II
Determinação da freqüência de linfócitos B CD32
+
................................................................... 65
5 - Resposta imune celular no contexto in vitro......................................................66
5.1 - Preparação do Antígeno Solúvel de Leishmania (ASL) utilizado na estimulação das culturas
de CMSP........................................................................................................................................
67
5.1.1 - Obtenção da massa de promastigotas ........................................................................... 67
5.1.2 - Preparo do Antígeno Solúvel de Leishmania (ASL) ....................................................... 68
5.2 - Obtenção de leucócitos do sangue periférico para fenotipagem no contexto in vitro........... 68
5.3 - Ensaio de imunofenotipagem celular e marcação de citocinas intracitoplasmáticas no
contexto in vitro..............................................................................................................................
70
5.4 - Estratégia de análise de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo em culturas de
CMSP.............................................................................................................................................
73
Determinação da freqüência de linfócitos T CD4
+
e linfócitos T CD8
+
expressando citocinas
intracitoplasmáticas (INF-
, IL-4)................................................................................................ 73
6 - Avaliação da produção de óxido nítrico por células mononuclerares do sangue
periférico.................................................................................................................
74
7 - Antigenicidade avaliada através da citometria de fluxo e da Reação de
Imunofluorescência indireta (RIFI) .........................................................................75
7.1 - Pesquisa de anticorpos da classe IgG e subclasses IgG1 e IgG2 pela citometria de fluxo . 75
7.1.1 - Obtenção de formas promastigotas de Leishmania chagasi para utilização como
antígeno......................................................................................................................................
75
7.2 - Preparação das amostras de plasma para avaliação pela citometria de fluxo ..................... 76
7.3 - Metodologia empregada para a avaliação da reatividade de IgG e subclasses IgG1 e IgG2
de cães vacinados a formas promastigotas de L. chagasi............................................................
76
7.4 - Aquisição e análise dos dados da pesquisa de reatividade de IgG e subclasses IgG1 e IgG2
de cães vacinados a formas promastigotas de L. chagasi............................................................
77
8 - Pesquisa de anticorpos da classe IgG pela Reação de Imunofluorescência
Indireta (RIFI) .........................................................................................................79
9 - Análise estatística dos dados............................................................................79
RESULTADOS..........................................................................................................80
I . Cinética do perfil hematológico do sangue periférico canino no contexto ex-
vivo, desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
....81
I.1. Cinética do perfil hematológico desencadeada pela imunização com a
LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
: ênfase em subpopulações leucocitárias. ...82
II . Cinética do perfil imunofenotípico de leucócitos do sangue periférico
canino no contexto ex-vivo, desencadeada pela imunização com a
LEISHVACIN e a LEISHMUNE
®
...............................................................................85
II.1. Cinética do perfil fenotípico de leucócitos do sangue periférico canino,
desencadeada pela imunização com a LEISHVACIN e com a LEISHMUNE
®
:
ênfase na resposta imune inata (NEUTRÓFILOS, EOSINÓFILOS, MONÓCITOS)
...............................................................................................................................86
II.1.1 - Cinética de alterações imunofenotípicas em NEUTRÓFILOS circulantes de cães
submetidos à vacinação.................................................................................................................
86
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em NEUTRÓFILOS.................................................. 86
Percentual de NEUTRÓFILOS MHCI
+
....................................................................................... 87
Percentual de NEUTRÓFILOS MHCII
+
...................................................................................... 87
Percentual de NEUTRÓFILOS CD32
+
....................................................................................... 87
II.1.2- Cinética de alterações fenotípicas em EOSINÓFILOS circulantes de cães submetidos à
vacinação. ......................................................................................................................................
90
Densidade de Expressão de CD18 (IMF) em EOSINÓFILOS................................................... 90
Percentual de EOSINÓFILOS MHCI
+
........................................................................................ 90
Percentual de EOSINÓFILOS MHCII
+
....................................................................................... 90
Percentual de EOSINÓFILOS CD32
+
........................................................................................ 91