente em

caracteres moleculares, e em uma curta discussão, apresentam uma nova hipótese

filogenética para a família alocando as espécies chamadas de Chaunus (Frost et al.

2006) como pertencentes ao gênero Rhinella.

O grupo de Rhinella crucifer (sensu Baldissera-Jr et al. 2004) é composto por R.

abei (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004), R. crucifer (Wied-Neuwied, 1821),

R. henseli (A. Lutz, 1934), R. ornata (Spix, 1824) e R. pombali (Baldissera-Jr,

Caramaschi & Haddad, 2004). O grupo é diagnosticado pelos seguintes caracteres: 1.

frontoparietais alargados fusionados aos proóticos; 2. canal occipital parcialmente

recoberto; 3. ossos no teto da cabeça com exostose dermal moderada; 4. linha ou grupo

de tubérculos queratinizados partindo da comissura bucal em direção posterior; 5.

ausência da crista craniana pré-ocular, parcialmente nas espécies menores, sempre

presente e fortemente elevada nas espécies maiores; 6. linha de tubérculos glandulares

na lateral do corpo sempre presente, com a primeira glândula podendo ser unida ou não

à paratóide; 7. glândula paratóide de tamanho moderado a pequeno, triangular, elíptica

ou alongada; 8. tímpano sempre visível, às vezes recoberto por uma dobra de tegumento

na região posterior; 9. focinho variando de truncado a mucronado ou sub-elíptico a

arredondado em vista dorsal; 10. primeiro dedo nem sempre mais longo que o segundo;

11. tegumento bastante variável, de extremamente granuloso até um aveludado macio

(Duellman & Schulte, 1992; Baldissera, 2001; Baldissera et al. 2004).

A espécie Rhinella pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004) (Figura

1), pertence ao grupo de R. crucifer (Wied-Neuwied, 1821), o qual foi recentemente

revisado por Baldissera-Jr et al. (2004). Esta espécie foi separada de R. crucifer, sendo

R. pombali restrita ao estado de Minas Gerais, com sua distribuição geográfica através

da Mata Atlântica brasileira e áreas de transição com o cerrado no Estado (Baldissera-Jr

et al. 2004).

Figura 1. Holótipo (MNRJ 22311) de Rhinella pombali (CRC 84.10). Proveniente de

São Gonçalo do Rio Abaixo, MG.

Como todas as espécies do grupo, R. pombali é bastante adaptada a ambientes

antropizados, sendo muito comum em parques ou jardins (Santana et al. 2010). Rhinella

pombali apresenta o corpo recoberto por glândulas que conferem à sua pele um aspecto

bastante rugoso. É uma espécie de tamanho relativamente grande para o grupo (CRA

54,5 - 92,7 mm nos machos; 74,9 – 118,7 mm nas fêmeas), cabeça mais larga que

longa, com uma subdivisão claramente observada entre a cabeça e o corpo em vista

dorsal; focinho arredondado em vista dorsal; cristas craniais conspícuas; glândulas

paratóides ovóides, não subdivididas, mais largas na porção anterior, e em vista lateral

pendendo sobre a lateral do corpo; primeiro tubérculo da fileira lateral sempre em

contato com a glândula paratóide; padrão geral cinza escuro nos membros, variando

para um padrão único de coloração mais clara; em vida, as marcas amarelas aproximam

da cloaca e na superfície posterior das coxas pode ocorrer uma linha de tubérculos na

superfície ventral da parte posterior do esqueleto, formando uma franja em indivíduos

grandes (Baldissera-Jr et al. 2004).

Embora uma revisão sistemática tenha sido feita há pouco tempo (Baldissera-Jr et

al. 2004), algumas inconsistências poderiam ser encontradas devido à grande variação

morfológica das espécies e à inclusão de espécimes de novas áreas. É possível que os

limites específicos sejam um pouco mais amplos que os determinados por Baldissera-Jr

et al. (2004).

EFERÊNCIAS

ITADAS

Baldissera-Jr, F.A. 2001. Taxonomia e filogenia do grupo de Bufo crucifer Wied-

Neuwied, 1821 (Anura, Bufonidae). Tese de DoUGrado. Universidade Estadual

Paulista Júlio de Mesquita Filho.

Baldissera-Jr, F.; Caramaschi, U. & Haddad, C.F.B. 2004. Review of the Bufo crucifer

species group, with description of two new related species (Amphibia, Anura,

Bufonidae). Arquivos do Museu Nacional. 62(3): 255-282.

Chaparro, J.C.; Pramuk, J.B. & Gluesenkamp, A.G. 2007. A new species of arboreal

Rhinella (Anura: Bufonidae) from cloud forest of Southeastern Peru.

Herpetologica. 63(2): 203-212.

Duellman, W.E. & Schulte, R. 1992. Description of a new species of Bufo from

northern Peru with comments on phonetic groups of South American toads

(Anura: Bufonidae). Copeia 1992: 162-172.

Duelmann, W.E. & Trueb, L. 1994. Biology of amphibians. Johns Hopkins University

Press. Baltimore and London.

Faivovich, J.; Haddad, C.F.B.; Garcia, P.C.A.; Frost, D.R.; Campbell, J.A. & Wheeler,

W.C. 2005. Systematic review of the frog family Hylidae, with special reference

to Hylinae: Phylogenetic analysis and taxonomic revision. Bulletin of the

American Museum of Natural History. 294: 1-239.

Frost, D.R. 1985. Amphibian Species of the World. A Taxonomic and Geographical

Reference. Lawrence: Allen Press, Inc. e The Association of Systematic

Collections. 732p.

Frost, D.R. 2009. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 5.3

(12 February, 2009). Electronic Database Accessible at

http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/American Museum of Natural

History, New York, USA.

Frost, D. R.; Grant, T.; Faivovich, J.; Bain, R.H.; Haas, A.; Haddad, C.F.B.; De Sá,

R.O.; Channing, A.; Wilkinson, M.; Donnellan, S.C.; Raxworthy, C.J.; Campbell,

J.A.; Blotto, B.L.; Moler, P.; Drewes, R.C.; Nussbaum, R.A.; Lynch, J.D.; Green,

D.M. & Wheeler, W.C. 2006. The Amphibian tree of life. Bulletin of The

American Museum of Natural History. 297: 1-370.

Grant, T.; Frost, D.R.; Caldwell, J.P.; Gagliardo, R.; Haddad, C.F.B.; Kok, P.J.R.;

Means, D.B.; Noonan, B.P.; Schargel, W.E. & Wheeler, W.C. 2006. Phylogenetic

systematics of dart-poison frogs and their relatives (Amphibia: Athesphatanura:

Dendrobatidae). Bulletin of American Museum of Natural History. 299: 1-262.

Guayasamin, J.M.; Castroviejo-Fisher, S.; Trueb, L.; Ayarzagüena, J.; Rada, M.; &

Vilà, C. 2009. Phylogenetic systematics of glassfrogs (Amphibia: Centrolenidae)

and their sister taxon Allophryne ruthveni. Zootaxa 2100: 1-97.

Hedges, S.B.; Duellman, W.E.; & Heinicke, M. P. 2008. New World direct-developing

frogs (Anura: Terrarana): Molecular phylogeny, classification, biogeography and

conservation. Zootaxa 1737: 1-182.

McDiarmid, R.W. 1971. Comparative morphology and evolution of frogs of the

neotropical genera Atelopus, Dendrophryniscus, Melanophryniscus and

oreophrynella. Bulletin of the Los Angeles County Museum of Natural

History. 12: 1-66.

Narvaes, P. 2003. Revisão taxonômica das espécies de Bufo do complexo granulosus

(Amphibia, Anura, Bufonidae). Tese de DoUGrado. Universidade de São Paulo.

Pough, F.H.; Janis, C.H. & Heiser, J.B. 2003. Vida dos vertebrados. 3 ed. São Paulo,

699p.

Santana, D.J.; São-Pedro, V.A.; Hote, P.S.; Roberti, H.M.; Sant’Anna, A.C.;

Figueiredo-de-Andrade, C.A. & Feio, R.N. 2010. Anurans in the region of the

High Muriaé River, state of Minas Gerais, Brazil. Herpetology Notes. 3: 1-10.

2. A

RTIGOS

IENTÍFICOS

I – Santana, D.J. & Dergam, J.A. Citogenética de Rhinella crucifer (Wied-Neuwied,

1821) e R. pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004) (Anura,

Bufonidae) no sudeste do Brasil.

II – Santana, D.J.; Hote, P.S.; Feio, R.N. & Dergam, J.A. Análise morfométrica de

populações de Rhinella pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004).

2.1. Santana, D.J. & Dergam, J.A. Citogenética de Rhinella crucifer (Wied-Neuwied,

1821) e R. pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004) (Anura,

Bufonidae) no sudeste do Brasil.

Citogenética de Rhinella crucifer (Wied-Neuwied, 1821) e R. pombali (Baldissera-

Jr, Caramaschi & Haddad, 2004) (Anura, Bufonidae) no sudeste do Brasil.

Diego J. Santana* & Jorge A. Dergam

Departamento de Biologia Animal, Beagle – Laboratório de Sistemática Molecular,

Universidade Federal de Viçosa. CEP 36571-000, Viçosa, MG, Brasil.

* [email protected]

Abstract

We described the karyotypes (conventional staining, C and NOR-banding of

Rhinella crucifer and R. pombali, two species of the R. crucifer group. Both species had

diploid number 2n=22, characteristic of the family Bufonidae. Blocks of constitutive

heterochromatin were centromeric, and occasional interstitial C-bands were observed in

some chromosomes. NORs were located in the short arm of chromosome seven, as

observed in R. ornata and other South American species of Rhinella. Both species

showed karyotypes that were typical for the genus Rhinella.

