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SALVADOR LIMA BRITO JÚNIOR
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA INDUZIDA POR
Phakopsora pachyrhizi EM SOJA
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento, para
obtenção do título de Magister
Scientiae.
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ii
DEDICO
Aos meus pais,
Salvador Lima Brito e Ises da
Aparecida Nunes Brito, e ao
meu irmão, Guilherme
Emanuell Nunes Lima Brito
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iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por sempre me dar forças para seguir em frente.
Aos meus pais, Salvador Lima Brito e Ises Aparecida Nunes Brito,
razão maior da minha existência, e espelho para a minha conduta.
Obrigado por sempre me apoiarem e estarem ao meu lado nas minhas
decisões.
Ao meu irmão Guilherme por sempre me proporcionar momentos
de alegrias. Obrigado pelo seu companheirismo Gui.
Ao meu orientador Dr. Aluízio Borém, pelos seus ensinamentos,
competência, e acima de tudo pela sua amizade.
Aos meus co-orientadores Dr. Ricardo Vilela Abdelnoor e Dra.
Francismar Corrêa Marcelino, pelo incentivo, credibilidade e confiança.
Seus ensinamentos e amizade serão por toda vida.
Ao Dr. Ney Sussumu Sakyama, Dr. Múcio Silva Reis e Dr.
a
Eveline
Teixeira Caixeta, pela participação na banca de defesa da dissertação.
Aos funcionários do laboratório de Biotecnologia Vegetal da
Embrapa-Soja, Silvana Rockenback, César Silveira, Vera Pierotti
(Verinha), Nilson Vieira, Jairo, que diretamente participaram da realização
deste trabalho. Agradeço o carinho e amizade de todos vocês.
Aos pesquisadores Dr. Alexandre Nepomuceno, Dr. Álvaro
Almeida, Dr. Eliseu Binneck e Dr. Naoki Yamanaka, por toda ajuda,
sempre disponibilizada.
Aos meus amigos Renata Stolf, Danielle Gregorio, Noelle
Giacomini, Adriana Polizel, Aguida Morales, Alan Pereira, Lizandra Catelli,
Magda Beneventi, Renata Fuganti, André Passionoto, João Maldonado,
André Paulo, Maria Thereza, Maria Cecília, Paula Camargo, Selma
Pereira, Amanda Paiva, Luana Gonçalves e Rodrigo Pereira, meus
iv
sinceros agradecimentos por tudo; pelos bons e divertidos momentos que
passamos no laboratório. Tenho um carinho muito grande por vocês.
À minha namorada Lívia, pela sua amizade, companheirismo,
carinho e dedicação. Por sempre proporcionar momentos ímpares na
minha vida e me dar forças para seguir em frente.
Aos meus amigos Leonardo Ribeirinho e Isabele Bruna Barbieri
pela grande amizade e por terem me acolhido em Londrina - PR.
Aos meus amigos da pós-graduação em Genética da UFV, em
especial à Maíra Cristina Menezes Freire, Samuel Mazzinhghy e Ramon
Almeida, pela grande amizade. Obrigado pelo incentivo e torcida pelo
meu sucesso.
Aos meus familiares que sempre acreditaram no meu potencial.
Aos meus amigos Hubsclender, Sarah, Ighor e Camilah Zappes,
Wilson Cardoso, Mauredson Vieira e Arilson Ribeiro que de perto,
acompanharam essa trajetória. Obrigado por tudo.
À Embrapa-Soja por ter me proporcionado um aperfeiçoamento
profissional, tornando possível a realização dos experimentos.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Programa de Pós-
Graduação em Genética pela oportunidade oferecida para realização
deste curso.
À Capes pelo apoio financeiro.
E a todos que direta ou indiretamente participaram da realização
deste trabalho.
v
BIOGRAFIA
SALVADOR LIMA BRITO JÚNIOR, filho de Salvador Lima Brito e
Ises da Aparecida Nunes Brito, nasceu na cidade de Governador
Valadares, MG, em 15 de março de 1982.
Ingressou no curso de Bacharel em Ciências Biológicas, na
Universidade Vale do Rio Doce – UNIVALE em 2001, concluindo a
graduação em 2004.
Em agosto de 2005 iniciou o Mestrado em Genética e
Melhoramento da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG.
vi
SUMÁRIO
RESUMO ..................................................................................................... viii
ABSTRACT .................................................................................................... x
1 - INTRODUÇÃO ......................................................................................... 1
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................... 3
2.1 – A Soja ................................................................................................... 3
2.1.1 – A Soja no Mundo ............................................................................... 3
2.1.2 – A Soja no Brasil ................................................................................. 4
2.1.3 – A Soja na Economia Brasileira ......................................................... 6
2.2 – Ferrugem Asiática da Soja ................................................................... 7
2.2.1 – Dados Econômicos da Ferrugem Asiática no Brasil ........................ 9
2.2.2 – Aspectos Epidemiológicos da Ferrugem Asiática .......................... 10
2.2.3 – Métodos de Controle ....................................................................... 13
2.3 – Mecanismos de Resistência a Doenças em Plantas ........................ 14
3 – OBJETIVO GERAL ............................................................................... 19
3.1 – Objetivos Específicos ......................................................................... 19
4 – MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 20
4.1 – Seleção dos Genes ............................................................................ 20
4.2 – Construção dos Oligonucleotídeos .................................................... 20
4.3 – Material Biológico ............................................................................... 21
4.4 – Delineamento Experimental ............................................................... 22
4.5 – Inoculação do Patógeno .................................................................... 23
4.6 – Coleta do Material .............................................................................. 24
4.7 – Extração do RNA ................................................................................ 25
4.8 – Síntese do cDNA ................................................................................ 26
4.9 – PCR Qualitativo .................................................................................. 27
vii
4.10 – PCR em Tempo Real ....................................................................... 28
4.11 – Análise Estatística ............................................................................ 30
5 – RESULTADO ......................................................................................... 31
5.1 – Seleção dos Genes para Análise da Expressão Gênica .................. 31
5.2 – Acesso dos Genes no GenBank........................................................ 32
5.3 – Construção dos Oligonucleotídeos .................................................... 33
5.4 – Teste de Amplificação dos Oligonucleotídeos .................................. 36
5.5 – Quantificação Relativa dos Genes Envolvidos na Resposta de
Resistência .................................................................................................. 39
6 - DISCUSSÃO .......................................................................................... 43
6.1 – Genes selecionados para a análise da quantificação relativa por
PCR em tempo real, em soja, após inoculação do patógeno
P. pachyrhizi..............................................................................................43
6.2 – Quantificação relativa dos genes envolvidos no mecanismo de
defesa da soja frente a P. pachyrhizi........................................................45
7 – CONCLUSÃO......................................................................................54
8 – CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................55
9 – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA .......................................................... 57
viii
RESUMO
BRITO JÚNIOR, Salvador Lima, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
julho de 2007. Análise da expressão gênica induzida por
Phakopsora pachyrhizi em soja. Orientador: Aluízio Borém de
Oliveira. Co-Orientadores: Ricardo Vilela Abdelnoor e Francismar
Corrêa Marcelino.
Ferrugem asiática da soja, uma doença causada pelo fungo
Phakopsora pachyrhizi, tem provocado sérios danos econômicos à
sojicultura brasileira e mundial. A obtenção de linhagens de soja
resistentes ao fungo tem sido um desafio, e atualmente as medidas de
controle da doença são baseadas no manejo da cultura e aplicação de
fungicidas. Com o objetivo de avançar o conhecimento sobre o
mecanismo molecular de defesa da planta frente a ferrugem asiática da
soja, avaliou-se, através da técnica de PCR em tempo real, a expressão
de genes que supostamente estão envolvidos no mecanismo de defesa.
Dois genótipos foram selecionados para a condução do experimento, PI
230970, que possui o alelo Rpp2 e desenvolve lesões do tipo RB, quando
em presença de P. pachyrhizi, e Embrapa-48, suscetível, desenvolvendo
lesões tipo TAN. O experimento foi conduzido em sala climatizada
(Fitotron) e para a análise de expressão gênica foram extraídos RNAs de
folhas da soja inoculadas com o patógeno e falso-inoculadas (água).
Dentre os genes avaliados, quitinase apresentou uma expressão 117
vezes maior no genótipo resistente (PI 230970), quando comparado com
o calibrador (PI 230970 falso-inoculado), atuando possivelmente como
ix
uma barreira de defesa da planta. No genótipo suscetível a expressão
deste gene foi 1,75 vezes maior que o seu calibrador (Embrapa-48 falso-
inoculado). Foi observada uma expressão diferencial de genes
relacionados a espécies reativas de oxigênio, produção de fitoalexinas
bem como genes envolvidos na liberação de elicitores. Esses genes
podem estar atuando no mecanismo de defesa contra P. pachyrhizi no
genótipo resistente, porem sua expressão também no genótipo suscetível
pode estar relacionado a uma maior colonização do patógeno no tecido
hospedeiro ou uma resposta tardia à infecção. A identificação de uma rota
de defesa pode possibilitar o estudo mais aprofundado da mesma, com o
objetivo de identificar genes mais específicos no processo de defesa
celular e apontar novas alternativas para obtenção de cultivares
resistente.
x
ABSTRACT
BRITO JÚNIOR, Salvador Lima, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
July of 2007. Analysis of gene expression induced for Phakopsora
pachyrhizi in soybean. Adviser: Aluízio Borém de Oliveira. Co-
advisers: Ricardo Vilela Abdelnoor and Francismar Corrêa Marcelino.
Soybean Asian Rust, a disease caused by the fungi Phakopsora
pachyrhizi, has caused serious economic damages to the Brazilian and
world-wide soybean crop. The development of soybean lines resistant to
this fungi has been a challenge, and currently the measures of control this
disease are based on the handling of the crop and application of
fungicides. With the objective to advance the knowledge on the molecular
mechanism of defense of the plant to the Soybean Asian Rust, it was
evaluated, by PCR in real time, the expression of genes that supposedly
are involved in the defense mechanism. Two genotypes had been
selected for the conduction of the experiment, PI 230970, that it possess
allele Rpp2 and develops type RB type injuries, when in presence of P.
pachyrhizi, and Embrapa-48, susceptible, which develops injuries of Tan
type. The experiment was carried out in Fitotron and for the analysis of the
gene expression was done using RNAs from leaves of the soybean
inoculated either with pathogen or mock-inoculated with water. Amongst
the evaluated genes, chitinase presented an expression 117 times higher
in the resistant genotype (PI 230970), when compared with the calibrator
(PI 230970 mock-inoculated) possibly acting as a barrier of defense of the
plant. In the susceptible genotype the expression of this gene was 1.75
xi
time higher that your calibrator (Embrapa-48 mock-inoculated). It was
observed a differential expression of related genes with reactive species
oxygen, production of fitoalexinas as well as involved genes in the release
of elicitors. These genes can be acting in the mechanism of defense
against P. pachyrhizi in the resistant genotype; however its expression in
the susceptible genotype can be related to a bigger settling of the
pathogens in the tissues of the host or to a delayed response the infection.
The identification of a defense route should be farther investigated, with
the objective to identify more specific genes in the process of cellular
defense and to point out new alternatives for the development of resistant
cultivars.
1
1 – INTRODUÇÃO
A ferrugem asiática da soja, causada pelo fungo Phakopsora
pachyrhizi, tem causado inúmeros danos a sojicultura brasileira e mundial.
Desde a sua constatação no território brasileiro no ano de 2001, no
Estado do Paraná, a doença espalhou-se rapidamente pelo Brasil
(YORINORI, 2004). Na safra 2001/2002 se apresentava por toda a região
Sul e parte do Centro-Oeste. Já na safra 2002/2003 atingia 90% da área
de soja do Brasil (YORINORI, 2005). A única região brasileira com plantio
de soja, onde ainda não foi constada a ocorrência da ferrugem asiática é
Roraima – RR (EMBRAPA-SOJA, 2006a).
Somados os custos na produção, aplicações de fungicidas, perda
na produtividade entre outros, os danos econômicos ao Brasil já
ultrapassam a soma de sete bilhões de dólares, desde a constatação da
ferrugem asiática em 2001. Isso demonstra a importância dos
investimentos em pesquisas, para que melhores estratégias sejam
elaboradas e medidas eficientes sejam executadas no intuito de minimizar
os danos causados pela ferrugem.
Quando atacada pelo fungo da ferrugem, as plantas de soja
respondem por meio de complexos mecanismos que resultam em
interações compatíveis ou incompatíveis com o patógeno. PASCHOLATI
& LEITE (1995) argumentaram que a interação hospedeiro-patógeno
pode ser vista como uma luta entre dois organismos pela sobrevivência,
onde o hospedeiro, por meio de mecanismos estruturais e/ou bioquímicos,
procura se defender do patógeno. Ainda segundo os mesmos autores, a
2
tentativa de infecção dos tecidos de uma planta por um patógeno inicia
uma progressão complexa de interações biológicas e moleculares, que
culmina nos sintomas visuais associados com resistência (interação
incompatível) ou suscetibilidade (interação compatível).
Quando submetida ao ataque de um patógeno, a planta
desenvolve um processo de reconhecimento e defesa. A produção de
compostos antimicrobianos, ativação do processo de morte celular
(reação de hipersensibilidade), indução de proteínas relacionadas à
patogenicidade (PR), aumento na expressão de genes de defesa, bem
como a produção de compostos oxidativos, são alguns exemplos dos
mecanismos da planta em resposta à presença do patógeno (KITAJIMA &
SATO, 1999, MYSORE & RYU, 2004). Esses mecanismos de defesa são
desencadeados pela expressão de vários genes envolvidos em várias
fases do processo de infecção. Muitos genes já tiveram o seu papel
molecular correlacionado com defesa da planta (KITAJIMA & SATO,
1999; THEVISSEN, TERRAS & BROEKAERT, 1999; KIRIK et al., 2001;
GLAZEBROOK, 2001).
Considerando a importância em avançar o conhecimento sobre o
mecanismo molecular de defesa da soja frente ao fungo P. pachyrhizi, o
estudo de genes relacionados ao mesmo, torna-se importante. O objetivo
é o entendimento dos processos moleculares que levam a resistência a
essa doença bem como no desenvolvimento de métodos eficientes de
controle do fungo e no estudo da reação da soja a outros patógenos.
