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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA METALOTIONEÍNA EM DUAS ESPÉCIES DE
PEIXES, Oreochromis niloticus E Prochilodus lineatus
Thaissa de Melo Galante Coimbra
SÃO CARLOS
2008
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ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA METALOTIONEÍNA EM DUAS ESPÉCIES DE
PEIXES, Oreochromis niloticus E Prochilodus lineatus
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA METALOTIONEÍNA EM DUAS ESPÉCIES DE
PEIXES, Oreochromis niloticus E Prochilodus lineatus
Thaissa de Melo Galante Coimbra
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Genética
e Evolução da Universidade Federal de São
Carlos, como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Mestre em Genética
e Evolução.
Orientadora: Heloísa Sobreiro
Selistre de Araújo.
SÃO CARLOS
2008
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária/UFSCar
C679ae
Coimbra, Thaissa de Melo Galante.
Análise da expressão da metalotioneína em duas
espécies de peixes, Oreochromis niloticus e Prochilodus
lineatus / Thaissa de Melo Galante Coimbra. -- São Carlos :
UFSCar, 2008.
76.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2008.
1. Genética. 2. Peixes. 3. Metalotioneína. 4. Expressão
gênica. 5. Metais. 6. Zinco. I. Título.
CDD: 575.1 (20
a
)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE S~O CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E EVOLUÇÃO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DA METALOTIONEíNA EM DUAS
ESPÉCIES DE PEIXES, Oreochromís ní/otícus E Prochilodus
lineatus
Dissertação de Mestrado de Thaissa de Meio Galante Coimbra
Banca Examinadora
Prata. Ora.Heloísa Sobreiro Selistre de Araújo
Prata. Ora.Maria Célia Bertolini
Prata. Ora.Marisa Narciso Fernandes
Dedico este trabalho ao meu marido, Ricardo
a meus pais, Vânia e Paulo
a minha avó Telma e tia Raquel
pelo apoio e torcida durante os momentos difíceis.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela vida e chance de chegar até aqui.
Agradeço grandemente ao meu dedicado marido, Ricardo, pelo total apoio e
incentivo nos caminhos que escolhi traçar. Que com todo o seu amor e carinho se manteve ao
meu lado sempre.
Agradeço aos meus pais, Vânia e Paulo, e aos meus irmãos, Raphael e Leandro,
pelo respeito, e compreensão quanto aos passos que resolvi trilhar. Sobretudo, agradeço as
palavras de incentivo de minha mãe, que não me deixaram desistir em momentos difíceis.
Agradeço à minha avó, Telma e a minha tia, Raquel pelo apoio incondicional e
amor dedicado que tanto foram importantes para alcançar qualquer objetivo.
Agradeço aos amigos do peito, Vivian, Ricieri, Eliel, Alex, Gustavo, Elisandra e
Marina, pelo apoio moral e deliciosos churrascos. Também por estarem ao meu lado
incondicionalmente, como amigos verdadeiros.
Agradeço ainda aos queridos amigos D. Marta, S. Espedito, D. Ede e S. Alcides
por toda a ajuda e torcida que tiveram por mim.
Agradeço às amigas que fiz aqui em São Carlos, companheiras da labuta diária do
Laboratório, Carmen Lúcia, Milena e Rita de Cássia, pelos momentos de distração e superação
durante o desenvolvimento do Mestrado.
Agradeço aos importantes amigos que conquistei no laboratório de Bioquímica e
Biologia Molecular, Beth, Márcia, Raquel, Mônica, Cláudio, Zé Roberto, Carol Martins, Aline,
Rafael, Juliana, Kelly, Uliana, André, Ana, Sabrina e Gisele, por toda a ajuda, incentivo e força
em momentos bons e também nos estressantes!
Agradeço a Cléo e a Débora, com quem eu pude contar para dar início ao meu
trabalho com metalotioneína.
Agradeço à Regiane e à Greissi, secretárias do programa do PPG-GEV pela
paciência e diversas ajudas nos assuntos burocráticos.
Agradeço a colaboração da Profa. Dra. Marisa Narciso Fernandes, do Laboratório
de Zoologia e Bioquímica Comparativa, por acreditar neste trabalho.
Agradeço ao Departamento de Tecnologia de Informação da Empresa SAS Brasil,
que tão gentilmente me cedeu o computador para elaboração desta tese.
Agradeço à CAPES, pela concessão da bolsa e à Fapesp , pelo financiamento do
projeto.
Agradeço em especial à minha orientadora, Profa. Dra. Heloísa Sobreiro Selistre
de Araújo, pela confiança, apoio e orientação. Agradeço a oportunidade de realizar este trabalho.
Por fim, agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuiram para a
realização deste Mestrado.
Muito obrigada!
"Há pessoas que transformam o Sol numa simples mancha amarela
mas há aquelas que fazem de uma simples mancha amarela o próprio Sol"
Pablo Picasso
RESUMO
A metalotioneína (MT) é uma proteína não enzimática, com a propriedade de ligação a
metais. Ela é usada como bioindicador de poluição de ambientes expostos a metais através da
avaliação de sua expressão em diferentes espécies de peixes. A tilápia é um modelo animal
comumente utilizado em estudos toxicológicos e algumas de suas espécies têm a seqüência de
MT conhecida. Neste trabalho foi utilizada a espécie Oreochromis niloticus na padronização dos
ensaios de expressão dessa molécula. Já a espécie Prochilodus lineatus é amplamente distribuída
nas Bacias Brasileiras e tem sido estudada quanto ao acúmulo, mortalidade e toxicidade frente a
metais, porém nada se sabia sobre a estrutura gênica da metalotioneína destes peixes. Com o
objetivo de avaliar a seqüência gênica da metalotioneína em O. niloticus e em P. lineatus,
indivíduos destas espécies receberam injeções intraperitoneais de cloreto de zinco, em doses
crescentes de 1 a 8 mg/Kg, durante 4 dias. Através de ensaios de amplificação gênica foi possível
obter as seqüências da MT de ambas as espécies. Por PCR em tempo real também se pôde avaliar
um aumento da expressão do RNA mensageiro da metalotioneína de até 4 vezes para O. niloticus
e cerca de 35 vezes para P. lineatus, quando comparados a indivíduos não expostos a metais. A
diferença da expressão foi estatisticamente significante nos experimentos com as duas espécies.
Os resultados permitem considerar a alta conservação da estrutura gênica da metalotioneína
importante para estudos com espécies diferentes, permitindo a sua utilização para estudos
ambientais, além de confirmar a análise da expressão gênica dessa molécula como boa ferramenta
nos estudos de monitoramento de poluição de ambientes aquáticos.
Palavras-chave: Metalotioneína, expressão gênica, Oreochromis niloticus, Prochilodus lineatus,
metais, zinco.
ABSTRACT
Metallothioneins (MT) are non enzymatic proteins with with metal-binding ability. It has
been used as a biomarker for environmental pollution by the analysis of its expression in several
fish species. The tilapia is a commonly used model in studies of animal toxicology and some of
these species have a well characterized MT sequence. Here, the Oreochromis niloticus specie was
used in the standardization of the MT expression assay. The Prochilodus lineatus species is
widely distributed in the Brazilian’s Basins that has been studied regarding growth, illness and
the toxicity of metals. However the MT DNA sequence from this species has not been described.
The aim of this project was the analysis of the MT DNA in both species, O. niloticus and P.
lineatus. For that, individuals from these species received intraperitoneal injections of zinc
chloride, in increasing doses of 1 to 8 mg/kg for 4 days.. After this time, animals were killed and
total RNA was isolated from the liver and used in an RT-PCR with primers designed accordingly
to MT coding regions of fish MT deposited at www.ncbi.nlm.nih.gov. DNA sequencing
confirmed the highly conserved MT sequence for both species. For quantitative analysis, cDNA
was used in a similar real-time PCR with the same primers plus the fluorophore Syber Green.
TheZnCl
2
treatment increased MT mRNA expression about 4 times for O. niloticus and almost 35
times for P. lineatus when compared with subjects that were not exposed to the metal. This
difference was statistically significant in the experiments for both species. The results indicate the
high conservation of the MT gene structure, that allow the use of MT in environmental research..
Keywords: Metallothionein, gene expression, Oreochromis niloticus, Prochilodus lineatus,
metals, zinc.
Lista de Figuras
Figura 1 Estrutura cristalográfica da MT ..................................................................................... 16
Figura 2 Representação estrutural da molécula de MT ............................................................... 18
Figura 3 Alinhamento de MTs de diferentes organismos ............................................................ 19
Figura 4 Modelo de indução da expressão do gene da MT ......................................................... 21
Figura 5 Região de regulação do gene da MT humana ............................................................... 22
Figura 6 Exemplar de tilápia (Oreochromis niloticus) ................................................................ 29
Figura 7 Exemplar de curimbatá (Prochilodus lineatus) ............................................................. 30
Figura 8 Alinhamento de MTs de diferentes espécies de peixes ................................................. 33
Figura 9 RNA total extraído de fígado de tilápia ........................................................................ 47
Figura 10 Amplificação do cDNA da MT de O. niloticus .......................................................... 48
Figura 11 Alinhamento da seqüência de O. niloticus com O. mossambicus ............................... 49
Figura 12 PCR quantitativo da MT de tilápia .............................................................................. 50
Figura 13 PCR quantitativo para GAPDH de tilápia ................................................................... 51
Figura 14 Diagrama de caixas e suíças dos resultados de qPCR de tilápia ................................. 52
Figura 15 SDS-PAGE dos extratos de proteína de tilápia ........................................................... 53
Figura 16 Western Blotting com amostras de tilápia ................................................................... 54
Figura 17 Ensaio de imunoprecipitação com tilápia .................................................................... 54
Figura 18 Alinhamento da MT de O. niloticus com as MTs humana e de coelho ...................... 55
Figura 19 Análise das preparações de RNA total de curimbatá .................................................. 55
Figura 20 Amplificação do cDNA da MT de curimbatá ............................................................. 56
Figura 21 Alinhamento da MT de P. lineatus com seqüências do GeneBank ............................ 57
Figura 22 PCR quantitativo da MT de curimbatá ........................................................................ 58
Figura 23 PCR quantitativo de GAPDH de curimbatá ................................................................ 59
Figura 24 Diagrama de caixas e suíças dos resultados de qPCR de curimbatá ........................... 60
Figura 25 SDS-PAGE dos extratos proteicos de fígado de P. lineatus ....................................... 61
Figura 26 Western Blotting para detecção da MT de P. lineatus ................................................ 61
Figura 27 Alinhamento da MT de P. lineatus com as MTs humana e de coelho ........................ 62
Lista de Tabelas
Tabela 1 Seqüência de primers para análise da MT .................................................................... 33
Tabela 2 Seqüência de primers de GAPDH para controle endógeno .......................................... 33
Tabela 3 Expressão da MT de tilápia por qPCR .......................................................................... 50
Tabela 4 Análise descritiva da expressão da MT de tilápia ......................................................... 51
Tabela 5 Expressão da MT de curimbatá por qPCR .................................................................... 58
Tabela 6 Análise descritiva da expressão da MT de curimbatá ................................................... 59
Lista de Abreviatura
ABREVIATURA DESCRIÇÃO
AP-1 “Activator protein 1”
AP-2 “Activator protein 2”
ARE “Antioxidant response elements”
BCA Ácido Bicincrõnico
BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato de p-toluidina
BSA Soro albumina bovina
cDNA DNA complementar
Ct “Threshold cycle”
Da Daltons
DNA Ácido desoxidoribonucléico
DEPC Dietilpirocarbonato
D.O. Densidade óptica
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
GIF “Growth inibitory factor”
GRE “Glucocorticoid response elements”
HEPES Ácido Etanosulfônico 4-2 Hidroxietil Piperazina-1
IgG Imunoglobulina G
InRs Regiões iniciadoras
IPTG Isopropil-β-D- tiogalactopiranosídeo
LB Meio de cultura de bactérias (Luria Bertani)
MOPS Ácido 3-N Mofolino Propanosulfônico
MRE “Metal regulatory elements”
mRNA RNA mensageiro
MT Metalotioneína
MTF-I “Metal transcriptions factor I”
MTFL “Major late transcription factor”
nm Nanômetros (10
-9
m)
NBT Cloreto de “nitroblue” tetrazoílo
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase
ROS “Reactive oxigen species”
rpm Rotações por minutos
S Enxofre
SDS Duodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
TBS Solução tamponada com NaCl e Tris
TFIID “Transcription factor II D”
UA Unidades Arbitrárias
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 16
1.1 Regulação Gênica da MT ......................................................................................... 19
1.2 Funções da MT .......................................................................................................... 23
1.3 Importância do zinco ................................................................................................ 26
1.4 A MT como Biomarcador Ambiental ...................................................................... 27
1.5 A MT e os Peixes ....................................................................................................... 29
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 31
3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 32
3.1 Animais ...................................................................................................................... 32
3.2 Primers ....................................................................................................................... 32
3.3 Equipamentos ............................................................................................................ 34
3.4 Métodos ...................................................................................................................... 35
3.4.1 Animais .................................................................................................................... 35
3.4.2 Extração de RNA ..................................................................................................... 36
3.4.3 Produção de cDNA .................................................................................................. 36
3.4.4 PCR convencional .................................................................................................... 37
3.4.5 PCR quantitativo ...................................................................................................... 38
3.4.6 Clonagem ................................................................................................................. 39
3.4.7 Isolamento de DNA plasmidial ................................................................................ 40
3.4.8 Reação de Digestão .................................................................................................. 41
3.4.9 Extração de Proteína ................................................................................................ 42
3.4.10 Western Blotting (Imunodetecção) ........................................................................ 42
3.4.11 Imunoprecipitação .................................................................................................. 44
4. RESULTADOS ....................................................................................................................... 46
4.1 Oreochromis niloticus ................................................................................................ 46
4.1.1 PCR quantitativo ...................................................................................................... 49
4.1.2 Tentativas de Clonagem ........................................................................................... 52
4.1.3 Identificação proteica da MT ................................................................................... 53
4.2 Prochilodus lineatus .................................................................................................. 55
4.2.1 PCR quantitativo ...................................................................................................... 57
4.2.2 Tentativas de Clonagem ........................................................................................... 60
4.2.3 Identificação proteica da MT ................................................................................... 60
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 63
6. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 69
1. INTRODUÇÃO
A metalotioneína (MT) foi primeiramente estudada em 1957 por MARGOSHES e
VALLEE, que a identificaram no córtex renal eqüino associada ao metal cádmio.