Resumo

Neste trabalho descrevemos o cariótipo, assim como os padrões Banda C e Ag-

NOR de Rhinella crucifer e R. pombali, espécies pertencentes ao grupo de R. crucifer,

que não possuíam cariótipo nem padrões de bandeamento descritos, particularmente

porque o cariótipo descrito de R. crucifer em outros trabalhos trata-se na verdade de R.

ornata. As espécies analisadas apresentaram número diplóide 2n=22, comum à família

Bufonidae, com os blocos de heterocromatina constitutiva localizadas na região

centromérica dos cromossomos podendo ocorrer uma marcação intersticial em alguns

cromossomos. As regiões organizadoras de nucléolo encontraram-se nos braços curtos

do sétimo par cromossômico, assim como observado para R. ornata e outras espécies de

Rhinella na América do Sul. Não foram encontrados padrões espécie-específico para

nenhuma espécie analisada.

Introdução

A família Bufonidae Gray, 1825 é composta por 46 gêneros e 528 espécies (Frost,

2009), tem distribuição ampla ocorrendo em quase todos os continentes, com exceção

da Austrália, Nova Guiné e Madagascar, onde Rhinella marina foi recentemente

introduzida (Pough et al. 1998, Narvaes, 2009). Bufonidae forma um grupo

monofilético definido por várias sinapomorfias morfológicas como a presença do órgão

de Bidder, de glândulas paratóides, cintura peitoral arcífera ou firmisterna modificada,

ausência de dentes, presença de esterno e vômer, presença de esterno e de diapófises

sacrais bastante dilatadas (Pough et al. 1998; McDiarmid, 1971; Frost et al. 2006).

O gênero Rhinella Fitzinger, 1826 foi recentemente associado a diversas espécies

de bufonídeos das Américas (Chaparro et al., 2007) desde o baixo vale do Rio Grande

no sul do Texas (EUA) e sul de Sonora, pelo México tropical e América Central,

ocorrendo até o sul da América do Sul. Rhinella marina foi introduzida amplamente nas

ilhas das Antilhas, Havaí, Fiji, Filipinas, Taiwan, Ryukyu e em Nova Guiné, Austrália e

muitas ilhas do Pacífico (Frost, 2009).

Rhinella pombali (Baldissera-Jr., Caramaschi & Haddad, 2004), pertence ao

grupo de R. crucifer (Baldissera-Jr et al., 2004). Rhinella pombali foi separada de R.

crucifer, sendo R. pombali restrita ao estado de Minas Gerais, onde ocorre na Mata

Atlântica e em áreas de transição com o cerrado no estado (Baldissera-Jr et al., 2004), e

R. crucifer encontra-se com distribuição ao longo da Floresta Atlântica e áreas

adjacentes, do Estado do Ceará ao sul do Estado do Espírito Santo e no nordeste do

Estado de Minas Gerais (Baldissera-Jr et al. 2004).

Até a década de 80, os estudos citogenéticos em Anura eram desenvolvidos com

técnicas simples de coloração visando à caracterização do número e da morfologia dos

cromossomos, especialmente com Giemsa. Esses estudos iniciais permitiram detectar a

ocorrência de certa variabilidade citogenética entre anuros, em especial em gêneros,

como Eleutherodactylus (Bogart, 1970 e 1972; Bogart & Hedges, 1995) e pouca

variabilidade em outros, como em Bufo (Bogart, 1973). Porém, outras espécies de

morfologia semelhante (e que poderiam ser consideradas como uma única espécie)

apresentaram diferenças no número de e/ou na morfologia cromossômica, conforme foi

observado em Osteopilus brunneus (Gosse, 1851) (2n=34) e Osteopilus septentrionalis

(Duméril & Bibron, 1841) (2n=24) (Cole, 1974); em Dendropsophus nanus e

Dendropsophus sanborni (2n=30) (Medeiros et al. 2003), em Physalaemus petersi

(Lourenço et al. 1998), em Paratelmatobius cardosoi e Paratelmatobius sp. (aff.

cardosoi) (2n=24) (Lourenço et al. 2003). O último grupo de espécies confirma que a

sistemática e a evolução dos anfíbios podem ser analisados com técnicas citogenéticas

refinadas como bandamento C, bandamento de replicação tardia, bandamentos com

enzimas de restrição, método de impregnação pela prata, coloração com fluorocromos e

a hibridação “in situ” com corantes fluorescentes. Dentre as espécies de Rhinella

(=Bufo) analisadas por Baldissera-Jr. et al. (1999), que apresentaram grande semelhança

em sua morfologia cromossômica, o grupo de espécies Rhinella granulosa apresentou

diferença na localização das NORs. Através do método de bandamento C, também é

possível detectar variações que diferenciam espécies consideradas próximas e que

apresentam morfologia cromossômica bastante semelhante. A localização e o número

de NORs e de heterocromatina são caracteres informativos em nível de variação intra-

específica, conforme caracterizado nas espécies Agalychnis callidryas (Schmid et al.

1995), Hyla ebraccata (Kaiser et al. 1996), Physalaemus petersi (Lourenço et al. 1998)

e Physalaemus cuvieri (Silva et al. 1999).

Existem poucas análises citogenéticas nas espécies brasileiras de Rhinella (por

exemplo, Kasahara et al. 1996; Baldissera-Jr et al. 1999; Amaro-Ghilardi et al. 2007).

Dentro dos bufonídeos, espécies dos gêneros Anaxyrus, Atelopus, Bufo, Capensibufo,

Melanophryniscus, Nannophryne, Nectophrynoides, Ollotis, Schismaderma e Werneria

são caracterizadas pelo número diplóide 2n=22 (King 1990; Kuramoto 1990). Fugindo a

essa estabilidade cromossômica, algumas espécies de Amietophrynus apresentam 2n=20

e NF=40, provavelmente devido a eventos de fusão cromossômica (Beckert & Doyle

1968; Bogart 1968; Bogart & Perret 1977). Segundo Bogart (1968) esse número seria

derivado de espécies ancestrais com 2n=22.

Bogart (1972) e Formas (1978) destacam a uniformidade cromossômica de

Rhinella (consideradas como Bufo ou Chaunus na época) e outros bufonídeos, e

sugerem que os primeiros membros do gênero que chegaram à América do Sul eram

2n=22, além de apresentar uma constrição secundária no par 7. No gênero Rhinela, uma

única Ag-NOR foi detectada no sétimo par cromossômico nas espécies R. arenarum, R.

ornata (chamada de R. crucifer em trabalhos anteriores), R. icterica, R. marina, R.

rubescens e R. schneideri; por outro lado a Ag-NOR ocorre no quinto par em R.

granulosa e R. pygmaea (Schmid 1978, 1980 e 1982; Kasahara et al. 1996; Baldissera-

Jr et al. 1999; Azevedo et al. 2003).

Duellman & Schutle (1992) mencionam que o grupo de R. crucifer é mais

próximo do grupo de R. marina, e que se separam por apresentarem a crista cranial mais

baixa, a pele dorsal mais lisa e glândulas paratóides menores. Baldissera-Jr et al. (1999)

mencionam que esses dois grupos são citogeneticamente próximos entre si, pois

apresentam a NOR no sétimo par cromossômico.

São poucos os trabalhos que abordam a citogenética de espécies de Rhinella do

grupo crucifer, sendo que até o momento, apenas os cariótipos de R. ornata (tratado de

B. crucifer em trabalhos anteriores) e de uma população R. crucifer do Estado da Bahia

(chamado de Bufo crucifer) são conhecidos (Beçak, 1968; Beçak et al. 1970; Brum-

Zorilla & Saez 1971; Kasahara et al. 1996; Baldissera-Jr et al. 1999; Amaro-Guilardi et

al. 2004). O objetivo deste trabalho é a comparação citogenética (coloração

convencional, padrões de banda C e Ag-NORs) de R. crucifer e R. pombali. As duas

espécies se distinguem por R. crucifer apresentar maior tamanh o que R. pombali

(média CRC R. crucifer 81.6mm e média CRC de R. pombali 73.3mm), focinho curto

em visão lateral (focinho longo em R. pombali) e linha vertebral muito fina ou ausente

(linha vertebral sempre presente em R. pombali, às vezes larga e limitada por marcas

escuras).

Material e Métodos

Animais

Foram analisados neste estudo uma população de R. crucifer provenientes de

Alfredo Chaves no estado do Espírito Santo e 10 populações de R. pombali de diversas

localidades do estado de Minas Gerais (Figura 1, Tabela 1). Os espécimes estão

depositados na coleção herpetológica do Museu de Zoologia João Moojen, da

Universidade Federal de Viçosa, situada em Viçosa, Minas Gerais, Brasil.

Figura 1. Localidades em Minas Gerais (MG) e Espírito Santo (ES) onde foram coletados os exemplares

analisados neste estudo de Rhinella crucifer (▲) e Rhinella pombali (●): 1) APA Pandeiros; 2) Sete

Cachoeiras, Ferros; 3) Caratinga; 4) Ipanema; 5) FLOE Uaimií, Ouro Preto; 6) PESB, Araponga; 7)

Viçosa; 8) Coimbra; 9) Muriaé; 10) Belmiro Braga; 11) Alfredo Chaves.

