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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
DEPARTAMENTO DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
ALTERAÇÕES NOS NÍVEIS DE COLESTEROL MEMBRANAR
INTERFEREM NA EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS ADESÃO EM
CÉLULAS MUSCULARES
Tese de doutorado submetida à
Pós-Graduação em Ciências Morfológicas – ICB - UFRJ
Aluna: Eliane do Carmo Ribeiro Martins
Orientadora: Cláudia dos Santos Mermelstein
Co-orientador: Manoel Luis Costa
Julho
2008
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ii
Alterações nos níveis de colesterol membranar interferem
na expressão de moléculas de adesão em células musculares
ELIANE DO CARMO RIBEIRO MARTINS
Tese submetida ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio
de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Doutor em
Ciências.
Aprovada em ____de __________de 2008 pela Banca Examinadora:
avaliador interno
Prof. Dr. João Ricardo L. Menezes – ICB / UFRJ
avaliadora externa
Profa. Dra. Helene Santos Barbosa – IOC / FIOCRUZ
avaliadora externa
Profa. Dra. Tecia Maria U. Carvalho – IBCCF / UFRJ
revisora e avaliadora interna
Profa. Dra. Morgana Teixeira Lima Castelo Branco – ICB / UFRJ
avaliador externo
Prof. Dr. Paulo de Assis Melo – ICB / UFRJ
orientadora
Profa. Dra. Claudia dos Santos Mermelstein – ICB / UFRJ
co-orientador
Prof. Dr. Manoel Luis Costa – ICB / UFRJ
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iii
Ficha Catalográfica
MARTINS, Eliane do Carmo Ribeiro
Alterações nos níveis de colesterol membranar interferem
na expressão de moléculas de adesão em células musculares) /
Eliane do Carmo Ribeiro Martins. Rio de Janeiro, UFRJ, Pós
Graduação em Ciências Morfológicas, 2008.
91pp, xiii
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, PCM,
2008.
1. Adesões Celulares. 2. Colesterol. 3. Micro-domínios. 4.
Miogênese. 5. Imunofluorescência – Tese. I. Tese (Doutorado) –
Pós Graduação em Ciências Morfológicas. II. Título
iv
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Diferenciação Muscular e Citoesqueleto
do Departamento de Histologia e Embriologia da UFRJ, sob orientação da Profª. Drª. Cláudia dos
Santos Mermelstein e co-orientação do Prof. Dr. Manoel Luís Costa e na vigência de auxílios
concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ),
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programas de Núcleo
de Excelência (PRONEX) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ).
v
"O verdadeiro lugar de nascimento é aquele em que lançamos pela
primeira vez um olhar inteligente sobre nós mesmos"
Marguerite Yourcenar
vi
Agradecimentos
Agradeço a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste estudo:
Meus pais Antonio e Maria Candida;
Meu marido Marcelo;
Meus orientadores Cláudia e Manoel;
Minha coleguinha divertida de bancada Carol;
Minha companheira nas primeiras horas do dia Ju;
Minha colega que está longe Débora;
Minha ex-colega querida Adriana;
Meus ex-estagiários preferidos Nathalia e Joseph.
vii
Sumário
Página
I. INTRODUÇÃO...........................................................................1
1.1 Músculo...................................................................................................................1
1.1.1 Músculo estriado esquelético................................................................................1
1.1.2 Miogênese.............................................................................................................4
1.2 Citoesqueleto...........................................................................................................6
1.2.1 Microfilamentos e microtúbulos...........................................................................7
1.2.2 Filamentos intermediários.....................................................................................8
1.3 Membrana plasmática..............................................................................................9
1.3.1 Micro-domínios de membrana............................................................................12
1.3.2 Métodos de estudo dos micro-domínios.............................................................13
1.3.3 Cavéolas..............................................................................................................15
1.3.4 Caveolinas...........................................................................................................16
1.4 Adesão celular........................................................................................................18
1.4.1 Adesão célula-célula...........................................................................................19
1.4.2 Adesão célula-matriz extracelular.......................................................................21
1.4.2.1 Contato focal...................................................................................................22
1.4.2.2 Adesão fibrilar.................................................................................................26
1.4.2.3 Complexo de proteínas associadas a distrofina...............................................26
1.5 Micro-domínios de membrana e adesão celular....................................................29
II. OBJETIVOS..............................................................................31
2.1 Objetivo geral.....................................................................................................31
2.2 Objetivos específicos..........................................................................................31
III. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................32
3.1 Cultura de células primárias de músculo esquelético e de fibroblastos.................32
3.2 Tratamento das culturas primárias com metil-beta-ciclodextrina (MCD).............34
3.3 Imunofluorescência de células em cultura.............................................................34
3.4 Aquisição e processamento de imagens.................................................................37
3.5 Preparação das frações enriquecidas em cavéolas.................................................37
3.5.1 Obtenção da amostra de músculo esquelético de embrião de galinha...............37
3.5.2
Dosagem de proteínas totais..............................................................................37
3.5.3 Preparação das soluções de sacarose..................................................................38
3.5.4 Ultra-centrifugação............................................................................................38
3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida....................................................................39
3.7 Revelação imunológica de transferência eletroforética de proteínas em
gel desnaturante de poliacrilamida para folha de PVDF.............................................40
3.8 Desligamento de anticorpo “STRIP” em “immunoblotting”.................................41
viii
IV. RESULTADOS .........................................................................42
V. DISCUSSÃO..............................................................................61
VI. CONCLUSÕES...............................................................................70
VII. BIBLIOGRAFIA........................................................................72
VIII. ANEXOS..................................................................................85
ix
Lista de Ilustrações
Página
Figura 1- Esquema de um sarcômero............................................................................3
Figura 2- Etapas da miogênese.....................................................................................4
Figura 3- Modelo “mosaico-fluido” da membrana plasmática...................................10
Figura 4- Composição dos micro-domínios................................................................12
Figura 5
- Organização da cavéola...............................................................................15
Figura 6- Adesão célula-célula por caderina...............................................................19
Figura 7
- Estrutura do Contato Focal..........................................................................23
Figura 8- Adesão fibrilar e contato focal....................................................................27
Figura 9
- Imunomarcação para desmina em cultura de células de músculo
esquelético de embrião de galinha com 48 horas de diferenciação..............................43
Figura 10
- Imunomarcação para caveolina-3 em cultura de células de
músculo esquelético de embrião de galinha com 48 horas de diferenciação...............43
Figura 11
- Imunomarcação para caderina em cultura de células de
músculo esquelético de embrião de galinha com 48 horas de diferenciação...............45
Figura 12- Imunomarcação para FAK em cultura de células de músculo
esquelético de embrião de galinha com 48 horas de diferenciação..............................45
Figura 13- Imunomarcação para paxilina em cultura de células de
músculo esquelético de embrião de galinha com 48 horas de diferenciação...............46
Figura 14- Microscopia óptica de contraste de fase de cultura de células de
músculo esquelético controle e tratadas com metil-beta-ciclodextrina........................46
Figura 15- Imunomarcação para caveolina-3 em miotubos controle com 48
horas e após 24 horas de tratamento com MCD 2mM.................................................48
Figura 16- Imunomarcação para M-caderina em miotubos controle com 48
horas e após 24 horas de tratamento com MCD 2mM.................................................49
Figura 17- Imunomarcação para paxilina em miotubos controle com 72 horas e
após 48 horas de tratamento com MCD.......................................................................50
Figura 18- Vinculina e actina-F em miotubos controle e tratados com MCD............51
x
Figura 19- Imunomarcação para vinculina e actina-F em fibroblastos controle com
72 horas e após 48 horas de tratamento com MCD 2mM analisados por
microscopia confocal...................................................................................................52
Figura 20
- Imunomarcação de vinculina e actina-F em mioblastos controle com
24 horas e após 1-2 horas de tratamento com MCD 4mM........................................53
Figura 21
- Actina-F em mioblastos e fibroblastos controle com 24 horas e
após 3 horas de tratamento com 4mM MCD.............................................................54
Figura 22- Paxilina em mioblastos controle com 24 horas e após 1-2 horas
de tratamento com 4mM de MCD.............................................................................55
Figura 23- Coloração por azul de Coomassie e “immunoblotting” das amostras
de cultura controle e tratada com MCD 2mM............................................................57
Figura 24- “Immunoblotting” das amostras de cultura de fibroblastos
controle e tratada com MCD 2mM.............................................................................59
Figura 25- “Immunoblotting” das amostras de cultura de mioblastos controle e
tratada com 4 mM de MCD........................................................................................59
Figura 26- “Immunoblotting” das amostras de cultura de fibroblastos
controle e tratada com 4mM de MCD........................................................................60
Figura 27- “Immunoblotting” das frações caveolares e não-caveolares.....................60
Tabela 1- Comparação entre as composições proteicas dos tipos de adesão
focal e fibrilar .............................................................................................................22
Tabela 2- Anticorpos e sondas...................................................................................35
xi
Abreviações
ATP- Adenosina trifosfato
BSA- Albumina de soro bovino
CCD- “Charged coupled device” – câmera digital
DABCO – 1,4-diazabiciclo-2-(2.2.2) octano
DAPI- 4,6-diamidino-2-fenilindole
DNA-
Ácido desoxirribonucléico
ECL- “Excelent chemiluminescent labeling” – marcador quimioluminescente
FITC
- Isotiocianato de fluoresceína
GPI- Glicoinositilfosfato
GTP
- Guanosina trifosfato
HEPES- (N-[2-hidroxietil] piperazina-N’-[2-ácido etanossulfônico])
MBS
- Tampão salino com MES
MES- Ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico
PBS
- Tampão fosfato salino
PPD- Para-fenilenodiamina
PVDF- Membrana difluoridro polivinilideno hidrofóbica
SDS- Dodecil sulfato de sódio
TBS-Tween- Tampão tris salino com monolaurato de polioxietilenosorbitano
TCA- Ácido tricloro acético
TRIS- Tris-hidroximetil-aminometano
TRITC- Isotiocianato de tetraetilrodamina
TRITON X-100- t-octilfenoxipolietoxietanol
xii
Resumo
Micro-domínios ricos em esfingolipídeos são considerados como resultado da organização de
esfingolipídeos e colesterol da membrana plasmática em uma fase líquida ordenada, enriquecidos
em proteínas ancoradas a glicosilfosfatidilinositol. Esses domínios, resistentes a extração por
Triton X-100 gelado, podem ser isolados em complexos de membrana através de gradientes de
densidade descontínuos. A formação da fibra muscular esquelética é considerada iniciada a partir
da saída do ciclo celular de precursores mononucleados comprometidos. Em seguida, esses
mioblastos se alongam enquanto se alinham uns com os outros, guiados pelo reconhecimento
entre as suas membranas. Essa etapa é seguida pela adesão celular e a formação de longos,
estriados, multinucleados miotubos. Em células musculares o tratamento com metil-β-
ciclodestrina (MCD), um agente específico que se liga a colesterol, aumenta a fusão de
mioblastos e induz a formação de grandes miotubos multinucleados. O número e a distribuição
das moléculas lipídicas, em particular o colesterol, na membrana plasmática, provavelmente tem
um papel importante na regulação de vários processos fisiológicos nas células. Nesse estudo nós
usamos cultura de células musculares esqueléticas de galinha para examinar a distribuição e a
expressão de paxilina e vinculina (proteínas relacionadas com processos de adesão celular) após o
tratamento com MCD 2mM ou 4mM. A análise imunocitoquímica revelou uma reorganização
espacial de paxilina na membrana, e o remodelamento de vinculina e do citoesqueleto de actina,
em miotubos, em ambos os casos. Para determinar qual tratamento (2mM ou 4mM MCD) estava
relacionado com o aumento da adesão celular, realizamos a análise por “immunoblotting”. Os
resultados indicaram diminuição nos níveis de paxilina e vinculina depois de 2mM MCD, e
aumento após 4mM MCD. Para nós, esses resultados indicam que 4mM MCD promove uma
aceleração das etapas iniciais de diferenciação muscular esquelética.
xiii
Abstract
Sphingolipids microdomains are thought to result from the organization of plasma membrane
sphingolipids and cholesterol into a liquid ordered phase, wherein the
glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins are enriched. These domains, resistant to
extraction by cold Triton X-100, can be isolated as buoyant membrane complexes in
discontinuous density gradients. The formation of a skeletal muscle fiber is thought to begin with
the withdrawal of committed mononucleated precursors from the cell cycle. Then these
myoblasts elongate while aligning with each other, guided by recognition between their
membranes. This step is followed by cell adhesion and the formation of long striated
multinucleated myotubes. In muscle cells the treatment with methyl-β-cyclodextrin (MCD), a
specific cholesterol-binding agent, enhances myoblast fusion and induces the formation of large
multinucleated myotubes. The number and distribution of lipid molecules, cholesterol in
particular, in the plasma membrane, may play a key role in regulating several physiological
processes in cells. In this study, we used primary cultured chick skeletal muscle cells to examine
distribution and expression of paxillin and vinculin (proteins related to cellular adhesion
processes) after treatment with MCD 2mM or 4mM. Immunocytochemical analysis revealed a
spatial reorganization of paxillin in the membrane, and a remodeling of vinculin and actin
cytoskeleton in myotubes in both cases. To determine which treatment (2mM or 4mM MCD) was
associated to enhance cellular adhesion, we performed immunoblot analysis. The results
indicated decrease in paxillin and vinculin levels after 2mM MCD, and increase after 4mM
MCD. Thus, these results indicate that 4mM MCD promotes an acceleration of early steps of
skeletal muscle differentiation
1
I - Introdução
1.1 - Músculo
Os tecidos musculares dos vertebrados podem ser subdivididos, com base em diferenças
funcionais e morfológicas, em três tipos: músculo liso, músculo estriado cardíaco e músculo
estriado esquelético. Os três tecidos musculares citados são constituídos por células contráteis
(Huddart, 1975).
O músculo liso é formado por células fusiformes e mononucleadas, que não possuem
estriações. A contração destas células é lenta e involuntária. O tecido muscular liso está presente
nos vasos sanguíneos e em órgãos ocos ou tubulares, como o intestino.
O músculo estriado cardíaco é formado por células alongadas que são geralmente
mononucleadas ou binucleadas, e que se unem às células vizinhas através de junções celulares.
Estas células, os cardiomiócitos, apresentam estriações. A contração destas células é rápida,
rítmica e involuntária.
O músculo estriado esquelético é formado por feixes de células cilíndricas longas e
multinucleadas, que apresentam estriações transversais. Estas células têm contração rápida e
estão sujeitas ao controle voluntário. O tecido muscular esquelético recebe este nome porque suas
contrações geralmente movem alguma parte do esqueleto.