Essa proteína tem sido largamente estudada por sua peculiar propriedade de ligação a
metais (ROESIJADI, 1996; IOACHIM et a.l, 1999; CARVALHO et al., 2004; VERGANI et al.,
2007). Sabe-se que ela é uma proteína intracelular, sem atividade enzimática, que possui pequena
massa molecular, em geral entre 6 e 7 kDa (REN et al., 2006; THIRUMOORTHY et al., 2006). É
composta por 61 ou 62 aminoácidos, dependendo do tecido de origem, dos quais 20 são resíduos
de cisteína (Cys). A Cys é um aminoácido polar neutro, que possui um grupo tiol (-SH) na sua
cadeia lateral, que está possivelmente envolvido em ligações denominadas pontes de dissulfeto
(-S-S), podendo inclusive formar uma ligação cruzada covalente com outros resíduos de cisteína.
As cisteínas presentes na MT estão envolvidas na coordenação de metais e são consideradas
essenciais para a estrutura e função desta proteína (ROESIJADI et al., 1996). A MT é também
isenta de aminoácidos aromáticos (KAGI; SCHAFFER, 1988). A figura 1 traz uma estrutura
cristalográfica da metalotioneína.
16
Figura 1 Estrutura cristalográfica da MT-2 de Rattus rattus. A estrutura
linear é a molécula da metalotioneína e as esferas são metais. Fonte:
www.ncbi.nlm.nih.gov.
A MT é localizada principalmente no citoplasma das células, mas ainda pode ser
visualizada no núcleo e nos lisossomos após exposição a metais pesados (CAJARAVILLE et al.,
2000; COYLE et al., 2002). Sua localização intracelular é também dependente do estágio de
desenvolvimento tecidual, sendo encontrada no núcleo de células parenquimais de fetos e recém
nascidos, mas são primeiramente citoplasmáticas em fígado adulto (HAQ et al., 2003). A MT já
foi também localizada no espaço intermembrânico de mitocôndrias ou mesmo dentro desta
organela quando em condições anormais de excesso de cobre na célula (YE et al., 2001).
As MTs compõem uma família de proteínas divididas nas classes MT-1, MT-2, MT-3 e
MT-4 com múltiplas isoformas em cada classe (THIRUMOORTHY et al., 2007). As MT-1 e
MT-2 são expressas constitutivamente em todos os tipos celulares, porém em intensidades
variáveis e sendo mais notáveis no fígado de mamíferos, que é um dos primeiros sítios de
produção desta proteína, principalmente durante a reprodução e desenvolvimento (SCUDIERO et
al., 1997); a MT-3 está relacionada à inibição do crescimento neuronal e é expressa em neurônios
glutaminérgicos; já a MT-4 está presente em epitélios estratificados de revestimento em
mamíferos (HAQ et al., 2003). As metalotioneínas 1 e 2 são as mais estudadas pela sua ampla
distribuição e por serem mais responsivas a estímulos indutores de sua expressão (MILES et al.,
2000; COYLE et al., 2002; HAQ et al, 2003).
Múltiplas isoformas da MT também têm sido documentadas em peixes e em diversos
organismos, e as diferentes isoformas não respondem igualmente aos diferentes metais
(SCHMITT et al., 2007). Sabe-se ainda que nem todas as isoformas estão presentes em todos os
organismos. Por exemplo em peixes, duas isoformas da MT são encontradas nas espécies
Chionomadraco hamatus e Cyprinus carpio, e apenas uma isoforma tem sido documentada em
Carassus auratus e na Tilapia mossambica (REN et al., 2006).
17
A proteína MT pode ser encontrada na forma de Apo-MT, uma forma livre de metais,
porém a forma mais comum é a associada a metais (DUNCAN; STILLMAN, 2006). Os
aminoácidos desta proteína formam dois domínios globulares, que são denominados domínio α,
na região carboxiterminal, e domínio β, região aminoterminal. O dobramento da proteína nestes
dois domínios se deve à presença dos resíduos de Cys, em que o domínio α possui 11 cisteínas,
que podem se ligar a até 4 átomos bivalentes, como o zinco, ou seis monovalentes, enquanto o
domínio β apresenta 9 cisteínas, que se ligam a até 3 átomos bivalentes (Figura 2).
A ligação de metais a esta proteína é responsável pela sua conformação final, sendo que a
composição metálica é determinante da resistência da metalotioneína à degradação, que parece
ser realizada principalmente por catepsinas (KLAASSEN et al., 1994; HAQ et al., 2003).
Segundo KLAASSEN e colaboradores (1994) a degradação da MT depende da liberação dos
metais a ela ligados, sendo a forma apo-MT mais rapidamente degradada do que as formas
18
Figura 2 Representação estrutural da molécula de metalotioneína, adaptada de
FISCHER; DAVIE (1998). Destaque dos domínios α, na porção carboxiterminal, com
11 Cys e 4 átomos de zinco, e β, na porção aminoterminal, com 9 Cys e 3 átomos de
zinco.
associadas a íons metálicos, em que estes estariam conferindo resistência ao processo
degradativo. Este processo de degradação parece acontecer tanto no compartimento citosólico,
por um pool de enzimas, como dentro dos lisossomos, pelas catepsinas, as principais proteases
lisossomais.
A MT apresenta notável preservação estrutural, podendo ser encontrada em diferentes
espécies, como bactérias, fungos, plantas e animais. O alto grau de conservação evolutiva
apresentado pela MT implica em importantes funções biológicas (HAQ et al., 2003). A figura 3
traz o alinhamento de MTs de diferentes organismos, em que nota-se um alto grau de
conservação da estrutura primária, sobretudo uma preservação das posições dos resíduos de
cisteína.
1.1 Regulação Gênica da MT
A localização cromossômica da metalotioneína varia nos diferentes organismos. Por
exemplo, em humanos os genes relacionados à produção de MT estão localizados no braço longo
do cromossomo 16, incluindo uma micro-heterogeneidade de seqüências gênicas para a MT-1
(MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1H e MT-1X), além dos genes da MT-2, MT-3 e
19
Figura 3 Alinhamento de MTs de diferentes organismos. [gi:55741493] é a MT-4 de Canis
lupus familiares; [gi:34328216] é a MT-1 de Mus musculus; [gi:141803125] é a MT-1F de
Homo sapiens; e [gi:3676239] é a MT-1 de Trematomus bernacchii.
MT-4 (HAQ et al., 2003, THIRUMOORTHY et al., 2007). Em camundongos, os genes da MT
estão localizados no cromossomo 8 e há uma cópia de cada gene (MT-1, MT-2, MT-3 e MT4)
(HAQ et al., 2003).
Os principais estudos sobre a indução da expressão da MT relacionam-se aos tipos 1 e 2
(BOURDINEAUD et al., 2006; REN et al., 2006; WERNER et al., 2008). A regulação da
biossíntese da metalotioneína ocorre primeiramente a nível transcricional por alguns agentes,
incluindo metais, radicais livres, hormônios, fatores de crescimento e promotores de tumores
(VERGANI et al., 2007). O gene codificador da MT é um exemplo de como um único gene pode
ser regulado por muitos circuitos diferentes. A região de regulação do gene da MT contém
elementos reguladores no promotor bem como no enhancer (LEWIN, 2001). Assim sendo,
variados fenômenos podem induzir a expressão da MT.
A indução da expressão da metalotioneína deve-se ao estímulo de elementos regulatórios
encontrados em cis (anterior à seqüência codificante do mRNA) aos genes respectivos. Os
promotores dos genes da MT-1 e MT-2 contêm regiões de TATA boxes e Iniciadoras (InRs), que
recrutam o fator de transcrição TFIID, que é expresso constitutivamente, como parte de um
complexo para a transcrição basal destes genes (MILES et al., 2000; HAQ et al., 2003).
Outros elementos adicionais, porém necessários também para a expressão basal da MT,
são os elementos regulatórios associados a metais, MRE (Metal Regulatory Elements). Tais
elementos atuam em conjunto ao fator de transcrição responsivo ao zinco, MTF-I (Metal
Transcriptions Factor I). Este fator de transcrição foi descrito em 1988 por WESTIN e
SCHAFFNER como uma proteína de ligação a MRE que requer elevados níveis de zinco para se
ligar ao DNA. O MTF-I é expresso ubiquamente e é essencial tanto na expressão basal quanto na
expressão induzida da metalotioneína. Tal fator é encontrado deslocado do citoplasma para o
20
núcleo em situações de estresse celular, como hipóxia ou condições oxidativas, ou ainda na
exposição a metais. Quando no núcleo, este fator de transcrição se liga ao MRE no promotor da
MT e regula a transcrição gênica dela por interação com componentes da RNA polimerase II na
maquinaria transcricional, direta ou indiretamente. Esta associação do MTF-I ao MRE requer a
ligação de zinco a este fator de transcrição (figura 4) (HAQ et al., 2003; BOURDINEAUD et al.,
2006).
