( PDF ) Alterações comportamentais e neuroquímicas causadas por compostos orgânicos de selênio

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Naturais e Exatas

Programa de Pós-graduação em Bioquímica Toxicológica

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS

CAUSADAS POR COMPOSTOS ORGÂNICOS DE SELÊNIO

elaborada por

Gabriele Cordenonzi Ghisleni

como requisito parcial para obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica

COMISSÃO ORGANIZADORA:

____________________________________________________

Profº Dr. Diogo Onofre Gomes de Souza

Presidente/ Orientador

____________________________________________________________

Profº Dr. Carlos Alberto Saraiva Gonçalves (UFRGS)

____________________________________________________________

Profª Dra. Susana Tchernin Wofchuk (UFRGS)

____________________________________________________________

Profº Dr. Félix Antunes Soares (UFSM)

____________________________________________________________

Profº Dr. Marcelo Farina (UFSC)

Santa Maria, 22 de novembro de 2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

TOXICOLÓGICA

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E

NEUROQUÍMICAS CAUSADAS POR COMPOSTOS

ORGÂNICOS DE SELÊNIO

TESE DE DOUTORADO

Gabriele Cordenonzi Ghisleni

Santa Maria, RS, Brasil

2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

TOXICOLÓGICA

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E

NEUROQUÍMICAS CAUSADAS POR COMPOSTOS

ORGÂNICOS DE SELÊNIO

Gabriele Cordenonzi Ghisleni

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Toxicológica, Área de Concentração em Bioquímica Toxicológica, da

Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial à

obtenção do grau de

Doutor em Bioquímica Toxicológica.

Orientador: Prof. Dr Diogo Souza

Santa Maria, RS, Brasil

2006

É muito melhor arriscar coisas grandiosas,

alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se à

derrota, do que formar fila com os pobres de

espírito, que nem gozam e nem sofrem muito,

porque vivem nessa penumbra cinzenta que não

conhece vitória nem derrota.

(Theodore Roosevelt)

AGRADECIMENTOS

Ao Diogo, primeiramente pela disponibilidade, confiança e pelas portas abertas em seu

laboratório para o desenvolvimento desta tese. Por ter permitido gozar da sua adorável

companhia, pelas grandes lições de vida e aprendizado ao longo destes anos. Além disso,

agradeço ao Diogo pelo seu lado pai, amigo, companheiro de festas e orientador para todas

as horas.

A Lisi, exatamente por tudo, desde a minha vinda para Bioquímica. Pelos ensinamentos,

confiança, dedicação, ajuda e pela grande amizade, dentro e fora do laboratório. Obrigada

por todo apoio e companheirismo.

A minha maravilhosa família, pela dedicação, incentivo e amor. Em especial à minha mãe,

que nunca me deixou desistir de seguir em frente.

Ao João Batista, que descobri ao longo do doutorado que não era um bicho de sete cabeças,

e sim uma grandiosa contribuição.

Aos meus fiéis amigos desde a época da faculdade, Jean, Dani e Gabi, pela amizade e por

grandes momentos da minha vida, inclusive pela minha vinda a Bioquímica.

A Vanessa, pela grande amizade que se construiu durante estes últimos anos, pela

cumplicidade e ajuda nos trabalhos de comportamento.

A Ana e Renata, pelos bons momentos, apoio e amizade, sem esquecer é claro dos

momentos de desabafo.

Ao Ganzella, pela ajuda, parceria de bancada, amizade e descontração.

A todo o pessoal do laboratório pelo ótimo convívio e clima de trabalho, sem contar dos

diversos momentos de descontração.

Ao Roska, Dioguinho e André, pela divertida convivência, apoio e carinho.

Ao pessoal dos demais laboratórios com quem interagi durante o doutorado, e que de certa

forma contribuíram para este trabalho.

A duas pessoas fundamentais e insubstituíveis, Cléia e Angélica, pela disposição e ajuda.

Ao pessoal do ratário sempre solícito e onde sempre obtive compreensão e animais para a

realização dos experimentos.

RESUMO

ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICAS DE COMPOSTOS

ORGÂNICOS DE SELÊNIO

Autor: Gabriele Cordenonzi Ghisleni

Os compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila (PhSe)

, são

considerados como miméticos da enzima glutationa peroxidase e apresentam propriedades

antioxidantes e antiinflamatórias em diversos modelos de injúria celular. Tendo presente

que as ações farmacológicas do (PhSe)

parecem ser mais proeminentes do que seu análogo

ebselen, o presente estudo foi delineado para avaliar o efeito deste composto na morte

celular e na detecção do imunoconteúdo da enzima oxido nítrico sintase induzível em um

modelo de deprivação de glicose e oxigênio em fatias de hipocampo de ratos. Observamos

que a ação neuroprotetora do composto (PhSe)

foi correlacionada com a supressão do

imunoconteúdo da enzima oxido nítrico sintase induzível, visto que as concentrações do

composto que apresentaram proteção contra a morte celular, também suprimiram o

aumento do imunoconteúdo desta enzima. A ação neuroprotetora do (PhSe)

foi dose

dependente e mais pronunciada do que previamente descrito para o ebselen. Visto que

ambos os compostos ebselen e (PhSe)

, são capazes de modular parâmetros da sinapse

glutamatérgica in vivo e in vitro, e que o composto ebselen apresentou efeito neuroprotetor

em um modelo de toxicidade provocada pelo glutamato seguido de redução na peroxidação

de lipídeos, avaliamos também, neste trabalho, o efeito destes compostos no aumento da

atividade de ectonucleotidases pelo glutamato em culturas de neurônios cerebelares de

ratos. Foi observado que os compostos de selênio não alteram a atividade de

ectonucleotidases, mas previnem a estimulação na hidrólise de ATP e AMP pelo glutamato.

Na tentativa de correlacionar o efeito preventivo dos compostos com sua atividade

antioxidante, comparou-se o efeito do trolox, um antioxidante clássico descrito na

literatura. O trolox de maneira similar aos compostos de selênio também preveniu o

aumento na atividade das ectonucleotidases pelo glutamato. Embora o glutamato não tenha

desencadeado morte celular 24 horas após a prévia exposição das células a este aminoácido,

sugeriu-se que parte da ação do ebselen e (PhSe)

podem estar relacionadas com suas

propriedades antioxidantes. Inferiu-se ainda que a participação de grupos sulfidrila nos

efeitos dos compostos de selênio parece estar envolvida nos seus efeitos neuroprotetores,

uma vez que tanto o aumento na hidrólise dos nucleotídeos quando a morte neuronal pelo

agente alquilante N-ethylmaleimide (NEM) foram prevenidas tanto pelo ebselen quanto

pelo (PhSe)

A co-incubação de NEM e glutamato não modifica o perfil de morte neuronal

e a estimulação da hidrólise de nucleotídeos, com o ebselen e (PhSe)

revertendo

parcialmente o aumento da hidrólise para o ATP e a morte celular. Entretanto, ambos

compostos foram ineficazes em reverter o aumento na hidrólise do AMP causado pela co-

incubação do NEM e glutamato. Portanto, apesar de ambos compostos prevenirem

parcialmente a morte celular evidenciada por estes dois agentes citotóxicos co-incubados, a

ação do ebselen e (PhSe)

parece modular diferentemente estas enzimas. Por meio de

estudos comportamentais com a administração intraperitoneal de (PhSe)

observamos que

este composto não alterou a atividade exploratória dos animais quando avaliados na tarefa

do campo aberto. Porém, nesta tarefa, os animais administrados com 50 µmol/kg de (PhSe)

apresentaram uma diminuição no número de defecações, um comportamento que

corresponde a um primeiro índice de ansiedade intrínseca diminuída dos animais quando

expostos a um ambiente novo. A partir dessa observação, essa dose mais alta não foi

utilizada para os experimentos onde se avalia a consolidação da memória nos animais. Na

tarefa de esquiva inibitória houve uma diminuição no desempenho dos animais tratados

com 25 µmol/kg de (PhSe)

apenas para a consolidação da memória de curta duração, pois

esse efeito supostamente amnésico não foi observado na consolidação da memória de longa

duração. Apesar dos resultados encontrados na tarefa da esquiva inibitória, os mecanismos

envolvidos no efeito amnésico do (PhSe)

não foram explorados. A partir da diminuição do

número de defecações na arena de campo aberto, os animais foram tratados com 50

µmol/kg de (PhSe)

e submetidos a tarefa do labirinto em cruz elevado (Plus Maze), para

melhor caracterizar um possível efeito ansiolítico. Foi possível claramente observar que os

animais tratados com a dose de 50 µmol/kg, apresentaram um comportamento menos

ansioso pela maior permanência nos braços abertos e pelo aumento no número de entradas

nestes braços. Esse efeito foi semelhante ao observado com fármacos que classicamente

possuem ação ansiolítica como o diazepam. Assim, investigou-se a participação de outros

sistemas de neurotransmissores nos efeitos ansiolíticos do (PhSe)

pela administração de

agonistas e antagonistas do sistema GABAérgico e serotoninérgico. Uma vez que

antagonistas para receptores GABA

e 5-HT

2A/C

reverteram a ação ansiolítica do (PhSe)

sugerimos que ambos sistemas de neurotransmissores classicamente envolvidos no

comportamento ansiolítico/ansiogênico participam do efeito ansiolítico deste composto.

Palavras chave: disseleneto de difenila, ebselen, sistemas neurotransmissores,

ectonucleotidases, ansiedade.

ABSTRACT

BEHAVIORAL AND NEUROCHEMISTRY ALTERATIONS OF SELENIUM

ORGANIC COMPOUNDS

Author: Gabriele Cordenonzi Ghisleni

Selenium organic compounds, ebselen and diphenyl diselenide (PhSe)

, are considered

mimics of glutathione peroxidase enzyme and present antioxidants and anti-inflammatory

properties in different models of brain injury. In view of the pharmacological actions of

(PhSe)

seem to be more potent than its analogue ebselen, this study was delineated to

evaluate the effect of this compound on cell death and in immunocontent detection of

inducible nitric oxide sinthase, in a model of oxygen and glucose deprivation in rat

hippocampal slices. We observed that the neuroprotection action of (PhSe)

was correlated

with the suppression on immunocontent of inducible nitric oxide sinthase enzyme. The

neuroprotection action of (PhSe)

was dose dependent and more pronunciated than its

equivalent compound previously described ebselen. Since both compounds, ebselen and

(PhSe)

, are able to modulate some parameters of glutamatergic system in vivo and in vitro,

and the compound ebselen presented neuroprotective effect in a model of glutamate toxicity

following redution on lipid peroxidation, we also evaluated in this work, the effect of these

compounds on increase of ectonucleotidases activities induced by glutamate in rat cultived

cerebellar cells. It was observed that both selenium compounds did not modify the

ectonucleotidases activities, but prevent glutamate stimulation on ATP and AMP

hydrolysis. In the attempt of correlate the preventive effect of these compounds with their

antioxidant activity, we compared the effect of trolox, a classic antioxidant described in

literature. Trolox, similarly to selenium compounds, also prevent the increase on

ectonucleotidases atictivities induced by glutamate. Although glutamate did not unchain

cell death after 24 hours of previous cells exposure to glutamate, it was suggested that part

of ebselen and (PhSe)

action can be related to their antioxidants properties. It was still

inferred that the participation of sulfhidril groups on selenium compounds effects seems to

be involved on their neuroprotective effects, a time that as much the increase on nucleotides

hydrolysis as the neuronal death for alkylant agent NEM were prevented by both

compounds. Co-incubation of NEM and glutamate did not modify the profile of cell death

and nucleotides hydrolysis stimulation, with ebselen and (PhSe)

partially reverting the

increase on ATP hydrolysis and cell death. However, both compounds were ineffective in

revert the increase on AMP hydrolysis caused by co-incubation of NEM and glutamate.

Although both compounds partially prevent cell death evidenced by co-incubation of these

two citotoxics agents, the action of ebselen and (PhSe)

seems differently modulate these

enzymes. Through behavioral studies with intraperitoneal administration of (PhSe)

, we

observed that (PhSe)

did not alter the exploratory activity of animals when evaluated on

open field task. However, in this task, animals administered with 50 µmol/kg of (PhSe)

presented decreased number of defecations, a behavior that correspond at a first index of

diminish intrinsic anxiety in animals displayed for a new environment. From these

observations, the higher dose of (PhSe)

was not used in the experiments where

consolidation memory of animals was evaluated. On the inhibitory avoidance task animals

treated with 25 µmol/kg of (PhSe)

had a diminished performance only for consolidation of

short-term memory, therefore this supposed amnesic effect was not observed on

consolidation of long-term memory. Although the results found on inhibitory avoidance

task, the mechanisms involved on amnesic effect of (PhSe)

were not explored. From the

diminished number of defecations on open field task, the animals were treated with 50

µmol/kg of (PhSe)

and submitted to elevated plus maze task for better characterize a

possible anxiolytic effect. It was possible to observe that animals treated with the dose of

50 µmol/kg, presented less anxious behavior for the higher permanency on open arms and

for the increase on number of entries in open arms. This effect was similar with classical

pharmacological drugs with anxiolytic action as diazepam. Thus, the participation of other

neurotransmitter systems was investigated on anxiolytic effects of (PhSe)

for

administration of agonists and antagonists of GABAergic and serotoninergic system. A

time that antagonists for GABA

and 5-HT

2A/C

receptors reverted the anxiolytic action of

(PhSe)

, we suggest that both classical neurotransmitter systems involved on

anxiolytic/anxiogenic behavior participate of anxiolytic effect of this compound.

Key words: diphenyl diselenide, ebselen, glutamatergic system, purinergic system,

anxiety.

LISTA DE FIGURAS.

Artigo I

Figure 1: Effect of diphenyl diselenide on viability of rat

hippocampal slices submitted to oxygen-glucose deprivation.

Figure 2: Effect of diphenyl diselenide on immunocontent of

iNOS protein in rat hippocampal slices submitted to oxygen-

glucose deprivation.

Artigo II

Figure 1: Effect of glutamate on ecto-nucleotidase activities in

cerebellar granule cells.

Figure 2: Effect of selenium compounds on glutamate-induced

increase of ectonucleotidases activities. Denotes co-incubation of

ebselen and glutamate on ATP and AMP hydrolysis (2a).

Denotes co-incubation of (PhSe)

and glutamate on ATP and

AMP hydrolysis (2b).

