ads:
SIMONE GUALBERTO SANTOS
Análise da
hipótese da
vicariância entre
Dalbergia nigra
Allem.
e
x Benth.
e
Dalbergia miscolobium
Benth. (Fabaceae)
com base em DNA cloroplastídico
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação
em Botânica, para obtenção do título de
Doctor
Scientiae
.
VIÇOSA
MINAS GERAIS
-
BRASIL
200
8
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SIM
ONE GUALBERTO SANTOS
Análise da
hipótese da
vicariância entre
Dalbergia nigra
Allem.
e
x Be
nth.
e
Dalbergia miscolobium
Benth. (Fabaceae)
com base em DNA cloroplastídico
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Botânica, para
obtenção do título de
Doctor
Scientiae
APROV
ADA:
17 de abril de 2008
_______________________________ ___________________________
Prof.
Luiz Orlando de Oliveira
Prof. Wagner Campos Otoni
(Co
-
orientador
) (
Co
-
orient
ador
)
_______________________________ ____________________________
Prof.
João Augusto Alves
Prof.
Lyderson Facio Viccini
Meira Neto
_____________________________
Prof. Everaldo Gonçalves de Barros
(Orientador)
ads:
ii
AGRADECIMENTOS
À Deus, que me concedeu vitória nas lutas enfrentadas e possibilitou
alcançar mais este importante objetivo.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Programa de Pós-graduação em
Botânica vinculado ao Departamento de Biologia Vegetal, pela oportunidade de
realização deste trabalho.
A Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado da Bahia (FAPESB) pela
concessão da bolsa de do
utorado.
Aos meus queridos pais Aderbal e Lourdes, pelo amor, oração e
dedicação, torcendo sempre pela minha vitória.
Ao meu grande amor e esposo Marcelo que me acompanhou durante
essa jornada, me dando atenção, paz, tranqüilidade, amor e carinho.
A minha família que vibrou e sofreu junto comigo durante todas as etapas
do meu trabalho.
Ao meu orientador, professor e amigo Everaldo Gonçalves de Barros, pela
confiança e amizade, pelo apoio e incentivo durante todas as etapas dessa
minha formação e dos meus
trabalhos.
Ao professor Ronan Xavier Corrêa pelo incentivo, auxílio, apoio e amizade
e compreensão em todos os momentos da minha trajetória acadêmica.
Aos meus professores conselheiros Wagner Campos Otoni e Luiz Orlando
de Oliveira, pelos aconselhamentos
durante a formulação do projeto.
Ao meu amigo Fabrício Juchum, pelas analises estatís
ti
cas e pelos
aconselhamentos
A minha amiga Mariana, pela cumplicidade, paciência, amor, amizade
dedicação extrema a este trabalho.
A
os
meus anjos do campo
Brazilino
e
Lima
, que me acompanharam nas
expedições de coleta do material botânico.
Aos amigos que conquistei em Viçosa, por serem meus companheiros-
irmãos nesta trajetória.
Aos primos Arthur Dantas Silva e Claudio Olívio Vilela de Lima, pela
contribuição na eta
pa final da escrita.
iii
Ao Gilmar Valente pelo auxilio nas coletas de D. miscolobium em Minas
Gerais.
Aos professores, pelos aconselhamentos prestados durante o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos colegas de trabalho do Laboratório de Genética e Biologia
Molecular
e aos funcionários da UESC pela colaboração e agradável convivência.
Ao amigo e técnico do laboratório da UESC Robson, por todo o apoio no
seqüenciamento das minhas amostras.
Aos herbários, em nome dos seus curadores, André M. Amorim (CEPEC
– Centro de Pesquisas do Cacau, CEPLAC, Ilhéus, BA) e Luiz Alberto M. Silva
(UESC
- Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA), que forneceram
informações dos bancos de dados.
Aos funcionários da UFV, em especial Ângelo pelo seu atendimento
sempre carin
hoso e atencioso mesmo distante.
A todos os professores que ministraram as disciplinas do curso, pelos
ensinamentos. Em especial ao Alexandre (in memoriam), por ter plantado em
minha vida a semente da sabedoria e da simplicidade.
Ao André Carvalho (in mem
oriam
) por seu essencial trabalho de
sistemática do gênero
Dalbergia
no Brasil.
A todos os amigos e colegas do curso que certamente contribuíram, direta
ou indiretamente, para a conclusão deste trabalho.
iv
BIOGRAFIA
SIMONE GUALBERTO SANT
OS
, filha de Aderbal Souza Santos e
Lourdes Gualberto Santos, nasceu em São Paulo - SP, em 10 de dezembro de
1975.
Em 1994, iniciou o curso superior em Ciências Biológicas na
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), concluindo em 2000. Na UESC
desenvol
veu atividades de Iniciação Científica no projeto “Formação do Horto e
Recomposição da Mata da UESC”.
Em 2002 recebeu da UESC o título de especialista em Genética e Biologia
Molecular, onde desenvolveu um trabalho na área de diversidade genética d
e
plantas.
Em
fevereiro de 2004
,
concluiu
o curso de Mestrado em Botânica, com
área de concentração em Botânica Estrutural/ Biotecnologia, na UFV
.
Em março de 2004, iniciou o curso de Doutorado em Botânica, com área
de concentração em Botânica Estrutural/ Biotecnologia, na UFV, defendendo
tese em
abril
de 2008.
v
SUMÁRIO
RESUMO
........................................
....................
....................
....................
vi
ABSTRACT
....................
...........
....................
....................
....................
.........
vii
1.
INTRODUÇÃO
. ..................
....................
....................
............................
...
....
1
2.
REVISÃO DE LITERATUR
A
.. .................
....................
....
....................
......
..
..
3
2.1
.
Familia Leguminosae
....................
........................................
.......
....
...
....
3
2
.2
.
Aspectos
gera
is
do gênero
Dalbergia
....................
.....
....
..........
....
..
.......
4
2.3.
Vicariânc
ia
.........................
....
............
....................
.............
..............
.....
.
5
2.
4.
Filogenia Molecular
........................................
...........
.................
........
...
.. 6
2.
4
.1
.
Genomas nuclear, mitocon
drial e cloroplastídico
.........................
9
2.4.2. Ferramentas de análise de dados moleculares.........
....................
11
3.
MATERIAL E MÉTODOS
.......................................
....................
.............
..
....
14
3.1.
Material vegetal
....
........................................
....................
..............
..
...
....
14
3.2
Extração de DNA
....................
..............
....................
.......
.......
....
..
....
..
...
.
....
15
3.3
Amplificação d
e DNA
....
....................
..........
....................
..........................
.
........
16
3.4
Purificação dos produtos
de P
CR
...................
....................
..............
.
............
.
17
3.5
Seqüenciamento dos produtos
de
PCR
.
.................................
.......
.
...............
17
3.6.
Análises filogenéticas
....................
................
....................
....................
...........
18
4.
RESULTADOS
....................
................
.........
............................................................
.
19
5
. DISCUSSÃO
........................................
........................................
..................
22
6
.
CONCLUS
ÃO
................
....................
....................
......
......
....................
........
26
7.
REFER
Ê
NCIAS BIBLIOGR
Á
FICAS
........................................
..................
....
27
vi
RESUMO
SANTOS, Simone Gualberto, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
abril
de
2008.
Análise da
hipótes
e da vicariância entre Dalbergia nigra
Allem.
ex Benth. e Dalbergia miscolobium Benth. (Fabaceae) com base em
DNA cloroplastídico
.
Orientador: Everaldo Gonçalves de Barros. Co-
orientadores
:
Ronan Xavier Corrêa
,
Luiz Orlando de Oliveira e
Wagner
Campos Oton
i
O gênero
Dalbergia
L. f. (Fabaceae: Papilionoideae), possui cerca de
100 espécies de distribuição pantropical. No Brasil, há 40 espécies de
Dalbergia
distribuídas em áreas representativas dos diferentes ecossistemas
brasileiros.
D.
nigra
e D. miscolobium são espécies consideradas vicariantes,
que ocorrem na Mata Atlântica e no Cerrado, respectivamente. Estas espécies
figuram como objetos de estudo sobre vicariância em trabalhos anteriores de
fitossociologia e quimiossistemática, porém, estes estudos necessitam de
outras abordagens, visto ser a teoria de vicariância ainda polêmica entre
pesquisadores. Neste trabalho, objetivou-se analisar as seqüências do íntron
trnL em D. nigra e D. miscolobium, visando investigar a validade dessa região
genômi
ca para distinguir essas espécies e discutir possível vicariância entre
elas. Amostras de DNA de plantas das espécies de
Dalbergia
foram extraídas e
amplificadas com
primers
específicos trnL-c e trnL-d (cpDNA). As seqüências
de DNA alinhadas produziram uma matriz com 530 caracteres. Excluindo os
autopomórficos e os invariáveis, foram obtidos 75 sítios variáveis dos quais 37
foram informativos para análise de parcimônia. De modo geral, as análises de
máxima parcimônia e
neighbor
-
joining
foram consistentes, resultando em
árvores de topologias semelhantes entre si, com a separação dos
taxa
em
clados. As relações filogenéticas entre as espécies estudadas, com base nos
dados moleculares, corroboram aquelas baseadas em dados de morfologia
encontrados na literatura, contudo não confirmam a hipótese de vicariância
entre
D. nigra
e
D. miscolobium
.
vii
ABSTRACT
SANTOS, Simone Gualberto, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
April
2008.
Analysis of vicariance hypothesis between Dalbergia nigra
Allem. ex Benth.
and
Dalbergia miscolobium Benth. (Fabaceae) based
on chloroplast DNA sequences
.
Adviser: Everaldo Gonçalves de Barros.
Co
-advisers: Ronan Xavier Corrêa, Luiz Orlando de Oliveira and Wagner
Campos Otoni
The genus
Dalbergia
L. f. (Fabaceae: Papilionoideae) includes
approximately 100 pantropical species. In Brazil there are 40
Dalbergia
species
distributed in different Brazilian ecossistems.
D.
nigra
and
D. miscolobium
which
occur in the Mata Atlântica and Cerrado regions, respectively, are considered to
be
vicariant. Vicariance between these two species has been investigated by
phytosociological and chymosystematic studies, however, new approaches
need to be used for these studies as this hypothesis has not been confirmed
and is not fully accepted by the sci
entific community. In this work the chloroplast
trnL intron sequences of D. nigra
and
D. miscolobium have been analyzed as a
tool to distinguish these two species and possibly aid the discussion of
vicariance between them. Leaf DNA samples was extracted, amplified and
sequenced with specific primers for the trnL-c and trnL-d regions of the trnL
gene present in the chloroplast DNA. The sequences obtained were aligned
generating a matrix with 530 characters. Seventy-five variable sites were
obtained, 37 of them were informative for the parsimony analysis. As a whole
the maximum parsimony nd the neighbor-joining analyses were consistent,
giving rise to trees with similar topologies, separating the different taxa into
clades. The phylogenetic relationships between the species studied based on
molecular data support those based on morphological data presented in the
literature, however, they do not confirm the hypothesis of vicariance between
D.
nigra
and
D. miscolobium
.
