( PDF ) Análise da distribuição de proteínas de adesão e de matriz extracelular no músculo esquelético de peixezebra (Danio rerio) adulto

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

LAISE MONTEIRO CAMPOS

“Análise da distribuição de proteínas de adesão e de

matriz extracelular no músculo esquelético de peixe-

zebra (Danio rerio) adulto”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de

Janeiro como parte dos requisitos para obtenção do

Título de Mestre na área de Ciências Morfológicas –

Programa de mestrado fora da sede.

Orientador: Prof. Manoel Luís Costa

Co-orientador: Prof. Marcos André Vannier dos Santos

Colaboradora: Profa. Cláudia dos Santos Mermelstein

Rio de Janeiro

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Campos,Laise M.

“Análise da distribuição de proteínas de adesão e matriz extracelular no

músculo esquelético de peixe-zebra (Danio rerio) adulto”

Rio de Janeiro, UFRJ, ICB, 2007.

xvii, 101 p.

Dissertação de Mestrado em Ciências Morfológicas

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Ciências Biomédicas

1- músculo esquelético; 2- citoesqueleto 3- proteínas de adesão 4- matriz extracelular; 5-peixe-

zebra (Danio rerio).

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iii

FOLHA DE APROVAÇÃO

CAMPOS LAISE, M. “Análise da distribuição de proteínas de adesão e

matriz extracelular no músculo esquelético de peixe-zebra (Danio rerio)

adulto”.

[Dissertação de Mestrado submetida ao programa de Pós-graduação em Ciêncais Morfológicas do

Instituto de Ciências Biomédicas do Centro de Ciências da Saúde, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do grau de mestre]. Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro,

2007.

Laise Monteiro Campos

Banca Examinadora:

__________________________________ Orientador

Prof. Manoel Luis Costa (Instituto de Ciências Biomédicas- UFRJ)

__________________________________ - Co-orientador

Prof. Marcos André Vannier-Santos (FIOCRUZ- Bahia)

_________________________________ - Colaborador

Prof. Cláudia dos Santos Mermelstein (Instituto de Ciências Biomédicas- UFRJ)

_______________

- Suplente interno e revisor

Prof. Leonardo Rodrigues Andrade (Instituto de Ciências Biomédicas- UFRJ)

_______________

- Suplente externo

Prof. Vítor Fortuna (Instituto de Ciências Biomédicas- UFRJ)

__________________________________ - Examinador

Prof. Radovan Borojevic (Instituto de Ciências Biomédicas- UFRJ)

____

- Examinador

Prof. Jamary Oliveira Filho (Instituto de Ciências da Saúde- UFBA)

___________________________________ - Examinadora

Prof. Sílvia Lima Costa (Instituto de Ciências da Saúde- UFBA)

Rio de Janeiro

2007

DEDICATÓRIA

A Deus por me proporcionar mais uma oportunidade de reconhecer seu

amor incondicional por mim. Passando por altos montes ou profundos

vales a sua destra sempre esteve a me guiar e sustentar.

Aos meus maravilhosos pais, José e Lena Célia, exemplos de amor,

incentivo e vitória.

As meus amados irmãos, Taise e Marcos.

AGRADECIMENTOS

• A Deus por acrescentar sentido ao meu viver;

• Ao professor Manoel Luís Costa pela sua grande presteza e paciência

na orientação deste trabalho, mesmo diante de muitas dificuldades como

a distância. Por todo conhecimento plantado e gerado em mim;

• A professora Cláudia Mermelstein pela excelente colaboração durante a

elaboração deste trabalho e por sempre encher meu coração de alegria

pelo simples fato da sua presença;

• Ao Prof. Marcos André Vannier pela boa acolhida e auxílio desde os

primeiros passos dentro do laboratório. Por compartilhar o seu extenso

conhecimento científico;

• Ao Prof. Leonardo Rodrigues de Andrade por gentilmente ter aceitado

revisar este trabalho e também pelas palavras de incentivo e conforto.

• Aos Profs. Radovan Borojevic, Vivaldo Mora Neto, Fabiana Paim -

idealizadores e efetivadores do Programa de Mestrado Interinstitucional,

pelas palavras de esperança;

• Ao profs. Luiz Eurico Nasciutti, Ana Maria Blanco Martinez, Lenira

Moura, Silvana Allodi, Cristina Maeda Takiya, Maria Isabel Doria Rossi,

Maria Eugênia Leite Duarte, Marcos Farina de Souza, José Garcia

Abreu, Helena Marcolla Araujo, Morgana Castelo Branco, Fani Mercante

– como corpo docente, compartilhando o saber e incentivando às novas

descobertas;

• Aos colegas do laboratório de diferenciação muscular, Débora, Eliane,

Fernanda, Roberta, Carolina, Adriana, Pedro, Nathália e Joseph que,

independente do tempo de convivência, sempre trouxeram alegria e

muito incentivo;

• Ao amigo Ricardo Noboro por toda ajuda concedida e, principalmente,

por seu exemplo de nobreza;

• Aos funcionários Ludmila, Lenna, Jorge, Carlos, Mair, Tânia, Rosângela

e Silvania, pela presteza em atender;

• Aos colegas do laboratório de Microscopia Eletrônica (FIOCRUZ),

Adriana, Eli, Rafael, Diego, Vanessa, Carla Graziela, Cristiane, Cíntia,

Bete, Mara, Abraão Baptista e, especialmente, Cláudio Pereira Ferreira

pelo importante acompanhamento dentro do laboratório transmitindo sua

valiosa experiência.

• Aos colegas de trabalho Caroline Dieder, Viviane Landulfho, Cristiane

Malheiros, Gabriel Ribeiro, Maria Catarina Silva, Francine Soares,

Adriana Campos, Nelzair Vianna e, especialmente, Erasmo de Almeida

Jr que desde o início sempre me incentivou e acreditou muito em meu

trabalho.

• A amiga, uma verdadeira irmã, Eliana Câmara que é um exemplo de

sinceridade, solidariedade, muita garra e vitórias constantes. Não há

palavras para agradecê-la por estes dez anos de grandes experiências

vividas a cada dia.

• Aos preciosos amigos da ICM, verdadeiros irmãos pelos quais agradeço

muito a Deus por conhecer e conviver, especialmente Bia, tia Luci e

Dhudy.

vii

• A meus pais e meus irmãos por todo amor vivenciado a cada momento,

além do estímulo a sempre lutar pelos meus ideais.

• Aos meus cunhados Dai e Val pelo carinho e cuidado dispensados a

mim.

• Às famílias Monteiro e Campos que apesar da distância estão sempre

na lembrança e no coração.

• À família Câmara Pereira pelo incentivo constante, especialmente

Adilton Pio pelos sábios conselhos.

• A todos aqueles que não foram mencionados, mas que ajudaram de

algum modo na elaboração deste trabalho.

viii

Este trabalho foi realizado sob orientação do Prof. Manoel Luís Costa

(UFRJ-ICB), co-orientação do Prof. Marcos André Vannier (FIOCRUZ-Ba) e

colaboração da Profa. Claudia dos Santos Mermelstein (UFRJ-ICB) no

período de março de 2005 a julho de 2007. No decorrer do trabalho,

contamos com intercâmbio interinstitucional entre a Universidade Federal

da Bahia, Universidade Federal do Rio de Janeiro e o Centro de Pesquisas

Gonçalo Muniz - Fundação Oswaldo Cruz, na vigência de auxílios

concedidos pela UFRJ e da UFBA – Programa MINTER. Participaram da

execução desta dissertação os seguintes laboratórios:

• Laboratório de Diferenciação Muscular e Citoesqueleto, ICB, (UFRJ)

• Laboratório de Microscopia Eletrônica da FIOCRUZ – Bahia

• Laboratório de Biomineralização, ICB, UFRJ

• Laboratório de Neuro-histologia e Ultraestrutura, ICB, UFRJ

• Laboratório de Neuroplastiidade, ICB, UFRJ

• Laboratório de Patologia Celular, ICB, UFRJ

• Laboratório Dra. Hertha Meyer de Ultraestrutura Celular, IBCCF, UFRJ

• Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular do Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho, UFRJ

RESUMO

A montagem de uma estrutura especializada como o músculo depende

de uma sequencia muito particular de eventos, que envolvem moléculas

sinalizadoras e estruturais, tanto do citoesqueleto quanto da matriz extracelular.

O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo vertebrado muito utilizado em estudos

de biologia do desenvolvimento, com embriões, por apresentar um rápido

desenvolvimento, além de ser transparente. Porém poucos são os estudos do

aparato contrátil de peixe-zebra adulto. Este trabalho analisou a estrutura geral

do músculo esquelético deste animal adulto. Um relevante problema

encontrado foi a autofluorescência do tecido que é comum em músculo, sendo

resolvido pelo tratamento por cloreto de amônio. Pela microscopia de

imunofluorescência foi analisada a distribuição de proteínas de adesão célula-

célula como caderina e β-catenina, de adesão célula -matriz, como a alfa-

actinina, a paxilina, a vinculina e também o filamento intermediário desmina,

assim como proteínas de matriz-extracelular como a laminina, a fibronectina e

o colágeno. Por meio da microscopia eletrônica de transmissão foi possível

estudar, especialmente, o septo de tecido conjuntivo presente no tecido

muscular do peixe-zebra, assim como fibroblastos associados a este. Por fim

foi proposto um modelo onde é possível localizar todas as proteínas estudadas,

as quais estão associadas às miofibrilas, localizadas no sarcolema, em

costâmeros, na junção miotendinosa e no septo.

ABSTRACT

The assembly of a specialized structure like muscle is based on a

particular events sequence involving signaling and structural molecules, present

in the cytoskeleton and extracellular matrix. The zebrafish (Danio rerio) is an

interesting vertebrate model in developmental biology research with embryos

because it has a fast development and it is transparent. However, there are few

studies of the contractile structures in adult zebrafish. This research has

focused on the analysis of adult zebrafish skeletal muscle. An important

problem was the autofluorescence in muscle tissue, but it has been corrected

by ammonium chloride. The distribution of cell-cell adhesion proteins like

cadherin and β-catenin; proteins of cell-matrix adhesion, like alpha-actinin,

paxillin, vinculin, the intermediate filament protein, desmin and matrix proteins

like laminin, fibronectin and collagen was analyzed by immunofluorescence

microscopy. The connective tissue septum as well as associated fibroblasts

was studied by transmission electron microscopy. Finally, a model was

proposed where it is possible to locate all the studied proteins associated with

myofibrils, in the sarcolemma, in costameres, in the myotendinous junction and

in the septum.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

Actina F – actina filamentosa

Actina G – actina globular

ATP – adenosina trifosfato

²+

– íons cálcio

caderinas N (neuronal), P (placentária) e E (endotelial).

CAMs – cellular adhesion molecules

- álcool metílico

DABCO – 1,4-diazabiciclo-2-(2.2.2)octano

DAPI – 4’,6’-diamidino-2-fenilindole dihidrocloreto

DIC - contraste interferencial diferencial

FAK – proteína cinase de adesão focal

FGF – fator de crescimento de fibroblastos

FITC – isotiocianato de fluoresceína

GFAP - proteína ácida fibrilar glial

GTP – guanosina trifosfato

hpf - horas pós-fertilização

ICAMs – molécula de adesão intercelular

IF - filamentos intermediários

IgG – imunoglobulina G

_ íon potássio

kDa – quilodaltons

MAdCAM-1 – molécula de endereçamento celular em mucosa

MAP’s – proteínas associadas a microtúbulos

MEF-2 - fator estimulatório miocítico tipo 2

MET – microscopia eletrônica de transmissão

²+

– íons Magnésio

Mgn – miogenina

MIBP – muscle integrin binding protein

MO – microscopia óptica

MRFs – fatores regulatórios miogênicos

NaCl – cloreto de sódio

NADH – dinucleotídeo nicotinamida adenina hidrogenase

NADPH – NADP reduzido

NaH

– fosfato dibásico de sódio

NaHPO

– fosfato monobásico de sódio

NaOH – hidróxido de sódio

N-CAM – molécula de adesão neuronal

xii

Cl - representação molecular de cloreto de amônio

nm - nanômetro

OCT – meio de inclusão para congelamento

PBS – tampão fosfato com salina

PECAM-1 – molécula de adesão celular de revestimento endotelial

PFA - paraformaldeído

pH – potencial hidrogeniônico

RNA – ácido ribonucleico

SBF – soro fetal bovino

selectina E – selectina endotelial

selectina L – selectina leucócitária

selectina P – selectina plaquetária

SFLS – estruturas semelhantes a fibras de stress

Shh – sonic hedgehog

TCF/LEF-1 – T cell factor / Lymphoid enhancing factor

TGF-beta – fator de crescimento tumoral

TGFR – receptor do fator de crescimento tumoral

TnC – troponina ligada ao cálcio

TnI - troponina inibidora

TnT – troponina que se liga à tropomiosina

TRICT – isotiocianato de tetraetilrodamina

Triton X-100 – t-octilfenoxipolietoxietanol

UV – ultravioleta

VCAM-1 – molécula de adesão celular vascular

Wnt – família de genes de vertebrados homólogos ao fator de crescimento Wingless de

Drosophila

xiii

Lista de Figuras

Figura 1 – Constituintes do citoesqueleto 02

Figura 2 – Esquema do sarcômero 10

Figura 3 – Moléculas de adesão 14

Figura 4 – Estrutura do contato focal 18

Figura 5 – Componentes do tecido conjuntivo_____ 23

Figura 6 – Peixe-zebra (Danio rerio) adulto 25

Figura 7 - Cortes congelados do tecido muscular de peixe-zebra corados com

hematoxilina e eosina 41

Figura 8 - Peridocidade no tecido muscular do peixe-zebra por azul de

toluidina___________________________________________________41

Figura 9 - Coloração de colágeno por picrossirius 42

Figura 10 - Controle de autofluorescência com PBS 47

Figura 11 – Controle de autofluorescência com Bórax 47

Figura 12 – Controle de autofluorescência com cloreto de amônio 48

Figura 13 – Controle de anticorpos secundários______________________49

Figura 14 – Galeria de imagens de tecido sem marcação de anticorpo

Primário 50

Figura 15 – Imagem gerada a partir da galeria apresentada na Figura 14 50

Figura 16 – Galeria de imagens de tecido com marcação de anticorpo primário

e com secundário FITC

Figura 17 – Imagem gerada a partir da galeria apresentada na Figura 16

Figura 18 – Galeria de imagens de tecido com marcação de anticorpo primário

e com secundário TRITC 52

Figura 19 – Imagem gerada a partir da galeria apresentada na Figura 18 52

Figura 20 – Gráficos superpostos obtidos de cada galeria de imagem 53

Figura 21 – Imunofluorescência com anticorpo anti-caderina 57

Figura 22 – Imunofluorescência com anticorpo anti beta-catenina 58

Figura 23 - Imunofluorescência com anticorpo anti alfa-actinina (1) 59

Figura 24 - Imunofluorescência com anticorpo anti alfa-actinina (2) 60

Figura 25 – Imunofluorescência com anticorpo anti-paxilina

Figura 26 –- Imunofluorescência com anticorpo anti-vinculina (1)

Figura 27 – Imunofluorescência com anticorpo anti-vinculina (2) 63

xiv

Figura 28 - Imunofluorescência com anticorpo anti-desmina 64

Figura 29 – Imunofluorescência com anticorpo anti-laminina 66

Figura 30 – Imunofluorescência com anticorpo anti-fibronectina_________67

Figura 31 –Visualização de colágeno por luz polarizada 68

Figura 32 – Estrutura geral da fibra muscular esquelética por microscopia

eletrônica de transmissão ____________________________ 70

Figura 33 – Micrografia eletrônica de corte ultrafino do músculo com presença

de fibroblasto 71

Figura 34– Identificação de colágeno por MET 71

Figura 35 - Prosposta de modelo de proteína de adesão no tecido muscular do

peixe-zebra adulto____________________________________ 72

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Características das fibras musculares____________________09