Figure 3: Effect of glutamate and/or the antioxidant trolox on

ATP and AMP hydrolysis.

Figure 4: Effect of the alkylating agent N-ethylmaleimide (NEM)

and/or ebselen or (PhSe)

on ATP and AMP hydrolysis.

Figure 5: Effect of co-incubation with glutamate and NEM and/or

ebselen or (PhSe)

on ATP and AMP hydrolysis.

Figure 6: Cell viability assessed 24 hours after nucleotides

hydrolysis assay by MTT. Denotes cell viability on exposure to

glutamate and/or ebselen or (PhSe)

(6a).

Denotes cell viability on exposure to NEM or NEM plus

glutamate, and/or ebselen or (PhSe)

(6b).

Artigo III.

Figure 1: Performance of animals treated with (PhSe)

in the

open field test. Denotes number of crossings (1a).

Denotes number of rearings (1b). 73

Denotes number of fecal boli (1c). 74

Figure 2: Effect of (PhSe)

administered immediately after

training session in a step-down inhibitory avoidance task. Denotes

latency to retention test after 1.5 h of training session (2a).

Denotes latency to retention test after 24 h of training session

(2b).

Figure 3: Effect of (PhSe)

after 24 hours of treatment in the

elevated plus-maze test. Denotes time spent in open or closed

arms (3a).

Denotes number of entries in open or closed arms (3b). 76

Figure 4: Pharmacological manipulation of pentylenetetrazol

(PTZ), diazepam (DZP) and/or (PhSe)

in the elevated plus-maze

test.

Figure 5: Effects of ritanserin and/ or (PhSe)

in the elevated

plus-maze test.

Resultados preliminares

Figura 1: Níveis de lactato no liquor de ratos injetados com uma

única injeção intraperitoneal de ebselen e disseleneto de difenila

após 48 horas do tratamento.

Figura 2: Níveis da proteína S100B no liquor de ratos injetados

com uma única injeção intraperitoneal de ebselen e disseleneto de

difenila após 48 horas do tratamento.

Figura 3: Medida da atividade de ectonucleotidases em fatias de

hipocampo de ratos tratados com uma única injeção de ebselen e

disseleneto de difenila após 48 horas de tratamento (3a,b)

Figura 4: Imunoconteúdo da proteína pré-sináptica SNAP 25 e do

transportador vesicular de glutamato VGLUT1 em fatias

hipocampais de ratos tratados com uma única injeção de ebselen e

disseleneto de difenila após 48 horas de tratamento (4a,b)

LISTA DE TABELAS.

Artigo II

Tabela 1- Effect of ebselen and diphenyl diselenide on ATP and

AMP hydrolysis in cultured cerebellar granule neuron.

Artigo III

Tabela 1- Effects of diazepam (DZP) or pentylenetetrazol (PTZ) on

the anxiolytic-like effect by 50 µmol/ kg diphenyl diselenide in the

elevated plus maze.

Tabela 2- Effects of ritanserin on the anxiolytic-like effect by 50

µmol/ kg diphenyl diselenide in the elevated plus maze.

APRESENTAÇÃO

Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de

artigo, o qual encontra-se no item ARTIGO CIENTÍFICO. As seções Materiais e

Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências Bibliográficas, encontram-se

no próprio artigo e representam a íntegra deste estudo.

Os itens DISCUSSÃO E CONCLUSÕES, encontrados no final desta dissertação,

apresentam interpretações e comentários gerais sobre os artigos científicos contidos neste

trabalho.

As REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS referem-se somente às citações que

aparecem nos itens INTRODUÇÃO, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, DISCUSSÃO

GERAL e CONCLUSÕES desta tese.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS

RESUMO

ABSTRACT vii

LISTA DE FIGURAS ix

LISTA DE TABELAS xi

APRESENTAÇÃO xii

Capítulo I. Introdução

I.1- Introdução 1

Capítulo II. Revisão Bibliográfica

II.1- Selênio 5

II.1.1- A descoberta do selênio 5

II.1.2- O selênio em sistemas biológicos 6

II.1.3- Compostos orgânicos de selênio 7

II.1.3.1- Ebselen 8

II.1.3.2- Disseleneto de difenila (PhSe)

II.2- Sistemas Neurotransmissores 10

II.2.1- Glutamato e seus receptores 10

II.2.2- GABA 11

II.2.3- Serotonina 12

II.3- Ectonucleotidases 13

II.4- Objetivos gerais 16

Capítulo III. Artigo I

Ghisleni, G., Porciúncula, L.O., Cimarosti, H.,

Rocha, J.B.T., Salbego, C.G., Souza, D.O.

Diphenyl diselenide protects rat hippocampal slices

submitted to oxygen-glucose deprivation and

diminishes inducible nitric oxide synthase

immunocontent. Brain Research 986: 196-199

(2003).

Capítulo IV. Artigo II

Ghisleni, G., Porciúncula, L.O., Boeck, C.R.,

Rocha, J.B.T., Souza, D.O. Selenium compounds

counteract the increase of ectonucleotidases

activities in rat cultured cerebellar granule cells:

putative correlation with neuroprotective effects.

Submetido.

Capítulo V. Artigo III

Ghisleni, G., Kazlauckas, V., Both, F.L.,

Pagnussat, N., Rocha, J.B.T., Souza, D.O.,

Porciúncula, L.O. Anxiolytic-like effect of

diphenyl diselenide involves GABA

and

serotonin receptors. Submetido.

Capítulo VI. Discussão geral

Capítulo VII. Conclusões

Capítulo VIII. Resultados preliminares e perspectivas

Capítulo IX. Referências bibliográficas

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

I. Introdução.

O selênio é um elemento traço nutricionalmente essencial para os mamíferos. Na

forma de selenocisteína, este micronutriente se torna constituinte do sítio ativo de muitas

enzimas antioxidantes, como a glutationa peroxidase, fosfolipídeo hidroperóxido glutationa

peroxidase, tioredoxina redutase e seleneproteína P (Flohe et al., 1973; Rotruck et al., 1973;

Chen e Berry, 2003). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a deficiência de

selênio na dieta, está diretamente associada à gênese e/ou progressão de patologias como

distúrbios cardiovasculares, neurológicos, infecções virais, câncer e de humor (Ge e Yang,

1993; Benton, 2001; Navsariwala et al., 2006; Hill et al., 2004; Beck et al., 2003). A

descoberta das propriedades farmacológicas dos compostos orgânicos de selênio bem como

sua menor toxicidade em relação as espécies inorgânicas, tem despertado interesse para a

síntese de novos compostos orgânicos que apresentem potencial terapêutico. Em especial,

os compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila - (PhSe)

, têm sido

investigados pois simulam a ação catalítica da enzima glutationa peroxidase (Müller et al.,

1984; Wilson et al., 1989). Estes compostos apresentam propriedades farmacológicas

benéficas que incluem ações como antioxidantes e antiinflamatórios, prevenindo o dano

celular em diversos modelos de injúrias (Porciúncula et al., 2001; Rossato et al., 2002a;

Porciúncula et al., 2003; Nogueira et al., 2003a).

O estresse oxidativo e o aumento na formação de espécies reativas de oxigênio estão

fortemente implicados em patologias do sistema nervoso central (SNC) tais como: acidente

vascular cerebral, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e epilepsia (Facchinetti et al.,

1998; Pràtico, 2002; Pràtico & Sung, 2004; Schapira, 2006; Liang & Patel, 2006). Dessa

forma um balanço adequado entre a produção de espécies reativas de oxigênio e a ação das

defesas antioxidantes endógenas é de extrema importância para a integridade do sistema

nervoso central, o qual por possuir menor expressão de enzimas antioxidantes e alto

conteúdo lipídico é um dos tecidos mais vulneráveis aos efeitos deletérios do estresse

oxidativo (Ullegaddi et al., 2005; Sultana et al., 2006; Arlt et al., 2002)

Embora o selênio possa apresentar efeitos neuroprotetores tanto em humanos quanto

em modelos experimentais de patologias associadas ao SNC, como parte do sítio ativo de

enzimas antioxidantes, este elemento também é reconhecido pela sua toxicidade quando

administrado em altas doses. Dentre os mecanismos propostos para a toxicidade do selênio

alguns estudos sugerem que ele possa exercer uma ação pró-oxidante pois altas

concentrações podem oxidar grupamentos sulfidrila endógenos e aumentar a formação de

radicais livres (Stewart et al., 1999; Nogueira et al., 2003b).

Neste sentido, considerando que os compostos de selênio, ebselen e (PhSe)

, têm

sido descritos pelos seus efeitos na proteção e toxicidade em sistema nervoso central,

estudos da interação destes compostos com diferentes sistemas neurotransmissores bem

como possíveis mecanismos de ação, podem ajudar no esclarecimento da farmacologia

destes compostos.

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

II.Revisão bibliográfica.

II.1 - Selênio

II.1.1 – A descoberta do selênio e sua utilização.

O elemento selênio foi descoberto em 1817 pelo químico sueco Jöns Jacob

Berzelius e seu nome foi dado em homenagem à Selena, deusa grega da lua, devido a sua

coloração. O selênio é um elemento traço pertencente ao grupo 16 da tabela periódica,

apresentando-se em três formas alotrópicas incluindo selênio cinza, vermelho e preto, e

ocorre em quatro estados de oxidação: seleneto (Se

-2

), selênio elementar (Se

), selenito

(Se

) e selenato (Se

). Na forma elementar o selênio é um semicondutor, e na forma

alotrópica cinza é sensível à luz. Por estas características o selênio exibe propriedade de

transformar energia luminosa diretamente em energia elétrica, e dessa forma tem sido

utilizado extensivamente como células fotoelétricas, fotômeros e células solares. Além

destas aplicações, sua utilização se encontra na fabricação de vidros, nos processos de

reprodução xerográfica, catalisador e como suplemento alimentar. O selênio compartilha

propriedades químicas e físicas com o enxofre. Esta similaridade permite que o selênio

substitua o enxofre, promovendo interações selênio-enxofre nos sistemas biológicos. Por

outro lado, as diferenças nas propriedades físico-químicas entre selênio e enxofre

constituem a base de seus papéis biológicos específicos (Ursini e Bindoli, 1987).

II.1.2- O selênio em sistemas biológicos.

O selênio ocorre naturalmente no ambiente, distribuído irregularmente pelo solo e

encontrado nas rochas sedimentares das regiões mais áridas. No ano de 1930, o selênio foi

reconhecido como uma substância tóxica quando animais que se alimentaram de plantas

com grande potencial de acumular este elemento, apresentaram sintomas de

envenenamento. Foi em 1957 que Schwarz e Foltz identificaram o selênio como um

micronutriente essencial para bactérias, mamíferos e pássaros. Além disso, sua

identificação como parte do sítio ativo da glutationa peroxidase, uma enzima antioxidante

de mamíferos, permitiu que outras selenoproteínas fossem identificadas (Rotruck et al.,

1973; Flohé et al., 1973; Flohé et al., 2000). Estes fatos deram início à busca por compostos

orgânicos e inorgânicos de selênio, e seus efeitos foram estudados pela administração em

animais. No entanto, durante muitos anos os problemas na purificação, o odor desagradável

e a instabilidade de muitos compostos dificultaram sua síntese. Além disso, a síntese de

compostos orgânicos de selênio aumentou consideravelmente devido à menor toxicidade

dos compostos orgânicos em relação aos inorgânicos, embora muitos deles ainda não

tenham sido testados biologicamente (Klayman e Günter, 1973). Nas últimas décadas

estudos de síntese têm sido direcionados para o desenvolvimento de compostos orgânicos

de selênio mais estáveis que possam ser usados como antioxidantes, inibidores enzimáticos,

agentes anti-tumorais e antiinfecciosos, bem como imunomoduladores (Müller et al., 1984;

Wendel et al., 1984; Wilson et al., 1989; Sies e Matsumoto, 1997; Mugesh et al, 2001).

Dentre estes, o desenvolvimento de novos compostos que possuam atividade catalítica

sendo capazes de atuar como enzimas, tem merecido maior destaque.

De fato, alguns compostos orgânicos de selênio já consolidaram o elemento como

um antioxidante por mimetizar as ações da glutationa peroxidase, reduzindo peróxido de

hidrogênio, hidroperóxidos lipídicos e fosfolipídicos. Além das suas propriedades

antioxidantes, os compostos orgânicos de selênio também apresentaram propriedades

antiinflamatórias por reduzir hidroperóxidos intermediários formados na via da

cicloxigenase e lipoxigenase, diminuindo a produção de prostaglandinas e leucotrienos

(Spallholz et al., 1990; Rayman 2000).

O selênio entra na cadeia alimentar através das plantas, que o absorvem do solo. Sua

importância como elemento essencial na dieta foi reconhecida após a descoberta da doença

de Keshan, uma cardiopatia infantil com alta incidência em algumas regiões da China onde

o solo é extremamente pobre em selênio (Ge e Yang, 1993). O consumo diário de selênio

varia entre 100 a 200 µg/ dia, podendo ser encontrado nos seguintes alimentos: castanha-

do-pará, alho, cebola, brócolis, cogumelos, cereais, pescados, ovos e carnes (Dumont et al.,

2006; Reilly, 1996). As espécies de selênio estão distribuídas no organismo em diferentes

órgãos, sendo que grandes quantidades deste elemento estão presentes em ordem de

concentração: nos rins, fígado, baço, músculo cardíaco, pulmão e cérebro (Dumont et al.,

2006). Apesar da concentração de selênio cerebral não se apresentar elevada, este órgão é o

único que mantém um suplemento adequado em caso de deficiência do elemento.

A ingestão adequada de selênio também pode prevenir o surgimento de alguns tipos

de câncer e infecções graves, pois alguns estudos prospectivos demonstraram que a

suplementação de selênio na dieta foi associada à redução na incidência de câncer da

próstata, pulmão e coloretal e na prevenção de infecções virais como o HIV (Patrick, 2004;

Clark et al., 1998; Knekt et al., 1998; Kupka et al., 2004; Broome et al., 2004).