1
1. INTRODUÇÃO
O gênero
Dalbergia
L. f. (Fabaceae: Papilionoideae), possui cerca de 100
espécies de distribuição pantropical, sendo considerado o segundo maior da tribo
Dalbergieae Bronn ex. D.C. No Brasil, ocorrem 40 espécies de
Dalbergia
distribuídas em
áreas representativas dos diferentes
ecossistemas brasileiros. É
possível encontrar as espécies de
Dalbergia
nos mais variados tipos de
vegetação, como: Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e Campo Rupestre
(Carvalho, 1997).
Dalbergia nigra
(jacarandá-
da
-
bahia, típico da Mata Atlântica)
e
Dalbe
rgia miscolobium (jacarandá-
do
-cerrado) foram espécies consideradas
vicariantes, isto é, afins em substituição umas às outras em territórios vizinhos
nos nichos ecológicos (Rizzini,1963). Essa hipótese foi corroborada
pela
técnica de cromatografia em sílic
a,
que permitiu avaliar a presença de
substâncias típicas de
Dalbergia
de diferentes continentes entre essas duas
espécies (Gottlieb, 1964).
Segundo Carvalho (1997), D. miscolobium apresenta folhas alternas e
compostas por cinco a 10 pares de folíolos rígidos, ovalados, de cor verde-
azulada, com até três centímetros de comprimento. As inflorescências são
ramificadas e estão no ápice dos ramos ou
na
axila das folhas, contendo até 60
flores. As flores têm cerca de dois mm de comprimento e cor roxo-
escura
. Os
frutos são escuros, secos (tipo legume samaróide), alongados com até oito cm
de comprimento, foliáceos, contendo uma ou duas sementes castanhas,
achatadas e
reniformes
.
D. nigra caracteriza-se pelos folíolos oblongos com
ápice obtuso, às vezes retuso, ovár
io glabro, exceto na margem ventral, onde é
ciliado e sâmaras glabras castanho-escuras. Distingue-se das demais espécies
de
Dalbergia
por apresentar frutos com duas sementes. Assim, pode-
se
salientar que essas duas espécies apresentam diferenças marcantes
em
formato de folhas, pilosidade de algumas estruturas e cor da flor.
As duas espécies objeto deste estudo apresentam elevado valor econômico.
Além disso, D. nigra encontra-se em risco de extinção (Varty, 1998). A destruição
acelerada das florestas tropicais e o intenso processo de exploração extrativista
têm inserido muitas espécies de interesse econômico e conservacionista no grupo
de espécies ameaçadas de extinção (Carvalho, 1992; Silva & Mendonça, 1998).
2
Poucos indivíduos dessa espécie são encontrados, ainda que de forma isolada,
nos maciços e nos fragmentos de floresta que restam, devido ao intenso
desmatamento indiscriminado da Mata Atlântica no sul da Bahia (Almeida, 2001).
A madeira do jacarandá-
do
-cerrado é de boa qualidade, assim como d
o
jacarandá
-
da
-Bahia, porém é pouco utilizada por causa da tortuosidade de seu
tronco. Também conhecida por sua importância econômica, sua madeira é usada
em construções de casas e cercas,
na
fabricação de instrumentos e
na
produção
de carvão. Os frutos secos são usados para compor arranjos artesanais de flores
secas. Possui grande potencial para a ornamentação devido à presença de
algumas características, como a folhagem verde-azulada. A casca libera um
corante utilizado para tingir o algodão empregado em tecelagem (A
lmeida, 1998).
Seqüências de DNA cloroplastídico têm sido largamente utilizadas em
estudos de sistemática molecular de Leguminosae em diferentes níveis
taxonômicos (Chase et al., 1993; Doyle et al., 2000; Brouat et al., 2001;
Pennington et al., 2001; Doyle & Luckow et al. 2003; Herendeen et al., 2003;
Luckow et al., 2003; Wojciechowski, 2003; Simpson et al., 2003; Mcmahon &
Hufford
, 2004; Wojciechowski et al., 2004; Luckow et al., 2005; Haston et al.,
2005). Esta região do genoma do cloroplasto tem sido utilizada com sucesso
em estudos interespecíficos, intragenéricos e em reconstruções filogenéticas
(Gielly et al., 1996; Bruneau et al., 2000; Bruneau et al., 2001;
Lee
&
Wen
,
2004).
Neste
trabalho, objetivou-se analisar as seqüências do íntron trnL em
D.
nig
ra
e D. miscolobium, visando investigar a validade dessa região genômica
para distinguir essas espécies e discutir
a
possível vicariância entre elas.
3
2. REVISÃO DE LITERA
TURA
2.1
.
Família
Leguminosae
A família Leguminosae Juss. ou Faba
ceae
Lindl. (
sensu
APG II) é a terceira
maior família de angiospermas, compreendendo cerca de 727 gêneros e
19.325 espécies (Lewis et al., 2005), com menos espécies apenas que
Orchidaceae e Asteraceae (Doyle & Luckow, 2003). Cronquist (1981, 1988),
em seu esquema de classificação, considerou
as
legum
inosas
como três
famílias independentes. Com base em dados moleculares e não-
moleculares,
Leguminosae é dividida nas subfamílias Caesalpinioideae, Mimosoideae e
Papilionoideae (Faboideae) (Judd et al., 1999; Le
wis
& Schrire, 2003; APG II,
2003; Soltis et al., 2005). A subfamília Faboideae é a maior com 476 gêneros e
aproximadamente 14.000 espécies (Lewis et al., 2003); em Mimosoideae,
encontram
-se 77 gêneros e aproximadamente 3.000 espécies (Doyle &
Luckow, 2003); Caesalpinioideae é formada por 170 gêneros e
aproximadamente 3.000 espécies (Doyle, 1995; Doyle et al., 2000; Bruneau et
al., 2001), sendo extremamente diversa em morfologia (Tucker, 2003),
compartilhando algumas das características de Mimosoideae e Fab
oideae.
As
legum
inosas
estão distribuídas através do mundo, em diferentes
habitats, latitudes e altitudes, nos mais diferenciados ecossistemas. Enquanto
que Faboideae, considerada a subfamília com o maior número de caracteres
derivados é cosmopolita, as outras duas subfamílias ocorrem principalmente
nas regiões tropicais e subtropicais do globo (Heywood, 1979; Polhill & Raven,
1981).
A riqueza dos legum
inosa
s não pode ser resumida somente à sua
importância ecológica ou ao grande número e distribuição de suas espécies.
Economicamente, seu potencial é bastante acentuado incluindo variedades
alimentícias, medicinais, madeireiras, ornamentais, produtoras de fibras e
óleos, além de contribuir com a agricultura fixando nitrogênio aos solos. Por
isso, Fabaceae é a segunda maior família botânica em importância econômica,
sendo menos importante apenas que Poaceae (Wojciechowski et al., 2004).
4
Uma característica marcante desta família é a simbiose em suas raízes com
rizóbios, que permite a fixação de nitrogênio atmosférico (Sprent, 2001).
2.2
.
Aspectos Gerais do gênero
Dalbergia
O gênero
Dalbergia
foi proposto pelo filho de Linnaeus em 1781, em memória
de Carl Gustav Dahlberg, um soldado sueco no Suriname e coletor para Linnaeus
.
É considerado o segundo maior
gênero
da tribo Dalbergieae Bronn ex. D.C. e
pertence à família Fabaceae, sub-família Papilionoideae. Foi descrito para
acomodar duas espécies: D. lanceolaria, originária de Ceilão, e D. monetaria
,
originária do Suriname (Carvalho, 1989).
Existem cerca de 100 espécies no gênero
Dalbergia
,
sendo que no Brasil
obse
rva
-se a ocorrência de 40 delas. O gênero é dividido em cinco seções
(Pseudoecastaphyllum, Triptolemea, Ecastaphyllum, Selenolobium
e
Dalbergia)
,
que podem ser definidas por meio das características da inflorescência e do fruto.
D. ecasthaphyllum pertence à seção
Ecastaphyllum
; D. decipulares pertence a
seção
Triptolemea
; e D. glaucescens, D. nigra (Vell.) Allem. ex Benth e D.
miscolobium
pertencem a seção
Dalbergia
com a inflorescência do tipo panícula e
o fruto oblongo, samaroide, membranáceo com venação reticulata (Carvalho,
1997).
O gênero
Dalbergia
surgiu na África, de onde dispersou, tanto para o leste,
como para o oeste. As diferentes condições climáticas e ecossistemas da Ásia
e
América do Sul in
fluenciaram
os diferentes modos de evolução do gênero
(Almeida, 2001). É possível encontrar espécies de
Dalbergia
nos mais variados
tipos de vegetação, como: Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e Campo Rupestre
(Carvalho, 1997). D. nigra é arbórea, de grande porte, endêmica do litoral sul da
Bahia, sendo um componente típico da Mata Atlântica. É uma planta decídua, de
caráter pioneiro, característica da floresta pluvial da encosta atlântica, sendo
encontrada nas encostas bem drenadas, tanto no interior da ma
ta primária densa,
como em formações secundárias (Lorenzi, 1992).
D. miscolobium
é característica
da vegetação de Cerrado e ocorre do Estado do Piauí ao Estado do Paraná.
Ela é encontrada sob a forma de arbustos ou pequenas árvores de campos
limpos que podem alcançar 12 m de altura, quando as condições de solo e
5
disponibilidade de água permitem a formação de um tipo de floresta seca,
chamada cerradão (Carvalho, 1997).
Espécies de
Dalbergia
são importantes árvores tropicais de madeira de lei,
que apresentam modo de dispersão de sementes principalmente pelo vento
(Rout et al., 2003).
As valiosas madeiras dos jacarandás são conhecidas desde o
Brasil colonial e a importância econômica dessas plantas é citada na literatura já
no início daquele período. Entre estas espécies, o jacarandá-
da
-Bahia é a que
possui madeira com maior valor econômico. Esta
apresenta
cor escura, de
fragrância acentuada e bastante
resistente
e que apesar de seu peso e
densidade, é facilmente trabalhada e resiste ao apodrecimento mesmo nas
quentes e úmidas condições tropicais
(Carvalho,
1990).
Além disso,
é amplamente
utilizada, não só pelo desenho decorativo de seu laminado, mas também pela
multiplicidade de suas aplicações, tais como: na confecção de mobílias torneadas
de luxo, no preparo
de acabamentos internos em construção civil, em molduras de
portas e rodapés, em caixas de rádios e televisões, em peças entalhadas, em
cabos de talheres e no artesanato em geral (Almeida, 2001).
D. miscolobium
(jacarandá
-
do
-cerrado) é uma madeira de boa q
ualidade,
assim como o jacarandá-
da
-Bahia, porém é pouco utilizada devido à tortu
osidade
de seu tronco. Também conhecida por sua importância econômica, sua madeira é
usada em construções de casas e cercas, fabricação de instrumentos e carvão.
Os frutos secos são usados para compor arranjos artesanais de flores secas.
