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UFSM
Tese de Doutorado
ANTIMICROBIAL CIPROFLOXACINA EM EFLUENTE
HOSPITALAR: EXPOSIÇÃO AMBIENTAL, AVALIAÇÃO DE
RISCO E DEGRADAÇÃO ATRAVÉS DE PROCESSOS
AVANÇADOS DE OXIDAÇÃO
Tibiriçá Gonçalves Vasconcelos
PPGQ
Santa Maria - RS, BRASIL
2006
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2
ANTIMICROBIAL CIPROFLOXACINA EM EFLUENTE
HOSPITALAR: EXPOSIÇÃO AMBIENTAL, AVALIAÇÃO DE
RISCO E DEGRADAÇÃO ATRAVÉS DE PROCESSOS
AVANÇADOS DE OXIDAÇÃO
Tibiriçá Gonçalves Vasconcelos
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química, Área de
Concentração em Química Analítica, da Universidade Federal de
Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do
grau de
DOUTOR EM QUÍMICA
PPGQ
Santa Maria, RS, Brasil
2006
Universidade Federal de Santa Maria
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3
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
Centro de Ciências Naturais e Exatas
Programa de Pós-Graduação em Química
A comissão examinadora, abaixo assinada,
aprova a tese de doutorado
ANTIMICROBIAL CIPROFLOXACINA EM EFLUENTE HOSPITALAR:
EXPOSIÇÃO AMBIENTAL, AVALIAÇÃO DE RISCO E DEGRADAÇÃO
ATRAVÉS DE PROCESSOS AVANÇADOS DE OXIDAÇÃO
elaborada por
TIBIRIÇÁ GONÇALVES VASCONCELOS
Como requisito parcial para obtenção do grau de doutor em química
COMISSÃO EXAMINADORA:
Prof. Dr. Ayrton F. Martins - Orientador
Universidade Federal de Santa Maria
Profª. Drª. Martha Bohrer Adaime
Universidade Federal de Santa Maria
Prof. Dr. Adilson Bem da Costa
Universidade de Santa cruz do Sul
Prof. Dr. Airton Kunz
Universidade de Santa cruz do Sul
Profª. Drª. Rejane Helena Ribeiro da Costa
Universidade Federal de Santa Catarina
Santa Maria, 01 de setembro de 2006
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus orientadores Prof. Dr. Ayrton Figueiredo Martins e Prof. Dr.
Klaus Kümmerer pela oportunidade e confiança, aos meus colegas do Laboratório de
Tratamento de Efluentes e Resíduos da Universidade Federal de Santa Maria e da
Seção de Epidemiologia e Medicina Ambiental do Hospital Universitário de
Freiburg pelo companheirismo, às bancas examinadoras do exame de
qualificação e defesa pela valiosa contribuição e a todas as pessoas que de
alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Agradeço também a minha família pelo apoio e especialmente a minha
esposa Ana Carla pelo amor e compreensão.
Agradeço à Universidade Federal de Santa Maria, à Universidade de
Freiburg, ao CNPp, ao CT-Hidro e ao DAAD pela infra-estrutura e suporte financeiro
para a realização deste trabalho.
vii
vii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS-------------------------------------------------------------------------- ix
LISTA DE FIGURAS --------------------------------------------------------------------------- x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ------------------------------------------- xii
RESUMO ----------------------------------------------------------------------------------------xiv
ABSTRACT -------------------------------------------------------------------------------------xvi
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ----------------------------------------------------------- 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ------------------------------------------------------------- 5
2.1. Fármacos no meio ambiente ---------------------------------------------------------------- 5
2.2. Uso de antibióticos --------------------------------------------------------------------------- 6
2.3. Destino, ocorrência, efeitos e riscos da ciprofloxacina no meio ambiente------------ 9
2.4. Degradação da ciprofloxacina: características relevantes ----------------------------- 13
2.4.1 Fotosensibilidade da ciprofloxacina ---------------------------------------------------- 13
2.4.2. Reatividade entre ozônio e ciprofloxacina-------------------------------------------- 15
2.5. Processos avançados de oxidação -------------------------------------------------------- 15
3. MATERIAIS E MÉTODOS -------------------------------------------------------------- 16
3.1. Materiais------------------------------------------------------------------------------------- 16
3.2. Reagentes e soluções----------------------------------------------------------------------- 16
3.3. Determinação de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM ------------------------- 16
3.3.1. Coleta de amostras ----------------------------------------------------------------------- 16
3.3.2. Caracterização das amostras ------------------------------------------------------------ 17
3.3.3. Determinação cromatográfica da concentração de ciprofloxacina----------------- 19
3.4. Degradação fotoinduzida de ciprofloxacina em solução sintética-------------------- 21
3.4.1. Estudo cinético --------------------------------------------------------------------------- 21
3.4.2. Estudo da biodegradabilidade ---------------------------------------------------------- 22
3.4.3. Estudo quantitativo de ciprofloxacina e qualitativo de seus metabólitos de
fotodegradação----------------------------------------------------------------------------------- 23
3.5. Processos avançados de oxidação na degradação de ciprofloxacina em efluente do
PA-HUSM ---------------------------------------------------------------------------------------- 23
3.5.1. Amostras ---------------------------------------------------------------------------------- 23
3.5.2. Determinações analíticas ---------------------------------------------------------------- 24
3.5.3. Processo fotoinduzido ------------------------------------------------------------------- 24
3.5.4. Fotocatálise heterogênea ---------------------------------------------------------------- 24
viii
viii
3.5.5. Ozonização e peroxônio----------------------------------------------------------------- 25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO---------------------------------------------------------- 27
4.1. Cito/genotoxicidade do efluente do PA-HUSM---------------------------------------- 27
4.2. Determinação de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM-------------------------- 28
4.3. Degradação fotoinduzida de ciprofloxacina em solução sintética-------------------- 35
4.3.1. Estudo cinético --------------------------------------------------------------------------- 35
4.3.2. Estudo da biodegradabilidade ---------------------------------------------------------- 37
4.3.3. Subprodutos de degradação------------------------------------------------------------- 40
4.4. Processos avançados de oxidação na degradação de ciprofloxacina no efluente do
PA-HUSM ---------------------------------------------------------------------------------------- 49
5. CONCLUSÕES------------------------------------------------------------------------------ 55
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ------------------------------------- 58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS -------------------------------------------------- 59
ix
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Concentrações ambientais de ciprofloxacina ------------------------------------ 10
Tabela 2. Escala de fatores de indução e relação com efeitos genotóxicos-------------- 12
Tabela 3. Estudos envolvendo fotodegradação da ciprofloxacina ------------------------ 14
Tabela 4. Características das amostras de efluente do PA-HUSM tomadas em P1 e que
foram utilizadas no estudo envolvendo PAOS----------------------------------------------- 18
Tabela 5. Condições das células das radículas de Allium cepa durante o ciclo mitótico27
Tabela 6. Figuras de mérito do procedimento 1 usado na determinação de
ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM ---------------------------------------------------- 29
Tabela 7. Concentrações de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM medidas nos
pontos P1 e P2------------------------------------------------------------------------------------ 31
x
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema do sistema de esgotos da unidade de Pronto Atendimento do
Hospital Universitário de Santa Maria---------------------------------------------------------- 3
Figura 2. Fontes e distribuição de fármacos no meio ambiente----------------------------- 8
Figura 3. Estrutura da ciprofloxacina----------------------------------------------------------- 9
Figura 4. Processos fotoquímicos relevantes para fluoroquinolonas--------------------- 14
Figura 5. Sistemas utilizados na degradação fotoinduzida e fotocatalítica da
ciprofloxacina em amostras de efluente do PA-HUSM.------------------------------------ 25
Figura 6. Sistema utilizado nos processos de ozonização --------------------------------- 26
Figura 7. Divisão mitótica de células de radículas de Allium cepa. ---------------------- 28
Figura 8. Espectros de massas no tempo de retenção característico da ciprofloxacina,
obtidos através do procedimento 2, na determinação por LC-MS------------------------- 30
Figura 9. Variação da concentração de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM após
passagem pelo sistema de tratamento --------------------------------------------------------- 34
Figura 10. Frações das microespécies da ciprofloxacina em diferentes pH ------------- 35
Figura 11. Processo fotoinduzido de degradação de ciprofloxacina em solução sintética37
Figura 12. Pronta biodegradabilidade de soluções sintéticas de ciprofloxacina, medida
através de CBT, durante processo fotoinduzido --------------------------------------------- 39
Figura 13. Variação de concentração de ciprofloxacina em diferentes amostras de
processo fotoinduzido (amostras dos tempos 0, 2 e 4 min) durante os 28 dias de análise
do CBT- 39
Figura 14. Espectros de fluorescência de amostras de solução sintética de
ciprofloxacina tomadas em diferentes tempos (0, 2 e 4 min) de processo fotoinduzido
com identificação dos sinais de interesse----------------------------------------------------- 40
Figura 15. Metabólitos possivelmente formados e suas respectivas massas ------------ 41
Figura 16. Espectros de massas obtidos através de análise por LC-MS referentes ao
tempo de retenção 7,5, característico do sinal 1 (sinal obtido através de análise por
HPLC-FLD – Figura 14) durante diferentes tempos (0, 2 e 4 min) de processo
fotoinduzido -------------------------------------------------------------------------------------- 42
Figura 17. Espectros de massas obtidos através de análise por LC-MS referentes ao
tempo de retenção 7,2 min, característico do sinal 2 (sinal obtido através de análise por
HPLC-FLD, Figura 14) durante diferentes tempos (0, 2 e 4 min) de processo
fotoinduzido -------------------------------------------------------------------------------------- 43
xi
xi
Figura 18. Fotometabólitos de ciprofloxacina em solução aquosa formados em
diferentes condições e suas respectivas rotas reacionais------------------------------------ 45
Figura 19. Compostos provavelmente formados durante degradação fotoinduzida de
ciprofloxacina em solução sintética (pH 9 e em meio a HO
-
) e rotas possíveis --------- 47
Figura 20. Compostos com maior probabilidade de serem formados durante degradação
fotoinduzida de ciprofloxacina em solução sintética (pH 9 e em meio HO
-
) e rotas
reacionais possíveis------------------------------------------------------------------------------ 48
Figura 21. PAOs na degradação de ciprofloxacina em efluente do PA-HUSM -------- 50
Figura 22. Cromatogramas de soluções do efluente do PA-HUSM durante ozonização
como um modelo do perfil dos metabólitos, primariamente formados, em função do
tratamento com PAOs--------------------------------------------------------------------------- 54
xii
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
τ
- Tempo de existência
Φ - Rendimento quântico
λ
max
T-T
- Comprimento de onda máximo de absorção triplete-triplete
ε
T
max
- Absortividade triplete molar
1
O
2
- Oxigênio no estado singlete
CAM - Concentrações ambientais medidas
CAP - Concentração ambiental predita
CBT - Closed bottle test
CE - Concentração efetiva
CE
0
- Concentração efetiva de inibição em algum grau do crescimento
CE
100
- Concentração efetiva de inibição de 100% do crescimento
CE
50
- Concentração efetiva de inibição de 50% do crescimento
CEO - Concentração de efeito observado
CIP - Ciprofloxacina
CPENO - Concentração predita de efeito não observado
DQO - Demanda química de oxigênio
ETE - Estação de tratamento de esgotos
FI - Fator de indução
FQ - Fluoroquinolonas
FQ
1
*- Fluoroquinolonas no estado singlete
FQ
3
*- Fluoroquinolonas no estado triplete
HPLC-FLD - Cromatografia líquida com detecção de fluorescência
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência
HUSM - Hospital Universitário de Santa Maria
IM - Índice mitótico
ISC - Cruzamentos intersistemas
K - Constante de velocidade de reação
k’’
app
- Constante aparente de velocidade de reação
LATER - Laboratório de Tratamento de Efluentes e Resíduos
LC-MS - Cromatografia líquida com detecção de massas
LD - Limite de detecção
xiii
xiii
log K
d
- Coeficiente de partição
log K
ow
- Coeficiente de partição octanol-água
LQ - Limite de quantificação
P1 - Ponto de coleta 1 (antes do sistema de fossa séptica e filtro anaeróbio da rede PA-
HUSM)
P2 - Ponto de coleta 2 (depois do sistema de fossa séptica e filtro anaeróbio da rede PA-
HUSM)
PA-HUSM - Pronto Atendimento do Hospital Universitário de Santa Maria
PAOs - Processos avançados de oxidação
ST - Sólidos totais
T-T - Absorção triplete-triplete
t - Tempo
t
1/2
- Tempo de meia-vida
ThOD - Demanda teórica de oxigênio
UFSM - Universidade Federal de Santa Maria
VMT - Valor médio teórico
xiv
xiv
RESUMO
ANTIMICROBIAL CIPROFLOXACINA EM EFLUENTE
HOSPITALAR: EXPOSIÇÃO AMBIENTAL, AVALIAÇÃO DE RISCO E
DEGRADAÇÃO ATRAVÉS DE PROCESSOS AVANÇADOS DE
OXIDAÇÃO
Autor: Tibiriçá Gonçalves Vasconcelos
Orientador: Ayrton Figueiredo Martins
Neste trabalho, investigou-se a presença do antimicrobial ciprofloxacina (CIP)
em efluente do Pronto Atendimento do Hospital Universitário de Santa Maria (PA-
HUSM) e a sua destruição através de processos avançados de oxidação (PAOs) -
processo fotoinduzido (lâmpada de Hg de média pressão de 125 W, reator em batelada
com recirculação, pH 3), fotocatálise heterogênea (lâmpada de Hg de média pressão de
125 W, reator tubular helicoidal, pH 3, 400 mg TiO
2
), ozonização e peroxônio (450 mg
h
-1
de O
3
, pH 9, sistema de semi-batelada e 500 mg H
2
O
2
L
-1
no caso do peroxônio). A
determinação de CIP, realizada através de cromatografia líquida com detector de
fluorescência (HPLC-FLD), envolveu dois pontos de amostragem: antes (P1) e depois
(P2) do sistema de tratamento (fossa séptica e filtro anaeróbio) durante 7 dias. As
concentrações ambientais medidas (CAMs) foram 19-155 µg L
-1
(média: 65±45 µg L
-1
)
e 32-99 µg L
-1
(média: 54±21 µg L
-1
) em P1 e P2, respectivamente. Realizou-se
avaliação de risco baseado nas CAMs e em dados ecotoxicológicos retirados da
literatura. Usando-se três diferentes valores de concentrações preditas de efeito não
observado (CPENO), foram calculadas razões CAM/CPENO entre 4-1.980. Estes
quocientes indicam alto risco ao meio ambiente e a necessidade de um projeto de
gerenciamento de risco. Além disso, estes valores são 48-3.300 vezes maiores que
aqueles encontrados em países desenvolvidos, o que significa uma situação bem mais
crítica do que as que vinham sendo reportadas e mundialmente discutidas. Na aplicação
de PAOs ao efluente do PA-HUSM a oxidação fotoinduzida demonstrou ser muito mais
lenta quando comparada aos outros processos: tempo de meia-vida (t
1/2
) da CIP durante
degradação fotoinduzida foi de 2,5 h, enquanto durante os processos de fotocatálise
heterogênea, peroxônio e ozonização, t
1/2
foi 20, 15 e 9 min, respectivamente. Os
melhores resultados obtidos para a ozonização na degradação de CIP foram
conseqüência da maior reatividade do fármaco com ozônio do que com espécies
radicalares formadas durante os processos. Porém, no que diz respeito à redução da
demanda química de oxigênio (DQO) e absorbância integrada, os processos peroxônio e
de fotocatálise heterogênea, (maior capacidade de geração de HO•) foram mais efetivos
que os processos fotoinduzido e de ozonização (menor capacidade de geração de HO•).