Tabela 2 – Anticorpos primários ____ 28

Tabela 3 - Anticorpos secundários 29

Tabela 4 - Sondas fluorescentes 29

Tabela 5 - Filtros de fluorescência______ 37

Tabela 6 – Distribuição das proteínas de adesão e matriz extracelular no peixe-

zebra adulto em diferentes estruturas do músculo__________

xvi

Sumário

Resumo viii

Abstract ix

Lista de Abreviações x

Lista de Figuras xii

Lista de Tabelas xiv

I - Introdução ___ ____ 1

1. Organização geral do citoesqueleto no músculo 1

2. Tecido muscular ____

3. Ligações entre o citoesqueleto muscular e o sarcolema_____________ 10

4. Miogênese_______________________________________________

5. Adesão celular__________________________________ 14

5.1. Adesão célula-célula_______________________________________ 14

5.2. Adesão célula-matriz_______________________________________ 17

6. Matriz extracelular 21

7. O peixe-zebra como modelo __________________________________ 24

8. Septo no peixe-zebra _________ __________ ____ 25

9. Justificativa _______________________________________________ 26

II – Objetivos _____ 27

1.Objetivo geral __________ 27

2.Objetivos específicos __________ 27

III - Materiais e Métodos _____ _____

1. Reagentes_________________________________________________ 28

2. Anticorpos_________________________________________________ 28

3. Manutenção dos peixes_______________________________________29

4. Preparo do material biológico para colorações e imunofluorescência____

5. Colorações_________________________________________________31

5.1 Coloração por Hematoxilina e eosina____________________________31

5.2. Coloração por Azul de Toluidina_______________________________ 32

5.3. Coloração para colágeno (picrosírius)__________________________

6. Controles para autofluorescência e bloqueio_______________________33

7. Imunofluorescência __________________________________________34

8. Preparo do material para microscopia eletrônica de transmissão (MET)__35

xvii

9. Microscopia e aquisição de imagens____________________________37

9.1. Aquisição de imagens em microscopia de fluorescência___________37

9.2. Aquisição de imagens em microscopia de campo claro____________38

9.3. Aquisição de imagens em microscopia confocal__________________38

9.4. Aquisição de imagens em microscopia eletrônica_________________38

IV - Resultados 40

V - Discussão 73

VI - Conclusões 87

VII - Perspectivas 88

VIII – Bibliografia_

I. INTRODUÇÃO

1. ORGANIZAÇÃO GERAL DO CITOESQUELETO NO MÚSCULO

O citoesqueleto é formado por três sistemas de filamentos protéicos,

classificados pelos tipos de proteína e diâmetro. Cada tipo de filamento é

formado por subunidades de diferentes proteínas: actina nos microfilamentos,

tubulina nos microtúbulos e uma família de proteínas fibrosas, nos filamentos

intermediários. Actina e tubulina são proteínas ubíquas e conservadas

evolutivamente.

Microtúbulos consistem de uma rede altamente polarizada com proteínas

associadas (MAP’s) e proteínas motoras, como dineína e cinesina. Os

microtúbulos são cilindros longos e ocos com diâmetro externo de 25 nm

(Figura 1). Sua proteína constituinte, tubulina, existe em duas isoformas

principais alfa e beta ambas com 55 kDa, que se dividem em diferentes

variantes nos vários tipos celulares (Dutcher, 2001), e são finalizadas por

modificações pós-traducionais. Essas isoformas se subdividem em pelo menos

seis formas de α-tubulina e um número similar de formas de β-tubulina, cada

uma codificada por um gene diferente (Alberts, 2004).

Os microtúbulos são formados através da polimerização da tubulina

realizada de modo reversível, processando ciclos contínuos de arranjo e

desorganização como resultado da hidrólise do GTP que é seguida pela

polimerização da tubulina (Cooper, 2001). Participam de várias funções

celulares como divisão, secreção e transporte de vesículas.

No músculo estriado, os microtúbulos estão envolvidos na diferenciação,

morfologia e atividade contrátil destas células. São ainda essenciais no

elongamento dos mioblastos (McElhinny et al., 2004).

Microfilamentos formam polímeros em hélice dupla com diâmetro de 5-7

nm compostos de actina (43kDa), que nos eucariotos mais acima na escala

evolutiva, apresentam seis isoformas, que por sua vez se dividem em três

classes dependendo do seu ponto isoelétrico. Alfa-actinas estão presentes nas

células musculares enquanto as células não musculares possuem as isoformas

beta e gama. Os filamentos são formados pela polimerização de G-actina, que

passa a F-actina, dependendo da concentração de K+ e Mg+, da presença de

ATP e, principalmente, de várias proteínas associadas (Cooper, 2001).

A miosina está diretamente relacionada à actina por funcionar como uma

proteína motora, a qual usa a energia resultante da hidrólise do ATP, gerando

força e movimento. A contração muscular é o resultado do deslizamento entre

Figura 1- Constituintes do citoesqueleto. fai.unne.edu.ar/biologia/ celulamit/cytoskel.htm. 2004.

Subunidade fibrosa

Filamento intermediário

a actina e a miosina, sendo que é a hidrólise do ATP que fornece energia para

os repetidos ciclos de interação entre estas proteínas, gerando alterações

conformativas que resultam em movimento da cabeça da miosina ao longo do

filamento de actina (Cooper, 2001). A actina participa de diferentes funções

celulares, como citocinese, secreção e contração muscular (Small et al., 1999).

O citoesqueleto nas células musculares se dispõe de maneira a permitir

a organização de uma miofibrila funcional. Recentemente, foi identificado um

sistema composto por moléculas de titina, maior proteína já identificada em

vertebrados, e um quarto sistema formado por moléculas da proteína nebulina

que se associa ao longo dos filamentos de actina (Clark et al., 2002). A função

destes dois últimos sistemas é de servir como “molde molecular” para a ligação

de outras proteínas típicas de células musculares durante a embriogênese,

além de fornecer apoio e resistência ajudando a manter a integridade estrutural

do músculo durante a contração (Centner et al.,2000).

Os filamentos intermediários são constituídos pela associação lateral de

várias proteínas alongadas, com um diâmetro final de aproximadamente 8 – 12

nm (Figura 1). Eles formam redes que se irradiam do núcleo e vão até a

periferia das células (Herrmann, 2000). Ao contrário dos microfilamentos e

microtúbulos que são muito instáveis, os filamentos intermediários são

estáveis, e sua polimerização e despolimerização são reguladas por cinases

específicas. A principal função atribuída aos filamentos intermediários é de

manter a estrutura mecânica da célula e do tecido, por sua característica

estrutural estável. Eles são compostos por uma família de proteínas,

classificadas em cinco tipos principais, de acordo com sua composição,

estrutura gênica e evolução:

• tipo I e II: queratinas (40-47 kDa), expressas em células epiteliais,

divididas em ácidas (tipo I) e básicas (tipo II);

• tipo III: vimentina (54 kDa), em células de origem mesenquimal, e é

expressa em células em desenvolvimento, GFAP (proteína ácida fibrilar

glial, 55 kDa), em células gliais, desmina (55 kDa) em células

musculares; nestina (50 kDA) no sistema nervoso central e precursores

de músculos; periferina em neurônios;

• tipo IV: proteínas dos neurofilamentos (60-130 kDa), presentes em forma

de tripletes (NF-L, NF-M e NF-H) nos neurônios;

• tipo V: laminas (65-75 kDa) que formam a lâmina nuclear, que mantém o

núcleo das células durante a intérfase, presentes em todos os tipos de

células.

A desmina é uma proteína dos filamentos intermediários exclusiva de

tecido muscular. É expressa desde os estágios iniciais da miogênese onde

inicialmente se apresenta como grandes filamentos em mioblastos, mas se

modifica de maneira mais difusa à medida que a célula amadurece. Após a

estriação das miofibrilas, em células esqueléticas maduras (miotubos), a

desmina se associa às linhas Z nos sarcômeros, as mitocôndrias, aos núcleos

e ao sarcolema (Costa et al., 2003). Em embriões a desmina se acumula ao

redor do septo entre miofibrilas (Cary,1994). Em músculo maduro, além de

estar presente na linha Z, a desmina integra as miofibrilas com o sarcolema,

núcleo, mitocôndria e, possivelmente, microtúbulos (revisado por Clark et al.,

2002).

2. TECIDO MUSCULAR

O tecido muscular presente em vertebrados é de origem mesodérmica,

sendo caracterizado pela propriedade de contração e distensão de suas

células, o que determina a movimentação corpórea e das vísceras. Há

basicamente três tipos de tecido muscular: liso, estriado esquelético e estriado

cardíaco. O músculo liso, diferentemente dos outros tipos, não apresenta

estriações. Suas células têm formato fusiforme, são mononucleadas e com

núcleo centralizado. Não apresenta contração voluntária, sendo inervado pelo

sistema nervoso autônomo. Constitui a parede da maioria dos vasos, vísceras,

sendo presente também na derme e olhos (Moore & Dalley, 2001).

O músculo estriado cardíaco é formado por células que apresentam

estriações e são alongadas, denominadas cardiomiócitos, os quais podem ser

mononucleadas ou binucleadas e com o núcleo central. Unem-se às células

vizinhas através dos discos intercalares onde são encontradas três

especializações juncionais: as junções do tipo GAP ou comunicantes que se

situam nas partes laterais dos discos e são responsáveis pela continuidade da

passagem iônica entre células musculares vizinhas; a zônula de adesão que

serve para ancorar os filamentos de actina dos sarcômeros terminais às

membranas e os desmossomos que unem as células musculares impedindo

que elas se separem sob a vigorosa atividade contrátil do coração. Cada célula

muscular cardíaca apresenta estriações semelhantes a do músculo estriado

esquelético, possuindo a mesma organização sarcomérica, sendo que, em

suas extremidades estão presentes estriações transversais denominadas

discos intercalares. Nesta célula, as mitocôndrias são grandes, numerosas e

intercaladas entre os conjuntos de miofilamentos, e o retículo sarcoplasmático

não é tão abundante (Williams et al., 1995).

O músculo estriado esquelético da mesma maneira que o estriado

cardíaco, apresenta estriações transversais facilmente visíveis ao microscópio

de luz. É formado por feixes de células cilíndricas longas chamadas de fibras

musculares ou miotubos. Uma fibra muscular ordinária típica mede

aproximadamente 2,5 cm de comprimento e sua largura é menor que um

décimo de milímetro. As células musculares estriadas possuem inúmeros

núcleos com dimensões em torno de 10 µm, os quais ocupam regiões

periféricas da fibra muscular. As estruturas encontradas na célula muscular

recebem nomenclatura própria, ou seja, cada fibra muscular é envolvida por

uma membrana plasmática conhecida como sarcolema, o retículo

endoplasmático como retículo sarcoplasmático e o citoplasma é chamado de

sarcoplasma, onde existe grande número de mitocôndrias, que se localizam

entre e paralelamente às miofibrilas, o que indica elevada demanda de ATP

formado nestas organelas para que ocorra a contração muscular (Junqueira &

Carneiro, 2004).

Os espessos feixes de fibras musculares são envolvidos por uma

membrana denominada epimísio composto por tecido conjuntivo. Este origina o

perimísio que é uma lâmina que circunda feixes menores. Cada fibra muscular

é envolvida pelo endomísio que é uma camada muito fina constituída pela

lâmina basal da fibra muscular e por fibras reticulares. Esses envoltórios são

importantes para a união das fibras musculares, permitindo a transmissão da

força de contração do músculo a componentes do esqueleto. Vale ressaltar

ainda que cada fibra muscular apresenta perto de seu centro uma terminação

nervosa motora conhecida como placa motora (Junqueira & Carneiro, 2004).

As miofibrilas são formadas por unidades morfofuncionais denominadas

sarcômeros. Cada sarcômero é limitado por duas linhas Z. As bandas claras

denominadas bandas I por serem isotrópicas à luz polarizada, são compostas

por microfilamentos de actina, juntamente com troponina e tropomiosina. Cada

um contém dois filamentos de actina F ancorados na linha Z. A tropomiosina é

uma cadeia polipeptídica longa que se localiza nos sulcos da dupla hélice de

actina a cada intervalo de sete monômeros de actina G. A troponina é um

complexo de três proteínas globulares: a troponina T(TnT), de 38 kDa, une

cada complexo a um sítio específico na molécula de tropomiosina, a troponina

C (TnC), de 18 kDa se liga a íons cálcio e a troponina I (TnI), de 20 kDa, inibe a

interação entre filamentos delgados e espessos. Estas três últimas são

proteínas que mediam a regulação da contração por meio dos íons Ca

(Clark

et al., 2002). Outras proteínas também estão presentes na banda I: a nebulina

(500 kDa) que se estende desde a linha Z até a extremidade “menos” da

actina, servindo como um regulador no comprimento da actina; as

extremidades “menos” dos filamentos de actina são cobertas pela

tropomodulina (4 kDa) e a extremidade “mais” pela proteína CapZ, que é um

heterodímero contendo duas subunidades, α de 36 kDa e β de 32 kDa (Clark et

al., 2002).

A banda A é escura, anisotrópica à luz polarizada e corresponde ao

ponto em que os filamentos finos interagem com os grossos constituídos por

miosina II, que tem peso molecular de 470 kDa, a qual apresenta duas cadeias

pesadas 200 kDa (cada uma formada por uma cauda em forma de bastão e

uma cabeça globosa), além de quatro cadeias leves cujos pesos moleculares

variam de 15 a 27 kDa. A porção da cabeça da cadeia pesada tem um sítio de

ligação para o ATP e um sítio de ligação para actina, ambos necessários para

o processo de contração. A titina (2700 kDa) distribui-se da linha M até a linha

Z e interage com a miosina permitindo o alinhamento dos filamentos grossos. O

centro de cada banda A é ocupada por uma área pálida conhecida como

Banda H, a qual é dividida por uma delgada Linha M.

Segundo Clark et al. (2002), a linha Z além de definir o bandeamento

lateral do sarcômero é considerada como sendo o primeiro local onde as forças

de contração são geradas. Em miofibrilas adjacentes, eles são alinhados

permitindo contrações coordenadas entre miofibrilas individuais para um ponto

específico onde a linha Z está ligada ao sarcolema.

Numerosos componentes de transdução de sinais estão associados à

linha Z, facilitando seu papel de sensor biomecânico que responde às

mudanças de tensão no sarcolema. Sabe-se ainda que um grande número de

proteínas associadas a essa linha tem uma distribuição dinâmica no músculo e

pode servir de ligação entre a linha Z e outros locais subcelulares, como por

exemplo, o núcleo, para transmitir sinais. Portanto, a linha Z não é

simplesmente a borda estrutural do sarcômero, mas apresenta um papel

importante na sinalização e homeostase muscular (Clark et al., 2002).

Os músculos estriados esqueléticos apresentam tipos distintos de fibras

que podem ser classificadas em brancos ou vermelhos de acordo com a

intensidade de sua coloração. Também exibem fibras com características

intermediárias entre os tipos vermelho e branco. O conteúdo maior de

mioglobina das fibras vermelhas em relação às brancas é o responsável pela

sua coloração. As características estruturais, funcionais e metabólicas das

fibras musculares vermelhas, intermediárias e brancas estão demonstradas na

Tabela 1.

CARACTERÍSTICA VERMELHAS INTERMEDIÁRIAS BRANCAS

Cor

Vermelha Vermelha Branca

Conteúdo em

mioglobina

Alto Alto Baixo

Diâmetro da fibra

Pequeno Pequeno-

Intermediário

Grande

Velocidade de

contração

Lenta Rápida Rápida

Tipo de contração

Tônica Tônica Fásica

Número de

mitocôndrias

Alto Intermediário Baixo

Tamanho

mitocondrial

Grande Intermediário Pequeno

Densidade capilar

Alta Intermediária Baixa

Metabolismo

oxidativo

Abundante Intermediário Escasso

Metabolismo

glicolítico

Escasso Intermediário Abundante

Conteúdo lipídico

Alto Intermediário Baixo

Conteúdo

glicogênico

Baixo Alto Alto

Tabela 1: Características das fibras musculares (Judje et al., 1989).