1.1.1- Músculo estriado esquelético
O músculo estriado esquelético é formado por feixes de células longas e cilíndricas
conferindo um diâmetro que varia de 10 a 500µm, chamadas de fibras musculares esqueléticas ou
miotubos. Por serem muito peculiares e diferenciados, os componentes das células musculares
esqueléticas recebem nomes especiais (Huddart, 1975). A membrana que envolve estas células é
2
denominada de sarcolema. O citoplasma é chamado de sarcoplasma, e neste estão dispersas as
miofibrilas (os elementos contráteis da célula). Por fim, o retículo endoplasmático é chamado de
retículo sarcoplasmático. Os vários núcleos dos miotubos se encontram alinhados, próximos ao
sarcolema.
No interior do sarcoplasma, preenchendo quase completamente o seu interior, se encontram
as miofibrilas, que são os elementos contráteis dessas células. Miofibrilas são estruturas
cilíndricas, com cerca de 1 a 2µm de diâmetro, que correm longitudinalmente à fibra muscular e
são geralmente tão longas quanto o próprio miotubo (Huddart, 1975).
Ao microscópio óptico, as miofibrilas aparecem como estriações transversais, pela
alternância de faixas claras e escuras. As faixas claras recebem o nome de bandas I por serem
isotrópicas ao microscópio de polarização, e as faixas escuras recebem o nome de bandas A por
serem anisotrópicas. No centro de cada banda I aparece uma linha transversal escura, denominada
de linha Z ou disco Z.
O estudo das miofibrilas ao microscópio eletrônico revela que são formadas por unidades
que se repetem: os sarcômeros (Figura 1). O sarcômero é a unidade morfofuncional da
miofibrila. Cada sarcômero é limitado por duas linhas Z e mede cerca de 2 a 3µm de
comprimento quando relaxado. Logo, o sarcômero é formado por uma banda A e duas metades
de bandas I que são cortadas ao meio pela linha Z, e entre as linhas Z existe ainda a linha M
(Huxley & Niedergerke, 1954).,
3
Figura 1- Esquema de um sarcômero.
Os principais componentes dos sarcômeros são os filamentos grossos (15nm de diâmetro e
1,5µm de comprimento), constituídos de miosina, os filamentos finos (6nm de diâmetro e 1µm de
comprimento), constituídos de actina, tropomiosina e as troponinas. Estes filamentos estão
organizados num padrão longitudinal e regular na direção do movimento do sarcômero. Os
filamentos de miosina ocupam a região central do sarcômero, a banda A (Huxley & Nieder,
1954). As linhas Z participam da transmissão da tensão mecânica para os outros sarcômeros
interligados e são constituídas por desmina e alfa-actinina, essa última relacionada com a
organização dos filamentos de actina (Ohtsuka et al., 1997; Sorimachi et al., 1997; Miller, 2003).
A linha M é composta por miomesina e proteína C e sua função é interligar os filamentos de
actina e miosina. As proteínas titina e nebulina também auxiliam nessa associação (Gregorio et
al., 1999).
As miofibrilas e os sarcômeros das células musculares são descritos como adaptações do
citoesqueleto que existem em todos os tipos de células. Dessa forma, as proteínas que constituem
o sarcômero das células musculares esqueléticas são variantes de proteínas ubiquitárias. Nas
4
células musculares esqueléticas os sarcômeros se associam com o citoesqueleto. A linha Z ancora
proteínas do citoesqueleto, como, desmina, nebulina e titina (Schiaffino & Reggiani, 1996).
1.1.2- Miogênese
Durante o desenvolvimento do embrião, os precursores das células musculares esqueléticas
estão contidos no mesoderma. Depois de uma rápida proliferação destas células (os pré-
mioblastos), emergem as células musculares primitivas, os mioblastos (Figura 2).
Figura 2- Etapas da miogênese.
Os mioblastos se alongam e iniciam a expressão das proteínas miofibrilares, e passam a ser
chamados de miócitos. Esses se alinham em fileiras e se fundem para formar miotubos estriados e
multinucleados (Vrbová, 1978). A diferenciação destas células continua e os núcleos localizados
na região central dos miotubos migram para a periferia da fibra muscular, a região central é
preenchida em grande parte por sarcômeros. A diferença entre pré-mioblastos e mioblastos é que
os últimos possuem a habilidade de sintetizar e organizar as proteínas estruturais musculares
5
(miosina, actina, alfa-actinina, entre outras) em miofibrilas, e contém receptores para acetilcolina.
Além dessas propriedades os mioblastos possuem outras duas características: em determinado
momento param irreversivelmente de se replicar e, como segunda característica, fundem-se
(Vrbová, 1978). Nas culturas de células musculares de embriões de galinha, os pré-mioblastos
saem do ciclo celular, se tornam não proliferativos, em poucas horas e após 24 horas em cultura
já é possível observar miócitos (células alongadas) e após 48 horas em cultura já podem ser
visualizados os miotubos (célula muscular madura).
Mioblastos são descendentes das células mononucleares, chamadas de pré-mioblastos ou
mioblastos comprometidos, que já expressam algumas proteínas da linhagem muscular estriada,
como MyoD e myf5 (Yun & Wold, 1996). Os pré-mioblastos possuem um número limitado de
opções: podem se dividir para produzir mais pré-mioblastos ou dar origem aos mioblastos.
Mioblastos se dividem certo número de vezes antes de se fundirem em miotubos, e esse número
de divisões é pré-determinado. Quando mioblastos completam a sua última mitose, começam a se
alongar e a sintetizar várias proteínas específicas de músculo estriado. O sinal para a síntese
dessas proteínas é a saída do ciclo mitótico. A primeira proteína muscular a ser sintetizada no
mioblasto é a desmina, seguida por alfa-actinina e titina, e só depois miosina (neste momento a
célula já é considerada um miócito). Essa seqüência é seguida por células musculares em cultura,
por somitos e ainda por células não-musculares infectadas com um vírus que contenha o gene
diferenciador de músculo, o MyoD1 (Choi et al., 1990).
Portanto, a formação do miotubo multinucleado é um processo que envolve a proliferação,
a diferenciação, o alongamento, o alinhamento, a adesão e a fusão de células musculares
mononucleadas (miócitos).
A estabilização da forma, a interação com outras células e com a matriz extracelular de
células musculares é controlada pela associação entre as proteínas do citoesqueleto e as proteínas
6
que conectam o citoesqueleto com a membrana plasmática. A actina é um exemplo de proteína
relacionada com a manutenção do citoesqueleto, motilidade e, ainda, contração muscular
(Fujiwara & Pallard, 1976).
Para esclarecer os eventos que ocorrem durante a formação de miotubos multinucleados,
pesquisadores vêm buscando meios para inibir ou estimular o evento de formação de miotubos.
Estudos realizados em nosso laboratório mostram que miotubos formados por mioblastos tratados
com metil-beta-ciclodextrina (substância que se liga ao colesterol e o retira da membrana
plasmática) apresentam diâmetro maior, se comparados com miotubos controle, indicando um
aumento na fusão dos mioblastos (Mermelstein et al., 2005). Além disso, a proteína Wnt-3a
(integrante da família de proteínas Wnt relacionadas com a ativação da miogênese) quando
aumentada no meio de cultura induz a miogênese enquanto a Wnt-5a inibe, já que, ocorre a
formação de miotubos mais finos que os miotubos controle (Portilho et al., 2007). Os resultados
desses estudos com inibidores ou estimulantes levam a conclusão que proteínas, lipídeos (como o
colesterol) e citoesqueleto estão envolvidos na fusão de mioblastos.
1.2- Citoesqueleto
O citoplasma das células eucarióticas é espacialmente organizado por uma complexa rede
de filamentos protéicos chamada de citoesqueleto. Essa estrutura é altamente dinâmica e se
reorganiza continuamente, à medida que a célula muda de forma, se divide e responde ao seu
meio ambiente. É responsável pela distribuição das células pelo substrato, pela contração
muscular e pelas inúmeras mudanças de forma que ocorrem nas células de um embrião de
vertebrado em desenvolvimento. Também fornece a maquinaria necessária aos movimentos
intracelulares, como o transporte de vesículas e outras organelas e a segregação dos cromossomos
7
na mitose. Além de manter a compartimentalização das funções celulares de forma altamente
organizada, participa das vias de comunicação entre as células e destas com o meio extracelular
(Voet & Voet, 1990).
O citoesqueleto é basicamente formado por três tipos de filamentos protéicos:
microfilamentos (4 a 6nm), microtúbulos (22 a 25nm) e filamentos intermediários (7 a 11nm).
Cada um desses filamentos é formado por um tipo diferente de subunidade protéica: os
microfilamentos são formados por unidades de actina G (sua forma filamentosa é denominada
actina F), os microtúbulos formados por treze protofilamentos compostos de tubulina (α e β) e os
filamentos intermediários por uma família de proteínas fibrosas relacionadas com o tipo celular
(Mermelstein et al., 2000; Herrmann et al., 2000; Amos & Schlieper, 2005; Revenu et al., 2005).
Os filamentos intermediários, por serem constituídos por unidades fibrosas, são mais estáveis que
a maioria dos polímeros de actina e tubulina (Lazarides, 1980).
1.2.1- Microfilamentos e microtúbulos
Os microfilamentos e os microtúbulos são formados por subunidades protéicas globulares
que podem se associar e dissociar rapidamente, no interior da célula. O processo de
polimerização e despolimerização dos microfilamentos e dos microtúbulos é
regulado,respectivamente, por ATP e GTP, e ainda, por íons bivalentes de cálcio e magnésio,
temperatura e proteínas acessórias (Fujiwara & Pallard, 1976).
A actina como monômero globular é chamada de actina-G e tem peso molecular de
aproximadamente 43kDa. Já a sua forma polimérica filamentosa é chamada de actina-F e é
constituída por uma cadeia linear de subunidades de actina-G. Existem duas isoformas para
actina nos músculos estriados, a esquelética e a cardíaca, que são diferentes de isoformas de
8
células de músculo liso e não musculares, sendo cada uma destas variantes de actina codificada
por um gene diferente (Schiaffino & Reggiani, 1996). Os microtúbulos estruturalmente são
polímeros de subunidades α e β-tubulinas (55kDa cada) que determinam diferentes isoformas
dependendo do tipo celular.
Os filamentos protéicos de actina e tubulina se ligam a uma grande variedade de proteínas
acessórias que permitem aos mesmos participarem de diferentes funções, em locais distintos da
célula. Algumas dessas proteínas acessórias ligam os filamentos de um mesmo tipo entre si, a
outro tipo de filamento e, ainda, a componentes celulares. Outras controlam quando e onde os
microfilamentos e microtúbulos devem se estabelecer na célula, através da regulação de sua
extensão e razão de polimerização. Existem também proteínas motoras, que hidrolisam ATP,
produzindo força e movimento direcionado ao longo desses filamentos (Mermelstein et al., 2000;
Alberts et al., 2002; Voet & Voet, 1990).
1.2.2- Filamentos intermediários
Os filamentos intermediários estão presentes na maioria das células eucarióticas, e seus
constituintes protéicos possuem distribuição celular específica. Como proteína de filamentos
intermediários pode-se citar a desmina (53kDa) que está presente em células de músculo estriado,
compondo a região de linha Z e junção miotendinosa. No músculo maduro, os filamentos de
desmina interligam linhas Z, possivelmente através da interação com nebulina, e ainda
miofibrilas, núcleo, mitocôndria e microtúbulos. Estudos mostram que a desmina liga o
sarcolema ao envelope nuclear, através da ligação à anquirina (Capetanaki et al., 1997). A
proteína vimentina é expressa em células mesenquimais, em células da glia (no sistema nervoso
em astrócitos imaturos), cancerosas e crescidas em cultura; os neurofilamentos presentes nos
9
neurônios; as queratinas que são um grupo de proteínas presentes nas células epiteliais; a
periferina presente em células do sistema nervoso periférico; a nestina presente em células
musculares, neurais e células-tronco; a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) presente em células
gliais (astrócitos) e as laminas nucleares que são três (A, B e C) associadas à membrana interna
do núcleo das células eucarióticas (Toivola et al., 2005).
Além da desmina, os outros filamentos intermediários característicos de músculo estriado
são: vimentina, nestina, sinemina e paranemina. A vimentina é o filamento intermediário
predominante durante o desenvolvimento do músculo estriado, sua expressão é significativa em
mioblastos replicantes e ausente em músculo adulto. A nestina é expressa nas junções
miotendinosa e neuromuscular, durante o desenvolvimento e regeneração muscular e pouco
expressa no músculo maduro. Sinemina e paranemina são filamentos intermediários associados à
desmina e vimentina, mas não estão funcionalmente bem caracterizados. Identificam-se, ainda,
dois novos filamentos intermediários: desmuslina e sincoilina que se associam à α-distrobrevina,
componente do complexo de adesão associado à distrofina, e que colocalizam com desmina nas
linhas Z (Bellin et al., 2001; Mizuno et al., 2001).
1.3- Membrana plasmática
A membrana plasmática representa a interface que a célula possui com o seu meio ambiente
e com células vizinhas. É o sitio de transporte de íons e nutrientes, recepção de moléculas
sinalizadoras, e de contato com as células adjacentes e a matriz extracelular. Para desempenhar
essas funções, a membrana é sustentada e organizada pelo citoesqueleto de actina subjacente.
Há vários anos, os cientistas vêem a bicamada lipídica como um mosaico fluido bidimensional
(Figura 3) onde proteínas e lipídios difundem livremente (Singer & Nicolson, 1972). Entretanto,
10
mais recentemente, a membrana plasmática passou a ser considerada um mosaico de diferentes
compartimentos ou domínios que são mantidos pelo citoesqueleto (Ritchie et al., 2003).
Figura 3- Modelo “mosaico fluido” da membrana plasmática (Adames & Cooper,
2000).
Os principais componentes da membrana plasmática são proteínas, glicídeos e lipídeos, e
suas combinações, conferindo uma espessura de 8 a 10nm (Weigandt et al.,1982; Unwin &
Hendersen, 1984). As proteínas presentes na membrana plasmática podem ser integrais que
atravessam toda a membrana, ou, periféricas voltadas para o citoplasma ou para a matriz
extracelular. E, ainda, podem estar associadas à glicídeos, na face extracelular, sendo chamadas
11
de glicoproteínas. As funções das proteínas de membrana são muitas, como, estrutural ao
conferirem sustentação à célula, transporte de íons, e recepção e transdução de sinais.
A membrana plasmática é composta por uma bicamada fosfolipídica. Os fosfolipídeos são
constituídos de uma cabeça hidrofílica contendo fosfato, glicerol e resíduo que pode variar de
acordo com o fosfolipídeo, e, duas caudas hidrofóbicas de ácidos graxos. Uma das principais
funções da bicamada de fosfolipídeos é a permeabilidade seletiva, essa também permite o
isolamento entre o meio intracelular e o extracelular. Dessa forma, a bicamada fosfolipídica da
membrana plasmática contribui para a integridade celular, influenciando no funcionamento,
crescimento e multiplicação celular (Alberts et al., 2002).