Os produtos formados durante os diferentes processos demonstraram ser bastante
semelhantes. Avaliou-se também a degradação fotoinduzida de CIP em solução sintética
(lâmpada de Hg de média pressão de 150 W, reator em batelada), em concentração
ambiental de 0,1 mg L
-1
(0,3 x 10
-3
mol L
-1
) e pH 9 (NH
4
Cl/KOH) por meio de HPLC-
FLD. A taxa de reação de primeira ordem e t
1/2
foram 1,56 ±0,11 x 10
-2
s
-1
e 44±7 s,
respectivamente. As estruturas dos fotometabólitos foram investigadas através de
cromatografia líquida com detecção de massas (LC-MS). Cinco prováveis
fotometabólitos primários foram identificados e demonstraram não ser prontamente
biodegradáveis frente a closed bottle test (CBT). Estes compostos são produtos de
xv
xv
defluoração, descarboxilação e abertura do anel piperazínico e já foram identificados em
estudos anteriores, porém, nunca nas condições testadas na presente investigação.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Autor: Tibiriçá Gonçalves Vasconcelos
Orientador: Ayrton Figueiredo Martins
Título: Antimicrobial ciprofloxacina em efluente hospitalar: exposição ambiental,
avaliação de risco e degradação através de processos avançados de oxidação.
Tese de Doutorado
Santa Maria, 1 de setembro de 2006
xvi
xvi
ABSTRACT
ANTIMICROBIAL CIPROFLOXACIN IN HOSPITAL EFFLUENT:
ENVIRONMENTAL EXPOSURE, RISK ASSESSMENT AND
DEGRADATION BY ADVANCED OXIDATION PROCESSES
Author: Tibiriçá Gonçalves Vasconcelos
Adviser: Ayrton Figueiredo Martins
In the present study, the presence of the antimicrobial ciprofloxacin (CIP) in effluent
from the first-aid clinic of the University Hospital of Santa Maria (PA-HUSM) and its
degradation by advanced oxidation processes (AOPs) - photo-induced process (medium
pressure Hg-lamp 125 W, batch recirculation reactor, pH 3), heterogeneous catalysis
(medium pressure Hg-lamp 125 W, helicoidal tubular reactor, pH 3, 400 mg TiO
2
),
ozonation and peroxone (450 mg O
3
h
-1
, pH 9, semi-batch system, 500 mg H
2
O
2
L
-1
for
peroxone) were investigated. Determination of the CIP concentration developed by high
pressure liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) was
measured before (P1) and after (P2) treatment system (cesspit and anaerobic filter),
during 7 days. Measured environmental concentrations (MECs) were 19-155 µg L
-1
(average: 65±45 µg L
-1
) and 32-99 µg L
-1
(average: 54±21 µg L
-1
) in P1 and P2,
respectively. In addition, risk assessment based on the MECs and ecotoxicity data from
the literature was proposed. Using three different values of predicted no-effect
concentration (PNEC), MECs/PNEC ratios between 4-1,980 were calculated. These risk
quotients imply a high risk for a negative impact of CIP to aquatic environment and
suggest that risk management is necessary. These quotients are 48-3,300-fold higher
than those found in developed countries and mean a worse-case than the discussed wide
world until now. Regarding the treatment of the effluent by AOPs, photo-induced
degradation was slowest than the other processes: half-life (t
1/2
) during photo-induced of
CIP was 2.5 h, while heterogeneous photocatalysis, peroxone and ozonation presented
20, 15 and 9 min, respectively. The best results obtained through ozonation were
consequence of the higher reactivity of CIP with ozone than with radicalar species
formed during the processes. However, about chemical oxygen demand (COD) and
integrated absorbance, peroxone and heterogeneous photocatalysis (higher capacity for
hydroxyl radical generation) were more effective than the photo-induced and ozonation
processes (lower hydroxyl radical generation capacity). The metabolites formed during
the processes demonstrated to be very similar. In addition, photo-induced degradation of
CIP (medium pressure Hg-lamp 150 W, batch reactor) in environmental concentration
of 0.1 mg L
-1
(0.3 x 10
-6
mol L
-1
) and pH 9 (NH
4
Cl/KOH) was studied. The first order
rate constant and half-life were 1.56 ±0.11 x 10
-2
s
-1
(R
2
> 0.999) and 44±7 s,
respectively. The first formed metabolites were identified by HPLC-FLD and high
pressure liquid chromatography with mass detection (LC-MS). Five compounds were
qualitatively identified as probable metabolites and were not ready biodegradable by
closed bottle test (CBT). They would be products from reactions of defluorination,
decarboxilation and break of the piperazine ring. They have been already reported in the
literature but under other conditions.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
xvii
xvii
Author: Tibiriçá Gonçalves Vasconcelos
Adviser: Ayrton Figueiredo Martins
Title: Antimicrobial ciprofloxacin in hospital effluent: environmental exposure,
risk assessment and degradation by advanced oxidation processes.
PhD Thesis
Santa Maria, September 1
st
, 2006
1
1. Introdução e objetivos
“Fármacos no meio ambiente” é um campo que tem despertado crescente
interesse da comunidade científica. A ocorrência, os efeitos e os riscos destas
espécies xenobióticas têm sido amplamente reportados
10,38,54,57
, sendo que,
atualmente, o foco da discussão está cada vez mais se voltando para a avaliação
da capacidade de sua destruição/remoção, tanto através de sistemas
convencionais como não-convencionais de tratamento de efluentes
44,45,46,48
.
Considerando-se estudos de exposição ambiental, concentrações de fármacos na
faixa de ng-µg L
-1
vêm sendo reportadas na literatura.
Preocupada com esta situação, a Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM) colocou os resíduos gerados pelo Hospital Universitário de Santa Maria
(HUSM), uma das mais importantes instituições de saúde da região centro do
estado do Rio Grande do Sul (atendimento diário de cerca de 2000 pessoas)
como ponto prioritário dentro de uma parceria firmada com a Universidade de
Freiburg - Alemanha, que visa avaliar as condições da UFSM no que diz respeito
ao tratamento e gerenciamento de seus resíduos. Ações referentes ao resíduo
sólido do hospital já encontram-se em estágio mais avançado, enquanto a
condição dos efluentes líquidos gerados pelo HUSM é ainda um grande
problema. O desconhecimento de sua composição e da real dimensão do impacto
ambiental por eles causado impossibilita a tomada de ações corretivas adequadas.
Assim, os primeiros passos do trabalho de remediação do problema passam pela
avaliação das condições dos efluentes no que diz respeito à presença de
fármacos.
Ambientalmente, antibióticos constituem a classe de fármacos considerada
uma das mais problemáticas. Isto devido a sua baixa biodegradabilidade, e
toxicidade para bactérias
1,3,59
, além do potencial para o desenvolvimento de
espécies bacterianas resistentes
58
. Dito isto, estudos de exposição e risco
ambiental são uma forma adequada de iniciar a caracterização dos efluentes do
HUSM.
2
Partindo para uma abordagem mais específica, dentre as classes de
antibióticos de maior relevância ambiental estão as fluoroquinolonas, sendo que a
ciprofloxacina (CIP), espécie que atua contra uma ampla gama de bactérias
gram-positivas e gram-negativas
104
tem demonstrado ser a mais problemática.
Isto devido aos efeitos tóxicos mais acentuados que ela exerce sobre bactérias,
além, também, da sua biorecalcitrância
1,37,40,41,59
. Devido a sua ampla utilização, a
CIP vem sendo identificada em concentrações-traço em estações de tratamento
de esgotos (ETEs), águas superficiais e efluentes hospitalares (vide Tabela 1,
seção 2.3), sendo que estudos visando avaliar a carga ambiental da CIP
demonstram a sua alta taxa de adsorção a partículas sólidas como aquelas de
lodos ativados, solos e sedimentos
33,34,62
. A CIP é um dos antibióticos mais
administrados do HUSM (consumo anual de aproximadamente 6,5 kg) sendo que
a unidade que mais a utiliza é a de pronto atendimento (PA-HUSM). O quadro
descrito acima, credencia a CIP a ser a primeira espécie a ter o comportamento
investigado no efluente do HUSM.
O tratamento das águas servidas, geradas pelo hospital, é feito através de
um sistema doméstico dotado de fossa séptica e filtro anaeróbio, sendo o resíduo
tratado descartado em córrego que corta o campus da UFSM (Figura 1). Nos
últimos anos, o atendimento do HUSM foi intensificado; porém, nenhuma
medida foi tomada no sentido de adequar a rede de esgotos à nova demanda.
Frente a este panorama, admite-se como necessárias tecnologias de
tratamento de efluentes adequadas à conversão de fármacos como a CIP a
espécies menos tóxicas e/ou mais suscetíveis a tratamento microbiológico. O
conhecimento deste quadro faz com que tecnologias alternativas baseadas no uso
de oxidantes com ozônio, radiação UV e peróxido de hidrogênio na degradação
de fármacos, isoladamente ou de forma combinada (processos avançados de
oxidação, PAOs), venham sendo amplamente investigadas
6,65,102
. Os resultados
têm demonstrado que estes processos são bastante promissores. Entretanto, a
grande maioria dos estudos restringe-se à investigação de solução aquosa dos
compostos isolados. Este tipo de estudo é bastante útil como primeira abordagem
na elucidação do mecanismo global da reatividade do substrato. Por outro lado, a
3
utilização desta via de investigação como modelo e base para a implementação
de processos de degradação de compostos específicos em efluentes reais, é
bastante discutível. Por esse motivo, é indispensável verificar-se também a
resposta dos processos investigados face a amostras reais.
Figura 1 - Esquema do sistema de esgotos da unidade de Pronto Atendimento do
Hospital Universitário de Santa Maria.
Em relação à aplicação de oxidantes na degradação da CIP, é importante
considerar uma característica de fluoroquinolonas que é a sua fotoinstabilidade.
Dentro disto, uma série de estudos a respeito da identificação dos metabólitos de
fotodegradação da CIP
14,74,93
e sobre a diminuição da atividade biológica de
soluções irradiadas
84
vêm sendo feitos. Entretanto, pouco se sabe a respeito da
biodegradabilidade destes compostos e da sua toxicidade para bactérias.
Dentro deste contexto, o objetivo central deste estudo foi dar início a um
trabalho de gerenciamento dos efluentes gerados pelo HUSM, passando por
4
estudos de exposição e risco ambiental dos fármacos utilizados pelo hospital. Já
de forma mais específica - tomando-se a CIP - este trabalho visa:
• Avaliar a capacidade de eliminação de cito/genotoxicidade do efluente do
PA-HUSM pelo sistema de fossa séptica e filtro anaeróbio;
• Investigar a exposição ambiental da CIP presente no efluente do PA-
HUSM e avaliar a eficiência de remoção do sistema de fossa séptica e
filtro anaeróbio;
• Conduzir estudo de avaliação de risco ambiental da CIP, comparando com
resultados de estudos em países desenvolvidos;
• Avaliar a degradação fotoinduzida da CIP em concentrações similares
àquelas encontradas no efluente do PA-HUSM, definindo parâmetros
cinéticos;
• Identificar metabólitos primários da fotodegradação da CIP e sua pronta
biodegradabilidade, além de discutir possíveis rotas de formação;
• Avaliar a efetividade dos processos fotoinduzido, ozonização, peroxônio e
fotocatálise heterogênea na degradação da CIP no efluente PA-HUSM.
5
2. Revisão bibliográfica
2.1. Fármacos no meio ambiente
O interesse científico pela questão “fármacos no meio ambiente” foi
despertada nos anos 70
77,91
. A principal informação tirada deste período foi de
que estas espécies apresentavam baixa biodegradabilidade. Durante os anos 80,
os holofotes da ciência ambiental se voltaram para uma série de outros
compostos deixando os fármacos um pouco esquecidos. A partir da metade dos
anos 90 a pesquisa a este respeito voltou a crescer, juntamente com a discussão
envolvendo compostos químicos disruptores endócrinos. De lá para cá a
ocorrência, os efeitos e os riscos destas espécies ao meio ambiente vêm sendo
investigados
10,21,38,42,54, 56,57,97,99
.
Em relação ao destino de fármacos no ambiente, um editorial publicado na
revista Chemosphere, em 2000
21
, faz uma boa análise, ressaltando que, para
identificar as rotas de exposição no meio ambiente, é necessário dividirem-se as
substâncias usadas, em tratamento humano e tratamento veterinário, mesmo que
a droga seja utilizada nos dois casos. Isto porque o local de aplicação e,
conseqüentemente, as rotas seguidas pelos fármacos, após sua excreção, serão
diferentes de acordo com um ou outro grupo. A identificação da rota de
exposição é crucial para a estimativa da carga ambiental correspondente, visto
que, assim como acontece com os pesticidas, é a dose da droga e a duração do
tratamento que determinam a carga ambiental. Fármacos de uso humano,
normalmente, atingem as ETEs através das fezes e da urina. O possível destino
de drogas em ETEs, assim como qualquer outro xenobiótico, pode ser dividido
da seguinte maneira:
• A droga e/ou seus metabólitos são mineralizados por
microrganismos;
•
A droga e/ou seus metabólitos são relativamente persistentes em
ETEs, o que implica, dependendo da lipofilicidade ou outras possíveis ligações
(p. ex., força iônica) que uma fração da substância será retida no lodo. Se este
6
lodo é utilizado como adubo, esta substância alcançará o solo. Novamente, o
destino da droga depende da lipofilicidade ou outra habilidade de se ligar a lodos,
sedimentos e solos. Espécies que apresentam mobilidade no solo podem percolar
e contaminar lençóis freáticos ou águas superficiais;
• A droga e/ou seus metabólitos são persistentes e ao mesmo tempo
polares e com baixa capacidade de se ligarem a lodos, sedimentos e solos. Estas
espécies não são retidas nem degradadas em ETEs, alcançando facilmente
ambientes aquáticos, afetando os organismos destes ecossistemas.
Uma vez em águas superficiais, a possibilidade de fármacos atingirem
água potável aumenta, como já vem sendo reportado na literatura
72
. A situação é
ainda mais grave no que diz respeito a países em desenvolvimento, onde grande
parte das comunidades não possui rede de esgotos e de água tratada para
consumo. Em ETEs os principais mecanismos de remoção de fármacos são a
degradação biológica
48
e a adsorção
34
. Entretanto, visto que uma ampla gama de
compostos é recalcitrante aos tratamentos aplicados em ETEs, processos como
ozonização, oxidação avançada e fotoprocessos vem sendo extensivamente
investigados
44,45,46,65
. O esquema da Figura 2 ilustra as fontes e distribuição de
fármacos no meio ambiente
55
.
2.2. Uso de antibióticos
Os antibióticos são considerados um dos mais importantes grupos de fármacos.
Estas espécies são extensivamente utilizadas na medicina humana e veterinária,
e, em aqüicultura, com o propósito de prevenir ou tratar infecções microbiais,
embora na pecuária sejam também usadas como promotoras de crescimento.
