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1
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
EVELISE MARIA NAZARI
ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS E CELULARES
INDUZIDAS PELA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA B EM
EMBRIÕES DO CAMARÃO DE ÁGUA DOCE
Macrobrachium olfersi
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos para
a obtenção do Título de Doutor em
Ciências (Morfologia).
Orientadora: Profa. Dra. Silvana Allodi
Rio de Janeiro
2010
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i
Alterações morfológicas e celulares induzidas pela radiação ultravioleta B em
embriões do camarão de água doce Macrobrachium olfersi.
Evelise Maria Nazari
Tese submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências Morfológicas.
Aprovada em _____ de __________________ de 2010, pela Banca Examinadora:
_______________________________________________________- Orientadora
Profa. Dra. Silvana Allodi (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)
_______________________________________________________- Examinador
Prof. Dr. Luiz Eduardo Maia Nery (Instituto de Ciências Biológicas - FURG)
_______________________________________________________- Examinadora
Prof. Dra. Márcia Alves Marques Capella (Instituto de Biofísica-UFRJ)
_______________________________________________________- Examinador
Prof. Dr. Stevens Kastrup Rehen (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)
_____________________________________________________- Suplente Externo
Prof. Dr. Marcelo de Pádula (Faculdade de Farmácia - UFRJ)
_____________________________________________- Suplente Interno e Revisor
Prof. Dr. José Garcia Ribeiro Abreu Junior (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)
Rio de Janeiro
2010
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ii
FICHA CATALOGRÁFICA
Nazari, Evelise Maria
Alterações morfológicas e celulares induzidas pela radiação ultravioleta B em
embriões do camarão de água doce Macrobrachium olfersi. Rio de Janeiro, UFRJ,
ICB. 2010.
xviii, 140p.
Tese de Doutorado em Ciências Morfológicas.
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Instituto de Ciências Biomédicas.
1- radiação ultravioleta 2- embriões 3- alterações morfológicas 4- respostas celulares
5- crustáceos
iii
Este trabalho foi realizado nos seguintes laboratórios:
- Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal, do Departamento de
Biologia Celular, Embriologia e Genética - Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC.
- Laboratório de Neuro-histologia e Ultraestrutura, do Instituto de Ciências
Biomédicas - Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ.
Bolsa concedida pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), através do Edital Pró-doutoral (2008-2010).
iv
Ainda que eu falasse as línguas dos
anjos e dos homens, sem amor eu nada
seria...
v
Aos meus pais, pela incondicional
dedicação...
Ao Dib pelo nosso presente, passado e
futuro!
vi
AGRADECIMENTOS
Este é um momento muito especial por inúmeras razões. Sem dar as
devidas explicações, a vida nos coloca diante de situações difíceis e não temos a
opção de fugir. Por uma questão de segundos, a vida dá uma guinada e levamos
dias, meses e até anos para retornar ao caminho original. Foi assim comigo. Depois
de um acidente, que levou segundos para acontecer, parece que agora volto para o
caminho que entendo ser o original. E nesses dias, meses e anos, contei com
inúmeras pessoas que me fizeram acreditar que era possível continuar...E para elas,
meus mais sinceros agradecimentos...
À minha orientadora, professora Silvana que acreditou e, acima de tudo, confiou
no meu trabalho independentemente dos limites geográficos. Admiro e me
inspiro na sua perspicácia, determinação científica e generosidade, além do
excelente humor. Só não vou querer enfartar dia sim, e no outro também...
De forma muito especial, à professora Yara, minha companheira de trabalho na
UFSC e grande amiga, que por seus exemplos e ações mostra total
coerência, integridade e um enorme coração. Por, me oportunizar crescer
científica, pessoal e profissionalmente. Não há palavras para expressar a
minha gratidão.
vii
Ao Dib por seu amor. E também pela extrema paciência e por me apoiar
incondicionalmente nos momentos mais difíceis da vida. Por ser tão teimoso
quanto eu, e assim me fazer ver o que eu não vejo, ou não quero ver. Por seu
olhar crítico e por suas dicas e preciosas colaborações no laboratório.
Aos meus pais, que superaram comigo as adversidades e que voltaram a ter em
casa uma filha dependente. Não deve ter sido física e emocionalmente fácil,
mas eles superaram com bravura.
Ao meu irmão e à sua barulhenta família, por sua impaciência nas minhas
ausências e atrasos por sair tarde do laboratório. É o jeito deles de dizer que
me querem por perto.
Aos bolsistas e estagiários de graduação e às pós-graduandas do Laboratório de
Reprodução e Desenvolvimento Animal/UFSC, em particular à Karoline e à
Valquíria, pela convivência, confiança, troca de experiências e pelo cafezinho
na hora certa.
Aos colegas do Laboratório de Neuro-histologia e Ultraestrutura/UFRJ, pelas
agradáveis estadas e pela pronta disposição em colaborar. E também às
professoras Ana, Nádia e ao professor Marcelo, que me receberam sempre
de forma muito amistosa.
viii
À Direção do Centro de Ciências Biológicas e à Pró-reitoria de Pós-Graduação
da UFSC, pelo apoio demonstrado através dos auxílios concedidos.
Às professoras Alexandra e Andreza, do Laboratório de Bioenergética e Estresse
Oxidativo/UFSC, por suas colaborações nas análises bioquímicas e aos seus
alunos Viviane e Marcos, que foram ótimos comigo.
Aos amigos Pablo e Nani, pelas experiências em laboratório e também pelos
agradáveis momentos de descontração no Rio de Janeiro e em Rio Grande.
À professora Gilma Santos Trindade do Instituto de Ciências Biológicas – FURG,
pelo uso do radiômetro e a determinação da irradiância em aquário.
Ao professor José Garcia, pela revisão criteriosa e pelas sugestões para a versão
final da tese.
Aos professores membros da banca examinadora desta tese, por seu tempo
dedicado e suas contribuições.
Ao colega Henrique, que só “conheço” por e-mail, pelo envio generoso de
anticorpos cedidos pelo professor Patel da Universidade da Califórnia.
Aos colegas do Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética e aos
colegas do Centro de Ciências Biológicas da UFSC.
Aos meus amigos de perto e de longe que sempre torceram por mim.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AN apêndices naupliares
An antênulas
AP apêndices pós-naupliares
At antenas
BFC bromofluorocarbonos
BSA albumina sérica bovina
CAT catalase
CFC clorofluorocarbonos
CPD dímeros de pirimidina ciclobutano
DAB diaminobenzidina
DAPI
4,6-diamidina-2-fenil-indol
DG disco germinativo
DNA ácido desoxirribonucleico
DTNB 5,5’-ditio-bis ácido 2-nitrobenzóico
E dia embrionário
EGTA ácido tetracético glicol etileno
GC gânglio cerebral
GSH glutationa
GSSG glutationa oxidada
H
2
O
2
peróxido de hidrogênio
H
2
S- radical superóxido
HSC proteína de choque térmico constitutivas
HSE elemento de choque térmico
HSF-1 fator de transcrição de choque térmico
x
HSP 70 proteína de choque térmico de 70 kDa
KCl cloreto de potássio
LO lobo óptico
LPO peroxidação lipídica
Md mandíbula
MDA malondialdeído
MET microscopia eletrônica de transmissão
MgSO
4
sulfato de magnésio
NaCl cloreto de sódio
NaClO hipoclorito de sódio
NER reparo por excisão de nucleotídeos
N Neurômeros
NO neurópilo óptico
NPSH grupos tióis não-proteicos
O Olho
O
2
-
ânion superóxido
-OH radical hidroxila
PBS tampão fosfato-salina
PC papila caudal
PIPES piperazina-1,4-bis ácido 2-etanosulfónico
ROS espécies reativas de oxigênio
SA segmentos adominais
SOD superóxido dismutase
T telson
xi
TBA ácido tiobarbitúrico
TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TBS tampão Tris-salina
TNF fator de necrose tumoral
TUNEL
terminal tansferase dUTP nick end labeling
UV ultravioleta
UV-A ultravioleta A
UV-B ultravioleta B
UV-C ultravioleta C
V vitelo
xii
LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS
Figura 1. Representação esquemática da formação e dissociação do ozônio...... 3
Figura 2. Representação esquemática da interação das moléculas de clorofluo-
rocarbonos e ozônio.......................................................................................
4
Figura 3. Representação esquemática da formação de dímeros de pirimidina..... 7
Figura 4.
Representação das prováveis vias apoptóticas......................................
10
Figura 5. Representação dos mecanismos de regulação de HSP 70....................
15
Figura 6. Estágio de clivagem em M. olfersi em E1...............................................
24
Figura 7.
Estágio de formação do blastoderma em E2, da área blastoporal e do
disco germinativo em E3................................................................................
25
Figura 8.
Estágio de nauplius embrionizado de M. olfersi em E4..........................
26
Figura 9.
Estágio de pós-nauplius embrionizado de M. olfersi em E5 e E6...........
27
Figura 10.
Embriões de M. olfersi em E7 e E9.......................................................
28
Figura 11.
Embriões de M. olfersi em E12 e E14...................................................
29
Figura 12.
Alterações morfológicas induzidas pela radiação UV-B....................... 56
Figura 13. Volume e teor de água dos ovos entre E1 – E6 e E7 – E14.................
59
Figura 14.
Índice do olho de embriões entre E10 – E14........................................ 60
Figura 15. Embrião em E6 evidenciando as células em proliferação.................... 61
Figura 16. Imunomarcação com fosfo histona H3 dos embriões em E6................
62
Figura 17. Eletromicrogafias de embriões de M. olfersi.........................................
64
Figura 18.
Níveis de TBARS e NPSH de embriões de M. olfersi...........................
66
xiii
Figura 19. Imunomarcações com anti-p53 e anti-Bcl-2.......................................... 67
Figura 20. Imunomarcação com anti-caspase-3.................................................... 69
Figura 21. Imunomarcação com anti-4D9............................................................. 70
Figura 22. Imunomarcações com anti-2B8 e anti-7H5............................................ 71
Figura 23. Imunomarcação com anti-Oct-4............................................................. 72
Figura 24. Imunomarcação com anti-HSP 70..........................................................
73
Figura 25. Dupla imunomarcação com anti-HSP 70 e anti-caspase-3....................
74
Figura 26. Imunomarcação com anticorpo anti-HSP 70 nos olhos......................... 75
Figura 27. Dupla imunomarcação com anti-HSP 70 e anti-caspase-3 nos olhos... 76
Figura 28. Imunomarcação com anti-dímeros de timina......................................... 77
Figura 29. Representação do conjunto de resultados............................................. 78
Figura 30.
Sumário dos efeitos da radiação UV-B em embriões de M. olfersi........
95
Quadro I. Relação dos anticorpos primários utilizados nas marcações celulares.
47
Tabela 1. Número total de desovas e de ovos analisados.....................................
53
Tabela 2.
Descrição geral e frequência das alterações morfológicas....................
55
xiv
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas................................................................................................
ix
Lista de figuras, quadros e tabelas........................................................................ xii
Resumo.................................................................................................................. xvii
Abstract.................................................................................................................. xviii
1. Introdução.......................................................................................................... 1
1.1. A radiação ultravioleta e a camada de ozônio............................................
1
1.2. Os efeitos celulares induzidos pela radiação UV........................................ 5
1.3. Mecanismos de resposta à radiação UV.....................................................
11
1.4. Os efeitos da radiação UV nos organismos aquáticos................................
15
1.5. Os efeitos da radiação UV em crustáceos.................................................. 18
1.6. O modelo biológico de estudo.....................................................................
21
1.7. Justificativa para este trabalho de tese.......................................................
30
2. Objetivos............................................................................................................ 34
2.1. Objetivos gerais...........................................................................................
34
2.2. Objetivos específicos.................................................................................. 34
3. Materiais e Métodos........................................................................................... 36
3.1. Animais........................................................................................................
36
3.2. Delineamento dos grupos experimentais.................................................... 37
3.3. Exposição à irradiação UV-B...................................................................... 38
3.4. Análises morfométricas dos ovos e embriões.............................................
39
xv
3.4.1. Biometria dos ovos............................................................................
39
3.4.2. Teor de água dos ovos......................................................................
40
3.4.3. Índice do olho.................................................................................... 40
3.5. Análises morfológicas dos embriões...........................................................
41
3.5.1. Avaliação da morfologia externa in vivo............................................
41
3.5.2. Fixação dos embriões....................................................................... 41
3.5.2.1. Fixação para a confecção de cortes histológicos................. 42
3.5.2.2. Fixação para a confecção de preparados totais................... 42
3.5.2.3. Fixação para a confecção de cortes ultrafinos......................
43
3.5.3. Inclusão dos ovos..............................................................................
43
3.5.3.1. Inclusão dos ovos em Parapalst® ........................................
43
3.5.3.2. Inclusão dos ovos em resina Spurr® ................................... 44
3.5.4. Confecção de preparados totais (embriões entre E4 – E7).............. 44
3.5.5. Marcações celulares por imuno-histoquímica................................... 45
3.5.5.1. Procedimentos com os cortes histológicos........................... 45
3.5.5.2. Procedimentos com os preparados totais.............................
45
3.5.5.3. Marcadores celulares............................................................
46
3.5.6. Marcação celular pelo método de TUNEL....................................... 48
3.6. Análises bioquímicas dos embriões............................................................ 49
3.6.1. Determinação dos níveis de substâncias reativas ao TBARS......... 49
3.6.2. Determinação dos níveis de grupos tióis não-proteicos (NPSH)..... 50
xvi
3.7. Quantificação das marcações celulares......................................................
50
3.8. Análises estatísticas....................................................................................
51
4. Resultados......................................................................................................... 52
4.1. Análise da morfologia externa dos embriões in vivo...................................
52
4.2. Morfometria dos ovos e embriões............................................................... 57
4.3. Análise da proliferação celular.................................................................... 60
4.4. Análise da morte celular..............................................................................
63
4.5. Análise da diferenciação celular..................................................................
69
4.6. Análise da expressão de HSP 70................................................................
73
4.7. Análise da formação de CPD...................................................................... 76
5. Discussão...........................................................................................................
79
5.1. O efeito da radiação UV-B sobre morfologia dos embriões........................ 81
5.2. A radiação UV-B induz apoptose nos embriões de M. olfersi.....................
87
5.3.
O sistema nervoso como alvo da radiação UV-B.............................................
91
6. Conclusões.........................................................................................................
97
7. Referências bibliográficas....................................................................................
99
8. Anexos............................................................................................................... 119
xvii
Resumo
NAZARI, Evelise Maria.
Alterações morfológicas e celulares induzidas pela radiação
ultravioleta B em embriões do camarão de água doce Macrobrachium olfersi.
Tese
(Doutorado em Ciências Morfológicas) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
A diminuição do ozônio estratosférico tem resultado no aumento dos níveis de
radiação ultravioleta B (UV-B) que atinge a superfície terrestre. Nos ecossistemas de
água doce onde a água é transparente, a radiação UV-B pode facilmente penetrar e
potencialmente causar efeitos danosos aos organismos. O objetivo deste estudo foi
caracterizar os efeitos da radiação UV-B sobre a proliferação, morte e diferenciação
celular, bem como sobre as respostas celulares de defesa, em embriões do camarão
de água-doce Macrobrachium olfersi. Três grupos de embriões foram analisados: o
primeiro para verificar se a radiação UV-B produziu alterações morfológicas externas
e celulares, e ainda se causou distúrbios bioquímicos em laboratório. O segundo
para checar se embriões com as mesmas alterações observadas em laboratório
foram encontrados no ambiente, onde estavam expostos à radiação solar natural
(controle do ambiente). O terceiro grupo foi composto por embriões obtidos em
laboratório e não-irradiados com UV-B (controle do aquário). Embriões irradiados por
30 minutos com lâmpada UV-B 6W (irradiância de 310mW.cm
-2
) apresentaram os
maiores valores de volume dos ovos, acompanhados por um aumento no teor de
água, quando comparados com os grupos controles do ambiente e do aquário.
Embriões irradiados apresentaram alterações morfológicas induzidas pela radiação
UV-B, semelhantes às observadas nos embriões do grupo controle do ambiente. Os
efeitos mais importantes decorrentes da exposição à radiação UV-B foram as
alterações na pigmentação dos olhos e a presença de cromatóforos atípicos. O
índice mitótico apresentado pelos embriões irradiados com UV-B diferiu
significativamente dos controles. Embriões irradiados apresentaram um padrão
morfológico nuclear comparável ao de núcleos apoptóticos e fragmentação do DNA
associada ao processo apoptótico, além de mitocôndrias atípicas. Os elevados
níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) indicaram que a
radiação induziu à peroxidação lipídica e os baixos níveis de tióis não proteicos
(NPSH), que esta radiação comprometeu as funções antioxidantes das células
embrionárias. Foi observada baixa expressão das proteínas p53 e Bcl-2, além de
discreta formação de dímeros de pirimidina nos embriões irradiados. A expressão
das proteínas caspase-3 e HSP 70 foram observadas no sistema nervoso dos
embriões irradiados, porém não foi verificada a expressão simultânea das mesmas.
A radiação UV-B comprometeu ainda o processo de diferenciação dos teloblastos e
neuroblastos. Os resultados revelaram importantes efeitos induzidos pela radiação
UV-B nos embriões, que podem comprometer o desempenho das larvas e juvenis,
alterando as populações de M. olfersi e a dinâmica dos ecossistemas de água doce.
xviii
Abstract
NAZARI, Evelise Maria.
Morphological and cellular alterations induced by ultraviolet B
radiation on freshwater prawn Macrobrachium olfersi embryos.
Tese (Doutorado em
Ciências Morfológicas) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Rio de Janeiro, 2010.
The decrease of the stratospheric ozone has resulted in an increase of ultraviolet B
(UV-B) radiation reaching the Earth’s surface. In freshwater ecosystems with
transparent water, UV-B radiation easily penetrates and potentially causes harmful
effects to organisms. The aim of this study was to characterize the effects of UV-B
radiation on proliferation, cell death and cell differentiation processes, as well as on
the cell defense responses, in Macrobrachium olfersi freshwater prawn embryos.
Three groups of embryos were observed: the first was to assess whether UV-B
radiation induced external morphological defects and cell impairments, and still
whether it induced biochemical disturbances in the laboratory. The second was to
check whether embryos with the same injuries as those observed in the laboratory
were found in their environment, under natural solar radiation (environmental control).
The third group was constituted by the embryos obtained in laboratory and non-
irradiated with UV-B (aquaria control). Embryos irradiated with 6W UV-B lamp
(irradiance 310mW.cm
-2
) for 30 min displayed higher egg volume, which was
accompanied by an increase in the water content when compared with environmental
and aquaria controls. Irradiated embryos showed UV-B induced morphological
alterations similar to those observed in embryos from the environmental control
group. The most important effects of the UV-B exposure observed were pigmentation
changes in the eyes, and non-typical chromatophores. The mitotic index shown by
UV-B irradiated embryos differed significantly from the controls. Irradiated embryos
showed a morphological nuclear pattern suggestive of apoptotic nuclei, and DNA
fragmentation related to the apoptotic process, in addition to non-typical
mitochondria. The high levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)
indicated that UV-B radiation induced lipid peroxidation, and low levels of non-protein
thiol (NPSH) directly compromised the antioxidant function of the embryonic cells.
Low expression of p53 and Bcl-2 proteins, and discrete formation of pyrimidine
dimers were observed in irradiated embryos. Caspase-3 and HSP 70 proteins were
expressed in the irradiated embryos, but the simultaneous expression of these
proteins was not observed. UV-B radiation still interfered on the differentiation
process of teloblasts and neuroblasts. The results revealed important effects induced
by UV-B on embryos, which may alter the larval and juvenile performances, affecting
the M. olfersi populations and the freshwater ecosystem dynamics.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. A radiação ultravioleta e a camada de ozônio
A energia solar, transmitida sob a forma de ondas eletromagnéticas, constitui
um dos fatores ambientais mais importantes para os mecanismos biológicos de
organismos uni e pluricelulares, sendo fundamental para a manutenção da dinâmica
dos ecossistemas (Diffey, 1991). A radiação ultravioleta (UV) corresponde a uma
porção do espectro solar, juntamente com raios gama, raios X, luz visível,
infravermelho, micro-ondas e ondas de rádio (Diffey, 2002). A maior parte da energia
solar está concentrada nas faixas de ondas do espectro infravermelho (49%), do
visível (43%) e UV (7%). Os demais espectros correspondem a cerca de 1% da
energia transmitida pelo sol (Diffey, 2002; Varejão-Silva, 2006).
Dentre os espectros de radiação solar que atingem a superfície terrestre, a luz
visível é essencial para o processo de fotossíntese, para a visão de muitos animais e
para a regulação de ritmos biológicos, enquanto que os raios infravermelhos
transmitem calor para a atmosfera (Diffey, 1991). Já a radiação UV corresponde ao
espectro mais nocivo da radiação solar, embora também seja necessária para
alguns processos biológicos, como a orientação visual de muitas espécies de
invertebrados e vertebrados e para a produção de vitamina D na pele humana (Paul
e Gwynn-Jones, 2003). No entanto, os efeitos negativos da radiação UV são muito
mais proeminentes e incluem principalmente alterações no DNA, nas proteínas e
lipídeos que constituem as membranas celulares, resultando em uma variedade de
efeitos letais e subletais nos organismos (Leun e Gruijl, 1993; Sagata, 2002; Häder
et al., 2003; Dahms e Lee, 2010).