O selênio também exerce influência em patologias associadas aos transtornos de

humor, uma vez que a carência de selênio parece levar a um estado de humor mais

deprimido (Hawkes e Hornbostel, 1996) e o aumento no consumo deste elemento estabiliza

o humor e diminui o estado depressivo e outros sintomas negativos do humor como

ansiedade, confusão e hostilidade (Benton e Cook, 1991, Finley e Penland, 1998). No que

diz respeito às doenças associadas ao envelhecimento, observou-se que níveis séricos

baixos de selênio foram associados à aceleração do declínio cognitivo no decorrer da idade

(Savarino et al., 2001; Akbaraly et al., 2005). Essas observações corroboram com as

alterações metabólicas decorrentes da idade avançada tais como a diminuição na absorção

de micronutrientes, incluindo o selênio. Desta forma, as defesas antioxidantes endógenas

começam a diminuir e dada a susceptibilidade do cérebro ao estresse oxidativo juntamente

com a predisposição genética, surgem as doenças decorrentes do envelhecimento.

II.1.3- Compostos orgânicos de selênio.

Os compostos orgânicos de selênio, ebselen e disseleneto de difenila (PhSe)

, têm

merecido destaque na literatura desde a década de 80 principalmente por serem miméticos

da enzima glutationa peroxidase (Müller et al., 1984; Wendel et al., 1984; Wilson et al.,

1989). Desde então, outras propriedades farmacológicas benéficas foram descobertas tais

como suas ações como antiinflamatórios e antinociceptivos (Parnham et al., 1991;

Nogueira et al, 2003a), crescendo enormemente o número de estudos onde estes compostos

exercem proteção nos mais diversos tipos celulares para os mais diversos tipos de injúria.

Concomitantemente a esses estudos, o risco de contaminação ocupacional por compostos

de selênio tem motivado pesquisas voltadas ao entendimento dos seus efeitos tóxicos.

Alguns estudos mostram que a toxicidade do ebselen e (PhSe)

são bastante

similares, dependendo no entanto, da via de adiministração e do modelo animal utilizado

(Meotti et al., 2003; Nogueira et al., 2003b). Entretanto, quando administrados em doses

farmacológicas, ambos os compostos apresentam baixa toxicidade tanto para ratos como

para camundongos (Nogueira et al., 2004).

II.1.3.1- Ebselen

O ebselen, por suas propriedades antioxidantes e antiinflamatórias, além da baixa

toxicidade, tem sido estudado na prevenção e proteção celular contra os mais diversos tipos

de injúria, utilizando-se de modelos animais, experimentos in vitro e inclusive estudos em

humanos. O ebselen apresentou importantes efeitos como antioxidante na redução da

peroxidação de lipídeos e pelas reações com grupos sulfidrílicos (–SH) em diferentes

tecidos (Sies e Arteel, 2000; Rossato et al., 2002b; Davis et al., 2004; Nowak et al., 2006).

Além disso, a ação antiinflamatória deste composto foi demonstrada pela inibição de

algumas enzimas envolvidas no processo inflamatório e pela redução da síntese e liberação

de citocinas pró-inflamatórias (Parnham et al., 1991; Haddad et al., 2002; Walther et al.,

1999). O ebselen inibe in vivo a formação de leucotrienos sintetizados pela via da

lipoxigenase 5, e em granulócitos inibe a atividade da proteína kinase C (PKC) e da

NADPH oxidase (Schewe et al., 1994; Cotgreave et al., 1989). O ebselen também inibiu in

vivo e in vitro a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), isoforma da óxido nítrico

sintase que torna-se ativa nos processos inflamatórios (Hattori et al., 1994; Porciúncula et

al., 2003).

Este composto apresenta efeitos protetores em diversos modelos de isquemia tais

como: cerebral, cardíaca, hepática e em um modelo in vitro, pela privação de glicose e

oxigênio (Osaki et al., 1997; Takasago et al., 1997; Maulik et al., 1998; Imai et al., 2001;

Porciúncula et al., 2003). O ebselen apresentou neuroproteção em pacientes que sofreram

acidente vascular cerebral isquêmico em um ensaio clínico de fase III (Yamaguchi et al.,

1998), e além disso quando administrado em humanos, diminuiu os déficits neurológicos

provocados por hemorragia de aneurisma subaracnóide (Saito et al., 1998).

Recentemente, estudos têm investigado a habilidade deste composto na supressão de

enzimas envolvidas no processo apoptótico e vias de sinalização, colaborando para a

elucidação de outros mecanismos que possam estar envolvidos nas propriedades

farmacológicas do ebselen (Yoshizumi et al., 2002, 2004; Xu et al., 2006). Em estudos in

vitro com tecidos e células do SNC o ebselen apresentou efeito protetor contra a

excitotoxidade provocada pelo glutamato, bem como demonstrou alterar alguns parâmetros

do sistema glutamatérgico (Porciúncula et al., 2001; Nogueira et al., 2002; Porciúncula et

al., 2004). Além disso, Herin et al. (2001) sugeriu que o efeito neuroprotetor do ebselen em

injúrias provocadas pelo glutamato e seus agonistas, pode ser em parte devido a sua direta

interação com o sítio modulatório redox do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-

aspartato (NMDA). No entanto, este composto quando administrado por infusão direta na

região CA1 do hipocampo prejudica a perfomance dos animais na tarefa de esquiva

inibitória, sugerindo que o ebselen pode prejudicar os processos de aquisição, consolidação

e evocação da memória (Porciúncula et al., 2002).

II.1.3.2- Disseleneto de difenila (PhSe)

O composto (PhSe)

é empregado como intermediário em síntese orgânica,

apresentando síntese mais barata e rentável que seu análogo ebselen (Zeni et al., 2003).

Embora este composto tenha recebido menor destaque, seus possíveis efeitos como

antioxidante e antiinflamatório, tem apresentado maior potência farmacológica do que o

ebselen (Wilson et al., 1989; Rossato et al., 2002a; Nogueira et al., 2003a). O (PhSe)

tem

apresentado pronunciada ação como antioxidante, na redução da peroxidação de lipídeos

provocada por diversos agentes e em diferentes tecidos (Nogueira et al., 2004; Rossato et

al., 2002a; Santos et al., 2004; Posser et al., 2006; Borges et al., 2006). Além disso, a

administração aguda deste composto em ratos e camundongos, apresentou uma atividade

antiinflamatória e antinociceptiva mais potente do que seu análogo ebselen (Nogueira et al.,

2003a).

Em modelos experimentais de injúria no sistema periférico, o (PhSe)

foi eficaz na

redução de lesões hepáticas provocadas por 2-nitropropano, preveniu o aumento na

atividade de enzimas plasmáticas marcadores de lesão hepática e restaurou a atividade de

enzimas antioxidantes como a catalase e superóxido dismutase (Borges et al., 2005, 2006).

Recentes estudos demonstraram ainda que este composto previne o dano oxidativo

induzido por nitroprusiato de sódio em plaquetas humanas e, diferentemente do composto

ebselen, o (PhSe)

foi capaz de reverter as alterações causadas na indução de diabetes,

demonstrando uma propriedade anti-diabetogênica (Posser et al., 2006; Barbosa et al.,

2006).

Alguns estudos, entretanto, relatam que altas doses deste composto, quando

administradas de forma crônica e aguda, levam a deposição de selênio no fígado, rim e

cérebro, chamando a atenção para o potencial tóxico do composto (Jacques-Silva et al.,

2001; Maciel et al., 2003). Através destes estudos se pode observar que (PhSe)

é capaz de

desencadear danos cerebrais em camundongos. O composto (PhSe)

demonstrou ainda

afetar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico em cérebro de ratos in vivo e in vitro

(Nogueira et al., 2001), e em ensaios in vitro com plaquetas humanas (Borges et al., 2004).

O efeito agudo da toxicidade por (PhSe)

foi investigado pelo potencial de indução de

convulsões em camundongos, nos quais a modulação de sistemas neurotransmissores, em

especial moduladores do sistema GABAérgico, preveniram as convulsões (Nogueira et al.,

2003b). Recentes estudos mostraram ainda que em altas doses este composto orgânico de

selênio acelera o início das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), um

antagonista GABA

, e aumenta a incidência de morte nestes animais (Britto et al., 2006).

Estes resultados indicam evidências da modulação pelo (PhSe)

de diferentes sistemas de

neurotransmissores em SNC de ratos.

II.2- Sistemas neurotransmissores

II.2.1- Glutamato.

O aminoácido glutamato é o principal neurotransmissor do SNC de mamíferos. O

glutamato está envolvido em diversas funções cerebrais tais como cognição, aprendizado e

memória e na formação de redes neurais durante o desenvolvimento (Izquierdo e Medina,

1997; Ozawa et al., 1998; Castellano et al., 2001). Alguns estudos têm avaliado o

envolvimento do sistema glutamatérgico na ansiedade. Neste sentido, estudos com

antagonistas de receptores glutamatérgicos têm demonstrado eficácia pela ação ansiolítica

em diferentes modelos animais (Jessa et al., 1996; Fraser et al., 1996). No entanto, Olney e

colaboradores (1970,1978) observaram que altas doses de glutamato e seus agonistas

provocavam dano, e até mesmo morte celular, introduzindo na literatura o termo

excitotoxicidade para a morte neuronal provocada pela estimulação excessiva de receptores

glutamatérgicos.

Os receptores glutamatérgicos estão categorizados em duas classes distintas:

receptores ionotrópicos e metabotrópicos (Osawa et al., 1998). Os receptores ionotrópicos

(iGluR) são assim denominados, pois são canais que permitem a passagem de um cátion

específico quando ativados por um agonista (Ozawa et al., 1998) e foram subdivididos em

N-metil-D-aspartato (NMDA), α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazol-ácido propiônico

(AMPA) e ácido caínico (KA), de acordo com a sensibilidade a estes agonistas. Os

receptores metabotrópicos (mGluR) pertencem a uma família de receptores que estão

acoplados às proteínas ligantes de nucleotídeos da guanina (proteínas G), promovendo

então a modulação de efetores intracelulares que por sua vez ativam e/ou inibem diversos

eventos de transdução de sinal (Conn e Pin, 1997; Osawa et al., 1998).

O glutamato, após ser liberado para o espaço extracelular, e realizar sua ação via

seus receptores, é removido da fenda sináptica principalmente por sistemas de transporte

que são dependentes de sódio, localizados nos neurônios e principalmente nas células gliais

(Anderson e Swanson, 2000; Danbolt, 2001; Amara e Fontana, 2002). A atividade de

alguns receptores de glutamato, em especial o receptor ionotrópico do tipo NMDA, e

alguns mecanismos de captação de neurotransmissores são regulados pelo seu estado redox

(Gozlan e Ben-Ari, 1995; Trotti et al., 1997; Tang e Aizenman, 1993). Um aumento nas

concentrações de glutamato na fenda sináptica leva à estimulação excessiva dos receptores

glutamatérgicos, desencadeando uma cascata de eventos intracelulares que incluem

aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, diminuição nos níveis de enzimas

antioxidantes e maior influxo de cálcio e sódio (Lafon-Cazal et al., 1993; Reynolds e

Hastings, 1995; Singh et al., 2003; Lipton e Rosenberg, 1994). Alguns estudos têm

demonstrado que o tratamento com compostos de selênio restabelece o nível e a atividade

de enzimas antioxidantes, reduz a peroxidação de lipídeos e previne a morte celular em

modelos de toxicidade pelo glutamato e seus agonistas (Porciúncula et al., 2001; Savaskan

et al., 2003).

II.2.2- GABA

O ácido γ-amino-butírico (GABA), principal neurotransmissor inibitório do SNC

adulto é indispensável para o controle de funções do SNC como atividade locomotora,

aprendizado e ritmo circadiano (Varju et al., 2001). O GABA é responsável pelo tônus

inibitório que contrabalança a excitação neuronal. Episódios convulsivos podem ocorrer

pela perturbação nesse balanço inibitório/excitatório (Treiman et al., 2001). O GABA pode

ser liberado do terminal pré-sináptico pelas vesículas sinápticas, um processo que é

dependente de cálcio e estimulado por altas concentrações de potássio. Esse

neurotransmissor pode ainda ser liberado pelo transporte reverso, um processo

independente de cálcio e secundário à despolarização da membrana celular e influxo de

sódio (Treiman et al., 2001). A ação do GABA após liberação dos terminais pré-sinápticos

ocorre em receptores ionotrópicos e metabotrópicos, e termina pela sua rápida recaptação

via transportadores Na

/Cl

dependentes, ligados a membranas pré e pós-sinápticas de

neurônios e também de células gliais (Minelli et al., 1995, 1996).

A ação inibitória do GABA é mediada via a ativação de receptores específicos.

Dentre eles, os receptores ionotrópicos GABA

são constituídos de um complexo de

estrutura hetero-oligômera, cujas subunidades formam um canal de cloreto, o qual, ao

aumentar o influxo, hiperpolariza o neurônio. Estes receptores medeiam a resposta

inibitória rápida e apresentam sítios de ligação para GABA, benzodiazepínicos,

barbitúricos, neuroesteróides, picrotoxina e etanol (Korpi et al., 2002). Os subtipos de

receptores GABA

são formados por diferentes combinações de subunidades, cuja

expressão em diferentes células e regiões de cérebro e propriedades farmacológicas variam

(Korpi et al., 2002). Já os receptores GABA

ligados a proteína G, hiperpolarizam o

neurônio aumentando a condutância de potássio e diminuindo o influxo de cálcio,

desencadeando assim, um efeito inibitório lento. Este receptor é ativado com baixas

concentrações de neurotransmissor, e, portanto agonistas de receptor GABA

, sob certas

circunstâncias, podem ser anticonvulsivantes (Veliskova et al., 1996). A função de cada

receptor ainda não está claramente estabelecida, mas muitos estudos têm apontado para a

importância de algumas subunidades, por exemplo, na regulação da ansiedade e efeitos

colaterais de benzodiazepínicos (Rudolph et al., 1999; Low et al., 2000; Gulinello et al.,

2001).

II.2.3- Serotonina.

O sistema serotoninérgico está envolvido em uma ampla variedade de funções

fisiológicas e comportamentais como o humor, memória, aprendizado, agressão, resposta

ao estresse, sono e termoregulação (Buhot et al., 2000; Ressler e Nemeroff, 2000; Struder e

Weicker, 2001a; 2001b). A disfunção na neurotransmissão serotoninérgica em várias

regiões cerebrais, tem sido relacionada ao desenvolvimento da depressão e ansiedade

(Wrase et al., 2006).

