( PDF ) Análise bioquímica e equilíbrio ácido-base em Biomphalaria glabrata (Say, 1818), hospedeiro intermediário do Schistosoma mansoni (Sambom, 1907), sob a exposição ao Stryphnodendron polyphyllum

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

CIRLANE SILVA FERREIRA

Análise bioquímica e equilíbrio ácido-base em Biomphalaria glabrata

(Say, 1818), hospedeiro intermediário do Schistosoma mansoni

(Sambon, 1907), sob a exposição ao Stryphnodendron polyphyllum

(Martius, 1837), planta moluscicida do Cerrado brasileiro.

Orientador:

Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra.

Dissertação de Mestrado

Goiânia-Goiás, 2006.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

CIRLANE SILVA FERREIRA

Análise bioquímica e equilíbrio ácido-base em Biomphalaria glabrata

(Say, 1818), hospedeiro intermediário do Schistosoma mansoni

(Sambon, 1907), sob a exposição ao Stryphnodendron polyphyllum

(Martius, 1837), planta moluscicida do Cerrado brasileiro.

Orientador:

Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra.

Dissertação de Mestrado submetida ao PPGMT/IPTSP/UFG como

requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre na área de Concentração

de Parasitologia.

Goiânia-Goiás, 2006.

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DEDICATÓRIA

Ao meu querido marido, Carlos Roberto Ferreira, pela

dedicação, incentivo e pelo apoio nos momentos difíceis durante a realização

deste trabalho.

Ao meu filho Renato Silva Ferreira, razão de minha existência,

dedico este trabalho.

Cirlane Silva Ferreira

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus por me proporcionar inteligência e sabedoria nesta longa

caminhada de aprendizado e vitórias.

Ao Professor Dr. José Clecildo Barreto Bezerra, professor adjunto do

departamento de parasitologia, IPTSP/UFG, minha gratidão pela

oportunidade, confiança, incentivo e orientação deste trabalho.

Ao meu marido, Carlos Roberto Ferreira, pelo companheirismo, pela

atenção, compreensão e principalmente pelo amor demonstrado durante

toda esta trajetória.

Ao meu filho, Renato Silva Ferreira, pelas demonstrações de carinho

nas horas difíceis.

Aos meus pais, Gaspar Silva e Aida Maria da Silva pela oportunidade

de estudo e apoio dispensado neste sentido.

Ao meu sogro Oscar Cardoso Ferreira e minha sogra Dolores Moreira

Ferreira, pela disposição em ajudar sempre.

Aos queridos amigos Francisco Gilson Montenegro, Laís Rocha

Montenegro, Ricardo Wagner de Oliveira e Rosana Evangelista Pinto de

Oliveira, a minha eterna gratidão por ajudar-me a dar os primeiros passos

nesta caminhada.

À Darcy Arruda Villela, chefe do setor de Análises Clínicas do Hospital

de Urgências de Goiânia, pela contribuição inestimável e por tanta

compreensão durante a realização desta titulação.

Às amigas Marina Clare Vinaud e Josireny Mariano Mendes que

contribuíram para o fortalecimento e engrandecimento deste trabalho.

Cirlane Silva Ferreira

Aos amigos, colegas do mestrado, técnicos e funcionários do

IPTSP/UFG pela colaboração na realização deste trabalho.

E a todos que mesmo não citados aqui contribuíram, diretamente ou

indiretamente, possibilitando a realização deste trabalho, os meus sinceros

agradecimentos.

Cirlane Silva Ferreira

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................. - vii-

ABSTRACT .............................................................................. - ix-

LISTA DE FIGURAS ................................................................. - xi -

LISTA DE TABELAS................................................................. - xiii -

LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................... - xiv -

INTRODUÇÃO ......................................................................... -1-

1. A Esquistossomose e o molusco Biomphalaria glabrata . -1-

2. Controle da esquistossomose ........................................ -7-

3. Controle com produtos naturais. .................................. -11-

4. Metabolismo de B. glabrata.................................................

4.1) Equilíbrio ácido-basico e do pH.................................

4.2) Metabolismo da Glicose..............................................

4.3) Metabolismo de Aminoácidos......................................

4.4) Metabolismo do Cálcio.................................................

-14-

-16-

-18-

-20-

-22-

JUSTIFICATIVA ....................................................................... -24-

OBJETIVOS............................................................................. -26-

ARTIGO 1. Análise do Equilíbrio Ácido-Base em Biomphalaria

glabrata (Say, 1818), sob exposição a Stryphnodendron

polyphyllum

(

Martius, 1837

)

, planta moluscicida do Cerrado

brasileiro....................................................................................... -27-

ARTIGO 2 - Análise do metabolismo de proteínas, da via glicolítica

e da fosforilação oxidativa de Biomphalaria glabrata

(

Say, 1818

)

sob ação do extrato da planta do Cerrado brasileiro

Cirlane Silva Ferreira

Stryphnodendron polyphyllum (Martius, 1837)............................. -43-

CONCLUSÕES FINAIS ............................................................. -68-

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................... -70-

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................ -72-

ANEXOS.................................................................................. -87-

Cirlane Silva Ferreira

vii

RESUMO

O Estado de Goiás representa uma área de alto risco ao

estabelecimento da esquistossomose. A presença do hospedeiro

intermediário, Biomphalaria sp, somada à elevada migração de pessoas

oriundas de regiões endêmicas do país são fatores que favorecem a

instalação do ciclo desta doença. Há, no Estado de Goiás, relatos de casos

com alta intensidade parasitária, e até mesmo um caso com paraplegia

associada a esquistossomose. O Stryphnodendron polyphyllum (Martius,

1837) conhecido como “Barbatimão de Folha Pequena” é relatado como

planta moluscicida. Neste trabalho, avaliou-se a atividade de extratos brutos

da casca do caule de S. polyphyllum sobre o metabolismo e o equilíbrio

ácido-base do B. glabrata. Os moluscos foram expostos ao extrato por 24

horas, nas concentrações de 25 e 50 mg/L, e comparados com um grupo

controle. Foram avaliadas as concentrações de glicose, cálcio, uréia,

proteínas e atividade das enzimas lactato desidrogenase e aminotransferases

pelo método de espectrofotometria. Os ácidos orgânicos citrato, propionato,

α-cetoglutarato, succinato, acetato, malato, fumarato, piruvato e lactato

foram dosados pelo método da cromatografia líquida. Dos ácidos orgânicos

encontrados na hemolinfa apenas o citrato e o propionato tiveram uma

alteração significativa. O equilíbrio ácido-base foi verificado pela medida das

concentrações de pH, oxigênio, gás carbônico, íons carbonatos e saturação

de oxigênio através de equipamento Radiomiter.

Cirlane Silva Ferreira

viii

O extrato de S. polyphyllum testado demonstrou ação efetiva,

observada pelo estabelecimento de toxicidade celular sobre B. glabrata. (Say,

1818). As alterações apresentadas nas dosagens bioquímicas refletem os

distúrbios metabólicos ocorridos na hemolinfa deste molusco. A interferência

deste extrato fez com que os níveis de glicose, uréia, cálcio, aspartato,

alanina aminotransferases e pressão de gás carbônico se elevassem,

enquanto que os níveis de lactato desidrogenase, pH, pressão de oxigênio,

íons carbonato e saturação de oxigênio diminuíram.

Este trabalho confirma a bioatividade do extrato aquoso de S.

polyphyllum sobre o B. glabrata. Uma das principais contribuições desse

estudo desenvolvido é a observação pós-contato direto com o extrato que

demonstrou uma bioatividade sobre o metabolismo do molusco. A análise de

extrato aquoso obtido do caule do barbatimão pode subsidiar nova

alternativa de menor toxicidade e menor custo financeiro no controle da

esquistossomose no Brasil, onde o Cerrado é vasto e a carência de recursos é

freqüente no setor da saúde.

Palavras Chaves: Biomphalaria glabrata, Cerrado, CLAE, controle,

equilíbrio ácido-base, metabolismo, Schistosoma mansoni, Stryphnodendron

polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

ABSTRACT

The state of Goiás represents a high risk to schistosomiasis stablishment

area. The presence of the intermediate host, Biomphalaria sp, added to high

migration levels of people from endemic regions of the country; are evidences

that favour the installation of this disease life cycle. In this state of Goiás,

there are reports of high parasitary intensity and even cases of paraplegia

associated with schistosomiasis. The Stryphnodendron polyphyllum (Martius,

1837) known locally as “Barbatimão de folha pequena”, is reported as a

molluscicide plant. This paper assesses the activity of gross bark extracts

from S. polyphyllum on the metabolism and on the acid-alkaline balance of

B. glabrata. The mollusks were exposed to the extract at 25 and 50 mg/L

concentrations for 24 hours and compared to a control group. The

concentrations of glucose, calcium, urea, proteins and the activity of the

following enzymes: dehydrogenases lactate and aminotransferases were

estimated using the spectrophotometry method. The organic acids citrate,

propionate, α- cetoglutarate, succinate, acetate, malate, fumarate, pyruvate

and lactate were detected and quantified using the liquid chromatography

method. Of all the organic acids found in the hemolymph, only citrate and

propionate presented a significant alteration. The acid-alkaline balance was

verified by measuring the concentrations found in the pH, oxygen, carbonic

gas, carbonate ions and oxygen saturation using Radiomiter equipment.

The S. polyphyllum extract tested proved effective due to celular toxicity

on B. glabrata.(Say 1818). Alterations verified in the biochemical dosages

reflect the metabolic disturbances in the hemolymph of the mollusk. The

Cirlane Silva Ferreira

extract interference caused an increase in the levels of glucose, urea,

calcium, aspartate, alanine aminotransferases and carbonic gas pressure,

simultaneously causing a decrease in the levels of lactate dehydrogenase,

pH, oxygen pressure, carbonate ions and oxygen saturation.

This study confirms the bioactivity of the S. polyphyllum aqueous extract

on B.glabrata. One of the main contributions of the methodology used is that

it enabled observation after direct contact with the extract that proved

bioactivity on the metabolism of the mollusk. The analysis of the aqueous

extract taken from the bark of the “barbatimão” may be the basis for new

and less toxic, as well as less costly alternative for the control of

schistosomiasis in Brazil, where the savannah is vast and financial

resources are often scarce in the health sector.

Key words: acid-alkaline balance, Biomphalaria glabrata, control,

HPLC, metabolism, savannah, Schistosoma mansoni, Stryphnodendron

polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Figura 1. Ciclo biológico de Schistosoma mansoni .......

- 5 -

Figura 2 - Metabolismo da via glicolítica e dos aminoácidos ........

-22-

Figura 3 – a

)

Taxas de pH, b

)

concentrações de íons carbonatos, c

)

pressão parcial de gás oxigênio e gás carbônico,d

)

saturação de

oxigênio na hemolinfa de Biomphalaria glabrata

expostos ao

extrato de caule de Stryphnodendron polyphyllum, nas

concentrações de 25 e 50 mg/L..............................................

- 37 -

Figura 4 – Efeitos do extrato de Stryphnodendron polyphyllum no

equilíbrio ácido-base do Biomphalaria glabrata............................

- 38 -

Figura 5 – Representa o dióxido de carbono produzido pelo

metabolismo, a sua pequena dissociação em íons e o equilíbrio

sob a forma de CO

dissolvido e água..........................................

- 39 -

Figura 6 - Representa o pH na acidose e na alcalose. Demonstra

também os limites de tolerância do organismo aos desvios de pH.

- 41 -

Figura 7 – Taxas de glicose e cálcio na hemolinfa de Biomphalaria

glabrata exposto ao extrato do caule de Str

phnodendron

polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50

mg/L............................................................................................

- 54 -

Figura 8- Taxas de uréia e proteínas na hemolinfa de

Biomphalaria glabrata exposto ao extrato do caule de

Stryphnodendron polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50

Cirlane Silva Ferreira

xii

mg/L............................................................................................

- 55 -

Figura 9 – Taxas da atividade enzimática na hemolinfa de

Biomphalaria glabrata exposto ao extrato do caule de

Stryphnodendron polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50

mg/L..................................................................................................

- 57-

Figura 10. Esquema resumido da produção de ácidos orgânicos

- 65 -

Cirlane Silva Ferreira

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Análise do equilíbrio ácido-base na hemolinfa de

Biomphalaria glabrata expostos ao extrato do caule de

Stryphnodendron polyphyllum, nas concentrações de 25 e

50mg/L valor em média±desvio padrão ou mediana (mínimo -

máximo)..................................................................................

- 36 -

Tabela 2. Análise bioquímica da hemolinfa de Biomphalaria

glabrata expostos ao extrato do caule de Str

phnodendron

polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50mg/L valor em

média±desvio padrão ou mediana (mínimo -

máximo).....................................................................................

- 53 -

Tabela 3. Média e Mediana da concentração

(

mmol/L

)

de ácidos

orgânicos presentes na hemolinfa de Biomphalaria glabrata,

grupo controle e o grupo teste exposto a 25 e 50 mg/L do extrato

de Stryphnodendron polyphyllum ................................................

- 59 -

Cirlane Silva Ferreira

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

ADP – Adenosina di-fosfato

ALT – Alanina aminotransferase

AST – Aspartato aminotransferase

ATP – Adenosina tri-fosfato

BH – Belo Horizonte

cAMP – Adenosina-5`-monofosfato cíclico

CFX – Clesosulfontaleina

CLAE – Cromatografia líquida de alta performance

IFCC – Federação Internacional de Química Clínica

IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

LDH – Lactato desidrogenase

mmol/L – milimol por litro

NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo

PFK – Fosfofrutoquinase

pH – Potencial hidrogeniônico

mg/L – Partes por milhão

SUCAM - Superintendência de Campanhas de Saúde Pública

SFBC – Sociedade Francesa de Biologia Clínica

UFG – Universidade Federal de Goiás

U/L – Unidades internacionais por litro

UVAA – Ultravioleta para analisador automático

Cirlane Silva Ferreira

INTRODUÇÃO

1) A Esquistossomose e o molusco Biomphalaria glabrata

Exames em múmias do antigo Egito revelaram lesões produzidas pela

doença esquistossomose conhecida desde a antiguidade. Em 1852, o médico

alemão, Theodor Bilharz descobriu o verme causador desta doença, o

trematódeo do gênero Schistosoma. Atualmente registra-se a existência de

cinco espécies dentro deste gênero, que causam a doença ao homem:

Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonicum, S. intercalatum e S.

mekongi. No Brasil, a transmissão da doença teve início com a chegada dos

escravos africanos. Em 1951, Pirajá da Silva relata os primeiros casos.

(SUCEN 2001).

O agente causador da esquistossomose, no Brasil, é o trematódeo

digenético S. mansoni. Os vermes adultos vivem dentro de pequenas veias do

intestino posterior e do fígado do homem doente; alcançam até 12 mm de

comprimento por 0,44 mm de diâmetro. A manutenção do ciclo de vida deste

parasito é pela presença de espécies do molusco aquático do gênero

Biomphalaria, hospedeiro intermediário. Das várias espécies de moluscos

existentes no Brasil, três mostraram-se capazes de infectar-se com o S.

mansoni, Biomphalaria tenagophila, B. glabrata e B. straminea (Rey 1991).