2
A radiação UV é constituída por uma ampla faixa de comprimento de onda,
entre 400 e 10 nm, onde a faixa entre 180 e 10 nm se propaga apenas no vácuo,
sendo referida no espectro como UV extremo. Em 1932, como resultado do Second
International Congress on Light realizado em Copenhagen, a radiação UV foi
subdividida em 3 faixas de comprimento de onda, UV-A (400 – 315 nm), UV-B (315 –
280 nm) e UV-C (280 – 100 nm). Contudo, considera-se biologicamente ativa, a faixa
de radiação UV entre 400 e 200 nm, a qual está dividida em radiação UV-A (400 –
320 nm), UV-B (320 – 290 nm) e UV-C (290 – 200 nm). Para o estudo dos efeitos
fotobiológicos da radiação UV-A, adota-se ainda a divisão em UV-A I (340 – 400 nm)
e UV-A II (320 – 400 nm) (Diffey, 2002).
Ao atravessar a atmosfera, o espectro e a intensidade da radiação solar são
modificados através de mecanismos de absorção e reflexão. Na estratosfera (15
- 50
km de altitude acima do nível do mar), a principal interação é a absorção pela
camada de ozônio, além da dispersão pelas moléculas de oxigênio e nitrogênio
atmosféricos. Já na troposfera (0 – 10 km de altitude acima do nível do mar), ocorre
a absorção pelo vapor de água atmosférico, pela água das nuvens, por poluentes e
partículas de poeira no ar (Pereira e Colle, 1997; Echer et al., 2001; Pallancar e
Toselli, 2004; McKenzie et al., 2007).
O ozônio desempenha papel fundamental no controle dos níveis de radiação
UV que atingem a superfície. Apenas 1% da atmosfera terrestre é constituída pelo
gás ozônio, o qual apresenta sua concentração máxima, cerca de 90%, na
estratosfera, onde absorve a radiação solar no espectro UV. A região entre 25 e 35
km de altitude é denominada camada de ozônio, devido a maior quantidade do gás
entre estes limites (Kirchhoff, 1991).
3
O máximo de absorção do UV ocorre nos comprimentos de onda na faixa de
100 e 300 nm, que correspondem à radiação UV-C. Assim, praticamente toda a
radiação UV-C é absorvida pela molécula de oxigênio na camada de ozônio, e não
chega a atingir níveis significativos na superfície terrestre. Por sua vez, a radiação
UV-B é em grande parte absorvida pela camada de ozônio, atingindo a superfície
terrestre em quantidades menores, enquanto que a radiação UV-A é a mais
abundante na superfície, pois não é absorvida na camada de ozônio (Kirchhoff et al.,
2000; Vernet, 2006).
O ozônio (O
3
) é um gás originado pela associação de uma molécula de
oxigênio (O
2
) com um átomo livre de oxigênio (O) presentes na estratosfera. A
ocorrência de átomos de oxigênio na estratosfera é decorrente da ação fotoquímica
da radiação UV-C, que dissocia a molécula de oxigênio em dois átomos livres. Cada
átomo livre se liga a uma molécula de oxigênio formando o ozônio. Por sua vez, o
ozônio absorve a radiação UV-B dissociando-se em uma molécula de oxigênio e em
um átomo de oxigênio. Assim, a camada de ozônio é resultante do balanço natural
de formação e dissociação do gás ozônio (Diffey, 1991) (Figura 1).
a b c
Figura 1. Representação esquemática da formação e dissociação do ozônio. (a)
radiação UV-C dissocia a molécula de oxigênio em dois átomos livres de oxigênio.
(b) cada átomo de oxigênio se liga a uma molécula de oxigênio formando a molécula
de ozônio. (c) radiação UV-B dissocia a molécula de ozônio em uma molécula de
oxigênio e em um átomo de oxigênio (Baseado em Diffey, 1991).
4
Na década de 70, os químicos Mario Molina e Frank Rowland (Molina e
Rowland, 1974) e o engenheiro/meteorologista Paul Crutzen (Crutzen, 1974),
demonstraram que compostos clorofluorocarbonos (CFC) e bromofluorocarbonos
(BFC) eram dissociados pela radiação UV na estratosfera, liberando cloro, flúor e
bromo, que se ligavam à molécula de ozônio formando outras novas moléculas,
contribuindo assim, para a redução da camada de ozônio (Figura 2).
a
b
Figura 2. Representação esquemática da interação das moléculas de
clorofluorocarbonos e ozônio. (a) radiação UV-B promove a liberação do átomo de
cloro que se liga à molécula de ozônio, resultando na formação do monóxido de
cloro e na molécula de oxigênio. (b) o átomo de oxigênio se liga ao monóxido de
cloro, resultando na formação da molécula de oxigênio e no átomo de cloro
(Baseado em Crutzen, 1974 e em Molina e Rowland, 1974).
Esta descoberta, inicialmente considerada irreal e alarmista, foi se
consolidando no meio científico e, em 1995, Molina, Rowland e Crutzem receberam
o Prêmio Nobel de Química por suas pesquisas. A descoberta destes cientistas
expôs um grande problema: a redução na camada de ozônio acarreta
5
consequentemente o aumento da intensidade de radiação UV-B e, potencialmente
de UV-C, que atingem a superfície terrestre (Kirchhoff e Leme, 2002).
Na década de 80, os cientistas Joesph Farman, Brian Gardiner e Jonathan
Shanklin descobriram, com base nos trabalhos de Molina, Rowland e Crutzen, o
chamado buraco de ozônio antártico (Farman et al., 1985; Shanklin, 2010), que
corresponde a uma drástica redução da camada de ozônio na região polar Antártica
(Solomon, 1988). Dentre as hipóteses para a formação do buraco de ozônio, a que
parece mais aceita é a de que durante a primavera no hemisfério sul, há uma
intensa concentração de compostos químicos presos no vórtice polar antártico, que
desencadeiam reações químicas destruidoras do ozônio no Polo Sul (André et al.,
2003).
Mais recentemente, os estudos sobre a tendência à redução da camada de
ozônio demonstram que o buraco de ozônio pode estender-se para latitudes mais
baixas, atingindo o Chile, Argentina, Uruguai e os estados brasileiros do Rio Grande
do Sul, Santa Catarina e Paraná (Kirchhoff et al., 1996; 2000).
1.2. Os efeitos celulares induzidos pela radiação UV
A radiação UV gera nos organismos efeitos diversificados, que podem
comprometer a sua viabilidade e sobrevivência (efeitos letais) ou alterar a sua
estrutura tecidual e celular e, portanto, a sua fisiologia (efeitos subletais) (Freitag,
1998; Bancroft et al., 2007; Häder et al., 2007). Os eventos pós-irradiação podem ser
classificados de acordo com o tempo em que eles irão se manifestar em: imediatos,
aqueles observados após poucas horas ou dias da irradiação; atrasados, que se
6
manifestam após semanas; e tardios que irão se manifestar meses após a irradiação
(Somosy, 2000).
Diminuição nas taxas de sobrevivência, aumento na ocorrência de alterações
morfológicas em embriões, larvas e adultos, atraso no desenvolvimento embrionário
e diminuição nas taxas de crescimento corporal são efeitos adversos causados pela
radiação UV e amplamente reportados. Tais efeitos são invariavelmente decorrentes
da ação da radiação UV nas células, afetando diretamente suas membranas,
compartimentos citoplasmáticos e componentes nucleares, pois a radiação UV
possui energia suficiente para penetrar nas células e alterar a estrutura de suas
moléculas, como o DNA, lipídios e proteínas (Diffey, 1991; Somosy, 2000; Häder et
al., 2003).
Em particular, a radiação UV-B é absorvida principalmente pelo DNA, que é o
principal cromóforo para esta radiação, seguido das proteínas e outras moléculas,
como os carotenóides (Horneck, 1995; Hildesheim e Fornace, 2004; Franco et al.,
2009). Normalmente, os fótons absorvidos pelo DNA não são energeticamente
suficientes para inativar a célula, de tal modo que a maioria dos efeitos da radiação
UV é do tipo subletal (Diffey, 1991). A seguir, serão abordados alguns dos efeitos da
radiação UV nas células, bem como, quando pertinente, os possíveis mecanismos
de reparo aos danos induzidos por esta radiação.
Na molécula de DNA, o principal efeito da radiação UV-B corresponde à
formação de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD, do inglês cyclobutane
pyrimidine dimers). A energia da radiação UV-B transferida para a célula é capaz de
gerar a quebra das ligações entre as pirimidinas e purinas da fita oposta (Figura 3a),
a qual é seguida pelo estabelecimento de ligações carbono-carbono entre
7
pirimidinas adjacentes (Figura 3b) (Browman et al., 2000; Ravanat et al., 2001;
Cadet et al.,2005; Dahms e Lee, 2010). Nos pontos onde há a formação de CPD,
perde-se a ligação entre as duas fitas de DNA, o que compromete a atividade da
enzima DNA polimerase, interferindo na transcrição gênica (MacFadyen et al., 2004;
Essen e Klar, 2006). A formação de CPD corresponde à cerca de 90% dos danos no
DNA causados pela radiação UV-B e, a ocorrência destes danos no organismo está
diretamente relacionada com o tempo e a dose da exposição (Browman et al., 2000;
MacFadyen et al., 2004). Assim, a quantificação de CPD pode ser utilizada como
uma ferramenta de avaliação de danos específicos causados pela radiação UV-B.
Figura 3. Representação esquemática da formação de dímeros de pirimidina (CPD),
em decorrência da radiação UV-B. (a) Ilustração do estabelecimento dos dímeros na
mesma fita de DNA (em amarelo) (www.sciencebuddies.org). (b) Formação de
ligações carbono-carbono (destacadas em vermelho) entre pirimidinas adjacentes,
em decorrência do rompimento das ligações entre as pirimidinas e as purinas da fita
oposta (www. ncbi.nlm.nih.gov).
Contudo, a formação de CPD pode ser reparada através de dois principais
mecanismos: (1) reparo por excisão de nucleotídeos (NER, do inglês nucleotide
excision repair) e (2) fotorreativação enzimática. O reparo através de NER inicia com
8
o reconhecimento da lesão por proteínas específicas que se ligam à porção
lesionada, seguido de uma cascata de eventos para a verificação da lesão. A
finalização deste reparo se dá pela ação de endonucleases, que clivam o DNA nos
locais de formação de CPD, resultando na eliminação da região de afetada (Thoma,
1999; Kulms e Schwarz, 2002; Weber, 2005;
Essen e Klar, 2006). Já o reparo por
fotorreativação enzimática é mais direto e energeticamente mais econômico, quando
comparado às múltiplas reações que ocorrem no reparo através de NER (Kulms e
Schwarz, 2002; Sinha e Häder, 2002; Weber, 2005). O processo de fotorreativação é
catalisado pela enzima fotoliase, que apresenta alta afinidade pelas regiões com
formação dos dímeros. Este processo é também dependente de luz visível e de
radiação UV-A, para que a fotoliase reverta a estrutura dimérica originada no DNA,
na sua forma original monomérica. Assim, após o reparo, as pirimidinas estão aptas
a re-estabelecer as pontes de hidrogênio com as purinas complementares (Kulms e
Schwarz, 2002; Weber, 2005).
A existência de danos no DNA gera ainda um aumento na expressão de
marcadores de ciclo celular, como a proteína p53. Essa proteína mantém o ciclo
celular na fase G1, permitindo que a célula repare os danos antes que ocorra a
síntese de DNA, reduzindo assim a taxa de mutação (Kulms e Schwarz, 2002; Lesse
et al., 2003; Hildesheim e Fornace, 2004). Quando esses mecanismos de reparo no
DNA não são eficientes, os danos remanescentes podem desencadear uma série de
eventos celulares que induzem a morte celular programada por apoptose (Godar,
1996; Bates e Vousden, 1999; Franco et al., 2009; Dahms e Lee, 2010).
A apoptose induzida pela radiação UV parece ser desencadeada por 3 vias
independentes que, no entanto, devem atuar de modo simultâneo: (1) em
9
decorrência dos danos induzidos no DNA, (2) pela ativação de receptores de
membrana e (3) pela geração de espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês
reactive oxygen species). Na primeira via, o aumento da expressão de p53,
anteriormente mencionado, induz um aumento na expressão de Bax, uma proteína
pró-apotótica que aumenta a permeabilidade da membrana mitocondrial,
promovendo a liberação de citocromo c, que por sua vez ativa a caspase-9 e
finalmente a caspase-3, dita executora da apoptose (Figura 4a) (Kulms e Schwarz,
2002; Franco et al., 2009; Dahms e Lee, 2010; Okamoto et al., 2010). Neste
contexto, o potencial da radiação UV de induzir apoptose pode ser amenizado, se
houver uma superexpressão de Bcl-2 e Bcl-xl, proteínas antiapoptóticas, que estão
associadas à manutenção da integridade da membrana mitocondrial, impedindo
assim a liberação de citocromo c (Hildesheim e Fornace, 2004; Franco et al., 2009).
Na segunda via de indução à apoptose, a radiação ativa receptores de morte
da família de receptores para o fator de necrose tumoral (TNF, do inglês tumor
necrosis factor) na superfície celular. Estes receptores possuem uma porção
extracelular e outra citoplasmática, necessárias para a transdução intracelular do
sinal de morte, de modo que no citoplasma acorram várias reações que ativam a
caspase-8, que por sua vez ativa a caspase-3, de forma independente da via
mitocondrial (Figura 4b) (Kulms e Schwarz, 2002; Hildesheim e Fornace, 2004;
Chowdhury et al., 2008).
Adicionalmente, a radiação UV pode induzir apoptose através da formação de
ROS. A energia da radiação transferida para a célula promove a formação de ROS,
que por sua vez, promovem a peroxidação lipídica (LPO, do inglês lipid
peroxidation), alterando a integridade da membrana mitocondrial e a liberação de
10
citocromo c no citoplasma, ativando as caspases-9 e 3 (Figura 4c) (Kulms e
Schwarz, 2002; Franco et al., 2009).
Figura 4. Representação esquemática resumindo as prováveis vias pelas quais a
radiação UV-B pode induzir a apoptose. (a) Apoptose induzida pela ocorrência de
danos ao DNA. (b) Apoptose induzida por meio da ativação de receptores de
membrana pela energia da radiação UV-B. (c) Indução à apoptose em decorrência
do aumento de espécies reativas de oxigênio. Bax, proteína pró-apoptótica; p53,
proteína de controle do ciclo celular; FAAD, domínio de morte associado ao fator de
necrose tumoral; LPO, peroxidação lipídica; ROS, espécies reativas de oxigênio;
TNF, fator de necrose tumoral.
Estes são alguns exemplos de como a radiação UV pode induzir a ocorrência
de apoptose. Contudo, é importante enfatizar que a apoptose é um evento celular
normal e necessário para a homeostase tecidual e que durante o desenvolvimento
embrionário, foco deste trabalho, a apoptose é fundamental para os processos de
morfogênese e organogênese. A apoptose cumpre ainda o papel de remover as
células alteradas que não foram eficientes nos seus mecanismos de reparo,
mantendo assim a integridade dos tecidos. A indução à apoptose passa a ser um
efeito adverso da radiação UV, quando esta compromete as funções básicas da
morte celular programada nos organismos.
11
A energia da radiação UV transferida para as células pode ainda induzir
estresse oxidativo, pela geração de ROS, como o ânion superóxido (O
2
-
), o peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) e por fim, o radical hidroxila (-OH) que é altamente reativo
(Obermüller et al., 2005; Franco et al., 2009). As ROS reagem principalmente com
lipídios, na cadeia de eventos da LPO. Devido a sua constituição lipoproteica, as
membranas celulares são alvo importante da LPO, que promove a perda da
integridade das membranas e altera a sua permeabilidade (Obermüller et al., 2005;
Franco et al., 2009; Dahms e Lee, 2010). Como dito anteriormente, estas alterações
comprometem a permeabilidade das membranas mitocondriais e promovem a
liberação de citocromo c, induzindo a apoptose.
De um modo geral, a radiação UV afeta os organismos de forma muito
semelhante, uma vez que interfere diretamente no metabolismo celular. Contudo,
diferentes organismos tendem a apresentar sensibilidade diferenciada às doses
incidentes de radiação, o que confere um panorama diversificado de implicações
biológicas (Bancroft et al., 2007; Häder et al., 2007), que serão descritas nos itens
1.4 e 1.5.
1.3. Mecanismos de resposta à radiação UV
Os organismos, em particular os aquáticos, apresentam algumas estratégias
para minimizar os efeitos da radiação UV, dentre as quais destacamos: a dispersão
de pigmentos nos cromatóforos, a produção de substâncias antioxidantes e a
expressão de proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP 70, do inglês heat shock
protein).
12
Os cromatóforos são células pigmentares de inúmeras espécies de
invertebrados aquáticos, peixes e anfíbios (Britton, 2008). Os pigmentos presentes
nos cromatóforos podem desempenhar seu papel fotoprotetor contra os danos da
radiação UV através de dois mecanismos: (1) absorvendo a radiação e (2)
protegendo as proteínas, lipídios e o DNA contra o estresse oxidativo. No primeiro
mecanismo, uma resposta rápida dos cromatóforos diante da incidência de radiação
UV é a dispersão dos pigmentos para toda a extensão da célula, que apresenta
numerosas ramificações, aumentando assim a superfície corporal protegida pelos
pigmentos (Armstrong et al., 2002; Gouveia et al., 2005; Auerswald et al., 2008).
Este mecanismo de resposta rápida pode ocorrer em segundos ou minutos e
corresponde à chamada mudança de cor fisiológica. Pode haver ainda um segundo
tipo de mudança de coloração, denominado mudança de cor morfológica, que
consiste no aumento ou diminuição da concentração de pigmentos, no número de
cromatóforos ou ambos (Auerswald et al., 2008). De um modo geral, a resposta dos
cromatóforos é eficiente, pois estas células podem conter diferentes pigmentos que
absorvem os comprimentos de onda das radiações UV-A, UV-B e luz visível (Cockell
e Knowland, 1999; Armstrong et al, 2002; Moeller et al., 2005; Auerswald et al.,
2008).
No segundo mecanismo de defesa conferido pelos cromatóforos, os
pigmentos carotenóides, incorporados aos animais através da dieta, desempenham
função antioxidante capturando o oxigênio molecular e outras ROS. A energia das
ROS é transferida para a molécula de carotenóide, a qual irá reagir com os solventes
celulares dissipando a energia obtida. Ao final dessas reações químicas os
carotenóides permanecem íntegros, podendo ser usados em novos ciclos de
13
interação com as ROS (Young e Lowe, 2001; Stahl e Sies, 2003; Obermüller et al.,
2005). Os carotenóides reagem de forma eficiente com os radicais peróxidos, que
são gerados no processo de LPO. Com a ausência destes radicais é interrompida a
sequência de reações que causa danos nos compartimentos lipofílicos. Desta forma,
os carotenóides desempenham um papel importante na proteção das membranas
celulares e de lipoproteínas contra o estresse oxidativo (Stahl e Sies, 2003). Além
dos carotenóides, os organismos incorporam ainda através da dieta, outros
compostos antioxidantes, como os flavonóides e as vitaminas C (ácido ascórbico) e
E (α-tocoferol) (Obermuller et al., 2005) .
Uma das moléculas antioxidantes mais importantes e que atua no sistema de
defesa contra os danos da radiação UV-A e UV-B é a glutationa (Storey, 1996;
Franco et al., 2009; Dahms e Lee, 2010). A forma reduzida da glutationa (GSH)
reduz as ligações dissulfetos induzidas pelo estresse oxidativo e neutraliza as ROS.
A GSH é utilizada como substrato pela glutationa peroxidase durante o processo de
eliminação de peróxidos, sendo então convertida em glutationa oxidada (GSSG). A
redução da GSSG é mediada pela enzima glutationa redutase, que recupera a GSH
(Storey, 1996).
Outro mecanismo de defesa antioxidante dos organismos é mediado pela
ação combinada da enzima superóxido dismutase (SOD), que converte o radical
superóxido (H
2
S-) em H
2
0
2
e da enzima catalase (CAT), que converte H
2
O
2
em água
e oxigênio molecular (Franco et al., 2009; Dahms e Lee, 2010).
A síntese de proteínas de estresse, como a HSP 70, constitui mais um tipo de
resposta dos organismos a estressores ambientais, como a radiação UV (Parsell e
Lindquist, 1993; Trautinger et al., 1996; Feder e Hofmann, 1999; Mukhopadhyay et
14
al., 2003). As HSP são proteínas constitutivas (HSC, do inglês heat shock
constitutive) presentes nas células em condições normais e atuam como
chaperonas, envolvidas no enovelamento e no transporte de proteínas para
diferentes compartimentos celulares (Hendrick e Hartl, 1993). Contudo, numa
situação de estresse, as células passam a expressar as chamadas HSP induzíveis
e, de um modo geral, as HSP induzíveis pela radiação UV pertencem a família HSP
70 (Parsell e Lindquist, 1993; Trautinger et al., 1996; Feder e Hofmann, 1999;
Mukhopadhyay et al., 2003).
A regulação na expressão de HSP induzíveis parece ser controlada
inicialmente pelo acúmulo de proteínas incorretamente enoveladas em
consequência dos danos causados na célula pelo estressor, no caso a radiação UV.
Este acúmulo faz com que as HSC, que originariamente estão acopladas ao fator de
transcrição de choque térmico HSF1 (HSF, do inglês heat shock factor), sejam
desacopladas para auxiliar na recuperação das proteínas danificadas. Deste modo,
o fator HSF-1 fica livre e migra para o interior do núcleo na forma de monômero. No
núcleo ocorre a formação de trímeros de HSF1 que se ligam a uma sequência de
nucleotídeos denominada elemento de choque térmico (HSE, do inglês heat shock
element) localizada na região promotora dos genes que codificam as HSP,
resultando num aumento do nível de transcrição dos genes de choque térmico
(Morimoto, 1998) (Figura 5). Assim, a elevada expressão de HSP constitui uma
resposta celular para conter os danos provocados pelo agente estressor, pois
previnem o enovelamento anormal de proteínas e auxiliam na eliminação de
proteínas desnaturadas (Trautinger et al., 1996; Clark e Peck, 2009).
