( PDF ) Alcalóides tropânicos de Erythroxylum caatingae Plowman (Erythroxylaceae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA

PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SINTÉTICOS BIOATIVOS

STENO LACERDA DE OLIVEIRA

Alcalóides Tropânicos de Erythroxylum caatingae

Plowman (Erythroxylaceae).

JOÃO PESSOA

2008

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STENO LACERDA DE OLIVEIRA

Alcalóides Tropânicos de Erythroxylum caatingae Plowman

(Erythroxylaceae).

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação

em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos da

Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento às

exigências para a obtenção do título de Mestre em

Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de

Concentração Farmacoquímica.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcelo Sobral da Silva.

João Pessoa

2008

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STENO LACERDA DE OLIVEIRA

Alcalóides Tropânicos de Erythroxylum caatingae Plowman

(Erythroxylaceae).

Banca examinadora

Prof. Dr. Marcelo Sobral da Silva (Orientador)

Profª. Drª. Bárbara Viviana de Oliveira Santos (Examinador interno)

Prof. Dr. João Xavier de Araújo Júnior (Examinador externo)

AGRADECIMENTOS

A Deus, fonte de força e inspiração para vencer os obstáculos em toda essa caminhada.

Ao Prof. Dr. Marcelo Sobral da Silva pela amizade e pelos ensinamentos e orientação.

Aos professores de graduação e pós-graduação pela participação em minha formação

acadêmica.

À Profa. Dra Maria de Fátima Agra pela identificação do material botânico.

Prof. João Xavier de Araújo Júnior do Laboratório de Pesquisas em Recursos Naturais Escola

de Enfermagem e Farmácia/ Instituto de Química e Biotecnologia - UFAL

pela ajuda na

realização dos espectros de RMN e Cristalografia de Raio-x.

A Patrick Wehrung da Plateforme de Chimie Biologique Intégrative de Strasbourg (PCBiS)

IFR 85 e Martine Schmitt Laboratoire de Pharmacochimie Faculté de Pharmacie 74 route du

Rhin – 67400 ILLKIRCH, pela realização do CL-EM/EM.

À Vicente Carlos pela obtenção dos espectros de RMN e pela amizade firmada ao longo desta

caminhada.

Aos técnicos Welington Navarro e Sócrates Golzio pela obtenção dos espectros de IV e a

Raimundo Nonato pelas ajudas constantes na bancada e pela amizade.

Ao Sr. Severino (Seu Bil) pela destilação dos solventes utilizados.

Ao Sr. Gilvan Góes pela coleta do material botânico

A Gil, Crispim, Tânia e Dinho pelo carinho nesta caminhada.

As alunas de Iniciação Científica, Helane, Ana Lívia e Karine, pessoas fundamentais no

desenvolvimento desse trabalho.

Aos Amigos Jackson, Fernando Medeiros, Sócrates, Gabriela pelos vários ensinamentos na

bancada, em espectroscopia e pela excelente convivência dentro e fora do laboratório.

Ao meu grande amigo Josean, pela amizade, companhia e ensinamentos.

Em especial aos meus pais Ariovaldo Carneiro e Maria Iraquitânia, pelo incentivo e apoio em

todos os momentos e pelo amor que sempre demonstraram e por sempre creditar em mim.

Aos meus irmãos Stéfano e Stanley pelo apoio, carinho, amizade e por sempre acreditar no

meu potencial e a minha sobrinha Jéssica pela amizade e grande carinho e minha irmã,

Slovênia que foi minha grande incentivadora e que sempre esteve ao meu lado em todos os

momentos dessa caminhada.

A meu tio Idagman e minha tia Nenzinha pelo apoio e amizade quando vim morar aqui em

João Pessoa.

Aos amigos de apto. Daniel, João Paulo, Josean, Marcão, Gilberto, Antônio Nei, Willian,

Herman, Jileno e Vanda pela amizade e excelente convivência durante todos esses anos.

Aos meus amigos Gregório, Max, Elane, Charlane, Laura, Nathália, Cristiane, Daniela pela

amizade e companhia.

A todos os meus colegas de graduação que conviveram todos esses anos comigo nessa

caminhada e aos meus amigos de turma em especial a Adriana, Vivianne, Camila Carolina,

Gabriela, Wylly e Danielle pelo apoio, amizade e carinho.

Ao CNPq pelo apoio financeiro

RESUMO

Erythroxylum caatingae Plowman, (Erythroxylaceae) foi coletada em Picuí-PB, Brasil e, em

seguida identificada pela botânica Prof. Maria de Fátima Agra do Laboratório de Tecnologia

Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba. Uma exsicata encontra-se depositada no

Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB), sob o n° 5666. Um estudo fitoquímico com o caule

dessa espécie realizado no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica reportou o isolamento de

três alcalóides do tipo tropânico, sendo eles: 3α, 6β dibenzoiloxitropano, 3α–(3,4,5

trimetoxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano (Catuabine B), 3α-(3,4,5 trimetoxibenzoiloxi) -6β-

benzoiloxitropano. Dando continuidade a esse estudo fitoquímico o pó do caule seco e

pulverizado foi submetido a uma extração para alcalóides com clorofórmio, NH

OH e ácido

clorídrico a 3%, resultando na Fração de Alcalóides Totais. A Fração de Alcalóides totais foi

cromatografada em coluna de sílica gel onde foi possível isolar e identificar dessa espécie três

alcalóides. Todas essas substâncias tiveram sua identificação estrutural baseada na análise de

dados espectrais de IV, RMN

H e

C, incluindo técnicas bidimensionais homonucleares

(COSY e NOESY) e heteronucleares (HMQC e HMBC), cristalografia de raio-X, além de

comparação com dados da literatura. Os alcalóides EC-1 e EC-2 já foram relatados no gênero

Erythroxylum e EC-3 é relatado pela primeira vez neste trabalho.

Palavras-Chave: Erythroxylaceae, Erythroxylum caatingae, Alcalóides.

ABSTRACT

Erythroxylum caatingae Plowman, (Erythroxylaceae) was collected in Picuí-PB, Brazil, and

then identified by botany prof. Maria de Fatima Agra, from Pharmaceutical Technology

Laboratory of the Federal University of Paraíba. Am exsicata is deposited in the Herbarium

prof. Lauro Pires Xavier (JPB), under paragraph 5666. A phytochemical study with stem

conducted at the Laboratory of Pharmaceutical Technology reported the isolation of three

alkaloids of the tropane nucleus: 3α, 6β dibenzoyloxytropane, 3α–(3,4,5

trimethoxybenzoyloxy)-6β-benzoyloxytropane (Catuabine B) and 3α – (3, 5

dimethoxybenzoyloxy)-6β-benzoyloxytropane. Continuing this phytochemical study the dried

powder and sprayed the stem was submitted to an alkaloids extraction with chloroform,

OH, 3% hydroclorid acid, resulting in the Total Alkaloids Fraction. The Total Alkaloids

Fraction was chromatographed over silica gel column leding to the isolation of, three

alkaloids from this species. The structure elucidation of all these compounds was made based

on the analysis of the IR,

H and

C NMR sepectral data, including homonuclear (COSY and

NOESY) and heteronuclear (HMQC and HMBC) two-dimensional techniques, and X-ray

crytallography and compared with literature data. The alkaloids EC-1 and EC-2 are cited in

genus Erythroxylum and EC-3 is being reported for the first time herein.

Key-word: Erythroxylaceae, Erythroxylum caatingae, Alkaloids.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição do gênero Erythroxylum...................................................................... 22

Figura 2. Principais constituintes do Gênero Erythroxylum.....................................................23

Figura 3. Alguns alcalóides tropânicos isolados de espécies do gênero Erythroxylum .......... 24

Figura 4. Alguns diterpenos de espécies do gênero Erythroxylum ......................................... 25

Figura 5. Alguns flavonóides de espécies do gênero Erythroxylum ....................................... 26

Figura 6. Erythroxylum caatingae........................................................................................... 27

Figura 7. Mapa de distribuição das Erythroxylaceae na Paraíba, Brasil................................. 28

Figura 8. Alguns alcalóides fisiologicamente ativos e as plantas que a produzem................. 32

Figura 9. Biossíntese do anel tropano......................................................................................38

Figura 10. Espectro de massas de EC 1 gerado através da método de ionização ESI.............51

Figura 11. Espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-1 em CDCl

................................. 52

Figura 12. Espectro de IV de EC-1 em pastilhas de KBr........................................................ 53

Figura 13. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-1 em CDCl

na região

entre δ

125-165 ppm............................................................................................................... 54

Figura 14. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-1 em CDCl

na região

entre δ

35-80 ppm................................................................................................................... 55

Figura 15. Espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-1 em CDCl

........................................... 56

Figura 16. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre

7,0-8,2 ppm..........................................................................................................................57

Figura 17. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre

5,3-5,9 ppm..........................................................................................................................58

Figura 18. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre

1,5-3,5 ppm..........................................................................................................................59

Figura 19. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

HSQC (500 MHz) de EC-1 em

CDCl

na região entre δ

35-80 ppm........................................................................................ 60

Figura 20. Expansão do espectro de RMN

H x

H COSY (500 MHz) de EC-1 em CDCl

região entre δ

1,0-6,0 ppm...................................................................................................... 61

Figura 21. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-

1 em CDCl

na região entre δ

58-82 ppm............................................................................... 62

Figura 22. Espectro de massas de EC-2 gerado através do método de ionização ESI............ 67

Figura 23. Espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-2 em CDCl

................................. 68

Figura 24. Espectro de IV de EC-2 em pastilhas de KBr........................................................ 69

Figura 25. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-2 em CDCl

na região

entre δ

100-160 ppm............................................................................................................... 70

Figura 26. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-2 em CDCl

na região

entre δ

35-80 ppm................................................................................................................... 71

Figura 27. Espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

........................................... 72

Figura 28. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre

7,3-8,1 ppm..........................................................................................................................73

Figura 29. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre

5,3-5,9 ppm..........................................................................................................................74

Figura 30. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre

2,8-4,0 ppm..........................................................................................................................75

Figura 31. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre

1,8-2,6 ppm..........................................................................................................................76