Glicolipídeos, encontrados em todas as membranas plasmáticas, são moléculas de lipídeos
associadas à glicídeos, encontradas na face extracelular da bicamada fosfolipídica. Como função
os glicolipídeos desempenham papel nas interações da célula com o microambiente circundante.
O colesterol, outro lipídeo constituinte da membrana plasmática, é um dos responsáveis pela
regulação da fluidez e formação de micro-domínios lipídicos. A presença de colesterol, assim
como de estruturas de adesão e comunicação celular diminui a fluidez na bicamada fosfolipídica
(Alberts et al., 2002). O colesterol tem sido relacionado com o processo de fusão de mioblastos
que ocorre durante a diferenciação muscular. Alguns trabalhos mostram que a diminuição da
quantidade de colesterol na membrana é necessária para fusão de mioblastos (Hirayama et al.,
2001; Nakanishi, 2001; Sekiya et al., 1984). No entanto, Cornell e colaboradores (1980) mostram
que o suprimento local e contínuo de colesterol é necessário para formação ou manutenção da
grande agregação celular que ocorre durante a fusão de mioblastos.
12
1.3.1- Micro-domínios de membrana
Atualmente, evidencia-se a presença de micro-domínios com pouca viscosidade e
organizados na membrana plasmática, também denominados “rafts” (balsas) lipídicos (Figura 4).
Os micro-domínios lipídicos têm uma organização preferencial de glicoesfingolipídeos e
colesterol, e através dos mesmos, proteínas específicas se unem dentro da bicamada.
Figura 4- Composição dos micro-domínios (Alberts et al., 2002).
Como essa região da membrana é mais espessa, as proteínas integrais têm um longo
domínio intermembranar. Esses micro-domínios funcionam como plataformas para várias
funções celulares, como tráfego de vesículas e transdução de sinais (Galbiati et al., 2001a) e,
ainda, outros fenômenos celulares como homeostase de colesterol (Fielding et al., 1997; Ikonen
& Parton, 2000; Schlegel et al., 2000), processos patológicos e proteolíticos (Lee et al., 1998;
Simons et al., 1998) e infecção por microorganismos (Fivaz et al., 1999).
Os micro-domínios musculares se relacionam diretamente com o citoesqueleto através da
proteína desmina (Mermelstein et al., 2007) e são descritos em processos de adesão celular
(Wary et al., 1996, Swaney, et al., 2006).
13
Devido à alta concentração de colesterol e lipídeos com longas caudas saturadas, dentro da
bicamada fosfolipídica, estes domínios estão fortemente empacotados e inseridos em um estado
líquido organizado rico em fosfolipídeos insaturados, onde estes micro-domínios coexistem com
a fase líquida desorganizada que possui menos colesterol (London & Brown, 2000; Simons,
2004). Dessa forma, a membrana plasmática apresenta diferentes fases (organizada e
desorganizada) em seu estado líquido (Ipsen et al., 1987 e1989).
Os micro-domínios lipídicos podem, então, fixar proteínas como: proteínas
transmembranares e ancoradas a GPI. Além dessas proteínas, os micro-domínios podem ser
enriquecidos com caveolina, componente protéico estrutural (integral na membrana) que provoca
diferenças na morfologia e na função do micro-domínio lipídico (Razani et al., 2002). A presença
de caveolina-1, a primeira caveolina descoberta, determina a formação de cavéolas, que são
invaginações dos micro-domínios, localizadas na membrana plasmática.
1.3.2- Métodos de estudo dos micro-domínios
Muitos métodos comprovam a existência de micro-domínios funcionais na membrana
plasmática in vivo (Hooper, 1999; Jacobson & Dietrich, 1999; Simons & Toomre, 2000). A
substância metil-β-ciclodextrina, que momentaneamente retira o colesterol da célula (24 horas
após o tratamento o nível de colesterol já está normalizado), é utilizada por diversos autores para
desorganizar os micro-domínios (Mermelstein et al., 2005). Essa desorganização é possível
porque grande parte da constituição dos micro-domínios é colesterol. A utilização de marcadores
de micro-domínios lipídicos, como GM1, indica que após o tratamento com metil-β-ciclodextrina
ocorre uma desorganização dos lipídeos na membrana celular.
14
Micro-domínios de membrana enriquecidos em componentes de cavéolas e de “rafts”, como
colesterol, glicoesfingolipídeos e proteínas caveolares, podem ser isolados com base em sua
insolubilidade em detergente não-iônico (Triton X-100) a 4
0
C e sua baixa densidade em gradiente
de sacarose. Não existe uma terminologia única para esses micro-domínios de membrana
purificados bioquimicamente. Esses têm sido chamados de DIGs (membranas insolúveis em
detergente ricas em glicolipídeos), DRMs (membranas resistentes a detergentes), TIFFs (frações
flutuantes insolúveis em Triton) e CMDs (micro-domínios de membrana enriquecidos em
caveolina).
Estão sendo desenvolvidos também métodos de isolamento de membranas enriquecidas em
caveolina que não utilizam a solubilização com detergentes. Esses métodos diferem entre si, com
relação às quais proteínas co-fracionam com as caveolinas. Em 1995, Smart e colaboradores
desenvolverm um método de isolamento sem detergente que mostra proteínas associadas à GPI
em frações enriquecidas em cavéolas, entretanto, outro método, baseado na imobilização com
sílica de vesículas caveolares que se desprendem da membrana plasmática, não apresenta
proteínas associadas à GPI em frações enriquecidas em cavéolas (Schnitzer et al., 1995).
Nossos resultados são baseados na utilização de procedimentos já estabelecidos como:
desorganizar micro-domínios (Mermelstein et al., 2005) e isolar frações de membrana
enriquecidas em cavéolas (Volonte et al., 2003) considerando as características dos micro-
domínios caveolares (alta concentração de colesterol, insolubilidade no detergente não-iônico
Triton X-100 a 4
0
C e baixa densidade em gradiente de sacarose).
15
1.3.3- Cavéolas
As cavéolas (Figura 5) estão presentes em vários tipos celulares como: fibroblastos,
adipócitos, células endoteliais, pneumócitos, células epiteliais, e células de músculo liso e
estriado (Smart et al., 1999). Consideradas uma subclasse de micro-domínios lipídicos, as
cavéolas formam domínios invaginados de membrana plasmática com tamanho entre 50 e 100
nm, que foram visualizadas pela primeira vez por Yamada (1955). Ricas em colesterol e
glicoesfingolipídeos, as cavéolas são caracterizadas pela presença da proteína caveolina (Parton,
1996). Outra proteína encontrada em cavéolas é a flotilina-1 (presente em grandes quantidades no
músculo estriado esquelético) e a flotilina-2 (considerada ubiquitária). Essas proteínas são
responsáveis por induzir a formação de vesículas semelhantes à cavéolas em células de insetos
(Volonte et al., 1999). Quando são co-expressas com as caveolinas, formam complexos que
auxiliam a estabilizar as cavéolas (Volonte et al., 1999).
Figura 5- Organização da cavéola (Razani et al., 2002).
As cavéolas, assim como os outros micro-domínios, participam no tráfego de vesículas
(endocitose) e nos processos de transdução de sinais, por atuarem na organização e concentração
16
de lipídeos específicos (colesterol e glicoesfingolipídeos) e de moléculas sinalizadoras
modificadas por lipídeos, dentro das membranas caveolares (Anderson, 1998; Smart et al., 1999).
A função endocítica da cavéola é regulada pela presença balanceada de caveolina-1, colesterol e
glicoesfingolipídeos na membrana plasmática, já que a alteração de qualquer desses fatores
interfere inibindo ou estimulando a endocitose (Deepak et al., 2004). Dessa forma, as funções das
cavéolas parecem ser as mesmas das desempenhadas pelos micro-domínios não caveolares.
Entretanto, segundo Bathori e colaboradores (2004), ao contrário de micro-domínios não
caveolares, nem todos os tipos celulares formam cavéolas.
1.3.4- Caveolinas
A família de genes de caveolina em mamíferos consiste de caveolina-1, -2 e -3. As
caveolinas-1 e -2 são coexpressas e estão presentes em muitos tipos celulares, enquanto a
expressão de caveolina-3 é específica de músculos liso, e estriado cardíaco e estriado esquelético
(Smart et al., 1999).
A proteína caveolina-1 foi a primeira a ser descrita (Glenney, 1992), no entanto
evolutivamente acredita-se que a caveolina- 3 seja a forma mais primitiva por sua similaridade
gênica com a caveolina descrita no (nematodo) Caenorhabditis elegans (Zhaolan, 1997).
Segundo Razani e colaboradores (2002), a similaridade entre as caveolinas-3 e 1 corresponde a
85%. Evolutivamente a proteína precursora é a caveolina-3, seguida pela caveolina-1 e caveolina-
2 (a mais divergente).
As caveolinas apresentam peso molecular que varia entre 21 e 25kDa (Razani et al., 2002).
Segundo Galbiati e colaboradores (2001a), a proteína caveolina-1 possui duas isoformas, a
caveolina-1α (caracterizada por ter sua estrutura completa) e a caveolina-1β (com tamanho menor
17
possui aproximadamente 3kDa). A estrutura da proteína caveolina-1 foi caracterizada por ser
capaz de se associar em filamentos de 50nm de comprimento por 11nm de diâmetro, dados que se
aproximam com a morfologia da estrutura de cobertura filamentosa das cavéolas (Fernandez et
al., 2002). Outra característica da caveolina-1 é a sua capacidade de formar complexos
oligoméricos com aproximadamente 15 monômeros, descoberta através de gradiente de ultra-
centrifugação. Nesse experimento a caveolina-1 forma complexos que variam entre 200 e 40kDa
(Monier et al., 1995 e Sargiacomo et al., 1995). A caveolina-3 também forma oligômeros com
aproximadamente 350kDa, já a caveolina-2 necessita da caveolina-1 para formar esses
complexos oligoméricos (Tang et al., 1996 e Parolini et al., 1999). Como a distribuição dessas
proteínas varia entre os tipos celulares, essas podem apresentar funções específicas distintas nos
diferentes tecidos.
Com relação à proteína caveolina-1, estudos demonstram que atua nas cavéolas
estabilizando-as na membrana plasmática e controlando seu potencial endocítico (Nabi & Le,
2003). A caveolina-1 quando fosforilada é descrita associada com proteínas de adesão como
FAK, paxilina e vinculina (Swaney et al., 2006). A proteína caveolina-3 é expressa durante a
diferenciação de mioblastos esqueléticos em cultura e se localiza na membrana plasmática
muscular (sarcolema), onde forma um complexo com distrofina e se associa a glicoproteinas
(Sotgia et al., 2000). Recentemente, foi descoberto que uma mutação na seqüência do gene da
caveolina-3 humana está relacionada à distrofia muscular pélvica escapular (Galbiati et al.,
2001a). Essas mutações no gene da caveolina-3 são responsáveis pela geração de agregados de
caveolina-3 instáveis, que são submetidos à ubiquitinilação e degradação por proteossomas.
Outro trabalho utiliza um modelo de camundongo sem caveolina-3, através de técnicas de
recombinação para mimetizar a deficiência dessas proteínas (Galbiati et al., 2001b). Esses
camundongos apresentam ausência de caveolina-3 e cavéolas, indicando que a proteína é
18
necessária para formação de cavéolas. Volonte e colaboradores (2003) mostram que a
superexpressão de caveolina-3 induz um fenótipo semelhante ao da distrofia muscular de
Duchenne e células musculares que não expressam caveolina-3 apresentam um aumento na fusão
de mioblastos e formação de músculo distrófico, em grau moderado. Estes resultados do trabalho
de Volonte e colaboradores (2003), confirmam os achados em nosso laboratório que mostram que
a desorganização de micro-domínios, por metil-beta-ciclodextrina, leva ao aumento da fusão de
mioblastos e formação de miotubos mais espessos (Mermelstein et al., 2005). Estudos da
expressão de caveolina-3 durante o desenvolvimento embrionário de galinha demonstram sinais
de presença dessa proteína no quarto dia de desenvolvimento, principalmente na região de tubo
neural e miótomo. Porém esses sinais reduzem para valores quase imperceptíveis no oitavo dia e
a presença exclusiva em membranas de células musculares ocorre apenas a partir do décimo
primeiro dia de desenvolvimento embrionário (Shin et al., 2003). Um estudo recente de nosso
laboratório mostra, através de frações enriquecidas em cavéolas, co-imunoprecipitação,
“immunoblotting” e cultura primária de células de músculo esquelético estriado de embrião de
galinha, que a caveolina-3 e a desmina co-localizam indicando uma associação entre as duas
proteínas (Mermelstein et al., 2007).
1.4- Adesão Celular
As interações adesivas compreendem regiões de contato entre uma célula e sua matriz
extracelular ou entre células adjacentes que regulam a sua morfologia, propriedades de migração,
crescimento, diferenciação e apoptose (Angst et al., 2001; Steinberg et al., 1999).
As principais famílias de proteínas relacionadas às adesões célula-célula e célula-matriz
são, respectivamente, a das caderinas e a das integrinas (Alberts et al., 2002).
19
1.4.1- Adesão Célula-Célula
Em vertebrados, duas classes distintas de moléculas de adesão célula-célula atuam em vias
dependentes ou independentes de Ca
2+
. As moléculas envolvidas na adesão célula-célula em um
mecanismo independente de Ca
2+
são as CAMs (“Cellular Adhesion Molecule”). As caderinas
constituem o grupo de proteínas de adesão celular relacionadas com a adesão célula-célula
dependente de Ca
2+
(Figura 6) e esta atividade é regulada por interações citoplasmáticas entre
caderinas, cateninas e o citoesqueleto de actina (Hazan et al., 1997).
Figura 6- Adesão célula-célula por caderina (Cooper, 2002).
As caderinas possuem domínios extracelulares com resíduos iguais, sendo os membros da
superfamília de caderinas (100-130kDa) divididos em tipo clássico e tipo protocaderina (Suzuki,
1996). Estudos recentes têm mostrado importante papel das caderinas clássicas na adesão celular,
20
morfogênese e outros processos biológicos que ocorrem durante a vida embrionária de
vertebrados.