Estima-se que o mercado mundial consuma algo em torno de 100.000 e 200.000
toneladas de antibióticos
103
. Em 1996, na Comunidade Européia foram usadas
cerca de 10.200 toneladas destes medicamentos, sendo que, aproximadamente,
50% foram administrados em medicina veterinária como promotores de
crescimento. Nos Estados Unidos, em torno de 16.200 toneladas de antibióticos
7
foram produzidas no ano de 2000. Destes, 70% são destinados à pecuária. Isto
corresponde a 8 vezes o que é usado em medicina humana
56
. Posteriormente, o
uso de uma série de promotores de crescimento foi proibido na comunidade
européia, o que fez com que seu consumo diminuísse em relação aos antibióticos
empregados em medicina humana
52
. No Brasil, a legislação que abrange resíduos
hospitalares é não-específica e não trata separadamente antibióticos nem
qualquer outra espécie de fármaco. Segundo as resoluções n° 358 do Conselho
Nacional de Meio Ambiente e RDC n° 306 da Agência Nacional de Saúde, os
efluentes hospitalares líquidos, para serem lançados na rede pública de esgoto ou
em corpo receptor, devem atender às diretrizes estabelecidas pelos órgãos
ambientais, gestores de recursos hídricos e de saneamento. Porém, estas
diretrizes não incluem parâmetros para produtos farmacêuticos.
Quinolonas e Fluoroquinolonas. Fluoroquinolonas são agentes
bactericidas extremamente úteis, particularmente, devido ao seu amplo espectro
de ação e boa absorção oral
60
. As primeiras quinolonas (ácido nalidíxico, ácido
oxolínico, cinoxacina) apresentavam a limitação de não atingirem níveis
antibacterianos sistêmicos, sendo, por isso, úteis apenas como anti-sépticos
urinários. Os análogos fluorados mais novos são derivados do ácido nalidíxico
sintético (norfloxacina, ciprofloxacina, enrofloxacina) e exibem atividade
antibacteriana muito maior, atingem níveis bactericidas no sangue e nos tecidos e
possuem baixa toxicidade
51
. Estes fármacos são potentes inibidores da síntese de
ácidos nucléicos, bloqueando a ação da enzima DNA-girase (topoisomerase II)
50
.
Acredita-se que isto ocorre através de pontes de hidrogênio e interações de
cargas com o DNA bacterial, na presença da enzima. De acordo com o modelo
aceito para a ligação fluoroquinolona-DNA, a fração quinolônica da molécula é
responsável por estas interações
87
.
Dentre as fluoroquinolonas, tomemos a CIP, objeto de estudo desta tese. A
CIP (Figura 3) possui alta atividade contra uma ampla gama de bactérias gram-
positivas, incluindo várias espécies de Enterobacteriaceae e Pseudomonas,
algumas gram-positivas e muitas aeróbias e anaeróbias facultativas, Mycoplasma
e Rickettsia
8,19,26,104
. Comparado à fluoroquinolonas similares, como
8
norfloxacina, ofloxacina, pefloxacina e enoxacina, a CIP é aproximadamente 4
vezes mais ativa contra quase todas as bactérias relacionadas acima
100
. Quando
administrada oralmente, a CIP é bem absorvida e distribuída nos tecidos e
excretada na urina e bile, em altas concentrações
11,83,105
(81% do administrado a
humanos
11
).
Figura 2 - Fontes e distribuição de fármacos no meio ambiente
55
PRODUÇÃO
EXCEDENTES
VETERINÁRIA HUMANOS
ATERRO
SANITÁRIO
ÁGUAS
SUPERFICIAIS
ESTERCO
SOLO
ESGOTOS
ETEs
SEDIMENTOS
ÁGUAS
SUBTERRÂNEAS
ÁGUA DE CONSUMO
VENCIDOS
9
N
F
N
OO
OH
HN
1
2
3
4
5
6
1
4
Figura 3 - Estrutura da ciprofloxacina
2.3. Destino, ocorrência, efeitos e riscos da ciprofloxacina no meio ambiente
Uma série de estudos vêm sendo realizados para a identificação de CIP em
efluentes hospitalares, ETEs e águas superficiais (Tabela 1). Além disso, a
eficiência das ETEs na remoção de CIP vem sendo avaliada através do balanço
de massa durante a sua passagem por estes compartimentos. O principal destino
do medicamento foi identificado como sendo a fauna microbiana ativa (lodo
biológico), uma vez que 70-100% da CIP que entra em ETEs é adsorvida em
lodo bruto proveniente de diferentes passos do processo, sendo o restante
detectado no efluente final
34,62,64
. Isto, aliado a resultados que comprovaram a
recalcitrância da CIP à ação biológica
1,37,59
, demonstra que o mecanismo de
remoção se dá através de adsorção, e não de biodegradação. CIP é também
recalcitrante a tratamento anaeróbio, visto que apenas pequena remoção foi
identificada em lodos anaerobicamente digeridos (aproximadamente 11%)
34
. Por
outro lado, tratamentos térmicos de secagem do lodo em ETEs (180 °C)
apresentaram cerca de 65% de remoção de CIP
62
.
Esta mesma capacidade de adsorção em lodos ativados verifica-se,
também, em solos e sedimentos. Coeficientes de partição (log K
d
) de 2,4 e 2,6 L
kg
-1
para solos
78
e matéria orgânica dissolvida
92
, respectivamente, foram já
reportados. Investigações utilizando solos tratados com lodos impactados por
10
CIP demonstraram a sua pequena mobilidade nestes compartimentos, além da
resistência à foto e bioprocessos
16,33
.
Tabela 1 - Concentrações ambientais de ciprofloxacina
Concentração, µg L
-1
Tipo de água País Fonte
3-87 Efluente hospitalar Suíça 40
14,5
c
Efluente hospitalar Suíça 40
0,7-124,5 Efluente hospitalar Suíça 41
2,3
c
Efluente hospitalar Alemanha 1,59
0,6
c
ETE Alemanha 1,59
0,06
c
Águas superficiais Alemanha 1,59
0,055-0,405 ETE Suíça 32
0,434/0,072
Antes e depois de ETE Suíça 31
0,005-0,018
Águas superficiais Suíça 31
0,27-2,42ª
,e
Lodo (ETE); solo trat. c/ lodo Suíça 33
0,02
a
e 0,03
b
Águas superficiais EUA 52
0,427/0,071
Antes e depois de ETE Suíça 34
5,3ª
,e,f
Lodo ativado de ETE Suíça 34
0,118
a
e 0,4
b
ETE Canadá 75
3,6-101 Efluente hospitalar Suécia 63
0,1-0,16 ETEs EUA 85
0,03
b
Águas superficiais
d
EUA 53
0,238
a
e 0,514
b
Efluentes de ETEs Itália 17
0,36 Efluentes de ETEs Holanda 7
0,60 Efluentes de ETEs França 4
0,70
a
Efluentes de ETEs Grécia 4
0,057
a
Efluentes de ETEs Itália 4
0,030 Efluentes de ETEs Suécia 4
15
c
Efluente hospitalar Suécia 47
0,5 Efluente hospitalar Suécia 47
151,4
g
Sedimento efluente hospitalar Suécia 47
0,158/0,018
a
Antes e depois de ETEs Suécia 64
2,54
a,e,f
Lodo de ETEs Suécia 64
0,22/0,048
a
Antes e depois de ETE Suécia 62
31,2
a,e,f
Lodo de ETE Suécia 62
6,3
c
Águas superficiais Europa 37
0,15
a
(0,21
b
)/0,06
a
(0,14
b
) Antes e depois de ETEs EUA 49
259
a
(120-507)/97
a
(37-271) Antes e depois de ETEs
h
Itália 18
a
concentração média;
b
concentração máxima;
c
concentração ambiental predita;
d
encontrado em 3,3% das amostras;
e
mg kg
-1
;
f
soma de concentração de CIP
encontrada em lodos de diferentes passos de tratamento dentro da ETE;
g
µg g
-1
;
h
mg dia
-1
a cada 1000 habitantes.
11
Após alcançar águas superficiais, CIP é continuamente removida do meio
aquoso, mas os mecanismos envolvidos neste processo não são totalmente
conhecidos
31
. Apesar disso, a fotodegradação e a adsorção em sedimentos vêm
sendo reportadas como os caminhos mais prováveis
12
. As concentrações de CIP
encontradas em ETEs, principalmente, são da mesma ordem de magnitude
daquelas que causam efeitos tóxicos a bactérias
40,41, 59
.
De forma geral, fluoroquinolonas são consideradas muito tóxicas para
bactérias (concentração de inibição de crescimento em 50% (CE
50
) = 1 mg L
-1
),
tóxicas para algas (1 mg L
-1
< CE
50
< 10 mg L
-1
) e perigosas para crustáceos e
peixes (10 mg L
-1
< CE
50
< 100 mg L
-1
)
23
.
CIP, respectivamente, em concentrações de 10, 80 e 320 µg L
-1
, inibe em
algum grau (CE
0
), em 50% (CE
50
) e em 100% (CE
100
), o crescimento de
Pseudomonas putida, organismo indicador de toxicidade para ampla gama de
bactérias gram-negativas ambientais
59
. Exibe fraca, mas significativa, toxicidade
para bactérias encontradas em efluentes
59
(CE
50
= 0,61 (0,31-1,22) mg L
-1
37
).
Para a cianobactéria Microcystis aeroginosa, a CE
50
é de 5 µg L
-1
e, a
concentração predita de efeito não observado (CPENO), foi estabelecida como
sendo 0,05 µg L
-1
. Uma relação CAP/CPENO (onde CAP é a concentração
ambiental predita) de aproximadamente 13 foi calculada
37
. Em testes de
genotoxicidade para bactérias, a CIP apresentou fator de indução (FI) superior a
20, indicando, segundo escala demonstrada na Tabela 2, a sua alta
genotoxicidade
59
. Danos causados pela CIP ao DNA de bactérias de relevância
ambiental, podem ser observados em concentrações da ordem de 0,2-0,4 µg L
-1
.
Esta faixa é, em alguns casos, até 150 vezes menor que a concentração
normalmente encontrada em efluentes de hospitais e muito similar àquela
encontrada em ETEs
59
(vide Tabela 1).
Hartmann et al.
40
investigaram todos os possíveis causadores da
genotoxicidade em amostras de efluente hospitalar e verificaram que a CIP foi a
principal responsável. As evidências foram as seguintes:
• Os valores médios teóricos da concentração de CIP (VMTs) no efluente
foram superiores à menor concentração de efeito observado (CEOs) em, no
12
mínimo, uma ordem de magnitude quando comparadas aos outros fármacos
investigados. Os valores de VMTs e CEOs para CIP foram de 14,5 e 5 µg L
-1
,
respectivamente;
• Testes em amostras de urina de pacientes tratados com antibióticos e
antineoplásicos demonstraram que amostras de pacientes tratados com CIP
apresentaram genotoxicidade até mesmo quando diluídas de 2.000 a 20.000
vezes. Para pacientes tratados com enrofloxacina, outra fluoroquinolona
investigada, as amostras foram genotóxicas quando diluídas até 200 vezes.
No caso dos outros fármacos, o teste só foi positivo quando as amostras não
foram diluídas ou quando diluídas no máximo 4 vezes. É importante ressaltar
que o fator de diluição, normalmente, para urina em efluentes hospitalares, é
assumido como sendo de 100 a 5000 vezes;
• Encontrou-se uma forte correlação (r
2
= 0,84) entre a genotoxicidade de
amostras de efluentes de 16 hospitais e a concentração de CIP. Este valor de
r
2
foi posteriormente confirmado, utilizando-se amostras de efluentes de mais
5 hospitais
41
.
Apesar disso, alguns casos foram reportados dando conta de que a
mutagenicidade de amostras de efluentes medidas através de aberrações
cromossômicas Ames e V79 nada têm a ver com a concentração de CIP
41
.
Tabela 2 – Escala de fatores de indução e relação com efeitos genotóxicos
59
Fator de indução (FI) Genotoxicidade do composto
FI < 1,5 Composto não-genotóxico
1,5 < FI < 2,0 Composto marginal
FI > 2,0 Composto genotóxico
Confrontando-se o que foi reportado acima, com a situação brasileira e de
outros países em desenvolvimento, é preciso lembrar que a grande maioria dos
dados gerados, atualmente, sobre exposição ambiental e avaliação de risco da
CIP, diz respeito à América do Norte e Europa (vide Tabela 1). Porém, é sabido
13
que em países em desenvolvimento, uma grande fatia da população não é
assistida por ETEs, ou mesmo, rede de esgotos. Some-se a isto o atraso destes
países no que diz respeito a gerenciamento de risco e legislação ambiental
específica, além da prática da auto-medicação. Esta falta de informação a
respeito da exposição ambiental da CIP, em países em desenvolvimento,
restringe a discussão mundial à situações que, ao que tudo indica, não são as
mais críticas, subestimando, conseqüentemente, o potencial de risco ao meio
ambiente.
2.4. Degradação da ciprofloxacina: características relevantes
2.4.1. Fotossensibilidade da ciprofloxacina
2
A fotossensibilidade é uma propriedade bem conhecida das
fluoroquinolonas. Um trabalho de revisão feito por Albini e Monti
2
é uma
excelente ferramenta para o entendimento dos fenômenos fotofísicos e
fotoquímicos relacionados a esta classe de fármacos. De maneira geral,
moléculas contendo 4-quinolona ou 4-naftipiridona convertem-se eficientemente
ao estado triplete ao absorver luz. No referido trabalho de revisão, os espectros
de absorção triplete-triplete (T-T) de fluoroquinolonas são caracterizados por λ
T-
T
max
no intervalo entre 500 e 650 nm. Os coeficientes de absortividade triplete
molar (ε
T
max
) são na faixa de 4000-14000 M
-1
cm
-1
dependendo da estrutura
molecular e do método utilizado para sua determinação. Mella et al.
74
investigando a fotoquímica da CIP verificaram absorção T-T em λ
max
= 610 nm e
com perfil de tempo de
τ
= 1,5 x 10
-6
s. A formação de T-T dita a fotoreatividade
de fluoroquinolonas, sendo que a ocorrência de reações, após fotoexcitação, é
devido a processos envolvendo os substituintes que atuam como sítios
fotoquimicamente instáveis (p. ex., a ligação carbono-flúor, o anel piperazínico e
a carboxila). Um perfil geral é mostrado na Figura 4. A Tabela 3 mostra uma
série de estudos relacionados à fotodegradação da CIP.
14
A fotoinstabilidade de fluoroquinolonas
2
e, mais especificamente, da
CIP
12,93
, é uma importante característica a ser explorada. Quando irradiadas, as
moléculas de CIP são excitadas a sua forma ππ* triplete, que possui maior
caráter eletrofílico que aquele da CIP no estado fundamental
74
. A formação e
reatividade deste intermediário são extremamente dependentes das características
do meio, e, em boa parte dos casos, podem favorecer a destruição da espécie-
mãe. Estudos apontam para a fotodecomposição de CIP em águas superficiais
sob condições naturais
16
, o que reforça a idéia de aplicação de fotoprocessos no
tratamento de efluentes contendo esta espécie.
N
F
N
OO
O
-
RNX
Y
R
H
FQ FQ
1
* FQ
3
*
Fluorescência
O
2
cruzamentos
intersistemas
ISC
+
Produtos
1
O
2
, O
2
.