Figura 32. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

HSQC (500 MHz) de EC-2 em

CDCl

....................................................................................................................................... 77

Figura 33. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-

2 em CDCl

na região entre δ

33-41 ppm............................................................................... 78

Figura 34. Expansão do espectro de RMN

H x

H COSY (500 MHz) de EC-2 em CDCl

.. 79

Figura 35. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-

2 em CDCl

na região entre δ

164-166ppm............................................................................ 80

Figura 36. Cristalografia de raio-X da EC-3 ........................................................................... 84

Figura 37. Espectro de massas de EC-3 gerado através do método de ionização ESI............ 86

Figura 38. Espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-3 em CDCl

................................. 87

Figura 39. Espectro de IV de EC-3 em pastilhas de KBr........................................................ 88

Figura 40. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-3 em CDCl

na região

entre δ

110-170 ppm............................................................................................................... 89

Figura 41. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-3 em CDCl

na região

entre δ

30-80 ppm................................................................................................................... 90

Figura 42. Espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

........................................... 91

Figura 43. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre

7,3-8,0 ppm..........................................................................................................................92

Figura 44. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre

5,3-5,9 ppm..........................................................................................................................93

Figura 45. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre

3,3-4,1 ppm..........................................................................................................................94

Figura 46. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre

1,8-2,9 ppm..........................................................................................................................95

Figura 47. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

HSQC (500 MHz) de EC-3 em

CDCl

na região entre δ

56-82 ppm........................................................................................ 96

Figura 48. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

HSQC (500 MHz) de EC-3 em

CDCl

na região entre δ

32-42 ppm........................................................................................ 97

Figura 49. Expansão do espectro de RMN

H x

H COSY (500 MHz) de EC-3 em CDCl

.. 98

Figura 50. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-

3 em CDCl

na região entre 125-175 ppm ............................................................................... 99

Figura 51. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de

EC-3 em CDCl

na região entre 60-80 ppm........................................................................... 100

Figura 52. LC-MS-MS com fonte ESI de EC-1 (A) (3α, 6β dibenzoiloxitropano), EC-2 (B)

(Catuabine B) e EC-3 (C) (3α-3,4,5 trimetoxibenzoiloxi -6β-benzoiloxitropano) ................ 103

Figura 53. Espectro de massas e fragmentação do pico 1 de EC-1....................................... 105

Figura 54. Espectro de massas e fragmentação do pico 2 de EC-1....................................... 106

Figura 55. Espectro de massas e fragmentação do pico 3 de EC-1....................................... 107

Figura 56. Espectro de massas e fragmentação do pico 1 de EC-2....................................... 108

Figura 57. Espectro de massas e fragmentação do pico 2 de EC-2....................................... 109

Figura 58. Espectro de massas e fragmentação do pico 3 de EC-2....................................... 110

Figura 59. Espectro de massas e fragmentação do pico 4 de EC-2....................................... 111

Figura 60. Espectro de massas e fragmentação do pico 1 de EC-3....................................... 112

Figura 61. Espectro de massas e fragmentação do pico 2 de EC-3....................................... 113

Figura 62. Espectro de massas e fragmentação do pico 3 de EC-3....................................... 114

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Dados de RMN de

H e

C uni e bidimensionais em CDCl

a 500 MHz e 125 MHz

de EC-1 (3α, 6β dibenzoiloxitropano) .....................................................................................50

Tabela 2: Dados de RMN de

H e

C uni e bidimensionais em CDCl

a 500 MHz e 125 MHz

de EC-2 (Catuabina B)............................................................................................................. 66

Tabela 3: Dados de RMN de

H e

C uni e bidimensionais em CDCl

a 500 MHz e 125 MHz

de EC-3 (3α – (3, 5 dimetoxi-4’-hidroxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano)........................... 85

Tabela 4: Dados do CL-EM-EM de cada íon analisado e suas fragmentações. ...................104

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Classificação de Erythroxylum caatingae.............................................................. 29

Quadro 2. Classificação de alcalóides de acordo com o precursor biogenético ..................... 34

Quadro 3. Fracionamento cromatográfico da fração de alcalóides 1......................................44

Quadro 4. Dados da reunião das frações após monitoração em CCDA.................................. 45

Quadro 5. Parâmetros utilizados para análise na CLAE ....................................................... 101

Quadro 6. Parâmetros utilizados para análise no Espectrômetro de Massas ........................ 101

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1. Marcha para extração de alcalóides das folhas de Erythroxylum caatingae .. 42

Fluxograma 2. Extração de alcalóides da fase aquosa a pH 8,0 do caule de Erythroxylum

caatingae .................................................................................................................................. 43

Fluxograma 3. Extração de alcalóides da fase aquosa a pH 9,0 do caule de Erythroxylum

caatingae .................................................................................................................................. 44

Fluxograma 4. Processo cromatográfico da Fração de Alcalóides 1......................................45

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

APT “Attached Proton Test”

CC Cromatografia em Coluna

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CL-EM-EM Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas

COSY “Correlation Spectroscopy”

d Dupleto

dd Duplodupleto

EC Erythoxylum caatingae

ESI “Electrospray ionization”

HMBC “Heteronuclear Multiple Bond Correlation”

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

IV Infravermellho

J Constante de acoplamento

m Multipleto

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

ppm Partes por milhão

RMN

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

RMN

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

s Simpleto

sl Simpleto largo

t Tripleto

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 18

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 21

2.1

Considerações sobre a família Erythroxylaceae

2.2

Considerações sobre o gênero Erythroxylum

2.3

Erytohroxylum caatingae

2.4

Classificação botânica

2.5

Consideração sobre alcalóides

2.5.1

Alcalóides tropânicos

2.5.2

Importância e biossíntese de alcalóides tropânicos

3 OBJETIVOS 39

3.1

Objetivo Geral

3.2

Objetivos Específicos

4 EXPERIMENTAL 40

4.1

Especificações dos Materiais, Métodos e Equipamentos Utilizados

4.2

Coleta dos materiais botânicos

4.3

Processamento do Caule de Erythroxylum caatingae

4.4

Obtenção do extrato metanólico bruto

4.5

Metodologia para isolamento de alcalóides

4.6

Fracionamento cromatográfico

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 46

5.1

Substâncias isoladas do caule de Erythroxylum caatingae

5.2

Identificação estrutural dos constituintes químicos de E. caatingae

5.2.1

Identificação estrutural de EC 1

5.2.2

Elucidação estrutural de EC 2

5.2.3

Elucidação estrutural de EC 3

6 ANÁLISE DE EC-1, EC-2 E EC-3 POR CL-EM/EM 101

7 CONCLUSÕES 115

8 PERSPECTIVAS 116

REFERÊNCIAS 117

1 INTRODUÇÃO

As primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo homem remontam às

sagradas escrituras e ao papiro de Ebers. Este papiro foi descoberto e publicado por Georg

Ebers, sendo traduzido pela primeira vez, em 1890, por H. Joachin. Foi encontrado nas

proximidades da casa mortuária de Ramsés II, porém pertence à época da XVIII dinastia.

Enumera mais ou menos 100 doenças e descreve um grande número de drogas de natureza

animal e vegetal. Porém o isolamento das primeiras substâncias puras do reino vegetal

começa a acontecer no século XVIII. Este século, juntamente com o XIX, caracteriza-se pelos

trabalhos de extração, principalmente de ácidos orgânicos e de alcalóides. (PINTO, 2002).

A história do Brasil está intimamente ligada ao comércio de produtos naturais (as

especiarias), que determinaram as várias disputas de posse da nova terra e, por fim a

colonização portuguesa. Do pau-brasil (Cesalpinia echinata) era obtido um corante de cor

vermelha, muito utilizada para tingimento de roupas e como tinta de escrever, que já era

conhecido e utilizado nas Índias Orientais desde a idade média. Alem, do pau-brasil, que foi

extraído de forma predatória do nosso território até quase sua extinção, muitos outros

produtos despertaram interesse por parte dos europeus que aportaram na terra recém

descoberta. A morina obtida de Chlorofora tinctoria, foi outro corante exportado para a

Europa, permanecendo em destaque no comércio até o desenvolvimento da química das

anilinas na Alemanha (VIEGAS-JUNIOR, 2006).

As plantas têm a habilidade de produzir dezenas de milhares dos metabólitos

secundários altamente complexos para ajudar a sua sobrevivência no ambiente, muito dos

quais ajudam a proteger a planta contra predadores. Porém o homem explorou estes

compostos naturais como fontes de agentes medicinais, venenos, e poções através dos tempos

(BRUCE, 2007).

As plantas quando são administradas ao homem ou animal e exerce sobre eles uma

ação farmacológica qualquer é denominada de plantas medicinais. As plantas medicinais

sempre foram objetos de estudo na tentativa de descobrir novas fontes de obtenção de seus

princípios ativos. O uso de plantas medicinais pela população mundial tem sido muito

significativo nos últimos anos, sendo este, incentivado pela própria Organização Mundial de

Saúde - OMS (CRAVO, 1999). Entretanto, apesar do aumento de estudos nessa área, estima-

se que apenas 15 a 17% delas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal

(SOEJARTO, 1996).

Muitas das propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela população, as quais

são confirmadas em sua maioria nos estudos científicos, comprovando a importância da

pesquisa etnofarmacológica. Tais propriedades propiciam o desenvolvimento de vários

medicamentos, sejam estes obtidos por síntese a partir do metabólito protótipo ou através de

isolamento, algumas vezes, biomonitorado (SIMÕES et al., 2002).

O Brasil é o país com a maior diversidade vegetal do mundo e conta com mais de

55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA;

NODARI, 2003). Frente a isto, o Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o

detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua

vocação para os produtos naturais (PINTO, 2002).

A pesquisa moderna em produtos naturais no Brasil teve início em meados do século

passado e tem sido foco de constantes revisões, indicando uma preocupação com a

diversidade a ser pesquisada, a qualidade e objetividade dos trabalhos (PUPO, 2007).