No peixe-zebra adulto e na maioria dos peixes, as fibras musculares

rápidas e lentas ocupam regiões distintas no corpo do animal. As fibras

musculares rápidas compreendem a porção profunda do miótomo e

compreendem a maior parte da musculatura do tronco. As fibras de contração

lenta estão na extremidade lateral do miosepto horizontal, separando a

musculatura epiaxial e hipoaxial. As fibras musculares do tipo II-A ou

intermediárias estão localizadas entre as fibras de contração rápida e lenta.

Como acontece em outros vertebrados, as fibras de contração lenta são

pequenas e apresentam coloração mais escura por serem mais vascularizadas

e por apresentarem maior quantidade de mitocôndrias, se comparada às fibras

de contração rápida que são maiores e mais pálidas (revisado por Devoto et al.

1996)

Figura 2 - Esquema do sarcômero (Alberts, 2004).

3. LIGAÇÕES ENTRE O CITOESQUELETO MUSCULAR E O SARCOLEMA

Os costâmeros são definidos desde a década de 80 como associações

periódicas das miofibrilas com o sarcolema, importante na transmissão de força

contrátil da linha Z para a membrana basal (Pardo,1983). Alguns acreditam que

associações entre a linha M e o sarcolema sejam também estruturas

costaméricas (Porter et al, 1992; Clark et al., 2002). São estruturas ricas

especialmente em paxilina (Kovacic-Milivojevic et al., 2001), vinculina, talina,

alfa-actinina e integrina, sendo que esta última tem um papel fundamental

como molécula sinalizadora pela ativação de vias intracelulares de transdução

de sinais que levam à mudanças na transcrição genética e reorganização do

citoesqueleto. (Clark et al., 2002). A proteína desmina também está presente

em costâmeros (Tidball, 1992; Costa et al., 2004)

Proteínas da matriz extracelular como laminina-2, colágeno IV e

fibronectina se ligam a integrinas específicas, tendo fundamental importância

no alinhamento dos costâmeros. Baseando-se neste aspecto, pode-se inferir

linha Z

Cap Z

titina

tropomodulina

Linha M

miosina (filamento grosso)

extremidade “mais”

da actina

nebulina

actina (filamento fino)

extremidade “menos”

da actina

linha Z

que os costâmeros transmitem força contrátil lateralmente da miofibrila,

passando pelo sarcolema à matriz extracelular, atuando como sensores de

stress mecânico permitindo a manutenção da integridade estrutural da

membrana durante a contração (Lundgren et al.,1988; Clark et al., 2002;

Quatch & Rando, 2006). Sendo assim, os locais de transmissão lateral de força

através do sarcolema devem ser mecanicamente fortificados para minimizar o

estresse imposto à bicamada lipídica.

A junção miotendinosa é classicamente abordada como sendo uma

estrutura juncional de fibras musculares esqueléticas, sendo a única estrutura

que constitui o ponto de terminação da miofibrila. Esta é especialmente

reforçada por ser o local principal de transmissão de força durante a contração.

(Clark et al., 2002). Na terminação da fibra muscular, a membrana é altamente

invaginada e interdigitada com a matriz do tendão adjacente, o que permite o

aumento da área de superfície da junção miotendinosa, bem como a redução

do estresse na membrana (Tidball, 1991). É, portanto um segundo tipo de

estrutura de ligação à membrana, a qual apresenta algumas similaridades

estruturais e funcionais com relação aos costâmeros. Sabe-se que o sistema

de ligação entre o citoesqueleto e a membrana via complexo associado à

distrofina, bem como o complexo de adesão contendo integrinas, talina e

vinculina são encontrados na junção miotendinosa, sugerindo que ambos

complexos participam na conexão de filamentos finos terminais à membrana

muscular (Clark et al., 2002).

4. MIOGÊNESE

A miogênese é o processo caracterizado pela determinação e formação

das células que compõem o tecido muscular. Pode ser subdividida em várias

etapas. A primeira delas é a determinação das células do mesoderma

embrionário, os pré-mioblastos replicantes, os quais se transformam em

populações de mioblastos epiaxiais (dorsais) ou hipoaxiais (ventrais). Os

mioblastos epiaxiais são estimulados tanto por moléculas sinalizadoras que

atuam como mediadores no controle de muitos aspectos do desenvolvimento

conhecidas como Wnt (Wingless), provavelmente Wnt 1 quanto por genes do

tipo Shh (Sonic Hedgehog) que levarão à expressão do Myf5; os hipoaxiais

serão estimulados por uma combinação entre uma outra molécula Wnt

(provavelmente Wnt7a), BMP4 e Noggin que culminarão na expressão do gene

MyoD (Cossu & Borello, 1999). Estes mioblastos migram induzidos pela

expressão dos genes Myf5 e MyoD. A migração se dá através da diminuição

das β-integrinas pelo fato de se ligar a elas uma proteína presente no citosol

denominada MIBP, a qual se liga à integrina, estando presente em músculo. A

migração também é possível pela formação de contatos focais (Li et al., 1999).

A MIBP também pode interagir com a cinase de adesão focal (FAK) e com a

paxilina, promovendo a formação de contatos focais para o movimento de

migração. Esta formação implica também na diminuição das N-caderinas na

superfície celular dos mioblastos. Estes eventos são controlados pela ativação

de fatores regulatórios miogênicos (MRFs). Nos vertebrados, a família de

MRFs inclui MyoD, MyF5, mgn e MRF4, os quais estão envolvidos na

diferenciação muscular (Zang et al., 2005).

Em uma etapa seguinte, os mioblastos se fundem e diferenciam em

miotubos. O processo da fusão envolve proteínas de adesão célula-célula que

mediam o reconhecimento entre mioblastos recém-diferenciados. Uma vez que

tenha ocorrido a diferenciação, as células não se dividem e os núcleos jamais

replicam seu DNA novamente. Nesta fase, algumas proteínas como as N-

caderinas (Redfield et al., 1997), β-catenina (Goichberg et al., 2001) e

integrinas α7A, α7B e β1D estão aumentadas (Musarò & Rosenthal, 1999). Os

miotubos formados são fusiformes e multinucleados No seu sarcoplasma

organizam-se as miofibrilas funcionais, as quais expressam, inicialmente,

proteínas específicas como a desmina, alfa-actinina e titina.

Durante a fusão dos mioblastos, alguns permanecem em estado

quiescente, os quais irão formar, no músculo esquelético maduro, as células

satélites. Esta é uma população de células situada entre o sarcolema da fibra

muscular e sua membrana basal (Goldring et al., 2002). Em resposta a

estímulos como o crescimento, remodelação ou trauma, as células satélites

são ativadas, proliferando-se. As células satélites quiescentes diferem das

ativadas por apresentarem relação de volume núcleo/citoplasma elevada, por

apresentarem poucas organelas, núcleo menor que os da fibra muscular, além

de aumento da heterocromatina nuclear comparada aos núcleos da fibra

muscular (Foschini et al., 2004). Nas células satélites ativadas ocorre redução

da heterocromatina, aumento da relação de volume entre citoplasma/núcleo e

aumento no número de organelas intracelulares (Schultz & McCormick, 1994).

O padrão de expressão gênica das células satélites ainda é pouco

conhecido, tanto no estado de quiescência como no estado ativado. Alguns

marcadores como c-Met, M-caderina, Pax7 e CD34 são importantes para o

reconhecimento das células satélites no tecido muscular (Foschini et al., 2004).

5. ADESÃO CELULAR

Em níveis celulares, as adesões podem ocorrer entre células vizinhas

(adesão célula-célula) ou entre células com a matriz extracelular que a permeia

(adesão célula-matriz).

As interações entre células podem ser do tipo homofílicas, as quais

permitem que moléculas de uma célula se liguem a outras moléculas do

mesmo tipo nas células adjacentes; heterofílicas, onde as moléculas de uma

célula ligam-se às moléculas de um tipo diferente nas células adjacentes; ou

ligações dependentes de ligante, onde receptores de superfície celular nas

células adjacentes são ligados uns aos outros por moléculas ligantes

multivalentes. O processo de adesão é fundamental em vários eventos

celulares como morfogênese, crescimento, organização e estabilização

teciduais, inflamação, resposta do hospedeiro a infecções e injúrias,

cicatrização e resposta imunocelular (Petruzelli et al., 1999). Na figura 3 estão

representados tipos de moléculas de adesão.

Figura 3 - Moléculas de adesão (Petruzelli et al., 1999).

5.1- ADESÃO CÉLULA-CÉLULA

caderinas selectinas

superfamília das

imunoglobulinas

integrinas

A habilidade que as células possuem em aderir umas às outras através

de interações moleculares desempenha um importante papel em vários

processos biológicos, tais como homeostase, resposta imune, inflamação,

embriogênese e desenvolvimento do tecido nervoso (Petruzelli et al., 1999).

Proteínas específicas de superfície celular estão envolvidas em mediar adesão

entre células, tais como as caderinas, membros da família das imunoglobulinas

e selectinas.

As caderinas (135 kDa) são uma família de glicoproteínas cálcio-

dependentes que mediam adesões célula-célula através de um modelo de

ligação homofílica. Sua estrutura básica inclui uma simples cadeia de proteína

que se estende à membrana e apresenta, em seu domínio externo, uma série

de cinco repetições de caderina de, aproximadamente, 100 aminoácidos cada,

os quais constituem sítios de ligação para o cálcio (Gumbiner, 1996; Yap,

1997). Apresentam um domínio extracelular, um segmento transmembranar e

um curto domínio citoplasmático, o qual interage com o citoesqueleto de actina

através de algumas moléculas de ligação. (Humphries & Newham, 1998). As

caderinas clássicas estão entre as primeiras a terem sido identificadas nesta

família e compreendem as caderinas N, P e E (Gumbiner, 1996).

O cálcio é de extrema importância na manutenção da integridade

estrutural da proteína. O domínio N-terminal da caderina media ligação, sendo

que as repetições de caderina atuam mantendo a proteína em uma

conformação necessária que permite a união desta a outra molécula de

caderina (Takeichi, 1995; Yap, 1997). Estudos sugerem que quando há

aumento da quantidade de cálcio nas porções extracelulares das cadeias de

caderina, estas se tornam mais rígidas; se o cálcio é removido a porção

extracelular da proteína é degrada por enzimas proteolíticas (Alberts et al.,

2004).

O domínio citoplasmático da caderina serve como meio de ligação para

o citoesqueleto através de interações com proteínas intracelulares conhecidas

como β cateninas, as quais irão interagir com as α cateninas, que por sua vez

se ligam aos filamentos de actina nas junções aderentes.

A beta-catenina (94 kDa) está envolvida na via de sinalização Wnt, pois

seu domínio extracelular se liga a fatores de transcrição da família TCF/LEF-1

(T cell factor/ Lymphoid enhancing factor), os quais ativam sua atividade

transcricional no núcleo, resultando na expressão de genes importantes na

regulação do destino celular, como a ciclina D1, c-myc, a metaloproteinase 7

(Goichberg, 2001), e a metaloproteinase 26 (Marchenko et al., 2004; Oloumi et

al., 2004).

Outros membros da família das caderinas consideradas caderinas não-

clássicas formam desmossomos e hemidesmossomos, os quais permitem

ligação destas a filamentos intermediários através de interações com uma outra

molécula semelhante à catenina denominada placoglobina. Sabe-se ainda que

as caderinas têm importante papel na manutenção de contatos intracelulares

fortes, semelhantes aos encontrados na zona aderente e nos desmossomos

(Yap, 1997).

As moléculas de adesão que compõem a superfamília das

imunoglobulinas exibem uma grande diversidade morfológica e funcional.

Estruturalmente, estas proteínas apresentam uma ou mais repetições comuns

semelhantes às imunoglobulinas que são caracterizadas por duas cisteínas

separadas por 55 a 75 aminoácidos. Os domínios semelhantes às

imunoglobulinas são expressos no domínio extracelular da proteína.

Geralmente, moléculas desta família atravessam a membrana celular e

apresentam apenas uma curta cauda citoplasmática. Os membros deste grupo

têm um importante papel no desenvolvimento do sistema nervoso, em

respostas imunes e inflamatórias e no desenvolvimento embrionário. (Petruzelli

et al., 1999).

As selectinas são moléculas de adesão que medeiam adesão

carboidrato-dependente de leucócitos para células endoteliais e plaquetas.

Esta família de proteínas possui três membros: selectina L (leucócitária), E

(endotelial) e P (plaquetária) que são todas estruturalmente homólogas.

Recentemente, as selectinas têm sido consideradas alvos terapêuticos

potenciais para o desenvolvimento de agentes antiinflamatórios, o que tem

estimulado o interesse em sua estrutura e função (Humphries, 1998).

5.2- ADESÃO CÉLULA-MATRIZ

As integrinas (130 kDa) são receptores tanto de adesão célula-célula,

quando em associação com as moléculas de adesão celular (CAMs), por

exemplo, quanto de adesão célula-matriz mediada pela ligação do seu domínio

extracelular a diversas proteínas ligantes heterodiméricas formadas por

associações não covalentes de subunidades α e β. Cada subunidade é uma

glicoproteína transmembrana tipo I que tem, relativamente, domínios

extracelulares longos (Hynes, 2002). Estão presentes em todos os

metazoários, sendo que o número de integrinas no genoma geralmente

aumenta de acordo com a complexidade do organismo (Bokel e Brown, 2002;

Hynes, 2002) o que é consistente com o papel central de integrinas na adesão,

migração e organização tecidual. Os mamíferos apresentam cerca de 18 α e 8

β subunidades que se combinam para produzirem 24 heterodímeros diferentes,

sendo que cada um destes pode se ligar a um repertório específico de

moléculas de superfície celular, matriz extracelular, ou proteína ligante solúvel

(Calderwood, 2004).

Unindo-se tanto a ligantes intra quanto extracelulares, as integrinas

promovem uma ligação transmembrana de transmissão bidirecional de força

mecânica e sinais biomecânicos através da membrana plasmática

(Calderwood, 2004).

As interações entre moléculas de matriz, as integrinas e citoesqueleto de

actina são denominadas adesões focais. Estas ligações são indiretas, sendo

portanto mediadas por múltiplas proteínas-âncora intracelulares, tais como a

vinculina, talina, alfa-actinina, paxilina e a cinase de adesão focal. A figura 4

mostra um esquema simplificado de adesão focal, envolvendo alguns de seus

constituintes.

Figura 4: Estrutura do contato focal (Alberts et al., 2004).

α-actinina

paxilina

talina

vinculina

fibronectina

receptor de fibronectina (integrina)

filamento

de actina

proteína

capeadora

A vinculina (116 kDa) é uma proteína que contém sítios de ligação com

múltiplas proteínas do citoesqueleto, tais como actina, α-actinina, talina e a

paxilina. Possui uma cabeça globular com diâmetro de 8 nm e uma cauda em

forma de haste com comprimento de 20 nm. A molécula de vinculina pode

existir tanto em um estado ativo quanto inativo. Neste último, interações

intramoleculares de alta afinidade entre a cabeça e a cauda mascaram a sua

ligação à actina, além de reduzir a afinidade da vinculina à talina. Eventos de

sinalização mediados pela integrina podem ativar a molécula de vinculina,

permitindo que esta se ligue à actina e à talina, por romper a interação entre

sua cabeça e cauda. Existem três isoformas de vinculina, α, β e γ, sendo que

as duas primeiras são as mais encontradas em músculo esquelético (Berthier &

Blaineau, 1997)

A proteína paxilina (68 kDa) também interage com a integrina e está

envolvida em contatos como vinculina e talina, sendo encontrada de outras

formas associada ao citoesqueleto de actina, como nas placas densas de

músculo liso e junção miotendinosa em músculos estriado esquelético (Turner

et al., 1990). Apresenta muitos domínios de interação proteína-proteína: cinco

domínios ricos em leucina (LD) na porção amino-terminal e quatro domínios

LIM, que são dedos de zinco duplos na porção carboxi-terminal. Os domínios

LIM mediam ligação. Se ligam à proteína tirosino-fosfatase denominada PEST.