-
Figura 4 – Processos fotoquímicos relevantes para fluoroquinolonas
2
Tabela 3 - Estudos envolvendo fotodegradação da ciprofloxacina
Tipo de investigação Fonte
Estudo cinético; fotoprodutos formados 12-14
Destino da CIP em sistemas aquáticos 16
Fotofísica/fotoquímica do processo; subprodutos 74
Subprodutos 93-96
Perda da atividade biológica 84
Fluoroquinolonas: fotofísica/fotoquímica (review) 2
Fotodegradação na presença de espécies húmicas 86
Estabilidade da CIP 98
15
2.4.2. Reatividade entre ozônio e ciprofloxacina
A reatividade da CIP frente a O
3
molecular depende do pH. A constante de
velocidade de reação de segunda ordem aparente k’’
03,app,CIP
varia na faixa de 4 x
10
2
a 10
5
L mol
-1
s
-1
, em pH entre 3 e 8
90
. Esta dependência do pH é governada
pela desprotonação do N(4) amina. As constantes específicas de reação k’’
03/CIP
das espécies diprotonada, monoprotonada e desprotonada são 4,0 (±1,2) x 10
2
,
7,5 (±2,8) x 10
3
e 9,0 (±3,1) x 10
5
L mol
-1
s
-1
, respectivamente
90
. Em pH inferior
a 4, a reatividade não foi atribuída ao átomo N(4) ou ao anel quinolínico
heterocíclico e, sim, ao nitrogênio piperazínico N(1) ou ao carbono não-
substituído na posição orto do anel aromático adjacente. Porém, esta reatividade
não significa necessariamente perda da atividade antimicrobiana, visto que os
sítios reativos nada têm a ver com o mecanismo de ação de fluoroquinolonas
sobre bactérias
20,90
.
2.5. Processos avançados de oxidação
O Laboratório de Tratamento de Efluentes e Resíduos (LATER) da UFSM
vem investigando a utilização de processos não-convencionais no tratamento de
efluentes
66-71
. Tais tecnologias baseiam-se na utilização de oxidantes químicos
(ozônio, peróxido de hidrogênio, etc.) e físicos (radiação ultravioleta, ultra-som,
etc.) na destruição de espécies químicas biorecalcitrantes. A combinação destes
oxidantes, além de outras espécies, de maneira a gerar radicais hidroxil, espécie
química de alta reatividade, originam os chamados PAOs. São exemplos de
PAOs os processos de ozonização (O
3
/HO
-
), peroxônio (O
3
/H
2
O
2
),
fotoperoxidação (UV/H
2
O
2
) e fotocatálise heterogênea (UV/TiO
2
). Devido ao já
discutido interesse na questão fármacos no meio ambiente e à resistência destas
espécies a tratamento microbiológico, uma série de estudos do uso de PAOs na
degradação de fármacos têm sido publicadas e vêm demonstrando o potencial
destas tecnologias para esta finalidade
44,45,61,73,102
.
16
3. Materiais e métodos
3.1. Materiais
A parte experimental deste trabalho foi realizada no LATER e na Seção de
Epidemiologia e Medicina Ambiental do Hospital Universitário de Freiburg -
Alemanha, sendo que os aparelhos e equipamentos utilizados são integrantes dos
recursos instrumentais de ambos os órgãos.
3.2. Reagentes e soluções
Nos estudos de determinação da concentração de CIP e de sua degradação,
no efluente do HUSM, utilizou-se ciprofloxacina hidroclorídrica gentilmente
doada pela empresa Galena Química e Farmacêutica (www.galena.com.br). Já
nos estudos de degradação fotoinduzida de CIP, utilizou-se ciprofloxacina na
forma neutra (Fluka, www.sigmaaldrich.com). Todos os outros reagentes foram
de grau analítico.
3.3. Determinação de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM
3.3.1. Coleta das amostras
Como já referido, no HUSM, o maior consumo de CIP e de antibióticos
em geral é no PA-HUSM. A rede de esgotos do hospital é dividida em duas
grandes linhas que abrangem, separadamente, as alas norte e sul do hospital
(Figura 1 - seção 1). A rede do PA-HUSM, devido ao fato de ter sido construída
recentemente, encontra-se com a rede sul num ponto externo. Após isto, passam
por um sistema de tratamento dotado de fossa séptica doméstica e filtro
17
anaeróbio, para depois desaguar em um curso d’água que corta o campus da
UFSM.
A fim de avaliar a eficiência do sistema de tratamento, as amostras foram
coletadas, antes e depois dele, em pontos denominados P1 e P2, respectivamente
(Figura 1). A coleta foi realizada diariamente, durante uma semana. Foram
obtidas 2 amostras a cada dia (1 de P1 e 1 de P2), sendo que cada uma delas era
composta por frações de efluente tomadas ao longo de 10 horas de amostragem
(das 08:00 às 18:00 h, a cada 2 h). Cada fração foi imediatamente filtrada (0,45
µm), sendo transferidos 50 mL para frasco de vidro âmbar e estocados a 4 °C. Ao
final de cada dia, as amostras resultantes (1 de P1 e 1 de P2) eram armazenadas
no escuro, a -4 °C. Tendo em vista que CIP apresenta baixa atividade biológica
sob condições aeróbias e anaeróbias
34,62
, e o curto espaço de tempo entre a
amostragem e a determinação, considerou-se que apenas o resfriamento a -4 °C
era suficiente para a diminuição da atividade biológica. Assim, também não se
reduziu o pH das amostras.
3.3.2. Caracterização das amostras
Visto que, no presente estudo, o interesse da investigação restringe-se
apenas à CIP, a caracterização do efluente foi realizada apenas com a intenção de
se obter a ordem de grandeza de alguns parâmetros. Não foram levadas em
consideração possíveis diferenças entre amostras de P1 e P2. Foram consideradas
as características da amostra de P1 utilizada no estudo da degradação através de
PAOs. Todos os procedimentos analíticos seguiram métodos-padrão (APHA-
AWWA, 1995)
5
e são demonstrados na Tabela 4.
Utilizou-se o sistema teste Allium cepa na obtenção de informações gerais
de cito/mutagenicidade do efluente do PA-HUSM. Allium cepa é uma das
espécies vegetais mais utilizadas na avaliação da genotoxicidade de espécies
tóxicas ou inibidores biológicos, em efluentes. O índice mitótico (IM) e o índice
de replicação são usados como indicadores de proliferação adequada das
18
células
29
, o que pode ser medido através do sistema teste vegetal de Allium cepa.
O método da aberração cromossômica em raízes de Allium cepa é validado pelo
Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, WHO) e o Programa
Ambiental das Nações Unidas (UNEP), como um eficiente teste para análise e
monitoramento in situ da genotoxicidade de substâncias ambientais
15
.
Tabela 4 - Características das amostras de efluente do PA-HUSM tomadas em P1
e que foram utilizadas no estudo envolvendo PAOS.
Parâmetros Concentrações
658 mg O
2
L
-1
DQO
ST
720 mg L
-1
Cl
-
139 mg L
-1
pH 7,4
Os ensaios foram realizados no Laboratório de Citogenética Vegetal do
Departamento de Biologia da UFSM. As amostras avaliadas foram tomadas em
P1e P2, sendo compostas de 10 amostragens efetuadas entre 9-18 horas do dia 3
de janeiro de 2005. Após a coleta, as amostras foram imediatamente filtradas,
acidificadas e resfriadas a 4 °C. O procedimento utilizado no estudo de
cito/mutagenicidade do efluente do PA-HUSM foi realizado conforme Fiskejö
27
,
com modificações. Para o sistema teste de Allium cepa colocou-se para enraizar,
em água, 3 grupos de 6 bulbos de cebola. O grupo controle permaneceu em água
e os bulbos dos outros dois grupos foram tratados por 24 h nas distintas amostras
do efluente do PA-HUSM. Feito isto, realizou-se a coleta das radículas e
colocou-se em fixador 3:1 (álcool etílico; ácido acético) por 48 horas, sendo
conservadas em álcool 70%, a 4 °C. Para o preparo das lâminas, as radículas
foram hidrolisadas em HCl 1 mol L
-1
por 5 min, lavadas em água destilada e
submetidas à técnica de esmagamento
36
, sendo que, orceína acética a 2% foi
usada para a coloração. Foram feitas lâminas das pontas de raízes de cada bulbo e
a contagem de 6000 células por grupo de bulbos, calculando-se os IMs e
19
comparando-se estatisticamente os dados pelo teste χ
2
do programa estatístico
Bioetat 3.0.
Utilizou-se, também, sistema teste de E. sativa
88
. O teste consistiu da
colocação de 50 sementes para germinar em placas de Petri, com papel filtro e
água destilada, com duas repetições para o controle e três repetições para cada
amostra P1 e P2 de efluente (1,5 mL), por 72 horas. Avaliou-se a influência das
amostras sobre o número de sementes germinadas.
3.3.3. Determinação cromatográfica da concentração da ciprofloxacina
Esta parte da investigação foi realizada conforme Hartmann et al.
40
. De
acordo com o que foi anteriormente referido, este estudo foi desenvolvido em
dois diferentes laboratórios. Por isso, foram feitas algumas modificações na
metodologia a fim de adequá-la às condições de cada laboratório. Assim, três
diferentes procedimentos foram executados:
a) Procedimento 1. Este foi o principal procedimento, visto que foi empregado
para determinação da concentração de CIP no estudo de exposição ambiental.
Preparação das amostras. Foi feito através de pré-concentração em cartuchos
C18 3 mL/200 mg (Phenomenex; www.phenomenex.com), pré-condicionados
com 6 mL de metanol, utilizando-se dispositivo de vácuo. O analito foi retido no
cartucho com a passagem das amostras em vazão de 1 mL min
-1
. Após isto,
deixou-se o cartucho secar por 5 min. A eluição foi efetuada com 2 mL de
solução aquosa de HCl 10% e metanol (20:80). O solvente foi então evaporado
sob fluxo de nitrogênio até quase secagem, sendo a seguir reconstituído ao
volume de 2 mL com fase móvel. As amostras foram, depois, centrifugadas e, o
sobrenadante, tomado para a determinação por cromatografia líquida com
detecção de fluorescência (HPLC-FLD). A recuperação foi de 103 (±1,4)%.
Determinação por HPLC-FLD. Foi feita utilizando-se bomba LC-10AD
Shimadzu (www.shimadzu.com
), detector de fluorescência (λ
exc
:
278 nm;
λ
em
:
445 nm) HP 1046A (www.hp.com
), coluna de fase reversa C18 (250 x 460 mm,
20
4 µm) e pré-coluna (4 x 3 mm), ambas Phenomenex (www.phenomenex.com). A
aquisição dos dados foi feita utilizando-se integrador Shimadzu C-R6A
Chromatopac (www.shimadzu.com
). A fase móvel foi uma mistura dos solventes
A (o-H
3
PO
4
0,02 mol L
-1
e trietilamina 0,008 mol L
-1
) e B (acetonitrila), na
proporção de 85:15. O volume de injeção foi de 20 µL e o fluxo foi de 1,0 mL
min
-1
.
b) Procedimento 2. Determinação por cromatografia líquida com detecção de
massas (LC-MS), a fim de confirmar a presença de CIP no efluente.
Preparo das amostras. 5 replicatas de uma mesma amostra de P2 foram pré-
concentradas conforme procedimento 1 acima descrito, acondicionadas nos
cartuchos e enviadas à Seção de Epidemiologia e Medicina Ambiental do
Hospital Universitário de Freiburg para análise pelo doutorando, em estágio de
curta duração na Alemanha. Soluções de referência de CIP foram enviadas
juntamente com as amostras e submetidas ao mesmo procedimento a fim de
garantir idêntico tratamento de amostras e padrões. A eluição do analito do
cartucho foi realizada conforme procedimento 1, porém, a reconstituição foi feita
com 0,5 mL do solvente A. As amostras foram centrifugadas e o sobrenadante
tomado para determinação por LC-MS.
Determinação por LC-MS. Fez-se a determinação de CIP com aparelho Agilent
Series 1100 LC (www.chem.agilent.com), equipado com duas bombas binárias,
degaseificador, forno para coluna e amostrador automático. O software
Chemstation (Agilent Technologies) foi utilizado como instrumento de controle.
O sistema MS foi o Esquire 3000 plus (Bruker Daltonics, www.bdal.com), com
fonte ortogonal de ionização eletrospray e íon trap. Aquisição e tratamento dos
dados foram feitos usando-se software Bruker Daltonics Esquire 5.1. A
separação foi efetuada em coluna de fase reversa (C18 RP18 CC 125x4 mm
Nuclodur 100-5 Macherey-Nagel, www.mn-net.com
), dotada de pré-coluna (C18
RP18 CC 8x4 mm Nucleosil 100-5). Utilizou-se programa de gradiente para a
fase móvel combinando os solventes C (solução aquosa de ácido fórmico 0,1%,
v/v) e B (acetonitrila), conforme descrito a seguir: 1-40% de B até 25 min, 40-
21
1% de B até 30 min. O fluxo foi de 0,5 mL min
-1
, o volume de injeção, de 50 µL
e a temperatura do forno da coluna mantida a 40 °C.
3.4. Degradação fotoinduzida de ciprofloxacina em solução sintética
Os experimentos foram conduzidos em fotorreator, em batelada (2,5 L),
dotado de agitação magnética, sistema de resfriamento e de monitoramento de
temperatura e pH. Foi utilizada uma lâmpada de mercúrio Heraeus de 150 W e
média pressão (www.heraeus.com
), revestida com camisa de quartzo. A lâmpada
foi ligada 2 min antes de cada experimento a fim de alcançar estabilização.
Todos os experimentos foram realizados com água Milli-Q, a 30 °C e pH 9. Para
o estudo cinético e de avaliação da natureza e biodegradabilidade dos metabólitos
trabalhou-se sob diferentes condições, descritas a seguir.
3.4.1. Estudo cinético
Um terceiro procedimento analítico foi utilizado para a realização do
estudo cinético:
Procedimento 3. Soluções de CIP tiveram seu pH ajustado com NH
4
Cl 0,05 mol
L
-1
e KOH 3 mol L
-1
. A concentração de CIP utilizada foi de 0,1 mg L
-1
(0,3 x 10
-
6
mol L
-1
), da mesma ordem de grandeza daquelas encontradas no efluente do
HUSM.
Preparação das amostras para a análise. As amostras foram pré-tratadas
adicionando-se 1 mL de NH
4
Cl 0,05 mol L
-1
, ajustando-se à pH 9 com KOH 3
mol L
-1
e 0,1 mL de acetonitrila. Após isto, fez-se extração em fase sólida
usando-se sistema de vácuo e cartuchos C18 3 mL/500 mg Macherey-Nagel
(www.mn-net.com
), pré-condicionados com metanol (6 mL). O fluxo de extração
foi de 1 mL min
-1
. Após cada extração, o conteúdo retido no cartucho foi eluído
com 2 mL de mistura aquosa de HCl 10% e metanol (20:80). O solvente foi
22
evaporado até secagem sob fluxo de nitrogênio e, posteriormente, reconstituído
com 0,5 mL do eluente A (vide seção 3.3.3.a). Então, as amostras foram
centrifugadas e, o sobrenadante, tomado para análise por HPLC-FLD.
