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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Alterações na sinalização intracelular do cálcio e do
óxido nítrico em cardiomiócitos de camundongos
knockout para o receptor Mas
Marco Fabrício Dias Peixoto
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Sílvia Guatimosim Fonseca
Belo Horizonte –MG
Janeiro de 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
Alterações na sinalização intracelular do cálcio e do
óxido nítrico em cardiomiócitos de camundongos
knockout para o receptor Mas
Marco Fabrício Dias Peixoto
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Sílvia Guatimosim Fonseca
Belo Horizonte –MG
Janeiro de 2010
Tese de Doutorado apresentada ao
curso de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas - Fisiologia e Farmacologia -
da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito para obtenção do
título de doutor.
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DEDICATÓRIA
A Deus e Nossa Senhora,
por sempre iluminar meu caminho.
À Sílvia Guatimosim,
pela confiança, entusiasmo e competência.
À Thalita,
pelo amor, paciência e companherismo nas horas mais difíceis.
À minha mãe,
por tanta dedicação ao longo de toda minha vida.
AGREDECIMENTOS
Ao “Nonô” Enéas e Aline,
pela amizade e ajuda, sempre!!!
Ao Pedro e Mariana,
pela amizade e receptividade dentro e fora do laboratório.
À Amanda, Léo, Marcinha e Sasha,
pela alegria no trabalho e espírito de equipe.
Ao Ricardo, Éder, Adriano, Cris, Lígia, Priscila, Anita, Flaviana, Miguel,
Felipe, Nayara e Rose,
por fazerem do Eletrocel um ambiente tão agradável de se trabalhar.
Ao professor Robson,
pelas oportunidades oferecidas e confiança depositada.
Ao professor Jader e à Sandrinha
por me ajudarem tanto no início da minha caminhada.
Ao meu professor e amigo Ary
pelo incentivo e amizade.
Ao João Pedro, Nico, Luciane, Bruna, Claudinha, Tia Arlete, Tio David,
Daniele, Davizinho, Tia Neuza,
pela torcida sempre !!!
A tantos amigos que fiz no departamento, praticamente em todos
laboratórios:
Nívea, Walquiria, Beth, Gonzaga e todos os demais alunos (Hipertensão);
Luciano, Sílvia (Cardio); Daniel, Aninha (Endócrino), Érica, Jonas, Dadá, Laura
(Metabolismo); Vivi, Ana Paula, Lili (Renal); Gabriel (NNC), Carla, Mateus, Vivi,
Flávia, Camila (Laboratório da Fátima); Pesquero (Biofísica), Dante
(Laboratório do Frezard) e Rose (Café) .
A todos professores do departamento que tive a honra de conhecer
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Visão moderna do Sistema Renina-Angiotensina................................ 01
Figura 2- Principais ações da Ang-(1-7) no coração ........................................... 07
Figura 3- Expressão do receptor MAS no coração de ratos Wistar em
diferentes idades ................................................................................... 11
Figura 4- Balanço das ações contrarregulatórias do eixo Ang II / receptor AT1 vs.
Ang-(1-7) / receptor Mas ...................................................................................... 13
Figura 5- Localização do receptor Mas no cardiomiócito .................................... 17
Figura 6- Acoplamento excitação-contração-relaxamento no cardiomiócito ....... 20
Figura 7- Síntese do NO a partir da NO sintase................................................. 21
Figura 8- Mecanismo de detoxificação das ROS................................................. 27
Figura 9- Mecanismo da indução da apoptose pelas ROS ................................. 28
Figura 10- Representação esquemática da medida do transiente de Ca
2+
........ 31
Figura 11- Relação do peso do coração em miligramas (mg) pelo comprimento
da tíbia em milímetros (mm) em camundongos selvagem (Mas
+/+
) e
knockout (Mas
-/-
).................................................................................... 36
Figura 12- Redução no transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
..................................................................................................... 37
Figura 13- Expressão da SERCA2 em cardiomiócitos de camundongos Mas-/-. 38
Figura 14- Níveis de fosforilação da fosfolamban em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
.............................................................................. 39
Figura 15- A Ang-(1-7) aumenta a produção de NO em cardiomiócitos de
camundongos controle (Mas
+/+
)............................................................. 40
Figura 16- A produção de NO estimulada pela Ang-(1-7) está abolida em
cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
................................................. 41
Figura 17- Expressão da eNOS em homogenato de miócitos de camundongos
Mas
-/-
..................................................................................................... 42
iv
Figura 18- A expressão da caveolina-3 foi maior em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
quando comparada ás células controle (Mas
+/+
) .. 43
Figura 19- A expressão da Hsp90 está reduzida em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
quando comparada ás células controle (Mas
+/+
).. 44
Figura 20- A expressão da Akt está aumentada em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
quando comparada ás células controle (Mas
+/+
).. 45
Figura 21- Imunofluorescência da Akt em cardiomiócito de camundongos
Mas
+/+
e
Mas
-/-
........................................................................................ 46
Figura 22- A Akt fosforilada está reduzida em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
indicando menor ativação da Akt nestas células ......................... 47
Figura 23- A GSK-3β fosforilada está aumentada em cardiomiócitos
ventriculares de camundongos Mas
-/-
quando comparada às células
de camundongos selvagem Mas
+/+
........................................................ 48
Figura 24- A expressão da nNOS foi menor em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
quando comparada às células controle Mas
+/+
.... 49
Figura 25- A expressão da XIAP foi maior em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
quando comparada às células controle Mas
+/+
............................ 50
Figura 26- A. A expressão da caspase 3 foi maior em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
quando comparada às células controle Mas
+/+
.... 51
Figura 27- Medida da produção de ROS em cardiomiócitos de animais Mas
-/-
e
Mas
+/+
na presença ou não de Ang II .................................................... 52
Figura 28 - Regulação parácrina e autócrina do NO sobre o ciclo do Ca
2+
no
cardiomiócito ......................................................................................... 58
Figura 29- Mecanismo proposto para participação do NO na via anti-apoptótica
mediada pela ERK 1/2 e GSK-3β .......................................................... 62
Figura 30- Mecanismo de sinalização do NO e a apoptose cardíaca.................. 64
Figura 31- Formação de peroxinitrito (ONOO
-
) a partir do superóxido (O
2
-
) e do
óxido nítrico (NO) .................................................................................. 67
Figura 32- Mecanismos celulares do óxido nítrico (NO) superóxido(O
2
-
) e
peroxinitrito (ONOO-) ............................................................................ 68
v
LISTA DE ABREVIATURAS
Akt- Proteína Kinase B
Ang II- Angiotensina II
Ang-(1-7)- Angiotensina (1-7)
Ca
2+
- Cálcio
Camundongos Mas
-/-
- Camundongos knockout para o receptor Mas
Camundongos Mas
+/+
- Camundongos selvagem
ECA – Enzima Conversora de Angiotensina
ECA2 – Enzima Conversora de Angiotensina 2
HSP – Heat Shock Protein
lCa- Canal de cálcio tipo L
NO- Óxido Nítrico
NOS- enzimas sintetizadoras de óxido nítrico
nNOS ou NOS1 - enzima sintetizadora de óxido nítrico neuronal
NCX: trocador sódio/cálcio
iNOS ou NOS2- enzima sintetizadora de óxido nítrico induzível
eNOS ou NOS3- enzima sintetizadora de óxido nítrico endotelial
PI3K – Fosfatidil-inositol-3-fosfato
PLB- fosfolamban
ROS-Espécies Reativas de Oxigênio
Ryr: receptor de rianodina
SRA- Sistema Renina-Angiotensina
XIAP- proteína inibitória da apoptose
vi
RESUMO
Recentes evidências têm sugerido que os efeitos benéficos da angiotensina-(1-7)
[Ang-(1-7)] no coração são mediadas por seu receptor, Mas. No entanto, as vias
de sinalização envolvidas nestes efeitos são desconhecidas no cardiomiócito.
Resolvemos então investigar o envolvimento do eixo Ang-(1-7)/Mas na cinética do
Ca
2+
e geração de óxido nítrico (NO) em miócitos ventriculares adultos utilizando
uma combinação de biologia molecular, imagem intracelular do Ca
2+
e
microscopia confocal. No primeiro momento, investigamos o papel do eixo Ang-(1-
7)/Mas na sinalização do Ca
2+
. Cardiomiócitos tratados com 10nmol/L de Ang-(1-
7) não apresentaram alterações nos parâmetros da cinética do Ca
2+
, tais como o
pico e decaimento do transiente de Ca
2+
. No entanto, os cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
apresentaram redução da amplitude e aumento do tempo de
decaimento do transiente de Ca
2+
quando comparado com cardiomiócitos de
camundongos selvagem. Estas alterações foram acompanhadas de uma redução
nos níveis de expressão da SERCA2 e fosfolamban, proteínas do retículo
sarcoplasmático, em camundongos Mas
-/-
. Portanto, a deleção gênica do receptor
Mas leva a um prejuízo na cinética do Ca
2+
em cardiomiócitos. O tratamento agudo
com Ang-(1-7) (10 nmol/L) leva à ativação da eNOS e produção de NO no
cardiomiócito pela via da Akt, sendo estes efeitos abolidos pelo pré-tratamento
com A779 (1 µmol). Para confirmar que a ação da Ang-(1-7) é mediada pelo
receptor Mas, usamos cardiomiócitos isolados de camundongos Mas
-/-
. Nestes
animais, a Ang-(1-7) não foi capaz de aumentar os níveis de NO. Além disso, a
deleção gênica do Mas, foi acompanhada por alterações significativas nas
proteínas envolvidas na regulação da atividade da eNOS, indicando que esta
isoforma e suas proteínas regulatórias são importantes efetores da via de
sinalização mediada melo eixo Ang-(1-7) em cardiomiócitos. Além disso,
mostramos evidências de que camundongos Mas
-/-
apresentam redução da
atividade nNOS, alterações em proteínas envolvidas na apoptose dependente de
NO e aumento da produção de ROS no cardiomiócito. Coletivamente, essas
observações revelam um papel fundamental do eixo Ang-(1-7) / Mas como um
modulador da função do cardiomiócito.
vii
ABSTRACT
Recently there has been growing evidence suggesting that beneficial effects of
angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] in the heart are mediated by its receptor Mas.
However, the signaling pathways involved in these effects in cardiomyocytes are
unknown. We then investigated the involvement of the Ang-(1-7)/Mas axis in NO
generation and Ca
2+
handling in adult ventricular myocytes using a combination of
molecular biology, intracellular Ca
2+
imaging, and confocal microscopy. Here,
investigated the role of the Ang-(1-7)/Mas axis on Ca
2+
signaling. Cardiomyocytes
treated with 10nmol/L of Ang-(1-7) did not show changes in Ca
2+
transient
parameters such as peak Ca
2+
transients and kinetics of decay. Nevertheless,
cardiomyocytes from Mas-deficient mice presented reduced peak and slower
[Ca
2+
]i transients when compared with wild-type cardiomyocytes. Lower Ca
2+
ATPase of the sarcoplasmic reticulum and phospholamban expression levels
accompanied the reduced Ca
2+
transient in Mas-deficient cardiomyocytes.
Therefore, chronic Mas-deficiency leads to impaired Ca
2+
handling in
cardiomyocytes. Acute Ang-(1-7) treatment (10 nmol/L) leads to NO production
and activates endothelial NO synthase and Akt in cardiomyocytes. Ang-(1-7)–
dependent NO raise was abolished by pretreatment with A-779 (1 µmol/L). To
confirm that Ang-(1-7) action is mediated by Mas, we used cardiomyocytes isolated
from Mas-deficient mice. In Mas-deficient cardiomyocytes, Ang-(1-7) failed to
increase NO levels. Moreover, Mas-ablation was accompanied by significant
alterations in the proteins involved in the regulation of endothelial NO synthase
activity, indicating that endothelial NO synthase and its binding partners are
important effectors of the Mas-mediated pathway in cardiomyocytes. Moreover, we
show evidence that Mas-deficient cardiomyocytes have reduced NO synthase
neuronal activity, changes in proteins involved in NO-induced apoptosis and higher
ROS levels in cardiomyocytes. Collectively, these observations reveal a key role
for the Ang-(1-7)/Mas axis as a modulator of cardiomyocyte function.
viii
SUMÁRIO
Lista de figuras.................................................................................................... iii
Lista de abreviaturas........................................................................................... v
Resumo............................................................................................................... vi
Abstract............................................................................................................... vii
1. Introdução ....................................................................................................... 01
1.1- Sistema Renina-Angiotensina e o sistema cardiovascular ...................... 01
1.1.1-Angiotensina II .................................................................................. 02
1.1.2-Angiotensina-(1-7) ............................................................................ 03
1.2- O Sistema Renina-Angiotensina coração ................................................ 04
1.2.1-Angiotensina II .................................................................................. 04
1.2.1-Angiotensina-(1-7) ............................................................................ 05
1.3-Receptores angiotensinérgicos e o coração............................................. 07
1.3.1-Receptores AT1 e AT2...................................................................... 07
1.3.2- Receptor Mas................................................................................... 08
1.3.2.1- As ações da Ang-(1-7) são mediadas pelo receptor Mas ..... 08
1.3.2.2- A identificação da proteína Mas............................................ 09
1.3.2.3- Presença da proteína Mas em diferentes tecidos................. 09
1.3.2.4- A proteína Mas como receptor da Ang-(1-7)......................... 11
1.4-Animais Mas
-/-
apresentam disfunção....................................................... 14
1.4.1- Pressão arterial e função endotelial................................................. 14
1.4.2- Disfunção cardíaca .......................................................................... 15
1.5-Identificação do receptor Mas no cardiomiócito........................................ 16
1.6- Investigação das vias de sinalização da Ang-(1-7) / Mas no coração..... 17
1.7-As vias de sinalização do Ca
2+
e do óxido nítrico em cardiomiócitos ....... 18
1.7.1- Cálcio e disfunção contrátil.............................................................. 18
1.7.2- NO e apoptose................................................................................. 21
1.8- Eixo Ang-(1-7)/receptor Mas e a via de sinalização do NO...................... 23
1.9-
Espécies reativas de oxigênio e apoptose................................................................
