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UFRRJ
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
CIÊNCIA DO SOLO
DISSERTAÇÃO
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA E
AVALIAÇÃO DA FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE
NITROGÊNIO ENTRE ACESSOS DE AMENDOIM
(Arachis hypogaea L.).
Wardsson Lustrino Borges
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
CIÊNCIA DO SOLO
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA E AVALIAÇÃO DA
FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO ENTRE ACESSOS DE
AMENDOIM (Arachis hypogaea L.).
WARDSSON LUSTRINO BORGES
Sob a Orientação da Pesquisadora
Maria Cristina Prata Neves
e Co-orientação da Pesquisadora
Norma Gouvêa Rumjanek
Dissertação submetida como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Curso de Pós-
Graduação em
Agronomia, Área de Concentração
em Ciência do Solo
Seropédica, RJ
Março de 2006
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633.368
B732a
T
Borges, Wardsson Lustrino, 1981-
Análise da variabilidade genética e avaliação da fixação
biológica de nitrogênio
entre acessos de amendoim (Arachis
hypogaea L.) / Wardsson Lustrino Borges. – 2006.
48 f. : il.
Orientador: Maria Cristina Prata Neves.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro, Instituto de Agronomia.
Bibliografia: f. 41-48.
1. Amendoim – Cultivo – Teses. 2. Amendoim –
Genética - Teses. 3. Amendoim - Variedades – Teses. 4.
Nitrogênio – Fixação - Teses. I. Neves, Maria Cristina
Prata, 1950-. II. Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro. Instituto de Agronomia. III. Título.
É permitida a cópia parcial ou total desta Dissertação, desde que seja citada a fonte
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE AGRONOMIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA – CIÊNCIA DO SOLO
WARDSSON LUSTRINO BORGES
Dissertação submetida ao Curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de Concentração em
Ciência do Solo, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências, em
Agronomia.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 28/3/2006.
Norma Gouvêa Rumjanek. Ph.D. Embrapa Agrobiologia
Co-Orientadora
Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos. Dr. UFRPE
Sonia Regina de Souza. Dr. UFRRJ
Gustavo Ribeiro Xavier Dr. Embrapa Agrobiologia
DEDICATÓRIA
Dedico a meu Avô Antônio
Ferreira Lustrino (in memória)
pela sua história de vida, a qual
orgulho-me muito.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq pela bolsa concedida durante 43 meses de Iniciação Científica e durante o período
do Mestrado.
Ao curso de Pós-Graduação em Agronomia - Ciência do Solo pela oportunidade.
A Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro pela excelente formação que recebi nos
níveis de Graduação e Pós Graduação.
A Embrapa Agrobiologia por possibilitar a infra-estrutura necessária aos trabalhos.
A Maria Cristina Prata Neves pela oportunidade de iniciar como bolsista de Iniciação
Científica na Embrapa Agrobiologia.
A Norma Gouvêa Rumjanek pela orientação durante estes seis anos e principalmente pela
confiança depositada em mim durante o Mestrado.
A Gustavo Ribeiro Xavier pelas sugestões neste trabalho de Mestrado.
A Ignácio Godoy, José Francisco Montenegro Valls e Tais Moraes Falleiro Suassuna pelo
fornecimento dos acessos utilizados neste estudo.
Aos amigos do Laboratório de Ecologia Microbiana que contribuíram diretamente para a
minha formação: Jerri Édson Zilli, Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos, Flávia
Venâncio, Fernanda Cíntia Pires e Teixeira e Claudia Miranda Martins.
Aos amigos do Laboratório de Ecologia, pela amizade e pelo entusiasmo diário: Rejane
Guedes, Alanir Bratti, Adriano Knupp, Jamileh Carvalho, Samuel Passos, Anelise Dias,
Enderson Brito, Gloria Botelho, Marcela Drecshel, Marcela Aboim, Sheila Vasconcelos e
Rachel Pinton.
A Paulo Ivan Fernandes Junior, Carlos Brasil Batista Júnior e João Luiz Bastos pela amizade
e pelo companheirismo.
A minha mãe Maria Antônia Lustrino Borges pelo cuidado dedicado a mim.
Aos meus irmãos Wallysson, Danilo, Sheila e Cristian e ao meu cunhado Jair Rodrigues pela
ajuda.
A Ana Amélia dos Santos Cordeiro, minha namorada, pela atenção e carinho durante este
tempo que estamos juntos.
A Sociedade Brasileira por ter financiado os meus estudos, do primeiro dia até o presente
momento.
BIOGRAFIA
Wardsson Lustrino Borges filho de Maria Antônia Lustrino Borges e Juracy Borges do Rego
nasceu em Varzelândia, norte de Minas Gerais no dia 21 de outubro de 1981. Passou a sua
infância em Varzelândia onde cursou o ensino fundamental na Escola Estadual Padre José
Silveira, concluindo em 1995. De 1996 a 1998 morou em Januária, tradicional cidade do norte
do estado, ribeirinha ao Rio São Francisco onde conclui o curso de Técnico em Agropecuária,
na Escola Agrotécnica Federal de Januária, atual Centro Federal de Educação Tecnológica de
Januária. Wardsson diplomou-se Engenheiro Agrônomo pela Universidade Federal Rural do
Rio de Janeiro (Antiga Escola Nacional de Agronomia). No período da graduação foi
orientado por pesquisadoras da Embrapa Agrobiologia.
RESUMO
BORGES, Wardsson Lustrino. Análise da variabilidade genética e Avaliação da fixação
biológica de nitrogênio entre acessos de amendoim (Arachis hypogaea L.). 2006. 48f.
Dissertação (Mestrado em Agronomia, Ciência do Solo). Instituto de Agronomia,
Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2006.
O amendoim é uma cultura cultivada em todo o mundo que apresenta elevado potencial para
fixação biológica de nitrogênio (FBN). Entretanto o amendoim é considerado uma espécie
promíscua, o que faz necessário um extenso trabalho de seleção de estirpes de rizóbio
eficientes e competitivas para a produção de inoculantes para esta cultura. A seleção de uma
associação eficiente depende do conhecimento da variabilidade genética do macro e do
microssimbionte, uma vez que o padrão de variabilidade pode revelar níveis de especificidade
da associação. O conhecimento a respeito de interações mais especificas e eficientes pode
permitir a otimização do processo de fixação biológica de nitrogênio via seleção de pares
simbiontes. O objetivo deste trabalho foi avaliar por meio de marcador molecular (RAPD) a
variabilidade genética entre 29 acessos da espécie A. hypogaea L. e avaliar a fixação
biológica de nitrogênio em acessos representantes de grupos, em condição de não inoculação.
Foram testados 55 iniciadores randômicos, sendo selecionados 31, que geraram um total de
145 fragmentos amplificados, destes 35 foram polimórficos (24,0%), com médias de 4,67 e
1,13 fragmentos e fragmentos polimórficos por iniciador, respectivamente. Apesar da
existência de substancial diversidade entre genótipos de amendoim para várias características
morfológicas, pouca variação tem sido detectada quando se utiliza marcadores baseados em
DNA. Pelos dendrogramas construídos com os dados de RAPD, foi possível observar a
formação de dois grupos principais entre os acessos estudados. Não foi observado
agrupamento em função da origem dos acessos nem em função da caracterização em
subespécies. A diferença na capacidade de nove acessos em fixar nitrogênio em condições de
não inoculação foi avaliada em dois solos. As avaliações deste experimento permitiram
concluir que os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner, Sapucaia Vermelha, Sapucaia Bege e
CV Tatuí mostraram um rendimento superior quando comparado com os demais acessos.
Observou-se também que, a definição dos acessos mais eficientes quanto à FBN não está
necessariamente relacionada ao relacionamento genético, uma vez que, estes acessos
pertencem a grupos distintos pelo ensaio RAPD.
Palavras chave: Diversidade genética, FBN, AP-PCR.
ABSTRACT
BORGES, Wardsson Lustino. Analisys of genetic variability and assessment of biological
nitrogen fixation among peanut (Arachis hypogaea L.) accessions. 2006. 49f. Dissertation
(Master Science in Agronomy, Soil Science) Instituto de Agronomia, Departamento de Solos,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2006.
The peanut is a crop worldwide cultivated and it presents a high potential to biological
nitrogen fixation (BNF). However peanut is considered a very promiscuous crop, what makes
necessary a hard work of selection of rhizobial efficient and competitive strains to produce
inoculants for this crop. The selection of an efficient association depends of the knowledge of
genetic variability between both symbionts, since the levels of compatibility may reveal
specificity association levels. The knowledge of more efficient and specific associations may
optimize of BNF by selection of symbiont partners. The aim of this study was evaluate, by a
molecular marker (RAPD), the genetic variability among 29 accessions of A. hypogaea L. and
evaluate the BNF of clusters representing accessions, above non inoculated conditions. Were
tested 55 arbitrary primers and selected 31, that generated 145 amplified fragments, which 35
showed polymorphism (24%), with averages of 4.67 and 1.13 fragments and polymorphic
fragments by primer, respectively. In despite of the substantial diversity among peanut
genotypes by several morphologic characteristics, low variation had been detected using DNA
based markers. In the dendrograms constructed using the RAPD data was possible to observe
two principal clusters among the accessions studied. It was not observed clustering neither by
the origin of accessions nor about characterization of subspecies. The BNF capability
differences of nine accessions in non inoculation conditions were evaluated in two soils. The
evaluations of this experiment permitted conclude that the accessions IAC Tatu-ST, IAC 886
Runner, Sapucaia vermelha, Sapucaia Bege and CV Tatuí had shown a higher performance
when compared with the other accessions. It was also observed that, the definition of the
accessions more efficient to BNF, necessarily is not related to its genetic relationship, once
this accessions belonged to distinct groups by assay RAPD.
Keywords: Genetic diversity, BNF, AP-PCR.
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Área plantada e a produção observada para a cultura do amendoim, no Brasil e nas
regiões do país. Dados referentes ao ano de 2005 de acordo com levantamento do IBGE.6
Tabela 2: Identificação dos acessos de amendoim utilizados para a extração de DNA total e
posterior ensaio por RAPD............................................................................................ 15
Tabela 3: Reagentes e concentrações testadas para a padronização do ensaio RAPD........... 16
Tabela 4: Temperaturas utilizadas no gradiente (45ºC +/- 10 ºC), para o passo de anelamento.
...................................................................................................................................... 17
Tabela 5: Nome e seqüência dos 40 iniciadores randômicos dos kits A e B da Operon
testados na etapa de seleção........................................................................................... 18
Tabela 6: Seqüência e a temperatura de anelamento (ºC) de 15 iniciadores propostos por HE
& PRAKASH (1997)..................................................................................................... 19
Tabela 7: Resultado da análise química das amostras de terra utilizadas no experimento..... 19
Tabela 8: Acessos utilizados para a extração de DNA, a concentração obtida para cada
produto de extração e a relação entre os valores de absorbância obtidos com leituras a 260
e 280nm para inferência sobre a qualidade do produto................................................... 22
Tabela 9: Resultados obtidos com os diferentes iniciadores utilizados no ensaio RAPD com
os 29 acessos de amendoim. .......................................................................................... 25
Tabela 10: Valores médios de matéria fresca e matéria seca da parte aérea das plantas dos
nove acessos utilizados no experimento de casa de vegetação........................................ 34
Tabela 11: Teores médios de nitrogênio e acúmulo total de nitrogênio na parte aéreas das
plantas dos nove acessos utilizados no experimento de casa de vegetação...................... 35
Tabela 12: Valores médios de etileno produzido pelos nove acessos utilizados no
experimento de casa de vegetação, analisados pela técnica de redução de acetileno....... 35
Tabela 13: Valores médios de número de nódulos e massa seca de nódulos dos nove acessos
de amendoim utilizados no experimento de casa de vegetação....................................... 37
Tabela 14: Valores médios de massa seca de raiz e massa seca total do sistema radicular dos
nove acessos de amendoim utilizados no experimento de casa de vegetação.................. 38
Tabela 15: Correlação observada entre os parâmetros analisados no experimento com os nove
acessos de amendoim. ................................................................................................... 39
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Subespécies, variedades botânicas e tipos agronômicos da espécie Arachis
hypogaea L. (Adaptado de HERSELMAN, 2003). .......................................................... 4
Figura 2: Gel de agarose (0,8%p/v) mostrando o produto da extração com um (canaletas de 1
a 6) e com três discos de tecido vegetal (canaletas de 7 a 12). Sendo que as canaletas 1, 2,
7 e 8 correspondem ao produto da extração com o acesso 193AM, canaletas 3, 4, 9 e 10
correspondem ao produto da extração com o acesso 184AM e, canaletas 5, 6, 11 e 12
correspondem ao produto da extração com o acesso 218AM. ........................................ 21
Figura 3: Perfis de bandas obtidos com quatro misturas diferentes das oito testadas, em cada
gel podem ser observadas duas misturas. A concentração de DNA utilizada foi de
1ηg.µL
-1
para ambos os géis, a concentração de iniciador utilizada foi de 1,0ηg.µL
-1
no
gel da parte superior da figura e 1,5 ηg.µL
-1
no gel da parte inferior da figura. A
concentração de MgCl
2
variou de 1,5mM (1 a 12) para 2,0 mM (13 a 24) em cada gel.. 23
Figura 4: Perfis de bandas obtidos com quatro misturas diferentes das oito testadas, em cada
gel podem ser observadas duas misturas. A concentração de DNA utilizada foi de
1,5ηg.µL
-1
para ambos os géis, a concentração de iniciador utilizada foi de 1,0ηg.µL
-1
no
gel da parte superior da figura e 1,5 ηg.µL
-1
no gel da parte inferior da figura. A
concentração de MgCl
2
variou de 1,5mM (1 a 12) para 2,0 mM (13 a 24) em cada gel... 23
Figura 5: Perfis de bandas obtidos com o iniciador opA5 para os acessos (1) Tatu-St, (2) IAC
8112, (3) IAC Caiapó, (4) V12549, (5) Md1678, (6) V12548, (7) CV Tatuí, (8) Mf 1538,
(9) IAC Runner, (10) Sapucaia Bege, (11)Mf 1560 e (12) CV Tatu. B e M correspondem
ao branco e ao marcador X174, respectivamente............................................................ 26
Figura 6: Perfil de bandas obtido com o iniciador opB15 para os acessos (1) 76AM, (2)
Sapucaia vermelha, (3) 174AM, (4) 192AM, (5)198AM, (6) 214AM, (7) 178AM, (8)
208AM, (9) 185AM, (10) Serrinha, (11) 184AM, (12)193AM, (13) 158AM, (14) 206AM,
(15) 218AM, (16) 180AM e (17) 202AM. M corresponde ao marcador X174. .............. 26
Figura 7: Dendrograma de similaridade construído com o algoritmo UPGMA e o coeficiente
de similaridade Simple Match (SM), a partir da matriz binária de dados RAPD com os 12
iniciadores randômicos em que se observou polimorfismo. Mostrando os grupos formados
entre os 29 acessos de amendoim................................................................................... 28
Figura 8: Dendrograma de similaridade construído com o algoritmo UPGMA e o coeficiente
de similaridade DICE, a partir da matriz binária de dados RAPD com os 12 iniciadores
randômicos em que se observou polimorfismo. Mostrando os grupos formados entre os 29
acessos de amendoim. ................................................................................................... 29
Figura 9: Análise de componentes principais de 29 acessos de amendoim, com base nos
dados da matriz binária de 12 iniciadores RAPD, mostrando a ordenação dos acessos... 33
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO 1
2 - REVISÃO DE LITERATURA 2
2.1 - Gênero Arachis 2
2.1.1 - Origem do genoma de Arachis hypogaea 3
2.1.2 – A espécie Arachis hypogaea L – amendoim 3
2.1.3 – A cultura do amendoim 5
2.2 - Fixação Biológica de Nitrogênio em Amendoim 6
2.2.1 - Diversidade de rizóbio que nodula amendoim 8
2.3 - Marcadores Moleculares 8
2.3.1 – Marcadores moleculares do tipo RAPD 11
3 - MATERIAL E MÉTODOS 14
3.1 - Obtenção dos Acessos de Amendoim 14
3.2 - Extração de DNA Total 14
3.3 - Otimização das Condições de Amplificação 16
3.4 - Seleção dos Iniciadores Randômicos 17
3.5 – Ensaio RAPD 18
3.6 – Experimentos em Condição de Casa de Vegetação 19
3.7 – Análise Estatística dos Dados 20
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 21
4.1 - Extração do DNA 21
4.2 - Otimização das Condições de Amplificação 22
4.3 – Ensaio RAPD 24
4.4 – Avaliação da Nodulação e Fixação Biológica de Nitrogênio 34
5 – CONCLUSÕES 40
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 41
1 – INTRODUÇÃO
O Nitrogênio é o nutriente considerado como sendo o mais crítico para a
produtividade agrícola, desta forma, a introdução de práticas culturais que maximizem o
aproveitamento e reduzam os custos com este nutriente devem ser buscadas. Dentro deste
contexto a otimização do processo de fixação biológica de nitrogênio resultante da seleção de
simbiontes eficientes poderia contribuir para aumentar a produtividade e diminuir os custos
com fertilizantes nitrogenados.