Em vista da prevalência, morbidade e mortalidade, essa doença é um

sério problema de saúde pública no Brasil, ocorrendo do norte ao centro sul

do país (Mendes et al. 1999; Katz, Peixoto 2000).

O Estado de Goiás representa uma área de alto risco ao

estabelecimento da esquistossomose. A presença do hospedeiro

Cirlane Silva Ferreira

intermediário, Biomphalaria sp, somada à elevada imigração de pessoas

oriundas de regiões endêmicas do país são fatores que favorecem a

instalação do ciclo desta doença. A transmissão da esquistossomose é

limitada ao município de Padre Bernardo. A prevalência em 2002 foi de

1,86%. A média anual de internação por esquistossomose, no período de

1999 a 2003, foi de sete e taxa de 0,19/10 mil internações. O número médio

de óbitos, no período de 1998 a 2002 foi de três com taxa de mortalidade de

0,06/100 mil habitantes. As internações e óbitos são de pacientes de outros

estados (Ministério da Saúde 2005).Há, no Estado, relatos de casos com alta

intensidade parasitária, e até mesmo um caso com paraplegia associada a

esquistossomose. (Bezerra et al. 1996).

Vale ressaltar que é indispensável o tratamento dos pacientes com

infecção. Na atualidade conta-se com dois medicamentos, apenas, para o

tratamento corrente da esquistossomose mansônica: oxamniquine e

praziquantel. Os medicamentos são geralmente inativos contra as formas

larvárias (esquistossômulos), de modo que, em pacientes reinfectados pouco

antes do tratamento existe a possibilidade de tais formas juvenis escaparem

ao efeito terapêutico e transformarem-se, depois, em vermes adultos,

reiniciando a eliminação de ovos nas fezes (Rey 1991).

No entanto, no período de tratamento, o ciclo infeccioso não se

interrompe totalmente e, conseqüentemente, a resistência do parasito aos

agentes quimioterápicos pode agravar o problema. O tratamento pela

oxamniquine pode selecionar linhagens de S. mansoni resistentes a essa

droga. A resistência dos helmintos comporta-se como um caráter mendeliano

recessivo e parece depender da falta de produção de uma enzima que

Cirlane Silva Ferreira

converta a oxamniquine em um metabólito ativo. Assim, em pacientes que

tendo recebido a medicação correta não se curaram, é conveniente refazer o

tratamento com outra droga (Rey 1991). Desse modo, são necessárias ações

que possam contribuir para interromper o ciclo de vida de S. mansoni e,

assim, controlar a esquistossomose.

Além do tratamento das pessoas infectadas, uma das maneiras mais

eficientes e rápidas de redução da transmissão da esquistossomose é a

interrupção do ciclo de vida do parasito por meio do combate aos moluscos

com o uso de moluscicidas, prevenindo dessa maneira a infecção humana

(Souza et al. 1997).

O S. mansoni desenvolve sua fase adulta como parasito na luz dos

vasos sanguíneos do homem e de outros mamíferos, habitando

preferencialmente as vênulas do plexo hemorroidárias superior e as

ramificações mais finas das veias mesentéricas, particularmente da

mesentérica inferior, onde põe seus ovos. Depois de atravessarem a parede

intestinal, os ovos, que apresentam um espinho lateral, são eliminados com

as fezes. Quando chegam às águas superficiais, liberam seus miracídios, que

nadam durante horas até encontrarem os moluscos do gênero Biomphalaria.

Penetrando nos tecidos do molusco, os miracídios transformam-se em

esporocistos que, por poliembrionia, geram esporocistos filhos e depois

cercárias. Várias gerações de esporocistos podem suceder-se, todas,

produzindo, por algum tempo, cercárias. Estas abandonam o hospedeiro

intermediário e nadam ativamente, quase sempre em direção à superfície,

até encontrarem o hospedeiro definitivo, o homem ou outro mamífero

susceptível. Penetram na sua pele, onde logo se transformam em

Cirlane Silva Ferreira

esquistossômulos. Os parasitos que não são destruídos na pele ganham a

circulação sanguínea e chegam no coração, depois nos pulmões (onde

também podem ser retidos e destruídos) e, em seguida, no fígado. Quando

chegam no sistema porta hepático, os esquistossômulos desenvolvem-se e

alcançam a fase adulta (Fig.1). Os vermes adultos acasalam-se e migram

para as vênulas da parede intestinal, migrando contra a corrente sanguínea

pela veia porta e veias mesentéricas (Rey 1991).

Cirlane Silva Ferreira

Miracídio

Adultos

OVO

Cercária

Figura 1. Ciclo biológico de Schistosoma mansoni (Bezerra et al 1997).

Na maioria das vezes, a infecção humana por S. mansoni costuma ser

assintomática ou oligossintomática; mas ela pode produzir alterações

anatomotológicas cujo caráter e gravidade cobre extensa gama de situações,

o que imprime a essa doença grande polimorfismo e, em muitos casos,

prognóstico incerto (Rey 1991). Aquelas com sintomas podem apresentar

uma fase aguda e outra crônica.

A fase aguda geralmente só é percebida em pessoas de área não

endêmica e depende do número de cercárias infectantes. Inicialmente, surge

uma coceira e vermelhidão no local de penetração da cercária, a dermatite

cecariana. Pode aparecer febre, suores frios, dor de cabeça, dores

musculares, cansaço, perda de apetite, emagrecimento, tosse, dores

Cirlane Silva Ferreira

abdominais. Algumas pessoas relatam enjôos e vômitos. O fígado fica um

pouco aumentado e doloroso à palpação.

A fase crônica pode se manifestar de três formas: intestinal, hepato-

intestinal e hepato-esplênica. Na primeira forma, a diarréia é o sintoma mais

comum. Pode acontecer perda de apetite, cansaço e abdome doloroso à

palpação. Na forma hepato-intestinal os sintomas são os mesmos, porém,

mais acentuados, hepatoesplenomegalia. A forma hepato-esplênica tem este

nome devido a lesões no fígado e baço na qual o indivíduo queixa-se de

tumor no abdome, já que o fígado e baço estão muito aumentados de

volume. A lesão no fígado leva ao aparecimento de varizes no esôfago, e como

sintomas vômitos e sangue nas fezes. Pode ocorrer aumento do tamanho do

abdome, com presença de líquido (ascite). Esta forma aparece nas áreas de

maior incidência como Nordeste e Minas Gerais (SUCEN 2001).

O B. glabrata, está comumente associado à vasta distribuição e à alta

morbidade da esquistossomose mansônica no Brasil, advindo, desse fato,

sua grande importância em saúde pública (Rey 1993). O molusco,

hospedeiro intermediário, tem papel crucial no desenvolvimento desta

parasitose, pois é um elemento obrigatório no ciclo. Ou seja, podemos dizer

que se num local encontramos exemplares do molusco e a presença de

somente um paciente liberando ovos viáveis, associados às condições

inadequadas de saneamento básico, ali poderá se estabelecer um novo foco

de doença, tal é sua importância (Moyou-Somo et al. 2003).

O homem parece constituir, em geral, o único reservatório importante

do S. mansoni. Nesse particular difere do S. japonicum que admite grande

número de mamíferos como hospedeiros vertebrados ou que, na variedade

Cirlane Silva Ferreira

existente em Taiwan (China), só se desenvolve em hospedeiros não

humanos, principalmente o cão (Rey 1991).

O S. mansoni tem comportamento intermediário entre os de S.

haematobium e de S. japonicum. Em condições naturais infecta marsupiais,

desdentados, roedores, artiodátilos, canídeos, primatas e bovinos. Dos

roedores, destaca-se pelas taxas elevadas de infecção o rato-lava-pés

(Nectomys squamipes), o rato-de-cana (Holochilus sciureus) e o rato-porco

(Oxymycterus angulares), que apresentam ampla distribuição geográfica no

Brasil, e vivem próximo das coleções líquidas, nos vales, canaviais e

capinzais(Rey 1991)

2) Controle da esquistossomose

O S. mansoni tem no homem seu principal hospedeiro definitivo e as

modificações ambientais produzidas pela atividade humana favorecem a

proliferação dos caramujos transmissores. O Programa de Controle de

Esquistossomose Mansônica, no Ministério da Saúde, tem como linhas

mestras o diagnóstico e o tratamento quimioterápico com busca de novos

casos. A vigilância epidemiológica é fundamentada na busca passiva de

casos por meio de sensos coproscópicos direcionados à população de risco. É

uma doença tipicamente condicionada pelo padrão sócio-econômico precário

que atinge a maioria da população brasileira. É importante salientar que

cada foco de transmissão tem suas peculiaridades e que a estratégia de

controle deve levar em consideração estas características. Assim, em

pequenos focos, restritos às vezes a uma única coleção aquática, o

aterramento ou canalização deste criadouro pode resultar na extinção do

foco (Amaral, Porto 1994).

Cirlane Silva Ferreira

Além disso, devem ser tomadas medidas profiláticas para que novos

casos não apareçam na região. Entre elas podemos citar: tratamento dos

doentes, saneamento básico, combate dos caramujos transmissores e

educação sanitária da população (Amaral, Porto 1994).

Tem sido feito um grande esforço para evitar o contato do homem com

águas contaminadas, porém este é feito, por motivos de necessidades

trabalhistas, envolvendo lavadeiras, pescadores, trabalhadores em

plantações de arroz, e de lazer como crianças que se banham em lagos e rios

contaminados. Em tais situações deve-se fazer um trabalho de educação da

população, conscientizando-a do problema, além de melhorar as condições

sanitárias locais, afastando os indivíduos das águas que contém caramujos.

A construção de banheiros adequados nas habitações, tanques públicos

para a lavagem das roupas, piscinas públicas destinadas ao lazer das

crianças, rede de abastecimento de água e esgoto são algumas das medidas

indicadas (Schall 1995, Moza et al. 1998).

Para o controle da esquistossomose, devem ser considerados fatores

epidemiológicos, tratamento de casos positivos, combate ao hospedeiro

intermediário, educação sanitária e saneamento básico. Para obter-se um

moluscicida ideal, esse deve ser letal para qualquer estágio de vida do

molusco, ser de fácil estocagem, apresentar baixo custo, ser seguro para o

aplicador, ser efetivo em baixas concentrações. Poucos produtos sintéticos

usados atualmente apresentam estes requisitos, e o mais recomendado para

aplicação em grande escala, pela Organização Mundial de Saúde no controle

da esquistossomose é a niclosamida (Bayluscide

) (Who 1993, Souza et al.

1997).Esta droga destaca-se por sua alta toxicidade para os moluscos, tem

Cirlane Silva Ferreira

atividade letal de 100% na concentração 1 mg/litro. Os inconvenientes da

droga são seu custo elevado e toxicidade para peixes e pequenos animais.

Nas últimas décadas tem-se constatado o envolvimento de muitos

pesquisadores na busca de novos compostos de plantas que possuam estas

propriedades (Mendes et al. 1999).

Recomenda-se que o controle dessa endemia seja baseado em medidas

integradas entre o progresso tecnológico e a agricultura moderna. O combate

aos hospedeiros intermediários é considerado imprescindível, destacando-se,

para esse fim, o uso de medidas ambientais, tais como abastecimento de

água tratada, as instalações sanitárias e o tratamento dos esgotos

sanitários, ou seu destino adequado, sendo estas as mais importantes em

saúde pública (WHO 1998). Entretanto, a eficácia do controle depende dos

conhecimentos sobre a ecologia desses moluscos, a composição do habitat,

condições gerais e sobre seu papel na situação epidemiológica local (Madsen

1992).

Dentre as atividades de controle de esquistossomose, destaca-se a

quimioterapia com oxamniquina, em pacientes com a doença, administrado

por via oral, é absorvido prontamente e age sobre as formas adultas do

parasito, realizada pelas Unidades de Saúde e eventualmente pela SUCAM. A

aplicação de moluscicidas em coleções hídrica com planorbídeos infectados

mata os moluscos adultos e destroem as desovas e as formas larvais do

Schistosoma. As ações educativas têm assumido papel complementar no

programa (SUCEN 1989). As drogas administradas aos pacientes até o

presente momento reduzem a morbidade, mas não controlam a transmissão

Cirlane Silva Ferreira

da doença, pois não imunizam o paciente, além de provocarem na maioria

das vezes, reações colaterais desagradáveis (Mendonça 2003).

Em busca de novas drogas no controle dos moluscos hospedeiros

intermediários da esquistossomose, as plantas são sempre lembradas como

fontes alternativas. Apesar do aumento de estudo nessa área, os dados

disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas brasileiras foram

estudadas quanto ao seu potencial medicinal (Soeyarto 1996).

O controle da população dos moluscos hospedeiros intermediários B.

glabrata tem sido feito com moluscicidas sintéticos que trazem danos ao

ecossistema por não terem especificidade de seu alvo, atingindo não só o

molusco, mas também o plâncton, e animais que dependem, dele, criando,

muitas vezes, desequilíbrio na cadeia trófica (Mendonça 2003).

Nos últimos anos tem-se verificado um grande avanço científico,

envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que

visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas (Filho,Yunes

1998) e embora as drogas sintéticas constituam maioria nas farmácias

caseiras, os medicamentos à base de plantas, vêm ganhando um espaço

cada vez maior no combate e tratamento de diversas doenças, entre elas a

esquistossomose(Wink 1990). Planta de uso medicinal de família

Euphorbiacae, a Euphorbia milii, foi amplamente testada contra miracídios e

cecárias de S. mansoni apresentando atividade na concentração de 100

mg/L (Carvalho et al. 1998).

3) Controle com produtos naturais

Cirlane Silva Ferreira

Moluscicidas extraídos de plantas vêm sendo pesquisados no combate

aos moluscos dos gêneros Biomphalaria, Bulinus e Oncomelania, diretamente

implicados na transmissão do S. mansoni, S. haematobium e S. japonicum,

respectivamente (Marston, Hostettmann 1985, Whitfield 1996).

Fatores econômicos e ecológicos estimulam a descoberta de

moluscicidas vegetais com ação seletiva, biodegradável, de baixo custo e de

fácil aplicação nos criadouros naturais (Who 1983). Moluscicidas sintéticos

são onerosos e ainda podem levar a problemas de toxicidade para

organismos não-alvos. A niclosamida (Bayluscide

) tem sido por quatro

décadas, o moluscicida sintético recomendado pela Organização Mundial de

Saúde, para a aplicação em grande escala no controle desta parasitose,

porém não apresenta os requisitos desejados, entre eles baixo custo, baixa

toxicidade para peixes e pequenos animais, ser seguro para o aplicador,

entre outros, como os citados para aqueles provenientes de produtos

naturais (WHO 1993).

Extratos brutos obtidos de diversas partes de plantas de espécies da

família Clusiaceae, como Calophyllum verticillatum, C. inophyllum e C.

recedens apresentam atividade moluscicida com 20% de mortalidade dos

moluscos B. glabrata na concentração de 100 mg/L para a primeira espécie

e 10 mg/L para as outras duas (Ravelonjato et al. 1987).