Preparações cromossômicas e técnicas de bandeamento

Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do epitélio intestinal

seguindo a metodologia proposta por Schmid (1978). Em cada espécime foi injetado

intraperitoneamente 0,1 mL (para cada 10 g de peso) de uma solução de 0,1% de

colchicina por 4h antes da eutanásia (feita a partir do uso de Lidocaína 5%). Após os

procedimentos, as preparações foram examinadas em microscópio óptico e as metáfases

foram capturadas com o sistema digital fotomicroscópio Olympus BX41 com a objetiva

de imersão de 100x, para aumento de 1000x. Os cromossomos homólogos foram

pareados utilizando o software Image Pro Plus® (IPP) e classificados pelo seus índices

centroméricos segundo Levan et al. (1964).

A técnica de coloração das Regiões Organizadoras de Nucléolo pelo Nitrato de

Prata (Ag-NOR) seguiu Howell & Black (1980), o protocolo de Banda C foi o proposto

por Sumner (1972).

Resultados

Todos os espécimes analisados de R. pombali e R. crucifer apresentaram número

diplóide 2n=22. O cariótipo (Figura 2) tem cinco pares maiores de cromossomos

metacêntricos, um par maior submetacêntrico e cinco pares menores de metacêntricos.

Com relação ao tamanho, os pares 1, 2 e 5 foram grandes metacêntricos, os pares 3 e 4

são representados por grandes submetacêntricos; o par 6 é um submetacêntrico de

tamanho médio e os cromossomos dos pares de 7 a 11 correspondem a pequenos

metacêntricos. Em algumas metáfases, foi observada uma constrição secundária no

sétimo par cromossômico (Figura 3), sendo esta uma variação de caráter intra-

individual.

Nas duas espécies as regiões organizadoras de nucléolo foram observadas nas

regiões subteloméricas nos braços curtos do sétimo par. Neste local também aparecem

as constrições secundárias eventuais (Figura 4), e foram idênticas para todas as

populações analisadas e entre as duas espécies do estudo.

A heterocromatina constitutiva apresentou-se de forma característica, nas regiões

pericentroméricas, além de uma marcação intersticial no sétimo par (Figura 5). Porém, a

obtenção dessa técnica não foi satisfatória para todas as populações analisadas.

Figura 2. Cariótipos de algumas populações analisadas nesse estudo: (A) Rhinella crucifer de Alfredo

Chaves, ES e B) Rhinella pombali de Viçosa, MG e C) de Belisário, Muriaé, MG.

Figura 3. Constrição secundária no braço menor do sétimo par cromossômico de um espécime macho de

R. crucifer.

Figura 4. Metáfases com bandeamento NOR de algumas populações analisadas: (A) Viçosa, MG; (B)

Belmiro Braga, MG; (C) Belisário, Muriaé, MG e (D)

Sete Cachoeiras, Ferros, MG. Marcações indicadas

pela seta, encontradas no sétimo par.

Figura 5. Padrão de distribuição de Banda-C em (A) Rhinella crucifer macho, de Alfredo Chaves, ES;

(B) R. pombali de Viçosa, MG.

Discussão

Rhinella pombali e R. crucifer apresentaram número diplóide 2n=22,

característico de bufonídeos em todo o mundo (e. g. Beçak 1968; Morescalchi &

Gargiulo 1968; Bogart 1972; Brum-Zorrilla & Saez 1971; Kuramoto, 1990; Piazze,

1995; Kasahara et al. 1996; Amaro-Ghilardi et al. 2007). A exceção na família ocorre

com as espécies do gênero Amietophrynus Frost et al. (2006), que agrupa antigas

espécies de Bufo do grupo B. regularis, é restrito a África Subsaariana e que possui o

cariótipo 2n=20 (. Dentro da família Bufonidae não há um padrão quanto à morfologia

cromossômica, sendo estável apenas o número diplóide 2n=22.

Das espécies de Rhinella do grupo R. crucifer (sensu Baldissera-Jr et al., 2004),

apenas o cariótipo de R. ornata (tratado de B. crucifer em trabalhos anteriores) (Beçak,

1968; Beçak et al. 1970; Brum-Zorrilla & Saez 1972; Kasahara et al. 1996; Baldissera-

Jr et al. 1999; Amaro-Guilardi et al. 2004) e de R. crucifer procedente de Ilhéus, Bahia

(tratado de Bufo crucifer) (Baldissera-Jr et al. 1999) são conhecidos.

Baldissera-Jr et al. (1999) descrevem o cariótipo de R. ornata proveniente de

Ubatuba, estado de São Paulo e R. crucifer de Ilhéus, estado da Bahia (ambos referidos

no texto como Bufo crucifer). Neste trabalho não há comparação entre as duas

populações, sendo apresentado apenas um cariótipo para ambas. Os dados indicam que

não há diferenças na morfologia cromossômica e nos padrões de Ag-NOR entre essas

duas espécies.

Na literatura, é evidente que o cariótipo das espécies de Rhinella do grupo

crucifer é extremamente conservado. Esta estabilidade é também presente em R. ornata

(Beçak, 1968; Beçak et al. 1970; Brum-Zorrilla & Saez 1972; Kasahara et al. 1996;

Baldissera-Jr et al. 1999; Amaro-Guilardi et al. 2004) e em R. crucifer (Baldissera-Jr et

al. 1999). Conclui-se que as espécies de Rhinella da América do Sul (e.g. Kuramoto,

1990; Piazze, 1995; Kasahara et al. 1996; Baldissera-Jr et al. 1999; Amaro-Ghilardi et

al. 2007) apresentam cariótipos extremamente conservados em nível de coloração

convencional.

Constrições secundárias são comumente observadas na família Bufonidae

(Bogart, 1972) e a presença dela no braço curto do sétimo par cromossômico, como

observado nas duas espécies analisadas são encontradas também em R. ornata

(Kasahara et al. 1996; Baldissera-Jr et al. 1999; Amaro-Ghilardi et al. 2007) e em outros

grupos e espécies de Rhinella sul americanos (e.g. R. atacamensis, R. arenarum, R.

granulosa, R. marina, Rhaebo maematiticus, Incilius valliceps, “Bufo”stomaticus)

(Bogart, 1972).

Rhinella crucifer de Ilhéus, Bahia e Rhinella ornata, assim como diversas outras

espécies do gênero Rhinella (tratados como Bufo) apresentam suas NORs na região

intersticial do braço curto do cromossomo sete (Baldissera-Jr et al. 1999; Amaro-

Ghilardi et al. 2007). O número e a posição das NORs são semelhantes ao achado nas

duas espécies analisadas neste estudo.

Com base na semelhança morfológica e a presença da região organizadora de

nucléolo no par cromossômico 7, Low (1972) e Maxson (1984), sugerem que o grupo R.

marina é mais próximo de R. crucifer. Este padrão foi corroborado por Baldissera-Jr et

al. (1999). Os resultados aqui apresentados indicam que a posição da NOR no sétimo

cromossomo é estável para o grupo de R. crucifer. Essa proximidade citogenética de

ambos os grupos, é também verificada de forma independente por evidências

moleculares (Pramuk, 2006; Chaparro et al. 2007), onde as topologias da família

Bufonidae mostram os dois grupos como clados irmãos.

Através das técnicas de Banda C, as regiões que apresentaram heterocromatina

constitutiva mostraram-se similar entre eles, sendo que foi possível avaliar apenas duas

populações de R. pombali (Viçosa e Muriaé) e uma de R. crucifer (Alfredo Chaves),

assim, faz-se necessário uma avaliação de um maior número de localidades para

confirmar essa invariabilidade desse bandeamento.

Os únicos dados disponíveis de padrões de banda-C em espécies do gênero

Rhinella do grupo R. crucifer (R. ornata) foram indicados por Kasahara et al. (1996).

Da mesma forma que em nossos resultados, as bandas ocorrem nas regiões

centroméricas de todos os pares cromossômicos. Kasahara et al (1996) associaram a

marcação no cromossomo 7 à presença da constrição secundária, porém, esta marcação

era visível às vezes com, ou sem a presença da constrição no cariótipo. E assim como

observado por Amaro-Ghilardi et al. (2007), que analisaram quatro espécies do grupo de

R. marina, no presente estudo também foram descobertas algumas marcações nas

regiões intersticiais restritas a alguns cromossomos e de ocorrência eventual (Figura 5).

Todas as espécies analisadas mostraram associação entre a heterocromatina e Ag-

NORs. Em alguns casos, os padrões de distribuição de heterocromatina podem ser

excelentes marcadores de linhagens. Tal foi o caso de Matsui et al. (1985), os quais

reconheceram seis cariótipos no complexo de espécies de Bufo bufo baseado nos

padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva. Miura (1995) distinguiu dois

cariótipos em Bufo japonicus japonicus usando também padrões de Banda-C, apesar da

uniformidade desses cariótipos utilizando coloração convencional.

Rhinella crucifer e R. pombali tem os padrões de Banda-C e Ag-NOR exatamente

como observado em trabalhos anteriores (e.g. Kasahara et al. 1996; Baldissera-Jr et al.

1999; Azevedo et al. 2003; Amaro-Ghilardi et al. 2007). Assim, nenhuma das espécies

dos grupos de R. marina e R. crucifer apresentam padrões espécie-específico de

distribuição da heterocromatina constitutiva ou das regiões organizadoras de nucléolo.

Porém, é evidente que em bufonídeos as técnicas clássicas de bandeamento, como Ag-

NOR e Banda-C não são suficientes para identificar esses padrões. Análises

citogenéticas deverão ser realizadas ainda em R. henseli e em R. abei, que possuem a

distribuição mais meridional das espécies do gênero.