As múltiplas ações da serotonina (5-HT) são explicadas pela sua interação com mais

de um subtipo de receptor. Atualmente, os receptores para a serotonina foram classificados

em sete famílias (5-HT1-7), sendo que algumas classes são ainda dispostas em subclasses

estruturalmente e farmacologicamente distintas (Barnes e Sharp, 1999). A grande maioria

dos receptores de serotonina são metabotrópicos, atuando em proteínas G e estimulando

atividade de fosfolipase e adenilato ciclase, dependendo do subtipo de receptor. Entre os

receptores de serotonina, em especial os 5-HT1A, 2A e 2C, têm sido extensivamente

estudados pelo envolvimento destas subunidades na regulação do humor e ansiedade (Toth,

2003; Van Oekelen et al., 2003). A ativação dos receptores 5-HT1A, via proteína G

sensível à toxina pertussis, decorre na inibição da adenilato ciclase ou pela abertura de

canais de potássio que dessa forma inibem o disparo neuronal (Hensler, 2003). Por outro

lado, a ativação dos receptores 5-HT2A e 5-HT2C acoplados à proteína G para fosfolipase

C e A2, aumentam o acúmulo de fostato inositol e Ca

intracelular, levando a excitação

celular (Van Oekelen et al., 2003).

Estudos farmacológicos têm esclarecido o papel destes receptores em diversos

distúrbios psiquiátricos. Neste contexto, agonistas do receptor 5-HT1A e antagonistas dos

receptores 5-HT2A e 5-HT2C, demonstraram propriedades como antidepressivos (Blier et

al., 1997; Palvimaki et al., 1996). Fármacos que atuam em receptores 5-HT1A, 5-HT2A, 5-

HT2C têm sido revelados em modelos comportamentais condicionados (Bourin e Hascoet,

2001) por suas propriedades como ansiolíticos. No entanto, dados na literatura sobre a

função destes receptores no tratamento da ansiedade, ainda são contraditórios.

II.3- Ectonucleotidases.

A concentração de nucleotídeos presente em um determinado meio biológico é o

resultado do equilíbrio existente entre a liberação destes nucleotídeos e seu metabolismo

através de nucleotidases apropriadas.

Uma vez liberado, o ATP pode interagir com receptores P

(Burnstock e Williams,

2000), ser degradado até adenosina ou servir como substrato para ecto-quinases, durante o

fenômeno de plasticidade sináptica (Vizi e Sperlagh, 1999). Os receptores P

estão

envolvidos na modulação da maioria das ações induzidas pelo ATP, incluindo os efeitos

sobre a transmissão sináptica (Inoue et al., 1992; Inoue, 1998), podendo ser classificados

em duas famílias: receptores P

X e P

Y. Os receptores P

X atuam como canais ionotrópicos

ativados por ATP e estão divididos em sete subtipos (P

). Os receptores metabotrópicos

Y são acoplados a proteínas G e estão divididos nos subtipos P2Y

1,2,4,6,11

(Ralevic e

Burnstock, 1998)

O nucleosídeo adenosina é de importância para a manutenção de uma série de

processos fisiológicos em diferentes tecidos. Devido ao importante papel na modulação da

atividade sináptica, adenosina é descrita como uma substância neuroprotetora e

neuromoduladora em diferentes regiões do SNC de mamíferos (Cunha, 2001).

A adenosina exerce seus efeitos modulatórios através da interação com

purinoreceptores P

. Tais receptores foram identificados e clonados, sendo então divididos

em quatro subtipos: A

, A

(receptores de alta afinidade), A

e A

(receptores de baixa

afinidade). Todos estes receptores são acoplados a proteína G, sendo que os receptores A

, interagem com proteínas G da família G

e G

, enquanto que os receptores A

e A

estimulam a adenilato ciclase através da proteína G

(Klinger et al., 2002). Adicionalmente,

os receptores A

também podem ativar a fosfolipase C através da interação com a proteína

(Klinger et al., 2002). Os efeitos modulatórios de adenosina estão associados com o

subtipo de receptor ativado. Sabe-se que o efeito de inibição da liberação de

neurotransmissores, é mediado pelos receptores A

(Dragunow, 1988; Brundege e

Dunwidie, 1997). O papel neuroprotetor de adenosina em situações patológicas, pode ser

atribuído aos mecanismos de manutenção da homeostase intracelular do cálcio, diminuição

da liberação de aminoácidos excitatórios e manutenção do potencial de membrana

(Rudolphi et al., 1992). Outro aspecto que exemplifica o papel neuroprotetor de adenosina,

é o seu efeito na ativação das enzimas do sistema antioxidante como a catalase, superóxido

dismutase e glutationa peroxidase (Maggirwar et al., 1994).

Portanto, após a liberação e posterior interação com seus receptores específicos

localizados na membrana celular, os nucleotídeos da adenina devem ser posteriormente

metabolizados através da ação de ecto-enzimas, para sua conversão em adenosina. A

degradação seqüencial de ATP extracelular pela “via das ectonucleotidases”,pode resultar

na inativação da sinalização mediada pelo ATP via receptores P

, e contribuir para a

sinalização mediada por adenosina através dos receptores P

(Richardson et al., 1987;

Sebastião et al., 1999). Desta forma, as ecto-nucleotidases constituem um eficiente

mecanismo de controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos no espaço extracelular

(Zimmermann, 1996; Zimmermann, 2001; Robson et al., 2006). Este processo envolve uma

variedade de enzimas, dentre as quais podemos citar: (a) os membros da família das E-

NTPDases (ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase), para a hidrólise de nucleotídeos di-

e trifosfatados, e (b) a 5’-nucleotidase, principal enzima responsável pela hidrólise de

nucleotídeos monofosfatados (Zimmermann, 2001).

A família das E-NTPDases, inclui as ATPases do tipo-E que se caracterizam

principalmente por possuírem atividade dependente de cátions divalentes, serem insensíveis

a inibidores específicos de ATPases do tipo-P (Na

ATPase), tipo-F (ATPase

mitocondrial) e tipo-V (bomba de prótons vacuolar), além de hidrolisarem todos

nucleotídeos di- e trifosfatados, mas não nucleotídeos monofosfatados (Plesner, 1995). Nas

últimas décadas, apirases ou ATP difosfohidrolases (EC 3.6.1.5) têm sido descritas em

diversos tecidos, entre eles tecidos de mamíferos como preparações de SNC e periférico

(Battastini et al., 1991; Bruno et al., 2002; Sarkis & Salto, 1991). Estudos sobre as

NTPDases e seus efeitos na regulação dos níveis de nucleotídeos e seus produtos, indicam

os diferentes papéis fisiológicos desempenhados por estas enzimas, dependendo do tecido

em que se encontram. Em sistema nervoso, as NTPDases possuem um importante papel na

inativação da ação do neurotransmissor ATP através de sua hidrólise seqüencial até o

neuromodulador adenosina (Battastini et al., 1991; Sarkis & Salto, 1991; Zimmermann,

1996). Estas enzimas também tem sido descritas em situações patológicas. Alterações

significativas na atividade da ATP difosfohidrolase foram descritas em hipocampo de ratos

submetidos a episódios isquêmicos (Braun et al., 1998; Schetinger et al., 1998), e em SNC

de ratos após a indução de epilepsia através da administração de diferentes agentes pró-

convulsivantes (Bonan et al., 2000; Bruno et al., 2003).

A ecto-5’-nucleotidase (EC 3.1.3.5) é a principal enzima responsável pela formação

de nucleosídeos extracelulares a partir de nucleotídeos monofosfatados. Apesar da 5’-

nucleotidase possuir habilidade para hidrolisar nucleotídeos como GMP e UMP, o AMP

geralmente é o nucleotídeo hidrolisado com maior eficiênica (Zimmermann, 1996). A

presença desta enzima foi demonstrada em particular, em diferentes regiões de cérebro de

ratos (Cammer et al., 1980; Heymann et al., 1984), estando presente tanto em neurônios,

como em células gliais, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e microglia (Maienschein &

Zimmermann, 1996; Zimmermann, 1996).

Estudos têm demonstrado a expressão da ecto-5’-nucleotidase na superfície de

células neuronais e em sinapses durante o desenvolvimento neuronal (Schoen &

Kreutzberg, 1994). Outros trabalhos ainda mostram que esta enzima desempenha um papel

essencial para a diferenciação e sobrevivência das células neuronais durante seu

desenvolvimento (Heilbronn et al., 1995). O principal papel fisiológico atribuído a ecto-5’-

nucleotidase, é a formação de adenosina a partir do AMP extracelular e a subsequente

ativação dos receptores P

, que em sistema nervoso, resulta principalmente na inibição da

liberação de neurotransmissores excitatórios (Brundege & Dunwidie, 1997). Dessa forma,

alterações na atividade da 5’-nucleotidase tem sido demonstrada em resposta a uma série de

situações patológicas como epilepsia (Bonan et al., 2000; Bruno et al., 2003), isquemia

(Schetinger et al., 1998) e toxicidade pelo glutamato (Boeck et al., 2000; Bruno et al.,

2002).

II.4- Objetivos gerais.

O objetivo do primeiro trabalho desta tese, que constitui o capítulo III, foi verificar

a eficácia do disseleneto de difenila em prevenir a morte celular e o aumento do

imunoconteúdo da oxido nítrico sintase induzível em um modelo experimental de isquemia

in vitro pela deprivação de glicose e oxigênio em fatias de hipocampo de ratos. Além disso,

este trabalho tem a intenção de estabelecer uma comparação da eficácia do disseleneto de

difenila neste modelo com o ebselen a partir de dados já previamente publicados.

No segundo trabalho desta tese, que constitui o capítulo IV, verificou-se a ação do

ebselen e disseleneto de difenila sobre as enzimas responsáveis pela hidrólise extracelular

de nucleotídeos - as ectonucleotidases – em cultura de neurônios cerebelares. Ainda

buscou-se estabelecer uma relação entre os compostos e a ação estimulatória do glutamato

sobre a atividade das ectonucleotidases com a viabilidade neuronal e a participação de

grupos sulfidrilas.

Dada a pequena parcela de estudos abordando parâmetros comportamentais com

disseleneto de difenila, no capítulo V que compreende o terceiro estudo desta tese,

investigou-se o efeito da administração intraperitoneal do disseleneto de difenila sobre

vários parâmetros comportamentais que incluíram: a) testes de aprendizado e memória; b)

avaliações da performance motora e exploratória dos animais; c) avaliação do

comportamento ansiolítico/ansiogênico dos animais. Com este estudo, a partir dos

resultados obtidos, pretendeu-se estabelecer alguma relação por meio de manipulações

farmacológicas com alguns sistemas de neurotransmissão particularmente envolvidos nas

alterações comportamentais observadas pelo disseleneto de difenila.

CAPÍTULO III

Diphenyl diselenide protects rat hippocampal slices submitted to

oxygen-glucose deprivation and diminishes inducible nitric oxide

synthase immunocontent.

Brain Research 986: 196-199 (2003).

Ghisleni, G., Porciúncula, L.O., Cimarosti, H., Rocha, J.B.T., Salbego, C.G., Souza, D.O.*

CAPÍTULO IV

Selenium compounds counteract the increase of

ectonucleotidases activities in rat cultured cerebellar granule

cells: putative correlation with neuroprotective effects.

Submetido a Neurochemistry International

Ghisleni, G., Boeck, C.R., Rocha, J.B.T., Souza, D.O.*, Porciúncula, L.O.

Selenium compounds counteract the stimulation of ectonucleotidases activities in rat

cultured cerebellar granule cells: putative correlation with neuroprotective effects.

Gabriele Ghisleni, Lisiane O. Porciúncula

, Carina R. Boeck

, João B. T. Rocha,

Diogo O. Souza

# *

Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de

Santa Maria, Santa Maria, RS, CEP 97105-900, Brazil.

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, CEP 90035-003, Brazil.

Corresponding author: Diogo Onofre Souza

Address: Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, CEP 90035-003, Brazil.

Fone: +5551 33165557 Fax: +5551 33165540

E-mail: [email protected]

(Diogo O. Souza)

Abstract

The organoselenium compounds, ebselen and diphenyl diselenide (PhSe)

, have been

studied by their antioxidant and anti-inflammatory properties. Ebselen was described to

prevent glutamate-induced lipid peroxidation and cell death in cerebellar granule cells and

both compounds were demonstrated to modify glutamatergic synapse parameters in vitro

and in vivo. Glutamate, an excitatory neurotransmitter involved in pathophisiology of

various brain injuries, was demonstrated to stimulate ectonucleotidases activities in

cerebellar granule cells, producing adenosine, molecule showed to counteract the glutamate

toxicity. In this study, we investigated the effects of ebselen and (PhSe)

on the increase of

ATP and AMP hydrolysis in rat cultured cerebellar granule cells, induced by glutamate and

NEM (a thiol groups alkylant agent). Both organoselenium counteracted these effects.

However, only NEM caused cell death (which was also counteracted by the selenium

compounds), an effect not observed with glutamate (up to 24 h after the treatment). Our

results suggest that selenium compounds can be preventing the increase of

ectonucleotidases activities probably by their antioxidant properties.

Key words: Ebselen, diphenyl diselenide, glutamate, ectonucleotidase, cerebellar granule

cells.

1. Introduction

Organoselenium compounds have been known by their antioxidant properties, being

effective in preventing oxidative stress by detoxifying reactive oxygen species (ROS). In

this context, ebselen is one of the most recognized organoselenium compounds with

antioxidant properties, able to mimic the glutathione peroxidase activity (Müller et al.,

1984; Wilson et al., 1989). As the selenium core in ebselen molecule is not totally

available, this compound has been safely administered in animal models of brain injuries

with pronounced neuroprotective effects (Namura et al., 2001; Takasago et al., 1997). Part

of the neuroprotection conferred by ebselen also involves its anti-inflammatory actions, as

observed in clinical conditions such as acute ischemic stroke, subarachnoid hemorrhage,

acute middle cerebral occlusion, animal models of Parkinson´s disease and brain ischemia

(Yamaguchi et al., 1998; Mouassoui et al., 2000; Imai et al., 2001; Porciúncula et al.,

2003).

Although glutamate is an essential brain excitatory neurotransmitter, it is well

established the role of glutamate in the pathophysiology of brain injuries by over

stimulation of its receptors (Lipton and Rosemberg, 1994; Osawa et al., 1998; Maragakis

and Rothstein, 2004). In fact, high concentration of extracellular glutamate are extremely

toxic to neurons by triggering via overstimulation of its receptors a sequence of cellular

events including oxidative stress, which ultimately leads to neuronal death (Atlante et al.,

2000; Atlante et al., 2001; Sanganahalli et al., 2006; Reynolds and Hastings, 1995).