Plantas do gênero Kielmeyera, conhecidas como rosa do campo,

pertencentes à família das Clusiaceae e encontrada no cerrado brasileiro,

têm sido usadas pela população para o tratamento de diversas doenças,

como esquistossomose, leishmaniose, malária, infecção por bactérias e

fungos, entre outras (Alves et al.2000). A osajaxantona isolada da espécie

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Kielmeyera coriacea exibe proteção contra a infecção das cercárias do S.

mansoni, quando aplicada na pele de animais (Lopes et al. 1976).

A utilização de substâncias moluscicidas é um fator crucial para o

controle da esquistossomose. Em países do Terceiro Mundo o uso de

moluscicidas sintéticos tem causado problemas de toxicidade, contaminação

do meio ambiente e a resistência dos caramujos (B. glabrata) transmissores

da esquistossomose. Em contraste, o uso de plantas com atividade

moluscicida pode representar uma alternativa barata (Marston, Hostettmann

1985).

O mecanismo de ação dos moluscicidas contendo polifenois vegetais,

ainda é pouco conhecido. O que se tem estabelecido, geralmente, é a

bioatividade e o índice de mortalidade que estes produtos podem determinar,

existindo dessa forma uma escassez de informações com respeito aos

princípios ativos e mecanismos de ação dos moluscicidas naturais. Apesar

dos taninos serem a classe individual de fenóis vegetais mais estudadas em

ecologia química, o esclarecimento do modo de ação sobre os moluscos,

hospedeiro intermediário de S. mansoni ainda é objetivo de estudos (Alcanfor

2001).

O reconhecimento da bioatividade de extratos de plantas que

preencham estes requisitos necessários à ação moluscicida poderá tornar o

seu uso uma alternativa aos compostos sintéticos usados no controle de

moluscos. Muitas são as espécies de plantas relatadas na literatura

buscando-se este propósito. Plantas existentes no Brasil têm demonstrado

grande eficiência, como por exemplo, Euphorbia (“Coroa-de-Cristo”) em que

frações fitoquímicas são 100 vezes mais ativas contra B. glabrata que o

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produto sintético Niclosamida ( Baptista et al. 1992, Coelho et al. 1999).

Vários pesquisadores, trabalhando com diferentes espécies vegetais,

confirmaram a eficiência dos extratos como moluscicidas (Kuo 1987, Jurberg

et al. 1989, Batista et al. 1992).

O Cerrado brasileiro é dotado de grande biodiversidade de plantas, por

isso nos últimos anos tem se avaliado o potencial medicinal e aplicativo de

suas espécies o que deverá contribuir também para a preservação e

utilização consciente deste importante ecossistema.

O Stryphnodendron polyphyllum (Martius,1837) conhecido como

Barbatimão de Folha Pequena é pouco relatada, mas tem revelado diversas

ações de bioatividade em estudos preliminares em vários organismos (Audi

et al. 1999, Alves et al. 2000).

O S. polyphyllum é uma planta considerada tanífera por apresentar

altos teores de taninos em suas estruturas (Schaufelberger Hostettmann

1983). Essa substância contribui na defesa das plantas contra consumo de

herbívoros, além de limitar o crescimento de microorganismos patogênicos.

O ácido tânico, presente no extrato da casca é considerado o princípio ativo

de moluscicidas sintetizados a partir de plantas taníferas (Alcanfor et al.

2001, Santos et al. 2002).

O barbatimão é uma Mimosoideae arbórea bastante comum nas

regiões do Cerrado (Ferri 1980), cuja casca contém substâncias tânicas. Os

taninos são produtos do metabolismo secundário dos vegetais e estão

presentes em diversos grupos destes, constituindo-se em compostos

altamente polimerizados e hidroxilados, com peso molecular variável,

podendo ultrapassar 3.000 Da (Bravo 1998). Tais características permitem

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que esses compostos formem complexos insolúveis com carboidratos e

proteínas. O conhecimento da absorção de compostos polifenólicos no trato

digestivo animal ainda é escasso e muitas vezes controverso. Resultados de

estudos in vivo e in vitro, utilizando compostos polifenólicos de estruturas

químicas diferentes, têm demonstrado sua variável susceptibilidade à

digestão e à absorção, sendo, o peso molecular e características que

apresentam quanto à extração por diferentes solventes, fatores

determinantes (Bravo 1998).

As atividades moluscicidas dos extratos aquosos metanólicos de uma

série de plantas têm sido relacionadas, principalmente, à presença de

taninos. Por exemplo, os efeitos moluscicidas da planta Acácia nilótica têm

sido atribuídos à sua constituição rica em taninos. Um spray seco

desenvolvido a partir delas, contendo 56% de taninos condensados e

hidrolisáveis foi efetivo contra moluscos B. pfeifferi, na concentração de 55

mg/L. Porém, os constituintes ativos ainda não foram bem identificados e

pouco se sabe sobre a forma de atuação de moluscicidas a base de taninos

puros, apesar de o ácido tânico comercial a 50 mg/L ser ativo contra B.

glabrata. Fontes típicas de taninos tais como Krameria triandra,

Hammamelis virginiana e Quercus sp, produzem extratos que são ativos a 50,

100 e 200 mg/L respectivamente (Marston, Hostettmann 1985).

4) Metabolismo de B. glabrata

No caso de B.glabrata, estudos do metabolismo têm sido direcionados

com o objetivo de avaliar as regras metabólicas sob algumas condições

fisiológicas distintas (Patience et al. 1983, Bezerra et al 1999). Invertebrados

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que apresentam metabolismo aeróbio, entre estes B. glabrata, podem acionar

ou redirecionar seu fluxo metabólico em sentido anaeróbio sob determinadas

condições ecofisiológicas em que se encontrem. A alteração mais notável na

passagem aeróbia para anaeróbia é a inversão no sentido do ciclo de Krebs

(Bezerra 1994). Caminhos anaeróbios dão continuidade à produção de

energia e apresentam como produto final substâncias facilmente excretadas

sem causar, inicialmente, grandes danos à célula (Schöttler 1986).

O metabolismo do molusco pode-se modificar quando este está sob

influência causadas através de limitações ou modificações dos fatores

ecológicos como o clima, alimentação (jejum e estivação) ou infecção

(Wolmarans 1987, Bezerra et al 1999).Os estudos do metabolismo do

molusco B. glabrata são importantes na compreensão de sua fisiologia, além

de gerar subsídios para a elucidação de suas vias metabólicas.

Diferenças no metabolismo, como as reações metabólicas ou

mecanismos de regulação vital para a sobrevivência de B. glabrata, sob

condições fisiológicas adversas, podem contribuir muito para o

conhecimento da relação hospedeiro-parasito, podendo ser de grande

importância para o controle de parasitoses específicas, servindo de base para

o entendimento e o desenvolvimento do parasito em seu hospedeiro.Sob esta

avaliação, pode-se afirmar que muitos invertebrados (parasitos e vetores)

apresentam metabolismo diferenciado dos vertebrados, seus hospedeiros

definitivos. Já foram descritos para diversos parasitos e seus hospedeiros

vias metabólicas distintas, que serviram como ponto de controle específico,

inclusive com aplicação de novas drogas naturais com especificidade a

determinada via metabólica essencial aos moluscos e parasitos, que podem

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ser utilizadas no controle de parasitoses. As enzimas vitais no metabolismo

energético têm sido alvo lógico na ação de quimioterápicos. Diferenças

metabólicas abrem novas possibilidades ao desenvolvimento de

quimioterápicos mais específicos (Metzger 1970, Saz 1990, Kita 1992, Nabih

e El-Ansary 1992, Bryant 1993, Tielens 1994).

4.1) Equilíbrio ácido-básico e do pH

O termo pH provém da expressão francesa “puissance” do hidrogênio,

que se refere à força ou poder do hidrogênio. O pH é definido como o

logaritmo negativo da concentração de íons hidrogênio. Na escala de pH uma

mudança de 1,0 unidade de pH significa uma modificação de 10 vezes na

concentração de íons hidrogênio. O teor de íons hidrogênio é regulado por

uma série de tampões, destacando-se as hemoglobinas, as proteínas, os

fosfatos e o sistema de bicarbonato. Este sistema é o tampão mais

importante, pois se encontra presente em grandes quantidades

(Marzzoco,Torres 1999).

O dióxido de carbono (CO

), em soluções aquosas, existe em equilíbrio

potencial com o ácido carbônico (CO

+ H

O ↔ H

↔ H

+ HCO

). A

enzima anidrase carbônica catalisa esta reação em direção a um ponto de

equilíbrio: o CO

é produzido através do metabolismo celular e liberado na

hemolinfa; o ácido carbônico produzido dissocia-se rapidamente em íons

hidrogênio (H

) e íons bicarbonato (HCO

). Esta situação pode ser mais bem

visualizada por meio da equação de Henderson-Hasselbach. Esta equação

especifica que:

HCO

+ H

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pH = pK + log base

ácido H

onde pK é a constante de dissociação (capacidade de liberar íons

hidrogênio) do ácido H

. Se houver aumento de HCO

sem qualquer

elevação correspondente do H

, a relação está aumentada, e o pH sofrerá

uma elevação. Por outro lado, se algum fator produzir aumento do H

o denominador irá aumentar, a relação estará diminuída, o pH sofrerá uma

queda (Marzzoco, Torres 1999).

A pO

representa o conteúdo de oxigênio dissolvido na hemolinfa. A

saturação de oxigênio representa a quantidade de oxigênio ligada à

hemoglobina. Quando a pressão parcial do oxigênio é diferente em duas

partes de um sistema, estabelece-se um gradiente de difusão, ou seja, o gás

se difunde do local em que a pressão parcial é maior para aquele em que ela

é menor. Caso o sistema permaneça sem perturbações, a pressão parcial de

um gás se torna a mesma em todas as suas partes. A ligação do complexo

"heme" da hemoglobina com o oxigênio é fraca e instável, dependendo de

uma série de fatores, como pH, temperatura e da pressão parcial dos gases

dissolvidos no sangue. Portanto, o equilíbrio ácido-base é um dos fatores

fundamentais para que o processo de transporte do oxigênio seja efetuado de

maneira satisfatória (Marzzoco, Torres, 1999).

O dióxido de carbono produzido nos tecidos se difunde através das

membranas celulares e dissolve-se na hemolinfa de B. glabrata. A pCO

refere-se à pressão parcial do gás CO

na hemolinfa expressa em mmHg. Os

ácidos gerados durante o metabolismo e o íon hidrogênio gerado pela fixação

do CO

são tamponados por tampões intracelulares, especialmente proteínas

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e fosfatos. Contudo, o bicarbonato é o principal tampão que neutraliza os

ácidos provenientes do metabolismo. O tampão bicarbonato minimiza as

modificações na concentração de íons hidrogênio pela dissociação de um

ácido ou associação de uma base no plasma. Quando o ácido é adicionado, o

bicarbonato reage com o H

e o H

é liberado. O ácido carbônico é uma

estrutura muito instável e logo se dissocia em dióxido de carbono e água. O

excesso de CO

é então eliminado pelo tegumento. É importante ressaltar

que a solução tampão tem um determinado limite de ação. Ultrapassado

esse limite, a variação de pH ocorre como se não existisse mais um sistema

tampão (Marzzoco, Torres 1999). Nestes casos, ocorrem perdas de atividades

vitais podendo levar o molusco à morte.

4.2)Metabolismo da Glicose

A glicose é o monossacarídeo mais abundante na hemolinfa de B.

glabrata, organismo que apresenta uma organização citofisiológica de

mitocôndrias, ciclo de Krebs funcional e metabolismo aeróbio (Cheng, Lee

1971). Esse caramujo apresenta como principal reserva energética o

glicogênio. Acredita-se que a regulação da glicólise e dos estoques de

glicogênio ocorram por intermédio de um controle cascata de glicogênio

fosforilase. Em moluscos, este efeito cascata de proteínas para regular a

formação ou quebra de glicogênio é, portanto, funcional e a

fosfofrutoquinase (PFK), regulada conforme a taxa de ATP/ADP catalisa a

primeira reação unidirecional no caminho da glicólise. (Becker, Lüth 1977).

Em caso de infecção por S. mansoni, a hipoglicemia em B. glabrata é

um resultado comum, pois S. mansoni é capaz de utilizar a glicose do

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caramujo diminuindo também os níveis de glicogênio (Christie et al. 1974 b,

Rupprecht et al. 1989).

Os mecanismos envolvidos na regulação dos níveis de glicemia são

complexos e, em muitos casos, apenas parcialmente esclarecidos. A

formação da glicose a partir de precursores diferentes das hexoses é

chamada de gliconeogênese (“formação de açúcar novo”). A gliconeogênese é

uma via universal, encontrada em todos os animais, vegetais, fungos e

microrganismos, e as reações que dela fazem parte são as mesmas em todos

os casos. Os precursores importantes da glicose nos animais são o lactato, o

piruvato, o glicerol e a maioria dos aminoácidos. Esta via aumenta a reserva

de carboidratos disponível para elevar os níveis de glicemia. Embora as

reações da gliconeogênese sejam as mesmas em todos os organismos vivos, o

contexto metabólico e a regulação da via diferem de organismo para

organismo e de tecido para tecido (Lehninger et al 1995).

Em condições de oxigenação tecidual adequada ou quase adequada, a

glicose é metabolizada para a produção de energia através da via metabólica

aeróbica, que converte os produtos metabólitos da glicolise em piruvato que,

por sua vez, é metabolizado no ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs). Em

condições de hipóxia tecidual grave, o metabolismo aeróbico é incapaz de

funcionar adequadamente, de modo que os produtos metabólicos da glicolise

na etapa de produção de piruvato são convertidos em lactato (ácido láctico)

através do metabolismo anaeróbico (Marzzoco, Torres 1999). Por

conseguinte, o aumento de lactato na hemolinfa, indica uma redução

significativa da oxigenação tecidual (Fig. 2). O piruvato tem vários destinos

possíveis: ser usado como precursor na síntese de carboidratos

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(gliconeogênese), aminoácidos (transaminação) e ácidos graxos (via acetil-

CoA) ou ser totalmente oxidado a dióxido de carbono CO

(via acetil CoA e

ciclo de Krebs) (Fig.2.) (Marzzoco, Torres 1999).

4.3) Metabolismo de Aminoácidos

Os aminoácidos, derivados principalmente das proteínas da

alimentação ou da degradação das proteínas intracelulares, são a última

classe de biomoléculas, cuja oxidação faz uma contribuição significativa

para a geração de energia metabólica. O valor da fração de energia

metabólica derivada dos aminoácidos varia muito com o tipo de organismo

considerado e com a situação metabólica em que ele se encontra. As vias de

degradação dos aminoácidos são muito similares na maioria dos

organismos. Os esqueletos carbônicos dos aminoácidos, em geral,

encaminham-se para o ciclo do ácido cítrico e, de lá, são oxidados para

produzirem energia química ou, então, encaminhados para a gliconeogênese(

Lehninger et al 1995).