Agradecimentos

Aos amigos U. Jacobina e C. B. Lima pela ajuda na fase inicial desse projeto

com críticas e sugestões além da parte laboratorial. Aos amigos do Museu de Zoologia

João Moojen pela coleta de alguns exemplares utilizados. Ao InstitUG Chico Mendes

de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) pela licença de coleta (ICMBio 17696-1).

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ANEXO 1

Protocolos utilizados

Técnica de obtenção de cromossomos a partir de intestino

1. Injetar, intraperitonealmente, solução de colchicina a 0,1%, na proporção aproximada

de 0,1 mL/10 g de peso do animal, cerca de 4 h antes do sacrifício.

2. Após o sacrifício, retirar todo intestino delgado e uma parte do estômago (para

auxiliar na manipulação). Apoiando o intestino no dedo indicador, abri-lo

longitudinalmente, iniciando pelo estômago. Lavar com solução de citrato de sódio a

0,9% para retirar restos de alimento.

3. Fazer o tratamento hipotônico colocando o intestino em uma placa de Petri com cerca

de 3 mL de solução de citrato de sódio a 0,9%, à temperatura ambiente, durante 25 a 30

min. Durante esse processo, movimentar a placa para impedir que o intestino se dobre.

4. Após a hipotonização, transferir o intestino para uma placa de Petri contendo fixador

Carnoy (metanol:ácido acético, 3vv:1v) e, gentilmente, raspar a mucosa intestinal com

auxílio de uma pequena espátula. Após 20 min, transferir a suspensão para um tubo de

centrífuga. Centrifugar e descartar o sobrenadante.

5. Adicionar fixador, pipetar e fazer pelo menos mais duas lavagens. Seguir os demais

passos como descrito na técnica de obtenção de cromossomos a partir de medula óssea.

Observação: Em geral, a técnica produz melhores resultados (bom índice mitótico),

quando o animal for sacrificado imediatamente após ser coletado na natureza ou se

alimentado em cativeiro, um pouco antes de se iniciar o procedimento técnico.

Técnica de obtenção de Banda C (Heterocromatina Constitutiva)

1. Incubar a lâmina em solução 0,2 N de ácido clorídrico, à temperatura ambiente,

durante 30 a 45 min.

2. Lavar em água destilada.

3. Incubar em solução de hidróxido de bário octahidratado Ba(OH)

.8H

O a 5%, à

temperatura de 60 °C, durante 10 a 20 segundos. Lavar em água destilada.

4. Passar rapidamente em solução 1 N de ácido clorídrico, a 60 °C. Lavar em água

destilada.

5. Incubar em solução de 2xSSC, a 60 °C, durante 15 min. Lavar em água destilada.

6. Corar com solução de Giemsa (2 mL da solução comercial + 28 mL de tampão

fosfato, pH 6,8), durante 20 min.

7. Lavar em água destilada. Secar.

Técnica de coloração das Regiões Organizadoras de Nucléolo pelo Nitrato de Prata

(Ag-NORs)

1. Proceder a hidrólise, incubando a lâmina em solução 1 N de ácido clorídrico, a 60 °C,

durante 3 min. Sem lavar a lâmina, deixar secá-la à temperatura ambiente.

2. Pingar na lâmina uma gota de solução coloidal reveladora e, sobre ela, duas gotas de

solução a 50% de nitrato de prata. Cobrir com lamínula.

3. Incubar a lâmina em câmara úmida, preparada com placa de Petri forrada com papel-

filtro, a 60 °C, durante 3 minUGs.

4. Lavar em água destilada.

5. Corar em solução de Giemsa (ver coloração convencional), durante 30 segundos.

6. Lavar em água destilada. Secar.

ANEXO 2

Tabela 1. Espécimes analisados neste trabalho.

Código Taxa Sexo Procedência UF

Coordenadas Município

(latº / lonº)

DS044 Rhinella pombali M Sete Cachoeiras, Ferros/ MG MG

-19.235818º / -43.019063

DS045 Rhinella pombali M Sete Cachoeiras, Ferros/ MG MG

-19.235818º / -43.019063

DS063 Rhinella aff. crucifer M

Área de Proteção Ambiental

Pandeiros.

-44.821667 / -15.440556

CT 1585 Rhinella pombali -

Parque Estadual Serra do

Brigadeiro

-20.686322 / -42.461827

CT 1679 Rhinella pombali - Caratinga MG

-19.790428 / -42.139286

CT 1404 Rhinella pombali F Belisário, Muriaé MG

-20.916667 / -42.466667

CT 1405 Rhinella pombali F Coimbra MG

-20.849815 / -42.789975

CT 1412 Rhinella pombali F Coimbra MG

-20.849815 / -42.789975

CT 1408 Rhinella pombali F Macuco, Muriaé MG

-21.133333 / -42.500000

CT 1532 Rhinella crucifer F Alfredo Chaves ES -20.635712 / -40.749310

CT 1406 Rhinella pombali F Muriaé MG

-21.130315 / -42.367389

CT 1680 Rhinella pombali F Sto. Ant. Manhuaçu, Caratinga MG

-19.726520 / -41.818270

CT 1431 Rhinella pombali F

Parque Estadual Serra do

Brigadeiro

-20.686322 / -42.461827

CT 1538 Rhinella pombali M Belmiro Braga MG

-21.922997 / -43.402699

CT 1539 Rhinella pombali M Belmiro Braga MG

-21.922997 / -43.402699

CT 1540 Rhinella pombali M Belmiro Braga MG

-21.922997 / -43.402699

CT 1745 Rhinella pombali M

Floresta Estadual do Uaimii,

Ouro Preto

-20.296623 / -43.574757

CT 1385 Rhinella pombali M Ipanema MG

-19.801256 / -41.713840

CT 1432 Rhinella pombali M Macuco, Muriaé MG

-21.133333 / -42.500000

CT 1748 Rhinella pombali M Viçosa MG

-20.754590 / -42.882524

CT 1531 Rhinella crucifer M Alfredo Chaves ES -20.635712 / -40.749310

CT 1533 Rhinella crucifer M Alfredo Chaves ES -20.635712 / -40.749310

CT 1301 Rhinella pombali M Muriaé MG

-21.130315 / -42.367389

CT 1302 Rhinella pombali M Muriaé MG

-21.130315 / -42.367389

CT 1313 Rhinella pombali M Muriaé MG

-21.130315 / -42.367389

CT 1372 Rhinella pombali M

Parque Estadual Serra do

Brigadeiro

-20.686322 / -42.461827

CT 1373 Rhinella pombali M

Parque Estadual Serra do

Brigadeiro

-20.686322 / -42.461827

CT 1407 Rhinella pombali M Pirapanema, Muriaé MG

-21.077683 / -42.435631

CT 1386 Rhinella pombali M Sto. Ant. Manhuaçu, Caratinga MG

-19.726520 / -41.818270

CT 1387 Rhinella pombali M Sto. Ant. Manhuaçu, Caratinga MG

-19.726520 / -41.818270

CT 1411 Rhinella pombali M Viçosa MG

-20.754590 / -42.882524

CT 1676 Rhinella pombali M Caratinga MG

-19.790428 / -42.139286

CT 1677 Rhinella pombali M Caratinga MG

-19.790428 / -42.139286

CT 1376 Rhinella pombali M Viçosa MG

-20.754590 / -42.882524

CT 1384 Rhinella pombali M Viçosa MG

-20.754590 / -42.882524

CT 1569 Rhinella pombali M Viçosa MG

-20.754590 / -42.882524

CT 1187 Rhinella pombali - Muriaé MG

-21.130315 / -42.367389

CT 1403 Rhinella pombali - Viçosa MG

-20.754590 / -42.882524

2.2. Santana, D.J.; Hote, P.S.; Feio, R.N. & Dergam, J.A. Análise morfométrica de

populações de Rhinella pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004).

Análise morfométrica de populações de Rhinella pombali (Baldissera-Jr,

Caramaschi & Haddad, 2004).

Diego José Santana

1,2*

, Priscila Soares Hote

, Renato Neves Feio

, Jorge Abdala

Dergam

Beagle – Laboratório de Sistemática Molecular Departamento de Biologia

Animal, Universidade Federal de Viçosa. CEP 36571-000, Viçosa, MG, Brasil.

Museu de Zoologia João Moojen, Departamento de Biologia Animal,

Universidade Federal de Viçosa. CEP 36571-000, Viçosa, MG, Brasil

* [email protected]

Abstract

Rhinella pombali is a species recently separated from R. crucifer, and considered

restricted to the state of Minas Gerais, in southeastern Brazil. Although their

systematics was recently revised, it remains some taxonomic and geographical

inconsistencies, due mainly to morphological variation of the R. crucifer group. This

work analyzed the external morphology and 25 morphometrical characters of specimens

of R. pombali, distributed in 10 geographical unities (GUs) to verify the

interpopulational variation of this species and detect possible variations along

geographical gradients. Sexually dimorphic traits were also included. The analysis of

regional aspects of simpatry between R. pombali and other species of the R. crucifer

group in Espírito Santo and Rio de Janeiro states, led to some inconsistencies for the

expected geographical distribution of taxonomic characters. The results indicate the

existence of high level of morphometrical sexual dimorphism and some morphological

differences between males and females. The analyses of the 10 OTUs showed absence

of significant levels of differentiation among them.