Assim, temos que a expressão da metalotioneína depende, em grande parte, da presença
de quantidades essenciais de zinco na célula. Os MREs estão presentes em diferentes isoformas,
de MREa até MREg, no promotor da metalotioneína (MILES et al., 2000; HAQ et al., 2003).
É sugerido que os os metais de transição também ativam a expressão da MT por um
mecanismo independente da interação do MTF-I com o DNA. O cádmio, por exemplo, é
altamente redox-ativado em comparação ao zinco, e induz o estresse oxidativo, que pode ativar o
21
Figura 4 Modelo para indução da expressão do gene da metalotioneína (baseado em HAQ et al,
2003). Esquema celular com o núcleo contendo gene de resposta a metais. MT indica a
metalotioneína, que libera zinco ao se ligar a outro metal. ARE é o elemento de resposta a
antioxidante, MTF-1 é o fator de transcrição de metais 1, MRE é o elemento de resposta a metais,
ROS indica as espécies reativas de oxigênio.
Cd, Cu, Hg ou outro metal
MT
MT
Enzima
Inativa
Enzima
Ativa
Estresse
Oxidativo
ROS
gene da MT diretamente pela estimulação de seqüências específicas conhecidas como MTFL
(Major Late Transcription Factor, ou Fator principal de transcrição tardia). Os MTFLs estão
presentes junto a elementos de resposta antioxidante (ARE – Antioxidant Response Elements),
formando um complexo promotor MTFL/ARE. O estresse oxidativo ocasionado pela presença de
metais também pode ativar o gene da MT indiretamente pelo aumento do zinco livre, já que a
MT, bem como outras proteínas, libera zinco em condições redox pela oxidação dos tiois, que é
responsável pela coordenação da ligação de zinco (MILES et al., 2000; COYLE, 2001; HAQ et
al., 2003).
Hormônios glicocorticóides podem também induzir a expressão da metalotioneína
independentemente de outras seqüências regulatórias. Há no gene da MT elementos de resposta a
glicocorticóides, os GREs (Glucocorticoid Response Elements), os quais também são responsivos
a citocinas. Cada GRE pode independentemente mediar resposta transcricional a glicocorticóides
endógenos, como hidrocortisona (HAQ et al., 2003).
Também as regiões do tipo GC Box e seqüências realçadoras (enhancers) basais, que são
responsivas à ligação das proteínas ativadoras 1 (AP1 - Activator Protein 1) e 2 (AP2) são
encontrados no promotor do gene da MT, principalmente da MT-2 (MILES et al., 2000).
A figura 5 traz representados os diversos pontos de regulação do gene da metalotioneína.
22
Figura 5 Região de regulação do gene da metalotioneína humana, com elementos reguladores tanto no promotor
como no enhancer (LEWIN, 2001). O promotor tem elementos para indução por metais (MRE) e o enhancer traz
elemento de resposta a glicocorticóides (GRE). BLE é elemento de nível basal e o TRE é uma seqüência consensual
presente em diversos enhancers e confere resposta a forbol-ésteres. Os elementos promotores são apresentados
acima do mapa e as proteínas que se ligam a eles estão indicadas a baixo.
Sabe-se ainda que a indução de mudanças na organização da cromatina também altera a
expressão da metalotioneína. A metilação do DNA está associada a uma baixa expressão desta
proteína. Porém apenas a metilação do DNA não pode reprimir sua expressão, pois é preciso a
participação de outros fatores de inibição. A repressão da transcrição pode ser por mecanismos
tais como a inibição da ligação de fatores positivos ao promotor, pelo recrutamento de co-
repressores transcricionais ou pela alteração da estrutura da cromatina em que os nucleossomos
inibidores são posicionados no promotor (HAQ et al., 2003).
Estudos têm demonstrado que o promotor do gene da MT de peixes apresentam
seqüências regulatórias semelhantes à de mamíferos (VIARENGO et al., 2007).
Eventos pós-transcricionais têm se mostrado de grande importância na determinação dos
níveis protéicos da MT. Percebe-se em alguns trabalhos que a expressão do gene não é
necessariamente indicada pela concentração da proteína tecidual e que a relação entre o mRNA e
a proteína é dependente do metal e do tecido analisado (SCUDIERO et al., 1997;
VASCONCELOS et al., 2002; VERGANI et al., 2007).
1.2 Funções da MT
Uma propriedade importante das metalotioneína é o seu alto conteúdo de resíduos de
cisteínas (cerca de 30%), que lhe confere a capacidade de ligação a um número variado de íons
metálicos de transição, essenciais e não essenciais (KAGI; SCHAFFER, 1988). Assim sendo,
tem-se conferido a esta proteína prováveis funções protetoras, incluindo papel importante na
regulação e metabolismo dos metais essenciais, como zinco e cobre, na desintoxicação de metais
23
pesados, como cádmio e mercúrio (CHAN, 1994), além de estar relacionada à proteção tecidual
contra o estresse oxidativo (MILES et al., 2000; KNAPEN et al., 2007; WERNER et al., 2008).
No entanto, uma função única que envolva todas as diferentes isoformas dessa proteína
ainda não foi descrita. Sabe-se que a MT-3 foi inicialmente descrita como um fator de inibição do
crescimento neuronal, denominado de GIF (Growth Inibitory Factor), e que ela está expressa em
diversas formas de danos do sistema nervoso central, acreditando-se inclusive que estaria
relacionada a doenças degenerativas como o mal de Alzheimer (SIMPKINS, 2000). SENS e
colaboradores em 2001, utilizando-se de anticorpos monoclonais específicos para a MT-3,
indicaram a presença desta isoforma também em tecido renal e prostático, bem como em
neoplasias derivadas desses órgãos e em carcinomas mamários. Já a expressão da MT-4 foi
observada em epitélios estratificados, como o da mucosa bucal. Nestes tecidos essa isoforma foi
detectada nas camadas mais superficiais, o que indica uma provável associação da MT-4 com a
diferenciação epitelial (QUAIFE et al., 1994).
A grande maioria dos estudos sobre as funções das metalotioneínas está relacionada às
duas formas mais comuns, MT-1 e MT-2, que são mais amplamente distribuídas pelos diferentes
tecidos, além de serem mais responsivas aos estímulos indutores de sua expressão (MILES et al.,
2000; COYLE et al., 2002; HAQ et al., 2003).
As funções fisiológicas da metalotioneína ainda não foram totalmente identificadas, mas é
geralmente aceito que ela esteja principalmente envolvidas na regulação homeostática de zinco e
do cobre (KNAPEN et al., 2007). Essa proteína tem papel potencial como doador de metal para
metaloproteínas, tendo então a habilidade de ativar proteínas que necessitam de zinco ou cobre,
como por exemplo as enzimas álcool desidrogenase e fosfatase alcalina (ROESIJADI, 1996).
Quando há aumento das concentrações de zinco disponíveis, ocorre a indução da síntese da MT
24
por ação do zinco sobre fatores de transcrição dependentes deste metal e consequente aumento da
concentração da MT, Já em baixas concentrações do zinco nas células, este é liberado da
proteína, que estará exposta à degradação, diminuindo no entanto sua concentração (MARET,
2000; MAFRA; COZZOLINO, 2004).
Apesar das ligações a metais serem estáveis, essas ligações são dinâmicas com rápidas
mudanças de metais inter e intra proteína (ROESIJADI, 1996). Sabe-se que a intensidade de
ligação da MT aos metais de transição é variável, tendo por exemplo, o cobre uma maior
afinidade seguido pelo cádmio e pelo zinco (MILES et al., 2000; COYLE et al., 2002), o que
ocasiona um deslocamento do zinco na presença de outros metais. A ligação da MT aos metais
pesados reduz os seus efeitos tóxicos no citosol, sobre proteínas e nos processos enzimáticos
(OLSVIK et al., 2001). Em organismos não expostos a metais pesados, a MT liga-se
primeiramente ao zinco e secundariamente ao cobre (SABER; PISKIN, 2003). A indução da MT
por outros metais é proposta como uma via que resulta no aumento dos níveis de zinco livre
intracelularmente (ROESIJADI, 1996).
O papel da metalotioneína na proteção contra danos causados por agentes oxidativos tem
sido também estudado (VIARENGO et al., 1999; SAMSON et al., 2001). A MT é tratada como
“lixeira” para o metabolismo de moléculas de oxigênio reativas, denominadas ROS (Reactive
Oxigen Species), particularmente o radical hidroxila. As ROS são produzidas continuamente
durante o metabolismo aeróbico normal e podem se tornar nocivas em situações de desequilíbrio
com antioxidantes endógenos ou podem induzir danos no DNA. Acredita-se que a MT, quando
exposta a ambiente celular oxidante, libera os átomos aos quais está ligada, como o zinco, e
forme pontes dissulfeto intramoleculares, diminuindo o dano potencial dos radicais livres
carregados negativamente (ROMERO-ISART; VASAK, 2002). É provável que a proteção
25
conferida pela metalotioneína nesse caso ocorra mais pela liberação do zinco do que
propriamente pela neutralização dos compostos tóxicos (COYLE et al., 2001).
Diante de todas essas funções propostas, muitos trabalhos têm envolvido a metalotioneína.
Ela tem sido estudada em quadros neoplásicos, devido à sua atuação na biodisponibilidade de
zinco, que interage com diversos fatores envolvidos no processo apoptótico e de proliferação
celular (CHERIAN et al., 2003; THIRUMOORTHY et al., 2007). Também, graças à sua
propriedade de ligação a metais e proteção ao estresse oxidativo, a MT tem sido amplamente
utilizada no biomonitoramento de poluição ambiental, através do estudo de sua expressão
principalmente em tecidos de peixes (ROESIJADI, 1996; SCHLENK et al., 1997; VIARENGO
et al., 1999; CARVALHO et al., 2004; SCHMITT et al., 2007).
1.3 Importância do Zinco
O zinco é um metal essencial, necessário na manutenção das funções celulares normais
tanto para plantas como animais, porém em concentrações elevadas pode-se tornar extremamente
tóxico a tais organismos (CARVALHO et al., 2004), causando danos como morte celular,
diminuição do crescimento e/ou proliferação celular (MONTEIRO, 2000; MAZON et al., 2002).
O zinco participa de muitas reações do metabolismo celular, incluindo processos como
função imune, defesa antioxidante, co-fator de enzimas, crescimento e desenvolvimento
(MAFRA; COZZOLINO, 2004). A presença desse metal em altas concentrações nas células pode
interferir com outros processos metalo-dependentes ou inibir proteínas. A metalotioneína ligada
ao zinco age como marcador bioquímico que controla a concentração desse metal. A MT tem
26
sido considerada a principal proteína relacionada à regulação da biodisponibilidade do zinco no
ambiente intracelular, recebendo e doando zinco a outros componentes celulares (SUHY et al.,
1999). Altas concentrações de zinco induzem a síntese da MT por meio da ação desse metal sobre
fatores de transcrição dependentes de zinco, como o MTF-I (KLAASSEN et al., 1994; MARET,
2000; KOURY; DONANGELO, 2003; MAFRA; COZZOLINO, 2004).
Quando em excesso no organismo o zinco interfere no metabolismo de outros metais
como o cobre e o ferro. Doses excessivas desse metal podem causar problemas pulmonares,
gastrointestinais, febre, calafrios, sonolência, náusea, desidratação e descoordenação muscular em
humanos. Para os peixes, o excesso de zinco pode afetar a secreção mucosa produzida pelas
brânquias e assim obstruir o espaço interlamelar, bloqueando o movimento respiratório (ROCHA
et al., 1985).
