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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
MARIANA SILVA DE ALMEIDA
ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR NA INFECÇÃO
EXPERIMENTAL POR LEISHMANIA (LEISHMANIA) AMAZONENSIS
EM CAMUNDONGOS COM DIFERENTES GRAUS DE
SUSCETIBILIDADE
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Biologia Parasitária
Orientador: Dra Kátia da Silva Calabrese
RIO DE JANEIRO
2009
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ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
MARIANA SILVA DE ALMEIDA
ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR NA INFECÇÃO EXPERIMENTAL
POR LEISHMANIA (LEISHMANIA) AMAZONENSIS EM CAMUNDONGOS COM
DIFERENTES GRAUS DE SUSCETIBILIDADE
ORIENTADOR: Dra Kátia da Silva Calabrese
Aprovada em: 26 / 05 / 2009
EXAMINADORES:
Dr Wagner Baetas da Cruz
Dr Sérgio Coutinho Furtado de Mendonça
Dra Suzana Côrte-Real Faria
SUPLENTES:
Dra Maria do Socorro Rosa Rodrigues de Carvalho
Dr Roberto Carlos Tedesco
Rio de Janeiro, 26 de maio de 2009.
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Ficha catalográfica elaborada pela
Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ
A447
Almeida, Mariana Silva de
Alterações da matriz extracelular na infecção experimental por
Leishmania (Leishmania) amazonensis em camundongos com diferentes
graus de suscetibilidade / Mariana Silva de Almeida. – Rio de Janeiro,
2009.
x, 87 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em
Biologia Parasitária, 2009.
Bibliografia: f. 77-87
1. Leishmania (Leishmania) amazonensis 2. Matriz extracelular. 3.
Camundongo. 4. Colágeno. 5. Fibronectina. 6. Laminina I. Título.
CDD 571 633
iii
“Aos meus pais, irmãos e amor.”
iv
Agradecimentos
Os hindus contam que certa vez ocorreu uma competição entre as divindades Ganesha
e seu irmão Kartikeya para saber quem conseguiria dar a volta aos três mundos mais
rapidamente e então ganhar o fruto do conhecimento. Karthikeya foi em uma jornada pelos
três mundos enquanto que Ganesha apenas andou ao redor de seus pais. Quando perguntado
por que fez isso ele respondeu que para ele seus pais, Shiva e Parvati, representavam todos os
três mundos, e então foi dado a ele o fruto do conhecimento. É assim que eu gostaria de
demonstrar meu amor e minha gratidão a meus pais, que sempre serão a base do meu mundo.
Minha mãe, exemplo de força e altruísmo, meu pai exemplo de fé, perseverança e amor a
vida. Meus irmãos, Tiago e Bruna, completam a formação deste alicerce. Nas brincadeiras e
desavenças fomos treinados para enfrentar as alegrias e frustrações da vida, como todo bom
mamífero! Com a família Pereira aprendi tanta coisa. Nossa, quanto exemplo! O carinho
especial da tia Creusa, do padrinho Uliceu e tio Celso que ao longo destes dois anos sempre
me incentivaram e vibraram com meu crescimento.
Os amigos. Ah, os amigos! O que seria de mim sem as risadas, as viagens, os sambas,
as idas a praia, barzinhos, telefonemas, orkut, msn, conversa fiada? Amigos da escola, da
faculdade. As vetspoderosas e uma agrônoma fofa que têm um lugar tão especial em meu
coração. Ivan Bustamante que teve participação essencial para que eu aqui estivesse, muito
obrigada. Amigos do namorado que eu roubei e não devolvo, e de quebra as namoradas que
aos poucos se tornaram grandes amigas. Amigos do mestrado, que galera boa! Amigos do lab.
Kátia Calabrese e Luiz Otávio Carvalho, obrigada pela oportunidade. Serei
eternamente grata. Dr. Sylvio Celso Gonçalves da Costa, obrigada pelo carinho. Celeste
Souza, Mariana Rottini, Caroline Mattoso, conversas, conselhos, almoços, que coisa boa
conviver com vocês! Ce, aprendi muito com você, obrigada pelos inúmeros helps! Luciana
Pereira obrigada pelo apoio. Roberto Tedesco, obrigada pelas dicas de microscopia e as idas
ao confocal. Daiana Hardoim, sempre me salvando, tudo de bom sempre. Rosa Cavalcanti,
Celso Dias obrigada pelo carinho com que sempre me trataram. Luiz d'Escoffier aprendo
muito com você, obrigada pela grande ajuda. Aos alunos: Pamella Constantino, Suzane
Borges, Aline Ramos, Thayane Adegas, Caroline Magalhães, Ana Caroline Machado,
Carolina Olivares, Anderson Borba, Eduarda Araújo, Fábio Silva, Livia Correia e Carolina
Costa, um futuro lindo a vocês, obrigada pela companhia e ajuda. Henrique Vitalino, o que
seria da minha barriguinha sem o pão de cada dia? Dona Dalva Lima, Eliana Francisco
obrigada por manterem as coisas em ordem. Ana Lúcia Abreu-Silva, Flávia Cardoso e Tânia
v
Zaverucha do Valle muito obrigada pela ajuda, vocês são grandes exemplos pra mim! Não
posso me esquecer da Veronica Mendes, Leandro Silva, Cristiane Marques, Fernanda Puga e
Joanna Valverde, obrigada pelo carinho.
À equipe da microscopia confocal da Plataforma Técnica Fiocruz - RJ (PDTIS
FIOCRUZ) e da UFRJ, muito obrigada.
Ao meu maior incentivador e melhor amigo. Everton, obrigada por me ajudar a
encontrar a paz que preciso para encarar os dias, a vida. Amo você.
Aos benfeitores espirituais e ao mestre amigo Jesus. Que eu possa ter clareza de idéias,
que a lente de enxergar a vida esteja sempre limpa para que eu encontre a felicidade nas
coisas mais simples e faça sempre as melhores escolhas. Que assim seja!
Enfim, todos, todos aqueles que passaram pela minha vida deixaram sua marca direta
ou indiretamente. Sou o que sou graças a vocês. Cresci muito, emocional e intelectualmente.
Muito obrigada por tornarem este sonho real!
vi
“O homem semeia um pensamento e colhe um hábito. Semeia um
hábito e colhe um caráter. Semeia um caráter e colhe um destino.”
(Swami Sivananda)
vii
Resumo
O primeiro contato entre protozoários do gênero Leishmania e hospedeiros mamíferos ocorre
na derme durante o repasto sanguíneo de fêmeas flebotomíneas infectadas. Os parasitos são
então expostos a um novo microambiente que consiste, principalmente, da matriz extracelular
(MEC) do tecido conjuntivo, composta por proteínas fibrosas e multifuncionais circundadas
por proteoglicanos e glicosaminoglicanos. Essa estrutura é bastante dinâmica, fornece aos
tecidos propriedades físicas e funcionais e realiza importante papel no processo de
desenvolvimento normal bem como em várias patologias. Diversos estudos sugerem que as
leishmânias possuem moléculas de adesão de superfície responsáveis pela interação entre
moléculas da MEC durante os estágios iniciais da infecção. A presença destas moléculas pode
estar envolvida na patogenia das leishmanioses e explicar o tropismo de certas espécies pela
pele, onde há abundância de componentes da MEC. Devido à importância da MEC nos
processos inflamatórios e infecciosos o presente estudo se propôs a analisar as alterações
ocorridas nesta estrutura durante a infecção murina por Leishmania (Leishmania)
amazonensis, em linhagens de camundongos com diferentes graus de suscetibilidade a este
parasito. Para isto foram inoculadas 10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis no coxim
plantar esquerdo de camundongos BALB/c e C3H.He, que foi retirado após necropsia e
processado para análise histopatológica e imunohistoquímica, aos 30, 60, 90 e 120 dias após a
infecção. A cinética da lesão também foi avaliada nos mesmos tempos. O estudo demonstrou
que os camundongos BALB/c infectados por L. (L.) amazonensis apresentam um processo
inflamatório progressivo ao longo da infecção, composto de polimorfonucleares e macrófagos
parasitados, enquanto os C3H.He apresentam um processo inflamatório mais discreto. Há
diminuição do colágeno tipo I e progressivo aumento do colágeno tipo III junto às células
inflamatórias na derme reticular, até o 60º dia de infecção, nos dois modelos estudados. Nos
camundongos BALB/c, a partir do 90º dia de infecção, não se verifica a presença do colágeno
tipo I e tipo III e essa degradação é evidenciada até mesmo junto à lâmina reticular da
membrana basal. Os camundongos C3H.He após 90 dias de infecção apresentam histologia
normal semelhante a dos animais controles. As fibras elásticas e elaunínicas se mantêm
preservadas ao longo da infecção nos dois modelos utilizados. As oxitalânicas estão
degradadas no BALB/c durante toda a infecção, contudo, os camundongos C3H.He
recuperam estas fibras a partir de 90 dias de infecção. Nesses camundongos, a análise
histopatológica aos 90 dias de infecção e a imunohistoquímica aos 120 não evidencia a
presença de parasitos, corroborando para a hipótese de que estes animais são capazes de
controlar a infecção. Há infecção do tecido muscular nos dois modelos estudados, entretanto o
C3H.He apresenta regeneração muscular a partir do 90º dia de infecção. Ocorre um aumento
da fibronectina, nos camundongos BALB/c infectados, enquanto nos C3H.He há uma
diminuição desta proteína. Entretanto, não há alterações significativas da laminina entre os
modelos utilizados. Podemos concluir que a habilidade dos camundongos da linhagem
C3H.He de controlar a infecção estaria associada a sua maior capacidade de expressar
componentes da matriz extracelular que estão associados à manutenção da integridade e
homeostasia tecidual.
Palavras-chave: Leishmania (Leishmania) amazonensis, matriz extracelular, camundongo,
colágeno, fibronectina, laminina.
viii
Abstract
The first contact between protozoans from Leishmania genus and mammal hosts occurs at
dermis during the repast of female infected phlebotomines. Thereafter the parasites are
exposed to a microenvironment which mainly consists of a loose matrix of connective tissue,
which is composed of multifunctional and fibrous proteins surrounded by
glycosaminoglycans and proteoglycans. This structure is very dynamic, provides physical and
functional properties for tissues and has a prominent role in normal development as well as in
a variety of disease processes. Many works suggest that Leishmania spp. have cell surface
adhesion molecules responsible by interaction among extracellular matrix proteins during the
initial phases of infection. The presence of these molecules can be involved in leishmaniasis
pathogenesis and can explain the specific tropism for the skin of certain species, where there
is abundance of extracellular matrix constituents. Due to the importance of extracellular
matrix in infectious and inflammatory processes, the present dissertation aimed to analyze the
alterations occurred in this structure in Leishmania (Leishmania) amazonensis murine
infection. For this purpose 10
4
amastigotes forms of L. (L.) amazonensis were inoculated in
left hind footpad of BALB/c and C3H.He mice. The lesions were collected after necropsy and
processed for histopathological and immunohistopathological analysis, at 30, 60, 90 and 120
days post infection. The lesion kinetics was evaluated at the same dates. This study showed
that infected BALB/c mice exhibit a progressive inflammatory process during the infection
constituted by polymorphonuclears and parasitized macrophages, while C3H.He show an
inflammatory response more discreet. There is a decrease of collagen type I and a progressive
increase of collagen type III near of inflammatory cells in reticular dermis, until 60 days of
infection, in the two studied models. In BALB/c strain mice, from 90
th
day of infection, it was
not verified the presence of collagens I and III and this degradation is evidenced even close to
reticular lamina of basement membrane. C3H.He mice after 90 days of infection present
normal histology like control animals. Elastic and elaunin fibers are preserved during the
infection in two studied mice strains. Oxitalan fibers are degraded in BALB/c mice during the
experiment, however C3H.He mice recover these fibers from 90
th
day of infection. In these
mice, histopathological analysis at 90
th
day of infection and the immunohistochemical at 120
day do not evidence parasites, according to the hypothesis that these animals are able to
control the infection. Muscular tissue was infected in both studied mice strains, but C3H.He
mice could regenerate this tissue from 90
th
day of infection. There is an increase of
extracellular matrix protein fibronectin in infected BALB/c mice, while in C3H.He there is a
decrease of this protein. However, there is not significant laminin alterations in mice utilized
in this study. We can concluded that the ability of C3H.He mice to control the infection would
be associated to their capacity to express extracellular matrix constituents that are related to
maintenance of integrity and tissue homeostasis.