Resumo

Separada recentemente de R. crucifer, R. pombali é uma espécie restrita ao

Estado de Minas Gerais. Embora uma revisão sistemática tenha sido feita há pouco

tempo, algumas inconsistências taxonômicas e geográficas seriam esperadas devido à

grande variação morfológica das espécies do grupo de R. crucifer. Baseamos nosso

trabalho no estudo da morfologia externa e em 25 caracteres morfométricos de 10

unidades taxonômicas operacionais para verificar o nível de variação interpopulacional

deste táxon e definir possíveis variações em gradientes geográficos. Apresentamos

também dados de dimorfismo sexual para a espécie. Analisando aspectos regionais de

simpatria de R. pombali com outras espécies do grupo nos estados do Espírito Santo e

do Rio de Janeiro, percebemos algumas inconsistências quanto ao registro geográfico

nesses locais. Vemos que a espécie apresenta acentuado dimorfismo morfométrico e

algumas diferenças morfológicas separando machos e fêmeas. Nas análises

populacionais entre as 10 UGs, foi verificado que não há separação significativa entre

elas, não apresentando também tendências de separação.

Introdução

As espécies do grupo de Rhinella crucifer (Wied-Neuwied, 1821) encontram-se

distribuídas por todos os domínios morfo-climáticos da Floresta Atlântica, desde o

Estado do Ceará até o Estado do Rio Grande do Sul e adentrando os estados de Minas

Gerais e Mato Grosso do Sul. Distribuem-se, também, no leste do Paraguai e nordeste

da Argentina (Frost, 2009).

Este grupo foi revisado recentemente (Baldissera-Jr et al. 2004), sendo que

anteriormente muitos nomes estavam disponíveis para diversas populações ao longo da

distribuição das espécies devido à grande variação cromática entre os táxons, ou mesmo

pela variação intraespecífica. O grupo é composto por R. abei (Baldissera-Jr,

Caramaschi & Haddad, 2004), R. crucifer (Wied-Neuwied, 1821), R. henseli (A. Lutz,

1934), R. ornata (Spix, 1824), R. pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004)

e é caracterizado por uma série de características morfológicas (para revisão ver

Baldissera-Jr, 2001).

A espécie Rhinella pombali (Baldissera-Jr, Caramaschi & Haddad, 2004), foi

separada de R. crucifer, sendo R. pombali restrita ao estado de Minas Gerais, com sua

localidade tipo em São Gonçalo do Rio Abaixo, e de distribuição geográfica através da

Mata Atlântica e áreas de transição com o cerrado no Estado. Como todas as espécies do

grupo, é uma espécie bastante adaptada a ambientes antropizados, sendo bastante

comum em parques ou jardins (Santana et al. 2010). Rhinella pombali apresenta o corpo

recoberto por glândulas que conferem à sua pele um aspecto bastante rugoso. É uma

espécie de tamanho relativamente grande para o grupo (♂ comprimento rostro-cloacal

(CRC) 54,5-92,7 mm; ♀ 74,9-118,7 mm), cabeça mais larga que longa, com uma

subdivisão claramente observada entre a cabeça e o corpo em vista dorsal; focinho

arredondado em vista dorsal; cristas craniais conspícuas; glândulas paratóides ovóides,

não subdivididas, mais largas na porção anterior, e em vista lateral pendendo sobre a

lateral do corpo; primeiro tubérculo da fileira lateral sempre em contato com a glândula

paratóide; padrão geral cinza escuro nos membros, variando para um padrão único de

coloração mais clara; em vida, as marcas amarelas aproximam da cloaca e na superfície

posterior das coxas pode ocorrer uma linha de tubérculos na superfície ventral da parte

posterior do esqueleto, formando uma franja em indivíduos grandes (Baldissera-Jr et al.

2004).

Estudos com análises multivariadas para o estudo de populações e espécies de

anfíbios têm sido amplamente utilizados (e.g. Prado & Pombal, 2008; Narvaes &

Rodrigues, 2009; Napoli et al. 2009). Os métodos morfométricos podem ser usados para

detectar diferenças sutis entre populações (Reyment et al. 1981). A morfometria

multivariada é útil na detecção de diferenças e no estudo das variações de caracteres

quantitativos (Cavalcanti & Lopes 1993). A Análise de Componentes Principais (ACP)

utilizada na ordenação dos dados morfométricos permite que parâmetros biológicos

possam ser mais facilmente detectados e interpretados (Blackith & Reyment 1971; Reis

1988).

Embora uma revisão sistemática tenha sido feita há pouco tempo (Baldissera-Jr et

al. 2004), algumas inconsistências taxonômicas e geográficas poderiam ser encontradas

devido à grande variação morfológica das espécies, uma vez que as espécies são muito

semelhantes entre si, e a inclusão de espécimes de localidades mais distantes poderia

apresentar padrões inconsistentes de variação.

Assim, este trabalho teve como objetivo caracterizar estatisticamente a variação

morfológica e morfométrica de amostras populacionais de R. pombali.

Material e Métodos

Este trabalho se baseou no estudo da morfologia externa e em dados

morfométricos de exemplares de R. pombali fixados em formol 10% e preservados em

álcool 70%. Para verificar o nível de variação interpopulacional deste táxon e definir

possíveis variações em gradientes geográficos, sendo estas amostras populacionais

organizadas em Unidades Taxonômicas Operacionais (UGs) divididos por localidades

geográficas (ou populações), como proposto por Heyer (1983). Cada UG incluiu no

mínimo 5 exemplares. Outras espécies do grupo de localidades com distribuição

conhecida em limites com a distribuição de R. pombali. Localidades estas definidas a

priori foram utilizadas na comparação, para um melhor entendimento sobre a variação

morfométrica de R. pombali buscando dessa forma auxiliar em sua taxonomia e revelar

a real distribuição geográfica deste táxon.

Os dados da morfologia externa utilizados no estudo, são caracteres usualmente

utilizados em estudos de taxonomia, seguindo Heyer et al. (1990) e aspectos

mencionados na diagnose da espécie por Baldissera-Jr et al. (2004).

Para todas as análises estatísticas foi adotado o nível de significância de 5%.

Foram utilizados “análise de componentes principais” (ACP), visto que se mostra um

procedimento empregado em estudos de variação geográfica, objetivando-se verificar as

distâncias morfométricas entre as UGs (Tabela 1, Figura 1).

Figura 1. Distribuição das localidades de Rhinella pombali e R. crucifer utilizadas para a estruturação

das Unidades Taxonômicas Operacionais (UGs) definidas na tabela 1.

Tabela 1. Unidades Taxonômicas Operacionais (UGs) utilizadas para a análise das amostras

populacionais de Rhinella pombali, com suas respectivas áreas de abrangência.

UG Nome Abrangência

Sul da Bahia

BA: Arataca, Barra do Choça, Boa Nova, Coaraci, Ilhéus, Itacaré, Jussari,

Mascote, Prado

Vale do Jequitinhonha

MG: Almenara, Ladainha, Poté, Irapé

Cerrado Central

GO: Mineiros; MG: Januária

Médio Rio Doce

MG: João Monlevade, Ipanema, Caratinga, Ferros, PERD (Marliéria),

Resplendor

Espírito Santo

ES: Cariacica, Castelo, Domingos Martins, Fundão, Itaúnas,

Santa Teresa

Caparaó

ES: Dores do Rio Preto; MG: Espera Feliz, Alto Caparaó,

Manhumirim

Espinhaço Meridional

MG: Belo Horizonte, Conceição do Mato Dentro, Conselheiro Lafaiete,

Ouro Preto, Ouro Branco, São Gonçalo do Rio Abaixo (Localidade Tipo),

Nova Lima, Ucrânia

Zona da Mata Alta

MG: Viçosa, Muriaé, Canaã, PESB (Araponga), Pedra Dourada,

Carangola, Divino

Zona da Mata Sul

MG: Belmiro Braga, Bicas, Coronel Pacheco, Juiz de Fora,

Santa Rita de Jacutinga

Norte Fluminense

RJ: Santa Maria Madalena, Natividade

Foram examinados os 25 caracteres morfométricos seguidos por Baldissera-Jr et.

al (2004) os quais ele apresenta como significativos para estudos com morfometria das

espécies do grupo de R. crucifer. Os 25 caracteres morfométricos, obtidos sempre de

medidas realizadas em linha reta, com paquímetro de precisão 0,01 mm, foram os

seguintes: CRC (comprimento rostro-cloacal: medida da extremidade do focinho à

extremidade posterior do corpo), CC (comprimento da cabeça: medida da extremidade

do focinho ao canto da boca), LC (largura da cabeça: medida transversalmente à cabeça,

na altura do canto da comissura bucal), DC (distância entre coanas: medida entre os

bordos internos das coanas), DIN (distância internasal: medida entre os bordos internos

das narinas), DNO (distância narina-olho: medida entre o bordo posterior da narina e o

bordo anterior do olho), DO (diâmetro do olho: medida horizontal entre os bordos

anterior e posterior do olho), LP (largura da pálpebra superior: medida transversal entre

o bordo externo da pálpebra superior e o bordo externo da crista supra-orbital), DIO

(distância interorbital: medida transversal entre os bordos externos das cristas supra-

orbitais), DOM (distância olho-borda do maxilar superior: medida vertical entre o bordo

inferior do olho e o bordo do maxilar superior), CCC (comprimento da crista cantal),

CCST (comprimento da crista supra-timpânica), DOT (distância olho-tímpano: medida

entre o bordo posterior do olho e o bordo anterior do tímpano), DT (diâmetro do

tímpano: distancia horizontal entre os bordos anterior e posterior do tímpano), AT

(altura do tímpano: distância vertical entre os bordos superior e inferior do tímpano),

DGP (distância entre glândulas paratóides: medida transversal entre os bordos internos

anteriores das glândulas paratóides), CA (comprimento do antebraço: medida entre a

articulação da mão e a articulação braço com o antebraço), CB (comprimento do braço:

medida entre a articulação do braço com o antebraço e a articulação do braço com a

cintura escapular), CCCI (comprimento do calo carpal interno), LCCI (largura do calo

carpal interno), MAO (comprimento da mão: medida entre a articulação antebraço-mão

e a base do terceiro dedo), DAV (distância axila-virilha: medida longitudinal entre a

axila e a virilha), COXA (comprimento da coxa: medida entre a articulação da coxa

com a cintura pélvica e a articulação da coxa com a tíbia), TIBIA (comprimento da

tíbia: medida entre a articulação da coxa com a tíbia e a articulação do tarso com a tíbia)

e TARSO (comprimento do tarso: medida entre a articulação do tarso com a tíbia e a

base do calo metatarsal externo).