3
2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 – A Soja
2.1.1 – A Soja no Mundo
A soja Glycine max (L.) Merrill é uma espécie autógama
pertencente à família das Fabáceas, subfamília das Papilionáceas e ao
gênero Glycine L. (GOMES, 1988, CARVALHO FILHO & AMABILE, 1996;
WIKIPEDIA, 2007). Apresenta-se como um organismo diplóide (2n=40),
derivado de um ancestral alotetraplóide, o que explica as altas taxas de
duplicação de seu genoma (SHOEMAKER et al., 1996).
Muitos autores relatam que a espécie teria surgido no continente
asiático (HYMOWITZ, 1970; BONETTI, 1981; BERTRAND, LAURENT &
LECLERCQ, 1987). Como relatam MORAES et al. (1996), é provável que
entre o ano 200 a.C e o século III d.C, a soja tenha sido introduzida na
Coréia, migrando posteriormente para o Japão. Durante séculos, o cultivo
permaneceu restrito apenas aos países orientais, principalmente para a
produção de grãos usados na preparação de grande variedade de
alimentos. Com a chegada dos europeus no final do século XV e começo
do XVI, a soja foi introduzida no Ocidente (BONETTI, 1981).
O botânico alemão Engelbert Kaempher (1651-1716) introduziu a
soja na Europa em 1712, quando a trouxe do Japão. Em 1753, Linnaeus
foi o primeiro a descrevê-la cientificamente, em sua obra intitulada
Species Plantarum. Sob as Regras da Nomenclatura Botânica
Internacional, a soja é cientificamente chamada Glycine max (BONETTI,
1981; MORAES et al., 1996).
4
Em 1739, missionários na China enviaram sementes de soja para
França, onde foi plantada no Jardim ―des Plantes‖, em Paris. No ano de
1790, a soja foi plantada nos Jardins Botânicos Reais de Kew, um dos
mais extensos, antigos e prestigiosos jardins botânicos do mundo
localizados na cidade de Londres, Inglaterra (BONETTI, 1981). Assim, a
soja foi se disseminando pelo continente Europeu.
A primeira menção da cultura de soja no continente americano data
de 1804, no Estado da Pensilvânia. A partir de 1880, a soja adquiriu
importância nos Estados Unidos como cultura forrageira. No ano de 1898,
o Departamento de Agricultura de Washington estimulou seu cultivo,
distribuindo grande número de variedades (MORAES et al., 1996). Devido
a sua alta capacidade de rendimento e menor custo de produção,
comparada com outras leguminosas, a soja ganhou importância no
mercado norte-americano, que em uma política governamental de
restrição à produção de milho e algodão, iniciada em 1934, teve um efeito
na expansão da área de produção de soja nos Estados Unidos.
2.1.2 – A Soja no Brasil
Concomitante à expansão da sojicultura norte-americana, tem-se
os primeiros registros de soja no Brasil. Por intermédio do engenheiro
agrônomo Gustavo D´Utra, germoplasma proveniente dos Estados Unidos
foi introduzido no Estado da Bahia no ano de 1882, não apresentando,
porém uma adaptação às condições locais (BONETTI, 1981; MORAES et
al., 1996).
5
No ano de 1908, através de imigrantes japoneses que se
estabeleceram no Estado de São Paulo, a cultura da soja, de fato, foi
introduzida no Brasil, disseminando-se por outros Estados, como Rio
Grande do Sul, onde encontrou condições favoráveis para o seu
desenvolvimento (BONATO & BONATO, 1987).
Somente na década de 1940 o Brasil iniciou as produções
comerciais de soja, aumentando gradativamente a sua área plantada e
produtividade. Na década de 1960, o Estado do Rio Grande do Sul
apresentava 70% da área plantada de soja no país. O estado do Paraná
também se destacou a partir desse período, onde a produção de soja
passou de 8,5% em 1965 para 42% em 1976 (COSTA, 1996).
Com o avanço de novas fronteiras, a produção de soja ganhou o
Brasil Central, no Cerrado, passando a ser a região mais importante para
o plantio desta cultura. O desenvolvimento de cultivares bem adaptados,
incentivos fiscais, aumento na demanda de soja como uma fonte de
proteína, valorização no mercado internacional, estabelecimento de
parques industriais, fornecimento de tecnologia e a construção de Brasília
no centro do Cerrado, fornecendo uma infra-estrutura e facilitando o
acesso à comunicação, entre outros fatores (DALL´AGNOL, 2004),
fizeram com que a produção de soja no Cerrado passasse de 2% do total
brasileiro em 1970, para mais de 40% em 1990.
6
Atualmente, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento (MAPA) os cinco maiores estados produtores de soja
são: Mato Grosso, Paraná, Goiás, Mato Grosso do Sul e Minas Gerais
(MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2007a).
2.1.3 – A Soja na Economia Brasileira
A soja destaca-se como o maior produto de exportação do
agronegócio brasileiro. Em quatro décadas (1960 a 2000), a produção de
soja no Brasil aumentou 260 vezes, determinando uma transformação
positiva na economia brasileira. A produção e competitividade da soja
brasileira foram associadas aos avanços científicos e melhorias na
tecnologia de produção (DALL`AGNOL, 2004).
O Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial do grão,
ficando atrás somente dos Estados Unidos. Em 2005, a produção mundial
de grãos de soja foi de 214,3 milhões de toneladas, sendo a produção
dos Estados Unidos de 83,9 milhões de toneladas, e a do Brasil de 52,7
milhões de toneladas (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2007b).
Os principais componentes da semente ou grãos de soja,
responsáveis por seu valor econômico, são o óleo e a proteína, sendo o
óleo de soja o mais consumido no mundo (COSTA, 1996).
Nos últimos três anos (2004 a 2006) as exportações brasileiras de
grãos de soja cresceram aproximadamente 31%, totalizando 24.957.973
toneladas, em 2006. A China tem se destacado como o maior importador
7
de grãos de soja do Brasil. No último ano (2006), 44% das exportações
brasileiras de grãos de soja foram destinadas à China (CONAB, 2007a).
Até o momento, em último levantamento sobre a produção de
grãos de soja no Brasil para a safra 2006/2007, a área cultivada
representou 20,7 milhões de hectares, apresentando uma redução de
6,9% em relação à safra 2005/2006. No entanto essa redução não afetou
a produção brasileira, onde as boas condições climáticas favoreceram as
lavouras elevando a produtividade de 53,4 milhões de toneladas para 58
milhões de toneladas, um aumento de 8,5% em relação à safra anterior
(IBGE, 2007).
A região Centro-Oeste destaca-se com 45,9% da produção,
seguida pela região Sul (38,2%), Sudeste (7,0%), Nordeste (6,8%) e
Norte, com 2,1% (CONAB, 2007b).
2.2 - Ferrugem Asiática da Soja
A ferrugem da soja pode ser causada por duas espécies de fungo
do gênero Phakopsora; Phakopsora meibomiae (Arthur) Arthur e
Phakopsora pachyrhizi Sydow & Sydow. A primeira é conhecida como a
ferrugem americana e raramente causa danos econômicos. A segunda,
conhecida como a ferrugem asiática, consiste em uma das doenças de
maior impacto econômico na cultura da soja (BROMFIELD, 1982;
ZAMBENEDETTI, 2005).
8
A primeira menção da ferrugem asiática da soja data de 1903, no
Japão (ONO, BURITICÁ & HENNEN, 1992), avançando, já na década de
1910, para vários países do sudoeste asiático. Até o início do século XXI,
a presença da ferrugem asiática não havia sido constatada na América do
Sul (HENNING & GODOY, 2006).
Em fevereiro de 1979, DESLANDES (1979) identificou, em área
experimental da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais, em
Lavras - MG, sintomas de ferrugem das folhas em soja, que inicialmente
classificou como uma nova doença em soja perene. Com base no
hospedeiro, Deslandes mencionou tratar-se de P. pachyrhizi o agente
causador das lesões. No entanto, o fungo presente era o causador da
ferrugem americana – P. meibomiae (CARVALHO JÚNIOR &
FIGUEIREDO, 2000).
O primeiro relato da ferrugem asiática na América do Sul
aconteceu em 2001, afetando lavouras no Paraguai e atingindo o sul do
Brasil, no Estado do Paraná. Já na safra 2001/2002, a ferrugem foi
identificada em lavouras nos Estados do Rio Grande do Sul, Paraná, São
Paulo, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais e Mato Grosso,
ocasionando perdas de mais de 50% na produção de soja no país
(HENNING & GODOY, 2006).
Até o momento, o único estado brasileiro produtor de soja, em que
não foi constatada a ferrugem asiática, é o Estado de Roraima
(EMBRAPA-SOJA, 2007a).
9
2.2.1 - Dados Econômicos da Ferrugem Asiática no Brasil
Desde a sua constatação no território brasileiro, a ferrugem asiática
da soja tem causado sérios danos à economia, com a elevação do custo
de produção e redução da produtividade.
Por se tratar de uma doença nova no Brasil, os produtores não
estavam preparados para um eficiente controle do patógeno, o que fez
com que as medidas tomadas na safra 2001/2002 não fossem muito
eficazes no controle à ferrugem. Nessa safra as perdas de produção, em
grãos/tonelada, foram na ordem de 569,2 mil, estimando um prejuízo de
US$125,5 milhões.
Na safra de 2002/2003 a ferrugem asiática foi constatada em
praticamente todas as regiões produtoras de soja, exceto Roraima e Pará.
As perdas econômicas ultrapassaram US$ 1,1 bilhão.
Avançando ainda mais na área produtora de soja no Brasil, na
safra 2003/2004, o único Estado onde não se constatou a presença do
patógeno foi Roraima. Aliado às perdas na produção de grãos e custos de
produtos e aplicações para o controle da doença, os danos econômicos
foram estimados em US$ 2,08 bilhões.
Na safra 2004/2005, a doença foi relatada praticamente em todas
as regiões produtoras, mas somente em Mato Grosso registrou-se perdas.
Segundo dados da CONAB, as perdas ocasionadas pela ferrugem foram
compensadas provavelmente pelo aumento da área plantada, bem como
medidas de controle como a aplicação de fungicidas.
10
A safra de 2005/2006 registrou uma perda econômica de
US$ 2, 124 bilhões onde em todos os Estados produtores de soja no
Brasil, com exceção de Roraima, foi constatada a ferrugem asiática
(EMBRAPA-SOJA, 2007b).
As perdas em grãos de soja devido a ferrugem asiática, na safra
2006/2007, foram de aproximadamente 4,5%, o que equivale a 2,67
milhões de toneladas de grãos. O custo total da ferrugem nesta safra foi
de 2,19 bilhões (EMBRAPA-SOJA, 2007c).
Um fato interessante a ser mencionado é que em 2004 foi instituído
o Consórcio Anti-Ferrugem, que tem o Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento (MAPA) como coordenador, e vários segmentos da
cadeia produtiva da soja como atores. Entre eles estão: Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), fundações de apoio à
pesquisa, empresas estaduais de pesquisa, de transferência de
tecnologias, cooperativas, universidades, a Associação Nacional de
Defesa Vegetal (Andef) e a Associação Brasileira dos Defensivos
Genéricos (AENDA). O objetivo do Consórcio Anti-Ferrugem tem sido
propor soluções para a identificação, o manejo e, principalmente, o
controle da ferrugem asiática.
2.2.2 - Aspectos Epidemiológicos da Ferrugem Asiática
A ferrugem asiática da soja é causada por fungo biotrófico,
portanto, dependente de células vivas do hospedeiro.
11
A infecção por P. pachyrhizi causa rápido amarelecimento,
bronzeamento ou crestamento (queimaduras) e queda prematura das
folhas, impedindo a plena formação dos grãos (YORINORI, NUNES
JUNIOR & LAZZAROTTO, 2004). COSTAMILAN, BERTAGNOLLI &
YORINORI, em 2002, avaliando a redução de rendimentos de grãos de
soja causados pela ferrugem, constataram que o principal efeito no
rendimento causado pela doença foi a diminuição do tamanho de grãos
resultantes de desfolha precoce.
Em Taiwan, foram registradas perdas de 70-80% na produção de
soja, em função da ferrugem asiática. Dados semelhantes ocorreram em
Zimbábue, aonde as perdas também chegaram a 80% (LEVY, 2004). No
Brasil, os danos causados pela ferrugem asiática, em média, variam de 30
a 70% (ZAMBOLIM, 2006).
Adaptada a uma variação de temperatura entre 7 e 28 °C, P.
pachyrhizi apresenta uma faixa ótima entre 15 e 25 °C para a germinação
(ALVES, FURTADO & BERGAMIN FILHO, 2006). KOCHMAN (1979),
avaliando o efeito da temperatura no desenvolvimento da ferrugem
asiática, verificou que a faixa de temperatura entre 17 e 27 °C
apresentou-se como a melhor condição para o desenvolvimento da
ferrugem, ao passo que temperaturas superiores a 28,5 °C
comprometeram o desenvolvimento do fungo. BONDE et al. (2006)
avaliaram o efeito da temperatura na germinação dos esporos e do tubo
germinativo de seis isolados de P. pachyrhizi, provenientes de Taiwan,
Zimbábue, Havaí, Brasil e dois isolados dos Estados Unidos. Os autores
12
constataram que todos apresentaram temperatura ótima de germinação
entre 17 e 28 °C, sendo a ideal entre 20 e 22 °C.
Concomitante à temperatura, o período de molhamento foliar
constitui um fator importante no desenvolvimento da ferrugem. Associado
a uma faixa ideal de temperatura, um período de 6 a 10 horas de
molhamento foliar proporciona condições ideais para a infecção do fungo.
MELCHING et al. (1989) avaliaram o efeito da temperatura e molhamento
foliar no tempo para penetração da ferrugem e demonstraram um período
de 6 horas na faixa de temperatura de 18 a 26 °C.