A descoberta de novos compostos é motivada pela busca de substâncias mais ativas e

menos tóxicas, que possam ser utilizadas no tratamento de diversas patologias, ou em

substituição àquelas já existentes. Fontes alternativas aos medicamentos industrializados e a

implementação de um projeto sistemático para o estudo e validação do uso de plantas

medicinais, são de grande interesse para comunidade científica (SANTOS, 2002).

Aproximadamente 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica moderna, foram

desenvolvidos direta ou indiretamente, a partir de fontes naturais, sendo 25% de plantas, 13%

de microrganismos e 3% de animais (YUNES, 2001).

A natureza, de um modo geral, é a responsável pela produção da maioria das

substâncias orgânicas conhecidas, entretanto, o reino vegetal é responsável pela maior parcela

da diversidade química conhecida e registrada na literatura. A variedade e a complexidade das

micromoléculas que constituem os metabólitos secundários de plantas e organismos marinhos

ainda é inalcançável por métodos laboratoriais. Isto seria a conseqüência direta de milhões de

anos de evolução, atingindo um refinamento elevado de formas de proteção e resistência às

intempéries do clima, poluição e predadores (VIEGAS-JUNIOR, 2006).

O crescente interesse por medicamentos oriundos de plantas medicinais, mais

especificamente os fitoterápicos, fizeram crescer o número de publicações referentes à

etnofarmacologia, registrando-se as espécies mais popularmente conhecidas e utilizadas tanto

entre populações indígenas quanto em urbanas. Porém, há ainda uma grande lacuna entre

atividades biológicas descritas e uso popular, assim como uma carência de estudos quanto aos

efeitos adversos, contra-indicações, toxicidade e validação da eficácia e segurança do

fitoterápico (PUPO, 2007).

Entre os produtos naturais de origem vegetal, por exemplo, encontra-se ampla e

diversa arquitetura molecular como ilustram os terpenos, bioformados pela mesma rota

biossintética geral contendo diversos centros esterogênicos e apenas átomos de C, H e O. A

variedade de padrões estruturais que se encontram nas distintas classes de produtos naturais

como flavonóides, cumarinas, cromonas, isocromonas, quinonas, alcalóides de diversas

categorias, entre outros, atestam sua excepcional diversidade molecular, fonte inesgotável de

modelos, originais de arquitetura molecular (BARREIRO, 2001).

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE A FAMÍLIA ERYTHROXYLACEAE

A família Erythroxylaceae compreende quatro gêneros e cerca de 240 espécies com

distribuição pantropical, tendo seus principais centros de diversidade e endemismo na

Venezuela, Brasil e Madagascar (DALY, 2004). A maioria das espécies pertence ao gênero

Erythroxylum P. Browne, que apresenta distribuição ampla sendo encontrado nos quatro

continentes, principalmente na América tropical (PLOWMAN, 2001). Os outros três gêneros,

Aneulophus Benth., Nectaropetalum Engl. e Pinacopodium Exell & Mendonça, possuem

poucas espécies e apresentam distribuição exclusiva na África (PLOWMAN & BERRY,

1999; DALY 2004).

O gênero Erythroxylum, com cerca de 230 espécies, é o único gênero representado na

região Neotropical, onde aproximadamente 187 espécies são exclusivas (PLOWMAN &

HENSOLD, 2004), tendo como principal centro de diversidade e endemismo a América do

Sul, especialmente o Brasil e a Venezuela (PLOWMAN & HENSOLD, 2004).

No Brasil, o gênero possui cerca de 74 espécies com distribuição restrita, que

corresponde a 40% das espécies da região Neotropical, encontradas nos mais diversos tipos de

vegetação do país, ocorrendo desde as florestas úmidas da Amazônia e Atlântica, até as matas

secas do Cerrado e da Caatinga (PLOWMAN & HENSOLD, 2004).

Na Paraíba foram registradas 13 (treze) espécies: E. caatingae Plowman, E. citrifolium

A. St.-Hil, E. nummularia Peyr., E. pauferrense Plowman, E. passerinum Mart., E. pulchrum

A. St.-Hil., E. pungens O. E. Schulz, E revolutum Mart., E. simonis Plowman, E. suberosum

var denudatum O.E. Schulz, E. subrotundum A. St.-Hil. e E. squamatum Sw., encontradas nas

diversas formações do Estado, como as florestas úmidas da Mata Atlântica, Brejos de

Altitude, Matas Serranas, Restingas e áreas mais secas da Caatinga, como o Cariri Paraibano

(LOIOLA et al., 2007).

2.2 COSIDERAÇÕES SOBRE O GÊNERO ERYTHROXYLUM

De acordo com Zuanazzi et al., (2001), o interesse pelo gênero intensificou-se no

século XIX, após a descoberta das atividades farmacológicas apresentadas pelas folhas de

Erythroxylum coca Lam., que secularmente eram empregadas pelos indígenas da região

andina da América do Sul. Quimicamente, o gênero caracteriza-se pela presença de alcalóides

do grupo tropano, dentre os quais se destaca a cocaína, um alcalóide natural produzido por E.

coca Lam., que foi empregado como anestésico local em pequenas cirurgias (BOHM et al.,

1982; GRIFFIN & LIN, 2000). Entretanto, a cocaína ganhou notoriedade por sua atividade

psicoativa no Sistema Nervoso Central-SNC, tornando-se um dos grandes problemas de saúde

pública da atualidade (ALAGILLE et al., 2005). Ele é o maior gênero da família

Erythroxylaceae, com ampla distribuição, nas regiões tropicais da Austrália, Ásia, África e

Américas (Figura 1, pág. 22) (LOIOLA, 2007).

Figura 1. Distribuição do gênero Erythroxylum.

Fonte: http://www.mobot.org/MOBOT/Research/APweb/welcome.html. Acessado em 30 de

maio de 2007.

O levantamento bibliográfico realizado no NAPRALERT (Natural PROducts ALERT,

banco de dados da Universidade de Illinóis) revelou que das 230 espécies existentes no

gênero Erythroxylum, apenas 61 foram estudadas no âmbito da sua composição química,

resultando no isolamento e caracterização de 449 compostos. As classes de maior ocorrência

no gênero são: alcalóides tropânicos, terpenóides e flavonóides (Figura 2, pág. 23).

44,99

4,45

24,28

2,67

18,49

0,45

0,22

1,11

0,67

0,45

0,67

1,56

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

Principais Constituintes do Gênero

Erythroxylum

ALCALÓDES TROPÂNICOS

ALCALÓIDES

DITERPENOS

TRITERPENOS

FLAVONÓIDES

BENZENÓIDES

CUMARINAS

QUINÓIDES

ALKENOL

STERÓIDES

PROTÉINAS

LIPÍDIOS

Figura 2. Principais constituintes do Gênero Erythroxylum.

Diversas espécies têm sido investigadas quanto às atividades farmacológicas: E.

vacciniifolium mostrou efeito anti HIV e contra infecções oportunas em pacientes com HIV, e

forneceu alcalóides tropano da série catuabine (A, B e C) (ZANOLARI et al., 2003 a);

Pervilleines A e B (Figura 3, pág.24), isolados de E. pervillei, inibiram o crescimento de

carcinoma de pele em células KB-VI (MI et al., 2002), e outros tipos de alcalóides extraídos

de E. rotundifolium também apresentaram esta mesma atividade (Figura 3, pág.24) (CHÁVEZ

et al., 2002); E. moonii apresentou atividade antimicrobiana frente a cepas de bactérias,

fungos e leveduras, além de fornecer os alcalóides tropânicos mooniine A e B, (RAHMAN et

al., 1998). Outras classes de compostos foram isolados de espécies de Erythroxylum como

diterpenos do tipo kaurano, atisano e labdano (Figura 4, pág. 25) e flavonóides glicosilados

(Figura 5, pág. 26).

Figura 3. Alguns alcalóides tropânicos isolados de espécies do gênero Erythroxylum.

OCH

6β-Benzoiloxi-3α-(Z)-(3,4,5-trimetoxicinamoiloxi)tropano (CHAVEZ et al., 2002)

OCH

6β-Benzoiloxi-3α-(E)-(3,4,5-trimetoxicinamoiloxi)tropano (CHAVEZ et al., 2002)

OCH

Pervileina A(QIUWEN et al., 2002) Pervileina B (QIUWEN et al., 2002)

ent- rosan-1-ona-5a,15,16-triol ent-11a-acetoxi-devadarano-15,16-diol

(SANTOS, 2006) (SANTOS, 2006)

erytroxidiol X (SANTOS, 2006) (-)-atisireno (SOMAN, 1983)

CH CH

(+)-devadareno

(-)-ent-8(17),13(E)-labdadien-15-ol

(SOMAN, 1983) (SOMAN, 1983)

17-Norkaur-15-eno, 13-metil-, (8β,13β) Kauran-16-ol

(ANSELL, 1993) (ANSELL, 1993)

Figura 4. Alguns diterpenos de espécies do gênero Erythroxylum.

OHO

CCH

Taxifolina (BOHM, 1981) β-Amyrina (BARREIROS, 2005)

Ombuin 3-rutinosídeo-5-glicosídeo (GONZALEZ-GUEVARA, et al., 2006)

Eriodictiol-L-ramnosídeo

(

JOHNSON

E. L.

;

SCHMIDT

W. F.

2002

)

OMe

OCH

Figura 5. Alguns flavonóides de espécies do gênero Erythroxylum.

2.3 ERYTHROXYLUM CAATINGAE

Erythroxylum caatingae (Figura 6, pág. 27) possui distribuição restrita ao Nordeste do

Brasil, somente registrada para os Estados da Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco e Rio

Grande do Norte (PLOWMAN & HENSOLD, 2004). Sua ocorrência na Paraíba está restrita à

coletas na caatinga, em área de afloramentos rochosos (Figura 7, pág. 28). Apresentam-se na

forma de arbustos à arvoretas, com até 3,0 m de altura, possuem folha discolor, obovadas a

oblongas e com flores pediceladas, triangulares, brevistilas e longistilas esbranquiçadas

(LOIOLA, et al., 2007).

Figura 6. Erythroxylum caatingae (Foto: JOSEAN FECHINE TAVARES, 2006).