Para o tratamento estatístico de dimorfismo sexual, o teste t, conforme indicado

por Zar (1984) e Análise de Componentes Principais foram aplicados para verificar a

significância da diferença entre medidas de machos e fêmeas. O dimorfismo sexual foi

analisado apenas em indivíduos da amostra ZA, para evitar possíveis variações

geográficas.

Os acrônimos das instituições dos exemplares analisados utilizados neste estudo

são: CHUFJF (Coleção Herpetológica da Universidade Federal de Juiz de Fora, MG),

CHUNB (Coleção Herpetológica da Universidade de Brasília, DF), MBML (Museu de

Biologia Mello Leitão, ES), MCNAN (Museu de Ciências Naturais da Pontifícia

Universidade Católica de Minas Gerais, MG), MNRJ (Museu Nacional do Rio de

Janeiro, RJ), MZUESC (Universidade Estadual de Santa Cruz, BA), MZUFV (Museu

de Zoologia João Moojen, MG).

Resultados e Discussão

Aspectos regionais de simpatria

Rödder et al. (2007) citam a presença de R. crucifer e R. pombali ocorrendo em

simpatria no município de Santa Teresa, Estado do Espírito Santo. Avaliando

separadamente a ACP (Figura 1), sobre os 25 dados morfométricos, de exemplares

procedentes do município de Santa Teresa sob a denominação desses dois nomes (RC,

n= 28; RP, n=6) sendo cada espécie considerada uma UG para a análise.

Os três primeiros componentes da ACP acumularam 87.86% da variação

encontrada. Os caracteres morfométricos que mais contribuíram para a discriminação

obtida e suas respectivas significâncias estão apresentadas na Tabela 2.

Os indivíduos analisados apresentaram um alto grau de sobreposição, sendo que

os escores individuais dos exemplares analisados foram projetados no espaço reduzido

dos dois componentes principais de maiores contribuições (Figura 1).

Tabela 2. AUGvetores e coeficientes de correlação (r) da análise de componentes principais (ACP) para

os 25 caracteres morfométricos de machos adultos de Rhinella crucifer e Rhinella pombali do Município

de Santa Teresa, Estado do Espírito Santo, Brasil. NS, não significativo; * P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01; ** P ≤

0.001.

Caractere

PC1 PC2 PC3 r (PC1) r (PC2) r (PC3)

CRC

-0.698340 0.108186 -0.135246

-0.9000 *** 0.0478

-0.0665

-0.231995 0.101699 0.077263

-0.8574 *** 0.1306

0.0015 *

-0.314815 0.067377 0.203413

-0.8558 *** 0.0635

0.0460

-0.063444 0.020676 0.032676

-0.8215 *** 0.0948

0.0023

DIN

-0.039683 -0.011943 0.033074

-0.7375 *** -0.0801

-0.0916

DNO

-0.044228 0.040658 0.058632

-0.6597 *** 0.2269

0.1984

-0.043844 0.037070 0.040437

-0.5686 *** 0.1700

-0.0278

-0.045955 0.016062 0.049420

-0.6592 *** 0.0818

0.2514

DIO

-0.109380 0.017905 0.056505

-0.8672 *** 0.0459

-0.0540

DOM

-0.033524 0.009466 0.042606

-0.5676 *** 0.0582

0.1847

CCC

-0.059764 0.073280 -0.038755

-0.7398 *** 0.3092 * -0.0538

CCST

-0.061140 0.068241 0.086279

-0.5475 *** 0.2425

0.1283

DOT

-0.028847 -0.002336 0.020547

-0.7085 *** -0.0197

0.0176

-0.047841 0.040895 0.006030

-0.5758 *** 0.1845

0.0107

-0.050938 0.029870 -0.005212

-0.7128 *** 0.1484

-0.1899

DGP

-0.170950 0.029478 0.161192

-0.6615 *** 0.0398

0.0057

-0.157324 -0.019224 0.014374

-0.8506 *** -0.0356

-0.0217

-0.112977 -0.126539 -0.059955

-0.7191 *** -0.2518

-0.0562

CCCI

-0.037639 0.081587 -0.080015

-0.2334

0.1902

-0.0635

LCCI

-0.022952 0.024537 0.000989

-0.6810 *** 0.2586

-0.0125

MAO

-0.099479 -0.088373 0.103310

-0.5488 *** -0.1705

0.0432

DAV

-0.259916 -0.769763 -0.463215

-0.7384 *** -0.6330 *** -0.2985

COXA

-0.242771 0.522027 -0.382183

-0.6085 *** 0.4602 ** -0.1750

TIBIA

-0.262120 0.016455 0.075597

-0.8706 *** 0.0187

-0.1204

TARSO

-0.218880 -0.242723 0.705009

-0.5862 *** -0.2273

0.2251

Figura 2. (A) Projeção dos escores individuais resultado da Análise dos Componentes Principais (ACP)

para 25 caracteres morfométricos de machos adultos de espécimes de Rhinella crucifer e R. pombali

provenientes de Santa Teresa, ES. Rc, Rhinella crucifer; Rp, Rhinella pombali e (B) Projeção dos escores

individuais resultantes da analise de componente principal no espaço reduzido dos dois primeiros

componentes.

Em relação à ACP realizada entre as duas espécies, pode-se considerar o

primeiro componente principal como um indicador de tamanho, visto que todos os

aUGvetores mostram valores positivos. Os demais componentes, por alternarem valores

positivos e negativos, podem ser considerados indicadores de forma (Humphries et al.

1981). A projeção dos escores individuais resultantes da análise mostrou agrupamento

claro entre as amostras, sendo observada uma tendência à aglomeração dos indivíduos

(Figura 1).

Da mesma forma a análise da morfologia externa conduzida posteriormente,

mostra também todos os exemplares como uma espécie. Assim, todos os indivíduos

encontrados no município de Santa Teresa, no estado do Espírito Santo podem ser

considerados como Rhinella crucifer. Considera-se assim que até o momento não há

registros de R. pombali no Estado do Espírito Santo.

Esse fato encontrado em Santa Teresa mostra que estas duas espécies são

facilmente confundidas, o que corrobora a necessidade de estudos complementares que

permitam a separação mais objetiva destes dois táxons com a conseqüente delimitação

mais precisa das localidades onde as espécies ocorrem. A difícil identificação poderia

ser explicada por uma hipótese alternativa, como a existência de uma extensa zona de

hibridismo entre 2 ou mais espécies do grupo R. crucifer. Esta condição foi observada

em espécies do gênero Phyllomedusa (Haddad et al. 1994), e mesmo no gênero

Rhinella, entre R. ornata e R. icterica (Haddad, 1990). Casos de hibridismo na família

Bufonidae são bem reportados em diversos grupos sul americanos, sendo conhecidas

formas intermediárias em alguns grupos como R. granulosa e R. marina (Bogart, 1972).

Silveira et al. (2009) registram a presença de R. crucifer, R. pombali e R. ornata

na região norte do Estado do Rio de Janeiro, ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul,

com a presença conjunta de R. crucifer e R. pombali em 2 localidades do Estado

(Itaperuna e Santa Maria Madalena). Apenas os exemplares chamados pelos aUGres de

R. pombali foram analisados no presente estudo e foram considerados como a UG NF.

Entretanto quando analisados morfometricamente com as outras populações de R.

pombali ao longo da distribuição da espécie, não foram observadas diferenças

morfométricas que os distinguissem das outras populações. Porém, esses espécimes não

foram comparados com seus respectivos táxons sintópicos para comparações

morfológicas externas. Assim, como em Silveira et al. (2009) não são apresentadas as

diferenças pelos aUGres encontradas para denominar os táxons como espécies distintas,

visto que o grupo em questão possui complicados padrões de variações morfológicas,

podendo levar a identificações errôneas.

Dimorfismo Sexual

Exemplares machos (n=29) e fêmeas (n=14) da UG ZA foram analisados com os

mesmos 25 caracteres morfométricos apresentados anteriormente. Quando comparados

morfometricamente pela ACP (Figura 2), estes apresentaram diferenças significativas.

Os dois primeiros componentes entre machos e fêmeas acumularam 95.33% da variação

encontrada (CP1 90.35%; CP2 4.98%). Os caracteres morfométricos que mais

contribuíram para a discriminação obtida e suas respectivas significâncias estão

apresentadas na tabela 3.

Tabela 3. Coeficientes AUGvetores e coeficientes de correlação (r) da análise de componentes principais

(ACP) para os 25 caracteres morfométricos de machos adultos de Rhinella crucifer e Rhinella pombali do

Município de Santa Teresa, Estado do Espírito Santo, Brasil. NS, não significativo; * P ≤ 0.05; ** P ≤

0.01; ** P ≤ 0.001.