Keywords: Leishmania (Leishmania) amazonensis, extracellular matrix, mice, collagen,
fibronectin, laminin.
ix
Índice
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................11
1.1. Leishmanioses – considerações gerais...............................................................................12
1.2. Parasito, vetor e ciclo.........................................................................................................16
1.3. A pele.................................................................................................................................20
1.4. Matriz extracelular.............................................................................................................20
1.4.1. Colágenos.......................................................................................................................21
1.4.2. Laminina.........................................................................................................................22
1.4.3. Fibronectina....................................................................................................................22
1.4.4. Membrana basal..............................................................................................................23
1.4.5. Sistema elástico...............................................................................................................24
1.5. Matriz extracelular e leishmanioses...................................................................................24
2. OBJETIVOS.........................................................................................................................26
2.1. Objetivo geral.....................................................................................................................27
2.2. Objetivos específicos.........................................................................................................27
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................................28
3.1. Animais..............................................................................................................................29
3.2. Parasitos.............................................................................................................................29
3.3. Infecção..............................................................................................................................29
3.4. Cinética da lesão................................................................................................................29
3.5. Processamento histológico.................................................................................................29
3.6. Histopatologia....................................................................................................................30
3.6.1. Técnica de Hematoxilina-eosina.....................................................................................30
3.6.2. Técnica de Tricômico de Masson...................................................................................30
3.6.3. Técnica de Shorr (modificada por Carvalho, 1999)........................................................31
3.6.4. Técnica de Picrosirius-red...............................................................................................31
3.6.5. Técnica de Reticulina de Gomori....................................................................................31
x
3.6.6. Técnica de Weigert (1898) com oxidação pela Oxona (Fulmer et al., 1974) ................32
3.7. Imunohistoquímica.............................................................................................................32
3.8. Quantificação das proteínas multifuncionais laminina e fibronectina...............................33
3.9. Análise estatística...............................................................................................................33
4. RESULTADOS.....................................................................................................................34
4.1. Cinética da lesão................................................................................................................35
4.2. Análise histopatológica e histoquímica..............................................................................35
4.2.1. 30º dia após a infecção....................................................................................................35
4.2.2. 60º dia após a infecção....................................................................................................44
4.2.3. 90º dia após a infecção....................................................................................................50
4.2.4. 120º dia após a infecção..................................................................................................55
4.3. Análise imunohistoquímica das proteínas fibronectina e laminina....................................60
5. DISCUSSÃO........................................................................................................................68
6. CONCLUSÕES....................................................................................................................75
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................77
1. INTRODUÇÃO
_________________________________________________________________Silva-Almeida, M
12
1.1. Leishmanioses - considerações gerais
As leishmanioses são doenças causadas por parasitos intracelulares obrigatórios
pertencentes à ordem Kinetoplastida (Honigberg, 1963, emend. Vickerman, 1976), família
Trypanosomatidae (Doflein, 1901, emend. Grobben, 1976), gênero Leishmania (Ross, 1903)
e transmitidas aos hospedeiros vertebrados por insetos flebotomíneos. As manifestações
clínicas dependem da interação entre o parasito e o hospedeiro, entre outros fatores
(Handman, 2001). Várias formas clínicas estão incluídas no termo leishmanioses, mais
notavelmente as leishmanioses cutânea, mucosa e visceral que resultam do parasitismo no
sistema linfomonocitário da derme, da mucosa oronasofaríngea e de forma sistêmica,
respectivamente (Herwaldt, 1999). Independente da forma que a doença assuma, a infecção
apresenta as seguintes características: macrófagos são os principais alvos para a replicação
intracelular do parasito; a clínica da doença é determinada tanto pela resposta
imunoinflamatória do hospedeiro, quanto pela espécie do parasito e a infecção tecidual
persistente é característica (Murray et al., 2005).
Uma das primeiras descrições clínicas que remete às leishmanioses data de 1756 e foi
realizada por Alexander Russel após examinar um paciente turco. Alexander relatou que após
a resolução, a ferida deixa uma cicatriz que mantém cor viva por meses e quando não irritada
não costuma causar muita dor. Além disso, há textos do século XV e XVI, do período Inca e
durante a colonização espanhola, que fazem menção a úlceras na pele que correspondem à
descrição da forma cutânea da leishmaniose (WHO, 2007). Segundo León e Léon (1976),
assim não há dúvida de que esta doença provoca o sofrimento de populações desde a época
pré-colombiana, a ponto de impressionar os artistas da época.
O início do século XX foi marcado por uma série de descobertas em relação às
leishmanioses. Em 1903, Leishman identificou certos microrganismos isolados do baço de
um paciente que morreu de febre “Dum-dum” na Índia, que até aquele momento pensava-se
tratar de tripanosomos. Donovan (1903) também descreveu os mesmos parasitos, entretanto,
considerando-os como novos. Posteriormente, Ross (1903) correlacionou os microrganismos
ao calazar, forma visceral da leishmaniose, e deu o nome de Leishmania donovani (WHO,
2007).
A primeira referência de leishmaniose tegumentar (LT) no Brasil encontra-se no
documento da Pastoral Religiosa Político-Geográfica de 1827, citado no livro “Antiguidad de
La Syfilis em El Peru” (Rabello, 1925a). Entretanto, a doença só teve seu parasito identificado
e sua natureza leishmaniótica confirmada em 1909 (Lindenberg; Carini & Paranhos). Em
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13
1911, Gaspar Vianna descreveu uma nova espécie denominando-a Leishmania braziliensis
(Vianna, 1911) e até a década de 70 todos os casos de LT eram atribuídos a este agente. Já a
leishmaniose visceral (LV) foi descrita pela primeira vez nas Américas por Migone (1913) ao
examinar um paciente febril que havia retornado ao Paraguai após trabalhar na construção da
estrada de ferro São Paulo-Corumbá no Brasil (Lainson e Shaw, 1992) e os estudos sobre sua
distribuição geográfica só ocorreram duas décadas mais tarde com os achados de amastigotas
em fragmentos de fígados obtidos por meio de viscerotomias para a febre amarela, por um
patologista do Instituto Oswaldo Cruz (Penna, 1934). Somente em 1936 foi descrito o
primeiro caso de LV em um indivíduo vivo, residente no Brasil. Evandro Chagas,
investigando a doença em Sergipe, diagnosticou a doença e caracterizou um foco de LV na
região (Chagas, 1936). As amostras de parasitos isoladas no Brasil não se reproduziram
experimentalmente, o que levou dois pesquisadores brasileiros a concluírem que se tratava de
uma nova espécie de parasito, classificando-o então como Leishmania chagasi (Cunha &
Chagas, 1937).
No ano de 2005 (DATASUS) foram registrados no Brasil 3.481 casos novos de LV e
26.014 de LT (tabelas I e II). Segundo Dujardin et al. (2008) a epidemiologia das
leishmanioses se encontra em processo de modificação. Alterações ambientais realizadas pelo
homem e a movimentação populacional levam a mudanças no alcance e densidade de vetores
e reservatórios, aumentando o risco de exposição do homem aos flebotomíneos. O processo
de urbanização está se tornando bem comum assim como a ruralização da co-infecção
leishmaniose e AIDS. Como o meio rural é mais carente de meios de diagnóstico e
tratamento, o agravamento da infecção ocorre levando a um aumento nas taxas de
mortalidade. Aliado a estas alterações está o crescente número de isolados resistentes a drogas
antimoniais, drogas de primeira escolha em muitos países, e também resistentes a drogas de
segunda escolha como a miltefosina e a anfotericina B (Dujardin et al., 2008; Croft et al.,
2006).
Uma avaliação epidemiológica da LV nos últimos anos, por exemplo, demonstra
alterações no seu perfil de transmissão que, originariamente, era rural e ocasional na periferia
de algumas cidades, e hoje associado a grandes cidades como Corumbá (MS) e Araçatuba
(SP) e algumas capitais como Belo Horizonte (MG), Campo Grande (MT), Palmas (TO),
Teresina (PI) e São Luís (MA) (SVS, 2006).
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1.2. Parasito, vetor e ciclo
Das 30 espécies que infectam mamíferos cerca de 21 atingem o homem. Essas
espécies estão divididas em dois subgêneros: Leishmania e Viannia (Laison and Shaw, 1987).
Subgênero Leishmania
Velho Mundo:
Leishmania (Leishmania) donovani (Laveran & Mesnil, 1903) Ross, 1903.
Leishmania (Leishmania) tropica (Wright, 1903) Luhe, 1906.
Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908.
Leishmania (Leishmania) major Yakimoff & Schokhor, 1914 emend Bray et al., 1973.
Leishmania (Leishmania) archibaldi Castellani & Chalmers, 1919.
Leishmania (Leishmania) gebilli Wang et al., 1964.
Leishmania (Leishmania) aethiopica Bray et al., 1973.
Leishmania (Leishmania) killicki Rioux et al., 1986.
Leishmania (Leishmania) arabica Peters et al., 1987.
Leishmania (Leishmania) turanica Strekova et al., 1990.
Novo Mundo:
Leishmania (Leishmania) chagasi Cunha & Muniz, 1937.
Leishmania (Leishmania) enrietti Muniz & Medina, 1948.
Leishmania (Leishmania) mexicana Biagi emend. Garnham, 1962.
Leishmania (Leishmania) pifanoi Medina &Romero, 1959 emend. Medina & Romero,
1962.
Leishmania (Leishmania) hertigi Herrer, 1971.
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17
Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972.
Leishmania (Leishmania) deanei Lainson & Shaw, 1977.
Leishmania (Leishmania) aristidesi Lainson & Shaw, 1979 emend. Lainson & Shaw,
1987.
Leishmania (Leishmania) venezuelensis Bonfante-Garrido, 1980.
Subgênero Viannia:
Novo Mundo:
Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911emend. Matta, 1916.
Leishmania (Viannia) peruviana Vélez, 1913.
Leishmania (Viannia) guyanensis Floch, 1954.
Leishmania (Viannia) panamensis Laison & Shaw, 1972.
Leishmania (Viannia) laisoni Silveira et al., 1987.
Leishmania (Viannia) naiffi Laison & Shaw, 1989.
Leishmania (Viannia) shawi Laison & Shaw, 1989.
Leishmania (Viannia) colombiensis Kreutzer et al., 1991.
Leishmania (Viannia) lindenbergi Silveira et al., 2002.
O parasito se apresenta sob duas formas principais: promastigotas, células de 5-15µm,
alongadas e com flagelo livre, encontradas no tubo digestório do hospedeiro flebotomíneo, e
amastigotas, células ovóides de 3-5µm, imóveis com pequeno flagelo restrito a bolsa flagelar,
encontrada intracelularmente no hospedeiro mamífero (Bates, 2008; Kamhawi, 2006).
Os vetores das leishmanioses são fêmeas de pequenos dípteros do gênero
Phlebotomus, no Velho Mundo, e Lutzomyia, no Novo Mundo. São reconhecidos por terem o
corpo coberto por cerdas e pelo curioso hábito de permanecerem com as asas abertas quando
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18
pousados, por este motivo possuem nomes vulgares como “cangalhinha”, “mosquito palha”,
“asa-dura” entre outros (SVS, 2006).