Possui grande potencial para a ornamentação devido à presença de algumas
características, como a folhagem verde-azulada. A casca libera um corante
utilizado para tingir o algodão empregado em
tecelagem (Almeida, 1998).
2.
3.
Vicariância
No estudo da distribuição dos seres vivos verifica-se, frequentemente, que
alguns taxa muito similares entre si, originários de um mesmo ancestral,
ocupam áreas contínuas e ecologicamente distintas, como, por exemplo, o
Cerrado e a Mata Atlântica (Rizzini, 1971; Amorim, 2002). Este conceito
ecológico de vicariância é o mais usual e os taxa envolvidos levam o nome de
vicariantes (o que substitui; do latim
vicarius
, substituto), ou pares vicarian
tes,
quand
o se quer fazer referê
ncias dois-a-
dois (Pereira, 1990).
6
Entretanto, há sérias dificuldades que tornam problemática a inferência do
tipo de processo que tenha gerado o padrão de distribuição de espécies tidas
como vicariantes. A escassez de dados fósseis faz com que estudos históricos
sobre vicariância sejam feitos com base em informações contemporâneas.
Talvez este seja o principal motivo pelo qual a vicariância ainda seja um tema
muito polêmico entre os pesquisadores da área.
Rizzini (1963) apresentou uma lista de 35 espécies vicariantes lenhosas de
Mata e Cerrado e sugeriu que as espécies da Mata evoluíram in loco para as
de Cerrado. A existência de tantos pares vicariantes sugere uma coexistência
antiga entre os dois tipos contrastantes de formação, Cerrado e Mata
(Labouriau,
1966). Estas idéias
são
também
compartilhadas
por
Gottlieb.
(196
4) que verificaram, por meio de análise da compo
sição
químic
a,
a estreita
relação entre diversos pares vicariantes, como por exemplo, D. nigra e
D.
miscolobium
.
2.
4.
Filogenia Molecular
A noção acerca da evolução de que todos os seres vivos partilham um
ancestral comum e que a estrutura dos organismos de hoje traz gravada em si
parte de sua história evolutiva, tem estimulado o estudo das relações de
pare
ntesco entre os organismos. Desta forma, quando propomos a existência
de conexões entre as espécies, ou seja, a existência de uma filogenia,
passamos de um modelo estático para um modelo onde tanto as espécies
quanto suas características são conectadas historicamente (Amorim, 2002).
Assim, poderíamos definir filogenia como uma suposta reconstrução da história
evolutiva de um grupo, indicando os vários níveis nas relações de
ancestralidade das espécies com suas espécies descendentes (Miyaki et al.,
2001; Amo
rim, 2002).
A análise filogenética fornece um referencial evolutivo que permite uma
maior eficiência no uso do conhecimento sobre as espécies e seus habitats,
facilitando o gerenciamento do conhecimento biológico (Miyaki et al., 2001).
Quando todo o conhecimento biológico sobre a vida é organizado ao redor de
uma classificação filogenética, o armazenamento dessas informações torna-
se
mais eficiente e, conseqüentemente, facilita a recuperação dessas informações
7
pelos cientistas e pela própria sociedade interessada (Amorim, 2002). Enfim,
por meio da análise filogenética, podem-se compreender os processos
evolutivos como a especiação, extinção, adaptação e, dessa forma, inferir a
história da evolução
.
Estudos recentes confirmam dados anteriores a respeito da f
ilogenia
de
Leguminosae, indicando seu monofiletismo, sendo esta família pertencente à
ordem Fabales juntamente com Polygalaceae, Surianaceae e Quillajaceae
(Doyle et al., 2000; APG II, 2003; Doyle & Luckow, 2003; Wojciechowski et al.,
2004; Soltis et al., 2005). Análises filogenéticas baseadas em dados
morfológicos e moleculares
indicam
que Faboideae e Mimosoideae são
monofiléticas (Doyle, 1995; Doyle et al., 2000; Kajita et al., 2001; Lavin et al.,
2001; Wojciechowski, 2003).
A tribo Dalbergiaeae, com exceção de Andira, Hymenolobium, Vatairea e
Vataireopsis
, pertence a um grupo monofilético pantropical de leguminosas da
subfamília Papilionoidea, designado dalbergióides. Esse grupo ainda inclui
todos os gêneros previamente referidos para as tribos Aeschynomene e
Adesmieae e a subtribo Bryinae da Desmodieae. Esse grupo foi detectado a
partir de análises filogenéticas de seqüências de DNA de cloroplasto e do RNA
ribossomal 5,8 S. Todos os d
albergió
ides são membros de um dos seguintes
subclados:
Adesmia, Dalber
gia
e Pterocarpus. O clado dalbergióide e seus três
subclados são crípticos, no sentido de que eles são geneticamente distintos,
mas pobremente distinguidos por dados não-moleculares. Caracteres
taxonômicos tradicionalmente importantes como hábitos arbóreos, estames
livres e vagens leguminosas, não fornecem suporte para o estabelecimento dos
clados, que são mais apropriadamente identificados por análises moleculares
(Lavin et al., 2001).
Análises moleculares de leguminosas revelam o grupo Papilonoideae como
monofilético e sugerem que ele divergiu de outras leguminosas
entre
40 a 50
milhões de anos atrás. Essas mesmas análises dão suporte à existência de
quatro grupos maiores de papilionóides, que contêm importantes espécies
domesticadas e/ou espécies modelo, mas as relações filogenéticas entre
alguns desses grupos não estão bem esclarecidas. O clado aeschynomenóide/
dalbergióide é um grupo diverso que inclui o amendoim e outros gêneros
8
herbáceos, mas também plantas lenhosas como o jacarandá-
da
-Bahia (Doyle
&
Luckow, 2003).
Diversas abordagens para inferir as relações filogenéticas foram sendo
desenvolvidas ao longo do século XX, resultando em controvérsias a respeito
de tais relações, dos métodos e tipos de dados utilizados para
inseri
-
las
(Amorim, 1997, 2002). Tradicionalmente, a identificação de espécies tem sido
feita com base em características morfológicas, como morfologia floral, cor da
flor, e características agronômicas. Porém, dados genéticos têm se mostrado
bastante úteis na identificação e classificação de espécies. Atualmente as
análises de macromoléculas, em especial do DNA, vêm sendo amplamente
utilizadas para este fim, caracterizando uma linha de pesquisa denominada
sistemática molecular. Além disso, os d
ados
relativos à análise do DNA são
gerad
os de forma rápida e em grande quantidade devido aos avanços
tecnológicos na área de biologia molecular (Judd et al., 1999; Matioli & Passos-
Bueno, 2001).
Muitos estudos sobre sistemática e evolução têm revelado a forte
tendência do uso de análises de seqüências de genes para a reconstrução de
árvores filogenéticas. Em plantas com flores, genes de cloroplastos têm sido
muito utilizados para este
fim
(Doyle
&
Luckow, 2003).
Os dados moleculares associados às novas ferramentas de análise têm
contribuído acentuadamente nas mais diversas pesquisas, envolvendo estudos
sobre irradiações adaptativas (Givnish, 2001), história da diferenciação
geográfica entre espécies (Schaal & Olsen, 2001), fluxo gênico e variabilidade
genética entre populações (Cain et al., 2000), impactos da hibridação e
poliploidia sobre a especiação, adaptação, expressão gênica e evolução
cromossômica (Rieserberg et al., 1996). Essas informações moleculares têm
sido extensivamente utilizadas tanto para esclarecer quanto
confirmar
ou
questionar
relações filogenéticas
já
propostas.
Adicionalmente, podemos inferir que a constante busca por filogenias
precisas supera o ideal puramente descritivo. Assim, a origem das adaptações
morfológicas pode ser inserida em um contexto filogenético na reconstruç
ão
segura das mudanças moleculares que originaram novas estruturas Clegg et
al.
(1994), ou ainda, dos genes de desenvolvimento, usados como marcadores
9
filogenéticos para elucidar a diversidade morfológica de algumas estruturas
(Beckert
& Theiben, 2003
; Kau
fmann et al., 2005).
2.
4
.1
.
Genomas mitocondrial e cloroplastídico
A célula vegetal possui genomas de origem nuclear, mitocondrial (DNAmt)
e cloroplastídico (DNAcp), cada um com características que definem sua
utilidade para resolver questões evolutiva
s
em
diferentes níveis (Stebbins,
1950; Walbot & Cullis, 1985; Nahum, 2001). O DNAmt e o DNAcp diferem
grandemente em relação ao genoma nuclear, no tamanho e número de genes
e, principalmente, nas taxas e nos padrões de evolução (Nahum, 2001). O
s
genes
mi
toc
ondriais
e cloroplast
ídic
os são herdados de uma maneira não-
Mendeliana em todos os organismos estudados, e a herança dos genomas
citoplasmáticos é freqüentemente materna, mas existem numerosas exceções
que resultam em diferentes graus de herança paterna ou biparental do DNAcp
e DNAmt
(
Birky
,
1995,
2001),
A maior parte das informações genéticas das células vegetais está
localizada no núcleo. Contudo, o estudo do genoma nuclear
em
angiospermas,
traz
algumas dificuldades por causa
do
grande tamanho e comple
xidade
do
genoma
, com extensas regiões não-
codificantes.
Os genomas de plantas com
flores
estão entre os maiores entre os organismos vivos (Bennett et al., 2000).
O grande tamanho desses genomas, em parte, deve-se à origem poliplóide de
muitas espécies veg
etais
. Adicionalmente, alguns autores têm proposto que
cerca de 30-80% de todas as espécies de plantas podem ter sido originadas
por eventos de hibridação (Grant, 1971; Stace, 1987; Whitham et al., 1999), o
que torna mais complexo o estudo evolutivo de alg
uns grupos.
O genoma do cloroplasto corresponde a uma molécula de DNA circular,
podendo variar de 120 a 220 kb (Nahum, 2001; Borém & Vieira, 2005). O DNA
cloroplastídico (cpDNA) geralmente apresenta duas regiões simples, uma
grande (LSC, large single copy) e uma pequena (SSC, small single copy), com
aproximadamente 134-160 kb e 80-87 kb, respectivamente. Além disso
,
são
encontradas
regiões repetidas invertidas (IR, inverted repeats), formadas por
dois segmentos idênticos em sentidos opostos, separando a SSC da LSC
(Doyle, 1995; Nahum, 2001). As regiões IR podem apresentar um tamanho
10
variável, de 12 a 25 kb cada, porém algumas linhagens, nas leguminosas,
perd
eram
estas regiões (Doyle, 1995; Palmer
&
Delwiche, 1998).
O cpDNA vem sendo bastante empregado em estudos de filogenia por
causa de sua estabilidade estrutural, seu padrão de herança e sua elevada
taxa de mutação. Nos últimos anos, ocorreu grande aumento no número de
publicações sobre filogenia molecular, nos diferentes níveis taxonômicos,
construídas a partir do cpDNA ou em
associação
com o mesmo (Chase et al.,
1993; Doyle et al., 2000; Bruneau et al., 2001; Brouat et al., 2001; Doyle &
Luckow, 2003; Herendeen et al., 2003; Luckow et al., 2003; Simpson et al.,
2003; Wojciechowski, 2003; Mcmahon & Hufford, 2004; Wojciechowski et al.,
2004; Haston et al., 2005; Salamin et al., 2005).