Análise por HPLC-FLD. Utilizou-se sistema LC10 HPLC equipado com duas
bombas LC 10 AT, forno para coluna, detector de fluorescência (λ
exc
.: 278 nm;
λ
em
.: 445 nm) e amostrador automático (Shimadzu, www.shimadzucom). Na
aquisição e avaliação dos dados utilizou-se software Class LC10 (Shimadzu). A
separação foi realizada utilizando-se a mesma coluna empregada na análise por
LC-MS descrita na seção 3.3.3.b. A metodologia foi aquela descrita na seção
3.3.3.a readequada como segue: regime de gradiente, sendo a fase móvel mistura
dos solventes A (seção 3.3.3.a) e D (acetonitrila e solvente A, 90:10), com a
seguinte programação: 2% de D até 4 min, 2-35% de D até 18 min e 35-2% de D
até 20 min. O fluxo foi de 1,2 mL min
-1
, o volume de injeção, de 5 µL, e a
temperatura do forno da coluna de 35 °C.
3.4.2. Estudo da biodegradabilidade
Utilizou-se o closed bottle test (CBT), padrão para a avaliação da pronta
biodegradabilidade, recomendado como um primeiro simples teste para a
verificação da biodegradabilidade de compostos orgânicos (Nyholm
79
, 1991;
OECD
80
, 1992). O CBT foi realizado segundo teste padrão
79,80
, no escuro, a 20 ±
1 °C, como descrito por Kümmerer et al.
60
. O período de incubação do CBT foi
de 28 dias. Cada teste consiste em quatro diferentes séries: controle de qualidade
(acetato de sódio, correspondendo à demanda teórica de oxigênio, ThOD, de 5
mg L
-1
); amostra em branco, amostras do fotoprocesso e controle de toxicidade
(amostras do fotoprocesso e acetato de sódio). Os experimentos foram feitos em
duplicata. Todos os frascos foram inoculados com alíquota de efluente final de
uma ETE não impactada por efluentes hospitalares a fim de garantir uma carga
adequada de microorganismos. A fim de alcançar condições adequadas de ThOD
para o CBT, os experimentos de fotoprocesso foram realizados utilizando-se
23
soluções de CIP de 6 mg L
-1
(1,81 x 10
-5
mol L
-1
) e amostragens, durante o
tratamento (em tempos de 0, 2 e 4 min), de grandes volumes (2 L cada). Como o
volume total da amostra submetida ao fotoprocesso foi de 2,5 L, amostragens de
2 L obrigaram a realização de um experimento para cada amostragem. Outra
conseqüência da amostragem de grandes volumes foi a necessidade de saturar
com ar a água utilizada na preparação da solução de CIP para o fotoprocesso. O
objetivo foi obter concentrações adequadas de oxigênio para o CBT. Amostras
tomadas após 0, 2 e 4 min foram submetidas ao CBT. A concentração de O
2
foi
monitorada em diferentes dias durante o processo (dias 0, 1, 7, 14 e 28).
3.4.3. Estudo quantitativo de ciprofloxacina e, qualitativo, de seus
metabólitos de fotodegradação
As mesmas amostras submetidas ao CBT foram encaminhadas à
determinação da concentração de CIP através do procedimento 3 (seção 3.4.1),
porém sem pré-concentração. O estudo qualitativo dos sub-produtos de
fotodegradação da CIP foi feito utilizando-se LC-MS conforme descrito no
procedimento 2 da seção 3.3.3.b.
3.5. Processos avançados de oxidação na degradação de ciprofloxacina em
efluente do PA-HUSM
3.5.1. Amostras
A amostra foi tomada em P1 a fim de avaliar a aplicabilidade dos
diferentes processos na remoção de CIP, sob condições mais drásticas do que
aquelas que seriam encontradas, realmente, se aplicadas no efluente após o
sistema de tratamento. Após a coleta, a amostra foi filtrada (filtração rápida),
acidificada e medida a concentração de CIP. Se inferior a 200 µg L
-1
,
24
concentração superior à faixa encontrada anteriormente nas amostras de P1,
fortificou-se a amostra com CIP até este valor. Tomou-se o cuidado de se utilizar
amostra que tivesse características típicas daquelas encontradas para o efluente,
em estudos prévios de determinação de CIP. As características são demonstradas
na Tabela 4 (seção 3.3.2).
3.5.2. Determinações analíticas
A efetividade dos processos foi avaliada acompanhando-se o decréscimo
da concentração de CIP através de medidas por HPLC-FLD, conforme descrito
na seção 3.3.3.a, da DQO (método padrão: 5020-C, APHA-AWWA, 1995
5
) e da
absorbância UV-vis integrada, utilizando-se Espectrofotômetro UV-vis
Shimadzu modelo Multispec-1501, com arranjo de diodos (www.shimadzu.com
).
3.5.3. Processo fotoinduzido
Os experimentos foram realizados utilizando-se 500 mL de amostra e pH
inicial igual a 3; fotorreator em regime de batelada, com recirculação, dotado de
agitação magnética e câmara de irradiação com lâmpada de mercúrio de 125 W,
de média pressão (Phillips; www.phillips.com
), e tubo de quartzo por onde
recircula o fluxo impulsionado por bomba peristáltica Cole Parmer Masterflex
L/S (www.coleparmer.com). Uma foto do sistema é mostrada na Figura 5a.
3.5.4. Fotocatálise heterogênea
Os testes foram realizados em um reator tubular helicoidal
70
(700 mL),
utilizando-se a lâmpada descrita na seção 3.5.3 (Figura 5b), e 400 mg de TiO
2
P-
25 Degussa (www.degussa.com) em suspensão. O pH inicial da amostra foi
25
regulado a 3,0. Após o tratamento, as amostras foram filtradas para remoção das
partículas de TiO
2
utilizando-se papel com tamanho de poro de 0,22 µm.
Figura 5 - Sistemas utilizados na degradação fotoinduzida e fotocatalítica da
ciprofloxacina em amostras de efluente do PA-HUSM. (a) Processo
fotoinduzido: (1) tanque de recirculação; (2) câmara de fotoirradiação; (3) bomba
peristáltica; (b) Fotocatálise heterogênea: (1) Coluna de recirculação, (2) Reator
helicoidal de fotoirradiação; (3) Bomba peristáltica.
3.5.5. Ozonização e peroxônio
Os ensaios foram realizados utilizando-se reator tubular de vidro
borossilicato, em sistema de semi-batelada. Utilizou-se ozonizador modelo
experimental MV01 (desenvolvido pela Qualidor Saneamento Inc e pelo Instituto
Tecnológico da Aeronáutica) e ar como gás de alimentação, previamente seco
pela passagem por uma coluna contendo carvão ativo, cloreto de cálcio e sílica
gel (Figura 6). A determinação da capacidade de geração de ozônio foi feita
segundo Flamm
28
e as condições de maior geração de ozônio foram determinadas
previamente. O fluxo de ar foi de 8 L min
-1
tendo-se, sob tais condições, a
(1)
(2)
(3)
(a
)
(1)
(2)
(3)
(b)
26
geração de 450 mg O
3
h
-1
. O volume de amostra foi de 500 mL e o pH inicial 9.
No processo peroxônio, a concentração de H
2
O
2
utilizada foi de 500 mg L
-1
.
Figura 6 - Sistema utilizado nos processos de ozonização. No detalhe, o reator
tubular. (1) compressor de ar; (2) tubo com secantes; (3) gerador de ozônio; (4)
reator.
(1)
(2)
(3)
(4)
27
4. Resultados e discussão
4.1. Cito/genotoxicidade do efluente do PA-HUSM
Avaliou-se a cito/genotoxicidade do efluente do PA-HUSM, em P1 e P2,
através do sistema teste Allium cepa. Os resultados mostrados na Tabela 5 dão
conta de que houve decréscimo do IM para ambas as amostras. Isto indica,
qualitativamente, a presença no efluente de compostos com algum grau de
citotoxicidade.
Foram avaliadas também possíveis alterações genéticas provocadas pelos
constituintes do efluente em células das radículas de Allium cepa. Os resultados
indicam freqüentes disrupções cromossômicas na metáfase (Figura 7a), formação
de pontes anafásicas (Figura 7b) e presença de micronúcleos na telófase (Figura
7c). Estas alterações observadas indicam claramente a presença de substâncias
tóxicas e mutagênicas e/ou genotóxicas nas amostras do efluente.
Tabela 5 - Condições das células das radículas de Allium cepa durante o ciclo
mitótico.
Em relação aos IMs, as amostras de P1 apresentaram uma diminuição
mais acentuada do que naquelas de P2. Isto demonstra a capacidade parcial do
sistema de fossa séptica e filtro anaeróbio de diminuição da citotoxicidade do
efluente, sendo que a citotoxicidade residual reforça a idéia de sobrecarga no
sistema de tratamento. Como fora apresentado na seção 2.3, efeitos genotóxicos
de CIP em bactérias já foram comprovados
10,27,32
. Porém, deve-se levar em conta
Total de
células
Células em
divisão
Células em
interfase
% Células em
divisão
Controle 6000 523 5477 8,72
P1 6000 196 5804 3,27
P2 6000 424 5576 7,07
28
que os testes realizados com Allium cepa dizem respeito a células eucariontes,
sendo que a CIP afeta mais acentuadamente células procariontes. De qualquer
maneira, no presente estudo, nenhum tipo de investigação a respeito da presença
de CIP foi realizada nesta etapa do trabalho, o que impossibilita qualquer relação
entre a cito/genotoxicidade e a concentração do fármaco. Os testes com E. sativa
não demonstraram efeitos estatisticamente consideráveis.
Figura 7 - Divisão mitótica de células de radículas de Allium cepa. Radículas
submetidas à (a) amostra P1: disrupção / desorganização cromossômica na
metáfase; (b) amostra P1: ponte anafásica; (c) amostra P2; desorganização dos
cromossomos na anáfase; (d) controle; metáfase normal, sem anomalias.
4.2. Determinação de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM
Como referido na seção 3.3.3, as determinações da concentração de CIP
no efluente do PA-HUSM foram feitas segundo Hartmann et al.
40
, com algumas
adaptações. Variações desta metodologia vêm sendo amplamente referidas na
(a)
(b)
(c) (d)
29
literatura
32,33
. Por este motivo, não serão discutidas aqui todas as possibilidades
investigadas. Utilizou-se pré-concentração em fase sólida, sempre que
necessário, alcançando fatores de pré-concentração de até 200 vezes
(recuperação: 103±1,4%). As condições são descritas na seção 3.3.3.a. A Tabela
6 mostra as figuras de mérito do procedimento 1, que foi empregado na
determinação da concentração de CIP no efluente. A fim de confirmar a presença
de CIP no efluente do hospital, fez-se análise por LC-MS. A similaridade entre
os espectros de massas de uma solução analítica de CIP e de uma amostra de
efluente do PA-HUSM, tomada em P2, no tempo de retenção característico do
analito (Figura 8), demonstram a presença de CIP no efluente.
A fim de investigar a seletividade do procedimento 1, utilizado para a
determinação da concentração de CIP, alguns testes adicionais foram feitos:
utilizou-se método de adição do padrão a fim de comparar os coeficientes
lineares “a” das retas das curvas analíticas obtidas através deste método e do
método do padrão externo, utilizado para a determinação da concentração de
CIP. Confrontando-se os valores do coeficiente angular (a) das duas retas (Tabela
6), é possível notar que não há diferença estatística (desvio padrão relativo, rsd <
5%).
Tabela 6 - Figuras de mérito do procedimento 1 usado na determinação de
ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM.
Método do padrão externo*
Faixa linear Equação da reta r
2
LQ*** LD****
0,08 – 4 mg L
-1
y = 53996x - 4102,3 0,9993 0,2 mg L
-1
0,06 mg L
-1
Método de adição do padrão**
Equação da reta r
2
y = 50640x - 11441 0,9998
* utilizado na determinação de CIP propriamente dita
** utilizado na avaliação da seletividade do método do padrão externo
***limite de quantificação
****limite de detecção
Em negrito nas equações das retas, o coeficiente linear “a”
30
Igualmente, nenhuma diferença estatística foi observada (rsd < 2%) entre
as razões “sinal da solução analítica de CIP/sinal da amostra do efluente do PA-
HUSM” quando, durante a determinação, interrompeu-se o fluxo no momento da
passagem do analito pelo detector, variou-se λ
em
e manteve-se fixo λ
exc
.
288.2
314.2
332.2
+MS2(332.2), 8.4min (#169)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4
x10
Intens.
260 280 300 320 340 m/z
288.2
314.2
332.2
+MS2(332.2), 8.4min (#169)
0
1000
2000
3000
Intens.
260 280 300 320 340 m/z
Figura 8 - Espectros de massas no tempo de retenção característico da
ciprofloxacina, obtidos através do procedimento 2, na determinação por LC-MS.
(A) amostra de solução analítica de ciprofloxacina; (B) amostra do efluente do
PA-HUSM tomada em P2.
A Tabela 7 mostra os resultados obtidos através da determinação da
concentração de CIP no efluente do PA-HUSM. As concentrações ambientais
medidas (CAMs) foram entre 19 e 155 µg L
-1
(média de 65±45 µg L
-1
, n = 7) e
32 e 99 µg L
-1
(média de 54±21 µg L
-1
, n = 7) para P1 e P2, respectivamente.
Como já foi referido anteriormente (seções 1 e 3.3.1), após passar pelo
sistema de tratamento, o efluente é despejado diretamente no córrego que corta o
campus da UFSM. O efluente de outro prédio da universidade junta-se ao do PA-
HUSM após o ponto P2. Entretanto, nenhuma investigação a respeito do fluxo e
(A) Solução analítica
de CIP
(B) Amostra do efluente
do PA-HUSM (P2)
31
da diluição resultante foi realizada. Assim, a fim de simular as condições mais
drásticas, considerou-se não ocorrer nenhuma diluição. Uma vez que a legislação
ambiental vigente não faz nenhuma consideração específica a fármacos, foram
utilizados parâmetros europeus no presente estudo de avaliação de risco.
Tabela 7 - Concentrações de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM medidas
nos pontos P1 e P2.
CAMs de CIP (µg L
-1
)
Dias de amostragem
P1 P2 Balanço entre P1 e P2*
28/06/2006, quarta-feira 39 56 Aumento de 44%
29/06/2006, quinta-feira 155 99 Diminuição de 36%
30/07/2006, sexta-feira 19 32 Aumento de 68%
01/07/2006, sábado 46 43 Diminuição de 7%
02/07/2006, domingo 44 45 Aumento de 2%
03/07/2006, segunda-feira 44 52 Aumento de 18%
04/07/2006, terça-feira 75 52 Diminuição de 31%
Média 65
±45 54±21 Diminuição de 17%
* Obtido considerando-se o aumento ou diminuição relativos das CAMs de P1
para P2, considerando-se P1 como o 100%
A avaliação de risco ambiental para águas de superfície foi baseada no
Draft Discussion Paper proposto pela European Agency for the Evaluation of
Medical Products (EMEA)
22
. Os coeficientes de risco da CIP em corpos
receptores foram avaliados comparando-se dados de toxicidade aguda da CIP
(CE
50
) a organismos de três níveis tróficos da cadeia alimentar (peixe, daphnia e
alga)
37
como recomendado pela EMEA
22
. CPENOs em águas superficiais foram
obtidas através da aplicação de um fator de segurança de 1000 ao menor valor de
CE
50
entre as três espécies. Apesar de conservador, o fator de segurança de 1000
é sugerido para testes de toxicidade aguda a curto prazo (short-term data)
22
. Ele
considera incertezas advindas de variações intra e inter-espécies e extrapolações
de toxicidade aguda para crônica.