O ciclo de vida de P. pachyrhizi inicia-se com a produção de
urediósporos (esporos) provenientes das urédias - estruturas de
frutificação do fungo (ZAMBOLIM, 2006). Os urediósporos são facilmente
disseminados pelo vento, atingindo assim, lavouras próximas ou distantes
(YORINORI, NUNES JUNIOR & LAZZAROTTO, 2004).
Em condições favoráveis para o desenvolvimento, ao atingirem as
folhas de soja, ocorre a germinação dos urediósporos, com a
conseqüente formação do apressório (estrutura de fixação do fungo),
ocorrendo a penetração diretamente pela epiderme da folha, raramente
pelos estômatos (ZAMBENEDETTI, 2005).
Sob condições favoráveis à infecção e colonização, os sintomas
podem surgir de 5 a 7 dias, com a conseqüente formação de urediósporos
num período de 9 a 12 dias após a germinação e penetração. As urédias
podem produzir urediósporos por até 3 semanas (ZAMBOLIM, 2006).
13
As lesões foliares causadas por P. pachyrhizi são pequenas
manchas de coloração castanha a marrom-escura. À medida que ocorre a
esporulação, o tecido da folha adquire coloração castanho-clara (lesão
tipo TAN, característica de genótipos suscetíveis) a castanho-
avermelhada (lesão tipo RB – reddish-brown, característica de genótipos
tolerantes) (BROMFIELD, 1982).
2.2.3 – Métodos de Controle
As variações climáticas nas diversas áreas de cultivo de soja
podem exercer influência na severidade final da doença, o que dificulta
uma recomendação genérica de controle que satisfaça todas as regiões.
Atualmente o controle químico e o manejo da cultura têm sido os
meios de minimizar os danos causados pela ferrugem asiática da soja.
Algumas medidas têm sido adotadas, como semear cultivares mais
precoces e evitar a semeadura em várias épocas e cultivares tardias;
Essas medidas reduziriam os danos por receber uma maior carga de
esporos multiplicados nas primeiras semeaduras. Além disso, semear a
soja com densidade de plantas que favoreça bom arejamento foliar
contribui para otimizar a penetração e a cobertura pelos fungicidas
(YORINORI, NUNES JUNIOR & LAZZAROTTO, 2004; ANDRADE &
ANDRADE, 2006).
O controle químico da doença, com a aplicação de fungicidas, tem
sido uma medida adotada pelos agricultores, aliada a um correto
monitoramento, estabelecendo unidades de alerta em períodos de
14
semeadura da cultura (ANDRADE & ANDRADE, 2006). Para a safra
2007/2008, 35 produtos comerciais encontram-se registrados para o
controle da ferrugem (EMBRAPA-SOJA, 2007d).
A obtenção de cultivares de soja resistente à doença tem sido um
desafio à pesquisa. Quatro genes foram identificados como responsáveis
pela tolerância e conseqüentemente levando à ocorrência de lesões do
tipo RB nos cultivares, sendo eles Rpp1, Rpp2, Rpp3 e Rpp4 (McLEAN &
BYTH, 1980; HARTING, 1986). No entanto, Rpp1 e Rpp3 tiveram sua
resistência quebrada, restando apenas Rpp2 e Rpp4 conferindo tolerância
às raças fisiológicas do patógeno existentes no Brasil (ARIAS et al.,
2004).
2.3 – Mecanismos de Resistência a Doenças em Plantas
Em termos fitopatológicos, a doença é vista como uma interação
entre dois organismos: de um lado a planta, que recebe a denominação
de hospedeiro, e de outro, o agente causador da doença, chamado de
patógeno (KRUGNER, 1995).
Segundo AGRIOS (2004), uma planta é considerada saudável, ou
normal, quando ela pode executar suas funções fisiológicas no melhor do
seu potencial genético. Quando a habilidade das células de uma planta,
ou parte da planta, em executar as funções fisiológicas é interferida por
um organismo patogênico ou um fator ambiental adverso, as atividades
celulares são interrompidas, alteradas ou inibidas, a célula passa a
funcionar mal, ou morre, e a planta desenvolve uma doença.
15
Inúmeros organismos podem causar doenças em plantas, tais
como vírus, bactérias, fungos, nematóides e protozoários (HARRAR &
STACKMAN, 1957; FRY, 1982; BEDENDO, 1995a; SALGADO &
FERREIRA, 1995; BACCHI & KRUGNER, 1995; MONTEIRO & FERRAZ,
1995; BEDENDO, 1995b; AGRIOS, 2004).
Geralmente, um determinado patógeno é específico para um
determinado hospedeiro. A presença no patógeno, de um ou mais gene
para patogenicidade, especificidade e virulência contra um particular
hospedeiro é que possibilita o desenvolvimento da doença (AGRIOS,
2004).
A resistência de um hospedeiro, dentro de um contexto fisiológico,
pode ser definida como a capacidade da planta em atrasar ou evitar a
entrada e/ou o subseqüente ataque de um patógeno em seus tecidos
(LEITE & PASCHOLATI, 1995). A tolerância, por sua vez, provém em
suportar um ataque do patógeno sem que ocorram danos significativos
em sua produção (CAMARGO, 1995).
Num contexto genético, a interação entre a planta e o patógeno,
seria devido à presença de um gene de resistência (R) no hospedeiro e
um gene de avirulência (Avr) no patógeno, conforme proposto na
chamada teoria gene-a-gene (FLOR, 1971). De acordo com esta teoria a
indução da resposta de defesa é iniciada pelo reconhecimento por parte
da planta hospedeira, de moléculas sinalizadoras específicas (elicitores),
codificadas por genes Avr do patógeno. As proteínas que reconhecem os
elicitores são codificadas por genes R correspondentes, presentes nas
16
células vegetais. O reconhecimento do elicitor leva a uma cascata de
eventos de transdução de sinais que irá ativar genes da célula vegetal
hospedeira, resultando em uma rápida resposta de defesa. Quando o
patógeno não tem o correspondente gene Avr ele não é reconhecido pelo
hospedeiro e, portanto, não ocorre indução dos mecanismos de defesa,
ou esta ocorre de um modo bastante lento, o que possibilita o crescimento
do patógeno e o desenvolvimento da doença.
A resistência monogênica (vertical) envolve a presença de um
único gene, sendo este suficiente para conferir o efeito (CAMARGO,
1995). Usualmente, a resistência condicionada por um único gene é
estável sobre uma grande variação de condições ambientais. Entretanto,
a expressão da resistência algumas vezes é alterada pelo estágio de
desenvolvimento da planta (HOOKER & SAXENA,1971). Porém existem
questionamentos sobre as terminologias adotadas para a resistência,
atribuindo àquelas ocasionada por poucos genes (oligogênica), como uma
resistência vertical.
Existem casos em que a resistência ocorre devido ao envolvimento
de vários genes (resistência poligênica ou horizontal). Em um mesmo
hospedeiro, mecanismos de resistência monogênicos e poligênicos
podem estar presentes (HOOKER & SAXENA, 1971, CAMARGO, 1995,
AGRIOS, 2004).
O reconhecimento da presença do patógeno conduz a respostas
de defesa do hospedeiro, que incluem, por exemplo, a morte celular
programada de células da planta que estão em contato com o patógeno;
17
um fenômeno chamado de resposta de hipersensibilidade (HR)
(GLAZEBROOK, 2001). Esta reação culmina na parada do crescimento
e do desenvolvimento do patógeno nos tecidos da planta.
Durante os mecanismos celulares de defesa, há a formação de
substâncias reativas de oxigênio devido a combustão oxidativa, alteração
do potencial de membrana e aumento na concentração de moléculas
sinalizadoras. Ácido salicílico, ácido jasmônico, etileno, óxido nítrico bem
como as ―espécies reativas de oxigênio‖ são exemplos de sinalizadores
para a ativação de genes envolvidos na resposta de resistência
(GLAZEBROOK, 2001; SINGH, FOLEY & OÑATE-SANCHEZ, 2002;
FARMER, ALMÉRAS & KRISHNAMURTHY, 2003; WENDEHENNE,
DURNER & KLESSIG, 2004).
Tais moléculas sinalizadoras podem induzir a expressão das
chamadas proteínas relacionadas à patogênese - proteínas PR
(Pathogenesis-related). Estas proteínas são produzidas pela planta
hospedeira, mas induzidas sobre condições patológicas (VAN LOON &
STRIEN, 1999). Como exemplos de proteínas PR, podem-se mencionar
as quitinases e glucanases (KITAJIMA & SATO, 1999).
Quitinases e β-1,3-glucanases são enzimas líticas que ocorrem
normalmente nas plantas. Elas hidrolisam a quitina e as β-1,3-glucanas e
podem estar envolvidas na defesa contra fungos, visto que os polímeros
citados mostram-se como os principais constituintes da parede celular
fúngica (PASCHOLATI & LEITE, 1995).
18
Os mecanismos de resistência são geralmente divididos em duas
categorias: pré-formados (passivos) e pós-formados (ativos). Ambos
podem ser subdivididos em estruturais e bioquímicos. Os fatores
estruturais da planta atuam como barreiras físicas, impedindo a entrada
do patógeno e a colonização dos tecidos, enquanto que as reações
bioquímicas que ocorrem nas células do hospedeiro visam criar condições
adversas ao crescimento do patógeno ou mesmo apresentarem-se como
substâncias tóxicas (PASCHOLATI & LEITE, 1995).
Outro grupo de substâncias que são expressas sobre
patogenicidade, são as fitoalexinas, que são constituintes dos fatores de
resistência bioquímicos pós-formados. São definidas como compostos
antimicrobianos de baixo peso molecular, sendo sintetizados pelas
plantas e se acumulam nas células vegetais em resposta à infecção
microbiana (PASCHOLATI & LEITE, 1995). Essas moléculas são
produzidas em resposta ao reconhecimento de um elicitor, que podem ser
constituintes de microrganismos, bem como presentes na parede celular
da planta (DARVILL & ALBERSHEIM, 1984).
A forma como uma planta vem a desenvolver um mecanismo de
resistência frente a um determinado patógeno tem sido foco de muitos
estudos, aliando as mais diversas áreas do conhecimento, como
fitopatologia, biologia molecular, bioquímica e genética. Uma vez que a
interação planta-patógeno pode ser diferente dependendo do
patossistema considerado, a busca pelo entendimento dos mecanismos
de resistência estará sempre à luz de novas elucidações.
19
3 - OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve como objetivo, estimar, através da técnica de
PCR em tempo real, os níveis de expressão de genes que supostamente
estejam envolvidos no mecanismo de defesa da soja à ferrugem asiática,
causada pelo fungo P. pachyrhizi.
3.1 - Objetivos Específicos
Selecionar genes que estejam relacionados ao mecanismo de
defesa contra patógenos.
Compreender, em parte, o mecanismo molecular de defesa da
soja, frente ao patógeno P. pachyrhizi.
Gerar conhecimento para o desenvolvimento de estratégias
eficientes no controle da doença.
20
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – Seleção dos Genes
A seleção dos genes para a análise da expressão gênica em soja
após a infecção com a ferrugem asiática foi baseada em revisão de
literatura, visando identificar genes envolvidos na resposta de resistência
e mecanismos de defesa. Após a seleção promoveu-se o acesso das
seqüências no banco de dados GenBank, disponibilizado gratuitamente
no link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
4.2 – Construção dos Oligonucleotídeos
Após a seleção dos genes, foram confeccionados os
oligonucleotídeos para a análise da expressão gênica em soja após
inoculação com P. pachyrhizi.
Foi utilizado o programa VECTOR NTI
®
(distribuído gratuitamente
pela Invitrogen
®
, através do link www.invitrogen.com/vectorNTIcommunity)
para o manuseio das seqüências disponibilizadas no GenBank e
avaliação dos oligonucleotídeos desenhados.
Após a identificação das regiões específicas para um determinado
gene, selecionadas a partir do alinhamento entre genes relacionados à
mesma proteína, foi utilizado o programa Primer Express
TM 2
2.0, (Applied
Biosystems) para a confecção dos oligonucleotídeos. Os parâmetros
utilizados para a construção dos mesmos estão especificados na tabela 1.
21
Tabela 1 - Parâmetros utilizados para a construção dos
oligonucleotídeos.
Temperatura de anelamento
Mínimo: 58 °C
Máximo: 62 °C
Conteúdo de GC no oligonucleotídeo
Mínimo: 20%
Máximo: 80%
Tamanho do Oligonucleotídeo
Mínimo: 18 bases
Máximo: 25 bases
Tm do Amplicon
Mínimo: 75 °C
Máximo: 85 °C
Tamanho do Amplicon
Mínimo: 50 bases
Máximo: 150 bases
Após selecionar os pares de oligonucleotídeos que atendiam a
essas condições, foi utilizado novamente o programa VECTOR NTI
®
para
verificar a formação de dímeros, dobramento (hairpin) e força de ligação
entre os oligonucleotídeos.
4.3 – Material Biológico
Foram utilizados dois genótipos de soja. Embrapa-48, uma cultivar
suscetível a P. pachyrhizi (Embrapa-Soja, 2006b), e PI 230970, que
possui o alelo Rpp2, sendo tolerante ao patógeno (USDA, 2007).
O material foi cedido pelo Banco de Germoplasma (BAG) da Embrapa-
Soja.
22
4.4 – Delineamento Experimental
O experimento foi montado em três Fitotrons (sala climatizada),
sendo cada, uma unidade independente. Cada Fitotron estava
programado para uma temperatura de 22 °C e um fotoperíodo de 14
horas.
Para a análise de expressão gênica foram definidos 7 (sete)
tempos de coleta do material, após inoculação: 1 hora, 12 horas, 24
horas, 48 horas e 192 horas.
As sementes dos genótipos foram distribuídas em vasos
devidamente identificados. Em cada Fitotron, para cada genótipo, foram
utilizados quatorze vasos, contendo quatro plantas cada. Esses vasos
foram distribuídos em dois grupos: plantas que receberam a inoculação
do fungo P. pachyrhizi e plantas que receberam uma falso-inoculação
(água) (Figura 1).
Figura 1 - Esquema da disposição do material no Fitotron
23
4.5 – Inoculação do Patógeno
As plantas foram inoculadas no estádio de desenvolvimento V2-V3,
de acordo com a escala fenológica de FEHR & CAVINESS (1977).