Dentre as regiões plastidiais não codificadoras
melhor
estudadas no grupo
das angiospermas, nas análises filogenéticas, encontram-se o espaçador
intergênico
trn
L-
trn
F e o
íntr
on
trn
L (Mes et al., 2000; Holt et
al.
, 2004; Lledó
et
al., 2005) (Figura 1). Essas regiões têm sido amplamente utilizadas nas
análises filogenéticas nos mais variados níveis taxonômicos (Mes et al., 2000;
Bruneau et al., 2001; Muschner et al., 2003; Lee & Wen, 200
4;
Haston et al.,
2005).
Entretanto, o uso de regiões não-
codifica
doras
é muito discutido por alguns
autores. Segundo Golenberg et al. (1993), algumas seqüências não-
codificadoras
contêm mais
indels
(inserções ou deleções) do que substituições,
não devendo ser tratados como caracteres informativos. Kelchner (2000), por
outro lado, considera que apesar de
os
indels
dificultar
em
o alinhamento das
seqüências e a determinação das homologias, esses trechos contêm
informações filogenéticas importantes e
que devem ser incluídas nas análises.
trnT
trnL 5’
trnL 3’
trnF
B
trnL 5’-for
E
trnL 3’-for
D
trnL 3’-bac
F
trnF-bac
CA
11
Figura 1. Representação da região cloroplastídica
trn
L e
trn
L-F (Taberlet et al.,
1991). Os quadrados representam regiões codifica
doras
.
A mitocôndria em células
vegeta
is
, semelhantemente ao cloroplasto,
apresenta seu material genético na forma de DNA circular. Contudo,
a
amplitude de tamanho do genoma mitocondrial em diferentes espécies é
bastante grande,
pode
ndo
varia
r de 6 a 2000 kb (Judd et al., 1999; Nahum,
2001). Pode-se destacar que o genoma mitocondrial (DNAmt) apresenta um
alto dinamismo em algumas espécies com variações no tamanho, porém, seu
material genético é muito conservado (Eguiarte et al., 2003). Adicionalmente,
Muse (2000) verificou que as taxas de substituição são
acentuadamente baixas
em genes mitocondriais das plantas. Segundo Palmer & Herbon (1988), a
pouca utilização do DNAmt nas análises filogenéticas de plantas pode estar
relacionada ao alto grau de recombinação intra-molecular encontrado na
maioria das espécies estudadas, dificultando o estudo de grandes regiões de
seu genoma.
Segundo Palmer (1992), o DNAmt de plantas tem sido pouco aplicado em
estudos filogenéticos por causa das características da estrutura e
baixa
taxa de
mutação desse genoma. Entretanto, nos últimos anos tem crescido o interesse
na inclusão do genoma mitocondrial nos estudos filogenéticos. Alguns
trabalhos abrangendo regiões intrônicas e espaçadoras têm mostrado
o
potencial
dessas seqüências para uso na sistemática molecular (Freudenstein
& Chase, 2001; Duminil et al., 2002; Dombrovska & Qiu, 2004). Uma das
primeira
s regiões investigadas
para
uso
no estudo de filogenia foi o gene
que
codifica
a NADH desidrogenase, principalmente os fragmentos
correspondentes às subunidades I (Wissinger et al., 1991) e II (Demesure
et
al., 1995).
Chen
& Sun (1998), em seus estudos baseados no DNAmt,
encontraram variações compatíveis à de algumas regiões cloroplastídicas e
nucleares. Destaca-se ainda que outras regiões desse genoma podem conter
informações filo
genéticas muito úteis, principalmente aquelas relacionadas com
os eventos de inserção e deleção (Freudenstein
&
Chase, 2001).
12
2.
4
.2
.
Ferramentas de análise de dados moleculares
Assim como a natureza dos dados moleculares é bastante diversa daque
la
das características morfológicas, os métodos de análise filogenética utilizando
seqüências também tiveram de ser adaptados a partir dos métodos
tradicionais, e novas abordagens foram criadas. Na análise de dados
moleculares para a inferência filogenética têm sido mais comumente utilizadas
quatro abordagens: métodos baseados em análise de distância, máxima
parcimônia, máxima verossimilhança e análise bayesiana (Felsenstein, 1988;
Swofford et al., 1996; Huelsenbeck et al., 2001). Na reconstrução por esses
métodos estão associadas a estimativa da topologia e a estimativa do valor do
comprimento de cada ramo, a fim de gerar uma árvore que represente uma
inferência estatística da árvore verdadeira (Nei
&
Kumar, 2000).
O método de agrupamento de vizinhos ou
ne
ighbor
-
joining
(
NJ
) (
Saitou
&
Nei, 1987) é uma simplificação do método de evolução mínima (Nei & Kumar,
2000), o qual se baseia no cálculo das distâncias evolutivas (Graur & Li, 2000)
para todos os pares de indivíduos e reconstrução de uma árvore que leva
em
consideração as relações entre todas as distâncias (Russo, 2001; Schneider
,
2001
). No caso de NJ, a metodologia não busca examinar todas as possíveis
topologias, mas aquelas que produzem uma árvore refletindo a organização
seqüencial de vizinhos e minimizem seu comprimento total (Schneider, 2001
).
Trata
-se de um método rápido, apropriado para grandes conjuntos de dados,
permitindo linhagens com diferentes tamanhos de ramos e substituições
múltiplas, no entanto, ele mostra apenas uma topologia possível (N
ei
& Kumar,
2000).
O método NJ requer uma menor capacidade computacional podendo
levar a conclusões similares àquelas obtidas por métodos que requerem maior
tempo
de cálculo, como Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança (Nei et
al., 1998).
A Máxima Parcimônia (MP) (Henning, 1966; Eck & Dayhoff, 1967) é um
método muito simples, baseado na mudança do estado dos caracteres (Graur
&
Li, 2000). Fundamenta-se na hipótese de que a via menos complicada é a
mais provável, minimizando o número de etapas evolucionárias necessárias
para explicar um determinado evento. Segundo Schneider (2001), o método é
baseado na premissa de que a árvore mais provável explicaria todas as
13
variações encontradas requerendo o menor número de mudanças. Ainda sobre
a MP, Miyaki et al. (2001) descrevem que este método baseia-se em um
modelo evolutivo no qual uma mudança é mais provável do que duas, tratando
as substituições independentemente. Essa metodologia procura todas as
topologias de árvores possíveis, em busca da árvore mínima ótima. Apesar de
fazer análises de diferentes topologias, MP é um método que requer grande
tempo de comparação, o tamanho dos ramos não é informativo e utiliza-
se
apenas sítios informativos (
Nei & Kumar, 2000
).
Ao contrário da MP, o método de Máxima Verossimilhança (MV) (
Cavalli
-
Sforza
& Edwards, 1967; Felsenstein, 1981) baseia-se em testar hipóteses ou
modelos evolutivos, considerando todos os sítios indistintamente, observando
qual topologia obtida é a mais adequada ao modelo utilizado (Pereira et al.,
2001;
Nei & Kumar, 2000; Schneider, 2001). Essa metodologia apresenta
menor variância em comparação com outros métodos, tendendo a ser robusta
ao assumir o modelo evolutivo, sendo caracterizada ainda por uma boa base
estatística. Contudo, devido ao seu grande consumo de memória
computacional
, trata-se de um método moroso quando utilizado na análise com
grandes bancos de dados (Nei
&
Kumar, 2000).
14
3. MATERIAL E MÉTODO
S
3.1
.
Material vegetal
Amostras de folhas de 35 plantas de diferentes espécies de
Dalbergia
L.F.
foram coletadas nas regiões de Mata Atlântica, Cerrado e Caatinga, nos
Estados da Bahia e de Minas Gerais (Tabela 1 e Figura 2). As espécies
D.
nigra
e
D. miscolobium foram escolhidas com base na hipótese de vicariância
entre elas
(Rizzini, 1963) e, principalmente, porque
D. nigra
encontra
-
se na lista
de espécies ameaçadas de extinção da flora da Mata Atlântica (IBAMA, 1992;
Varty, 1998). Essas localidades foram escolhidas porque figuram nos herbários
do Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC) e da Universidade Estadual de
Santa Cruz (UESC) como locais de ocorrência dessas espécies. Os materiais
testemunhas dessas espécies encontram-se depositados nos Herbários da
UESC (HUESC) e da UFV (VIC), sob os seguintes números: HUESC 11042
(
D.
ni
gra
);
HUESC 11713 (D. miscolobium
);
HUESC 11043 (D. decipulares
);
HUESC 11391
(
D. ecastaphyllum
);
VIC 4441
(
D. glaucescens
).
Tabela 1.
Indivíduos de
Dalbergia
utilizados neste trabalho.
Planta
Espécie
Local de coleta
Vegetação
1 a 5
D. nigra
Viçosa (MG
)
Mata Atlântica
6 a 11
D. nigra
Ilhéus (BA)
Mata Atlântica
12 a 16
D. miscolobium
Paraopeba (MG)
Cerrado
17 a 22
D. miscolobium
Caetité (BA)
Cerrado
23 a 28
D. decipulares
Jacobina (BA)
Caatinga
29 a 34
D. ecastaphyllum
Ilhéus (BA)
Restinga
35
D. g
laucescens
Abaíra (BA)
Caatinga
15
Figura
2.
Áreas de coleta de espécies de
Dalbergia
nos estados da Bahia e
Minas Gerais. Números represe
ntam:
1,
Ilhéus;
2, Jacobina
;
3,
Abaíra
;
4,
Caetité
;
5,
Paraopeba;
6,
Viçosa.
As amostras de folhas foram acondicionadas em sílica-gel entre o período
de coleta e extração de DNA. Foram incluídas, nas análises, seqüências
obtidas no Genbank referentes às espécies Andira inermis e
Macherium
sp.,
utilizadas na polarização das árvores. A espécie Andira inermis foi selecionada
como grupo externo e
Macherium
sp. como grupo irmão com base na literatura
(Lavin et al., 2001).
3.2.
Extração do DNA
O DNA genômico total foi extraído do tecido foliar, das amostras de folhas
acondicionadas em síli
ca
-gel, pelo método do CTAB de acordo com a
metodologia descrita por Doyle & Doyle (1990), modificada por Grattapaglia
&
Sederoff (1994), Corrêa et al. (1999) e Almeida et al. (2001).
16
As folhas foram
pulverizadas
em tubos do tipo Eppendorf (2 mL) na
presen
ça de nitrogênio líquido e com auxílio de uma “chave estrela” adaptada
para esse fim. Posterior
mente
à
pulverização
, foram adicionados 700 µL de
tampão de extração CTAB 2% às amostras, as quais foram
agitad
as no vórtex
e incubadas em banho-
maria
a
65
°C po
r
30 a 40 min
utos
, sendo vertidas
suavemente a cada 10 minutos.