Alguns trabalhos têm elucidado que, quando comparado a outros metais, o zinco apresenta
um maior potencial de indução da expressão gênica da metalotioneína (CHAN, 1994; KNAPEN
et al., 2007). O Zn
2+
é um íon estável, que possui orbital d” completo, o que impossibilita sua
participação em reações de óxido-redução, mas permite que ele seja aceptor de elétrons. Assim, o
zinco funciona como co-fator em reações que necessitam de um íon redox estável
(FERNANDES; MAFRA, 2005).
1.4 A MT como Biomarcador Ambiental
Percebe-se que cada vez mais os níveis de contaminação de ambientes, sobretudo
aquáticos, têm aumentado grandemente com a influência da ação humana (CAJARAVILLE et
27
al., 2000), podendo citar como exemplo, o desenvolvimento industrial e o uso de pesticidas na
agricultura como alguns responsáveis pelo aumento inclusive no nível de metais pesados nas
águas (McCLAIN et al., 2003). Para analisar o quanto um ambiente está contaminado, são feitos
estudos utilizando-se principalmente peixes, já que eles constituem um indicador muito útil do
real estado de pureza do ambiente ao qual pertence (ROCHA et al., 1985).
Com relação à mensuração da concentração de metais em água ou sedimento, uma série
de métodos e biomarcadores têm sido propostos e extensivamente testados (OLSVKI et al., 2001;
McCLAIN et al., 2002; WOO et al., 2006; KNAPEN et al., 2007; SCHMITT et al., 2007). A
caracterização do acúmulo de metais em diferentes órgãos tem provado ser uma medida
representativa de exposição e é usado no monitoramento desses metais. Porém a MT tem se
mostrado como um dos mais importantes marcadores usados nos programas de
biomonitoramento para caracterizar a contaminação de ambientes por metais (KNAPEN et al.,
2007). Tem sido demonstrado que a concentração da MT aumenta significativamente em tecidos
de uma ampla variedade de espécies aquáticas, tanto em estudos laboratoriais como em estudos
de campo (BOURDINEAUD et al., 2006; KNAPEN et al., 2007).
Recentes trabalhos têm utilizado técnicas como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
em Tempo Real para avaliar os níveis da expressão gênica da MT sob diferentes cenários de
exposição a metais, indicando que a expressão gênica da MT é um sensível e eficiente
biomarcador para avaliar os efeitos biológicos cumulativos da exposição a metais (VERGANI et
al., 2007; KNAPEN et al., 2007; WERNER et al., 2008).
No entanto, alguns estudos indicaram que os níveis da proteína e os níveis de mRNA da
MT não são claramente associados (VASCONCELOS et al., 2002; VERGANI et al., 2007) e
então seria interessante a mensuração de ambos no biomonitoramento de ambientes aquáticos.
28
Pesquisas laboratoriais sugerem que a quantificação dos níveis de mRNA da MT seja um
indicador mais sensível das alterações ambientais nos estudos de biomonitoramento (KNAPEN
et al., 2007; WERNER et al., 2008).
1.5 A MT e os Peixes
Com a descoberta da metalotioneína em espécies aquáticas, estudos de sua indução e
ligação a metais foram propostos como candidatos ao monitoramento bioquímico de poluição por
metais em ambientes aquáticos (ROESIJADI, 1996). Dentre os animais aquáticos, os peixes são
os mais estudados para esse fim (LINDE et al., 2001; SAMSON et al., 2001; CARVALHO et al.,
2004; CHAN et al., 2003), embora estudos com moluscos também sejam realizados (CERATTO
et al., 2001; BOURDINEAUD et al., 2006).
A tilápia (Oreochromis niloticus) (figura 6) é um modelo animal comumente utilizado em
estudos toxicológicos. É resistente a doenças causadas por vírus, bactérias e parasitas e
considerada uma espécie resistente à poluição e ideal para o biomonitoramento ambiental de
poluição aquática, pela análise da concentração de metais e pela expressão do gene da MT nos
seus tecidos (CHAN, 1994; CHEUNG et al., 2005).
29
Figura 6 Exemplar de tilápia (Oreochromis niloticus).
Também o curimbatá vem sendo utilizado em estudos toxicológicos. São animais que
vivem em baixa alcalinidade, em águas pobres em íons e apresentam tolerância a mudanças no
pH e temperatura da água. Além disso, o curimbatá tem importância comercial e ambiental, sendo
uma espécie nacional de larga distribuição pelas Bacias Hidrográficas Brasileiras (CARVALHO
et al., 2004). A espécie Prochilodus lineatus (figura 7) possui uma distribuição mais restrita ao
Sudeste brasileiro.
30
Figura 7 Exemplar de curimbatá (Prochilodus lineatus).
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivos:
Desenvolver uma metodologia para análise da expressão da metalotioneína
utilizando-se a espécie Oreochromis niloticus (tilápia), visando a padronização de um estudo
aplicável a outras espécies.
Aplicar a metodologia desenvolvida, a partir da tilápia, em Prochilodus lineatus
(curimbatá), que não possui informação sobre o gene da sua metalotioneína. Assim, permitindo a
utilização de uma nova espécie nos estudos de biomonitoramento.
31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados exemplares jovens de tilápia (O. niloticus) e de curimbatá (P. lineatus),
fornecidos pela Estação de Hidrobiologia e Piscicultura, da Usina de Furnas, Furnas-MG. Os
animais foram transportados até o Laboratório de Zoofisiologia e Bioquímica Comparativa do
Departamento de Ciências Fisiológicas da UFSCar, onde foram aclimatados às condições
laboratoriais (25± 1
o
C; pH 7,0).
3.2 PRIMERS
Os primers utilizados foram desenhados a partir de pesquisa no GenBank. No site do
NCBI (National Center for Biotechnology Information) foi realizada uma busca com as palavras-
chave “metallothionein and fish” no campo “search protein”, obtendo-se assim uma lista de
artigos relacionados, dos quais foram selecionados os mais pertinentes, ou seja, estudos
realizados em peixes e que continham seqüências completas de aminoácidos. As seqüências
foram alinhadas pelo programa Multalin Online (figura 8), de onde obteve-se uma seqüência
consenso. Também foi realizada uma pesquisa com a seqüência nucleotídica desta proteína,
selecionando aqueles trabalhos que apresentavam a seqüência do cDNA e/ou mRNA e que
32
estavam isentas de íntrons. Para orientar a construção dos primers o programa GeneRunner foi
utilizado.
Figura 8 Alinhamento de MTs de peixes. gi|33090207| MT B de Salvelinus alpinus; gi|30421163| MT A de
Salvelinus alpinus; gi|18201961| MTB CHIHA MT B; gi|8099055| MT Dicentrarchus labrax; gi|3292988| MT
Pagothenia borchgrevinki; gi|1323543| MT Trematomus bernacchii; gi|1322376| MT Chaenocephalus aceratus; gi
MT Pagothenia borchgrevinki; gi|3201536| MT I Notothenia coriiceps; gi|3676135| MT Chionodraco
rastrospinosus; gi|3334767| MT Parachaenichthys charcoti; gi|3676090| MT Chaenocephalus aceratus; gi|
27261572| de Carassius cuvieri; gi|27261557| Carassius cuvieri.
Assim, construiu-se o primer Foward com base na seqüência inicial consenso da MT. Os
primers Adaptador poli-T e o Adaptador foram desenhados a partir de primers presentes na
literatura (SCUDIERO et al., 1997; KNAPEN et al., 2005). Estes primers estão indicados na
tabela 1.
Primers
Adaptador poli-T
5’CGGAGATCTCCAATGTGATGGGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT3’
Adaptador
5’CGGAGATCTCCAATGTGATGGGAATTC3’
Forward
5’ATGGAYCCITGYGAITG3’
Tabela 1. Seqüências dos primers para análise do gene da metalotioneína.
Para o controle endógeno utilizou-se primers Forward e Reverse para GAPDH, com as
seqüências listadas na tabela 2.
Primers
GAPDH Forward
5’GATGCTGGTGCTGAGTATGTCG3’
GAPDH Reverse
5’GTGGTGCAGGATGCATTGCTGA 3’
Tabela 2. Seqüências dos primers de GAPDH para controle endógeno.
33
3.3 EQUIPAMENTOS
Para extração do RNA total foi utilizado o Homogenizador Power Gen1000 (Fisher
Scientific) e a Centrífuga Refrigerada (Eppendorf). Para analisar a qualidade e pureza do RNA
total obtido, as amostras foram avaliadas no Espectrofotômetro Ultrospec 2000 UV/Visible
Spectrophotometer (Pharmacia Biotech) e resolvidas em gel de agarose 1% com formaldeído em
cuba de eltroforese Horizon®58.
Para amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizou-se o
Termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer). Correu-se gel de Agarose 1% com
o resultado da PCR e este gel foi analisado e fotografado no White/2 UV Transilluminator – UVP
(Kodak Digital Science 1D).
A PCR em Tempo Real foi desenvolvida no Termociclador Rotor Gene RG3000 (Corbett
Research), com o software para do programa Rotor Gene 6.
Também foi utilizado o homogenizador descrito anteriormente para a extração de
proteínas. A SC 210ª Speed Vac®Plus (Thermo Savant) foi utilizada nos ensaios com a proteína
para secar ou concentrar as amostras.
As imagens referentes aos géis de poliacrilamida e às membranas de imunodetecção
presentes nesse trabalho foram documentadas com a ajuda do scanner (ScanJet Hewlet Packard)
e da câmera Kodak DS 120.
34
3.4 MÉTODOS
3.4.1 Animais
Os animais vindos da Estação de Furnas foram aclimatizados nos tanques do laboratório e
durante 15 dias foram observados quanto à anormalidades no comportamento, ausência de
escamas ou qualquer outra alteração que indicasse alguma patologia.
Para realização dos experimentos com tilápia (O. niloticus) foram separados em aquários
cinco animais para compor o grupo tratado (T) e cinco para compor o grupo controle (C). Já para
os experimentos com curimbatá (P. lineatus), o número foi de treze animais para cada grupo,
formando também um grupo controle (C) e outro tratado (T).
Para ambas as espécies os grupos tratados receberam injeções intraperitoniais de cloreto
de zinco (ZnCl
2
) em concentrações crescentes, ou seja, no primeiro dia eles receberam uma dose
de 1mg/Kg (1mg de Zn
2+
por kg de peixe), no segundo dia 2mg/kg, no terceiro 4mg/kg e no
quarto 8mg/kg. No quinto dia os animais foram sacrificados por secção da medula (CHAN et al.,
1989). Foi considerado um peso médio dos animais de 100g.
Os grupos controles dessas espécies também receberam injeções intraperitoniais, porém
contendo NaCl (1,1%) na intenção de submeter os animais às mesmas condições de estresse que
os dos grupos tratados.
O fígado dos animais foi separado para as análises posteriores, sendo armazenado em tubo
de criogenia e colocado em nitrogênio líquido. Posteriormente este tecido foi congelado à
temperatura de -80
o
C.
35
3.4.2 Extração de RNA
Dos tecidos congelados foi extraído o RNA total usando o reagente Trizol. Os tecidos
foram homogeneizados em Trizol e centrifugados por 10 minutos a 12000 rpm a 4
o
C. Ao
sobrenadante foi acrescentado clorofórmio e deixado à temperatura ambiente por 2 minutos. As
amostras foram centrifugadas e a fase aquosa obtida foi transferida para um novo microtubo.
Acrescentou-se isopropanol e novamente centrifugou-se as amostras. O precipitado formado foi
lavado com etanol 75% e ressuspendido em 70µl de água tratada com DEPC 1%
(Dietilpirocarbonato) (livre de RNAse).