Figura 7. Mapa de distribuição das Erythroxylaceae na Paraíba, Brasil: A. Erythroxylum

caatingae Plowman (o); B.E. citrifolium A.St.-Hil. (•); C. E. nummularia Peyr. (▲); D. E.

passerinum Mart. (□); E. E. pauferrense Plowman (

); F. E. pulchrum A.St.-Hil. (■); G. E.

pungens O.E. Schuz (∆).

Fonte: Adaptado de LOIOLA, 2007.

2.4 CLASSIFICAÇÃO BOTÂNICA

A classificação botânica de Erythroxylum caatingae segundo CRONQUIST (1988)

QUADRO 1. Classificação de Erythroxylum caatingae.

Reino Plantae

Divisão Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida

Ordem Malpighiales

Família Erythroxylaceae

Gênero

Erythroxylum

Espécie

Erythroxylum caatingae

2.5 CONSIDERAÇÃO SOBRE ALCALÓIDES

As plantas produzem uma grande variedade dos metabólitos secundários, que possuem

um papel importante na sua sobrevivência em seus ecossistemas. Esses metabólitos estão

envolvidos na resistência contra pestes e doenças, na atração dos polinizadores, na interação

com os microorganismos simbióticos etc. Aproximadamente 100.000 metabólitos secundários

de plantas já são conhecidos e aproximadamente 4.000 novos estão sendo descobertos a cada

ano. O maior grupo de produtos naturais consiste nos isoprenóides, compreendendo mais de

um terço de todos os compostos conhecidos. O segundo maior grupo é o formado pelos

alcalóides, que compreendem muitas drogas e venenos. Alcalóides são isolados de diversos

organismos como rãs, formigas (feromônios), borboletas (defesa), bactérias, esponjas, fungos,

aranhas (neurotoxina do veneno), besouros (defesa), e mamíferos marinhos, embora não

esteja ainda descrito se o alcalóide em cada organismo tem origem de uma nova rota

biossintética (KUTCHAN, 1995).

Os alcalóides constituem-se num vasto grupo de metabólitos com grande diversidade

estrutural, representando cerca de 20% das substâncias naturais descritas. O uso de extratos

vegetais contendo alcalóides como medicamentos, venenos e em poções mágicas, pode ser

traçada desde os primórdios da civilização (HENRIQUES, et al., 1999). Historicamente,

Sócrates morreu em 399 d.C. pelo consumo de extratos contendo coniina (Figura 8, pág. 32)

(Conium maculatum), Cleópatra durante muito tempo no século d.C. fez uso de extratos

contendo atropina (Hyoscyamus muficus) (Figura 8, pág. 32) para dilatar suas pupilas e desse

modo parecer fascinante (KUTCHAN, 1995).

A cocaína (Figura 8, pág. 32) foi isolada por Niemann em 1860. Foi introduzida para

uso clínico por Koller em 1884 como anestésicos oftálmico. Verificou-se logo que a cocaína

exercia ações sobre o sistema nervoso central, causando acentuada dependência, entretanto,

apesar disso, foi amplamente utilizada durante 30 anos, por ser a única droga anestésica local

então disponível (KATSUNG, 2003).

Além dos gregos e romanos, muitas outras culturas antigas usavam e ainda usam

alcalóides como venenos, principalmente para o envenenamento de flechas empregadas em

caçadas e guerras. Exemplos disso são os extratos seco do curare (Chondodendron

tomentosum), contendo o alcalóide tubocurarina (Figura 8, pág. 32), utilizado pelos índios da

Bacia Amazônica, e a famosa estricnina extraída de Strychnos nux-vomica por nativos

asiáticos (PERES, 2008).

Os alcalóides possuem um amplo espectro de atividades biológicas reportadas que

pode estar relacionado com sua estrutura química. A presença de alcalóides pode ser

assinalada em diversas de atividades biológicas investigadas. Assim podemos citar emetina

(amebicida e emético), atropina, hiosciamina e escopolamina (anticolinérgico), reserpina e

protoveratrina A (antipertensivo), quinina (antimalárico), camptotecina, vinblastina e

vincristina (antitumorais), codeína e noscapina (antitussígenos), morfina (hipnoanalgésico),

quinidina (depressor cardíaco), cafeína (estimulante do SNC), teobromina e teofilina

(diuréticos), colchicina (tratamento da gota), tubocurarina (miorrelaxante), efedrina

(simpatomimético), castanospermina (antiviral) entre muitos outros (HENRIQUES et al.,

1999).

Devido ao elevado número de atividades biológicas atribuídas aos alcalóides, estes

foram continuamente objetos de estudos. Atualmente, a função natural de muitos metabólitos

secundários tem sido reavaliada, reconhecendo que estes são, de fato, essenciais para a

existência dos vegetais. Tem sido observado que muitas plantas que produzem alcalóides são

evitadas por animais ou insetos em sua dieta, isto certamente devido a sua toxicidade ou ao

fato de a maioria dos alcalóides terem gosto amargo (HENRIQUES et al., 1999).

Figura 8. Alguns alcalóides fisiologicamente ativos e as plantas que a produzem

(KUTCHAN, 1995).

2.5.1 ALCALÓIDES TROPÂNICOS

Alcalóides tropânicos apresentam em comum uma estrutura bicíclica, denominada

tropano [3,2,1]octano.

O anel tropano é formalmente constituído pelos anéis pirrolidina e piperidina. São

conhecidos cerca de 150 alcalóides tropânicos, sendo em sua maioria derivados da pirrolidina

como: higrina, cuscohigrina e os principais atropina, hiosciamina, escopolamina e cocaína. Os

alcalóides tropânicos ocorrem na família Solanaceae, mas são encontrados também em

famílias como a Erythroxylaceae, Convolvulaceae, Proteaceae, e Rhizophoraceae (BRUCE,

2007).

Atropina Escopolamina

Atropina e escopolamina são potentes agentes anticolinérgicos utilizados na

terapêutica na forma do sal sulfato de grande uso oftalmológico e relaxante gastro-intestinal.

2.5.2 IMPORTÂNCIA E BIOSSÍNTESE DE ALCALÓIDES TROPÂNICOS

Medicamentos contendo alcalóides tropânicos são utilizados para diminuição de

cólicas nos ureteres e aquelas provocadas por cálculos renais, em espasmos brônquicos, nos

casos de asma brônquica. São também utilizados em espasmos do trato gastrintestinal,

portanto contra cólicas e em hipersecreção gástrica. Esse grupo de substâncias também tem

uso como anestésico local, por atuar na dessensibilização das terminações nervosas

(BACCHI, 1999).

A biossíntese dos alcalóides vem sendo extensivamente estudada e, atualmente, pode-

se traçar um esquema da rota de formação para vários deles. Contudo, essas rotas metabólicas

não foram ainda completamente delineadas em termos bioquímicos, pois muitas das enzimas

envolvidas em diversas etapas não foram ainda isoladas e caracterizadas. A formação do

sistema heterocíclico dos alcalóides ocorre, normalmente, através de reações inter/ou

intramoleculares simples. De uma maneira geral, os alcalóides são formados a partir de

aminoácidos (alcalóides verdadeiros e protoalcalóides) (Quadro 2) (HENRIQUES et

al.,1999).

Quadro 2. Classificação de alcalóides de acordo com o precursor biogenético

Precursor biogenético Exemplo

L-ornitina

Retronecina Atropina

Tiloforina Higrina

L-lisina

Coniina Lupinina

L-histidina

Pilocarpina

L-triptofano

Quinina Reserpina

L-tirosina

Emetina Betanidina

L-fenilalanina

Tenelina

Ácido L-aspártico

Nicotina

Ácido antranílico

Dictamina Peganina

Ácido mevalônico

Valeriana Dendrobina

Atisina Ciclomicrofilina A

Solasodina

A biossíntese dos alcalóides tropânicos é originada através da formação do íon de N-

metil-∆

-pirrolíneo derivado dos aminoácidos ornitina e arginina que também é um

intermediário na via de formação da nicotina. O cátion sal N-metil ∆

– pirrolíneo se condensa

com o acetoacetato para formar posteriormente a higrina que é um precursor do anel tropânico

(Figura 9, pág. 38).

HOOC NH

HCH

CHO

NHCH

COO

NCH

COOH

NCH

ORNITINA ARGININA

PUTRESCINA

-METIL-PUTRESCINA

4-METIL AMINO BUTANAL

AGMATINA

SAL N-METIL ∆

- PIRROLÍNEO

ACETOACETATO

D-

(

)

-HIGRINA

TROPINA

Figura 9. Biossíntese do anel tropano.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

¾ Contribuir para o estudo químico e quimiotaxonômico do gênero Eythroxylum, através do

estudo da espécie Erythroxylum caatingae Plowman.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

¾ Estudo fitoquímico do caule da espécie Erythroxylum caatingae, através de métodos de

extração, isolamento e purificação dos constituintes químicos;

¾ Identificar e/ou elucidar a estrutura de seus constituintes químicos através de técnicas de

IV, EM e RMN (uni e bidimensionais);

¾ Obter substâncias ativas para posterior avaliação da sua atividade biológica;

¾ Disponibilizar extratos, frações e substâncias isoladas para estudos farmacológicos.

4- EXPERIMENTAL

4.1 Especificações dos Materiais, Métodos e Equipamentos Utilizados

a) Cromatografias de adsorção em colunas foram realizadas em colunas de vidro de

comprimentos e diâmetros variados, utilizando como adsorvente sílica gel da Merck, 7734,

com partículas 0,063-0,200 mm de diâmetros;

b) Cromatografias em Camada Delgada Analítica e Preparativa (CCDA e CCDP) foram feitas

com sílica gel 60 PF

254

artigo 7749, Merck, suspensas em água destilada (1:2), espalhadas

sobre placas de vidro por meio de um cursor “Quick fit” que conferia a camada espessuras de

0,25 e 1,00 mm, respectivamente. As cromatoplacas obtidas eram secas ao ar livre e, em

seguida, ativadas em estufa a 110 ºC durante duas horas;

c) As revelações das cromatoplacas foram realizadas por irradiação a luz ultravioleta, em

comprimentos de onda 254 e 366 nm, por meio de aparelho Mineralight, modelo UVGL-58

com dois comprimentos de onda (254 e 366 nm), para os dois tipos de cromatografia, e

reveladas com vapores de iodo e reagente de Dragendorff (tetraiodobismutato de potássio)

para as placas analíticas;

d) Os espectros de absorção na região de infravermelho (IV) foram obtidos em espectrômetro,

MODELO BOMEM SERIE 100MB, na faixa de 4000 a 400 cm

-1

, utilizando-se pastilhas de

KBr (0,5 mg da amostra/ 100 mg de KBr);

e) Os pontos de fusão das amostras foram determinadas em aparelho digital para ponto de

fusão, marca Microquímica, modelo MQAPF-302, com bloco de platina em microscópio

óptico tipo “Kofle”, marca REICHERT, modelo R3279, com temperatura que varia de 0 a

350º C. Os valores obtidos não foram corrigidos.

f) Os espectros de RMN foram registrados em espectrômetros VARIAN-NMR SYSTEM,

operando a 500 MHz para hidrogênio (RMN

H) e a 125 MHz para carbono-13 (RMN

C).

Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes

de acoplamento (J) em Hz. As multiplicidades das RMN

H foram indicadas segundo a

convenção: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), tl

(tripleto largo) q (quadrupleto) e m (multipleto);

g) Os espectros de CL-EM/EM (ESI) foram obtidos com CLAE Agilent 1200RRLC e

espectrômetro de massas Bruker HCT Ultra

h) Os solventes utilizados foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puro ou em

misturas binárias, segundo gradiente crescente de polaridade, sendo para análises os da Merck

e Vetec e solventes deuterados como acetonitrila, água e metanol.

i) A Cristalografia foi realizada em um Difratômetro Enraf-Nonius Kappa-CCD.

4.2 Coleta dos materiais botânicos

O material botânico foi coletado em Picuí-PB, Brasil e, em seguida identificado pela

Prof. Dra. Maria de Fátima Agra do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da UFPB. Uma

exsicata AGRA 5666 encontra-se catalogada no Herbário JPB/UFPB.

4.3 Processamento do Caule de Erythroxylum caatingae

O material botânico foi dessecado em estufa com ar circulante à temperatura de 40 °C

durante 3 dias. Após secagem, foi submetido a um processo de pulverização em moinho

mecânico, obtendo-se 4,0 Kg de pó do caule.

4.4 Obtenção do extrato metanólico bruto

O pó do caule seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva com metanol

(MeOH) durante 72 horas. Esse processo foi repetido por 4 vezes obtendo-se o extrato

metanólico bruto (EMB). A solução extrativa foi concentrada em rotavapor sob pressão

reduzida a uma temperatura de 35° C obtendo-se o extrato metanólico bruto (500 g), que foi

submetido a uma metodologia para isolamento de alcalóides.

4.5 Metodologia para isolamento de alcalóides

O extrato metanólico bruto (500 g) foi dissolvido em água e desengordurado com

hexano. O extrato aquoso desengordurado foi acidificado com uma solução de ácido

clorídrico a 3% sob agitação mecânica, filtrado em celite fornecendo um resíduo que foi

descartado e uma solução ácida. Esta solução ácida foi submetida a extrações com

clorofórmio (3 x 500 mL) obtendo-se a fase clorofórmica ácida e uma fase aquosa que foi

basificada até pH 7,0 com hidróxido de amônio. A fase a pH 7,0 foi então submetida a uma

extração com CHCl

fornecendo uma fase aquosa a pH 7,0 e a fase clorofórmica ácida que foi

lavada com água destilada, seca com Na

e concentrada em rotaevaporador a uma

temperatura de 35º C fornecendo um resíduo pesando 4,0g que foi denominado de Fração de

Alcalóides 1 (FA 1). A marcha para extração de alcalóides está sumarizada no fluxograma 1

abaixo.

Fluxograma 1. Marcha para extração de alcalóides do caule de Erythroxylum caatingae.

- Acidificado com HCl 3%

- Filtração em celite

Extrato aquoso desengordurado

- Dissolvido em água

- Desen

ordurado com hexano

Fase hexânica

Resíduo descartado Solução aquosa ácida

- Extração com CHCl

Fase clorofórmica ácida Fase aquosa ácida

- Basificado com NH

OH até

H 7

Fase aquosa a pH 7,0

Fase aquosa a pH 7,0 Fase clorofórmica a pH 7,0

- Lavagem com H

- Secagem com Na

- Evaporação do solvente

Fração de alcalóides 1

FA 1 (4,0g)

-Extra

ão com CHCl

EMB (500

)

A fase aquosa obtida a pH 7,0 foi posteriormente basificada até pH 8,0 com hidróxido

de amônio. A fase a pH 8,0 foi então extraída com CHCl

fornecendo duas fases, a aquosa a

pH 8,0 e a clorofórmica a pH 8,0. A fase clorofórmica a pH 8,0 foi lavada com água destilada,

seca com Na

e concentrada em rotaevaporador a uma temperatura de 35º C fornecendo

um resíduo pesando 3,0g denominado de Fração de Alcalóides 2 (FA 2) que foi guardada para

estudos posteriores (Fluxograma 2).

Fluxograma 2. Extração de alcalóides da fase aquosa a pH 8,0 do caule de Erythroxylum

caatingae.

Fase aquosa a pH 8,0 Fase clorofórmica a pH 8,0

- Extração com CHCl

- Lavagem com H

- Secagem com Na

-Eva

ora

ão do solvente

Fração de alcalóides 2

FA 2 (3,0g)

- Basificado com NH

OH até pH 8,0

Fase aquosa a pH 7,0

Fase aquosa a pH 8,0*

A fase aquosa obtida a pH 8,0 foi posteriormente basificada até pH 9,0 com hidróxido

de amônio. A fase a pH 9,0 foi então extraída com CHCl

fornecendo duas fases, a aquosa a

pH 9,0 e a clorofórmica a pH 9,0. A fase clorofórmica a pH 8,0 que foi lavada com água

destilada, seca com Na

e concentrada em rotaevaporador a uma temperatura de 35ºC

fornecendo um resíduo pesando 2,0g denominado de Fração de Alcalóides 3 (FA 3) que foi

guardada para estudos posteriores (Fluxograma 3, pág. 44)

Fluxograma 3. Extração de alcalóides da fase aquosa a pH 9,0 do caule de Erythroxylum

caatingae.

4.6 Fracionamento cromatográfico

Fase aquosa a pH 9,0 Fase clorofórmica a pH 9,0

- Extração com CHCl

- Lavagem com H

- Filtração

- Secagem com Na

- Evaporação do solvente

Fração de alcalóides 3

FA 3 (2,0g)

- Basificado com NH

OH até pH 9,0

Fase aquosa a pH 8,0

Fase aquosa a pH 9,0*

A fração FA 1 (4,0g) foi submetida a uma coluna cromatografica (CC) utilizando

sílica gel como fase estacionária e como eluentes clorofórmio e metanol puros ou em misturas

binárias em grau crescente de polaridade. O resultado foi a obtenção de 55 frações de 100 mL

(Quadro 3).

QUADRO 3. Fracionamento cromatográfico da fração de alcalóides 1.

Frações

Solvente Proporção

1-11

12-13

14-41

42-44

45-46

48-50

51-52

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

CHCl

– MeOH

100

99,5 : 0,5

99 : 1

99 : 2

99 : 3

95 : 5

90 : 10

88 : 12

80 : 20

70 : 30

50 : 50

As 55 frações foram monitoradas através de Cromatografia em Camada Delgada

Analítica (CCDA), eluídas em diversos sistemas de solventes (clorofórmio e/ou clorofórmio-

metanol em ordem crescente de polaridade) em cubas pré-saturadas com vapores de NH

reveladas com o reagente de Dragendorff e reunidas em 21 grupos de acordo com os seus Rf`s

(Quadro 4). As frações 25, 45 e 47 foram submetidas a uma recristalização com acetona e

éter, obtendo-se os compostos codificados como EC 1, EC 2 e EC 3. (Fluxograma 4, pág. 45)

QUADRO 4. Dados da reunião das frações após monitoração em CCDA.

Frações

Frações Frações

1-6

7-17

18-20

22-23

24-26-27

28-29

30-34

35-39

40-44

Fluxograma 4. Processo cromatográfico da Fração de Alcalóides 1.

CC em sílica gel

CHCl

/ MeOH

CCDA

FA 1 (4,0g)

1-6 7-17 25 30-34 45 46 47 48 50-52 53-55

REC* REC* REC*

EC-3

27,0mg

EC-2

40,0mg

EC-1

47,0mg

* Recristalização com acetona/ éter

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Substâncias isoladas do caule de Erythroxylum caatingae

O estudo fitoquímico do caule de Erythroxylum caatingae resultou no isolamento e

identificação estrutural dos seguintes alcalóides tropânicos:

OCH

EC 1 EC 2

OCH

EC 3

5.2 Identificação estrutural dos constituintes químicos de E. caatingae

5.2.1 Identificação estrutural de EC-1

A substância EC-1 foi isolada na forma de cristais brancos, com ponto de fusão 116-

121ºC. O espectro de massas obtido com CL-ESI-EM (Figura 10, pág. 51) mostrou o pico do

íon molecular em 366 m/z [M+H], compatível com a fórmula molecular C

O espectro de RMN

C – APT em CDCl

a 125 MHz (Figura 11, pág. 52) apresentou

20 sinais. Os sinais em δ

128,58 e 129,38 correspondem a dois carbonos cada, totalizando 22

carbonos. Dos 20 sinais, 8 são carbonos metínicos sp

, 4 metínicos sp

, 3 metilênicos sp

, 4

não-hidrogenados, além de um sinal em δ

40,1 ppm característico de grupo N-CH

. Os

deslocamentos químicos dos carbonos em δ

67,56 e 80,09 (oximetínicos) e δ

59,92 e 65,84

(metínicos, α a nitrogênio), além dos deslocamentos químicos dos carbonos metilênicos sp

em δ

33,16, 34,65 e 36,16 são compatíveis, com os dados descritos na literatura para o

esqueleto de alcalóides tropânicos dioxigenados (CHAVEZ, et al, 2002).