Moreover, over stimulation of glutamate receptors also promotes an increase in

extracellular ATP levels and subsequently an increase in adenosine levels via sequential

hydrolysis of adenine nucleotides by the ectonucleotidases (E-NTPDases) (Zimmermann,

2006). The most relevant ecto-enzymes involved in this chain are the ecto-nucleoside

triphosphate diphosphohydrolases family (E-NTPDases, including ATP-

diphosphohydrolase), which hydrolyzes nucleoside tri- and di- phosphates, and ecto-5’-

nucleotidase, which hydrolyzes nucleoside monophosphates (Fredholm et al, 2005;

Zimmermann, 2006; Robson et al., 2006). Physiological levels of extracellular nucleotides

and nucleosides are maintained by releasing through particular transporters or via

sequential action of the ectonucleotidases. Importantly, alterations in the activity of these

enzymes have been found in some models of acute brain injury involving over stimulation

of glutamate receptors (Bonan et al., 2000, Bruno et al., 2003, Nedeljkovic et al., 2006).

Likewise, exogenous glutamate modifies the activity of ectonucleotidases in cerebellar

granule neurons and hippocampal slices (Boeck et al., 2000, Bruno et al., 2002).

Ebselen seems to interfere with some parameters of the glutamatergic system

depending on its concentration. Administration of high doses of ebselen inhibited glutamate

release and uptake by rat brain synaptosomes and impaired glutamate uptake into synaptic

vesicle by inhibiting the vesicular H

-ATPase, (Nogueira et al., 2002; Porciúncula et al.,

2004). Conversely, ebselen at low concentrations prevented glutamate-mediated neuronal

death (Porciúncula et al., 2001), and these neuroprotective effects are associated with its

antioxidant and/or anti-inflammatory properties. Recently, some reports have also

evidenced its ability to inhibit alterations in apoptotic pathways, contributing for

elucidating other mechanisms involved in the pharmacological properties of ebselen (Xu et

al., 2006;Yoshizumi et al., 2002; 2004).

In the last years, our group has investigated possible pharmacological properties of

diphenyl diselenide (PhSe)

, another organoselenium compound that hitherto seems to

share most of antioxidant and anti-inflammatory effects with ebselen (Rossato et al., 2002;

Nogueira et al., 2003). Although both compounds displayed beneficial pharmacological

properties when administered at low doses, cellular and molecular mechanisms involved on

the actions of these compounds are still lacking in the literature.

In this study, we evaluated, in cerebellar granule neurons, the effect of ebselen and

(PhSe)

on the basal activity of ectonucleotidases as well as their effects on the stimulation

of ectonucleotidases activities by glutamate and/or N-ethylmaleimide (NEM), since this

type of neurons has a remarkable sensitivity to glutamate toxicity due to a predominant

expression of N-methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate subtype receptor (Llansola et al,

2005). Moreover, these neurons also express ectonucleotidases (Van der Valk et al., 1991;

Resink et al., 1994; Maienschein and Zimmermann, 1996; Wang and Guidotti, 1998; Wink

et al, 2006).

2. Experimental procedures

2.1. Chemicals

Glutamate, nucleotides, ebselen (2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one), trypan

blue, [3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT), malachite

green base, coomassie brilliant blue G were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis,

MO, U.S.A). Trolox was purchased by Aldrich (Milwaukee, WI, U.S.A) and N-

ethylmaleimide (NEM) was from FLUKA (New York, NY, U.S.A). Diphenyl diselenide

was synthesized by the method described previously (Paulmier, 1986). All other chemicals

were of analytical grade.

2.2. Cell Culture

Primary cultures of cerebellar granule cells were prepared from 8-day-old Wistar

rats (Boeck et al, 2000; Porciúncula et al, 2001). Briefly, freshly dissected cerebella were

incubated with 0.025% trypsin solution for 15 min at 37ºC and disrupted mechanically in

the presence of 0.08 mg/ml DNase and 0.05% trypsin inhibitor. The cells were then seeded

at a density of 2.5 × 10

cell/cm

in a 96-well multiwell dish (TPP) coated with 10 µg/ml

poly-D-lysine in minimum essential medium (MEM) containing Earle’s salts (GIBCO)

supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 µg/ml gentamicin and 25 mM KCl. The

growth of non-neuronal cells was inhibited by addition of 20 µM cytosine

arabinofuranoside 18-24 h after seeding and the medium was maintained without change

during the culture period.

2.3. Determination of ectonucleotidase activities

After 8 days in vitro (DIV), culture medium was carefully discarded, and the cell

monolayer was gently washed twice with the reaction medium used to measure ATP

hydrolysis, which consisted of (mM): 20 HEPES/Na

(pH 7.4), 120 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl

10 glucose (Boeck et al, 2000). For AMP hydrolysis assay, the reaction medium used was

the same above except that 2 mM CaCl

was replaced by 2 mM MgCl

The reaction started

by adding ATP or AMP (1mM final concentration) and incubated for 20 min or 10 min,

respectively, at 37ºC, in a final volume of 150 µl/well. The reaction was stopped by

removal of 115 µl aliquot of the assay that was then immediately mixed with 115 µl 10 %

TCA. After centrifugation for 5 min at 12000 × g at 4ºC, the amount of released inorganic

phosphate (Pi) in the medium was measured as described by Chan et al., 1986. Nucleotide

hydrolysis was expressed as percentage of control.

2.4. Experimental design for enzyme assays

In a set of experiments, cells were pre-incubated for 30 min in the presence of 10

µM or 100 µM glutamate. In other set of experiments, 100 µM glutamate was co-incubated

with ebselen (1-10 µM), (PhSe)

(0.3-3 µM) or Trolox (50 µM) for 30 minutes. In another

set of experiments, 10 µM NEM was pre-incubated for 10 min prior to addition of 100 µM

glutamate, in the presence or absence of 3 µM ebselen or 1 µM (PhSe)

As control,

selenium compounds, trolox and NEM were also pre-incubated alone. Selenium

compounds were diluted in 50% ethanol (v/v). Maximal concentration of ethanol in the

medium was 0.25%, which did not interfere in the nucleotide hydrolysis.

2.5. Neuronal viability

Neuronal viability was assessed by exclusion assay with 0.4% trypan blue for 4 min

just at the end of incubation. The number of non-viable (blue stained cells) and viable

(bright cells) cerebellar neurons was counted in at least five randomly fields in duplicate in

phase contrast microscopy. Moreover, neuronal viability was also assessed by MTT method

after 24 hours of incubation period. Briefly, immediately after the assay, the cultures were

replaced with the previously saved culture-conditioned medium in the absence of any drug.

After 24 hours, cultures were incubated for 30 minutes at 37 ºC with 0.5 mg/ml of MTT.

Only metabolically active cells are able to reduce MTT into formazan product soluble in

dimethyl sulfoxide (DMSO). Measurements of formed formazan amounts were performed

at 490 and 630 nm.

2.6. Protein determination

Protein was determined colorimetrically using bovine serum albumin as standard

(Bradford, 1976).

2.7. Statistics

All the assays were carried out in triplicate or quadruplicate and each value is

represented by mean ± S.E.M. of five to nine independent cultures. The significance of the

differences among groups was evaluated by a One-Way analysis of variance (ANOVA)

followed by Duncan’s post-hoc test. Differences were significant for p ≤ 0.05.

3. Results

The effects of organoselenium compounds, ebselen (1-10 µM) and (PhSe)

(0.3-3

µM), on the ectonucleotidase activities are shown in Table 1. Pre-incubation of both

compounds in all concentrations tested had no effect on basal ATP and AMP hydrolysis.

We further investigated whether pre-incubation of both organoselenium compounds could

modulate the glutamate-mediated stimulation of ATP and AMP hydrolysis. Glutamate

stimulated ATP hydrolysis at 10 µM (36% ± 7) and 100 µM (43% ± 9) and AMP

hydrolysis at 10 µM (44% ± 8) and 100 µM (47% ± 9) (Fig. 1). To evaluate if inorganic

phosphate (Pi) release was not related to cell membrane disruption, cells were incubated

with glutamate in the absence of substrates. Neurons incubated with glutamate did not

release Pi (data not shown), suggesting that the effect of glutamate involved the enzyme

activities.

To evaluate if ebselen (1-10 µM) or (PhSe)

(0.3-3 µM) could affect the stimulatory

effect promoted by glutamate, the compounds were co-incubated for 30 minutes in the

presence of 100 µM glutamate. Both selenium compounds abolished the stimulatory effect

(Fig. 2A and B).

Searching for some correlation with the antioxidant properties of these

compounds with the modulation of the ectonucleotidases, we investigated the effect of the

well-known antioxidant trolox. As observed with the selenium compounds, pre-incubation

for 30 min with 50 µM trolox had no effect on basal nucleotides hydrolysis, but prevented

the glutamate-mediated increase of ATP and AMP hydrolysis (Fig. 3).

In order to elucidate the modulation of redox sites by ebselen and (PhSe)

, we

evaluated if the alkylating agent NEM, which irreversibly alkylates thiol groups, could

inhibit the action of selenium compounds on the glutamate effect. Cells were previously

incubated with 10 µM NEM and after 10 minutes selenium compounds were added (Fig.

4). Treatment with NEM alone increased ATP (55.5 % ± 8) and AMP (61 % ± 20)

hydrolysis, and similarly to observed with glutamate, this effect was abolished by ebselen

(3 µM) or (PhSe)

2 (

1 µM). Moreover (Fig. 5), ATP and AMP hydrolysis remained increased

46 % ± 12 and 79 % ± 16, respectively when 100 µM glutamate and 10 µM NEM were co-

incubated. Furthermore, ebselen and (PhSe)

were less effective in preventing the AMP

hydrolysis stimulation by glutamate/NEM.

Finally, we examined cell viability with trypan blue exclusion assay at the end of

incubation period and with MTT 24 h after the incubation. The percentage of cells stained

with trypan blue (non-viable cells) was similar for all groups analysed, ranging from 15%

to 19% (data not shown). Conversely, cell viability assessed 24 hours with MTT (Fig.6)

showed no effect of glutamate during incubation period (Fig. 6A); however, treatment with

NEM or NEM plus glutamate increased the number of non-viable neurons. Interestingly, 3

µM ebselen and 1 µM (PhSe)

, partially protected cultured neurons from NEM and NEM-

glutamate toxicity (Fig. 6B).

4. Discussion

In this study, we aimed to investigate the effects of two organoselenium compounds

on brain ectonucleotidase activities, trying to establish some relationship between the know

beneficial pharmacological properties of these compounds with some parameters of the

purinergic/glutamatergic systems of rat brain. Ebselen or (PhSe)

did not affect the basal

ATP and AMP hydrolysis by ectonucleotidases.

Previous reports from our group showed that glutamate stimulates nucleotides

hydrolysis, an effect that apparently was not correlated to the glutamatergic neurotoxicity

(Boeck et al., 2000). As both organoselenium compounds did not affect basal

ectonucleotidase activities and ebselen prevented glutamate-mediated neuronal death

(Porciúncula et al., 2001), we decide to investigate whether they could modify alterations

caused by glutamate on the nucleotides hydrolysis. Searching for putative mechanisms

involved, we also studied the interaction of selenium compounds and NEM.

As expected, glutamate was able to stimulate the nucleotides hydrolysis albeit in a

lower concentration than previously reported (Boeck et al., 2000). Both organoselenium

compounds were able to counteract this glutamate effect. As we did not observe neuronal

death 24 hours after glutamate exposure, we suppose that this effect exerted by both

compounds could be related to their ability in preventing the first signs of glutamate

neurotoxicity. Furthermore, cellular injuries implicating overstimulation of glutamate

receptors or even neuronal death by exogenous glutamate are prevented by antagonists for

ATP receptors (Volonté and Merlo, 1996; Amadio et al., 2002; Volonté et al., 2003).

Additionally, an increase in the extracellular ATP concentrations has been reported to cause

neuronal death primarily via P2X ionotropic ATP receptors activation (Volonté and Merlo,

1996; Amadio et al., 2002). Thus, an increase in the ectonucleotidases activities induced by

glutamate could be an initial attempt to rescue neurons from toxic effects of ATP by

increasing extracellular adenosine levels. In fact, adenosine is an ubiquitous

neuromodulator in the CNS, but it is also released upon conditions of metabolic stress for

preventing cell damage from excitotoxic conditions (Fredholm et al., 2005), since

adenosine is described to refrain both glutamate release and the activation of NMDA

receptors (Boeck et al., 2000; Latini and Pedata, 2001; Franke et al., 2006). Accordingly, an

increase in nucleotides hydrolysis via up regulation of ectonucleotidases has also been

evidenced in animal models of acute noxious brain conditions such as hypoxia/ischemia,

trauma and epilepsy, where neuronal death observed in these injuries is strictly implicated

with the overstimulation of glutamate receptors (Bonan et al., 2000, Amadio et al., 2002;

Bruno et al., 2003; Volonté et al., 2003; Nedeljkovic et al., 2006; Franke et al., 2006).

Here, we did not address for measurements of oxidative stress immediately after

nucleotidase assays, but we cannot discard that organoselenium compounds could prevent

the increase on nucleotides hydrolysis by glutamate and NEM via their antioxidant

properties. Accordingly, ebselen was described to prevent glutamate-mediated neuronal

death by preventing lipid peroxidation (Porciúncula et al., 2001). Moreover, the well-know

water-soluble antioxidant trolox, described to prevent lipid peroxidation and glutamate-

induced cell death (Sohn et al., 1998; Tirosh et al., 2000), in our study also counteracted

glutamate-mediated increase of nucleotides hydrolysis. Accordingly, hydrogen peroxide

was able to inhibit nucleotidases activities (Vietta et al., 1996) and by triggering oxidative

stress enhances the production and actions of adenosine in the kidney via ecto-5’-

nucleotidase, as a form to protect from cell injuries (Chen et al., 2001).

The alkylating agent NEM also increased nucleotides hydrolysis, but differently

from glutamate, NEM caused some degree of neuronal death after 24 hours, probably by

impairing the physiological redox status of proteins. Both organoselenium compounds were

able to counteract NEM-mediated increase of nucleotides hydrolysis. Otherwise, as the

organoselenium compounds were only partially effective, it suggests that other mechanisms

besides alkylation of thiol groups could be involved in NEM deleterious effects.