Já os domínios LD mediam interações com outras proteínas como FAK e

vinculina (Zeid et al., 2006).

A talina é um componente da adesão focal que se liga a outras

moléculas de adesão incluindo β integrinas, vinculina, cinase de adesão focal,

e actina. Justapõe receptores de integrina com a actina. Além do seu papel

estrutural, a talina também tem papel funcional importante em regular a

ativação da integrina (Nayal, 2004). Seu domínio globular apresenta 50 kDa e é

o local principal de ligação à integrina. O restante da proteína possui 220 kDa.

Possui baixa afinidade à integrina, mas apresenta sítios de ligação à vinculina e

actina. (Garcia-Alvarez et al, 2003).

A cinase de adesão focal possui 125 kDa e é uma das principais

proteínas tirosina fosforiladas encontradas nas adesões focais. A ativação da

FAK inicia cascatas de transdução de sinal intracelular, incluindo as que estão

envolvidas em ativação da mitose e remodelação do citoesqueleto (Mitra et al.,

2005). Estes efeitos regulam processos celulares como migração, crescimento

e diferenciação (Schlaepfer et al., 2004). A localização da FAK na adesão focal

é dependente do seu domínio C-terminal denominado FAT (focal adhesion

targeting) (Parsons, 2003). O domínio FAT da FAK interage com proteínas

associadas às integrinas como paxilina e talina. (Schaller, 2001).

A alfa-actinina (110 kDa) possui um domínio globular de associação à

actina e extremidades em forma de bastão (Blanchard, 1989). Está conjugada

à actina ao longo das fibras de stress de células em cultura, nos corpos densos

de células de músculo liso, em placas de adesão, sendo também o maior

componente da linha Z nos sarcômeros de músculo estriado esquelético,

associando-se a complexos juncionais entre o citoesqueleto e o sarcolema

(Flick & Konnieczny, 2000). Também está ligada ao domínio intracelular de

integrinas compondo o complexo de adesão focal (Alberts, 2004). Alguns

autores (Franzini-Armstrong, 1973; Goldstein et al., 1979) afirmaram que a

espessura da linha Z pode variar de ~ 30 nm, em músculo esquelético de

peixe, a ~ 160 nm em músculo cardíaco de vertebrados, sugerindo que a

configuração e/ou número de ligações da alfa-actinina à linha Z pode variar em

tipos musculares diferentes. Sabe-se ainda que a molécula de alfa-actinina

mantém-se bastante conservada evolutivamente, tendo sido identificada em

tecidos de mamíferos, aves e peixes (Blanchard, 1989).

6. MATRIZ EXTRACELULAR

A matriz extracelular (MEC) é uma rede complexa de macromoléculas

que promove informações sobre a posição e condições do meio ambiente

celular, funções estas importantes para o funcionamento tecidual.

Proteínas da MEC tais como a fibronectina, lamininas e colágenos

formam distintas redes protéicas que denotam a variabilidade tecido-específica

em termos de composição e arquitetura (Hay, 1991). As respostas celulares ao

contato com a MEC dependem não só do tipo da mesma, bem como do

repertório de receptores celulares presentes na MEC. As conexões da matriz

através destes receptores determinam não só a organização de estruturas do

citoesqueleto, mas também a ativação de moléculas sinalizadoras principais a

funções tecido-específicas (Schwarzbauer & Sechler, 1999)

O colágeno é a maior proteína fibrosa insolúvel presente na MEC e no

tecido conjuntivo. De fato é a proteína mais abundante no reino animal.

Existem pelo menos 18 tipos conhecidos desta proteína, sendo que cerca de

80-90% no corpo consiste nos tipos I, II e III. Em geral, as moléculas de

colágeno se unem para formar fibrilas finas e longas, diferentemente do

colágeno tipo IV, qual forma uma estrutura reticular bidimensional (Alberts,

2004).

Por um período, se acreditou que todos os colágenos eram secretados

por fibroblastos no tecido conjuntivo, mas hoje é conhecido que várias células

epiteliais sintetizam alguns tipos de colágeno (Lodish et al., 2003).

A laminina e o colágeno IV são elementos estruturais chave da

membrana basal, sendo geralmente acompanhados por entactina/nidogênio,

perlecan, dentre outras glicoproteínas. A laminina possui cerca de 900 kDa e

representa uma família de proteínas, sendo todas estas glicoproteínas

extracelulares heterotriméricas. A laminina-I é considerada a laminina clássica

que contém cadeias polipeptídicas longas conhecidas como α, β e γ, as quais

estão organizadas na forma de cruz assimétrica e unidas por pontes dissulfeto

(Alberts et al., 2004). A laminina α2 faz uma importante ligação do

citoesqueleto a matriz extracelular em células musculares. Isso pode ser

confirmado diante de uma situação em que há uma quebra desta laminina ou

de proteínas que interagem com a mesma gerando uma distrofia muscular

(Cote et al., 1999). A laminina é considerada como a principal proteína da

lâmina basal e acredita-se que ela desempenha um papel importante na

promoção de adesão, migração, proliferação e diferenciação dos mioblastos

(Gu et al., 1994).

A fibronectina (130 kDa) é uma glicoproteína que está presente no

plasma e na matriz extracelular da maioria dos tecidos. Estruturalmente, é um

dímero formado por duas grandes subunidades ligadas por pontes dissulfeto

em uma extremidade (Zhao et al., 2001). Cada subunidade consiste em

módulos de repetição do tipo I, II e III, os quais constituem domínios de

interação da fibronectina com células, outros componentes da matriz ou até

mesmo com outra molécula de fibronectina (Schwarzbauer & Sechler, 1999).

Desempenha um importante papel em vários processos celulares, incluindo

adesão celular, migração, crescimento, diferenciação e formação de coágulo

(Zhao et al., 2001).

A Figura 5 mostra moléculas da matriz extracelular presentes no tecido

conjuntivo.

Figura 5 - Componentes do tecido conjuntivo (Alberts et al., 2004).

Vale ainda ressaltar que os fibroblastos são células do tecido conjuntivo

que têm capacidade de secretar uma matriz extracelular não rígida rica em

colágeno tipo I e/ou tipo III. Podem se diferenciar em outros membros da

família do tecido conjuntivo como por exemplo osteoblastos, adipócitos, célula

muscular lisa e condrócito (Alberts et al. 2004).

O conhecimento acerca dos diferentes tipos de adesão à matriz tem sido

corroborado por observações de moléculas de adesão associada a fibroblastos

através de imagens bidimensionais, a partir de estudos do substrato de células

em cultura, além de reconstrução tridimensional de células “in vivo” por

camada de

células epiteliais

lâmina basal

macrófago

fibroblasto

glicosaminoglicanas,

proteoglicanas e

glicoproteínas

fibra de

colágeno

capilar

fibra elástica

mastócito

____tecido conjuntivo____

microscopia confocal (Cukierman et al., 2001; Grinnel, 2003; Quach & Rando,

2006).

7. O PEIXE-ZEBRA COMO MODELO

Desde o início da década de 80, o modelo do peixe-zebra (Danio rerio),

anteriormente chamado Brachidanio rerio, começou a ser foco de estudos

sistemáticos em biologia do desenvolvimento de vertebrados (Streisinger et al.,

1981).

Este animal é fácil de criar, além de ter uma reprodução rápida dentro de

três meses após fertilização. Um par saudável pode gerar mais de duzentos

embriões por dia. Os embriões têm desenvolvimento rápido, ou seja, a

gastrulação é completa dentro de dez horas após fertilização e o coração

começa a pulsar ao final do primeiro dia de vida do embrião. A maioria dos

órgãos são formados e funcionam dentro dos primeiros cinco dias de vida. Vale

ressaltar que os embriões do peixe-zebra são particularmente adequados para

estudos de biologia celular porque eles se desenvolvem externamente e são

bastante transparentes (Eisen, 1996; Beis & Stainier, 2006).

Este peixe é um modelo de desenvolvimento amplamente utilizado

porque combina características de modelos invertebrados com outros mais

avançados como camundongo (Haffter et al.,1996; Briggs, 2002). Ele vem

assumindo uma liderança no estudo do desenvolvimento devido a sua

combinação única de curso genéticos e embriológicos. Além disso, vem sendo

usado como modelo para o estudo de doenças humanas (Dooley & Zon, 2000).

A figura 6 mostra o peixe-zebra adulto que apresenta cerca de 5

centímetros.

Figura 6: Peixe-zebra (Danio rerio) adulto. Laboratório de Citoesqueleto e

Diferenciação muscular (UFRJ).

8. SEPTO NO PEIXE-ZEBRA

Durante o desenvolvimento normal do plano corporal dos vertebrados,

um aspecto crucial envolvido é a divisão do corpo do animal em segmentos.

Nos vertebrados, a segmentação mesodérmica tem como resultado a formação

dos somitos, os quais irão formar estruturas ósseas tais como costelas e

vértebras, bem como músculos esqueléticos (Henry et al., 2005). A função do

sistema muscular esquelético depende da transmissão de forças ao esqueleto.

As fibras musculares não se ligam aos ossos e cartilagens diretamente, sendo

que nos locais de fixação as estruturas do tecido conjuntivo fibroso, tais como

tendões em tetrápodes e miosepto de peixes, estão sempre presentes ligando

os músculos ao esqueleto, bem como a outros músculos (Kudo et al., 2004).

O sistema músculoesquelético dos peixes é mais simples se comparado

com o de tetrápodes. Os miótomos embrionários do tronco e cauda se

desenvolvem em séries de segmentos musculares dobrados que formam os

sarcômeros em músculos adultos. Os sarcômeros individuais são separados

por tecido conjuntivo denominado “miosepto”, o qual se estende no eixo

vertebral formando bandeamentos intersomitos. Diversas proteínas estão

presentes no miosepto, tais como: as proteínas da matriz extracelular como

laminina, colágeno tipo I e tenascina (Parsons et al., 2002A) constituintes do

complexo de proteínas associadas à distrofina, agindo como sistema de

ancoramento entre miofibrilas com a matriz extracelular (Campbel, 1995); e a

proteína cinase de adesão focal, bem como sua forma fosforilada que serve

como um transdutor de sinal do citoplasma à matriz por intermédio de integrina

(Henry et al, 2001), fato semelhante ao que acontece na junção miotendinosa

em mamíferos (Mayer et al., 1997). Em 2004, Kudo e colaboradores

comprovaram que periostina é a primeira molécula envolvida na formação do

septo muscular do peixe-zebra e propuseram que a secreção desta proteína na

superfície do miosepto é importante para a adesão da fibra muscular a ele,

bem como para a diferenciação da célula muscular.

9. JUSTIFICATIVA

Este trabalho tem particular importância para o conhecimento da

localização de proteínas de adesão e matriz extracelular até então nunca

caracterizadas no músculo esquelético do peixe-zebra adulto. Isso é

fundamental para o entendimento de como é composto o aparato contrátil

deste animal, bem como para conhecer diferenças e/ou semelhanças na

distribuição destas proteínas através de comparações feitas com o embrião do

próprio peixe-zebra e até mesmo com outros modelos de estudo.

II. OBJETIVOS

1. OBJETIVO GERAL:

• Estudar a expressão e distribuição de proteínas de adesão e matriz

extracelular associadas às fibras musculares esqueléticas do peixe-

zebra adulto (Danio rerio), importantes no funcionamento do aparato

contrátil do animal.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Observar histologicamente a organização geral da fibra muscular

esquelética do peixe-zebra.

• Caracterizar no peixe-zebra proteínas de adesão célula-célula,

estudando a distribuição tanto da caderina quanto da β-catenina.

• Caracterizar a distribuição de proteínas envolvidas na adesão célula-

matriz, tais como a alfa-actinina, a paxilina e a vinculina.

• Caracterizar a distribuição da proteína de filamento intermediário

desmina, envolvida na adesão célula-matriz e na ligação da miofibrila à

membrana.

• Caracterizar a distribuição de proteínas que compõem a matriz

extracelular como a fibronectina, laminina e colágeno no peixe-zebra.

III. MATERIAIS E MÉTODOS

1. Reagentes

- Merck: acetona, NaCl, clorofórmio, metanol e ácido acético, isopentano,

Entellan, cloreto de amônio, bórax

- Polybed Polysciences, Inc.: Resina Epon – Polybed

- Reagen: Paraformaldeído; NaHPO

, NaH

, HCl

- Sakura: OCT (Tissue Tek compound)

- Sigma: soro fetal bovino, Triton X-100, N-propil Galato, DABCO, glicerol,

glutaraldeído, poli-L-lisina, cacodilato de sódio, sacarose, soro albumina bovina

- Ted Pella: acetato de uranila, citrato de chumbo, tetróxido de ósmio

- Vetec: hidróxido de sódio, azul de toluidina

2. ANTICORPOS:

ANTICORPOS

PRIMÁRIOS

TIPO FEITO EM DILUIÇÃO

UTILIZADA

ORIGEM DO

ANTÍGENO

FABRICANTE N°

CATÁLOGO

Anti-pan caderina

policlonal Coelho 1:50 Galinha Sigma C-3678

Anti ß-catenina

monoclonal Camundongo 1:50 Camundongo BD Pharmigen 610153

Anti α-actinina

sarcomérica

monoclonal Camundongo 1:50 Camundongo Sigma A-7811

Anti-paxilina

monoclonal Camundongo 1:50 Camundongo BD Pharmigen 610051

Anti-vinculina

monoclonal Camundongo 1:50 Galinha Sigma V-4505

Anti-desmina

policlonal coelho 1:50 Galinha Sigma

D-8281

Anti-fibronectina

policlonal Coelho 1:50 Humana Sigma F-3648

Anti-laminina

policlonal Coelho 1:50 Camundongo Sigma L-9393

Anti-colágeno IV

monoclonal Camundongo 1:50 Humana Sigma C-1926

Tabela 2 – Anticorpos primários.

ANTICORPOS

SECUNDÁRIOS

FEITO

DILUIÇÃO

UTILIZADA

FABRICANTE N°

CATÁLOGO

Anti-IgG de camundongo-TRITC

Cabra 1:100 Sigma T-7657

Anti-IgG de coelho-TRITC

Cabra 1:100 Sigma T-6778

Tabela 3 – Anticorpos secundários

SONDA MARCAÇÃO DILUIÇÃO

UTILIZADA

DAPI

Núcleo 1:20000

Tabela 4 – Sonda fluorescente

3. MANUTENÇÃO DOS ESTOQUES DE PEIXE

Os peixes utilizados neste experimento foram provenientes do biotério

para peixe-zebra situado no Departamento de Histologia e Embriologia da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, sendo que a utilização dos mesmos foi

aprovada pelo comitê de ética institucional conforme as normas vigentes que

regulamentam o uso desse modelo biológico.

O sistema de criação do peixe-zebra foi montado a partir de modelos

comerciais e dados da literatura, tendo sido feitas algumas adaptações diante

dos materiais disponíveis localmente.

Os animais adultos são separados de acordo com o sexo e mantidos sob

um sistema de regulação do ciclo de luz de 14 horas. São alimentados com

alimento importado (Sera Vipan, Alemanha) para peixe de aquário, além de

artemias vivas, que são muito importantes para a saúde dos peixes. O biotério

é mantido em temperatura em torno de 21°C. Existem no momento cerca de

300 peixes adultos, adquiridos com criadores de animais nacionais, que

estamos considerando como do tipo selvagem, sendo que eles são mantidos

em água filtrada e sem cloro. Antes de restabelecer o nível de água após a

limpeza, ajusta-se o pH para 7,2 com solução de bicarbonato de sódio 1M,

porém também se realiza, através de pHmetro, a aferição diária dos valores de

pH de cada um dos tanques, visando evitar variações extremas ou bruscas que

poderiam estressar os peixes e alterar o seu metabolismo.