Anel tropânico

O espectro de IV em pastilhas de KBr (Figura 12, pág. 53), mostrou absorção em 1724

-1

atribuída a C=O de grupo éster. Esse assinalamento foi corroborado pela presença dos

sinais δ

165,70 e 166,37 ppm no espectro de RMN

C. De maneira análoga, as absorções

em 1600-1585 cm

-1

características de estiramento C=C de anel aromático, foram confirmados

pela presença de sinais na região entre δ

128,58 a 133,00 ppm no espectro APT. Comparação

desses deslocamentos químicos com dados da literatura permitiu caracterizar substituintes

benzoiloxi no anel tropânico (CHAVEZ, et al, 2002).

Benzoiloxi

O espectro de RMN

H a 500 MHz em CDCl

(Figura 15, pág. 56) mostrou sinais em

3,39 e 3,42 ppm, compatíveis com os prótons H-1 e H-5 de alcalóides tropânicos. O

espectro de correlação heteronuclear – HSQC (Figura 19, pág. 60), confirma esses

assinalamentos pelas correlações com os carbonos em δ

59,92 (C-1) e δ

65,84 (C-5),

respectivamente. Absorções em δ

1,82; 2,26 e δ

2,06; 2,29 ppm foram atribuídas aos

hidrogênios 2H-2 e 2H-4 respectivamente. Essas absorções foram confirmadas pelo espectro

de correlação homonuclear – COSY devido ao acoplamento vicinal dos prótons H-1 com 2H-

2 e H-5 com 2H-4 (Figura 20, pág. 61).

3,4

(CHAVEZ et al, 2002).

No espectro de RMN

C – APT, os deslocamentos químicos em δ

67,56 e 80,09 ppm

são compatíveis com alcalóides tropânicos oxigenados nas posições C-3 e C-6 (ZANOLARI

et al, 2003). A localização desses substituintes foi confirmada pelo espectro HMBC (Figura

21, pág. 62), através das correlações de C-3 a J

com H-2 eq e H-4 eq e C-6 com H-4 ax e H-7

eq. O deslocamento químico em δ

33,16 ppm (C-4) corroborou com a localização de um dos

substituintes na posição C-6.

HMBC

No espectro de RMN

H, o tripleto largo (tl) referente ao sinal de H-3 em δ

5,34 ppm

(J = 5,0 Hz), indicou a orientação α para o substituinte em C-3. Por outro lado, o duplo

dupleto (dd) em δ

5,87 ppm (J = 3,0 e 7,5 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-6, a ausência de

acoplamento desse hidrogênio com o hidrogênio vicinal H-5, justifica sua multiplicidade e

define a orientação β do substituinte em C-6 (ZANOLARI et al, 2003 b). Na região de

hidrogênios aromáticos, o duplo dupleto com deslocamento químico δ

8,03; 8,11 (J = 1,5 e

8,0 Hz) com integração para quatro hidrogênios, foi atribuído aos prótons H-2’, 2’’ e H-6’, 6’’

e o mutipleto entre δ

7,58 e 7,55 ppm com integração para dois hidrogênios, foi atribuído aos

hidrogênios H-4’, 4’’. Já os tripletos em δ

7,43 e 7,49 ppm (J = 8,0 Hz), com integração para

quatro hidrogênios foram atribuídos a H-5’, 5’’ e H-3’, 3’’ respectivamente. Os dados de

RMN

H e

C uni e bidimensional estão compilados na Tabela 1 (pág. 50).

A partir desses dados e comparação com a literatura, foi possível identificar EC–1

como sendo o alcalóide 3α, 6β dibenzoiloxitropano (ZANOLARI, et al., 2003 b).

1''

2''

3''

4''

5''

6''

7''

EC-1. 3α, 6β dibenzoiloxitropano

Tabela 1. Dados de RMN de

H e

C uni e bidimensionais em CDCl

a 500 MHz e 125 MHz

de EC-1 (3α, 6β dibenzoiloxitropano)

1''

2''

3''

4''

5''

6''

7''

HSQC

H X

Posição δ

C δ

H HMBC COSY NOESY

59,92 3,42(m) CH

/H-2/H-3 H-2/H-7

34,65

1,82 eq (dl, J = 15,0)

2,26 ax (m)

H-3/H-7 H-1/H-3

67,57 5,34 (tl, J = 5,0) H-2/H-4 H-4

33,16

2,06 eq (dl, J = 15,0)

2,29 ax (m)

H-3 H-5

65,85 3,39 (sl) CH

/H-3/ H-4/H-7 H-4 H-4/H-6

80,10 5,87 (dd, J = 3,0 e 7,5) H-4/H-7 H-7

36,16

2,78 ax (dd, J = 7,5 e 14,5)

2,33 eq (m)

1’

130,41 H-3’/H-5’

2’

129,50 8,11 (dd, J = 1,5 e 8,0) H-4’/H-6’ H-3’

3’

128,58 7,49 (t, J = 8,0) H-5’

4’

133,00 7,58 (m) H-2’/H-6’

5’

128,58 7,49 (t, J = 8,0) H-3’

6’

129,50 8,11 (dd, J = 1,5 e 8,0) H-2’/H-4’ H-5’

7’

165,70 H-2’/H-6’/H-3

1’’

130,37 H-3’’/H-5’’

2’’

129,48 8,03 (dd, J = 1,5 e 8,0) H-4’’/H-6’’ H-3’’

3’’

128,32 7,43 (t, J = 8,0) H-5’’

4’’

132,89 7,53 (m) H-2’’/H-6’’

5’’

128,38 7,43 (t, J = 8,0) H-3’’

6’’

129,50 8,03 (dd, J = 1,5 e 8,0) H-2’’/H-4’’ H-5’’

7’’

166,37 H-2’’H-6’’

N-CH

40,11 2,60 (s)

Figura 10. Espectro de massas de EC-1 gerado através do método de ionização ESI.

Figura 11. Espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-1 em CDCl

Figura 12. Espectro de IV de EC-1 em pastilhas de KBr

Figura 13. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

125-165 ppm

Figura 14. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

35-80 ppm

ura 15. Es

ectro de RMN

(

500 MHz

)

de EC-1 em CDCl

Figura 16. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

7,0-8,2 ppm

ura 17. Ex

ansão do es

ectro de RMN

(

500 MHz

)

de EC-1 em CDCl

na re

ião entre δ

3-5

Figura 18. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

1,5-3,5 ppm

Figura 19. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

HSQC (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

35-80 ppm

Figura 20. Expansão do espectro de RMN

H x

H COSY (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

1,0-6,0 ppm

Figura 21. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-1 em CDCl

na região entre δ

58-82 ppm

5.2.2 Elucidação estrutural de EC-2

A substância EC-2 foi isolada na forma de cristais brancos, com ponto de fusão 152-

157ºC. O espectro de massas obtido com CL-ESI-EM (Figura 22, pág. 67) mostrou o pico do

íon molecular em 456 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

O espectro de RMN

C – APT em CDCl

a 125 MHz (Figura 23, pág. 68) apresentou

19 sinais. Os sinais em δ

106,63, 128,35 e 129,48 ppm correspondem a dois carbonos cada e

153,13 ppm corresponde a três carbonos, totalizando 25 carbonos. Dos 19 sinais, 7 foram

atribuídos a carbonos metínicos sp

, 4 metínicos sp

, 3 carbonos metilênicos sp

, 7 carbonos

não-hidrogenados, além de um sinal em δ

40,16 ppm característico de grupo N-CH

e 3

carbonos metoxílicos. Os deslocamentos químicos dos carbonos em δ

67,65 e 79,84 ppm

(oximetínicos) e δ

60,03 e 65,74 ppm (metínicos, α a nitrogênio), além dos deslocamentos

químicos dos carbonos metilênicos sp

em δ

33,31, 34,66 e 36,69 são compatíveis com os

dados descritos na literatura para esqueleto tropânico dioxigenados (CHAVEZ et al., 2002).

Anel tropânico

O espectro de IV em pastilhas de KBr (Figura 24, pág. 69), mostrou absorção em 1709

-1

atribuída a C=O de grupo éster. Esse assinalamento foi corroborado pela presença dos

sinais δ

165,32 e 166,05 no espectro APT. De maneira análoga, as absorções na região entre

1600-1585 cm

-1

características de estiramento C=C de anel aromático, foram confirmadas

pela presença de sinais na região entre δ

106,63-132,94 no espectro APT. Absorções em δ

56,31 e 60,89 foram atribuídos a carbonos metoxílicos. Comparação desses deslocamentos

químicos com dados da literatura permitiu caracterizar os substituintes benzoiloxi e

trimetoxibenzoiloxi no anel tropânico (CHAVEZ et al, 2002).

OCH

Benzoiloxi Trimetoxibenzoiloxi

O espectro de RMN

H a 500 MHz em CDCl

(Figura 27, pág. 72) mostrou sinais em

3,43 e 3,42 ppm, compatíveis com os prótons H-1 e H-5 de alcalóides tropânicos. O

espectro de correlação heteronuclear – HSQC (Figura 32, pág. 77), confirmou esses

assinalamentos pelas correlações com os carbonos em δ

60,03 (C-1) e δ

65,74 (C-5)

respectivamente. Absorções em δ

1,83, 2,26 e δ

2,03, 2,33 ppm foram atribuídos aos

hidrogênios 2H-2 e 2H-4 respectivamente. Essas absorções foram confirmadas pelo espectro

HMBC (Figura 33, pág. 78) que mostrou correlações de C-2 a J

com H-3 e a J

com H-4 e H-

7 e uma correlação de C-4 a J

com H-3 e a J

com H-2. Observou-se também, uma correlação

homonuclear – COSY (Figura 34, pág. 79) devido ao acoplamento vicinal dos prótons H-2 e

H-3, confirmando a atribuição feita a H-2.

COSY

HMBC

No espectro de RMN

C-APT, os deslocamentos químicos em δ

67,65 e 79,84 ppm

são compatíveis com alcalóides tropânicos oxigenados nas posições C-3 e C-6 (ZANOLARI

et al., 2003 b). A localização desses substituintes foi confirmada pelo espectro HMBC (Figura

35, pág. 80), através das correlações de C-7’ a J

com H-3 e C-7’’ a J

com H-6. O

deslocamento químico em δ

33,31 ppm (C-4) corroborou com a localização de um dos

substituintes em C-6.