Desta forma, revestem-se de grande importância, os estudos dos fatores que regulam o
estabelecimento da simbiose, que são mais efetivos no caso da associação entre rizóbio e soja.
No entanto, para outras leguminosas muitas outras oportunidades de estudos são eminentes, a
fim de otimizar a FBN em condições tropicais.
A otimização da fixação biológica de nitrogênio em espécies tropicais, considerada a
questão relacionada à promiscuidade destas espécies, que é a capacidade destas em formar
associação com um grupo diverso de bactérias nativas do solo e, a possibilidade do
incremento de produtividade via otimização da FBN costuma ser questionada, uma vez que
estes rizóbios nativos são considerados de pouca eficiência e competitivos.
O amendoim (Arachis hypogaea L.) é considerado uma espécie promíscua, desta
forma a prática de inoculação não é muito comum. No entanto, a seleção de uma associação
eficiente depende do conhecimento da variabilidade genética do macro e do microssimbionte,
uma vez que o padrão de variabilidade e o conhecimento de interações mais eficientes podem
revelar níveis de especificidade da associação permitindo-se a maximização do processo de
FBN via seleção de pares simbiontes.
A característica simbiótica da cultura do amendoim não tem sido considerada nos
diferentes programas de melhoramento de cultivares de amendoim, onde predominam
questões como a qualidade das sementes, o rendimento das sementes, bem como a resistência
às principais doenças causadas por fungos de parte aérea. Por esse motivo não se conhece
com profundidade os níveis de especificidade das cultivares de amendoim nem a capacidade
simbiótica destas.
Com base neste cenário, o incremento da fixação biológica em amendoim deve ser
parte integrante de um programa de melhoramento e deve ser conduzido de forma contínua,
ou seja, a seleção de microssimbionte deve ser realizada a cada seleção de um novo
macrossimbionte. Assim como, para a seleção de um microssimbionte deve se ter
conhecimento da capacidade de fixação que o germoplasma vegetal apresenta, sua
especificidade com o microssibionte e a eficiência do par em relação ao processo de FBN.
O objetivo deste trabalho foi avaliar por meio de marcador molecular (RAPD) a
variabilidade genética de 29 acessos da espécie A. hypogaea L. e avaliar a fixação biológica
de nitrogênio em acessos representantes de grupos obtidos por RAPD.
2
2 - REVISÃO DE LITERATURA
2.1 - Gênero Arachis
O gênero Arachis, da família Fabaceae, é nativo da América do Sul, provavelmente da
região que inclui o Brasil Central e o Paraguai (GREGORY et al.,1980). HOLBROOK &
STALKER (2002) destacam que as espécies do gênero Arachis são nativas de uma extensa
região da América do Sul que se estende desde os contrafortes dos Andes ao Atlântico e, da
costa norte brasileira até 34
0
S no Uruguai. PEÑALOSA (1995) corrobora esta observação
citando que as espécies deste gênero ocorrem naturalmente em cinco países da América do
Sul: Argentina, Bolívia, Brasil, Paraguai e Uruguai.
KRAPOVICKAS & GREGORY (1994) descreveram 69 espécies neste gênero, as
quais estão classificadas em nove seções, de acordo com as características morfológicas,
citogenéticas, genéticas, distribuição geográfica e na fertilidade de híbridos interespecíficos.
Segundo estes mesmos autores os dados citogenéticos são importantes para auxiliar o estudo
taxonômico das espécies do gênero Arachis. As nove seções são: Arachis, Caulorrhizzae,
Erictoides, Extranervosae, Heteranthae, Procumbentes, Rizomatosae, Trierectoides e
Triseminatae. Recentemente, onze novas espécies, de seis diferentes seções foram
identificadas (VALLS & SIMPSON, 1997) e analisadas quanto ao número cromossômico
(PEÑALOSA & VALLS, 1999).
As espécies do gênero Arachis se distinguem da maioria das outras espécies de plantas
por florescerem acima do solo, mas produzirem frutos abaixo da superfície do solo. Dados
citogenéticos identificaram três genomas na seção Arachis (A, B e D) e a maior parte das
espécies diplóides possuindo o genoma A, que é caracterizado pela presença de um par de
cromossomos menor do que os outros cromossomos enquanto o genoma B não apresenta este
par. STALKER (1991) descreveu a espécie Arachis glandulifera como pertencente ao
genoma D, por ser a única espécie a apresentar seis pares de cromossomos subtelocêntricos.
Dentre as espécies do gênero Arachis, o amendoim é a espécie mais estudada em
função da sua importância econômica. Entretanto, outras espécies apresentam características
de interesse agronômico, como forrageiras, tais como Arachis glabrata Bentham da seção
Rhizomatosae (PRINE et al., 1981) e duas da seção Caulorrhizae: Arachis repens Handro e
Arachis pintoi Kraprov. & Gregory (KERRIDGE & HARDY, 1994). Arachis glabrata é um
tetraplóide, de ocorrência natural na Argentina, Brasil e Paraguai, já as espécies da seção
Caulorrhizae são diplóides e têm sido encontradas crescendo naturalmente apenas no Brasil.
GIMENES et al. (2002) ressaltaram que o grande número de acessos coletados
recentemente ampliou a distribuição geográfica de muitas seções e que novas questões sobre a
posição taxonômica e parentesco entre algumas espécies têm sido levantadas neste gênero.
Uma vez que alguns destes novos acessos apresentam características morfológicas
intermediárias entre diferentes espécies, mudanças na taxonomia podem ocorrer quando estes
acessos forem considerados.
VALLS et al. (1985) relataram que a distribuição das espécies neste gênero é quase
contínua e há uma quantia extensa de distribuição sobreposta entre alguns taxa em diferentes
seções. O gênero ocupa uma região de 4000 km de extensão desde o Nordeste do Brasil até os
Andes (KRAPOVICKAS & GREGORY, 1994), com espécies que crescem desde o nível do
mar até 1450m de altitude, em ambientes com floresta descontínuas até vegetação de
gramíneas, em regiões com média superior a 2000 mm de chuva/ano ou mesmo em
pedregulho árido (SINGH & SIMPSON, 1994; apud FÁVERO, 2004).
3
2.1.1 - Origem do genoma de Arachis hypogaea
Arachis hypogaea é um anfidiplóide cujos progenitores não têm sido determinados de
forma conclusiva, sendo que várias espécies já foram propostas como doadoras dos genomas
A e B. A identificação das doadoras dos genomas A e B, envolvidos na origem do amendoim
tem grande importância teórica e prática (FERNÁNDES & KRAPOVICKAS 1994).
Quase todas as espécies do gênero Arachis são diplóides, mas o amendoim cultivado é
um tetraplóide (genoma AABB). Este é um membro da seção Arachis, onde também, estão
incluídas 25 espécies diplóides e uma espécie selvagem tetraplóide (Arachis monticola)
(KRAPOVICKAS & GREGORY, 1994).
Arachis hypogaea L. (AABB; 2n=4x=40) teria se originado por domesticação da
espécie tetraplóide A. monticola (AABB) e esta, pelo cruzamento entre duas espécies
silvestres da seção Arachis, uma de genoma “A” (com o par de cromossomos “A”), e outra de
genoma “B” (sem o par de cromossomos “A”) (GREGORY & GREGORY 1976, 1979).
Arachis monticola e A. hypogaea são as únicas espécies tetraplóides da seção Arachis e
formam híbridos férteis quando cruzados entre si.
Em função das diferenças entre as duas subespécies de Arachis hypogaea,
KRAPOVICKAS & GREGORY (1994) ressaltam que a possibilidade do envolvimento de
mais de uma espécie na origem desta espécie não deve ser descartada. Estes autores, baseados
em dados de distribuição geográfica das espécies silvestres da seção Arachis sugerem que a
subsp. hypogaea tenha originado no Sudeste da Bolívia e que a subsp. fastigiata tenha se
diferenciado mais ao Norte, possivelmente no Peru, onde apresenta sua maior variabilidade,
observando a presença das vars. fastigiata, peruviana e aequatoriana.
Com base em evidências citogenéticas, aliadas ou não a dados moleculares e de
cruzamentos interespecíficos, a hipótese mais aceita é de que A. duranensis teria sido a
doadora do genoma “A” (FERNANDES & KRAPOVICKAS, 1994; KOCKER et al.,1991,
1996; SINGH, 1986) e A. batizocoi, do genoma “B” (CAI et al., 1987, SINGH 1986,
SMARTT et al., 1978).
Em uma revisão sobre os doadores dos genomas para o amendoim baseados em dados
de citogenética SINGH & SMARTT (1998) concluíram que A. duranensis e A. batizocoi
ainda são os mais prováveis progenitores de A. hypogaea e, que a possibilidade de A.
ipanensis ser doador do genoma B só deveria ser considerada quando híbridos férteis forem
produzidos entre A. hypogaea e o produto do cruzamento entre A duranensis e A. ipanensis.
Posteriormente, FÁVERO (2004) produziu híbrido fértil entre Arachis hypogaea e o produto
do cruzamento entre A duranensis e A. ipanensis, o que indica que A. ipanensis pode ser um
dos progenitores de amendoim.
2.1.2 – A espécie Arachis hypogaea L – amendoim
Muito antes dos portugueses chegarem ao Brasil em 1500, o amendoim já era
conhecido e utilizado pelos índios brasileiros. Em algumas tribos ele era chamado de mandubi
ou mandobim e em outras de manobi. Mas tarde, provavelmente por causa do gosto
semelhante do “Manobi” com as amêndoas já largamente conhecidas na Europa, os
colonizadores portugueses foram adaptando o seu nome para “Amendoi” – derivado de
amêndoa – surgindo o seu nome atual - amendoim (MARTIN, 1985).
A. hypogaea é classificado conforme a ausência ou a presença de flores no eixo
principal em duas subespécies, hypogaea e fastigiata e, estas subespécies foram então
divididas em seis variedades botânicas conforme o hábito de crescimento (hypogaea, hirsuta,
fastigiata, vulgaris, aequatoriana e peruviana) (KRAPOVICKAS & GREGORY, 1994).
4
Outra diferença notável entre as duas subespécies é a cor da folhagem, verde escura na
subespécie hypogaea e verde claro na subespécie fastigiata.
O amendoim, também é classificado, agronomicamente, como pertencente aos grupos
Valência, Spanish ou Virginia, de acordo com os caracteres reprodutivos e vegetativos
(Figura 1). As cultivares ou acessos de A. hypogaea pertencentes aos grupos Valência e
Spanish possuem eixo central com flores, hábito ereto ou semi-ereto, poucos ramos
secundários e as vezes terciários, ciclo curto, vagens com duas (Spanish), três ou quatro
sementes (Valência). Morfologicamente acessos de amendoim do grupo Spanish podem ser
enquadrados em A. hypogaea subsp fastigiata var. vulgaris e, aqueles do grupo Valência
podem ser considerados pertencentes à A. hypogaea subsp fastigiata var. fastigiata. Acessos
do grupo Virginia são pertencentes à A. hypogaea subsp. hypogaea var. hypogaea, já que
mostram hábito rasteiro e ramificação abundante, ciclo longo, ausência de flores no eixo
central e vagens com duas sementes (GODOY et al., 1999, apud FÁVERO, 2004). No
entanto, a classificação agronômica, não abrange todas as variedades de A. hypogaea e as
cultivares podem ter em seu pedigree acessos pertencentes a distintas subespécies e
variedades (FÁVERO, 2004).
Figura 1: Subespécies, variedades botânicas e tipos agronômicos da espécie Arachis
hypogaea L. (Adaptado de HERSELMAN, 2003).
Depois da domesticação o amendoim dispersou-se pela América do Sul o que levou a
diferenciação de seis variedades botânicas que atualmente estão distribuídas em sete (I a VII)
centros de diversidade (centros secundário e terciário). A. hypogaea subsp hypogaea var.
hypogaea está presente em três centros, III – Rondônia e Noroeste do Mato Grosso (Brasil),
IV - Os contrafortes orientais do Andes na Bolívia e V – Peru; A. hypogaea subsp hypogaea
var. hyrsuta está presente no centro V – Peru; A. hypogaea subsp fastigiata var. fastigiata está
presente em cinco centros, I - Guarani, II – Goiás e Minas Gerais (Brasil), IV - Os
contrafortes orientais do Andes na Bolívia, V – Peru, VI – Nordeste do Brasil; A. hypogaea
subsp fastigiata var. vulgaris está presente nos centros, I- Guarani e IV - Nordeste do Brasil;
A. hypogaea sbsp fastigiata var. peruviana está presente no centro V – Peru e, por fim A.
hypogaea subsp fastigiata var. aequatoriana está presente no centro VII Equador
(FERGUSON et al., 2004a).
Apesar da dificuldade de classificação e catalogação, são conhecidas algumas
características desses materiais, como por exemplo, para BR1, IAC Tatu-ST, IAC Caiapó e
IAC Runner 886, conforma abaixo:
Arachis hypogaea subsp. fastigiata var. fastigiata
1. BR 1: Ciclo curto (89 dias), hábito ereto, maior tolerância aos estresses hídricos, com
grãos de cor vermelha e vagens com 3 a 4 sementes.
Virginia
hypogaea hirsuta
Arachis hypogaea subs hypogaea
Valência
fastigiata
Spanish
vulgaris aequatoriana peruviana
Arachis hypogaea subs fastigiata
Arachis hypogaea
5
2. IAC-TATU-ST: Porte ereto, ciclo de 90 a 110 dias, suscetível à mancha-castanha,
mancha-preta, verrrugose, mancha-barrenta e ferrugem, rendimento em sementes após
descascamento de 70%, peso de 100 sementes de 40g, tamanho de sementes de 18 a
20 mm, cor vermelha da película das sementes, não possui dormência das sementes e
rendimento em óleo de 41%
Arachis hypogaea subsp. hypogaea var. hypogaea
1. IAC-Caiapó: cultivar de ciclo longo (130-135 dias), de hábito rasteiro, produtividade
de 2,5 a 3,0 t/ha, grãos de tamanho médio, de cor castanha e com dormência. Possui
alto teor de óleo (44%) de alta qualidade com relação oléico/linoléico de 1,6 a 2,0. É
moderadamente resistente a cercosporiose, ferrugem e verrugose e resistente à mancha
barrenta. Melhor adaptada para semeadura e colheita mecanizada.