4. PREPARO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA COLORAÇÕES E

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Para que pudesse ser feito o processamento do material, inicialmente o

peixe adulto de cerca de dois meses de idade era capturado, colocado em um

becker com água do próprio aquário e submetido à analgesia sendo colocado

em freezer a -20°C por cerca de 15 minutos, tempo suficiente para os animais

tornarem-se hipocinéticos. A partir daí o sacrifício era feito através do método

de guilhotina gerando separação da cabeça, que era desprezada, com relação

ao resto do animal. O corpo era levado a um recipiente contendo solução de

paraformadeído a 4% tamponado, onde imerso permanecia em fixação por 5

minutos. Antes do congelamento, esse material era colocado em uma solução

protetora de sacarose a 30% por cerca de 2 horas a -4°C.

Após esse período, o corpo do peixe era posicionado em um pedaço de

madeira (palito de picolé) com OCT, sendo colocado paralelo ou perpendicular

ao palito, variando de acordo com o tipo de corte desejado, se longitudinal ou

transversal, respectivamente. Seguiu-se então ao congelamento rápido,

imergindo todo o bloco (peixe+ Tissue Tek OCT Compound + palito) em

isopentano a uma temperatura de -160ºC por 1 minuto. Vale ressaltar que o

isopentano era previamente resfriado em nitrogênio líquido por cerca de 5

minutos

Dentre os fixadores testados (paraformaldeído, metanol e acetona), o

paraformaldeído foi o fixador de escolha pelo fato de ter sido o que melhor

preservou a arquitetura tecidual do músculo esquelético do peixe-zebra adulto.

O peixe congelado era transportado ao criostato do tipo Leica CM 1850

e regulado a uma temperatura de cerca de -21ºC. O bloco era fixado com

OCT no porta espécime do aparelho. Eram obtidos cortes de 10µm,

colhidos em lâminas recobertas com poli-L-lisina.

5. COLORAÇÕES

Foram feitas as seguintes colorações a partir dos cortes

congelados de músculo esquelético do peixe-zebra:

5.1- Hematoxilina-eosina

Através do método de coloração com hematoxilina e eosina pode-se

diferenciar núcleos e citoplasma, sendo que a hematoxilina é um corante

básico, que cora moléculas ácidas presentes no núcleo. Eosina é um corante

ácido, cora moléculas básicas presentes no citoplasma.

Inicialmente foi feita rápida lavagem da lâmina em água destilada,

seguindo com colocação da mesma em hematoxilina de Haris por 10 minutos,

depois sendo lavada em água corrente por cerca de 10 minutos, seguindo com

breve passagem em álcool clorídrico. Na seqüência, lavou-se a lâmina em

água destilada por 2 minutos para posterior coloração com eosina por 10

minutos. Lavou-se rapidamente em água corrente e para posterior desidratação

em álcool, nas concentrações de 95% e 100%, 5 minutos em cada

procedimento. A partir de então a lâmina era montada com Entelam.

5.2- Azul de toluidina

A coloração dos cortes com azul de toluidina é deveras importante por

permitir uma visualização da estrutura geral do tecido muscular, demarcando

especialmente a periodicidade das bandas claras e escuras.

O azul de toluidina permite coloração bastante intensa, mesmo variando

o tempo de permanência do mesmo em contato com o tecido durante o

procedimento de coloração. Por esse motivo, o azul de toluidina foi utilizado em

uma concentração final de 2%, diluído em PBS 0,01M. Era colocada então uma

gota desse corante diluído sobre o corte por 1 minuto e, posteriormente, lavado

com água destilada prosseguindo com montagem da lâmina.

5.3- Coloração para colágeno (Picrosírius)

A coloração de colágeno presente em septos da musculatura do peixe-

zebra foi obtida através do método de picrossírius, o qual permite uma

tonalidade vermelho vivo do colágeno e amarelo-alaranjado das fibras

musculares.

Inicialmente a lâmina foi lavada em água destilada por 10 minutos. Na

seqüência foi feita uma passagem pelo ácido fosfomolíbdico 0,2% por 1 minuto

e depois colocada na solução de picrossírius (Sirius red F3 BA 0,1g + ácido

pícrico 1%) por 90 minutos na jarra de coplin envolvida em papel alumínio e

colocada em recipiente escuro. Após esse período foi feita breve lavagem em

álcool a 70%, seguindo-se à desidratação dos cortes em álcool, nas

concentrações de 95% e 100%, 5 minutos em cada. e finalmente feita

montagem com Entelan.

6. CONTROLES PARA AUTOFLUORESCÊNCIA E BLOQUEIO

Para controlar a autofluorescência presente no músculo esquelético do

peixe-zebra foi montado o seguinte experimento:

a. Lavagem da lâmina em PBS por 1 hora

b. Lavagem da lâmina em Tetraborato de Sódio (bórax) a 2% por 1 hora

c. Lavagem da lâmina em Cloreto de Amônio (NH

Cl) 50mM por 1 hora.

Dentre as condições estabelecidas, a de escolha foi a descrita no item

C. Logo depois foi utilizada uma solução de bloqueio contendo albumina bovina

sérica (BSA) a 2,5%, leite desnatado a 2% e soro fetal bovino (SFB) a 8%

overnight a 4°C no intuito de impedir ligações de anticorpos secundários a

sítios inespecíficos.

Para determinar com mais precisão a faixa do espectro com

autofluorescência foi feita uma análise em um microscópio espectral de

varredura a laser. Os cortes utilizados foram tratados com cloreto de amônio

50mM e também submetidos ao uso da solução de bloqueio. Excitando o

tecido em um comprimento de onda de 488 nm foram feitas imagens de uma

lâmina controle (denominada controle FITC), sem marcação de anticorpo

primário e com marcação de anticorpo secundário ligado à fluoresceína em

vários comprimentos de onda (467 nm). Diante dos mesmos parâmetros de

excitação, foram obtidas imagens de outro corte de tecido marcado com

anticorpo primário anti pan-caderina acrescido de anticorpo secundário também

ligado à fluoresceína (denominado caderina FITC). Um terceiro corte marcado

com anticorpo primário anti pan-caderina acrescido de anticorpo secundário

ligado à rodamina (denominado caderina TRITC) foi excitado por um filtro que

permite passar dois comprimentos de onda (488 e 586 nm), sendo obtidas

imagens no mesmo espectro de emissão (467 nm). Fatias ópticas obtidas a

partir de cada uma das três galerias de imagens foram coloridas artificialmente,

sendo que a cor representada em cada uma destas equivale à intensidade

máxima de fluorescência presente em alguns comprimentos de onda. A

fluorescência média em cada fatia óptica foi representada em um gráfico. Cada

uma das imagens das três pilhas corresponde, portanto a um ponto no gráfico

da figura que relaciona a intensidade da fluorescência com o comprimento de

onda.

Somente após os procedimentos de controle foram realizadas as

marcações imunológicas.

7. IMUNOFLUORESCÊNCIA

Para se obter imagens em microscopia de imunofluorescência, os cortes

congelados eram lavados em Triton X-100 a 0,25% diluído em PBS 0,01 M por

10 minutos por 2 vezes, antes de serem colocados por 1 hora em solução de

cloreto de amônio 50 mM.

Após esse intervalo, foram feitas duas lavagens em PBS 0,01 M por 5

minutos cada. O tecido era deixado overnight em solução de bloqueio

composta por BSA a 2,5%, leite desnatado a 2% e (SFB) a 8%, diluídos em

PBS 0,01 M. Mais duas lavagens era feitas em PBS/Triton X-100 a 0,25% de 5

minutos cada antes da incubação do anticorpo primário já diluído neste mesmo

tipo de solução, durante 1 hora a 37°C. Outras três lavagens com PBS 0,01 M

de 5 minutos cada foram realizadas antes da incubação com anticorpo

secundário ligado a fluorocromo que permanecia por 1 hora a 37°C. Mais três

lavagens com PBS 0,01 M por 5 minutos cada foram necessárias antes da

lavagem em solução aquosa com NaCl 0,9% por 5 minutos, já preparando para

a incubação com a sonda DAPI que era o próximo passo feito por 3 minutos.

Nova lavagem com salina 0,9% por 5 minutos precedia a montagem da lâmina.

Para as amostras que serviram de controle negativo, não foi feita

incubação com anticorpo primário. Após o bloqueio era feita a incubação com

anticorpo secundário, havendo duas breves lavagens de 5 minutos cada com

Triton X-100 a 0,25% diluído em PBS 0,01 M entre o bloqueio e a incubação.

8. PREPARO DO MATERIAL PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE

TRANSMISSÃO (MET)

O primeiro passo para o processamento do material para a MET é a

fixação do tecido do animal que ocorreu após a morte do peixe, onde

fragmentos da musculatura esquelética foram fixados em solução fixadora

contendo paraformaldeído a 4%, glutaraldeído a 4% em tampão cacodilato de

sódio 0,1M com pH 7,4, onde os fragmentos permaneciam por 1h a 4°C. Após

isso, foram realizados três banhos de 10 minutos cada a 4°C com tampão

cacodilato de sódio a 0,1M, pH 7,4.

Para a pós-fixação foi utilizado o tetróxido de ósmio a 1% diluído em

tampão cacodilato de sódio a 0,1M, permanecendo 1h a 4°C.

Após esse período, uma lavagem de 10 minutos em tampão cacodilato

de sódio 0,1 M era feita, passando para a desidratação, onde os fragmentos

foram submetidos a banhos sucessivos com acetona durante 15 minutos em

temperatura ambiente nas seguintes porcentagens: 30%, 50%, 70% e 95%.

Completando esse processo, foram ainda feitos três lavagens com acetona a

100% por 10 minutos cada.

Seguimos à inclusão do material em resina Epon de modo gradual.

Inicialmente foi feita uma mistura de acetona com resina sem catalisador numa

proporção 2:1 por 2h em temperatura ambiente. Após isso, incluímos o material

em acetona com resina Epon sem catalisador na proporção 1:1, tendo que

permanecer overnight em temperatura ambiente. A próxima fase foi a

impregnação em resina pura com catalisador overnight em temperatura

ambiente.

Com o material já incluso em resina, este foi emblocado em molde

específico, sendo colocado o fragmento na ponta deste e levado para a estufa

a 60°C por 3 dias para polimerização.

Para o corte em um ultramicrótomo CM1850

(Leica, USA), o bloco era

preparado, ou seja, era configurado um trapézio em sua extremidade

permitindo a realização de cortes semifinos com navalha de vidro e,

posteriormente, ultrafinos com navalha de diamante

(Diatome, USA).

Os cortes foram colhidos sobre uma grade de cobre de 300 mesh para

posterior contrastação. Para melhorar o contraste dos cortes ultrafinos, os

cortes eram colocados sob uma gota de acetato de uranila a 5% em água

destilada por 30 minutos, seguindo-se da utilização de solução de citrato de

chumbo 1% sobre a grade por 5 minutos. Após a contrastação, o corte estava

pronto para ser examinado ao microscópio eletrônico de transmissão.

9. MICROSCOPIA E AQUISIÇÃO DE IMAGENS

9.1. AQUISIÇÃO DE IMAGENS EM MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

As lâminas montadas para imunofluorescência foram observadas em

microscópio invertido do tipo Axiovert 100 (Zeiss, Alemanha) utilizando os filtros

apropriados para rodamina, luz ultravioleta (DAPI) e contraste diferencial

interferencial (DIC) como mostrado na tabela 4. A aquisição das imagens foi

possível pelo uso de um processador de imagens Argus-20 (Hamamatsu,

Japão) acoplado à uma câmera CCD modelo C2400 integrada (Hammamatsu,

Japão), e enviadas através de uma interface SCSI à um computador Dell

Optiplex GX270 (Dell Corporate, EUA). Imagens dos experimentos coloridas no

programa Image Java desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde (EUA) e

disponível na internet no http://rsb.info.nih.gov/nih-image/. Foram montadas em

pranchas utilizando o programa Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems

Incorporated, EUA). Todo equipamento utilizado nestes procedimentos

pertencem ao Laboratório de Diferenciação Muscular e Citoesqueleto do ICB-

UFRJ.

Luz/Fluorocromo Filtro de

excitação

Espelho

dicróico

Filtro de

emissão

Luz ultravioleta BP365 FT935 LP393

Rodamina BP546 FT580 LP590

Tabela 5: Filtros de fluorescência.

9.2. AQUISIÇÃO DE IMAGENS EM MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO

Lâminas coradas com hematoxilina e eosina, azul de toluidina e pela

técnica de picrosírius foram observadas em aumentos diferentes em um

microscópio Nikon Eclipse E800 (Nikon, Japão). As imagens foram transferidas

através da câmera Evolution VF cooled collor (Media Cybernetics, EUA) e

digitalizadas através de interface com o programa Image Pro Plus (Media

Cybernetics, EUA) e as pranchas foram montadas utilizando o programa Adobe

Photoshop 7.0 (Adobe Systems Incorporated, EUA). As imagens foram

adquiridas e processadas no Laboratório de Patologia Celular do ICB-UFRJ.

9.3. AQUISIÇÃO DE IMAGENS EM MICROSCOPIA CONFOCAL

Lâminas foram observadas em um microscópio confocal a laser Zeiss

LSM 510 Meta (Zeiss, Alemanha), com excitação de 488 nm e varredura de

espectro de emissão de 467, 489, 510, 531, 553, 574, 596, 617, 638, 660, 681

nm. A projeção e os valores do gráfico foram feitos usando o programa Zeiss

LSM Image Browser, sendo que o gráfico propriamente dito foi elaborado no

programa Microsoft Office Excel (Microsoft, EUA). Foi utilizado o microscópio

confocal localizado no Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular do

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ.

9.4. AQUISIÇÃO DE IMAGENS EM MICROSCOPIA ELETRÔNICA

As grades contendo material contrastado foram transferidas para o

porta-espécimem. Os cortes foram observados e eletromicrografias realizadas

em Microscópio Eletrônico de Transmissão Jeol 1200 EX (Jeol, Japão) do

instituto de Biofísica da UFRJ operando em 80 kV, em diferentes aumentos. As

imagens foram digitalizadas através de scanner Epson Perfection 3170 Photo

(Epson, Japão) com auxílio do programa Image ProPlus e transferidas para um

computador. Algumas imagens foram obtidas no Microscópio Eletrônico Zeiss

modelo CEM 900 (Zeiss, Alemanha) da Fiocruz-BA e as pranchas foram feitas

utilizando o programa Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems Incorporated,

EUA). As imagens foram obtidas de microscópios pertencentes tanto ao

Laboratório de Ultraestrutura Celular Herta Meyer do IBCCF, UFRJ quanto do

Laboratório de Biomorfologia Parasitária/ Unidade de Microscopia Eletrônica da

FIOCRUZ- BA.

IV – RESULTADOS

Esta dissertação se concentrou na análise das estruturas de adesão

celular no músculo esquelético de exemplares adultos de peixe-zebra (Danio

rerio). Cortes congelados transversais e longitudinais do tecido muscular foram

submetidos à colorações por hematoxilina e eosina e por azul de toluidina para

uma análise inicial da preservação do tecido muscular e da estrutura do

mesmo. Pode-se observar na Figura 7, obtida através de coloração com

hematoxilina e eosina em corte longitudinal (Figura 7A) e em corte transversal

(Figura 7B), a presença de miofibrilas com estriações que evidenciam a

periodicidade muscular. Os núcleos, situados na periferia da fibra muscular,

bem como o sarcolema também são evidentes pela coloração com

hematoxilina. Na Figura 8, obtida através da coloração com azul de toluidina,

são evidenciadas de novo as estriações presentes nas fibras musculares

esqueléticas em cortes longitudinais. As imagens presentes nas Figuras 7 e 8

foram obtidas através de microscopia óptica de campo claro. Ambas mostram

que os protocolos utilizados nesta dissertação para a fixação, congelamento e

corte de tecido foram adequados para uma boa preservação do músculo

esquelético do peixe-zebra.