A infecção do inseto se dá quando as fêmeas ingerem as amastigotas encontradas
livres no tecido ou em fagolisossomos de macrófagos e outros fagócitos quando picam um
hospedeiro mamífero infectado (Handman & Bullen, 2002). No intestino do inseto vetor os
parasitos se diferenciam em promastigotas procíclicas, formas ovóides de flagelo curto, pouco
móveis (Pimenta et al., 1997; Soares et al., 2005) e replicativas que se multiplicam por
divisão binária, e posteriormente se fixam em porções específicas do tubo digestivo de acordo
com o subgênero a que perteçam. No subgênero Viannia essa adesão ocorre na região
peripilárica e no Leishmania na região suprapilárica (Nieves & Pimenta, 2000). Em uma etapa
seguinte, alguns parasitos se diferenciam em promastigotas metacíclicas, forma infectante
para mamíferos, num processo conhecido como metaciclogênese. Estas migram para o
intestino anterior do inseto onde secretam quitinases, que destroem a válvula estomodeal do
inseto, e PSG (promastigote secreted gel), ambos dificultam o processo de sucção sanguínea
e, em um próximo repasto, o flebotomíneo acaba por regurgitar o sangue recém-ingerido,
acrescido de formas promastigotas metacíclicas, na pele de um novo hospedeiro vertebrado
levando à transmissão da parasitose (Bates, 2008; Bates, 2007; Rogers et al., 2002). Kimblin
et al (2008) em um estudo recente se propuseram a quantificar o número de promastigotas
inoculadas por um único inseto vetor. E demonstraram uma clara distribuição bimodal, com
insetos transmitindo baixas doses, menos de 600, e outros, altas doses que variavam de mais
de 1.000 a 100.000 promastigotas.
Uma vez na derme, as promastigotas devem resistir à ação lítica do complemento e
serem fagocitadas por fagócitos mononucleares. No interior destas células, se diferenciam em
amastigotas que se replicam, também por divisão binária, dentro do fagolisossomo. A
dispersão da infecção ocorre quando a célula, densamente parasitada, se rompe e as
amastigotas são novamente fagocitadas por novas células (Lodge & Descoteaux, 2005).
Várias moléculas na superfície de células fagocíticas têm implicação no processo
inicial de internalização do parasito e na iniciação das vias de sinalização. Os receptores de
manose são umas dessas moléculas importantes na interação parasito-hospedeiro (Akilov et
al., 2007), além de receptores de complemento 1 (CR1), 3 (CR3), 4 (CR4), receptor Fc para
imunoglobulina G e receptor de fibronectina (Handman & Bullen, 2002; Peters et al., 1995;
Handman, 2001). Glicoproteínas de superfície do parasito estão envolvidas no processo de
ligação com os receptores da célula hospedeira, sendo a glicoproteína 63 (gp63) e o LPG os
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19
maiores glicoconjugados envolvidos no processo. Embora não possua um mecanismo ativo de
entrada na célula, o parasito utiliza esses ligantes de superfície, sendo fagocitada por meio de
endocitose mediada por receptores (Alexander et al., 1999). Os polimorfonucleares (PMN)
são os primeiros leucócitos a chegarem ao sítio de infecção, fagocitando os parasitos.
Segundo van Zandbergen et al (2004), os macrófagos são capazes de fagocitar PMN
infectados e as Leishmania spp. utilizariam os granulócitos como “cavalos de Tróia” para
entrarem nas células hospedeiras de forma “silenciosa”.
Dependendo do estágio e espécie, as leishmânias podem se evadir da resposta inata,
remodelar compartimentos intracelulares e vias metabólicas e prejudicar ações de macrófagos
e células dendríticas (McMahon-Pratt et al., 2004). O lipofosfoglicano (LPG) e a
metaloproteinase de superfície gp63 representam dois fatores de virulência de promastigotas
(Murray et al., 2005).
O lipofosfoglicano (LPG) é uma molécula multifuncional expressa principalmente na
forma promastigota. Tem sido sugerido que ela promove a sobrevivência do parasito de
diversas maneiras incluindo: a progressão retrógrada no intestino do vetor, a resistência a lise
mediada por complemento, a inibição da resposta oxidativa, a degradação de enzimas
lisosomais e a inibição da proteína quinase C (Lodge & Descoteaux, 2005; Cunningham,
2002).
A gp63, também chamada de leishmanolisina ou MSP (major surface protease), é uma
metaloproteinase expressa na membrana de todas as espécies de Leishmania spp. (Yao et al.,
2003; Bordier, 1987). Há diversos estudos que relatam a presença desta glicoproteína em
promastigotas, alguns correlacionam até mesmo sua presença à virulência do parasito
(Ramamoorthy et al., 1992; Wilson et al., 1989). Seu estudo em formas amastigotas é mais
difícil, por se encontrarem no meio intracelular, e por isso há poucos trabalhos abordando o
tema. Entretanto, Hsiao et al. (2008) relatam a presença majoritária da gp63 na bolsa flagelar
e alguma distribuição na superfície de amastigotas, que cumpriria um papel importante neste
estágio do ciclo do parasito, pelo menos em L. (L.) chagasi.
Numa infecção os macrófagos exercem um papel fundamental, pois possuem funções
microbicidas, de processamento e de apresentação de antígenos, moléculas co-estimulatórias
e citocinas para a ativação de células T (Denkers & Butcher, 2005, Sacks & Sher, 2002).
Parasitos como os do gênero Leishmania, ao longo do processo evolutivo desenvolveram
mecanismos de interferência nas vias de sinalização, responsáveis pela defesa celular,
garantindo assim permanência e disseminação no hospedeiro (Denkers & Butcher, 2005).
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20
Eles utilizam a imunidade do hospedeiro vertebrado para serem fagocitados, e uma vez no
interior da célula hospedeira, manipulam o ambiente hostil através da inibição de enzimas
hidrolíticas, produtos tóxicos do metabolismo, sinalização celular, produção de citocinas e
outros eventos. Estas estratégias permitem a sobrevivência do parasito, à medida que se
evadem das respostas imunológicas inatas e adquiridas do hospedeiro (Cunningham, 2002).
1.3. A pele
A pele é formada pela epiderme, junção dermo-epidérmica, derme e hipoderme; além
dos folículos pilosos e glândulas sebáceas (Prost-Squarcioni et al., 2005). A derme pode ser
dividida em duas regiões. A derme papilar, mais superficial, formada pelo tecido conjuntivo
frouxo em proporção semelhante às fibras, células e substância amorfa e a derme reticular,
mais profunda e mais espessa, formada pelo tecido conjuntivo denso, onde o componente
fibroso é predominante em relação às células, principalmente fibroblastos, e à substância
amorfa (Prost-Squarcioni et al., 2008). O tecido conjuntivo da derme e hipoderme inclui
como em todos os tecidos, células rodeadas por uma abundante matriz extracelular que
consiste principalmente de proteínas elásticas (Kielty et al., 2002) e colágenas (Fichard et al.,
2003; Van der Rest & Garrone R, 1991; Holbrook & Byers, 1989).
1.4. Matriz extracelular
A matriz extracelular é uma complexa rede composta por macromoléculas tais como
colágenos, proteoglicanos e elastina que interagem fortemente entre si e entre as células a fim
de manter a integridade estrutural de diversos tecidos. Essas interações também sustentam
importantes eventos celulares como migração, proliferação, diferenciação e apoptose
(Huxley-Jones et al., 2007, Aumailley & Gayraud, 1998). É uma estrutura bastante dinâmica
que realiza importante papel no processo de desenvolvimento normal bem como em várias
patologias. A pele, mais especificamente a derme, contém uma grande diversidade de
macromoléculas que refletem a importância da composição e organização dos componentes
da matriz em fornecerem propriedades físicas e funcionais aos tecidos (Bosman &
Stamenkovic, 2003).
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21
1.4.1. Colágenos
Os mais abundantes componentes da matriz extracelular são os colágenos, esses
formam uma superfamília de 27 membros divididos em subgrupos. Os colágenos fibrilares
tipo I, III e V; os colágenos FACIT, tipo XII, XIV e XVI e o colágeno tipo VI são todos
expressos abundantemente na derme. Apesar de suas características estruturais estarem bem
caracterizadas, suas funções permanecem elusivas. São secretados por diversas células,
principalmente as do tecido conjuntivo, representam 25% do total de proteínas de mamíferos
e são encontradas sobretudo na pele e nos ossos. Pelo menos três critérios definem um
colágeno: a localização, sempre no espaço extracelular, a presença de pelo menos uma tripla
hélice em sua estrutura e a capacidade de formar agregados macromoleculares. O domínio
helicoidal do colágeno consiste de uma repetição dos resíduos (Gly-XY) onde X é quase
sempre o aminoácido prolina e Y hidroxiprolina. Uma molécula de colágeno é composta por
três cadeias α que se enroscam entre si para formar uma tripla hélice. Estas três cadeias
podem ser idênticas, e formar um homotrímero, ou distintas, formando um heterotrímero. As
regiões helicoidais ou colágenas enquadram-se pelos domínios globulares, e as não-colágenas
conferem ao colágeno uma estrutura modular. Estes módulos, ou domínios, exercem função
particular e estão envolvidos em muitos mecanismos moleculares e interações celulares
(Ruggiero et al., 2005)
O colágeno tipo I é o mais abundante e o mais estudado, forma mais de 90% da massa
orgânica dos ossos e é o principal colágeno de tendões, pele, ligamentos, córnea e de vários
interstícios (Lochner et al., 2006; Gelse et al., 2003; Aumailley & Gayraud, 1998). A tripla
hélice do colágeno tipo I está usualmente na forma de um heterotrímero com duas cadeias
α1(I) idênticas e uma cadeia α2(I). In vivo, as fibras em tripla hélice estão na maioria das
vezes associadas ao colágeno tipo III ou tipo V. O colágeno tipo III é um homotrímero de três
cadeias α1(III) e amplamente distribuído nos tecidos que contêm colágeno tipo I e fibras do
sistema elástico (oxitalânicas, elaunínicas e elásticas). O colágeno tipo IV é um colágeno não
fibrilar que compõe aproximadamente 50% de todas as membranas basais (LeBleu et al.,
2007), se encontra integrado a laminina, ao nidogênio e a outros componentes. É
caracterizado por 3 domínios, um C-terminal globular (NC1), um N-terminal 7S e uma parte
central em tripla hélice com curtas interrupções de repetições Gly-X-Y resultando numa
flexível tripla hélice. Já foram identificadas 6 cadeias α1(IV) - α6(IV) associadas a três
moléculas heterotriméricas distintas (Gelse et al., 2003; Aumailley & Gayraud, 1998).
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22
O colágeno tipo VII [α1(VII)]
3
é conhecido como fibrila de ancoragem e interage com
a membrana basal, exercendo função essencial na coesão dermo-epidérmica (Keene et al.,
1997). É produzido por queratinócitos, seu domínio NC1 se liga ao colágeno tipo IV na
membrana basal. Os colágenos tipo IV e VII se prendem pelas extremidades a membrana
basal do epitélio e a placas de ancoragem que são encontradas próximas à membrana basal e
parecem ter os mesmos constituintes. A rede resultante desta associação se entrelaça
fisicamente aos colágenos fibrilares intersticiais, contribuindo para a aderência da membrana
basal ao epitélio do estroma (Van Der Rest & Garrone, 1991).
Os colágenos contribuem para a captura, armazenagem local e liberação de fatores de
crescimento e citocinas, portanto executam importante papel durante o desenvolvimento dos
órgãos e cicatrização de ferimentos e reparo tecidual (Hay, 1981).
1.4.2. Laminina
As lamininas são uma família de macromoléculas multifuncionais presentes na
membrana basal e representam as glicoproteínas estruturais não colágenas mais abundantes
desta especialização da matriz extracelular, são compostas por três cadeias peptídicas: α, β e γ
(Miner & Yurchenco, 2004; Aumailley & Smyth, 1998). Possuem componentes com funções
estruturais e são essenciais para a morfogênese e nas interações com receptores celulares
(Tunggal et al., 2000).
1.4.3. Fibronectina
A fibronectina é um componente abundante da matriz extracelular extracelular, medeia
a interação entre células e outros componentes da matriz extracelular (De Jong et al., 2006) e
está intimamente relacionada a proliferação celular (Danen & Yamada, 2001). É secretada por
células na forma solúvel, polimerizada em fibras insolúveis e incorporadas à matriz
extracelular. Há duas origens de fibronectina passíveis de serem polimerizadas, uma é aquela
sintetizada localmente pelas células e a outra é aquela sintetizada pelo fígado, a fibronectina
plasmática, carreada pelo sistema circulatório (Pickering et al., 2000). A habilidade de
fibroblastos de produzirem moléculas constituintes da matriz extracelular e a eficiência em se
organizarem são essenciais para o desenvolvimento tecidual e reparo de lesões (Eckes et al.,
2000).