2. Runner IAC 886: cultivar de ciclo longo (125 a 130 dias), com grãos de cor castanha,
alta produtividade e características de grão tipo exportação. Indicada para lavouras
tecnificadas.
O amendoim é considerado como uma espécie autógama, com uma estrutura
reprodutiva, que facilita a autofecundação, sendo composta por oito anteras e estigma na
mesma altura ou ligeiramente acima das anteras, sendo que todas as estruturas são envoltas
por uma quilha (SANTOS & GODOY, 1999 apud FÁVERO 2004).
2.1.3 – A cultura do amendoim
Dentre as espécies do gênero Arachis a maior parte das pesquisas genéticas são
dirigidas à seção Arachis que contém o amendoim cultivado, que é amplamente cultivado em
mais de 80 países da América, Ásia e África (MORETZSOHN et al., 2004, SINGH &
SINGH, 1992). Considerada como apreciável fonte de matéria graxa, o amendoim é tido
como uma das principais oleaginosas cultivadas em larga escala mundial, principalmente na
África, na América, incluindo os Estados Unidos e em diversos países da América Latina,
inclusive no Brasil e, na Indonésia (Ásia) (MARTIN, 1985; SANTOS et al., 1997). É a quarta
maior cultura oleaginosa mundial, seguindo a soja (56,8%), o algodão (11,3%) e a canola
(11,8%). Participa com 10% da produção mundial de óleo comestível. A China, os EUA e a
Índia são os maiores produtores mundiais (HE et al., 2003). Já a China, os Estados Unidos e a
Argentina são os maiores exportadores devido à qualidade dos grãos, enquanto, o Japão e a
Europa os maiores importadores (RANGEL, 2005).
Cerca de oito milhões de toneladas anuais de grãos destinam-se ao consumo como
alimento “in natura” ou industrializado, e 15 a 18 milhões são esmagados para fabricação de
óleo comestível. Os Estados Unidos e a China, além de produtores, são grandes consumidores
de amendoim como alimento. Juntos consomem cerca de três milhões de toneladas. Nos
Estados Unidos, além de outras utilizações em confeitaria, cerca de 500 mil toneladas são
destinadas especificamente à fabricação da pasta ou manteiga de amendoim (“peanut butter”),
consumida diariamente em sanduíches, em substituição a manteigas ou margarinas
convencionais (GODOY, 2005).
De acordo com estimativa da FAO (2004), a produção mundial de amendoim está
sendo incrementada e tem alcançado 37 milhões de toneladas na casca e 5,8 milhões de
toneladas de óleo.
No Brasil, o nível tecnológico e os sistemas agrícolas em que o amendoim é produzido
apresentam variações, que podem ser observadas pela produção de cada região (Tabela 1). O
estado de São Paulo é o maior produtor nacional onde, destacam-se os municípios de Ribeirão
Preto e Marília, sendo que em Ribeirão Preto, o amendoim assume uma especial importância,
em função de estar entre as culturas de ciclo curto, que é uma opção juntamente com a soja,
na ocupação das áreas de reforma dos canaviais e, também, por existirem na região empresas
6
produtoras de sementes. Estima-se que 80% da área de reforma de canavial seja ocupada pela
cultura do amendoim (RANGEL, 2005).
No estado de São Paulo as cultivares IAC Tatu Vermelho, IAC-Tatu-ST e IAC Caiapó
têm uma participação no mercado de sementes fiscalizadas ou certificadas de 53%, 34% e
13% respectivamente, enquanto na região Nordeste, as cultivares mais plantadas são Tatu e
BR1 (FÁVERO, 2004).
Tabela 1: Área plantada e a produção observada para a cultura do amendoim, no Brasil e nas
regiões do país. Dados referentes ao ano de 2005 de acordo com levantamento do
IBGE.
Região Cultivo Produção (Mg) Área (ha)
Produtividade
Mg.ha
-1
1
a
Safra 698 573 1.218
Nordeste
2
a
Safra 10.303 8.629 1.194
1
a
Safra 219.351 84.721 2.589
Sudeste
2
a
Safra 26.500 14.700 1.803
1
a
Safra 11.822 8.952 1.321
Sul
2
a
Safra ---- ---- ----
1
a
Safra ---- ---- ----
Centro-Oeste
2
a
Safra 23.292 7.915 2.943
1
a
Safra 231.871 94.246 2.460
Brasil
2
a
Safra 60.095 31.244 1.923
Fonte: http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp?z=t&o=22&i=P.
A cultura caracteriza-se por ser de ciclo curto, resistente à seca e de adaptabilidade
ampla, sendo cultivada por pequenos e médios produtores em vários estados da federação,
especialmente na região Nordeste, tanto em sistema de produção de sequeiro, quanto de
irrigado. O óleo, seu principal produto, é muito rico em ácidos graxos insaturados, média de
51,0% de oléico e de 28,0% de linoléico e, cada 100g é capaz de fornecer 580 Kcal. O
amendoim é ainda uma rica fonte de proteínas (25% da massa dos grãos) e vitamina E
(antioxidante), além de conter vitaminas do complexo B, ácido fólico e, minerais como cálcio,
fósforo, potássio e zinco (BELTRÃO, 2004).
A recomendação de plantio do amendoinzeiro tem sido para solos de textura arenosa
ou franco-arenosa, bem drenados e de fertilidade média, com pH entre 6,0 e 6,5, bem
preparados e corrigidos, se for o caso, via calagem e fertilização (BELTRÃO, 2004).
A diversidade na forma de consumo faz com que esta cultura tenha uma
expressividade econômica. Os grãos são consumidos “in natura” ou processados
industrialmente, originando alguns derivados (óleo e farelo) ou ainda, sendo utilizados na
fabricação de produtos alimentícios, ou no ramo das conservas, confeitarias, enlatados e,
também, na indústria farmacêutica (GODOY, 1985; MARTIN, 1985).
2.2 - Fixação Biológica de Nitrogênio em Amendoim
7
Vários membros da Família Leguminosae são de considerável importância ecológica e
econômica, devido, em parte, a habilidade destes em formar simbiose fixando nitrogênio com
bactérias dos gêneros Rnizobium e Bradyrhizobium. A introdução de bactérias específicas,
promotoras de crescimento, nos solos pode suprir nutrientes para as espécies cultivadas, como
o nitrogênio no caso de bactérias que realizam a fixação biológica, pode promover o
crescimento de plantas pela produção de fitohormônios e controlar ou inibir atividade de
patógenos de plantas (CASTRO et al., 1999).
A inoculação com bactérias do grupo rizóbio é uma prática de significante beneficio
agronômico em áreas onde a espécie vegetal é cultivada pela primeira vez (BROWCKELL et
al., 1988; HUME & BLAIR, 1992) ou em solos onde o número de rizóbios é tão baixo para
permitir uma eficiente nodulação da planta (SINGLETON et al., 1992). O número e as
espécies de rizóbios no solo dependem das condições bióticas e abióticas deste ambiente e das
espécies de leguminosas silvestres ou cultivadas (SIMON et al., 1996 apud CASTRO et al.,
1999).
Segundo THIES et al. (1991) na cultura do amendoim (Arachis hypogaea L.) a prática
de inoculação não é muito comum, uma vez que esta é considerada como sendo capaz de
nodular com uma ampla faixa de rizóbios tropicais do grupo miscelânea caupi. Entretanto, a
inoculação com estirpes selecionadas, é capaz de aumentar a efetividade da simbiose e
aumentar o rendimento do amendoim (HUANG, 1987, 1988).
SANTOS (2001), avaliando a diversidade e a eficiência simbiótica de isolados de
rizóbio nativos da região Nordeste do Brasil, na cultura do amendoim, concluiu que as
associações amendoim e rizóbio são dependentes do genótipo da planta. Dos genótipos
estudados, a cultivar IAC Tatu foi a que estabeleceu as associações mais eficientes,
apresentando valores de massa seca de parte aérea semelhante ao tratamento com adição de N
mineral, enquanto a cv. BR1 foi dependente do N aplicado ao solo, só sendo capaz de se
beneficiar da FBN com um dos isolados estudados (A-105). A cultivar Sertão apresentou taxa
de eficácia superior à 80% com os isolados S10 e S11 e, todos os isolados testados neste
estudo foram eficazes com as cultivares IAC Tatu, Embrapa 142-L7 e Sertão, apresentando
taxa de eficácia variando de 50 a 90%. Estes resultados sugerem ser possível otimizar o
processo de FBN para a cultura de amendoim através da seleção de associações eficientes.
A competitividade também é uma característica importante no processo de inoculação
já que se refere à habilidade de uma dada estirpe de dominar a nodulação na presença de
outras estirpes. A alta competitividade da estirpe inoculada é tão importante quanto a
efetividade simbiótica (TRIPLETT, 1990). É desejável que a seleção de um inoculante para
amendoim contemple não somente estirpes que apresentem uma maior competitividade em
relação às estirpes nativas, como também, que sejam capazes de manter níveis eficientes de
FBN.
Numa compilação dos principais resultados obtidos nos mais importantes programas
de melhoramento a nível mundial visando incremento da fixação biológica de nitrogênio em
feijoeiro, HERRIDGE & DANSO (1995), concluíram que quando a nodulação é usada como
principal critério de seleção, o progresso é limitado. Estes autores sugerem que o parâmetro
mais adequado seja a fixação de nitrogênio, estimada através nitrogênio total da planta ou da
semente, sob condições de baixa disponibilidade de nitrogênio.
Tendo em vista a demanda da planta por nitrogênio, o mercado brasileiro por
amendoim e seus derivados, e a área plantada desta cultura no Brasil, programas de
melhoramento que visem o incremento da FBN em amendoim podem trazer contribuições
significativas em termos de geração de renda e riqueza no país, além de contribuir com o
desenvolvimento econômico das regiões produtoras desta cultura.
8
2.2.1 - Diversidade de rizóbio que nodula amendoim
O amendoim é considerado como sendo uma espécie promíscua por ser nodulada por
rizóbios capazes de nodular um grupo diverso de leguminosas (ALWI et al., 1989). Em um
estudo amplo de caracterização polifásica de isolados de amendoim YANG et al. (2005)
concluíram, baseados em dados de testes fenotípicos, RFLP 16S rDNA, RFLP-ITS 16S-23S,
ERIC, REP, BOX-PCR e seqüenciamento do 16S, que o grupo de isolados de distintas
regiões da China são bastante próximos da espécie Bradyrhizobium japonicum ou de
Bradyrhizobuim spp. Os autores concluíram que o grupo de isolados exibiu uma grande
variabilidade embora pertencessem ao mesmo gênero. Todos os isolados de amendoim foram
capazes de nodular Arachis hypogaeae e Phaseolus vulgaris, mas não mostraram capacidade
de fixar nitrogênio com P. vulgaris e alguns dos isolados foram capazes de nodular e fixar
nitrogênio quando em associação com Glycine soja.
Estudos conduzidos sobre a diversidade genética de isolados de amendoim por URTZ
& ELKAN (1996) e VAN ROSSUM et al. (1995), concluíram que os isolados que nodulam
eficientemente o amendoim são de crescimento lento, apresentando uma diversidade dentro
do grupo com relação às características de resistência a antibióticos e são comumente
classificados no gênero Bradyrhizobium.
CHEN et al. (2003) avaliaram por meio de marcadores AFLP, a diversidade de 125
isolados de amendoim, e observaram, por análise de agrupamento, que os isolados
distribuíram-se em três grupos principais. Representantes destes grupos foram utilizados em
estudo de compatibilidade com acessos vegetais de amendoim e foi observado que os isolados
de um grupo apresentaram capacidade de nodulação restrita, enquanto que os isolados dos
demais grupos são geralmente bons noduladores.
Embora isolados de rizóbio de crescimento rápido tenham sido relatado como
nodulando amendoim (HUANG, 1990, apud CHEN et al., 2003, SANTOS, 2001), a maioria
das estirpes eficientes de amendoim é de crescimento lento (CHEN et al., 2003).
Nos últimos anos, vários estudos têm indicado que isolados de amendoim são
fenotípica e genotipicamente diversos (LI et al., 1999; ZHANG et al., 1999, YANG et al.,
2005, SANTOS, 2001) abrindo a possibilidade de seleção de diferentes bactérias com
inoculantes rizobianos para os diferentes acessos, dentro do germoplasma vegetal utilizados
comercialmente. Dentro deste contexto, a disponibilidade de variabilidade no germoplasma
vegetal se torna importante para a seleção de associações eficientes.
2.3 - Marcadores Moleculares
No início deste século foram fundamentadas algumas questões na recente ciência da
Genética que proporcionaram, posteriormente, avanços significativos no melhoramento
vegetal. Uma destas questões foi a descrição da primeira exceção a um dos postulados de
Mendel, que inicialmente levantada por Bateson e Punnet em 1905, quando em estudo com
ervilhas indicaram a possibilidade de existência de “reduplicação” (mais tarde rebatizada de
“ligação”) entre genes controlando a cor da pétala e forma do grão de pólen. Tomas Hunt
Morgan foi o primeiro a demonstrar claramente que havia uma exceção a um dos postulados
de Mendel, isto é, que nem todos os genes têm segregação independente, pelo contrário, estão
ligados em grupos pelo mesmo filamento de material em que residem, os cromossomos
(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Fundamentada esta questão, surgiu a possibilidade de utilização de marcadores em
programas de melhoramento, uma vez que a seleção de um determinado marcador de fácil
identificação física que esteja ligado a uma pequena distância de um gene que controla um
caráter de interesse agronômico, resulta na seleção indireta deste gene. Por marcador
9
molecular entende-se todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de
um segmento específico de DNA (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Para os primeiros estudos de genética utilizando marcadores, foram utilizados os
marcadores morfológicos (cor de pétala, nanismo, morfologia foliar, etc) de fácil identificação
ou avaliação, para seleção de fenótipos complexos. A.H. Sturtevant desenvolveu o primeiro
mapa genético, o mapa da mosca-de-fruta Drosophila sp (STURTEVANT, 1913, apud
FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Com o advento das técnicas bioquímicas e moleculares, baseadas na análise de
polimorfismo de proteínas e fragmentos de DNA, uma rápida proliferação da utilização de
marcadores foi observada. A primeira classe de marcadores baseava-se no polimorfismo de
proteínas, as isoenzimas, que compreendem um grupo de proteínas com mesma função
catabólica, mas que são codificadas por genes de seqüências diferentes, o que resulta em
estruturas protéicas diferentes, que por sua vez confere diferenças a essas proteínas com
relação à mobilidade em géis de amido ou poliacrilamida. Esta classe de marcadores ainda é
bastante utilizada, entretanto como o número de sistemas enzimáticos disponíveis para análise
é pequeno, a técnica apresenta-se limitada a alguns estudos (DIAS et al., 2003).