Inicialmente as plantas controle receberam a inoculação com água. A
água foi borrifada sobre as plantas, que posteriormente foram cobertas
com sacos plásticos. No segundo grupo de plantas (inoculados com o
fungo P. pachyrhizi), foi borrifada uma solução contendo 0,05% de
polioxietileno sorbitano monolaurato (Tween 20) e água com esporos do
fungo, numa concentração de 300.000 esporos por mL. Após a
inoculação, as plantas também foram cobertas com sacos plásticos.
Posteriormente, todo o material foi transferido para o Fitotron (Figura 2).
Figura 2 - Ilustração dos vasos no Fitotron
24
4.6 – Coleta do Material
Para a análise da expressão gênica foi coletado um trifólio de uma
das quatro plantas de cada vaso. Os vasos foram identificados pelo
genótipo, tratamento e tempo de coleta. Cada vaso continha plantas
enumeradas de 1 a 4, sendo que apenas uma delas foi utilizada para a
extração de RNA. A escolha das plantas a ser extraído o RNA foi feita
após análise fenotípica (dados não apresentados).
Após a retirada do trifólio, o mesmo foi embalado em papel
alumínio, identificado com o genótipo, tratamento, tempo de coleta e
número da planta. O material foi congelado imediatamente em nitrogênio
líquido e armazenado em ultrafreezer -80 °C para a posterior extração do
RNA (Figura 3).
Figura 3 - Esquema da coleta do material
25
4.7 – Extração do RNA
A extração de RNA das amostras coletadas foi feita utilizando o
reagente TRIZOL, seguindo as recomendações do fabricante
(Invitrogen
TM
). Todas as etapas para isolamento do mRNA para análise
de expressão gênica foram conduzidas a 4 C. A água e as soluções
utilizadas foram tratadas com dietilpirocarbonato (DEPC) 0,1%, a 37C
por 8 h, e, em seguida, autoclavadas. Cerca de 100 mg de folhas das
cultivares de soja Embrapa-48 e PI 230970 foram triturados em nitrogênio
líquido.
O material triturado foi transferido para tubos eppendorfs de 1,5
mL, adicionando 1 mL de TRIZOL. Após a adição do TRIZOL, o material
foi misturado com o auxílio de um vortex, por aproximadamente 1 minuto
e centrifugado por 10 minutos a 12.000 rpm.
Após a centrifugação o pellet foi descartado e o sobrenadante
transferido para novos tubos, deixando em temperatura ambiente (15 a
30°C) por 5 minutos. Posteriormente foram adicionados 200μL de
clorofórmio e o material homogeneizado em vortex por aproximadamente
15 segundos.
Após permanecer em temperatura ambiente por 3 minutos,
procedeu-se uma centrifugação por 15 minutos a 12.000 rpm.
Aproximadamente 500 μL do sobrenadante foram transferidos para novos
tubos, onde foi adicionado 500 μL de isopropanol. O material foi
homogeneizado manualmente e deixado em sala climatizada por 10
minutos. Uma nova centrifugação foi realizada (10 minutos por 12.000
26
rpm) onde posteriormente o sobrenadante foi descartado, permanecendo
o pellet formado. Foi adicionado 1 mL de etanol 75%, seguido de uma
homogeneização em vortex por 15 segundos.
Após centrifugar por 5 minutos a 9.500 rpm, o sobrenadante foi
descartado e o pellet permaneceu em temperatura ambiente por 8
minutos. Foram utilizados 50 μL de água milli-Q tratada com DEPC, para
ressuspender o pellet. O material foi armazenado em freezer -80°C.
O RNA total foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm. A
integridade do RNA total isolado foi avaliada por eletroforese em gel de
agarose desnaturante (contendo 0,6 moles/L de formaldeído), a 1% e
contendo 0,1 mg/mL de brometo de etídio. Como tampão de corrida foi
utilizado o tampão TBE (Tris – 10,8 g, Ácido Bórico – 5,5 g e EDTA – 4
mL 0,5 M pH 8,0).
4.8 – Síntese do cDNA
A primeira fita do cDNA foi sintetizada com auxílio da transcriptase
reversa MMLV-RT (Maloney Murine Leukemia Vírus Reverse
Transcriptase) e oligonucleotídeos aleatórios (primer randômico).
À cerca de 1,5 μg de RNA foi adicionado 1g do primer randômico,
sendo o volume final da reação, 11 L, ajustado pela adição de água
tratada com DEPC. A reação foi incubada por 3 minutos à temperatura 80
ºC. Posteriormente foi transferido para o gelo, sendo adicionado o mix da
reação, constituído por: 6 μL de RT-Buffer (5x), 4μL de dNTP´s (0,4 mM),
27
2 μL de DTT (0,8 mM) e 2 μL Transcriptase Reversa (400 U/mL). A
reação foi novamente incubada no termociclador a 37 °C por 60 minutos
permanecendo 10 minutos a 65 °C.
4.9 – PCR Qualitativo
O PCR qualitativo foi utilizado para verificar a amplificação dos
oligonucleotídeos antes de iniciarmos os testes em PCR quantitativo em
tempo real. O material utilizado foi DNA genômico de soja e dois tipos de
cDNA (após inoculação com o fungo P. pachyrhizi e outro após
inoculação com o nematóide Meloidogyne javanica).
As condições de termociclagem foram 50 ºC por 2 minutos, 95 ºC
por 2 minutos e 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 15 segundos,
seguida de 60 ºC por 30 segundos, para o anelamento dos
oligonucleotídeos e 72 °C por 30 segundos para a extensão dos
fragmentos.
Foram utilizados 2,5 μL de tampão 10x (10mM de Tris e 50mM de
KCl), 0,75 μL de MgCl
2
(50 mM), 1 μL de dNTP´s (2,5 mM), 0,2 μL de
Taq-Polimerase (5 U/μL), 0,5 μL de oligonucleotídeos forward e reverse
(10 μM) e 2 μL de DNA genômico ou cDNA, completando com Água Milli-
Q para um volume final de 25 μL por reação.
28
4.10 – PCR em Tempo Real
As reações de PCR em tempo real foram conduzidas em
equipamento ABI PRISM® 7300 Sequence Detection System (Applied
Biosystems). A amplificação dos genes alvos foi realizada utilizando-se a
metodologia SYBR Green. Como referência endógena foi utilizado o gene
que codifica rRNA 18S. A amplificação dos genes alvos e da referência
endógena foi realizada em diferentes tubos, na mesma placa de reação.
A amplificação de cada sistema foi avaliada previamente a fim de
que a eficiência dos genes alvo e a referência endógena se mostrassem
similares.
A eficiência da amplificação é medida pela fórmula: E= [10
-1/slope
] -1,
onde o slope indica a inclinação da reta, cujo valor próximo a -3,3 indica
uma eficiência próxima de 100%. Após verificar a eficiência do gene,
escolheu-se a diluição do cDNA e a concentração dos oligonucleotídeos
adequadas para preparar as reações da quantificação relativa.
À 2 µL da reação da primeira fita do cDNA foram adicionados 0,2 a
0,4 pmoles de cada oligonucleotídeo e 12,5 µL do tampão SYBR Green
master mix, que contém todos os componentes necessários à
amplificação (as enzimas uracil N-glicosilase e AmpliTaq Gold, MgCl2,
dNTPs, KCl e o fluoróforo SYBR green), em um volume final de 25 µL.
Em cada placa, foram amplificadas amostras controle, que
apresentavam todos os reagentes necessários à amplificação, exceto
DNA. As condições de termociclagem foram 50 ºC por 2 minutos, para
permitir a ação da uracil N-glicosilase, 95 ºC por 10 minutos para a
29
ativação da DNA polimerase ―Hot Start” que é pré-complexada, com um
anticorpo monoclonal específico que inibe a atividade da DNA polimerase
em temperatura ambiente, e 40 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 15
segundos, seguida de 60 ºC por 1 minuto, para anelamento dos
oligonucleotídeos e amplificação. Ao final dos 40 ciclos de amplificação,
um período adicional de 30 minutos, com elevação gradual da
temperatura de 60 ºC a 94 ºC foi utilizado para obtenção da curva de
dissociação.
A determinação dos níveis de expressão dos genes alvos foi
realizada pela quantificação relativa utilizando a expressão 2
-∆∆CT
. Para
cada tratamento é detectado o valor de Ct (Cycle threshold), tanto para o
gene alvo quanto para o controle endógeno. Este valor representa o ponto
em que o sinal de amplificação é detectado. O valor do Ct do gene alvo é
subtraído do valor do Ct do controle endógeno, para normalizar a reação.
Obtém então o valor de ∆Ct. O valor de ∆Ct dos tratamentos é subtraído
do valor do ∆Ct da amostra controle (calibrador), tendo-se o valor de
∆∆Ct. Este valor é utilizado na fórmula do nível de expressão, onde o
número 2 representa a somatória da eficiência do gene alvo e do controle
endógeno, considerando que ambos os genes possuem 100% de
eficiência.
30
4.11 – Análise Estatística
Foi realizada uma análise de variância combinada, utilizando como
repetições as triplicatas do material biológico, presentes em cada placa da
análise de PCR em tempo real.
Os níveis de expressão dos genes avaliados entre cada
tratamento, inoculado e não inoculado, dentro de cada Fitotron, foram
analisados pelo teste t ao nível de 5 e 1% de significância.
31
5 – RESULTADOS
5.1 – Seleção dos genes para a análise da expressão gênica
Para análise de expressão gênica foram utilizados genes que estão
envolvidos em mecanismos de defesa ou que são ativados por mudanças
fisiológicas na planta em resposta à patógenos (Figura 4). Foi feita uma
revisão de literatura para a identificação dos mesmos, sendo eles:
fenilalanina amônia liase (PAL), chalcona sintase 1 (Gmachs1),
superóxido dismutase (SodB2), lipoxigenase (lox7), quitinase (chib1-A),
beta-1,3-endoglucanase (Endogluc), mensageiro associado a estresse
(sam22), fator de ribosilação do ADP (ARF) e inibidor de
poligalactunorase 3 (pgip3).
Figura 4 - Esquema ilustrando possíveis mecanismos de ativação gênica
na planta, em resposta à presença de um fungo patogênico.
32
5.2 – Acesso dos genes no GenBank
Após a escolha dos genes, foi feita uma busca pela sua seqüência
no banco de dados GenBank. Inicialmente a busca foi feita com base na
seqüência protéica, pois desta forma reduziria o número de acessos. Ao
nome da proteína foi acrescido o termo Glycine max, para especificar o
organismo de interesse.
Foi verificado que alguns genes possuíam mais de um acesso. Isso
se deve ao fato da presença de mais de um tipo de proteína relacionada à
mesma função. Por conseguinte, com base na revisão de literatura, foi
feita a escolha do gene específico (Tabela 2).
Tabela 2 - Número de acesso no GenBank, dos genes utilizados no
experimento.
Proteína
N° de acesso
da proteína
Gene
N° de acesso
do gene
Inibidor de
poligalacturonase
CAI99394
pgip3
AJ972662
Chalcona sintase
CAA38456
Gmachs1
X54644
Fenilalanina amonia liase
P27991
PAL 1
X52953
Mensageiro associado a
estresse
CAA42646
Sam22
X60043
Fator de ribosilação do
ADP
AAD17207
ARF
AF114796
Quitinase
BAA77676
Chib1-A
AB007126
Beta-1,3-endoglucanase
AAA33946
Endogluc
M37753
Superóxido dismutase
AAQ13492
SodB2
AF108084
Lipoxigenase
AAC49159
Lox7
U36191
33
5.3 – Construção dos Oligonucleotídeos
Após a escolha dos genes, foi utilizado o programa VECTOR NTI
®
para o manuseio das seqüências. Uma vez que algumas proteínas
apresentavam mais de um acesso para os genes, foi necessário fazer um
alinhamento entre os nucleotídeos, utilizando o programa ClustalW (1.83),
com o objetivo de selecionar as regiões candidatas para a construção dos
oligonucleotídeos, sendo estas, específicas para um determinado gene.
Outro procedimento adotado antes da construção dos
oligonucleotídeos foi a identificação de regiões conservadas na proteína.
Essa análise teve por objetivo evitar o uso de nucleotídeos que estavam
associados a domínios conservados entre proteínas diferentes.
Entre os genes selecionados, pgip3 apresentava somente a
seqüência de nucleotídeos traduzida, demarcada do códon de iniciação
ATG ao códon de parada ATT. O alinhamento entre pgip3 e os outros 3
genes para a proteína Pgip (pgip1, pgip2 e pgip4) revelou grande
identidade entre os mesmos, disponibilizando poucas regiões de
nucleotídeos específicas para o gene pgip3.
A estratégia adotada foi a identificação de regiões além do códon
de parada do gene, com o objetivo de encontrar a região 3´ não-traduzida
e assim, construir o oligonucleotídeo nessa região.
Para realizar a extensão desse gene, foi selecionada a seqüência
de nucleotídeos do mesmo e promovido um alinhamento com ETS´s
(Expressed Sequence Tag) de soja. Foi utilizado o programa BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool) disponibilizado gratuitamente no link
34
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. A partir desse alinhamento,
estendeu-se 180 nucleotídeos na região 3´ não-traduzida do gene,
identificando a cauda poli-A do mesmo. Essa região foi utilizada para a
construção dos oligonucleotídeos para pgip3.
Uma vez selecionadas as regiões dos genes para a construção dos
oligonucleotídeos, foi utilizado o programa Primer Express
TM 2
2.0 para a
confecção dos mesmos. Após a seleção dos pares de oligonucleotídeos
para cada gene, foi realizada a análise da força de ligação e formação de
dímeros entre os primers, utilizando o VECTOR NTI
®
.
Para o gene lox7, foram construídos dois pares de
oligonucleotídeos. Um amplificando a região 5´ não-traduzida do gene e o
outro amplificando a região 3´ não-traduzida. Esta estratégia foi adotada
uma vez que se encontrou dificuldade em construir os oligonucleotídeos
para esse gene, pois apresentava elevada identidade entre os
nucleotídeos dos genes para as demais lipoxigenases em soja, bem como
regiões que atendessem aos parâmetros utilizados para a construção dos
oligonucleotídeos.