A fibronectina é remodelada devido a forças exercidas pelas células durante o
processo de migração celular. A facilidade de reorganização destas fibras é determinada pela
intensidade da ligação da célula ao substrato (Ohashi et al., 2002). A ligação da fibronectina é
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23
resultado de interações moleculares específicas entre integrinas e monômeros e interações
iônicas não específicas entre fibras de fibronectina e a superfície a qual a matriz extracelular
está aderida. Se a conexão entre integrina e fibronectina permanece intacta, as células podem
exercer força sobre a rede de fibronectina, influenciando assim sua estrutura e organização
(De Jong et al., 2006).
1.4.4. Membrana basal
A membrana basal é uma camada de 50 a 100nm de um complexo especializado de
proteínas da matriz extracelular encontrada basolateralmente a todas as monocamadas
celulares do corpo, funcionando como um local de adesão para várias populações celulares de
tecidos adjacentes (LeBleu et al., 2007; Brown et al., 2006). Participa da regulação do
crescimento, diferenciação e migração celular durante o desenvolvimento e reconstrução
tecidual (Erickson & Couchman, 2000). É composta por lamininas, colágenos do tipo IV e
VII, nidogênio, perlecan, agrinina e outras macromoléculas (LeBleu et al., 2007; Yurchenco
et al., 2004).
A integridade estrutural da derme depende da organização correta de macromoléculas
produzidas por células da epiderme e da derme. Essas duas camadas da pele são separadas
pela membrana basal as quais numerosas macromoléculas se ligam entre si contribuindo
portanto para a estabilidade da junção dermo-epidérmica (Brittingham et al., 2006; Vracko,
1974).
A aparência e síntese dos diferentes constituintes da lâmina basal da junção dermo-
epidérmica resultam da ação conjunta de células epiteliais e fibroblastos. A laminina 5 é
sintetizada por células epiteliais, nidogênio por fibroblastos e os colágenos dos tipos IV e VII
por ambos os tipos celulares (revisado por Elkhal et al., 2004).
Os queratinócitos da epiderme produzem componentes da membrana basal incluindo a
cadeia β4 da integrina, laminina, colágenos dos tipos IV e VII. Já fibroblastos dérmicos
estimulam a expressão de componentes da membrana basal e a formação da zona de
membrana basal, sugerindo que estes podem produzir laminina, colágenos tipos IV e VII, ou
influenciar os efeitos dos queratinócitos na formação da membrana basal (Lee e Choo, 2005).
O modo pelo qual a membrana basal da pele se conecta ao estroma não é
completamente compreendido, porém Brittingham et al. (2006) demonstraram que as
interações entre o domínio NC1 do colágeno tipo VII, laminina tipo 5, colágeno tipo IV e
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24
colágeno tipo I fornecem a base molecular para a compreensão do papel deste domínio na
estabilização da junção dermo-epidérmica (Colognato & Yurchenco, 2000).
1.4.5. Sistema elástico
A elastina e as fibrilinas são proteínas que se encontram no tecido conjuntivo, formam
as fibras do sistema elástico (Aumailley & Gayraud, 1998) e compõem um conjunto insolúvel
que dotam o tecido conjuntivo de elasticidade, permitindo longo alcance de deformação e
recuo sem gasto de energia (Kielty et al., 2002). As fibras elásticas são formadas pelo
constituinte amorfo identificado como elastina, na porção central e cercado pelo constituinte
microfibrilar. São produzidas pelas mesmas células que produzem as fibras colágenas, como
fibroblastos por exemplo (Montes, 1996).
As fibras do sistema elástico são classificadas de acordo com a quantidade de elastina
e fibrilina. Aquelas constituídas somente por componentes microfibrilares são denominadas
fibras oxitalânicas, as fibras elaunínicas são constituídas pelo componente amorfo sob forma
de pequenos depósitos em volta do fibrilar, que é o componente predominante, já as elásticas
são constituídas principalmente pelo componente amorfo com uma pequena quantidade do
microfibrilar. Suas propriedades também variam de acordo com a constituição e quantidade
de elastina (Kielty et al., 2002; Montes, 1996).
1.5. Matriz extracelular e leishmanioses
Os componentes da matriz extracelular interagem entre si e demonstram grande
interdependência, a modificação de um deles, seja por um fator intrínseco (sistêmico,
genético, relacionado à idade) ou extrínseco (ambiental), pode acarretar consequências para
todo o tecido. Tais alterações, apesar de raramente seguirem um padrão para determinadas
enfermidades podem servir para confirmação de diagnóstico (Holbrook & Byers, 1989).
Ao serem inoculadas na pele do hospedeiro as leishmânias estão expostas a um novo
microambiente na derme que consiste principalmente da frouxa matriz do tecido conjuntivo,
composto por proteínas fibrosas envolvidas por uma substância amorfa de
glicosaminoglicanas e proteoglicanas (McGwire et al., 2003, Lira et al., 1997).
Macrófagos e fibroblastos estão presentes no tecido e aumentam sua atividade após
uma inflamação (Inoue et al., 2005). Muitos estudos já demonstraram a infecção de outros
tipos celulares por Leishmania spp., tanto in vivo quanto ex vivo, incluindo culturas de
fibroblastos humanos. A infecção de fibroblastos é frequente em estados latentes da doença;
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25
essas células fornecem um ambiente menos hostil aos parasitos, possibilitando sua
persistência e casos subclínicos da parasitose (Bogdan et al., 2000). Fibroblastos e
macrófagos ocupam áreas muito próximas à inoculação dos protozoários, portanto os
primeiros também se tornam alvo de infecção (revisado por Hespanhol et al., 2005).
Estudos sugerem que parasitos do gênero Leishmania possuem moléculas de adesão
na superfície que, pelo menos na espécie L. (L.) mexicana, devem ser responsáveis pela
interação com moléculas da matriz extracelular durante os estágios iniciais da infecção (Lira
et al., 1997). Vários ligantes têm sido demonstrados na interação entre Leishmania spp. e
células hospedeiras (Chang & McGwire, 2002, Lira et al., 1997). Lira et al. (1997),
demonstraram que as promastigotas se ligam ao colágeno tipo I e que esta interação é
específica e saturável. A presença de moléculas de adesão pode estar envolvida na patogenia
das leishmanioses e pode explicar a preferência de certas espécies pela pele, onde há
abundância de componentes da matriz extracelular.
O papel da proteína de superfície gp63 de leishmânias no aumento da capacidade de
migração através da matriz extracelular foi demonstrado ex vivo. Esta proteína mostrou
habilidade para degradar componentes da matriz extracelular, aumentando as chances de
acesso do parasito às circulações linfática e sanguínea e facilitando a ativação e migração de
macrófagos (McGwire et al., 2003). Outros estudos demonstraram que a fibronectina também
pode ser um importante constituinte da matriz extracelular participante da interação do
parasito com os fagócitos mononucleares (Vannier-Santos et al., 1992, Wyler et al., 1985).
Ela agiria influenciando consideravelmente a fagocitose em vários sistemas celulares e
modulando a resposta imunológica. Macrófagos humanos e de camundongos sintetizam e
secretam esta proteína, sabe-se hoje que vários componentes da matriz extracelular como:
laminina, fibronectina e trombospondina podem regular as funções dos macrófagos (Kulkarni
et al., 2008; revisado por Vannier-Santos et al., 1992). Além disso, a gp63, por interagir com
receptores para fibronectina, facilita a infecção de macrófagos pelas leishmânias, à medida
que estabiliza a adesão complemento dependente entre parasitos e macrófagos permitindo
rápida e eficiente fagocitose (Brittingham et al., 1999).
Devido à importância da matriz extracelular nos processos inflamatórios e infecciosos
o presente estudo se propôs a analisar as alterações ocorridas nesta estrutura na infecção
murina por L. (L.) amazonensis, contribuindo para uma melhor compreensão desta parasitose.
2. OBJETIVOS
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2.1. Objetivo geral
Avaliar as alterações da matriz extracelular na infecção por Leishmania (Leishmania)
amazonensis em camundongos com diferentes graus de suscetibilidade a este parasito.
2.2. Objetivos específicos
Comparar a cinética das lesões primárias entre os camundongos BALB/c e C3H.He,
mais e menos suscetíveis a Leishmania (L.) amazonensis, respectivamente.
Avaliar histopatologicamente as alterações da matriz extracelular na lesão primária
causada pela L. (L.) amazonensis.
Verificar as alterações de componentes fibrosos da matriz extracelular no sítio da
infecção
Verificar alterações das proteínas multifuncionais fibronectina e laminina no sítio da
infecção.
3. MATERIAL E MÉTODOS
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3.1. Animais
Foram utilizados camundongos BALB/c e C3H.He fêmeas com 4 a 6 semanas de
idade e peso entre 20 e 25g, fornecidos pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório
(CECAL) do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro. Os animais foram
mantidos no biotério de experimentação do Pavilhão Leônidas Deane, sob temperatura
controlada, alimentação com ração apropriada e água filtrada ad libidum.
3.2. Parasitos
Foram utilizadas nos experimentos formas amastigotas de Leishmania (L.)
amazonensis cepa H21 (MHOM/BR/76/MA-76), isoladas de um caso humano de
leishmaniose cutâneo-difusa e mantida em passagens seriadas em camundongos.
3.3. Infecção
Os camundongos foram divididos em quatro grupos: grupo 1 (G 1) e grupo 2 (G 2), os
quais continham 20 e 15 animais da cepa BALB/c, respectivamente e grupo 3 (G3) e grupo 4
(G4), os quais continham 20 e 15 animais da cepa C3H.He. Os animais do G1 e do G3 foram
infectados subcutaneamente no coxim plantar esquerdo com 10
4
formas amastigotas de L. (L.)
amazonensis. Para controle dos experimentos nos animais do G2 e do G4 foram inoculados
PBS, pela mesma via.
3.4. Cinética da lesão
Com o objetivo de avaliar a progressão das lesões, após a infecção as patas dos
animais foram medidas periodicamente aos 30, 60, 90 e 120 dias e a espessura do coxim
plantar esquerdo mensurada usando um paquímetro (Schnelltaster, H.C. Kröplin, GMBH,
Hessen, Germany). A cinética da lesão foi expressa pela diferença entre as médias da
espessura (em mm) de 5 coxins de animais infectados e a média de 5 coxins de animais
normais, não infectados, mantidos ao longo do experimento.
3.5. Processamento histológico
Nos tempos 30, 60, 90 e 120 dias após a infecção, 3 animais dos grupos G1 e G3 e 2
animais do G2 e G4 foram eutanasiados em câmara de CO
2
e necropsiados para a remoção do
coxim plantar esquerdo. Metade do coxim de cada animal foi lavado com PBS e fixado em
paraformaldeído a 4% em PBS por 48h para análise histopatológica. A outra metade foi,
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30
imediatamente após a remoção, embebida em OCT (Compound-embedding medium Miles,
Inc., Elkart, IN Tissue Tek) e congelada a -70
o
C.
3.6. Histopatologia
Os fragmentos de tecidos para os estudos de microscopia de luz foram desidratados
em concentrações crescentes de etanol e clarificados em xilol em inclusor Leica TP1020 e
incluídos em definitivo em central de inclusão Microm AP280. Os blocos foram trimados em
micrótomo Microm HM360 e cortes de 5µm foram obtidos e corados por diversas técnicas
descritas abaixo, para a demonstração de fibras da derme e parasitos.