15
Figura 5. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão de
HSP 70 em decorrência da ação da radiação UV-B nas células. A radiação
desnatura proteínas, que são recuperadas pela ação das HSC, em virtude do
desacoplamento do complexo HSF1+HSC. HFS1 migra para o interior do núcleo,
formando trímeros que ativam a transcrição dos genes de choque térmico. HSC,
proteína de choque térmico constitutiva; HSE, elemento de choque térmico; HSF1,
fator de transcrição de choque térmico; HSP, proteína de choque térmico indizível.
(Adaptado de Morimoto, 1998).
Embora os organismos apresentem alternativas tanto para o reparo dos
danos causados pela radiação UV, como para minimizar os seus efeitos, até mesmo
a ação combinada destas duas estratégias não é totalmente eficaz. Contudo, estas
alternativas de reparo e de respostas celulares têm sido utilizadas como poderosas
ferramentas no diagnóstico dos efeitos adversos causados pela radiação UV.
1.4. Os efeitos da radiação UV nos organismos aquáticos
Devido a sua inquestionável importância ecológica, os ecossistemas
aquáticos têm sido alvo de inúmeros estudos sobre os efeitos da radiação UV (Hardy
16
e Gucinski, 1989; Smith et al., 1992; Williamson, 1995; Browman et al., 2000; Häder
et al., 2003; Bancroft et al., 2007).
A radiação UV-A e UV-B pode penetrar nos ambientes aquáticos a diferentes
profundidades, sendo sua capacidade de penetração dependente principalmente da
profundidade da coluna d’água e da quantidade de matéria orgânica e inorgânica em
suspensão (Häder et al., 1998; 2007). Em águas claras, a radiação pode penetrar
até 70 m de profundidade e a inibição de processos biológicos tem sido detectada
em profundidades de até 30 m (Smith et al., 1992; Williamson, 1995).
É importante destacar que inúmeras espécies de peixes, anfíbios e de
invertebrados, vivem, reproduzem-se e desenvolvem seus ovos nesta faixa de
profundidade estando, portanto, todo o seu ciclo de vida exposto aos efeitos da
radiação UV incidente. Ressalta-se ainda, que apesar da necessidade de se
intensificar os estudos acerca da ação da radiação UV nos organismos aquáticos
durante as diferentes fases dos seus ciclos de vida, a maioria dos trabalhos é
realizada com as larvas, juvenis e adultos, havendo menor disponibilidade de
resultados referentes ao desenvolvimento embrionário das espécies.
Estudos realizados na última década mostram o efeito da radiação UV-B em
embriões e larvas de espécies aquáticas (Charron et al., 2000; Lesser et al., 2003;
Palen et al., 2005; Dong et al., 2007; Nahon et al., 2009). Dentre as espécies de
peixes estão relatadas a redução na taxa de eclosão e elevada mortalidade de
indivíduos recém-eclodidos do peixe-zebra Brachydanio rerio (Charron et al., 2000);
a ocorrência de apoptose anormal nos embriões da espécie de bacalhau Gadus
morhua, bem como atraso no ciclo celular, retardo no tempo de desenvolvimento e
diminuição no tamanho de suas larvas Lesser et al. (2001a); o aumento da
17
mortalidade e a diminuição da capacidade de flutuar dos ovos da espécie de
linguado Pleuronectes platessa (Steeger et al., 2001); a ocorrência de alterações
morfológicas nas vértebras dos embriões do peixe-zebra Danio rerio (Dong et al.,
2007).
Já dentre os anfíbios, os estudos mostram que embriões de Rana blairi (Smith
et al., 2000) e de Rana aurora (Belden e Blaustein, 2002) expostos à radiação UV-B
desenvolveram-se em larvas que apresentaram redução no crescimento corporal; a
radiação UV-B desencadeou ainda elevada mortalidade de embriões de duas
espécies de sapo Rana cascadae e Pseudacris regilla e de duas espécies de
salamandra Ambystoma macrodactylum e Ambystoma gracile (Palen et al., 2005);
embriões de Bufo arenarum expostos à radiação UV-B apresentaram aumento da
mortalidade e nos níveis da enzima superóxido dismutase (Herkovits et al., 2006);
malformações, retardo no crescimento larval e diminuição no desempenho da
natação foram observados em larvas do sapo Limnodynastes peronii expostas à
radiação UV-B em baixas temperaturas (van Uitregt et al., 2007).
Nas espécies de invertebrados aquáticos, os estudos sobre os efeitos da
radiação UV-B em embriões e larvas utilizam principalmente espécies de ouriço-do-
mar e de crustáceos - estes últimos serão abordados separadamente no item a
seguir.
Em embriões do ouriço-do-mar Strongylocentrotus droebachiensis foram
observados danos expressivos no DNA, que acarretaram a ocorrência anormal de
apoptose (Lesser et al., 2003); alterações morfológicas na formação das espículas e
aumento nos níveis de HSP 70 foram observados em embriões de ouriço-do-mar
Paracentrotus lividus (Bonaventura et al., 2005); foram relatados ainda danos no
18
DNA, avaliados pela formação de CPD, em embriões de três espécies de ouriços S.
droebachiensis, Sterechinus neumayeri, Evechinus chloroticus (Lesser et al., 2006);
a radiação UV-B induziu ainda redução na taxa de eclosão e ocorrência de
anormalidades morfológicas nos braços da larva do ouriço-do-mar Sphaerechinus
granularis (Nahon et al., 2009).
1.5. Os efeitos da radiação UV em crustáceos
Muitas espécies de crustáceos têm sido empregadas como modelo biológico
em estudos sobre os efeitos da radiação UV, utilizando-se diferentes doses de
radiação UV-A, UV-B e UV-C, em diferentes fases do ciclo de vida. De um modo
geral, as doses empregadas nos estudos foram simulações das doses de radiação
UV observadas no ambiente natural onde os animais foram coletados (Hovel e
Morgan, 1999; Cywinska et al., 2000; Browman et al., 2003; Obermüller et al., 2007;
Auerswald et al., 2008).
A participação dos cromatóforos na defesa contra os danos causados pela
radiação foi estudada em pós-larvas dos caranguejos Cancer oregonensis
eTelmessus cheiragonus, que apresentaram expansão dos pigmentos após 10
minutos de exposição a radiação UV-A e UV-A+UV-B (Miner et al., 2000).
Exemplares adultos do caranguejo Chasmagnathus granulata e do camarão
Palaemonetes argentinus, também apresentaram rápida dispersão de pigmentos nos
cromatóforos após a exposição à radiação UV-A, UV-B e UV-C (Gouveia et al.,
2004). A dispersão dos pigmentos nos cromatóforos mostrou-se efetiva na proteção
da epiderme de C. granulata. Foi observado que epiderme com pigmentos
agregados apresentaram aumento de danos oxidativos e de danos ao DNA, quando
19
comparada à epiderme que apresentava dispersão de pigmentos (Gouveia et al.,
2005). Já exemplares adultos de krill Euphausia superba responderam mais
efetivamente na dispersão dos pigmentos do cromatóforo após a exposição à
radiação UV-A do que quando expostos à UV-B (Auerswald et al., 2008).
No sistema visual, foram observadas após exposição à radiação UV-B e UV-
C, alterações estruturais no núcleo e citoplasma das células da retina e da lâmina
ganglionar de caranguejos adultos da espécie Ucides cordatus (Miguel et al., 2002).
A apoptose também foi induzida na retina e lâmina ganglionar de U. cordatus após
exposição à radiação UV-B e UV-C (Miguel et al., 2007). Danos celulares e
alterações no sistema de defesa antioxidante do sistema visual de Neohelice
granulata (=Chasmagnathus granulata), associados a diferentes regimes de
fotoperíodo, foram observados após a irradiação com UV-A e UV-B (Vargas et al.,
2010).
O sistema de defesa antioxidante do copépode Schmackeria inopinus
também foi alterado após a exposição de adultos à radiação UV. O aumento da
atividade das enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase foi observado
após a exposição à baixa dose de UV-B, enquanto que a exposição a uma dose
mais alta da radiação provocou uma significativa diminuição da atividade das
enzimas antioxidantes (Yu et al., 2009).
Danos à molécula de DNA e elevados níveis de formação de CPD ocorreram
em cladóceros adultos da espécie Daphnia pulicaria, após a exposição à radiação
UV-B combinada às temperaturas de 5°, 15° e 25°C (MacFadyen et al., 2004). A
expressão da proteína constitutiva de choque térmico (HSC 70) foi aumentada após
20
a exposição à radiação UV-A e UV-B de indivíduos adultos do copépode Acartia
tonsa (Tartarotti e Torres, 2009).
Trabalhos sobre os efeitos da radiação UV durante o desenvolvimento
embrionário de crustáceos abordam principalmente os danos provocados à taxa de
eclosão e taxa de sobrevivência dos ovos. Estes estudos mostram que a radiação
UV pode induzir efeitos bastante divergentes entre as espécies estudadas. De um
modo geral, o principal efeito observado é o aumento na taxa de mortalidade dos
embriões, como o descrito para os caranguejos Uca pugnax, Sesarma reticulatum e
Dyspanopeus sayi expostos à radiação UV-B (Hovel e Morgan, 1999). Embriões
recém-eclodidos das espécies de ostrácode Cypridopsis vidua, de anfípode Hyalella
azteca e de cladócera Daphnia magna expostos à radiação UV-B apresentaram
elevada mortalidade, além de efeitos sub-letais, como alterações nos movimentos
larvais, paralisia corporal e mudanças na pigmentação (Cywinska et al., 2000).
Reduzida sobreviência de nauplius do copépode Calanus finmarchicus foi verificada
após doses acumulativas de radiação UV-B (Browman et al., 2003).
Do mesmo modo, diminuição na taxa de eclosão e ocorrência de larvas
malformadas foram observadas em Calanus sinicus quando submetidos à radiação
UV-B. Contudo, estes danos foram reduzidos quando as larvas foram expostas
simultaneamente à radiação UV-A+UV-B, sugerindo que a radiação UV-A atue na
fotorreativação dos danos causados pela UV-B (Naganuma et al.,1997). Ao
contrário, nos ovos do copépode Calanus finmarchicus submetidos à radiação UV-A,
a taxa de eclosão foi significativamente menor do que nos ovos expostos à UV-B
(Rodriguez et al., 2000). Os efeitos da radiação nestes organismos parecem estar
associados tanto à dose quanto ao tempo de exposição. A taxa de eclosão dos ovos
21
do copépode Paracalanus parvus foi menor após a exposição por longos períodos
com baixas doses de UV-B, do que quando foram expostos por curtos períodos a
altas doses da radiação (Saito e Taguchi, 2003).
Além destes trabalhos, foram demonstradas alterações no comportamento de
migração vertical de D. pulicaria exposta à radiação UV (Leech e Williamson, 2001),
alterações na fisiologia respiratória dos anfípodes Gondogeneia antarctica e Djerboa
furcipes induzidas pelas radiações UV-A e UV-B (Obermüller et al., 2007), alterações
na fisiologia reprodutiva de Palaemontes pugio induzidas por UV-A (Volz et al.,
2002) e imunodepressão provocada pela radiação UV-A no camarão
Farfantepenaeus paulensis (Hollmann et al., 2008).
1.6. O modelo biológico de estudo
Macrobrachium olfersi é um crustáceo decápode da família Palaemonidae,
constituída por camarões de água doce, popularmente conhecidos como pitus. Esta
espécie tem ampla distribuição geográfica (Holthuis, 1980) e, na Ilha de Santa
Catarina, é encontrada com freqüência em riachos de águas claras e com pequena
profundidade (Ammar et al., 2001; Nazari et al., 2003).
Uma característica importante destes camarões, que os diferencia dos
camarões de água salgada, é o fato de as fêmeas transportarem os ovos em uma
câmara incubadora durante todo o período de desenvolvimento embrionário. A
câmara incubadora encontra-se na região ventral do abdome e é formada pela
dilatação lateral da carapaça. Nestes camarões não há formação de uma carapaça
de revestimento ventral da câmara, de modo que os ovos ficam expostos a todas as
condições presentes no meio. Após a fecundação, os ovos são depositados na
22
câmara incubadora e ficam aderidos às cerdas ovígeras dos pleópodos, que são os
apêndices abdominais (Charniaux-Cotton and Payen, 1992). A permanência dos
ovos na câmara é garantida também pela presença de um muco produzido pela
fêmea que envolve todos os ovos mantendo-os unidos e aderidos às cerdas
ovígeras (Glas et al., 1997).
Os ovos de M. olfersi, assim como de outras espécies de crustáceos, são
diretamente revestidos por dois envelopes ovulares. O envelope mais externo é
produzido ainda no ovário e tem constituição protéica, enquanto que o mais interno é
provavelmente produzido pelas células extra-embrionárias, após dois ou três dias da
fecundação (Saigusa, 1996; Glass et al., 1997). Tais envelopes recebem diferentes
denominações, como cório, envelope vitelino, envelope do ovo ou membrana do ovo
(Goudeau e Lachaise, 1980; Talbot e Helluy, 1995; Palomino et al., 2002). No
presente trabalho adotaremos a denominação cório.
Durante os estágios
1
do desenvolvimento, o cório protege o embrião de
contaminações por bactérias e fungos e de pequenos choques mecânicos
decorrentes da atividade de locomoção da fêmea. O cório ainda permite a troca
gasosa e passagem de água, necessários ao metabolismo das células embrionárias
(Green, 1965; Glass et al., 1997; Charmantier e Charmantier-Daures, 2001).
As fêmeas de M. olfersi transportam em média 2000 ovos por desova e o
desenvolvimento embrionário tem duração de 14 dias na temperatura de 24 ºC (± 2)
(Nazari et al., 2003; Simões-Costa et al., 2005). Os ovos são do tipo centrolécito,
cuja grande quantidade de vitelo, bem como a sua distribuição no citoplasma
1
No presente trabalho adotaremos os termos estágio e estagiamento para referir às etapas
do desenvolvimento embrionário e os métodos de classificação do desenvolvimento,
respectivamente.
23
determinarão o tipo de clivagem e de desenvolvimento embrionário subsequentes.
Nestes ovos, com formato levemente elíptico, o vitelo distribui-se regularmente em
grumos por todo o citoplasma, exceto em uma pequena área ao redor do núcleo e
na região subjacente à membrana vitelínica ou membrana do ovo (Müller et al.,
2003; 2004).
Diferentes critérios de estagiamento
1
são utilizados para os crustáceos que
apresentam ovos centrolécitos: estagiamento através do aparecimento de estruturas
de referência, como o olho e os apêndices (Perkins, 1972; Scholtz e Kawai, 2002);
estagiamento através das etapas do desenvolvimento, como clivagem, gastrulação e
nauplius embrionizado (Scholtz, 1992; Müller et al., 2004); estagiamento percentual,
onde 0% corresponde à postura e 100% ao momento da eclosão (Helluy e Beltz,
1991; Sandeman e Sandeman, 1991); estagiamento diário, no qual cada período de
24 horas corresponde a um dia embrionário (E) (Nagao, et al., 1999; Nazari et al.,
2000; Müller et al., 2003). Neste trabalho, adotaremos o critério de estagiamento do
desenvolvimento por dia embrionário.
O desenvolvimento embrionário de M. olfersi segue o padrão de clivagem
meroblástico superficial, observado nas espécies de crustáceos com ovos
centrolécitos (Anderson, 1973; Scholtz, 2000; Scholtz et al., 2009). As características
das principais etapas do desenvolvimento de M. olfersi apresentadas a seguir foram
descritas por Müller et al. (2003; 2004) e por Simões-Costa et al. (2005).
A clivagem superficial, também denominada intralécita, é caracterizada por
sucessivas divisões do núcleo do ovo no interior da massa de vitelo, formando as
enérgides em E1 (Figura 6a - d). Em seguida, em E2, as enérgides migram para a
periferia do ovo formando o blastoderma sincicial e posteriormente o blastoderma
24
celular, a partir do qual passam a ser denominadas blastômeros (Figura 7a - b). O
processo de gastrulação inicia-se com a formação da área blastoporal, resultante da
migração dos blastômeros para a região próxima a um dos pólos do ovo (Figura 7c -
d). Pouco se conhece sobre os mapas do destino e a regulação do processo de
formação do blastóporo durante a gastrulação inicial nos crustáceos com clivagem
superficial, em parte, devido à grande massa de vitelo que dificulta a realização de
marcações celulares (Gerberding e Patel, 2004).
Figura 6. Estágio de clivagem em M. olfersi em E1. Nenhuma estrutura embrionária
é observada na superfície do ovo logo após a desova (a). Esquemas representam as
sucessivas divisões das enérgides (cabeça de seta) no centro da massa de vitelo
(b - d). V, vitelo. Barra de escala = 0,1 mm. (Fotos: Simões-Costa et al., 2005,
esquemas: Dib Ammar).
Durante a gastrulação inicial a área blastoporal corresponde a uma pequena
depressão na superfície do ovo, delimitada por um anel de aproximadamente 13
blastômeros, cujo formato alongado difere das demais células do blastoderma. Os
blastômeros migram em direção à área blastoporal e ingressam através do anel de
células formando o disco germinativo em E3 (Figura 7e - g). Em decorrência do
padrão de migração das células embrionárias, o disco germinativo organiza-se
25
superficialmente no ovo e apresenta a forma característica de V, onde as
extremidades superiores correspondem ao esboço dos lobos ópticos (LO) e a
extermidade inferior, ao esboço da papila caudal (PC) (Figura 7h, i). Na superfície do
ovo ainda são observados alguns blastômeros dispersos, que irão originar o
ectoderma extra-embrionário.
Figura 7. Estágio de formação do blastoderma em E2, da área blastoporal e do
disco germinativo de M. olfersi em E3. Blastômeros (cabeça de seta) visualizados na
superfície do ovo (a - b). Organização da área blastoporal (cabeça de seta) (c - d) e
migração de células (cabeça de seta) através da área blastoporal (e - g) para a
formação do disco germinativo em E3 (h, i). DG, disco germinativo; V, vitelo;
asterisco, futura região do lobo óptico; duplo asterisco, futura região da papila
caudal. Barra de escala = 0,1 mm. (Fotos: Simões-Costa et al., 2005, esquemas: Dib
Ammar).
No início de E4, o disco germinativo torna-se mais espesso e o LO e a PC
passam a ser compostos por várias camadas celulares. Tem início a formação do
26
nauplius, que em M. olfersi corresponde a uma fase in ovo, razão pela qual recebe o
nome de nauplius embrionizado, diferindo da larva nauplius dos crustáceos com
ovos oligolécitos (Dahms, 2000; Scholtz 2000). O nauplius embrionizado (Figura 8a)
é constituído pelos LO, por três pares de apêndices laterais, ditos naupliares (AN),
que são as antênulas, antenas e mandíbulas e ainda pela PC (Figura 8b). Na região
central do nauplius observa-se uma pequena depressão que corresponde ao
estomodeu. A formação do nauplius embrionizado dá início à morfogênese em M.
olfersi.
Figura 8. Estágio de nauplius embrionizado em E4. (a) Nauplius organiza-se na
periferia do ovo. (b) Esturutras embrionárias típicas do nauplius embrionizado. An,
antênulas; At, antenas; e, estomodeu; LO, lobo óptico; Md, mandíbula; PC, papila
caudal. Barra de escala = 0,1 mm. (Fotos: Simões-Costa et al., 2005, esquemas: Dib
Ammar).
Durante os estágios de disco germinativo e de nauplius embrionizado ocorre
intensa diferenciação celular e as células derivadas dos ectoteloblastos passam a
expressar os fatores de transcrição engrailed e even-skipped, na região posterior do
embrião. Engrailed e even-skipped estão envolvidos no estabelecimento do padrão
de organização corporal em segmentos ao longo do eixo ântero-posterior e na
27
diferenciação dos neuroblastos, responsável pela diversidade de células neuronais
em diferentes espécies de crustáceos (Patel et al., 1989, Duman-Scheel e Patel,
1999).
Em E5 e E6 a morfogênese prossegue e organiza-se o pós-nauplius
embrionizado, caracterizado principalmente pelo alongamento do embrião no sentido
ântero-posterior, crescimento e encurvamento da PC através da proliferação e
diferenciação dos teloblastos (células multipotentes), bifurcação dos AN, formação
dos primeiros cromatóforos e pelo surgimento dos apêndices ditos pós-naupliares
(AP), que são as maxílulas, as maxilas e os primórdios dos segmentos torácicos
(Figura 9).
Figura 9. Estágio de pós-nauplius embrionizado de M. olfersi em E5 (a, b) e E6 (c,
d). AN, apêndices naupliares; AP, apêndices pós-naupliares; LO, lobo óptico; PC,
papila caudal; V, vitelo. Barra de escala = 0,1 mm. (Fotos: Simões-Costa et al., 2005,
esquemas: Dib Ammar).
Em E7, a organogênese pode ser evidenciada pelo início da pigmentação do
olho na região distal do LO (Figura 10a, b). A massa de vitelo, ainda presente na
porção central do ovo, determina que o crescimento do embrião continue
superficialmente no sentido céfalo-caudal. Nos estágios subsequentes, de E8 a E10,
28
a incorporação gradativa do vitelo possibilita o crescimento das estruturas
embrionárias em direção à porção mais interna do ovo (Figura 10c). O coração
apresenta batimentos irregulares e os grânulos de vitelo circulam nas vesículas do
intestino médio.