Uma outra classe de marcadores amplamente utilizada são os marcadores RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism – polimorfismo de comprimento dos fragmentos
de restrição), onde o polimorfismo é evidenciado pela fragmentação do DNA total através do
uso de enzimas de restrição e observação da hibridização dos fragmentos com seqüências
homólogas de DNA, marcadas com radioatividade ou por compostos que desencadeiam uma
reação de luminescência (GRODZICHER et al., 1974). Ao se submeter à clivagem com uma
enzima de restrição, o DNA de indivíduos geneticamente distintos é cortado nos sítios de
restrição gerando fragmentos de diferentes tamanhos, que são detectados por hibridização. A
base genética de detecção desta classe de marcador são as mutações nos sítios de restrição ou
inserções, deleções e rearranjos entre os sítios de restrição (LOPES et al., 2003). Esta classe
de marcador é bastante informativa do ponto de vista do polimorfismo identificado, uma vez
que é possível identificar vários alelos do mesmo loco (marcador co-dominante), entretanto,
apresenta a limitação de ser bastante laboriosa, exigindo mais tempo para a identificação da
informação genética. Além disso, é difícil de ser automatizada, uma vez que é executada
através de várias etapas (DIAS et al., 2003).
Com o desenvolvimento da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction - reação de
polimerase em cadeia), que utiliza uma enzima Taq polimerase termoestável (MULLIS &
FALONA, 1987) possibilitando a amplificação de grande quantidade de um determinado
fragmento de DNA, novas classes de marcadores foram descritas, tais como, os marcadores
do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – polimorfismo de DNA amplificado
ao acaso) (WILLINANS et al., 1990) e, os marcadores do tipo AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism – polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados) (VOS et
al., 1995).
Com o desenvolvimento da tecnologia da PCR, surgiu uma limitação para a
implantação imediata em larga escala de análises genéticas para os diversos organismos de
interesse, que foi a necessidade do conhecimento de seqüências de nucleotídeos no genoma
dos organismos para o desenho e a síntese de iniciadores. Para sanar esta limitação, de forma
independente e quase simultânea, três grupos de pesquisadores nos Estados Unidos
propuseram a utilização de iniciadores curtos de seqüência arbitrária para a amplificação via
PCR de segmentos de DNA. WILLIAMS et al. (1990) foram os primeiros a publicar a
tecnologia com o nome mais comumente utilizado RAPD; WELSH & McCLELLAND
(1990), utilizaram o nome mais adequado para a técnica AP-PCR (Arbitrarily Primed –
Polymerase Chain Reaction – reação de polimerase em cadeia com iniciadores arbitrários),
uma vez que a amplificação não ocorre de forma aleatória e, sim em sítios específicos do
10
DNA onde o iniciador encontra uma seqüência complementar, em orientação oposta nas duas
fitas, dentro de uma distância amplificável pela polimerase. CAETANO-ANÓLES et al.
(1991) propuseram a tecnologia para a identificação de diferenças genética entre organismos e
utilizaram o nome DAF (DNA Amplification Fingerprint – impressão digital por amplificação
de DNA). Esta classe de marcador foi mundialmente difundida durante os primeiros anos da
década de 90 e desde então, está sendo utilizada para estudos moleculares, tanto em
organismos eucariotos quanto em procariotos.
Os marcadores do tipo AFLP constituem-se numa conversão dos marcadores RFLP
para marcadores dependentes da reação de PCR, uma vez que o DNA dos indivíduos
analisados é clivado com enzimas de corte raro e de corte freqüente que formam extremidades
coesivas, cujos fragmentos resultantes são ligados a adaptadores específicos (segmentos de
DNA de fita dupla, de seqüência conhecida) e, iniciadores são desenhados para a reação de
PCR baseando-se nas seqüências de base dos adaptadores e das seqüências de bases
reconhecidas pelas enzimas de restrição (VOS et al., 1995). Uma vez que milhares de
fragmentos são gerados na restrição do DNA total, cada iniciador reconhece um subconjunto
dos fragmentos de restrição que são amplificados via PCR. Portanto, visando a obtenção de
um grau mais alto de polimorfismo, podem ser utilizados na extremidade 3` nucleotídeos
seletivos, um na pré-amplificação e três ou quatro na amplificação seletiva, dependendo da
complexidade do genoma analisado (LOPES et al.,2003).
Mais recentemente, com o avanço nos projetos de seqüenciamento de genomas
completos, principalmente o genoma humano e do arroz (Oriza sativa), uma nova classe de
marcadores foi identificada. Os marcadores microssatélites (SSR – Simple Sequence Repeat –
seqüências simples repetidas), que são constituídos de seqüências pequenas de uma a seis
pares de bases que se repetem em tandem (uma trás da outra) em número variável,
dispersadas por todo o genoma (WELL, 1990 apud HE et al., 2003). A análise de locos
microssatélites é realizada por meio da reação de PCR utilizando iniciadores complementares
às regiões que os flanqueiam.
Estes marcadores têm sido uma ferramenta molecular muito utilizada em estudos
ecológicos e genéticos, em função do seu caráter codominante, que permite a detecção de
todos os alelos de um dado loco. A amplificação utilizando iniciadores específicos que
permitem a amplificação de locos individuais tem sido responsável pela observação de um
elevado número de alelos o que possibilita a identificação de maior polimorfismo e
proporciona informação genética de melhor qualidade, além de permitir uma praticidade na
integração e comparação dos dados (HOSHINO et al., 2002; MORETZSOHN et al., 2004).
Recentemente, alguns estudos revelaram polimorfismo em amendoim usando SSR
(HOPKINS et al., 1999; FERGUSON et al., 2004b; KRISHNA et al., 2004; HE et al., 2003,
2005).
A principal limitação dos marcadores moleculares do tipo SSR reside no fato de serem
dependentes de um extenso e caro trabalho de seqüenciamento para a identificação das
seqüências que se repetem e das seqüências que flanqueiam os locos hipervariáveis. Para
identificação das regiões que flanqueiam os locos microssatélites para o desenho dos
iniciadores faz-se necessário a clonagem e seqüenciamento de elevadas quantidades de
seqüências, que podem ser conseguidas através da construção de bibliotecas genômicas,
seqüenciamento de fragmentos RAPD, etc. Os produtos da amplificação dos marcadores SSR
devem ser necessariamente revelados em géis de poliacrilamida, uma vez que as diferenças de
comprimento entre os fragmentos são pequenas. Estas características tornam os marcadores
baseados em locos SSR caros, trabalhosos (DIAS et al., 2003). Conferindo uma limitação para
a implantação desta classe de marcador em alguns laboratórios que não disponham de
recursos para implantar este tipo de eletroforese, bem como em análise de rotina em
programas de melhoramento, onde uma grande quantidade de amostras é analisada.
11
2.3.1 – Marcadores moleculares do tipo RAPD
WILLIAMS et al. (1990) mostraram que os marcadores moleculares do tipo RAPD
podem ser utilizados como marcadores genéticos, uma vez que estes apresentam segregação
mendeliana. Dado isto, estes marcadores passaram a ser utilizados para diferentes estudos de
genética de população, mapeamento, identificação de fragmentos ligados a genes de interesse
e análises de similaridade e distância genética, bem como para a produção de marcas que
possibilitaram a correta identificação de acessos de germoplasma vegetal e/ou de
microrganismos.
Dados de marcadores RAPD são analisados usando o algoritimo UPGMA
(Umweighted Pair Group Method with Avareges - método da média aritmética não
ponderada) como método de agrupamento de uma matriz de similaridade ou distância
genética. A similaridade ou dissimilaridade e a distância genética são calculadas através de
uma matriz de presença e ausência para comparações entre os indivíduos. Os índices de
similaridade comumente utilizados são Simple Match (coincidência simples) [S=
(a+d)/(a+b+c+d)] , Jaccard [J=a/(a+b+c)] , e Dice [D= 2a/(2a+b+c)], onde a é o número de
fragmentos presentes nós dois indivíduos analisados, b é o número de fragmentos presentes
em apenas um deles, c é o número de fragmentos presentes apenas no outro e d é o número de
alelos nulos ou duplas ausências. BUSSELL et al. (2005), MEYER et al. (2004), indicaram
que os índices Jaccard e Dice são os mais apropriados para este marcador uma vez que os
alelos nulos podem não corresponder a locos homólogos.
Para o cálculo de distância genética o coeficiente comumente utilizado é o de Nei & Li
[DG = 1-2N
ij
/(N
i
+N
j
)], onde, N
ij
é o número de bandas compartilhados pelos genótipos I e J,
N
i
é o número de bandas presentes apenas no genótipo I e N
j
é o número de bandas presentes
apenas no genótipo J.
Com o objetivo de caracterizar um grupo de marcadores moleculares capazes de
identificar 15 genótipos de eucalipto, ROCHA et al. (2002), utilizaram marcadores SSR e
RAPD. A utilização de 29 iniciadores RAPD permitiu a amplificação de 210 fragmentos,
sendo que 134 foram polimórficos. A partir destes dados os genótipos foram individualmente
identificados e o dendrograma produzido mostrou uma clara separação entre os grupos
formados. Neste ensaio dos 20 pares de iniciadores SSR utilizados 16 revelaram polimorfismo
detectável em gel de agarose e, estes produziram, em média, cinco formas alelicas, variando
de três a sete alelos por par de iniciador. Neste estudo os dendrogramas produzidos pelas duas
classes de marcadores, RAPD e SSR, foram ligeiramente diferentes, mas uma correlação
significativa foi observada entre eles.
Marcadores do tipo RAPD foram utilizados por JUNGHANS et al. (2003), para
estudar o modo de herança e mapear um gene de efeito principal que confere resistência à
ferrugem em eucalipto, dos 980 iniciadores utilizados foi possível identificar seis fragmentos
ligados ao gene de resistência (mesmo grupo de ligação), sendo que o marcador denominado
de AT9/970, para o qual nenhuma recombinação foi observada, apresentou-se fortemente
ligado ao gene Ppr1 (Puccini psidi resistence gene 1).
Marcadores RAPD foram utilizados por Martin et al. (1997) para estudar a
identificação de espécies dentro de germoplasma de Oriza. Neste estudo 60 acessos
identificados como sendo das espécies O.meridionalis, O. glumaepatula, O. nivara ou O.
rufipogon e três híbridos de O. nivara foram analisados com nove iniciadores e produziram 81
bandas polimórficas. Cinco dos sete acessos de O. meridionalis apresentaram-se mais
relacionados a O. rufipogon, enquanto a maioria dos acessos de O. glumaepatula formaram
um grupo bem definido. Entretanto como quatro acessos desta espécie ficaram separados dos
demais, os autores sugeriram que estes foram mal identificados no momento do depósito no
12
banco. A diferenciação entre os acessos de O. nivara e O. rufipogon não ficou muito clara,
uma vez que estes formaram um grupo complexo com acessos suspeitos de pertencerem às
espécies O. meridionalis e O. glumaepatula. Neste grupo é possível identificar três
subdivisões, um grupo composto principalmente por acessos de O. nivara, outro composto por
acessos da espécie O. rufipogon e, um último com um acesso de O. glumaepatula e quatro
como O. nivara.
Utilizando apenas cinco iniciadores RAPD 30 acessos de arroz foram individualmente
identificados, sendo que estes iniciadores produziram 32 bandas polimórficas e sete
monomórficas. Neste ensaio os agrupamentos gerados pelos dados moleculares e os
descritores morfológicos utilizados não foram os mesmos e os dados de RAPD não agruparam
os acessos em função das duas subespécies (indica e japonica) (ARAÚJO et al., 2003).
Cinco iniciadores RAPD foram selecionados de um grupo de 42 para análise de
relacionamento genético entre 70 acessos de 11 espécies do gênero Passiflora. O
agrupamento formado permitiu uma perfeita distinção entre os acessos mostrando que os
marcadores RAPD são úteis para distinção de genótipos relacionados e os resultados
confirmaram a hipótese de que Passiflora edulis f flavicarpa surgiu a partir de uma mutação
de Passiflora edulis, e não como resultado de um cruzamento entre Passiflora edulis e
qualquer uma das outras espécies estudadas (CROCHEMORE et al., 2003).
Acessos de caupi foram analisados por meio de marcadores do tipo RAPD e 40% dos
iniciadores testados foram polimórficos gerando 62,5% de fragmentos informativos. Todos os
acessos foram individualmente identificados e houve uma tendência de agrupamento em
função da origem dos acessos, uma vez que a maior parte dos acessos utilizados no Brasil
ficou em um grupo. Entretanto, os acessos da Nigéria foram distribuídos pelos quatro grupos
formados, evidenciando uma maior variabilidade. Através do agrupamento gerado observou-
se a formação de quatro grupos distintos, sendo observada variação de similaridade entre 81 e
98 % entre os 45 acessos analisados. O alto nível de similaridade encontrado foi atribuído
pelos autores ao processo de domesticação que levou ao estreitamento genético (XAVIER et
al., 2005).
Arachis pintoi e Arachis repens são duas espécies do gênero Arachis que são
facilmente distinguidas, tomando por base a forma e tamanho das folhas, quando se trabalha
com acessos tipos. Entretanto a crescente coleta de novos acessos tem dificultado esta
classificação com a identificação de formas intermediárias. Neste sentido, dez iniciadores
randômicos foram utilizados por GIMENES et al. (2000), para avaliar o nível de variação
genética entre acessos distintos de Arachis pintoi e Arachis repens. Neste estudo, os autores
concluíram que apesar do percentual de fragmentos polimórficos ter sido elevado (93,3%), o
número de fragmentos compartilhados pelos acessos das duas espécies foi bastante alto,
enquanto e o número de genótipos únicos identificados foi baixo. Cinco fragmentos foram
específicos para A. repens e 23 para A. pintoi e, o dendrograma gerado pelos dados de RAPD
não é capaz de corroborar a proposta de separação das duas espécies, pois, a maioria dos
acessos de A. repens agrupou com um específico grupo de A. pintoi. Uma vez que os
marcadores RAPD são usualmente eficientes em detectar polimorfismo, os resultados
sugerem que as duas espécies devem ser muito próximas.
Todos estes estudos anteriores revelam a aplicabilidade dos marcadores moleculares
do tipo RAPD em estudos básicos e aplicados de genética. Esta tecnologia por ser baseada em
PCR, utilizar iniciadores pequenos e possibilitar a revelação dos dados em géis simples de
agarose, apresenta uma grande vantagem com relação às outras classes de marcadores, uma
vez que os marcadores AFLP e RFLP exigem trabalhos mais intensivos no laboratório, e os
marcadores do tipo SSR demandam uma maior disponibilidade de recursos e
desenvolvimento inicial dos iniciadores. Além disso, a aplicabilidade dos marcadores RAPD
depende da espécie vegetal que está sendo estudada. A crítica mais importante cunhada aos
13
marcadores tipo RAPD, deve-se a considerada baixa reprodutibilidade dos dados entre
laboratórios diferentes. Entretanto, uma etapa de otimização, adequação às condições
laboratoriais e um conhecimento prévio das ferramentas moleculares são requisitos
necessários para iniciar um estudo baseado nesta classe de marcadores, o que proporciona a
obtenção de dados confiáveis.
14
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Obtenção dos Acessos de Amendoim
Inicialmente foram selecionados 29 acessos de amendoim para o início do ensaio
RAPD (Tabela 2). Estes acessos foram provenientes de dois centros da Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Centro Nacional de Pesquisa em Algodão (Campina
Grande - Paraíba) e Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen -
Brasília-DF) e do Instituto Agronômico de Campinas (IAC Campinas – SP).