A purificação dos ácidos nucléicos iniciou-se com a eliminação das
proteínas, adicionando-se 700 µL de clorofórmio-alcool isoamílico (24:1) em
cada amostra, sendo por 5 minutos agitadas suavemente por inversões. Em
seguida foram centrifugadas por 10 minutos a 14.000 g, sendo a fase superior,
contendo o DNA,
transferida para um novo tubo.
Posteriormente,
foi feita a precipitação dos ácidos nucléicos pela adição de
isopropanol gelado (4°
C)
ao
n
ovo
tubo na proporção de 1:1
(sobrenadante:isopropanol), o qual, após suave agitação foi incubado por 30
min a -20 °C. Em seguida, os materiais foram centrifugados a 14.000g por 10
min a 4 °C, formando-se ao final um precipitado esbranquiçado. A fase aquos
a
foi descartada e o precipitado foi lavado duas vezes com etanol 70% e uma vez
com etanol 95%, sendo seco à temperatura ambiente. Por fim, o precipitado foi
ressuspenso em 70 µL de TE
-
RNAase (Tris
-
HCl 10
m
M, pH 8,0 / EDTA
1 m
M
+
RNAase
A
10 µg/mL) e incub
a
do em banho
-
maria por 30 min
a 37
°
C.
Após a extração, a avaliação da qualidade e a estimativa da concentração
do DNA foram realizadas por meio
de eletroforese em
gel de agarose 1%.
Após
quantificação, o DNA obtido foi diluído para a concentração de 10 ng/
µL,
sendo
, então,
armazenado
a
-
20
°C.
3.3.
Amplificação
do DNA
Amostras de DNA de cada uma das cinco espécies (Tabela 1) foram
amplificadas pela técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) em
termociclador
GeneAmp PCR System 9700 da
PerkinElmer
. Os
prim
ers
trnL
(Tabela 2) e o programa de amplificação dos fragmentos foram aqueles
recomendados
por
Taberlet et al. (1991) e Gielly & Taberlet (1994), alterando-
se a temperatura de “anelamento” para 52,3ºC. Os produtos de amplificação
foram analisados por el
et
roforese em gel de agarose 1%
.
17
Tabela
2- Seqüências dos
prim
ers
utilizados no estudo das espécies de
Dalbergia
Primer
Seqüência
Sentido
trn
L-c
5’ CGAAATCGGTAGACGCTACG 3’
Forward
trn
L-d
5’ GGGGATAGAGGGACTTGAAC 3’
Reverse
3.4. P
urificação dos produto
s
de
PCR
A purificação dos produtos
de
PCR foi realizada pela adição das enzimas
exonuclease (EXO1) e fosfatase alcalina (SAP
–
Shri
m
p Alkaline
p
hosphatase
).
A primeira degrada o excesso de
primer
fita
simples e a segunda, os
nucleotídeos não incor
porados. Para purificação
de
produto
s
de
PCR
em
12 µL
de mistura de reação, de foram utilizados 0,66 µL de exonuclease, 0,66 µL de
fosfatase alcalina
e
0,68 µL de H
2
O
ultrapura
autoclavada. As amostras foram
incubadas
no termociclador por 30 min a 37 °C e 15 min a 80 °C, essa última
etapa
visa à inativação das enzimas.
3.5. Seqüenciamento dos
produtos de PCR
Os produtos de PCR purificados foram seqüenciados utilizando o kit de
seqüenciamento
“DYEnamic
TM
ET Terminator Sequencing Premix”
(MegaBace
TM
) (Amersham Pharmacia Biotech. Inc). Para os seis indivíduos
analisados de cada
espécie
foram feitas seis repetições de cada amostra,
sendo três oriundas do
primer
foward
e três do
reverse
. Nas reações, cada
primer
(sentido R e F) foi colocado separadamente. As reações seguiram as
recomendações do fabricante com as seguintes modificações: 1,5 µL de DNA
purificado, 0,5 µL de
primer
, 1 µL de H
2
O
ultrapura
autoclavada e 2 µL de Mix
(integrante do kit).
No termociclador, a reação passou por 40 ciclos de ampl
ificação,
apresentando três etapas, a primeira a uma temperatura de 95 °C por 10 s, a
segunda a 53 °C ou 52,3 °C (dependendo do
primer
) por 15 s e a terceira a 60
°C por 100 s. As temperaturas utilizadas para os
primers
nessa reação são as
18
mesmas da reação de amplificação. Posteriormente, os produtos provenientes
dessa amplificação foram sequenciados no seqüenciador MegaBace DNA
Analysis System 1000 (Amersham & Life Science).
3.6.
Análises filogenéticas
As seqüências foram alinhadas com auxílio do programa ClustalW,
implementado no programa BioEdit (Hall, 1999), seguido de ajustes manuais
quando necessários. Ressalta-se que a seqüência
final
de cada indivíduo foi
resultado da análise de seis seqüências, sendo três oriundas do
primer
fo
r
ward
e três do
reve
rse
.
De
posse da matriz, construiu-se uma árvore utilizando o agrupamento de
vizinhos (NJ –
neighbor
-
joining
) (Saitou & Nei, 1987), baseado no modelo de
Jukes
& Cantor (1969), no programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis), versão 1.02 (Kumar et al., 1993). Adicionalmente, procedeu-se à
análise filogenética, feita pelo método da máxima parcimônia implementado no
programa MEGA (Hall, 1999).
19
4. RESULTADOS
Foram obtidos produtos de amplificação e seqüências do
íntron
trn
L
para
todos os indivíduos de
Dalbergia
analisados. A partir do alinhamento múltiplo
das seqüências provenientes dessa região, foi produzida uma matriz com 530
caracteres. Os comprimentos dos fragmentos seqüenciados entre as espécies
de
Dalbergia
estudadas v
ariaram
de 506 a 513 pb.
O conteúdo A-T teve pequena variação entre as espécies estudadas tendo
encontrado 65,8% em D. decipularis, 66,7% em D. ecastaphyllum, 67,3% em
D. glaucescens
, 66,6% em
D.
miscolobium
(Bahia) e 66,4% em D. miscolobium
(Minas Gerais), 66,7% em D. nigra. Os diferentes tratamentos para os
indels
nas análises demonstraram que eles não influenciaram na topologia dos
dendrogramas nem nos resultados do estudo.
Após a exclusão dos caracteres invariáveis, foram obtidos 75 sítios
variáveis dos quais 37 foram informativos para
a
análise de parcimônia. O
índice de divergência entre as seqüências oriundas das espécies de
Dalbergia
variou de 1,2% a 6,9%. Entretanto, entre D. nigra e D. miscolobium, espécies
consideradas vicariantes, esse índice de divergência foi de 3%, sendo igual ou
superior ao de outras espécies bem definidas dentre as
Dalbergia
analisadas
neste
trabalho
.
As
análises
indicam
a existência de variações intra e inter-
populacionais
em D. miscolobium, no entanto, há a necessidade de um estudo
mais específico para uma inferência mais segura
a esse respeito
.
As análises filogenéticas utilizando os métodos de
neighbor
-
joining
e
máxima parcimônia produziram resultados similares entre si (Figuras 3 e 4). A
divergência genética estimada por
neighbor
-
joining
reproduz claramente a
distância genética entre D. nigra e D. miscolobium (Figura 3). O cladograma,
consenso estrito (Figura 4), construído com base na máxima parcimônia,
apresenta uma topologia com clados bem definidos, agrupando os indiví
duos
de mesma espécie. Os clados que representam D. nigra e D. miscolobium
estão separados, indicando que essas espécies não são vicariantes.
Adicionalmente, novas hipóteses podem ser inferidas, como a relação entre
D.
nigra
e D. ecastaphyllum, as quais formaram um clado bem suportado
caracterizando uma estreita relação entre estas duas espécies. Um clado
20
exclusivo de D. miscolobium foi obtido, indicando a separação dos indivíduos
oriundos dos estados da Bahia e de Minas Gerais.
Figura
3.
Árvore
representativa da dissimilaridade genética entre indivíduos de
Dalbergia
,
obtida
pelo método de agrupamento de vizinhos
.
Os
números ao longo dos ramos representam os valores de
bootstrap
calculados em 10,000 replicações. (
Dalberg
ia decipulares (DD);
Dalbergia nigra Bahia e Minas Gerais (DN BA e DN MG);
Dalbergia
miscolobium
Bahia e Minas Gerais (DM BA e DM MG);
Dalbergia
ecastaphyllum
(DE);
Dalbergia glaucescens
(
D
G)
.
21
Figura
4. Árvore de consenso estrito das 399 árvores mais parcimoniosas das
seqüências do
íntron
trn
L para as espécies de
Dalbergia
, incluindo os
indels. Os números ao longo dos ramos representam os valores de
bootstrap
calculados em 10,000 replicações (CI = 0,91; RI = 0,96).
Dalbergia decipulares
(DD);
Dalbergia nigra
Bahia e Minas Gerais (DN
BA e DN MG);
Dalbergia miscolobium
Bahia e Minas Gerais (DM BA e
DM MG);
Dalbergia ecastaphyllum (DE);
Dalbergia glaucescens
(
D
G)
.
22
5
.
DISCUSSÃO
Os comprimentos dos fragmentos de DNA obtidos com os
primers
selecionados para a região do íntron
trn
L, para as espécies de
Dalbergia
apresentaram similaridade aos observados em outras Leguminosae (Taberlet
et al., 1991). A riqueza do conteúdo A-T observado nas sequências analisadas
neste
trabalho é reflexo da região do cloroplasto selecionada, uma vez que
seqüências não
-
codificantes tendem a
ser mais ricas em A
-T
.
Os
dados
obtidos
foram
similar
es
a estudos anteriores que abordaram regiões de
íntron
, onde o
conteúdo A-T foi superior ao G-C (P
al
mer, 1991; Small et al., 1998). A
presença de
indels
nos dados oriundos do
trn
L em
Dalbergia
também era
esperada pois, segundo Golenberg et al. (1993); Gielly
&
Taberl
et (1994) e
Small et al. (1998) seqüências não-codificantes geralmente acumulam
indels
e
substituições nucleotídicas em taxas mais elevadas que regiões codificantes.
Rizzini (1963) estudou 45 pares de espécies vicariantes na flora do
cerrado, incluindo
D. nigra
e
D. miscolobium
.
Segundo esse autor,
tal vicariância
indicaria que a flora arbórea do Cerrado evoluiu in loco a partir de outras floras
silvestres, porém, mais úmidas. Apesar da hipótese de vicariância entre essas
duas espécies ter sido corroborada por Gottlieb (1964), persistem lacunas
acerca da sistemática dessas espécies. Carvalho (1997) redefiniu o gênero
Dalbergia
em cinco seções que podem ser sistematizadas por meio das
características da inflorescência e do fruto. A seção
Dalbergia
(D. nigra, D.
miscolobium, D. foliolosa, D. glaucescens e D. acuta) é caracterizada por sua
inflores
cência do tipo panícula, fruto oblongo e nervura reticulada. Apesar da clara
relação taxonômica entre D. nigra e D. miscolobium, sendo posicionadas em uma
mesma seção, Carvalho (1997) não tratou estas duas espécies como vicariantes.