Figura 10. Embriões de M. olfersi em E7 (a, b) e em E9 (c). O embrião continua
crescendo no sentido ântero-posterior, ocupando a região superficial do ovo. AN,
apêndices naupliares; AP, apêndices pós-naupliares; LO, lobo óptico; O, olho; PC,
papila caudal; V, vitelo. Barra de escala = 0,1 mm. (Fotos: Simões-Costa et al., 2005,
esquemas: Dib Ammar).
De E11 a E14, o olho apresenta um crescimento bastante expressivo, os AN
e os AP apresentam cerdas e estão nitidamente bifurcados e a carapaça dorsal
recobre todo o cefalotórax. Nos estágios finais do desenvolvimento embrionário, o
coração, o intestino primitivo, os gânglios cerebrais e os apêndices corporais estão
preparados para a eclosão (Figura 11a - d).
29
Figura 11. Embriões de M. olfersi em E12 (a, b) e em E14 (c, d). A massa de vitelo
diminui gerando espaço para o crescimento do embrião. O olho aumenta e o telson
atinge a porção mais cefálica do embrião. Formam-se a carapaça do cefalotórax e
os segmentos abdominais. AN, apêndices naupliares; AP, apêndices pós-naupliares;
C, carapaça; O, olho; SA, segmentos abdominais; T, telson; V, vitelo. Barra de
escala = 0,1 mm. (Fotos: Simões-Costa et al., 2005, esquemas: Dib Ammar).
Dentre as características da reprodução e do desenvolvimento embrionário de
M. olfersi, destacamos algumas que foram fundamentais na escolha desta espécie
como modelo de estudo no presente trabalho, que são: (1) a adaptabilidade da
espécie em aquário e a possibilidade de se obter desovas em laboratório,
controlando o ambiente de desenvolvimento durante todo o período de incubação;
(2) o fato de as fêmeas transportarem os ovos em uma câmara incubadora externa,
que permite o fácil acesso aos embriões; (3) o elevado número de ovos e o tempo
de desenvolvimento embrionário de 14 dias, que possibilita a retirada parcelada de
ovos e o acompanhamento sistemático dos estágios do desenvolvimento; (4) o fato
dos embriões de uma mesma desova apresentarem desenvolvimento sincrônico,
que contribui para a padronização (homogeneidade) das amostragens; (5) a posição
do embrião na superfície do ovo, o que facilita a visualização direta das mudanças
morfológicas ao longo dos estágios do desenvolvimento; (6) a transparência das
células embrionárias, que contribui para a visualização das mudanças internas no
30
embrião; (7) o formato do embrião nos estágios de nauplius e pós-nauplius inicial
(morfogênese e organogênese iniciais) e a sua posição em relação à massa de
vitelo, que permite a confecção de preparados totais, possibilitando a realização de
marcações celulares no embrião inteiro, sem a necessidade de cortes histológicos.
1.7. Justificativa para este trabalho de tese
Este trabalho justifica-se primeiramente, pela questão atual referente ao
aumento da radiação UV-B na superfície terrestre em decorrência das alterações na
camada de ozônio, provocadas principalmente pela emissão de CFC e BFC. Nas
três últimas décadas, o aumento nos comprometimentos à saúde humana, como
fotoenvelhecimento (Hachiya et al., 2009), câncer de pele (Sarasin, 1999; Young,
2006) e catarata (Hoover, 1986; Feretis et al., 2002; Young, 2006) tem sido atribuído
ao aumento da incidência da radiação UV-B. Contudo, além da saúde humana, são
reportados expressivos efeitos da radiação UV-B em muitos animais vertebrados e
invertebrados, como já mencionado anteriormente, comprometendo inclusive a
manutenção das populações, a exemplo dos anfíbios (Blaustein et al., 1994; Belden
e Blaustein, 2002; Palen et al., 2005; Herkovits et al., 2006). Soma-se ainda, o fato
de as espécies apresentarem sensibilidade diferenciada à radiação incidente, o que
certamente se reflete em variados padrões de efeitos induzidos pela radiação UV-B.
Assim, torna-se imprescindível estudar diferentes espécies e ainda abrir o leque de
espécies estudadas para que se possa conhecer de modo mais abrangente tais
padrões de efeitos induzidos pela radiação UV-B.
A segunda justificativa para este trabalho de tese consiste nos crescentes
níveis de radiação UV que têm sido registrados na região sul do Brasil, em particular
31
durante os meses de verão. Dados do Centro de Previsão do Tempo e Estudos
Climáticos do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (CPTEC/INPE) revelam que
os índices de UV para esta região estão sempre nos níveis “muito alto” (de 8 a 10) e
“extremo” (de 11 a 15) da escala (www.cptec.inpe.br). Pode-se buscar explicação
para esta situação em dois fatos: a região sul estar sob a influência do buraco de
ozônio antártico (André et al., 2003; Díaz et al., 2006) somada à grande emissão de
metano proveniente das lavouras, principalmente de arroz, cujo descarte
inadequado da casca produz grande quantidade deste gás.
Os meses de verão correspondem justamente à estação reprodutiva de M.
olfersi na Ilha de Santa Catarina, cujas fêmeas ovígeras são encontradas em águas
claras e rasas (Müller et al., 1999; Ammar et al., 2001), onde a incidência da
radiação UV é a mesma da superfície. Considerando que a fêmea apresenta uma
carapaça transparente e que os ovos na câmara incubadora estão expostos a todas
as condições do meio, pode-se supor que os embriões desta espécie estejam
expostos às mesmas condições de radiação UV do seu meio ambiente.
Este trabalho justifica-se ainda pelo fato de que pouco se estuda sobre os
efeitos da radiação em embriões de invertebrados aquáticos. De um modo geral,
embriões de anfíbios e peixes são os mais estudados. Sob o ponto de vista
ecológico, alterações na morfofisiologia dos embriões induzidas pela radiação UV-B
pode comprometer a viabilidade dos mesmos e acarretar conseqüências maiores
para a população. M. olfersi é uma espécie importante para a dinâmica dos
ecossistemas de água doce, pois é detritívora e participa da cadeia alimentar de
peixes e aves aquáticas, atuando assim na reciclagem de energia destes ambientes.
32
Sob o ponto de vista morfológico, o estudo dos efeitos da radiação UV-B em
embriões de M. olfersi poderá contribuir para o conhecimento de como as células
embrionárias são afetadas e como elas respondem ao insulto da radiação,
principalmente no que diz respeito à proliferação, à morte e à diferenciação celular
durante a embriogênese. Adicionalmente, este estudo poderá indicar que defesas os
embriões apresentam e o quanto elas são eficientes, isto porque, classicamente, os
embriões são considerados mais susceptíveis à ação de efeitos externos do que
juvenis e adultos (Epel et al., 1999; Charron et al., 2000; Bancroft et al., 2007).
Como hipótese geral, pretendemos investigar se a radiação UV-B interfere
nos mecanismos celulares necessários para o desenvolvimento e, se as possíveis
interferências geram consequências que comprometem a morfogênese e
organogênese normal de M. olfersi.
Considerando as justificativas apresentadas, bem como a abrangência da
hipótese proposta, definimos algumas questões que este estudo se propõe a
responder:
1- Quais as alterações morfológicas que são induzidas pela radiação UV-B em
laboratório? Levando-se em conta que em laboratório procurou-se simular as
condições do ambiente, tais alterações são também registradas na natureza?
2- A radiação UV-B pode afetar os mecanismos de proliferação e de diferenciação
celular, essenciais durante a embriogênese? Em particular, a radiação UV-B pode
33
afetar a expressão dos genes even/skipped e engrailed/invected reportados como
fundamentais nas etapas iniciais do desenvolvimento de decápodes?
3- A radiação UV-B altera a ocorrência de apoptose durante o desenvolvimento de
M. olfersi? No caso de haver aumento na ocorrência de apoptose, de que forma esta
radiação induz a apoptose? A exemplo do que é de reportado na literatura, a
indução à apoptose é resultante da ocorrência de danos no DNA, da ocorrência de
LPO e/ou da ativação de receptores de membrana?
Estas são questões primordiais que precisam ser respondidas, considerando
a escassez de estudos que abordam os efeitos da radiação UV-B sobre os
mecanismos celulares durante o desenvolvimento embrionário de espécies
aquáticas.
34
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Caracterizar os efeitos da radiação UV-B sobre os mecanismos essenciais da
embriogênese, como a proliferação, a morte e a diferenciação celular, bem como
sobre as respostas celulares de defesa nos diferentes estágios do desenvolvimento,
utilizando como modelo de estudo embriões do camarão de água-doce M. olfersi.
2.2. Específicos
- Diagnosticar e quantificar a ocorrência de alterações morfológicas externas
em embriões obtidos em laboratório e irradiados com lâmpada que emite UV-B,
comparando-os com embriões coletados diretamente do ambiente e, portanto,
submetidos à radiação solar natural;
- Quantificar a proliferação celular através do cálculo do índice mitótico
durante a morfogênese e a organogênese inicial em embriões irradiados e não-
irradiados;
- Reconhecer se a radiação UV-B induz apoptose através de análises
ultraestruturais e da fragmentação do DNA, bem como investigar a provável via
apoptótica que está sendo ativada pela radiação em embriões de M. olfersi;
- Investigar se a radiação induz a síntese de HSP 70 e se a expressão desta
proteína induzível interfere no processo de apoptose;
35
- Avaliar se a radiação interfere no processo de diferenciação celular durante
a morfogênese inicial, através da análise dos teloblastos e durante a organogênese
inicial, através da diferenciação das células do sistema nervoso;
- Avaliar se a radiação altera as defesas antioxidantes durante o
desenvolvimento comparando entre os grupos experimentais, os níveis de grupos
tióis não-proteicos, constituídos principalmente por glutationa;
- Avaliar se a radiação induz estresse oxidativo durante o desenvolvimento,
comparando os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, que
corresponde a um dos principais marcadores biológicos de peroxidação lipídica.
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Exemplares adultos de M. olfersi (machos: comprimento total médio de 71 mm
(± 4,9); fêmeas e fêmeas ovígeras: comprimento médio de 53 mm (± 6,2)) foram
coletados no Parque Municipal da Lagoa do Peri, na Ilha de Santa Catarina, SC. Os
camarões foram capturados nas margens rasas da Lagoa, onde a água é clara e há
pouca vegetação. De um modo geral, os machos são os indivíduos que
permanecem a maior parte do tempo abrigado, sendo coletados preferencialmente
sob as pedras. Já as fêmeas e fêmeas ovígeras permanecem mais tempo
desabrigadas, sendo coletas com frequência em áreas mais expostas. A Lagoa do
Peri não tem contaminação por efluentes, sendo um manancial de água potável para
a Ilha de Santa Catarina (www.casan.com.br). A qualidade das águas da Lagoa foi
essencial na escolha do local de coleta, pois provavelmente, não há neste ambiente
a influência de fatores antropogênicos, que pudessem comprometer de forma
negativa os resultados dos experimentos realizados neste trabalho.
Após a coleta, os camarões foram transportados em aquário portátil com
aeração constante para o Laboratório de Reprodução e Desenvolvimento Animal,
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética da Universidade Federal
de Santa Catarina. Em laboratório, os camarões foram aclimatados por 96 horas em
aquários de 30 litros, com sedimento arenoso e pedras para abrigo, mantidos a 24º
C (±1), com aeração constante, em condições naturais de fotoperíodo e alimentados
diariamente com ração balanceada para organismos aquáticos (Alcon Bottom
Fish®), fornecida em bandejas submersas para controle do consumo.
37
Para favorecer a cópula e a obtenção de fêmeas ovígeras em aquário,
machos e fêmeas (1:3) foram acondicionados em aquários de 60 litros, mantidos nas
mesmas condições descritas para o período de aclimatação.
Os procedimentos de coleta e manutenção dos camarões em laboratório de
pesquisa, adotados neste trabalho, foram aprovados pelo IBAMA (Certificado nº
157/2005 e Autorização Permanente nº 15294-1/2008), além do que, toda atenção
foi dada para minimizar o desconforto dos animais.
3.2. Delineamento dos grupos experimentais
Para o estudo dos efeitos da radiação UV-B, as fêmeas ovígeras foram
distribuídas em três grupos:
- grupo irradiado UV-B: composto por fêmeas ovígeras acasaladas em laboratório e
irradiadas com lâmpada UV-B por 30 minutos;
- grupo controle do ambiente: composto por fêmeas ovígeras coletadas diretamente
do ambiente durante os meses de verão, no qual estavam sujeitas à
irradiância de 225 a 350 mW/cm
2
. Estes valores foram calculados a partir
dos índices de UV disponibilizados diariamente pelo Centro de Previsão de
Tempo e Estudos Climáticos (CPETEC) do Instituto Nacional de Pesquisas
Espaciais (INPE). Para o cálculo foram utilizados os valores diários de
índice de UV durante o período de estudo, que variaram de 9 a 14. Cada
unidade de índice de UV corresponde a 25 mW/cm
2
de energia. As fêmeas
deste grupo não foram submetidas à radiação UV-B artificial;
- grupo controle do aquário: composto por fêmeas ovígeras obtidas em laboratório e
não-irradiadas.
38
3.3. Exposição à irradiação UV-B
Antes de proceder à irradiação, retirou-se uma amostra de aproximadamente
20 ovos das fêmeas ovígeras destinadas ao grupo irradiado UV-B, para o
reconhecimento ao estereomicroscópio (Olympus SHZ 10; zoom de 35 – 70 X) do
estágio do desenvolvimento dos embriões, de acordo com Müller et al. (2003; 2004)
e Simões-Costa et al. (2005). Em seguida, as fêmeas ovígeras foram transferidas
para um aquário localizado em uma câmara escura, onde está a lâmpada que emite
UV-B (Vilber Lourmat; 6 W de potência), e irradiadas por 30 minutos. Foram
utilizadas fêmeas ovígeras com ovos em todos os esztágios do desenvolvimento. O
período de exposição à radiação foi adotado com base no trabalho de Miguel et al.
(2002), realizado com animais adultos do caranguejo Ucides cordatus, o qual
mostrou-se adequado para estudos sobre os efeitos da radiação UV em crustáceos.
A incidência da radiação no fundo do aquário foi medida com radiômetro
International Light IL1400A, sendo a irradiância obtida para o fundo do aquário de
310 mW/cm
2
, com contaminação de 0,217 mW/cm
2
de UV-A.
Após a irradiação, as fêmeas ovígeras foram mantidas no escuro durante
quatro dias e então, os ovos foram novamente analisados para o reconhecimento do
estágio do desenvolvimento, antes de se dar prosseguimento aos procedimentos
metodológicos. É importante destacar que a manutenção das fêmeas no escuro teve
por objetivo evitar a ocorrência de fotorreparo mediada pela radiação UV-A e luz
visível. Adicionalmente, para avaliar o efeito da radiação nos embriões, foi
necessário esperar por mudanças de estágio do desenvolvimento, razão pela qual
se optou por fazer as análises quatro dias após a irradiação.
39
O reconhecimento dos estágios dos embriões dos grupos controle do
ambiente e controle do aquário foi realizado conforme descrito acima, sendo que as
fêmeas destes dois grupos foram mantidas nas mesmas condições das fêmeas do
grupo irradiado UV-B, exceto pelo fato de não terem sido irradiadas.
Os ovos obtidos das fêmeas dos três grupos experimentais foram destinados
às análises morfométricas e morfológicas em microscopias de luz, fluorescência,
confocal e eletrônica de transmissão e a ensaios bioquímicos.
3.4. Análises morfométricas dos ovos e embriões
Para a realização destas análises foram utilizadas 44 fêmeas do grupo
irradiado UV-B, 56 fêmeas do grupo controle do ambiente e 58 fêmeas do grupo
controle do aquário.
3.4.1. Biometria dos ovos
Uma subamostra de cinco ovos de cada fêmea foi mensurada ao microscópio
de luz (Olympus; 40 X) com auxílio de ocular micrométrica (Olympus), para a
obtenção das medidas dos eixos longitudinal (L) e transversal (T) de cada ovo. Tais
medidas foram utilizadas na determinação do volume do ovo, através da fórmula
(
π.
L.T
2
)/6 (Odinetz-Collart e Rabelo, 1996), sendo os valores expressos em
milímetros cúbicos.
40
3.4.2. Teor de água dos ovos
Uma subamostra com cerca de 100 ovos de cada fêmea foi pesada para a
obtenção do peso fresco (g) e em seguida, desidratada em estufa a 60ºC por 48
horas. Decorrido este período, os ovos foram novamente pesados para a obtenção
do peso seco (g) e posterior cálculo do teor de água, através da diferença entre peso
fresco e peso seco, sendo os valores expressos em porcentagem.
3.4.3. Índice do olho
Uma subamostra de cinco ovos de cada fêmea foi utilizada para a obtenção
ao microscópio de luz (Olympus; 400 X) com auxílio de ocular micrométrica
(Olympus) das medidas do maior (M) e menor (m) eixos do olho, as quais foram
aplicadas na fórmula (M+m)/2, proposta por Perkins (1972). O olho dos embriões é
uma estrutura fácil de visualizar e, segundo este autor, o índice do olho reflete o
grau de desenvolvimento de estruturas internas, mais difíceis de serem visualizadas
externamente. A relação entre o índice do olho e o desenvolvimento das estruturas
embrionárias de M. olfersi em condições normais foi descrita por Simões- Costa et
al. (2005). Para evitar a obtenção de valores muito discrepantes, em função das
diferenças de tamanho durante o desenvolvimento do olho, foram utilizados nesta
etapa da metodologia apenas os embriões entre E10 e E14, os quais apresentavam
olho arredondado e omatídeos reconhecíveis. Sendo assim, foram utilizadas 12
fêmeas do grupo irradiado UV-B, 14 do grupo controle do ambiente e 17 fêmeas do
grupo controle do aquário.
41
3.5. Análises morfológicas dos embriões
3.5.1. Avaliação da morfologia externa in vivo
Para a análise da morfologia externa dos embriões foram utilizados cerca de
50 ovos de cada uma das 44 fêmeas do grupo irradiado UV-B, 56 fêmeas do grupo
controle do ambiente e 58 fêmeas do grupo controle do aquário.
Após o período de quatro dias no escuro, procedeu-se à nova determinação
do estágio do desenvolvimento, conforme descrito no item 3.3, visando a reconhecer
se o estágio do desenvolvimento observado correspondia ao esperado para o dia da
análise. Em seguida, realizou-se a quantificação dos embriões normais e dos
embriões que apresentavam alterações morfológicas externas, para o cálculo das
freqüências de embriões malformados. Para auxiliar no reconhecimento e na
descrição das alterações morfológicas das estruturas embrionárias, os embriões
foram filmados (câmera Sony CCD-IRIS, DXC 107A)
ao estereomicroscópio
(Olympus SHZ 10; zoom de 35 – 70 X), permitindo assim que as imagens pudessem
ser analisadas repetidas vezes.
3.5.2. Fixação dos embriões
Foram adotados diferentes procedimentos de fixação dos embriões, conforme
as análises microscópicas a serem realizadas.
42
3.5.2.1. Fixação para a confecção de cortes histológicos de embriões incluídos
em Paraplast® (embriões entre E4 – E14)
Nesta etapa, os ovos foram previamente descorionizados com hipoclorito de
sódio (NaClO) a 5% por 5 minutos em agitação, lavados rapidamente por três vezes
na solução de Triton X-100 a 0,2% + NaCl a 1,5 %.
Foram testadas duas soluções de fixação:
– solução fixadora I:
tampão fosfato-salina (PBS) 10 mM, pH 7,4 + ácido tetracético
glicol etileno (EGTA) 0,05 mM + formaldeído a 37% + heptano PA (Hemavathy et al.,
1997; Araújo e Bier, 2000), sendo os ovos fixados por 10 minutos em agitação e
lavados rapidamente com metanol PA, sendo então preservados em etanol PA;
– solução fixadora II: piperazina-1,4-bis ácido 2-etanosulfónico (PIPES) 0,1 M, pH
6,95 + EGTA 2 mM + sulfato de magnésio (MgSO
4
) 1 mM + formaldeído a 37%
(Scholtz et al., 1994), sendo os ovos fixados por 10 minutos em agitação e
preservados em etanol PA.
3.5.2.2. Fixação para a confecção de preparados totais (embriões entre E4 –
E7)
Os ovos foram fixados em solução de Bouin alcoólico (etanol a 53% +
formaldeído a 25%+ ácido acético glacial a 5% + ácido pícrico saturado a 0,4%) por
30 minutos sob agitação e preservados em PBS 0,1 M.
43
3.5.2.3. Fixação para a confecção de cortes ultrafinos de embriões incluídos
em resina Spurr® (embriões entre E4 – E14)
Os ovos foram fixados primeiramente em glutaraldeído a 2% +
paraformaldeído a 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2, por
aproximadamente 6 horas a 4ºC. Após, foi realizada a fixação secundária com
solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M por 1
hora.
3.5.3. Inclusão dos ovos
Foram adotados diferentes procedimentos de inclusão dos ovos, conforme as
análises microscópicas a serem realizadas.
3.5.3.1. Inclusão dos ovos em Paraplast® (embriões entre E4 – E14)
Os ovos foram desidratados em série etanólica crescente 70% - 100%,
diafanizados em xilol, incluídos em Paraplast®, seccionados em micrótomo rotativo
(Micronal) entre 5 e 8 µm, sendo os cortes seriados coletados em lâminas
albuminizadas para a realização de técnicas de coloração de rotina (controle
histológico), em lâminas gelatinizadas para as análises por imuno-histoquímica
(marcações celulares) e em lâminas tratadas com poli-L-lisina para análise através
do método de TUNEL (do inglês Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling -
marcação de apoptose). Cada lâmina foi montada com cortes de embriões de
mesma idade dos grupos irradiado e não-irradiados. Este procedimento foi adotado
para que durante as marcações, os cortes ficassem nas mesmas condições
(corantes, reagentes do kit TUNEL, tampões, soluções de permeabilização e de
44
inativação e tempos de incubação dos anticorpos) permitindo assim, a comparação
direta entre os cortes dos diferentes grupos.