Para verificar a qualidade e a pureza do RNA extraído, as amostras foram diluídas 100x
em água tratada com DEPC 1% para leitura no espectrofotômetro, em absorbâncias de 260 e
280nm. Foram consideradas as amostras que continham a razão A260/A280 ≥ 1,65. As amostras
também foram resolvidas em Gel de Agarose 1% para RNA (0,3g de agarose, 3ml de MOPS
10X, 25,5ml de água com DEPC e 2,7ml de formaldeído 37%), utilizando tampão MOPS 1X
(Ácido 3-N Morfolino Propanosulfônico) para a corrida.
3.4.3 Produção do cDNA
Usando o kit da Promega, M-MLV Reverse Transcriptase, 2µg de RNA total foram
adicionados em um microtubo com mais 1µl do primer Adaptador poli-T e completado com água
com DEPC para um volume final de 14µl. Aqueceu-se o microtubo a 70
o
C por 5 minutos,
seguido de resfriamento em gelo imediatamente após este tempo. Foi acrescentado ao tubo o
36
Tampão 5x do kit, dNTPs (10mM) e a transcriptase reversa. Incubou-se esta reação por 60
minutos à 37
o
C. O cDNA foi armazenado a -20
o
C.
Também foi produzido cDNA de todas as amostras utilizando-se o primer poli-T, para a
realização dos controles endógenos.
3.4.4 PCR Convencional
Foi feita a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a partir do cDNA produzido de ambas
as espécies, tilápia e curimbatá. Para tanto, colocou-se 1,0µl de DNA molde com dNTPs, primers
Forward e Adaptador, cloreto de magnésio (50mM), Taq DNA Polimerase (Fermentas) e mais o
tampão 10x com KCl (Fermentas). A reação foi colocada no Termociclador a 94
o
C por 5
minutos, com 30 ciclos (94
o
C por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos, 72
o
C por 1 minuto), e 10
minutos a 72
o
C.
O produto da reação foi analisado em gel de agarose 1%, visto sob a luz UV do
Transiluminador e fotografado. Utilizou-se padrão Low DNA Mass Ladder (Invitrogen). Para
cada uma das espécies foi selecionada a banda mais expressiva, que foi recortada do gel para
tratamento de purificação com o kit Perfect Gel Cleanup (Eppendorf) para o posterior
sequenciamento. O fragmento retirado do gel foi colocado em microtubo e pesado. A ele foi
adicionado tampão de ligação do kit e incubado por 5 minutos a 50
o
C para dissolução do gel. Foi
adicionado isopropanol e a amostra foi colocada em coluna com tubo coletor. Centrifugou-se e
acrescentaram-se 750µl de tampão de lavagem. Depois de centrifugar novamente a coluna foi
37
colocada em novo tubo e à ela foi adicionado tampão de eluição. A solução final foi lida em
espectrofotômetro com absorbância de 260nm.
Uma alíquota da solução foi enviada ao Laboratório de Cristalografia do Departamento de
Biofísica da USP – Campus São Carlos, para a realização do sequenciamento do fragmento.
Os resultados obtidos a partir do sequenciamento foram analisados pelo site do NCBI,
através do programa “Blast” – Basic Local alignment sequence tool
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), para comparação com as seqüências depositadas
no GenBank, para confirmação da seqüência encontrada.
3.4.5 PCR quantitativo
Para realização da PCR em tempo real ou PCR quantitativo (qPCR) com o kit Quantimix
Easy SYG Kit, da Biotools, foi utilizado 1µl do cDNA produzido, juntamente com 2µl de cada
primer (Forward e Adaptador), 20µl da solução do kit e completada a reação com água com
DEPC para um volume final de 42µl, correspondendo à duplicata de 20µl para cada microtubo.
A reação foi colocada no Termociclador Rotor Gene a 94
o
C por 5 minutos, com 40 ciclos
de 94
o
C por 30 segundos, 50
o
C por 30 segundos e 72
o
C por 1 minuto.
Foram verificadas a florescência emitida e a curva de melting para avaliar a qualidade e
pureza do resultado obtido na amplificação. Os produtos das reações foram também observados
em gel de agarose 1% e o padrão utilizado foi o Low DNA Mass Ladder (Invitrogen).
O software do programa Rotor Gene forneceu os valores de Ct (Threshold Cycle), que
foram utilizados para análises estatísticas. As análises foram realizadas através de métodos
38
descritivos e pelo teste T (Student), pelo software SAS Interprise GUIDE. A utilização de uma
abordagem paramétrica se dá pelo fato de suposições básicas deste tipo de abordagem não serem
violadas (ZAR, 1999), ou seja, os dados foram considerados independentes, normais e
homocedásticos (com variância constante).
3.4.6 Clonagem
Visando conseguir a seqüência mais completa do RNA mensageiro da metalotioneína,
foram realizados ensaios de clonagem. Para preparação de células competentes foi colocado em
um tubo falcon 10ml de meio LB (Luria Bertani) (Sigma USA) juntamente com células da
linhagem de DH5-α. Em outros dois tubos foram colocados, além do meio e das células,
antibióticos ampicilina (50mg/ml) e canamicina (30mg/ml) respectivamente usados como
controles. Estes falcons foram incubados a 37
o
C por toda noite (cerca de 16h) sem agitação.
Mantendo a esterilidade da cultura trabalhando em fluxo laminar, foi retirada uma
alíquota de 1ml do Falcon contendo apenas o meio com as células, para se medir a DO 600nm
que deveria estar entre 0,4 e 0,6. A amostra foi centrifugada a 5000 rpm por 10 minutos em
centrifuga refrigerada. Ressuspendeu-se o precipitado em 3ml de cloreto de cálcio (CaCl
2
) 50mM
estéril. Incubou-se em gelo por 30 minutos, voltando a centrifugar em seguida, sob as mesmas
condições anteriores. O precipitado foi novamente ressuspendido em 600µl de CaCl
2
50mM e
transferido para um microtubo que foi mantido em isopor com gelo a 4
o
C por no mínimo 24h.
Foi feita uma PCR convencional para amostras de tilápia e de curimbatá e posteriormente
visualizadas em gel de agarose 1,0%, do qual as bandas de interesse foram purificadas pelo kit
39
Perfectprep Gel Cleanup. Foi realizada uma etapa de adenilação, em que ao DNA purificado foi
acrescentado tampão (KCl), dATP e a Taq polimerase e mantida a 72
o
C por 30 minutos.
Todo o produto adenilado foi utilizado para a reação de ligação. Esta reação dependeu do
vetor utilizado, já que foram testados diferentes kits como o TOPO TA Cloning® Kits
(Invitrogen), Clone Jet
TM
PCR Cloning kit (Fermentas), InsTA Clone PCR Product Cloning kit
(Fermentas) e o pGEM® T Easy Vector Systems (Promega). No geral acrescentou-se ao produto
adenilado o vetor, o tampão correspondente de cada kit e mais a T4 DNA Ligase (exceto para o
TOPO).
A reação de transformação foi feita utilizando-se a reação de ligação misturada com 100µl
das células competentes e colocada em gelo por 30 minutos. Foi realizado um choque térmico,
para que as células permitissem a entrada do vetor, de 30 segundos a 42
o
C e resfriando em gelo
imediatamente. Acrescentou-se ainda 500µl de meio LB e colocou-se em agitação a 37
o
C pelo
período de 1h. Plaqueou-se esta solução em placas contendo antibiótico canamicina (30mg/ml),
IPTG e X-Gal (40mg/ml). As placas foram colocadas em estufa a 37
o
C por 16h
.
3.4.7 Isolamento de DNA plasmidial
O isolamento do DNA plasmidial foi realizado através de ensaio por Lise Alcalina e pelo
kit da Eppendorf.
Para realização da Lise Alcalina, incubou-se 10ml de meio LB com material de uma
colônia mais 10µl do antibiótico canamicina (30mg/ml), deixando por cerca de 16h a 37
o
C.
Separou-se uma alíquota de 900µl desta que foi acrescida de 100µl de glicerol para fazer solução
40
estoque. Centrifugou-se 1,5ml de células por 20 segundos, ressuspendendo o precipitado obtido
em 100µl de GTE (Glicose 50mM, Tris-HCl 25mM e EDTA 10mM, pH8,0) por 5 minutos a
temperatura ambiente. Acrescentou-se em seguida solução de lise (200µl de NaOH 1N, 100µl de
SDS 10% e 700µl de água estéril) por 5 minutos em gelo. Adicionaram-se 150µl de acetato de
potássio 5M (Acetato de potássio 5M, ácido acético glacial e água estéril, pH4,8) e deixou-se por
mais 5 minutos no gelo. Em seguida, centrifugou-se e transferiu-se o sobrenadante para novo
tubo, adicionando 800µl de etanol 95% por 2 minutos a temperatura ambiente. Novamente
centrifugou-se e o precipitado obtido foi lavado com etanol 70%. Por fim, o precipitado foi
ressuspendido em 30µl de água estéril e estocado. Para verificação deste ensaio foi feito gel de
agarose 1,0%.
A minipreparação pelo kit da Eppendorf foi realizada seguindo o protocolo do fabricante e
também foi resolvida em gel de agarose 1,0%.
3.4.8 Reação de Digestão
O sucesso da clonagem foi verificado por reação de digestão para verificar a ocorrência de
inserção do cDNA de interesse ao plasmídeo. Foi acrescentado ao plasmídeo, , a enzima Eco RI
(Invitrogen), RNAse, água estéril e tampão React 3 10X (Invitrogen). Esta reação foi colocada
em banho-maria a 37
o
C por 2h. Fez-se gel de agarose 1,0% para analisar esta reação, com padrão
Low DNA Mass Ladder (Invitrogen).
41
3.4.9 Extração de Proteína
Para extração de proteína dos tecidos armazenados a -80
o
C, preparou-se tampão Hepes
(Hepes 10mM pH7,1 acrescido de 0,25% de Triton X-100). Os tecidos colocados em microtubos
com este tampão foram homogeneizados utilizando-se o mesmo homogenizador dos ensaios de
extração do RNA. Os extratos obtidos foram armazenados a -20
o
C.
A concentração de proteína foi determinada através do kit BCA™ Protein Assay Kit
(Pierce) Este kit é uma formulação baseada no método do ácido bicincrônico (BCA) para a
detecção colorimétrica e quantificação de proteína total (SMITH et al., 1985). Uma série de
diluições de soroalbumina bovina (BSA) de concentração conhecida (25µg/ml a 2.000µg/ml) foi
preparada e testada juntamente com as amostras de concentração desconhecida, de acordo com as
instruções do fabricante. A reação produzida por este método exibe uma forte absorbância em
562nm que é linear com as concentrações protéicas crescentes em um intervalo de 20 a 2000µ
g/ml. Desta forma, após a leitura da absorbância de todas as reações, a concentração protéica das
amostras purificadas foi determinada a partir da curva padrão construída através das diluições de
BSA.
3.4.10 Western Blotting (Imunodetecção)
Para os ensaios de imunodetecção da metalotioneína as amostras de proteína foram
separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE,
LAEMMLI, 1970). Tais amostras foram aplicadas em um gel de empilhamento de 5% de
42
poliacrilamida sendo resolvidas em um gel de tricina 16% de acrilamida/bisacrilamida, já que a
proteína metalotioneína apresenta baixa massa molecular de cerca de 6kDa. Secou-se as amostras
em Speed Vac®Plus, ressuspendendo-as em 15µl de água estéril e foi adicionado o tampão da
amostra desnaturante contendo β-mercaptoetanol (Tris-HCl 125mM pH 6,8, SDS 4%, 0,025%
azul de bromofenol, glicerol 20%, 0,1M β-mercaptoetanol). Essas amostras foram colocadas em
banho seco a 100
o
C por 10 minutos e em seguida aplicadas ao gel e submetidas à eletroforese
com uma corrente elétrica de 25mA e 110V, por aproximadamente 1,5h. Foi utilizado o marcador
pré-corado BenchMark
TM
Prestained Protin Ladder (Invitrogen). Como controle positivo foi
utilizada a metalotioneína de fígado de coelho (Sigma – Aldrich, catálogo M5267).