24
2-Objetivos.......................................................................................................... 29
ix
2.1-Objetivo geral............................................................................................ 29
2.2- Objetivos específicos............................................................................... 29
3-Materiais e Métodos......................................................................................... 30
3.1- Animais.................................................................................................... 30
3.2- Isolamento de cardiomiócitos................................................................... 30
3.3- Medida do transiente de Cálcio................................................................ 30
3.4-Tratamento das células para medida da produção de NO........................ 32
3.5- Western Blot ............................................................................................ 32
3.6- Imunofluorescência.................................................................................. 34
3.7- Tratamento das células para medida da produção de ROS .................... 34
3.8- Reagentes................................................................................................ 35
3.9- Análise estatística.................................................................................... 35
4- Resultados...................................................................................................... 36
4.1- Relação do peso do coração pelo comprimento da tíbia ......................... 36
4.2- Redução do transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
........................................................................................................ 36
4.3- Ang-(1-7) aumenta a produção de NO em cardiomiócitos....................... 39
4.4- A produção de NO em cardiomiócitos pela Ang-(1-7) é abolida em
camundongos...........................................................................................40
4.5- A expressão da eNOS não está alterada em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
.................................................................................41
4.6- A deleção do receptor Mas é acompanhada por alterações em proteínas
que regulam a atividade da eNOS............................................................43
4.7- A GSK-3β está hiperfosforilada em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
.........................................................................................................47
4.8- A expressão da nNOS está reduzida em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
.................................................................................48
4.9- Camundogos Mas
-/-
apresentam alterações em proteínas da via de
sinalização da apoptose mediada pelo NO ..............................................49
4.10- Camundongos Mas
-/-
apresentam aumento da produção de ROS no
cardiomiócito ............................................................................................51
5- Discussão.........................................................................................................53
5.1- Alterações na via de sinalização do Ca
2+
e NO como mecanismo da
redução da contratilidade cardíaca em camundongos Mas
-/-
...........................53
5.1.1- Transiente de Ca
2+
............................................................................53
5.1.2- Transiente de Ca
2+
e NO ..................................................................57
5.2- Alteração na sinalização do NO como mediadora da apoptose cardíaca
de camundongos Mas
-/-
....................................................................................59
5.2.1- Alteração da via Akt/eNOS ...............................................................59
5.2.2- GSK-3β .............................................................................................61
5.2.3- nNOS................................................................................................63
5.2.4- NO/Caspase .....................................................................................64
5.3- ROS, apoptose e o SRA...........................................................................65
5.3.1- Produção das ROS em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.......65
x
5.3.2- ROS e o SRA....................................................................................66
5.3.3- ROS e NO.........................................................................................67
6- Conclusão........................................................................................................70
Referências..........................................................................................................71
ANEXO.................................................................................................................84
xi
1
1-Introdução
1.1-Sistema Renina-Angiotensina e o sistema cardiovascular
O Sistema Renina-Angiotensina (SRA) tem mostrado exercer importante
papel na regulação da pressão arterial e, nos últimos anos, papel fundamental no
remodelamento de diferentes tecidos. Na visão clássica, o SRA é constituído de
enzimas e peptídeos que levam à formação da Ang II. Na visão moderna, este
sistema possui outras enzimas que levam a formação de uma via contrarregulatória
tendo a Ang-(1-7) como um peptídeo com ações, na maioria das vezes, protetoras e
antagônicas à Ang II (Santos e cols., 2008) (Figura 1).
Figura 1 - Visão moderna do Sistema Renina-Angiotensina. Abreviações: ECA,
Enzima Conversora de Angiotensina; Ang, Angiotensina; AMP, Aminopetidase; D-
AMP, Dipeptidil-Aminopeptidase; IRAP, Aminopeptidase Insulina-Regulatória, PCP,
Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolil-endopeptidase; NEP, Endopeptidase Neutra;
P(RR), Receptor da Renina/Pró-Renina. (Adaptado de Santos e cols, 2008).
2
1.1.1-Angiotensina II
A Ang II, peptídeo classicamente conhecido deste sistema, promove ações
hipertensivas nos diferentes sistemas fisiológicos. Nos estudos de Bono e cols.,
(1962) a infusão endovenosa deste peptídeo em indivíduos normotensos sadios
promoveu aumento na pressão arterial de repouso, sendo este aumento 50 vezes
maior que o mesmo experimento com infusão de noradrenalina. No sistema nervoso
central a Ang II estimula a área rostral ventrolateral do bulbo (área pressora)
(Andreatta e cols., 1988) e facilita a liberação de noradrenalina pelas terminações
nervosas simpáticas exercendo uma comunicação de feedback positivo entre
sistema nervoso simpático e sistema renina-angiotensina (Fagard e cols., 1984).
Outro mecanismo hipertensor utilizado pela Ang II é o aumento do volume
sanguíneo, que pode se dar de três formas: 1-estimulando a hipófise posterior a
liberar ADH, que atua nos túbulos distais via receptor V2 reabsorvendo água e,
além disso, é um potente vasoconstritor via receptor V1 . 2- estimulando a liberação
de aldosterona na zona glomerulosa renal. 3- interferindo no comportamento,
atuando no órgão subfornical aumentando o apetite por sódio e água (Ferrario e
cols., 1988). Nos tecidos periféricos a Ang II promove redução da sensibilidade dos
barorreceptores, o que reduz a eficácia no controle da variação da pressão arterial a
cada ciclo cardíaco (Oparil e cols., 1988). Em adição, promove vasoconstrição
potente e proliferação endotelial (Machado e cols., 2000).
3
1.1.2- Angiotensina-(1-7)
A via de formação da Ang-(1-7) tem sido explorada nos últimos anos e,
apesar de várias enzimas formarem a Ang-(1-7), a Enzima Conversora de
Angiotensina 2 (ECA 2) parece ser a principal enzima formadora deste peptídeo
(Tipnis e cols., 2000; Donoghue e cols., 2000).
A Ang-(1-7) foi vista por muito tempo como um peptídeo inativo do SRA
(Greene e cols, 1982). Entretanto, no final da década de 1980 esta visão foi mudada
a partir de estudos que apontavam a Ang-(1-7) como um petídeo ativo. Em 1988,
Schiavone e cols., mostraram que a Ang-(1-7) aumenta a liberação de vasopressina
pela neuro-hipófise. Em 1989, Campagnole-Santos e cols., verificaram que
microinjeções de baixas doses da Ang-(1-7) no núcleo do trato solitário promeveram
queda da pressão arterial. Desde então, diversos estudos mostraram que a Ang-(1-
7) é um importante peptídeo ativo deste sistema. Dentre as ações cardiovasculares
da Ang-(1-7) podemos citar o aumento da sensibilidade do barorreceptor
(Campagnole-Santos e cols., 1992) e a potencialização do efeito vasodilatador da
bradicinina (Paula e cols., 1995; Abbas e cols., 1997; Fernandes e cols., 2001) e do
NO (Porsti e cols., 1994; Brosnihan e cols., 1996; Machado e cols., 2001; Heitsch e
cols., 2001).
Apesar dos mecanismos vasodilatadores da Ang-(1-7) terem sido destacados,
é importante ressaltar que dados da literatura mostram apenas um ligeiro efeito
hipotensor da Ang-(1-7) em animais in vivo (Sampaio e cols., 2003). Estes estudos
mostram um possível papel da Ang-(1-7) na elevação do débito cardíaco e, portanto,
é possível que a vasodilatação promovida pela Ang-(1-7) seja acompanhada por um
aumento no débito cardíaco, o que leva a uma alteração mais discreta dos níveis
4
pressóricos. Estes resultados ainda são controversos pois, os estudos de Braga e
cols., 2002 mostram que a Ang-(1-7) promove bradicardia. Além disso, Santos e
cols., 2007 mostraram que animais que superexpressam Ang-(1-7) apresentavam
aumento do volume de ejeção e do débito cardíaco, além de redução da resistência
periférica total.
1.2- O Sistema Renina-Angiotensina e o coração
1.2.1- Angiotensina II
A presença de um sistema renina-angiotensina tecidual foi primeiramente
descrita no rim (Kimbrough e cols., 1977) e, posteriormente, nos vasos sanguíneos
(Dzau e cols., 1984) e no coração (Re, 1987). Nesse sentido, alguns estudos
mostram que o tecido cardíaco tem uma alta eficiência em captar da circulação as
enzimas e os demais componentes do sistema renina-angiotensina. A renina, por
exemplo, parece ser facilmente captada na circulação coronariana (Muller e cols.,
1998). Entretanto, diversos estudos mostram que todos componentes do SRA
podem ser sintetizados pelo próprio tecido cardíaco (Campbell, 1987; Lindpainter e
cols., 1990; Schunkert e cols., 1990) e a síntese de enzimas como a renina no
coração está aumentada em condições patológicas como no infarto do miocárdio
(Clausmeyer e cols., 1998). Além disso, a descoberta de outras enzimas no coração,
tais como as quimases que convertem a Ang I diretamente em Ang II, representa
uma via alternativa a da ECA presente neste órgão (Carey & Siragy, 2003).
Essa via de formação local do SRA levantou a hipótese de que os efeitos
locais destes peptídeos poderiam ser independente de seus efeitos sistêmicos.
5
Corroborando esta hipótese, Mazzolai e cols., 1998, mostraram que a elevação
crônica da Ang II no coração promove danos ao tecido cardíaco sem exercer seus
efeitos clássicos de elevação na pressão arterial sistêmica . De forma oposta, nos
estudos de Kang e cols., (1999) animais que expressam angiotensinogênio
exclusivamente no fígado e cérebro desenvolvem hipertensão sem apresentar
alterações na estrutura cardíaca.
Além disso, vários trabalhos descreveram os efeitos da elevação crônica da
Ang II no coração, de forma mais aprofundada. Em resumo, podemos citar que o
aumento crônico cardíaco da Ang II promove o remodelamento ventricular (Weber e
cols., 1995), a deteriorização da função sistólica e diastólica (McElmurray e cols.,
1999), o crescimento de células musculares lisas em cultura (Kato e cols., 1991), o
aumento da proliferação de fibroblastos (Crabos e cols., 1994; Sun e cols., 1997;
Kawano e cols., 2000; Gonzalez e cols., 2002), a hipertrofia dos miócitos
(Sadoshima & Izumo, 1993), a redução da contratilidade (Lijnen & Petrov, 2003), e,
além disso, a Ang II promove vasoconstrição coronariana, participando assim no
processo de arritmias cardíacas (Ferreira e cols., 2001).
1.2.2- Angiotensina-(1-7)
A síntese local de Ang-(1-7) no coração foi primeiramente detectada em cães
após isquemia aguda do miocárdio (Santos e cols., 1990) e, desde então, o coração
tem sido considerado um importante alvo de estudo das ações da Ang-(1-7). Desta
forma, surgiam as primeiras evidências de que o dano tecidual cardíaco é um
estímulo para formação local de um sistema contrarregulatório mediado pela Ang-(1-
7), sendo a ECA 2 a principal enzima envolvida na formação deste peptídeo no
6
coração (Crackower e cols, 2002). Zisman e cols., (2003), e Averill e cols., (2003),
mostraram que a Ang-(1-7) está presente no miocárdio, especialmente após o
infarto, e sua formação parece ser dependente da presença da Ang II como
substrato.
A partir destas descobertas, pouco ainda se sabia sobre os efeitos da Ang-(1-
7) no tecido cardíaco. Foi então que diversos estudos mostraram que, além de inibir
o efeito pressor sistêmico, a Ang-(1-7) era capaz de inibir os efeitos deletérios locais
da Ang II no coração. Essa ação local da Ang-(1-7) especificamente no coração tem
sido proposta em diversos trabalhos, que serão citados a seguir.
Ferreira e cols., (2001), mostraram que a Ang-(1-7) diminui a duração do
período de arritmia durante a reperfusão do miocárdio após o colabamento da
coronária esquerda e melhora a contratilidade cardíaca nestas condições. Loot e
cols., (2002), mostraram que após o infarto do miocárdio a infusão crônica de Ang-
(1-7) por 8 semanas atenuou o processo de falência cardíaca e melhorou a função
endotelial aórtica em ratos. Além disso, animais transgênicos que superexpressam
Ang-(1-7) no plasma apresentaram melhora significativa de todos os parâmetros da
função cardíaca após a isquemia aguda do miocárdio (Santos e cols., 2004). Em
2005 Mendes e cols., constataram que a Ang-(1-7) reduz os níveis teciduais de Ang
II, o que foi confirmado recentemente com animais que superexpressam Ang-(1-7)
(Nadu e cols., 2006). Além disso, recentemente Grobe e cols., (2006) mostraram que
a Ang-(1-7) previne o surgimento de fibrose cardíaca sem alteração dos níveis
pressóricos sistêmicos de ratos hipertensos, além de atenuar em fibroblastos
cardíacos a produção de endotelina-1, um importante marcador proliferativo desta
célula (Iwata e cols., 2005).
7
A ECA 2, principal enzima envolvida na formação da Ang-(1-7) apresentou
aumento de sua expressão em coração infartado (Santos e cols., 2005) e a deleção
gênica ou a superexpressão da ECA 2 mostrou que essa enzima tem papel crucial
na manutenção da estrutura e função cardíaca (Crackower e cols., 2002; Diez-
Freire e cols., 2006; Gurley e cols., 2006). Em concordância, Grobe e cols., 2007
mostraram uma redução significativa da produção de colágeno induzida por hipóxia
em cultura de fibroblastos transfectados com a ECA 2. O resumo das principais
ações da Ang-(1-7) no coração estão apresentados na figura 2.
Figura 2- Principais ações da Ang-(1-7) no coração.
1.3- Receptores angiotensinérgicos e o coração
1.3.1- Receptores AT1 e AT2
As ações da Ang II são mediadas pelos receptores AT1 e AT2, os quais foram
descritos como receptores com sete domínios transmembrana, acoplados à proteína
8
G (Kim & Iwao, 2000). Via receptor AT1, a Ang II contribui diretamente para os
efeitos deletérios no remodelamento cardíaco tendo papel importante no processo
de hipertrofia (Senbonmatsu, 2003), arritmias (Ferreira e cols, 2001) e fibrose
(Sadoshima e cols, 1993; Brilla e cols, 1994). Sendo que, animais transgênicos que
superexpressam o receptor AT1 no coração exibem uma significativa hipertrofia
cardíaca, apresentando alta mortalidade logo após o nascimento (Hoffman e cols.,
1996).
Via receptor AT
2
a Ang II promove efeitos antagônicos como vasodilatação
(Tsutsumi e cols., 1999), inibição da proliferação celular induzida pela estimulação
dos receptores AT
1
(Stoll e cols., 1995; Tanaka e cols., 1995), sendo que, estes
efeitos, parecem ser mediados pela formação de cininas, NO e cGMP (Tsutsumi e
cols., 1999). No entanto, devemos ressaltar que os efeitos da Ang II via receptor
AT2, ainda são controversos.