3.6.1. Técnica de Hematoxilina-eosina
Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
etanol, 100, 90, 80, 70GL, e água destilada e corados durante 7min em hematoxilina de Harris
pré-filtrada (2,5g de hematoxilina – Sigma foi dissolvida em 25mL de álcool absoluto,
paralelamente, 50g de alúmen de amônio foram dissolvidos em 500mL de água destilada pré-
aquecida. As duas soluções foram misturadas e aquecidas até breve fervura, retirada do fogo e
acrescida de 1,25g de óxido vermelho de mercúrio. A solução foi imediatamente resfriada,
através da imersão do frasco em água fria. Foi então acrescido 20mL de ácido acético glacial,
e amadurecida por 2 meses). Os cortes foram lavados e azurecidos em água corrente,
diferenciados em álcool-ácido (5 gotas de ácido clorídrico em 100mL de álcool etílico a
95GL), novamente lavados em água corrente e corados por 2min em solução alcoólica de
eosina (5g de eosina Y “yellowish” - Merck dissolvidas em 200mL de água destilada
acrescida de 800mL de álcool etílico absoluto). Os cortes foram desidratados em
concentrações crescentes de etanol, diafanizados em xilol e montados entre lâmina e lamínula
com “Entellan” (Merck).
3.6.2. Técnica de Tricrômico de Masson
Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
etanol, 100, 90, 80, 70GL, e água destilada e corados durante 10min em hematoxilina de
Harris pré-filtrada, azurecidos em água corrente e lavados em água destilada. Posteriormente
foram corados por 30min na solução “A” de Masson (1g de Ponceau de Xilidina - Sigma, 1g
Fucsina Ácida - Sigma, 1g de Escarlat de Biebrich - Sigma, 3mL de ácido acético glacial e
97mL de água destilada); e rapidamente lavados em água acética a 1%. Em seguida, imersos
por 10min na solução “B” de Masson (1g de ácido fosfomolibdico e 100mL de água
destilada), lavados em água destilada, corados por 5min na solução “C” de Masson (2g de
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31
Fast Green FCF - Sigma, 1mL de ácido acético glacial e 100mL de água destilada),
rapidamente lavados em solução aquosa a 1% de ácido acético glacial, com água destilada,
desidratados em concentrações crescentes de etanol, diafanizados e montados entre lâmina e
lamínula com Entellan® (Merck).
3.6.3. Técnica de Shorr (modificada por Carvalho, 1999)
Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
etanol, 100, 90, 80, 70GL, e água destilada, corados durante 7min em hematoxilina de Harris
pré-filtrada, azurecidos em água corrente e imersos por 30min em solução de Shorr, que
consiste da mistura, na ordem específica citada, filtragem e estocagem em frasco escuro de
quatro soluções. A primeira, solução de Orange G (1,25g de Orange G - Sigma dissolvido em
150mL de água destilada aquecida); a segunda, solução de Azul de Anilina (0,75g de Azul de
Anilina – Sigma dissolvido em 500mL de álcool etílico a 50GL, onde se adicionou 0,25g de
ácido fosfotúngstico, 0,25g de ácido fosfomolibdico e 10mL de ácido acético glacial); a
terceira solução de Ponceau R (5g de Ponceau R – Sigma dissolvido em 250mL de água
destilada aquecida e filtrada depois de fria) e a última, solução de Verde Luz (0,25g de Verde
Luz – Merck dissolvido em água destilada aquecida e filtrada depois de fria). Em seguida os
cortes foram rinsados em água corrente, desidratados em três trocas de álcool isopropílico,
diafanizados em xilol e montados entre lâmina e lamínula com Entellan® (Merck).
3.6.4. Técnica de Picrosirius-red
Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
etanol, 100, 90, 80, 70GL, e água destilada. Em seguida foram corados por 60min na solução
de Picrosirius (0,1g de Sirius Red F3B200 - Sigma foi dissolvido em 100mL de solução
aquosa saturada de ácido pícrico). Posteriormente foram lavados rapidamente em água
destilada, corados por 15min na hematoxilina de Harris, lavados e azurecidos em água
corrente durante 10min, desidratados em concentrações crescentes de etanol, diafanizados em
xilol e montados entre lâmina e lamínula com Entellan® (Merck). Com esta técnica se
identifica o colágeno tipo I marcado em vermelho intenso, em amarelo tendendo a alaranjado
as fibras do colágeno tipo I neoformado e em verde a marcação de fibras delgadas e
ramificadas características do colágeno tipo III.
3.6.5. Técnica de Reticulina de Gomori
Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
etanol, 100, 90, 80, 70GL, e água destilada. Em seguida foram tratados com uma solução
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32
aquosa de permanganato de potássio a 0,5% por 2min, rinsados em água destilada e
mergulhados em solução aquosa de ácido oxálico a 5% até o clareamento dos cortes. Foram
então lavados em água corrente e imersos em solução aquosa de alúmen de ferro a 2% por
2min, lavados em água corrente e em água destilada, trocada a cada banho e postos a
impregnar por 2min, a frio, à solução argêntica de Gomori (em 5mL de solução aquosa de
hidróxido de potássio a 10% adicionou-se 20mL de solução aquosa de nitrato de prata a 10%,
formou-se um precipitado escuro, acrescentou-se amoníaco gota a gota em agitação até a
dissolução completa do precipitado; em seguida adicionou-se solução aquosa de nitrato de
prata a 10% gota a gota até formar novamente um precipitado que deixou a solução turva e
diluiu-se a solução com igual volume de água destilada). Depois de lavados abundantemente
em água destilada, trocada a cada banho, os cortes foram reduzidos por 3min em solução
aquosa de formol a 10%, e lavados em água destilada. Em seguida, foram tonificados em
solução aquosa de cloreto de ouro a 0,2%, até a viragem, levados a uma solução aquosa de
tiossulfato de sódio a 5% por 2min e lavados em água corrente. Feito isso, os cortes foram
contracorados por 1min em solução alcoólica de eosina a 0,5% e então desidratados em
concentrações crescentes de etanol, diafanizados em xilol e montados entre lâmina e lamínula
com Entellan® (Merck).
3.6.6. Técnica de Weigert (1898) com oxidação pela Oxona (Fulmer et al., 1974)
Os cortes foram desparafinados em xilol, hidratados em concentrações de etanol de
100 e 90GL e oxidados, com o objetivo de se evidenciar as fibras oxitalânicas, por 40min em
solução de Oxona (monopersulfato de potássio – Aldrich) a 10%. Foram lavados em água
corrente, imersos em dois banhos de água destilada e, em seguida, foram corados durante
60min em solução de Weigert (2g de fucsina básica, 4g de resorcina dissolvidos em 200mL
de água em ebulição. Juntou-se 25mL de solução aquosa de cloreto de ferro a 30% e fervida
durante 5min, filtrada e o precipitado dissolvido, sem lavar, em 200mL de etanol a 90GL
aquecido. Após o resfriamento adicionou-se 4mL de ácido clorídrico concentrado ao
precipitado). Posteriormente os cortes foram lavados em álcool a 90GL, levados à água e
mergulhados em solução aquosa de Orange G a 0,5% durante 30 segundos para coloração de
fundo. Os cortes foram desidratados em concentrações crescentes de etanol, diafanizados em
xilol e montados entre lâmina e lamínula com Entelan® (Merck).
3.7. Imunohistoquímica
Foram obtidos cortes de 5µm em criostato Leica CM 1850, esses foram colocados
sobre lâminas cobertas com 3-aminopropyl triethoxylane (Sigma, A3648) e fixados em
___________________________________________________________________Silva-Almeida, M
33
acetona a 4
o
C por 15min. Em seguida, os cortes foram bloqueados com PGN (PBS pH 7.2,
contendo 0,25% de gelatina e 0,1% de azida) e incubados em câmara úmida por 15min. Os
cortes foram então incubados com soro humano policlonal anti-Leishmania (L.) chagasi
diluído em PGN contendo 0,1% de saponina (PGN-saponina), por 40min. Após esse tempo,
as lâminas foram lavadas três vezes em PBS (pH 7,2) sob agitação. Os cortes foram cobertos
com anticorpo secundário anti-IgG humano, conjugado a Cy3 (SIGMA, C2571), incubadas
por 40min e lavados como descrito anteriormente. Em seguida foram incubadas por 40min
com anticorpo monoclonal anti-laminina (rabbit anti-laminin, Sigma, L9393) ou anti-
fibronectina (rabbit anti-fibronectin, Sigma, F3648) diluídos em PGN-saponina. Após as três
lavagens, as amostras foram incubadas com os anticorpos secundários (anti-rabbit IgG,
molécula total, conjugado a FITC, Sigma, F7512) diluídos em PGN-saponina. As lâminas
foram lavadas, montadas em glicerol contendo 0,1% de p-phenylenediamine
(Sigma, 695106)
e observadas em microscópio confocal de varredura a laser LSM 510-META (Zeiss).
3.8. Quantificação das proteínas multifuncionais laminina e fibronectina
Seis imagens de cada lâmina foram obtidas no microscópio confocal de varredura a
laser. O software Image Pro Plus 4.0 foi utilizado para medir a área, em µm
2
, das proteínas
multifuncionais laminina e fibronectina. A média das áreas mensuradas foi calculada e
posteriormente comparadas entre os animais estudados.
3.9. Análise estatística
A análise estatística dos resultados obtidos com a quantificação das proteínas
multifunconais laminina e fibronectina foi realizada utilizando o teste T-student bicaudal.
Esse projeto foi submetido à Comissão de Ética para uso de animais (CEUA) e
aprovado sob o protocolo de n
o
L0001/07. Os experimentos foram repetidos duas vezes para a
confirmação dos resultados.
4. RESULTADOS
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
35
4.1. Cinética da lesão
A avaliação da cinética das lesões mostrou diferenças entre as medidas dos coxins dos
camundongos infectados com 10
4
amastigotas de L. (L.) amazonensis e dos controles não
infectados, nas duas linhagens utilizadas no presente trabalho.
Os camundongos BALB/c apresentaram lesões palpáveis a partir do 30º dia de
infecção, que aumentaram progressivamente e ulceraram. Ao longo da infecção estes animais
apresentaram lesões maiores que as dos C3H.He, que apresentaram lesões palpáveis no início
da infecção e regrediram ao longo do experimento (Fig. 4.1).
4.2. Análise histopatológica e histoquímica
4.2.1. 30º dia após a infecção
A análise histopatológica do sítio da infecção dos camundongos BALB/c demonstrou
intenso infiltrado inflamatório na derme reticular, com inúmeros macrófagos vacuolizados,
densamente parasitados, e polimorfonucleares (PMN) (Fig. 4.2A). Observou-se também
destruição das fibras musculares; com perda de estriações transversais que conferiram as
mesmas um aspecto hialino (Fig. 4.2B). Além disso, observou-se discreta desagregação das
fibras da matriz extracelular (MEC) (Fig. 4.2A) quando comparados aos camundongos
controle (Fig. 4.2C). A degradação foi melhor evidenciada pelas colorações tricrômico de
Masson (Fig. 4.3A e B) e Shorr modificado (Fig. 4.3C e D).
A análise dos cortes corados pelo picrosirius red revelou que havia produção
significativa de colágeno tipo III entre as células do processo inflamatório presentes na derme
reticular (Fig. 4.4A e B). Em contrapartida na derme papilar, onde o processo inflamatório foi
discreto ou inexistente, não houve alterações dos colágenos tipo I e III (Fig. 4.4C e D),
semelhante ao observado nos animais do grupo controle (Fig. 4.4E e F). A análise
histoquímica pela técnica de reticulina de Gomori realizada em todos os grupos confirmou os
resultados observados com a técnica picrosirius red, para o colágeno tipo III, nas dermes
papilar e reticular (Fig. 4.5A).
A avaliação das fibras que constituem o sistema elástico, pela técnica de Weigert com
prévia oxidação pela oxona (monopersulfato de potássio), demonstrou que as fibras elásticas e
elaunínicas estavam preservadas, entretanto as oxitalânicas não foram evidenciadas nas áreas
associadas ao processo infamatório (Fig. 4.5B). Apesar de não terem sido degradadas, as
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
36
fibras elásticas próximas às células parasitadas apresentaram um padrão diferente de
distribuição (Fig. 4.5C) quando comparadas ao grupo controle (4.5D).