Em seguida, as amostras corridas no gel foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose 0,2 micron 20x20 cm (Sigma-Aldrich), através do sistema de transferência semi-
seca Trans-Blot®SD Semi-Dry transfer (Bio Rad), usando tampão de transferência Tris-HCl
48mM, glicina 39mM, metanol 20% pH 9,0 durante 1 hora a 20V. Após a transferência, as
membranas foram incubadas em solução de bloqueio (leite desnatado 5%, Tween 20 0,5% em
TBS 1X) durante 16 horas. Após esse período, a membrana foi lavada com TBS 1X (NaCl 1,4M,
KCl 27mM, NaHPO
4
100mM, KH
2
PO
4
, pH7,3) com Tween 20, por 3 vezes durante 15 minutos e
incubada por 2 horas com o anticorpo primário policlonal anti-metalotioneína humana (Santa
Cruz) na concentração 1:1000. Depois lavou-se a membrana por mais 3X de 15 minutos cada
com TBS 1X com Tween 20 e incubou-se por mais 2 horas com o anticorpo anti-IgG de coelho
conjugado com fosfatase alcalina (Santa Cruz). Foi repetida a fase de lavagem e a membrana foi
revelada utilizando solução contendo o substrato cromogênico, BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indoil-
fosfato de p-toluidina) na presença de NBT (cloreto de nitroblue tetrazólico). A revelação foi
interrompida por lavagem da membrana com água.
43
Para confirmar a eficiência da transferência, o gel de poliacrilamida foi corado com 0,25%
de Comassie Blue R-250 (Sigma) dissolvido em 50% de isopropanol e 10% de ácido acético e a
membrana de nitrocelulose foi corada com Ponceau 0,5% (m/v) em ácido acético 0,1% (v/v). As
bandas referentes à proteína de interesse foram marcadas e a membrana descorada com ácido
acético 0,1% (v/v) e o gel de poliacrilamida com 10% de ácido acético e 10% de metanol .
As amostras de proteína também foram submetidas a eletroforeses com gel de tricina
sendo as bandas protéicas reveladas após a corrida incubando os géis em solução corante de
0,25%(v/v) de Comassie Blue R-250 (Sigma, USA) dissolvido em 50% (v/v) de isopropanol e
10% (v/v) de ácido acético durante 30 minutos e depois na solução descorante de 10% (v/v) de
ácido acético e 10%(v/v) de metanol.
3.4.11 Imunoprecipitação
A imunoprecipitação foi utilizada como um ensaio mais sensível para a detecção da
metalotioneína. Para tanto foi utilizada uma alíquota de 80µg de proteína e esta foi incubada com
1µl do anticorpo anti-metalotioneína humana concentrado. A mistura contendo a proteína com o
anticorpo foi colocada em microtubo em um isopor com gelo e deixada em agitação por 1h.
Posteriormente este isopor foi colocado a 4
o
C por aproximadamente 16h.
Após a incubação, foi adicionados 20µl da proteína AG-agarose e a mistura incubada por
2h coberta por gelo sob suave agitação. Centrifugou-se por 10 minutos a 12000rpm a 4
o
C.
Retirou-se o sobrenadante e lavou-se o precipitado com tampão de lise (50mM de Tris-HCl
pH7,4, 150mM de NaCl, 1,5mM de MgCl2, 1,5mM de EDTA, 1% de Triton X-100 e 10% de
44
Glicerol) por 2X. Acrescentou-se 50µl de tampão da amostra com β-mercaptoetanol, e a amostra
foi aquecida por 3 minutos a 90
o
C.
Repetiram-se os procedimentos do Western Blotting. Antes de correr a eletroforese,
centrifugou-se em alta velocidade (13000rpm) por 5 minutos para retirar a partícula de AG-
agarose.
O anticorpo secundário utilizado para este ensaio foi o anti-IgG de coelho conjugado com
peroxidase (Sigma). Para a etapa de revelação foi necessária a permanência em sala escura.
Foram utilizadas as soluções do kit Chemiluminescent Peroxidase Substrate (Sigma) para
preparação da membrana. Esta foi envolvida em parafilm e colocada na placa para revelação
(Amersham). Sobre a membrana foi colocado o Hyperfilm
TM
ECL (Amersham) e esperou-se 1
minuto para a sensibilização do filme. Este filme foi revelado passando primeiro na solução
reveladora (Kodak Dental), em água, depois na solução fixadora (Kodak Dental) e novamente em
água, deixando-se secar posteriormente.
45
4. RESULTADOS
Os animais utilizados para os experimentos não apresentavam anormalidades no
comportamento, ausência de escamas ou qualquer alteração que pudesse indicar alguma
patologia.
Os grupos controle e tratado da espécie O. niloticus, constavam inicialmente de cinco
animais cada. Durante o desenvolvimento do experimento dois animais morreram, devido ao
estresse da manipulação. Como o interesse do estudo com o grupo da tilápia foi como um
experimento para otimização da metodologia, não se mostrou necessária a repetição do
experimento com outros animais. Assim, as análises foram realizadas com três animais do grupo
controle e cinco do grupo tratado.
Sabendo da possibilidade de se perder alguns animais na realização dos experimentos,
para os ensaios com a espécie P. lineatus utilizou-se um número maior de indivíduos para que ao
final houvesse ao menos dez animais de cada grupo. Assim, dos treze animais iniciais para cada
grupo, utilizamos para as análises dez deles, visto que três de cada grupo morreram durante o
desenvolver do procedimento experimental.
4.1 Oreochromis niloticus
O RNA total obtido foi verificado quanto a sua qualidade em gel de agarose 1% para
RNA e a sua absorbância lida a 260 e 280nm. Com os valores das absorbâncias foi determinada a
razão A260/A280 e todos os valores obtidos estavam a cima de 1,65 como é o indicado para se
46
ter uma amostra de boa qualidade, indicando maior teor de ácido nucléico do que proteína. A
resolução em gel mostrou a presença de bandas indicando o RNA ribossomal, não apresentou
DNA genômico, e por isso foi considerado de boa qualidade para realização dos experimentos
(figura 9).
A partir do RNA total foi realizada a produção de cDNA, molécula que é mais estável que
o RNA, e por isso facilita sua manipulação nos ensaios realizados. Com esse cDNA então foi
possível realizar o experimento de PCR amplificando apenas as seqüências de interesse, no caso a
metalotioneína, graças à utilização dos primers específicos. Os resultados obtidos com a PCR
foram resolvidos em gel de agarose 1% e estão apresentados na figura 10.
47
Figura 9 RNA total extraído de fígado de tilápia, resolvido em gel de agarose
1% para RNA, com amostras da extração dos grupos controle (C) e tratado (T).
28S
18S
5S
C
C
T
T
O tamanho do fragmento encontrado (400pb) foi maior do que o fragmento traduzido da
MT presente na literatura. Porém, o primer Adaptador se liga na região 3' UTR, ou seja, na
porção 3' não transcrita, e espera-se que o fragmento obtido pela PCR contenha parte desta
região, e por isso, seja maior.
Foi realizada em seguida a purificação das bandas dos géis e mandadas para
sequenciamentos no Laboratório de Cristalografia do Departamento de Biofísica da USP,
Campus São Carlos. As seqüências de nucleotídeos obtidas, que estão mostradas abaixo, foram
analisadas utilizando-se a ferramenta Blast do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) o que nos garantiu que as bandas obtidas realmente
se tratavam da metalotioneína, já que a seqüência apresentou 94% de similaridade com a
seqüência do mRNA de O. mossambicus, outra espécie de tilápia.
48
Figura 10: Amplificação do cDNA da metalotioneína de O. niloticus. Resultado
representativo de eletroforese em gel de agarose 1%. P = padrão, C = controle, T =
tratado. Bandas à aproximadamente 400 pares de bases.
400 pb
C TP
Seqüênciamento de aminoácidos correspondentes ao N-terminal da metalotioneína:
NPPPPKKXXXXGPEDTELRRCTCTKCSCKSCKKSCCDCCPSGCSKCASGCVCKGKTCDT
SCCQ&
Pelo programa GeneRunner a seqüência de nucleotídeo obtida foi traduzida em
aminoácidos e foi feito o alinhamento dessa seqüência com a seqüência da MT de O.
mossambicus presente no GenBank, mostrando grande similaridade entre as elas (figura 11).
Como pôde-se observar a extremidade N-terminal da sequência obtida não foi totalmente
resolvida, e os Xs indicam aminoácidos que não foram seqüenciados, que é o sítio de ligação do
primer Forward. Por essa razão, foram feitas tentativas de clonagem, visando um melhor
sequenciamento da MT.
4.1.1 PCR quantitativo
As análises quantitativas da expressão da metalotioneína foram feitas pela metodologia de
PCR em tempo real, onde foram obtidos os valores de Ct em duplicata e calculada a média desses
valores para cada indivíduo, como mostrado na tabela 3 (média dos Cts). Na tabela também estão
indicadas as médias de Cts do gene normalizador GAPDH. Os demais valores presentes nessas
tabelas são os cálculos para se chegar aos valores de expressão de cada indivíduo (UA, unidades
49
Figura 11: Alinhamento das seqüências traduzidas da metalotioneína das espécies
O. mossambicus, presente no GenBank, e O. niloticus, obtida a partir do
sequenciamento.
arbitrárias). O produto da qPCR de tilápia foi resolvido em gel de agarose 1%, mostrado na figura
12 para determinação da sua massa molecular, que era coincidente com a esperada de 400pb. A
figura 13 apresenta a expressão do gene de GAPDH nos mesmos tecidos, usada para
normalização dos dados.
Planilha - Tilápia
Controle GAPDH Controle MT DCt DDCt UA Média S
Média Cts Média Cts
1.101667
C1 Til GAPDH 20.96 C1 Til 21.66 0.7 -0.4016667 1.3210331
C2 Til GAPDH 19.325 C2 Til 20.845 1.52 0.4183333 0.7482886
C3 Til GAPDH 19.595 C3 Til 20.68 1.085 -0.0166667 1.0116194
Tratado GAPDH Tratado MT DCt DDCt UA
Média Ct Média Ct
T1 Til GAPDH 23.435 T1 Til 15.705 -7.73 -8.8316667 455.61349
T2 Til GAPDH 18.08 T2 Til 17.175 -0.905 -2.0066667 4.0185267
T3 Til GAPDH 18.26 T3 Til 15.32 -2.94 -4.0416667 16.468836
T4 Til GAPDH 19.14 T4 Til 17.38 -1.76 -2.8616667 7.2685453
T5 Til GAPDH 17.89 T5 Til 17.64 -0.25 -1.3516667 2.5520678
50
400 pb
P
T
T
T
C
C
C
Tabela 3: Análise da expressão da metalotioneína de O. niloticus pelo PCR em tempo real. A média dos Cts indica a
média entre os valores da duplicata. O DCt, ou delta Ct, é a média de Ct da metalotioneína (MT) – (menos) a média de
Ct do GAPDH. A Média S é a média dos valores de DCt dos controles. O DDCt (delta delta Ct) é o valor do DCt –
(menos) a Média S. O UA, é o valor da expressão da MT em cada indivíduo e é calculado por 2
-DDCt
.
Figura 12 PCR quantitativo da MT de tilápia, resolvido em gel de agarose 1%. P: padrão
Low DNA Mass Ladder, C: animais do grupo controle, T: animais do grupo tratado.