Caractere PC1 PC2 PC3 r (PC1) r (PC2) r (PC3)

CRC

-0.708263 -0.229751 0.157817

-0.5816 *** 0.1091

0.0345

-0.206915 -0.071673 0.104077

-0.5618 *** -0.1219

0.0767

-0.305255 -0.041634 0.134179

-0.5725 *** -0.0794

0.0676

-0.075001 -0.055188 -0.019283

-0.4331 *** -0.1828

-0.0373

DIN

-0.036693 -0.002259 0.011898

-0.4700 ** -0.0874

0.0450

DNO

-0.033059 -0.005099 0.048863

-0.5007 *** -0.0118

0.1920

-0.035641 0.002803 0.014782

-0.5317 *** -0.0542

0.0487

-0.030404 0.018865 0.019553

-0.4545** 0.0932

0.0735

DIO

-0.113071 -0.058894 0.126476

-0.4977 *** -0.1300

0.1619

DOM

-0.040428 -0.030142 -0.005402

-0.4013 *** -0.1868

-0.0180

CCC

-0.064694 -0.012981 0.028768

-0.4855 *** -0.1624

0.0645

CCST

-0.050882 -0.032756 0.038605

-0.4641 *** -0.2417

0.1012

DOT

-0.031429 -0.018262 0.042342

-0.5463 *** -0.1886

0.1743

-0.035902 -0.011198 0.010689

-0.5367 *** -0.1221

0.0429

-0.039404 -0.021562 0.030423

-0.5062 *** -0.1516

0.1093

DGP

-0.144924 -0.092622 -0.009585

-0.5054 *** -0.1353

-0.0099

-0.143577 -0.038367 0.248775

-0.5434 *** -0.0732

0.2504

-0.101679 0.078360 0.085254

-0.5059 *** 0.0170

0.1072

CCCI

-0.015395 0.003824 0.034287

-0.4136** -0.1129

0.2118

LCCI

-0.015764 0.015187 0.033658

-0.5025 *** 0.1339

0.2189

MAO

-0.084104 0.094855 0.159214

-0.5046 *** 0.1516

0.2538

DAV

-0.353038 -0.153349 -0.851419

-0.4450** -0.1483

-0.3489

COXA

-0.262688 0.934150 -0.116968

-0.4746 *** 0.4680*** -0.0530

TIBIA

-0.246231 0.087387 0.288869

-0.5820 *** 0.0336

0.1763

TARSO

-0.115328 -0.033741 0.051298

-0.4670 *** -0.0605

0.0603

Os escores individuais dos exemplares machos e fêmeas analisados foram

projetados no espaço reduzido dos componentes PC1 E PC2 (Figura 2).

Fêmeas apresentaram maior tamanho em todos os 25 caracteres morfométricos,

sendo que as médias de todos eles revelaram médias com diferenças estatisticamente

significativas entre machos e fêmeas (Tabela 4).

Figura 3. (A)Projeção dos escores individuais resultado da Análise dos Componentes Principais (ACP)

para 25 caracteres morfométricos de espécimes adultos machos e fêmeas de Rhinella pombali

provenientes da UG ZA e (B) Projeção dos escores individuais resultantes da analise de componente

principal no espaço reduzido dos dois primeiros componentes.

Dimorfismo sexual com fêmeas maiores do que machos é comum entre anuros

(Shine, 1979), mas existem diferentes interpretações sobre como esta característica

surgiu (Thomé & Brasileiro, 2007). As fêmeas maiores seriam selecionadas por sua

capacidade reprodutiva (maior produção de óvulos ou de óvulos maiores) (Crump &

Kaplan 1979, Prado et al. 2000). Por sua vez, machos não atingiriam tamanhos grandes

devido a restrições energéticas relacionadas à reprodução (Woolbright, 1983), ou à

maior pressão de predação decorrente de atividades relacionadas à reprodução (Ryan,

1985).

O padrão dimórfico de tamanho de R. pombali tem sido indicado para várias

espécies do gênero Rhinella (e.g. Maciel, 2008; Narvaes & Rodrigues, 2009). Em R.

pombali, as causas do dimorfismo também podem estar relacionadas ao aumento de

fecundidade das fêmeas, geralmente associado ao padrão de reprodução explosiva

(Sebbins & Cohen 1995). Embora R. pombali não apresenta comportamento

reprodutivo explosivo, ela tem um curto período de reprodução em diversos locais (por

exemplo, Grandineti & Jacobi, 2005; Canelas & Bertoluci, 2007; Assis, 2009). A

grande quantidade de ovos presentes nos grandes cordões gelatinosos das desovas de

Rhinella (Eterovick & Sazima, 2004) sugere novamente uma relação direta entre o

maior tamanho da fêmea e a alta produção de óvulos (Crump & Kaplan 1979, Prado et

al. 2000).

Tabela 4. Resultados da análise do teste t para os 25 caracteres morfométricos de machos e fêmeas da

UG ZA.

Caracter Média ♂♂ Média ♀♀ P t

CRC 75.33 102.19 < 0.0001 11.88

CC 23.38 31.27 < 0.0001 11.46

LC 28.38 39.91 < 0.0001 11.38

DC 6.61 9.62 < 0.0001 9.93

DIN 4.63 6.1 < 0.0001 7.74

DNO 4.84 6.03 < 0.0001 6.3

DO 6.65 7.89 < 0.0001 5.03

LP 6.04 7.01 < 0.0001 4.13

Caracter Média ♂♂ Média ♀♀ P t

DIO 11.88 16.32 < 0.0001 10.48

DOM 2.65 4.44 < 0.0001 12.98

CCC 5.8 8.3 < 0.0001 10.11

CCST 3.63 5.62 < 0.0001 8.05

DOT 2.12 3.35 < 0.0001 7.47

DT 4.05 5.4 < 0.0001 8.9

AT 4.9 6.45 < 0.0001 8.15

DGP 1.86 2.61 < 0.0001 12.09

CA 17.62 22.92 < 0.0001 8.57

CB 15.62 18.8 < 0.0001 4.79

CCCI 3.42 3.97 0.0003 3.76

LCCI 2.27 2.73 0.0093 2.61

MAO 11.99 14.43 < 0.0001 4.58

DAV 30.93 44.61 < 0.0001 8.01

COXA 33.76 41.05 0.0077 2.75

TIBIA 33.84 42.14 < 0.0001 7.51

TARSO 15.28 19.23 < 0.0001 5.25

Além da significativa distância morfomométrica, machos e fêmeas diferenciam

entre si em vários aspectos. Machos (Figura 3A) apresentam as mesmas características

como apresentadas na descrição da espécie por Baldissera-Jr et al. (2004). Porém, as

fêmeas (Figura 3B) que não possuem descrição formal com dados de dimorfismo

sexual, geralmente apresentam coloração mais viva, sendo a linha vertebral mais

freqüente e a faixa negra, que acompanha a linha vertebral mais clara, é melhor

demarcada e, por vezes, mais larga. A coloração amarelada em torno da região cloacal,

está sempre presente nos espécimes de ambos os sexos, mas nas fêmeas, o colorido é

mais intenso essas linhas amarelas são mais largas que nos machos.

Este padrão da coloração mais viva e intensa em fêmeas é também observado em

outras espécies do gênero Rhinella. Algumas espécies do grupo R. marina como R.

icterica, R. cerradensis e R. veredas, apresentam dimorfismo sexual bem mais

acentuado. Nestas espécies os machos possuem coloração dorsal uniforme, enquanto

que as fêmeas apresentam coloração preta em muitas áreas de dorso (as vezes nos

membros posteriores) (Heyer et al., 1990; Brandão et al., 2007; Maciel et al., 2007).

Além dessas pequenas diferenças, os machos de R. pombali possuem, como a

maioria dos anuros, fenda vocal lateral à língua. No período reprodutivo, ou próximo

dele, aparecem calosidades nupciais, sempre na superfície dorsal do dedo I, podendo

estar presente também no dedo II ou mesmo chegar ao dedo III. Outra diferença são os

braços dos machos, os quais são proporcionalmente mais robustos.

Figura 4. Rhinella pombali: (A) Exemplar macho (MZUFV 7303; CRC 81.82) proveniente APA Pedra

Dourada, Município de Pedra Dourada (MG), e (B) fêmea (MZUFV 3851; CRC 122.87) proveniente

Estadual da Serra do Brigadeiro, Município de Araponga (MG).

Análise morfométrica em nível de populações

Os 3 primeiros componentes principais da ACP das 10 UGs de Rhinella

analisadas neste estudo, acumularam 90.25% da variação encontrada (PC1 77.88%; PC2

9.21%; PC3 3.06%). Os caracteres morfométricos que mais contribuíram para a

discriminação obtida e suas respectivas significâncias estão apresentadas na tabela 3.