Uma variedade de tipos celulares que expressa caderinas tem demonstrado capacidade de
promoção de adesão célula-célula de forma específica. A M-caderina é encontrada em células
musculares esqueléticas e está relacionada com a miogênese (adesão e fusão de miócitos) e
também é considerada marcadora de células satélites (células comprometidas com a linhagem
muscular (Zeschnigk et al., 1995 e Wernig et al., 2004). N-caderina é expressa por células
musculares esqueléticas e cardíacas em desenvolvimento ou maduras e parece desempenhar papel
importante na interação entre os miócitos e na miogênese. A N-caderina funciona no nervo como
uma molécula de adesão célula-célula. N-caderina é expressa por fibroblastos de galinha de
cultura primária de células (Knudsen et al., 1995). A α-catenina (105kDa), é fundamental para a
fixação transmembrana de caderinas e mutações desta proteína impedem a adesão, porém alguns
animais mutantes para α-catenina exibem adesão e se especula que caderinas estejam mediando
estas conexões citoplasmáticas com o citoesqueleto envolvendo vinculina. A α-catenina acopla-se
com o citoesqueleto de actina, se liga à β-catenina (94kDa), esta a γ-catenina que se associa a
actina. A α-catenina também se liga a α-actinina e a espectrina, mas o papel destas interações
ainda é desconhecido (Hazan et al., 1997). A interação do complexo caderina/catenina com a
actina não está bem elucidada, já que alguns trabalhos mostram que esta interação se dá via α-
actinina (Knudsen et al., 1995) enquanto outros indicam que a ligação com o citoesqueleto de
actina ocorre via vinculina (Hazan et al., 1997).
21
1.4.2- Adesão Célula-Matriz Extracelular
A matriz extracelular é constituída por uma mescla de polímeros formada por proteínas
multiméricas, sendo que o seu arranjo é resultado da interação com seus próprios componentes e
com outras proteínas celulares. Interações com a proteína transmembrana integrina são
necessárias para a disposição correta de fibronectina e laminina, sendo que esta última proteína,
além das integrinas interage com o α2-distroglicano (Schwarzbauer & Sechler, 1999). Proteínas
de matriz extracelular como fibronectina, laminina e colágeno formam arranjos protéicos
diferenciados de acordo com condições específicas da composição e arquitetura do tecido.
No músculo estriado, a matriz extracelular e o sarcolema fornecem a estabilidade estrutural
necessária para a contração muscular. O aparato contrátil se associa em pontos periódicos ao
sarcolema em um arranjo denominado costâmero, através da associação com a linha Z do
sarcômero, e assim transmite a força da contração muscular. Essa associação é possível devido a
diferentes redes de associação entre proteínas membranares e de citoesqueleto como
integrinas/complexos de adesão focal e complexo distroglicano (Clark et al., 2002).
A maioria dos estudos sobre adesão célula-matriz extracelular é realizado in vitro, em duas
dimensões, e evidenciam dois tipos distintos de adesões, focal e fibrilar, com composições
protéicas distintas. As adesões focais ou contatos focais são estruturas baseadas em integrinas que
transmitem informações de forma bidirecional entre as moléculas extracelulares e o citoplasma
(Yamada & Geiger, 1997). A adesão fibrilar é caracterizada por formar filamentos de
fibronectina na matriz extracelular (Pankov et al., 2000). Cukierman e colaboradores (2001)
mostram que fibroblastos cultivados sobre matriz extracelular com três dimensões (oriunda de
células ou de tecido) não possuem a mesma composição que as adesões clássicas (Tabela 1).
22
MOLÉCULA
ADESÃO
FOCAL
ADESÃO
FIBRILAR
MATRIZ 3D
α5-
integrina - + +
β1-
integrina + + +
β3-
integrina + - -
fibronectina - + +
α- actinina + + +
F- actina + + +
talina + + +
tensina + + +
vinculina + - +
fosfotirosina + - +
FAK + - +
FAK397 + - -
paxilina + - +
paxilina31 + - +
Tabela 1- Comparação entre as composições proteicas dos tipos de adesão focal e fibrilar
(Cukierman et al., 2001).
1.4.2.1- Contato Focal
Este modelo de interação é mediado por proteínas transmembranares chamadas integrinas,
que estabelecem ligação entre a matriz extracelular e o citoesqueleto de actina, se apresentando
como “clusters” que determinam as adesões e os complexos focais (Figura 7), onde se inserem
proteínas associadas e outras moléculas de sinalização (Schoenwaelder & Burridge, 1999). As
integrinas são heterodímeros αβ, sendo que as subunidades α possuem peso entre 120 e 180kDa e
se associam não-covalentemente às subunidades β que compreendem peso entre 90 e 110kDa
(Hynes, 1992). As integrinas funcionam como sensores da matriz extracelular, sendo essenciais
para migração, crescimento e invasão celular. Possuem papel central na organização do
citoesqueleto de actina em sítios de adesão à matriz extracelular.
23
Figura 7- Estrutura do contato focal (Fluck et al., 2002).
As integrinas também regulam vias de sinalização entre componentes da família das
RhoGTPases como Cdc42, Rac e Rho, que podem influenciar e coordenar a dinâmica e estrutura
de processos formados por actina como filopódios, lamelipódios e formação de fibras de estresse
(Martin et al., 2002). As proteínas α-actinina, vinculina e talina são componentes estruturais
importantes envolvidos na estabilidade e formação de adesões focais.
A α-actinina pertence à família das proteínas associadas à actina e possui homologia
estrutural com distrofina, espectrina e fimbrina (Izaguirre et al., 2001). Desempenha importante
papel na regulação de fibras de estresse, sendo que juntamente com vinculina e talina está
estruturalmente relacionada à formação e estabilidade de adesões focais, parecendo ligar
diretamente filamentos de actina aos receptores do tipo integrina. (Greenwood et al., 2000).
Estudos recentes mostram que α -actinina, vinculina e talina são as primeiras três proteínas que
24
seguem o recrutamento da quinase de adesão focal (FAK) e sua localização com agregados de
integrina (Izaguirre et al., 2001).
A FAK (125kDa) se apresenta em grande quantidade nas junções miotendinosas
juntamente com as integrinas e também na linha Z com as integrinas costaméricas. A fosforilação
e subseqüente ativação de FAK ocorrem por estiramento mecânico, dessa forma pode-se dizer
que FAK e integrinas funcionam como um complexo sensorial e de sinalização no músculo
(Clark et al., 2002). Estudos demonstram que, no músculo, a FAK está relacionada com o
controle do ciclo celular de mioblastos em cultura (Disatinick & Rando, 1999) e ainda que a
ativação da FAK é induzida durante a formação de fibras musculares tanto em cultura e quanto
em tecido (Fluck et al., 1999). Katz e colaboradores (2003) mostram através de estudos com a
linhagem de fibroblastos 3T3 que após sua fosforilação a FAK reduz sua localização em adesões
focais e essa regulação negativa pode ser impedida ao se realizarem mutações na região de
adesão da FAK.
Uma das principais proteínas estruturais da face citoplasmática da membrana é a vinculina
(130kDa). Esta é presente em contatos célula-célula e célula-substrato e possui a capacidade de se
ligar diretamente à actina e está associada também à talina e α-actinina in vitro (Burridge &
Chrzanowska-Wodnicka., 1996). Estudos têm demonstrado que, na verdade, a vinculina pode se
associar com diversas proteínas exercendo papéis distintos desde adesão célula-célula como
sinalização na regulação de apoptose (Ziegler, et al., 2006). O papel específico da vinculina na
adesão focal ainda não foi esclarecido mas o aumento de sua expressão reduz a migração celular
enquanto a diminuição de sua expressão promove aumento na motilidade celular. E ainda, em
células modificadas que não expressam vinculina ocorre o aumento da sinalização via FAK e
paxilina (Xu, et al., 1998). A associação entre vinculina, α e β-cateninas e paxilina é
imprescindível em processos de adesão celular (Ziegler, et al., 2006). A vinculina também se
25
relaciona com a mili-calpaína (protease dependente de cálcio envolvida com migração e fusão
celular), já que a redução dessa promove o aumento da expressão da vinculina (Goudenege et al.,
2007). De acordo com experimentos nesse mesmo trabalho a vinculina também se associa
diretamente com a caveolina-3.
A proteína paxilina (68kDa) interage também com a integrina em contatos focais, sendo
também encontrada associada aos microfilamentos de actina, como nas placas densas de músculo
liso e junção miotendinosa em músculo estriado esquelético (Turner et al., 1991). A paxilina é
uma proteína com múltiplos domínios que funciona como um adaptador molecular para o
ancoramento de diversas proteínas à membrana plasmática. A principal função da paxilina é a
integração e a disseminação dos sinais oriundos das integrinas e dos receptores de fatores de
crescimento que regulam a migração celular (Brown & Turner, 2004). Nos contatos focais, a
associação com outras proteínas como a FAK e ainda a sua fosforilação possibilitam a migração
celular (Turner, 2000). Zamir & Geiger (2001) descrevem que a paxilina também pode regular de
forma independente a migração celular, baseada na sua localização na periferia ou na região
central da célula. A caveolina-1 quando fosforilada co-imunoprecipita com paxilina junto com
outras proteínas de adesão (Swaney et al., 2006). No músculo a paxilina e a vinculina atuam
juntas em resposta a contração muscular, sendo recrutadas do citoplasma para reforçar os
contatos focais (Brown & Turner, 2004).
A talina (270kDa) liga diretamente o receptor integrina ao citoesqueleto de actina e possui
sítio de interação com a vinculina. Outro grupo importante de proteínas nas junções adesivas é a
das plectinas (500kDa) que pertencem à família das plaquinas cujos membros são
desmoplaquinas, plectinas, envoplaquina, periplaquina e epiplaquina, dentre outros, num total de
sete proteínas. Muitas plaquinas são expressas em tecidos submetidos, freqüentemente, a estresse
como epitélio e músculo, interligando filamentos do citoesqueleto e ancorando-os em complexos
26
de adesão na membrana, mantendo a integridade do tecido. Outra família de proteínas envolvidas
na ligação de integrinas e proteínas associadas com mecanismos intracelulares de sinalização é a
das parvinas. As isoformas α e β estão localizadas nas adesões focais e possuem importante
função na adesão e motilidade celular (Sepúlveda & Wu, 2006).
1.4.2.2- Adesão fibrilar
Fibronectina (130kDa) é uma proteína multifuncional de matriz extracelular com uma
variedade de sítios de ligação para outras moléculas extracelulares. Estudos mostram que a
fibronectina pode estar envolvida em processos de migração, assim como poderia regular a
diferenciação celular e morfogênese (Schwarzbauer et al., 1999; Miyamoto et al., 1995).
A adesão fibrilar (Figura 8) é caracterizada por formar filamentos de fibronectina na matriz
extracelular (Pankov et al., 2000). A composição protéica predominante desse tipo de adesão é
α
5
β
1
-integrina e tensina, enquanto no contato focal os marcadores são FAK e paxilina. Entretanto
Cukierman e colaboradores (2001) mostram que em matriz tridimensional a paxilina e a α
5-
integrina apresentam co-localização, diferente do que é mostrado em estudos de duas dimensões.
1.4.2.3- Complexo de proteínas associadas à distrofina
A proteína distrofina (427kDa), predominantemente expressa em músculo estriado esquelético,
possui quatro domínios protéicos, sendo que os três primeiros exibem seqüência homóloga a
proteínas citoesqueléticas como α-actinina e espectrina; um domínio amino-terminal de ligação à
actina, um domínio em bastão com estrutura em tripla hélice; um domínio rico em cisteína e um
domínio carboxi-terminal (Rybakova et al., 1996). A deficiência de distrofina resulta em perda da
integridade do complexo associado e da membrana do sarcômero e distrofia muscular severa.
27
Figura 8- Adesão fibrilar e contato focal (Zamir et al., 2001). Abreviações: a- actina; α- α
actinina; F- FAK; fn- fibronectina; m- miosinaII; P- parvina; pa- paxilina; ta- talina; te- tensina;
vi- vinculina; vn- vitronectina; 51- α5β1 integrina; V3- αVβ3 integrina.
Em camundongos mutantes para distrofina, a expressão de vinculina, α-actinina, β-
distroglicano e utrofina se mantêm, indicando que a perda da associação distrofina-actina
costamérica não necessariamente representa instabilidade generalizada da membrana (Rybakova
et al., 2000). Tais resultados indicam que o complexo de adesão via distrofina possui a função de
estabilizar a membrana do sarcômero, mantendo sua integridade durante o estiramento que ocorre
durante as contrações musculares.
A distrofina integra um complexo de adesão no qual se associam distroglicanos,
sarcoglicanos, sarcospan, α-distrobrevinas, sintrofinas, sincoilina, óxido nítrico sintase, laminina-
2 e caveolina-3 (Ehmsen et al., 2002). Os distroglicanos podem ser do tipo α e β, o α-
28
distroglicano é uma proteína de interação extracelular e se associa à laminina α1 e α2 na lâmina
basal e à agrina. Quanto ao β-distroglicano é uma proteína transmembrana que se associa à
distrofina e através desta ao citoesqueleto de actina e tem sido mostrado também que interage
com utrofina, uma proteína homóloga autossômica da distrofina (Durbeej et al., 1998).
A laminina (337kDa) representa uma família de proteínas, sendo todas estas glicoproteínas
extracelulares heterotriméricas que contém cadeias α, β e γ. A laminina α2 faz a ligação do
citoesqueleto à matriz extracelular em células musculares.
Os sarcoglicanos também participam do complexo associado à distrofina, e compreendem
cinco proteínas transmembrana expressas em músculo esquelético como: sarcoglicanos α, β, γ e
ε. Sendo que o sarcoglicano-γ se associa diretamente à distrofina. O sarcospan é uma proteína de
membrana com quatro domínios transmembrana sendo expresso predominantemente em células
de músculo estriado esquelético e cardíaco, enquanto as sintrofinas são expressas em três
isoformas na junção neuromuscular, e apenas as isoformas α1 e β1 presentes no sarcolema
(Ehmsen et al., 2002).
Estudos demonstram que a caveolina-3 é outra proteína que participa do complexo
associado à distrofina. A caveolina-3 interage diretamente com β-distroglicano, co-fraciona com
distrofina e α-sarcoglicano e está super-expressa na distrofia muscular de Duchenne.
Experimentos realizados com camundongos transgênicos que super-expressam caveolina-3
sugerem que ocorre uma competição e consequentemente uma diminuição de distrofina no
sarcolema (Ehmsen et al., 2002). Segundo Galbiati e colaboradores (2001b), mutações na
caveolina-3 estão associadas com distrofia muscular pélvico-escapular do tipo 1C (LGMD-1C).
29
1.5- Micro-domínios de membrana e adesão celular
Estudos mostram que as cavéolas controlam o fluxo de colesterol na superfície celular,
transmitem sinais para o núcleo sobre alterações na membrana plasmática e regulam o tráfego de
sinais oriundos de estímulos extracelulares. Dessa forma as cavéolas influenciam eventos como
ciclo celular, crescimento e adesão (Fielding & Fielding, 2000).