1.3.2- Receptor Mas
1.3.2.1- As ações da Ang-(1-7) são mediadas pelo receptor Mas
Em um número crescente de estudos tem sido mostrado que os efeitos da
Ang-(1-7) não são abolidos pelo bloqueio dos receptores AT1 e AT2, sugerindo a
presença de um receptor específico para a Ang-(1-7) (Benter e cols., 1993; Porsti e
cols., 1994; Brosnihan e cols., 1996). Em concordância com estes achados, uma
forma modificada da Ang-(1-7), a [D-Ala7]-Ang-(1–7), na qual a prolina da posição 7
é substituída pela D-Alanina, bloqueou seletivamente os efeitos da Ang-(1-7)
9
(Santos e cols, 1994; Tallant e cols, 1999). A partir destes resultados os
pesquisadores sugeriram a presença de um receptor específico para Ang-(1-7).
1.3.2.2- A identificação da proteína Mas
O receptor Mas foi primeiramente caracterizado como um receptor órfão,
acoplado a proteína G, com sete domínios transmembrana e baixa atividade
oncogênica (Young e cols., 1986). Mais tarde em 1988, Young e cols. e Metzger e
cols., 1995, isolaram e caracterizaram o gene da proteína Mas em ser humano, rato
e camundongo, sendo caracterizada como uma proteína constituída de 324
aminoácidos, com homologia de 97% entre rato e camundongo e de 91% entre o
camundongo e humanos.
Em 1992, Andrawis e cols., mostraram que a proteína Mas promoveu o
crescimento de fibroblastos em cultura e em 2000, Xu e cols., identificaram redução
da formação de tumor e morte celular em cones da retina com superexpressão da
proteína Mas sugerindo que esta proteína não teria atividade oncogênica como
anteriormente descrito por Young e cols., 1986.
1.3.2.3- Presença da proteína Mas em diferentes tecidos
- Cérebro
O cérebro foi o primeiro órgão a ser identificado com alta expressão da
proteína Mas, mais especificamente no hipocampo e córtex cerebral de ratos (Young
e cols., 1988) e camundongos (Metzger e cols., 1995). Kitaoka e cols., 1994,
identificaram uma pequena expressão do Mas na retina.
10
Recentemente, Becker e cols., 2007, identificaram a presença do Mas em
regiões do sistema nervoso central envolvidas com o controle cardiovascular.
- Testículo
O mRNA que codifica a proteína Mas foi também identificado no testículo de
camundongo e de rato (Metzger e cols., 1995; Alenina e cols., 2002). Aspecto
interessante é que, no testículo, a expressão do Mas aumenta durante o
desenvolvimento a partir de cinco semanas de vida, chegando ao maior nível de
expressão em ratos com 25 semanas (Metzger e cols., 1995). Em camundongos, a
expressão do Mas não foi detectada em recém-nascidos, porém observou-se um
aumento da expressão desta proteína a partir de 2 semanas do nascimento até os 6
meses. Além disso, observa-se uma expressão maior do Mas nas células de Leydig
comparada às células de Sertoli (Alenina e cols., 2002).
- Coração e outros tecidos
Pela técnica de RT-PCR, já foi identificada a presença do mRNA da proteína
Mas nos rins, pulmão, região esplânica, e músculo esquelético (Villar & Pedersen,
1994; Metzger e cols., 1995). No coração, Tallant e cols., 2005, identificaram a
presença da proteína Mas em ratos neonatos. Recentemente identificamos a
presença da proteína Mas no coração de ratos adultos (Dias-Peixoto, 2007). Além
disso, Ferrario e cols., 2005, também demonstraram a expressão do mRNA do Mas
no coração, além disso, os autores observaram que o aumento da expressão do
mRNA do AT1 era seguido por uma redução do mRNA do Mas.
11
É interessante ressaltarmos que, de modo semelhante aos estudos de
Alenina e cols., 2002, em testículo, verificamos que a expressão do Mas aumenta no
coração com o desenvolvimento (Dias-Peixoto, 2007). (Figura 3).
Figura 3 - Expressão do receptor MAS no coração de ratos Wistar em diferentes
idades. A. Western blot representativo de 3 experimentos independentes (MAS e
GAPDH). B. O gráfico de barras mostra que a expressão protéica do receptor MAS
no coração aumenta com o envelhecimento. n = número de amostras. * P < 0.05 - 3
e 12 meses vs recém-nascido. # P < 0.05 - 3 e 12 meses vs 7 dias. † P < 0.05 – 3,
12 meses vs 21 dias. O gráfico de barras mostra a expressão do receptor MAS no
coração após a normalização com GAPDH, confirmando os resultados apresentados
em B. (u.a. = unidades arbitrárias). (Dias-Peixoto, 2007).
1.3.2.4- A proteína Mas como receptor da Ang-(1-7)
Inicialmente a proteína Mas foi caracterizada como um receptor de Ang II
(Jackson e cols., 1988). Porém, os principais receptores de Ang II, AT1 e AT2,
exibiam apenas 8 e 19% de aminoácidos homólogos à proteína Mas,
12
respectivamente (Sasaki e cols., 1991; Mukoyama e cols., 1993). No entanto, em
2003, Santos e cols mostraram evidências funcionais de que o receptor Mas é o
ligante da Ang-(1-7). Nesse estudo, foi mostrado através de experimentos de binding
no rim, que em camundongos com deleção genética do receptor Mas, a Ang-(1-7)
apresentou baixa afinidade de ligação a este tecido. Por outro lado, no mesmo
estudo, a Ang-(1-7) se ligou com alta afinidade em células de linhagem
transfectadas com o receptor Mas. Vale ainda ressaltar, que a Ang-(1-7) via receptor
Mas promoveu a liberação de ácido aracdônico, efeito este que não foi bloqueado
pelos antagonistas dos receptores AT1 e AT2, sendo bloqueado apenas com o
antagonista específico do receptor Mas (A779).
Recentemente, foi demonstrado que o receptor Mas pode formar dímero com
o receptor AT1, o que poderia explicar, em parte, os efeitos contrarregulatórios à
Ang-(II) por antagonizar a via de sinalização do receptor AT1 (Kostenis e cols.,
2005). Há evidências funcionais de que o receptor Mas pode interagir, não apenas
com o receptor AT1, mas também com o receptor AT2 (Castro e cols., 2005). Canals
e cols., 2006, sugerem que possivelmente a Ang-(1-7) via receptor Mas ativa a
proteína Gαq/11 e estimula a fosforilação da proteína quinase C dependente do
receptor AT1.
Desta forma, na visão atual, o eixo Ang-(1-7) / receptor Mas forma uma
importante via contrarregulatória ao eixo Ang-II / receptor AT1 sendo o balanço entre
estas duas vias crucial para a homeostasia cardiovascular (Ferreira e Santos,
2005). Hoje, é sugerido que essas vias não agem de forma independente mas sim,
dependem do balanço final entre elas. Ou seja, uma maior atividade do eixo Ang II /
receptor AT1 leva a um predomínio dos efeitos vasoconstritores, proliferativos e
hipertróficos. Enquanto a maior atividade do eixo Ang-(1-7) / receptor Mas será
13
acompanhado de efeitos vasodilatadores, anti-proliferativos e anti-hipertróficos
(Figura 4). De fato, Mendes e cols., 2004, mostraram que a infusão crônica da Ang-
(1-7) levou a uma diminuição dos níveis teciduais de Ang-II no coração.
Dentre as ações da Ang-(1-7) via recepor Mas no coração destacam-se a
inibição da proliferação de fibroblastos cardíacos (Iwata e cols., 2007), e os efeitos
anti-hipertóficos (Tallant e cols., 2005). Nestes estudos foi demonstrado que a Ang-
(1-7), via receptor Mas, inibe a hipertrofia de cardiomiócitos em cultura
possivelmente através das MAP-Quinases ERK1/2 e calcineurina/NFAT,
respectivamente. Em seguida, Grobe e cols., 2007, mostraram que a infusão de
Ang-(1-7) em ratos previne a hipertrofia de cardiomiócitos induzida pela Ang-II,
sendo estes efeitos abolidos na presença do antagonista do receptor Mas, A779.
Recentemente, Gomes e cols., 2010, demonstraram que a Ang-(1-7) é capaz de
antagonizar os efeitos hipertróficos da Ang II através da via NO/cGMP.
Figura 4 – Balanço das ações contrarregulatórias do eixo Ang II / receptor AT1 vs.
Ang-(1-7) / receptor Mas. (Adaptado de Santos e cols., 2008).
14
1.4- Animais Mas
-/-
apresentam disfunção cardíaca
A construção de animais com deleção genética do receptor Mas (Mas
-/-
) tem
trazido grande avanço para o entendimento das funções e mecanismos celulares do
eixo Ang-(1-7)/receptor Mas.
Walther e cols., 1998, geraram os primeiros camundongos Mas
-/-
a partir da
deleção gênica do aminoácido terminal 253 da proteína Mas. De forma interessante,
foi observado que os camundongos Mas
-/-
tinham o crescimento normal e não
apresentavam alterações da pressão arterial.
1.4.1- Pressão arterial e função endotelial
É interessante observarmos que as alterações cardiovasculares apresentadas
nos animais Mas
-/-
podem ser dependentes do background genético do animal. Por
exemplo, camundongos Mas
-/-
FVBN exibiram alta pressão arterial em comparação
aos animais controle, quando medida por telemetria (Xu
e cols., 2008), o que não foi observado em camundongos Mas
-/-
C57/BL6 (Walter e
cols, 1998). Neste último estudo, os autores atribuem esta variabilidade às
alterações cardíacas e vasculares íntrinsecas que o animal pode apresentar. Os
autores sugerem que camundongos Mas
-/-
C57/BL6 podem apresentar redução do
débito cardíaco, podendo assim explicar a ausência de alterações dos níveis
pressóricos nesses animais.
Peiro e cols., 2007, utilizando a linhagem FVBN observaram disfunção
endotelial em camundongos Mas
-/-
e, além disso, mostraram que tanto
camundongos Mas
+/+
tratados com A779, quanto camundongos Mas
-/-
tiveram
15
redução do relaxamento de artérias mesentéricas induzido pela Ang-(1-7). Esses
resultados corroboram com os achados de que a Ang-(1-7) tem importante função
no relaxamento vascular por sua ação endotelial via receptor Mas.
1.4.2- Disfunção cardíaca
A Ang-(1-7) tem mostrado exercer importante papel na função cardíaca, como
por exemplo o aumento do débito cardíaco (Sampaio e cols., 2003), e a prevenção
do surgimento de fibrose cardíaca, especialmente por suas ações no fibroblasto
cardíaco (Iwata e cols., 2005). Em concordância, dois estudos recentes
demonstram a ocorrência de duas importantes disfunções cardíacas em
camundongos Mas
-/-
, a disfunção contrátil e a apoptose cardíaca.
- Contratilidade
Santos e cols, 2006, mostraram que animais Mas
-/-
apresentam redução da
contratilidade cardíaca. Nestes estudos, foram utilizados camundongos C57/BL6
Mas
-/-
que apresentaram baixa reatividade da Ang-(1-7) em fatias do ventrículo
esquerdo. Através da técnica de coração isolado foi mostrado que camundongos
Mas
-/-
apresentaram menor tensão sistólica quando comparado aos animais Mas
+/+
.
- Fibrose e apoptose
Santos e cols., 2006, mostraram também alterações morfológicas cardíacas
em animais Mas
-/-
, como um marcante aumento da matrix extracelular levando a um
estado pró-fibrótico no coração pelo aumento da síntese de colágeno I e III,
fibronectina e redução do colágeno VI. Além desta disfunção, recentemente estudos
16
de nosso grupo mostraram que animais Mas
-/-
apresentam apoptose cardíaca (Dias-
Peixoto e cols., 2008).
A apoptose, morte celular programada, pode ser um processo fisiológico
benéfico envolvido na regeneração celular. No cardiomiócito, este processo tem
papel benéfico, especialmente nas fases iniciais do nascimento, no entanto em
animais adultos a apoptose está geralmente associada com a disfunção cardíaca
(Kim e cols., 1999; Nadal e cols., 2003).
Em conjunto, estes resultados mostram que o receptor Mas tem um
importante papel na manutenção da estrutura e função cardíaca.
1.5- Identificação do receptor Mas no cardiomiócito
A presença do receptor Mas em cardiomiócito de ratos neonatos foi
identificada por Tallant e cols., 2005. Nós mostramos que o receptor Mas está
presente também em cardiomiócitos de ratos adultos (Dias-Peixoto, 2007). De modo
interessante, podemos verificar que nos estudos de Tallant e cols., 2005, com ratos
neonatos, o receptor Mas está localizado de forma difusa em toda a célula. Já nos
nossos estudos com ratos adultos verificamos a presença do receptor Mas
principalmente no sarcolema desta célula. Não sabemos ainda se esta diferenciação
se deve à técnica utilizada nesses experimentos ou se realmente à medida que o
animal atinge a vida adulta o receptor Mas começa a ter a expressão aumentada
especificamente na membrana plasmática. A figura 5 mostra os resultados obtidos
pela técnica de imunofluorescência destes dois estudos.
17
Figura 5- Localização do receptor Mas no cardiomiócito. A. Cardiomiócitos
provenientes de ratos neonatos marcados com anticorpo anti-Mas (marcação em
verde; retirado de Tallant e cols., 2005). B. Cardiomiócito ventricular de rato adulto
narcado com anticorpo anti-Mas (marcação em vermelho; Dias-Peixoto, 2007).
1.6- Investigação das vias de sinalização da Ang-(1-7) / Mas no coração
Em 2007 dois estudos mostraram importantes efeitos da Ang-(1-7) via
receptor Mas no coração. Grobe e cols., 2007, mostraram que a Ang-(1-7) via
receptor Mas previne o remodelamento cardíaco induzido pela Ang-II, sugerindo que
estes mecanismos podem ser mediados pelo TGF-β. Já Iwata e cols., 2007,
demonstraram que a via Ang-(1-7) / receptor Mas está envolvida com a inibição da
proliferação de fibroblastos cardíacos. Apesar de vários estudos confirmarem que o
18
receptor Mas é um importante ligante da Ang-(1-7) as vias de sinalização
intracelular deste eixo ainda são pouco conhecidas.
1.7- As vias de sinalização do Cálcio e do NO em cardiomiócitos
A justificativa deste trabalho baseia-se nas investigações de que o
cardiomiócito é um importante alvo do eixo Ang-(1-7)/ receptor Mas e que animais
Mas
-/-
apresentam disfunção cardíaca. Como as disfunções cardíacas relatadas até
o presente momento na literatura são a redução da contratilidade e apoptose
cardíaca, decidimos investigar duas importantes vias de sinalização no cardiomiócito
envolvidas com estas disfunções: a via de sinalização do Ca
2+
e do NO. Assim, nós
levantamos a hipótese de que cardiomiócitos ventriculares de camundongos Mas
-/-
apresentam alterações nessas vias de sinalização.