Os camundongos C3H.He infectados apresentaram a derme papilar íntegra e a
presença de moderado infiltrado inflamatório rico em PMN e macrófagos parasitados na
derme reticular (Fig. 4.6A). Observou-se também alguns feixes de colágeno com discreta
dissociação (Fig. 4.6B). As fibras musculares apresentaram um grau menor de destruição que
nos camundongos BALB/c, porém foi frequente a presença de macrófagos parasitados entre
os feixes (Fig. 4.6C). Também havia intenso infiltrado inflamatório perineural composto
principalmente por macrófagos, não parasitados (Fig. 4.6D).
Semelhante ao observado nos camundongos BALB/c infectados, a matriz extracelular
da derme papilar dos C3H.He não apresentou alterações (Fig.4.6E). Os camundongos
controles não apresentaram alterações dos tecidos epitelial, conjuntivo e muscular (Fig. 4.6F).
Na análise histoquímica, utilizando-se do picrosirius red e reticulina de Gomori, observou-se,
na derme reticular, que a distribuição dos colágenos tipos I e III foi semelhante ao padrão
apresentado pelos camundongos BALB/c infectados, havendo formação de colágeno tipo III
entre as células inflamatórias (Fig. 4.7A, B, C e D). Quanto às fibras elásticas verificou-se as
mesmas alterações observadas nos camundongos BALB/c, ou seja, destruição das fibras
oxitalânicas, conservação das elaunínicas e das elásticas, porém estas últimas tiveram sua
distribuição alterada, apresentando-se juntas ao infiltrado inflamatório (Fig. 4.7E e F).
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37
Fig. 4.2 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c no 30º dia de experimento. A e B: Camundongos infectados
subcutaneamente com 10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis. A: Intenso infiltrado
inflamatório na derme reticular (***), com inúmeros macrófagos vacuolizados (cabeça de
seta) e polimorfonucleares, além de discreta desagregação das fibras da matriz extracelular
(seta vazada) (HE). B: Destruição das fibras musculares, algumas com perda de estriações
transversais e aspecto hialino (**) (HE). C: Morfologia normal do tecido de camundongo não
infectado (HE).
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38
Fig. 4.3 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 30 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. As figuras mostram a degradação das fibras da matriz extracelular (setas
vazadas). A e B: Tricrômico de Masson. C e D: Shorr modificado.
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39
B
C D
A
Fig. 4.4 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 30 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A: Picrosirius red em luz não-polarizada e B: em luz polarizada; a imagem
mostra o colágeno tipo I (vermelho) e uma produção significativa de colágeno tipo III (verde)
entre as células do processo inflamatório presentes na derme reticular. C: Picrosirius red em
luz não-polarizada e D: luz polarizada, nota-se na derme papilar processo inflamatório
discreto, e ausência de alterações dos colágenos tipo I e III. E: Picrosirius red em luz não-
polarizada e F: em luz polarizada observa-se a disposição normal dos colágenos tipo I e III
em camundongo não infectado.
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40
Fig. 4.5 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c no 30º dia de experimento. A, B e C: Camundongos infectados
subcutaneamente com 10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis. A: Fibras do colágeno
tipo III (seta branca) inalteradas na derme papilar (Reticulina de Gomori). B: Detalhe mostra
as fibras elásticas (seta fina) e elaunínicas (seta grossa) preservadas e oxitalânicas não
evidenciadas (detalhe). C: Fibras elásticas íntegras (seta) próximas às células parasitadas. D:
Fibras elásticas (seta fina), elaunínicas (seta grossa) e oxitalânicas (seta) em animais do grupo
controle (Weigert).
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41
Fig. 4.6 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He no 30º dia de experimento. A, B e C, D e E: Camundongos infectados
subcutaneamente com 10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis. A: Derme papilar
íntegra e moderado infiltrado inflamatório (***) rico em PMN e macrófagos parasitados na
derme reticular (HE). B: Discreta dissociação em alguns feixes de colágeno (seta vazada),
(Tricrômico de Masson). C: Destruição discreta de fibras musculares (**) e macrófagos
parasitados entre os feixes (cabeça de seta) (HE). D: Intenso infiltrado inflamatório perineural
composto principalmente por macrófagos (cabeça de seta) com raros parasitos livres ou no
interior dessas células (HE). E: Matriz extracelular da derme papilar sem alterações (Shorr
modificado). F: Integridade dos tecidos epitelial, conjuntivo e muscular em camundongos não
infectados (HE).
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42
Fig. 4.7 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He 30 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e C: Picrosirius red em luz não-polarizada e B e D, em luz polarizada,
formação de colágeno do tipo III (verde) entre as células inflamatórias. E e F: Destruição das
fibras oxitalânicas, conservação das elaunínicas (seta grossa) e elásticas (seta fina) (Weigert).
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43
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44
4.2.2. 60º dia após a infecção
Os camundongos BALB/c apresentaram lesões ulceradas com derme densamente
parasitada, extensas áreas de necrose e redução drástica das fibras colágenas (Fig. 4.8A). Em
33,3% dos animais a membrana basal apresentou-se descontínua, evidenciando dessa forma
degradação parcial nas áreas onde o processo inflamatório e parasitismo foram intensos (Fig.
4.8B e C e Fig. 4.9A e B). O infiltrado inflamatório apresentou o mesmo padrão observado no
30º dia de infecção, com predomínio de PMN e macrófagos parasitados. Em cortes
longitudinais e transversais de fibras musculares esqueléticas observou-se intenso infiltrado
inflamatório com presença de macrófagos infectados. A presença de amastigotas no interior
de fibras musculares, além de perda de estrias transversais foi observada (Fig. 4.9C). Os
animais infectados apesar de apresentarem preservação das fibras elásticas e elaunínicas (Fig.
4.11A), mostraram destruição das fibras de colágeno tipo I (Fig. 4.10A, B, C e D), quando
comparados aos animais do grupo controle (Fig. 4.10E e F).
Nos camundongos C3H.He notou-se intenso infiltrado inflamatório constituído
basicamente por PMN e poucos macrófagos parasitados. Notou-se ainda alteração moderada
dos componentes da MEC, quando comparados aos camundongos BALB/c (Fig. 4.11B). Em
66,7% dos animais observou-se edema, presença de eosinófilos e diapedese de células
inflamatórias (Fig. 11C e D). Observou-se ainda infiltrado inflamatório moderado entre as
fibras musculares esqueléticas, com discreta alteração destas e ausência de amastigotas neste
tecido (Fig. 4.11E). Em 33,3% dos animais havia raros macrófagos parasitados, sempre
próximos às fibras musculares (Fig. 4.11F). Nestes animais também se verificou aumento da
marcação histoquímica para o colágeno tipo III coerente ao aumento de células inflamatórias
(Fig. 4.12A e B), em outros notou-se a tentativa de reparação da derme infectada,
caracterizada pela presença de colágenos dos tipos I, III e I neoformado (Fig. 4.12C e D). A
técnica da reticulina de Gomori confirmou o aumento do colágeno tipo III nas áreas de
processo inflamatório mais intenso (Fig. 4.12E). Verificou-se ainda uma reestruturação das
fibras de colágeno e manutenção da integridade da membrana basal (Fig. 4.12F e G). A
integridade das fibras elásticas e elaunínicas foi mantida, porém as fibras oxitalânicas não
foram observadas (Fig. 4.12H).
Fig. 4.8 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 60 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A: Lesões ulceradas, derme densamente parasitada (cabeça de seta),
extensas áreas de necrose (*) e redução drástica das fibras colágenas (seta vazada) (HE). B
(HE) e C (Tricrômico de Masson): Membrana basal descontínua (setas vazadas) em áreas de
processo inflamatório (***) e parasitismo intensos (cabeça de seta)
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
45
Fig. 4.9 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 60 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e B: Descontinuidade da membrana basal (setas vazadas), onde o
processo inflamatório (***) e parasitismo (cabeça de seta) são intensos (Shorr modificado).
C: Intenso infiltrado inflamatório (***) com presença de macrófagos infectados (cabeça de
seta) em cortes longitudinais e transversais de fibras musculares esqueléticas. Detalhe:
Amastigotas no interior de fibras musculares (cabeça de seta) e ausência de estrias
transversais (HE).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
46
Fig. 4.10 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c no 60º dia do experimento. A, B, C e D: Camundongos infectados
subcutaneamente com 10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis. A e C Picrosirius red
em luz não-polarizada, B e D em luz polarizada, destruição de fibras dos colágenos tipo I, 60
dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis. E: Em
luz não-polarizada e F em luz polarizada, distribuição normal dos colágenos tipo I (vermelho)
e tipo III (verde) em animal não infectado.
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
47
Fig. 4.11 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c e C3H.He 60 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas
amastigotas de L. (L.) amazonensis. A: Acentuada destruição dos componentes colágenos da
MEC e preservação de fibras elásticas (setas finas) e elaunínicas (setas grossas) em
camundongos BALB/c (Weigert). B, C, D, E e F: camundongos C3H.He. B: Intenso
infiltrado inflamatório (***) e alteração moderada dos componentes da MEC (seta vazada)
em camundongos C3H.He (HE). C e D: Edema (estrela), eosinófilos (e), diapedese de células
inflamatórias (d) (HE). E: Infiltrado inflamatório moderado (***) entre as fibras musculares
esqueléticas, discreta alteração dessas e ausência de amastigotas (HE). F: Raros macrófagos
parasitados (cabeça de seta) próximos às fibras musculares (HE).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
48
Fig. 4.12 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He 60 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e C Picrosirius red em luz não-polarizada, B e D em luz polarizada. A e
B: Aumento de colágeno tipo III (verde) coerente ao aumento de células inflamatórias. C e D:
Tentativa de reparação da derme infectada, com presença de colágenos dos tipos I (vermelho),
III e I neoformado (amarelo). E: Aumento do colágeno tipo III (seta branca) nas áreas de
processo inflamatório mais intenso (Reticulina de Gomori). F e G: Reestruturação das fibras
de colágeno e manutenção da integridade da membrana basal (setas vazadas) (Tricrômico de
Masson). H: Integridade das fibras elásticas (seta fina) e elaunínicas (seta grossa) e ausência
das oxitalânicas (Weigert).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
49
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
50
4.2.3. 90º dia após a infecção
O sítio de infecção de camundongos BALB/c analisados apresentou intenso infiltrado
inflamatório, aumento do número de células densamente parasitadas (Fig. 4.13A e B), ruptura
de vacúolos parasitóforos e liberação de amastigotas para o espaço extracelular, além de dano
à membrana basal (Fig. 4.13B). Havia também macrófagos intensamente parasitados, com
fusão entre eles, assim como a presença de eosinófilos (Fig. 4.13C). Os músculos estriados
mostraram diminuição das estrias e aspecto eosinofílico, com severa destruição das fibras nas
áreas associadas ao parasitismo intenso (Fig. 4.13D). Nesta fase de evolução da infecção não
se evidenciou o colágeno tipo III, que estava presente aos 30 e 60 dias de infecção associado
às células do processo inflamatório (Fig. 4.14A, B, C e D). Entretanto, a degradação do
colágeno tipo III na lâmina reticular da membrana basal foi observada (Fig. 4.14E). As fibras
elásticas e elaunínicas estavam preservadas na junção dermo-epidérmica (Fig. 4.14F).
Os camundongos C3H.He demonstraram, no sítio de infecção, discreto infiltrado
inflamatório, ausência de células parasitadas, discreta desagregação das fibras da MEC e
preservação da membrana basal (Fig. 4.15A). Em 33,3% dos animais observou-se infiltrado
inflamatório com predomínio histioplasmocitário (Fig. 15B), particularmente junto às fibras
estriadas esqueléticas da derme reticular, sem evidenciação de parasitos (Fig. 4.15C). Os
outros animais (66,7%) apresentaram as fibras musculares sem alterações (dado não
mostrado). A distribuição dos colágenos do tipo I e III neste período da infecção foi coerente
ao processo de reparação da derme, sem, formação de fibrose (Fig. 4.16A, B. C e D). A
técnica tricrômico de Masson mostrou proliferação e rearranjo das fibras colágenas,
confirmando assim o processo de reparação da derme (Fig. 4.16E). A região da junção dermo-
epidérmica apresentou as fibras elásticas e elaunínicas preservadas (Fig. 4.16).