Na tabela 3 são apresentadas as seqüências dos
oligonucleotídeos, tamanho do amplicon e a temperatura de anelamento
(TA) estimada pelo programa Primer Express
TM 2
2.0 para cada
oligonucleotídeo.
35
Tabela 3 - Seqüência dos oligonucleotídeos, tamanho do amplicon
e temperatura de anelamento.
Gene Alvo
Seqüência
Amplicon
TA °C
Inibidor de
poligalacturonase 3
(Pgip3)
F: GTTTGTGTGGCTCTCCTCTTCC
85 pb
59
R: CCATCCGTTCTTATTAATCCAAGC
59
Chalcona sintase 1
(Gmchs1)
F: TTGCTACTTCCCACTTCCATTCTT
111 pb
59
R: GTGCCAATAGCCATGACAGTG
58
Fenilalanina amônia
liase 1 (Pal 1)
F: GCAATTCCAAACAAGATCCAAGA
79 pb
59
R: GCAACCCAGTCCCTAATTCCTC
60
Mensageiro associado a
estresse (Sam22)
F: ACACGGCGGAGAAGATCACAT
78 pb
60
R: TGACAGTGAGCTTCCCAGCAG
60
Fator de ribosilação do
ADP (ARF)
F: TGAAGGTTTGGACTGGCTTTC
87 pb
58
R: CGCATGAAATCACCAGACAAG
58
Quitnase (Chib1-A)
F: CCCTGATGCTCACTTGGATAGA
83 pb
58
R: GCATGAAGGGTTGTTGTAGAAT
58
Beta-1,3 endoglucanase
(Endogluc)
F: TTGGGGGCTCTTTTCTCCTAT
86 pb
58
R: TCACACCAAATTATGCTTCTGCT
58
Superóxido dismutase
(SodB2)
F: TGGCGTCATGAGGAATAGTGGAT
120 pb
61
R:
AGAACATAATCTGCAGGCTGAAGTG
60
Lipoxigenase 7
(Lox7_5UTR)
F: ACAAGCTAGGCACAAGAAAACCA
111 pb
60
R: TTGTTCCTCCGATGATTCCAA
60
Lipoxigenase 7
(Lox7_3UTR)
F: TTGAGGTTGCTGTACTACTCTGCC
99 pb
59
R: CACCCCAAATGTAACTTGACCAT
59
36
5.4 – Teste de amplificação dos oligonucleotídeos
Antes de se iniciar as análises de PCR em tempo real, foi feito um
teste de amplificação dos oligonucleotídeos através do PCR
convencional. Para realizar este teste utilizou-se como material a ser
amplificado cDNA e DNA genômico de soja.
Quando foi utilizado DNA genômico de soja para a amplificação,
com todos os oligonucleotídeos, foram obtidos fragmentos com tamanho
conforme o esperado (figura 5), com exceção de Lox7_5UTR que não
amplificou, e ARF, que amplificou um fragmento de aproximadamente
550pb, o que indica a possivelmente a presença de um intron na região
flanqueada por esses dois oligonucleotídeos.
Figura 5 - Amplificação dos oligonucleotídeos utilizando DNA Genômico
de Soja. M (marcador 100pb) 1.1 (Gmchs1), 1.2 (controle
Gmchs1); 2.1 (SodB2), 2.2 (controle SodB2), 3.1
(Lox7_3UTR), 3.2 (controle Lox7_3UTR); 4.1 (Lox7_5UTR),
4.2 (controle Lox7_5UTR); 5.1 (Pgip3), 5.2 (controle Pgip3);
6.1 (ARF), 6.2 (controle ARF); 7.1 (Sam22), 7.2 (controle
Sam22); 8.1 (PAL), 8.2 (controle PAL); 9.1 (Chib1A), 9.2,
(controle Chib1A); 10.1(Endogluc), 10.2 (controle Endogluc).
37
A amplificação utilizando cDNA após inoculação com P. pachyrhizi
e M. javanica também levou à produção de fragmentos com os tamanho
esperados. O oligonucleotídeo Lox7_5UTR que em DNA genômico não
havia amplificado, produziu, em cDNA, uma banda de tamanho
correspondente ao seu amplicon (111pb). ARF, em cDNA, amplificou um
fragmento de 87pb (figura 6). Isso reforça a possibilidade da presença de
um intron em ambos os genes, visto a diferença na amplifica gerada em
DNA genômico e cDNA.
Figura 6 – Amplificação dos oligonucleotídeos utilizando cDNA de soja
inoculado com P. pachyrhizi e Meloidogyne javanica. M
(marcador 100pb); 1 (Gmchs1 – cDNA P. pachyrhizi); 2
(Gmchs1 – cDNA M. javanica); 3 (controle Gmchs1); 4
(SodB2 - cDNA P. pachyrhizi; 5 (SodB2 – cDNA M. javanica);
6 (controle SodB2); 7 (Lox7_3UTR - cDNA P. pachyrhizi; 8
(Lox7_3UTR - cDNA M. javanica); 9 (controle Lox7_3UTR);
10 (Lox7_5UTR - cDNA P. pachyrhizi; 11 (Lox7_5UTR -
cDNA M. javanica); 12 (controle Lox7_5UTR); 13 (Pgip3 -
cDNA P. pachyrhizi; 14 (Pgip3 - cDNA M. javanica); 15
(controle Pgip3); 16 (ARF - cDNA P. pachyrhizi; 17 (ARF -
cDNA M. javanica); 18 (controle ARF); 19 (Sam22 - cDNA P.
pachyrhizi; 20 (Sam22 - cDNA M. javanica); 21 (controle
Sam22); 22 (PAL - cDNA P. pachyrhizi; 23 (PAL - cDNA M.
javanica); 24 (controle PAL); 25 (Chib1A - cDNA P.
pachyrhizi; 26 (Chib1A - cDNA M. javanica); 27 (controle
Chib1A).
38
Um novo teste de amplificação foi realizado, com o objetivo de
verificar a faixa de amplificação dos oligonucleotídeos, com exceção de
Gmchs1 e SodB2, que apresentaram uma banda de alta intensidade
quando amplificados a 60 °C. Foi estabelecido um gradiente de
temperatura de amplificação, variando de 58 °C a 62 °C.
Todos os oligonucleotídeos amplificaram dentro da faixa de
temperatura estabelecida (figura 7 e 8). Este teste possibilitou a escolha
do oligonucleotídeo a ser utilizado para a amplificação do gene
lipoxigenase, sendo aqueles que anelam na região 5´ não-traduzida do
gene.
Figura 7 – PCR Gradiente para os oligonucleotídeos Lox7_3UTR,
Lox7_5UTR, PAL e Chib1-A. M (Marcador 100pb),
1 (58 °C), 2 (59 °C), 3 (60 °C), 4 (61 °C), 5 (62 °C) e 6
(controle).
39
Figura 8 - PCR Gradiente para os oligonucleotídeos Sam22, Endogluc e
ARF. M (Marcador 100pb), 1 (58 °C), 2 (59 °C), 3 (60 °C), 4
(61 °C), 5 (62 °C) e 6 (controle).
5.5 – Quantificação Relativa dos Genes Envolvidos na Resposta de
Resistência
A quantificação da expressão de genes potencialmente ativados
pela presença de P. pachyrhizi em soja foi determinada pela quantificação
relativa pela técnica de PCR em tempo real. As amostras de folhas dos
genótipos Embrapa-48 e PI 230970 foram coletadas 1 hora, 12 horas, 24
horas, 48 horas e 192 horas após a infecção, e após a extração do mRNA
as mesmas foram homogeneizadas em bulks para posterior síntese do
cDNA.
A obtenção da curva de amplificação obtida por PCR quantitativo
para cada par de oligonucleotídeos a partir da diluição das amostras de
cDNA, permitiu que os ajustes fossem feitos. Isto garantiu que a eficiência
de amplificação entre os genes alvos e a referência endógena fosse
similar, e conseqüentemente permitiram que as análises dos níveis de
40
expressão fossem realizadas pelo método 2
-∆∆Ct
(LIVAK & SCHMITTGEN,
2001).
A curva de dissociação gerada para os produtos de amplificação
demonstrou que todos os oligonucleotídeos estavam amplificando um
único fragmento, não havendo amplificação inespecífica.
A expressão dos genes analisados foi muito diferente entre os
Fitotrons, não sendo possível observar repetibilidade nos resultados
obtidos entre os mesmos.
Considerando o primeiro Fitotron, observou-se que o gene Chib1-A
se expressou 117 vezes mais na PI 230970 inoculada com o patógeno P.
pachyrhizi, quando comparado com o falso-inoculado. Em relação à
Embrapa-48, observou-se uma expressão 1,75 vezes mais que o falso-
inoculado. Para o gene sam22, a expressão só foi significativa no
genótipo tolerante inoculado, que se expressou 12,85 vezes mais. Não
houve expressão diferencial entre inoculado e não inoculado na Embrapa
48.
Os genes PAL, Gmchs1, Endogluc, SodB2, Pgip3 e Lox7_5UTR
também apresentaram expressão diferencial nos dois genótipos. O gene
ARF demonstrou uma expressão diferencial apenas no genótipo
suscetível.
Já no segundo Fitotron, o gene que se destaca com maior
expressão é o Gmchs1, no genótipo tolerante inoculado, sendo 53,74
vezes mais expresso que a amostra calibradora. Para este mesmo gene,
Embrapa-48 inoculado também aumentou sua expressão, sendo 21,9
41
vezes mais expresso. Chib1-A também foi um gene que se destacou,
sendo diferencialmente expresso nos dois genótipos, o mesmo
acontecendo com o gene pgip3.
Os genes Endogluc, SodB2 e Lox7_5UTR tiveram expressão
diferenciada na PI230970, quando inoculado com fungo. No genótipo
Embrapa-48 não foi observada diferença de expressão para esses genes.
Em contrapartida, os genes PAL, ARF e sam22 tiveram expressão
diferenciada no genótipo suscetível. No genótipo PI 230970 não foi
observada diferença de expressão para esses genes.
No terceiro Fitotron o gene Chib1-A foi diferencialmente expresso
em ambos os genótipos, ao passo que Gmchs1 e PAL somente no
genótipo PI 230970 e o gene Sam22 na cultivar Embrapa-48. Todos os
demais genes apresentaram expressão diferencial em ambos os
genótipos.
42
A tabela 4 sumariza os dados obtidos.
Tabela 4 – Valores da quantificação relativa (RQ) dos genes
relacionados à resposta à infecção de P. pachyrhizi nos genótipos PI
230970 e Embrapa 48, após inoculação com P. pachyrhizi.
Valor da expressão gênica (RQ)
PI 230970
(Tolerante)
Embrapa-48
(Suscetível)
Gene
Fitotron
1
Fitotron
2
Fitotron
3
Fitotron
1
Fitotron
2
Fitotron
3
Chib1-A
117,32
**
0,37*
2,19*
1,75**
6,60**
4,07**
Gmchs1
62,47**
48,41**
2,17**
26,21**
20,20**
0,41
NS
PAL 1
26,38**
2,43
NS
2,40*
18,02**
3,98*
1,48
NS
Endogluc
4,29*
7,80**
0,52
NS
38,93**
0,89
NS
0,19
NS
SodB2
2,96**
11,53*
0,42
NS
23,68**
0,80
NS
0,41
NS
ARF
0,90
NS
1,99
NS
0,21
NS
13,18**
0,42*
0,46
NS
LOX7_5UTR
1,76**
10,38**
0,02
NS
15,53**
1,21
NS
0,06
NS
Sam22
12,85**
1,25
NS
0,82
NS
1,44
NS
4,79**
3,32**
Pgip3
3,50**
5,11*
0,24
NS
16,89**
0,50*
0,22
NS
** - Valor significativo ao nível de 1%, calculado pelo teste t.
* - Valor significativo ao nível de 5%, calculado pelo teste t.
NS - não significativo.
43
6 - DISCUSSÃO
6.1 – Genes selecionados para a análise da quantificação relativa por
PCR em tempo real, em soja, após inoculação do patógeno P.
pachyrhizi
O reconhecimento do patógeno pela planta leva à indução da uma
resposta de defesa que é controlada por inúmeros genes que estão
envolvidos desde a detecção do patógeno até a resposta final. Em se
tratando de um fungo, num primeiro contato com a planta, este poderia
estar liberando poligalacturonases, que são enzimas que degradam a
parede celular da planta, sendo uma possível estratégia de ataque do
patógeno. Em contrapartida, uma estratégia de defesa da planta seria a
produção de proteínas inibidoras de poligacturonases – Pgip
(polygalacturonase-inhibiting protein) e desta forma, inibir a atividade das
poligalacturonases fúngicas (MAHALINGAM, WANG & KNAP, 1999).
Sendo assim, Pgip3 foi um dos genes que teve seus níveis de expressão
avaliados neste trabalho.
Outras enzimas também atuam como barreiras iniciais à infecção,
tais como, quitinases e β-1,3 glucanases, que hidrolisam a quitina e as β-
1,3-glucanas, visto que os polímeros citados mostram-se como os
principais constituintes da parede celular fúngica (MAUCH & STAEHELIN,
1989; GIJZEN, et al. 2001; BRAVO et al. 2003).
A infecção da planta por um patógeno pode desencadear a
liberação de moléculas elicitoras, tanto da planta como do patógeno, que
são capazes de ativar cascatas de transdução de sinais, que culminam
44
com a produção de espécies reativas de oxigênio, ácido salicílico, etileno,
que constituem as principais moléculas sinalizadoras. Além disso, a
resposta da planta à infecção pode levar à produção de fitoalexinas, que
são compostos antimicrobianos que atuam de forma direta sobre o
agressor, limitando o crescimento do patógeno. Enzimas tais como
fenilalanina amônia liase e chalcona sintase, são compostos chave na
rota das fitoalexinas (ESTABROOK & SENGUPTA-GOPALAN, 1991;
MORAN et al. 2003; TUTEJA, et al., 2003) e desde modo, também eleitas
para terem seus níveis de expressão avaliados na presença de P.
pachyrhizi.