1.7.1- Cálcio e disfunção contrátil
O Ca
2+
é um importante segundo mensageiro no cardiomiócito, exercendo,
dentre outras funções, papel essencial para a contração cardíaca (Bers, 2003).
A figura 6A ilustra os mecanismos envolvidos na manutenção do Ca
2+
no
cardiomiócito. Durante a sístole, ocorre a chegada de um potencial de ação nos
túbulos T, promovendo a abertura de canais de Ca
2+
sensíveis à voltagem, os
canais de Ca
2+
tipo L. A entrada de Ca
2+
extracelular estimula a abertura de
receptores de rianodina, localizados no retículo sarcoplasmático, levando a abertura
destes receptores e consequente saída do Ca
2+
do retículo sarcoplasmático para o
citosol do cardiomiócito. O aumento do Ca
2+
citosólico promove um deslizamento
19
das pontes cruzadas e, consequentemente, a contração celular. No período de
diástole, o Ca
2+
é extrusado do citosol por diferentes mecanismos, dentre estes
destaca-se a Ca
2+
-ATPase localizada no retículo sarcoplasmático, a SERCA2, que
tem importante participação na recaptação dos íons Ca
2+
para o retículo
sarcoplasmático.
A SERCA2 é o principal responsável pela recaptação do Ca
2+
pelo retículo
sarcoplasmático (Figura 6B) em camundongos e ratos, portanto, a expressão desta
proteína foi objeto de nosso estudo. A função da SERCA2 é regulada pela
fosfolamban, que interage com a SERCA2, inibindo a sua atividade. A fosfolamban
modula desta forma a recaptação do Ca
2+
pelo retículo sarcoplasmático (Wolska e
cols. 1996; Bluhm e cols, 2000). Entretanto, quando a fosfolamban é fosforilada via
PKA ou calmodulina, ela se desacopla da SERCA2 aumentando a recaptação do
Ca
2+
(James e cols, 1989; Bluhm e cols, 2000).
O restante do Ca
2+
citoplasmático é extrusado pelo NCX (Bers, 2001; Bers,
2002). Existe também um pequeno fluxo de Ca
2+
para a mitocôndria, no entanto,
este mecanismo parece não influenciar de maneira significativa o transiente de Ca
2+
(Bers, 2001; Bers, 2002).
20
Figura 6- Acoplamento excitação-contração-relaxamento no cardiomiócito.
A.Mecanismos envolvidos na manutenção da cinética do Ca
2+
no cardiomiócito. B.
Durante a diástole a SERCA2 é responsável por 92% da recaptação do Ca
2+
pelo
retículo sarcoplasmático. lCa: influxo de cálcio; NCX: trocador sódio/cálcio; Ryr:
receptor de rianodina; ATP: cálcio ATPase/SERCA 2; PLB: fosfolamban; SR: retículo
sarcoplasmático. (Adaptado de Bers, 2002).
Como foi relatado anteriormente, animais Mas
-/-
apresentam redução da
contratilidade cardíaca e, sendo assim, a pergunta que fizemos foi se estes
camundongos apresentariam alterações na sinalização do cálcio no cardiomiócito.
21
1.7.2- NO e apoptose
Uma outra via de sinalização importante para a homeostase da célula
cardíaca, é a via do NO. O NO é um gás, que apresenta um elétron
desemparelhado na sua estrutura sendo então um radical livre. As enzimas
sintetizadoras de NO convertem o aminoácido L-arginina em L-citrulina com
consequente produção de NO (Figura 7). Existem três isoformas da NOS: a neuronal
(nNOS ou NOS1), a endotelial (eNOS ou NOS3) e a induzível (iNOS ou NOS2);
sendo a função das duas primeiras dependentes da concentração de Ca
2+
. As
enzimas sintetizadoras de NO (NOS) possuem na sua estrutura um grupamento
heme ligante de O
2
. Existe um mecanismo de feedback negativo pelo qual o NO
controla a atividade destas enzimas por competir com este sítio de ligação do O
2
,
sendo que a eNOS e nNOS são mais susceptíveis a esta inibição do que iNOS
(Griscavage e cols., 1995).
Figura 7- Síntese do oxido nítrico (NO) a partir da óxido nítrico sintase (NOS).
A.Esquema simplificado da síntese de NO. B. Representação da reação;
Inicialmente, ocorre a hidroxilação da L-arginina a L-hidroxiarginina, seguida de
oxidação da L-hidroxiarginina formando L-citrulina e NO. Os co-substratos NADPH e
O
2
também estão representados na figura.
22
O papel biológico do NO foi demonstrado, inicialmente, nos vasos onde
participava do mecanismo de relaxamento. Após essa descoberta muitos
pesquisadores começaram a investigar um possível papel do NO no coração.
Recentemente o NO tem mostrado ser um importante sinalizador no
cardiomiócito (Seddon e cols., 2007). As isoformas da NOS, eNOS e nNOS, são
expressas constitutivamente na célula muscular cardíaca em condições fisiológicas,
enquanto a iNOS, tem a expressão induzida em determinadas situações patológicas.
É interessante ressaltar que a localização das NOSs no cardiomiócito é diferenciada
dentro da célula, enquanto a nNOS está presente principalmente na membrana do
retículo sarcoplasmático, a eNOS é encontrada na membrana citoplasmática dos
túbulos T, em regiões denominadas cavéolas, que são invaginações da membrana
plasmática (Xu e cols., 1999; Champion e cols., 2004; Barouch e cols., 2002).
Entretanto, em condições patológicas parece haver alteração na localização dessas
isoformas. Neste contexto, Damy e cols., 2004 relataram um possível
translocamento da nNOS do retículo sarcoplasmático para a membrana celular
durante a insuficiência cardíaca.
A compartimentalização do cardiomiócito é um ponto extremamente
importante para o entendimento dos efeitos do NO na célula, principalmente pela
meia vida curta que este radical apresenta, principalmente porque o NO interage
rapidamente com a mioglobina cessando assim sua atividade (Ravazi e cols., 2005).
Apesar do papel do NO não ser completamente elucidado no miócito
cardíaco, algumas evidências sugerem que o NO pode tanto modular a
contratilidade (Paulus & Shah, 1999; Shakil e cols., 2003; Loyer e cols., 2008)
quanto a apoptose celular (Young-Myeong e cols., 1999; Razavi e cols., 2005). Uma
vez que camundongos Mas
-/-
apresentam redução da contratilidade (Santos e cols.,
23
2006) e aumento da apoptose cardíaca (Dias-Peixoto e cols., 2008), achamos
importante avaliar a via do NO nos cardiomiócitos ventriculares provenientes destes
animais.
1.8- Eixo Ang-(1-7)/receptor Mas e a produção de NO
Em 2001 estudos de Heitsch e cols., mostraram que, no endotélio, a Ang-(1-
7) estimula a produção de NO. Posteriormente, outros estudos confirmaram estes
resultados, além de demonstrarem a dependência do receptor Mas nestes efeitos
da Ang-(1-7) (Faria-Silva e cols, 2005; Sampaio e cols, 2007).
Recentemente a via de sinalização da Akt tem sido explorada como
importante mediador da ação da Ang-(1-7)/Mas. Nos estudos de Sampaio e cols,
2007, foi demonstrado que a Ang-(1-7)/receptor Mas estimula a produção de NO
pela via da PI3-quinase-Akt-eNOS. Em concordância, Giani e cols., 2007, mostraram
que, no coração, a Ang-(1-7) é capaz de estimular a fosforilação da Akt e estes
efeitos são bloqueados pelo A779.
Apenas recentemente, as vias de sinalização da Ang-(1-7)/Mas tem sido
investigadas no cardiomiócito. Em célula de ratos neonatos foi relatado que a Ang-
(1-7) diminui a expressão de quinases envolvidas no processo de hipertrofia
cardíaca (Tallant e cols, 2005).
Estudos recentes mostraram que a via da PI3-Quinase/Akt/eNOS exerce
importante papel anti-apoptótico no cardiomiócito (An-Heng e cols., 2008). A PI3-K é
uma enzima amplamente expressa cuja atividade primária é a fosforilação de
fosfatidilinositol (PI fosfolipídeos de membrana). A família PI3-K medeia uma gama
24
de efeitos biológicos através da ação de segundos mensageiros por ela gerados.
(Cantrell, 2001).
Já a família da Akt é composta por três membros: Akt1, Akt2 e Akt3. Estas
três isoformas compartilham mais de 80% de homologia e são expressas de maneira
específica nos tecidos, assim, as isoformas Akt1 e Akt2 são predominantemente
expressas no músculo-esquelético, cérebro, coração e pulmão e a isoforma Akt3 é
predominante no cérebro e testículo (Jones e cols., 1991; Franke e cols., 1995). A
fosforilação e ativação da Akt é estimulada por uma variedade de fatores, como
citocinas, hormônios e fatores de crescimento (Datta e cols., 1999), de maneira
dependente da fosfatidilinositol 3 quinase (PI3-K) (Franke e cols., 1995).
Na verdade a via PI3K/Akt/eNOS/NO vem sendo considerada uma importante
via de sobrevivência na célula cardíaca, apresentando um importante papel anti-
apoptótico (Liu e cols, 2008). Uma vez que a Ang-(1-7) é capaz de estimular essa
via em células endoteliais e o fato de que camundongos Mas
-/-
apresentam um
aumento da taxa de apoptose (Dias-Peixoto e cols., 2008) nós resolvemos
investigar se cardiomiócitos provenientes de animais Mas
-/-
apresentam alterações
na via de sinalização do NO.
1.9-Espécies reativas de oxigênio e apoptose
- Espécies Reativas de Oxigênio
As espécies reativas de oxigênio (ROS) têm mostrado exercer importante
papel na regulação da apoptose de cardiomiócitos e dentre os principais precursores
das ROS se encontram o O
2
elementar e o NO (Cook e cols., 1999).
25
Algumas das ROS mais conhecidas são: radical hidroxil (OH
-
), a mais
pontente por sua alta reatividade; radical superóxido (O
2
-
); peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e peroxinitrito (ONOO
-
), sendo estas duas últimas não radicalares.
As ROS são caracterizadas pela presença de um ou dois elétrons
desemparelhados, instáveis, altamente reativos e os principais locais de formação
das ROS são: 1) a mitocôndria, especialmente pela formação de O
2
-
na cadeia
respiratória e 2) a membrana celular, pela presença da NAD(P)H oxidase formando
principalmente ânions superóxido (Anderson, 1996).
Em condições normais ocorre uma produção basal de ROS, que é essencial
para diversos processos fisiológicos, tais como a defesa do organismo contra
agentes infeciosos, a síntese protéica, regulação metabólica, dentre outras funções
(Day, 2004). Na doença isquêmica, por exemplo, é sugerido que as ROS têm um
papel importante na ativação de uma resposta protetora (Kabir e cols., 2006).
Porém, quando há um desbalanço na geração de ROS, os radicais livres, em
excesso, podem danificar diversas estruturas biológicas, como os lipídios, proteínas
e carboidratos de membrana, bem como o DNA caracterizando, assim, o estresse
oxidativo (Anderson, 1996; Yu & Anderson, 1997).
Por exemplo, a peroxidação lipídica ocorre em consequencia do estresse
oxidativo e compreende uma reação em cadeia que leva a degradação de lipídios de
membrana, podendo gerar mais ROS e radicais, que podem danificar outras
estruturas, especialmente o DNA (Sies, 1993).
26
- Enzimas anti-oxidantes
Em uma visão geral, Sies, 1993, definem um antioxidante como “qualquer”
substância, que presente em baixas concentrações, quando comparada a do
substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira eficaz”,
sendo clasificados como antioxidantes enzimático e não enzimático como descrito a
seguir:
Não-enzimático: L-cisteína, α-tocoferol (vitamina E), beta-caroteno, ácido
ascórbico (vitamina C), Selênio, Glutationa, dentre outros.
Enzimático: Superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase
(GPX), dentre outras.
Os antioxidantes atuam no combate aos radicais livres impedindo a sua
formação ou interferindo no reparo de lesões celulares provocadas pelos radicais. A
eficiência das enzimas antioxidantes no combate às ROS se deve a capacidade oxi-
redutora destas pela presença de metais de transição em sua estrutura.
As enzimas antioxidantes mais conhecidas são a SOD, catalase e GPX que,
em conjunto, são responsáveis pela detoxificação do O
2
-
e H
2
O
2
(Sies, 1993). A
figura 8, ilustra o papel destas 3 enzimas no processo de detoxificação das ROS.
A SOD posui três isoformas: a SOD1 tem como cofatores cobre e zinco (Cu
2+
e Zn
2+
) e se encontra no espaço intermembranar da mitocôndria, núcleo e citosol; a
SOD2 é dependente de manganês (Mn) e está localizada na matriz mitocondrial e
uma terceira isoforma extracelular dependente também de Cu
2+
e Zn
2+
, a SOD3.
Esta enzima age na dismutação do radical superóxido em peróxido de hidrogênio e
oxigênio e impede a formação de ONOO
-
por evitar a reação do O
2
-
com o NO.
A GPX é encontrada no citosol, mitocôndria, retículo endoplasmático e
núcleo, sendo dividida em dois tipos, uma dependente de selênio, que catalisa a
27
remoção do H
2
0
2
, e outra independente de selênio, que é inativada pelo H
2
0
2
. Para
exercer sua função antioxidante, a GPX detoxifica o H
2
0
2
através da oxidação da
glutationa e formação de água. (Gutteridge, 1993).
A catalase, encontrada especialmente nos peroxissomos, e em menor
proporção, no citosol e mitocôndria, detoxifica o peróxido de hidrogênio em água e
oxigênio molecular. Esta enzima é mais ativa em condições patológicas, tendo
importante papel no combate ao estresse oxidativo nestas condições e, no
cardiomiócito, parece exercer importante papel na proteção contra a disfunção
contrátil (Matés e cols., 1999).
Figura 8- Mecanismo de detoxificação das ROS. A enzima SOD age na defesa
contra superóxiodos (O
2-
), enquanto as enzimas catalase e glutationa peroxidase
atuam sobre o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
).
- Apoptose
A apoptose é marcada por uma fragmentação do DNA que ocorre em
consequência da depleção de ATP, aumento do cálcio intracelular, redução do Bcl-2
e/ou aumento do Bax e, de especial importância neste trabalho, pelo aumento da
produção de ROS (McConkey, 1998).