Fig. 4.13 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 90 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e B: Intenso infiltrado inflamatório (***) e células densamente
parasitadas, ruptura de vacúolos parasitóforos e liberação de amastigotas para o espaço
extracelular (cabeça de seta), intenso dano à membrana basal (setas vazadas) (Tricrômico de
Masson). C: Macrófagos intensamente parasitados e fusão entre eles (cabeça de seta),
presença de eosinófilos (e). No detalhe, maior aumento mostra eosinófilos (e) e macrófagos
fusionados, com amastigotas em seu interior (cabeça de seta) (HE) D: Diminuição das estrias
e aspecto eosinofílico do músculo esquelético, com severa destruição das fibras (**) nas áreas
associadas ao parasitismo intenso (cabeça de seta) (HE).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
51
Fig. 4.14 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 90 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e C Picrosirius red em luz não-polarizada, B e D em luz polarizada;
colágenos tipo I e III não evidenciados. A: Degradação da membrana basal (seta vazada). C:
Maior aumento demonstra macrófagos densamente parasitados com fusão entre eles (cabeça
de seta). E. Degradação do colágeno tipo III (seta branca) na lâmina reticular da membrana
basal (Reticulina de Gomori). F: Fibras elásticas (seta fina) e elaunínicas (seta grossa)
preservadas na junção dermo-epidérmica (Weigert).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
52
Fig. 4.15 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He 90 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A: Discreto infiltrado inflamatório (***), ausência de células parasitadas,
discreta desagregação das fibras da MEC (seta vazada) e preservação da membrana basal
(HE). B: Predomínio de histiócitos (h) e plasmócitos (p) e ausência de parasitos (HE). C:
Infiltrado inflamatório focal severo (***) junto às fibras estriadas esqueléticas da derme
profunda, sem a presença de parasitos (HE).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
53
Fig. 4.16 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He 90 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e C Picrosirius red em luz não-polarizada, B e D em luz polarizada;
distribuição dos colágenos do tipo I (vermelho) e III (verde) coerente ao processo de
reparação da derme. E: Proliferação e arranjo das fibras colágenas (seta vazada) compatíveis
ao processo de reparação da derme (Tricrômico de Masson). F: Junção dermo-epidérmica
apresenta fibras elásticas (seta fina) e elaunínicas (seta grossa) preservadas (Weigert).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
54
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
55
4.2.4. 120º dia após a infecção
No sítio de infecção dos camundongos BALB/c observou-se infiltrado inflamatório
difuso, constituído por PMN e macrófagos intensamente parasitados, assim como parasitos
livres, fibras colágenas degradadas, destruição da membrana basal (Fig. 4.17A) e de algumas
camadas da epiderme, o que permitiu contato dos parasitos com os queratinócitos (Fig. 4.17B,
C e D). Houve degradação dos colágenos tipos I e III na junção dermo-epidérmica (Fig.
4.18A, B, C e D). Neste ponto da infecção houve também degradação das fibras de colágeno
tipo III da derme papilar (Fig. 4.18A), assim como perda de outros componentes fibrosos da
MEC também foi observada (Fig. 4.18A, B, C e D). Um dos animais analisados apresentou
proliferação de células com características morfológicas semelhantes a dos fibroblastos e com
a presença de formas amastigotas no seu interior (Fig. 18E).
Os camundongos C3H.He, aos 120 dias pós-infecção, não apresentaram alterações
clínicas e histopatológicas (Fig. 4.19A e B). O quadro histológico foi semelhante ao
observado nos animais não infectados (Fig.4.19C e D e 4.20A e B), inclusive com o mesmo
padrão de distribuição da matriz extracelular (Fig. 4.20C e D). As mesmas características
também foram evidenciadas por meio da técnica de reticulina de Gomori (Fig. 4.20E).
Observou-se também preservação das fibras do sistema elástico (Fig. 4.20F) pela técnica de
Weigert.
Fig. 4.17 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 120 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A: Infiltrado inflamatório difuso (***), constituído por PMN e macrófagos
intensamente parasitados (cabeça de seta). B e C: Fibras colágenas bastante degradadas e
destruição da membrana basal (setas vazadas) (Tricrômico de Masson). D: Destruição da
membrana basal e camadas da epiderme (seta vazada). O detalhe mostra o contato de
parasitos (cabeça de seta) com queratinócitos (Shorr modificado).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
56
Fig. 4.18 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos BALB/c 120 dias após a infecção subcutânea com 10
4
formas amastigotas de L.
(L.) amazonensis. A e C Picrosirius red em luz não-polarizada, B e D em luz polarizada;
colágenos dos tipos I e III intensamente degradados, inclusive na junção dermo-epidérmica.
E: Proliferação de células com características morfológicas semelhantes a dos fibroblastos,
algumas dessas células exibem formas amastigotas (cabeça de seta) em seu interior (HE).
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
57
Fig. 4.19 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He aos 120 dias de experimento. A (HE) e B (Shorr modificado):
Ausência de lesões nos camundongos infectados subcutaneamente com 10
4
formas
amastigotas de L. (L.) amazonensis, regeneração da arquitetura tecidual. C (Tricrômico de
Masson) e D (HE): Quadro histológico de camundongos não infectados.
________________________________________________________________Silva-Almeida, M
58
Fig. 4.20 Análise histopatológica de fragmentos da pele do coxim plantar esquerdo de
camundongos C3H.He aos 120 dias de experimento. A e C Picrosirius red em luz não-
polarizada, B e D em luz polarizada; A e B: Camundongos infectados subcutaneamente com
10
4
formas amastigotas de L. (L.) amazonensis exibem o mesmo padrão da matriz extracelular
que os animais não infectados (C e D), com preservação das estruturas dérmicas e
epidérmicas. E: Fibras do colágeno do tipo III (seta branca) nos camundongos infectados
apresentam padrão semelhante ao observado nos camundongos normais (Reticulina de
Gomori). F: Fibras do sistema elástico preservadas nos camundongos infectados (Weigert).
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4.3. Análise imunohistoquímica das proteínas fibronectina e laminina
Os camundongos BALB/c apresentaram do início ao fim da infecção um aumento
significativo de fibronectina quando comparados aos animais não infectados. Todos os
camundongos C3H.He analisados, infectados ou não, apresentaram uma diminuição desta
proteína aos 120 dias de infecção (Fig. 4.21, 22 e 23).
Não houve alterações significativas na análise da proteína laminina durante todo o
curso da infecção nos dois modelos estudados (Fig. 4.24, 25 e 26).
A significância da análise estatística desses resultados está expressa na Tabela 4.1A, B
e C.
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5. DISCUSSÃO
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Atualmente milhões de pessoas em 88 países estão expostas ao risco de contrair
leishmaniose. As leishmânias infectam os chamados fagócitos profissionais neutrófilos,
macrófagos, bem como células dendríticas (Rittig & Bogdan, 2000). Entretanto, o mecanismo
imunológico que confere resistência ou suscetibilidade às leishmanioses e particularmente a
causada pela L. (L.) amazonensis permanece incerto (Serezani et al., 2006). Fatores como
local de inoculação dos parasitos, carga parasitária e citocinas expressas resultam na variação
da severidade da infecção em diferentes linhagens de camundongos singênicos (Cardoso,
2006; Baldwin et al.,2003). Fatores relacionados à suscetibilidade à leishmaniose causada por
diferentes espécies de Leishmania parecem ser regulados por loci genéticos distintos,
explicando deste modo porque fatores de virulência do parasito, assim como o papel de
citocinas e moléculas co-estimulatórias variam de acordo com a espécie do parasito
(McMahon-Pratt & Alexander, 2004).
As linhagens de camundongos escolhidas no presente estudo baseiam-se nos trabalhos
preliminares realizados pelo nosso grupo, que permitiram a determinação dos graus de
suscetibilidade e resistência à infecção subcutânea por L. (L.) amazonensis em diferentes
linhagens de camundongos singênicos (Cardoso, 2006). Com base nos resultados deste
estudo, escolhemos como representantes do pólo mais suscetível a linhagem de camundongos
BALB/c e do pólo menos suscetível os da linhagem C3H.He.
A análise dos resultados obtidos pela cinética da lesão mostrou que os camundongos
BALB/c apresentaram lesões maiores que os C3H.He corroborando os dados de Cardoso
(2006). A avaliação histopatológica dos coxins dos camundongos da linhagem BALB/c,
quando comparado aos C3H.He, confirmou este grau de suscetibilidade a L. (L.) amazonensis.
Os camundongos BALB/c infectados apresentaram um intenso infiltrado inflamatório na
derme reticular com inúmeros macrófagos parasitados; este quadro foi progressivo ao longo
de todo o experimento. Nos camundongos C3H.He observou-se um infiltrado inflamatório
moderado, com a presença de poucos parasitos e resolução das lesões desenvolvidas ao final
do experimento confirmando que esses animais são menos suscetíveis à infecção pela L. (L.)
amazonensis.
A infecção do tecido muscular esquelético por parasitos é pouco estudada. Em cães, a
miopatia inflamatória está associada a várias doenças infecciosas como as provocadas por
Toxoplasma gondii ou Neospora caninum. Contudo, a doença muscular causada por
Leishmania spp. tem sido pouco relatada. Recentemente, Paciello et al. (2009) relataram uma
miopatia inflamatória em cães naturalmente infectados com L. (L.) infantum, entretanto, por
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não terem observado a presença de amastigotas nas fibras musculares pelas formas
amastigotas deste parasito, afirmaram que estes parasitos não seriam capazes de infectar estas
células, contradizendo os resultados anteriores de Vamvakidis et al. (2000), em cães também
naturalmente infectados. No presente estudo, a avaliação das fibras musculares dos
camundongos BALB/c no sítio de inoculação mostrou um comprometimento muscular já no
início da infecção, com a presença de infiltrado inflamatório composto principalmente por
macrófagos infectados, fibras musculares rompidas, com perda das estriações transversais e
presença de amastigotas no interior destas fibras, corroborando os dados obtidos por
Vamvakidis et al. (2000) no modelo cão. O comprometimento muscular observado neste
trabalho foi progressivo ao longo da infecção. A avaliação das lesões dos camundongos
C3H.He mostrou um comprometimento muscular mais discreto nos primeiros meses,
contudo, aos 120 dias de infecção esses animais apresentaram um quadro histológico
semelhante ao observado nos animais não infectados, sugerindo uma capacidade de reparação
tecidual nesta linhagem. Mais estudos são necessários a fim de se identificar o meio de
entrada dos parasitos nas células musculares, uma vez que estas não são fagócitos
profissionais; onde elas se localizam, quando no interior da célula; e se há ou não formação de
fagolisosomos.
Um dos principais eventos descrito no início das doenças infecciosas em geral, é a
ligação do patógeno a células epiteliais do hospedeiro e posteriormente a penetração desses
parasitos nessas células, levando a progressão da doença. Durante este trânsito os parasitos
interagem com constituintes da matriz extracelular (Ghosh et al, 1999). No ciclo de
transmissão das leishmanioses as formas promastigotas são regurgitadas pelo vetor durante o
repasto sanguíneo, e no interior de macrófagos residentes transformam-se em amastigotas e se
multiplicam. Eventualmente os parasitos liberados no espaço intersticial, devido à lise de
macrófagos, invadem outras células dando continuidade ao ciclo. Durante o trânsito no meio
extracelular, esses parasitos intracelulares entram em contato com a matriz extracelular e a
membrana basal das células. Ghosh et al. (1996) e Ghosh et al. (1999) descreveram a
presença de uma proteína de ligação a laminina (laminin biding protein) na superfície de
promastigotas de L. (L.) donovani que pode mediar à adesão celular. A habilidade desta
proteína em se ligar a proteínas da matriz extracelular como a laminina, provavelmente
influencia o curso clínico da doença causada por esta espécie em seus hospedeiros. Esta
habilidade pode permitir que o parasito persista no hospedeiro contribuindo assim para a sua
patogenicidade. Além disso, pode também facilitar a adesão do parasito às células hospedeiras
tais como macrófagos, via receptores de laminina presentes na superfície celular
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(Bandyopadhyay et al., 2002). Posteriormente, Ghalbzouri et al (2005) demonstraram in vitro,
a expressão de laminina por queratinócitos e relataram que esta proteína medeia a ligação
destas células ao compartimento dérmico somente quando fibroblastos ou fatores de
crescimento exógenos estão presentes. Demonstrando assim a importância da interação entre
as células epiteliais e as de origem mesenquimal na regulação da síntese de componentes da
membrana basal.