32
O caminho seguido no presente trabalho já foi relatado na literatura
31
.
Seguindo as recomendações do European guidelines and draft documents a
CPENO em água superficiais é de 3 µg L
-1
usando-se os dados de CE
50
para a
alga Selenastrum capricornutum
37
. A partir destes dados calculou-se uma razão
CAM/CPENO de 11-33 (média: 18). Este valor é 1.100-3.300 vezes maior que
aqueles reportados pela literatura
31
. De acordo com as referências 22 e 24, a
inclusão de microrganismos na avaliação de risco de fluoroquinolonas em águas
superficiais não é recomendada, sendo que isto deve ser feito para a avaliação de
risco em ETEs
24
. Isto porque a concentração de antibióticos é consideravelmente
maior em ETEs do que em águas de superfície. Assim pode-se assumir que o
risco para microrganismos no último compartimento é coberto pelo primeiro.
Entretanto, no presente trabalho, é necessário ter em mente a inexistência de
ETEs e que o corpo receptor é composto quase que exclusivamente por efluente
hospitalar, sendo um verdadeiro “esgoto a céu aberto”. Assim, o uso de
microrganismos, nesta situação, para a caracterização de risco, foi considerado
adequado. Considerando-se CPENO em ETEs de 8 µg L
-1
e usando-se dados de
CE
50
para uma população de bactérias relevantes de Pseudomonas putida
59
, a
razão CAM/CPENO é de 4-12 (média: 7), 200-600 vezes maior que o reportado
pela literatura
31
. Por outro lado, utilizando-se CPENO de 0,05 µg L
-1
obtido
através da CE
50
de 58 µg L
-1
, para a cianobactéria Microcysistis aeroginosa
37
, a
razão CAM/CPENO é de 640-1.980 (média: 1.080). Este valor é
aproximadamente 48-149 vezes maior que os reportados na literatura
37
.
Os quocientes maiores obtidos no presente estudo demonstram a situação
de risco mais crítica causada pelo efluente do PA-HUSM e enfatizam a
necessidade de geração de mais dados de exposição ambiental de CIP em países
em desenvolvimento. Estes resultados indicam possíveis perigos ambientais
relacionados ao uso de CIP da maneira que é feito atualmente (quantidade
administrada, condições de tratamento do efluente do PA-HUSM e
características do corpo receptor).
Some-se a isto os efeitos positivos no teste umuC causado pela presença
de 0,7 µg L
-1
de CIP em amostras de efluente de hospital
40,41
e concentrações de
33
CIP de 0,2-0,4 µg L
-1
, que causam efeitos danosos a DNA de bactérias
características de efluentes
57
. Estas concentrações, que causam efeitos
genotóxicos em bactérias, são aproximadamente 80-270 vezes menores que as
CAMs obtidas no presente estudo.
Comparando-se os resultados encontrados para P1 e P2, tem-se que a
concentração de CIP algumas vezes aumentou e outras diminuiu com a passagem
do efluente pelo sistema de tratamento (vide coluna de balanço entre P1 e P2 -
Tabela 7. Este comportamento deve ser causado pela predominância de processos
de adsorção, já amplamente reportados para a CIP
33,34,62
. Além disso, não é
esperada a degradação de CIP em condições de anaerobiose como as encontradas
no sistema fossa séptica e filtro anaeróbio da rede PA-HUSM
34,62
. Da mesma
forma, reações de hidrólise
30,59
, assim como fotodegradação, uma vez que
nenhuma exposição à luz acontece até o efluente encontrar o córrego. Acredita-se
que durante a passagem do efluente pelo sistema de tratamento ocorreu a partição
de CIP entre as fases líquida (efluente) e sólida (lodo). Tal situação de equilíbrio
demonstrou ser conduzida por dois processos: concentrações mais elevadas de
CIP no efluente (onde o limiar pareceu ser aproximadamente 45 µg L
-1
); e a
saturação do lodo com o medicamento. Como pode-se ver no gráfico da Figura 8,
quando a concentração de CIP em P1 é inferior a aproximadamente 45 µg L
-1
, a
concentração em P2 aumenta (variação positiva na concentração de CIP de P1
para P2 no gráfico). Já quando a concentração de CIP em P1 é superior a
aproximadamente 45 µg L
-1
, a concentração em P
2
diminui (variação negativa na
concentração de CIP de P1 para P2 no gráfico). Estes resultados dão indícios de
haver a migração da CIP do efluente para o lodo e vice-versa. A Figura 9
também demonstra que quanto mais a concentração de CIP em P1 está próxima
de 45 µg L
-1
, menor a variação de concentração de P1 para P2, evidenciando a
tendência de equilíbrio da CIP entre as fases sólida e líquida.
34
-40
-20
0
20
40
60
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Concentração de Cipro em P1 (mg/L)
variação da Concentração de Cipro de P1
para P2 (%)
Figura 9 - Variação da concentração de ciprofloxacina no efluente do PA-HUSM
após passagem pelo sistema de tratamento. Valores positivos e negativos na
abscissa significam, respectivamente, aumento e diminuição da concentração de
ciprofloxacina ao passar pelo sistema de tratamento.
Esta suposição é corroborada pelo alto coeficiente de partição lodo-
efluente (log K
d
lodo) da CIP (log K
d
lodo = 4,2 L kg
-1
). log K
d
> 2,5 significam
alta capacidade de adsorção
34
. Visto que cada CAM apresentada é uma amostra
composta por coletas tomadas ao longo de cada dia (representando, portanto,
tendência diária), desconsiderou-se qualquer imprecisão advinda do tempo de
retenção hidráulica.
Embora os processos envolvidos sejam muito complexos,
algumas discussões ambientalmente relevantes já vem sendo feitas a respeito da
adsorção de fluoroquinolonas em material orgânico particulado
34,78,86
. O que se
sabe é que CIP é uma quinolona anfótera, que contém dois prótons ionizáveis.
Assim, a CIP existe na forma de quatro microespécies diferentes em solução, que
são dependentes do pH: as formas positiva, zwitteriônica, neutra e negativa. A
forma neutra, independente do pH, é a fração que ocorre em muito menor
proporção (Figura 10)
89
. Tal comportamento, aliado aos valores negativos de
coeficiente partição octanol-água (log K
ow
) de CIP, indica que interações
hidrofóbicas desempenham um papel menos importante no processo de adsorção.
35
Por outro lado, as formas carregadas que ocorrem em muito maior extensão
sugerem que interações eletrostáticas são as principais responsáveis pela
migração de CIP para partículas sólidas
34,39,43
. Obviamente, o grau de adsorção
de CIP depende, também, do pH do meio e das características do adsorvente,
como por exemplo, que tipo de interações ele é capaz de fazer com o fármaco.
Figura 10 – Frações das microespécies da ciprofloxacina em diferentes pH
89
.
4.3. Degradação fotoinduzida de ciprofloxacina em solução sintética
4.3.1. Estudo cinético
Alguns estudos têm sido realizados a cerca da fotodegradação da CIP.
Porém, a grande maioria deles não é de relevância ambiental. Assim, a fim de
ter-se uma primeira impressão do comportamento de CIP em concentrações
36
ambientais frente ao uso de processo fotoinduzido, uma série de ensaios foi feita
com soluções sintéticas desta espécie.
Após 2 minutos de tratamento observou-se uma redução de quase 85% da
concentração de CIP (Figura 11a). Após 4 min a concentração de CIP era inferior
a 3% da concentração inicial. O decaimento de CIP demonstrou ser de primeira
ordem (Figura 11b), sendo que a constante de velocidade de reação (k) foi
determinada a partir da lei de cinética de primeira ordem, para o consumo de um
reagente, no caso, a CIP,
Onde [CIP] é a concentração de CIP, t é o tempo de reação de fotodegradação e k
é a constante de velocidade de reação. A equação 1 pode ser independentemente
integrada entre os limites t
0
([CIP]
0
) e t ([CIP]), como segue:
A partir daí, obtém-se
Calculou-se, então, um k de (1,56±0,11) x 10
-2
s
-1
.
O tempo de meia-vida (t
1/2
) foi calculado considerando-se [CIP] =
1/2[CIP]
0
, na equação 2. Como resultado obtêm-se a equação:
k
t
2
ln
2/1 =
(3)
[]
[]
CIP
d
CIP
d k
t
−=
(1)
[]
[]
∫∫
−=
t
tk
0
[Cipro]
[Cipro]
d
CIP
CIPd
0
[]
[]
kt−=
0CIP
CIP
ln
(2)
37
Assim, no presente trabalho, observou-se t
1/2
de 44±7 s.
A não influência da concentração na fotodegradação de CIP está de acordo
com os estudos realizados por Cardozo et al.
16
que, em experimentos com
mesocosmo, verificaram que a fotodegradação da CIP obedeceu a um regime de
primeira ordem (t
1/2
= 68,4-58,2 mim). Utilizando fonte artificial de irradiação o
tempo de meia-vida foi de 114 e 2760 min. Gagliano e McNamara
30
verificaram
o mesmo perfil de primeira ordem, obtendo k = 1,49 x 10
-2
(t
1/2
= 46,4 min), 7,69
x 10
-2
(t
1/2
= 9,0 min) e 3,00 x 10
-2
d
-1
(t
1/2
= 23,1 min), em pH 5, 7 e 9,
respectivamente. Por outro lado, Burhenne et al.
12
encontraram uma taxa de
degradação de segunda ordem (k = 1,11 x 10
-2
L mol
-1
s
-1
e t
1/2
= 90,2 min).
Figura 11 - Processo fotoinduzido de degradação de ciprofloxacina em solução
sintética. a) decaimento da concentração de ciprofloxacina; b) decaimento de 1ª
ordem. Condições: fotorreator, em batelada (2,5 L); 30 °C; pH 9 (NH
4
Cl 0,05
mol L
-1
e KOH 3 mol L
-1
); 0,1 mg L
-1
de ciprofloxacina (0,3 x 10
-6
mol L
-1
).
4.3.2. Estudo da biodegradabilidade
Valendo-se de estudos prévios a respeito da disposição geral dos
subprodutos de degradação de CIP, determinou-se que seriam utilizadas amostras
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 50 100 150 200 250
tempo (s)
C (mM)
y = -0,0153x - 0,0538
R
2
= 0,9993
-5
-4
-4
-3
-3
-2
-2
-1
-1
0
0 50 100 150 200 250
tempo (s)
ln C/Co
(a)
(b)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 50 100 150 200 250
tempo (s)
C (-3e mol/L)
y = -0,0153x - 0,0538
R
2
= 0,9993
-4,5
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0 50 100 150 200 250
tempo (s)
ln C/Co
(a)
(b)
38
tomadas em tempos de 0, 2 e 4 min de fotoprocesso. Escolheram-se amostras que
possibilitassem a investigação dos efeitos de alguns metabólitos na
biodegradabilidade das soluções irradiadas, além da sua identificação. Como
pode ser visto na Figura 12, os experimentos realizados foram todos válidos,
visto que o acetato de sódio, espécie prontamente biodegradável, utilizada como
indicador de toxicidade e controle de qualidade, foi eliminado a uma taxa
superior a 60%, após 14 dias. Apesar dos valores negativos para as três amostras
do fotoprocesso, os resultados foram considerados estatística e quimicamente
consistentes. Nenhuma diferença significativa de biodegradabilidade foi
verificada entre a solução antes da irradiação e aquelas irradiadas. A degradação
de CIP durante o fotoprocesso foi de 64% e 80%, após 2 e 4 min,
respectivamente, o que significa que estava presente em todas as três amostras.
Halling-Sørensen et al.
37
verificaram a biorecalcitrância de CIP através do CBT.
Al-Ahmad et al.
1
e Kümmerer et al.
59
obtiveram o mesmo perfil, mesmo com
testes prolongados de 28 para 40 dias. Analisando-se a Figura 13, verifica-se
decréscimo na concentração de CIP em amostras sem tratamento, incubadas para
o CBT. Já, para as amostras tomadas a 2 e 4 min de fotoprocesso, não houve
variação significativa na concentração do fármaco após a incubação. Este
comportamento está em desacordo com o que fora reportado por Kümmerer et
al.
60
, em que a concentração de CIP permanece constante no decurso do teste.
Apesar de existir uma série de casos relatando a alta capacidade de adsorção da
CIP
33,34,64
, este fenômeno não é esperado ocorrer nas condições do CBT. Reações
de hidrólise são igualmente improváveis
30,59
e não devem explicar o
comportamento observado.
Os resultados aqui apresentados evidenciam que os subprodutos formados
não são prontamente biodegradáveis. Porém, tomando-se diferentes tempos de
irradiação, diferentes compostos fluorescentes são formados, sendo que
prolongando-se o tempo de exposição, os sinais referentes a eles tendem a
desaparecer. Assim, é necessária uma nova investigação visando avaliar a
biodegradabilidade de compostos formados em tempos de processo diferentes
destes demonstrados no presente estudo.
39
Figura 12 - Pronta biodegradabilidade de soluções sintéticas de ciprofloxacina,
medida através de CBT, durante processo fotoinduzido. Condições: fotorreator,
em batelada, 30 °C; pH: 9 (controlado com adição de solução de KOH, apenas);
Concentração de ciprofloxacina: 6 mg L
-1
(1,81 x 10
-5
mol L
-1
).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 1 7 14 28
Dias
Concentração do Cipro (mg/L)
0 min
2 min
4 min
Figura 13 - Variação de concentração de ciprofloxacina em diferentes amostras
de processo fotoinduzido (amostras dos tempos 0, 2 e 4 min), durante os 28 dias
de análise do CBT.
Deve-se, também, ter em mente que o CBT é utilizado para determinar a
biodegradabilidade de compostos e misturas sob baixa densidade bacteriana,
sendo que, de uma maneira geral, os resultados obtidos através dele podem ser
extrapolados para águas superficiais. Porém, no momento da escolha do teste de
biodegradabilidade, deve-se considerar as características microbiológicas do
ecossistema impactado pelo efluente, contendo o composto ou a mistura de
-20
-5
10
25
40
55
70
85
0102030
Dias
Biodegradação (%)
amostra 0 min
controle de qualidade
controle de toxicidade
-20
-5
10
25
40
55
70
85
0102030
Dias
Biodegradação (%)
amostra 2 min
controle de qualidade
controle de toxicidade
-20
-5
10
25
40
55
70
85
0102030
Dias
Biodegradação (%)
amostra 4 min
controle de qualidade
controle de toxicidade
40
interesse. Normalmente, efluentes hospitalares são tratados em ETEs que se
valem de sistemas de lodos ativados, o que nos remete à utilização de testes que
utilizem maiores densidades bacterianas, como por exemplo, o Zanh-Wellens
test. Assim, uma nova série de investigações será necessária, caso se queira
avaliar a biodegradabilidade dos subprodutos de fotodegradação de CIP frente a
um ambiente com uma população bacteriana diferenciada desta apresentada no
corrente estudo.