3.5.3.2. Inclusão dos ovos em resina Spurr® (embriões entre E4 – E14)
Após a fixação, os ovos foram imediatamente desidratados em série
crescente de acetona 30% - 100% e a infiltração em resina Spurr®, foi realizada de
forma lenta, nas proporções acetona:resina de 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 e resina pura, por 24
horas cada. Após a polimerização da resina, os blocos obtidos foram cortados em
ultramicrótomo (RMC-MT 6000-XL) para a obtenção de cortes semifinos (900 nm),
os quais foram corados com solução de azul de toluidina a 1% e observados ao
microscópio de luz para controle da orientação dos embriões e observação da
qualidade de preservação do material. Os cortes ultrafinos (70 - 80 nm) foram
coletados em grades de 200-300 mesh, contrastados com citrato de chumbo e
solução aquosa a 0,5% de acetato de uranila e observados ao microscópio
eletrônico de transmissão (MET, modelo JEM-1011) operado a 100 KV.
3.5.4. Confecção de preparados totais (embriões entre E4 – E7)
Nesta etapa, apenas embriões entre E4 e E7 foram submetidos à confecção
de preparados totais, pois nestes estágios o embrião, que se encontra nas fases
iniciais de morfogênese e organogênese, é composto por poucas camadas celulares
e apresenta pequena curvatura no ovo. Os procedimentos foram realizados em
estereomicroscópio (Olympus SHZ 10; zoom de 35 – 70 X), sendo primeiramente
efetuada a descorionização manual dos ovos, removendo-se o cório mais externo
45
com estiletes de ponta fina. Em seguida, procedeu-se à remoção dos grânulos de
vitelo e, por último, a remoção de parte do cório interno, que fica aderido ao embrião.
3.5.5. Marcações celulares por imuno-histoquímica
Os cortes coletados em lâminas gelatinizadas, bem como os preparados
totais foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica.
3.5.5.1. Procedimentos com os cortes histológicos
Primeiramente procedeu-se à remoção do Paraplast® dos cortes com dois
banhos de xilol, em seguida os cortes foram
hidratados em série alcoólica
decrescente 100% - 70% e
lavados por duas vezes de 10 minutos com PBS 0,1M,
pH 7,4.
Os cortes foram então banhados por 20 minutos em metanol: peróxido de
hidrogênio (1:1) para o bloqueio das peroxidases endógenas, lavados com PBS 0,1
M, permeabilizados por 30 minutos com PBS 0,1 M + Triton X-100 a 0,3% e tratados
por 40 minutos com albumina sérica bovina (BSA) a 5% para a inativação dos sítios
inespecíficos.
3.5.5.2. Procedimentos com os preparados totais
Os preparados totais foram acondicionados em tubos Eppendorf® de 250 µL
durante todos os procedimentos da técnica de imuno-histoquímica até a montagem
das lâminas. Primeiramente, os embriões foram banhados por 20 minutos em
metanol: peróxido de hidrogênio (1:1) para o bloqueio das peroxidases endógenas,
lavados com PBS 0,1 M, permeabilizados por 2 horas com PBS + Tween 20 a 0,1%
e tratados por 1 hora com BSA a 5% para a inativação dos sítios inespecíficos.
46
3.5.5.3. Marcadores celulares
Os cortes destinados às análises em microscopias de luz e fluorescência
foram incubados com anticorpos primários durante a noite a 4°C. Os preparados
totais, destinados às análises em microscopia confocal, foram incubados com
anticorpos primários durante 4 dias a 4°C.
Foram usados marcadores diversos para a identificação de proliferação
celular, apoptose, células neuronais, dímeros de pirimidina e HSP 70, conforme o
Quadro I.
Após a incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados por
45 minutos com PBS + Triton X-100 a 0,03% e incubados por 2 horas com
anticorpos secundários (anti-coelho conjugado à peroxidase, Sigma; anti-
camundongo conjugado à peroxidase, Sigma; anti-camundongo Alexa Fluor® 488 e
633, anti-coelho Alexa Fluor® 488 e 568). Depois deste procedimento, os cortes
foram lavados com PBS 0,1 M, pH 7,4. No caso das marcações colorimétricas, os
cortes foram tratados com diaminobenzidina (DAB, Sigma). Por fim, as lâminas
foram montadas em Entellan® (Merck) para microscopia de luz e Gelmount®
(Biomeda) para microscopia de fluorescência.
Os preparados totais foram lavados por 2 horas com PBS + Tween 20 a
0,03% e incubados por 2 dias a 4°C com anticorpos secundários (anti-camundongo
Alexa Fluor® 488 e 633, anti-coelho Alexa Fluor® 488 e 568). Depois deste
procedimento, os preparados totais foram lavados por 2 horas com PBS 0,1 M, pH
7,4, sendo alguns incubados com a sonda nuclear fluorescente
4,6-diamidina-2-fenil-
indol (
DAPI, Sigma). Por fim, os embriões foram montados em lâminas com
Gelmount® para microscopia confocal (
Leica DMI6000 B).
47
Quadro I: Relação dos anticorpos primários utilizados nas marcações celulares por
imuno-histoquímica.
Anticorpo primário Desenvolvido em:
Espécie de
origem
Diluição utilizada
Proliferação celular
Anti-fosfo histona H3
serina 10;
Upstate
coelho humana 1:100
Apoptose
Anti-caspase 3 ativa;
Abcam
coelho humana 1:100
Anti-Bcl-2; Chemicon camundongo humana 1:100
Anti-p53; Dako camundongo humana 1:100
Estresse celular Anti-HSP 70; Abcam camundongo humana 1:100
Neurônios
Anti-Bp102;
Developmental Studies
Hybridoma Bank
camundongo Drosophila 1:50
Anti-engrailed (4D9);
Developmental Studies
Hybridoma Bank e doação
Lab. Dr. Nipam Patel -
Universidade da Califórnia
camundongo Drosophila 1:1
Anti-even skipped (2B8);
Developmental Studies
Hybridoma Bank e doação
Lab. Dr. Nipam Patel-
Universidade da Califórnia
camundongo Drosophila 1:1
Anti-even skipped (7H5);
Developmental Studies
Hybridoma Bank e doação
Lab. Dr. Nipam Patel-
Universidade da Califórnia
camundongo Drosophila 1:1
Anti-β tubulina III;
Promega
camundongo peptídeo
sintético
1:100
Teloblastos
Anti-Oct 4; Chemicon coelho
peptídeo
sintético
1:100
Dano específico
causado pela radiação
Anti-dímeros de timina;
Sigma
camundongo galinha 1:100
Para os controles negativos, foram seguidos os mesmos procedimentos
adotados para os cortes e preparados totais, com a omissão dos anticorpos
primários.
48
Nos preparados totais, as marcações celulares foram realizadas no grupo
irradiado UV-B e no grupo controle do aquário. Os embriões do grupo controle do
ambiente não foram utilizados, pois as fêmeas ovígeras no ambiente natural ocorrem
apenas durante um período mais restrito do ano, o que dificulta a condução das
marcações. Como as marcações celulares foram realizadas simultaneamente nos
dois grupos, desta forma foram padronizadas as condições da técnica quanto às
propriedades químicas dos tampões, os tempos de incubação e as condições de
análise à microscopia confocal. Ressalta-se ainda, que a fixação dos embriões para
a confecção dos preparados totais com Bouin alcoólico, bem como a sua posterior
preservação em PBS a 4ºC não mantém os embriões em condições viáveis por
muito tempo.
3.5.6. Marcação celular pelo método de TUNEL
A marcação pelo método de TUNEL foi utilizada para o reconhecimento de
morte celular. O procedimento foi realizado utilizando o kit TdT FragEL
TM
DNA
Fragmentation Detection kit (Calbiochem; QIA 33).
Primeiramente, procedeu-se à remoção do Paraplast® dos cortes com dois
banhos de xilol; em seguida os cortes foram
hidratados com série alcoólica
decrescente 100% - 70% e
lavados rapidamente com tampão Tris-salina (TBS)
0,1M, pH 7,4. Os cortes
foram imediatamente permeabilizados com proteinase K
diluída em tampão Tris 10 mM, pH 8,0 (1:400), lavados com TBS 20 mM e em
seguida, lavados com
metanol:peróxido (9:1) para o bloqueio das peroxidases
endógenas. Na sequência destes procedimentos, os cortes foram preparados para a
incubação com a enzima de marcação do TUNEL a 37ºC, tratados com DAB e
49
contracorados com verde de metila. Por fim, as lâminas foram montadas com
Entelan®. Para os controles negativos foram seguidos os mesmos procedimentos,
com omissão da enzima de marcação do TUNEL.
3.6. Análises bioquímicas dos embriões
Para a análise dos níveis de grupos tióis não-proteicos e dos níveis de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, foram utilizadas desovas inteiras de 26
fêmeas do grupo irradiado UV-B, 28 fêmeas do grupo controle do ambiente e 28
fêmeas do grupo controle do aquário. As desovas foram homogeneizadas em PBS
20 mM, pH 7,4 contendo cloreto de potássio (KCl) 140 mM. Posteriormente, as
desovas foram centrifugadas a 2.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante
foi separado e utilizado para as análises de estresse oxidativo. A dosagem protéica
das amostras foi determinada pelo método de Bradford (1976), utilizando BSA como
padrão.
3.6.1. Determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS)
O nível de TBARS foi determinado pelo método de Ohkawa et al. (1979),
através do qual o malondialdeído (MDA) é o produto final da peroxidação lipídica e
reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA), formando um complexo colorido. Alíquotas
do homogenato das desovas foram incubadas a 100ºC por 1 hora em meio contendo
dodecil sulfato de sódio a 0,45% + TBA a 0,6%. Após a centrifugação, o produto da
reação foi determinado em espectrofotômetro a 532 nm, utilizando o
50
tetrametoxipropano como padrão. Os níveis de TBARS foram expressos em nmol de
MDA/mg de proteína.
3.6.2. Determinação dos níveis de grupos tióis não-proteicos (NPSH)
Grupos NPSH
, constituídos por cerca de 90% de glutationa (Cooper e Kristal,
1997), foram determinados após a precipitação dos homogenatos com 1 volume de
ácido tricloroacético a 10% (Ellman, 1959). Após a centrifugação, uma alíquota do
sobrenadante foi diluída em PBS 800 mM, pH 7,4, sendo adicionado 500 µM de 5,5’-
ditio-bis ácido 2-nitrobenzóico (DTNB). O desenvolvimento da cor é resultado de
reação do DTNB com grupos tióis. Após 10 minutos, a absorbância foi lida a 412 nm.
Os nívies de NPSH foram expressos em nmol de NPSH/mg de proteína.
3.7. Quantificação das marcações celulares
A proliferação celular foi avaliada através do cálculo do índice mitótico,
determinado pela razão entre o número de células em mitose pelo número total de
células, utilizando o software Image J® (National Institutes of Health, NIH). Para
quantificação do índice mitótico foram utilizadas as imagens da imunomarcação com
anti-fosfo histona H3. Do mesmo modo, foi calculado o índice apoptótico
determinado pela razão entre o número de núcleos apoptóticos pelo número total de
núcleos. Para a quantificação do índice apoptótico foram utilizadas as imagens
obtidas em microscopia eletrônica de transmissão.
51
3.8. Análises estatísticas
Para a determinação do número de ovos (n) necessários para a obtenção das
medidas do volume do ovo e do índice do olho, foi aplicada a fórmula n = (1,96. S)/L,
onde S = desvio padrão de uma amostra inicial (n = 10) e L = 10% da média desta
amostra inicial (Bussab e Moretin, 2004).
Os resultados quantitativos das análises morfométricas dos ovos e embriões,
das marcações celulares, bem como das análises bioquímicas foram avaliados no
programa estatístico Statistica® versão 6.0 para Windows. Para verificar a existência
de diferenças significativas entre as médias dos grupos experimentais foi utilizado o
teste de análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido do teste post-hoc de
Tukey (p < 0,05). Os resultados foram apresentados em média (± erro padrão).
52
4. RESULTADOS
No presente trabalho, o efeito da radiação UV-B foi investigado em embriões
de M. olfersi, desde a postura dos ovos na câmara incubadora (E1) até o dia da
eclosão (E14).
A análise dos embriões, imediatamente após o período de permanência no
escuro, revelou que nas condições experimentais adotadas neste trabalho não
houve alteração no ritmo de desenvolvimento. Em outras palavras, foi constatado
que o estágio do desenvolvimento esperado para o dia da análise coincidiu com o
estágio observado. Embora neste trabalho não tenhamos buscado determinar as
taxas de sobrevivência dos embriões após a irradiação, observamos que todas as
fêmeas irradiadas mantiveram seus ovos na câmara incubadora até o dia da
eclosão, mesmo aquelas que foram irradiadas nos estágios mais iniciais do
desenvolvimento.
4.1. Análise da morfologia externa dos embriões in vivo
Após a irradiação com 310 mW/cm
2
, os embriões de M. olfersi apresentaram
uma série de alterações morfológicas, relacionadas com o formato do ovo e das
estruturas embrionárias, transparência do embrião, aspecto dos cromatóforos e dos
grânulos de vitelo. Observações feitas no ambiente natural revelaram que os
embriões (controle do ambiente) que se desenvolveram sob a luz solar
apresentaram alterações morfológicas similares às apresentadas pelos embriões
irradiados com UV-B. Já os embriões que se desenvolveram totalmente em aquário
(controle de aquário) e que não foram expostos à radiação UV-B, apresentaram uma
53
menor frequência de alterações morfológicas, além de terem sido observadas em
apenas 14 % das amostras analisadas. Por outro lado, foram observadas alterações
embrionárias em 84% das amostras de embriões irradiados e em 51% das amostras
do ambiente natural (Tabela 1). É importante ainda salientar que, de um modo geral,
os embriões apresentaram mais de um tipo de alteração. Contudo, a associação das
alterações não obedeceu a um padrão de ocorrência, sendo observadas
combinações aleatórias de fenótipos.
Tabela 1. Número total de desovas e de ovos analisados, bem como as freqüencias
de desovas com embriões alterados.
Não-irradiados
Irradiado UV-B
Controle aquário Controle ambiente
Número de desovas
analisadas
76 55 32
Número de desovas com
ovos alterados
11 28 27
Porcentagem de desovas
com embriões alterados
14 % 51 % 84 %
Total de ovos analisados 11.365 6.090 5.937
Número médio de ovos
analisados por desova
150,9 105,08 181,92
Considerando as características dos estágios do desenvolvimento de M.
olfersi, e buscando a melhor visualização dos resultados, optamos por agrupar os
embriões, adotando como estrutura de referência durante o desenvolvimento, a
presença do olho. Embriões que não possuem olho têm em comum as estruturas
embrionárias constituídas por poucas células e, portanto, morfologicamente menos
54
complexas, além de grande quantidade de vitelo no ovo. Nestes embriões, os
processos de morfogênese e organogênese estão iniciando. Assim, foram
estabelecidos dois conjuntos de embriões: E1 a E6, constituídos por embriões que
não apresentavam olhos; E7 a E14, embriões com olhos pigmentados em
desenvolvimento.
No primeiro conjunto de embriões, E1 – E6, verificou-se uma menor
freqüência de alterações morfológicas induzidas pela radiação UV-B, quando
comparado com os embriões entre E7 – E14 (Tabela 2).
Destacamos em E1 – E6, as alterações no formato do DG, da PC e dos AN
(Figura 12a - c), a redução na transparência das células embrionárias
(Figura 12b, c), as alterações no aspecto da massa de vitelo (Figura 12c), além da
presença de poucos cromatóforos e cromatóforos atípicos, que corresponderam às
alterações mais expressivas nesse grupo de embriões (Figura 12c). Cromatóforos
atípicos consistiram principalmente em células grandes, arredondadas e com
pigmento mais claro ou em células com aspecto granular. Pode-se ainda observar
que os limites das estruturas embrionárias, que em um embrião normal são bem
definidos, estavam pouco reconhecíveis.
55
Tabela 2. Descrição geral e frequência das alterações morfológicas observadas em
embriões de M. olfersi não-irradiados e irradiados com UV-B.
Estágio
dos
embriões
Categorias
morfológicas
Descrição das
alterações
Frequência (%)
Não
-
irradiados
Irradiado
UV-B
Controle
aquário
Controle
ambiente
E1
–
E6
Formato do
embrião
Embriões com
formas atípicas e
estruturas
embrionárias pouco
reconhecíveis
0,7 0,8 16,6
Região da papila
caudal com
curvatura atípica
0 0 0,6
Transparência
das células
Embriões com
aspecto opaco
0
0,9 2,0
Aspecto dos
cromatóforos
Formato e
pigmentação atípicos
dos cromatóforos
0 0 50,8
Tamanho do
ovo
Ovos maiores e mais
arredondados,
perdendo o aspecto
elíptico típico
0,45 0 20,0
Massa de vitelo
Vitelo sem
organização em
grânulos, formando
uma massa com
gotas de água
0,6
n = 32
1,0
n = 29
6,7
n = 24
E7
-
E14
Formato do
embrião
Embriões com
formas atípicas;
estruturas
embrionárias pouco
reconhecíveis
0,5 1,5 1,0
Transparência
das células
Embriões com
aspecto opaco
1,0 1,3 11,0
Aspecto dos
cromatóforos
Cromatóforos
atípicos com formato
e pigmentação
alterados
27,6 46,9 95,5
Formato e
pigmentação do
olho
Olhos grandes e com
formas atípicas; em
alguns embriões, os
olhos não se
desenvolveram
0 1,2 2,8
Olhos com
pigmentação branca
associada aos
omatídeos
33,7
78,0 98,9
Tamanho do ovo
Ovos grandes e
arredondados
0 2,1 22,0
Massa de
vitelo
Massa de vitelo sem
o aspecto granular
típico
0,6
n = 26
2,0
n = 27
2,2
n = 20
n = número de fêmeas analisadas, no mínimo 50 ovos por fêmea.
56
Figura 12. Alterações morfológicas induzidas pela radiação UV-B em embriões de
camarões de água doce M. olfersi. Os asteriscos brancos indicam os embriões não-
irradiados e com desenvolvimento normal. (a) Alterações na organização do disco
germinativo em E3, relacionadas à presença de poucas células (losango preto);
embriões corados com azul de toluidina; (b) Curvatura anormal da papila caudal
(asterisco preto) em E4; (c) Embriões em E6 com aspecto opaco (cabeça de seta
preta), cromatóforos (asterisco preto) e grânulos de vitelo (duplo asterisco preto)
atípicos; (d) Embriões em E8 com aspecto opaco (cabeça de seta preta) e olhos
não-desenvolvidos (cabeça de seta branca) e sem cromatóforos visíveis;
(e) Embriões em E10 com estruturas embrionárias pouco reconhecíveis e gotas de
água misturadas ao vitelo (seta preta); (f) Embriões em E10 com aspecto opaco
(cabeça de seta preta), grânulos de vitelo atípicos (duplo asterisco preto),
pigmentação branca recobrindo os omatídeos (dupla cabeça de seta preta),
pigmentação branca associada aos cromatóforos na região próxima ao olho (dupla
cabeça de seta branca); (g) Embriões em E10 com cromatóforos atípicos (asterisco
preto), gotas de água misturadas ao vitelo (seta preta) e pigmentação branca
recobrindo os omatídeos (dupla cabeça de seta preta); (h) Embriões em E14 com
aspecto opaco (cabeça de seta preta) e olhos com formas atípicas. Barra de escala
= 0.1 mm.
57
Nos embriões entre E7 – E14, as alterações mais frequentes estavam
relacionadas à pigmentação dos olhos e ao formato e pigmentação dos
cromatóforos, tanto nos embriões capturados diretamente no ambiente, como
naqueles irradiados com UV-B. Atraso no desenvolvimento do olho (Figuras 12d, e),
o qual estava normalmente associado à ausência de cromatóforos, presença de uma
pigmentação branca recobrindo os omatídeos (Figuras 12f, g) e formato anormal do
olho (Figura 12h) foram as alterações verificadas de modo mais expressivo nos
embriões irradiados. Observou-se ainda a presença de embriões com estruturas
pouco reconhecíveis (Figura 12e), embriões com pigmentação branca associada aos
cromatóforos (Figura 12f), ausência de cromatóforos ou cromatóforos atípicos nos
embriões com coloração opaca (Figura 12e, f) e gotas de água dispersas entre os
grânulos de vitelo (Figura 12g).
4.2. Morfometria dos ovos e embriões
Com o objetivo de estabelecer alguns parâmetros quantitativos, foram
calculados o volume e o teor de água dos ovos, bem como o índice do olho dos
embriões. Primeiramente, considerando que cerca de 20% dos embriões irradiados
com UV-B apresentaram ovos grandes e arredondados, diferindo do formato elíptico
dos ovos não-irradiados, procedeu-se à determinação do volume dos ovos entre os
estágios E1 – E6 e E7 – E14. Conforme o esperado verificou-se um aumento no
volume dos ovos nos dois conjuntos de embriões. Em E1 – E6 a radiação UV-B
provocou um aumento significativo no volume dos ovos (0,047 mm
3
, ± 0,01), quando
comparados com os ovos do controle do ambiente (0,042 mm
3
, ± 0,001; P ≤ 0,05) e
do controle do aquário (0,038 mm
3
, ± 0,0005; P ≤ 0,00001). Entre E7 – E14, o
58
volume dos ovos do controle do aquário (0,053 mm
3
± 0,07) diferiu significativamente
dos ovos do grupo controle do ambiente (0,061 mm
3
, ± 0,0009; P ≤ 0,00001) e do
grupo irradiado com UV-B (0,062 mm
3
, ± 0,001; P ≤ 0,0001) (Figura 13a).