Para os acessos provenientes do Cenargen, as folhas foram coletadas nesta unidade e
transportadas para a Agrobiologia onde se procedeu a extração imediata do DNA total. Os
acessos provenientes da Embrapa Algodão e do IAC foram cultivados em casa de vegetação
na Embrapa Agrobiologia para coleta de tecido vegetal. Para estes as sementes foram
desinfestadas em etanol (70%) por 30 s e lavadas em água estéril por 10 vezes. A semeadura
foi realizada diretamente nos vasos. As plantas foram cultivadas em casa de vegetação, em
vasos de Leonard, supridas com a solução nutritiva de Norris (NORRIS & T´MANNETJE,
1964), e com 25mg de N por semana na forma de NH
4
NO
3
(ZILLI, 2001). Folhas foram
coletadas 15 dias após plantio para a extração imediata do DNA total.
3.2 - Extração de DNA Total
Para a extração do DNA total foi utilizado o protocolo descrito em FERREIRA &
GRATTAPAGLIA (1998) com algumas modificações. Testou duas quantidades de tecido
vegetal para a extração (um e três discos de tecido foliar com diâmetro de 1,0 cm) (XAVIER
et al., 2005). Para a obtenção destes discos, a folha foi colocada sobre um microtubo aberto e
a tampa foi pressionada sobre a folha. Após este teste, utilizou-se para a extração um disco de
tecido vegetal de folha jovem e fresca. O disco de tecido foliar foi macerado até o estado de
pó fino em nitrogênio liquido, ressuspendido em tampão de extração (CTAB 2,0%, 20 mM
EDTA, 100 mmTris-HCl pH 8,0, 1% mercaptoetanol) e incubado a 65
0
C por 60 min. Após
esta incubação adicionou-se 600µL de clorofórmio - álcool isoamilico (24:1) e as amostras
foram centrifugadas a 16100g (Centrífuga marca Eppendorf modelo 5415D) por 10 min. O
sobrenadante foi transferido para um microtubo novo e, o DNA foi precipitado, adicionondo-
se 2/3 do volume de isopropanol gelado e incubando-se as amostras a 4 ºC por 60 min. Após
este período as amostras foram centrifugadas a 16100g (8 min), o sobrenadante foi descartado
e o precipitado foi lavado com etanol 70% (v/v) duas vezes por um período de 10 min e uma
vez com etanol absoluto por 5 min. Posteriormente, o precipitado foi seco em centrifuga a
vácuo e ressuspendido em 25µL de TE (Tris-HCl 10mM pH8, EDTA 1mM). As amostras
foram congeladas para posterior diluição e realização do ensaio RAPD.
15
Tabela 2: Identificação dos acessos de amendoim utilizados para a extração de DNA total e
posterior ensaio por RAPD.
Acessos Origem Procedência
Variedade
Botânica
Tipo
botânico
Hábito de
crescimento
1 76Am
África-
Senegal
Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
2 192AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
3 198AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
4 214AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
5 208AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
6 193AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
7 206AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
8 218AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
9 202AM África Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
10 174AM Argentina
Embrapa Algodão hypogaea Virgínia
Rasteiro
11 Sapucaia Bege
Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
12
Sapucaia
Vermelha
Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
13 Serrinha Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
14 158AM Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
15 178AM Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
16 185AM Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
17 184AM Brasil Embrapa Algodão fastigiata Valência
Ereto
18 180AM Brasil Embrapa Algodão vulgaris Spanish
Ereto
19
IAC 886
Runner
Brasil IAC hypogaea Virgínia
Rasteiro
20 IAC Tatu ST Brasil IAC fastigiata Valência
Ereto
21 IAC 8112 Brasil IAC vulgaris Spanish
Ereto
22 IAC Caiapó Brasil IAC hypogaea Virgínia
Rasteiro
23 V12549 Brasil Cenargen nd* **nc **nc
24 V12548 Brasil Cenargen hypogaea **nc **nc
25 CV Tatuí Brasil Cenargen vulgaris Spanish
Ereto
26 CV Tatu Brasil Cenargen fastigiata Valência
Ereto
27 Mf 1538 Equador
Cenargen hirsuta **nc **nc
28 Mf 1560 Equador
Cenargen peruviana **nc **nc
29 Md 1678 Equador
Cenargen aequatoriana
**nc **nc
*nd - variedade botânica não determinada
**nc - acessos não cultivados
16
O produto de extração do DNA foi submetido à eletroforese por 40 min em gel de
agarose (0,8% p/v) a voltagem constante (10V.cm
-1
). O gel foi corado com brometo de etídio
e visualizado sob luz UV. Foi realizada a leitura da densidade ótica em espectrofotômetro, a
260nm, para calcular a concentração de DNA das amostras.
A concentração de DNA da amostra foi estimada pela equação abaixo:
[DNA] = L*50*f,
Onde:
[DNA] em ηg.µL
-1
L = leitura observada à 260nm
f = fator de diluição utilizado (500)
3.3 - Otimização das Condições de Amplificação
A otimização da técnica de RAPD e padronização do ensaio foi iniciada com reações
onde foi utilizado o DNA total extraído de um acesso (76 AM) e um iniciador opB11,
selecionado na literatura (DWIVEDI et al., 2001). Para esta otimização foram testadas oito
diferentes combinações entre duas concentrações de DNA molde, duas concentrações
iniciadores e duas concentrações de cloreto de magnésio (Tabela 3), a fim de se obter uma
condição capaz de produzir um padrão de bandas interpretável e reprodutível. Utilizou-se 200
µM de cada dNTP, 0,5µg.µl
-1
de BSA (soro de albumina bovina), 1X tampão (200mM Tris-
HCl pH 8,0; 500mM KCl), 1U Taq polimerase (Invitrogen Life Technologies), a um volume
total da reação de 25µL.
Tabela 3: Reagentes e concentrações testadas para a padronização do ensaio RAPD.
Misturas DNA Iniciador MgCl
2
I 1,5 mM
II
0,3µM
2,0 mM
III 1,5 mM
IV
1,0 ηg.µl
-1
0,5µM
2,0 mM
V 1,5 mM
VI
0,3µM
2,0 mM
VII 1,5 mM
VIII
1,5 ηg.µl
-1
0,5µM
2,0 mM
Para a reação de otimização/padronização foi utilizado o perfil térmico de: 94 ºC por 1
minuto para desnaturação inicial, seguido de 34 ciclos de 92 ºC por 1 minuto, o gradiente de
45ºC +/- 10 ºC na etapa de anelamento por 1 minuto e 72 ºC por 2 min, com uma etapa final
de extensão por 5 min a 72 ºC. Com a utilização do gradiente foi possível testar 12 diferentes
temperaturas (Tabela 4), onde se objetivou determinar a temperatura ideal para a etapa de
anelamento. Utilizou-se o termociclador modelo Mastercycler Gradient marca Eppendorf.
17
Tabela 4: Temperaturas utilizadas no gradiente (45ºC +/- 10 ºC), para o passo de anelamento.
Condição T (ºC) Condição T (ºC)
1 34,9 7 45,7
2 35,2 8 48,4
3 36,3 9 51
4 38 10 53,2
5 40,3 11 54,8
6 42,9 12 55,7
Os fragmentos gerados foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose
2% (p/v), com voltagem constante de 7V.cm
-1
de gel por um período de 105 min. O gel foi
corado com brometo de etídio e fotografado sob luz UV. As imagens foram digitalizadas para
posterior análise.
3.4 - Seleção dos Iniciadores Randômicos
A partir das análises das imagens dos géis obtidos com os produtos da reação de
otimização da PCR-RAPD descrita acima, foi selecionada uma mistura com concentrações
definidas para todos os reagentes. Definida a condição da reação de PCR, procedeu-se a
seleção dos iniciadores decâmeros para a análise de RAPD com os 29 acessos de amendoim.
Para esta seleção realizou-se a reação de PCR-RAPD com 40 iniciadores (Kits A e B
da Operon - Tabela 5) onde se utilizou a condição de amplificação anteriormente definida e o
gradiente de 45 ºC +/- 10 ºC na etapa de anelamento, para cada iniciador. Utilizou-se o
termociclador modelo Mastercycler Gradient marca Eppendorf.
Procedeu-se a separação eletroforética dos fragmentos amplificados como descrito
acima na etapa de otimização. As imagens dos géis foram digitalizadas para posterior análise
e seleção dos iniciadores e da temperatura de anelamento.
18
Tabela 5: Nome e seqüência dos 40 iniciadores randômicos dos kits A e B da Operon
testados na etapa de seleção.
Nome Seqüência Nome Seqüência
opA1 CAGGCCCTTC opB1 GTTTCGCTCC
opA2 TGCCGAGCTG opB2 TGATCCCTGG
opA3 AGTCAGCCAC opB3 CATCCCCCTG
opA4 AATCGGGCTG opB4 GGACTGGAGT
opA5 AGGGGTCTTG opB5 TGCGCCCTTC
opA6 GGTCCCTGAC opB6 TGCTCTGCCC
opA7 GAAACGGGTG opB7 GGTGACGCAG
opA8 GTGACGTAGG opB8 GTCCACACGG
opA9 GGGTAACGCC opB9 TGGGGGACTC
opA10 GTGATCGCAG opB10 CTGCTGGGAC
opA11 CAATCGCCGT opB11 GTAGACCCGT
opA12 TCGGCGATAG opB12 CCTTGACGCA
opA13 CAGCACCCAC opB13 TTCCCCCGCT
opA14 TCTGTGCTGG opB14 TCCGCTCTGG
opA15 TTCCGAACCC opB15 GGAGGGTGTT
opA16 AGCCAGCGAA opB16 TTTGCCCGGA
opA17 GACCGCTTGT opB17 AGGGAACGAG
opA18 AGGTGACCGT opB18 CCACAGCAGT
opA19 CAAACGTCGG opB19 ACCCCCGAAG
opA20 GTTGCGATCC opB20 GGACCCTTAC
3.5 – Ensaio RAPD
Com os iniciadores selecionados, definida a condição de amplificação e a temperatura
de anelamento realizou-se o ensaio RAPD com os 29 acessos.
Além destes iniciadores selecionados a partir dos Kits A e B da Operon, o ensaio
RAPD foi complementado com 15 iniciadores randômicos (Tabela 6), propostos por HE &
PRAKASH (1997), como capazes de revelar polimorfismo em amendoim. A reação de PCR-
RAPD para estes iniciadores foi realizada utilizando 1ng.µL
-1
de DNA, 2,5 mM de MgCl
2
, 0,3
µM de iniciador, 1U de Taq polimerase, Tampão 1X (200mM Tris-HCl pH 8,0; 500mM
KCl), 0,5 µg.µl
-1
de BSA, 200 µM de cada dNTP, para um volume final de 25µl. O perfil
térmico foi utilizado foi 94 ºC por 5 min, 35 ciclos de 5 s a 94 ºC, 20 s a 35 ou 45 ºC
dependendo do iniciador (Tabela 6), 30 s a 72 ºC, e uma extensão final de 5 min a 72 ºC.
19
Tabela 6: Seqüência e a temperatura de anelamento (ºC) de 15 iniciadores propostos por HE
& PRAKASH (1997).
Seqüência T(ºC)
Seqüência T(ºC)
UBC23 5'-CCC GCC TTCC-3' 35 UBC3555'-GTA TGG GGCT-3' 45
UBC25 5'-ACA GGG CTCA-3' 35 UBC3915'-GCG AAC CTCG-3' 35
UBC336 5'- GCC ACG GAGA-3' 35 UBC7765'- CTT CCC TCCT-3' 35
UBC302 5'- CGG CCC ACGT-3' 35 UBC400 5'-GCC CTG ATAT-3' 35
UBC346 5'-TAG GCG AACG-3' 45 UBC7885'-CCT TCC CTCT-3' 35
UBC23 5'-CCCGCCTTCC-3' 35 UBC348 5'-CACGGCTGCG-3' 45
UBC306 5'-GTCCTCGTAG-3' 35 Hairpin29 5'-GCGAAGCCTC-3' 45
UBC332 5'-AACGCGTAGA-3' 35
3.6 – Experimentos em Condição de Casa de Vegetação
Para análise da variabilidade na capacidade de nodulação e fixação biológica de
nitrogênio entre os acessos de amendoim, foram selecionados a partir do agrupamento
realizado com os marcadores RAPD, nove acessos contrastantes, sendo: (1 - 202AM), (2 -
76AM), (3 - IAC Tatu-ST), (4 - IAC 886 Runner), (5 - IAC Caiapó), (6 - Sapucaia Bege), (7 -
198AM), (8 - Sapucaia Vermelha) e (9 - CV Tatuí).
Neste sentido foi realizado um experimento em condições de casa de vegetação e de
não inoculação, no Município de Seropédica-RJ (Latitude 22º44'38" Sul e Longitude
43º42'27" Oeste) com os acessos selecionados e dois solos, sendo que os nove acessos foram
casualisados dentro de cada solo. Foi utilizado no experimento o delineamento de blocos ao
acaso com quatro repetições.
As amostras de terra foram coletadas no SIPA (Sistema Integrado de Produção
Agroecológica) classificadas como sendo um Argissolo e um Planossolo. A coleta das
amostras de terra foi realizada apenas no horizonte superficial do solo.
Estas amostras foram destorroadas, peneiradas e homogeneizadas. Amostras foram
submetidas à análise de fertilidade (Embrapa, 1997) cujos resultados estão apresentados na
Tabela 7.
Tabela 7: Resultado da análise química das amostras de terra utilizadas no experimento.
Complexo sortivo
Al
+3
Ca
+2
+
Mg
+2
Ca
+2
Mg
+2
K
+1
P
Amostras pH
cmol
c
.kg
-1
mg.kg
-1
Argissolo 6,4 0,0 4,4 3,8 0,6 215,5 85,5
Planossolo 5,1 0,4 0,9 0,8 0,1 36,2 13,0
Após a análise química das amostras de terra foram realizadas, a correção e adubação
quando necessárias, preparando vasos de 2,5kg para posterior plantio. A amostra do Argissolo
por apresentar boas características com relação à fertilidade, não recebeu nenhuma
suplementação química, entretanto o Planossolo, em função do pH e dos baixos teores de
nutrientes recebeu uma correção com a aplicação de 0,5g.kg
-1
de solo de carbonato de
20
magnésio e 0,875g.kg
-1
de solo de carbonato de cálcio, com o objetivo de elevar os valores de
Ca
+2
+ Mg
+2
para 2 cmol
c
.kg
-1
e manter uma relação entre estes elementos de 3:1. Esta
aplicação corresponde a uma calagem com 1100kg de calcário por ha, sendo que o solo foi
incubado por um período de 41 dias, durante este período o solo foi regado com água a cada
três dias para a manutenção da umidade. Transcorrido esse período de incubação os vasos
com Planossolo receberam a aplicação de 500 mg de superfosfato simples (80 kg de P
2
O
5
.ha
-
1
), 200 mg de sulfato de potássio (80 kg de K
2
O.ha
-1
) e 60 mg de FTEBR12 (48 kg de
FTEBR12.ha
-1
.). Tanto os carbonatos quanto os fertilizantes foram aplicados e misturados no
solo em cada vaso.
As sementes dos nove acessos foram desinfestadas com álcool 70% (p/v) por 30 s e
lavadas em água destilada por 10 vezes. As sementes foram germinadas em copos plásticos
contendo substrato plantmax autoclavado (120ºC, 1,0atm, 20 min) e 17 dias após o plantio as
plantas foram transplantadas para os vasos contendo solo.
As plantas de amendoim foram colhidas com 29 e 30 dias após o transplantio, sendo
os blocos 1 e 2 coletados com 29 e os blocos 3 e 4 com 30 dias.