4.3.3. Subprodutos de degradação
Utilizou-se análise por LC-MS na investigação dos subprodutos formados
na fotodegradação de CIP. Como pode ser visto na Figura 14, a maioria dos
compostos formados durante o processo apresentam polaridade similar a do
composto-mãe. Por este motivo, não foi empregado nenhum tratamento
diferenciado das amostras fotoprocessadas e considerou-se que o procedimento
utilizado na determinação de CIP é adequado para a identificação dos
metabólitos.
Figura 14 - Espectros de fluorescência de amostras de solução sintética de
ciprofloxacina tomadas em diferentes tempos (0, 2 e 4 min) de processo
fotoinduzido com identificação dos sinais de interesse. Condições: fotorreator em
batelada, 30 °C, pH: 9 (controlado com adição de solução de KOH, apenas);
Concentração 6 mg L
-1
de ciprofloxacina (1,81 x 10
-5
mol L
-1
).
41
Nos primeiros momentos do tratamento, dois sinais (1 e 2 - Figura 14)
foram observados muito próximos ao sinal da CIP e referentes a compostos com
maior polaridade (menor tempo de retenção). O sinal 1 foi o primeiro a ser
detectado e aumentou à medida que o sinal referente à CIP diminuiu. O sinal 2
foi identificado um pouco mais tarde, no decorrer do fotoprocesso, e é referente a
um composto mais polar. No decorrer do tratamento estes compostos tenderam a
diminuir e desaparecer.
A investigação a respeito da estrutura dos metabólitos de fotodegradação
de CIP e a discussão e proposição de possíveis rotas reacionais envolvidas neste
processo foram feitas confrontando-se os dados obtidos através da análise por
LC-MS das amostras de soluções sintéticas de CIP, tomadas durante
fotoprocessos, com estudos encontrados na literatura. Visando o melhor
entendimento, serão apresentados, já num primeiro momento, todos os
compostos possivelmente identificados a partir de suas respectivas massas
(Figura 15).
N
F
N
OO
OH
HN
NN
OO
OH
HN
O
N
F
N
H
OO
OH
NH
2
NN
H
OO
OH
NH
2
N
HO
N
OO
OH
HN
Produto 1
[M + H]
+
= 306
Produto 4
[M + H]
+
= 330
Produto 3
[M + H]
+
= 288
Produto 2
[M + H]
+
= 330
CIP
N
F
N
O
HN
Produto 5
[M + H]
+
= 288
Figura 15 - Metabólitos possivelmente formados e suas respectivas
massas
12,13,74,93
42
O espectro de massas correspondente ao sinal 1 apresentou, como o mais
intenso, um fragmento de massa molecular 306,5 (Figura 16), a mesma do 7-[(2-
aminoetil)amino]-6-fluoroquinolina (produto 1 - Figura 15), formado a partir da
decomposição do anel piperazínico. Este produto é, normalmente, verificado
durante a fotodegradação de CIP sob condições ácidas e é um intermediário da
formação da amina primária 7-amino-6-fluoroquinolina
12,74,93
. Entretanto, esta
última espécie não foi observada na presente investigação. Uma provável
explicação para isso é o curto tempo de reação empregado. Apesar destes
compostos serem encontrados preferencialmente em condições ácidas, já foram
também obtidos em pH neutro
74
e alcalino (8,6 e 10,6)
96
.
177.3
218.4
237.2
268.4
306.5
332.5
379.2
397.1
419.1
443.1
+MS, 7.5min (#212)
0
2000
4000
6000
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
175.3
189.3
217.3
235.3
268.4
288.5
306.5
328.4
407.1 459.0
+MS, 7.5min (#213)
0
2000
4000
6000
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
177.3
199.4
217.3
235.3
268.4
288.5
306.5
328.4
357.2
455.5
+MS, 7.5min (#209)
0
2000
4000
6000
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Figura 16 - Espectros de massas obtidos através de análise por LC-MS referentes
ao tempo de retenção 7,5, característico do sinal 1 (sinal obtido através de análise
por HPLC-FLD – Figura 14), durante diferentes tempos (0, 2 e 4 min) de
processo fotoinduzido.
4 min
0 min
2min
43
193.2
218.4
237.2
257.2
301.4
361.2
443.1
+MS, 7.2min (#204)
0
2000
4000
6000
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
177.3
199.4
217.3
237.2
268.4
288.5
326.4
375.2 455.7
+MS, 7.2min (#203)
0
2000
4000
6000
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
171.4
199.3
218.4
237.2
268.4
288.5
330.5
357.2
399.4
475.0
+MS, 7.2min (#202)
0
2000
4000
6000
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Figura 17 - Espectros de massas obtidos através de análise por LC-MS referentes
ao tempo de retenção 7,2 min, característico do sinal 2 (sinal obtido através de
análise por HPLC-FLD, Figura 14), durante diferentes tempos (0, 2 e 4 min) de
processo fotoinduzido.
Nestas condições básicas, uma série de outros subprodutos foram
detectados, corroborando os resultados apresentados aqui. Nada foi encontrado a
respeito do mecanismo destas reações. Alguns pesquisadores consideram ocorrer
abstração de um hidrogênio por algum estado excitado ou por radicais hidroxil
formados a partir da reação direta da água com o fármaco, ou ativação de
dioxigênio residual
2
. Esta última hipótese parece ser especialmente possível
quando se considera que as soluções utilizadas nestes experimentos foram
saturadas com ar e continham, portanto, altas concentrações de O
2
. O espectro de
massa do sinal 2 demonstra que 288,5 é a massa do fragmento com sinal mais
intenso (Figura 17). A partir disto, uma série de hipóteses podem ser
consideradas:
4 min
2 min
0 min
44
Hipótese 1. A espécie formada pode ser referente à perda do átomo de
flúor na posição 6, juntamente com a mesma quebra do anel piperazínico referida
anteriormente, tendo-se, desta maneira, a formação do composto 3 (Figura 15).
É sabido que, durante a fotodegradação de CIP, sob condições redutoras,
ocorre defluoração induzida por transferência de elétron
2,76
através da
estabilização do estado triplete por uma espécie doadora de elétron, para formar o
anion radicalar a (Figura 18). O passo seguinte envolve a perda do flúor e a
formação de um radical aril b.
Hipótese 1.a. Na presença de um bom agente redutor, como, por exemplo, o
sulfito, a seqüência é completada por uma segunda transferência de elétrons
seguida de protonação para formar o composto c (Figura 18)
74
. Este
comportamento foi observado durante fotodegradação da norfloxacina,
fluoroquinolona estruturalmente bastante similar à CIP
25
.
Hipótese 1.b. Por outro lado, quando, por exemplo, fosfato é usado como
tampão, seu baixo potencial de redução impede a transferência de elétron para b
e o ânion radical fosfato, inicialmente formado, abstrai um próton da cadeia
lateral, gerando o diradical d. Por fim, esta espécie sofre clivagem do anel
piperazínico e adição de água, formando o composto 2 (M + H
+
= 330) e,
posteriormente, o composto 3
74
(Figura 18). No presente trabalho, um fraco sinal
referente à massa de 330,5 foi observado no mesmo tempo de retenção da massa
288,5 (vide Figura 17), podendo ser um indicativo da formação do composto 2.
Esta espécie também foi encontrada, porém, em menor concentração, na
irradiação de CIP em água pura
74
. Os autores dão como uma possível explicação
a oxidação da água para a geração de a e HO•. Este último poderia,
supostamente, abstrair um hidrogênio da mesma forma considerada para o caso
do ânion radicalar fosfato. Isto obedeceria ao bem conhecido mecanismo de
abstração de hidrogênio por radical hidroxil, que geralmente acontece com
espécies alifáticas. Somado a isto, radicais orgânicos provenientes deste tipo de
reação normalmente interagem com oxigênio molecular para formar radicais
peroxil
81
, sendo adequado, portanto, considerar que o produto 2 pode ser obtido
através deste tipo de mecanismo.
45
N
F
N
OO
OH
HN
CIP
3
*
N
OO
OH
F
N
HN
X
-
X
.
-F
-
NN
OO
OH
HN
SO
3
-.
SO
3
2
-
NN
OO
OH
HN
+H
2
O
N
OO
OH
N
HN
HO
F
-F
-
N
HO
N
OO
OH
HN
X
-
= SO
3
2
-
ou HPO
4
2
-
X
.
= SO
3
-.
ou HPO
4
-.
+H
+
-H
2
PO
4
-
.
NN
OO
OH
HN
NN
OO
OH
H
+
N
NN
OO
OH
HN
HO
NN
OO
OH
HN
O
H
2
O
a
b
c
d
e
f
Produto 2
NN
H
OO
OH
NH
2
Produto 3
N
F
N
O
HN
SO
3
2
-
SO
3
-.
N
F
N
O
HN
hv
-e
-
-CO
2
hv
Produto 4
Produto 5
g
h
CIP
Figura 18 - Fotometabólitos de ciprofloxacina em solução aquosa formados em
diferentes condições e suas respectivas rotas reacionais. Todas as informações
contidas aqui já foram reportadas na literatura
2,12,13,25,74,93
.
46
Hipótese 1.c. Deve-se, também, considerar a reação de terminação entre radical
hidroxil e as espécies, ou a, ou b, com formação do composto 4. Este suposto
metabólito foi identificado durante irradiação de CIP, em água pura, num
processo de baixa eficiência (Φ 0,07)
74
e também apresenta M + H
+
= 330,
indicando a possibilidade de ter sido formada nas condições aqui apresentadas.
Porém, baseado no que fora obtido na irradiação da norfloxacina, e por outras
substituições aromáticas nucleofílicas fotoinduzidas, o processo foi considerado
ocorrer via mecanismo de adição-eliminação, através da formação do
intermediário g, e, não, através de reações radicalares (vide Figura 18). Esta
espécie, porém, teria sua formação inibida pela saturação da solução com ar, o
que ocorre no presente estudo. Sob semelhantes condições, a defluoração da
norfloxacina para formar a espécie análoga a 4, apresentou um menor rendimento
quando comparado ao obtido com soluções sob fluxo de argônio
25
.
Fluoroquinolonas podem ser estabilizadas por oxigênio através de transferência
de energia, via formação de oxigênio singlete e/ou transferência de elétron para
formar o ânion superóxido e o cátion radicalar da correspondente
fluoroquinolona. Este último fenômeno é indicado como sendo o mecanismo
mais significante
2
, tendo-se a regeneração do composto original e a queda do
rendimento quântico da fototransformação.
Hipótese 2. Outra possibilidade é a descarboxilação da CIP para formar o
composto 5 (M + H
+
= 288). Ele foi observado, em menor extensão, na presença
de sulfito (espécie doadora de elétrons), em pH neutro, após redução do radical
aril formado pela perda do grupo carboxil
13
(Figura 18).
Tomando-se o que foi discutido a cima, deve-se considerar, para o
presente estudo, o fato de que o pH da solução foi ajustado apenas adicionando-
se KOH. Sob tais condições, HO
-
atuaria no lugar dos íons sulfito e fosfato, como
doador de elétrons, segundo os mecanismos discutidos no parágrafo anterior.
Não deve ser esquecido que tal comportamento implicaria na formação de radical
hidroxil, devendo este participar ativamente da cadeia de reações. Para o melhor
entendimento, os caminhos hipotetizados são demonstrados na Figura 19.
47
CIP
3
*
N
OO
OH
F
N
HN
HO
-
HO
.
-F
-
NN
OO
OH
HN
HO
.
HO
-
NN
OO
OH
HN
+H
2
O
N
OO
OH
N
HN
HO
F
-F
-
N
HO
N
OO
OH
HN
+H
+
H
2
O
NN
OO
OH
HN
NN
OO
OH
HN
O
a
b
c
d
Produto 2
NN
H
OO
OH
NH
2
Produto 3
HO
.
HO
.
N
F
N
OO
OH
HN
N
F
N
O
HN
HO
-
HO
.
N
F
N
O
HN
hv
-e
-
-CO
2
Produto 5
h
g
Produto 4
CIP
HO
.
-F
-
Figura 19 - Compostos provavelmente formados durante degradação
fotoinduzida de ciprofloxacina, em solução sintética (pH 9 e em meio a HO
-
) e
rotas possíveis. Os compostos e rotas foram propostos no presente trabalho, com
base em informações disponíveis na literatura e resumidamente apresentados na
Figura 18.
48
Porém, existe uma outra hipótese, quimicamente viável, que baseia-se
indiretamente nos mecanismos acima referidos. Sabendo-se que, mesmo
fluoroquinolonas que não possuem a parte piperazínica, são capazes de se
converter ao estado triplete
9,101
, deve-se considerar a obtenção do produto 3, via
formação do produto 1. Como já foi dito anteriormente, a espécie de massa 306,5
se forma antes daquela de massa 288,5. Assim, é aceitável a rota reacional
mostrada na Figura 20, onde o composto 1 seria convertido ao seu estado triplete
e, em seguida, estabilizado por HO
-
(doador de elétrons), com formação dos
intermediários i e j (correspondentes aos intermediários a e b, respectivamente)
e, finalmente, o produto 3 (correspondente, neste caso, ao composto c).
HO
-
HO
.
HO
.
HO
-
+H
+
i
j
N
F
N
H
OO
OH
NH
2
Produto 1
Produto 1
3
*
N
H
NH
2
N
OO
OH
F
NN
H
OO
OH
NH
2
NN
H
OO
OH
NH
2
Produto 3
Figura 20 - Compostos com maior probabilidade de serem formados durante
degradação fotoinduzida de ciprofloxacina em solução sintética (pH 9 e em meio
a HO
-
) e rotas reacionais possíveis. Os compostos e rotas foram propostos no
presente trabalho, com base em informações disponíveis na literatura e
resumidamente apresentados na Figura 18.
Alguns outros compostos fluorescentes de menor polaridade (em tempos
de retenção mais altos) são formados (Figura 14), porém seus espectros de
massas não foram suficientes para obter qualquer informação estrutural.
49
É importante notar que nenhum dos compostos sofreu quebra da parte
quinolônica da molécula, responsável pela atividade bacteriana de
fluorquinolonas
20,90
, sendo que o produto 3 apresenta fraca, mas comprovada
atividade bacteriana (100 vezes mais fraca que a da CIP)
106
. Apesar disso,
radiação UV pode ser responsável pela perda da ação biológica de soluções
contendo CIP
84
.
Todos os metabólitos discutidos acima foram reportados na literatura
apenas como um passo intermediário da fotodegradação de fluoroquinolonas,
visto que produtos com maior polaridade, além de CO
2
, foram observados em
seguida
12-14
. Isto provavelmente aconteceu aqui, uma vez que os sinais dos
produtos fluorescentes desapareceram, quando foram utilizados tempos
reacionais mais prolongados. Entretanto, nenhum dos estudos referenciados aqui,
e que investigaram fotometabólitos de fluoroquinolonas, foram realizados nas
mesmas condições apresentadas nesta tese (soluções aquosas, pH 9, não-
tamponadas e com excesso de HO
-
). Assim, no que diz respeito à estrutura dos
metabólitos e rotas reacionais, o presente trabalho pode servir como uma
abordagem primária para futuras investigações, mais detalhadas, a respeito (a) da
natureza e concentração dos subprodutos obtidos neste estudo; (b) da natureza e
concentração de subprodutos obtidos sob irradiação prolongada; e (c) rotas
reacionais.