Este aumento no volume foi acompanhado pelo aumento significativo do teor
de água dos ovos. Entre E1 – E6, os ovos irradiados com UV-B apresentaram teor
médio de água de 64,6%, diferindo significativamente dos ovos do controle do
aquário, com 55,9% (P ≤ 0,01). O teor médio de água dos ovos do controle do
ambiente (60,4%) não diferiu significativamente dos demais grupos. Nos ovos entre
E7 – E14, o grupo irradiado com UV-B apresentou teor de água de 78%, diferindo
significativamente do grupo controle do aquário (66,2%; P ≤ 0,001). Do mesmo
modo, o teor de água dos ovos do grupo controle do ambiente (72%) não
apresentou diferença significativa em relação aos outros grupos (Figura 13b).
59
Figura 13. Volume (a) e teor de água (b) dos grupos de ovos de M. olfersi não-
irradiados e irradiados com UV-B, nos estágios entre E1 – E6 e E7 – E14. Dados
apresentados em média (± erro padrão). Asteriscos indicam diferenças significativas
entre as médias dos grupos (**, P ≤ 0,01), (***, P ≤ 0,001) e (****, P ≤ 0,0001)
analisadas através de ANOVA de uma via, seguida do teste de Tukey. n = número
de fêmeas por grupo, em (a) foram analisados cinco ovos por fêmea e em (b) cerca
de 100 mg de massa fresca de ovos por fêmea.
60
O índice do olho foi calculado dentre os embriões dos estágios E10 – E14,
que apresentavam olhos com morfologia externa aparentemente normal. Embriões
dos grupos controle do aquário e controle do ambiente apresentaram índices
praticamente iguais, 103,2 µm e 103,9 µm, respectivamente. Já os embriões
irradiados com UV-B apresentaram índice de 110,3 µm. A análise de variância
ANOVA não indicou, porém, diferenças significativas entre os grupos (Figura 14).
Figura 14. Índice do olho de
embriões de M. olfersi não-
irradiados e irradiados com UV-
B, entre os estágios E10 – E14.
Dados apresentados em média
(± erro padrão). n = número de
fêmeas por grupo, cinco ovos
por fêmea.
4.3. Análise da proliferação celular
Inicialmente, foi observado um reduzido número de células nos embriões
irradiados com UV-B, como mostra a figura 12a. Observou-se ainda que nos
embriões controle do aquário a proliferação celular ocorreu em todas as regiões do
embrião, não havendo sítios de proliferação (Figura 15).
61
Figura 15. Embrião controle do aquário em
E6 submetido à imunomarcação com fosfo
histona H3 evidenciando as células em
proliferação (detalhe) em todas as regiões
do embrião. Barra de escalas = 100 µm (a)
e 50 µm (b).
A partir destas observações, foi quantificado, através do cálculo do índice
mitótico, o número de células em proliferação nos embriões no estágio de pós-
nauplius inicial (E6). Este estágio caracteriza-se pela presença do LO, da PC e de
apêndices já desenvolvidos, além de permitir a confecção de preparados totais, de
modo que se pudesse realizar a quantificação das células no embrião como um
todo. Aparentemente, a região anterior do embrião foi a mais afetada pela radiação,
apresentando menor número de células em proliferação, tanto no grupo controle do
ambiente, como no irradiado com UV-B (Figura 16a - h).
62
Figura 16. Imunomarcação com fosfo histona H3 dos embriões de M. olfersi em E6,
observada em microscopia de fluorescência. Controle do aquário (a, e), controle do
ambiente (b, f), irradiado com UV-B (c, g) e controle negativo da reação imuno-
histoquímica (d). O esquema mostra as estruturas embrionárias (h). O gráfico
demonstra o índice mitótico nos grupos analisados. AN, apêndices naupliares; AP,
apêndices pós-naupliares; LO, lobo óptico; MV, massa de vitelo; PC, papila caudl.
Dados apresentados em média (± erro padrão). Asteriscos indicam diferenças
significativas entre os grupos (*, P ≤ 0,05) e (***, P ≤ 0,001), analisadas através de
ANOVA de uma via, seguida do teste de Tukey. n = 16 embriões por grupo. Barra de
escalas = 100 µm (a, c, d, f) e 50 µm (b, e).
Os embriões do grupo controle do aquário foram os que apresentaram maior
taxa de proliferação celular, sendo o índice mitótico igual a 0,17, diferindo
significativamente dos embriões do controle do ambiente (0,10; P ≤ 0,05) e
irradiados com UV-B (0,04; P ≤ 0,0001) (Figura 16i).
63
4.4. Análise da morte celular
A análise do material observado ao MET revelou tanto nos embriões dos
grupos controle do aquário, como nos do grupo controle do ambiente, um
predomínio de células com morfologia citoplasmática normal e com padrão típico de
organização nuclear da eucromatina e heterocromatina (Figura 17a, b, d). No
entanto, os embriões irradiados com UV-B apresentaram células com um padrão
morfológico nuclear comparável ao de núcleos apoptóticos, além de um grande
número de mitocôndrias com aspecto atípico (Figura 17c, e). Através do método de
TUNEL foram observados núcleos marcados nos embriões irradiados, comprovando
a fragmentação do DNA associada ao processo apoptótico (Figura 17f). O elevado
índice apoptótico (0,86) observado nos embriões irradiados com UV-B sugere que a
irradiância empregada esteja induzindo apoptose, além da ocorrência de apoptose
normal, esperada durante o desenvolvimento (Figura 17g).
64
Figura 17. Eletromicrogafias de embriões de M. olfersi dos grupos controle do
aquário (a), controle do ambiente (b) e irradiados com UV-B (c). Detalhe de célula
com núcleo típico e mitocôndrias íntegras (asterisco) (d) e de célula com morfologia
nuclear comparável ao de núcleo apoptótico, além de alterações na morfologia
mitocondrial (duplo asterisco) (e). Micrografia de embrião irradiado, mostrando
núcleos marcados pelo método de TUNEL (dupla cabeça de seta) (f). Eucromatina
(cabeças de seta), heterocromatina (setas), v = vitelo. O gráfico demonstra o índice
apoptótico nos grupos de embriões analisados. Dados apresentados em média (±
erro padrão). Asteriscos indicam diferenças significativas entre as médias dos
grupos (***, P ≤ 0,001), analisadas através de ANOVA de uma via, seguida do teste
de Tukey. n = cerca de 50 embriões por grupo. Barra de escalas = 5 µm (a, c), 2 µm
(b), 1 µm (d, e) e 10 µm (f).
As alterações mitocondriais observadas nos embriões irradiados com UV-B
podem ser decorrentes da LPO. Assim, procedeu-se à determinação dos níveis de
65
TBARS para avaliação da LPO nos embriões de M. olfersi. Esta análise demonstrou
que dentre os embriões de E1 – E6, o maior nível de TBARS foi observado no grupo
irradiado com UV-B (1,6 nmol/mg proteína ± 0,1), o qual diferiu significativamente
dos grupos controle do aquário (1,06 nmol/mg proteína ± 0,1; P ≤ 0,01) e controle do
ambiente (1,13 nmol/mg proteína ± 0,1; P ≤ 0,05). O mesmo padrão de LPO foi
observado para os embriões entre E7 – E14. Embriões irradiados com UV-B
apresentaram o maior nível de TBARS (2,04 nmol/mg proteína ± 0,2) quando
comparados com os do grupo controle do aquário (1,15 nmol/mg proteína ± 0,1;
P ≤ 0,01) e controle do ambiente (1,18 nmol/mg proteína ± 0,1; P ≤ 0,05) (Figura
18a).
Embora os embriões irradiados tenham apresentado os mais elevados níveis
de TBARS, foi necessário determinar os níveis de NPSH para avaliar a capacidade
não-enzimática de defesa antioxidante dos embriões. Nos estágios iniciais do
desenvolvimento, E1 – E6, os embriões do grupo controle do aquário foram os que
apresentaram maior nível de NPSH (35,2 nmol/mg proteína, ± 4,7), os quais
diferiram significativamente dos grupos controle do ambiente (21,9 nmol/mg
proteína, ± 0,8; P ≤ 0,01) e irradiado com UV-B (19,4 nmol/mg proteína, ± 1,6; P ≤
0,01). O mesmo perfil nos níveis de NPSH foi observado para os embriões entre E7
– E14. O grupo controle do aquário (24,1 nmol/mg proteína, ± 1,9) diferiu
significativamente dos grupos controle do ambiente (11,1 nmol/mg proteína, ± 1,3; P
≤ 0,001) e irradiado com UV-B (11,8 nmol/mg proteína, ± 0,8; P ≤ 0,001). É
interessante ressaltar que, comparando os embriões dos dois grupos controles, sem
olho E1 – E6 e com olho E7 – E14, os embriões mais jovens foram os que
apresentaram maior nível de defesas antioxidantes não-enzimática (Figura 18b).
66
Figura 18. Níveis de TBARS (a) e NPSH (b) de embriões de M. olfersi não-
irradiados e irradiados com UV-B, entre os estágios E1 – E6 e E7 – E14. Dados
apresentados em média (± erro padrão). Asteriscos indicam diferenças significativas
entre as médias dos grupos (*, P ≤ 0,05), (**, P ≤ 0,01) e (***, P ≤ 0,001) analisadas
através de ANOVA de uma via, seguida do teste de Tukey. n = número de fêmeas
por grupo, foram analisadas desovas inteiras de cada fêmea.
Adicionalmente, procedeu-se à análise da expressão de p53 em embriões
irradiados e não-irradiados, utilizando o estágio E6 (Figura 19a), pelas mesmas
razões já descritas no item 4.3. A partir desta análise constatou-se que a expressão
da proteína p53 nos embriões não-irradiados e irradiados é muito fraca (Figura 19b -
67
d). Também foram realizadas marcações para a proteína Bcl-2, que igualmente
apresentou fraca expressão nos embriões não-irradiados e irradiados com UV-B
(Figura 19e - g).
Figura 19. Imunomarcações com anti-p53 e anti-Bcl-2 realizadas em embriões de M.
olfersi em E6. (a) O colchete mostra vista dorsal da região cefálica do embrião,
apresentada nas figuras b,c,e,f. (b, c) Fraca expressão de p53 nos preparados totais
de embriões não-irradiados e irradiados observados em microscopia confocal. O
inserto mostra o controle negativo da reação imuno-histoquímica. (d) Detalhe de
uma região do embrião irradiado observado ao microscópio de luz, evidenciando a
baixa quantidade de células marcadas com anticorpo anti-p53. (e, f) Fraca
expressão da proteína Bcl-2 nos embriões não-irradiados e irradiados observados
em microscopia confocal. (g) Detalhe do embrião irradiado em corte histológico
observado ao mocroscópio de luz, evidenciando igualmente a baixa quantidade de
células marcadas com anticorpo anti-Bcl-2. AN, apêndices naupliares; AP, apêndices
pós-naupliares; LO, lobo óptico; PC, papila caudal; V, vitelo. n = cerca de 20
embriões (preparados totais) por grupo e por marcação. As marcações para estas
proteínas foram repetidas 4 vezes. Barra de escalas = 35 µm (a), 50 µm (b, c, e, f,
inserto), 10 µm (d, g).
68
O efeito da radiação UV-B sobre o processo de apoptose nos embriões de M.
olfersi foi investigado ainda através de imunomarcações com anticorpo anti-caspase-
3 ativa, que é uma das proteínas executoras no processo apoptótico. Os embriões
não-irradiados não apresentaram reatividade ao anticorpo, como mostra a Figura
20a. Contudo, embriões irradiados apresentaram forte reatividade ao anticorpo,
principalmente nas estruturas do sistema nervoso. Foram observadas marcações
tanto nos gânglios cerebrais (Figura 20b) como nos neurômeros torácicos e
abdominais, os quais participarão da formação do cordão nervoso ventral (Figura
20c).
Foram realizadas imunomarcações complementares utilizando anticorpos
específicos para as células do sistema nervoso, como o marcador axonal anti-Bp102
(Figura 20d) e o marcador de neurônios imaturos anti-β-tubulina III (Figura 20e). Tais
marcações evidenciaram a organização do sistema nervoso, que apresentava as
estruturas neurais embrionárias típicas, a exemplo do modelo de organização
proposto para os decápodes (Figura 20f).
69
Figura 20. Imunomarcação com anti-caspase-3 realizadas em embriões de M. olfersi
em E6, observadas em microscopia confocal. (a) Ausência de marcação para
caspase-3 nos embriões não-irradiados. (b) Vista dorsal da região anterior de
embrião irradiado com UV-B mostrando marcação positiva para caspase-3 nas
células dos gânglios cerebrais (cabeça de seta). (c) Vista lateral de embrião irradiado
mostrando a marcação positiva para caspase-3 nos neurômeros abdominais (dupla
cabeça de seta). O inserto mostra o controle negativo da reação imuno-histoquímica.
Imunomarcações realizadas para evidenciar a organização do sistema nervoso do
embrião (d) com anti-Bp102 no gânglio cerebral (cabeça de seta) e nos neurômeros
torácicos (dupla cabeça de seta) e (e) com β- tubulina III principalmente nos
neurômeros torácicos (dupla cabeça de seta) e neurópilos ópticos. (f) Padrão geral
de organização do sistema nervoso de decápodes, regionalizando os gânglios
cerebrais e os neurômeros torácicos (modificado de Harzsch et al., 1998) utilizado
como referencial para o reconhecimento do sistema nervoso de M. olfersi. AP,
apêndices pós-naupliares; GC, gânglios cerebrais; LO, lobo óptico; NO; neurópilos
ópticos; PC, papila caudal; V, vitelo. n = cerca de 30 embriões (preparados totais)
por grupo. As marcações para foram repetidas 5 vezes. Barras = 50 µm.
4.5. Análise da diferenciação celular
A partir dos resultados obtidos, referentes à marcação de caspase-3, que foi
bastante intensa nas células do sistema nervoso, passou-se a investigar se a
radiação UV-B poderia também comprometer os processos iniciais de diferenciação
70
das células deste sistema. Assim, procedeu-se à identificação dos neuroblastos
através da expressão dos genes engrailed/invected e even-skipped.
A imunomarcação em E6 (Figura 21a), utlizando o anticorpo anti-4D9, que
reconhece os produtos dos genes engrailed/invected demonstraram a reatividade
das células da PC dos embriões não-irradiados (Figura 21b). O perfil de marcação
observado indica que as células reativas ao anticorpo estão localizadas nos
segmentos abdominais e estão relacionadas à formação dos neurômeros
abdominais. Em embriões no mesmo estágio irradiados com UV-B, a marcação com
anti-4D9 foi mais tênue, sugerindo que a radiação pode comprometer a
diferenciação das células neuronais (Figura 21c). Marcações em outros estágios
mostraram o mesmo padrão entre embriões não-irradiados e irradiados com UV-B.
Figura 21. Imunomarcação com anti-4D9, para a detecção da expressão de
engrailed/invected observadas em microscopia confocal nos embriões de M. olfersi
em E6 (a). O colchete mostra vista dorsal da região caudal de preparado total de
embrião, apresentada nas figuras b, c. Expressão de engrailed/invected na região
abdominal (cabeças de seta) dos embriões não-irradiados (b). Fraca expressão de
engrailed/invected (cabeças de seta) em embriões irradiados com UV-B (c). O
inserto mostra o controle negativo da reação imuno-histoquímica. AN, apêndices
naupliares; AP, apêndices pós-naupliares; LO, lobo óptico; PC, papila caudal. n =
cerca de 30 embriões (preparados totais) por grupo. As marcações para esta
proteína foram repetidas 9 vezes. Barra de escalas = 35 µm (a), 50 µm (b, inserto),
10 µm (c).
71
A expressão de even-skipped foi avaliada através de imunomarcações com
anti-2B8 e anti-7H5 em embriões em E6 (Figura 22a). Nos embriões não-irradiados,
observou-se a reatividade nos neurópilos ópticos, nos gânglios cerebrais e nos
neurômeros torácicos (Figura 22b, d). Nos embriões irradiados foi observada fraca
marcação para anti-2B8, que detecta a expressão de even-skipped em neurônios
motores e interneurônios (Figura 22c). A expressão de even-skipped nos demais
neurônios, marcados com anti-7H5, foi menos afetada pela radiação (Figura 22e).
Figura 22. Imunomarcações com anti-2B8 e anti-7H5 para a detecção da expressão
de even-skipped no sistema nervoso em E6 (a). O colchete mostra região cefálica de
preparado total apresentada em b, c, d, e. Nota-se pronunciada expressão de anti-
2B8 nos neurópilos ópticos (cabeça de seta) e uma marcação tênue desse anticorpo
nos gânglios cerebrais (seta) (b). Fraca reatividade ao anticorpo anti-2B8 nos
embriões irradiados (c). Reatividade ao anticorpo anti-7H5 nos gânglios cerebrais
(seta), neurópilos ópticos (cabeça de seta) e neurômeros (dupla cabeça de seta) nos
embriões não-irradiados (d) e irradiados (e). O inserto mostra o controle negativo da
imuno-histoquímica. AN, apêndices naupliares; AP, apêndices pós-naupliares; LO,
lobo óptico; PC, papila caudal. n = 20 embriões por grupo. As marcações foram
repetidas 7 vezes. Barra de escalas = 35 µm (a), 50 µm (b - e, inserto).
72
Considerando o efeito da radiação UV-B sobre a diferenciação de
neuroblastos e de neurônios, além das alterações na curvatura da PC observadas
nos embriões irradiados, seria provável que esta radiação afetasse também a
diferenciação dos teloblastos. Assim, procedeu-se à marcação destas estruturas
embrionárias indiferenciadas utilizando-se o anticorpo anti-Oct-4. Nos embriões não-
irradiados, a expressão inicial de Oct-4 foi reconhecida no nauplius (E4) (Figura 23a,
b) e mantida durante a fase de pós-nauplius inicial em E5 (Figura 23c) e E6 (Figura
23d). Contudo, nos embriões irradiados, a expressão de Oct-4 não é reconhecida
em E4, E5 e E6 (Figuras 23e - g).
Figura 23. Imunomarcação de células embrionárias indiferenciadas de M. olfersi,
utilizando o anticorpo anti-Oct-4 em E6, observada em microscopia confocal.
Embrião no estágio de nauplius, E4, marcado com sonda fluorescente DAPI, para o
reconhecimento das estruturas naupliares (a). Expressão de Oct-4 nos teloblastos
(cabeça de seta) de embriões não-irradiados em E4 (b), E5 (c) e E6 (d). Ausência de
reatividade ao anticorpo anti-Oct-4 nos embriões em E4 (e), E5 (f) e E6 (g) irradiados
com UV-B. O inserto mostra o controle negativo da reação imuno-histoquímica. An,
antênula; At, antena; LO, lobo óptico; Md, mandíbula; PC, papila caudal; V, vitelo.
n = cerca de 30 embriões (preparados totais) por grupo. As marcações para esta
proteína foram repetidas 3 vezes. Barra de escalas = 25 µm (a), 50 µm (b - g,
inserto).
73
4.6. Análise da expressão de HSP 70
A expressão da proteína induzível HSP 70 foi investigada nos embriões em
E6 (Figura 24a - d). Em embriões não-irradiados não foi verificada a expressão desta
proteína (Figura 24b), contudo, nos embriões irradiados com UV-B foi verificada a
reatividade ao anticorpo anti-HSP 70 nos gânglios cerebrais (Figura 24c) e nos
neurômeros abdominais (Figura 24d).
Figura 24. Imunomarcação com anticorpo anti-HSP 70 nos embriões de M. olfersi
em E6 (a), observada em microscopia confocal. O colchete mostra vista dorsal da
região cefálica, apresentada nas figuras b, c e da região caudal apresentada na
figura d. Ausência da expressão de HSP 70 nos embriões E6 não-irradiados (b). Os
embriões irradiados com UV-B mostram reatividade ao anticorpo nos gânglios
cerebrais (dupla cabeça de seta) (c) e nos neurômeros abdominais (cabeças de
seta) (d). O inserto mostra o controle negativo da reação imuno-histoquímica. AN,
apêndices naupliares; AP, apêndices pós-naupliares; LO, lobo óptico; PC, papila
caudal. n = cerca de 30 embriões (preparados totais) por grupo. As marcações para
esta proteína foram repetidas 8 vezes. Barra de escalas = 35 µm (a), 50 µm (b - d,
inserto).
Considerando que tanto HSP 70, quanto caspase-3 foram evidenciadas no
sistema nervoso de embriões irradiados, procedeu-se à dupla marcação destas
proteínas nos embriões em E6 (Figura 25a), na tentativa de reconhecer se a
expressão de HSP 70 poderia interferir no processo apoptótico. Nos embriões
irradiados com UV-B não foi observada marcação simultânea das proteínas, de tal
74
modo que, quando houve expressão de HSP 70, não houve expressão de caspase-3
(Figura 25b - d) e vice-versa (Figura 25e - g).
Figura 25. Dupla imunomarcação com os anticorpos anti-HSP 70 e anti-caspase-3
nos embriões de M. olfersi em E6 (a) irradiados com UV-B e analisados em
microscopia confocal. O colchete mostra vista dorsal da região cefálica do embrião.
Expressão de HSP 70 nos gânglios cerebrais (cabeça de seta) (b), ausência de
expressão de caspase-3 (c) e sobreposição das marcações (d). Ausência de
expressão de HSP 70 (e), expressão de caspase-3, principalmente nos neurômeros
abdominais (cabeça de seta) (f) e sobreposição das marcações (g). O inserto mostra
o controle negativo da reação imuno-histoquímica. AN, apêndices naupliares; AP,
apêndices pós-naupliares; LO, lobo óptico; PC, papila caudal; V, vitelo. n = cerca de
20 embriões (preparados totais) por grupo. As marcações para estas proteínas
foram repetidas 3 vezes. Barra de escalas = 35 µm (a), 50 µm (b - g, inserto).