A parte aérea de cada planta foi colocada em sacos de papel e incubada em estufa de
circulação forçada a 65ºC, até massa constante, em seguida as massas foram determinadas em
balança de precisão com três casas decimais. Foram determinados os teores de nitrogênio total
na parte aérea das plantas pelo método Kjeldhal, em analisador automático Kjeltec 1030, de
acordo com a metodologia descrita por Malavolta et al. (1989). Os nódulos foram retirados,
armazenados em potes com sílica gel, posteriormente contados e pesados. O sistema radicular
das plantas, após a retirada dos nódulos, foi incubado em estufa a 65ºC, até massa constante,
em seguida as massas foram determinadas em balança de precisão com três casas decimais.
No momento da colheita foi realizada a análise de redução de acetileno utilizando o
sistema radicular completo das plantas, para isso, foi coletado o sistema radicular e incubado
por um período de 15 min em mamadeiras de 250 mL contendo 10% deste volume do gás
acetileno. Para manutenção de valores de pressão iguais dentro e fora da mamadeira foi
realizada a retirada de igual volume de ar antes da aplicação do gás acetileno. O gás acetileno
foi produzido no momento da incubação, incubando pedras de carbureto com água em frascos
tipo kitasato. Após o período de incubação foram realizadas coletas de amostras para analises
em cromatógrafo gasoso com detecção por ionização de chama.
3.7 – Análise Estatística dos Dados
Para análise dos dados do ensaio RAPD, os perfis de bandas obtidos foram
convertidos em uma matriz binária de presença e ausência de bandas (sendo 0 para ausência e
1 para presença). A partir desta matriz foram construídos dendrogramas utilizando o
algoritimo UPGMA e os índices de SM (Simple Matching) e DICE (Dice, 1945). Estes
dendrogramas foram construídos utilizando o programa NTSys2.1. Foi também performizada
uma análise de componentes principais com a matriz de dados binários, utilizando o programa
Canoco For Windows 4.5.
Com relação aos dados do experimento de casa de vegetação foi realizada a análise de
variância e testes de média (Teste F, Scott-Knott e Tukey com nível de significância de 5%, α
igual a 0,05). Para estas análises utilizou-se o programa SISVAR (Universidade Federal de
Lavras).
21
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 - Extração do DNA
Como descrito em Material e Métodos a extração foi padronizada com relação à
quantidade de tecido foliar utilizada. Para isso utilizou-se um e três discos de tecido foliar
jovem com o diâmetro do microtubo de 1,5mL, quantidade de tecido vegetal correspondendo
a cerca de 10 e 30mg. Foi observado que este fator não interferiu no resultado da extração,
uma vez que se observou uma banda bastante intensa no gel tanto para as amostras com um
quanto para as amostras com três discos. Dessa forma optou-se por proceder as extrações dos
demais acessos utilizando apenas um disco foliar (Figura 2).
Figura 2: Gel de agarose (0,8%p/v) mostrando o produto da extração com um (canaletas de 1
a 6) e com três discos de tecido vegetal (canaletas de 7 a 12). Sendo que as canaletas 1,
2, 7 e 8 correspondem ao produto da extração com o acesso 193AM, canaletas 3, 4, 9 e
10 correspondem ao produto da extração com o acesso 184AM e, canaletas 5, 6, 11 e
12 correspondem ao produto da extração com o acesso 218AM.
Os produtos obtidos da extração do DNA dos acessos de amendoim apresentaram-se
de boa qualidade e quantidade, uma vez que, foi observada uma banda intensa nos géis e estes
não apresentavam arraste excessivo como resultado da degradação do DNA extraído (Tabela
8), livres de polissacarídeos e proteínas, dessa forma prontos para as reações de PCR.
De acordo com os dados de quantificação e qualidade do produto de extração, foi
observado uma variação entre 200 a 950ηg.µL
-1
de DNA. Essa quantidade de DNA extraída
está dentro da faixa esperada quando se utiliza este protocolo (FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1998).
A extração de DNA pelo método CTAB foi eficiente, uma vez que o produto de
extração apresentou-se de boa qualidade e em quantidade suficiente para o ensaio RAPD.
Como a técnica de RAPD é uma variação da técnica de PCR, a etapa de extração de DNA se
torna um passo crucial, pois excesso de impurezas na amostra pode limitar a extensão da
enzima Taq polimerase. Dessa forma o produto da extração deve-se apresentar de boa
qualidade e uniforme entre as amostras (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
22
Tabela 8: Acessos utilizados para a extração de DNA, a concentração obtida para cada
produto de extração e a relação entre os valores de absorbância obtidos com leituras
a 260 e 280nm para inferência sobre a qualidade do produto.
Acessos [DNA]
ηg.µL
-1
Acessos [DNA]
ηg.µL
-1
76Am 325 Sapucaia Vermelha
325
Sapucaia Bege
550 202AM 525
174AM 475 180AM 350
192AM 325 Runner 775
198AM 400 IAC Tatu ST 525
214AM 400 IAC 8112 950
178AM 250 IAC Caiapó 900
208AM 475 V12549 400
185AM 400 Md 1678 650
Serrinha 375 V12548 300
184AM 250 CV Tatuí 625
193AM 375 Mf 1538 325
158AM 550 Mf 1560 500
206AM 375 CV Tatu 200
218AM 425
4.2 - Otimização das Condições de Amplificação
O ensaio RAPD deve ser iniciado por uma otimização das condições de amplificação,
pois sua reprodutibilidade é fortemente influenciada pelas condições de amplificação. Uma
vez que neste tipo de ensaio é possível a amplificação de fragmentos com pareamento
imperfeito entre o iniciador e o DNA molde, é necessário a padronização das concentrações
dos reagentes e o perfil térmico utilizado no termociclador (FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1998).
Nas Figuras 3 e 4, são apresentados os géis da reação de otimização, mostrando o
resultado obtido com as diferentes concentrações de reagentes testados, sendo que cada
conjunto de 12 amostras corresponde às temperaturas testadas no gradiente (Tabela 4).
Pelo resultado observado nos géis das reações de otimização foi possível concluir que
o produto obtido da extração apresentou-se de boa qualidade, uma vez que foram possíveis a
amplificação e a detecção clara dos fragmentos no gel. No entanto, os géis obtidos da reação
de otimização (Figura 3, Figura 4) permitiram observar o efeito da temperatura de
anelamento, uma vez que nas temperaturas superiores a 51 ºC não foi observada amplificação.
A amplificação com o iniciador opB11 produziu duas bandas, sendo que uma banda de
aproximadamente 600pb foi observada em todas as reações positivas, para todas as oito
23
combinações de concentrações dos três reagentes testados. Uma segunda banda, de
aproximadamente 1200pb, foi observada principalmente nas temperaturas de 45,7 ºC; 48,4 ºC
e 51ºC.
Temperaturas mais baixas na etapa de anelamento podem acarretar amplificação
inespecífica, limitando as análises e interpretações dos dados obtidos por RAPD. As
concentrações de DNA, de iniciador e de MgCl
2
influenciaram os resultados, uma vez que
variações na intensidade das bandas foram observadas.
Figura 3: Perfis de bandas obtidos com quatro misturas diferentes das oito testadas, em cada
gel podem ser observadas duas misturas. A concentração de DNA utilizada foi de
1ηg.µL
-1
para ambos os géis, a concentração de iniciador utilizada foi de 1,0ηg.µL
-1
no gel da parte superior da figura e 1,5 ηg.µL
-1
no gel da parte inferior da figura. A
concentração de MgCl
2
variou de 1,5mM (1 a 12) para 2,0 mM (13 a 24) em cada gel.
Figura 4: Perfis de bandas obtidos com quatro misturas diferentes das oito testadas, em cada
gel podem ser observadas duas misturas. A concentração de DNA utilizada foi de
1,5ηg.µL
-1
para ambos os géis, a concentração de iniciador utilizada foi de 1,0ηg.µL
-1
no gel da parte superior da figura e 1,5 ηg.µL
-1
no gel da parte inferior da figura. A
concentração de MgCl
2
variou de 1,5mM (1 a 12) para 2,0 mM (13 a 24) em cada gel.
Este resultado pode ser atribuído à qualidade do produto de extração, que por não
conter concentrações elevadas de impurezas não influenciou a reação uma vez que
amplificações foram conseguidas utilizando a baixa concentração de 1ηg.µL
-1
, além disso as
concentrações do iniciador e do Mg
+2
testadas são concentrações baixas, assim não houve
interação entre altas concentrações destes, o que poderia levar a uma amplificação de
fragmentos de menor especificidade, uma vez que altas concentrações de magnésio aumentam
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
24
a atividade da enzima Taq polimerase. Estas concentrações foram escolhidas a fim de facilitar
a interpretação do padrão de bandas, onde se buscou a amplificação de fragmentos mais
intensos no gel.
Desta forma selecionou-se a mistura III (200 µM de cada dNTP, 0,5µg.µl
-1
de BSA,
1X tampão 200mM Tris-HCl pH 8,0; 500mM KCl, 1U Taq polimerase, 1,0 ηg.µl
-1
de DNA
molde, 0,5µM de iniciador e 1,5 mM de MgCl
2
) (Tabela 3) para a realização da seleção dos
iniciadores dos Kits A e B da Operon. A decisão por esta mistura foi definida evitando se
combinar a mais elevada concentração de MgCl
2
com a mais alta concentração de iniciador, a
fim de se obter perfis mais nítidos, mesmo que com menos bandas, entretanto sendo estas
presumidamente mais reprodutíveis.
Realizou-se a reação de PCR-RAPD com os 40 iniciadores, utilizando o gradiente de
temperatura citado na metodologia e as concentrações definidas pela reação de otimização,
com o DNA molde do acesso 76AM. Dos 40 iniciadores testados 21 produziram algum
fragmento e foram considerados para a análise de RAPD com os 29 acessos.
Embora alguns destes iniciadores tenham amplificado até a temperatura mais elevada
testada no gradiente, a temperatura selecionada para o ensaio RAPD foi a de 38 ºC, pois foi a
temperatura mais elevada em que houve amplificação, para todos estes 21 iniciadores. Esta
etapa de seleção de iniciadores e temperatura de anelamento proporcionou um diferencial para
este trabalho, visto que a temperatura de anelamento comumente utilizada em ensaios RAPD
é de 35 ºC.
Os iniciadores opB12, opB7; opB6, opA2 e opA3 amplificaram até a temperatura de
55 ºC, mostrando que estes podem ser utilizados em ensaios RAPD com as temperaturas mais
elevadas.
4.3 – Ensaio RAPD
A Tabela 9 sumariza os resultados obtidos com o ensaio RAPD, mostrando todos os
iniciadores testados (Operon e UBC) e o número de fragmentos que cada um produziu, bem
como o polimorfismo encontrado.
Dos 21 iniciadores, dos Kits A e B da Operon testados, sete revelaram polimorfismo
entre os acessos de Arachis hypogaea, sendo que estes amplificaram um total de 83
fragmentos, sendo 15 polimórficos. Entre os 15 iniciadores da UBC (University of Bristish
Columbia) testados, apenas 10 amplificaram. Dentre estes, cinco foram capazes de revelar
polimorfismo. Observou–se a amplificação de um total de 62 fragmentos, sendo 20
polimórficos. Interessante que cinco destes iniciadores, embora utilizados por HE &
PRAKASH (1997), não produziram qualquer amplificação entre os acessos testados, mesmo
utilizando as mesmas condições para amplificação.
Quando se analisaram todos os 31 iniciadores, observa-se um total de 145 fragmentos
amplificados, destes 35 foram polimórficos (24,0%). Foi observada uma média de 4,67
fragmentos por iniciador e 1,13 fragmentos polimórficos por iniciador. Os fragmentos
variaram entre aproximadamente 2300pb com o iniciador UBC302 e 300pb com o iniciador
UBC346. Esta variação no comprimento está dentro da faixa esperada para marcadores
RAPD, que podem teoricamente amplificar fragmentos de até 4000pb (FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1998). BUSSELL et al. (2005), em revisão sobre marcadores moleculares
(RAPD, AFLP e ISSR) citam que os fragmentos RAPD podem variar entre 200pb e 2000pb.
Embora, para cada iniciador que revelou polimorfismo, o número de fragmentos
polimórficos em relação ao número de fragmentos amplificados, tenha sido elevado, o
número de acessos em que se observou polimorfismo para estes mesmos iniciadores foi
reduzido, variando entre 1 e 11, para um total de 29, para os iniciadores UBC25 e opA4,
respectivamente (Tabela 9).
25
Observou-se que a maior parte (24 iniciadores) dos iniciadores testados não revelou
qualquer polimorfismo entre os acessos estudados, e apenas 12 iniciadores revelaram
polimorfismo (Tabela 9).
Tabela 9: Resultados obtidos com os diferentes iniciadores utilizados no ensaio RAPD com
os 29 acessos de amendoim.
Iniciador Nº de
fragmentos
amplificados
Nº de
fragmentos
polimórficos
Número de
perfis
Nº de acessos em que
foi observado
polimorfismo
*
OPA2 3 0 --- ---
OPA3 3 0 --- ---
OPA4 9 4 3 11
OPA5 3 2 3 3
OPA8 4 1 2 8
OPA13 7 0 --- ---
OPA14 5 3 3 6
OPA15 3 0 --- ---
OPA16 2 1 2 3
OPA17 1 0 --- ---
OPA18 3 0 --- ---
OPB10 3 3 2 2
OPB5 2 0 --- ---
OPB6 3 0 --- ---
OPB7 3 0 --- ---
OPB11 1 0 --- ---
OPB12 7 0 --- ---
OPB13 2 0 --- ---
OPB15 7 0 --- ---
OPB17 3 0 --- ---
OPB18 9 1 2 3
UBC23 7 5 2 3
UBC25 12 4 2 1
UBC302 10 7 3 3
UBC336 6 0 --- ---
UBC346 5 2 3 2
UBC355 10 0 --- ----
UBC391 5 0 --- ---
UBC400 2 0 --- ---
UBC776 1 0 --- ---
UBC788 4 2 3 10
Total 145 35 --- ---
O número de perfis de bandas identificado ficou entre dois e três para os iniciadores
em que se observou polimorfismo. Para os iniciadores opA5 foram observados três perfis de
bandas entre todos os acessos (Figura 5).
26
Figura 5: Perfis de bandas obtidos com o iniciador opA5 para os acessos (1) Tatu-St, (2) IAC
8112, (3) IAC Caiapó, (4) V12549, (5) Md1678, (6) V12548, (7) CV Tatuí, (8) Mf
1538, (9) IAC Runner, (10) Sapucaia Bege, (11)Mf 1560 e (12) CV Tatu. B e M
correspondem ao branco e ao marcador X174, respectivamente.
Na Figura 6, é apresentado o perfil de bandas obtido com o iniciador opB15. Para este
iniciador não foi observado qualquer polimorfismo, entre os 29 acessos estudados. Resultados
semelhantes, utilizando marcadores tipo RAPD para acesos de amendoim foram observados
por SUBRAMANIAN et al. (2000) evidenciando o baixo polimorfismo na espécie.
Figura 6: Perfil de bandas obtido com o iniciador opB15 para os acessos (1) 76AM, (2)
Sapucaia vermelha, (3) 174AM, (4) 192AM, (5)198AM, (6) 214AM, (7) 178AM, (8)
208AM, (9) 185AM, (10) Serrinha, (11) 184AM, (12)193AM, (13) 158AM, (14)
206AM, (15) 218AM, (16) 180AM e (17) 202AM. M corresponde ao marcador X174.