Interestingly, co-incubation with glutamate did not modify the pattern either of nucleotides

hydrolysis or neuronal death by NEM. Although both organoselenium compounds

prevented the increase of ATP and AMP hydrolysis stimulated by glutamate or by NEM

incubated alone, when both agents were incubated together the selenium compounds were

totally ineffective on the AMP hydrolysis. This topic deserves further investigation.

Finally, our data indicate that ebselen and (PhSe)

did not modify the basal

ectonucleotidases activities but they counteracted the stimulation of the ectonucleotidases

activities by two cytotoxic agents, probably by their antioxidant properties. Furthermore, in

our assays the 5’-nucleotidase activity was more susceptible to the effects of NEM and

glutamate co-incubation than E-NTPDases, suggesting different modulatory aspects of

these two enzymes.

The relevance and precise mechanisms involved in the observed effects of ebselen

and (PhSe)

on neural ectonucleotidases need to be more investigated. Both compounds

might be exerting their pharmacological properties by modulating essential enzymes for the

maintenance of normal function of purinergic/glutamatergic signaling interaction.

Acknowledgements

This study was supported in part by grants from Brazilian National Research

Council CNPq, CAPES and PRONEX. Another part of study was supported by FAPERGS

(Proc. Nº 0521850 to Lisiane O. Porciúncula) and Grants from L´oreal Prize “Women in

Science 2006” (Lisiane O. Porciúncula). Gabriele Ghisleni is supported by a CAPES

fellowship.

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Tab.1: Effect of ebselen and diphenyl diselenide on ATP and AMP hydrolysis in cultured

cerebellar granule neuron.

Groups ATP AMP

Control 20.0 ± 2.8 27.0 ± 3.6

Vehicle (Ethanol 0.25%) 18.3 ± 2.4 28.0± 3.7

Ebselen 1µM 20.0 ± 2.5 28.7 ± 3.6

Ebselen 3µM 18.3 ± 2.7 27.5 ± 3.8

Ebselen 10 µM 21.0 ± 3.8 30.0 ± 3.8

PhSe)

0.3 µM 20.5 ± 3.4 27.5 ± 3.7

(PhSe)

1 µM 19.5 ± 2.9 28.7 ± 2.9

(PhSe)

3 µM 18.0 ± 3.0 27.5 ± 3.0

Data are mean ± S.E.M. for six separate experiments (nmol Pi/ min/ mg of protein).

Legends

Fig. 1. Effect of 10 and 100 µM glutamate on ecto-nucleotidase activities in cerebellar

granule cells. Cultures were pre-incubated in the presence or absence (control group) of

glutamate for 30 min, and further evaluated for ATP and AMP hydrolysis. Values are mean

± SEM of six experiments independents. Control group: 100% (dotted line).

* p < 0.01 denotes a significant difference from control group.

Fig. 2. Effect of selenium compounds on glutamate-induced increase of ectonucleotidases

activities. (A) Co-incubation of ebselen (1-10 µM) and 100 µM glutamate on ATP and

AMP hydrolysis; (B) co-incubation of (PhSe)

(0.3-3 µM) and 100 µM glutamate on ATP

and AMP hydrolysis. Values are mean ± SEM from six independents experiments. Control

group: 100% (dotted line).

* p < 0.01; ** p < 0.05 from all other groups.

Fig. 3. Effect of glutamate (100 µM) and/or the antioxidant trolox (50 µM) on ATP and

AMP hydrolysis. Values are mean ± SEM from five independents experiments. Control

group: 100% (dotted line).

* p < 0.01; ** p < 0.05 from all other groups without asterisk.

Fig. 4. Effect of the alkylating agent N-ethylmaleimide (NEM -10 µM) and/or ebselen (3

µM) or (PhSe)

(1 µM) on ATP and AMP hydrolysis. Values are mean ± SEM from nine

independents experiments. Control group: 100% (dotted line).

* p < 0.05 from all other groups without asterisk.

Fig. 5. Effect of co-incubation with glutamate (100 µM) and NEM (10 µM) and/or ebselen

(3 µM) or (PhSe)

(1 µM) on ATP and AMP hydrolysis. Values are mean ± SEM from nine

independents experiments. Control group: 100% (dotted line).

* p < 0.05 from all other groups without asterisk.

Fig. 6. Cell viability assessed 24 hours after nucleotides hydrolysis assay by MTT: (A)

denotes cell viability on exposure to glutamate (100 µM) and/or ebselen (10 µM) or

(PhSe)

(3 µM); (B) denotes cell viability on exposure to NEM (10 µM) or NEM plus

glutamate (100 µM), and/or ebselen (3 µM) or (PhSe)

(1 µM). Values are mean ± SEM

from six independents experiments. Control group: 100% (dotted line).

# p < 0.001 from control groups.

* p < 0.05 from all other groups.

Fig. 1.

100

125

150

175

Glu 10 Glu 100

ATP

AMP

% of nucleotide hydrolysis

Fig 2.

Glu

u+Eb

100

125

150

175

ATP

AMP

% of nucleotide hydrolysis

Glu

(Ph

)

Glu

+ (P

100

125

150

175

ATP

AMP

% of nucleotide hydrolysis

Fig. 3:

lu 10

rolox + Glu Trolo

100

150

200

ATP

AMP

% of nucleotide hydrolysis

Fig. 4:

Glu

NEM +

+ (P

100

150

200

ATP

AMP

% of nucleotide hydrolysis

Fig. 5:

Glu

+ Glu

NEM + Glu

+ Eb

NEM +

+ (

100

150

200

250

ATP

AMP

% of nucleotide hydrolysis

Fig. 6:

Glu 100 Glu+eb 10 Glu+(PhSe)2 3

100

125

(A)

Cell vialbility (%)

NEM

+eb

EM+(P

)

NEM+Glu

NEM

Glu+eb 3

M+

+(P

)

100

125

(B)

% of cell viability

CAPÍTULO V

Anxiolytic-like effect of diphenyl diselenide involves

GABA

and serotonin receptors.

Submetido a Behavior Brain Research

Gabriele Ghisleni

*, Vanessa Kazlauckas, Fernanda L. Both, Natália Pagnussat,

João Batista T. Rocha

, Diogo O. Souza and Lisiane O. Porciúncula.

Anxiolytic-like effect of diphenyl diselenide involves GABA

and serotonin

receptors

Gabriele Ghisleni

*, Vanessa Kazlauckas, Fernanda L. Both, Natália Pagnussat, João

Batista T. Rocha

, Diogo O. Souza and Lisiane O. Porciúncula.

Departamento de Química, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de

Santa Maria, Santa Maria, RS, CEP 97105-900, Brazil.

Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal

do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, CEP 90035-003, Brazil.

Running title: Anxiolytic effects of diphenyl diselenide

Pages: 27

Number of figures: 11

* Corresponding author. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de

Ciências Básicas da Saúde, Departamento de Bioquímica, 90035-003, Porto Alegre/ RS,

Brazil. Voice: +55 51 33165557; fax: +55 51 33165540

E-mail: [email protected]

(Gabriele Ghisleni)

Abstract

Diphenyl diselenide (PhSe)

is a selenium organic compound, which may protect

cell damage due to its anti-inflammatory and antioxidant properties. However, studies on

behavioural alterations by (PhSe)

are under investigation yet. In this study, adult male

Wistar rats were administered with (PhSe)

(1, 5, 25 and 50 µmol/ kg, i.p) and further

submitted for analysis in the elevated plus maze and inhibitory avoidance task. Animals

treated with all doses of (PhSe)

did not show alterations on the locomotor and exploratory

activities, as evaluated in the open field arena. For inhibitory avoidance task, 25 µmol/ kg

(PhSe)

impaired short-term memory with no effect on long-term memory. However, in the

open field arena was noticed that 50 µmol/ kg (PhSe)

decreased number of fecal bolus.

Likewise, as a sign of anxiolytic behaviour 50 µmol/ kg (PhSe)

increased time spent and

number of entries in the open arms when assessed in the elevated plus maze. The

anxiolytic-like effect by (PhSe)

was reversed by pentylenetretazol (PTZ, GABA

receptors antagonist) and ritanserin (serotonin receptors antagonist). Thus, GABAergic and

serotoninergic systems seem to be involved in the anxiolytic-like effect by (PhSe)

Therefore, our data suggest another pharmacological property for (PhSe)

besides its

antioxidant and anti-inflammatory actions. Finally, administration of (PhSe)

may have a

possible relevance in the management of psychiatric disorders including anxiety.

Key Words: open field, diphenyl diselenide, anxiety, elevated plus maze, GABA, serotonin.

1. Introduction

Selenium is an essential trace element nutritionally important to mammals, with

physiological roles as a structural component of antioxidant enzymes including glutathione

peroxidase and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase [30,36]. Selenium has

provided protection against cell damage triggered by reactive oxygen species (ROS), being

effective in the treatment of brain disorders where oxidative stress is strongly implicated

[9,34]. Studies have reported that insufficient selenium intake impairs some aspects of

psychological functioning and selenium supplementation was found to be associated with

an improvement in mood and depression status [4,5].

Diphenyl diselenide (PhSe)

is a selenium organic compound with glutathione

peroxidase-like activity (Wilson et al., 1989). Antioxidant properties of (PhSe)

involve its

ability to prevent lipid peroxidation [2,29,31]. Besides its antioxidant activity, acute

administration of (PhSe)

also promotes anti-inflammatory and antinociceptive actions,

being more potent than its better tolerated analogue ebselen [22]. Likewise, neuroprotective

effects afforded by (PhSe)

were correlated with the decrease of inducible nitric oxide

synthase immunocontent (iNOS) in a model of in vitro ischemia, reinforcing the

relationship between its protective effects and anti-inflammatory properties [13,28].

Besides its beneficial pharmacological properties, (PhSe)

at high concentrations

has also a neurotoxic potential [20,24], since it promotes seizures, accelerates the onset of

pentylenetetrazol-induced seizures, leading to death [6,21]. Some neurotransmitters such as

γ-aminobutyric acid (GABA) seem to be involved in these effects, since treatment with

GABA modulators minimized or even abolished (PhSe)

-induced seizures [23]. GABA and

serotonin receptors are strongly involved in learning and memory processes as well as in

the regulation of fear and anxiety [7,8,25].

Given that ebselen shares the same pharmacological properties of the (PhSe)

and it

was described to impair learning and memory tasks in rats at high doses [27], we decided to

evaluate the effects of the intraperitoneal administration of (PhSe)

on behavioural tests in

rats.

Our results demonstrated that intraperitoneal administration of (PhSe)

altered

behavioural parameters involved in learning and memory and promoted anxiolytic effects

via serotoninergic and GABAergic systems.

2. Methods

2.1. Chemicals

Diphenyl diselenide (PhSe)

was synthesized as previously described [26].

Pentylenetetrazol (PTZ), ritanserin and Tween 20 were obtained from Sigma (St. Louis,

MO, USA). All other chemicals were of analytical grade. Except (PhSe)

and ritanserin, all

drugs were diluted in saline (0.9 % i.p). (PhSe)

was diluted in 10 % Tween 20 and

ritanserin in 10 % DMSO. Control animals were administered with 10 % Tween, 10 %

DMSO. Both vehicles did not show any effect on the behavioural tasks.

2.2. Animals

Male adult Wistar rats (280-350 g) were kept under a 12:12 h light: dark cycle at a

temperature of 22°C. They were housed in plastic cages (five animals per cage) with tap

water and commercial food ad libitum. The animals were acclimated for one hour before

the experiments. The animals were firstly analysed in the open field arena and one week

later in the elevated plus maze apparatus. Another set of animals was used for the inhibitory

avoidance tasks and interactions between drugs in the elevated plus maze analysis. The

doses and time of treatments were chosen according with biochemical alterations

previously reported [19,21].

2.3. Inhibitory avoidance (IA)

The IA apparatus was a 50 x 25 x 25 cm acrylic box whose floor consisted of

parallel stainless steel bars (1 mm diameter) spaced 1 cm apart. A 7-cm wide, 2.5-cm high

platform was placed against the left wall of the box. In the training sessions, animals were

kindly placed on the platform and the latency to step-down onto the floor with the four

paws was measured with an automatic device; immediately after stepping-down animals

received a 0.5 mA, 2 s foot shock. In test sessions, carried out 1.5 h (short term memory,

STM) and 24 h (long term memory, LTM) after training, no foot shock was given and the

step-down latency (180 s ceiling) was taken as a measure of memory. Intraperitoneal (i.p)

injection of vehicle or (PhSe)

(1, 5 and 25 µmol/ kg) was performed immediately after

training session. Data for inhibitory avoidance are shown as median values (interquartile

ranges) of training and test latencies to step down on the grid. Comparisons between groups

were performed using Kruskal-Wallis analysis of variance.

2.4. Exploration of an open-field

To evaluate putative effects of (PhSe)

the locomotor activity, animals received a

single injection of (PhSe)

(5, 25 or 50 µmol/ kg i.p) and they were submitted to an open

field arena 30 minutes or 24 hours after treatment. Animals were placed in a 50 X 25 X 50

cm chamber made of brown polywood with a frontal glass wall. The floor of the open-field

was divided into 12 equal squares by black lines. Animals were allowed to explore the

arena during 5 minutes. The number of crossings, rearings and fecal boli denotes

respectively: locomotor activity, exploratory behaviour and some sign of anxiety. Data are

presented as means ± S.E.M. of crossings, rearings and fecal boli.

2.5. Elevated plus-maze

Animals were injected with (PhSe)

(5, 25 or 50 µmol/ kg, i.p) or vehicle and

analysis in the elevated plus maze was performed 30 minutes or 24 hours after injection.

Another group of animals was pre-administered with a single injection of (PhSe)

(50 µmol/

kg, i.p) and 24 hours after they received a single dose of PTZ (30 mg/ kg, i.p) or ritanserin

(2 mg/ kg, i.p). After 30 minutes of administration for both drugs, the animals were

submitted to elevated plus maze session. As a positive control of the task, animals received

diazepam (1mg/ kg, i.p) (an anxiolytic drug) 15 minutes before session.

The elevated plus-maze apparatus consists of two 30 x 5 cm

open arms and two 30 x

5 x 15 cm

closed arms, with an open roof, arranged such that the two arms of each type

were opposite each other. All sessions were conducted under dim red light. During 5

minutes of session, the following indexes of anxiety behaviour were measured: number of

entries into, time spent (in seconds) in open and closed arms and rearings.