No coração, as ROS parecem exercer importante papel na apoptose. Uma
produção excessiva de ROS aumenta a permeabilidade da membrana mitocondrial
interna pelo aumento da relação Bax/Bcl-2, duas proteínas que regulam a abertura
de poros da mitocôndria. Isto, leva ao colapso na produção de ATP devido à
alteração do potencial de membrana e, além disso, ocorre a liberação de conteúdo
mitocondrial para o citoplasma, incluindo o fator indutor de apoptose (AIF) e o
28
citocromo C, que no citosol ativam as caspases. As caspases constituem uma
família de aspartil-cisteíno proteases que degradam diversas proteínas chave do
metabolismo celular levando à apoptose (Kumar & Judutt, 2003). (Figura 9).
Figura 9- Mecanismo da indução da apoptose pelas ROS. AIF: Fator Indutor da
Apoptose; ROS: Espécies Reativas de Oxigênio. ´(Figura adaptada de Kumar &
Jugdutt, 2003 apud. Gioda, 2009).
Partindo de nossos achados que animais Mas
-/-
apresentam um aumento da
taxa de apoptose cardíaca, a medida do estresse oxidativo também foi objeto do
presente estudo.
29
2.Objetivos
2.1-
Objetivo geral
Verificar possíveis alterações na sinalização intracelular do Ca
2+
e do NO em
cardiomiócitos ventriculares de camundongos Mas
-/-
.
2.2-Objetivos específicos
- Avaliar se cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
apresentam alterações no
transiente de Ca
2+
.
- Verificar possíveis alterações na expressão da SERCA2 e fosfolamban em
cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
- Avaliar se a Ang-(1-7) estimula a produção de NO em cardiomiócitos.
- Avaliar a produção do NO em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
- Analisar a expressão das isoformas da NOS em cardiomiócito de animais Mas
-/-
.
- Verificar a expressão de proteínas envolvidas com a apoptose em cardiomiócitos
provenientes de camundongos Mas
-/-
.
- Avaliar a produção de ROS em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
30
3-Materiais e Métodos
3.1-Animais
Foram utilizados 18 camundongos Mas+/+ e 20 camundongos Mas
–/–
, FVBN,
machos de 3 a 6 meses de idade, cedidos pelo Laboratório de Hipertensão da
Universidade Federal de Minas Gerais. Os camundongos foram mantidos em gaiolas
com ciclo claro/escuro de 12:12h com temperatura controlada e alimento e água a
libitium. Todos experimentos foram realizados de acordo com normas do biotério
estabelecidas pela instituição.
3.2-Isolamento dos cardiomiócitos
Os animais eram decaptados e o coração rapidamente retirado. Os miócitos
ventriculares cardíacos foram isolados de acordo com o protocolo descrito por Mitra
e Morad, 1985 e mantidos em DMEM (Sigma).
3.3-Medida do Transiente de Cálcio
O transiente de Ca
2+
ilustra o aumento e redução global do Ca
2+
citoplasmático após um estímulo elétrico (Guatimosim e cols., 2002). A figura 10
representa uma ilustração gráfica deste transiente. F
0
representa a fluorescência
basal e F a fluorescência máxima. A razão de F por F
0
representa pico do transiente
de Ca
2+
. A redução deste transiente ao longo do tempo é chamada de decaimento
do transiente de Ca
2+
.
31
Figura 10- Representação esquemática da medida do transiente de cálcio. À
esquerda é mostrada uma imagem representativa de um cardiomiócito com a
fluorescência basal, mostrada pelas cores frias em azul e, à direita, é mostrada um
aumento global do transiente de Ca
2+
após um estímulo elétrico, como demonstrado
pelas cores quentes em amarelo e vermelho. O perfil típico de um transiente de
Ca2+ obtido em uma célula controle está apresentado na parte de baixo da figura.
As setas em vermelho indicam o momento da estimulação elétrica.
Para análise do cálcio intracellular (Ca
2+
i
), os cardiomiócitos eram incubados
com 6 µmol/L Fluo-4 AM (Molecular Probes) por 30 minutos a temperatura ambiente
e, a seguir, lavados com DMEM. As células eram então excitadas no comprimento
de onda de 488nm e com emissão em 515nm. Durante o experimento as células
cardíacas foram estimuladas na freqüência de 1,0 hertz, com um pulso quadrado de
duração de 5ms e 30v. Após a aplicação de 8 pulsos elétricos foi feita uma varredura
repetitiva ao longo de uma linha no eixo longitudinal das células (Guatimosim e cols.,
2002) utilizando-se o microscópio confocal Zeiss 510 Meta do CEMEL no Instituto de
Ciências Biológicas da UFMG. A liberação global de Ca
2+
foi analisada pelo software
IDL 6,0 (Research System, Inc., Boulder, CO). A medida do transiente de Ca
2+
foi
obtida pela razão de F/F
0
, onde F
0
demonstra a fluorescência basal de Ca
2+
.
Fluorescência basal
Aumento global da fluorescência
F
0
F
F
0
1 Hz
32
3.4-Tratamento das células para medida da produção de NO
A medida da produção do NO em cardiomiócitos foi feita utilizando um
indicador de fluorescência permeável à membrana citoplasmática, sensível ao NO, o
DAF-FM (Molecular Probes). Para detectar o NO citoplasmático, os cardiomiócitos
eram mantidos a 37°C com 5 µmol/L de DAF em solução de Tyrode contendo (em
mmol/L), 140 NaCl, 5 KCl, 5 HEPES, 1 NaH
2
PO
4
, 1 MgCl
2
, 1.8 CaCl
2
e 10 de
glicose por 30 minutos e então, lavados em Tyrode por mais 30 minutos. Os
cardiomiócitos eram então incubados com 10 nmol/L de Ang-(1-7) por 15 minutos,
ou pré-incubadas com 1µmol/L de A779 por 15 min seguido da incubação com Ang-
(1-7) por 15 minutos. Após serem lavados por 5 minutos com solução de Tyrode a
fluorescência era obtida utilizando o confocal Zeiss Meta.
3.5-Western blot
Os cardiomiócitos foram homogeneizados em tampão de lise (100mM NaCl,
50mM Tris-base, 5mM EDTA–2Na, 50mM Na
4
P
2
O
7
x10H
2
O, 1mM MgCl
2
pH=8,0)
com detergentes (Nonidet P40 1%, Triton x-100 0.3% e Sodium deoxycholate 0.5%),
contendo inibidores de protease (PMSF 200mM, benzamidina 15.7mg/mL,
pepstatina 10µM, aprotinina 10mg/mL) e inibidores de fosfatase (20mM NaF e 1mM
Na
3
VO
4
). Ao fim desse procedimento, o conteúdo foi centrifugado por 12 minutos, à
4ºC e a 8000rpm. As proteínas foram quantificadas utilizando o método de Bradford
(BRADFORD, 1976). 60µg de proteína foram então diluídas em tampão de amostra
(5X - 2M Tris pH=6.8, 20% Glicerol, 30% SDS, 25% β-mercaptoetanol, 0,1% Azul de
Bromofenol) para separação em gel de SDS-PAGE (sodium dodecyl (lauryl) sulfate-
33
poliacrilamida) em concentração de 10 - 15%, dependendo da massa molecular da
proteína estudada, e 4% o gel de concentração. Após serem separadas em gel, as
proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF. A
qualidade da transferência foi monitorada através da coloração da membrana com
solução de Ponceau (0,2%). A membrana foi então lavada com PBS/TBS contendo
0.1% Tween 20 (PBS-T/TBS-T) e colocada por 1 hora em solução de bloqueio (PBS-
T/TBS-T com 5% de leite desnatado) a fim de bloquear ligações não específicas.
Após o bloqueio, as membranas foram incubadas overnight em câmara fria, com
temperatura 4ºC, com o anticorpo primário específico.
Os anticorpos primários utilizados foram: anti-SERCA2 (ABR), anti-eNOS
(AbCam), anti-nNOS e anti-nNOS fosforilada (Santa Cruz) anti-caveolina 3 (BD
transduction), anti-Akt, anti-phospho Akt, anti-Hsp90 (Cell Signaling), anti-Xiap (Cell
Signaling), anti caspase-3 (Cell Signaling), Anti-GSK3β (Cell Signaling), Anti-
phospho GSK3β (Cell Signaling) e anti-GAPDH (Clontech). Para detecção das
bandas foi utilizado um kit de quimioluminecência (Amersham Biosciences, England,
UK). A quantificação das proteínas foi realizada pela normalização com anticorpo
anti-GAPDH. Em seguida, a membrana foi novamente lavada com PBS-T/TBS-T (5
vezes por 5 minutos). E então incubada com o anticorpo secundário conjugado a
peroxidase (HRP) (1:5000) por 1 hora. E mais uma vez a membrana foi lavada como
descrito anteriormente. As bandas protéicas foram detectadas por reação de
quimioluminescência (ECL plus – Amersham Biotecnology) e a intensidade das
mesmas foi avaliada por análise densitométrica através do software ImageQuant™.
34
3.6-Imunofluorescência
Os cardiomiócitos foram fixados em paraformaldeído (PFA) 4% por 15
minutos, posteriormente foram feitas 3 lavagens de 5 minutos com PBS. Em seguida
as células foram incubadas por 1 hora com solução de bloqueio (PBS, BSA 1%,
triton X-100 0,5%). Com essa mesma solução foi feita a incubação overnight com o
anticorpo anti-Akt em uma diluição de 1:100. Após as lavagens os cardiomiócitos
foram incubados por 1 hora com anticorpo anti-mouse conjugado a Alexa-488
(1:1000, Molecular Probes) e DAPI (1:25, Sigma) em solução de bloqueio. Repetiu-
se as lavagens e os cardiomiócitos foram ressuspendidos em 20µl de PBS. As
lâminas foram montadas usando Hydromount (National diagnostics) e vedadas com
esmalte incolor. A obtenção das imagens de imunofluorescência dos miócitos
ventriculares foi realizada através do microscópio Confocal Zeiss 510 Meta e
analisadas no software LSM Image Browser.
3.7- Tratamento das células para medida da produção de ROS
Para a mensuração das espécies reativas de oxigênio (ROS), os
cardiomiócitos isolados foram incubados com uma sonda fuorescente sensível as
ROS, o dihidroetídio (DHE, Calbiochem), por 30 minutos, a 37°C na concentração de
10µmol/L em meio DMEM. Após o período de incubação, as células foram
centrifugadas a 500 rpm por 1 minuto, o meio com sonda retirado e as células
ressuspendidas em meio livre de DHE. Após isso, as células foram incubadas ou
não com Ang II (100nM) por 15 minutos e então a varredura feita em um microscópio
35
confocal Zeiss Meta 510, utilizando para excitação um feixe laser com 488nm e
emissão em 515nm.
3.8-Reagentes
O peptídeo, Ang-(1-7), e o D-Ala7-Ang-(1-7) (A779) (Bachem) foram cedidos
pelo laboratório de Hipertensão da UFMG.
3.9-Análise estatística
Os dados foram apresentados como a média ± o desvio padrão. Para
comparações de duas variáveis foi utilizado o teste t student e, para comparação de
mais de duas variáveis foi utilizado o teste one way ANOVA. O nível de significância
foi estabelecido para um *p< 0.05.
36
4- Resultados
4.1-Relação do peso do coração pelo comprimento da tíbia
A Figura 11 mostra a medida da razão entre o peso do coração e o
comprimento da tíbia dos animais Mas
+/+
e Mas
-/-
. Nossos resultados mostraram que
camundongos Mas
-/-
não apresentam hipertrofia cardíaca aparente.
Mas+/+ Mas-/-
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
(n=16)
(n=14)
Peso do coração/
comprimento da tíbia
(mg/mm)
Mas
-/-
Mas
+/+
Figura 11- Relação do peso do coração em miligramas (mg) pelo comprimento da
tíbia em milímetros (mm) em camundongos selvagem (Mas
+/+
) e knock-out (Mas
-/-
).
4.2- Redução do transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
Uma vez que Santos e cols 2006 demonstraram que camundongos Mas
-/-
apresentam disfunção cardíaca, resolvemos buscar, a partir de então, alterações no
plano celular responsáveis por este efeito. O primeiro passo foi investigar os níveis
intracelulares de Ca
2+
, íon essencial para contração do cardiomiócito. Para isto,
realizamos experimentos de microscopia confocal com miócitos ventriculares
marcados com sonda fluorescente sensível ao Ca
2+
, flúor-4 AM. Em miócitos
ventriculares provenientes de animais Mas
-/-
, foi observado uma redução
significativa no pico do transiente de Ca
2+
(aproximadamente 14%) (Figura 12A-B).
Além disso, foi observado um aumento no tempo de decaimento do transiente de
37
Ca
2+
nestas células, quando comparadas com cardiomiócitos provenientes de
animais Mas
+/+
(Figura 12C).
Figura 12- Redução no transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos Mas
-
/-
. A. Imagem confocal representativa obtida na configuração line-scan (parte de
cima) e o perfil do transiente de Ca
2+
(abaixo) em cardiomiócitos de camundongos
selvagem (Mas
+/+
) e Mas
-/-
. B. O gráfico de barras mostra a média do pico do
transiente de Ca
2+
após estimulação elétrica (1Hz). n= número de cardiomiócitos
ventriculares analisados. C. Média do tempo de decaimento do transiente de Ca
2+
.
Cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
apresentaram decaimento do transiente de
Ca
2+
mais lento, quando comparados aos cardiomiócitos de camundongos selvagem
(Mas
+/+
). T90 representa o tempo necessário para que o transiente de Ca
2+
reduza
de seu pico até 90% de seu decaimento n= número de cardiomiócitos analisados. *
p<0.05.
Em cardiomiócitos, Ca
2+
ATPases presentes na membrana do retículo
sarcoplasmático (SERCA2) permitem a rápida recaptação do Ca
2+
liberado pelo
retículo sarcoplasmático, sendo responsáveis por cerca de 92% da extrusão de Ca
2+
citosólico na diástole (Bers, 2002). Portanto, levantamos a hipótese de que o
decaimento mais lento do transiente de Ca
2+
em cardiomiócitos de camundongos
Mas
+/
+
Pico do
transiente de
Ca
2+
(F/F0)
Mas
+/+
Mas
+/+
Decaimento do
transiente de Ca
2+
T90(ms)
38
Mas
-/-
poderia ser causado por alterações na atividade ou expressão da SERCA2.
Para verificarmos esta hipótese, investigamos a expressão protéica da SERCA2
através da técnica de western blot. Redução significativa da expressão da SERCA2
(53%) foi observada em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
, quando comparados
a cardiomiócitos de camundongos controle Mas
+/+
(Figura 13).