O estresse causado pelo ataque do patógeno desencadeia a
produção de radicais superóxido, em função da produção de espécies
reativas de oxigênio na planta durante a HR. A presença desses
compostos é tóxica para o tecido vegetal, de modo que em resposta à
produção destes, há a expressão de enzimas superóxidos dismutases
(SOD), que convertem rapidamente os radicais superóxidos a peróxido de
hidrogênio, e assim protegem as células contra possíveis danos. A
atividade de SOD com conseqüente produção de H
2
O
2
é muito importante
durante a resposta de defesa, uma vez que H
2
O
2
pode atuar como
molécula sinalizadora durante a infecção. Ele atua como substrato para
peroxidação lipídica, que leva a produção de ácido jasmônico, um
sinalizador, além da ativação de PAL. Contribui para reforço da parede
celular (auxilia na formação de polímeros de lignina) e pode também
ativar aumento na síntese de fitoalexinas, por meio da biossíntese de
propanóides ou flavonóides, e ainda contribui para o aumento da
45
atividade da acido benzóico hidroxilase, que leva a produção de ácido
salicílico, outro sinalizador. Devido seu papel crucial na detoxificação
espera-se que SOD seja ativada nas interações com P. pachyrhizi.
Outra enzima que poderia estar presente no mecanismo de defesa
seria a lipoxigenase. Esta enzima atua na rota de produção do ácido
jasmônico, que por sua vez é um ativador de mecanismos de resistência.
Além do mais, a lipoxigenase poderia estar atuando também na rota das
enzimas oxidativas, bem como na produção de moléculas antimicrobianas
(SARAVITZ & SIEDOW, 1996).
Além desses genes, foi incluído um fator de ribosilação do ADP
(ARF – ADP-ribosylation factor), que atua no controle do ciclo celular
durante o desenvolvimento, e tem sido mostrado aumentar o nível do seu
transcrito quando exposto a peróxido de hidrogênio e a moléculas
sinalizadoras, como o ácido salicílico (LEE et al. 2003).
Completando a lista dos genes, foi escolhido um mensageiro
associado à resposta a patógenos e injúrias; identificado em soja como
Sam22 (Stress Associated Messages 22), pertencente ao grupo das
proteínas relacionadas à patogênese PR-10 (CROWELL et al. 1992).
6.2 – Quantificação relativa dos genes envolvidos no mecanismo de
defesa da soja frente a P. pachyrhizi
Foi observado que o nível de expressão gênica entre os Fitotrons
foi muito variável. Em função do baixo número de plantas com alto nível
de infecção nos Fitotrons 2 e 3 (26,6% e 28,5%, respectivamente), os
46
dados obtidos a partir dos mesmos não serão discutidos. Serão discutidos
mecanismos de defesa proposto com base no perfil encontrado no
Fitotron 1, onde mais de 80% das plantas apresentaram alto nível de
infecção.
Considerando um possível mecanismo de defesa proposto para a
soja frente à ferrugem asiática, a expressão do gene Chib1-A seria um
ponto chave no processo de defesa celular, sendo uma fonte efetiva de
combate ao patógeno.
A quitinase caracteriza-se por ser uma enzima hidrolítica, que
degrada a quitina, um polímero de ligação β, 1-4 de N-acetil-D-
glucosamina (BISHOP, DEAN & MITCHELL-OLDS, 2000; BRAVO et al.,
2003). Uma vez que a quitina é o principal componente da parede celular
de fungos, genes relacionados à produção de quitinases são associados
a vias de respostas de defesa da planta a estes patógenos.
VAN LOON (1997) propõe a localização das proteínas
relacionadas à patogenicidade (PR) quanto a sua característica ácida ou
básica. As enzimas ácidas estariam localizadas no apoplasto, ao passo
que as básicas predominantemente nos vacúolos. As proteínas
localizadas no espaço intercelular estariam atuando como uma primeira
linha de combate ao patógeno.
Chib1-A codifica uma quitinase em soja, pertencente ao grupo das
PR-8. WATANABE et al. (1999), verificaram tratar-se de uma PR ácida,
tendo sua expressão aumentada por etileno, respondendo também a
ácido salicílico e ferimento, associando esta proteína a uma resposta de
ataque patogênico.
47
A presença do patógeno P. pachyrhizi induziu um aumento na
expressão desse gene em ambos os genótipos avaliados, no entanto, sua
expressão foi mais intensa no genótipo tolerante (PI230970). Este perfil
de expressão pode estar relacionado à rápida produção da quitinase,
atuando com uma primeira linha defesa, buscando reduzir a colonização
do fungo. No genótipo suscetível essa expressão pode não ter sido tão
efetiva, ou tardia. KHAN & SHIH (2004), trabalhando com morangos,
também verificaram o aumento na indução de quitinases após inoculação
com o fungo patogênico Colletotrichum, relacionando esse aumento à
defesa celular. O mesmo foi observado por BLIFFELD et al. (1999),
trabalhando com trigo.
Outra proteína que poderia estar atuando juntamente com a
quitinase é a beta-1,3-endoglucanase. Esta proteína hidrolisa a ligação
1,3-β-D-glicosídica da parece celular dos patógenos, liberando
oligossacarídeos glucans, que por sua vez podem elicitar a expressão
gênica do hospedeiro (TAKEUCHI et al., 1990). Beta-1,3-endoglucanase
pertence à classe III das glucanases de soja, sendo uma PR-Q de
localização extracelular (JIN et al., 1999).
Apesar de quitinase e beta-1,3 endoglucanase terem sido
expressos nos genótipos avaliados, o tempo e a intensidade de resposta
pode ter sido o ponto-chave para contra-atacar a presença do fungo. No
genótipo suscetível essa ativação pode também estar relacionada a uma
maior colonização do fungo no tecido do hospedeiro, enquanto no
tolerante (PI230970) esta resposta pode ter sido mais efetiva. Esta
observação foi comprovada por VAN DE MORTEL et al. (2007), que
48
verificaram uma maior taxa de colonização de P. pachyrhizi na cultivar
Embrapa-48, comparada com PI 230970.
MONTESANO, BRADER & PALVA (2003) relataram a atuação de
elicitores na resposta de defesa a patógenos, observando que muitos
deles estão constitutivamente presentes na parede celular do patógeno
como componentes estruturais. O exemplo citado neste trabalho foi
quitina e glucan, oligossacarídeos liberados pela degradação da parede
celular fúngica (SHIBUYA & MINAMI, 2001, DAY et al., 2001).
Intensificando a resposta de defesa no genótipo tolerante,
observou-se a expressão do gene Sam22 (Stress-associated message
22). Este gene poderia estar limitar a propagação do patógeno no
genótipo tolerante e assim minimizar os dados causados pela sua
colonização.
CROWELL et al. (1992) demonstraram que este gene aumenta sua
expressão em folhas de soja quando submetidas a ácido salicílico,
ferimento e elicitores fúngicos. Este gene pertence ao grupo das PR-10,
com domínio BetV1 (alergeno de Betula verrucosa – vidoeiro), e as
proteínas codificadas se caracterizam pelo baixo peso molecular e acidez
CHADHA & DAS (2006) relataram que PR-10 possuidoras do
domínio BetV1 poderiam promover uma interação com a membrana do
fungo, e assim exerceria atividade RNase, limitando a propagação do
mesmo. Além disso, ALKHAROUF, KHAN & MATTHEWS (2004)
verificaram alto nível de transcritos de Sam22 nas bibliotecas de soja
infectada com nematóide do cisto, sugerindo uma contínua indução deste
49
gene. O mesmo autor verificou também a expressão de Sam22 em
bibliotecas de soja infectadas com P. pachyrhizi (ALKHAROUF et al.,
2005).
Muitos autores relatam que um primeiro mecanismo de ataque de
fungos patogênicos seria a liberação de enzimas poligalacturonases (PG).
Essas enzimas atuam clivando a ligação entre resíduos de ácido D-
galaturônico, componentes da pectina - matriz de polissacarídeos da
parede celular da planta (FAVARON et al., 1994; MAHALINGAM, WANG
& KNAP, 1999; DE LORENZO & FERRARI, 2002).
Atuando também num mecanismo de retroalimentação das
respostas de defesa, o gene pgip3, que codifica uma proteína inibidora de
poligalacturonase, demonstrou ser diferencialmente expresso nos dois
genótipos infectados por P. pachyrhizi, comparado com os mesmos
genótipos não inoculados. O alto nível de expressão observado no
genótipo suscetível pode ser atribuído a uma maior colonização do
patógeno no tecido hospedeiro, uma vez que este não apresenta
barreiras efetivas ao crescimento do patógeno, o que pode ser confirmado
pela formação das lesões tipo TAN neste genótipo. Assim, novas células
foram parasitadas, o que poderia desencadear uma maior ativação e
conseqüente acúmulo do transcrito. No genótipo tolerante, a reposta de
defesa logo no início da infecção, restringindo o acúmulo e a taxa de
colonização do patógeno levaria a uma expressão mais pontual de pgip3,
e, conseqüentemente um menor acúmulo do transcrito. Uma expressão
tardia desde gene poderia também estar contribuindo para a propagação
do patógeno no hospedeiro suscetível.
50
Proteínas Inibidoras de Poligalacturonases (PGIPs) são induzidas
em estágios iniciais de infecção, e atuam sobre as poligalacturonases,
retardando o seu modo de atuação (DE LORENZO & FERRARI, 2002).
Ao degradar a parede celular da planta, as poligalacturonases
liberam oligômeros, chamados oligogalacturonases (OGs), que funcionam
como elicitores ativando mecanismos de defesa. Porém os mesmos são
inativados pela ação das PGs. As PGIPs por sua vez aumentariam o
tempo de ação dos oligômeros, por limitar a ação das poligalacturonases,
permitindo dessa forma que os elicitores ativassem respostas de defesa
por mais tempo(GOMATHI & GNANAMANICKAM, 2004).
FAVARON (1994) trabalhando com PGIP de soja verificou
diferenças na habilidade de inibição de pgip3 contra poligalacturonases
de Sclerotinia sclerotiorum, atribuindo a diferenças na estruturas das PGs,
incluindo o sítio de ligação para PGIP. D´OVIDIO (2006) verificou a
atividade antifúngica de pgip3, comparado às outras três PGIPs de soja.
Considerando que P. pachyrhizi é um fungo biotrófico,
necessitando, portanto, de células vivas do hospedeiro, a atuação das
poligalacturonases estariam relacionadas a uma leve maceração da
parede celular, atuando sobre a pectina, porém não a degradando
totalmente, o que poderia levar à destruição da célula. O mesmo foi
observado por SIMONS et al. (2005), trabalhando com fungo biotrófico
Cymadothea trifolii, em folhas de Trifolium spp.
Concomitante à liberação de elicitores pela ação de quitinase,
endoglucanase e inibidor de poligalacturonases, respostas de defesa
como a produção de fitoalexinas pôde ser observada nos dois genótipos.
51
Fitoalexinas são compostos antimicrobianos de baixo peso
molecular produzidos pela planta em resposta a infecção ou estresse
(DARVILL & ALBERSHEIM, 1984). Fenilalanina amonia liase (PAL) e
chalcona sintase (CHS) são duas enzimas chave que estão envolvidas na
biossíntese de fenilpropanóides - fitoalexinas (ESTABROOK &
SENGUPTA-GOPALAN, 1991).
Em presença do fungo P. pachyrhizi, os dois genótipos, PI 230970
e Embrapa-48 apresentaram aumento na expressão para esses dois
genes. Uma vez que estes genes estão envolvidos na rota de biossíntese
de fitoalexinas, a soja poderia responder à presença do patógeno
produzindo estes compostos antimicrobianos. VAN DE MORTEL et al.
(2007) apresentaram o perfil de expressão de genes relacionados à
biossíntese de flavonóides (fitoalexinas) na interação soja - P. pachyrhizi,
utilizando a cultivar Embrapa-48 e o genótipo PI 230970. Os autores
demonstraram que nos estágios iniciais da infecção a expressão desses
genes aumenta em ambos os genótipos, retornando ao nível do falso
inoculado por volta de 24 horas após infecção. Num estagio tardio da
infecção observou-se um aumento novamente na expressão desses
genes, porem com um perfil diferençado entre os genótipos, sendo ao
menos 1 dia mais cedo no genótipo PI 230970.
HAHN (1996) observou que mesmo sendo capazes de sintetizar
fitoalexinas, algumas plantas podem fazer de maneira lenta, permitindo
que o microrganismo prolongue sua infecção antes que haja o acúmulo
dessas substâncias em quantidade suficiente para inibi-lo. Segundo
HAMMERSCHMIDT (1999) a atuação das fitoalexinas como componentes
52
de defesa ou simplesmente como uma resposta à infecção pode ocorrer,
uma vez que respostas diferenciadas podem ser observadas nas
interações planta-patógeno.
Espécies reativas de oxigênio (ROS) também são produzidas em
resposta à presença de patógenos no tecido hospedeiro, podendo ser
ativada, também, por estresses como seca, salinidade, temperatura, entre
outros. Enzimas como NADPH oxidase, amina oxidase e peroxidases,
atuam na produção de intermediários reativos de oxigênio; radicais
superóxido (O
2
-
), peróxido de hidrogeno (H
2
O
2
) e radicais hidroxil (HO
-
)
são representantes das ROS (MILTTLER, 2002).
O aumento na produção de ROS e o seu acúmulo dentro da célula
podem ocasionar danos oxidativos aos componentes celulares, o que
pode culminar em morte celular no sítio da infecção (HEATH, 1998;
MITTLER, 2002; ALSCHER, ERTUK & HEATH, 2002; ARORA, SAIRAM
& SRIVASTAVA, 2002).
Superóxido Dismutase (SOD) constitui-se como linha de defesa
contra a produção de intermediários reativos de oxigênio (ALSCHER,
ERTURK & HEATH, 2002). Ele catalisa a dismutação de radicais
superóxidos (0
2
-
), formando peróxido de hidrogênio (H
2
0
2
) e oxigênio
atmosférico, prevenindo danos oxidativos no organismo (MORAN et al.,
2003).