Sob condições ecofisiológicas adversas, muitos moluscos morrem

apesar de existirem boas reservas de proteínas e lipídios (Gress, Cheng

1973, Michelson, Dubois 1975; Becker, Lüth 1977). A degradação de

produtos nitrogenados, amônia e aminoácidos são geralmente transportados

com a hemolinfa para lugares onde eles possam ser excretados ou

futuramente processados (Little 1968).

A quantidade de produtos nitrogenados degradados é indicativa da

atividade do metabolismo de proteínas e ácidos nucléicos de um animal,

exposto a qualquer situação de estresse, onde deve aparecer uma produção

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aumentando as concentrações de uréia, amônia e ácido úrico. Tal estresse

pode ser causado por fases de uma intensa atividade reprodutiva ou por

invasão de parasitas. Um aspecto deve ser considerado, especialmente no

caso do B. glabrata, em estágio larval do S. mansoni que desenvolve dentro

deste molusco e mostra uma rápida taxa de reprodução (Becker 1968).

A uréia é um produto de degradação contendo nitrogênio, proveniente

do metabolismo das proteínas (Fig. 2).Estudos mostram que a função

fisiológica do ciclo da uréia consiste na desintoxicação da amônia, ocorrendo

um aumento na excreção e um acúmulo de uréia quando B. glabrata está

sob situações ecofisiológicas adversas, como estivação ou a exposição ao

extrato de S. polyphyllum (Cheng, Lee 1971, Schmale, Becker 1977).

Existem poucos dados na literatura sobre a concentração de uréia na

hemolinfa e valores de aproximadamente 0,26 mmol/L normalmente são

encontrados em B. glabrata (Becker, Schmale 1975).

Em B. glabrata, a ativação enzimática do ciclo da uréia pode surgir

pelo aumento de nova síntese ou por degradação das enzimas envolvidas,

sendo que este mecanismo provavelmente está sujeito à influência de

substratos ou outros ativadores e inibidores (Becker, Schmale 1975).

Cirlane Silva Ferreira

Dismutação do malato- ↑

Gliconeogênese- ↑

Aeróbio-

↑

Figura 2. Metabolismo da via glicolítica e dos aminoácidos (Bezerra et

al 1997. Mem.Inst.Osvaldo).

4.4) Metabolismo de Cálcio

Com referência à avaliação do metabolismo do cálcio, as alterações em

moluscos podem ser provocadas descalcificando a concha. Em situações

adversas e que causam alteração de pH na hemolinfa do molusco, como a

produção e acúmulo de succinato ou lactato, o carbonato de cálcio

proveniente da concha é excretado para a hemolinfa para neutralizar ou

tamponar estes ácidos, acumulados, se o molusco estiver sob anoxia

(Wolmarans 1987, Bielefeld et al. 1992, Marxen, Becker 2000).

Cirlane Silva Ferreira

O cálcio sérico total é constituído de cerca de 50% (faixa de 35-55%) de

cálcio ligado e de cerca de 50% (faixa de 35-65%) de cálcio não ligado.

Tradicionalmente, o cálcio não-ligado foi denominado cálcio “ionizado”,

sendo também conhecido como cálcio “livre ou dealisável”. O cálcio ligado é

subdividido em cálcio ligado a proteínas e cálcio complexado com compostos

não protéicos. Cerca de 45% do cálcio total (30-50%) estão ligados às

proteínas. A parte restante do cálcio total, que corresponde a 5% (5-15%), é

complexada como citrato, fosfato, sulfato e bicarbonato, que não fazem parte

das proteínas séricas (Marzzoco,Torres 1999).

Os íons Ca

liberados em resposta a um estímulo nervoso, além de

desencadearem a contração muscular, estimulam a degradação de glicogênio

e inibem a sua síntese. Estes íons ligam-se à subunidade da fosforilase

quinase, idêntica a calmodulina. A fosforilase quinase torna-se ativa,

desencadeando a glicogenólise, também induzida por adrenalina no músculo

em repouso. Menos de 5% do glicogênio fosforilase são funcionais, mas, 0,7

segundos após o início da contração, o percentual da enzima ativa já atinge

50%. O resultado final consiste em um aumento da oferta de substrato para

a glicólise e da produção de ATP para sustentar a contração muscular

(Marzzoco,Torres 1999).

Cirlane Silva Ferreira

justificativa

JUSTIFICATIVA

O Biomphalaria. glabrata, hospedeiro intermediário de S. mansoni,

possui um papel obrigatório e decisivo para a permanência da

esquistossomose em uma determinada região. Enfatiza-se a busca de

conhecimento a respeito de sua fisiologia e metabolismo frente a alterações

realizadas, experimentalmente, em laboratório. Diante dos inúmeros extratos

de plantas testados como moluscicidas, propõe-se o estudo da relação

parasito-hospedeiro como potencial sítio de ação de produtos naturais no

controle integrado da esquistossomose.

A adaptação do hospedeiro intermediário, B. glabrata, a períodos de

estiagem mais longos, o aumento de construções de represas e introdução de

esquemas de irrigação, vêm inadvertidamente propiciando criadouros ideais

para o B. glabrata. Assim, torna-se imprescindível a melhoria das condições

de vida, educação sanitária e a pesquisa de alternativas terapêuticas que

possam auxiliar no combate a esquistossomose.

O Cerrado brasileiro é um importante bioma com grande potencial

para esta aplicação. Esta bioatividade foi analisada em S. polyphyllum,

conhecido como Barbatimão de Folha Pequena, a qual é pouco relatada na

literatura, mas tem revelado bioatividade em estudos preliminares de vários

organismos (Audi et al. 1999; Alves et al. 2000). A espécie S. polyphyllum da

flora do Cerrado foi escolhida devido a sua ampla distribuição, já que o

Cerrado forma o 2º bioma mais extenso do Brasil, cobrindo mais de dois

milhões de Km

, o que representa cerca de 22% do território nacional. O

Cirlane Silva Ferreira

justificativa

Cerrado é considerado atualmente como a savana de maior biodiversidade

do mundo, tendo um potencial enorme ainda pouco explorado.

Sendo assim, o uso de extratos de plantas no controle de moluscos e

da inibição do desenvolvimento larvar dentro deste (esporocistos e cercárias)

vem de encontro a essa necessidade, buscando a bioatividade com eficiência

em baixas doses, baixo impacto ambiental e baixo custo de produção. Como

efeito, esta avaliação também contribuirá para o conhecimento das

propriedades da flora do Cerrado, sua conservação e utilização racional.

Para tanto, é necessário estudar a bioquímica da relação parasito-

hospedeiro com o intuito de se conseguir determinar os pontos de ação

suscetíveis a novas drogas, avaliando as alterações metabólicas sofridas pelo

hospedeiro intermediário.

Nosso grupo de pesquisa em bioquímica da relação parasita-

hospedeiro vem estudando as plantas do Cerrado goiano, com ênfase ao

Stryphnodendron spp, que se mostrou com grande potencial moluscicida.

Esta planta merece maiores estudos de sua toxicidade sobre o metabolismo

e o equilíbrio ácido-base do molusco B. glabrata.

Cirlane Silva Ferreira

Objetivos

OBJETIVOS

a) Estabelecer estudo interdisciplinar da ação de extrato de S.

polyphyllum, sobre B. glabrata, avaliando o efeito metabólico desta

interação nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

b) Estudar e avaliar as alterações no equilíbrio ácido-base de B.

glabrata, em condições de estresse, provocadas pela presença do extrato

de S. polyphyllum.

c) Verificar a eficiência do sistema tampão do molusco diante de

uma situação de estresse provocada pela presença do extrato de S.

polyphyllum.

d) Analisar o metabolismo de proteínas, a via glicolítica e a

fosforilação oxidativa de B. glabrata sob ação do extrato da planta do

Cerrado S. polyphyllum.

e) Avaliar a atividade das enzimas aminotransferases e lactato

desidrogenase após a exposição ao extrato de S. polyphyllum, observando

as mudanças assimiladas para a sobrevivência do molusco.

f) Avaliar, por meio do método de cromatografia líquida, as

concentrações dos ácidos orgânicos após a exposição de B. glabrata ao

extrato de S. polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

1º Artigo

Análise do Equilíbrio Ácido-Base em Biomphalaria glabrata (Say,

1818), sob exposição a Stryphnodendron polyphyllum (Martius, 1837),

planta moluscicida do Cerrado brasileiro.

Cirlane Silva Ferreira

RESUMO

Os moluscos do gênero Biomphalaria possuem sistema circulatório

aberto onde circula a hemolinfa. Esta distribui, entre os órgãos, os

metabólitos necessários; além disso, irá refletir distúrbios celulares, cujos

produtos serão excretados através da hemolinfa. Estes produtos podem ser

ainda eliminados ao meio exterior ou armazenados e, posteriormente

reabsorvidos da hemolinfa pela célula. O objetivo deste trabalho foi estudar e

avaliar as alterações no equilíbrio ácido-base de B. glabrata em condições

não adequadas provocadas pela presença do extrato de Stryphnodendron

polyphyllum, planta tanífera de comprovada ação moluscicida.

Os moluscos B. glabrata, cepa BH, foram mantidos no biotério do

IPTSP/UFG, tratados por 24 horas com os extratos de caule de S.

polyphyllum nas concentrações de 25 e 50mg/L (solução aquosa). No grupo

controle os moluscos foram mantidos em água desclorada. A análise do

equilíbrio ácido-base das amostras foi realizada com pool de hemolinfa de 3

moluscos e a leitura das concentrações feitas no gasômetro Radiometer

modelo ABL-5.

A grande maioria dos processos bioquímicos é extremamente sensível

à variação do pH. A manutenção do pH é conseguida pelos seres vivos graças

à existência dos sistemas-tampão, porém o extrato de S. polyphyllum

impediu que este sistema funcionasse de forma efetiva. Nesse sentido as

plantas moluscicidas são de grande importância no controle dos focos da

infecção, complementando outras medidas de prevenção da

esquistossomose.

Cirlane Silva Ferreira

Palavras chaves: Biomphalaria glabrata, equilíbrio ácido-base,

Schistosoma mansoni, Stryphnodendron polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

ABSTRACT

Biomphalaria mollusks have an open circulation system where the

hemolymph circulates distributing the necessary metabolites to the organs,

as well as reflecting cellular disturbances and transporting excreted

material, which may be eliminated into the environment or stored and later

reabsorbed from the hemolymph into the cell. The aim of this work was to

study and estimate the alterations in the acid-alkaline balance of B. glabrata

under inadequate conditions caused by the presence of the extract of S.

polyphyllum, a tanniferous plant with recognized molluscicide effect.

The B. glabrata mollusks, BH strain, were kept in the IPTSP/UFG

vivarium and treated for 24 hours with bark extracts from Stryphnodendron

polyphyllum at 25 and 50 mg/L concentrations (aqueous solution). The

control group was performed with mollusks in dechlorinated water. The

analysis of the acid-alkaline balance of the samples was performed by

pooling the hemolymph from 3 mollusks and the concentrations read on the

Radiometer gasometer, model ABL-5.

Most biochemical processes are extremely sensitive to any variation in

pH. The pH is maintained in living beings due to acid-alkaline balance but

the S. polyphyllum extract did not allow this system to function effectively. It

is in this sense that molluscicide plants are important in the control of

infection foci, complementing other schistossomiasis prevention measures.

Key words: acid-alkaline balance, Biomphalaria glabrata, Schistosoma

mansoni, Stryphnodendron polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

INTRODUÇÃO

No Brasil existem, segundo dados do 8º Simpósio Internacional de

Esquistossomose, cerca de 8 a 10 milhões de pessoas infectadas, de 25 a 30

milhões de pessoas expostas ao risco de infecção (Coutinho 2002). O ciclo de

vida do S. mansoni já foi extensamente estudado e seu mapa genético foi

recentemente concluído, além de várias pesquisas direcionadas ao

desenvolvimento de vacinas contra o S.mansoni (Colley 2000).

O hospedeiro intermediário desta doença é um molusco de água doce,

conhecido popularmente por caramujo. Esse molusco tem uma concha em

espiral, com as voltas ou giros no mesmo plano, recebendo por isso a

denominação de planorbídeo. Os caramujos, ou planorbídeos criam-se e

vivem na água doce de córregos, riachos, valas, alagados, brejos, açudes,

represas ou outros locais onde haja pouca correnteza. Os caramujos jovens

alimentam-se de vegetais em decomposição e folhas verdes. Os caramujos

põem ovos, dos quais, depois de alguns dias, nascem novos caramujos que

crescem e tornam-se adultos (SUCEN 2001).

O tratamento dessas coleções de água através de moluscicidas

naturais obtidos de partes de plantas renováveis poderá constituir em forma

mais econômica e de baixa toxicidade ao meio ambiente, para o combate ao

molusco transmissor (Branco 1986, Perret, Whitfield 1996, Juberg et al.

1997, Alves et al. 2000). Com esta finalidade, plantas da flora do Cerrado

brasileiro têm tido sua bioatividade estudada, avaliando-se alterações

histopatológicas, promovidas pela incubação de Biomphalaria glabrata em

diferentes extratos. Atribuem-se, inicialmente, estas alterações à

Cirlane Silva Ferreira

bioatividade dos taninos, que constitui uma classe de fenóis, presentes

nestas espécies vegetais, existindo, porém, pouco conhecimento de seu modo

de ação, principalmente em moluscos (Marston, Hostettmann 1985, Ozawa

et al. 1987, Haslam 1996).

Os moluscos do gênero Biomphalaria possuem sistema circulatório

aberto onde circula a hemolinfa, que veicula moléculas de baixo peso

molecular como íons, aminoácidos, carboidratos, vitaminas, uréia, dentre

outras e uma alta concentração de proteínas (Arndt, Santoro 2001). A

hemolinfa distribui entre os órgãos os metabólitos necessários; além disso,

irá refletir distúrbios celulares, cujos produtos serão excretados através

desta. Estes produtos podem ser ainda eliminados ao meio exterior ou

armazenados na hemolinfa e, posteriormente reabsorvidos da hemolinfa pela

célula (Wijsman et al. 1985). O objetivo deste trabalho foi estudar e avaliar

as alterações no equilíbrio ácido-base de B. glabrata, na presença do extrato

de Stryphnodendron polyphyllum nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

MATERIAL E MÉTODOS

Os moluscos B. glabrata, cepa BH, foram mantidos no biotério do

IPTSP/UFG em aquários com água desclorada e aerada, na temperatura de

25-28º C. A lavagem das caixas foi realizada semanalmente. Os moluscos

foram alimentados com Lactuca sativa L. (alface) e ração apropriada “ad

libitum” (Vinaud et al. 2001).

As cascas do S. polyphyllum usadas no trabalho foram colhidas,

lavadas, secadas em estufas a 40 ºC com ventilação forçada e

posteriormente moídas. A farinha obtida com a trituração é denominada de

Cirlane Silva Ferreira

extrato bruto. O extrato bruto foi diluído em água isenta de cloro formando

soluções nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

A coleta e obtenção de extratos brutos do caule de S. polyphyllum

foram realizadas pelo departamento de Botânica, de acordo com Santos et al.