A Figura 9 mostra cortes longitudinais de músculos corados com

picrosirius e analisados através de microscopia óptica de campo claro. Este

tipo de coloração evidencia fibras colágenas em vermelho. Pode-se observar

nestes cortes a presença de fibras colágenas marcadas intensamente em

vermelho tanto no septo entre as miofibrilas quanto no tecido conjuntivo em

torno do tecido muscular (endomísio) do peixe-zebra. Já as fibras musculares

apresentam-se amarelo-alaranjadas, indicando uma reação fraca do corante.

Figura 7: Cortes congelados do tecido muscular de peixe-zebra

corados com hematoxilina e eosina em microscopia óptica de campo claro.

Em A, evidência da periodicidade muscular em corte longitudinal (seta

verde) e núcleos na periferia da fibra muscular (seta amarela) Em B, corte

transversal. Em destaque, tecido conjuntivo em torno da fibra muscular (seta

vermelha). Barra = 10µm.

Figura 8: Periodicidade das estriações transversais na fibra muscular do

peixe-zebra em microscopia óptica de campo claro. Em A, presença de um

septo entre miofibrilas (seta amarela). Em B, detalhe das bandas claras e

escuras. Coloração com azul de toluidina. Barra = 10µm.

Figura 9: Cortes longitudinais de músculo corados com picrosirius em

microscopia óptica de campo claro. Evidência de fibras de colágeno em

vermelho no septo entre miofibrilas; fibras musculares apresentam-se amarelo-

alaranjadas. Barra = 10µm.

Após a observação preliminar da preservação e da estrutura do tecido

muscular, procedemos a uma análise mais detalhada da presença e

distribuição de proteínas de adesão celular no músculo do peixe zebra, através

da técnica de microscopia óptica de fluorescência. Como observamos em

alguns experimentos prévios que a autofluorescência era um problema

presente no tecido muscular do peixe–zebra, foi montado um experimento com

o intuito de tratar quimicamente esta autofluorescência que é uma condição

muito comum em músculo esquelético. No início dos experimentos era utilizada

apenas uma solução de bloqueio contendo BSA, leite desnatado e SFB,

diluídos em PBS por 24 horas, previamente às imunomarcações. Isso não era

eficaz para impedir o aparecimento de autofluorescência, visto que, na

verdade, a solução de bloqueio é eficaz para impedir ligações do anticorpo

secundário a sítios antigênicos inespecíficos, o que só foi possível entender

após revisões de literatura. Sendo assim, a autofluorescência no músculo

esquelético do peixe-zebra adulto foi controlada pelo uso do cloreto de amônio

(NH

Cl) 50 mM sendo eficaz tanto no canal da luz ultravioleta quanto da

rodamina, sendo que no canal da fluoresceína, a autofluorescência continuou a

aparecer. Isso pôde ser demonstrado através das imagens apresentadas nas

Figuras 10, 11 e 12. Cortes congelados foram submetidos à lavagem somente

com a solução salina tamponada (PBS), ou apenas com cloreto de amônio ou

ainda somente com bórax. Foram obtidas imagens a partir do microscópio de

fluorescência nos três canais referentes à excitação por luz ultravioleta (UV),

fluoresceína (FITC) e rodamina (TRITC). Como pode ser observado a partir

destas três Figuras, pode-se concluir que somente o cloreto de amônio foi

capaz de bloquear a autofluorescência no canal da rodamina (TRITC) e da luz

ultravioleta (UV) e não da fluoresceína (FITC) e, portanto a partir destes

resultados passamos a utilizar somente anticorpos secundários marcados com

rodamina e a tratar quimicamente o tecido com cloreto de amônio.

A Figura 13 mostra imagens de controles negativos das reações onde

era utilizado apenas o anticorpo secundário. Na Figura 13A observa-se a

marcação do anticorpo anti-IgG de coelho marcado com rodamina (TRITC). Na

Figura 13B observa-se a marcação deste mesmo corte de tecido com DAPI e

na Figura 13C observa-se o corte de tecido muscular por Contraste Diferencial

Interferencial (DIC). Já a marcação com o anticorpo secundário anti-IgG de

camundongo marcado com rodamina (TRITC) está representado na Figura

13D. Os núcleos deste mesmo corte de tecido podem ser vizualizados na

Figura 13E através da sonda DAPI, e o corte do tecido muscular pode ser

visualizado por (DIC) na Figura 13F.

Na seqüência, fizemos ainda imagens de corte congelado do músculo

esquelético do peixe-zebra adulto tratado com cloreto de amônio, sem

marcação de anticorpo primário e com marcação apenas do anticorpo

secundário ligado à fluoresceína (FITC). Este tratamento do corte congelado

serviu como controle com relação aos outros que serão descritos. Foram feitas

imagens através de um microscópio confocal espectral a laser com excitação

de 467 nm e o espectro de emissão variando de 467 a 681 nm como mostrado

na Figura 14. Nesta figura pode-se observar que há um aumento na

intensidade da fluorescência entre os comprimentos de onda de emissão desde

531 a 574 nm. A Figura 15 mostra imagem gerada a partir da galeria

apresentada na figura anterior, onde é possível observar que há um aumento

da intensidade de fluorescência na faixa do verde.

Na Figura 16 há uma galeria de imagens obtidas a partir de corte

congelado do músculo esquelético do peixe-zebra adulto tratado com cloreto

de amônio, marcado com anticorpo primário anti pan-caderina e anticorpo

secundário anti-IgG de coelho conjugado à FITC. A excitação foi de 467 nm e o

espectro de emissão variou de 467 a 681 nm. Pode-se observar que há um

aumento na intensidade da fluorescência entre os comprimentos de onda de

emissão desde 531 a 574 nm. A Figura 17 mostra imagem gerada a partir da

galeria apresentada na Figura 16 onde se pode observar que há um aumento

da intensidade de fluorescência na faixa do verde.

A Figura 18 mostra galeria de imagens obtidas a partir de corte

congelado do músculo esquelético do peixe-zebra adulto tratado com cloreto

de amônio, marcado com anticorpo primário anti pan-caderina e anticorpo

secundário anti-IgG de coelho ligado à Rodamina (TRITC). A excitação foi de

467 nm. O espectro de emissão variou de 467 a 681 nm. Pode-se observar que

há um aumento na intensidade da fluorescência entre os comprimentos de

onda de emissão entre 574 e 596 nm. A Figura 19 mostra imagem gerada a

partir da galeria apresentada na figura anterior onde se pode perceber que há

um aumento da intensidade de fluorescência na faixa do amarelo ao vermelho.

A Figura 20 mostra gráficos sobrepostos obtidos a partir de cada pilha

de imagem, onde é possível observar que não há diferença no espectro de

emissão da fluorescência entre a imagem do corte de tecido muscular que

serviu como controle e a imagem do corte marcado com anticorpo anti-caderina

com anticorpo secundário ligado à fluoresceína. Isso mostrou que mesmo na

ausência do anticorpo primário existe bastante fluorescência na faixa do verde.

Vale ressaltar que o espectro de emissão amplo encontrado nestas duas

situações corresponde à autofluorescência e não à reação imunológica de

identificação molecular. Este espectro é diferente com relação ao emitido a

partir do corte marcado com anticorpo anti pan-caderina ligado à rodamina, ou

seja o espectro de emissão está concentrado em torno do comprimento de

onda referente à cor vermelha, o que sugere marcação imunológica efetiva.

É importante ressaltar que somente o cloreto de amônio (NH

Cl) foi

capaz de tratar quimicamente a autofluorescência do tecido muscular, assim

como a utilização da solução de bloqueio impediu a presença de marcação

fluorescente inespecífica proveniente dos anticorpos secundários.

FITC UV

Figura 10: Lâminas submetidas à lavagem somente com a solução

salina tamponada (PBS) foram observadas em microscopia de fluorescência

nos três canais, onde marcações inespecíficas e autofluorescências foram

identificadas por excitação tanto da luz ultravioleta (UV), em A, da

fluoresceína (FITC), em B e da rodamina (TRITC) em C. Barra = 10 µm.

Figura 11: Lâminas submetidas ao tratamento com bórax foram

observadas em microscopia de fluorescência nos três canais, onde

marcações inespecíficas e autofluorescências foram identificadas por

excitação tanto da luz ultravioleta (UV), representada em A, da fluoresceína

(FITC),em B e da rodamina (TRITC) em C. Barra = 10 µm.

Figura 12: Lâminas com cortes congelados do tecido tratado com

Cl 50mM foram observadas em microscopia de fluorescência nos três

canais: luz ultravioleta (UV), fluoresceína (FITC), rodamina (TRITC) e

Verifica-se o bloqueio da marcação fluorescente inespecífica somente no

canal que detecta marcação com rodamina. Barra = 10 µm.

Figura 13: Imunofluorescências de tecido muscular com marcações

de anticorpos secundários anti-IgG de coelho (A) e anti-IgG de camundongo

(D), conjugados à rodamina; ambos com marcações com sonda DAPI (B e

E) para visualização de núcleos. O tecido é observado por DIC em C e F.

Barra = 10 µm.

Figura 14: Galeria de imagens obtidas a partir de corte congelado do

músculo esquelético do peixe-zebra adulto sem marcação de anticorpo

primário e com marcação apenas do anticorpo secundário ligado à

fluoresceína (FITC). O valor acima à esquerda corresponde ao comprimento

de onda (λ) em nanômetros da image adquirida. Excitado em 467nm.

Figura 15: Imagem gerada a partir da sobreposição das imagens da

galeria apresentada na Figura 14. Observa-se aumento da intensidade de

fluorescência na faixa do verde.

Figura 16: Galeria de imagens obtidas a partir de corte congelado do

músculo esquelético do peixe-zebra adulto marcado com anticorpo primário

anti pan-caderina e anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado à

Fluoresceína (FITC). Excitado em 467nm.

Figura 17: Imagem obtida a partir da sobreposição das imagens da

galeria mostrada na Figura 16. Percebe-se aumento da intensidade de

fluorescência variando desde a faixa do verde ao laranja, sendo que a maior

intensidade está na faixa do verde.

Figura 18: Galeria de imagens obtidas a partir de corte congelado do

músculo esquelético do peixe-zebra adulto, marcado com anticorpo primário

anti pan-caderina e anticorpo secundário anti-IgG de coelho ligado à

Rodamina (TRITC). Excitado em 467 nm.

Figura 19: Imagem obtida a partir da sobreposição das imagens da

galeria apresentada na Figura 18. Pode-se observar aumento da intensidade

de fluorescência na faixa do amarelo ao vermelho.

Figura 20: Gráficos sobrepostos obtidos a partir de cada pilha de

imagem. Não há diferença no espectro de emissão da fluorescência entre os

dois primeiros grupos (controle e caderina FITC), porém há diferença no

espectro de emissão relacionado à imagem do corte marcada com anticorpo

primário anti pan-caderina e secundário ligado à rodamina. (caderina TRITC).

Uma vez estabelecidas as condições ideais para a marcação, iniciamos

a identificação de componentes do complexo de adesão estudando a caderina,

e beta-catenina que são proteínas que fazem ligação célula-célula.

A Figura 21 mostra imagens de imunofluorescência feitas com anticorpo

primário contra a proteína de membrana caderina, seguido de anticorpo

secundário marcado com rodamina. Na Figura 21A, podemos observar a

caderina presente no sarcolema da fibra muscular na região de encontro de

células vizinhas. Na Figura 21B podemos observar a marcação dos núcleos

com DAPI; a Figura 21C foi gerada pela sobreposição das figura 21A e 21B. A

Figura 21D mostra imagem do corte de tecido muscular visto por DIC.

Em seguida analisamos outra proteína do complexo de adesão célula-

célula, a beta-catenina. A Figura 22A evidencia a presença desta proteína

localizada no sarcolema. Os núcleos estão com DAPI na Figura 22B. A

Figura 22C é o resultado da colocalização entre as Figuras 22A e 22B. A

Figura 22D representa a imagem do tecido muscular em DIC.

Após a observação de marcações de proteínas de adesão célula-célula,

passamos à observação de estruturas que compõem o complexo de adesão

célula-matriz, tais como alfa-actinina, paxilina, vinculina e também do filamento

intermediário desmina.

A proteína alfa-actinina, além de fazer parte da linha Z se encontra

ligada ao complexo de adesão focal por se ligar ao domínio intracelular das

integrinas. Ela possui uma isoforma específica do sarcômero, contra qual o

anticorpo foi utilizado neste trabalho. A Figura 23A mostra a presença da

alfa-actinina na linha Z ou em costâmeros. Como fizemos cortes

longitudinais de tecido não é possível uma observação tridimensional da

estrutura do músculo, não sendo possível distinguir com segurança a

marcação de linha Z de costâmeros. Marcação para núcleos com DAPI

estão presentes na Figura 23B, sendo que a Figura 23C representa uma

sobreposição das duas primeiras imagens. O corte do tecido é visualizado

em DIC na Figura 23D. Já na Figura 24A, a alfa-actinina está localizada na

região do sarcolema, mas não é observada a sua presença na junção

miotendinosa. Marcação para núcleos com DAPI estão presentes na Figura

24B. Há uma colocalização entre as Figuras 24A e 24B mostrada na Figura

24C, sendo que todo o tecido é demonstrado em DIC na Figura 24D.

A paxilina está envolvida no aparato protéico de adesão célula-matriz

associado a outras proteínas como a alfa-actinina, vinculina e talina, estando

ainda ligada ao citoesqueleto de actina. A Figura 25A mostra a marcação de

corte de tecido muscular com anticorpo contra a proteína paxilina na

terminação das fibras musculares, e não propriamente no septo. Passamos a

chamar essa região de junção miotendinosa, embora não exista propriamente

um tendão no músculo esquelético do peixe-zebra adulto, mas sim um septo. A

paxilina não foi encontrada em costâmeros. Na Figura 25B podemos observar

a marcação para núcleos com DAPI. Na Figura 25C observa-se imagem

sobreposta das duas figuras anteriores e na Figura 25D a imagem de DIC do

corte de tecido.

A proteína vinculina também faz parte do complexo de adesão focal,

juntamente com a paxilina, talina e a alfa-actinina. A Figura 26A mostra

marcação de corte de tecido muscular com anticorpo anti-vinculina na

terminação das fibras musculares, na junção miotendinosa. Na figura 26B

pode-se observar a marcação para núcleos com DAPI, sendo que a

sobreposição das duas imagens anteriores é mostrada na Figura 26C. Está

também presente imagem de DIC do corte de tecido na Figura 26D. Já na

Figura 27A observa-se a marcação desta em costâmeros, segundo da

marcação dos núcleos (Figura 27B), da sobreposição das imagens anteriores

(Figura 27C) e pela visualização de todo o tecido (Figura 27D).

A desmina, uma proteína de filamento intermediário específica de

músculos, também foi encontrada no tecido muscular do peixe-zebra adulto,

especificamente localizando-se na linha Z ou em costâmeros como mostrado

na Figura 28A. Esta não foi encontrada em outros locais como o sarcolema,

junção miotendinosa e septo. A Figura 28B mostra os núcleos marcados com

DAPI. Na seqüência, sobreposição das Figuras 28A e 28B, mostrada na Figura

28C, bem como imagem do corte do tecido em DIC (Figura 28D).

Figura 21: Imunofluorescência com anticorpo anti-Caderina. Seta

indica marcação da caderina no sarcolema (A); em B os núcleos marcados

com DAPI estão evidentes, sendo que em C há uma sobreposição das

imagens A e B. O corte do tecido é mostrado em DIC (D). Barra = 10 µm.

Figura 22: Imunofluorescência com anticorpo anti beta-catenina que

enconta-se no sarcolema (setas em A). Em B, evidência dos núcleos em

DAPI, mostrados. Em C imagem mostrando colocalização das duas

anteriores. Visualização do tecido muscular em DIC (D). Barra = 10 µm.

Figura 23: Imunofluorescência com anticorpo anti alfa-actinina. Em A,

esta proteína está presente na linha Z ou em costâmeros. Marcação para

núcleos com DAPI estão presentes em B. Em C observa-se a sobreposição

das duas primeiras imagens. O corte do tecido estriado é visualizado em DIC

(D). Barra = 10 µm.