Figura 13- Expressão da SERCA2 em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. Foi
constatada redução significativa da expressão da SERCA2 em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
, quando comparados aos cardiomiócitos de camundongos
Mas
+/+
. A. Western-blot representativo. B. Gráfico de barras mostrando a média das
densitometrias +/- desvio padrão. A expressão da GAPDH foi utilizada para a
normalização dos resultados. *p<0.05, e n = número de experimentos
independentes.
A fosfolamban interage com SERCA2, inibindo sua atividade. Esta,
permanece desfosforilada durante a liberação de Ca
2+
do retículo sarcoplasmático.
Quando a fosfolamban é fosforilada, ela se desacopla da SERCA2 aumentando a
recaptação de Ca
2+
para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de verificar os
níveis de fosforilação da fosfolamban, realizamos experimentos de western blot da
SERCA2
110 kDa.
GAPDH
37 kDa.
39
fosfolamban fosforilada e fosfolamban total. (Figura 14). Nossos resultados
mostraram que a fosfolamban está hipofosforilada em cardiomiócitos ventriculares
de camundongos Mas
-/-
.
Figura 14- Níveis de fosforilação da fosfolamban em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
. Cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
apresentaram
hipofosforilação da fosfolamban. A. Western-blot representativo. B. Gráfico de
barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. p-PLN
(fosfolamban fosforilada); PLN (fosfolamban total). n= número de amostras
analisadas *p<0.05.
4.3- A Ang-(1-7) aumenta a produção de NO em cardiomiócitos
Sampaio e cols em 2007, demonstraram que a Ang-(1-7), via receptor Mas, é
capaz de estimular a produção de NO através da ativação da eNOS em células
endoteliais humanas. Com o intuito de investigarmos se a Ang-(1-7) estimula a
produção de NO em cardiomiócitos ventriculares, as células foram marcadas com
sonda fluorescente sensível ao NO (DAF-FM) e estimuladas com Ang-(1-7). Em
25 kDa.
25 kDa.
p-PLN
25 kDa.
PLN
25 kDa.
40
alguns casos, o antagonista do receptor Mas, A779, foi pré-incubado por 15 minutos
com as células (Figura 15).
Figura 15- A Ang-(1-7) aumenta a produção de NO em cardiomiócitos de
camundongos controle (Mas
+/+
). A. Imagem representativa de cardiomiócitos
ventriculares obtida através de microscopia confocal mostrando o aumento de
fluorescência do DAF-FM, em células tratadas com Ang-(1-7) (10 nmol/L, 15 min),
quando comparadas com células controle. Células tratadas com Ang-(1-7), pré-
incubadas com o antagonista do receptor Mas (A-779), não apresentaram aumento
significativo de fluorescência. Barra= 10µm. B. Gráfico de barras mostra a média da
fluorescência (representada em unidades arbitrárias) obtida em cada um dos grupos
experimentais. *p < 0,05 vs controle, Ang-(1-7), Ang-(1-7)+A779 e A779. n= número
de células analisadas.
4.4- A produção de NO em cardiomiócitos pela Ang-(1-7) é abolida em
camundongos Mas
-/-
Para confirmar a participação do receptor Mas na produção de NO estimulada
pela Ang-(1-7), utilizamos cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. A figura 16
mostra que a produção de NO em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
não
aumenta em resposta a incubação com Ang-(1-7) (10nmol/L), confirmando a
controle
Ang-(1-7)
A.
A779 + Ang-(1-7)
controle Ang-(1-7) Ang-(1-7)+A779 A779
0
10
20
30
40
(n=36)
(n=49)
(n=38)
*
(n=24)
Dafi
fluorescência
(unidades arbitrárias)
B.
Mas
+/+
41
participação do receptor Mas nessa via de sinalização. Como esperado, a incubação
dos cardiomiócitos ventriculares com o antagonista do receptor Mas, A779, não
alterou significativamente a produção basal de NO nas células de camundongos
Mas
-/-
(Figura 14). Em conjunto, as figuras 15 e 16 mostram evidências importantes
que confirmam a idéia de que o eixo Ang-(1-7)/receptor Mas está envolvido na
produção de NO em cardiomiócitos ventriculares.
Figura 16- A produção de NO estimulada pela Ang-(1-7) está abolida em
cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. A. Imagem representativa obtida através da
microscopia confocal. Barra = 10µm. B. Gráfico de barras mostra a média da
fluorescência +/- desvio padrão obtido em cada um dos grupos experimentais. A
fluorescência do DAF não foi alterada pelo tratamento com Ang-(1-7) nos
cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. n= número de células analisadas.
4.5- A expressão da eNOS não está alterada em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
.
Como apresentado na figura 15, a Ang-(1-7) leva à produção de NO em
cardiomiócitos. Já que os animais com deleção gênica do receptor Mas perderam
DAFI
controle Ang-(1-7) Ang-(1-7)+A779 A779
0
10
20
30
40
(n=27)
(n=28)
(n=21)
(n=20)
fluorescência
(unidades arbitrárias)
control Ang-(1-
A779 + Ang-(1-
B.
A.
Mas
-/-
42
essa via de sinalização importante para a produção de NO dependente de Ang-(1-7),
a questão que levantamos foi se cardiomiócitos Mas
-/-
apresentariam alterações nas
proteínas que regulam a produção de NO.
Tanto a eNOS, como a nNOS, participam da formação de NO no cardiomiócito
(Seddon e cols, 2007). O fato de que a Ang-(1-7), via receptor Mas, ativa a eNOS
em células endoteliais nos levou a investigar se cardiomiócitos Mas
-/-
apresentariam
alteração na expressão da eNOS. Para isto, utilizamos a técnica de western blot
que revelou níveis semelhantes de expressão protéica da eNOS em cardiomiócitos
de camundongos Mas
-/-
, quando comparados a células de animais controle (Mas
+/+
)
(Figura 17).
Figura 17- Expressão da eNOS em homogenato de cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
. A expressão protéica da eNOS foi semelhante nos
cardiomiócitos de animais Mas
-/-
e Mas
+/+
. A. Western blot representativo. B. Gráfico
de barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. n=número de
células analisadas.
135 kDa.
37
kDa.
eNOS
135 kDa.
GAPDH
37 kDa.
43
4.6- A deleção do receptor Mas é acompanhada por alterações em proteínas
que regulam a atividade da eNOS
A eNOS tem mostrado ser uma importante isoforma envolvida na via de
sinalização do NO (Sampaio e cols, 2007). Em cardiomiócitos as principais proteínas
envolvidas na regulação da eNOS são a caveolina-3, a HSP90 e a Akt.
Com o intuito de investigar possíveis alterações nas proteínas envolvidas na
regulação da eNOS no cardiomiócito realizamos experimentos de western blot para
caveolina-3, HSP90, e Akt. A caveolina-3 interage diretamente com a eNOS
inibindo sua atividade basal por prevenir a interação desta com a calmodulina (Wu e
cols, 2002). A análise de western blot demonstrou um aumento da expressão
protéica da caveolina-3 em cerca de 77% em cardiomiócitos de animais Mas
-/-
,
quando comparados a cardiomiócitos de camundongos Mas
+/+
(Figura 18).
Figura 18- A expressão da caveolina-3 foi maior em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
quando comparado a células controle (Mas
+/+
). A. Western blot
representativo. B. Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/-
desvio padrão. A expressão da GAPDH foi utilizada para a normalização dos
resultados. # p<0.05, e n = número de experimentos independentes.
18 kDa.
37
kDa.
Caveolina 3
18 kDa.
GAPDH
37 kDa.
44
A HSP90 age como uma proteína de ancoragem recrutando a Akt até a
eNOS, o que leva à fosforilação desta enzima (Fontana e cols., 2002; Mount e cols.,
2007). Observamos uma redução significativa nos níveis de expressão da HSP90
em cardiomiócitos Mas
-/-
, quando comparados ao grupo controle (Figura 19).
Figura 19- A expressão da Hsp90 está reduzida em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
quando comparada às células controle (Mas
+/+
). A. Western-blot
representativo. B. Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/-
desvio padrão. A expressão da GAPDH foi utilizada para a normalização dos
resultados. # p<0.05, e n = número de experimentos independentes.
O terceiro componente, a Akt, fosforila a eNOS no sítio da serina 1177
aumentando a atividade desta enzima (Wu e cols., 2002). Analisamos os níveis
protéicos da Akt, bem como os níveis de sua fosforilação. Observamos um aumento
de cerca de 56% na expressão da Akt em cardiomiócitos de animais Mas
-/-
(Figura
20).
HSP90
90 kDa.
GAPDH
37 kDa.
45
Figura 20- A expressão da Akt está aumentada em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
quando comparado a células controle (Mas
+/+
). A. Western-blot representativo.
B. Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. A
expressão da GAPDH foi utilizada para a normalização dos resultados. #p<0.05, e n
= número de experimentos independentes.
Este resultado foi confirmado através da técnica de imunofluorescência,
utilizando anticorpo específico anti-Akt, que revelou maior expressão desta proteína
em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
, quando comparados aos cardiomiócitos
de animais Mas
+/+
(Figura 21).
AKT
60 kDa.
GAPDH
37 kDa.
46
Figura 21- Imunofluorescência da Akt em cardiomiócito de camundongos Mas
+/+ e
Mas
-/-
. Experimento de imunofluorescência, utilizando anticorpo específico anti-Akt,
revelou aumento da expressão da Akt (verde) no cardiomiócito de camundongos
Mas
-/-
. O núcleo está marcado com DAPI (azul).
Para verificar o nível de ativação da Akt em cardiomiócitos realizamos
análises de western blot utilizando anticorpos anti-Akt fosforilada (p-Akt). Embora
termos encontrado que a expressão protéica da Akt foi maior em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
, os níveis da p-Akt estavam significativamente reduzidos nos
cardiomiócitos destes animais, quando a expressão da Akt-fosforilada foi
normalizada pela Akt total (Figura 22). Em conjunto, estes resultados demonstram
fortes evidências de que as proteínas envolvidas na regulação da atividade da eNOS
estão alteradas em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
47
Figura 22- A Akt fosforilada está reduzida em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
indicando menor ativação da Akt nestas células. A. Western-blot representativo. B.
Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. A
expressão da Akt foi utilizada para a normalização dos resultados. # p<0.05, e n =
número de experimentos independentes.
4.7-A GSK-3β está hiperfosforilada em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
O NO produzido pela eNOS regula a atividade de outras proteínas, de
particular importância para nós, a GSK-3β, enzima que, entre outros efeitos, está
envolvida com a apoptose cardíaca. A Akt inativa a GSK-3β, que, assim, bloqueia a
liberação de citocromo c e a atividade da caspase-3 (Zhang ecols, 2003; Anindita e
cols, 2008).
Com o intuito de verificar se a hipofosforilação da Akt é acompanhada por
alterações nos níveis de fosforilação da GSK-3β realizamos a técnica de western
blot e verificamos que a GSK-3β está hiperfosforilada, o que indica uma redução de
sua atividade (Figura 23).
p-Akt
60 kDa.
Akt
60 kDa.
48
Figura 23- A GSK-3β fosforilada está aumentada em cardiomiócitos ventriculares
de camundongos Mas
-/-
quando comparada às células de camundongos selvagem
Mas
+/+
. A. Western blot representativo. B. Gráfico de barras mostrando a média das
densitometrias +/- desvio padrão. * p<0.05, e n = número de experimentos
independentes.
4.8- A expressão da nNOS está reduzida em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
Outra importante isoforma envolvida na produção de NO no cardiomiócito é a
nNOS, nesse sentido, resolvemos investigar se camundongos Mas
-/-
apresentam
alteração na expressão da nNOS e nNOS fosforilada. A partir da análise de western
blot mostramos que a expressão protéica da nNOS está reduzida em cardiomiócitos
de camundongos Mas
-/-
, quando comparada a células de camundongos Mas
+/+
(Figura 24A). Além disso, quando avaliada a expressão da nNOS fosforilada
utilizando anticorpos dirigidos contra o sítio inibitório da enzima, identificamos que os
animais Mas
-/-
apresentaram hiperfosforilação da nNOS no cardiomiócito (Figura
24B). Em outras palavras, sugerimos que cardiomiócitos provenientes de animais
p-GSK3β
46 kDa.
GSK3β
46
kDa.
49
Mas
-/-
apresentam redução da atividade da nNOS. Desta forma, mostramos
evidências de que, além da redução da atividade da eNOS, cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
apresentam também redução da expressão da nNOS e,
provavelmente, redução da atividade desta enzima.
Figura 24- A expressão da nNOS foi menor em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
quando comparada às células controle Mas
+/+
(A). Além disso, quando
avaliada a nNOS fosforilada verificamos uma hiperfosforilação da nNOS no sítio
inibitório da enzima (B). (Parte de cima) Western-blot representativo. (Parte de
baixo) Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. A
expressão da GAPDH foi utilizada para a normalização da expressão da nNOS e a
nNOS total foi utilizada para normalizar os níveis de nNOS fosforilada. *p<0.05, e n =
número de experimentos independentes.
4.9- Camundongos Mas
-/-
apresentam alterações em proteínas da via de
sinalização da apoptose mediada pelo NO.
Como mostramos neste trabalho, animais Mas
-/-
não apresentam produção de
NO dependente de Ang-(1-7). Além disso, mostramos que a expressão das enzimas
eNOS e nNOS e das proteínas regulatórias de sua atividade estão alteradas. Frente
Mas
-
/
-
Mas
-
/
-
nNOS
160 kDa.
GAPDH
37
kDa.
p-nNOS
160 kDa.
nNOS
160
kDa.
50
a este cenário, nós especulamos que a perda da produção de NO dependente do
eixo Ang-(1-7)/Mas possa ser fator importante para o aumento da apoptose no
coração de camundongos Mas
-/-
, uma vez que a alteração nos níveis de NO tem
papel importante na apoptose de cardiomiócitos. O NO modula a Xiap, uma proteína
inibitória da apoptose, além de enzimas proteases da família das caspases, em
especial a caspase-3 que ativa a apoptose (Razavi e cols., 2005). A figura 25
mostra que a expressão da XIAP está aumentada em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
, enquanto a expressão da caspase-3 está significativamente
aumentada nos cardiomiócitos destes camundongos (figura 26).
Figura 25- A expressão da XIAP foi maior em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
, quando comparada às células controle Mas
+/+
. A. Western blot representativo.
B. Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. A
expressão do GAPDH foi utilizada para a normalização dos resultados.*p<0.05, e
n = número de experimentos independentes.