Assim, pode-se inferir que as informações fornecidas pelos trabalhos de
quimiotaxonomia e morfologia nem sempre são satisfatórias para a reconstrução
das relações filogenéticas uma vez que persistem discordâncias na sistemática
das espécies.
Os processos e o tempo evolutivo ne
cessários para o surgimento de novas
espécies não são facilmente definidos. No entanto, a aplicação de técnicas
moleculares tem ajudado na identificação das taxas de especiação e
no
modo
23
pelo qual os fatores ecológicos, geográficos, e temporais influenciaram nessas
taxas de especiação no tempo (
W
ojciechowsk
et al., 2004).
Uma possível explicação para a existência de espécies de difícil distinção
morfológica, como D. nigra e D. miscolobium, poderia incluir processos
de
radiação recente. Essas espécies ocorrem na Bahia, região que sofreu grande
influência na formação de sua flora pelos ciclos de glaciação do quaternário,
período em que as Leguminosae já eram proeminentes na flora da Bahia (Lima et
al. 2002).
Segundo a hipótese do ''modelo glacial cíclico'', instabilidades recentes
no clima conduziram a expansões e retrações das florestas tropicais e
especiação alopátrica por diferenciação das populações em refúgios
separados. Ainda, os mesmos autores, no estudo das relações filogenéticas
entre espécies de
Ing
a, sugeriram que houve recente diversificação do gênero
associada
aos ciclos glaciais quaternários.
Na presente análise, baseada na sequência da região do íntron
trn
L,
foi
encontra
da
acentuada divergência genética entre D. nigra e D. miscolobium
.
Distância
s similares ou inferiores foram observadas entre as outras espécies bem
definidas de
Dalbergia
inclusas no estudo. Assim, essa divergência em níveis
moleculares sugere a presença de táxons distintos (Figura
3
).
Corroborando e proporcionando uma maior
confi
abilidade
, a filogenia
baseada no
íntron
trn
L acerca das relações entre D. nigra e D. miscolobium foi
consistente com as evidências morfológicas descritas por Carvalho (1997). Nesse
sentido, o cladograma de consenso estrito (Figura 4) ratifica que tratam-s
e
de
espécies distintas, uma vez que foram agrupados os indivíduos de mesma
espécie em clados, assim como,
os
clados
foram
form
ados
com alto suporte para
as respectivas espécies. Em nenhuma das análises realizadas nesse estudo foi
verificado algum posicionamento dos indivíduos inclusos na análise que indicasse
vicariância.
A inclusão dos
indels
em análises de parcimônia, em outros estudos,
caracterizou essa região como uma ferramenta interessante e eficiente,
contribuindo na melhor resolução dos cladogramas (Lee
&
Wen, 2004) no estudo
do gênero
Panax
, bem como Haston et al. (2005) no estudo do grupo
Peltophorum
- Caesalpinioideae. No entanto, no presente estudo, a inclusão dos
indels na análise de parcimônia não alterou os
resultados
, nem ofereceu uma
24
melhor
resolução, indicando, serem desnecessárias mudanças na atribuição de
peso dessas regiões.
Adicionalmente, os táxons restantes incluídos na presente análise
possibilitaram testar as relações entre espécies de pelo menos três das cinco
seções de
Dalbergia
.
Uma discussão mais detalhada das seções pode ser
encontrada em Carvalho (1997). Não obstante, é interessante notar a hipótese
alternativa da relação entre D. nigra
e
D. ecastaphyllum, uma vez que em
trabalhos baseados em morfologia essas espécies pertencem a distintas seções
(Carvalho, 1997). Anteriormente havia sido proposta a existência de um padrão
evolutivo em
Dalbergia
como base em morfologia comparativa (Carvalho, 1989).
Contudo, um clado bem
fundamentado,
com base nas seqüências do
íntron
trnL
,
inclu
iu essas duas espécies (Figura 4). Talvez, essa informação obtida
no
presente estudo
seja reflexo do baixo número de táxons envolvidos na análise. No
entanto, isso indica a necessidade de mais estudos a cerca do gênero
Dalbergia
,
e talvez,
uma revisão das
seções existentes.
Os
resultados do presente trabalho, indicaram a existência de acentuadas
variações genéticas nas populações de D. miscolobium da Bahia e de Minas
Gerais. Essas variações encontradas entre as populações podem estar ligadas a
fragmentação
do bioma o que provoca a diminuição do número de indivíduos de
uma população, favorecendo à perda de variação genética. A população
remanescente passa a ter um tamanho menor que o mínimo adequado para que
ela possa ter sua continuidade normal e evolução. Nessa pequena população
pode ocorrer, em curto prazo, deriva genética, o que significa que as freqüências
de seus genes irão diferir daquelas da população original, inclusive chegando à
perda de alelos. A longo prazo, pode ainda haver um aumento da endogami
a,
decorrente da maior probabilidade de autofecundação e cruzamentos entre
indivíduos aparentados (Kageyama,1998). Esses dados podem estar indicando a
formação de subespécies ou espécies dentro de D. miscolobium, sugerindo um
estudo mais detalhado a cerca
da evolução desse grupo.
No presente estudo, utilizando
ferramenta
s moleculares, foi possível
confirmar as observações feitas por Carvalho (1997), com base em caracteres
morfológicos
.
Ambos os estudos
negam a
hipótese de vicariância entre
D. nigra
e
D. miscolobium
. Nossos dados confirmam a utilidade do íntron
trn
L no estudo
inter
-específico de
Dalbergia.
Estudos moleculares com outra região genômica
25
estão em desenvolvimento em nosso laboratório. Caso os resultados dessas
análises reafirmem os resultados aqui obtidos, teremos demonstrado de modo
mais contundente que D. nigra e D. miscolobium são espécies distintas e não
vicariantes.
26
6. CONCLUS
ÃO
A região do íntron
trn
L de cloroplasto pode ser utilizada para auxiliar nas
soluçõ
es ligadas às questões filogenéticas espécies vegetais próximas
como
D. nigra
e
D. miscolobium
.
A análise da sequência da região
trn
L
nega a hipótese inicial que as
espécies
D. nigra e D. miscolobium são vicari
antes,
indicando o tratamento
destas como esp
écies distintas.
Os dendrogramas obtidos com base na análise das seqüências da região
trn
L apresentam topologias consistentes.
Estudos adicionais envolvendo outras regiões do genoma devem ser
conduzidos para confirmar os resultados aqui obtidos.
27
7
.
REFERÊNCIAS BIBLIOGR
ÁFICAS
ALMEIDA, C.A.S.; BONVICINO, C.R.; LACHTERMACHER, M.; MOREIRA,
M.A.M.; OLÍCIO, R.; SEUÁNEZ, H.N. Técnicas de avaliação da diversidade
genética. In: GARAY, I.; DIAS, B. (eds). Conservação da Biodiversidade
em Ecossistemas Tropicais
.
Petrópolis: Vozes, p. 268
-
294. 2001.
ALMEIDA, M.P. Avaliação da diversidade genética de acessos ex situ de
jacarandá
-
da
-bahia (Dalbergia nigra Vell. Allemão ex Benth.) por meio
de marcadores RAPD como subsídio para sua conserv
ação
.
2001. 56 f.
Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente) -
Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, 2001.
ALMEIDA, S. P.; PROENÇA, C.E.B.; SANO, S.M.; RIBEIRO, J.F. Cerrado:
espécies vegetais úteis. Planaltina:
EMBRAPA
–
CP
AC
. 1998.
AMORIM, D.S. Elementos Básicos de Sistemática e Filogenia. 2a ed.,
Ribeirão Preto: Holos e SBE, 276 p. 1997.
AMORIM, D.S. Fundamentos de Sistemática Filogenética
.
Ribeirão Preto:
Holos, 156 p. 2002.
BECKERT, A.; THEIBEN, G. The major clades of MADS-box genes and their
role in the development and evolution of flowering plants.
Molecular
Phylogenetics and Evolution.
v. 29, p. 464
-
489, 2003.
BENNETT, M.D., BHANDOL, P.; LEITCH, I.J. Nuclear DNA amounts in
angiosperms and their modern uses - 807 new estimates. Annals of
Botany
.
v. 86, p. 859
-
909, 2000.
BIRKY, C.W. Uniparental inheritance of mitochondria and chloroplast genes:
mechanisms and evolution. Proceedings of the National Academy of
Sciences
USA
. v. 92, p. 11331
-
11338, 1995.
BIRKY, C.W. The inheritance of genes in mitochondria and chloroplast: laws,
mechanisms, and models. Annual Review of Genetics. v. 35, p. 125-
148,
2001.
BORÉM, A. e VIEIRA, M. L. C. Glossário de Biotecnologia. Ed. Folha de
Viçosa, p.183.
2005.
BROUAT, C.; GIELLY, L.; MCKEY, D. Phylogenetic relationships in the genus
Leonardoxa
(Leguminosae: Caesalpinioideae) inferred from chloroplast
trnL
intron
and
trnF
intergenic spacer sequences. American Journal of Botany.
v. 88, p. 143
-
149, 2001.
BRUNEAU, A.; BRETELER F.J.; WIERINGA, J.J.; GERVAIS, G. Y. F.;
FOREST, F. Phylogenetic relationship in tribes Macrolobieae and Detarieae
28
as inferred from chloroplast
trn
L
intron
sequences.
In:
Herendeen PS,
Bruneau A (eds) Advances in Legume Systematics 9. Royal Botanic
Gardens, Kew, UK, p
p 121
-
149, 2000.
BRUNEAU, A.; FOREST, F.; HERENDEEN, P.S.; KLITGAARD, B.B.; LEWIS,
G.P. Phylogenetic relationships in the Caesalpinioideae (Leguminosae) as
inferred from chloroplast trnL
intron
sequences. Systematic Botany
.
v. 26,
p. 487
–
514, 2001.
CAIN,
M.L.; MILLIGAN, G.; STRAND, A.E. Long-distance seed dispersal in
plant populations. American Journal seed dispersal in plant populations.
American Journal of Botany
.
v. 87, p. 1217
-
1218, 2000.
CARVALHO, A. M. de. Systematics studies of the genus
Dalbergi
a L. f. in
Brazil
.
1989. Tese (Ph.D.). Reading (UK): University of Reading, 1989.
CARVALHO, A. M. de. Os Jacarandás da Bahia.
Agrotrópica
.
v.2, n.1, p.1-
10,
1990.
CARVALHO, A. M. de. The genus
Dalbergia
L. f. in Bahia, Brazil.
Herbarium,
CEPEC Cocoa Rese
arch Center
.
CP 7, p.6
–
17,1992.
CARVALHO, A. M. de. A synopsis of the genus
Dalbergia
(Fabaceae:
Dalbergieae) in Brazil.
Brittonia
.
v. 49, n. 1, p. 87
-
109, 1997.
CAVALLI
-SFORZA, L.L.; EDWARDS. Phylogenetic analysis: models and
estimation procedures.