(2002) pelo Instituto de Química da UFG.

Os moluscos, com diâmetro de concha de 14 +/- 2 mm e idade

aproximada de três meses, foram divididos em 20 grupos com 3 (três)

moluscos/ aquário e tratados, por 24 horas, em contato permanente com a

solução aquosa do extrato. As soluções aquosas do extrato bruto da casca do

caule de S. polyphyllum usado nos bioensaios, nas concentrações de 25 e 50

mg/L (dose sub-letal), foram preparadas a partir de 12,5 e 25 mg do extrato

e 500 ml de água de torneira desclorada. Durante o período de exposição os

moluscos não foram alimentados. No grupo controle, 10 grupos de 3

moluscos, foram mantidos em água desclorada, garantindo assim as

condições normais de sobrevivência.

Para a extração da hemolinfa os moluscos tiveram primeiro suas

conchas limpas com álcool 70% e depois com água destilada e,

posteriormente, seca com papel absorvente. Sob microscópio estereoscópio,

usando bisturi cirúrgico, foi feito um orifício na região pericárdica de onde

fluiu a hemolinfa, preenchendo a abertura central da concha, seguido de

aumento de fluxo de hemolinfa à medida que o molusco se retraía na

concha. A hemolinfa foi imediatamente pipetada e colocada num “ependorff”

conservado em gelo (Bezerra et al. 1997). Todos os moluscos foram

utilizados, pois não houve mortalidade. Em seguida a hemolinfa foi aspirada

Cirlane Silva Ferreira

com uma seringa, e retiradas todas as bolhas de ar, conservadas em banho

de gelo até a leitura das amostras.

A análise do equilíbrio ácido-base das amostras foi realizada com pool

de hemolinfa de 3 moluscos e a leitura das concentrações feita no gasômetro

Radiometer modelo ABL-5.

Os resultados dos testes foram analisados em média e mediana de

acordo com o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Na análise

estatística, utilizou-se o teste de χ

para a relação do molusco em condição

padrão comparando aos grupos expostos ao extrato da planta em estudo, e o

teste one way ANOVA e Tukey para comparação entre as diferentes

condições que os moluscos foram submetidos. Considerou-se

estatisticamente significativo o valor de p<0,05.

A tabela 1 refere-se aos resultados oriundos da análise do equilíbrio

ácido-base realizado no gasômetro Radiometer modelo ABL-5.

RESULTADOS

O pH da hemolinfa de B. glabrata reflete a atividade iônica de

numerosas substâncias e é ligeiramente maior que o pH da água. O pH da

hemolinfa dos caramujos mantidos sob condições padrão foi 7,64 ± 0,07,

sendo, portanto levemente alcalino em relação ao pH da água de

condicionamento ( água desclorada). Quando se adiciona o extrato de S.

polyphyllum na água, mesmo em pequenas concentrações, o pH da

hemolinfa sofreu uma acidose, variando de 7,59 ± 0,16 para os moluscos

submetidos à exposição de 25 mg/L e 6,87 ± 0,20 para os moluscos expostos

a 50 mg/L do extrato (Fig.3, tabela 1). A análise estatística dos valores

Cirlane Silva Ferreira

obtidos mostrou que houve distribuições normais, ocorrendo assim uma

diferença estatística entre o grupo controle e de 50 mg/L e entre os testes de

25 e 50 mg/L. Não houve diferença entre o controle e o teste de 25 mg/L

(p<0,001).

A pressão parcial de gás carbônico na hemolinfa de B. glabrata no

grupo controle apresentou mediana de 13,50 mmHg, com valores referentes

a 25% igual a 11,00 mmHg e referentes a 75% igual a 17,00 mmHg. Quando

estes moluscos foram submetidos ao extrato na concentração de 25 mg/L a

mediana foi 14,00 mmHg (12 a 15mmHg), não sendo estatisticamente

diferente do grupo controle. Quando a concentração elevou-se para 50mg/L

ocorreu um aumento significativo na pressão parcial de gás carbônico, a

mediana elevou-se para 38,00 mmHg (37 a 44mmHg ) ao ser comparada com

o grupo controle (p<0,001), (Fig.3, tabela 1).

A pressão parcial de gás oxigênio na hemolinfa dos caramujos do

grupo controle foi de 134,50 ± 19,50 mmHg e quando estes moluscos foram

submetidos a exposição de 25mg/L do extrato da planta esta concentração

passou a ser 133,90 ± 55,82 mmHg, não mostrando assim uma diferença

significativa. Porém quando estes foram submetidos à concentração de 50

mg/L a concentração parcial do gás oxigênio diminuiu para 66,70 ± 29,62

mmHg, permitindo concluir que houve uma diferença significativa entre o

controle e o teste de 50 mg/L (p<0,001) (Fig.3, tabela 1).

A dosagem dos íons bicarbonatos presentes na hemolinfa do grupo

controle apresentaram valores de 15,00 ± 1,41 mmol/L, não tendo diferença

estatística com o grupo exposto a 25mg/L do extrato que apresentou média

de 13,50 ± 2,70 mmol/L. Quando estes moluscos foram submetidos à

Cirlane Silva Ferreira

concentração de 50 mg/L os íons bicarbonatos diminuíram sua média para

7,50 ± 4,00 mmol/L (Fig.3, tabela 1). Isso permite concluir que houve uma

diferença significativa entre o grupo controle e o teste de 50 mg/L (p<0,001).

A saturação de oxigênio do grupo controle e do grupo exposto a 25

mg/L não sofreu variação significativa. A mediana destes dois grupos foi

99%. Já quando a concentração do extrato passou para 50 mg/L a

saturação de oxigênio caiu significativamente para 80% (75 a 90%),

(p<0,001), (Fig.3, tabela 1).

Tabela 1. Análise do equilíbrio ácido-base na hemolinfa de

Biomphalaria glabrata expostos ao extrato do caule de Stryphnodendron

polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50mg/L valor em média±desvio

padrão ou mediana (mínimo - máximo).

Controle S. polyphyllum

25mg/L

S. polyphyllum

50mg/L

pH 7,64±0,07 7,59±0,16 6,87±0,20

pCO

(mmHg)

13,50 (11,00 –

17,00)

14,00 (12,00 -15,00)

38,00 (37,00 –

44,00)

(mmHg) 134,50±19,50 133,90±55,82 66,70±29,62

HCO

(mmol/L)

15,00±1,41 13,50±2,70 7,50±4,00

s O

% 99,00 (99,00 –

99,00)

99,00 (99,00 –

99,00)

80,00 (75,00 –

90,00)

Cirlane Silva Ferreira

6,4

6,6

6,8

7,2

7,4

7,6

7,8

controle 25 ppm 50 ppm

média

íon

carbonato

Mmol/L

controle 25 ppm 50 ppm

média

100

120

140

mmHg

controle 25 ppm 50 ppm

pCO2

pO2

100

satura çã o

oxigênio

controle 25 ppm 50 ppm

mediana

Figura 3 – a)Taxas de pH, b) concentrações de íons carbonatos, c)

pressão parcial de gás oxigênio e gás carbônico,d) saturação de oxigênio na

hemolinfa de Biomphalaria glabrata expostos ao extrato de caule de

Stryphnodendron polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

Cirlane Silva Ferreira

DISCUSSÃO

Invertebrados que apresentam metabolismo aeróbio, entre estes B.

glabrata, podem acionar ou redirecionar seu fluxo metabólico em sentido

anaeróbio sob determinadas condições ecofisiológicas em que se

encontrem. A possibilidade de um metabolismo anaeróbio facultativo, em

invertebrados, como os moluscos, permite sua sobrevivência ou adaptação

às adversidades. Estes caminhos anaeróbios dão continuidade à produção

de energia e apresentam como produto final substâncias facilmente

excretadas sem causar inicialmente grandes danos à célula (Schöttler

1986).

Figura 4 – Efeitos do extrato de Stryphnodendron polyphyllum no equilíbrio

ácido-base em Biomphalaria glabrata.

Extrato de S. pol

llu

Mudança de

comportamento

Diminui

atividade

Diminui pH

Perda de O

Aumento de CO

Diminui consumo

de alimento

Diminui HCO

Aumenta pCO

Diminui pO

Desequilíbrio ácido-base

Queda de desempenho Morte

Cirlane Silva Ferreira

O B glabrata, sob condições padrão apresenta metabolismo aeróbico

como mostra o resultado da saturação de oxigênio no grupo controle de

99,00% e uma pressão parcial do gás oxigênio de 134,50 mmHg.

Possibilitando uma completa oxidação de carboidratos em CO

e H

Entretanto, quando estão sob condições desfavoráveis, impostas pela

presença do extrato de S. polyphyllum a 50 mg/L, a saturação de oxigênio

saiu de 99% para até 75 % e a pressão parcial do gás oxigênio abaixou de

134,5 para 66,70 mmHg (Fig. 3) , obrigando o molusco a redirecionar suas

vias metabólicas, buscando meios para sobreviver de acordo com idéias já

propostas por Bacila (1970), Becker (1980), Patience et al. (1983),

Wolmarans (1987) e Shaw, Erasmus (1987).

+ HCO

<--> H

<--> CO

+ H

Figura 5. Representa o dióxido de carbono produzido pelo

metabolismo, a sua pequena dissociação em íons e o equilíbrio sob a forma

de CO

dissolvido e água.

Em situações adversas e que causam alteração de pH na hemolinfa de

moluscos, como a produção e acúmulo de succinato ou lactato, o carbonato

Cirlane Silva Ferreira

de cálcio proveniente da concha é excretado para a hemolinfa, com a

finalidade de neutralizar ou tamponar estes ácidos, acumulados se o

molusco estiver sob anoxia (Wolmarans 1987, Bielefeld et al. 1992, Zelck et

al. 1995, Marxen, Becker 2000). A concentração do bicarbonato, a pCO2 e o

pH da hemolinfa são interdependentes. Portanto, a alteração de um dos

parâmetros leva ao movimento compensatório dos demais, na busca do

equilíbrio (Fig. 5). A hemolinfa destes moluscos apresentou o pH igual a 7,64

para o grupo controle e este pH tornou-se após a exposição ao extrato na

concentração de 50 mg/L atingindo o valor de 6,87. Na tentativa de

neutralizar o pH ácido, os íons carbonato foram consumidos, passando de

15,00 mmol/L no grupo controle para 7,50 mmol/L quando expostos a 50

mg/L do extrato de S. polyphyllum. A pressão parcial de gás carbônico

(pCO

) acompanhou também a alteração do pH, inicialmente a pCO

foi de

13,50 mmHg no grupo controle e 38,00 mmHg na hemolinfa dos moluscos

expostos a 50 mg/L do extrato da planta.Com isso percebemos que o extrato

realmente interfere no equilíbrio ácido-base do molusco (Fig. 6).

Cirlane Silva Ferreira

MORTE CELULAR

6,67

7,56 7,71

ACIDOSE ALCALOSE

DESVIOS DO pH

Figura 6. Representa o pH na acidose e na alcalose. Demonstra

também os limites de tolerância do organismo aos desvios do pH.

Patience et al. (1983), Wolmarans (1987), Bezerra et al. (1999) e Silva

(2002) também mostraram que os moluscos em condições não padrões à sua

sobrevivência acionam seu metabolismo anaeróbio.

No estudo do equilíbrio ácido-base verificou-se na hemolinfa uma

diminuição significativa no pH, na pressão de gás oxigênio, íons carbonatos

e na saturação de gás oxigênio. Por outro lado, houve um aumento na

pressão de gás carbônico, quando estes foram submetidos ao extrato na

concentração de 50 mg/L.

A grande maioria dos processos bioquímicos é extremamente sensível

à variação do pH. A manutenção do pH é conseguida pelos seres vivos graças

à existência dos sistemas-tampão. O teor de íons hidrogênio é regulado por

uma série de tampões, e dentre as substâncias que atuam como tampões,

destacam-se as hemoglobinas, as proteínas, os fosfatos e o sistema de

bicarbonato, sendo este o mais importante, pois se encontra presente em

Cirlane Silva Ferreira

grandes quantidades, porém o extrato de S. polyphyllum parece que impediu

que este sistema funcionasse de forma efetiva.

O ajuste do metabolismo às diferentes condições fisiológicas é obtido

graças a processos que, em conjunto são chamados de regulação metabólica.

Os eventos de regulação não são isolados; cada um deles atua como um

gerador primário de sinais, captados por geradores secundários, capazes de

retransmiti-los até atingir toda a rede metabólica e repercutir a distância, em

todo o organismo. A complexidade dos processos é enorme, mas justifica-se

por permitir um ajuste sensibilíssimo do metabolismo a diferentes situações,

propiciando uma resposta pronta e logicamente organizada (Marzzoco,

Torres 1999).

Cirlane Silva Ferreira

Artigo 2

Análise do metabolismo de proteínas, da via glicolítica e da

fosforilação oxidativa de Biomphalaria glabrata (Say, 1818) sob ação

do extrato da planta do Cerrado brasileiro Stryphnodendron

polyphyllum (Martius, 1837).

Cirlane Silva Ferreira

RESUMO

A esquistossomose permanece como uma das infecções parasitárias

mais prevalentes, constituindo-se na segunda parasitose mais importante,

depois da malária, em termos de índice de mortalidade global, apresentando

conseqüências econômicas e de saúde pública muito significativas. No

presente trabalho, o potencial de Stryphnodendron polyphyllum, uma planta

do cerrado brasileiro, foi testado como fonte alternativa de produtos naturais

com atividade moluscicida. Os moluscos foram submetidos a bioensaios,

com extrato de S. polyphyllum nas concentrações de 25 e 50 mg/L, por 24

horas, e comparados com um grupo controle mantido sob condições padrão.

O extrato interferiu no metabolismo destes moluscos de forma mais efetiva

na concentração de 50 mg/L. Aparentemente o molusco fez um ajuste do

metabolismo, frente às diferentes condições ecofisiológicas impostas pelo

extrato, através de uma regulação de toda a rede metabólica, que foi

adaptada a esta situação, repercutindo em todo o organismo do molusco. O

extrato aquoso obtido do caule do barbatimão pode, após análise mais

profunda, constituir uma alternativa de menor toxicidade e menor custo

financeiro no controle da esquistossomose no Brasil.

Palavras chaves: Biomphalaria glabrata, controle, esquistossomose,

metabolismo, molusco, Stryphnodendron polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

ABSTRACT

Schistossomiasis remains one of the most prevailing parasite

infections, second only to malaria in terms of global mortality index, causing

highly significant economic and public health consequences.

This study tested the potential of Stryphnodendron polyphyllum, a

plant from the Brazilian savannah as an alternative source of natural

molluscicide products. The mollusks were submitted to biotests at 25 and 50

mg/L concentrations for 24 hours and compared with a control group kept

under standard conditions. The extract affected more strongly the

metabolism of the mollusks in the 50 mg/L concentration. As a result, the

mollusk made a metabolic adjustment to the different eco-physiological

conditions determined by the extract, by means of a metabolic regulation.