Os testes estatísticos para análise dos dados de PCR quantitativo utilizaram o programa
estatístico SAS Interprise Guide. Para as análises com os dados referentes à espécie O. niloticus
os valores extremos de expressão da MT foram excluídos. As análises descritivas para esta
espécie estão indicadas na tabela 4 e na figura 14. Foi feito o Teste T para verificar se a diferença
entre os grupos controle e tratado era significativa. A hipótese para o Teste T foi de igualdade
entre os grupos, e com 95% de confiança o teste indicou que a diferença entre os grupos é
significativa, sendo o valor de T= -2,56, ou seja, o módulo do valor de T sendo maior do que 2,0
rejeita-se a hipótese de igualdade.
TILÁPIA Grupo C Grupo T
N
3 3
Média
1,027 4,613
Mediana
1,0116 4,018
Variância
0,08219 5,826
Desvio Padrão
0,2867 2,414
51
200 pb
P
T
T
T
C
C
C
Figura 13 PCR quantitativo para GAPDH de tilápia, resolvido em gel de agarose 1%. P:
padrão Low DNA Mass Ladder, C: animais do grupo controle, T: animais do grupo
tratado.
Tabela 4: Análise descritiva dos valores da expressão da MT (UAs) de tilápia.
4.1.2 Tentativas de Clonagem
Quanto aos ensaios de clonagem da MT de tilápia, apenas foram obtidas colônias brancas
quando se utilizou o kit do Topo. Ao realizar a minipreparação foram observadas em gel de
agarose 1% bandas correspondentes aos plasmídeos, porém quando feita a digestão e resolvida
em gel não se observou o inserto correspondente à seqüência da metalotioneína.
52
Figura 14 Diagrama de caixas e suíças representando os resultados de expressão da MT nos
grupos controle e tratado de tilápia. Os valores da média (x) e desvio padrão (dp) estão
apresentados. O * representa diferença estatisticamente significativa, com valor de t=-2,56.
4.1.3 Identificação protéica da MT
A análise da expressão proteica da metalotioneína envolveu sua extração por
homogenização com tampão Hepes e posterior quantificação do extrato proteico por BCA.
Foram utilizados 80µg de proteína de cada extrato para os ensaios de SDS-PAGE, mostrando
uma grande quantidade de proteínas (figura 15).
O Western Blotting apresentou resultado, porém não o esperado. Abaixo, a figura 16
mostra a membrana de Nitrocelulose após incubação com os dois anticorpos e corada com
Tampão de Fosfatase alcalina, com BCiP e NBT. As bandas apresentadas se encontram com
maior massa do que o esperado, estando na altura de aproximadamente 70kDa, quando era
esperado que estivessem entre 6 e 7 kDa.
53
Figura 15 SDS-PAGE dos extratos protéicos do fígado de tilápia. Gel de Tricina com 16% de
Acrilamida/Bisacrilamida. Corado com Comassie Blue. P: padrão de proteína pré-corado (kDa),
C: animais do grupo Controle de tilápia, T: animais do grupo Tratado da tilápia.
181,8
115,5
82,2
64,2
48,8
37,1
25,9
19,4
C
T
C
T
T
T
C
C
P
Um método de maior sensibilidade, a imunoprecipitação, também foi realizado. O
anticorpo usado para esse ensaio foi o anti-IgG de coelho conjugado com a Peroxidase. Foi
revelado no escuro e o resultado mostrou a presença de bandas, porém também de alta massa
molecular, não indicando ser a MT (figura 17).
Apesar da conservação da MT e da similaridade entre as MTs humana, de coelho
(controle positivo usado) e de peixes (figura 18) é possível que as diferenças existentes possam
ser uma explicação para o resultado negativo do Western Blotting, justificando o não
reconhecimento da MT de peixe pelo anticorpo anti-MT humana.
54
C T
70kDa
Figura 17 Ensaio de imunoprecipitação com tilápia. C: controle, T: tratado.
70 kDa
Figura 16 Western Blotting das amostras de tilápia. Membrana de nitrocelulose incubada com
anti-MT humana e com anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina. MT: metalotioneína
purificada (Sigma-Aldrish), C: grupos controles da tilápia, T: grupos tratados da tilápia.
4.2 Prochilodus lineatus
Os experimentos realizados com o curimbatá (P. lineatus), foram os mesmos realizados
com a tilápia. O RNA total foi verificado quanto a sua qualidade em gel de agarose 1% com
formaldeído para RNA e a sua absorbância lida a 260 e 280nm. Foi calculada uma razão
A260/A280 com as absorbâncias e todos os valores obtidos estavam a cima de 1,65 como é o
indicado. A resolução em gel mostrou a presença de bandas indicativas de RNA ribossomal e a
ausência de DNA genômico detectável (figura 19).
55
Figura 18 Alinhamento da MT de O. niloticus com as MTs humana e de colelho.
Figura 19 Análise das preparações de RNA total em gel de agarose 1% para RNA, com
amostras da extração dos grupos controle (C) e tratado (T) de curimbatá.
28S
18S
5S
C
CT T
O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total e utilizado na realização do experimento de
PCR, usando os mesmos primers que para os experimentos com tilápia. Os resultados da PCR
foram resolvidos em gel de agarose 1% e estão apresentados na figura 20.
As bandas próximas a 400 pares de bases foram recortadas do gel e mandadas para o
sequenciamento na USP. Assim como da tilápia, a seqüência obtida de curimbatá foi maior do
que a seqüência traduzida da MT, devido ao fato do primer Adaptador se ligar na posição 3' UTR
e a seqüência que se obteve conter uma grande porção de seqüência que não é traduzida. A
seqüência de nucleotídeos obtida também foi comparada com as seqüências do GenBank e
apresentou 80% de similaridade com as seqüências da metalotioneína de Trematomus bernacchii.
Seqüênciamento dos aminoácidos correspondentes ao N-terminal da MT de curimbatá:
XYRHLXYLSLSNCTNCTCKCCPCCPSSCSKASGCVCGKTCDSSCSVTP
56
400 pb
C
T
P
Figura 20 Amplificação do cDNA da MT de curimbatá, resolvida em gel de agarose 1% do produto
de PCR das amostras de cDNA, obtido a partir de extração de RNA total de amostras de fígado de P.
lineatus. P = padrão, C = controle, T = tratado. Banda a aproximadamente 400 pares de bases.
A tradução de nucleotídeos para aminoácidos também foi feita pelo GeneRunner, seguida
do alinhamento com seqüências da MT de outros peixes, o Trematomus bernacchii e O.
mossambicus, conforme mostra a figura 21. A seqüência obtida não está completamente
resolvida, e por isso a tentativa de clonagem, mas mesmo assim consegue-se observar uma
manutenção das posições do aminoácido Cys, que é uma característica marcante da
metalotioneína.
4.2.1 PCR quantitativo
Sabendo-se que a metalotioneína corresponde à banda encontrada na PCR, fez-se os
ensaios de PCR em tempo real com os mesmos primers da convencional, para poder quantificar a
expressão da MT nos dois grupos de curimbatá. Os valores obtidos e cálculos feitos para se
chegar à expressão estão indicados na tabela 5, inclusive os valores do gene normalizador
GAPDH. A figura 22 mostra o qPCR para o gene da MT de curimbatá e a figura 23 apresenta o
qPCR do gene GAPDH para os mesmos tecidos.
57
Figura 21 Alinhamento das seqüências traduzidas da metalotioneína das espécies O. mossambicus e
Trematomus bernacchii, presentes no GenBank, e P. lineatus, obtida a partir do sequenciamento.
Planilha - Curimbata
Controle GAPDH Controle MT DCt DDCt UA Média S
Média Ct Média Ct 7.0145
C1 Cur GAPDH 14.555 C1 Cur 19.88 5.325 -1.6895 3.225449
C2 Cur GAPDH 15.08 C2 Cur 19.355 4.275 -2.7395 6.6783884
C3 Cur GAPDH 14.495 C3 Cur 24.52 10.025 3.0105 0.1240935
C4 Cur GAPDH 17.23 C4 Cur 25.4 8.17 8.17 0.003472
C5 Cur GAPDH 15.215 C5 Cur 23.88 8.665 8.665 0.0024636
C6 Cur GAPDH 17.32 C6 Cur 23.535 6.215 6.215 0.0134617
C7 Cur GAPDH 14.68 C7 Cur 22.05 7.37 7.37 0.0060452
C8 Cur GAPDH 14.81 C8 Cur 21.585 6.775 6.775 0.0091311
C9 Cur GAPDH 14.09 C9 Cur 22.885 8.795 8.795 0.0022513
C10 Cur GAPDH 16.035 C10 Cur 20.565 4.53 4.53 0.0432847
Tratado GAPDH Tratado MT DCt DDCt UA
Média Ct Média Ct
T1 Cur GAPDH 14.87 T1 Cur 21.085 6.215 -0.7995 1.7404978
T2 Cur GAPDH 16.44 T2 Cur 22.25 5.81 -1.2045 2.3045739
T3 Cur GAPDH 14.68 T3 Cur 21.975 7.295 0.2805 0.8233056
T4 Cur GAPDH 16.26 T4 Cur 21.39 5.13 -1.8845 3.6922494
T5 Cur GAPDH 15.64 T5 Cur 21.12 5.48 -1.5345 2.8968802
T6 Cur GAPDH 18.595 T6 Cur 23.59 4.995 4.995 0.0313585
T7 Cur GAPDH 14.81 T7 Cur 16.85 2.04 2.04 0.2431637
T8 Cur GAPDH 14.915 T8 Cur 18.525 3.61 3.61 0.0818996
T9 Cur GAPDH 16.61 T9 Cur 21.505 4.895 4.895 0.0336092
T10 Cur GAPDH 17.995 T10 Cur 21.76 3.765 3.765 0.0735567
58
400 pb
P
T
T
T
C
C
C
Tabela 5 Análise da expressão da metalotioneína de P. lineatus pelo PCR em tempo real. A média dos Cts indica a
média entre os valores da duplicata. O DCt, ou delta Ct, é a média de Ct da metalotioneína (MT) – (menos) a média
de Ct do GAPDH. A Média S é a média dos valores de DCt dos controles. O DDCt (delta delta Ct) é o valor do DCt
– (menos) a Média S. O UA, é o valor da expressão da MT em cada indivíduo e é calculado por 2
-DDCt
.
Figura 22 PCR quantitativo com MT de curimbatá, resolvido em gel de agarose 1%. P:
padrão Low DNA Mass Ladder, C: animais do grupo controle, T: animais do grupo
tratado.
Os testes estatísticos para analisar os dados obtidos com PCR quantitativo, foi utilizando o
programa estatístico SAS Interprise Guide. As análises descritivas para esta espécie mostraram
haver dois pontos muito extremos em relação à maioria dos valores do grupo controle. Com a
rejeição desses pontos os resultados obtidos estão indicados na tabela 6 e representados na figura
24. Foi feito o Teste T para verificação da significância da diferença entre os grupos C e T, e
com 95% de confiança a diferença é significativa. O valor de t foi -2,24, portanto seu módulo foi
maior que 2 rejeitando a hipótes de igualdade dos grupos.
CURIMBATÁ Grupo C Grupo T
N
8 10
Média
0,0255 0,9143
Mediana
0,0076 0,2432
Variância
0,0018 1,245
Desvio Padrão
0,042 1,12
59
200 pb
P
T
T
T
C
C
C
Figura 23 PCR quantitativo de GAPDH de curimbatá, resolvido em gel de agarose 1%.
P: padrão Low, C: animais do grupo controle, T: animais do grupo tratado.
Tabela 6 Análise descritiva dos valores da expressão da MT (UAs) de curimbatá.