Tabela 3. AUGvetores e coeficientes de correlação (r) da análise de componentes principais (ACP) para

os 25 caracteres morfométricos de machos adultos de Rhinella crucifer e Rhinella pombali de diversas

populações dos estados de Minas Gerais, Espírito Santo e Bahia, Brasil. NS, não significativo; * P ≤ 0.05;

** P ≤ 0.01; ** P ≤ 0.001.

Caractere PC1 PC2 PC3 r (PC1) r (PC2) r (PC3)

CRC

-0.698340 0.108186 -0.135246

-0.9000 *** 0.0478

-0.0665

-0.231995 0.101699 0.077263

-0.8574 *** 0.1306

0.0015*

-0.314815 0.067377 0.203413

-0.8558 *** 0.0635

0.0460

-0.063444 0.020676 0.032676

-0.8215 *** 0.0948

0.0023

DIN

-0.039683 -0.011943 0.033074

-0.7375 *** -0.0801

-0.0916

DNO

-0.044228 0.040658 0.058632

-0.6597 *** 0.2269

0.1984

-0.043844 0.037070 0.040437

-0.5686 *** 0.1700

-0.0278

-0.045955 0.016062 0.049420

-0.6592 *** 0.0818

0.2514

DIO

-0.109380 0.017905 0.056505

-0.8672 *** 0.0459

-0.0540

DOM

-0.033524 0.009466 0.042606

-0.5676 *** 0.0582

0.1847

CCC

-0.059764 0.073280 -0.038755

-0.7398 *** 0.3092

-0.0538

CCST

-0.061140 0.068241 0.086279

-0.5475 *** 0.2425

0.1283

DOT

-0.028847 -0.002336 0.020547

-0.7085 *** -0.0197

0.0176

-0.047841 0.040895 0.006030

-0.5758 *** 0.1845

0.0107

-0.050938 0.029870 -0.005212

-0.7128 *** 0.1484

-0.1899

DGP

-0.170950 0.029478 0.161192

-0.6615 *** 0.0398

0.0057

-0.157324 -0.019224 0.014374

-0.8506 *** -0.0356

-0.0217

-0.112977 -0.126539 -0.059955

-0.7191 *** -0.2518

-0.0562

CCCI

-0.037639 0.081587 -0.080015

-0.2334 * 0.1902

-0.0635

LCCI

-0.022952 0.024537 0.000989

-0.6810 *** 0.2586

-0.0125

MAO

-0.099479 -0.088373 0.103310

-0.5488 *** -0.1705

0.0432

DAV

-0.259916 -0.769763 -0.463215

-0.7384 *** -0.6330 *** -0.2985

COXA

-0.242771 0.522027 -0.382183

-0.6085 *** 0.4602** -0.1750

TIBIA

-0.262120 0.016455 0.075597

-0.8706 *** 0.0187

-0.1204

TARSO

-0.218880 -0.242723 0.705009

-0.5862 *** -0.2273

0.2251

Os escores individuais dos exemplares analisados foram projetados no espaço

reduzido dos dois componentes principais de maiores contribuições (Cavalcanti e

Lopes, 1993) (Figura 4 e 5).

Em relação à ACP realizada entre as dez UGs, pode-se considerar o primeiro

componente principal como um indicador de tamanho, visto que todos os aUGvetores

mostraram valores positivos. Os demais componentes, por alternarem valores positivos

e negativos, podem ser considerados indicadores de forma (Humphries et al. 1981). A

projeção dos escores individuais resultantes da análise não mostrou agrupamento claro

entre as amostras de acordo com a localidade, não observando nem mesmo tendências

de aglomeração (Figura 4).

Figura 5. Projeção dos escores individuais resultado da Análise dos Componentes Principais (ACP) para

25 caracteres morfométricos de espécimes adultos machos de Rhinella pombali e Rhinella crucifer

provenientes das 25 UGs analisadas neste estudo.

Figura 6. Projeção dos escores individuais resultantes da analise de componente principal no espaço

reduzido dos dois primeiros componentes.

Como mencionado por Baldissera-Jr (2001), análises morfométricas são

utilizadas como ferramenta auxiliar para o entendimento da estrutura de espécies do

grupo de R. crucifer, não sendo necessário utilizá-las para discriminar as morfoespécies,

visto que estas são reconhecíveis por caracteres qualitativos externos. Embora

Baldissera-Jr et al., (2004) indicam que R. crucifer e R. pombali aparecem bem

definidas na análise discriminante canônica, os dados deste estudo não mostram esse

padrão. Uma explicação para esse fenômeno seria que os aUGres utilizaram indivíduos

das espécies com grande distancia geográfica, e no presente estudo, as UGs analisadas

representam locais mais próximos.

Agradecimentos

A M.R. Moura pelo auxílio com a estatística; A.J.S. Argolo (UESC), L.M.

Sarmento-Soares (MBML), R. Mary (CHUFJF), G.R. Colli (UnB), L.B. Nascimento

(MCNAN-PUC) pelo empréstimo de material aos seus cuidados; e a J.P. Pombal Júnior

(MNRJ) pela recepção no Museu Nacional quando fui analisar a série tipo de R.

pombali. A E.T. da Silva e P.S. Santos pelo auxílio para a coleta de exemplares da UG

MD e R.M. Pirani pela coleta de exemplares da UG EM. Aos amigos do Museu de

Zoologia João Moojen pela coleta de alguns exemplares utilizados. Ao InstitUG Chico

Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) pela licença de coleta (ICMBio

17696-1).

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ANEXO 1

Material Examinado

Rhinella crucifer

Bahia: Arataca UESC 1531, 2221; Barra do Choça UESC 691; Boa Nova UESC 1257,

4539-4540; Coaraci UESC 2326; Ilhéus UESC 4278, 4778, 6915, 7500; Itacaré

CHUNB 35670-35671, 39954-39955, UESC 4039; Jussari UESC 1508-1509; Mascote

CHUNB 25280; Prado CHUNB 49567.

Espírito Santo: Cariacica MBML 4831, 5030, 5054, 6054, 6081, 6084, 6123, 6349-

6351, 6356, 6358-6360, 6363-6364, MCNAN 2841-2842; Castelo MBML 4646, 4649;

Domingos Martins CHUNB 36199-36200, 36204, 36212; Dores do Rio Preto MCNAN

8047; Fundão MBML 4830; Itaúnas MBML 4836; Santa Teresa MBML 587, 589,

1112, 1176, 1178, 1181, 2574, 2579, 2727, 4647.

Rhinella pombali

Minas Gerais: Almenara MZUFV 4139, 5348; Alto Caparaó CHUNB 46250, 46289,

46298, 46300; 46320, 46330, 46334, 46336, 46338, 46344, 46347, 46351, 46353,

46358, 46360; Belmiro Braga MZUFV 8692-8596; Belo Horizonte CHUNB 14273,

MCNAN 3525-3531, 3534, 3538, 3548, 3554, 5143-5144, 5176, 5453, 5494, 5571-

5572, 5618, 6003; Bicas CHUFJF 398, 413-414; Canaã MZUFV 7693-7695; Conceição

do Mato Dentro MCNAN 9127; Conselheiro Lafaiete MCNAN 6947; Carangola

MZUFV 211; Coronel Pacheco CHUFJF 279-282; Divino MZUFV 9760; Dores do Rio

Preto MZUFV 7156-7157; Espera Feliz MZUFV 9762; Ferros MZUFV 8681-8682;

Ipanema DS 131, 135-144, MZUFV 9086; Irapé MCNAN 9400; João Monlevade

MZUFV 1983; Juiz de Fora MCNAN 6061, 6064, CHUFJF 258, 261, 537; Ladainha

MZUFV 5155-5156; Manhumirim CHUNB 35666; Muriaé MZUFV 8881-8882; Nova

Lima MCNAN 9445;

Ouro Branco MCNAN 7551-7552; Ouro Preto MZUFV 9880-

9882, 10083-10084; Pedra Dourada MZUFV 6946-6947, 7302-7305; PERD MCNAN

1406; MZUFV 2122, 2394-2395; PESB MZUFV 3101-3103, 3283, 3847-3851, 6644,

7140; Poté MZUFV 5635-5636; Resplendor MCNAN 7191; Rio Preto CHUFJF 435;

Santa Rita de Jacutinga MCNAN 2058-2059, 2314; São Gonçalo do Rio Abaixo

MCNAN 1914; MNRJ 22291-22300 (parátipos), MNRJ 22310 (parátipo), MNRJ

22311 (holótipo), MNRJ 22219 (parátipo); Ucrânia MCNAN 8049; Viçosa MZUFV

79, 216, 276, 278, 968, 1388, 1391, 1394-1395, 3127, 5261, 7051-7052.

Rio de Janeiro: Angra dos Reis CHUNB 14275; Paraíba do Sul CHUFJF 128, 132;

Santa Maria Madalena MNRJ 56634, 566360-56641; Natividade MNRJ 56633, 56635,

57054.

Rhinella ornata

São Paulo: Mogi das Cruzes CHUNB 35676.

Rhinella aff. pombali

Minas Gerais: Januária MZUFV 4933, 9269.

Goiás: Mineiros CHUNB 36547.

ONCLUSÕES

ERAIS

Com base no estudo realizado conclui-se que:

• Todos os espécimes analisados de R. pombali e R. crucifer apresentaram número

diplóide 2n=22.

• Nas duas espécies as regiões organizadoras de nucléolo foram observadas nas

regiões teloméricas nos braços curtos do sétimo par.

• A heterocromatina constitutiva apresentou-se de forma característica, nas regiões

centroméricas, além de uma marcação intersticial no sétimo par.

• Os indivíduos analisados de R. crucifer e R. pombali no município de Santa

Teresa, Estado do Espírito Santo não ocorrem em simpatria. Considerou-se que

não há registros de R. pombali no Estado do Espírito Santo.

• Fêmeas apresentaram maior tamanho que os machos em todos os 25 caracteres

morfométricos diferenciando também em vários aspectos morfológicos.

• A projeção dos escores individuais resultantes da análise de componentes

principais não mostrou agrupamento claro entre as 25 UGs, não observando nem

mesmo tendências de aglomeração.

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