Figura 24: Imunofluorescência com anticorpo anti alfa-actinina, a qual

em A, está presente na região do sarcolema das fibras musculares (seta

branca). As cabeças de seta mostram a demarcação das bordas do septo

entre miofibrilas (junção miotendinosa). Marcação para núcleos com DAPI

estão presentes em B. Em C, observa-se a sobreposição das duas primeiras

imagens. O corte do tecido é visualizado em DIC (D) com evidência do septo

(cabeças de setas). Barra = 10 µm.

Figura 25: Marcação de corte de tecido muscular com anticorpo anti -

paxilina na terminação das fibras musculares, na junção miotendinosa (cabeça

de seta em A), adjacente ao septo de tecido conjuntivo evidenciado em parte

pela linha branca. Em B, pode-se observar a marcação para núcleos com

DAPI. Na Figura C observa-se imagem sobreposta das duas figuras anteriores.

Imagem de DIC do corte de tecido em D com evidência da borda do septo

(cabeça de seta). Barra = 10 µm.

Figura 26: Marcação de corte de tecido muscular com anticorpo anti -

vinculina na terminação das fibras musculares, no septo (setas em A) Em B

pode-se observar a marcação para núcleos com DAPI. Na Figura C observa-se

imagem sobreposta das duas figuras anteriores. Imagem de DIC do corte de

tecido em D, mostrando especialmente o septo evidenciado em parte pela linha

amarela. Barra = 10 µm.

Figura 27: Imunofluorescência com anticorpo anti-vinculina mostrando

costâmeros (A); presença de marcação nuclear com DAPI (B). A partir da

colocalização entre as duas primeiras figuras foi obtida a imagem em C. A

visualização de todo o tecido é possível por DIC (D). Barra = 10 µm.

Figura 28: Imunofluorescência com anticorpo anti-desmina, localizando

esta proteína em costâmeros (A). Em B os núcleos estão marcados com DAPI.

Colocalização entre a figura A e B, sendo evidenciados alguns núcleos (setas

brancas), mostrando relação dos núcleos com miofibrilas (C). Em D, imagem

do corte do tecido em DIC, sendo mostrado um septo (seta verde). Barra = 10

µm.

Também analisamos a distribuição de proteínas de matriz extracelular

como a laminina, fibronectina e colágeno.

A laminina, principal proteína da lâmina basal, foi observada na Figura

29A marcando a terminação das fibras musculares ligadas ao septo,

correspondendo a região de junção miotendinosa, porém não marcou

costâmeros. Os núcleos marcados com DAPI estão evidentes na Figura 29B.

Na Figura 29C, colocalização das duas anteriores. É também possível perceber

os limites entre uma célula e outra, através das imagens de DIC (Figuras 29D).

A fibronectina é uma glicoproteína da matriz extracelular encontrada nos

vertebrados. Na Figura 30A, ela está evidente nas terminações das fibras

musculares na junção miotendinosa, não estando presente em costâmeros. A

imagem correspondente aos núcleos pode ser vista na Figura 30B. A Figura

30C mostra a sobreposição das duas imagens anteriores, e todo o tecido

muscular visualizado em DIC na Figura 30D.

A marcação de cortes de tecido muscular com anticorpo anti-colágeno

não foi eficaz, mas observa-se por luz polarizada uma região brilhante no

septo. Pode-se supor que este brilho, mostrado na Figura 31, se deva à

birrefringência do colágeno.

Figura 29: Marcação de corte de tecido muscular com anticorpo anti –

laminina. Na figura A existe marcação para laminina na terminação das fibras

musculares ligadas ao septo (setas amarelas). Os núcleos estão corados com

DAPI (B). Imagens A e B estão sobrepostas em C. Percebem-se limites entre

uma célula e outra nas bordas do septo, o que pode ser mais bem avaliado

através da imagem em DIC (seta em D). Barra = 10 µm.

Figura 30: Marcação de corte de tecido muscular com anticorpo anti –

fibronectina. Evidência desta proteína nas terminações das fibras musculares,

na junção miotendinosa (A). Núcleos corados em DAPI (B). Em C,

sobreposição das imagens A e B. A Figura D mostra corte de tecido, bem como

terminação das fibras musculares (setas) evidenciadas em DIC. Barra = 10 µm.

Figura 31: Imagem por microscopia de luz polarizada. Visualização de

um septo brilhante entre miofibrilas (A). Em B, os núcleos estão evidenciados

por DAPI, sendo que em C há uma sobreposição entre as imagens A e B,

sendo que a coloração é artificial, não significando marcação fluorescente. Na

imagem D observa-se a arquitetura tecidual por DIC. Barra = 10 µm.

Após as análises de proteínas de adesão celular em cortes de tecido

muscular através de imunofluorescência, partimos para uma análise

morfológica das regiões de adesão do músculo do peixe-zebra adulto, através

de microscopia eletrônica de transmissão, a fim de entendermos melhor a sua

organização ultraestrutural.

A Figura 32 evidencia em detalhes a estrutura geral da fibra muscular

esquelética antes já mostrada pela coloração de hematoxilina e eosina. Por

microscopia eletrônica de transmissão é possível observar um septo de tecido

conjuntivo cruzando obliquamente as miofibrilas. Estão também presentes

algumas mitocôndias aglomeradas próximas ao septo, bem como um núcleo na

periferia da fibra muscular e paralelo ao longo do septo.

Na micrografia eletrônica mostrada na Figura 33, podemos observar a

presença um septo entre miofibrilas do tecido muscular. Observa-se que há um

fibroblasto adjacente ao septo.

Em uma outra micrografia (Figura 34) podemos ver a borda de um

fibroblasto (Figuras 34 A e B) e septo adjacente a este em cada imagem. Há

evidencias de fibras de colágeno presentes neste septo em cortes transversais

(Figura 34A) e oblíquos (Figura 34B).

Figura 32: Estrutura geral da fibra muscular esquelética por microscopia

eletrônica de transmissão. Septo presente entre miofibrilas. Detalhe da união

da miofibrila ao septo (seta azul). Presença de mitocôndrias (setas vermelhas)

e núcleo (seta amarela). Barra = 500 nm.

Figura 33: Micrografia eletrônica de corte ultrafino do músculo. Em A e

B, presença de um fibroblasto dentro de uma região de septo (seta amarela).

Em B, detalhe do fibroblasto com presença evidente do núcleo cercado por

fibras colágenas. Barras em A = 1 µm e em B = 200 nm.

Figura 34: Identificação de colágeno por MET. Presença de septo

adjacente a um fibroblasto (A e B) do tecido muscular. Colágeno em corte

transversal (seta amarela em A) e oblíquo (seta vermelha em B). Barras em A e

B = 100 nm.

A distribuição das proteínas de adesão e matriz extracelular está

resumida na Tabela 5 e na figura 35, onde pode-se observar que estas se

localizam em distintas estruturas: sarcolema, costâmeros, junção miotendinosa

e septo.

PROTEÍNA SARCOLEMA COSTÂMEROS JUNÇÃO

MIOTENDINOSA

SEPTO

Caderina +

β-catenina +

Paxilina +

Alfa-actinina + +

Vinculina + +

Desmina +

Colágeno +

Laminina +

Fibronectina +

Tabela 5: Distribuição das proteínas de adesão e matriz extracelular no

peixe-zebra adulto em diferentes estruturas do músculo.

Figura 35: Modelo esquemático de proteínas de adesão do peixe-zebra

adulto dispostas especialmente no sarcolema da fibra muscular, em

costâmeros, na junção miotendinosa e no septo

V – DISCUSSÃO

O estudo descrito nesta dissertação baseou-se em uma análise

morfológica da distribuição de proteínas de adesão do músculo esquelético de

peixe-zebra (Danio rerio) adulto, bem como elementos da matriz extracelular,

através de microscopia óptica de campo claro, microscopia de

imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Em nosso laboratório alguns trabalhos têm sido realizados utilizando

embriões de peixe-zebra (Costa et al., 2002; Costa et al., 2003). Porém

detalhes sobre a associação de proteínas do citoesqueleto e sua relação com a

matriz extracelular no animal adulto precisam ser mais bem investigados.

O protocolo utilizado para congelamento e corte do tecido muscular,

permitiu a obtenção de um tecido com bom aspecto estrutural. Sendo assim,

em cortes congelados seccionados longitudinal e transversalmente, corados

com hematoxilina e eosina, foi identificada a preservação da periodicidade das

estriações transversais, assim como em secções longitudinais do músculo

esquelético do peixe-zebra corados com azul de toluidina foram visualizadas

estriações longitudinais correspondendo à periodicidade das miofibrilas. Além

disso, alguns núcleos ocupando regiões periféricas foram observados

densamente corados pela ação basófila da hematoxilina. O tecido conjuntivo

em torno da fibra muscular também foi observado intensamente corado no

músculo do peixe-zebra adulto. Esses detalhes do tecido muscular esquelético,

referentes à periodicidade das estriações transversais, bem como a ocupação

periférica dos núcleos e a relação desses com o sarcolema são bem

estabelecidos e já foram demonstrados (Huxley & Hanson,1954).

Após a padronização do protocolo de obtenção de cortes congelados

viáveis, partimos para a investigação da distribuição de proteínas de adesão e

matriz extracelular do tecido muscular do peixe-zebra. Entretanto, a

autofluorescência foi observada tornando-se um crítico problema em nossos

experimentos. Alguns estudos evidenciaram a presença de autofluorescência

endógena tanto em células musculares (Goodell et al., 2004), como em

eritrócitos (Tokumasu & Dvorak, 2003), em hepatócitos (Gabel & Neumann,

2002), nas artérias aorta e coronárias, bem como na pele de humanos

(Billington & Knight 2001), dentre outros tipos como o algodão (Ruan et al.,

2001) e algas (Billington & Knight 2001).

Moléculas endógenas que geram autofluorescência são encontradas em

alguns tecidos, tais como: biotina, em hepatócitos (Puvion-Dutilleul & Puvion

1991; de Souza et al., 1998) e em tecido muscular de aves e peixes; flavinas

(em mitocôndrias e membrana); NADPH (co-fatores do metabolismo); colágeno

e elastina (concentrados em tecidos conjuntivos); e clorofila (em algas e no

algodão) como demonstrado por Billington & Knight (2001) e Ruan et al. (2001).

Em nossos experimentos, testamos diferentes agentes para o

tratamento químico da autofluorescência em cortes do tecido muscular,

previamente à utilização de uma solução de bloqueio. Esses compostos

químicos foram o tampão fosfato salino (PBS), o tetraborato de sódio e o

cloreto de amônio. Nossos resultados comprovaram que somente o cloreto de

amônio foi eficaz na eliminação da autofluorescência, apenas no canal da

rodamina e da luz ultravioleta, não sendo efetivo no canal de ativação da

fluoresceína. Goodell et al., em 2004 detectaram autofluorescência verde em

fibras musculares esqueléticas de camundongos, a qual era semelhante a forte

emissão da proteína verde fluorescente (GFP). Demonstraram ainda que fibras

musculares oxidativas emitem essa autofluorescência, provavelmente devido à

presença da flavina associada ao NADH desidrogenase.

A partir desse resultado, padronizamos o protocolo para controle de

eliminação de autofluorescência utilizando o cloreto de amônio 50 mM, sendo

feitas marcações com anticorpos secundários ligados somente à rodamina,

sendo também possível utilizar o DAPI.

Foi realizado um experimento controle para eliminar marcação do

anticorpo secundário a sítios antigênicos inespecíficos presentes no tecido

muscular, sendo padronizada a utilizada da solução de bloqueio composta por

BSA a 2,5%, leite desnatado a 2% e SFB a 8%, diluídos em PBS 0,01M.

No intuito de quantificar a faixa do espectro com que apresentou

autofluorescência no canal da fluoresceína mesmo após utilização do cloreto

de amônio a 50 mM foi realizada a observação do tecido por microscopia

confocal a laser associada à avaliação por gráfico espectral, sendo possível

confirmar os dados obtidos até então. Análises da faixa do espectro de

autofluorescência por gráfico espectral já foram mostradas (Billington & Knight

2001; Goodell et. al, 2004).

Para o estudo de proteínas de adesão e matriz extracelular, elegemos

algumas proteínas, já bem caracterizadas em outros modelos vertebrados,

tanto em embriões como em adultos, mas ainda não descritas no peixe-zebra

adulto. O objetivo era observar a distribuição das mesmas e não

necessariamente estudar todas as proteínas de cada complexo. Foi por esse

motivo que não foram feitas marcações para todas as proteínas envolvidas.

Para verificar a distribuição de proteínas de adesão célula-célula, foram

feitas marcações para as proteínas caderina e β-catenina.

A caderina é uma glicoproteína cálcio-dependente que modula o

comportamento de adesão célula-célula (Petruzzelli et al.,1999). Ela interage

com o citoesqueleto de actina através de algumas moléculas de ligação

(Steinberg & McNutt, 1999). Embriões de camundongos negativos para N-

caderina tiveram seu desenvolvimento aparentemente normal nos estágios

iniciais, porém anormalidades como atraso no crescimento e formação do

embrião, além de defeitos no coração primitivo foram observados, resultando

em morte dos mesmos aos dez dias de vida fetal (Radice et al., 1997). Outros

estudos com embriões de galinha negativos para E-caderina demonstraram

que a diferenciação muscular ocorre normalmente, pois estes embriões

também foram submetidos à superexpressão de N-caderina, mostrando que

uma caderina pode atuar como um substituto funcional de um outro tipo

(George-Weinstein et al., 1997). Infere-se ainda que, especialmente a N-

caderina, é essencial ao desenvolvimento do animal. Experimentos anteriores

realizados em nosso laboratório identificaram a presença de caderina em

embriões de 24 hpf, bem como em embriões 48 hpf de peixe-zebra,

caracterizando a distribuição dessa proteína em mioblastos nos somitos

(Escaleira, 2005).

Neste trabalho observamos marcação de caderina no tecido muscular do

peixe-zebra adulto, integrando áreas compatíveis ao sarcolema, o que já era

esperado, pois a caderina é uma proteína essencial presente em locais de

adesão como já bem descrito em animais vertebrados (Craig & Pardo, 1989;

Wakayama et al. 1993), importante para o funcionamento do aparato contrátil

do animal.

Resultados anteriores em nosso laboratório demonstraram distribuição

de β-catenina no sarcolema em embriões de peixe-zebra de 48 hpf (Escaleira,

2005). Neste trabalho, a β-catenina também foi encontrada no sarcolema,

sendo um resultado esperado, já que ela integra, juntamente com a caderina,

os sistemas de adesão célula-célula. Ela foi observada por imunomarcações

em microscopia eletrônica em discos intercalares e costâmeros presentes em

cardiomiócitos de Xenopus adulto e também em linhas Z do sarcômero em

músculo esquelético; também foi detectada em discos intercalares e linha Z em

músculo cardíaco de porquinho da índia adulto (Kurth et. al., 1996). Em

camundongos adultos, observou-se que a expressão da β-catenina é

importante para o crescimento da fibra muscular em resposta à sobrecarga

mecânica (Armstrong et al, 2006). Foram também descritos distintos complexos

caderina-catenina estando presentes em túbulos contorcidos proximais de

camundongos adultos, mostrando a importância deste em outros tecidos (Jiang

et al., 2004).

Esses resultados do complexo de adesão célula-célula sugerem que

não houve mudança significativa de distribuição dessas proteínas no peixe-

zebra adulto, se comparados ao embrião e a outros modelos. Após estes

resultados partimos para a investigação da distribuição de proteínas do

complexo de adesão célula matriz: alfa-actinina, paxilina, vinculina, e

também a proteína desmina de filamento intermediário.