Nas Figuras 7 e 8 são apresentados os dendrogramas obtidos com os coeficientes de
similaridade utilizados (SM e DICE). A análise com os dois coeficientes resultou em
dendrogramas com topologias similares com relação aos grupos formados. Pode-se observar a
formação de dois grupos principais, sendo o primeiro (I) composto por apenas três acessos
(IAC Tatu-ST, 214AM e 198AM) e um segundo (II) grupo mais abundante e que pode ser
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B M
1358
1078
872
603
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M
1358
1078
872
603
27
subdividido em vários subgrupos dependendo do nível de similaridade utilizado. Foi
observado o mesmo agrupamento quando se analisam os acessos com os 31 iniciadores
randômicos utilizados no estudo.
O nível de similaridade observado entre os dois grupos principais foi de 82% com o
coeficiente SM e 89% com o coeficiente DICE. MEYER et al. (2004) analisaram oito
diferentes índices para cálculos de similaridade quando se utilizam dados de marcadores
moleculares dominantes em milho e, concluíram que os índices Jaccard, Sorensen-Dice,
Anderberg, Ochiai (índices que não levam a dupla ausência em consideração na formula –
classe 1) e Simple Matching, Rogers & Tanimoto, Ochai II (índices que consideram a dupla
ausência na formula- classe 2) produzem dendrogramas similares dentro de cada classe e
bastante próximos entre as classes, com uma pequena variação nos valores de similaridades
entre os acessos, como observado no presente trabalho. Segundo estes autores apenas o índice
de similaridade de Russel & Rao, não é adequado para agrupamento com dados de
marcadores dominantes, pois este produz um dendrograma dessemelhante dos demais.
Resultados similares foram encontrados por DUARTE et al. (1999) quando trabalhando com
dados de feijão. Os autores atribuíram estas diferenças na topologia dos dendrogramas o fato
do índice de Russel & Rao considerar a co-ocorrência negativa apenas no denominador da
formula.
Foi observado que entre os 26 acessos distribuídos no segundo grupo, 12 acessos em
três subgrupos distintos apresentaram um nível de similaridade de 100%, isso mostra que
estes acessos não puderam ser individualmente identificados com os iniciadores utilizados.
Embora o número de acessos e de iniciadores utilizados tenha sido relativamente
elevado, o polimorfismo observado ainda foi muito baixo para a espécie em estudo. Os dados
apresentados estão de acordo com os apresentados na literatura que mostram um
polimorfismo muito baixo para a espécie Arachis hypogaea (HALWARD et al., 1991;
SUBRAMANIAN et al., 2000).
Dos 145 fragmentos amplificados 35 foram polimórficos, entretanto as variações nos
perfis de bandas, quando observadas, restringiam-se a poucos acessos, revelando um padrão
monomórfico para a maioria dos acessos analisados.
28
Figura 7: Dendrograma de similaridade construído com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de similaridade Simple Match (SM), a partir da
matriz binária de dados RAPD com os 12 iniciadores randômicos em que se observou polimorfismo. Mostrando os grupos formados entre
os 29 acessos de amendoim.
II
I
29
Figura 8: Dendrograma de similaridade construído com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de similaridade DICE, a partir da matriz binária de
dados RAPD com os 12 iniciadores randômicos em que se observou polimorfismo. Mostrando os grupos formados entre os 29 acessos de
amendoim.
II
I
30
Com o objetivo de avaliar a utilidade de marcadores AFLPs no estabelecimento de
relações taxonômicas entre espécies do gênero Arachis e avaliar o polimorfismo entre
cultivares de A. hypogaea, utilizando três pares de iniciadores AFLP GIMENES et al. (2002),
encontraram um total de 408 fragmentos, partindo de 9 acessos de amendoim e 19 espécies
selvagens. Um total de 94 fragmentos foi encontrado nos acessos de A. hypogaea sendo que
apenas seis (6,4%) foram polimórficos. Os autores consideraram o polimorfismo muito baixo,
quando comparado ao que se encontra em outras culturas.
HE & PRAKASH (1997) em um amplo estudo de seleção de iniciadores para estudo
de variabilidade genética em amendoim, utilizando iniciadores DAF (ou RAPD), SSR e
AFLP, encontraram que apenas 17 dos 559 iniciadores DAF e SSR testados revelaram
polimorfismo em seis acessos representantes de três subespécies. Estes autores testaram 64
combinações de iniciadores AFLP (8 correspondendo ao adaptador de EcoRI e 8
correspondendo ao adaptador de MseI) e observaram polimorfismo em 28 pares, sendo que
uma média de 3,96 bandas por par de iniciador foi polimórfica. Neste mesmo estudo, HE &
PRAKASH (1997), identificaram 45 iniciadores que revelaram polimorfismo em amendoim
(17 DAF e 28 AFLP), entretanto a percentagem de marcadores polimórficos em relação ao
número total de iniciadores testados foi baixo (3% para DAF e 43% para AFLP). Para estes
autores isso suporta a noção de que Arachis hypogaea pode ter surgido recentemente como
resultado de um evento simples de poliploidização (HALWARD et al., 1991). Estes autores
ressaltam ainda que, em uma espécie evolucionariamente recente é provável que substituições
simples de nucleotídeos expliquem melhor a variação em amendoim do que diferenças
robustas em poucos locos.
Avaliando a variabilidade entre 21 acessos de amendoim comercialmente cultivados
na África, HERSELMAN (2003) conseguiu identificar individualmente os acessos utilizando
AFLP, entretanto o nível de variabilidade encontrado foi muito baixo, pois apenas 90
marcadores foram polimórficos entre 3241 fragmentos amplificados.
Em outro estudo, a partir de 70 acessos de amendoim com diferentes características
como tolerância a seca, eficiência no uso da água, período de maturação, dormência de
sementes, massa de 100 sementes, conteúdo de óleo entre outras, foram analisados com 48
iniciadores randômicos por SUBRAMANIAN et al. (2000). Apenas setes destes iniciadores
revelaram polimorfismo, onde 27 bandas de um total de 408 foram polimórficas. Mesmo entre
os iniciadores que revelaram polimorfismo a variação nos perfis de bandas entre os acessos
foi reduzida, uma vez que os dois iniciadores que mais diferenciaram os acessos mostraram
variação em apenas 12 ou 13 acessos.
Mais tarde, RAINA et al. (2001) analisaram por meio de marcadores RAPD e ISSR
(Inter Simple Sequence Repeat – polimorfismo da seqüência entre duas seqüências simples
repetitivas) a variabilidade genética entre 13 acessos de amendoim representando cinco das
seis variedades botânicas da espécie. Neste trabalho, a partir de 53 iniciadores randômicos
selecionou-se 21 e a partir de 100 iniciadores SSR, selecionou-se 29 para o ensaio. Com o
marcador RAPD, 220 produtos de amplificação foram observados, sendo que 94 foram
polimórficas (42,7%) e para o ensaio ISSR 124 bandas foram produzidas e 67 (54,4%)
mostraram-se polimórficas. Neste trabalho foi possível a identificação de cada acesso
individualmente, e o agrupamento formado entre os acessos foi coerente com a classificação
ao nível morfológico de variedades botânicas.
Como a maioria dos trabalhos utilizando marcadores moleculares em amendoim tem
revelado pouco polimorfismo, RAINA et al. (2001) sugerem que o sucesso deste trabalho em
identificar polimorfismo vis-à-vis no genoma de amendoim, ocorreu em função de três
fatores, sendo: (1) - utilização de acessos de cinco variedades botânicas, uma vez que os
trabalhos prévios utilizaram acessos representantes de até três variedades, o que pode ter
resultado na análise de acessos com uma estreita base genética; (2) – o número de iniciadores
31
utilizados, maior que os estudos prévios e (3) – o uso de iniciadores altamente informativos
que resultaram de um pré-estudo de seleção.
SINGH et al. (1998) revisaram os trabalhos realizados até aquele momento, tentando
identificar marcadores polimórficos em amendoim e sugeriram seis razões pelas quais estes
trabalhos falharam em identificar o polimorfismo, visto que é difícil de admitir que não haja
polimorfismo nesta espécie, uma vez que se observa substancial variação para várias
características morfológicas, que possibilitam dividi-la em duas subespécies e seis variedades
botânicas. Segundo estes autores o número de acessos utilizados; a base genética do material
analisado; o número de enzimas e sondas utilizadas; tipos de clones (sondas) usados e a
habilidade destes em revelar polimorfismo; número de iniciadores utilizados para
amplificação e identificação de seqüências polimórficas e por fim a metodologia e parâmetros
utilizados para a análise da variação entre e dentro espécies, podem ser citados. Estes autores
citam ainda a possibilidade dos diferentes marcadores utilizados em amendoim não
detectarem polimorfismo devido a complexidade do genoma da espécie, que pode ser
entendida como o pequeno comprimento dos cromossomos, locos multialélicos, a presença de
muitas seqüências repetitivas e redundantes e o confinamento das seqüências funcionais em
regiões pequenas.
Além disso, o baixo nível de polimorfismo ou variação no amendoim tem sido
atribuído também a outras causas, sendo: (1) - barreiras ao fluxo gênico de espécies diplóides
selvagens para o amendoim como conseqüência do evento da poliploidização, (2) - recente
poliploidização de um ou poucos indivíduos de cada espécie diplóide parental, combinado
com autopolinização e (3) - uso de poucas linhas e de pouco germoplasma exótico em
programas de melhoramento resultando em estreita base genética (MORETZSOHN et al.,
2004).
Apesar da existência de substancial diversidade entre genótipos de amendoim para
várias características morfológicas, fisiológicas e agronômicas, pouca variação tem sido
detectada quando se usa proteínas ou marcadores baseados em DNA (HALWARD et al.,
1991; HALWARD et al., 1992 apud HE et al., 2003; KOCHER et al., 1991; PAIK-RO et al.,
1992 e STALKER et al., 1994,).
Devido ao baixo polimorfismo ao nível de DNA não se tem conseguido progresso no
mapeamento genético, seleção assistida por marcadores moleculares e estudos evolucionários
na cultura do amendoim quando comparado com outras culturas (HE et al., 2003). Este
problema tem limitado a melhoria de cultivares de amendoim por técnicas moleculares, uma
vez que os programas de melhoramento são dependentes da identificação de genótipos
contrastantes, que possam viabilizar a transferência de características desejáveis.
No presente trabalho foi utilizado um elevado número de iniciadores (55 para seleção
de 31), um número considerável de acessos que representaram todas as seis variedades
botânicas. Embora o polimorfismo observado ainda tenha sido baixo, os resultados mostram a
utilidade da técnica de RAPD em revelar polimorfismo em amendoim com observado por
SUBRAMANIAN et al. (2000), RAINA et al. (2001) e DWIVEDI et al. (2001).
Pelos dendrogramas das Figuras 7 e 8 pode-se observar a formação de dois grupos
principais entre os acessos analisados, sendo o primeiro (I) composto por três acessos (IAC
Tatu-ST, 214AM e 198AM) e o segundo (II) grupo que se subdividi em dois subgrupos (A e
B) com 26 acessos (A-76AM, Mf1538, 158AM, 206AM, 218AM, Sapucaia Vermelha, CV
Tatu, 202AM, CV Tatuí, 180AM, Md1678; Sapucaia Bege, 174AM, 192AM, Serrinha,
184AM; 193AM; 178AM, 185AM, IAC 886 Runner, 208AM, IAC8112; B- V12549;
V12548, Mf1560 e IAC Caiapó).
Não foi observado agrupamento em função da origem dos acessos. Os acessos do
Brasil e da África distribuíram-se tanto no grupo I quanto no grupo II. Não foi observado
agrupamento dos acessos também em função das subespécies.
32
No grupo I do dendrograma estão 11% dos acessos da variedade botânica fastigiata e
17% dos acessos da variedade vulgaris. No subgrupo A do grupo II está 50% dos acessos da
variedade botânica hypogaea, 100% dos acessos da variedade hirsuta, ambas da subespécie
hypogaea; 100% dos acessos da variedade aequatoriana, 89% dos acessos da variedade
fastigiata, 83% dos acessos da variedade vulgaris, enquanto que no subgrupo B estão 50%
dos acessos da variedade botânica hypogaea e 100% dos acessos da variedade peruviana. Esta
distribuição mostra a variabilidade existente entre e dentro dos acessos das diferentes
variedades botânicas, uma vez que acessos da subespécie fastigiata estão presentes nos dois
grupos principais e os acessos da subespécie hypogaea estão distribuídos pelos grupos A e B
do grupo II do dendrograma.
Com relação às origens dos acessos pode-se observar que os acessos brasileiros se
distribuíram por todos os grupos do dendrograma mostrando uma variabilidade maior quando
comparado com os acessos africanos que não possuem nenhum representante no subgrupo B
do grupo II. Dos três acessos do Equador dois ficaram no subgrupo A e um no subgrupo B do
grupo II.
Herselman (2003) aponta que o primeiro acesso introduzido a partir do qual se
estabeleceu a cultivar Natal Common na África do Sul era do tipo Spanish, e que os acessos
do grupo Valência introduzidos não se adaptaram agronomicamente, de forma que a maior
parte dos acessos atualmente cultivados foi originada de cruzamentos envolvendo a cultivar
Natal Common do grupo Spanish.
Resultados similares, com relação ao tipo de agrupamento, foram obtidos por HE &
PRAKASH (2001). Neste trabalho os autores analisaram por meio de marcadores tipo AFLP
44 acessos de amendoim, onde testaram 28 combinações de iniciadores dos quais 15 pares
revelaram polimorfismo. Observaram a formação de dois grupos principais, sendo que o
primeiro agrupou os acessos das variedades hypogaea, hirsuta, aequatoriana e peruviana e no
segundo os acessos das variedades fastigiata e vulgaris. Os autores citam que os dados de
polimorfismo de DNA não estão de acordo com a classificação de Arachis hypogaea quando
às duas subespécies.
Em ensaio com marcadores RAPD DWIVEDI et al. (2001) conseguiram identificar
todos os acessos individualmente, entretanto os cinco grupos gerados pela análise de
agrupamento apresentaram acessos que não puderam ser associados aos seus países de
origem, às subespécies, às características de semente e vagens, nem com o conhecimento do
pedigree.
Na Figura 10 é apresentado um diagrama de ordenação, construído com os dados da
matriz binária utilizando a análise de componentes principais. Este diagrama pode ser
utilizado para verificação da significância dos grupos formados pelo método de agrupamento.
Esta ordenação representa a variância dos dados em um sistema de componentes principais
(eixos), de forma mais simples de analisar os agrupamentos. Para este conjunto de dados 48%
da variância total é explicada pelos dois primeiros componentes (componente um responsável
por 26% da variação e o componente dois por 22%). Pelo diagrama pode-se observar um
agrupamento bastante consistente com o já verificado pela análise de agrupamento, em que os
acessos do grupo II do dendrograma se subdividiram em três sub-grupos (marcados com
círculos) no diagrama. Já os acessos do grupo I ficaram distantes dos demais três sub-grupos e
o acesso proveniente do Brasil separou-se dos dois acessos provenientes da África.
33
Figura 9: Análise de componentes principais de 29 acessos de amendoim, com base nos
dados da matriz binária de 12 iniciadores RAPD, mostrando a ordenação dos acessos.
-1.0 1.5
-1.0 1.5
76Am
Sapucaia
174AM
192AM
198AM
214AM
178AM
208AM
185AM
Serrinha
184AM
193AM
158AM
206AM
218AM
Sapucaia
202AM
180AM
Runner
IACTatuS
IAC8112
IACCaiap
V12549
Md1678
V12548
CVTatuí
Mf1538
Mf1560
CVTatu
A
B
C
34
4.4 – Avaliação da Nodulação e Fixação Biológica de Nitrogênio
Foi implantado um experimento com o objetivo de avaliar os parâmetros relacionados
à nodulação e fixação biológica de nitrogênio em nove acessos de amendoim, representantes
de grupos distintos com base nos resultados da análise dos marcadores RAPD.