XIAP
53 kDa.
GAPDH
37kDa.
51
Figura 26- A expressão da caspase 3 foi maior em cardiomiócitos de camundongos
Mas
-/-
quando comparada às células controle Mas
+/+
. A. Western blot representativo.
B. Gráfico de barras mostrando a média das densitometrias +/- desvio padrão. A
expressão da GAPDH foi utilizada para a normalização dos resultados. *p<0.05, e n
= número de experimentos independentes.
4.10- Camundongos Mas
-/-
apresentam aumento da produção de ROS no
cardiomiócito.
O aumento da produção das ROS tem um papel importante na ativação da
apoptose no cardiomiócito, com o intuito de investigarmos se células de animais
Mas
-/-
apresentam um aumento dos níveis de ROS, nós marcamos cardiomiócitos
ventriculares com a sonda fluorescente DHE. A figura 27 mostra que cardiomiócitos
provenientes de camundongos Mas
-/-
apresentam um aumento da produção de ROS
quando comparado a células de animais Mas
+/+
. O aumento da produção de ROS
Caspase-3
35 kDa.
GAPDH
37
kDa.
52
pode explicar, pelo menos parcialmente o aumento da apoptose em cardiomiócitos
de camundongos Mas
-/-
.
Figura 27- Medida da produção de ROS em cardiomiócitos de animais Mas
-/-
e
Mas
+/+
na presença ou não de Ang II.
53
5-Discussão
O principal objetivo deste estudo foi caracterizar alterações em vias de
sinalização intracelulares distintas que pudessem explicar a disfunção cardíaca
apresentada pelos camundongos Mas
-/-
(Santos e cols, 2006; Dias-Peixoto e cols,
2008).
5.1-Alterações na via de sinalização do Ca
2+
e NO como mecanismo da redução
da contratilidade cardíaca em camundongos Mas
-/-
5.1.1-Transiente de Ca
2+
O transiente de Ca
2+
forma a principal base molecular do processo de
contratilidade cardíaca, sendo a medida da amplitude deste transiente, seu
decaimento e a análise das proteínas envolvidas na sua manutenção, foco dos
principais estudos que avaliam a alteração da contração dos cardiomiócitos.
Animais com insuficiência cardíaca representam um importante modelo
encontrado na literatura e apresentam, em geral redução do transiente de Ca
2+
e
respondem de forma positiva ao tratamento com inibidores e antagonistas do
sistema Renina-Angiotensina.
Alguns trabalhos mostram que os inibidores da ECA e antagonistas do
receptor AT1 parecem exercer papel benéfico na contratilidade cardíaca. Estudos
com humanos (Pitt, Nicklas, 2000) e animais (Wang e cols., 2005) mostram que na
falência cardíaca crônica o tratamento com inibidores da ECA promovem aumento
da fração de ejeção e do transiente de Ca
2+
de cardiomiócitos. Em conjunto, os
54
inibidores da ECA e antagonistas do receptor AT1 levam a uma menor produção de
Ang-II e o bloqueio da ação da Ang-II, respectivamente. Independente do
tratamento, o resultado final é uma melhora da contratilidade cardíaca, indicando
que níveis elevados de Ang-II reduzem o inotropismo.
De modo interessante foi descoberto que os inibidores da ECA promovem
redução da síntese de Ang-II seguida do aumento da produção de Ang-(1-7). Isto
sugere que não necessariamente apenas a redução dos níveis elevados de Ang-II
podem interferir positivamente na contratilidade cardíaca, mas, também, o aumento
dos níveis de Ang-(1-7).
De fato, alguns estudos já comprovam o efeito positivo na contratilidade
cardíaca não só da Ang-(1-7), mas, também, do seu receptor, Mas. Animais
knockout para ECA2, principal enzima envolvida na síntese de Ang-(1-7),
apresentam redução da contratilidade cardíaca quando comparado aos
camundongos WT (Crackower e cols., 2002). Ainda na mesma linha, Santos e cols.,
2004 mostraram que animais transgênicos que superexpressam Ang-(1-7),
apresentaram maior débito cardíaco e volume de ejeção quando comparado ao
grupo selvagem. Em 2006, este mesmo grupo mostrou que animais Mas
-/-
apresentam redução da contratilidade cardíaca (Santos e cols., 2006). Crackower e
cols., 2002, sugerem que um acúmulo da Ang-II e/ou deficiência da produção da
Ang-(1-7) no coração levam à redução do inotropismo cardíaco. Em conjunto, estes
resultados nos fornecem evidências da participação do eixo Ang-(1-7) na
contratilidade cardíaca e sugerem a possibilidade de que a Ang-(1-7) seja um
importante modulador do Ca
2+
no cardiomiócito ventricular. Porém, até recentemente
não tínhamos evidências diretas dos efeitos da Ang-(1-7)/receptor Mas no
cardiomócito. De fato, constatamos que camundongos Mas
-/-
têm menor pico e maior
55
decaimento do transiente de Ca
2+
no cardiomiócito, demonstrando que animais Mas
-
/-
apresentam uma disfunção na sinalização de Ca
2+
, o que explica, pelo menos em
parte, a disfunção contrátil apresentada por estes animais in vivo (Santos e cols.,
2006). Corroborando estes resultados, recentemente verificamos que animais que
superexpessam Ang-(1-7) no coração apresentam maior pico e menor decaimento
do transiente de Ca
2+
no cardiomiócito (Ferreira e cols., 2010).
Assim, o eixo Ang-(1-7)/receptor Mas parece estar envolvido direta ou
indiretamente com a mobilização do Ca
2+
intracelular em cardiomiócitos. Dados
obtidos por Gomes, 2008, mostraram no entanto que a incubação dos
cardiomiócitos com a Ang-(1-7) (10nM) por diferentes tempos não foi capaz de
alterar o transiente de Ca
2+
, apesar dos efeitos inotrópicos positivos descritos para a
Ang-(1-7) no coração in vitro e in vivo (Ferreira e cols., 2002) e a menor
contratilidade observada em animais Mas
-/-
(Castro e cols., 2006). Desta forma,
concluímos que as alterações no transiente de Ca
2+
observadas nas células
provenientes dos camundongos Mas
-/-
e dos ratos que superexpressam Ang-(1-7)
sejam conseqüência de efeitos indiretos ou das adaptações crônicas presentes
nestes animais transgênicos.
É amplamente relatado que a disfunção da contratilidade no cardiomiócito, em
geral é resultado das alterações do transiente de Ca
2+
e, estas alterações, são
decorrentes das mudanças nas proteínas envolvidas em sua regulação (Ito e cols,
2000; Bers, 2002). Santos e cols., 2006 demonstraram que os cardiomiócitos de
animais Mas
-/-
não apresentaram alteração significativa na densidade da corrente de
Ca
2+
do tipo L. Complementando este dado, nós observamos que a expressão da
SERCA2 está reduzida em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. Analisamos
também os níveis de fosforilação do sítio da PKA na fosfolamban, que quando
56
fosforilada, se desacopla da SERCA2, aumentando a recaptação do Ca
2+
(James e
cols, 1989; Bluhm e cols, 2000). Mostramos que a fosfolamban está hipofosforilada
em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. É interessante ressaltarmos que 92% da
recaptação de Ca
2+
pelo retículo sarcoplasmático é realizada pela SERCA2 em
camundongos e ratos (Bers, 2002). Na verdade, a menor expressão desta Ca
2+
-
ATPase e hipofosforilação da fosfolamban tem sido descrita em cardiomiócitos
ventriculares de camundongos com diferentes patologias cardíacas (Rolim e cols.,
2007) e podem estar relacionadas com o menor transiente de Ca
2+
destes animais.
Isto porque a menor recaptação do Ca
2+
para o retículo sarcoplasmático leva a uma
menor disponibilidade de Ca
2+
para ser liberado durante a sístole, o que está
diretamente relacionado com a redução da contratilidade cardíaca.
Ressaltamos que, além da SERCA2 e a fosfolamban, o NCX tem importante
papel no transiente. Quando existe alta concentração de Ca
2+
citoplasmático o NCX
auxilia na extrusão do Ca
2+
durante a diástole sendo importante a análise futura
deste componente. Acreditamos que os cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
possam apresentar aumento da expressão do NCX, já que, este aumento, leva a
uma maior extrusão de Ca
2+
citoplasmático durante a diástole, diminuindo a
disponibilidade do Ca
2+
para a recaptação pelo retículo sarcoplasmático.
É bom lembrarmos também que, além do transiente de Ca
2+
, a medida da
sensibilidade dos miofilamentos ao Ca
2+
também representa um importante
mecanismo envolvido no processo de contração celular (Bers e cols., 2002).
Entretanto, este mecanismo não foi estudado no presente trabalho, sendo um
importante foco de estudos futuros.
Não podemos deixar de especular também que outros fatores podem estar
envolvidos com a redução da contratilidade cardíaca em camundongos Mas
-/-
, como
57
a aumento da matrix extracelular com acúmulo de tecido fibrótico, o que interfere na
contratilidade. De fato, Santos e cols., 2006, demonstraram que animais Mas
-/-
apresentam um aumento de colágeno I, III e fibronectina, sendo este um importante
componente da disfunção cardíaca nestes animais.
5.1.2-Transiente de Ca
2+
e NO
Em um mecanismo mais complexo, o NO também modula a contratilidade
cardíaca por alterar a expressão e atividade das proteínas envolvidas no transiente
de Ca
2+
no cardiomiócito de uma forma direta, por reações de nitrosilação, ou
indireta, via produção de GMPc e ativação de PKG. Por estes mecanismos o NO
pode levar a alteração da atividade do receptor de rianodina (Petroff e cols., 2001),
do canal de Ca
2+
tipo-L (Kokoz e cols., 2007), da SERCA2 e PLN (Wang e cols.,
2008). Não podemos afirmar que a produção de NO é menor ou maior em
cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
, mas caso esta produção esteja realmente
alterada, este pode ser um mecanismo que auxilie no entendimento da relação entre
o eixo Ang-(1-7) / receptor Mas e as alterações no transiente de Ca
2+
observadas nos
cardiomiócitos, já que o NO modula diretamente as proteínas envolvidas no ciclo do
Ca
2
. Abaixo, é ilustrada a visão atual do papel do NO no ciclo do Ca
2+
em
cardiomiócitos (Figura 28).
58
Figura 28- Regulação parácrina e autócrina do NO sobre o ciclo do Ca
2+
no
cardiomiócito. As setas em vermelho ilustram a participação do NO durante a sístole
e e as setas em azul a modulação do NO durante a diástole. A nNOS está localizada
preferencialmente no retículo sarcoplasmático e a eNOS nas cavéolas. O NO
produzido pela nNOS tem efeitos inotrópico positivo por estimular a fosfolamban (p-
PLN) que, desta forma, se desacopla da SERCA que, assim, aumenta a recaptação
de Ca
2+
para o retículo sarcoplasmático. O NO produzido pela eNOS também pode
aumentar o inotropismo por estimular a abertura do receptor de rianodina (RyR),
além disso, durante a diástole o NO pode auxiliar na inativação do canal de Ca
2+
tipo L e reduzir a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca
2+
, o que otimiza o
relaxamento do cardiomiócito. (β1AR: receptor β adrenérgico tipo 1; M2: receptor
Muscarínico tipo 2; NCX:trocador Na
+
- Ca
2+
; XOR: xantina oxiredutase) (Figura
adaptada de Seddon e cols., 2007).
Como ilustrado acima o NO produzido pela eNOS e nNOS pode acelerar
tanto a contração como o relaxamento do cardiomiócito. Desta forma, uma redução
da produção de NO por essas duas isoformas pode reduzir o pico e aumentar o
decaimento do Ca
2+
no cardiomiócito.
Nossos resultados mostram que cardiomiócitos de camundongos Mas
+/+
apresentam aumento da produção de NO via Ang-(1-7) / receptor Mas e animais
Mas
-/-
, que perdem esta via de sinalização, não respondem a Ang-(1-7). Além disso,
59
mostramos que em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
o complexo molecular
que ativa eNOS está alterado, levando possivelmente à redução da atividade da
eNOS. Além disso, a expressão e fosforilação da nNOS estão reduzidas nestas
células. Desta forma, especulamos que a perda da produção de NO pela via da Ang-
(1-7) / receptor Mas pode contribuir para as alterações no transiente de Ca
2+
observadas em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
5.2- Alteração na sinalização do NO como mediadora da apoptose cardíaca de
camundongos Mas
-/-
5.2.1- Alteração na via Akt/eNOS
Como animais Mas
-/-
apresentam um aumento da apoptose cardíaca (Dias-
Peixoto e cols, 2008), resolvemos investigar as vias de sinalização envolvidas neste
processo. Uma vez que existe uma estreita relação entre a produção de NO e a taxa
de apoptose em cardiomiócitos é possível que alterações no complexo eNOS e na
nNOS observadas nas células dos animais Mas
-/-
, possam estar envolvidas no
aumento da apoptose no coração destes animais.
A fosforilação da eNOS pela Akt resulta na produção do NO em uma via
independente de Ca
2+
(Gao e cols., 2002) e, no cardiomiócito, esta via está
envolvida com o mecanismo anti-apoptótico (Gao e cols., 2002; Yigang e cols.,
2004; Seddon, 2005; Liu, 2008). Liu e cols., 2008, mostraram que a ativação da Akt
pelo ácido 4,4’-diisothiocianostilbeno-2,2’-disulfonico (DIDS) leva a fosforilação da
enzima, seguida pela fosforilação da serina 1177 da eNOS e aumento da produção
do NO, com conseqüente prevenção da apoptose de cardiomiócitos, especialmente
60
após a arritmia cardíaca (Yigang e cols, 2004). De forma semelhante mostramos que
a Ang-(1-7) estimula a fosforilação da Akt e da serina 1177 da eNOS levando a um
aumento da produção de NO no cardiomiócito, sugerindo portanto que a Ang-(1-7)
tenha um papel anti-apoptótico. No entanto, esse efeito está abolido em
cardiomiócitos ventriculares de camundongos Mas
-/-
. Em concordância, Peiro e cols.,
2007, mostraram que em células endoteliais de camundongos Mas
-/-
FVBN ocorre
redução da expressão da eNOS e menor produção de NO.
Com o intuito de verificar alterações na via de sinalização da Akt/eNOS
mostramos pelas técnicas de western blot e imunofluorescência que a Akt está
hipofosforilada em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
e, nesta célula, apesar da
expressão da eNOS não estar alterada, a expressão das proteínas que regulam sua
atividade está modificada.