2.6. Statistical analysis

The values are mean ± S.E.M. of 10-15 animals. Differences between groups were

evaluated by ONE-WAY ANOVA followed by appropriated pos-hoc tests. Differences

were considered significant for p < 0.05.

3. Results

3.1. Open field session.

(PhSe)

in all doses administered (5, 25 and 50 µmol/ kg), 30 min or 24 hours

before open field arena session, did not affect the number of crossings and rearings (Figs. 1

a, b). However, 50 µmol/ kg (PhSe)

decreased the number of fecal boli compared to

control group when assessed 24 hours after administration, a result that indicates a possible

anxiolytic effect (Fig. 1c) [10,12].

3.2. Inhibitory avoidance task.

Based upon results from Fig. 1c, we did not use purposely 50 µmol/ kg (PhSe)

, to

try avoid any interferences in the inhibitory avoidance task, even though the suspected

anxiolytic action was just evident after 24 hours of treatment. In order, (PhSe)

(1, 5 and 25

µmol/ kg i.p) was administered immediately after training session, a classical protocol to

assess putative effects on memory consolidation [17,37]. The latency to step-down was

evaluated 1.5 hours (STM) and 24 hours (LTM) after a single dose of (PhSe)

. We can

observe that 1 and 5 µmol/ kg (PhSe)

did not alter performance of animals when evaluated

either 1.5 or 24 hours after training session (Fig. 2 a, b). However, 25 µmol/ kg (PhSe)

impaired performance of animals only 1.5 h after administration, a period that corresponds

to analysis of STM (Fig. 2a). Conversely, the same dose was devoid of effect when animals

were submitted to testing session 24 hours after administration of (PhSe)

(Fig. 2b).

3.3. Elevated Plus maze analysis.

As firstly observed in the open field arena, 50 µmol/ kg (PhSe)

decreased number

of fecal boli 24 hours after administration, which may be considered as a first index of

anxiolytic behaviour in rats [10,12]. Number of rearings remained unchanged in all doses

tested (data not shown), confirming that (PhSe)

did not impair the exploratory activity of

the animals.

Based on these results, we decided to investigate the effects of (PhSe)

(5, 25 and 50

µmol/ kg) in the elevated plus maze performance, since this apparatus is widely used for

measuring anxiolytic/ anxiogenic behaviours [18]. After 30 minutes of administration,

(PhSe)

had no effect on plus maze performance (data not shown). However, 24 hours after

treatment from all doses tested, just the animals that received 50 µmol/ kg (PhSe)

spent

more time and increased the number of entries in the open arms, a typical anxiolytic

behaviour (Fig. 3 a, b).

As the results from Figs. 1 and 3 suggest anxiolytic-like effect of (PhSe)

, further

experiments were performed to investigate neurotransmitter systems strictly involved in the

anxiety behaviour such as GABA and serotonin. Thus, animals were pre-treated with 50

µmol/ kg (PhSe)

and 24 hours after they received a single injection of the antagonist for

GABA

receptors, PTZ (30 mg/ kg) or a serotonin receptors antagonist ritanserin (2 mg/

kg). As a positive control, diazepam (GABA

agonist, 1 mg/ kg) was used 15 minutes

before test. As expected, diazepam administered 15 min before the task, increased the time

spent in the open arms and also abolished the anxiogenic effect of pre- administration of

PTZ (Fig. 4). In a similar way, pre-treatment with 50 µmol/ kg (PhSe)

had the same

anxiolytic profile of diazepam, since the time spent in the open arms was the same for both

drugs. Moreover, pre-treatment of animals with 50 µmol/ kg (PhSe)

prevented the

anxiogenic effects mediated by subsequent PTZ administration (Fig. 4). Other parameters

analysed in the elevated plus maze were not modified by (PhSe)

(Table 1).

Finally, we investigated the involvement of serotonin receptors on the anxiolytic

effects of 50 µmol/ kg (PhSe)

by administrating ritanserin, a selective antagonist for 5-

2A/2C

receptors. Pre-administration of (PhSe)

was devoid of anxiolytic effect when

ritanserin was further administered, since the number of entries and time spent in the open

arms returns to control or ritanserin values (Fig. 5). All other data of elevated plus maze are

shown in Table 2.

4. Discussion

Although diphenyl diselenide (PhSe)

shares most of pharmacological properties

with ebselen, this selenium organic compound has been poorly studied so far. Recent

evidences have pointed that (PhSe)

seems to be more potent than ebselen taking into

account antioxidant and anti-inflammatory actions [13,22,31]. Although (PhSe)

had also

conferred neuroprotection in some models of cellular injury, its effects on behavioural

parameters are under investigation yet.

Our data showed that (PhSe)

in all doses tested did not modify the locomotor

activity and exploratory behaviour in adult male rats, since there was no difference in the

number of crossings and rearings in the open field arena. Both parameters deserve attention

in the behavioural analysis of new drugs since any change on the locomotor activity of the

animals usually may non-specifically affect other behavioural tasks. In addition, offsprings

from females treated with (PhSe)

presented locomotor alterations [11], but in our study it

was not the case.

Given the importance of glutamate homeostasis for the maintenance of the normal

brain functions such as learning and memory [16], it was previously observed that

administration of 25 µmol/ kg (PhSe)

modified some features of the glutamatergic

neurotransmission, as inhibition of glutamate and MK-801 binding in membrane brain

preparations [21]. Here, animals treated with the same dose presented a decline in the

performance of inhibitory avoidance task only 1.5 h after training session. We did not

explore the mechanisms involved in this impairment of STM by (PhSe)

but we speculated

that it could be related to alterations in the activity of essential enzymes involved in the

consolidation of STM. In this context, (PhSe)

was able to inhibit GMP-PNP binding [21],

a GTP analogue that modulates G-proteins activities, which are strictly linked to a variety

of signal transduction systems for many receptors involved in the consolidation of memory.

Differently from STM, consolidation of LTM requires a number of precisely timed

molecular processes, involving phosphorylation of the transcriptions factors, gene

activation and protein synthesis. Thus, both processes can be evaluated in the same task,

but they correspond to different cellular events [16]. Our data are in agreement with others

showing that a wide variety of substances from agonists/antagonists receptors to enzyme

modulators can specifically and differently modulate STM and LTM in animals submitted

to the same task [16,37,38]. Effects of (PhSe)

on STM might also characterize only a

transitory effect of this compound, since the amnesic effect was not extended up to LTM.

The most important finding of our study was the pronounced anxiolytic-like

behaviour promoted by 50 µmol/kg (PhSe)

, initially evidenced by a decrease on the

number of defecations. In fact, this observation prompted us to devote more investigation

on anxiolytic action by (PhSe)

, because the number of defecations usually presents a slight

increase when animals are exposed to a new environment.

To better characterize the anxiolytic-like effect of (PhSe)

we matched well-

recognized drugs that selectively modulate GABA and serotonin receptors,

neurotransmitters systems strictly involved in the anxiolytic/anxiogenic responses [25].

Noteworthy, administration of PTZ did not achieve anxiogenic effect in rats pre-treated

with (PhSe)

. In addition, (PhSe)

presented similar anxiolytic pharmacological features as

diazepam, a benzodiazepine drug used as a control in this study with well-described

anxiolytic action. Therefore, one of the mechanisms involved in the anxiolytic-like

behaviour by (PhSe)

seems to be the modulation of GABAergic system. Once more,

GABAergic system seems participates of effects mediated by (PhSe)

, since seizures

induced by high concentrations of this compound were prevented by diazepam,

phenobarbital and muscimol [23]. Likewise, (PhSe)

increased the potency of PTZ-induced

seizures and mortality in mice [6].

In order, similar effects were observed with ritanserin, a serotonin receptor

antagonist clinically used for treatment of anxiety. Although there are some discrepancies

whether acute administration of ritanserin may causes anxiolytic, anxiogenic or no effect at

all (3,14,35), in our study ritanserin did not affect the performance of rats in the elevated

plus maze task, but precluded anxiolytic-like behaviour caused by (PhSe)

Altogether, the anxiolytic effects observed after 24 hours of (PhSe)

administration

seem to indicate the participation of GABAergic and serotoninergic systems. Both systems

present a complex interaction in the hippocampus, where serotonin modulates GABAergic

neurotransmission in specific interneurons [15].

The anxiolytic-like effect caused by (PhSe)

in our study is shared with a wide

range of anxiolytic drugs such as benzodiazepines, which presents common side effects as

sedation and amnesia [1,32,33]. However, (PhSe)

did not cause undesirable effects such

as impairment on the locomotor and exploratory activity in animals.

The mechanisms underlining the beneficial pharmacological properties of (PhSe)

remain still under investigation, with main focus on its anti-inflammatory and antioxidant

properties. Our data suggest that (PhSe)

could be useful for some psychological disorder

involving anxiety, even so the correlation between amnesic and anxiolytic effects of

(PhSe)

is a topic that deserves more investigation. Undoubtedly, binding studies would be

useful to further clarify molecular mechanisms involved in this anxiolytic-like effect by

(PhSe)

. Given that interactions at multiple receptors (D

, 5-HT

, GABA, NMDA) seem to

be the key factors that vary the effectiveness of novel anxiolytic drugs with minimum side

effects, we suggest that (PhSe)

may be a novel potential anxiolytic drug.

Acknowledgements

This study was supported in part by grants from Brazilian National Research

Council CNPq, CAPES and PRONEX. Another part of study was supported by FAPERGS

(Proc. Nº 0521850 to Lisiane O. Porciúncula) and Grants from L´oreal Prize “Women in

Science 2006” (Lisiane O. Porciúncula). Gabriele Ghisleni is supported by a CAPES

fellowship.

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Table 1

Effects of diazepam (DZP) or pentylenetetrazol (PTZ) on the anxiolytic-like effect by

50 µmol/ kg diphenyl diselenide in the elevated plus maze.

Groups Time spent in closed

arms (%)

Nº entries open arms Nº entries closed arms

Control (Tween 10%)

83 ± 3.6 3.5 ± 0.7 6.4 ± 0.9

PTZ (30mg/ Kg)

92 ± 1.7 2 ± 0.4 4.5 ± 0.9

(PhSe)

50 / PTZ

87.5 ± 3.4 2.8 ± 0.8 6.2 ± 0.8

(PhSe)

62 ± 9 5.9 ± 1.1 * 5.9 ± 0.9

PTZ / DZP

73 ± 10 3.4 ± 1 3.5 ± 0.6

DZP (1mg/ Kg)

40 ± 13 ** 3.3 ± 1.2 2.4 ± 1 *

The data are expressed as percentage or number of means ± S.E.M. from 10-15 animals.

* p < 0.05 and ** p < 0.001 compared with control values.

Table 2

Effects of ritanserin on the anxiolytic-like effect by 50 µmol/ kg diphenyl diselenide in the

elevated plus maze.

Groups Time spent in closed

arms (%)

Nº entries open arms Nº entries closed arms

Control (DMSO 10%)

72 ± 9.6 4 ± 0.8 5.8 ± 1.2

Ritanserin (2mg/ Kg)

87 ± 2.7 2.4 ± 0.5 8.3 ± 1

(PhSe)

50 / Ritanserin

86 ± 5 2.3 ± 0.8 6.4 ± 1.3

(PhSe)

56 ± 5 7.8 ± 0.8 * 5.9 ± 1

The data are expressed as percentage or number of means ± S.E.M. from 10 animals for

each group. * p < 0.01 compared with control values.

Legends

Fig. 1. Performance of animals treated with (PhSe)

(5, 25 and 50 µmol/ kg, i.p) in the open

field test during 5 minutes observation period. (a) denotes number of crossings; (b) denotes

number of rearings; (c) denotes number of fecal boli. Behavioural analysis were performed

after 30 min (white bars) and 24 hours (black bars) of treatment with (PhSe)

. Each column

represents means ± S.E.M from 8-12 animals.

* p < 0.01 denotes a significant difference from control by using One-way ANOVA

followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.

Fig. 2. Effect of (PhSe)

(1, 5 and 25 µmol/ kg, i.p) administered immediately after training

session in a step-down inhibitory avoidance task. (a) denotes latency to retention test after

1.5 h (STM) of training session; (b) denotes latency to retention test after 24 h (LTM) of

training session. Data are expressed as medians (interquartile ranges) (in seconds) from 10

animals for each group.

* p < 0.01 indicates a significant difference in retention test performance from control

group by using Kruskal-Wallis followed by Dunn pos hoc test.

Fig. 3. Effect of (PhSe)

(5, 25 and 50 µmol/ kg, i.p) after 24 hours of treatment in the

elevated plus-maze test. Each column represents means ± S.E.M. from 10-15 animals for

each group. (a) data are presented as percentage of the time spent in open or closed arms;

(b) data are presented as number of entries in open or closed arms.

* p < 0.01 denotes a significant difference from control by using One-Way ANOVA

followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.

Fig. 4. Pharmacological manipulation of pentylenetetrazol (PTZ, 30 mg/ kg, i.p), DZP (1

mg/ kg, i.p) and/or (PhSe)

(50 µmol/ kg, i.p) in the elevated plus-maze test. Data are

represented as percentage of time spent in the open arms. (PhSe)

was administered 24

hours before all drugs and behavioural analysis. PTZ was administered 30 minutes before

test session. Diazepam was administered 15 minutes after PTZ administration. Each

column represents means ± S.E.M. from 10-15 animals for each group.

* p < 0.01; p < 0.001 denotes a significant difference from control; ** p < 0.05; p < 0.001

denotes a significant difference from DZP and (PhSe)

respectively; # p < 0.001 denotes a

significant difference of PTZ from (PhSe)

and DPZ. Statistical analysis was performed by

using One-Way ANOVA followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.

Fig. 5. Effects of ritanserin (2 mg/ kg, i.p) and/ or (PhSe)

(50 µmol/ kg, i.p) in the elevated

plus-maze test. Data are percent time spent in open arms. (PhSe)

was administered 24

hours before test. Ritanserin was administered 30 minutes before test. Each column

represents means ± S.E.M. from 10 animals for each group.

* p < 0.01 denotes a significant difference from control; # p < 0.01 denotes a significant

difference from other groups. Statistical analysis was performed by One-Way ANOVA

followed by Newman-Keuls Multiple Comparison test.