Foi observado tanto para os dados de matéria seca da parte aérea quanto para os dados
de matéria fresca da parte aérea efeito significativo dos fatores solo e acesso, não sendo
observada interação entre eles. Os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner, Sapucaia Bege,
CV Tatuí e Sapucaia Vermelha apresentaram médias estatisticamente superiores aos demais
acessos para os dados de matéria fresca, quando comparados pelo teste de Scott-Knott a 5%
de significância. Os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner, Sapucaia Bege e Sapucaia
Vermelha apresentaram as maiores médias para os dados de matéria seca da parte aérea,
sendo superiores estatisticamente aos demais.
Os demais acessos formaram um outro grupo não sendo observada diferença
significativa pelo teste Scott Knott entre eles (Tabela 10).
Com relação às amostras de terra estudadas, tanto para matéria seca quanto para
matéria fresca, o solo Argissolo apresentou médias superiores estatisticamente quando
comparado com o Planossolo.
Tabela 10: Valores médios de matéria fresca e matéria seca da parte aérea das plantas dos nove
acessos utilizados no experimento de casa de vegetação.
Matéria fresca Matéria seca Acessos
g.planta
-1
g.planta
-1
202AM 10,250 B 2,250 B
76AM 11,125 B 2,250 B
IAC Tatu-ST 13,750 A 2,750 A
IAC 886 Runner 14,000 A 3,250 A
IAC Caiapó 9,750 B 2,500 B
Sapucaia Bege 14,500 A 2,875 A
198AM 9,250 B 1,750 B
Sapucaia Vermelha 13,625 A 2,750 A
CV Tatuí 12,250 A 2,500 B
CV 21,60 24,11
Valores seguidos pela mesma letra, nas colunas não diferem entre si pelo teste Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade.
Na Tabela 11 são apresentados os teores médios de nitrogênio na parte aérea, bem
como, os dados de acúmulo de nitrogênio total na parte aérea, resultado do produto entre a
massa seca da parte aérea e o teor de nitrogênio apresentado pelos acessos testados. Para essas
variáveis também não foi observado efeito significativo da interação entre solo x acesso, mas
os seus efeitos isolados foram significativos pelo teste F.
Com relação ao teor de nitrogênio pode-se observar que houve a formação de dois
grupos de médias sendo que os acessos 202AM, 76AM, IAC Caiapó, Sapucaia Bege e CV
Tatuí apresentaram médias superiores aos demais acessos. Entretanto para os valores de
acúmulo total de nitrogênio na parte aérea os acessos IAC 886 Runner, IAC Caiapó, Sapucaia
Bege, Sapucaia Vermelha e IAC Tatuí foram os que apresentaram médias superiores
estatisticamente, quando comparado aos demais, mostrando que para os acessos IAC 886
Runner e Sapucaia Vermelha embora tenham apresentado teores de nitrogênio mais baixos, o
acúmulo total foi semelhante aos outros citados como resultado de um maior acúmulo de
massa seca.
35
Tabela 11: Teores médios de nitrogênio e acúmulo total de nitrogênio na parte aéreas das
plantas dos nove acessos utilizados no experimento de casa de vegetação.
Teor de Nitrogênio Acúmulo total de
nitrogênio
Acessos
% mg.planta
-1
202AM 2,893625 A 60,64750 B
76AM 2,887875 A 66,15500 B
IAC TatuST 2,509625 B 68,62875 B
IAC 886 Runner 2,627125 B 85,47375 A
IAC Caiapó 3,038375 A 71,99000 A
Sapucaia Bege 2,807750 A 86,08125 A
198AM 2,674250 B 51,28375 B
Sapucaia Vermelha 2,718125 B 73,23250 A
CV Tatuí 2,975625 A 73,84125 A
CV 11,57 25,25
Valores seguidos pela mesma letra, nas colunas não diferem entre si pelo teste Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade.
Os valores de matéria seca de parte aérea e Ntotal foram superiores estatisticamente no
solo Argissolo mostrando um efeito do solo. A estratégia de usar dois solos teve por objetivo
avaliar, não apenas as diferenças entre os acessos, mas também, se estas variações eram
consistentes entre solos distintos. Os resultados observados permitiram uma comparação entre
os acessos, uma vez que estes solos não apresentam no histórico nenhum ciclo de cultivo com
a cultura do amendoim, não proporcionando o estabelecimento de grupos específicos de
rizóbios selecionados por qualquer acesso.
Neste estudo foi quantificada a atividade da enzima nitrogenase pela técnica de
redução de acetileno utilizando-se todo o sistema radicular das plantas. Como pode ser
observado na Tabela 12, os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner, Sapucaia Bege, Sapucaia
Vermelha e CV Tatuí apresentaram as médias estatisticamente superiores aos demais acessos,
mostrando que nas condições do experimento estes se associaram a estirpes nativas do solo
que foram mais eficientes na redução do nitrogênio atmosférico que os acessos 202AM,
76AM, IAC Caiapó e 198AM.
Tabela 12: Valores médios de etileno produzido pelos nove acessos utilizados no
experimento de casa de vegetação, analisados pela técnica de redução de acetileno.
Acessos Etileno (nmol.mL
-1
)
202AM 10,875 B
76AM 10,375 B
IAC Tatu-ST 14,250 A
IAC 886 Runner 16,875 A
IAC Caiapó 10,875 B
Sapucaia Bege 16,500 A
198AM 7,6250 B
Sapucaia Vermelha 19,750 A
CV Tatuí 16,875 A
CV 45,66
Valores seguidos pela mesma letra, nas colunas não diferem entre si pelo teste Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade.
Com relação aos dados de nodulação (Tabela 13), para os parâmetros avaliados de
número e massa seca de nódulos foi observado efeito significativo da interação entre os
fatores solo e acesso. Foi observada uma nodulação mais intensa para todos os acessos
36
analisados quando cultivados no solo Argissolo, o que indica que a amostra desse solo possuía
no momento da coleta uma densidade de rizóbios formadores de nódulos em amendoim maior
do que a amostra de Planossolo, bem como características químicas mais favoráveis ao
desenvolvimento das plantas. Os acessos IAC Tatu-ST, Sapucaia Vermelha e CV Tatuí
apresentaram médias estatisticamente superiores aos demais acessos estudados quanto ao
número de nódulos no Argissolo, por outro lado, para o Planossolo não foi observada
diferença estatística entre os acessos nas condições deste experimento, embora o acesso
Sapucaia Vermelha tenha apresentado uma média numericamente superior aos demais. Para
uma condição de não inoculação pode-se concluir que os acessos foram capazes de formar
uma quantidade significativa de nódulos, observado pela boa nodulação no sistema radicular.
SANTOS et al. (2005) em experimento com inoculação de amendoim por diferentes
estirpes de rizóbio observaram que a nodulação foi dependente do genótipo, mas influenciada
também pela cobertura vegetal da área onde o solo foi coletado.
Para os dados de massa seca de nódulos foi observado comportamento semelhante ao
observado para os dados de número de nódulos, o que foi caracterizado como uma interação
significativa entre os fatores solo e acesso. Para o Planossolo não foi observada diferença
estatística entre os acessos, já para o Argissolo os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner,
Sapucaia Bege e Sapucaia Vermelha apresentaram médias superiores aos demais acessos pelo
teste utilizado.
Os dados mostram que o amendoim é uma espécie que pode estabelecer associações
simbióticas com estirpes nativas de rizóbio e se beneficiar desta interação em condições de
baixa disponibilidade de N no solo e que esta resposta é dependente do genótipo da planta.
CASTRO et al. (1999) em experimento de condições de campo com amendoim avaliaram a
competitividade da estirpe USDA 3187 frente aos rizóbios nativos do solo. Os autores citam
que como o amendoim é uma espécie considerada promíscua, a propriedade chave para a
inoculação de estirpes deve ser a habilidade de competir com os rizóbios nativos do solo.
Neste ensaio não foi observada diferença significativa entre os tratamentos, inoculado e não
inoculado, evidenciando a baixa competitividade da estirpe inoculada no experimento.
37
Tabela 13: Valores médios de número de nódulos e massa seca de nódulos dos nove acessos
de amendoim utilizados no experimento de casa de vegetação.
Número de nódulos
Massa seca de nódulos
(mg.planta
-1
)
Acesso
Argissolo Planossolo
Argissolo Planossolo
202AM 182,00 B 50,75 A 109,50 B 30,50 A
76AM 144,00 B 80,00 A 90,00 B 50,75 A
IAC Tatu-ST 303,50 A 68,50 A 174,75 A 49,25 A
IAC 886 Runner
192,00 B 39,50 A 143,25 A 45,50 A
IAC Caiapó 165,00 B 52,00 A 120,50 B 44,25 A
Sapucaia Bege 199,25 B 95,00 A 195,50 A 71,75 A
198AM 123,75 B 59,50 A 78,00 B 23,75 A
Sapucaia
Vermelha
242,75 A 117,00 A 156,75 A 78,50 A
CV Tatuí 307,00 A 81,50 A 197,00 A 44,75 A
CV 36,39 33,84
Valores seguidos pela mesma letra, nas colunas não diferem entre si pelo teste Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade.
Com o objetivo de avaliar o comportamento do sistema radicular de cada acesso nas
condições deste experimento, onde se trabalhou com dois solos de características químicas
distintas, foi realizada a pesagem das raízes após coleta dos nódulos e secagem em estufa para
determinação da massa seca total do sistema radicular (Tabela 14). Para estes dados não foi
observada interação entre os fatores solo e acesso e foi observado comportamento semelhante
para os acessos, tanto para massa seca das raízes quanto para massa seca total do sistema
radicular. Observou-se que o acesso 198AM apresentou média estatisticamente inferior ao
acesso IAC Tatu-ST, e os demais acessos apresentaram médias estatisticamente iguais. O
acesso 198AM apresentou médias inferiores para os dados de matéria seca da parte aérea,
acumulo de nitrogênio e massa seca de raízes, o que indica que houve uma limitação quanto
ao suprimento de nitrogênio para o desenvolvimento das plantas deste acesso, talvez esse
acesso apresente uma restrição à nodulação, em termos quantitativos ou qualitativos,
promovendo associação com grupos de rizóbios menos eficientes. Isso pode resultar em um
padrão de nodulação distinto dos demais acessos, o que pode vir a direcionar uma futura
seleção de estirpes inoculantes específicas.
38
Tabela 14: Valores médios de massa seca de raiz e massa seca total do sistema radicular dos
nove acessos de amendoim utilizados no experimento de casa de vegetação.
Massa seca de raiz
Massa seca total do
sistema radicular
Acessos
g.planta
-1
g.planta
-1
202AM 0,875 AB 0,875 AB
76AM 1,000 AB 1,000 AB
IAC Tatu-ST 1,250 A 1,375 A
IAC 886 Runner 0,875 AB 0,875 AB
IAC Caiapó 0,875 AB 0,875 AB
Sapucaia Bege 1,000 AB 1,125 AB
198AM 0,625 B 0,750 B
Sapucaia Vermelha 1,000 AB 1,125 AB
CV Tatuí 1,000 AB 1,125 AB
CV 32,22 36,21
Valores seguidos pela mesma letra, nas colunas não diferem entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
CHEN et al. (2003) avaliando a compatibilidade de diferentes acessos de amendoim
com diferentes estirpes de rizóbio nativos da China, mostraram que os acessos diferiram na
capacidade de nodular e acumular matéria seca com as diferentes estirpes e, citam uma baixa
correlação entre o número de nódulos e produção de matéria seca, indicando que nem sempre
alto número de nódulos está associado com alta produção.
Para os dados do presente experimento foi observada uma correlação elevada, acima
de 70%, entre os dados de acúmulo total de nitrogênio e as determinações de matérias seca e
fresca da parte aérea, número e massa seca de nódulos (Tabela 15) ao contrário do observado
para os dados de teor de nitrogênio, onde os valores de correlação são baixos entre os mesmos
conjuntos de valores. Mostrando que a determinação do acúmulo total de nitrogênio que
considera a massa seca da planta está mais relacionada às determinações de nodulação e
crescimento vegetal do que simplesmente os teores de nitrogênio. Foram observados também
valores elevados de correlação entre as determinações relacionadas a nodulação (número e
massa de nódulos) com as determinações de matéria seca e matéria fresca da parte aérea e
com o acúmulo total de nitrogênio na parte aérea da planta.
39
Tabela 15: Correlação observada entre os parâmetros analisados no experimento com os nove
acessos de amendoim.
Variáveis
TN ANPA
MSPA
MFPA
NN MSN ARA
MSR MSRN
TN 1,000 --- --- --- --- --- --- --- ---
ANPA 0,418 1,000 --- --- --- --- --- --- ---
MSPA 0,114 0,942 1,000 --- --- --- --- --- ---
MFPA 0,103 0,909 0,960 1,000 --- --- --- --- ---
NN 0,126 0,710 0,735 0,796 1,000 --- --- --- ---
MSN 0,188 0,838 0,848 0,880 0,887 1,000 --- --- ---
ARA 0,199 0,798 0,818 0,849 0,783 0,872 1,000
--- ---
MSR -0,142 0,468 0,579 0,599 0,339 0,417 0,394
1,000 ---
MSRN -0,096 0,577 0,680 0,704 0,468 0,560 0,515
0,987 1,000
TN - Teor de nitrogênio; ANPA - Acúmulo de nitrogênio na parte aérea; MSPA - Matéria seca da parte aérea;
MFPA - Matéria Fresca da parte aérea; NN - Número de nódulos; MSN - Massa seca dos nódulos; ARA -
Análise de redução de acetileno; MSR - Matéria seca das raízes; MSRN - Matéria seca total das raízes.
Pelas avaliações deste experimento os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner,
Sapucaia Vermelha, Sapucaia Bege e CV Tatuí mostraram um rendimento superior aos
demais acessos testados. Entretanto, estes acessos ficaram dispostos pelo ensaio RAPD em
grupos distintos, mostrando que a definição de acessos mais eficientes na fixação não está
necessariamente relacionada à sua posição ou relacionamento genético. CHEN et al. (2004)
observaram em estudo de compatibilidade entre rizóbios e acessos de amendoim que os
genótipos AFLP das estirpes não explicaram o comportamento simbiótico e sugeriram que
para obter máxima eficiência na fixação combinações compatíveis entre as estirpes e
cultivares devem ser selecionadas.
40
5 – CONCLUSÕES
A técnica de RAPD foi capaz de revelar o polimorfismo entre os acessos de
amendoim;
Foi observada, pelo dendrograma de similaridade, a separação de dois grupos com
89% de similaridade sendo possível à diferenciação entre os acessos analisados;
Não foi observado agrupamento nem em função da origem dos acessos nem em
função das subespécies;
Foi observada variabilidade tanto entre, quanto dentro dos acessos das diferentes
variedades botânicas;
Os acessos apresentaram diferenças quanto à nodulação e à fixação de nitrogênio
atmosférico, sendo que os acessos IAC Tatu-ST, IAC 886 Runner, Sapucaia Vermelha,
Sapucaia Bege e CV Tatuí apresentaram maior desenvolvimento vegetal analisando-se as
características observadas e,
Os dados mostram que o amendoim é uma espécie que pode se associar às estirpes
nativas de rizóbio do solo e se beneficiar desta interação.
41
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