These regulatory events did not occur alone, all the metabolic network was

adapted to the new situation which reflected on the mollusk organism as a

whole.

The aqueous extract taken from the bark of the “barbatimão” may,

after further analysis, constitute a less toxic as well as less costly alternative

for the schistosomiasis control in Brazil.

Key words: Biomphalaria glabrata, control, metabolism, mollusk,

schistossomiasis , Stryphnodendron polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

INTRODUÇÃO

A esquistossomose permanece como uma das doenças tropicais mais

prevalentes, constituindo-se na segunda parasitose mais importante, depois

da malária, em termos de índice de mortalidade global (Rug, Ruppel 2000),

apresentando conseqüências econômicas e de saúde pública muito

significativas. Embora a distribuição da esquistossomose tenha sido alterada

nos últimos 50 anos, através da implantação de programas de controle, o

número de pessoas infectadas ou com risco de infecção, não tem sido

reduzido (Mendes et al. 1999, Chitsulo et al. 2000). O controle desta doença

depende de um conjunto de “multifacetas desejáveis” (Whitfield 1996, Ed

Khoby et al. 1998), incluindo o controle do molusco hospedeiro

intermediário.

As atividades moluscicidas dos extratos aquosos e metanólicos de uma

série de plantas têm sido relatada, principalmente devido à presença de

taninos na sua constituição. Por exemplo, os efeitos moluscucidas da planta

Acácia nilótica têm sido atribuídos à sua constituição rica em taninos

(Marton, Hostettmann 1985)

Os moluscicidas vegetais com ações seletivas, biodegradáveis, de baixo

custo, localmente viáveis e de fácil aplicação nos criadouros naturais visam

atender às exigências econômicas e ecológicas (WHO 1983), pois os

moluscicidas sintéticos são onerosos e ainda podem acarretar problemas de

toxicidade para organismos não-alvos.

Convém assinalar que a niclosamida tem sido por quatro décadas, o

moluscicida sintético mais usado. Atualmente, a niclosamida ainda é

Cirlane Silva Ferreira

recomendada pela Organização Mundial de Saúde para aplicação em larga

escala (WHO 1993). Porém, esse produto provoca alta mortalidade de peixes

e possui um custo elevado (Perrett, Whitfield 1996), e áreas endêmicas para

esquistossomose, geralmente não possuem recursos econômicos, e assim,

mecanismos alternativos para controle dessa doença precisam ser buscado.

Nos últimos anos, o metabolismo de Biomphalaria glabrata, hospedeiro

intermediário de Schistosoma mansoni, vem sendo amplamente estudado por

meio da análise da concentração de glicose, uréia, proteínas, cálcio e ácidos

orgânicos em sua hemolinfa (Wolmarans 1987, Rupprecht et al. 1989).

Extratos de plantas estão sendo pesquisados no combate aos

moluscos do gênero Biomphalaria, que estão diretamente implicados na

transmissão de S. mansoni (Whitfield 1996), Uma vez que o uso de plantas

com propriedades moluscicidas pode ser uma medida econômica para se

promover o combate ao molusco transmissor da esquistossomose.

Nesse sentido, pesquisadores não têm dispensado esforços para

encontrar plantas que sejam ao mesmo tempo, altamente ativas, baratas,

seguras, de fácil aplicação e localmente viáveis (Mott 1987). Também foram

estudados vários mecanismos de interrupção do ciclo biológico utilizando-se

moluscicidas no controle do hospedeiro intermediário ou larvicidas para

combater as formas infectantes – cercárias e miracídios (Carvalho et al.

1998, Bezerra et al. 2002). Mas as plantas têm inúmeros compostos

químicos, só que como produtos naturais à degradação é mais rápida. O

objetivo deste trabalho foi delinear o perfil bioquímico da hemolinfa de B.

glabrata exposto a extratos do caule da planta do cerrado Stryphnodendron

polyphyllum.

Cirlane Silva Ferreira

MATERIAL E MÉTODOS

Os moluscos B. glabrata, cepa BH, foram mantidos no biotério do

IPTSP/UFG em aquários com água desclorada e aerada, na temperatura de

25-28º C. A lavagem das caixas foi realizada semanalmente. Os moluscos

foram alimentados com Lactuca sativa L. (alface) e ração apropriada “ad

libitum” (Vinaud et al. 2001).

As cascas do S. polyphyllum usadas no trabalho foram colhidas,

lavadas, secadas em estufas a 40 ºC com ventilação forçada e

posteriormente moídas. A farinha obtida com a trituração é denominada de

extrato bruto. O extrato bruto foi diluído em água isenta de cloro formando

soluções nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

A coleta e obtenção de extratos brutos do caule de S. polyphyllum

foram realizadas pelo departamento de Botânica, de acordo com Santos et al.

(2002) pelo Instituto de Química da UFG.

Os moluscos, com diâmetro de concha de 14 +/- 2 mm e idade

aproximada de três meses, foram divididos em 20 grupos com 3 (três)

moluscos/ aquário e tratados, por 24 horas, em contato permanente com a

solução aquosa do extrato. As soluções aquosas do extrato bruto da casca do

caule de S. polyphyllum usado nos bioensaios, nas concentrações de 25 e 50

mg/L (dose sub-letal), foram preparadas a partir de 12,5 e 25 mg do extrato

e 500 ml de água de torneira desclorada. Durante o período de exposição os

moluscos não foram alimentados. No grupo controle, 10 grupos de 3

moluscos foram mantidos em água desclorada, garantindo assim as

condições normais de sobrevivência.

Cirlane Silva Ferreira

Para a extração da hemolinfa os moluscos tiveram primeiro suas

conchas limpas com álcool 70% e depois com água destilada e,

posteriormente, seca com papel absorvente. Sob microscópio estereoscópio,

usando bisturi cirúrgico, foi feito um orifício na região pericárdica de onde

fluiu a hemolinfa, preenchendo a abertura central da concha, seguido de

aumento de fluxo de hemolinfa à medida que o molusco se retraía na

concha. A hemolinfa foi imediatamente pipetada e colocada num “ependorff”

conservado em gelo (Bezerra et al. 1997), posteriormente a hemolinfa foi

centrifugada ficando assim livre de células. Todos os moluscos foram

utilizados, pois não houve mortalidade.

A análise espectrofotométrica das amostras foi realizada com a

utilização dos seguintes kits comerciais marca Wiener®. A metodologia

empregada em cada análise foi a seguinte:

a. Glicose – Método enzimático para a determinação de glicose no sangue e

outros líquidos biológicos (Trinder 1969)

Glicose + O

+ H

O ácido glucônico + H

+ 4-AF + 4-hidroxibenzoato coloração vermelha

b. Protéinas – Método do Biureto, método colorimétrico para a determinação

de proteínas totais ( Giese, Annino 1978).

As ligações de peptídeos das proteínas totais reagem com o íon

cúprico, em meio alcalino, para se obter um complexo de cor lilás com

máximo de absorbância a 540 nm, cuja intensidade é proporcional à

concentração de proteínas totais na amostra.

c. Uréia – Método cinético UV linear para a determinação de uréia ( Talke,

Schubert 1965).

urease

GOD

POD

Cirlane Silva Ferreira

Uréia + H

O 2NH

+ CO

+ NADH + H

+ 2-oxaglutarato L-glutamato + NAD

+ H

d. Cálcio – Método CFX Arsenazo, método colorimétrico direto para a

determinação de cálcio (Martinek 1971).

O cálcio reage com arsenazio III produzindo um complexo de cor azul

que se medi em fotocolorímetro a 650 nm.

e. Lactato Desidrogenase – Método UV otimizado para a determinação de

lactato desidrogenase (SFBC 1982).

Piruvato + NADH + H

L-lactato + NAD

f. Aminotransferase – Método UV otimizado para a determinação de alanina e

aspartato (IFCC1980).

L- alanina + 2-oxaglutarato Piruvato + L-glutamato

Piruvato + NADH + H

L-lactato + NAD

L-aspartato + 2-oxoglutarato oxalacetato + L-glutamato

Oxalacetato + NADH + H

L-malato + NAD

GIDH

LDH

GOT

MDH

LDH

Os testes foram realizados em analizador automático para Química

Clínica BT T.A.R.G.A. 3000 PLUS, produzido pela Biotécnica Instruments

S.p.A Roma, Itália, com pool de hemolinfa de 3 moluscos, as amostras foram

analisadas através de dosagens espectrofotométricas.

Os ácidos orgânicos citrato, propionato, α-cetoglutarato, succinato,

acetato, malato, fumarato, piruvato e lactato presentes na hemolinfa

centrifugada foram extraídos a partir de colunas de Bond-Elut® (SAX-anion

Exchange-quartenary amine, Analytichem Internacional, Habor City, USA)

como descrito por Bezerra et al. (1997, 1999).

Cirlane Silva Ferreira

Foram obtidas 14 colunas, sendo 6 no grupo controle, 4 a 25 mg/L e 4

a 50 mg/L, estas foram ativadas em uma caixa de vácuo, consecutivamente

com 1,0 ml de ácido clorídrico 0,5 mol/L; 1,0 ml de metanol e 2,0 ml de

água ultra filtrada (tipo miliq). Neste ponto, com a coluna já ativada e ainda

sob vácuo, adicionaram-se 200µL de hemolinfa seguidos de 2,0 ml de água

ultra filtrada. As colunas foram retiradas do vácuo, e com a finalidade de

eluir os ácidos orgânicos retidos na coluna, aplicaram-se em cada uma

250µL de ácido sulfúrico 0,5 mol/L, em seguida centrifugou-se as amostras,

ainda dentro das colunas de extração, a 500 g por 5 min e a 2 ºC.

A mistura resultante da centrifugação foi submetida a uma

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE–Varian ProSTAR) com uma

coluna de exclusão molecular BIORAD-Aminex HPX – 87H ( 300 X 7,8 mm),

protegida por uma coluna de proteção BIORAD-Aminex HPX – 85 acoplado a

um detector UV em comprimento de onda de 210 nm. Cada amostra injetada

correspondia a um volume de 80 µL. O eluente utilizado na fase móvel foi o

ácido sulfúrico (8 mmol/L) à temperatura de 30 ºC, com vazão de 0,8

mL/min

Todos os resultados encontrados no grupo controle e nos grupos

submetidos à exposição do extrato de S. polyphyllum a 25 e 50 mg/L

durante os experimentos foram agrupados em duas tabelas para facilitar a

compreensão e análise dos dados obtidos. A tabela 1 refere-se às análises

bioquímicas e a tabela 2 dispõe os resultados encontrados pela técnica da

Cromatografia Líquida.

Os resultados foram analisados em média ou mediana de acordo com

o teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Na análise estatística,

Cirlane Silva Ferreira

utilizou-se o teste de χ

para a relação do molusco em condição padrão com

aqueles frente ao extrato da planta em estudo, e o teste one way ANOVA e

Tukey para comparação entre as diferentes condições que os moluscos

foram submetidos. Considerou-se estatisticamente significativo o valor de

p<0,05.

RESULTADOS

Foram observadas, durante os experimentos, algumas mudanças

fisiológicas conforme os resultados obtidos na dosagem espectrofotométrica e

cromatografia líquida, nos moluscos sob a exposição ao extrato de S.

polyphyllum a 25 e 50 mg/L.

Cirlane Silva Ferreira

Dosagens espectrofotométricas:

Tabela 2. Análise bioquímica da hemolinfa de Biomphalaria glabrata

expostos ao extrato do caule de Stryphnodendron polyphyllum, nas

concentrações de 25 e 50mg/L.Valores em média±desvios padrão ou

mediana (mínimo - máximo).

Controle S. polyphyllum

25mg/L

S. polyphyllum

50mg/L

Glicose

(mmol/L)

2,86±0,77 4,05±0,90 8,22±1,88

Uréia

(mmol/L)

2,40±1,06 1,98±0,56 3,48±1,54

Proteína

(g/dL)

4,11±0,48 4,33±0,61 3,94±0,51

Cálcio

(mmol/L)

4,12±0,54 6,10±0,80 13,25±1,25

DHL

(U/L)

197,00 (137,00-

282,00)

28 (21,75 – 35,75) 30 (12,00 – 58,00)

ALT

(

U/L

)

198,50 (163,00–

268,00)

225 (208,50 –

283,75)

1290,00 (687,00 –

1539,00)

AST

(U/L)

330,00(277,00-

423,00)

338,00 (362,25-

459,75)

2072,00 (1545,75-

2978,25)

DHL-Lactato Desidrogenase, ALT – Alanina Aminotransferase, AST –

Aspartato Aminotransferase.

Glicose e Cálcio

A concentração de glicose encontrada na hemolinfa de B. glabrata

para o grupo controle foi de 2,86±0,768 mmol/L . Nos moluscos expostos

a 25 e 50 mg/L do extrato as concentrações foram de:

4,04±0,898mmol/L, e de 8,22±1,878 mmol/L, respectivamente.

A análise estatística permite verificar uma alteração significativa

entre a concentração de glicose do grupo mantido sob condições padrão e

os grupos expostos a 25 e 50 mg/L do extrato (p<0,001), (Fig.7, tabela 2).

Cirlane Silva Ferreira

A concentração de cálcio na hemolinfa dos moluscos do grupo

controle foi de 4,12±0,54mmol/L. Já as dosagens de cálcio na hemolinfa

do grupo exposto a 25 mg/L foi de 6,101±0,803mmol/L, mostrando uma

diferença significativa com relação ao grupo controle e o grupo exposto a

50 mg/L que apresentou uma concentração de 13,250±1,250mmol/L

(p<0,001), (Fig.7, tabela 2); ocorrendo assim uma variação significativa

entre todos os grupos estudados.

Mmol/L

controle 25 p

glicose

cálcio

pm 50 ppm

mg/L mg/L

Figura 7 – Taxas de concentração de glicose e cálcio na hemolinfa de

Biomphalaria glabrata exposto ao extrato do caule de Stryphnodendron

polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

Uréia e proteínas

O molusco sob condição padrão apresentou a seguinte

concentração de uréia: 2,397±1,056mmol/L. A taxa de uréia do grupo

exposto a 25 mg/L foi de 1,981±0,557mmol/L, enquanto que o grupo

exposto a 50 mg/L apresentou a taxa de 3,480±1,536mmol/L. A análise

Cirlane Silva Ferreira

estatística mostra que não há diferença entre o grupo controle e o exposto

a 25 mg/L (p>0,05) e somente a concentração de uréia na hemolinfa do

grupo exposto a 50mg/L foi estatisticamente diferente da concentração de

uréia na hemolinfa do grupo a 25mg/L (p=0,017), (Fig.8, tabela 2).

Os achados dos experimentos não mostram diferenças (p>0,05)

entre os níveis de proteínas no grupo controle e nos grupos submetidos à

exposição ao extrato do S. polyphyllum. A média do grupo controle foi de

4,11 ± 0,48 g/dL , nos teste expostos a 25 e 50mg/L as médias foram de

4,33 ± 0,61 g/dL e 3,94 ± 0,51 g/dL, respectivamente ( fig.8, tabela 2),

não ocorrendo assim diferença significativa entre os grupos de estudos.