Am
erican Journal of Human Genetics
.
v. 19, p.
233
-
257, 1967.
CHASE, M.W.; SOLTIS, D.E.; OLMSTEAD, R.G.; MORGAN, D.;
MISHLER,B.D.; DUVALL, M.R.; PRICE, R.A.; HILLS, H.G.; QIU, Y.-
L.;
KRON, K.A.; RETTIG, J.H.; CONTI, E.; PALMER, J.D.; MANHART, J.R.;
SYTSMA, K.J.; MICHAELS, H.J.; KRESS, W.J.; KAROL, K.G.; CLARK,
W.D.; HEDREN, M.; GAUT, B.S.; JANSEN, R.K.; KIM, K.-J.; WIMPEE, C.F.;
SMITH, J.F.; FURNIER, G.R.; STRAUSS, S.H.; XIANG, Q.-Y.; PLUNKETT,
G.M.; SOLTIS, P.S.; SWENSEN, S.M.; WILLIAMS, S.E.; GADEK, P.A.;
QUINN, C.J.; EGUIARTE, L.E.; LES, D.H.; GOLENBERG, E.;
LEARNGRAHAM, G.H.J.; BARRETT, S.W.; DAYANANDAN, S.C.H.;
ALBERT, V.A.S. Phylogenetics of seed plants: an analysis of nucleotide
sequences from the plastid gene rbcL. Annals of the Missouri Botanical
Garden
. v. 80, p. 528-
580, 1993.
CHEN, H.; SUN, M. Consensus multiplex PCR-restriction fragment length
polymorphism (RFLP) for rapid detection of plant mitochondrial DNA
polymorphism.
Molecular Ecology
. v.7, p.1553
-
1556, 1998.
CORRÊA, R. X.; ABDELNOOR, R. V.; FALEIRO, F. G.; CRUZ, C. D.;
MOREIRA, M.A.; BARROS, E.G. Genetic distances in soybean based on
RAPD markers.
Bragantia
. v. 58, n.1, 15
-
23. 1999.
29
DEMESURE, B.; SODZI, N.; PETIT, R.J. A set of universal primers for
amplification of polymorphic non-
coding
regions of mitochondrial and
chloroplast DNA in plants.
Molecular Ecology
.
v. 4, p. 129
-
131, 1995.
DOMBROVSKA, O.; QIU, Y.-L. Distribution of
intron
s in the mitochondrial gene
nad1 in land plants: phylogenetic and molecular evolutionary implications.
Mol
ecular Phylogenetics and Evolution
.
v. 32, p. 246
-
263, 2004.
DOYLE, J. J., DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue.
Focus
. v.
12, n. 1, p.13
-
15, 1990.
DOYLE, J.J.
DNA
data and Legume Phylogeny: A progress report. In: CRISP,
M.; DOYLE, J.J. (eds). Advances in Legume Systematics 7. London:
Royal Botanic Gardens, Kew, p. 11
-
30, 1995.
DOYLE, J.J.; CHAPPILL, J.A.; BAILEY, D.C.; KAJITA, T. Towards a
comprehensive phylogeny of legumes: evidence from rbcL sequences and
non
-molecular data. In: HERENDEEN, P.S.; BRUNEAU, A. (eds).
Advances in Legume Systematics 9. London: Royal Botanic Gardens,
Kew, p. 1
-
20. 2000.
DOYLE, J.J.; LUCKOW, M.S. The rest of the iceberg: legume diversity and
evolution in a phylogenetic context. Plant Physiology. v. 131, p.
900
-
910,
2003.
DUMINIL, J.; PERNONGE, M.H.; PETIT, R.J. A set of 35 consensus primer
pairs amplifying genes and
intron
s of plants mitochondrial DNA.
Molecular
Ecology Notes
. v. 2, p. 428
-
430, 2002.
ECK, R.V.; DAYHOFF, M.O.
Atlas of protein sequence and s
tructures
.
Silver
Springs: National Biomedical Research Foudation, 1967
.
EGUIARTE, L.E.; CASTILLO, A.; SOUZA, V. Evolución molecular y genómica
en angiospermas.
Interciencia. v. 28, n. 3, p. 141
-
147, 2003.
FELSENSTEIN, J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum
likelihood approach. Journal of Molecular Evolution. v. 17, p. 368-
376,
1981.
FELSENSTEIN, J. Phylogenies from molecular sequences: inference and
reliability.
Annual Reviews Genetics
.
v. 22, p. 521
-
565, 1988.
FREUDENSTEIN, J.V.; CHASE, M.W. Analysis of mitochondrial nad1c-
c
intron
sequences in Orchidaceae: utility and coding of length-changes characters.
Systematic Botany
.
v. 26, p. 643
-
657, 2001.
GIELLY, L.; TABERLET, P. The Use of Chloroplast DNA to Resolve Plant
Phylogenies: Noncoding versus
rbc
L Sequences. Molecular Biology and
Evolution
.
v. 11, n. 5, p. 769
-
777, 1994.
30
GIELLY, L.; YUAN, Y-M; KUPFER, P.; TABERLET, P. Phylogenetic use of
noncoding regions in the g
enus
Gentiana
L.: chloroplast
trn
L (UAA)
intron
versus nuclear ribosomal internal transcribed spacer sequences.
Molecular
Phylogenetic
s and
Evolution
.
v.5, n.3, p.460
-
466,
1996.
GIVNISH, T.J. The rise and fall of plant species: a population biologist´s
perspective.
American Journal of Botany
.
v. 88, p. 1928
-
1934, 2001.
GOLE
NBERG, E.M., CLEGG, M.T.; DURBIN, M.L.; DOEBLEY, J.; MA, D.P.
Evolution of a noncoding região of the chloroplast genome.
Molecular
Phylogenetics and Evolution
.
v. 2, p. 52
-
64, 1993.
GOTTLIEB, O. R. The occurrence of (S)-dalbergione in Dalbergia vioalacea.
Anais da Academia Brasileira de Ciências
.
v. 36, p.31
-
32, 1964.
GRANT, V. Plant speciation. New York: Columbia University Press. 435 p.
1971.
GRATTAPAGLIA, D.; SEDEROFF, R. Genetic linkage maps of
Eucalyptus
grandis
and
E. urophylla using a pseudo-
testc
ross: mapping strategy and
RAPD markers.
Genetics
. v.137, p. 1121-
1137, 1994.
GRAUR, D.; LI, W.H. Fundamentals of Molecular Evolution. 2a ed.
Massachusetts: Sinauer Associates, 481 p. 2000.
HALL, T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp
osyum
. v.
41, p. 95
-
98, 1999.
HASTON, M.E., LEWIS, G.P. & HAWKINS, J.A. A phylogenetic reappraisal of
the
Peltophorum
group (Caesalpinieae: Leguminosae) based on the
chroloplast trnL-
F,
rbcL and rps16 sequence data. American Journal of
Botany
.
v. 92, n. 8, p. 1359
-
1371, 2005.
HENNING, W. Phylogenetic systematics
.
Urbana: University of Illinois Press,
263 p. 1966.
HERENDEEN, P.S.; BRUNEAU, A.; LEWIS, G.P. Phylogenetic relationships in
caesalpinioid legumes: a preliminary analysis based on morphological and
molecular data. In: KLITGAARD, B.B.; BRUNEAU, A. (eds). Advances in
Legume Systematics 10, Higher Level Systematics. London: Royal
Botanic Gardens, Kew, p. 37
-
62. 2003.
HERENDEEN, P.S.; LEWIS, G.P.; BRUNEAU, A. Floral morphology in
caesalpinioid legumes: testing the monophyly of the 'Umtiza clade'.
International Journal of Plant Sciences.
v. 164, p. 393
-
407, 2003.
HOLT, S.D.S.; HOROVA, L.; BURES, P. Indel patterns of the plastid DNA t
rn
L-
trn
F region within the genus
Poa
(Poaceae). Journal of Plant Research.
v.117, p. 393
-
407, 2004.
31
HUELSENB
ECK, J.P.; RONQUIST, F.; NIELSEN, R.; BOLLBACK, J.P.
Bayesian inference of phylogeny and its impacto on evolutionary biology.
Science
.
v. 294, p. 2
310
-
2314, 2001.
IBAMA. Lista oficial das espécies da flora brasileira ameaçada de extinção.
Disponível em http://www2.ibama.gov.br/flora/extinção.htm acessado em
18/06/08
.
JUDD, W.S.; CAMPBELL, C.S.; KELLOGG, E.A.; STEVENS, P.F.
Plant
Systematics a Phylogenetic Approach. Massachusetts, USA: Sinauer
Associates, 464 p. 1999.
JUKES, T.H.; CANTOR, C.R. Evolution of protein molecules. In: MUNRO, H.N.
(ed).
Mammalian protein metab
olism
. New York: Academic Press, p. 21-
132. 1969.
KAGEYAMA, P.Y.; GANDARA, F. B. Conseqüências genéticas da
fragmentação sobre populações de espécies arbóreas.
Série Técnica IPEF
.
v.12, n.32, p.65
-
70, 1998.
KAUFMANN, K.; MELZER, R.; THEIBEN, G. MIKC-
type
MADS-
domain
proteins: structural modularity, protein interactions and network evolution in
land plants.
Gene
.
v. 347, p. 183
-
198, 2005.
KELCHNER, S.A. The evolution of non-coding chloroplast DNA and its
application in plant systematics. Annals of the Missouri Botanical
Garden
.
v. 87, p. 482
-
498, 2000.
KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis, Version 1.02
.
Pennsylvania: Institute for Molecular Evolutionary
Genetics, Penn State University, University Park., 1993.
LAV
IN, M.; PENNINGTON, R. T; KLITGARD, B. B.; SPRENT, J.I.; LIMA, H.C.
de; GASSON, P.E. The dalbergioid legumes (Fabaceae): Delimitation of a
pantropical monophyletic clade. American Journal of Botany. v. 88, n. 3,
p. 503
-
533, 2001.
LEE, C.; WEN, J. Phylogeny of
Panax
using chloroplast trnC-trnD intergenic
region and the utility of trnC
-
trnD in interspecific studies of plants.
Molecular
Phylogenetics and Evolution
.
v. 31, p. 894
-
903, 2004.
LEWIS, G.P.; SCHRIRE, B.D. Leguminosae or Fabaceae? In: KLITGAARD,
B.
B.; BRUNEAU, A. (eds). Advances in Legume Systematics 10, Higher
Level Systematics
.
London: Royal Botanic Gardens, Kew, p. 1
-
3. 2003.
LEWIS, G.P.; SCHRIRE, B. D.; MACKINDER, B.; LOCK, M. Legumes of the
Word
.
London: Royal Botanic Gardens, Kew, 577 p. 2005
.
32
LIMA, H.C.; LEWIS, G.P.; BUENO, E. Pau-brasil: uma biografia. In: BUENO, E.
et al. (eds).
Pau
-
Brasil
.
São Paulo: Axis Mundi, 39
-
76 p. 2002.