Ambos os genótipos inoculados com P. pachyrhizi aumentaram a
expressão de SOD, no entanto a expressão no genótipo tolerante não foi
tão intensa quanto no genótipo suscetível. Esse perfil de expressão
poderia proporcionar um maior acúmulo de radicais superóxido na célula
53
de PI230970 inoculado, o que poderia levar à ativação de respostas de
defesa, em função dos danos oxidativos ocorridos dentro da célula. A
expressão de SOD no genótipo suscetível poderia estar relacionada a
uma maior re-infecção de células do hospedeiro.
A produção de espécies reativas de oxigênio poderia estar
relacionada com a ativação da lipoxigenase. Esses intermediários reativos
de oxigênio poderiam atuar como bioativadores de derivados de ácidos
graxos. Peróxido de hidrogênio poderia atuar como um substrato para a
produção de ácido jasmônico pela lipoxigenase, a partir de ácido linoléico
da membrana plasmática (DIXON & HARISSON, 1994). SARAVITZ &
SIEDOW (1996) demonstraram que a expressão do gene lox7 em soja
aumenta em resposta a ferimento. A presença do fungo P. pachyrhizi
poderia estar induzindo a expressão da lipoxigenase, em resposta à
colonização do tecido hospedeiro.
Outro efeito exercido pelos intermediários reativos de oxigênio
produzidos no genótipo recessivo seria a expressão do gene ARF1 que
codifica para um fator de ribosilação do ADP (Adenosina Difosfato),
representando uma subfamília de proteínas de ligação ao GTP
(Guanosina Trifosfato) (REGAD et al., 1993; MOLENDIJK, RUPERTI &
PALME, 2004). São proteínas bem caracterizadas em mamíferos, e em
plantas têm sido relatadas como importantes no transporte através da
membrana celular, bem como controle do ciclo celular, alteração da
composição de lipídeos da membrana e remodelagem de compartimentos
celulares (LEE et al., 2003; VERNOUD et al., 2003).
54
Foi observado um aumento de expressão desse gene somente no
genótipo suscetível, possivelmente em decorrência da produção de
intermediários reativos de oxigênio, como o peróxido de hidrogênio, por
exemplo, que pode ter atuado com o sinalizador para a expressão de
transcritos ARF. Possivelmente a produção desses elicitores pode ter
ocorrido devido a uma maior colonização do patógeno. LEE et al., (2003)
verificaram que células de arroz tratadas com peróxido de hidrogênio
apresentavam um aumento na expressão de ARF, o mesmo acontecendo
quando era aplicado ácido salicílico. Porém, a participação de ARF no
mecanismo de defesa celular precisa ser mais bem elucidada.
7 – CONCLUSÃO
Os genes analisados neste trabalho apresentaram expressão
diferenciada quando em presença do patógeno P. pachyrhizi.
Considerando que os genes estudados estão envolvidos em
diferentes mecanismos de defesa, isto demonstra o quão complexo é a
interação entre eles e o quão diversificado é o mecanismo molecular de
defesa da planta frente à ferrugem asiática da soja.
A partir da análise do perfil de expressão desses genes, estudos
mais aprofundados das rotas de defesa analisadas deverão ser
realizados, com o objetivo de identificar genes mais específicos no
processo de defesa celular, na interação soja - P. pachyrhizi, e assim
possibilitar o desenvolvimento de cultivares mais tolerantes, ou resistente
ao patógeno.
55
8 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os mecanismos de defesa que uma planta apresenta frente ao
ataque de um patógeno envolvem a participação de muitos genes através
de cascatas de reações. A identificação de uma rota de defesa pode
possibilitar o estudo mais aprofundado da mesma, com o objetivo de
identificar genes mais específicos no processo de defesa celular e apontar
novas alternativas para obtenção de cultivares resistente.
A fim de testar as hipóteses levantadas na discussão deste
trabalho, quanto à resposta de soja à infecção por P. pachyrhizi, a
montagem de um novo experimento será importante para confirmação
dos dados obtidos.
Foi verificado que a condução dos experimentos em Fitotron foi
eficiente no controle do surgimento de outras doenças além da ferrugem
asiática da soja. Numa primeira tentativa de condução do mesmo
experimento em casa de vegetação isso não ocorreu, onde foram
observadas lesões nas folhas ocasionadas por outros microrganismos
além de P. pachyrhizi. No entanto, baseado nas grandes variações dos
resultados entre os Fitotrons, uma proposta diferente para condução do
experimento precisa ser apresentada. Foi observado que o número de
vasos dentro do Fitotron estava muito elevado, em função do número de
genótipos utilizados e espaço disponível, ocasionando uma densidade
elevada dentro da sala climatizada. Além disso, o número de plantas em
relação ao tamanho do vaso também pode não ter sido adequado. A
redução no número de plantas e de genótipos poderia minimizar esses
56
fatores. Outro ponto importante seria o aumento da unidade experimental,
utilizando folhas de todas as plantas de cada vaso, para a extração do
RNA. A análise da expressão gênica dentro dos horários de coleta
também possibilitará confrontar com maior precisão os dados obtidos.
57
9 - REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
AGRIOS, G.N. Plant Pathology. Elsevier Academic Press. 5 ed. 2004.
ALKHAROUF, N.; KHAN, R. & MATTHEWS, B. Analysis of expressed
sequence tags from roots of resistant soybean infected by the
soybean cyst nematode. Genome, v.47, p.380-388, 2004.
ALKHAROUF, N., CHOI, J.J., FREDERICK, R.D., MATTHEWS, B.F.
Gene expression changes in soybean after infection with soybean rust
(P. pachyrhizi) [abstract]. BARC Poster Day. Paper No. 09. 2005.
ALVES, S.A.M; FURTADO, G.Q. E BERGAMIN FILHO, A. Influencia das
condições climáticas sobre a ferrugem da soja. In Ferrugem Asiática
da Soja. Editor: Laércio Zambolim. p.37-59, 2006.
ALSCHER, R.G.; ERTUK, N. & HEATH, L.S. Role of Superoxide
Dismutase (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of
Experimental Botany, v.53, n°372, p.1331-1341, 2002.
ANDRADE, P.J.M. & ANDRADE, D.F.A.A. Controle Químico da
Ferrugem Asiática da Soja. In Ferrugem Asiática da Soja. Editor:
Laércio Zambolim. p.61-72, 2006.
ARIAS, C.A.A.; RIBEIRO, A.S.; YORINORI, J.T.; BROGIN, R.L.;
OLIVEIRA, M.F.; TOLEDO, J.F.F. Inheritance of resistance of soybean
to rust (P. pachyrhizi sidow). In: WORLD SOYBEAN RESEARCH
CONFERENCE, 7., Foz do Iguaçu, PR, Anais... p.100, 2004.
ARORA, A.; SAIRAM, R.K. & SRIVASTAVA, G.C. Oxidative stress and
antioxidative system in plants. Current Science, v.82, n°.10, p.1227-
1238, 2002.
BACCHI, M.A.L. & KRUGNER, T.L. FUNGOS. In: Manual de
Fitopatologia. (Bergamin Filho, Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres,
p-46-96, 1995.
BARBER, M.S.; BERTRAM, R.E. & RIDE, J.P. Chitin oligosaccharides
elicit lignification in wounded wheat leaves. Physiological and
Molecular Plant Pathology. v.34, p.3-12, 1989.
BEDENDO, I.P. Vírus. In: Manual de Fitopatologia. (Bergamin Filho,
Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres, p.132-160, 1995a.
BEDENDO, I.P. Protozoários. In: Manual de Fitopatologia. (Bergamin
Filho, Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres, p.161-167, 1995b.
BERTRAND, J.; LAURENT, C. & LECLERCQ, V. O mundo da Soja. São
Paulo:HUCITEC. 139p, 1987.
58
BISHOP, J.G.; DEAN, A.M. & MITCHELL-OLDS, T. Rapid evolution in
plant chitinases: Molecular targets of selection in plant-pathogen
coevolution. PNAS, v.97, n°.10, p.5322-5327, 2000.
BLIFFELD, M.; MUNDY, J.; POTRYKUS, I. & FUTTERER. Genetic
engineering of wheat for increased resistance to powdery mildew
disease. Theor. Appl. Genet., v.98, p.1079-1086, 1999.
BONATO, E.R.; BONATO, A.L.V. A soja no Brasil: história e
estatística. Londrina: EMBRAPA-CNPSo, 61p. (EMBRAPA-CNPSo.
Documentos, 21) 1987.
BONDE, M.R., NESTER, S.E., BERNER, D.K., FREDERICK, R.D. Effects
of temperature on initiation of infection in soybean by isolates of P.
pachyrhizi and p. meibomiae. American Phytopathology Society.
v.96, 2006.
BONETTI, L.P. Distribuição da Soja no Mundo. Origem, História e
Distribição. p. 1-6 In: A Soja no Brasil. Editores: Shiro Miyasaka e
Júlio César Medina. 1981.
BRAVO, J.M.; CAMPO, S.; MURILLO, I.; COCA, M. & SEGUNDO, B.S.
Fungus- and wound-induced accumulation of mRNA containing a
class II chitinase of the pathogenesis-related protein 4 (PR-4) family of
maize. Plant Moelcular Biology, v.52, p.745-759, 2003.
BROMFIELD, K. R. Soybean Rust. Monograph 11. The american
phytopathological society. 1982.
CAMARGO, L.E.A. Análise genética da resistência e da patogenicidade.
In: Manual de Fitopatologia. (Bergamin Filho, Kimati & Amorin) São
Paulo: Ceres, p.470-493, 1995.
CARVALHO FILHO, A. & AMABILE, R. F. Biologia da Soja. In: Soja: Suas
Aplicações. (Moraes, A. A. C. & da Silva, A. L.). Rio de Janeiro:
MEDSI. 259p. 1996.
CARVALHO JUNIOR, A.A. & FIGUEREDO, M.B. A verdadeira identidade
da ferrugem da soja no Brasil. Summa Phytopathologica, v.26,
p.197-200, 2000.
CHADHA, P. & DAS, R.H. A pathogenesis related protein, AhPR10 from
peanut: an insight of its mode of antifungal activity. Planta, v.225,
p.213-222, 2003.
CONAB, 2005.
<http://www.cnpso.embrapa.br/index.php?op_page=294&cod_pai=17
> Disponível em 7 de março de 2007.
59
CONAB, 2007a.
<http://www.conab.gov.br/conabweb/download/indicadores/0204_
export_complexo_soja_e_trigo.pdf> Disponível em 10 de maio de
2007.
CONAB, 2007b.
<http://www.conab.gov.br/conabweb/index.php?PAG=131>
Disponível em 10 de maio de 2007.
COSTA, J. A. Cultura da Soja. Porto Alegre: I. Manica, J. A. Costa, 233p.
1996.
COSTAMILAN, L.M., BERTAGNOLLI, P.F. & YORINORI, J.T. Avaliação
de danos em soja causados por ferrugem asiática. In: REUNIÃO SUL
DE SOJA DA REGIÃO SUL, 30., Cruz Alta, RS. Anais... p.99, 2002.
CROWELL, D.N.; JOHN, M.E.; RUSSELL, D. & AMASINO, R.M.
Characterization of a stress-induced, developmentally regulated gene
family from soybean. Plant Molecular Biology, v.18, p-459-466, 1992.
DALL´AGNOL, A. Current status of soybean production and utilization in
Brazil. In: Proceedings of VII World Soybean Research Conference.
(Moscardi, F. et al. editors) Londrina: Embrapa Soybean, 2004.
DARVILL, A.G. & ALBERSHEIM,P. Phytoalexins and their elicitors – A
Defense Against Microbial Infection in Plants. Annual Review Plant
Physiology, v.35, p.243-75, 1984.
DAY, R.B.; OKADA, M.; ITO, Y.; TSUKADA, K.; ZAGHOUANI, H.;
SHIBUYA,N. & STACEY, G. Binding Site for Chitin Oligosaccharides
in the Soybean Plasma Membrane. Plant Physiology, v.126, p.1162-
1173, 2001.
DE LORENZO, G. & FERRARI, S. Polygalacturonase-inhibiting proteins in
defense against phytopathogenic fungi. Current Opinion in Plant
Biology, p.1-5, 2002.
DESLANDES, J.A. Ferrugem da soja e de outras leguminosas causadas
por Phakopsora pachyrhizi no Estado de Minas Gerais. Fitopatologia
Brasileira, v.4, p.337-339, 1979.
DIXON, R.A. & HARISSON, M.J. Early events in the activation of plant
defense responses. Annual Review of Phytopatology, v.32, p.479-
501, 1994.
D´OVIDIO, R.; ROBERTI, S.; DI GIOVANNI, M.; CAPODICASA, C.;
MELARAGNI, M.; SELLA, L.; TOSI, P. & FAVARON, F. The
characterization of the soybean polygalacturonase-inhibiting proteins
60
(Pgip) gene family reveals that a single member is responsible for the
activity detected in soybean tissues. Planta, v.224, p.633-645, 2006.
EMBRAPA-SOJA, 2006a. Disponível em
<http://www.cnpso.embrapa.br/alerta/ver_alerta.php?cod_pagina_
sa=146&cultura=1>. Acesso em 20 de novembro de 2006.
EMBRAPA-SOJA, 2006b. Disponível em
<http://www.cnpso.embrapa.br/index.php?op_page=299&cod_pai
=171>. Acesso em 26 de fevereiro de 2007.
EMBRAPA-SOJA, 2007a. Disponível em
<http://tamboril.cnpso.embrapa.br/alerta/anteriores.php> Acesso
em 9 de maio de 2007.
EMBRAPA-SOJA, 2007b. Disponível em
<http://www.cnpso.embrapa.br/noticia/ver_noticia.php?cod_notici
a=380> Acesso em 20 de maio de 2007.
EMBRAPA-SOJA, 2007c. Disponível em
<http://www.cnpso.embrapa.br/alerta/ver_alerta.php?cod_pagina_
sa=160> Acesso em 5 de junho de 2007.
EMBRAPA-SOJA, 2007d. Disponível em
<www.cnpso.embrapa.br/alerta/ver_alerta.php?cod_pagina_sa=1
45&cultura=1> Acesso em 11 de julho de 2007.