A pele é composta de epiderme, derme e tecido subcutâneo anatomicamente
interconectado. É um sistema integrado de tecido conjuntivo frouxo, mais próximo a
epiderme, e denso não modelado mais profundamente, que acomoda nervos, vasos,
fibroblastos, macrófagos e mastócitos, representando um obstáculo à mobilidade parasitária e
ao acesso aos nutrientes (Rhoads & Fetterer, 1997). A L. (L.) amazonensis, por ser uma
espécie preferencialmente dermotrópica, possui como característica um maior envolvimento
com componentes da matriz extracelular, em geral colágenos e especialmente com proteínas
multifuncionais, como a fibronectina e a laminina (Abreu-Silva et al., 2004; Giunchetti et al.,
2006). Assim, podemos afirmar que a presença dos parasitos influencia na síntese de
fibronectina e laminina e desta forma interfere na adesão, endocitose e consequente
internalização destes parasitos. Silva (2008) mostrou in vitro, uma relação entre o perfil de
produção de fibronectina e laminina e o processo de adesão e interiorização de formas
promastigotas de L. (L.) amazonensis em células do epitélio pigmentado da retina. Desta
forma, o aumento da expressão destas proteínas estava diretamente associado a um número
elevado de parasitos aderidos e interiorizados nestas células.
A fibronectina está envolvida na endocitose de vários tipos de partículas por diferentes
fagócitos (Vannier-Santos et al., 1992). Ela determina o aumento da migração da Leishmania
spp. no sítio da infecção, facilitando seu acesso às células alvos e disseminação. A degradação
da fibronectina gera compostos que funcionam como quimioatratores de macrófagos
estimulando o aumento da fagocitose dos parasitos (Kulkarni et al., 2008; McGwire et al.,
2003; Vannier-Santos et al., 1992). No presente modelo observa-se um aumento da
fibronectina nos animais BALB/c, suscetíveis à L. (L.) amazonensis, os quais apresentaram
lesões mais graves, com intenso parasitismo, associados a um severo infiltrado inflamatório.
Nos animais C3H.He, menos suscetíveis a infecção, as lesões eram menores, com poucos
parasitos, e menor quantidade da proteína fibronectina. Estes resultados foram similares aos
descritos por Calvet et al., (2004) na infecção experimental por Trypanosoma cruzi, in vivo,
que observaram o aumento da fibronectina associado ao infiltrado inflamatório em
camundongos suíços.
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A avaliação da laminina neste trabalho demonstrou que não houve diferença
significativa na produção desta proteína nos camundongos C3H.He e BALB/c infectados bem
como nos controles. Esses dados corroboram os de Abreu-Silva et al. (2004) que também não
observaram alteração na expressão da laminina em animais suscetíveis, BALB/c, e ou
resistentes, DBA/2, a L. (L.) amazonensis.
Segundo Kulkarni et al. (2008) a degradação da laminina pelo parasito pode contribuir
para o rompimento da matriz extracelular, facilitando a dispersão local do parasito, e a ruptura
da membrana basal que pode levar a dispersão do parasito para outros órgãos. A avaliação da
membrana basal no presente estudo mostrou intenso dano a esta estrutura a partir do 60º dia
de infecção nos camundongos da linhagem BALB/c. Esses achados podem explicar o
comportamento de visceralização da espécie L. (L.) amazonensis, como descrito por Abreu-
Silva et al., (2003) em camundongos, por Tolezano et al., (2007) em cães naturalmente
infectados e por Barral et al. (1991) em humanos.
Vários estudos mostram a existência de ligantes que participam na interação entre a
Leishmania spp. e células hospedeiras (Chang et al., 2002; Lira et al., 1997). Estes estudos
demonstram que as promastigotas de Leishmania spp. se ligam ao colágeno do tipo I da célula
hospedeira e que esta interação é específica e saturável. Lira et al. (1997) sugeriram que
muitos parasitos, incluindo os do gênero Leishmania, produzem proteínas que degradam
componentes da matriz extracelular, facilitando a abertura da barreira dérmica, produzindo
assim um afrouxamento da matriz do tecido conjuntivo e permitindo a expansão da infecção.
Posteriormente, Abreu-Silva et al. (2004) demonstraram que as alterações nos componentes
da matriz extracelular são mais evidentes onde a presença de parasitos é maior e observaram
que há uma substituição de colágenos ao longo da evolução da infecção.
No presente estudo, alterações nos componentes colagenosos da matriz extracelular
também foram observadas nos coxins de camundongos BALB/c, nos quais se notou uma
produção significativa de colágeno tipo III nos primeiros meses de infecção, em regiões do
tecido onde o processo inflamatório era mais intenso. Este aumento pode ser explicado pela
função do colágeno tipo III de sustentar as células inflamatórias presentes no sítio da infecção.
Como estas células estavam em grade quantidade, o colágeno tipo III também se apresentava
aumentado, neste período da infecção. Com o avanço da infecção, o número de macrófagos
contendo amastigotas em seus vacúolos parasitóforos aumentou consideravelmente ocupando
onde antes havia componentes da matriz extracelular. Com isso, nos tempos mais avançados
da infecção o colágeno tipo III não era identificado, bem como o tipo I que desde o 60º dia de
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infecção já estava degradado, na maioria dos animais desta linhagem. Aos 120 dias de
infecção os danos teciduais se estenderam a ponto de observarmos degradação até da
membrana basal. Os achados de substituição dos colágenos ao longo da infecção confirmaram
os dados de Abreu-Silva et al. (2004), que descreveram uma diminuição do colágeno tipo I e
um aumento do tipo III nos camundongos BALB/c. Nos camundongos C3H.He também
houve aumento do colágeno tipo III nos tempos iniciais de infecção, onde havia células
inflamatórias em maior quantidade. Porém a partir de 60 dias de infecção já foi possível notar
em alguns animais o reaparecimento do colágeno tipo I e a presença do tipo I neoformado, o
que condiz com a tentativa da manutenção da arquitetura tecidual, coerente com o processo de
regeneração da derme, sem formação de fibrose, o que caracterizaria uma reparação por
cicatrização.
As fibras elásticas são pouco estudadas nas doenças parasitárias e nas leishmanioses,
há pouquíssimos relatos de alterações destas fibras. Estas são divididas em fibras elásticas,
fibras elaunínicas e fibras oxitalânicas com função de conferir elasticidade à pele. As fibras
elásticas e elaunínicas possuem componentes microfibrilar e amorfo da matriz, a elastina,
enquanto as fibras oxitalânicas contêm somente microfibrilas (Prost-Squarcioni et al., 2008).
Um estudo de Esterre et al. (1991) sobre a remodelação da matriz extracelular em lesões de
leishmaniose cutânea em humanos verificou através de microscopia eletrônica deposição de
componentes da matriz no sítio da infecção, entre eles elastina, porém não descreveu de forma
explícita o que ocorre com as fibras elásticas na infecção. Nossos dados mostraram que em
ambas as linhagens de camundongos estudadas as fibras oxitalânicas já estavam ausentes no
sítio de inoculação desde os 30 dias de infecção, enquanto as elásticas e elaunínicas, fibras
insolúveis (Kielty, 2006; Montes, 1996) estavam preservadas. Todavia, aos 120 dias de
infecção, nos camundongos C3H.He, as fibras oxitalânicas voltaram a compor a matriz
extracelular do tecido reparado.
A infecção de células neurais por leishmânias também é pouco estudada, todavia
alguns autores têm descrito, in vivo e in vitro, a infecção perineural associada a infiltrado
inflamatório (Baetas-da-Cruz et al., 2009; Satti et al., 1989; Kubba et al., 1987). No presente
trabalho demonstramos em camundongos da linhagem C3H.He um infiltrado inflamatório
perineural, com presença de raros parasitos livres ou no interior de vacúolos, aos 30 dias de
infecção. Ao contrário do observado nos tempos mais avançados da infecção, onde o processo
de reparação foi verificado.
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Segundo Toriseva e Kähäri (2009) o reparo de lesões é um processo contínuo e
dinâmico e se confunde entre inflamação, proliferação e remodelagem aonde células do
sistema imunológico inato como neutrófilos, chegam primeiramente seguido de macrófagos,
linfócitos e finalmente, fibroblastos. Para a maioria das lesões, a reparação resulta em um
acúmulo de fibroblastos e de matriz extracelular desorganizada, sobretudo os colágenos,
comumente referidos como cicatriz. Entretanto, a resposta a uma injúria pode recuperar
completamente a arquitetura tecidual original, por um processo ainda pouco compreendido
chamado regeneração (Gurtner et al., 2008).
Cardoso (2006) demonstrou pela técnica de análise de diluição limitante a persistência
parasitária nos linfondos drenantes de camundongos C3H.He 120 após inoculação de L. (L.)
amazonensis no coxim plantar destes animais. A persistência dos parasitos nos linfonodos
poderia estar sendo responsável pela manutenção de uma resposta imunológica duradoura,
como sugeriram Moll et al. (1995). No presente trabalho, a ausência de parasitos na derme
dos camundongos, confirmada pela análise histopatológica e imunohistoquímica, portanto não
define cura e sim resolução da infecção ao menos no sítio de inoculação dos parasitos.
Nossos resultados corroboram os dados obtidos por Cardoso (2006) que descreveu
padrões de resistência e suscetibilidade a L. (L.) amazonensis em diferentes linhagens de
camundongos isogênicos experimentalmente infectados. Diante dos resultados obtidos em
nosso estudo, podemos concluir que os camundongos BALB/c apresentaram um maior grau
de suscetibilidade à L. (L.) amazonensis quando comparados aos camundongos C3H.He, com
uma maior carga parasitária no sítio da infecção, manifestações inflamatórias e alterações dos
componentes da matriz em todo o curso da infecção. Concluímos também que a habilidade
dos camundongos da linhagem menos susceptível C3H.He de controlar a infecção pode estar
associada a sua maior capacidade de expressar componentes da matriz extracelular que estão
associados à manutenção da integridade e homeostasia tecidual.
6. CONCLUSÕES
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• Camundongos BALB/c e C3H.He respondem de forma diferente a infecção por L. (L.)
amazonensis. O processo inflamatório apresentado pelos camundongos BALB/c durante o
curso da infecção por L. (L.) amazonensis foi mais severo que o apresentado pelos
camundongos C3H.He.
• Os camundongos BALB/c e C3H.He até 60 dias de infecção por L. (L.) amazonensis
respondem igualmente quanto a diminuição do colágeno do tipo I e progressivo aumento
do colágeno tipo III. Nos camundongos BALB/c esta degradação foi progressiva e
perdurou até o final da infecção.
• A partir do 90º dia de infecção por L. (L.) amazonensis os camundongos C3H.He mostram
padrão histológico normal com reparação dos colágenos tipo I e tipo III.
• Há preservação das fibras elásticas e elaunínicas nos camundongos BALB/c e C3H.He e
degradação das fibras oxitalânicas nos camundongos BALB/c durante todo o experimento.
• A partir de 90 dias de infecção por L. (L.) amazonensis os camundongos C3H.He
apresentam recuperação das fibras oxitalânicas.
• As duas linhagens de camundongos estudadas nesse trabalho apresentam
comprometimento muscular, demonstrando a capacidade da L. (L.) amazonensis de
infectar células musculares.
• Os camundongos C3H.He são capazes de regenerar as lesões musculares a partir do 90º
dia de infecção.
• Ocorre uma diferença na produção de fibronectina no modelo estudado. Esta proteína
aumenta ao longo da infecção por L. (L.) amazonensis nos camundongos BALB/c e
diminui nos camundongos C3H.He infectados e não infectados.
• Não há alterações significativas de laminina nos dois modelos estudados.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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