No espectro de RMN

H, o tripleto largo (tl) referente ao sinal de H-3 em δ

5,34 ppm

(J = 5,0 Hz), indicou orientação α do substituinte em C-3. Por outro lado, o duplo dupleto (dd)

em δ

5,92 ppm (J = 3,0 e 7,5 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-6, a ausência de acoplamento

desse hidrogênio com o hidrogênio vicinal H-5, justifica sua multiplicidade e define a

orientação β do substituinte em C-6 (ZANOLARI et al., 2003 b). Na região de hidrogênios

aromáticos o duplo dupleto com deslocamento químico em δ

8,02 (J = 1,5 e 8,5 Hz) com

integração para dois hidrogênios, foi atribuído aos hidrogênios H-2’’,e H-6’’ e um simpleto

com integral para dois hidrogênios em δ

7,39 foi atribuído a H-2’ e H-6’. Já os tripletos em

7,42 (J = 8,0 Hz) e δ

7,55 (J = 7,5 Hz) com integral para três hidrogênios foram

atribuídos a H-3’’/ H-5’’ e H-4’’ respectivamente. Os dados de RMN de

H e

C uni e

bidimensionais de EC-2 estão compilados na Tabela 2 (pág. 66).

A partir desses dados e comparação com a literatura, foi possível identificar EC–2

como sendo o alcalóide 3α–(3,4,5 trimetoxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano (Catuabina B)

(SILVA et al., 2001, GRAF et al, 1978).

1''

2''

3''

4''

5''

6''

7''

OCH

EC-2.Catuabine B

Tabela 2. Dados de RMN de H

e C

uni e bidimensionais em CDCl

a 500 MHz e 125 MHz

de EC-2 (Catuabina B).

1''

2''

3''

4''

5''

6''

7''

OCH

HSQC

H X

Posição δ

C δ

H HMBC COSY NOESY

60,03 3,43(m) CH

/H-3 H-7

34,66

1,83 eq (dl, J = 15,0)

2,26 ax (m)

H-3/H-4/H-7

67,65 5,34 (tl, J = 5,0) H-2/H-4 H-2

33,31

2,03 eq (dl, J = 15,0)

2,33 ax (m)

H-2/H-3

65,74 3,42 (m) H-3

79,84 5,92 (dd, J = 3,0 e 7,0) H-4/H-5/H-7 H-7

36,69

2,80 ax (dd, J = 7,0 e 15,0)

2,30 eq (m)

1’

125,38 H-2’/H-6’

2’

106,63 7,39 (s) H-6’

3’

153,13 H-2’/H-6’

4’

153,13 H-2’/H-6’

5’

153,13 H-2’/H-6’

6’

106,63 7,39 (s) H-2’

7’

165,32 H-2’/H-6’/H-3

1’’

130,31 H-3’’/H-5’’

2’’

129,48 8,02 (dd, J = 1,5 e 8,5) H-6’’ H-3’’

3’’

128,35 7,42 (t,J = 8,0) H-5’’ H-2’’

4’’

132,94 7,55 (t,J = 7,5)

5’’

128,35 7,42 (t,J = 8,0) H-3’’ H-6’’

6’’

129,48 8,02 (dd,

J = 1,5 e 8,5) H-2’’ H-5’’

7’’

166,05 H-2’’/H-6’’/H-6

N-CH

40,16 2,60 (s) H-7

m-OCH

56,31 3,98 (s)

p-OCH

60,89 3,92 (s)

Figura 22. Espectro de massas de EC-2 gerado através do método de ionização ESI

ura 23. Es

ectro de RMN

C-APT

(

125 MHz

)

de EC-2 em CDCl

ura 24. Es

ectro de IV de EC-2 em

astilhas de KB

ura 25. Ex

ansão do es

ectro de RMN

C-APT

(

125 MHz

)

de EC-2 em CDCl

na re

ião entre δ

100-160

Figura 26. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre δ

35-80 ppm

ura 27. Es

ectro de RMN

(

500 MHz

)

de EC-2 em CDCl

Figura 28. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre δ

7,3-8,1 ppm

Figura 29. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre δ

5,3-5,9 ppm

Figura 30. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre δ

2,8-4,0 ppm

Figura 31. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-2 em CDCl

na região entre δ

1,8-2,6 ppm

ura 32. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

HSQC (500 MHz) de EC-2 em CDCl

ura 33. Ex

ansão do es

ectro de RMN

H x

C-

(

n=2 e 3

)

HMBC

(

500 MHz

)

de EC-2 em CDCl

ura 34. Ex

ansão do es

ectro de RMN

H x

H COSY

(

500 MHz

)

de EC-2 em CDCl

Figura 35. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-2 em CDCl

5.2.3 Elucidação estrutural de EC-3

A substância EC-3 foi isolada na forma de cristais brancos, com ponto de fusão 220-

225ºC. O espectro de massas obtido com CL-ESI-EM (Figura 37, pág. 86), mostrou o pico do

íon molecular em 442 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

O espectro de RMN

C – APT em CDCl

a 125 MHz (Figura 38, pág. 87) apresentou

19 sinais. Os sinais em δ

56,50, 106,55; 128,34, 129,46 e 146,97 correspondem a dois

carbonos cada, totalizando 24 carbonos. Dos 19 sinais 7 foram atribuídos a carbonos

metínicos sp

, 4 metínicos sp

, 3 carbonos metilênicos sp

, 7 carbonos não-hidrogenados,

além de um sinal em δ

40,07 característico de grupo N-CH

e 2 carbonos metoxílicos. Os

deslocamentos químicos dos carbonos em δ

67,28 e 79,69 (oximetínicos) e δ

60,12 e 65,74

(metínicos, α a nitrogênio), além dos deslocamentos químicos dos carbonos metilênicos sp

33,25, 34,59 e 36,73 são compatíveis com os dados descritos na literatura para esqueleto de

alcalóide tropânico dioxigenados (CHAVES et al., 2002).

Anel tropânico

O espectro de IV em pastilhas de KBr (Figura 39, pág. 88), mostrou absorções em

3425 cm

-1

característico de grupo hidroxila, em 1724 cm

-1

e em 1277 cm

-1

atribuído a C=O de

grupo éster. Esses assinalamentos foram confirmados pela presença de sinais em δ

165,46;

166,00 e δ

56,50 no espectro de

C. De maneira análoga, as absorções em 1608-1462 cm

-1

característicos de estiramento C=C de anel, foram confirmados pela presença de sinais em δ

106,55 a 146,97 no espectro APT. A partir das informações obtidas nos espectros de RMN

C-APT e IV em conjunto com dados da literatura, foi possível caracterizar os substituintes

benzoiloxi e dimetoxi-hidroxibenzoiloxi no anel tropânico (ZANOLARI et al., 2003;

CHAVES et al., 2002).

OCH

Benzoiloxi Dimetoxibenzoiloxi

O espectro de RMN

H a 500 MHz em CDCl

(Figura 42, pág. 91) mostrou sinais em

3,45 e 3,43 ppm, compatíveis com os prótons H-1 e H-5 do núcleo tropânico. O espectro

de correlação heteronuclear – HSQC (Figura 47, pág. 96), confirma esses assinalamentos

pelas correlações com os carbonos em δ

60,12 (C-1) e δ

65,74 (C-5) respectivamente.

Absorções em δ

1,82 e 2,29 e δ

2,03 e 2,37 ppm foram atribuídos aos hidrogênios

metilênicos 2H-2 e 2H-4 e confirmados pela correlação HSQC (Figura 48, pág. 97) com os

carbonos δ

34,59 (C-2) e 33,25 (C-4). Essas absorções foram confirmadas pelo espectro de

correlação homonuclear – COSY devido ao acoplamento vicinal dos prótons H-1 com H-2 e

H-5 com H-4 (Figura 49, pág. 98).

COSY

No espectro de RMN

C – APT, os deslocamento químicos em δ

67,28 e 79,69 ppm

são compatíveis com alcalóides tropânicos oxigenados nas posições C-3 e C-6 (ZANOLARI,

2003 b). A localização desses substituintes foi confirmada pelo espectro HMBC (Figuras 50 e

51, pág. 99 e 100), através da correlação de C-7’ a J

com H-3 e C-6 a J

com H-7. O

deslocamento químico em δ

33,25 ppm (C-4) corroborou com a localização de um

substituinte em C-6.

No espectro de RMN

H, o tripleto largo (tl) referente ao sinal de H-3 em δ

5,34 (J =

5,0 Hz), indicou a orientação α do substituinte em C-3. Por outro lado, o duplo dupleto (dd)

em δ

5,93 (J = 3,0 e 7,5 Hz) foi atribuído ao hidrogênio H-6, a ausência de acoplamento

desse hidrogênio com o hidrogênio vicinal H-5, justifica sua mutiplicidade e define a

orientação β do substituinte em C-6 (ZANOLARI, 2003 b). Na região de hidrogênios

aromáticos o duplo dupleto com deslocamento químico em δ

8,01 (J = 1,0 e 7,5 Hz) com

integração para dois hidrogênios, foi atribuído aos prótons H-2’’ e H-6’’. Um simpleto com

integral para dois hidrogênios em δ

7,32 foi atribuído a H-2’ e H-6’. Já os tripletos em δ

7,43 e 7,55 (J = 7,5 e 7,5Hz) com integral para três hidrogênios, foram atribuídos a H-

3’’/H5’’ e H-4’’ respectivamente. Os dados de RMN de

H e

C uni e bidimensionais estão

compilados na Tabela 3 (pág. 85).

A partir desses dados, juntamente com a cristalografia de Raio-X (Figura 36, pág.84)

e comparação com a literatura, foi possível identificar EC–3 com sendo o alcalóide 3α– (3, 5

dimetoxi-4’-hidroxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano, um novo alcalóide tropano (SILVA et

al., 2001).

1''

2''

3''

4''

5''

6''

7''

OCH

EC-3. 3α – (3, 5 dimetoxi-4’-hidroxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano.

Figura 36. Cristalografia de Raio-X de EC-3.