Mmol/L

controle 25 ppm 50 p

Uréia

Proteína

mg/L

Figura 8 – Taxas de concentração de uréia e proteínas na hemolinfa de

Biomphalaria glabrata exposto ao extrato do caule de Stryphnodendron

polyphyllum, nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

Atividade Enzimática em B.glabrata

O resultado da atividade da enzima Lactato Desidrogenase no grupo

controle apresentou a mediana de 197,5 U/L, com o valor mínimo de 137

Cirlane Silva Ferreira

U/L e valor máximo de 282 U/L. Os moluscos expostos a 25 mg/L

apresentaram mediana de 28 U/L, com valores variando entre 21,75 e

35,75 U/L. Enquanto os moluscos expostos a 50 mg/L apresentaram

mediana de 30 U/L, com valores variando entre 12 e 58 U/L. Verifica-se

através da análise estatística, uma distribuição não normal, com

diferença significativa entre o controle e os testes a 25 e 50 mg/L, embora

não haja diferença entre os testes nas concentrações de 25 e 50 mg/L

(p<0,001), (Fig.9, tabela 2).

As transaminases são enzimas que catalisam a transferência de

grupamento amina de alfa-aminoácidos para alfa-acetoácidos. Os

resultados, em mediana, da atividade enzimática da ALT no grupo

controle foi de 198,5 U/L (163 a 268 U/L), não apresentando diferença

significativa com o grupo exposto a 25 mg/L que apresentou mediana 225

U/L (208,5 a 283,75 U/L). No grupo submetido a 50mg/L verificou-se a

mediana com o valor de 1290 U/L (687 a 1539 U/L), mostrando assim

uma variação estatística significativa (p<0,001).

Os resultados, em mediana, da atividade enzimática da AST do

grupo controle foi de 330 U/L (277 a 423 U/L), para o grupo exposto a 25

mg/L o resultado foi de 388 U/L (362,25 a 459,75 U/L) e para o grupo

exposto a 50 mg/L a atividade enzimática foi de 2072 U/L (1545,75 a

2978,25 U/L) (Fig.9, tabela 2).

Com isso, verifica-se que apenas o grupo exposto ao extrato na

concentração de 50 mg/L apresentou uma diferença estatística

importante com relação aos demais grupos (p<0,001).

Cirlane Silva Ferreira

500

1000

1500

2000

2500

U/L

ALT AST DHL

controle

25 ppm

50 ppm

Figura 9 – Taxas da atividade enzimática na hemolinfa de Biomphalaria

glabrata exposto ao extrato do caule de Stryphnodendron polyphyllum,

nas concentrações de 25 e 50 mg/L.

Dosagens pela Cromatografia Líquida

Os valores obtidos dos ácidos orgânicos: citrato, propionato, α-

cetoglutarato, succinato, acetato, malato, fumarato, piruvato e lactato a

partir da hemolinfa de B. glabrata em condição padrão referem-se ao

grupo controle. A exposição dos moluscos às concentrações de 25 e 50

mg/L do extrato de S. polyphyllum. A comparação entre estes valores

permitiu sugerir algumas modificações sobre o metabolismo dos

moluscos.

A exposição do molusco ao extrato da planta originou resultados de

distribuição não normal na maioria dos testes analisados na hemolinfa de

B. glabrata. Apenas o citrato e o propionato apresentaram diferenças

estatísticas significantes (p≤0,001). Para o grupo controle o citrato

apresentou a concentração mediana de 0,46 mmol/L, com valores

Cirlane Silva Ferreira

variando de 0,25 a 0,62 mmol/L, porém este não foi detectado na

hemolinfa dos moluscos expostos a 25 e 50 mg/L do extrato em estudo. O

propionato foi detectado nos três grupos e, para os dados obtidos, estes

resultados foram estatisticamente diferentes com relação ao grupo

controle e os testes expostos a 25 e 50 mg/L (p≤0,007). No grupo

controle, a concentração de propionato foi de 8,12 mmol/L (7,10 a 11,53);

a 25 mg/L o valor encontrado foi de 9,58 mmol/L ( 4,28 a 189,28) e a 50

mg/L sua concentração se elevou para 488,24 mmol/L (94,34 a 906,61).

O propionato apresentou uma diferença significativa quando o grupo

controle foi comparado com o teste exposto a 50 mg/L (p≤0,026), (tabela

3).

Os outros ácidos orgânicos como α-cetoglutarato, succinato,

acetato, malato fumarato, piruvato e lactato também foram detectados,

porém não apresentaram diferença estatística significante (p<0,05),

conforme tabela 3.

Cirlane Silva Ferreira

Tabela 3. Média e Mediana da concentração (mmol/L) de ácidos

orgânicos presentes na hemolinfa de Biomphalaria glabrata, grupo controle o

grupo teste exposto a 25 e 50 mg/L do extrato de Stryphnodendron

polyphyllum.

Ácidos

Orgânicos

Controle 25mg/L 50mg/L

Citrato* 0,46 (0,25-0,62) n.d. n.d.

Propionato

8,12 (7,10-

11,53)

9,58 (4,28-189,28) 488,24 (94,34-

906,61)

cetoglutarato n.d. 3,90 (0,0-9,04) 9,67 (4,10-13,08)

Succinato 3,13 (1,82-4,99) 4,05 (2,66-7,80) 45,84 (18,64-78,78)

Acetato 3,70 (0,74-5,39) 58,72 (4,03-

119,12)

118,43 (40,17-166,87

)

Malato 3,69 (2,09-7,25) 2,51 (0,73-6,55) 40,16 (19,74- 46,50)

Fumarato 0,12 (0,03-0,16) 0,12 (0,03-0,45) 0,13 (0,07-0,16)

Piruvato 0,19 (0,07-0,24) 0,13 (0,0-0,37) n.d.

Lactato 0,55 ±0,28 0,22 ±0,19 0,61 ±0,21

• *valores com diferença estatisticamente significativa.

n.d. não detectado

DISCUSSÃO

O uso de plantas com propriedades moluscicidas vem sendo

considerado desde que se descobriu na Etiópia, que os frutos da Phytolacca

dodecandra, possuíam a propriedade de interferir no metabolismo dos

moluscos transmissores da esquistossomose. Esta doença, endêmica em

várias regiões do Brasil, tem uma ampla distribuição geográfica dos

moluscos hospedeiros intermediários do S. mansoni (Schaufelberger,

Hostettmann 1983; Souza et al. 1992).

Em estudos preliminares realizados por nossa equipe, os extratos da

casca e folha de S. polyphyllum foram utilizados em testes de mortalidade de

Cirlane Silva Ferreira

moluscos B. glabrata, expostos por 24 horas às soluções testes com

resultados de 70% de eficácia moluscicida a 50 mg/L a partir do 3º dia de

observação (Bezerra et al. 2002).

Uma maneira de se atingir o objetivo de compreensão metabólica pode

ser através de bioensaios com produtos naturais, muitas vezes de uso

medicinal, encontrados na flora do Cerrado. Muitas dessas plantas são

consideradas taníferas, por apresentarem altos teores de taninos em suas

estruturas (Alcanfor et al. 2001).

Os taninos possuem a capacidade de complexar com proteínas,

polissacarídeos, alcalóides, íons metálicos como ferro, vanádio, cobre,

alumínio, cálcio e outros, além de atividade antioxidante e seqüestradora de

radicais livres. Testes in vitro demonstraram que fenóis e polifenóis inibem a

peroxidação de lipídios e lipogenases, assim como possuem a habilidade de

seqüestrarem radicais livres como: hidroxil, superperóxido e peroxil (Bezerra

et al. 1997, 1999, Gomes et al 1998, Foster et al. 1989, Herzog- Soares et al.

1999, Lima et al. 1998).

A glicose é o monossacarídeo mais comum na hemolinfa de

gastrópodes (Livingstone, de Zwaan 1983). Na classe Pulmonata de

moluscos diferentes estratégias podem ser desenvolvidas para o uso da

energia armazenada durante condições nutricionais adversas (Streit 1978).

No presente estudo, a concentração de glicose elevou-se de forma

significativa quando os moluscos foram expostos ao extrato de S.

polyphyllum, semelhante ao descrito por Wijsman et al. (1988), que relatam

hiperglicemia devido à anoxia química (sulfato de cobre) e anestesia

(Nembutal + MS 222) em Lymnaea stagnalis. Os autores concluíram que o

Cirlane Silva Ferreira

sulfato de cobre e anestesia induziam ao estresse (sem hiperlactatemia), mas

que a anóxia induzia a hiperglicemia para contrabalançar o uso inefetivo

anaeróbio de energia (hiperlactatemia drástica). Hiperglicemia, como uma

“reação de emergência” para o estresse, geralmente achada no reino animal e

no mecanismo intracelular (aumento de cAMP, análise do glicogênio) parece

ser onipresente (Marks 1979). A ausência de um efeito significante de

hipoglicemia em situação fisiológica de jejum, apresentado aqui, coincide

com os resultados de Liebsch e Becker (1990).

Com relação à avaliação do metabolismo do cálcio os resultados

mostraram um aumento nas concentrações deste, na hemolinfa dos

moluscos quando expostos por 24 horas ao extrato da casca de S.

polyphyllum. Alterações de cálcio em moluscos podem ser provocadas por

descalcificação da concha. O cálcio tem uma função muito importante na

biologia dos moluscos. Em B. glabrata o cálcio pode estar relacionado com a

produção e desenvolvimento de ovos e embriões (Shaw, Erasmus 1987).

Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Alcanfor (2001), porém

não estão de acordo com os resultados encontrados por Silva (2002) que fez

esta mesma análise sob condição de jejum e não se observou uma alteração

expressiva.

A biomineralização da concha de moluscos é um problema ainda não

resolvido pela ciência. A concha dos moluscos é constituída por carbonato de

cálcio e uma larga variedade de estruturas de cristais. É aceito pela maioria,

que a parte orgânica da concha é envolvida por uma determinada

quantidade de cristais modificados (Belcker et al. 1996). A matrix orgânica

consiste de proteínas e carboidratos (Marxen, Becker 1997) e o fornecimento

Cirlane Silva Ferreira

de ácidos ligados por todos os lados é determinante para a acumulação de

cálcio (Weiner, Addadi 1991).

Com referência ao metabolismo das proteínas, através da análise

estatística, foi verificado que as concentrações na hemolinfa dos moluscos

sob exposição ao extrato de S. polyphyllum e o grupo mantido sob condições

padrão não revelaram diferenças. Então as condições ecofisiológicas

adversas provocadas pelo extrato levam à morte dos moluscos, apesar de

existirem boas reservas de proteínas e lipídeos (Gress, Cheng 1973,

Michelson, DuBois 1975, Becker, Lüth 1977). Estes achados não estão de

acordo com os dados de Alcanfor (2001), que também expôs os moluscos ao

extrato de S. polyphyllum e Silva (2002) que encontrou uma redução nos

níveis de proteínas totais, quando submeteu os moluscos ao jejum e a

estivação.

Estudos mostram que a função fisiológica do ciclo da uréia consiste na

desintoxicação da amônia, ocorrendo um aumento na excreção e um

acúmulo de uréia quando B.glabrata está sob situações ecofisiológicas

adversas (Cheng, Lee 1971, Schmale, Becker 1977). Becker (1975) encontrou

valores de aproximadamente 0,26 mmol/L, neste trabalho o grupo controle

teve a concentração média de 2,4 mmol/L e quando o molusco foi exposto a

50 mg/L do extrato ocorreu uma maior excreção da uréia elevando sua

concentração para 3,48 mmol/L. Em B. glabrata a ativação enzimática do

ciclo da uréia pode surgir pelo aumento de nova síntese ou por restrição da

degradação das enzimas envolvidas, sendo que este mecanismo

provavelmente está sujeito à influência de substratos ou outros ativadores e

inibidores (Becker, Schmale 1975).

Cirlane Silva Ferreira

Observa-se que B. glabrata apresenta uma série de possibilidades

metabólicas que lhe permitem sobreviver temporariamente em condições

adversas. Obviamente, diferentes condições fisiológicas podem levar a

alteração na atividade de diferentes enzimas. O estudo da atividade de

algumas enzimas chave como um mecanismo de regulação fisiológica do

molusco pode representar alvo de estudo. Então se dosou a concentração

das enzimas transaminases-alanina aminotransferase (ALT), aspartato

aminotransferase (AST) - e a desidrogenase lática (LDH).

Testes farmacológicos e biológicos realizados com extratos ricos em

taninos têm identificado diversas atividades fisiológicas desta classe de

substância, como ação bactericida e fungicida, antiviral, moluscicida,

inibição de enzimas como glucosiltransferases de Streptococcus mutans e S.

sobrinus (Carmona 1994, Haslan 1998).

As aminotransferases representam uma ligação importante entre as

vias metabólicas de carboidratos e aminoácidos. Considerando as alterações

na concentração de carboidratos (Wright 1966) e aminoácidos (Gilbertson et

al. 1967, Feng et al. 1970) em moluscos infectados, onde é comum encontrar

uma redução nos níveis de glicose e proteínas. Neste trabalho a atividade

das aminotransferases aumentaram de forma significativa após a exposição

ao extrato de S. polyphyllum na concentração de 50mg/L. Manohar et al

(1972) encontraram as mesmas mudanças nas aminotransferases em

Lymnaea luteola infectada com Prosthogonimus sp.

Douglas e Haskim (1972) encontraram um aumento de aspartato

aminotransferase na hemolinfa de ostras (Crassostrea virginica) expostas a

Cirlane Silva Ferreira

Minchinia nelsoni (pequenos endoparasitas de invertebrados marinhos, filo

dos protozoários no ramo alvelado).

Christie et al (1974a) analisaram estas aminotransferases em B.

glabrata, infectado com S. mansoni, e verificaram que existe uma

significativa diminuição na concentração de AST e ALT, que pode ser

causada pelo declíneo na concentração de proteínas. Pode haver também

uma diminuição na atividade específica de ALT no tecido do molusco com

progresso da infecção. As atividades específicas de transaminases no tecido

do molusco são mais baixas que o normal durante a infecção.

Esta oxidação de aminoácidos pode ocasionar acidose metabólica

(Patience 1983), conforme visto na dosagem de pH no artigo anterior.

Goldberg e Cather (1963 a, b) descreveram múltiplas formas de lactato

desidrogenase em um molusco e malato desidrogenaase em duas espécies de

moluscos, o que leva a crer que múltiplas formas de desidrogenases são

provavelmente comuns em moluscos. Neste trabalho a enzima, DHL, sofreu

uma redução significativa quando o B.glabrata foi exposto ao extrato de S.

polyphyllum. Mas Coles (1969) relatou que estas enzimas podem ser restritas

a uma população local de moluscos e em outras populações da mesma

espécie os resultados podem ser diferentes.