A internalização de cavéolas regula vias de sinalização dependentes de integrina (Del Pozo
& Echarri, 2006). A inibição da endocitose dependente de caveolina-1 impede a regulação
negativa de sinalizações via integrina, como ErK, PI3K e Rac. A proteína filamina, que ancora a
actina permitindo a sua organização cortical na membrana plasmática, também está associada a
caveolina-1 (Halayko & Stelmack, 2005). E nessa actina cortical estão ancoradas integrinas e
adesões focais.
Song e colaboradores (1996) mostram através de experimentos com co-imunoprecipitação
que as proteínas do complexo de proteínas associadas a distrofina co-precipitam com caveolina-3.
Estudos com ultra-centrifugação em gradiente de sacarose e imunoprecipitação mostram que
quando ocorre a fosforilação de caveolina-1 esta passa a se localizar nas frações de membrana
com proteínas de adesão focal. Especificamente, que a fosfo-caveolina-1 imunoprecipita com
fosfo-FAK, vinculina e paxilina (Swaney , et al., 2006).
Ramprasad e colaboradores (2007) descreveram que alterações no colesterol da membrana
plasmática podem alterar a sinalização, adesão e migração celular. Através da retirada de
colesterol de células de sarcoma, e conseqüente desorganização de micro-domínios, observaram
reorganização na distribuição de actina e paxilina (que saem da periferia da célula para o interior
do citoplasma).
30
Apesar de se conhecer bastante sobre as proteínas de adesão, pouco se sabe sobre sua
interação com os micro-domínios membranares (“rafts”). Ao mesmo tempo, o estudo sobre
“rafts” se tornou mais intenso apenas nos últimos anos (no início da década de 90). Proteínas de
adesão têm um papel fundamental na diferenciação muscular, tanto na fase de adesão entre
mioblastos, como na fase de formação de miotubos multinucleados. Dessa forma, torna-se
importante investigar a relação entre diferentes proteínas de adesão celular e micro-domínios
membranares, em células musculares esqueléticas.
31
II- Objetivos
2.1- Objetivo Geral
Estudar a relação entre proteínas de adesão celular e micro-domínios membranares ricos em
colesterol, em células de músculo esquelético, de embrião de galinha, crescidas in vitro.
2.2- Objetivos Específicos
• Avaliar qualitativamente e quantitativamente, por imunofluorescência e
“immunoblotting”, a distribuição de proteínas de adesão celular e do citoesqueleto em
células musculares controle (não tratadas) e tratadas com a substância metil-beta-
ciclodextrina (que retira colesterol da membrana plasmática);
• Analisar a expressão a proteína caveolina-3 e proteínas de adesão celular presentes nas
frações de membrana enriquecidas em cavéolas musculares.
32
III- Materiais e Métodos
3.1- Cultura de células primárias de músculo esquelético e de fibroblastos
Todos os procedimentos foram feitos em fluxo laminar e com material descartável estéril ou
material de vidro ou plástico autoclavados. A máscara foi usada durante todo o procedimento da
cultura.
Foram utilizados por experimento 2 ovos de galinha provenientes da Granja Tolomei (Rio
de Janeiro, RJ). O projeto de pesquisa vinculado a presente tese de doutorado foi aprovado em
2007 pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio de Janeiro e recebeu o número de protocolo DAHEICB004. Os ovos
continham os embriões de galinha com 11 dias de desenvolvimento, e foram abertos sobre uma
placa de petri de 100 mm (Mermelstein et al., 2005). Com o auxílio de pinças de relojoeiro (No.
5), a cabeça e os restos de membranas que envolviam os embriões foram retirados e descartados.
Enquanto o corpo do embrião foi transferido para uma placa de 60 mm de diâmetro.
Na lupa, a origem umeral e as inserções esternal e clavicular do músculo peitoral foram
cortadas, através do uso de duas pinças de relojoeiro (No. 5) e/ou tesoura de micro-cirurgia. As
partes de tecido muscular retiradas foram colocadas em outra placa de 60 mm de diâmetro, com
solução salina sem cálcio e sem magnésio (CMF). Ainda na lupa, foram observados e retirados
possíveis contaminantes (porções ósseas).
Após a retirada dos possíveis contaminantes do tecido muscular, com o objetivo de fazer a
separação mecânica das células do tecido muscular, foram usadas duas facas de micro-cirurgia
para fragmentar o tecido. Em seguida, foi aplicada uma solução de tripsina 2,5% em meio sem
cálcio e magnésio (objetivo de interromper a adesão entre as células) de 1:10. Essas células foram
33
colocadas em estufa de células a 37 ºC com atmosfera de 5% de gás carbônico durante 20
minutos.
Após terem sido retiradas da incubadora, as células foram colocadas em tubo de 15ml e
foram adicionados 4ml de meio 8-1-0,5 (80% de meio essencial mínimo, 10% de soro de cavalo,
0,5% de extrato de embrião, 1% penicilina e estreptomicina e 1% L-glutamina). O soro de cavalo
inibe a ação da tripsina. As células foram então centrifugadas e, posteriormente, tiveram seu
sobrenadante descartado. O “pellet” foi ressuspenso com 6ml de meio 8-1-0,5.
A suspensão de células foi filtrada com filtro de nylon com poros de 50 µm e, então,
aproximadamente 1,5ml da suspensão de células filtradas (densidade inicial de 5x10
5
células) foi
colocado em placa de 35 mm (com lamínulas de vidro ou aclar cobertos com colágeno).
As células plaqueadas foram colocadas em incubadora de células a 37 ºC com atmosfera de
5% de gás carbônico.
As células foram observadas diariamente ao microscópio óptico de contraste de fase e o
meio 8-1-0,5 também foi trocado todos os dias.
A confirmação da grande quantidade de células musculares foi feita com a marcação para a
proteína muscular desmina.
A cultura de fibroblastos foi realizada de forma semelhante, porém o material retirado do
embrião de galinha foi o tecido conjuntivo que recobre o músculo peitoral. Os procedimentos
seguintes foram os mesmos da cultura de músculo esquelético (Portilho et al., 2007). Com o
objetivo de eliminar da cultura possíveis mioblastos, foram feitas cerca de 4 tripsinizações em
dias consecutivos nestas culturas. Uma vez que os miotubos maduros não resistem à ação da
tripsina, foi obtida desta forma uma cultura com aproximadamente 90% de fibroblastos. Dado
obtido através da marcação para desmina.
34
Em seguida as culturas de células foram submetidas ao tratamento com metil-beta-
ciclodextrina (MCD), à fixação para imunofluorescência ou preparação para eletroforese.
3. 2- Tratamento das culturas primárias com metil-beta-ciclodextrina (MCD)
As culturas primárias foram tratadas com 2 mM de MCD (concentração final da substância
diluída em água destilada) adicionados no meio 8-1-0,5 por 30 minutos, após 24 horas de
crescimento. Essa concentração de MCD já havia sido estabelecida por nosso laboratório, que
permitiu a observação de alterações nos micro-domíos em células viáveis (Mermelstein et al.,
2005). Também foi usada com uma concentração maior de MCD 4 mM por 30 minutos. Após o
tratamento esse meio foi trocado e as células cresceram por 1-2, 24 ou 48 horas. Em seguida, as
células foram submetidas à fixação em paraformaldeído ou preparadas para eletroforese.
3.3- Imunofluorescência de células em cultura
De acordo com Mermelstein e colaboradores (1996), as células foram fixadas e
permeabilizadas e posteriormente foram incubadas com os anticorpos primários ou sondas
fluorescentes. Dessa forma, as células foram lavadas com PBS 1X por 5 minutos, e, adicionou-se
2 ml de paraformaldeído a 4% durante 10 minutos. O paraformaldeído foi retirado e foram
realizadas 3 lavagens de 10 minutos com PBS Triton X-100 a 0,5% (esta etapa permeabilizou a
membrana plasmática e permitiu a entrada dos anticorpos nas células). Fez-se a diluição do
anticorpo primário (Tabela 2) em PBS Triton X-100 a 0,5%. Após ter coberto a lamínula com a
solução de anticorpo primário diluido, sobre a câmara úmida, colocou-se a lamínula em estufa a
37 ºC por 1 hora.
35
Tabela 2- Anticorpos e sondas utilizados
Anticorpos
Primários
Tipo Feito em Diluição
Utilizada
Peso
Molecular
Origem
anti-caveolina-3
de rato
monoclonal
(clone 26)
camundongo 1:3000
(“immunoblotting”)
1:50
(imunofluorescência)
24kDa B. D. Transduction
anti-vinculina
de galinha
monoclonal
(clone VIN-
11-5)
camundongo 1:3000
(“immunoblotting”)
1:50
(imunofluorescência)
130kDa Sigma
anti-desmina de
galinha
policlonal coelho 1:20000
(“immunoblotting”)
1:100
(imunofluorescência)
52kDa Sigma
anti-α-actina
sarcomérica de
coelho
monoclonal
(clone 5C5)
camundongo 1:1000
(“immunoblotting”)
1:50
(imunofluorescência)
43kDa Sigma
anti-FAK humana monoclonal
(clone 14)
camundongo 1:1000
(“immunoblotting”)
1:50
(imunofluorescência)
125kDa B. D. Transduction
anti-paxilina de
galinha
monoclonal
(clone 349)
camundongo 1:3000
(“immunoblotting”)
1:50
(imunofluorescência)
68kDa B. D. Transduction
anti-pan-caderina
de galinha
policlonal coelho 1:50
(imunofluorescência)
135kDa Sigma
anti-M-caderina de
camundongo
monoclonal camundongo 1:50
(imunofluorescência)
130kDa B. D. Transduction
anti-α-tubulina de
galinha
monoclonal
(clone DM
1A)
camundongo 1:3000
(“immunoblotting”)
55kDa Sigma
anti-laminina de
camundongo
policlonal coelho 1:50
(imunofluorescência)
337kDa Sigma
anti-fibronectina de
camundongo
monoclonal
(clone FN-
3E2)
camundongo 1:50
(imunofluorescência)
220kDa Sigma
36
Tabela 2 - Continuação
Para a incubação com anticorpos secundários (Tabela 2), a lamínula foi re-colocada em
placa de 35 mm com PBS Triton X-100 a 0,5% e foram realizadas mais 3 lavagens de 10 minutos
cada e repetiu-se o procedimento anterior.
Para a incubação com a sonda faloidina (que se liga especificamente à actina filamentosa)
retirou-se o anticorpo secundário, foram realizadas 3 lavagens de 10 minutos com PBS 1X. Após
as lavagens a lamínula foi incubada por 40 minutos, com a faloidina (Tabela 2), em estufa a 37
ºC e em seguida foram realizadas mais 3 lavagens de 10 minutos com PBS 1X.
Após a incubação com o anticorpo secundário (ou com a faloidina), foi realizada a
incubação com a sonda fluorescente DAPI (Tabela 2) a 0,1 µg/ml em NaCl a 0,9% por 3 minutos
para marcação dos núcleos celulares. Para retirar o excesso da sonda DAPI, fez-se nova lavagem
com solução salina por 5 minutos.
As células foram então montadas em lamínulas de vidro de 24 x 60 mm, foi usada uma
solução de montagem que foi composta por glicerol a 60%, PPD a 0,0025%, N-Propil-Galato a
5% e DABCO a 25% (pH 7,5).
Anticorpos Secundários e Sondas Feito em Diluição
Utilizada
Origem
anti-IgG de camundongo-peroxidase cabra 1:15000 Amersham
anti-IgG de coelho-peroxidase cabra 1:20000 Amersham
anti-IgG de coelho- TRITC cabra 1:50 Sigma
anti-IgG de camundongo-FITC cabra 1:50 Sigma
DAPI ligação à DNA 1:2000 Molecular Probes
FALOIDINA-TRITC ligação à actina-F 1:50 Molecular Probes
37
3.4- Aquisição e processamento de imagens
As células foram observadas em um microscópio óptico invertido Axiovert 100 (Carl
Zeiss, Alemanha), com filtros seletivos apropriados para contraste de fase e para fluorescência.
As imagens das células foram adquiridas com uma câmera CCD C24001 integrada ao
processador de imagens Argus 20, ambos da Hamamatsu Photonics (Japão), transferidas para o
computador Dell OptiplexGI 575 (Dell Computers, EUA). Algumas células também foram
observadas em um microscópio óptico confocal Fluoview 1000 da Olympus (Japão). As pranchas
finais foram montadas com o uso do programa Photoshop 6.0 (Adobe Systems, EUA).
3.5- Preparação das frações enriquecidas em cavéolas
3.5.1- Obtenção da amostra de músculo esquelético de embrião de galinha
Os procedimentos iniciais já foram descritos anteriormente. Na lupa, a origem umeral e as
inserções esternal e clavicular, do músculo peitoral de 4 embriões de galinha com 11 dias, foram
cortadas através do uso de duas pinças de relojoeiro (No. 5) e/ou tesoura de micro-cirurgia. As
partes de tecido muscular retiradas foram colocadas em outra placa de 60 mm de diâmetro, com
solução salina sem cálcio e sem magnésio (CMF). Ainda na lupa, foram observados e retirados
possíveis contaminantes (porções ósseas e tecido conjuntivo). Os fragmentos de músculo
esquelético obtidos foram submetidos à dosagem de proteínas.
3.5.2-
Dosagem de proteínas totais
O coquetel de inibidores das proteases de serina, cisteína, aspartato e aminopeptidases
(Sigma) foi adicionado a amostra (20 µl de inibidor para 400 mg de amostra), em tubo do tipo
38
eppendorf. Nesse, com auxílio de um bastão de vidro foi preparado o homogenato de células e
submetido à dosagem de proteínas totais.
O método de Bradford é um dos mais sensíveis e usados para dosagem de proteínas totais
(Bradford,1976). Por esta técnica, uma curva de calibração de cor versus concentração de
proteína foi construída a partir da reação de diferentes concentrações de uma proteína conhecida
com o reagente de Bradford. O resultado de absorbância no λ da cor azul gerada pela solução
desconhecida da proteína pôde ser convertida em concentração usando como referência a curva
de calibração.
Embora a precisão desta técnica seja aumentada se as proteínas conhecidas e desconhecidas
forem estruturalmente relacionadas, é uma prática comum usar albumina bovina como padrão (e
foi a proteína padrão utilizada nesta tese).
3.5.3- Preparação das soluções de sacarose
Para a formação do gradiente descontínuo foram utilizadas as concentrações de sacarose
40%, 30% e 5% preparadas em MBS (25 mM MES, 150 mM NaCl, pH 6,5). A partir de uma
solução de 80% de sacarose, foram feitas diluições em MBS de acordo com as concentrações
específicas do gradiente.