ESTABROOK, E.M. & SENGUPTA-GOPALAN, C. Differential Expression
of Phenylalanine Ammonia-Lyase and Chalcone Synthase during
Soybean Nodule Development. The Plant Cell, v.3, p.299-308, 1991.
FARMER, E.E., ALMÉRAS, E. & KRISHNAMURTHY, V. Jasmonates and
related oxylipins in plant responses to pathogenesis and herbivory.
Current Opinion in Plant Biology, v.6, p.372–378, 2003.
FAVARON, F.; D`OVIDIO, R.; PORCEDDU, E. & ALGHISI, P. Purification
and molecular characterization of a soybean polygalacturonase-
inhibiting protein. Planta, v.195. p.80-87, 1994.
FEHR, W. R.; CAVINESS, C. E. Stages of soybean development.
Ames: Iowa State University of Science and Techonology, 1977. 11p.
FLOR, H. H. Current status of gene-a-gene concept. Ann. Rev.
Phytopathol., v.9, p. 275-296, 1971.
FRY, W.E. Principles of Plant Disease Management. New York:
Academic Press. 378p, 1982.
GIJZEN, M.; KUFLU, K.; QUTOB, D. & CHERNYS, J.T. A class I chitinase
from soybean seed coat. Journal of Experimental Botany, v.52, n°,
365, p.2283-2289, 2001.
61
GLAZEBROOK, J. Genes controlling expression of defense responses in
Arabidopsis — 2001 status. Current Opinion in Plant Biology, v.4,
p.301–308, 2001.
GOMATHI, V. & GNANAMANICKAM, S.S. Polygalacturonase-inhibiting
proteins in plant defence. Current Science, v.87, n°9, p.1211-1217,
2004.
GOMES, P. A soja. – 5 ed. – São Paulo, 149p, 1986.
HAHN, M.G. Microbial elicitors and their receptor in plants. Annual
Review of Phytopathology, v.34, p.387-412,1996.
HAMMERSCHMIDT, R. Phytoalexins: What Have We Learned After 60
Years? Annual Review Phytopathology. v.37, p.285-306, 1999.
HARRAR, J.G. e STACKMAN, E.C. Principles of Plant Pathology. New
York: The Ronald Press Company. 581p, 1957.
HARTING, E.E. Identification of a fourth major genes conferring to rust in
soybeans. Crop Science, v.26, p.1135-1136, 1986.
HEATH, M.C. Apoptosis, programmed cell death and the hypersensitive
response. European Journal of Plant Pathology, v.104, p.117–124,
1998.
HENNING, A.A. & GODOY, C.V. Situação da Ferrugem da Soja no Brasil
e no Mundo. In Ferrugem Asiática da Soja. Editor: Laércio Zambolim.
p.1-14, 2006.
HOOKER, A.L. & SAXENA, K.M.S. Genetics of disease resistance in
plants. Annual Review of Genetics. v.5, p.407-424, 1971.
IBGE, 2007. Disponível em
<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuar
ia/lspa/defaulttab.shtm> Acesso em 22 de julho de 2007.
JIN, W.; HORNER, H.T.; PALMER, R.G. & SHOEMAKER, R.C. Analysis
and Mapping of Gene Families Encoding β-1,3-Glucanases of
Soybean. Genetics, v.153, p.445-452, 1999.
HYMOWITZ, T. On the domestication of the soybean. Economic Botany,
v.24, p.408-421, 1970.
KHAN, A.A. & SHIH, D.S. Molecular cloning, characterization, and
expression analysis of two class II chitinase genes from the strawberry
plant. Plant Science, v.166, p.753-762, 2004.
62
KIRIK, V., BOUYER, D., SCHÖBINGER, U., BECHTOLD, N., HERZOG,
M., BONNEVILLE, J. M., & HÜLSKAMP, M. CPR5 is involved in cell
proliferation and cell death control and encodes a novel
transmembrane protein. Current Biology v.11, p.1891–1895, 2001.
KITAJIMA, S. & SATO, F. Plant Pathogenesis-Related Proteins: Molecular
Mechanisms of Gene Expression and Protein Function. Journal of
Biochemistry. v.125 p. 1-8, 1999.
KOCHMAN, J.K. The effect of temperature on development of soybean
rust (P. pachyrhizi). Australian Journal of Agricultural Research
v.30, p.273–277, 1979.
KRUGNER, T.L. A Natureza da Doença. In: Manual de Fitopatologia.
(Bergamin Filho, Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres, p.34-45, 1995.
LEE, W.Y.; HONG, J.K.; KIM, C.Y.; PARK, H.C.; KIM, J.C.; YUN, D.;
CHUNG, W.C.; LEE, S.; LEE, S.Y.; CHO, M.J. & LIM, C.O. Over-
expressed rice ADP-ribosylation factor 1 (RARF1) induces
pathogenesis-related genes and pathogen resistance in tobacco
plants. Physiologia Plantarum, v.119, p.573-581, 2003.
LEITE, B. & PASCHOLATI, S.F. Hospedeiro: Alterações Fisiológicas
Induzidas por Fitopatógenos. In: Manual de Fitopatologia. (Bergamin
Filho, Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres, p.393-416, 1995.
LEVY, C. Zimbabwe – a country reporto n soybean rust control. In:
Proceedings of VII World Soybean Research Conference.
(Moscardi, F. et al. editors) Londrina: Embrapa Soybean, 2004.
LIVAK, K. J. & SCHMITTGEN, T. D. Analysis of Relative Gene Expression
Data Using Real- Time Quantitative PCR and the 2
-∆∆C
T
Method.
Methods, v.25, p.402-408, 2001
MAHALINGAM, R; WANG, G. & KNAP, H.T. Polygalacturonase and
Polygalacturonase Inhibitor Protein: Gene Isolation and Transcription
in Glycine max - Heterodera glycines Interactions. Molecular Plant-
Microbe Interactions, v.12, n°.6, p.490-498, 1999.
MARTIN, J.T. Role of cuticle in the defense against plant disease. Annual
Review of Phytopathology. v.2, p.81-100, 1964.
MAUCH, F. & STAEHELIN, A. Functional lmplications of the subcellular
Localization of Ethylene-lnduced Chitinase and β-1,3-Glucanase in
Bean Leaves. The Plant Cell, v.1, p.447-457, 1989.
McLEAN, R.J. & BYTH, D.E. Inheritance of resistance to rust (P.
pachyrhizi) in soybeans. Australian Journal Agriculture Research,
v.31, p.951-956, 1980.
63
MELCHING, J.S.; DOWLER, W.M.; KOOGLE, D.L.; ROYER, M.H. Effects
of durations, frequency, and temperature of leaf wetness periods on
soybean rust. Plant Disease, v.73, p.117-122, 1989.
MILTTLER, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance.
TRENDS in Plant Science, v.7, n°9, p.405-410, 2002.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2007a. Disponível em
<http://www.agricultura.gov.br> Acesso em 7 de março de 2007.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2007b. Disponível em
<http://www.agricultura.gov.br> Acesso em 10 de maio de 2007.
MOLENDIJK, A.J.; RUPERTI, B. & PALME, K. Small GTPases in vesicle
trafficking. Current Opinion in Plant Biology, v.7, p.694–700, 2004.
MONTEIRO, A.R. & FERRAZ, L.C.C.B. Nematóides. In: Manual de
Fitopatologia. (Bergamin Filho, Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres,
p-168-201, 1995.
MONTESANO, M.; BRADER, G. & PALVA, E.T. Pathogen derived
elicitors: searching for receptors in plants. Molecular Plant Pathology,
v.4, p-73-79, 2003.
MORAES, A. A. C.; SILVA, A. L.; CARVALHO FILHO, A. & AMABILE, R.
F. Histórico da Soja. In: Soja: Suas Aplicações. (Moraes, A. A. C. &
da Silva, A. L.). Rio de Janeiro: MEDSI. 259p. 1996.
MORAN, J.F.; JAMES, E.K.; RUBIO, M.C.; SARATH, G.; KLUCAS, R.V. &
BECANA, M. Functional Characterization and Expression of a
Cytosolic Iron-Superoxide Dismutase from Cowpea Root Nodules.
Plant Physiology, v.133, p.773-782, 2003.
MYSORE, K. S. & RYU, C. Nonhost resistance: how much do we know?
Plant Science. v.9, p.97-104, 2004
ONO, Y.; BURITICÁ, P. & HENNEN, J.F. Delimitation of Phakopsora,
Physopella and Cerotelium and their species on Leguminosae. Mycol.
Res. 96, v.10, p. 825-850, 1992.
PASCHOLATI, S.F. & LEITE, B. Hospediro: Mecanismos de Resistência.
In: Manual de Fitopatologia. (Bergamin Filho, Kimati & Amorin) São
Paulo: Ceres, p.417-454, 1995.
REGAD, F.; BARDET, C.; TREMOUSAYGUC, D.; MOISAN, A.;
LESCURE, B. & AXELOS, M. cDNA cloning and expression of an
Arabidopsis GTP-binding protein of the ARF family. FEBS, v.316, n°.2,
p.133-136, 1993.
64
SALGADO, C.L. e FERREIRA, L.P. Bactérias. In: Manual de
Fitopatologia. (Bergamin Filho, Kimati & Amorin) São Paulo: Ceres,
p.97-131, 1995.
SARAVITZ, D.M. & SIEDOW, J.N. The Differential Expression of Wound-
lnducible Lipoxygenase Genes in Soybean Leaves. Plant Physiology,
v.110, p.287-299, 1996.
SIMONS, U.K.; BAUER, R.; RIOUX, D.; SIMARD, M. & OBERWINKLER,
F. The intercellular biotrophic leaf pathogen Cymadothea trifolii locally
degrades pectins, but not cellulose or xyloglucan in cell walls of
Trifolium repens. New Phytologist, v.165, p.243-260, 2005.
SINGH, K.B, FOLEY, R. C. & OÑATE-SANCHEZ, L. Transcription factors
in plant defense and stress responses. Current Opinion in Plant
Biology, v.5, p.430–436, 2002.
SHIBUYA, N. & MINAMI, E. Oligosaccharide signalling for defence
responses in plant. Physiological and Molecular Plant Pathology,
v.59, p.223-233, 2001.
SHOEMAKER, R.C., POLZIN, K., LABATE, J., SPECHT, J., BRUMMER,
E.C., OLSON, T., YOUNG, N.D., CONCIBIDO, V.C., WILCOX, J.,
TAMULONIS, J.P., KOCHERT, G. & BOERMA, H.R. Genome
Duplication in Soybean (Glycine Subgenus Soja). Genetics 144:329-
338, 1996.
TAKEUCHI, Y.; YOSHIKAWA, M.; TAKEBA, G.; TANAKA, K.; SHIBATA,
D. & HORINO, O. Molecular Cloning and Ethylene Induction of Mrna
Encoding a Phytoalexin Elicitor-Releasing Factor, β-1,3-
Endoglucanase, in Soybean. Plant Physiology, v.93, p.673-682,
1990.
THEVISSEN, K., TERRAS, F. R. G., BROEKAERT, W. F.
Permeabilization of Fungal Membranes by Plant Defensins Inhibits
Fungal Growth. Applied and Environmental Microbiology, v.65,
p.5451–5458, 1999.
USDA, 2007. Disponível em
<http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/acc/display.pl?1183665>
Acesso em 26 de fevereiro de 2007.
VAN DE MORTEL, M.; RECKNOR, J. C.; GRAHAM, M. A.; NETTLETON,
D; DITTMAN, J. D.; NELSON, R. T.; GODOY, C. V.; ABDELNOOR, R.
V.; ALMEIDA, A. M. R.; BAUM, T. J. & WHITHAM, S. A. Distinct
Biphasic mRNA Changes in response to Asian Soybean Rust
Infection. MPMI, v.20, n°.8, p.887-899, 2007.
65
VAN LOON, L.C. Induced resistance in plants and the role of
pathogenesis-related proteins. European Journal of Plant
Pathology, v.103, p.753-765, 1997.
VAN LOON, L.C & STRIEN, E.A.V. The families of pathogenesis-related
proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type
proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology v.55, p.85-
97, 1999
VERNOUD, V.; HORTON, A.C.; YANG, Z. & NIELSEN, E. Analysis of the
Small GTPase Gene Superfamily of Arabidopsis. Plant Physiology,
v.131, p.1191–1208, 2003.
WATANABE, A.; NONG, V.H.; ZHANG, D.; ARAHIRA, M.; YEBOAH, N.A.;
UDAKA, K. & FUKAZAWA, C. Molecular Clonnig and Ethylene-
Inducible Expression of Chib1 Chitinase from Soybean (Glycine max
(L.) Merr.). Biosci. Biotechnol. Biochem., v.63, n°.2, p.251-246,
1999.
WIKIPEDIA, 2007. Fabaceae. <http://en.wikipedia.org/wiki/Fabaceae>.
Disponível em 9 de julho de 2007.
WENDEHENNE, D.,DURNER, J. & KLESSIG, D.F. Nitric oxide: a new
player in plant signaling and defense response. Current Opinion in
Plant Biology, v.7, p.449–455, 2004.
YORINORI, J.T. A country report and rust control strategies in Brazil. In:
Proceedings of VII World Soybean Research Conference.
(Moscardi, F. et al. editors) Londrina: Embrapa Soybean, 2004.
YORINORI, J.T.; NUNES JÚNIOR, J. & LAZZAROTTO, J.J. Ferrugem
“asiática” da soja no Brasil: evolução, importância econômica e
controle. Londrina: Embrapa Soja. 36p. (Documentos, 247), 2004.
YORINORI, J. T. A Ferrugem "Asiática" da Soja no Continente Americano:
Evolução, Importância Econômica e Estratégias de Controle.
I Workshop Brasileiro sobre a ferrugem asiática.Uberlandia:EDUFU
p.21-37, 2005.
ZAMBENEDETTI, E. B. Preservação de Phakopsora pachyrhizi Sydow
& Sydow e aspectos epidemiológicos e ultraestruturais da sua
interação com a soja (Glycine max (L). Merril). Lavras: UFLA, 95 p,
2005.
ZAMBOLIM, L. Manejo Integrado da Ferrugem Asiática da Soja. In
Ferrugem Asiática da Soja. Editor: Laércio Zambolim. p.73-98, 2006.
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