As análises realizadas pela técnica de cromatografia líquida tinham

como propósito o estudo da bioatividade da planta S. polyphyllum sobre a

hemolinfa de B. glabrata. Ácidos orgânicos são importantes componentes do

metabolismo intermediário e participam em ambas as vias: catabólica (ex.

glicólise) e anabólica (ex. gliconeogênese). O Piruvato é indicador de

processos glicolíticos sob condições aeróbias, o lactato é indicador de

Cirlane Silva Ferreira

processos sob condições anaeróbias, enquanto fumarato, succinato e malato

são indicadores do ciclo de Krebs ou produtos de metabolismo anaeróbio em

invertebrados (Bezerra, Becker 1993). A presença de corpos cetônicos, tal

como ß-hidroxibutirato e acetoacetato, assim como ácidos graxos, tal como

acetato e propionato, são indicativos para metabolismo de lipídios (Meyer et

al 1986, Bezerra, Becker 1993) (fig.10).

Produção de Ácidos Orgânicos

Glicólise

Piruvato

Lactato

Ciclo de Krebs

Succinato

Funarato

Malato

Ácidos Graxos

Acetato

Propionato

Corpos Cetônicos

Acetoacetato

Hidroxibutirato

Figura 10 – Esquema resumido da produção de ácidos orgânicos

(Bezerra et al 1997. Mem.Inst.Osvaldo).

Os resultados obtidos por Bezerra (1994) em B. glabrata com estudos

da concentração dos ácidos orgânicos succinato, malato e fumarato, sob

condições hipóxicas, evidenciou uma indicação para inversão parcial no ciclo

Cirlane Silva Ferreira

de Krebs como adaptação à nova circunstância metabólica, promovendo

desta forma a sobrevivência do mesmo. Esta adaptação estará originando

produtos finais do metabolismo anaeróbio em moluscos (Patiennce et al

1983). No presente trabalho não se evidenciou esta inversão do ciclo de

Krebs. Bezerra et al (1999) analisaram a hemolinfa de B.glabrata após 7 e 14

dias de estivação e verificaram que a concentração de acetato e piruvato

aumentou significativamente. Neste trabalho a situação de estresse foi

induzida pela presença do extrato de S. polyphyllum e as concentrações dos

ácidos orgânicos foram influenciadas de forma significativa para o citrato e o

propionato.

O trabalho desenvolvido enfatiza vários problemas críticos associados

com a investigação dos ácidos orgânicos de moluscos, porque existe uma

grande variação inerente na concentração destes ácidos na hemolinfa destes

moluscos, um grande número de amostras é necessário para se obter

diferenças estatísticas.

Seres vivos dependem de uma série de condições mínimas para que

suas funções sejam equilibradas e distribuídas propriamente pelo corpo,

afim de que os metabolismos possam ser exercidos de acordo com as

necessidades de vida do organismo. No meio aquático, a dependência de

vários fatores físicos, químicos e biológicos encontrados na água é de

importância vital aos que nela habitam. Esses fatores são naturalmente

mudados ou substituídos de forma constante, agindo de maneira altamente

influente nos organismos, necessitando de alguns ajustes para que tais

mudanças sejam assimiladas e corretamente direcionadas ao destino de

suas funções.

Cirlane Silva Ferreira

Obviamente, alterações fisiológicas podem levar a patologias. O

desenvolvimento de medicamentos ou de uma quimioterapia só será possível

se conhecermos características fisiológicas deste organismo e sua relação,

por isso, faz-se necessário que conheçamos a concentração de substâncias

intermediárias ou finais do metabolismo.

O estudo do metabolismo bioquímico do molusco, pode deduzir

algumas vias metabólicas alteradas, que irão proporcionar sua manutenção

por longos períodos e com isto interpretar e sugerir alternativas integradas

contra o molusco, evitando as estratégias metabólicas que permitam sua

sobrevivência (Bezerra e Becker 1993).

Cirlane Silva Ferreira

Conclusões Finais68

CONCLUSÕES FINAIS

1. A interação dos estudos em B. glabrata sob condições

ecofisiológicas adversas provocadas pela ação do extrato de S.

polyphyllum, produto natural extraído do caule da planta do Cerrado,

permite verificar uma influência na obtenção dos resultados analisados

na hemolinfa do molusco.

2. O extrato de S. polyphyllum, na concentração de 50 mg/L,

causou uma hiperglicemia na hemolinfa do molusco. As concentrações

de proteínas totais em B. glabrata após a exposição ao extrato da casca

do caule de S. polyphyllum não sofreram alterações. Ocorreu um

aumento na excreção da uréia. O extrato testado interferiu no

metabolismo de cálcio, aumentando sua concentração.

3. A atividade enzimática também sofreu influência do extrato

estudado, as concentrações das enzimas alanina e aspartato

aminotransferases elevaram-se de forma significante e a concentração de

lactato desidrogenase sofreu uma redução importante na concentração

de 50 mg/L apenas.

4. A avaliação das concentrações dos ácidos orgânicos sob a ação

do extrato de S. polyphyllum permitiu verificar a presença dos ácidos

citrato, propionato, cetoglutarato, succinato, acetato, malato, fumarato,

piruvato e lactato com uma alteração significativa sobre o citrato e o

propionato, indicando assim que os testes expostos à dose sub letal de

Cirlane Silva Ferreira

Conclusões Finais69

50 mg/L influenciaram no metabolismo do ciclo de Krebs e ácidos

graxos.

5. No estudo do equilíbrio ácido-base verificou-se na hemolinfa

uma diminuição significativa no pH, na pressão de gás oxigênio, íons

carbonatos e na saturação de gás oxigênio. Por outro lado, houve um

aumento na pressão de gás carbônico, quando estes foram submetidos

ao extrato na concentração de 50 mg/L.

6. A grande maioria dos processos bioquímicos é extremamente

sensível à variação do pH. A manutenção do pH é conseguida pelos seres

vivos graças à existência dos sistemas-tampão. O teor de íons hidrogênio

é regulado por uma série de tampões, e dentre as substâncias que atuam

como tampões, destacam-se as hemoglobinas, as proteínas, os fosfatos e

o sistema de bicarbonato, sendo este o mais importante, pois se encontra

presente em grandes quantidades, porém o extrato de S. polyphyllum

parece que impediu que este sistema funcionasse de forma efetiva.

7. Os resultados encontrados mostram perspectivas promissoras

para o controle da esquistossomose, visam não só ao combate do

hospedeiro intermediário, mas também a preservação deste rico bioma,

como potencial fonte de alternativas de produtos naturais para usos

diversos, que está sofrendo acelerado processo de destruição.

Cirlane Silva Ferreira

Considerações Finais70

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Esta investigação confirma a bioatividade do extrato aquoso de S.

polyphyllum sobre o B.glabrata, hospedeiro intermediário do S. mansoni.

Uma das principais contribuições da presente metodologia empregada é a

observação pós-contato direto com o extrato, que demonstrou uma

bioatividade sobre o metabolismo do molusco.

A análise de extrato aquoso obtido do caule do barbatimão pode

subsidiar novas alternativas de menor custo financeiro no controle da

esquistossomose no Brasil, onde o Cerrado é vasto e a carência de recursos é

freqüente no setor da saúde.

O estudo do metabolismo bioquímico do molusco nos permite deduzir

algumas vias metabólicas alteradas, que irão proporcionar sua manutenção

por longos períodos, além de interpretar e sugerir alternativas integradas

contra o molusco, evitando as estratégias metabólicas que permitam a sua

sobrevivência (Bezerra, Becker 1993).

Os mecanismos de ação dos taninos ainda não foram bem

esclarecidos. Entretanto, se for constatado que os taninos são menos tóxicos

para organismos não alvos do que outros compostos com ação moluscicida,

eles constituirão uma classe poderosa de produtos naturais (Marston,

Hostetmann 1985).

Um programa integrado envolvendo melhoria nas condições sanitárias,

juntamente com a quimioterapia de pacientes e a aplicação de moluscicidas

adequados, educação e saúde em zonas endêmicas da esquistossomose,

poderá reduzir a ocorrência da doença em grandes áreas endêmicas. Nesse

Cirlane Silva Ferreira

Considerações Finais71

sentido as plantas moluscicidas são de grande importância no controle dos

focos da infecção, complementando outras medidas de prevenção da

esquistossomose.

O Brasil é um país de contrastes, onde as desigualdades sócio-

econômicas perduram em pleno ano 2006. A ausência de programas sólidos

em saúde pública e na educação é uma das grandes causas das diferenças

nas camadas sociais. Poucos são aqueles que possuem acesso às melhorias

de vida, obtidas ao longo da evolução lenta de nossos governantes.

Enfrentamos em nosso cotidiano, ao longo do ano, o surgimento de doenças

outrora já controladas pela simples falta de educação e saneamento básico,

ou continuidade de investimentos.

Além das notórias deficiências dos serviços de saúde, principalmente

nas áreas periféricas da maioria dos países em desenvolvimento, constata-se

grande falta de pessoal qualificado, em todos os níveis, reduzida circulação

das informações científicas, nesses meios. Essa situação se agrava na

medida em que nos afastamos dos centros culturais e onde velhos

preconceitos prevalecem, ou subsiste uma cultura folclórica com noções e

práticas atrasadas de séculos ou milênios.

Afinal, tudo se passa como se não existissem, já, os conhecimentos

para solucionar os problemas e para implantar as medidas de controle da

esquistossomose se fazem necessárias.

Cirlane Silva Ferreira

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ANEXOS

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ANEXOS

Anexo 1 Tabela das dosagens bioquímicas e dosagens do equilíbrio ácido-base do grupo controle.

Contr ol

1 2

glicose 2,44 3,05

2,05

1,94

2,11

4,00

2,88

3,05

2,94

4,16

ureia 1,83 2,33

2,50

3,00

2,66

1,83

4,66

0,50

2,00

proteina 4,20 4,80

3,40

3,30

4,40

4,60

4,10

3,90

4,40

4,00

calcio 4,35 4,42

3,52

3,60

4,82

4,35

4,55

3,52

4,62

3,42

DHL 210,00 130,00

210,00

168,00

185,00

289,00

66,00

282,00

137,00

284,00

ALT 163 186

188

102

251

298

278

209

268

AST 277 284

151

324

232

553

423

336

420

567

pH 7,75 7,74

7,68

7,62

7,66

7,59

7,54

7,65

7,64

7,55

pCO2 11,00 11,00

11,00

17,00

13,00

14,00

17,00

14,00

12,00

17,00

pO2 145,00 123,00

110,00

136,00

139,00

125,00

156,00

168,00

105,00

138,00

HCO3- 16,00 16,00

14,00

18,00

15,00

14,00

15,00

13,00

15,00

SO2 99,00 99,00

99,00

100,00

99,00

Tabela das dosagens bioquímicas e dosagens do equilíbrio ácido-base do grupo exposto a 25 mg/L/24h.

25mg/L

1 2

6 7

glicose 3,11 4,94

3,00

3,66

3,50

4,05 3,83

3,55

5,39

5,44

ureia 2,66 1,33

1,33

2,00

1,50

1,50 2,50

1,83

2,50

2,66

proteina 3,10 5,10

4,70

4,20

3,60

4,70 4,10

4,30

4,80

4,70

calcio 7,20 5,35

5,35

7,00

6,45

7,02 5,07

5,82

6,35

5,40

DHL 28,00 15,00

43,00

41,00

34,00 32,00

7,00

24,00

ALT 423 225

269

189

209 207

209

328

227

AST 751 338

458

367

396 388

368

465

348

pH 7,20 7,70

7,76

7,57

7,74

7,61 7,62

7,58

7,55

7,60

pCO2 18,00 12,00

11,00

14,00

12,00

15,00 13,00

14,00

17,00

15,00

pO2 97,00 14,00

173,00

139,00

146,00

154,00 150,00

86,00

216,00

164,00

HCO3- 7,00 15,00

16,00

12,00

16,00

15,00 14,00

13,00

15,00

SO2 96,00 99,00

100,00

99,00

99,00 99,00

98,00

100,00

99,00

Cirlane Silva Ferreira

Tabela das dosagens bioquímicas e dosagens do equilíbrio ácido-base do grupo exposto a 50mg/L/24h.

mg/L

5 6

glicose 5,50

10,33

8,55

8,83

7,94 8,72

5,28

11,16

7,05

8,88

ureia 6,00

3,50

5,66

2,50

2,33 1,50

2,66

3,83

4,66

2,16

proteina 3,30

4,40

3,50

4,50 3,80

3,60

4,70

3,70

4,40

calcio 11,85

13,85

11,87

14,17

14,07 13,55

14,65

12,07

11,65

14,77

DHL 47,00

12,00

8,00

21,00

39,00

58,00

19,00

10,00

ALT 1875,00

1175,00

1405,00

672,00

687,00 1539,00

487,00

1618,00

1490,00

944,00

AST 3528

2040

2795

1284 2072

997

2313

3627

1633

pH 6,68

6,84

6,48

7,03

6,90 6,93

7,12

6,83

6,76

7,13

pCO2 27,00

38,00

58,00

37,00

38,00 44,00

47,00

26,00

37,00

39,00

pO2 19,00

84,00

41,00

70,00

91,00 123,00

44,00

66,00

78,00

51,00

HCO3- 3,00

6,00

4,00

9,00

7,00 9,00

15,00

4,00

5,00

13,00

SO2 99,00

86,00

20,00

86,00

90,00 96,00

64,00

75,00

80,00

75,00

Tabela das dosagens dos ácidos orgânicos do grupo controle.

oxalat

citrat

propionat

succinat

cetoglutara

acetato malat

fumarat

pituvat

Lactat

control

e 1

Nd 0,566

7,0987

0,7394

7,252

0,1762

0,2783

control

e 2

Nd 0,616

7,5771

10,3177

2,175

0,1161

0,1637

control

e 3

Nd 0,348

21,6616

2,0831

2,088

0,1208

0,2378

control

e 4

2,91 0,245

6,802

5,3864

7,441

0,0263

0,0704

control

e 5

Nd 0,658

11,5255

0,945

5,211

0,1639

0,214

0,082

control Nd 0,235 8,6573

5,3186

1,002 0,0168

0,0255

Cirlane Silva Ferreira

e 6 9

Cirlane Silva Ferreira

Tabela das dosagens dos ácidos orgânicos do grupo exposto a 25 mg/L

oxalat

citrat

propionat

succinat

cetoglutarat

acetato malat

fumarat

piruvat

lactat

spc 25

Nd Nd

8,5629

3,5961

10,2659

109,371

0,859

0,1789

spc 25

Nd Nd

10,5988

11,0952

8,942

0,7226

0,2611

spc 25

Nd Nd

367,9618

4,5101

128,871

4,158

0,482

spc 25

Nd Nd

1,7297

7,8056

8,0705

0,598

0,0664

Tabela das dosagens dos ácidos orgânicos do grupo exposto a 50 mg/L

oxalat

citrat

propionat

succinat

cetoglutarat

acetato malato

fumarat

piruvat

lactat

spc 50

15,0231 80,3498

39,473

0,508

spc 50

30,7454

11,1455 Nd

0,1837

spc 50

818,545

Nd 177,230

52,154

0,1321

spc 50

157,9257

37,28

8,2048 156,519

40,850

0,1346

0,686

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