A alfa-actinina está conjugada à actina ao longo das fibras de stress de

células em cultura, nas linhas Z de células de músculo estriado, em complexo

juncional entre actina e proteínas da matriz extracelular (Blanchard, 1989;

Djinovic-Carugo et al.,1999); também integra a rede protéica costamérica

(Ervasti, 2003). É também um importante componente do complexo protéico

denominado (MLP) Muscle Lim Protein (Louis et al, 1997). Estudos com

camundongos knockout demonstraram que a não expressão de MLP em

cardiomiócitos induz defeitos morfológicos em costâmeros (Ehler et al. 2001). A

alfa-actinina foi identificada em somitos jovens de embriões de peixe-zebra e

demonstrada por reconstrução tridimensional. Estriações transversais

sarcoméricas compatíveis com áreas de linha Z foram marcadas para alfa-

actinina (Costa et al., 2002). Observamos a presença de alfa-actinina em

costâmeros e próxima ao sarcolema. Não houve marcação na junção

miotendinosa, o que era esperado. Porém, o fato desse anticorpo ter marcado

o sarcolema, apesar de ser anti alfa-actinina sarcomérica, pode ser explicado

pelo fato de que houve alguma marcação não-específica da isoforma

sarcomérica. Em músculo esquelético de Xenopus adulto, avaliado por

microscopia eletrônica, não foi encontrada expressão de alfa-actinina de

músculo liso em segmentos terminais da miofibrila, nem próxima ao sarcolema

(Tidball, 1987), provavelmente por uso de uma isoforma não específica do

anticorpo. É provável que a isoforma que marcaria a junção miotendinosa não

seja a mesma.

Essa situação foi apontada por Pavalko e colaboradores (1995), os quais

confirmaram que a detecção por métodos imunológicos da presença da alfa-

actinina em adesões focais é limitada pela difícil compreensão acerca do

funcionamento de anticorpos anti alfa-actinina.

A paxilina é uma proteína que apresenta múltiplos domínios e localiza-se

em adesões focais formando um elo estrutural entre a matriz extracelular e o

citoesqueleto de actina. Outros estudos em embriões realizados em nosso

laboratório indicam que a paxilina encontra-se presente em regiões

intersomitos e essa distribuição se dá ao longo de todo o septo. Marcação

positiva para paxilina foi encontrada em experimentos feitos em cultura de

células musculares esqueléticas de embrião de galinha localizando-se nas

adesões focais e integrando fibras de strees (Turner et al.,1990). Sabe-se

ainda que paxilina mutante em fibroblastos de aves gera a formação de

múltiplos lamelipódios largos, gerando motilidade celular irregular (West et al,

2001). Foi visto que ela também está presente no evento da costamerogênese

em embriões de camundongos (Quach & Rando, 2006). Em tendões de ratos

adultos crescidos in vitro, foi observada a significativa expressão da paxilina,

especialmente na junção miotendinosa (Larkin et al., 2006). Evidenciamos

também a marcação da paxilina próxima ao septo entre miofibrilas do peixe-

zebra adulto, mostrando a presença desta na junção miotendinosa. Em

embriões de peixe-zebra de 48 hpf foi observada a presença da paxilina na

região de septo de tecido conjuntivo entre os somitos (Escaleira, 2005),

mostrando sua importância como componente do complexo de adesão célula-

matriz. Vale ressaltar que a paxilina marcou somente a junção miotendinosa de

peixe-zebra adulto, porém a mesma não foi encontrada compondo estruturas

costaméricas, o que era um resultado esperado em comparação a outros

modelos de estudo. Pode-se inferir que este é um achado surpreendente que

talvez seja uma particularidade na constituição do aparato contrátil do peixe-

zebra adulto.

A vinculina foi primeiramente descrita em placas densas de músculo liso

e em zônulas aderentes e epitélio (Geiger et al., 1980) e também em

costâmeros (Pardo et al., 1983). Atualmente é descrita relacionando-se

também com outras proteínas como paxilina, cinase de adesão focal e α5β1

integrina (Quatch & Rando, 2006). Foi vista alteração na forma e alinhamento

de cardiomiócitos de fetos de camundongos por alteração na expressão de

vinculina, mostrando sua importância para o desenvolvimento das miofibrilas

(Shiraishi et al., 1997). Em músculo humano adulto verificaram a colocalização

entre o sistema de proteínas de adesão composto pela vinculina, talina e

integrina com o complexo de proteínas associadas à distrofina, mostrando sua

interação não só estrutural como funcional no intuito de promover forte adesão

entre miofibrilas com o sarcolema (costâmeros) e, consequentemente com a

matriz extracelular (Anastasi et al., 2003). Neste trabalho, a vinculina também

foi encontrada em costâmeros e na junção miotendinosa. Esta última pode ser

comparada à localização da vinculina em embriões de peixe-zebra de 24 hpf, a

qual foi encontrada nos septos entre somitos jovens (Escaleira, 2005).

Vale ressaltar que a distribuição da paxilina no peixe-zebra adulto se

diferencia com relação às demais proteínas costaméricas pesquisadas como a

alfa-actinina e vinculina, visto que a paxilina não está presente em costâmeros

neste animal adulto. Este parece ser um resultado surpreendente, podendo-se

inferir que a paxilina não compõe estruturas costaméricas como acontece em

outros modelos de estudo tanto em embriões como em adultos.

A desmina é uma proteína de filamento intermediário encontrada

especificamente em tecidos musculares. Em músculo estriado esquelético, a

desmina foi descrita localizando-se nos sarcômeros, costâmeros, junção

miotendinosa, junção neuromuscular e em torno de mitocôndrias (Costa et al.,

2004). Em embriões de peixe-zebra de 24 hpf a desmina aparece como

pequenos aglomerados em células mais jovens. Em células mais velhas, a

desmina aparece perfeitamente estriada, além de distribuída em volta do

núcleo (Costa et al., 2002), mostrando que sua distribuição em sítios distintos

vai se estabelecendo ao longo do desenvolvimento do animal. Foi mostrado em

camundongos adultos que a desmina é importante para transmitir força gerada

nas miofibrilas tanto para a superfície muscular quanto para a junção

miotendinosa (Lieber et al., 2002). No presente trabalho, a desmina foi também

encontrada em estruturas costaméricas, mostrando sua importância na

transmissão de força lateral da miofibrila ao sarcolema e, consequentemente, a

matriz extracelular. Porém neste modelo adulto não foi encontrada desmina no

septo entre miofibrilas, diferentemente do que já foi mostrado tanto no embrião

do Xenopus (Cary et al., 1993) como em embriões de peixe-zebra do nosso

laboratório (dado não publicado), onde é vista marcação desta proteína no

septo entre somitos.

Esses resultados do complexo de adesão celula-matriz sugerem que

não houve mudança significativa de distribuição do embrião para o modelo

adulto do peixe-zebra. Após esses resultados, partimos para investigação das

proteínas de matriz extracelular.

Proteínas de matriz extracelular tais como a laminina, fibronectina e o

colágeno compõem arranjos protéicos caracterizados conforme as condições

específicas da constituição do tecido (Quach & Rando, 2006). É bem

documentado que proteínas da matriz extracelular interagem com proteínas

do citoesqueleto por meio de proteínas transmembranas (Geiger et al., 2001;

Spence et al., 2002; Hynes, 2002).

A laminina é um dos maiores componentes da matriz extracelular

presente em membranas basais em músculos estriados, sendo muito

importante na diferenciação muscular (Belkin & Stepp, 2000). Foi encontrada

em miotubos de embriões de ratos após a formação da sinapse e também

após desnervação. Estudos em embriões de peixe-zebra que não expressam

laminina mostram que não há formação da notocorda, pelo fato desta proteína

não estar presente em sua membrana basal (Parsons et al., 2002B). Em

junções miotendinosas de fetos humanos, isoformas de laminina α1 e α5,

foram identificadas por meio de imunocitoquímica, assim como em junções

miotendinosas em humanos adultos não distróficos foi observada a presença

significativa das isoformas de laminina α2 e β2. Entretanto em biópsias de

tecido muscular de pacientes portadores de distrofia muscular não foi

expressiva a presença da laminina α2 no músculo (Domellöf et al., 2000) Em

galinha, a laminina foi também encontrada de forma expressiva compondo a

junção miotendinosa (Swasdison & Mayne,1989). Nesta pesquisa, a laminina

foi identificada em terminações das fibras musculares, correspondendo à

região da junção miotendinosa, possivelmente servindo de ancoragem da fibra

muscular para permitir contrações.

A fibronectina é uma proteína que age como mediadora em uma ampla

variedade de interações celulares com a matriz extracelular, tendo importante

papel na adesão, migração, crescimento e diferenciação celular (Pankov &

Yamada, 2002). Peixe-zebra mutante para fibronectina apresenta alterações na

formação do coração pelo fato dessa proteína ser fundamental na migração de

precursores de células cardíacas, sugerindo que as interações entre célula e

matriz extracelular são importantes na organização epitelial deste animal (Trinh

et al., 2004) e também em embriões de galinha (Danen & Yamada, 2001).

Alguns estudos demonstraram que camundongos mutantes e incapazes de

expressar fibronectina morrem em estágios iniciais da embriogênese, pois as

células endoteliais falham na vasculogênese, cujos defeitos resultam de

anormalidades nas interações dessas células com a matriz (Schwarzbauer &

Sechi, 1999). Nesse trabalho foi possível evidenciar a presença desta proteína

próxima ao septo, mostrando a grande importância da fibronectina na

associação das miofibrilas a este na composição da junção miotendinosa no

peixe-zebra adulto. Como visto em experimentos com embriões de 48 hpf

(Escaleira, 2005), a fibronectina está presente em regiões de junções

intersomitos, nos septos, mostrando seu envolvimento em contato célula-

substrato desde estágios iniciais na formação do peixe-zebra.

Tanto a laminina quanto a fibronectina foram descritas como proteínas

associadas aos costâmeros (Ervasti, 2003). Porém as mesmas não foram

identificadas em costâmeros no músculo esquelético do peixe-zebra adulto.

Nesse trabalho foram feitas diversas marcações com anticorpo anti-

colágeno IV, seguido de anticorpo secundário associado à rodamina, porém

em nenhum experimento houve marcação no septo entre miofibrilas. Acredita-

se que a qualidade desse anticorpo utilizado não seja satisfatória, visto que

outros experimentos feitos no mesmo laboratório, utilizando tanto embrião de

peixe-zebra como de galinha, não obtiveram êxito nas marcações de colágeno

IV. Sendo assim, foram aplicadas técnicas que permitiram a detecção de

colágeno, provavelmente do tipo I no peixe-zebra adulto, tais como: coloração

pela técnica de picrosírius, observação do tecido por microscopia de

polarização e por microscopia eletrônica de transmissão.

Identificamos fibras de colágeno no septo do peixe-zebra adulto

coradas em vermelho pela técnica de picrosírius. Também foi obtida imagem

por meio de microscopia de polarização, o que permitiu observar o septo entre

miofibrilas com aspecto luminoso, provavelmente devido à birrefrigência do

colágeno. Beffa et al. (2003) identificaram, tanto por coloração de picrosírius,

quanto por imunocitoquímica, a presença do colágeno em musculatura

subepitelial em teleósteos, evidenciando sua grande proliferação pós-injúria

da nadadeira. O colágeno está presente no peixe-zebra compondo o septo,

sendo uma estrutura semelhante ao tendão de mamíferos (Kudo, 2004).

Camundongos que não expressam colágeno apresentam retardo do

desenvolvimento, além de marcação ausente desta proteína na membrana

basal vistas tanto por imunoflourescência quanto por imunomarcações em

microscopia eletrônica (Holster et al., 2007).

Septos musculares são constituídos por tecido conjuntivo e estão

presentes entre miofibrilas do peixe-zebra, podendo ser visto sobre a forma de

chevron, ou seja, em “V” (Henry, et al., 2005; Koudijs et al., 2005). Vale

ressaltar que não há diferenças estruturais entre a junção miotendinosa e o

septo em embrião do peixe-zebra (Escaleira, 2005). Não só neste embrião

como em outros modelos, o septo representa a área de tecido conjuntivo entre

somitos já denominado como “junção intersomitos” (Bonfanti et al., 2004) ou

“bandeamento intersomitos” (Nixon et al., 2007). No embrião do peixe-zebra o

septo já foi comparado ao tendão de mamíferos sendo denominado “miosepto”

(Kudo et al., 2004). Porém no peixe-zebra adulto observamos distinção entre

junção miotendinosa e septo, visto que há diferença na distribuição de

proteínas que aqui foram vistas estando localizadas ora na junção

miotendinosa, ora no septo, ou seja, as proteínas laminina e fibronectina estão

distribuídas somente na junção miotendinosa no peixe-zebra adulto, mas não

foram encontradas no septo como encontrado em embriões de peixe-zebra,

sendo que diferenças morfológicas entre junção miotendinosa e tendão foram

mostradas em humanos (Williams et al., 1995). Deste modo, pode-se inferir

que o septo do peixe-zebra adulto é uma estrutura análoga ao tendão de

humanos que é composto principalmente por fibras de colágeno do tipo I (86-

90%), proteoglicanas (1-5%), elastina (2%) e outras proteínas incluindo

colágenas VI, XII e XIV (3 %), sendo água responsável por 60-80% do peso

líquido total do tendão (Lin et al., 2004). A laminina e a fibronectina estão

especialmente presentes na junção miotendinosa (Swasdison & Mayne,1989).

Detalhes interessantes do septo foram bem evidenciados por

microscopia eletrônica de transmissão, onde verificamos estruturas

compatíveis com fibras de colágeno em corte transversal e longitudinal.

Também foi observada a presença de fibroblasto adjacente ao septo. Estes

poderiam ser confundidos com células satélites, mas isso não é provável, pois

células satélites são caracterizadas pela presença de heterocromatina

condensada típica de células quiescentes (Goldring et al., 2002), pela

ocupação periférica na miofibrila (Shi et al., 2006), intercalada à lâmina basal e

ao sarcolema, bem como pela ausência de organelas no seu citoplasma

(Foschini et al., 2004).

Nesse trabalho, foi possível analisar estruturas importantes na

morfologia do peixe, usando proteínas típicas de cada estrutura. Nós

comparamos a distribuição destas proteínas nas seguintes regiões associadas

às fibras musculares: o sarcolema, os costâmeros, a junção miotendinosa e o

septo.

Foram encontradas no sarcolema proteínas de adesão célula-célula, a

caderina e da β-catenina. Em associação ao sarcolema foi identificada a

proteína alfa-actinina. Em costâmeros, foram identificadas as proteínas alfa-

actinina, vinculina e desmina. Outro local marcado foi a junção miotendinosa

que equivale a região de união de miofibrilas ao septo. Neste local vistas

estruturas de matriz extracelular como laminina e fibronectina, bem como uma

proteína mais diretamente ligada ao citoesqueleto de actina, a paxilina. No

septo entre miofibrilas foi identificado o colágeno.

VI – CONCLUSÕES:

1. O protocolo de congelamento do tecido muscular permitiu observar

histologicamente a organização geral da fibra muscular esquelética do

peixe-zebra com qualidade da preservação do tecido, que pode ser

comprovada pela presença da periodicidade

2. O tratamento químico o cloreto de amônio 50mM eliminou a

autofluorescência no canal da rodamina e do DAPI.

3. As proteínas de adesão célula-célula, caderina e a β-catenina estão

presentes no sarcolema do tecido muscular do peixe-zebra adulto.

4. Proteínas envolvidas na adesão célula-matriz como a alfa-actinina, situa-

se no sarcolema do tecido muscular e em costâmeros, enquanto que a

paxilina está presente na junção miotendinosa, juntamente com a

vinculina que também se encontra em costâmeros.

5. A proteína de filamento intermediário desmina está presente em

costâmeros.

6. As proteínas de matriz extracelular, fibronectina e laminina estão

presentes em junções miotendinosas. Fibras de colágeno foram

observadas no septo entre miofibrilas do peixe-zebra adulto.

VII – PERSPECTIVAS

1. Análise ultraestrutural da distribuição de proteínas de adesão e matriz

extracelular do tecido muscular do peixe-zebra adulto.

2. Análise ultraestrutural da distribuição de proteínas de adesão e matriz

extracelular do tecido muscular do embrião do peixe-zebra.

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