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RESUMO
Análise da Presença de Bombas de Efluxo e Mutações no Gene nat em
Mycobacterium tuberculosis Resistentes a Isoniazida
É relatada que a resistência intrínseca de M. tuberculosis à diversos fármacos deve-se
à sua exclusiva parede celular e outros determinantes genéticos. Foram analisados
neste estudo 47 isolados, sendo 41 deles considerados resistentes a isoniazida (R-INH)
e 06 sensíveis (S-INH) pelo método das proporções (MP-LJ). Dos 41 isolados R-INH,
68,29% deles não apresentaram mutações no códon 315 do gene katG e inhA, sendo
considerados WT para ambos. E em 31,71% foi observada mutação pontual no códon
315 de katG. Do grupo de isolados WT para katG e inhA, foi observado um mecanismo
de efluxo ativo em 14,29%, todos pertencentes à família genotípica “Latin Americam
and Mediterranean” (LAM), enquanto em apenas 23,08% dos isolados com mutação em
katG foi observado esse sistema, tendo perfis genotípicos definidos como subtipos
LAM9, X2 e U. As inibições em ambos os grupos foram alcançadas com o uso de 2
inibidores, o CCCP (um desacoplador de prótons da membrana plasmática) e o
verapamil (inibidor de proteínas transportadoras que utilizam a hidrólise de ATP),
demonstrando assim, que proteínas transportadoras de famílias distintas estão
envolvidas na resistência a INH. Todos os isolados tiveram o gene nat seqüenciado e
em 9,76% foi observada a variante mutada 619-A NAT SNP dos R-INH e WT para
katG, com perfis genotípicos caracterizados como subtipos LAM3 S/Convergente, T3 e
um perfil “novo”, ainda não depositado no SpolDB4. Em nosso estudo, essa mutação
não foi associada à família LAM e demais famílias (p=0,87 e OD=0,85 (0,07-9,76).
Adicionalmente, foram identificadas 3 mutações sinônimas e 3 não-sinônimas ainda não
descritas para nat de M. tuberculosis, sendo C276T, C375G, G501C e G202A, C373A e
T503G respectivamente, caracterizados com perfis das famílias LAM, Beijing, T e um
perfil novo. Essas novas mutações não mostraram associação com a família LAM e
demais famílias (p=0,31 ; OD=0,52 (0,11-2,29). Dois isolados R-INH mutados em nat
apresentaram simultaneamente um mecanismo de efluxo, sendo este o primeiro
trabalho a fazer tal constatação. Enquanto 39,02% dos isolados foram considerados
WT para todos os genes investigados e não apresentaram um mecanismo de efluxo,
com genótipos das família LAM, U, Beijing, T, X, Haarlem e 3 perfis novos, sugerindo
que outros genes ou mecanismos moleculares ainda não descritos podem estar
envolvidos na resistência; De outro lado, 46,15% dos isolados com mutação em katG e
WT para nat não apresentaram efluxo ativo, sugerindo que a resistência possa ser
atribuída à alteração em katG, e em adição a isto, a presença de perfis Haarlem, LAM e
um perfil novo, poderiam contribuir a este fato, via níveis distintos de resistência. A
possibilidade de existência de clusters (agrupamentos) entre os isolados foi descartada
pela presença de diferentes SIT's. Esses dados sugerem a importância da
caracterização de outros genes ou mecanismos moleculares ainda desconhecidos, que
podem contribuir com níveis de resistência do bacilo da TB ao tratamento com INH. Em
estudo prospectivo, a atividade das isoformas de NAT serão investigadas, usando
experimentos in silico, promovendo simulações de docking (acoplamento) da INH, por
exemplo, a fim de predizer a afinidade do fármaco à estas estruturas mutadas.