A caveolina, proteína de ancoragem que inibe a atividade da eNOS, está
aumentada em cardiomiócitos ventriculares de camundongos Mas
-/-
. Este dado foi
bem interessante, pois é relatado que a superexpressão da caveolina 3 no coração é
seguida de degeneração cardíaca (Avaramudan e cols., 2003). Verificamos também
que a expressão da HSP90 está reduzida em cardiomiócitos ventriculares de
camundongos Mas
-/-
. A HSP90, tem função chaperona, pois aumenta a atividade da
eNOS por conduzir a Akt ao sítio de serina 1177 desta enzima. Desta forma, o
aumento da expressão da caveolina 3, a redução da expressão da HSP90 e a
hipofosforilação da Akt são fortes indicativos de que a via Akt/eNOS/NO, importante
via anti-apoptótica no cardiomiócito, tem sua atividade reduzida em camundongos
Mas
-/-
.
61
5.2.2- GSK-3β
Recentemente a GSK-3β tem mostrado ser um importante alvo do NO na via
de sinalização da apoptose de cardiomiócitos. A ativação da GSK-3β promove
apoptose em células neuronais (Pap & Cooper, 1998; Li e cols., 2000), no músculo
liso vascular (Hall e cols., 2001; Hardt e Sadoshima, 2002) e em cardiomiócitos
(Zhang e cols., 2003; Anindita e cols., 2008). Por outro lado, a inativação da GSK-3β
tem efeito anti-apoptótico.
É sugerido que o NO produzido pela eNOS, via GMPc ativa a PKG, que
fosforila a GSK-3β, inibindo sua atividade. Isto, exerce um efeito anti-apoptótico no
cardiomiócito, pois a redução da atividade da GSK-3β leva a um aumento da
expressão do Bcl-2 no cardiomiócito, o que diminui a permeabilidade mitocondrial
(Gomez-Sintes e cols., 2007; Chiou-Feng e cols., 2007).
Além do NO, a Akt também exerce efeito anti-apoptótico via GSK-3β. A Akt
fosforila a GSK-3β e, assim como na sua inativação pela PKG, diminui a
permeabilidade da membrana bloqueando assim a liberação de citocromo c e a
ativação da caspase-3 (Zhang e cols., 2003) (Figura 29). Isto, já foi demonstrado em
células de linhagem (Zhang e cols., 2003), células hepáticas (Lee e cols., 2001) e,
mais recentemente em cardiomiócitos (Anindita e cols, 2008). Zhang e cols., 2003,
mostraram que quanto maiores eram os níveis de fosforilação da AKT, maior a
inativação da GSK3-β, menor a fosforilação da caspase-3 e menor a apoptose
celular.
Além da GSK3-β, a PKG também fosforila a ERK-1/2, que, assim como a
GSK3-β tem papel anti-apoptótico (Anindita e cols, 2008). Estes trabalhos
62
mostraram que a fosforilação da ERK1/2 reduz a apoptose de cardiomiócitos, sendo
que um inibidor da ERK aboliu estes efeitos.
Figura 29- Mecanismo proposto para participação do NO na via anti-apoptótica
mediada pela ERK 1/2 e GSK-3β. Adaptado de Anindita e cols, 2008.
Resolvemos então avaliar a expressão da GSK-3β e, para nossa surpresa,
verificamos que esta enzima está hiperfosforilada em seu sítio inibitório em
cardiomiócitos ventriculares de camundongos Mas
-/-
o que, em teoria, aumentaria a
proteção do cardiomiócito contra a apoptose. Mostramos também que a Akt está
hipofosforilada em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. Desta forma,
p
-
Akt
63
especulamos que por uma via independente da Akt ou do NO/cGMP/PKG a GSK-3β
pode ser fosforilada em seu sítio inibitório em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
. Além disso, acreditamos que a maior fosforilação da GSK-3β no seu sítio inibitório
pode fazer parte de um mecanismo contrarregulatório no sentido de diminuir o
processo apoptótico no coração de camundongos Mas
-/-
(Dias-Peixoto e cols., 2008).
De qualquer forma esse complexo mecanismo ainda precisa ser elucidado em
pesquisas futuras.
5.2.3- nNOS
Recentemente, a nNOS tem mostrado ter uma importante função
cardioprotetora. Animais com superexpressão da nNOS no cardiomiócito
apresentam melhora da função cardíaca. (Xu e cols., 2008; Loyer e cols., 2008).
Além disso, Moayeri e cols., 2009, mostraram que animais knockout para nNOS
apresentam degeneração e redução da contratilidade cardíaca.
Portanto, nossa próxima etapa foi verificar a expressão da nNOS no
cardiomiócito ventricular de camundongos Mas
-/-
. Verificamos que além da
expressão da nNOS estar reduzida no cardiomiócito, esta isoforma está
hiperfosforilada em seu sítio inibitório, sugerindo assim uma menor atividade da
enzima nas células ventriculares cardíacas de camundongos Mas
-/-
. Interessante,
que animais que superexpressão Ang-(1-7) apresentam níveis aumentados desta
enzima (Gomes e cols. 2010), sugerindo uma possível modulação da nNOS pela
Ang-(1-7). No entanto, vale ressaltar, que a participação direta da nNOS na via da
Ang-(1-7) ainda não foi demonstrada. Em conjunto, alterações na expressão da
nNOS e proteínas regulatórias da eNOS, podem levar a uma menor produção do
64
NO basal, podendo este ser um mecanismo chave na disfunção contrátil no miócito
ventricular em camundongos Mas
-/-
.
5.2.4- NO/caspase
A redução da produção do NO é fator chave para a ativação de fatores pró-
apoptóticos, sendo o mais conhecido a caspase-3. Da mesma forma o aumento
exacerbado do NO também leva a um aumento da atividade caspase. Em condições
basais, o NO inibe por s-nitrosilação a atividade de caspases e liberação do
citocromo c mitocondrial (Kim e cols., 1999).
A figura 30 ilustra de maneira simplificada como o NO modula o processo de
apoptose no cardiomiócito. É interessante observarmos que o NO pode
desencadear tanto um processo apoptótico, quanto anti-apoptótico. Acredita-se que
tanto em níveis baixos como em elevados o NO leva à apoptose, enquanto níveis
basais fisiológicos mantêm um efeito anti-apoptótico.
Figura 30- Mecanismo de sinalização do NO e a apoptose cardíaca. A. No modelo
pró-apoptótico o NO inibe a atividade da XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis
protein), o que aumenta a atividade da caspase-3 que ativa enzimas DNases que
desencadeiam a apoptose. B. No modelo anti-apoptótico o NO inativa a caspase por
S-Nitrosilação. Adaptado de Ravazi e cols, 2005.
65
Nossos resultados mostraram que camundongos Mas
-/-
apresentam aumento
da expressão da caspase-3 no cardiomiócito, porém, os níveis da XIAP estão
aumentados nesta célula. Portanto, torna-se necessário verificarmos se o aumento
da expressão da caspase é seguido do aumento de sua atividade.
5.3- ROS, apoptose e o SRA
5.3.1- Produção das ROS em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
O estresse oxidativo surge através de um desbalanço entre a produção de
ROS e a produção de moléculas antioxidantes. Nossos resultados mostraram que
animais Mas
-/-
apresentam aumento da produção de ROS no cardiomiócito. Uma
resposta comum que acompanha o estresse oxidativo aumentado é a redução da
atividade de enzimas antioxidantes (Beckman & Koppenol, 1996). Xu e cols., 2008,
mostraram que em células endoteliais de camundongos Mas
-/-
a atividade da SOD e
catalase estão reduzidas e a produção das ROS está aumentada. É importante
ressaltar que estas alterações foram identificadas em ambas linhagens de
camundongos Mas
-/-
C57Bl/6 (Rabelo e cols., 2008) e FVBN (Xu e cols., 2008).
Portanto, tornou-se necessário avaliar se, além do aumento das ROS,
cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
apresentam alteração da expressão e/ou
atividade das enzimas antioxidantes, especialmente a SOD, catalase e GPX.
Além disso, acreditamos que a maior produção de ROS nas células de
camundongos Mas
-/-
, contribui de forma significativa para o aumento da apoptose
nesse modelo. Sabemos que as ROS levam a ativação das caspases,
especialmente as caspases 9 e 3 e, sendo assim, o aumento da expressão da
66
caspase-3 em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
pode ser decorrente do
aumento das ROS nestas células. Além disso, o aumento da expressão da XIAP,
proteína inibitória da caspase-3, pode representar uma resposta compensatória ao
aumento da expressão da caspase-3 em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
Vale também destacar, que o aumento das ROS pode interferir com o
processo contrátil do cardiomiócito através da redução da sensibilidade dos
miofilamentos ao Ca
2+
(Luo e cols., 2006).
5.3.2- ROS e o SRA
Recentemente tem sido relatado que os peptídeos e receptores do SRA
modulam a produção intracelular das ROS. Diversos trabalhos mostram que a Ang-II
aumenta a produção das ROS, por estimular o complexo da NAD(P)H da membrana
celular (Li & Shah, 2003; Wolf, 2005; Garrido & Griendling , 2008; Touyz & Schiffrin,
2008).
Estudos recentes de Chappel e cols., 2010, mostraram que a Ang-(1-7) via
receptor Mas dimunui a produção de ROS induzida pela Ang-II em células renais.
Um aspecto interessante neste trabalho é que os autores sugerem que a produção
de ROS estimulada pela Ang-(II) pode ser potencializada pelo bloqueio do receptor
AT2 ou Mas. Portanto esses resultados sugerem a participação direta do receptor
AT2 e Mas na produção de ROS estimulada pela Ang-II. Os autores sugerem que os
efeitos do bloqueio do receptor Mas no aumento da produção das ROS dependente
de Ang-II são mais pronunciados em idade mais avançada.
Pouco se sabe sobre as vias de sinalização intracelular da Ang(1-7)/receptor
Mas na modulação da produção das ROS. Estudos de Benter e cols., 2008,
67
mostraram que ratos diabéticos hipertensos tratados cronicamente com Ang-(1-7)
tiveram redução da atividade da NAD(P)H oxidase em células do rim.
Paralelamente, surgiram evidências de alterações da NAD(P)H oxidase, ROS e
enzimas antioxidantes em camundongos Mas
-/-
. Em células endoteliais de animais
Mas
-/-
, Xu e cols., 2008, mostraram que a expressão da subunidade catalítica
gp91
phox
da NAD(P)H (Nox2), principal fonte de O
2
-
no endotélio, está aumentada.
Desta forma, existem forte indícios de que o eixo Ang-(1-7) / receptor Mas
pode formar um importante mecanismo contrarregulatório à Ang-II na estimulação da
NAD(P)H oxidase e, consequentemente, na produção de ROS. Assim, ainda é
necessária a realização de experimentos de medida da atividade e expressão da
NADPH oxidase em cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
.
5.3.3- ROS e NO
As possíveis alterações na produção do NO em cardimomiócitos de
camundongos Mas
-/-
também podem fazer parte do mecanismo que leva às
alteraçoes da produção de ROS nestas células.
O NO, em conjunto com o O
2
no seu estado fundamental, são duas
importantes moléculas precursoras das ROS. Uma vez combinado com o
superóxido ( O
2
-
) o NO forma o peroxinitrito ( ONOO
-
) que rapidamente de dissocia
em potentes espécies reativas de oxigênio como o hidroxil (OH
.
) (figura 31).
Figura 31- Formação do peroxinitrito (ONOO
-
) a partir do superóxido (O
2
-
) e do óxido
nítrico (NO).
68
Portanto, o balanço entre a produção do NO e ONOO
-
pode ser crucial para
um efeito celular protetor ou deletério. Em concordância, Xu e cols., 2008,
mostraram que a concentração de metabólitos do NO no plasma e urina e a
expressão da eNOS no endotélio estão reduzidas em camundongos Mas
-/-
,
sugerindo uma redução da produção do NO e/ou aumento da formação de ROS a
partir do NO. Este trabalho ainda sugere que este possível desbalanço entre a
produção de NO e ROS favorece a disfunção endotelial destes animais. Acreditamos
que, no cardiomiócito, este desbalanço também pode contribuir para a disfunção
cardíaca de camundongos Mas
-/-
.
A figura 32 ilustra um modelo em que o NO pode ter um efeito cardioprotetor,
incluindo o efeito anti-apoptótico, e cardiodeletério, como o efeito pró-apoptótico a
partir da formação das ROS.
Figura 32- Mecanismos celulares do óxido nítrico (NO), superóxido (O
2
-
) e
peroxinitrito (ONOO-). O NO exerce importantes efeitos cardioprotetores, como,
efeitos antioxidante e anti-apoptóticos. Porém, ao se combinar com o superóxido
(O
2
-
) forma peroxinitrito (ONOO-) exercendo efeitos cardiodeletérios, como a
apoptose e necrose. (SOD:superóxido dismutase; GSH:glutationa; GSNO: S-
69
nitroglutationa; XOR: xantina oxiredutase; MMP: metaloproteinase de matrix; PARP:
poli-ADP ribose; NOS:óxido nítrico sintase)
Beckman & Koppenol, 1996; Rubbo e
cols, 1996.
De qualquer forma todas essas alterações nestas vias de sinalização da
apoptose e contratilidade cardíaca formam um complexo mecanismo que ainda
precisa ser elucidado em pesquisas futuras.
70
6 – Conclusão
O eixo Ang-(1-7)/receptor Mas tem papel crucial na
regulação do sistema cardiovascular. Neste trabalho mostramos que camundongos
Mas
-/-
apresentam alterações em vias de sinalização no cardiomiócito que estão
envolvidas com a disfunção cardíaca desses animais. Identificamos alterações na
via de sinalização do Ca
2+
e NO. Na primeira via mostramos que a redução do
transiente de Ca
2+
e as alterações em proteínas que regulam a cinética do Ca
2+
em
cardiomiócito podem ajudar a explicar os mecanismos intracelulares da redução da
contratilidade em camundongos Mas
-/-
. Relatamos também que a Ang-(1-7) estimula
a produção de NO no cardiomiócito via receptor Mas e que, em cardiomiócitos de
camundongos Mas
-/-
, esta via está ausente, com consequente alteração na
expressão e atividade de diferentes proteínas envolvidas na produção de NO. Por
fim, mostramos que cardiomiócitos de camundongos Mas
-/-
apresentam aumento da
produção de ROS. Em conjunto, estes resultados mostram que a deleção gênica do
receptor Mas leva a alterações em vias de sinalização distintas, sugerindo uma
estreita relação entre a Ang-(1-7) e a via do NO e suportam um papel protetor do
eixo Ang-(1-7)/receptor Mas no cardiomiócito.
71
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