A análise da expressão de HSP 70 foi verificada ainda em cortes seriados de
embriões nos estágios finais do desenvolvimento. Mais uma vez, não foi reconhecida
expressão da proteína nos controles (Figura 26a), e nos embriões irradiados com
UV-B, a expressão de HSP 70 foi verificada apenas nas células fotorreceptoras no
olho (Figura 26b), as quais foram confirmadas pela marcação com anticorpo anti-β
75
tubulina III (Figura 24c). Nestas idades, foi evidenciada uma tênue marcação na
região do futuro pedúnculo óptico, especificamente nos neurópilos ópticos (Figura
26d), não sendo observada expressão de HSP 70 em nenhuma outra região do
embrião.
Figura 26. Imunomarcação com anticorpo anti-HSP 70 nos olhos de embriões de M.
olfersi em E13, observada em microscopia de luz e de fluorescência. Ausência da
expressão de HSP 70 nos embriões não-irradiados (a), enquanto que nos embriões
irradiados com UV-B a expressão de HSP 70 pode ser evidenciada nas células
fotorreceptoras (cabeças de seta) (b), as quais foram identificadas com anticorpo
anti-β tubulina III (c). Além das células fotorreceptoras (cabeça de seta), foi
observada fraca expressão de HSP 70 no futuro pedúnculo óptico (d). O inserto
mostra o controle negativo da reação imuno-histoquímica. NO, neurópilos ópticos.
n = cerca de 50 embriões por grupo e por marcação. As marcações para esta
proteína foram repetidas 4 vezes. Barra de escalas = 10 µm.
Do mesmo modo que em E6, procedeu-se à dupla marcação de HSP 70 e
caspase-3 nos olhos de embriões em E13 (Figura 27). Nos embriões não-irradiados
não foi observada a expressão de HSP 70 no olho, contudo, observou-se em
algumas células a expressão de caspase-3, que pode indicar o processo normal de
apoptose que ocorre durante o desenvolvimento embrionário (Figura 27a, d, g). Já
nos embriões irradiados, o perfil de marcação foi o oposto. Houve forte marcação
para HSP 70 e uma tênue expressão de caspase-3 (Figura 27b, c, e, f, h, i).
76
Figura 27. Dupla imunomarcação com os anticorpos anti-HSP 70 e anti-caspase-3
nos olhos de embriões de M. olfersi em E13, analisada em microscopia de
fluorescência. Nos embriões não-irradiados verificou-se a ausência de expressão de
HSP 70 (a), associada a reatividade ao anticorpo anti-caspase-3 em algumas células
do olho (d) e sobreposição das marcações (g). Nos embriões irradiados com UV-B,
verificou-se intensa expressão de HSP 70 (b, c) e fraca expressão de caspase-3 (e,
f) e sobreposição das marcações (h, i). Os insertos mostram imagens em
microscopia de luz das regiões apresentadas nas imagens obtidas com microscopia
de fluorescência. n = cerca de 50 embriões por grupo e por marcação. As
marcações para estas proteínas foram repetidas 3 vezes Barra de escalas = 10 µm.
4.7. Análise da formação de CPD
Considerando o efeito da radiação UV-B sobre a molécula de DNA, procedeu-
se à análise da formação de CPD em embriões em E6 (Figura 28a). Nos embriões
não-irradiados não foi observada a formação de CPD, especificamente entre timina-
timina e timina-citosina, reconhecidos pelo anticorpo utilizado (Figura 28b, c). Já nos
77
embriões irradiados com UV-B verificou-se a presença de CPD (Figura 28d, e), nas
diferentes regiões do corpo do embrião.
Figura 28. Imunomarcação com o anticorpo anti-dímeros de timina analisada em
microscopia confocal nos embriões de M. olfersi em E6 (a). Ausência de formação
de dímeros nos embriões não-irradiados (b, c). O inserto mostra o controle negativo
da reação imuno-histoquímica. Presença de dímeros de timina nos embriões
irradiados com UV-B (d, e). O inserto em (e) destaca a presença de dímeros (setas)
nas células embrionárias. n = cerca de 30 embriões (preparados totais) por grupo.
As marcações para esta proteína foram repetidas 3 vezes Barra de escalas = 35 µm
(a), 50 µm (b - e, inserto em c), 10 µm (inserto em e).
Por fim, a figura 29 sintetiza os diferentes efeitos da radiação UV-B sobre os
embriões de M. olfersi, no que se refere: à morfologia externa do embrião, à
morfometria dos ovos e à proliferação celular (Figura 29a); à apoptose (Figura 29b);
78
à diferenciação celular (Figura 29c); aos níveis de defesas antioxidantes não-
enzimática e de estresse oxidativo, à expressão de HSP 70 e aos danos no DNA
(Figura 29d).
Figura 29. Representação esquemática do conjunto de resultados referentes aos
efeitos da radiação UV-B em embriões de M. olfersi. (a) Ocorrência de expressivas
alterações na morfologia externa dos embriões, aumento no volume dos ovos e no
teor de água, diminuição da proliferação celular e nenhuma variação no índice do
olho. (b) Elevada ocorrência de núcleos com perfil comparável ao de núcleos
apoptóticos, pouca expressão das proteínas p53 e Bcl-2 e moderada expressão de
caspase-3. (c) Diminuição razoável nos níveis de engrailed/invected e even/skipped
e diminuição acentuada na expressão de Oct-4. (d) Aumento nos níveis de TBARS e
diminuição nos níveis de NPSH, moderada expressão de HSP 70 e de CPD. Setas
pequenas, médias e grandes significam efeito leve, moderado e acentuado,
respectivamente. Sentido das setas significa aumento (para cima) ou diminuição
(para baixo).
79
5. DISCUSSÃO
As alterações na camada de ozônio, o consequente aumento na incidência da
radiação UV-B na superfície terrestre, bem como os efeitos adversos que as
radiações causam nos organismos, têm sido amplamente documentados
(Williamson, 1995; Kirchhoff et al., 1996; Casiccia et al., 2003; Vernet, 2006; Young,
2006; Shanklin, 2010).
Neste trabalho, em particular, destacamos os ambientes aquáticos, pois são
alvo importante da radiação UV, devido à capacidade desta radiação de atingir
profundidades significativas e afetar os organismos, desencadeando uma série de
efeitos morfofisiológicos (Cywinska et al., 2000; Häder et al., 2003; 2007;
Bancroft et
al., 2007). Dentre os organismos aquáticos, os crustáceos têm sido utilizados como
modelo biológico em diferentes estudos sobre os efeitos da radiação UV-B em pós-
larvas e indivíduos adultos, no que se refere: ao efeito protetor dos cromatóforos
(Miner et al., 2000; Gouveia et al., 2004; 2005; Auerswald et al., 2008); aos danos no
sistema visual (Miguel et al., 2002; 2007; Vargas et al., 2010); à diminuição da
atividade das enzimas antioxidantes (Yu et al., 2009); à formação de CPD
(MacFadyen et al., 2004); ao aumento da expressão de proteínas de choque térmico
(Tartarotti e Torres, 2009). Estudos utilizando embriões de crustáceos abordam
principalmente o aumento na taxa de mortalidade dos embriões e a ocorrência de
larvas malformadas após a exposição à radiação UV (Naganuma et al.,1997; Hovel e
Morgan, 1999; Cywinska et al., 2000; Saito e Taguchi, 2003). Contudo, não são
conhecidos trabalhos que enfocam os efeitos da radiação UV-B sobre a proliferação,
80
apoptose e diferenciação das células embrionárias, bem como sobre as defesas
antioxidantes e estresse oxidativo de embriões de crustáceos.
Esta carência de estudos dificultou a comparação direta dos resultados entre
espécies de crustáceos, de tal modo que na maioria das análises comparativas
feitas aqui, se utilizou como referência embriões de outras espécies, principalmente
as aquáticas, e até mesmo células humanas adultas, como os queratinócitos que
são frequentemente empregados em estudos para elucidar os mecanismos de ação
da radiação UV. Essa possibilidade de comparação entre grupos distantes foi
possível devido ao caráter conservativo das moléculas e mecanismos celulares, a
exemplo das HSP, das proteínas anti- e pró-apoptóticas, das substâncias
antioxidantes e da própria molécula de DNA, além dos diversos mecanismos que
envolvem tais moléculas.
De um modo geral, os estágios embrionários e larvais são mais sensíveis aos
estressores ambientais, como a radiação UV-B, do que os indivíduos em estágios
mais tardios do ciclo de vida (Epel et al., 1999; Charron et al., 2000; Bonaventura et
al., 2006; Bancroft et al., 2007). Portanto, estudos que contribuam para a
compreensão dos efeitos da radiação UV durante o desenvolvimento, bem como os
tipos de respostas celulares acionadas em embriões e larvas poderão contribuir para
uma avaliação mais abrangente da ação da radiação UV.
Neste sentido, no presente trabalho foram analisados diferentes parâmetros
para diagnosticar o efeito da radiação UV-B em embriões de M. olfersi, tendo sido
demonstrado que o desenvolvimento embrionário foi seriamente comprometido
quando fêmeas ovígeras e consequentemente, seus embriões, foram expostos à
irradiância de 310 mW/cm
2
de radiação UV-B.
81
5.1. O efeito da radiação UV-B sobre morfologia dos embriões e sua relação
com os mecanismos de proliferação e diferenciação celular
Embora a irradiância utilizada tenha provocado uma série de alterações
morfológicas e celulares nos embriões, não foi suficiente para afetar a duração do
desenvolvimento embrionário de M. olfersi. Resultados controversos em relação ao
efeito da radiação sobre o tempo de desenvolvimento têm sido reportados. Em
embriões de sapos Hyla regilla e Hyla cadavarina (Anzalone et al., 1998) e de peixes
G. morhua (Lesser et al., 2001a) e D. rerio (Dong et al., 2007), a radiação UV-B não
comprometeu o tempo de desenvolvimento. Contudo, atrasos no desenvolvimento
foram relatados para espécies de ouriço-do-mar P. lividus (Bonaventura et al., 2005)
e S. granularis (Nahon et al., 2009). Estes resultados mostram que o efeito da
radiação UV-B sobre o ritmo de desenvolvimento pode ser mutável e as variações
observadas podem estar relacionadas às estratégias reprodutivas das espécies,
como a fecundidade - elevada fecundidade está relacionada a ovos que apresentam
rápido desenvolvimento – e à presença de complexos envelopes ovulares que
podem atenuar os efeitos da radiação. Parâmetros físicos, como a temperatura,
podem também modificar a sensibilidade à radiação UV-B, como demonstrado para
embriões e larvas de sapo L. peronii, nos quais os efeitos adversos da radiação
foram mais pronunciados à temperatura de 20ºC do que à 30ºC (van Uitregt et al.,
2007).
Dentre as alterações observadas em M. olfersi, o aumento nas dimensões
dos ovos irradiados com UV-B foi bastante expressivo. Considerando que houve
uma diminuição no índice mitótico, é possível então que o aumento no volume dos
ovos não tenha sido decorrente do crescimento dos embriões, mas provavelmente
82
do significativo aumento no teor de água verificado nos ovos irradiados. A absorção
de água pelos ovos durante o desenvolvimento é necessária para permitir maior
mobilidade do embrião durante a sua organização estrutural e crescimento corporal
(Green, 1965; Kobayashi e Matsuura, 1995). Contudo, alterações no equilíbrio
hídrico dos ovos podem comprometer negativamente a mobilidade dos embriões e
das futuras larvas. De acordo com Cywinska et al. (2000), ovos de três espécies de
microcrustáceos, C. vidua, H. azteca e D. magna, apresentaram alteração no
balanço hídrico após a irradiação com UV-B e geraram larvas com movimentos
anômalos, paralisia parcial e até mesmo completa imobilidade. No presente trabalho,
observou-se a presença atípica de gotas de água no meio dos grânulos de vitelo, o
que provocou um visível aumento da massa de vitelo, que passou a ocupar um
espaço maior no ovo em detrimento do espaço disponível para o embrião.
Dentre as alterações morfológicas externas observadas nos embriões de M.
olfersi, as mais expressivas foram as alterações na pigmentação dos olhos. A
presença de uma pigmentação esbranquiçada nos olhos dos embriões, certamente
confere maior opacidade às lentes do olho, podendo ser comparável à opacidade
observada na catarata, o que sem dúvida traz comprometimento à função visual das
larvas. Embora a catarata seja resultante da exposição crônica à radiação UV-B,
tendo sido amplamente reportada no olho humano (Hoover, 1986; Gallagher and
Lee, 2006;
Young, 2006), a opacidade nos olhos de M. olfersi pode ter sido uma
reação cromática mais imediata à exposição aguda à radiação. Em espécies
aquáticas, o início do processo de formação de catarata foi observado em
exemplares de truta Oncorhynchus mykiss (Doughty et al., 1997)
e danos nucleares
83
e citoplasmáticos foram observados nas células da retina do caranguejo U. cordatus
(Miguel et al., 2002), após exposição aguda à radiação UV-B e UV-C.
A pigmentação esbranquiçada nos olhos dos embriões, verificada após a
irradiação em laboratório, foi igualmente observada em embriões coletados
diretamente do ambiente, os quais estavam expostos à radiação solar natural,
mostrando que no ambiente natural os embriões estão provavelmente sujeitos a
irradiâncias que podem desencadear efeitos que comprometam a viabilidade larval.
Embora essa pigmentação tenha também sido observada nos embriões do controle
do aquário, a frequência registrada nesse grupo foi menor, além do que, a área do
olho comprometida com tal pigmentação foi muito mais restrita.
Mesmo havendo alterações no formato e pigmentação dos olhos, o índice do
olho calculado para os embriões irradiados com UV-B e para os embriões dos
controles do ambiente e do aquário não variou significativamente. Este resultado
pode ter duas interpretações: (1) que a irradiância empregada não tenha induzido
alterações estruturais significativas, principalmente quanto ao crescimento dos olhos
ou (2) que a metodologia empregada, avaliando apenas os embriões com olhos
aparentemente normais, tenha mascarado possíveis alterações.
Ainda na tentativa de investigar os efeitos da radiação UV-B sobre os olhos
dos embriões, um resultado interessante foi observado na expressão de HSP 70.
Apenas nas células fotorreceptoras no olho foi observada a expressão desta
proteína, sugerindo a ativação de um mecanismo de resposta ao fator estressor, a
radiação UV-B. A marcação simultânea de HSP 70 e caspase-3 nos olhos de
embriões irradiados mostrou forte marcação para HSP 70 e pouca expressão de
caspase-3, ao contrário do controle do aquário. De acordo com a literatura, a
84
expressão de HSP 70 induz resistência à apoptose, inativando as caspases
executoras, como a caspase-3, contribuindo assim para a sobrevivência celular
(Samali e Cotter, 1996; Jäättelä, 1999; Li et al., 2000; Park et al., 2000; Belay e
Brown, 2003). É possível que o aumento na expressão de HSP 70 no olho de
embriões de M. olfersi tenha sido responsável pela proteção desta estrutura
embrionária, uma vez que as formas atípicas dos olhos não foram frequentes. Por
outro lado, a inativação das caspases pode ter contribuído negativamente para a
manutenção de células alteradas, o que talvez esteja relacionado com as
morfologias atípicas observadas nos olhos. Esta última suposição está
fundamentada no trabalho de Bonaventura e colaboradores (2006), que
demonstraram que em embriões de ouriço-do-mar irradiados com UV-B no estágio
de 16 blastômeros, a elevada expressão da proteína HSP 70 não foi capaz de
reduzir a ocorrência de embriões e larvas malformadas.
A segunda alteração mais freqüente observada externamente nos embriões
irradiados com UV-B foi a presença de cromatóforos atípicos. Nos embriões de M.
olfersi os cromatóforos tornam-se visíveis por volta de E6. Assim, a freqüência de
cromatóforos atípicos observada nos embriões irradiados com UV-B no grupo de
entre E1 – E6 corresponde somente aos embriões em E6. Já no grupo entre E7 –
E14, a presença de cromatóforos atípicos foi observada de forma expressiva, além
dos irradiados com UV-B, também nos embriões do controle do ambiente, mais uma
vez indicando que a radiação solar natural está desencadeando efeitos adversos
durante a embriogênese de M. olfersi. Cromatóforos atípicos como os observados
neste trabalho não têm sido reportados na literatura. As alterações nos cromatóforos
descritas na literatura estão relacionadas às mudanças na pigmentação em resposta
85
à exposição à radiação UV-B, como as observadas em larvas de microcrustáceos,
C. vidua, H. azteca e D. magna por Cywinska et al. (2000); em larvas de C.
oregonensis e T. cheiragonus por Miner et al. (2000); e em embriões de Artemia
franciscana por Tanguay et al. (2004).
De um modo geral, nos embriões de crustáceos, os cromatóforos contêm
pigmentos carotenóides que são eficientes na absorção da radiação UV (Sagi et al.,
1995; Liñán-Cabello et al., 2002; Bjerkeng, 2008). Nos embriões de M. olfersi, a
opacidade das células embrionárias sugere que a proteção conferida pelos
pigmentos não foi bem sucedida, uma vez que nos embriões normais, tanto as
células embrionárias como o cório são transparentes. Além da opacidade das
células, outra conseqüência da ineficiente proteção dos pigmentos é a ocorrência de
estresse oxidativo (Charron et al., 2000), a qual será abordada mais adiante. De um
modo geral, os carotenóides atuam na prevenção de LPO interagindo com radicais
peróxidos (Young e Lowe, 2001; Stahl e Sies, 2003; Dahms and Lee, 2010), porém
considerando que os cromatóforos ficaram bastante alterados após a irradiação,
talvez a função de prevenir a LPO tenha sido prejudicada nos embriões de M. olfersi.
Formas atípicas das estruturas embrionárias, como a PC, LO e AN
observadas neste trabalho podem ser resultantes de alterações no processo de
proliferação celular, demonstrado pelo baixo índice mitótico observado nos embriões
irradiados. Evidentemente, mudanças na taxa de proliferação das células
embrionárias comprometem a morfogênese e podem resultar nas formas atípicas
acima mencionadas. É sabido que durante o desenvolvimento, as divisões celulares
são bastante rápidas (Gilbert, 2000; Wolpert et al., 2002), e que na presença de
danos ao DNA, toda a maquinaria celular é ativada para tentar reparar os danos, a
86
exemplo da proteína p53 que atrasa o ciclo celular, e que será abordada adiante. A
velocidade da divisão e, em função disso, a possibilidade de não ter havido tempo
hábil para o reparo, pode ter causado um comprometimento da divisão, evidenciado
pela redução do índice mitótico.
As formas atípicas da PC, observadas externamente nos embriões de M.
olfersi, podem ter sido causadas pela aparente perda da multipotencialidade dos
teloblastos nos embriões irradiados. Os teloblastos são células indiferenciadas, que
se originam na base da PC, estando arranjadas em fileiras ordenadas e são as
células-fonte dos tecidos derivados do ectoderma e do mesoderma na região
posterior do embrião (Anderson, 1973; Dohle e Scholtz, 1997, Scholtz et al., 2009). A
divisão ordenada dos teloblastos, denominada teloblastia, é a responsável pelo
alongamento da parte posterior do embrião (Andreson, 1973). Durante o processo
inicial de teloblastia as células permanecem indiferenciadas, tendo sido
reconhecidas neste trabalho pelo marcador de células embrionárias indiferenciadas,
o anticorpo anti-Oct-4. Nos embriões não-irradiados, a expressão inicial de Oct-4 foi
reconhecida no nauplius (E4) e mantida durante a fase de pós-nauplius inicial (E5 e
E6). Contudo, nos embriões irradiados com UV-B, a expressão desse anticorpo não
foi reconhecida, demonstrando o efeito adverso da radiação sobre a diferenciação
das células ecto- e mesodérmicas da região caudal do embrião. Considerando que a
expressão de Oct-4 parece ser requerida para a manutenção do estado
indiferenciado da célula (Schöler et al., 1990), pode-se supor que a radiação UV-B
tenha alterado essa condição, de modo que as células da PC iniciaram
precocemente o processo de diferenciação, o que pode ter resultado nas formas
atípicas da parte posterior do corpo do embrião. A redução na expressão de Oct-4
87
também foi observada em células tronco indiferenciadas de camundongo após a
exposição à radiação UV (Guo et al., 2008), porém estudos dessa natureza em
invertebrados não têm sido reportados na literatura.
5.2. A radiação UV-B induz apoptose nos embriões de M. olfersi
Neste trabalho, outro efeito da radiação UV-B observado nos embriões de M.
olfersi foi a indução à apotose. O mecanismo de morte celular por apoptose é
extremamente necessário para os processos de morfogênese e organogênese (Kerr
et al., 1972; Jacobson et al., 1997; Doseff, 2004), porém alterações no sentido de
aumentar ou inibir a ocorrência de apoptose podem gerar consequências
morfológicas e fisiológicas adversas para os embriões. A indução à apoptose em
decorrência da radiação UV-B parece ser um mecanismo de defesa, na tentativa de
reduzir o número de células alteradas que não foram eficientes em seus reparos
(Kulmz e Schwars, 2002; Epel, 2003; Zhou e Steller, 2003).