3.5.4- Ultra-centrifugação
A amostra, em geral, continha 25mg/ml, dado obtido através da dosagem de proteínas
totais. Na amostra foram acrescentados 2ml de MBS, 40µl de Triton X-100 e 2ml de sacarose
80%. A mistura foi posteriormente submetida à um aparelho Vortex, para romper membranas
celulares. Então foi acrescentado, cuidadosamente, 1ml de cada concentração de sacarose.
39
Os tubos contendo as soluções de sacarose com as amostras foram centrifugados a 39.000
rpm por 17 horas em rotor SW 40ti (Beckman), a 4 ºC.
Após a centrifugação foram retiradas alíquotas de 1ml do topo ao final do gradiente,
gerando 12 frações. As frações 4, 5 e 6 foram consideradas caveolares, e as frações 10, 11 e 12 as
não-caveolares (Volonte et al., 2003). Uma nova dosagem de proteínas totais foi realizada, com
objetivo de saber a quantidade de proteína em cada alíquota.
3.6-
Eletroforese em gel de poliacrilamida
As amostras de culturas primárias foram preparadas a partir da retirada do meio 8-1-0,5
com 3 lavagens de PBS 1X. Em seguida, em gelo, as células foram raspadas das placas e
transferidas para um tubo eppendorf, centrifugadas (o sobrenadante é desprezado) e então foram
aplicados 50µl de tampão de amostra (62,5mM Tris-HCl pH 6,8; 2% SDS; 10% glicerol; 5% β-
mercaptoetanol; 0,001% azul de bromofenol). Em seguida foram aquecidas a 100 ºC por 5
minutos.
As amostras de frações de membrana enriquecidas em cavéolas foram precipitadas antes de
serem submetidas à eletroforese. Portanto foi calculado o volume de amostra necessário para que
se obtivesse 60µg de proteína de cada fração. Em seguida, foi adicionado o mesmo volume de
TCA 80%. Os tubos eppendorf com 60µg de proteína e TCA foram mantidos a 4 ºC por 10
minutos e em seguida centrifugados por 1 hora a 14.000 rpm. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi retirado e foram feitas 5 lavagens de 3 minutos (a 14.000 rpm) com acetona
100%. Então foram adicionados 10µl de tampão de amostra. O “pellet” foi desfeito com auxílio
de um bastão de vidro e as amostras foram aquecidas a 100 ºC por 5 minutos e depois
conservadas a -20 ºC.
40
Géis de corrida desnaturantes de poliacrilamida a 12%, 10% e 8% (Laemmli, 1970) e géis
de empilhamento a 4% foram preparados e quantidades iguais de proteína (60µg) foram aplicadas
nos poços dos géis. As eletroforeses foram realizadas a corrente constante (cerca de 30mA), em
tampão de corrida (Tris 50mM, glicina 384mM e SDS 0,2%). Em seguida, os géis de corrida
foram corados (azul de Coomassie 0,01%, álcool isopropílico 25% e ácido acético 10%) para que
fossem analisados ou transferidos para folhas de PVDF (“hydrophobic polyvinylidene difluoride
membrane”) para revelação imunológica de proteínas específicas.
3.7-
Revelação imunológica da transferência eletroforética de proteínas em gel
desnaturante de poliacrilamida para folha de PVDF
A revelação imunológica da transferência eletroforética de proteínas em gel desnaturante de
poliacrilamida para folha de PVDF, ou “immunoblotting”, foi feita de acordo com o descrito por
Towbin e colaboradores (1979), com modificações.
Primeiro foi feita uma eletroforese unidimensional em gel desnaturante de poliacrilamida,
das frações protéicas contra as quais se queria fazer um reconhecimento imunológico. Ao final da
eletroforese, o gel foi colocado no tampão de transferência (Tris 25mM, glicina 191mM e
metanol 20%), por 20 minutos. A folha de PVDF foi lavada por 10 segundos em metanol 100%,
colocada em água destilada por 5 minutos (sob agitação) e depois por 10 minutos em tampão de
transferência. A seguir as proteínas foram transferidas eletroforeticamente para a folha de PVDF,
durante 2 horas, a 60 mV (85mA) e a 4 ºC. Depois a PVDF foi corada com uma solução de
vermelho de Ponceau (0,1% vermelho de Ponceau e 5% de ácido acético) e a eficiência da
transferência foi analisada. Após a saturação da PVDF com uma solução de 10ml de tampão
TBS-Tween (Tris 10mM, NaCl 150mM e Tween 20 0,2%) e 5% de leite desnatado em pó em
41
água destilada, por 1 hora em temperatura ambiente, a membrana foi então lavada 3 vezes de 5
minutos com tampão TBS-Tween e incubada com o anticorpo primário (Tabela 2), diluído
adequadamente neste mesmo tampão, por 12 horas, à temperatura ambiente e sob agitação. Após
a incubação, a PVDF foi lavada 3 vezes de 10 minutos com o mesmo tampão TBS-Tween. A
seguir a PVDF foi incubada por 1 hora, em temperatura ambiente e sob agitação, com o anticorpo
secundário (Tabela 2) conjugado a enzima peroxidase. Após 4 lavagens de 10 minutos com este
mesmo tampão, a PVDF foi submetida à revelação pelo kit ECL™, e o procedimento foi feito
segundo protocolo da Amersham Biosciences (Brasil).
Os procedimentos de eletroforese e subsequente “immunoblotting” foram repetidos para
cada proteína cerca de 3 vezes, com obtenção de resultados semelhantes.
3.8- Desligamento de anticorpo “STRIP” em “immunoblotting”
Após a revelação, foi feito o desligamento dos anticorpos para permitir a marcação de
outras proteínas na mesma membrana de PVDF. Dessa forma, a PVDF foi lavada com tampão
TBS-Tween por 3 minutos e, em seguida, incubada com o tampão de “strip” (2-mercaptoetanol
110mM, SDS 2% e Tris-HCl 62,5mM, pH 6,7) por 30 minutos a 60 ºC, sob agitação. Foram
feitas 5 lavagens de 3 minutos cada, com tampão TBS-Tween e a PVDF pôde, então, ser
incubada com a solução de saturação e o “immunoblotting” foi novamente realizado (de acordo
com o descrito anteriormente). O desligamento do anticorpo foi feito segundo protocolo da
Amersham Biosciences (Brasil).
42
IV- Resultados
Para investigar a relação entre os micro-domínios membranares e as proteínas de adesão
celular utilizamos culturas de células musculares isoladas a partir de músculo estriado esquelético
de embriões de galinha. Algumas culturas de células foram tratadas com a substância metil-beta-
ciclodextrina (MCD) que se liga preferencialmente a colesterol da membrana plasmática, e desta
forma o retira seletivamente da mesma e desorganiza micro-domínios membranares ricos em
colesterol. Inicialmente foram feitas análises por imunofluorescência das distribuições de
proteínas de membrana plasmática, do citoesqueleto e de matriz extracelular de culturas controle
(não tratadas) de músculo esquelético.
Com o objetivo de confirmar a presença de células musculares nas culturas primárias foi
realizada a marcação por imunofluorescência da proteína de filamento intermediário específica de
músculo, a desmina. Na Figura 9, podem ser observadas células crescidas em cultura com 48
horas de diferenciação (miócitos e miotubos) e marcadas com anticorpo anti-desmina. A
marcação se apresenta na forma filamentosa ocupando todo citoplasma de miotubos e mioblastos
(Figura 9A). A marcação de material nuclear (DNA) feita com a sonda fluorescente DAPI pode
ser visualizada na Figura 9B. É importante notar a presença de fibroblastos nestas culturas
primárias de células, vistos pelos núcleos marcados com DAPI e negativos para desmina.
A Figura 10 mostra, através de imunofluorescência, a marcação da proteína marcadora de
micro-domínios de membrana caveolina-3. Com efeito, pode-se notar a marcação de caveolina-3
de forma filamentosa pelo citoplasma das células musculares (miotubos) em cultura com 48 horas
de diferenciação (Figura 10A). Os núcleos são visualizados na Figura 10B.
43
Figura 9- Imunomarcação para desmina em cultura de células de músculo esquelético de
embrião de galinha com 48 horas de diferenciação. Na Figura 9A é observada a rede
filamentosa de desmina pelo sarcoplasma de um miotubo e de um miócito (célula menor). Os
núcleos são visualizados na Figura 9B com a sonda DAPI. Barra de 10µm.
Figura 10- Imunomarcação para caveolina-3 em cultura de células de músculo esquelético de
embrião de galinha com 48 horas de diferenciação. Na Figura 10A podem ser notados os
filamentos de caveolina-3 presentes no miotubo. A marcação com a sonda DAPI dos núcleos
alinhados do miotubo é observada na Figura 10B. Barra de 10µm.
44
Para começar a analisar a expressão das proteínas de adesão nas células musculares foi feita
a marcação para caderina, proteína de adesão célula-célula. A Figura 11A mostra a marcação
com o anticorpo anti-caderina no sarcolema de um miotubo com 48 horas de diferenciação. Pode-
se observar também a marcação de caderina na membrana de um mioblasto (Figura 11A). Os
núcleos são visualizados na Figura 11B.
Com o objetivo de analisar a expressão de moléculas de adesão célula-matriz extracelular
em células musculares esqueléticas foram realizadas imunomarcações para algumas proteínas,
como a proteína FAK (quinase de adesão focal), a paxilina e a vinculina, todas características de
contatos focais. Na Figura 12A, observa-se a marcação discreta de FAK pelo sarcolema de
miotubos com 48 horas de diferenciação. Os núcleos são visualizados na Figura 12B.
A
Figura 13A
mostra a imunomarcação de paxilina em miotubos com 48 horas de
diferenciação. Como resultado observa-se a marcação paxilina de forma difusa pelo sarcolema de
um miotubo. Pode-se também observar a presença de paxilina concentrada em contatos focais
(linhas fluorescentes) nas áreas de adesão de fibroblastos (caracterizados pelo núcleo maior visto
pelo DAPI) ao substrato. A Figura 13B mostra os núcleos.
Após a análise inicial da distribuição de várias proteínas do citoesqueleto, de membrana
plasmática e de matriz extracelular, partimos para o estudo dos efeitos da substância metil-beta-
ciclodextrina (MCD) nas adesões de células musculares esqueléticas. A Figura 14 mostra,
através de microscopia óptica de contraste de fase, uma cultura controle de miotubos com 48
horas de crescimento (Figura 14A) e uma cultura de miotubos 24 horas após ser tratada com
MCD 2 mM (com também 48 horas de crescimento). Os miotubos após o tratamento com MCD
(Figura 14B) se tornam mais espessos devido ao maior número de núcleos em relação aos
miotubos controle. Esse resultado está de acordo com resultado anterior de nosso laboratório que
45
Figura 12- Imunomarcação para FAK em cultura de células de músculo esquelético de
embrião de galinha com 48 horas de diferenciação.
Na
Figura 12A
observa-se a marcação
discreta em alguns pontos do sarcolema de miotubos. Na
Figura 12B podem ser observados co
m
a sonda DAPI os núcleos alinhados do miotubo. Barra de 10
µ
m.
B
Figura 11- Imunomarcação para caderina em cultura de células de músculo esquelético de
embrião de galinha com 48 horas de diferenciação.
Na
Figura 11A
nota-se marcação no
sarcolema de um miotubo com 48 horas de diferenciação e em um mioblasto. Na
Figura 11B pode-
se observar com a sonda DAPI a marcação dos núcleos alinhados do miotubo. Barra de 10µm.
46
Figura 13- Imunomarcação para paxilina em cultura de células de músculo esquelético de
embrião de galinha com 48 horas de diferenciação.
Figura 13A observa-se a marcação de
p
axilina de uma forma difusa pelo sarcolema de um miotubo. Pode-se também observar a presenç
a
de paxilina concentrada em contatos focais (linhas fluorescentes) nas áreas de adesão de fibroblastos
ao substrato. A
Figura 13B mostra com a sonda DAPI os núcleos alinhados de um miotubo. Barr
a
de 10µm.
Figura 14- Microscopia óptica de contraste de fase de cultura de células de músculo
esquelético controle e tratadas com metil-beta-ciclodextrina (MCD 2mM).
A
Figura 14A
mostra miotubos controle com 48 horas de diferenciação e a Figura 14B mostra miotubos tratados
com MCD (total de 48 horas de crescimento). É importante notar o aumento na espessura dos
miotubos após o tratamento com MCD (setas). Barra de 10µm.
47
analisou através de contagem de núcleos, o aumento na espessura dos miotubos após o tratamento
com MCD (Mermelstein
et al., 2005).
Para avaliar a ação da MCD em micro-domínios caveolares, foi feita a imunomarcação
para caveolina-3 nas células musculares. Na
Figura 15A observa-se a cultura controle, com 48
horas de crescimento, marcada para caveolina-3 e na
Figura 15B podemos observar a marcação
de actina-F feita através da sonda fluorescente faloidina. A marcação de caveolina-3 está
distribuída por todo o sarcoplasma dos miotubos sob a forma de filamentos. Já na marcação de
actina-F podemos visualizar a presença de estriações nas miofibrilas dos miotubos. Após 24
horas de tratamento com MCD 2mM observamos marcação de caveolina-3 mais concentrada na
região terminal do miotubo (
Figuras 15D). A marcação de actina-F não apresentou alterações
significativas após o tratamento com MCD. Os núcleos das células controle e tratadas com MCD
são visualizados respectivamente nas
Figuras 15C e 15F.
A ação da MCD sobre as adesões célula-célula foi avaliada através da distribuição da
proteína M-caderina, que é específica de células musculares. Células controle com 48 horas
(
Figura 16A) e após 24 horas de tratamento com MCD 2mM (Figura 16C) foram marcadas com
anticorpo anti-M-caderina. O tratamento com MCD teve como conseqüência a maior intensidade
de marcação de caderina no sarcolema dos miotubos, provavelmente devido ao aumento da área
de membrana destas células tratadas. Pode-se observar a maior agregação de núcleos após o
tratamento com MCD pela comparação entre as marcações de DAPI nas
Figuras 16B e 16D.
Na marcação para paxilina e actina-F realizada nas culturas controle com 48 horas de
diferenciação e após 24 horas de tratamento com MCD não se observam alterações (resultados
não mostrados). Dessa forma, realiza-se também a marcação para paxilina tanto na situação
controle com 72 horas de diferenciação (
Figura 17A) quanto após 48 horas de tratamento
(
Figura 17D).
48
Figura 15- Imunomarcação para caveolina-3 em miotubos controle com 48 horas e após 24
horas de tratamento com MCD 2mM
. As
Figuras 15A
e
15B
mostram a marcação, em miotubos
controle, de caveolina-3 e actina-F, respectivamente. Nota-se a caveolina-3 distribuída por todo o
sarcoplasma dos miotubos sob a forma de filamentos. As
Figuras 15D e 15E mostram essa
marcação em miotubos tratados com MCD. Nota-se que a marcação está mais concentrada na região
terminal do miotubo. Os núcleos são vistos em
15C e 15F. Barra de 10µm.