4.4. Processos avançados de oxidação na degradação de ciprofloxacina no
efluente do PA-HUSM
Visto que o objetivo do uso de PAOs era, somente, investigar a sua
aplicabilidade de uma maneira genérica, na degradação de CIP em efluentes
hospitalares, nenhum estudo de otimização de processos será apresentado aqui.
Foram investigados os processos fotoinduzido, fotocatálise heterogênea,
ozonização e peroxônio. Os resultados são demonstrados na Figura 21.
50
Figura 21 - PAOs na degradação de ciprofloxacina em efluente do PA-HUSM.
Condições: X: concentração durante o processo; X
0
: concentração inicial,
concentração de CIP: 200 µg L
-1
; DQO: 658 mg L
-1
. Processo fotoinduzido -
fotorreator, em batelada com recirculação (500 mL); lâmpada de vapor de
mercúrio de 125 W e média pressão; pH 3. Fotocatálise heterogênea - Reator
tubular helicoidal (700 mL), lâmpada de vapor de mercúrio de 125 W e média
pressão; pH 3; 400 mg de TiO
2
em suspensão. Ozonização: reator tubular (500
mL), em regime de semi-batelada; fluxo de 8 L min
-1
de ar; geração 450 mg h
-1
de O
3
; pH 9. Peroxônio: como na ozonização; 500 mg L
-1
de H
2
O
2
.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min)
X/Xo
Conc. CIP
Ab s. Integrada
DQO
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 102030405060
Tempo (min)
X/Xo
Conc. CIP
Abs. Integrada
DQO
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 102030405060
Tempo (min)
X/Xo
Conc. CIP
Abs. Integrada
DQO
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 60 120 180 240 300
Tempo (min)
X/Xo
Conc. CIP
Ab s. Integrada
DQO
(b) Fotocatálise
heterogênea
(c) Ozonização
(d) Peroxônio
(a) Processo fotoinduzido
51
Analisando-se o que foi obtido através do processo fotoinduzido (Figura
21a), é possível notar o desfavorecimento da degradação da CIP dissolvida no
efluente quando comparado a sua fotodegradação em solução sintética, uma vez
que foram obtidos t
1/2
de 2,5 h e 44 s para a primeira e segunda condições,
respectivamente. Este comportamento era esperado, visto que é conhecida a
maior dificuldade na degradação de micropoluentes presentes em efluentes em
concentrações-traço, já que a competição entre o substrato e outros constituintes
do sistema, pelas espécies ativas responsáveis pela degradação, é normalmente
ditada por suas concentrações.
Porém, nos casos de degradação fotoinduzida de CIP, em solução sintética
e no efluente do PA-HUSM, aqui relatados, alguns fatores devem ser levados em
consideração: o primeiro deles é a diferença entre os dois sistemas utilizados.
Como estas duas séries de experimentos foram realizadas em laboratórios
diferentes, por força da disponibilidade de equipamentos, os regimes de operação
foram diferentes: em batelada para a degradação da CIP em solução sintética e,
em batelada com recirculação, para a degradação de CIP no efluente do HUSM.
Teoricamente, esta diferença nos regimes traz implicações no perfil dos
subprodutos formados, uma vez que sistemas com recirculação, devido à
exposição de pequenas frações da solução com a fonte de radiação, propiciam
degradação simultânea dos compostos-mãe e de espécies intermediárias. No caso
de reatores em batelada simples, de uma maneira geral, ocorre o acúmulo de
intermediários, uma vez que a degradação destes dependerá do aumento da sua
concentração e do desaparecimento do composto-mãe
82
. A diferença entre a
potência das lâmpadas também deve ter influenciado na eficiência do processo.
Porém, obviamente, os grandes responsáveis pela queda no rendimento do
processo são as espécies constituintes do efluente que, devido à absorção da
radiação e interação com espécies ativas formadas durante o processo, que têm
papel fundamental nas cadeias reacionais radicalares, restringem os caminhos de
reação do substrato. Os outros três processos investigados propiciaram melhores
resultados e seus rendimentos na degradação da CIP foram mais próximos entre
si, sendo que os processos de fotocatálise heterogênea, ozonização e peroxônio
52
apresentaram t
1/2
de 20, 9 e 15 min, respectivamente (Figuras 21b, 21c e 21d).
Como se pode perceber, a ozonização foi o processo mais adequado para a
remoção de CIP do efluente do PA-HUSM, inclusive, quando comparado ao
processo peroxônio que, de maneira geral, propicia a formação de espécies ativas
como o radical hidroxil, que apresentam potencial de oxidação mais elevado que
o do ozônio e, normalmente, criariam condições mais propícias à degradação de
poluentes. Entretanto, deve-se ter em mente que H
2
O
2
atua na iniciação e
terminação de cadeias radicalares, devendo promover a geração de radicais
hidroxil e também consumi-los, no decorrer do processo. Baseado nisto, entende-
se que a ação positiva ou negativa dependerá de fatores como a razão O
3
/H
2
O
2
,
presença e concentração de consumidores de radicais, além da reatividade entre
ozônio molecular e substrato
35
. A razão molar O
3
/H
2
O
2
mais adequada tem sido
demonstrado ficar na faixa 0,5-1. A concentração inicial de H
2
O
2
foi de 500 mg
L
-1
, porém, nenhum estudo visando determinar a concentração de ozônio no meio
reacional foi feito. Dodd et al
20
verificaram que a destruição de CIP durante
ozonização de amostras de efluente ocorre, preferencialmente, através da reação
direta do substrato com o O
3
. Considerando-se este comportamento, é coerente a
queda na velocidade da reação com a adição de H
2
O
2
, já que a concentração de
O
3
em solução diminui em função da sua reação com H
2
O
2
para iniciação de
cadeias radicalares. Esta teoria é reforçada pelo maior decréscimo da DQO, uma
vez que o mecanismo indireto, de uma maneira geral, deve favorecer a remoção
de carbono orgânico. Entretanto, nada de conclusivo pode ser dito a respeito,
sendo necessária uma investigação mais criteriosa a fim de definir o real efeito
do H
2
O
2
sobre o rendimento do processo. Novos experimentos de ozonização
utilizando amostras de efluente em meio ácido ou de O
3
/H
2
O
2
, na presença de um
consumidor de radicais hidroxil, podem ser úteis na definição do mecanismo
preferencial de degradação de CIP.
Mais especificamente em relação à ozonização, Dodd et al.
20
verificaram
que O
3
reage com CIP a uma taxa na faixa de 4 x 10
2
a 10
5
L mol
-1
s
-1
, entre pH 3
e 8. Segundo os autores, esta dependência do pH é governada pela desprotonação
do N(4) amina. Em pH inferior a 4, a reatividade não foi atribuída ao átomo N(4)
53
ou ao anel quinolínico heterocíclico, e, sim, ao nitrogênio piperazínico N(1), ou
ao carbono não-substituído na posição orto do anel aromático adjacente.
De qualquer maneira, pode-se considerar que os resultados obtidos através
da fotocatálise heterogênea e peroxônio apresentaram certa similaridade. No
processo de fotocatálise heterogênea, a superfície do catalisador é ativada pela
radiação UV e um elétron é promovido da banda de valência para a banda de
condução, formando duas regiões altamente reativas e com características
distintas: a lacuna eletrônica fotogerada que apresenta alto potencial de oxidação
e a camada de condução, onde a presença destes elétrons excitados cria um
ambiente altamente redutor. Desta maneira, água adsorvida na superfície do
catalisador sofre reações de oxi-redução, podendo gerar radical hidroxil, além de
uma série de outras espécies ativas. Poluentes também são adsorvidos na
superfície do catalisador e estão sujeitos à ação, tanto direta, da excitação do
catalisador, como indireta, da reação com os intermediários gerados. Assim, o
mecanismo pelo qual a CIP reage durante o processo fotocatalítico é bastante
parecido com aquele que o medicamento reage durante o processo peroxônio.
A similaridade entre os cromatogramas da análise por HPLC-FLD das
amostras tomadas durante os experimentos com PAOs aplicados ao efluente faz
crer que os produtos formados são, de maneira geral, similares. A Figura 22
mostra os cromatogramas obtidos através da análise por HPLC-FLD das
amostras tomadas durante a ozonização do efluente do PA-HUSM e que ilustra o
comportamento geral de todos os processos. Pode-se observar o aumento de um
sinal referente a um composto já existente no efluente, provavelmente, algum dos
metabólitos. Este sinal aumenta à medida que a CIP vai sendo destruída. A partir
de certo momento, com a queda da concentração da CIP, inicia-se uma
competição entre a CIP e o referido composto, pelas espécies responsáveis pela
degradação dos poluentes, e a concentração de ambos passa, então, a cair.
Como pode ser visto na Figura 21, os processos de ozonização e de
fotoindução demonstraram menor capacidade de redução de DQO e da
absorbância integrada, uma vez que as eficiências de degradação, de uma
maneira geral, foram em torno de 20% e nunca passaram de 40% (redução de
54
absorbância integrada durante processo fotoinduzido). Este comportamento era
esperado, já que estes processos, devido à maneira seletiva com a qual atuam,
não têm capacidade de remoção de carga orgânica. Já os processos peroxônio e,
especialmente, fotocatálise heterogênea, apresentaram maior capacidade de
remoção de DQO e de absorbância integrada, devido à capacidade dos
intermediários formados de reagirem de forma indiscriminada com os
constituintes do efluente.
Figura 22 - Cromatogramas de soluções do efluente do PA-HUSM durante
ozonização como um modelo do perfil dos metabólitos, primariamente formados,
em função do tempo de tratamento com PAOs.
0 min
5 min
10 min
15 min
20 min
25 min
30 min
CIP
55
5. Conclusões
Os testes realizados através do sistema Allium cepa com o efluente do PA-
HUSM evidenciaram a sua cito/genotoxicidade, inclusive, após passagem pelo
sistema de fossa/filtro. Porém, apesar da comprovada genotoxicidade da CIP,
nenhuma correlação pode ser feita entre a genotoxicidade do efluente e a
eventual presença do fármaco.
CIP foi identificada no efluente do PA-HUSM em concentração média de
65
±45 µg L
-1
(19-155 µg L
-1
) e 54±21 µg L
-1
(32-99 µg L
-1
), antes e depois do
sistema de tratamento, respectivamente. O aumento ou diminuição da
concentração de CIP no sistema fossa/filtro demonstrou obedecer a um equilíbrio
entre a fase líquida (efluente) e a fase sólida (lodo), governado pela saturação do
lodo com CIP e por concentrações do fármaco no efluente superiores a 45 µg L
-1
.
Quando houve, a remoção de CIP demonstrou ser causada pela adsorção do
medicamento no lodo do sistema de tratamento.
Utilizando-se três diferentes CPENO tomados da literatura, foram
calculadas razões CAM/CPENO entre 4-1.980. Estes valores demonstram alto
risco ambiental causado pela liberação de CIP, nas atuais condições e a
necessidade de um plano de gerenciamento de risco do uso de CIP no PA-
HUSM.
Os quocientes de risco encontrados no presente trabalho são 48-3300
vezes maiores que aqueles encontrados em países europeus, sendo este um
indicativo de que é necessário um maior estudo de avaliação de risco ambiental
causado por fármacos em países em desenvolvimento, a fim de que se tenha um
panorama mais realístico da situação mundial.
A degradação fotoinduzida de CIP, em concentrações ambientais e
dissolvida em solução tamponada com NH
4
Cl/KOH e pH 9, foi de primeira
ordem, k: 1,56 (±0,11) x 10
-2
s
-1
; t
1/2
: 44 (±7) s.
56
As soluções irradiadas de CIP não demonstraram aumento da pronta
biodegradabilidade medida com CBT. Nenhuma diferença significativa foi
observada entre a amostra sem tratamento e aquelas após processo fotoinduzido,
indicando que os produtos formados não são prontamente biodegradáveis.
Porém, os resultados indicaram que estas espécies são metabólitos
primários, visto que os cromatogramas demonstraram que os sinais referentes a
eles desapareceram em tempos prolongados de tratamento, e que outros sinais
surgiram.
A análise por LC-MS destes metabólitos sugere a possibilidade de
formação de cinco diferentes compostos, já reportados na literatura, mas não nas
condições utilizadas no presente trabalho (solução não tamponada e com o pH
regulado a 9 com solução de KOH).
Estes compostos seriam produtos de reação de defluoração,
descarboxilação, hidroxilação e rompimento da cadeia piperazínica, porém, os
resultados demonstraram não haver ataque à cadeia quinolônica, responsável pela
atividade biológica da CIP.
Considerando-se a fotossensibilidade da CIP, e de fluoroquinolonas em
geral, as condições reacionais influenciam grandemente a reatividade. Assim,
diferentes condições de pH, uso de diferentes soluções-tampão (ou a sua
ausência), variadas concentrações de oxigênio, dentre outros parâmetros, devem
propiciar diferentes mecanismos reacionais e, conseqüentemente, diferentes
metabólitos. Desta forma, a predição do comportamento fotoquímico de
fluoroquinolonas em sistemas complexos, como efluentes e águas superficiais,
através de soluções preparadas em laboratório, fica bastante prejudicada.
Considerando-se a natureza estrutural dos metabólitos formados durante a
fotodegradação de CIP e as rotas de sua formação, esta investigação serve como
uma abordagem primária, sendo necessários novos e mais detalhados estudos.
A degradação fotoinduzida de CIP no efluente hospitalar do PA-HUSM
demonstrou ser muito mais lenta do que aquela obtida em solução aquosa (t
1/2
=
57
2,5 h). Porém, as diferenças de configuração dos sistemas utilizados
impossibilitaram qualquer tipo de comparação.
De qualquer maneira, quando comparado aos outros processos utilizados
na degradação de CIP no efluente, a degradação fotoinduzida foi igualmente
menos efetiva em termos de degradação do fármaco-alvo: fotocatálise
heterogênea , t
1/2
= 20 min; ozonização, t
1/2
= 9 min; peroxônio, t
1/2
= 15 min.
Os melhores resultados obtidos para a ozonização na degradação de CIP
demonstraram ser conseqüência da maior reatividade do fármaco com ozônio do
que com espécies radicalares formadas durante os processos.
Porém, no que diz respeito à redução de matéria orgânica (DQO e
absorbância integrada), os processos com maior capacidade de geração de
radicais hidroxil (peroxônio e de fotocatálise heterogênea) foram mais efetivos
do que aqueles com menor capacidade (fotoinduzido e ozonização).
A similaridade entre os cromatogramas dos diferentes processos foi um
indicativo de que os produtos formados são bastante similares.
58
6. Sugestões para trabalhos futuros
• Estudo das CAMs de CIP no lodo da fossa séptica e no corpo receptor do
efluente do PA-HUSM em pontos mais avançados (água e sedimento) a
fim de avaliar os riscos ambientais da CIP ;
• Estudo de correlação da toxicidade com a concentração de CIP no efluente
e no curso d’água receptor;
• Avaliação da pronta biodegradabilidade de amostras de CIP irradiadas em
tempos mais longos dos que os estudados no presente trabalho, além de
estudos de biodegradabilidade utilizando densidades bacterianas mais
elevadas;
• Realização da mesma avaliação citada acima, porém, com diferentes
PAOs;
• Avaliação da toxicidade de subprodutos de degradação da CIP através de
PAOs.
59
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