As primeiras evidências de apoptose nos embriões irradiados, neste trabalho,
foram obtidas através de análises pelo método de TUNEL e em MET. Além do
reconhecimento de fragmentação do DNA e da morfologia nuclear típica das células
apoptóticas, foi evidenciada uma expressiva quantidade de mitocôndrias alteradas
nos embriões irradiados com UV-B. Um dos fatores que pode acarretar alterações
mitocondriais é a LPO, que por sua vez pode ser induzida pela radiação UV-B
(Obermüller et al., 2005; Franco et al., 2009). Nossos resultados mostraram que
embriões irradiados com UV-B apresentaram aumento significativo nos níveis de
TBARS, indicativo de ocorrência de LPO, que pode ter sido o fator desencadeador
das alterações mitocondriais observadas. Esta hipótese foi fortalecida pelos baixos
88
níveis de substâncias antioxidantes não-enzimática nos embriões irradiados,
quantificada pelos níveis de NPSH. Tais substâncias, entre elas a GSH, poderiam ter
neutralizado as ROS, evitando ou diminuindo a ocorrência de LPO. Assim, os baixos
níveis de NPSH e os elevados níveis de TBARS observados nos embriões irradiados
com UV-B indicam que esta radiação está comprometendo as funções antioxidantes
não-enzimática das células embrionárias de M. olfersi, induzindo o estresse
oxidativo.
Em crustáceos, estudos sobre a indução ao estresse oxidativo pela radiação
UV têm sido conduzidos principalmente com indivíduos adultos, demonstrando que
esta radiação altera o sistema de defesa antioxidante em diferentes espécies. Dentre
estes estudos destacamos o realizado por Vega e Pizzaro (2000), que
demonstraram aumento nos níveis de LPO após a exposição à radiação UV-A e UV-
B de cladóceros adultos da espécie Daphnia longispina; o estudo realizado por Yu e
colaboradores (2009), no qual a diminuição da atividade das enzimas antioxidantes
em copépodes adultos da espécie S. inopinus foi demonstrada após irradiação com
UV-B; e o estudo realizado por Vargas e colaboradores (2010) que evidenciaram o
aumento nos níveis de LPO, após irradiação com UV-A e UV-B, no sistema visual de
exemplares adultos do caranguejo N. granulata em diferentes regimes de
fotoperíodo.
Embora embriões de espécies aquáticas como do peixe G. morhua (Lesser et
al 2001a), da salamandra Ambystoma maculatum (Lesser et al., 2001b), do ouriço-
do-mar S. droebachiensis (Lesser et al., 2003) e do sapo B. arenarum (Herkovits et
al., 2006) tenham apresentado aumento da atividade da enzima antioxidante SOD
após a exposição à radiação UV, elevadas taxas de mortalidade e baixas taxas de
89
eclosão foram também registradas para estas espécies. Estes resultados mostram
mais uma vez que, apesar de os embriões apresentarem seus sistemas de defesas
ativados, os efeitos da radiação UV são bastante complexos e podem provocar
danos irreversíveis aos indivíduos e até mesmo às populações.
Uma característica interessante observada no desenvolvimento de M. olfersi
foi o fato de os embriões nos estágios mais iniciais terem apresentado níveis mais
elevados de defesas antioxidantes, em comparação com os embriões nos estágios
mais tardios do desenvolvimento. Esta condição provavelmente está relacionada
com a grande quantidade de vitelo presente nos ovos no início do desenvolvimento
e, portanto, com consideráveis quantidades de pigmentos carotenóides, como
descrito para os crustáceos por Sagi et al. (1995) e Liñán-Cabello et al. (2002). Tais
pigmentos, como já dito anteriormente, são potentes substâncias antioxidantes
(Stahl e Sies, 2003). Segundo Hamdoun e Epel (2007), a presença de elevados
níveis de defesas antioxidantes nos estágios iniciais do desenvolvimento é
considerada uma resposta adaptativa frente às adversidades ambientais, até que os
embriões atinjam estágios mais avançados e com células diferenciadas.
De volta às alterações nucleares e mitocondriais observadas nas análises
ultraestruturais de embriões de M. olfersi, estas últimas foram possivelmente
causadas pela LPO, conforme os níveis de TBARS e NPSH verificados nos
embriões irradiados. Assim, é provável que tenha ocorrido liberação de citocromo c
para o citoplasma, o qual está envolvido em uma cascata de eventos que culmina
com apoptose. Então, uma das possíveis vias de indução à apoptose em embriões
irradiados de M. olfersi pode ter sido através da liberação de citocromo c. Esta é
uma possibilidade viável, pois nos embriões irradiados foi observada intensa
90
marcação de caspase-3 ativa, que está envolvida nas etapas finais da cascata de
eventos apoptóticos decorrentes da liberação de citocromo c (Kulms e Schwarz,
2002; Franco et al., 2009). Outro indicativo da ocorrência desta via apoptótica foi a
fraca expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2. A presença desta proteína está
associada com a manutenção das propriedades das membranas mitocondriais
(Hildesheim e Fornace, 2004; Franco et al., 2009), assim, a reduzida expressão de
Bcl-2 sugere fortemente que pode ter ocorrido a liberação de citocromo c para o
citoplasma.
A apoptose pode ter sido ainda induzida pela ocorrência de danos no DNA e
uma das formas de investigar esta via apoptótica é por meio da expressão da
proteína p53 (Zhou e Steller, 2003; Dahms e Lee, 2010). Na presença de danos no
DNA, verifica-se um aumento na expressão desta proteína, que atua atrasando o
ciclo celular até o dano ser reparado. Porém, uma superexpressão desta proteína
desencadeia uma série de eventos que promovem a liberação de citocromo c e a
ocorrência de apoptose (Kulms e Schwarz, 2002; Hildesheim e Fornace, 2004).
Contudo, embriões de M. olfersi irradiados com UV-B apresentaram uma fraca
expressão de p53, sugerindo que esta parece não ter sido a principal via de indução
à apoptose. Este resultado está coerente com as marcações feitas para a
identificação de CPD, pois uma discreta formação de dímeros foi reconhecida nos
embriões irradiados com UV-B. Contudo, o esperado, diante dos diferentes efeitos
da radiação UV-B sobre os embriões de M. olfersi, seria uma expressiva formação
de CPD, uma vez que este tipo de dano é referido na literatura como induzido
especificamente pela radiação UV (Goodsell, 2001; Ravanat et al., 2001; Epel, 2003;
Cadet et al., 2005; Dahms e Lee, 2010).
91
Uma explicação para a reduzida formação de CPD é o provável reparo a este
tipo de dano, que pode ter ocorrido durante os quatros dias decorridos desde a
irradiação até o momento das análises. Considerando que os embriões
permaneceram no escuro, o reparo mediado por fotoliase não é plausível, pois esta
enzima necessita de luz visível e radiação UV-A para reverter o dano no DNA,
através do mecanismo de fotorreativação (Sinha e Häder, 2002; Weber, 2005).
Assim, provavelmente, o reparo ativado foi por NER, um mecanismo bastante
eficiente e conservado na escala animal (Dahms e Lee, 2010). Vários trabalhos em
crustáceos demonstram a ocorrência de reparo aos danos no DNA por
fotorreativação (Naganuma et al., 1997; Hovel e Morgan, 1999; Cywinska et al.,
2000; Wiegand et al., 2004; Yu et al., 2009). Já o reparo por NER tem sido menos
enfocado nos estudos conduzidos com crustáceos. MacFadyen e colaboradores
(2004) demonstraram que tanto a fotorreativação como NER contribuem para a
redução de danos causados pela radiação UV em D. magna em três diferentes
temperaturas (5, 15 e 25ºC). Contudo, este estudo mostra que nestas três condições
a maior frequência de reparo foi por NER, indicando a relevância deste mecanismo
de reparo, embora a fotorreativação seja considerada mais rápida e econômica para
a célula (Kulms e Schwarz, 2002; Sinha e Häder, 2002; Weber, 2005).
5.3.
O sistema nervoso como alvo da radiação UV-B
Um fato interessante observado durante a análise da apoptose foi a
expressiva marcação de caspase-3 no sistema nervoso de embriões de M. olfersi
irradiados com UV-B. Evidências de apoptose em estruturas neurais de exemplares
adultos do caranguejo U. cordatus, especificamente na lâmina ganglionar foram
92
demonstradas por Miguel e colaboradores (2002), através do reconhecimento da
perda da integridade das membranas nucleares, presença de fragmentos de
cromatina condensada e/ou condensação da cromatina após a irradiação com UV-B
e UV-C. Mais recentemente Miguel e colaboradores (2007) demonstraram que tanto
a radiação UV-B como a UV-C induzem apoptose na lâmina ganglionar, evidenciada
pelo método de TUNEL e por marcação imuno-histoquímica das proteínas Bax e
p53. No entanto, poucos são os trabalhos que evidenciam o efeito da radiação UV
no sistema nervoso de animais adultos. Mais escassas ainda são as referências
sobre o efeito da radiação UV sobre o sistema nervoso de embriões.
Considerando a marcação de caspase-3 no sistema nervoso de embriões de
M.olfersi irradiados supôs-se que a radiação UV-B pudesse também comprometer os
processos iniciais de formação do sistema nervoso, interferindo na diferenciação dos
neuroblastos. Assim como nos demais decápodes, os neuroblastos de M. olfersi são
células volumosas e indiferenciadas, que se dividem de forma assimétrica originando
um novo neuroblasto e uma célula menor, a célula ganglionar-mãe. Esta última se
divide apenas uma vez, originando dois neurônios, enquanto que os neuroblastos
passam por novas ondas de divisão assimétrica (Anderson, 1973; Scholtz, 1992;
Harzsch et al., 1998). Para investigar o efeito da radiação UV-B sobre a
diferenciação foram utilizados três marcadores: um para neurônios e neuroblastos
que já tenham se dividido várias vezes (engrailed/invected, anticorpo anti-4D9);
outros dois marcadores para neurônios (even-skipped, anticorpos anti-2B8 e anti-
7H5). Os resultados mostram que a radiação interfere de modo sutil na expressão de
4D9 e 7H5. Contudo, a diminuição na expressão de 2B8 nos embriões irradiados
pode acarretar em alteração na diferenciação inicial de neurônios motores e
93
interneurônios, de acordo com as descrições de Patel et al. (1989) e Harzsch (2003).
Mais uma vez, destaca-se a carência de estudos que enfoquem o efeito da radiação
UV sobre a ontogenia do sistema nervoso de crustáceos e de outras espécies
aquáticas.
O efeito da radiação UV-B sobre o sistema nervoso pôde ainda ser
evidenciado pela expressão de HSP 70. Embriões irradiados apresentaram forte
expressão desta proteína nos gânglios cerebrais e nos neurômeros abdominais,
indicando a ativação de um mecanismo de resposta celular ao insulto provocado
pela radiação. Assim como observado nos olhos dos embriões irradiados com UV-B,
a expressão de HSP 70 parece inativar a caspase-3, de modo a tentar recuperar os
danos induzidos pela radiação e assim favorecer a sobrevivência celular (Samali e
Cotter, 1996; Jäättelä, 1999; Li et al., 2000; Park et al., 2000; Belay e Brown, 2003).
O presente trabalho aponta para o sistema nervoso dos embriões como um
alvo relativamente específico da radiação UV-B. A princípio este foi um resultado
inesperado, pois o mais provável seria que a radiação afetasse as células
embrionárias de modo generalizado. Outra característica relevante foi que o efeito
da radiação sobre o sistema nervoso foi observado principalmente nos embriões
mais jovens, no início dos processos de morfogênese e organogênese.
Considerando estes fatos, pode-se especular que o sistema nervoso tenha sido alvo
da radiação devido às próprias características do desenvolvimento deste sistema, a
exemplo de outros decápodes (Scholtz, 1992; Scholtz e Dohle, 1996; Harzsch et al.,
1998; Harzsch, 2003), dentre as quais destacamos: (1) a precocidade de
diferenciação de suas células, pois os neuroblastos podem ser reconhecidos já na
formação inicial do disco germinativo; (2) a manutenção de células-fonte durante a
94
diferenciação neural; (3) o fato de a divisão coordenada dos neuroblastos e a
expressão de genes engrailed/invected e even/skkiped contribuírem para o
estabelecimento do eixo ântero-posterior do embrião. Assim, pode-se especular a
razão das células do sistema nervoso terem sido alvo da radiação UV-B, pois no
inicio do desenvolvimento tais células encontram-se em intensa atividade de
diferenciação, muito mais do que as células derivadas do meso- e endoderma.
Diante desta realidade, o estudo dos efeitos da radiação UV sobre o sistema
nervoso de embriões constitui uma interessante e inexplorada área de estudo, para
a qual este trabalho está contribuindo.
Por fim, os resultados do presente trabalho apontam para um conjunto
significativo de efeitos adversos da radiação UV-B sobre os embriões de camarões
de água doce M. olfersi, que está sumarizado na figura 30.
As alterações morfológicas observadas nos embriões irradiados podem ser
resultantes de interferências no processo de diferenciação celular, principalmente
dos teloblastos (Oct-4) e neuroblastos (even/skipped), além do aumento da
ocorrência de apoptose e da diminuição das taxas de proliferação celular. Este
desequilíbrio entre proliferação e morte certamente comprometeu a morfogênese de
forma bastante significativa. As evidências apontam para a indução à apoptose
através das alterações nas membranas mitocondriais decorrentes da LPO. Já a
ocorrência de danos ao DNA não pareceu ser determinante na indução à apoptose.
95
Figura 30. Sumário dos efeitos da radiação UV-B nas células de embriões de
M. olfersi, destacando: o papel da LPO associada à fraca proteção conferida pela
Bcl-2 na indução à apoptose; a possível indução à apoptose em decorrência de
danos no DNA; o provável papel da HSP 70 inibindo as caspases efetoras e
possibilitando a sobrevivência celular; o comprometimento da diferenciação celular
no sistema nervoso pela redução na expressão de Oct-4 e even/skipped. Em
conjunto tais efeitos podem desencadear alterações morfológicas, como as
reconhecidas nos embriões irradiados. Diferentes setas indicam a intensidade e o
sentido dos efeitos da radiação UV-B. Os tracejados indicam o possível efeito da
radiação.
A relevância destes resultados pode ser enfatizada por dois aspectos
principais: primeiro, porque muitas das alterações observadas em laboratório foram
também observadas no ambiente natural, sugerindo que faixas de comprimentos de
onda do espectro solar que atingem a superfície da terra estejam comprometendo o
desenvolvimento normal destes embriões. Tais comprometimentos podem afetar o
futuro desempenho larval, podendo ser decisivos para a sobrevivência de larvas e
96
juvenis, acarretando em implicações diretas na dinâmica populacional de M. olfersi
e, consequentemente, na dinâmica dos ecossistemas de água doce, onde estes
camarões desempenham importante papel ecológico. Segundo, porque a maioria
dos resultados apresentados neste trabalho, referentes aos danos da radiação UV-B
nas células embrionárias, principalmente das células do sistema nervoso, não têm
equivalências na literatura corrente para crustáceos. E, considerando as
características do desenvolvimento de M. olfersi, além do caráter conservativo dos
mecanismos celulares, o estudo sobre os efeitos da radiação UV-B nas células
embrionárias destes animais poderá ajudar a elucidar de modo mais abrangente os
efeitos da radiação UV nos organismos.
Com base nestes resultados pode-se ainda propor a utilização de M.olfersi
como bom modelo de bioindicador nos estudos de biomonitoramento da qualidade
ambiental. Sem dúvida, torna-se cada vez mais imprescindível ampliar as
abordagens de estudo para que se possa reconhecer, compreender e, por que não,
prever as possíveis conseqüências decorrentes das atuais mudanças ambientais
globais.
97
6. CONCLUSÕES
No presente trabalho os resultados demonstraram através de análises
morfométricas, macro- e micro-morfológicas, além de ensaios bioquímicos, os
efeitos induzidos pela radiação UV-B nos embriões do camarão de água doce M.
olfersi. Assim, podemos concluir:
1- A radiação UV-B induz alterações morfológicas expressivas, tanto nos
embriões nos estágios mais iniciais, como naqueles que se encontram nos estágios
finais do desenvolvimento;
2- O olho foi a estrutura embrionária com maior frequência de alterações nos
embriões irradiados com UV-B e nos embriões controle do ambiente. Nesta
estrutura, a expressão de HSP 70 parece ter sido um mecanismo de defesa, até
certo ponto eficiente, pois morfologias atípicas do olho decorrentes da manutenção
de células alteradas foram pouco freqüentes;
3- As alterações nos cromatóforos decorrentes da exposição à radiação podem
ter contribuído para o comprometimento da função antioxidante dos pigmentos
carotenóides e assim ter favorecido para a ocorrência de LPO;
4- A ocorrência de LPO parece ter sido determinante na indução à apoptose nos
embriões irradiados, visto que os baixos níveis de p53 e de Bcl-2, associados com a
pouca frequência de CPD, indicam que não foram os danos no DNA o principal
gatilho para a apoptose;
98
5- As características da expressão de caspase-3 e de HSP 70 no sistema
nervoso dos embriões durante os estágios iniciais da morfogênese e organogênese
de M. olfersi indicam que este sistema é alvo da radiação e que a HSP 70 está
envolvida na recuperação dos danos, favorecendo a sobrevivência celular;
6- A radiação UV-B comprometeu o processo de diferenciação dos teloblastos,
reconhecidos pelo marcador Oct-4, e possivelmente das linhagens ecto- e
mesodérmicas, o que pode estar relacionado com as alterações morfológicas
observadas na parte posterior do corpo do embrião derivada da papila caudal;
7- O efeito específico da radiação UV-B nas células da linhagem ectodérmica foi
reconhecido pela fraca marcação de even/skipped (anti-2B8), o que pode interferir
na diferenciação de neurônios motores e interneurônios, derivados dos
neuroblastos;
8- O conjunto de efeitos adversos induzidos pela radiação UV-B nos embriões,
observado inclusive no ambiente natural, pode comprometer o futuro desempenho
das larvas e juvenis, alterando diretamente as populações de M. olfersi e a dinâmica
dos ecossistemas de água doce;
9- Embriões de M. olfersi mostraram-se adequados para os estudos dos efeitos
da radiação UV em ambiente naturais e em laboratório, podendo ser propostos como
bom modelo biológico tanto nos trabalhos de biomonitoramento dos ambientes
aquáticos, como nos estudos dos efeitos celulares desta radiação.
99
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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www. ncbi.nlm.nih.gov. Acesso em abril de 2010.
www.sciencebuddies.org. Acesso em abril de 2010.
119
8. ANEXOS
8.1. Publicação resultante do trabalho da Tese
NAZARI E.M., AMMAR D., DE BEM A.F., LATINI A., MULLER Y.M.R., ALLODI S.
2010. Effects of environmental and artificial UV-B radiation on freshwater prawn
Macrobrachium olfersi embryos. Aquat Toxicol., 98: 25-33.
8.2. Publicações em colaboração com a equipe do Laboratório de Reprodução
e Desenvolvimento Animal/BEG/CCB/UFSC
AMMAR D., NAZARI E.M., ALLODI S., MÜLLER Y.M.R. CaMKII in the brain of a
freshwater prawn: what can in situ characterization tell us about its significance for
Decapod neurobiology? Cell Tissue Res, submetido em jun/2010–CTR–10–1078.
KOBUS K.; NAZARI E.M.; MÜLLER Y.M.R. 2009. Effects of folic acid and
homocysteine on spinal cord morphology of the chicken embryo. Histochem. Cell
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AMMAR D., NAZARI E.M., MÜLLER Y.M.R., ALLODI S. 2008. New insights on the
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MÜLLER Y.M.R., RIVERO L.B.D., CARVALHO M.C., KOBUS K., FARINA M.,
NAZARI E.M. 2008. Behavioral impairments related to lead-induced
developmental neurotoxicity in chicks. Arch. Toxicol., 82: 445-451.
CARVALHO M.C., NAZARI E.M., FARINA M., MULLER Y.M.R. 2008. Behavioral,
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chicks. Toxicol. Sci., 106: 180-185.
NAZARI E.M.
, BAINY A.C.D., AMMAR D., MÜLLER Y.M.R. 2007. Ovarian staging in
eyestalk ablated females of Farfantepenaeus paulensis: a histologic, morphometric,
and biochemical analysis. J. Crust. Biol., 27: 296-303.
MÜLLER Y.M.R., PACHECO C., SIMÕES-COSTA M.S., AMMAR D., NAZARI E.M.
2007. M
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acanthurus (Crustacea, Decapoda). Inv. Reprod. Dev., 50: 67-74.
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CARVALHO M C., FRANCO J.L., GHIZONI H., KOBUS K., NAZARI E.M., ROCHA
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2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid (DMPS) on methylmercury-induced
locomotor deficits and cerebellar toxicity in mice. Toxicology, 239: 195-203.
8.3. Publicações em colaboração com outros grupos de pesquisa do
CCB/UFSC
GLASER V., NAZARI E.M., MÜLLER Y.M.R., FEKSA L., WANNMACHER C.M.D.,
ROCHA J.B.T., DE BEM A., FARINA M., LATINI A. 2010. Effects of inorganic
selenium administration in methylmercury-induced neurotoxicity in mice. Int. J.
Dev. Neurosci., – in press
STRALIOTTO M.R.; MANCINI G.; OLIVEIRA J.; NAZARI E.M.; MULLER Y.M.R.;
DAFRE A.L.; ORTIZ S.; SILVA E.L.; FARINA M.; LATINI A.; ROCHA J.B.T.; BEM
A.F. 2010. Acute exposure of rabbits to diphenyl diselenide: a toxicological
evaluation. J. Appl. Toxicol., – in press
SEIBERT C. H., GARGIONI R., ROSA R.D., PERAZZOLO L.M., NAZARI E.M.,
AMMAR D., ZANETTI C.R., PINTO A.R. 2010 A novel monoclonal antibody that
binds to haemocytes from shrimps oyster. Hybridoma, 29: 161-167.
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