49
Figura 16
-
Imunomarcação para M-caderina em miotubos controle com 48 horas e após 24
horas de tratamento com MCD 2mM.
A Figura A mostra um miotubo controle mais fino que o
miotubo tratado com MCD e este com maior intensidade de marcação (
Figura E). Nota-se a maio
r
agregação de núcleos após o tratamento com MCD. Os núcleos são vistos em B e D. Barra de
10µm.
50
Nos miotubos tratados com MCD, a marcação para paxilina aparece mais concentrada na região
central em relação aos miotubos controle (estes têm marcação na região terminal).
A marcação de vinculina também é realizada nas culturas controle com 72 horas de
diferenciação (
Figuras 18A
e
B
) e após 48 horas de tratamento com MCD (
Figuras 18D
e
E
).
Com efeito, observa-se que a cultura controle tem menos células aderidas e uma rede filamentosa
de vinculina mais organizada (formando filamentos) que a cultura tratada. Os núcleos são vistos
em
C e F.
Culturas primárias de mioblastos também apresentam fibroblastos, provenientes do tecido
conjuntivo adjacente ao tecido muscular. Estes fibroblastos secretam várias substâncias que
Figura 17- Imunomarcação para paxilina em miotubos controle com 72 horas e após 48 horas
de tratamento com MCD.
As Figuras A (marcação de paxilina) e B (marcação de actina-F)
mostram miotubos controle. As
Figuras D e E mostram miotubos tratados com MCD marcados
p
ara paxilina e actina-F, respectivamente. Pode-se observar que a paxilina está mais concentrada n
a
região central nos miotubos tratados em relação aos miotubos controle. Os núcleos são vistos em C
e F. Barra de 10µm.
51
auxiliam o desenvolvimento dos mioblastos, tais como proteínas da matriz extracelular e fatores
de crescimento. Portanto, consideramos importante analisar também a distribuição de proteínas
de adesão nos fibroblastos presentes nestas culturas. As culturas tratadas com MCD 2mM e
crescidas por mais 48 horas apresentaram uma maior intensidade de marcação de vinculina em
relação às culturas controle, como se observa na
Figura 19 por microscopia óptica confocal.
Figura 18- Vinculina e actina-F em miotubos controle e tratados com MCD. Marcação de
vinculina em culturas controle com 72 horas (
Figura 18A) e após 48 horas de tratamento com MCD
(
Figura 18D). Observa-se que a controle tem menos células aderidas e uma rede filamentosa de
vinculina mais organizada que a tratada. Núcleos vistos nas
Figuras 18C e F. Barra de 10µm.
52
Com o objetivo de avaliar as alterações provocadas pela desorganização de micro-domínios
em estágios iniciais da diferenciação, realizamos marcações para vinculina e actina-F em culturas
de células musculares logo em seguida ao tratamento com MCD (2mM). O resultado que se
obtém não mostra diferença significativa entre as culturas controle e tratadas (dados não
mostrados). Dessa forma, decidimos testar uma concentração maior da substância MCD (4mM)
seguida de análise após 1-3 horas. O resultado mostra que culturas tratadas desta forma
apresentam um aumento na fusão dos miócitos (
Figuras 20D e E) em comparação com as
culturas controle (
Figuras 20A e B). A maior agregação de núcleos pode ser analisada nas
Figuras 20C e 20F.
Figura 19- Imunomarcação para vinculina e actina-F em fibroblastos controle com 72 horas
e após 48 horas de tratamento com MCD 2mM analisados por microscopia confocal.
Em
19A
marcação de vinculina, em 19B de actina-F em fibroblastos de uma cultura controle com 72 horas.
Em
19D e 19E marcação em fibroblastos 48 horas após o tratamento. Pode-se notar a maio
r
intensidade na marcação de vinculina na cultura tratada com MCD. As Figuras 19C e 19F
correspondem aos núcleos por microscopia de contraste interferencial. Barra de 10µm.
53
Ao deixar crescer por 3 horas essa cultura tratada com 4mM de MCD (
Figura 21),
observa-se que a rede de actina-F se torna mais desorganizada (
Figura 21C), em relação a
controle. Nota-se também efeito nos fibroblastos que passam a apresentar “ruffles” que são
ondulações na membrana.
A proteína paxilina também foi analisada em culturas controle com 24 horas de
diferenciação e em culturas com 1-2 horas após o tratamento com 4mM de MCD (
Figura 22).
Pode-se notar a maior intensidade na marcação de paxilina nas culturas tratadas com MCD.
Figura 20- Imunomarcação de vinculina e actina-F em mioblastos controle com 24 horas e
após 1-2 horas de tratamento com MCD 4mM.
Em 20A marcação de vinculina, em 20B de
actina-F em uma cultura controle com 24 horas. Em
20D e 20E marcação em mioblastos, 1-2 horas
após o tratamento. Pode-se notar a maior quantidade de miócitos se aderindo em miotubos na cultura
tratada com MCD. As
Figuras 20C e 20F correspondem aos núcleos, com efeito nota-se o maio
r
número de núcleos associados na cultura tratada. Barra de 10µm.
54
Figura 21- Actina-F em mioblastos e fibroblastos controle com 24 horas e
após 3 horas de tratamento com 4mM MCD.
Em A observa-se mioblastos e
fibroblastos controle, em
C os fibroblastos após o tratamento passam
a
apresentar ondulações na membrana. Os núcleos são visualizados em B e D.
Barra de 10µm.
55
Os resultados de imunofluorescência obtidos neste trabalho de tese mostraram que as
proteínas de adesão vinculina e paxilina apresentavam uma maior intensidade de marcação nas
culturas tratadas com MCD em relação às culturas não-tratadas. Para analisar quantitativamente
esta diferença de expressão das proteínas de adesão após o tratamento com MCD, foram
preparadas amostras de extratos totais de culturas controle e tratadas com MCD para análises em
eletroforese em gel de poliacrilamida seguido de “immunoblotting”. Inicialmente fizemos uma
Figura 22- Paxilina em culturas controle com 24 horas e após 1-2 horas de tratamento com
4mM de MCD. Em 22A observa-se miotubo com menor intensidade de marcação. Em 22C o
miotubo após o tratamento é mais espesso, com maior intensidade na marcação de paxilina. Os
núcleos são visualizados em
22B e 22D. Barra de 10µm.
56
eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (com SDS) das amostras de
culturas de células musculares. A
Figura 23A mostra a coloração por azul de Coomassie das
amostras de culturas controle e tratadas com MCD 2mM e de um padrão de pesos moleculares
(albumina, desmina e actina). Fizemos também densitometrias das bandas proteicas deste gel.
Apesar de não terem sido aplicadas as mesmas quantidades de proteínas das amostras de culturas
controle e tratadas, pôde se observar que o perfil densitométrico destas duas amostras apresenta
diferenças qualitativas entre essas, o que sugere diferenças na expressão proteica das células
antes e após o tratamento com MCD. Decidimos então realizar “immunoblottings” de amostras
de culturas controle com 72 horas de diferenciação e 48 horas após o tratamento com 2mM de
MCD. A
Figura 23B mostra as marcações para paxilina, vinculina e tubulina. Tubulina foi
utilizada como controle da quantidade de proteínas presentes nas amostras de culturas de células.
Isto por que a tubulina é uma proteína ubiquitária, ou seja, é expressa por todas as células
eucarióticas o tempo todo. As densitometrias realizadas, através do Programa Microsoft Office
Excel, destes “immunoblotting” mostram uma diminuição da expressão dessas duas proteínas de
adesão (paxilina e vinculina) nas culturas tratadas com MCD 2mM.
Como dito anteriormente, os fibroblastos normalmente estão presentes nas culturas
primárias de mioblastos e dessa forma também estão sujeitos a alterações com o tratamento com
MCD, como já visto através das imagens de imunofluorescência desta tese. Portanto com a
finalidade de analisar quantitativamente a alteração das proteínas de adesão nos fibroblastos
foram preparadas amostras para eletroforese a partir de culturas de fibroblastos (com mais de
90% de fibroblastos) controle com 72 horas e após 48 horas do tratamento com MCD 2mM.
57
Figura 23- Coloração por azul de Coomassie e “immunoblotting” das amostras de
cultura controle e tratada com MCD 2mM.
A Figura 23A mostra a coloração por azul
de Coomassie dos padrões de peso molecular (poço 1), das amostras controle com 72
horas (poço 2) e após 48 horas de tratamento com MCD (poço 3). A
Figura 23B mostra
as amostras de cultura controle e tratada submetidas ao “immunoblotting” para as
p
roteínas de adesão paxilina e vinculina. Pode-se observar, através da análise da
densitometria da coloração por azul de Coomassie e do “immunoblotting”, que ocorre a
diminuição das proteínas após o tratamento com MCD 2mM.
58
A Figura 24 mostra o “immunoblotting” para paxilina (A) e vinculina (B) dessas amostras,
seguido de suas densitometrias. Os resultados indicam um aumento da expressão das proteínas de
adesão paxilina e vinculina após o tratamento com MCD.
Os efeitos da concentração aumentada de MCD (4 mM) no início da diferenciação muscular
também foram analisados por “immunoblotting”. Na
Figura 25 pode-se observar a marcação
para paxilina (
A) e vinculina (B) nas amostras de cultura controle com 24 horas e após 2 horas de
tratamento com MCD 4mM. Os resultados das densitometrias mostram um aumento da expressão
dessas duas proteínas após o tratamento com MCD 4mM, oposto a diminuição da expressão
destas duas proteínas observado após o tratamento com MCD 2mM.
Procedemos também a análise por “immunoblotting” das amostras de culturas de
fibroblastos controle com 24 horas de diferenciação e após 2 horas de tratamento com MCD
4mM. A
Figura 26 mostra as marcações para paxilina (A) e vinculina (B), e através da
densitometria destes resultados observamos uma pequena diminuição da expressão de paxilina e
aumento da expressão de vinculina após o tratamento com MCD 4mM.
Com o objetivo de estudarmos também a presença das proteínas de adesão em micro-
domínios caveolares de músculo esquelético, foram preparadas amostras para análises em
eletroforese em gel de poliacrilamida seguido de “immunoblotting” de frações de membrana
enriquecidas em cavéolas de músculo peitoral de embrião de galinha. Na
Figura 27, observam-se
as marcações das frações enriquecidas em cavéolas feitas com os seguintes anticorpos: contra
caveolina-3 (é uma proteína marcadora de frações caveolares) e contra as proteínas de adesão
FAK, α-actina sarcomérica, paxilina e vinculina. Confirmamos a presença de caveolina-3 na
fração caveolar e verificamos que, com exceção da vinculina, todas as outras proteínas de adesão
estão presentes na fração não-caveolar.
59
Figura 24- “Immunoblotting” das amostras de cultura de fibroblastos
controle e tratada com MCD 2mM.
Figura A
marcação para paxilina das
amostras controle com 72 horas e após 48 horas de tratamento com MCD.
Figura B marcação para vinculina. Pode-se observar, através da análise d
a
densitometria que ocorre aumento das proteínas após o tratamento com MCD
2mM.
Figura 25- “Immunoblotting” das amostras de cultura de mioblastos controle
e tratada com 4 mM de MCD.
Figura 27A marcação para paxilina das amostras
controle com 24 horas e após 2 horas de tratamento com MCD.
Figura 27B
marcação para vinculina. Pode-se observar, através da análise da densitometria que
ocorre aumento das proteínas após o tratamento com 4mM de MCD.
60
Figura 26- “Immunoblotting” das amostras de cultura de fibroblastos
controle e tratada com 4mM de MCD.
Figura 26A marcação par
a
p
axilina das amostras controle com 24 horas e após 2 horas de tratamento
com MCD.
Figura 26B marcação para vinculina. Pode-se observar, através
da análise da densitometria que ocorre diminuição de paxilina e aumento de
vinculina após o tratamento com 4mM de MCD.
Figura 27- “Immunoblotting” das frações caveolares e não-caveolares.
As frações caveolares encontram-se na coluna da esquerda e as frações não-
caveolares encontram-se na coluna da direita. Pode-se observar que
a
maioria das proteínas de adesão está presente na fração não-caveolar, co
m
exceção da vinculina.
61
V- Discussão
Esta tese se concentrou no estudo das possíves relações entre colesterol membranar e
proteínas de adesão em um modelo de células musculares esqueléticas crescidas
in vitro. Isto
porque este assunto ainda não havia sido abordado na literatura e consideramos de especial
interesse para um melhor entendimento dos mecanismos básicos que regulam as fases iniciais da
formação de fibras musculares esqueléticas.
A diferenciação muscular esquelética tem início com a proliferação de células precursoras,
chamadas de pré-mioblastos. Após certo número de ciclos de proliferação, estas células (os
mioblastos) param de se dividir e começam a se alongar e se alinhar com outras células
semelhantes a elas. Este processo leva ao reconhecimento entre suas membranas plasmáticas e
culmina com a fusão dos mioblastos em células multinucleadas chamadas de miotubos. Estes
miotubos formarão no seu interior as miofibrilas, que são estruturas contráteis compostas por
proteínas do citoesqueleto. Desta forma, fica evidente que estruturas membranares têm
participação ativa nos processos de alinhamento, reconhecimento e adesão entre mioblastos.
Recentemente foram descritas regiões especializadas de membrana plasmática chamadas de
micro-domínios ou “rafts”. Estas regiões são ricas em colesterol e certos glicolipídeos e têm sido
descritas como tendo um papel importante em eventos de sinalização celular e de fusão entre
células, tais como na fusão de vírus com células-hospedeiras e de espermatozóides com a célula
ovo.
Nosso grupo de pesquisa se interessou pelo estudo do papel destes micro-domínios
membranares na diferenciação muscular esquelética. Utilizamos a substância metil-beta-
62
ciclodextrina (MCD) para retirar colesterol da membrana e assim podermos estudar os efeitos
desta depleção. Deste interesse já resultaram alguns resultados e publicações recentes
(Mermelstein
et al., 2005, 2007), que descrevem que os efeitos da MCD levam a um aumento da
proliferação e de diferenciação de células musculares esqueléticas de embriões de galinha
crescidas em cultura. Nesta tese decidimos investigar os efeitos da depleção de colesterol por
MCD na adesão intercelular e na adesão célula-matriz extracelular em culturas de células
musculares esqueléticas e em fibroblastos.