4.2.2 Tentativas de Clonagem
Quanto aos ensaios de clonagem utilizando o gene da MT de curimbatá, estes não
mostraram resultados. Não houve crescimento de colônias nas placas com meio LB.
4.2.3 Identificação protéica da MT
Para as análises da expresssão proteica da metalotioneina dessa espécie, fez-se a extração
de proteínas por homogenização com tampão Hepes e quantificação por BCA. Utilizou-se 80µg
60
Figura 24 Diagrama de caixas e suíças representando os resultados de expressão da MT nos grupos
controle e tratado de curimbatá. Os valores da média (x) e desvio padrão (dp) estão apresentados. O
* represeta diferença estatisticamente significativa, com valor de t=-2,24.
de proteína de cada extrato para os ensaios de SDS-PAGE, apresentando grande quantidade de
proteína (figura 25).
As proteínas resolvidas em gel de poliacrilamida com tricina foram transferidas para
membrana de nitrocelulose para realização dos ensaios de Western Blotting. Foram visualizadas
bandas, porém de grande massa molecular, aproximadamente 70kDa, e esperava-se a
metalotioneína com 6 a 7 kDa (figura 26).
61
Figura 25 SDS-PAGE dos extratos proteicos de fígado de curimbatá. Gel de tricina com
16% de Acrilamida/Bisacrilamida. Corado com Comassie Blue. P: padrão de proteína
pré-corado, C: animais do grupo controle, T: animais do grupo tratado.
70 kDa
Figura 26 Western blotting para detecção de MT em extratos protéicos de fígado de curimbatá.
Membrana de nitrocelulose incubada com anti-MT humana e com anti-IgG de coelho conjugado
com fosfatase alcalina. C: grupos controles, T: grupos tratados.
C
T
C
T
T
T
C
C
P
181,8
115,5
82,2
64,2
48,8
37,1
25,9
19,4
Assim como para os ensaios proteicos com tecidos de tilápia, uma possível explicação
para a não detecção da MT como esperado seja a utilização de um anticorpo anti-MT humana
para tecido de peixe. E apesar de certa similaridade (figura 27) pode não ter reconhecido a
proteína de peixe.
62
Figura 27 Alinhamento da MT de P. Lineatus com a MT humana e de coelho.
5 DISCUSSÃO
A metalotioneína é bastante estudada em trabalhos de biomonitoramento de poluição
ambiental. Seu estudo em peixes geralmente está associado ao monitoramento de ambientes
aquáticos quanto à exposição a metais. Com relação a mensuração da concentração de metais em
águas ou sedimento, diferentes métodos têm sido propostos e testados, como a caracterização do
acúmulo de metais em diferentes órgãos ou tecidos, que tem provado ser uma mensuaração
representativa (KNAPEN et al., 2007). Porém, a utilização de bioindicadores, como a
metalotioneína, tem se mostrado de grande importância para os estudos de poluição por metais.
Alguns diferentes métodos de análise da MT são utilizados, tais como a cromatografia líquida de
alta resolução (HPLC), métodos de saturação de metais, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay) e Western Blotting. Cada um desses métodos é capaz de mensurar a da proteína MT
(WERNER et al., 2008).
Os ensaios com os extratos proteicos deste trabalho mostraram um resultado diferente do
esperado. A banda marcada nos experimentos de Western Blotting corresponde a uma massa
muito maior do que a correspondente à metalotioneína. Algumas hipóteses podem ser levantadas,
como a ocorrências de uma reação cruzada do anticorpo, ou que a quantidade de MT seja
pequena e por isso não foi possível detectá-la, ou ainda que foi difícil sua transferência para a
membrana de nitrocelulose. Além disso, é preciso levar em consideração o fato de que o
anticorpo utilizado é humano e os tecidos são de peixes, e mesmo com tamanha conservação da
MT, pode ser que o anticorpo não tenha reconhecido a MT de peixe, ou que isso aumente a
possibilidade da ocorrência de reações cruzadas.
63
Alguns trabalhos mostram que o aumento da expressão do mRNA da MT não coincide
com aumento no nível proteico, e que mecanismos pós-transcricionais sejam importantes para
definir a expressão da proteína (VASCONCELOS et al., 2002; VERGANI et al., 2007). Assim,
apesar do mRNA de MT estar expresso em ambos os grupos, talvez o nível desta proteína ainda
seja muito pequeno para possibilitar sua detecção, mesmo com a exposição a metais.
Os trabalhos mais recentes têm se interessado na mensuração do RNA mensageiro da MT
como um bioindicador potencialmente mais responsivo a exposição a metais, que também permiti
o estudo de cada isoforma separadamente, o que não é possível nos estudos da proteína
(CERATTO et al., 2002; KNAPEN et al., 2007; WERNER et al., 2008). Os métodos mais
comumente utilizados para analisar o mRNA da MT têm sido por Northern Blot (SCUDIERO et
al., 1996), por RT-PCR (reaçao em cadeia da polimerase por transcriptase reversa) (SCHLENK
et al., 1997; CERATTO et al., 2002), e mais recentemente por PCR em tempo real (VERGANI
et al., 2007; WERNER et al., 2008). Esta última abordagem, PCR quantitativo, tem sido
sugerida como um método mais sensível para a análise da MT. Neste trabalho pôde-se constatar o
uso de qPCR como uma boa ferramenta nos estudos do gene da MT, chegando a resultados com
significância estatística.
Ao se comparar as metalotioneínas de diferentes organismos, percebe-se uma alta
conservação evolutiva, sobretudo no seu conteúdo de cisteína (HAQ et al., 2003). Os resultados
deste trabalho vieram reafirmar este fato, onde a utilização de primers que se associam a posições
tão conservadas permitiu analisar as seqüências da metalotioneína de espécies não estudadas
anteriormente. O sucesso da análise da expressão do mRNA da metalotioneína em curimbatá,
especialmente, se deu justamente pela manutenção da estrutura genética dessa molécula. Ao se
analisar as seqüências obtidas em relação às já estudadas (alinhamentos nas figuras 11 e 21)
64
percebe-se que o rico conteúdo do aminoácido cisteína é mantido em diferentes espécies,
mostrando a importância da MT nos processos envolvendo metais, já que esta função lhe é
conferida pela presença das Cys em sua estrutura.
Para a análise da expressão do gene da MT é necessária a utilização de um primer
adaptador (CHAN, 1994; SCUDIERO et al., 1997; SCHLENK et al., 1997). Para se expressar o
mRNA desta molécula é preciso a utilização de um adaptador poli-T para a produção do cDNA,
do qual se pretende analisar o gene da MT. Também para a amplificação é necessária a utilização
do adaptador (sem a cauda poli-T) e mais o primer Forward, desenhado para se ligar a
extremidade N-terminal da MT, que é um domínio conservado em MTs de peixes (CHAN, 1994).
A utilização dos primers Adaptador poli-T e do Adaptador, foi imprescindível para se conseguir
analisar a expressão da MT neste trabalho.
Seria interessante insistir nos ensaios de clonagem para se completar as seqüências aqui
obtidas. Mas percebemos com os resultados apresentados que o estudo da metalotioneína é
possível para diferentes espécies, utilizando inclusive os mesmos primers. Para estudos de
diferentes isoformas, sobretudo da espécie P. lineatus, seria necessário o desenho de primers
mais específicos. Os estudos com tilápia têm indicado a ocorrência de apenas uma isoforma
(CHAN, 1994; REN et al., 2006)
O uso do cloreto de zinco neste trabalho se deu pelo fato de estar relatado na literatura que
este é o metal que mais aumenta a expressão da metalotionéina, comparado ao cádmio e ao cobre
(CHAN, 1994; KNAPEN et al., 2007). Acredita-se que isto ocorra justamente porque o próprio
zinco se liga diretamente ao fator de transcrição MTF-1, que induz a expressão da MT por
ligação aos elementos de resposta a metais (MREs), enquanto que a indução por outros metais
dependem de vias indiretas, como o deslocamento do zinco ou por estresse oxidativo (HAQ et al.,
65
2003; BOURDINEAUD et al., 2006). Mesmo sendo o zinco um metal essencial, a maioria dos
organismos vivos só precisa de doses relativamente baixas para seu funcionamento normal.
Quando em excesso o zinco, bem como o cobre, torna-se tóxico e perigoso para o organismo
(ROCHA et al., 1985).
Diferentes estudos mostram a metalotioneína mais expressa quando na presença de metais
(LINDE et al., 2001; KNAPEN et al., 2007; SCHMITT et al., 2007). Os resultados aqui
apresentados confirmam esse aumento da expressão. A utilização da técnica de PCR em tempo
real se mostra sensível e eficiente para esse tipo de estudo. Mesmo com número pequeno de
amostras para as duas espécies, sendo ainda menor para tilápia, foi possível constatar diferença
estatisticamente significante entre os grupos controles e tratados com metais. Além disso, como
ambos os grupos de estudo, C e T, das duas espécies estudadas, foram submetidos ao estresse
durante o desenvolvimento dos experimentos, deve-se considerar alguma contribuição do estresse
para a expressão da MT, tanto para controles como para os tratados. Apesar de os peixes
apresentarem um tamanho semelhante, alguns eram um pouco maiores e a manipulação era mais
difícil, causando um estresse ainda maior. Sabe-se que o gene da MT conta com uma seqüência
responsiva a glicocorticóides e, portanto, sua indução também é responsiva ao estresse, que
aumenta o nível de hormônio no organismo (VERGANI et al., 2007). Isso pode justificar os
valores extremos de expressão da MT de alguns animais quando comparados aos animais do
mesmo grupo.
A maioria dos estudos realizados em peixes para avaliação da expressão do gene da MT
tem sido restrita a estudos laboratorias, em que espécies são artificialmente expostas a metais, no
intuito de reproduzir o que ocorre no meio natural. Para estudos em populações naturais é preciso
levar em consideração outros fatores como a temperatura da água, idade, sexo e variações
66
sazonais, que podem influenciar a expressão da metalotioneína (WERNER et al., 2008). Por isso,
um número bastante limitado de pesquisas efetivamente determina os níveis da MT em
populações naturais expostas a metais (KNAPEN et al., 2007).
Assim, percebe-se a importância de se realizar estudos laboratoriais minunciosos para,
cada vez mais, precisar a influência dos metais nos níveis de expressão gênica da metalotioneína
em diferentes organismos, de forma a possibilitar estudos mais eficientes em populações de
ambientes naturais.
67
6. CONCLUSÕES
Com os dados obtidos neste trabalho podemos concluir que:
A metalotioneína mantem sua estrutura gênica conservada o suficiente para que
estudos com diferentes espécies possam ser feitos usando como base seqüências já conhecidas de
outras espécies.
O seqüenciamento do gene da MT de curimbatá possibilita que esta espécie seja
estudada no biomonitoramento de ambientes aquáticos, pela análise da expressão de sua MT por
metais.
Frente a exposição a metais, em particular o zinco, a expressão gênica da
metalotioneína está aumentada, com significante diferença estatística, quando em comparação à
animais que não tiveram contato com metais.
A qPCR pode ser utilizada como método rápido e confiável para a determinação
de MT como biomarcador da contaminação de peixes por metais.
68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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73
APÊNDICE 1
NOMENCLATURA DOS AMINOÁCIDOS
Nome Símbolo de 3 Letras Símbolo de 1 Letra Estrutura
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Ácido Aspártico Asp D
Ácido Glutâmico Glu E
Cisteína Cys C
Feninalanina Phe F
Glicina Gly G
Glutamina Gln Q
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
74
Lisina Lys K
Metionina Met M
Prolina Pro P
Serina Ser S
Tirosina Tyr Y
Treonina Thr T
Triptofano Trp W
Valina Val V
75
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