Tabela 3. Dados de RMN de

H e

C uni e bidimensionais em CDCl

a 500 MHz e 125 MHz

de EC-3 (3α – (3, 5 dimetoxi-4’-hidroxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano).

1''

2''

3''

4''

5''

6''

7''

OCH

HSQC

H X

Posição δ

C δ

H HMBC COSY NOESY

60,12 3,45 (m) CH

34,59

1,82 eq (dl, J = 15,0)

2,29 ax (m)

H-7 H-1

67,28 5,34 (tl, J = 5,0) H-2/H-4

33,25

2,03 eq (dl, J = 15,0)

2,37 ax (m)

65,74 3,43 (m) CH3/H-3/H-7 H-4

79,69 5,93 (dd, J = 3,0 e 7,5) H-7

36,73

2,33 eq (m)

2,82 ax (dd, J = 7,5 e 14,0)

1’

121,15 H-2’/H-6’

2’

106,55 7,32 (s) H-6’

3’

146,97 OCH

/H-2’

4’

139,60

5’

146,97 OCH

/H-6’

6’

106,55 7,32 (s) H-2’

7’

165,46 H-3

1’’

130,28 H-3’’/H-5’’

2’’

129,46 8,01 (dd, J = 1,0 e 7,5) H-4’’/H-6’’ H-3’

3’’

128,34 7,43 (t, J = 7,5) H-5’’ H-2’

4’’

132,92 7,55 (t, J = 7,5) H-2’’/H-6’’

5’’

128,34 7,43 (t, J = 7,5) H-3’’ H-6’

6’’

129,46 8,01 (dd, J = 1,0 e 7,5) H-2’’/H-4’’ H-5’

7’’

166,00 H-2’’/H-6’’

N-CH

40,07 2,46 (s)

O-CH

56,50 4,00 (s)

ura 37. Es

ectro de massas de EC-3

erado através do método de ioniza

ão ESI.

ura 38. Es

ectro de RMN

C-APT

(

125 MHz

)

de EC-3 em CDCl

Figura 39 - Espectro de IV em KBr do alcalóide EC-3.

Figura 40. Expansão do espectro de RMN

C (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

110-170 ppm

Figura 41. Expansão do espectro de RMN

C-APT (125 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

30-80 ppm

Figura 42. Espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

Figura 43. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

7,3-8,0 ppm

Figura 44. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

5,3-5,9 ppm

Figura 45. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

3,3- 4,1 ppm

Figura 46. Expansão do espectro de RMN

H (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

1,8-2,9 ppm

Figura 47. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

- HSQC (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

56-82 ppm

Figura 48. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

- HSQC (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre δ

32-42 ppm

Figura 49. Expansão do espectro de RMN

H x

H COSY (500 MHz) de EC-3 em CDCl

Figura 50. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre 125-175 ppm

Figura 51. Expansão do espectro de RMN

H x

C-

(n=2 e 3) HMBC (500 MHz) de EC-3 em CDCl

na região entre 60-80 ppm

6 Análise de EC-1, EC-2 e EC-3 por CL-EM/EM.

Para análises das amostras foram utilizados um CLAE modelo Agilent 1200RRLC e

um espectrômetro de massas modelo Bruker HCT Ultra com fonte ESI usando os seguintes

parâmetros abaixo relacionados:

Quadro 5. Parâmetros utilizados para análise na CLAE

Parâmetros Valores

Coluna THERMO C18 Hypersil GOLD 30x1mm com partículas 1.9

Temperatura da coluna 60 graus celsius

Solvente A ACN SIGMA ALDRICH Chromasolv 34851

Solvente B H2O milliQ Millipore + 0.01% TFA Pierce 28904

Fluxo 0.3 mL/ min

Quadro 6. Parâmetros utilizados para análise no Espectrômetro de Massas

Parâmetros Valores

Scan Auto MSn 50-1000 uma

Nebulisador 4000 hPa

Dry Gaz 10 L/mn

Dry Gaz Temp 320 graus celsius

Os três alcalóides isolados foram submetidos à análise por CL-EM/EM, obtendo-se o

cromatograma de íons totais. Cada íon originado foi selecionado de acordo com sua relação

massa/ carga (m/z) (Tabela 4, pág. 104). O cromatograma de íons totais da substância EC-1

mostrou a presença de três picos (Figura 52, pág. 103). O pico 1 apresentou massa 278

[M+H], compatível com a fórmula molecular C

(Figura 53, pág. 105). O pico 2

apresentou massa 262 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

(Figura 54,

pág. 106). O pico 3 com massa 366 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

(Figura 55, pág. 107), corroborando com os dados dos espectros de RMN

C e

O cromatograma de EC-2 apresentou 4 picos, sendo o pico 1 com massa 262 [M+H],

com fórmula molecular C

(Figura 56, pág. 108). O pico 2 com massa 352 [M+H],

compatível com a fórmula molecular C

(Figura 57, pág. 109). O pico 3 com massa

426 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

(Figura 58, pág. 110). O pico 4

com massa 456 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

(Figura 59, pág.

111), corroborando com os dados do espectro de RMN

C e

O cromatograma de EC-3 apresentou 3 picos, sendo o pico 1 com massa 420 [M+H],

compatível com fórmula molecular C

(Figura 60, pág. 112). O pico 2 com massa

442 [M+H], compatível com a fórmula molecular C

(Figura 61, pág. 113),

corroborando com os dados de RMN de

C e

H. O pico 3 com massa 366 [M+H],

compatível com a fórmula molecular C

(Figura 62, pág. 114).

A análise do CL-EM/EM dos alcalóides mostrou fragmentações similares entre cada

composto, dando importante informação sobre a estrutura do núcleo. A seleção MS

de cada

pico mostrou que todas as moléculas diferentes compartilham o elemento estrutural central o

núcleo tropânico, com fragmentos de íons em m/z 122, 140 e 244, caracterizando-se

constituintes químicos similares em EC-1, EC-2 e EC-3.

Figura 52. LC-MS-MS com fonte ESI de EC-1 (A) (3α, 6β dibenzoiloxitropano), EC-2 (B)

(Catuabine B) e EC-3 (C) (3α-3’,4’,5’ trimetoxi-4’-hidroxibenzoiloxi -6β-benzoiloxitropano).

Tabela 4. Dados do CL-EM-EM de cada íon analisado e suas fragmentações.

Alcalóide Pico nº EM-EM M

Fragmentos MS

EC-1

1 A 278 156, 138, 94

2 B 262 140, 122, 91

3 C 366 244, 122

EC-2

1 D 262 140, 105

2 E 352 195, 140, 122

3 F 426 244, 165, 140, 122

4 G 456 244, 195, 167

EC-3

1 L 420 320, 222, 181, 140, 122

2 M 442 320, 244, 181, 140

3 N 366 244, 122

m/z 277

m/z 155

m/z 138

Figura 53. Espectro de massas e fragmentação do pico 1 de EC-1.

m/z 261

m/z 139

m/z 121

Figura 54. Espectro de massas e fragmentação do pico 2 de EC-1.

m/z 365

m/z 243

m/z 121

Figura 55. Espectro de massas e fragmentação do pico 3 de EC-1.

m/z 261

m/z 139

m/z 121

Figura 56. Espectro de massas e fragmentação do pico 1 de EC-2.

OCH

m/z 351

m/z 140

OCH

m/z 194

Figura 57. Espectro de massas e fragmentação do pico 2 de EC-2.

OCH

m/z 425

m/z 303

OCH

2 x OCH

m/z 243

m/z 164

Figura 58. Espectro de massas e fragmentação do pico 3 de EC-2.

OCH

m/z 455

m/z 333

OCH

3 x OCH

m/z 243

OCH

m/z 194

Figura 59. Espectro de massas e fragmentação do pico 4 de EC-2.

OCH

m/z 419

m/z 319

OCH

m/z 221

Figura 60. Espectro de massas e fragmentação do pico 1 de EC-3.

OCH

m/z 442

m/z 319

OCH

HO O

OCH

m/z 243

OCH

m/z 180

m/z 140

Figura 61. Espectro de massas e fragmentação do pico 2 de EC-3.

m/z 365

m/z 243

m/z 121

Figura 62. Espectro de massas e fragmentação do pico 3 de EC-3.

7 CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico de Erythroxylum caatingae Plowman (Erythroxylaceae) levou

ao isolamento de cinco substâncias. Através de técnicas de Ressonância Magnética Nuclear de

hidrogênio e carbono treze (RMN

H e

C), incluindo técnicas bidimensionais (HMQC,

HMBC, COSY e NOESY), foi possível identificar:

• Três alcalóides tropânicos de nomes 3α, 6β dibenzoiloxitropano, 3α – (3’,5’ dimetoxi-

4’-hidroxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano e 3α – (3’,4’,5’ trimetoxibenzoiloxi)-6β-

benzoiloxitropano (Catuabine B);

• Sendo os alcalóides 3α, 6β dibenzoiloxitropano e Catuabine B já relatados na

literatura;

• O alcalóide 3α – (3’,5’ dimetoxi-4’-hidroxibenzoiloxi)-6β-benzoiloxitropano relatado

pela primeira vez na literatura.

O isolamento dessas substâncias contribuiu para a quimiotaxonomia de Erythroxylum

caatingae.

8 PERSPECTIVAS

OCH

¾ Desenvolvimento de novas metodologias analíticas através de CL-DAD para posterior

utilização das técnicas avançadas de isolamento e identificação estrutural, dentre elas,

CL-RMN e CL-EM-EM, para isolamento dos compostos propostos após análise por

CL-EM-EM;

OCH

¾ Ampla caracterização em menor tempo, das espécies selecionadas gerando um

conhecimento mais preciso e crítico da constituição química de espécies desse

ecossistema;

¾ Caracterizar a atividade biológica dos extratos, frações e seus biometabólitos através

de triagem farmacológica, tais como: antiulcerogênica, antinociceptiva, relaxamento

em músculo liso e citotoxicidade além do SNC;

¾ Com resultados mais precisos e amplos espera-se excelentes publicações em

periódicos de alto fator de impacto em áreas específicas de produtos naturais.

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