Para realizar este estudo foram utilizadas as seguintes técnicas: culturas primárias de células
musculares esqueléticas e de fibroblastos; tratamento das culturas de células com a substância
metil-beta-ciclodextrina (MCD); microscopia óptica de imunofluorescência; preparação de
frações enriquecidas em cavéolas membranares; eletroforese em gel de poliacrilamida em
condições desnaturantes e “immunoblotting”. Os resultados obtidos com as imagens de
imunofluorescências de algumas proteínas de adesão como a caderina (presente em adesões
célula-célula), a vinculina e a paxilina (presentes em adesões célula-matriz extracelular), e
caveolina-3 (presente em micro-domínios membranares) mostraram que estas proteínas tinham
suas distribuições alteradas e suas expressões aumentadas após a depleção de colesterol por
MCD. Também foi observado que fibroblastos isolados a partir de culturas de células musculares
também apresentavam alterações em suas adesões celulares ao substrato.
Como os resultados desta tese se referem ao estudo de micro-domínios de membrana e
proteínas de adesão é necessário discutir os resultados encontrados e suas implicações.
63
Micro-domínios de membrana podem ser sub-divididos em dois tipos principais: os
caveolares (também chamados de cavéolas) e os não-caveolares (também chamados de “rafts”),
sendo a principal característica que os distingue a presença das proteínas caveolinas nas cavéolas.
Alguns autores questionam os componentes protéicos e até mesmo a existência de micro-
domínios lipídicos (“rafts”) e cavéolas, e afirmam que os métodos de isolamento destas estruturas
podem mudar a natureza dos micro-domínios e talvez até criá-los. Babiychuk e colaboradores
(2006) descrevem que a separação entre micro-domínios enriquecidos em colesterol e
glicoesfingolipídeos das regiões de glicerofosfolipídeos (regiões que não são consideradas como
micro-domínios) pode variar de acordo com o detergente utilizado, com a sua concentração e
com associações com o citoesqueleto de actina. No entanto, muitos métodos comprovam a
existência de micro-domínios funcionais na membrana plasmática
in vivo (Hooper, 1999;
Jacobson
et al., 1999; Simons et al., 2000). Micro-domínios de membrana enriquecidos em
componentes de cavéolas e de “rafts”, incluindo colesterol, glicoesfingolipídeos e proteínas
caveolares, podem ser isolados com base em sua insolubilidade em detergentes não-iônicos
(como o Triton X-100), a baixas temperaturas (4
0
C) e sua baixa densidade em um gradiente de
sacarose. Não existe uma terminologia única para esses micro-domínios de membrana
purificados bioquimicamente. Eles têm sido chamados de DIGs (membranas insolúveis em
detergente ricas em glicolipídeos), DRMs (membranas resistentes a detergentes), TIFFs (frações
flutuantes insolúveis em Triton) e CMDs (micro-domínios de membrana enriquecidos em
caveolina). Existem trabalhos enfatizando que as proteínas presentes nas frações de DIGs não
estão, obrigatoriamente, presentes em “rafts” ou em cavéolas, ou seja, existem diferentes tipos de
64
micro-domínios com diferentes tamanhos e composições protéicas (Maxfield, 2002). Existem
vários estudos sobre micro-domínios que promovem sua desorganização pela retirada de
colesterol com a metil-beta-ciclodextrina (MCD). Essa substância retira até 90% do colesterol da
membrana de eritrócitos (Ohtani
et al., 1989). Langumaran & Hoessli (1998) sugerem em seu
trabalho que a MCD retira preferencialmente o colesterol das regiões de membrana que não são
micro-domínios; que solubiliza proteínas transmembranares e ancoradas a GPI dessas regiões da
membrana; e que desprende da membrana micro-domínios vesiculares ou não-vesiculares. Em
células de linhagem de músculo liso, Gosens e colaboradores (2006) descrevem que após o
tratamento com 10mM MCD ocorre um aumento da proliferação celular provavelmente
provocado pela desorganização dos micro-domínios caveolares. A confirmação desse resultado é
obtida através do “knockdown” para caveolina-1, quando então observam aumento da
proliferação. Dessa forma, nossos resultados são baseados na utilização de procedimentos já
estabelecidos por outros autores e também pelo nosso grupo de trabalho (Mermelstein
et al.,
2005) para desorganizar micro-domínios de membrana em cultura de células de músculo
esquelético e para separar frações de membrana enriquecidas em cavéolas (Volonte
et al., 2003),
que consideram as propriedades biofísicas dos micro-domínios caveolares: insolubilidade em
detergente não-iônico (Triton X-100) a 4
0
C e baixa densidade em gradiente de sacarose.
As adesões célula-célula mediadas por caderina têm papel fundamental na morfogênese.
Volonte e colaboradores (2003) mostram em seu trabalho que a proteína M-caderina está
aumentada quando analisada em células musculares de camundongo negativas para caveolina-3
(não formam micro-domínios caveolares). Esses evidenciam, ainda, a formação de miotubos mais
65
espessos que encontrados na situação controle. Dessa forma, propõem que ocorre uma regulação
da atividade de M-caderina pelas cavéolas musculares. Os nossos resultados apontam também
para o aumento do tamanho dos miotubos após 24 horas do tratamento com 2mM de MCD e para
maior a quantidade de M-caderina presente no sarcolema (Mermelstein
et al., 2005). Portanto
pode-se notar que existe uma relação entre a desorganização de micro-domínios de membrana e a
adesão celular.
Os 2 tipos de adesões célula-matriz extracelular descritos em trabalhos
in vitro (contato
focal e adesão fibrilar) provocam questionamentos com relação a sua existência
in vivo. A adesão
focal é caracterizada principalmente pela presença das proteínas FAK e paxilina de forma
pontilhada nas células em cultura, observada através de técnica de imunofluorescência. A adesão
fibrilar tem como proteína característica a fibronectina que forma filamentos na sua associação
com o sustrato. Segundo Cukierman e colaboradores (2001) essas diferenças características entre
cada tipo de adesão célula-matriz extracelular não são tão evidentes se forem analisadas em uma
matriz tridimensional. Em seu trabalho mostra que se o substrato for uma matriz tridimensional (a
qual mimetiza com maior aproximação a situação
in vivo) são encontradas marcações
semelhantes para FAK, paxilina e fibronectina .
Vários autores descrevem o processo de adesão celular em fibroblastos. Cukierman e
colaboradores (2001) analisam a existência de adesões focais e fibrilares, através da comparação
in vitro e in vivo , utilizando células fibroblásticas de camundongo (3T3). O aumento da
fosforilação de paxilina nas adesões focais quando os fibroblastos são plaqueados em substrato de
fibronectina (ligante da integrina) é mostrado por Bellis e colaboradores (1997). A influência do
66
substrato na expressão das proteínas de adesão também é descrita por Bendori e colaboradores
(1987). Nesse trabalho a marcação de vinculina, em fibroblastos de embrião de galinha
plaqueados em componentes de matriz-extracelular, é visualizada em toda a região ventral das
células. Por outro lado, quando os fibroblastos são plaqueados em substrato de poli-metacrilato se
tornam redondos e a marcação para vinculina é difusa. Dessa forma, é interessante analisar a
alteração nos níveis de colesterol na membrana plasmática após o tratamento com MCD e sua
relação com as adesões celulares também em fibroblastos. Por isso em nosso estudo analisamos e
comparamos as alterações ocorridas após o uso da MCD nos dois tipos celulares.
Em nosso estudo são analisadas as alterações na adesão celular provocadas pela retirada de
colesterol. Ramprasad e colaboradores (2007) também estudam essas alterações em células de
sarcoma de camundongo (células da linhagem L27), e os resultados indicam que a depleção do
colesterol da membrana faz com que muitas células se tornem redondas (com despolimerização
da rede de actina), com menor taxa de adesão e motilidade no substrato de fibronectina. Quando é
feita a reposição do colesterol as células voltam à situação inicial. A retirada de colesterol altera a
distribuição de α5β1-integrina e também de paxilina, ambas passam a co-localizar na região
central da célula (Ramprasad
et al., 2007). Esse resultado é semelhante ao nosso em mioblastos
após o tratamento com MCD. Esse trabalho mostra ainda que a retirada de colesterol promove a
despolimerização da rede de actina, já os nossos resultados apontam para uma desorganização
evidente na rede de actina-F (após 3 horas de tratamento) e vinculina.
Ramprasad e colaboradores (2007) mostram que após o tratamento com MCD a paxilina
deixa de se localizar na periferia da célula em contatos focais e passa para a região central. Os
67
nossos resultados com mioblastos mostram uma diminuição de paxilina 48 horas após o
tratamento com MCD que pode ocorrer devido a essa alteração na sua distribuição. A redução na
paxilina pode também estar relacionada com a desorganização de micro-domínios caveolares, já
que Swaney e colaboradores (2006) descrevem que a paxilina e a vinculina co-imunoprecipitam
com a caveolina-1 fosforilada. Goudenege e colaboradores (2007) também descrevem em seu
trabalho a direta associação entre vinculina e caveolina-3. Dessa forma, a redução de vinculina
encontrada em nossos resultados também pode ocorrer devido à desorganização desses micro-
domínios caveolares.
O tratamento com a concentração de 4mM de MCD promoveu uma aceleração das etapas
iniciais da miogênese como pode ser observado através dos nossos resultados. A paxilina
presente nos contatos focais participa como ponto de convergência para diversas vias de
sinalização, por exemplo, ativando receptores de fatores de crescimento. Também está
relacionada com a actina, uma das proteínas responsáveis pelas mudanças de forma na célula, que
é um processo importante inclusive nos estágios iniciais do desenvolvimento (Turner, 2000).
Segundo Crawford e colaboradores (2003), durante as etapas de embriogênese do peixe-zebra, a
paxilina (assim como a FAK) atuam integrando os sistemas de adesão baseados em caderina e
integrina. Tendo portanto papel fundamental nos dois tipos de adesão celular. Na hipertrofia
muscular (em ratos) e em cultura com miotubos recém formados (embrião de galinha) também é
descrito o aumento das proteínas de contato focal, como a paxilina (Fluck
et al., 1999). Assim, o
aumento de paxilina observado nos nossos resultados pode ocorrer devido a essa aceleração das
etapas iniciais de desenvolvimento e subseqüente necessidade de maior quantidade de proteínas
68
relacionadas ao processo de crescimento celular. A vinculina também aparece aumentada em
nossos resultados, essa proteína mutli-ligante (ligada a actina, paxilina, entre outras) é descrita
tanto em processos de adesão célula-célula como célula-matriz extracelular. Esses processos são
fundamentais para a formação de tecidos durante a embriogênese. Barstead e colaboradores
(1991) descrevem que a alteração do gene da vinculina em
Caenorhabditis elegans leva a sua
morte. Alterações na fosforilação de vinculina podem regular adesões célula-célula e célula-
matriz extracelular (Jockusch
et al., 1996). Dessa forma, com a aceleração das etapas da
miogênese é necessária uma maior quantidade de vinculina, como é encontrada nos nossos
resultados.
O colesterol pode regular as funções da integrina, e esta tem papel fundamental na
regulação da forma e da motilidade das células (Gopalakrishna
et al., 2000). Alguns trabalhos já
descreveram a relação entre integrina e cavéolas, como Wary e colaboradores (1996) que
mostram em cultura primária de fibroblastos que caveolina-1 co-imunoprecipita com integrina-β1
e fibronectina. A função da integrina e da caveolina-1 associadas com canais iônicos formando
complexos na membrana que regulam vias de sinalização é descrita por Arcangeli e
colaboradores (2006). Dessa forma torna-se interessante investigar a associação de outras
proteínas de adesão com as cavéolas. Por esse motivo, neste estudo utiliza-se o fracionamento de
membrana plasmática para a obtenção de frações enriquecidas em cavéolas que são submetidas à
eletroforese e “immunoblotting”. Swaney e colaboradores (2006) mostram, em fibroblastos
cardíacos de ratos, que apenas a caveolina-1 fosforilada está presente nas mesmas frações
(descritas como não-caveolares, de 10 a 12) que as proteínas de adesão focal FAK, paxilina e
69
vinculina. Esse resultado é semelhante ao nosso, já que apenas a vinculina está presente na fração
caveolar. A presença de vinculina na fração caveolar descrita em nossos resultados é compatível
com o trabalho de Goudenege e colaboradores (2007). Nesse trabalho é utilizada a linhagem
muscular C2C12, o fracionamento por gradiente de sacarose e co-imunoprecipitação, e como
resultado apresenta a associação entre a vinculina e a caveolina-3.
Nossos resultados mostram uma relação entre colesterol, micro-domínios membranares,
adesões celulares e diferenciação muscular. Estudos mais detalhados dessas interações e das
moléculas envolvidas nestes processos são necessários para um entendimento dos mecanismos
básicos que governam as diferentes etapas envolvidas na formação de fibras musculares maduras.
70
VI- Conclusões
- Células de músculo esquelético de embriões de galinha quando crescidos in vitro na
presença da substância que retira colesterol membranar metil-beta-ciclodextrina (MCD) em
concentrações de 2 ou 4mM aumentam a taxa de adesão intercelular e induzem a formação
de miotubos mais espessos que os de culturas não tratadas;
- A distribuição da proteína de membrana caderina-M no sarcolema de miotubos parece estar
aumentada após a depleção de colesterol membranar por MCD, sugerindo um papel desta
proteína no aumento de adesão intercelular observado após o tratamento das células com
MCD. A proteína de micro-domínios membranares caveolina-3 se torna mais concentrada
nas regiões de contato das células com a matriz extracelular após o tratamento das células
com MCD. A expressão das proteínas de adesão vinculina e paxilina diminui após o
tratamento de células musculares com 2mM de MCD.
- Fibroblastos isolados a partir de músculo esquelético de galinha apresentam alterações na
quantidade das proteínas de adesão vinculina e paxilina após a depleção de colesterol
membranar por MCD. A expressão das proteínas de adesão vinculina e paxilina aumenta
após o tratamento de fibroblastos com 2mM de MCD.
71
- Concentrações de 4mM da substância MCD induzem efeitos mais evidentes sobre a adesão
intercelular e a adesão célula-matriz extracelular em culturas de células musculares
esqueléticas, levando a formação de miotubos mais espessos do que os observados com a
concentração de 2mM de MCD. A expressão das proteínas de adesão vinculina e paxilina
aumenta após o tratamento de células musculares com 4mM de MCD. Já em fibroblastos
expressão da proteína de adesão paxilina aumenta e da proteína de adesão vinculina
diminui após o tratamento com 4mM de MCD.
- A proteína de adesão vinculina e a proteína de micro-domínios caveolina-3 estão presentes
em frações caveolares de músculo esquelético, enquanto as proteínas de adesão FAK, α-
actina e paxilina estão presentes em frações não-caveolares;
- Esses resultados descrevem pela primeira vez as relações entre a disponibilidade de
colesterol membranar e a distribuição e expressão de proteínas de adesão em células
musculares esqueléticas.
72
VI - Bibliografia
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VII- Anexos
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