LLEDÓ, M.D.; CRESPO, M.B.; FAY, M.F.; CHASE, M.W. Molecular
phylogenetics of
Limonium
(Plumbaginaceae): Biogeographical and
systematic implications. American Journal of Botany. v. 92, p. 1189-
1198,
2005.
LORENZI, H.
Árvores Brasileiras. Manual de identificação e cultivo de plantas
arbóreas nativas do Brasil
.
Lorenzi, Harri (Ed.). Nova Odessa, SP: Editora
Plantaru
m, 368p. 1992.
LUCKOW, L.; MILLER, J.T.; MURPHY, D.J.; LIVSHULTZ, T. A phylogenetic
analysis of the Mimosoideae (Leguminosae) based on chloroplast DNA
sequence data. In: KLITGAARD, B.B.; BRUNEAU, A. (eds). Advances in
Legume Systematics 10, Higher Level S
ystematics
. London: Royal
Botanic Gardens, Kew, p. 197-
220. 2003.
LUCKOW, M.; FORTUNATO, R.H.; SEDE, S.; LIVSHULTZ, T. The
p
hylogenetic
affinities of two m
ysterious
m
onotypic
mimosoids from
Southern South America.
Systematic Botany
.
v.30, n.3, p.585
-
602,
2005.
MATIOLI, S.R.; PASSOS-BUENO, M.R.S. Métodos baseados em PCR para
análise de polimorfismos de ácidos nucléicos. In: MATIOLI, S.R. (ed.).
Biologia Molecular e Evolução
.
Ribeirão Preto: Holos, p. 153
-
161.
2001.
MCMAHON, M.; HUFFORD, L. Phylogeny of
Am
orpheae
(FABACEAE:
PAPILIONOIDEAE).
American Journal of Botany. v. 91, n. 8, p. 1219-
1230, 2004.
MES, T.H.; KUPERUS, P.; KIRSCHNER, J.; STEPANEK, J.; OOSTERVELD,
P.; STORCHOVA, H.; den NIJS, J.C. Hairpins involving both inverted and
direct repeats are associated with homoplasious indels in non-
coding
chloroplast DNA of Taraxacum (Lactuceae: Asteraceae).
Genoma
. v. 43, p.
634
-
641, 2000.
MIYAKI, C.Y.; RUSSO, C.A. de M.; PEREIRA, S.L. Reconstrução filogenética.
Introdução e o método da máxima parcimônia.
In:
MATIOLI, S.R. (ed).
Biologia Molecular e Evolução
.
Ribeirão Preto: Holos, p. 97
-
107, 2001.
MUSCHNER, V.C.; LORENZ, A.P.; CERVI, A.C.; BONATTO, S.L.; SOUZA-
CHIES, T.T.; SALZANO, F.M.; FREITAS, L.B. A first molecular phylogenetic
analysis of
Passiflora
(Pa
ssifloraceae).
American Journal of Botany. v. 90,
p. 1229
-
1238, 2003.
MUSE, S.V. Examining rates and patterns of nucleotide substitution in plants.
Plant Molecular Biology
.
v. 42, p. 25
-
43, 2000.
NAHUM, L.A. Evolução dos genomas. In: MATIOLI, S.R. (ed).
Biologia
Molecular e Evolução
.
Ribeirão Preto: Holos, p. 82
-
96. 2001.
33
NEI, M.; KUMAR, S.; TAKAHASHI, K. The optimization principle in phylogenetic
analysis tend to give incorrect topologies when the number of nucleotides or
aminoacids is small.
Proceeding
s of the National Academy of Sciences
.
v. 95, p. 12390
-
12397, 1998.
NEI, M.; KUMAR, S. Molecular Evolution and Phylogenetics.
Oxford
University Press, 333 p. 2000.
PALMER, J.D. Plastid chromosomes: structure and evolution. Cell Culture and
Somatic Cell G
enetics of Plants
.
v. 7A, p. 5
-
53, 1991.
PALMER, J.D. Mitochondrial DNA in plant systematics applications and
limitations. In: SOLTIS, P.S.; SOLTIS, D.E.; DOYLE, J.J. (eds).
Molecular
systematics of plants
.
New York: Chapmam and Hall, p. 36
-
49. 1992.
PAL
MER, J.D.; DELWICHE, C.F. The origin and evolution of plastids and their
genome. In: SOLTIS, P.S.; SOLTIS, D.E.; DOYLE, J.J. (eds).
Molecular
systematics of plants II
.
DNA sequencing. Boston: Kluwer, EEUU, p. 375-
408.
1998.
PALMER, J.D.; HERBON, L.A. Plant mitochondrial DNA evolves rapidly in
structure, but slowly in sequence.
Journal of Molecular Evolution
.
v. 27, p.
87
-
97, 1988.
PENNINGTON, R.T.; LAVIN, M.; IRELAND, H.; KLITGAARD, B.; PRESTON, J.;
HU, J-M. Phylogenetic relationships of basal papilionoid legumes based
upon sequences of the chloroplast
trn
L
intron
.
Systematic Botany. v.26,
n.3, p.537
-
556,
2001.
PEREIRA, B. A. da S. Estudo morfo-anatômico da madeira, casca e folha
de duas variedades vicariantes de Sclerobium paniculatum Vogel
(Leguminosae,
Caesalpinioideae) de Mata e Cerrado. Viçosa, MG: UFV,
Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais) Universidade Federal de
Viçosa. 192p. 1990.
PEREIRA, S.L.; MIYAKI, C.Y.; RUSSO, C.A. de M. Reconstrução filogenética.
Método probabilístico. In: MATIOLI, S.R. (ed). Biologia Molecular e
Evolução
.
Ribeirão Preto: Holos, p.117
-
129. 2001.
RIZZINI, C. T. A flora do cerrado. In: Simpósio sobre o Cerrado. Editora da
Universidade de São Paulo, p. 125-
177, 1963.
RIZZINI, C.T. Árvores e madeiras úteis do Brasil
.
Manual de Dendrologia
Brasileira. E. Blucher, São Paulo, 294 p. 1971.
ROUT, G. R.; BHATACHARYA, D.; NANDA, R.M.; NAYAK, S.; DAS, P.
Evaluation of genetic relationships in
Dalbergia
species using RAPD
markers.
Biodiversity and Conservation
.
v. 12, n. 2, p.
197
-
206, 2003.
34
RUSSO, C.A.M. Como escolher genes para problemas filogenéticos
específicos. In:
MATIOLI
, S.R. (ed). Biologia Molecular e Evolução.
Ribeirão Preto: Holos, p. 130
-
136.
2001.
SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. v. 24,
p. 184
-
204, 1987.
SALAMIN, N.; HODKINSON, T.R.; SAVOLAINEN, V. Towards building the tree
of life: a simulation study for all angiosperm genera. Systematic Biology. v.
54, p. 183
-
196
, 2005.
SCHAAL, B.A.; OLSEN, K.M. Gene genealogies and population variation in
plants.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA. v. 97, p.
7024
-
7029, 2001.
SCHNEIDER, H. Métodos de Análise Filogenética um guia prático. Ribeirão
Preto: Holos, 2
001.
SILVA, L. F. da; MENDONÇA, J.R. Mata Atlântica do Sudeste da Bahia: Interação
Ambiental e Deterioração do Ecossistema.
Especiaria
. Ano I, no. 2, jul/dez,
p.153
-
176. 1998.
SIMPSON, B.B.; LARKIN, L.L.; WEEKS, A. Progress towards resolving the
relatio
nships of the
Caesalpinia
group (Caesalpinieae: Caesalpinioideae:
Leguminosae). In: KLITGAARD, B.B.; BRUNEAU, A. (eds). Advances in
Legume Systematics 10, Higher Level Systematics
.
London: Royal
Botanic Gardens, Kew, p. 123-
148. 2003.
SMALL, R.L.; RYUBURN, J.A.; CRONN, R.C.; SEELAND, T.; WENDEL, J.F.
The torotoise and the hare: chosing between noncoding plastone and
nuclear Adh sequences for phylogeny reconstruction in a recently diverged
plant group.
American Journal of Botany
.
v. 85, n. 9, p. 1301
-
1315,
1998.
SOLTIS, D.E.; SOLTIS, P.S.; ENDRESS, P.K; CHASE, M.W. Phylogeny and
Evolution of Angiosperms. Sinauer Associates, Inc. Sunderland,
Massachusetts U.S.A, 370 p. 2005.
SPRENT, J.I. Nodulation in legumes. London: Royal Botanical Gardens, Kew,
146 p. 2001.
STACE, C.A. Hybridization and the plant species. In: Urbanska, K.M., (ed).
Differentiation patterns in higher plants
.
New York: Academic Press, p
115
-
127. 1987.
STEBBINS, G.L. Variation and evolution in plants. New York: Columbia
University Press, 19
50.
35
SWOFFORD, D. L., OLSEN, G. J., WADDELL, P. J.; HILLIS, D. M. In: HILLIS,
D. M., MORITZ, C. & MABLE, B. K. (eds.). Molecular Systematics
.
Massachusetts: Sinauer Associates, p. 407-
514, 1996.
TABERLET, P., GIELLY, L., PAUTOU, G.; BOUVET, J. Universal primers for
amplification of three non-coding regions of choloroplast DNA.
Plant
Molecular Biology
.
v. 17, p. 1105
-
1109, 1991.
TUCKER, S.C. Floral development in legumes. Plant Physiology. v. 131, p.
911
-
926, 2003.
VARTY, N. 1998. Dalbergia nigra. In: IUCN 2007. 2007 IUCN Red List of
Threatened Species. <
www.iucnredlist.org
>. Downloaded on 22 December
2007.
WALBOT, V.; CULLIS, C.A. Rapid genomic change in higher plants.
Annual
Review of Plant Physiology
.
v. 36, p
. 367
-
396, 1985.
WHITHAM, T.G.; MARTINSEN, G.D.; FLOATE, K.D.; DUNGEY, H.S.; POTTS,
B.M.; KEIM, P. Plant hybrid zones affect biodiversity: tools for a genetic-
based understanding of community structure.
Ecology
. v. 80, n. 2, p. 416-
428, 1999.
WISSINGER,
B., SCHUSTER, W.; BRENNICKE, A. Trans splicing in
Oenothera mitochondria: nad1 mRNAs are edited in exon and trans-
splicing
group II
intron
sequences.
Cell
.
v. 65, p. 473
-
482, 1991.
WOJCIECHOWSKI, M.F. Reconstructing the phylogeny of legumes
(Leguminosae):
an early 21
st
century perspective. In: KLITGAARD, B.B.;
BRUNEAU, A. (eds). Advances in Legume Systematics 10, Higher Level
Systematics
.
London: Royal Botanic Gardens, Kew, p. 5
-
35. 2003.
WOJCIECHOWSKI, M.F.; LAVIN, M.; SANDERSON, M.J. A Phylogeny of
Legu
mes (Leguminosae) based on analysis of the plastid Matk gene
resolves many well-supported subclades within the family.
American
Journal of Botany
.
v. 91, n.11, p. 1846
-
1862, 2004.
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