Fig. 1

Control

5 25 50

24 hours

30 min

(a)

(PhSe)2 µmol/ kg

number of crossings

Control

5 25 50

(b)

(PhSe)2 µmol/ kg

number of rearings

Control 5 25 50

(c)

(PhSe)2 µmol/ kg

number of fecal bolus

Fig. 2

Control 1 5 25

100

150

200

(PhSe)2 µmol/ kg

test 1.5 hours

training

(a)

Latency (s)

Control 1 5 25

100

150

200

(PhSe)2 µmol/ kg

test 24 hours

training

(b)

Latency (s)

Fig. 3

Control 5 25 50

100

Time spent in open arms

Time spent in closed arms

(PhSe)2 µmol/ kg

(a)

Time spent in arms (%)

Contol 5 25 50

Entries in open arms

Entries in closed arms

(b)

(PhSe)2 µmol/ kg

Number of entries

Fig. 4

trol

(Ph

)

(Ph

+DZ

Time spent in open arms (%)

Fig. 5

trol

(

Time spent in open arms (%)

CAPÍTULO VI

DISCUSSÃO GERAL

VI. Discussão geral.

A discriminação das propriedades farmacológicas e do potencial tóxico dos

compostos orgânicos de selênio tem sido tema de muitos estudos nos mais diversos

sistemas biológicos. Neste trabalho, procurou-se estudar os mecanismos celulares

envolvidos nos seus efeitos neuroprotetores seja pelas suas ações antioxidantes e

antiinflamatórias ou por meio de outros sistemas biológicos que participam dos eventos de

neurotoxicidade. De fato, ainda é pouco o conhecimento sobre outros mecanismos celulares

e moleculares (por exemplo, sistemas de neurotransmissores) que possam participar das

propriedades farmacológicas benéficas e até mesmo da toxicidade que esses compostos de

selênio apresentam. Esse é especialmente o caso para o disseleneto de difenila, o composto

orgânico de selênio que foi o principal objeto de estudo deste trabalho.

Portanto, na tentativa de conhecer um pouco mais sobre seus efeitos e mecanismos

de ação, dada a sua maior potência como antioxidante e antiinflamatório quando

comparado ao seu análogo ebselen (Wilson et al., 1989; Rossato et al., 2002a,

Nogueira et

al., 2003a), tendo em vista dados anteriores do nosso grupo com o composto de selênio

ebselen (Porciúncula et al., 2003), investigamos o efeito do (PhSe)

sobre a morte celular

induzida por deprivação de glicose e oxigênio em fatias de hipocampo de ratos, bem como

a correlação com o imunoconteúdo da oxido nítrico sintase induzível (iNOS). Nosso

trabalho primeiramente comprovou que a deprivação de glicose e oxigênio acarreta cerca

de 50 % de perda na viabilidade das fatias e aumenta nitidamente o imunoconteúdo da

oxido nítrico sintase induzível. O (PhSe)

previne a morte celular e suprime a indução dessa

isoforma da oxido nítrico sintase quando administrado durante a deprivação de glicose e e

oxigênio seguida do período de reoxigenação. Concomitantemente, (PhSe)

suprimiu o

aumento do imunoconteúdo da oxido nítrico sintase induzível. Esse efeito foi dependente

da concentração do composto utilizada, apresentando efeito máximo nas concentrações de

1 e 3 µM. Nas concentrações mais baixas observamos que além do composto não prevenir a

morte celular, este também não foi capaz de suprimir o aumento do conteúdo da óxido

nítrico sintase induzível (iNOS). Esses resultados, quando comparados aos dados

previamente observados pelo nosso grupo, sugerem que os efeitos do (PhSe)

foram mais

potentes do que o seu análogo ebselen no mesmo modelo experimental de injúria,

analisando a oxido nítrico sintase induzível (Porciúncula et al., 2003). Além disso, com este

trabalho nós demonstramos pela primeira vez que este outro análogo de selênio menos

estudado também parece exercer seu efeito neuroprotetor por diminuir o imunoconteúdo da

iNOS, evidenciando seu potencial antiinflamatório e com maior potência que o ebselen.

Portanto, sugere-se que em outras condições patológicas no SNC onde ocorre o aumento

na produção de óxido nítrico por esta enzima, a eficácia do (PhSe)

também possa ser

observada.

Nossos resultados também são compartilhados por outros dados na literatura em que

o (PhSe)

parece apresentar maior potência em exercer seus efeitos antiinflamatórios do que

o ebselen (Nogueira et al., 2003a). A administração de doses mais baixas de (PhSe)

foram

eficazes ainda na prevenção da peroxidação de lipídios, induzida por nitroprussiato de

sódio e ácido quinolínico (Rossato et al., 2002a). No entanto, ambos os compostos inibem a

atividade de enzimas fundamentais para a manutenção da homeostase celular pelo controle

dos gradientes iônicos das membranas, tais como a Na

-K

ATPase (Borges et al., 2005).

Em contrapartida, em injúrias provocadas pelo glutamato, o composto ebselen, demonstrou

um potencial neuroprotetor reduzindo a peroxidação de lipídeos em cultura de neurônios de

cerebelo (Porciúncula et al., 2001). Nesse contexto, na tentativa de investigar o potencial

farmacológico destes compostos sob outros parâmetros, no capítulo IV, verificamos o

efeito do ebselen e (PhSe)

na modulação do sistema purinérgico e glutamatérgico.

Nossos resultados mostram que os compostos de selênio por si só, não alteram a

atividade de ectonucleotidases em cultivo de neurônios de cerebelo de rato. Estes resultados

nos possibilitaram investigar o efeito destes compostos na modulação das ectonucleotidases

pelo glutamato. Verificamos neste trabalho, que o glutamato em concentrações

relativamente mais baixas daquelas citadas na literatura (Boeck et al., 2000), promove um

aumento na hidrólise de ATP e AMP, e que ambos os compostos, ebselen e (PhSe)

quando co-incubados com glutamato neutralizam esse efeito, retornando a hidrólise de

nucleotídeos aos valores de controle. Embora estudos tenham relatado efeitos tóxicos do

glutamato nas mesmas concentrações utilizadas neste trabalho, salientamos aqui que nossas

condições de incubação priorizaram a melhor atividade das ectonucleotidases. Dessa

maneira, não observamos morte celular após 24 horas do período de incubação com

glutamato, provavelmente devido a não estimulação dos receptores glutamatérgicos,

associados ao desencadeamento do processo de morte celular. Entretanto, em injúrias

celulares onde a estimulação dos receptores de glutamato está envolvida, antagonistas de

receptores para o ATP protegem do dano celular e concomitantemente, o aumento nas

concentrações extracelulares de ATP promove a morte celular primeiramente pela ativação

dos receptores ionotrópicos P2X (Volonté and Merlo, 1996; Amadio et al., 2002; Volonté

et al., 2003). Presumimos assim, que o aumento na hidrólise de nucleotídeos via a cadeia

extracelular de ectonucleotidases, pode ser uma tentativa inicial de proteger os neurônios

dos efeitos tóxicos do glutamato, pela formação extracelular de adenosina a partir do ATP.

No entanto, visto que resultados prévios do nosso grupo em cultivo de neurônios

cerebelares, demonstraram uma redução pelo ebselen na peroxidação de lipídeos induzida

pelo glutamato, sugerimos que o efeito dos compostos de selênio na prevenção do aumento

na hidrólise de ATP e AMP, podem estar relacionados a suas propriedades antioxidantes.

Além disso, estudos relataram que o estresse oxidativo produzido pelo glutamato foi

independente da ativação dos seus receptores (Herrera et al., 2001). Nesse sentido, testamos

ainda o antioxidante trolox, conhecido pela eficácia na toxicidade pelo glutamato (Sohn et

al., 1998; Tirosh et al., 2000), e observamos que da mesma forma que o ebselen e (PhSe)

este antioxidante preveniu o aumento na hidrólise de ATP e AMP.

Exploramos também neste trabalho o possível envolvimento de grupos sulfidrila,

utilizando um agente alquilante de grupos -SH, N-ethilmaleimida (NEM). Este composto

aumentou a hidrólise de ATP e AMP, mas diferentemente do glutamato, desencadeou a

morte celular após 24 horas de exposição. Ambos os compostos reverteram parcialmente do

dano celular e do aumento na hidrólise de nucletídeos, sugerindo que outros mecanismos

além da alquilação de grupos tióis possam estar envolvidos. No entanto, a co-incubação de

NEM e glutamato não modificou o padrão da atividade das ectonucleotidases e da morte

celular, mas o efeito dos compostos parece ser distinto para ambas as enzimas. Os

resultados mostram que ebselen e (PhSe)

preveniram parcialmente a hidrólise de ATP,

mas não foram eficazes sobre a hidrólise de AMP. Nossos dados indicam que os compostos

de selênio previnem o aumento na atividade das ectonucleotidases promovida por estes dois

agentes citotóxicos provavelmente devido a suas ações como antioxidante, mas com

diferentes respostas destas enzimas. Além disso outros mecanismos podem ser investigados

para melhor esclarecer o efeito dos compostos orgânicos de selênio.

A participação de sistemas neurotransmissores nas ações de ambos os compostos de

selênio também vem sendo investigada pelo nosso grupo com resultados interessantes. O

glutamato apresenta menor ligação aos seus receptores em membranas sinápticas de

animais previamente administrados com disseleneto de difenila (Nogueira et al., 2001). Em

relação ao ebselen, esse composto em altas concentrações inibiu a captação vesicular de

glutamato por comprometer a atividade da H+-ATPase, a enzima presente nas vesículas

sinápticas responsável pela captação de neurotransmissores e a formação do gradiente de

prótons entre as membranas das vesículas, como também inibiu a liberação e captação de

glutamato em preparações de sinaptossoma (Porciúncula et al., 2003; Nogueira et al.,

2002). Parte desses estudos pode explicar o efeito amnésico observado pelo ebselen quando

administrado por infusão no hipocampo em ratos (Porciúncula et al., 2002). Entretanto,

para o disseleneto de difenila estudos dessa magnitude avaliando vários parâmetros

comportamentais em animais adultos ainda não foram realizados.

Considerando que modificações em diversos sistemas de neurotransmissores se

refletem em alterações comportamentais e o ebselen parece caracterizar esse conceito,

decidimos investigar se a administração do (PhSe)

poderia acarretar de alguma forma

alterações comportamentais. No capítulo V, investigamos o efeito do (PhSe)

em diferentes

tarefas comportamentais. Nesse trabalho, quando administramos intraperitonealmente

(PhSe)

em diferentes concentrações, verificamos que este composto não alterou o

comportamento exploratório e a locomoção dos animais quando avaliados na arena de

campo aberto. No entanto, uma significativa diminuição no número de defecações nos

animais tratados com (PhSe)

nos indicou uma primeira evidência de efeito ansiolítico desta

droga. É bastante conhecido que os animais ao serem expostos a um ambiente novo

apresentem um ligeiro aumento no número de defecações, que é característico de um tênue

comportamento ansioso dos animais nos primeiros instantes em explorar o ambiente novo.

Essa observação foi levada em consideração quando foi feita a escolha de doses para a

análise da performance dos animais na tarefa de esquiva inibitória. Nessa tarefa qualquer

interferência que possa se refletir na atividade motora ou exploratória dos animais pode

induzir a erros de interpretação da performance dos animais na esquiva. Portanto, para os

estudos onde se pretendeu avaliar o aprendizado e a memória dos animais, optamos por não

administrar a maior dose. Desta forma, a fim de evitar qualquer interferência na tarefa de

esquiva inibitória, excluímos a dose de (PhSe)

responsável pelas alterações no número de

defecações. Na esquiva inibitória, a dose mais alta de (PhSe)

comprometeu somente a

memória de curta duração (1.5 h), porém este efeito não se manteve quando os animais

foram submetidos à sessão de teste para a memória de longa duração (24 h). Sabe-se que a

formação da memória de curta e longa duração envolve diferentes eventos celulares

(Izquierdo et al., 2006), e apesar de não termos explorado os mecanismos envolvidos no

comprometimento da memória de curta duração induzida pelo (PhSe)

, sugerimos que este

composto possa estar relacionado com a alteração de enzimas essenciais para a

consolidação dessa memória.

A indicação do efeito ansiolítico do (PhSe)

na tarefa do campo aberto, foi

comprovado quando os animais foram testados no labirinto em cruz elevado (Plus-Maze).

De fato, o (PhSe)

apresentou um pronunciado efeito ansiolítico, semelhante ao que se

observa com a administração de benzodiazepínicos, pois a administração de diazepam

utilizada como controle da tarefa promoveu efeito ansiolítico bastante similar ao (PhSe)

Para tentar caracterizar esse efeito ansiolítico, utilizamos drogas que modulam

seletivamente sistemas de neurotransmissores particularmente envolvidos na ansiedade tais

como o sistema GABAérgico e serotoninérgico. Nossos resultados mostraram uma possível

participação dos sistemas GABAérgico e serotoninérgico na ação ansiolítica do (PhSe)

pois o efeito ansiolítico deste composto

não se manifestou com o tratamento de antagonistas

dos receptores GABA

e 5-HT

2A/C

. Além disso, a ação ansiogênica pela administração de

doses não convulsivantes de pentilenotetrazol não foi observada nos animais previamente

tratados com (PhSe)

. A interação do (PhSe)

com o sistema GABAérgico observada neste

estudo, já foi demonstrada em outras abordagens, onde moduladores do sistema

GABAérgico são capazes de reverter o efeito convulsivante do (PhSe)

(Nogueira et al.,

2003b). No entanto, os eventos responsáveis pela interação do (PhSe)

com estes receptores

devem ser posteriormente melhor explorados na tentativa de esclarecer os mecanismos

moleculares envolvidos no efeito ansiolítico, por exemplo, por meio de estudos com

técnicas de “binding” ou medidas eletrofisiológicas.

De qualquer modo, esse efeito ansiolítico do (PhSe)

, demonstrado neste trabalho,

caracteriza pela primeira vez na literatura uma nova propriedade farmacológica para esse

composto. Além disso, mesmo que ele comprometa a memória esse efeito parece ser

transitório pois não foi refletido na memória de longa duração dos animais. De qualquer

modo, esse efeito aparentemente amnésico, está de acordo com outras drogas

reconhecidamente ansiolíticas e amplamente utilizadas até o momento, como é o caso dos

benzodiazepínicos que afetam a memória de trabalho. Finalmente, cabe ressaltar que apesar

deste possível efeito secundário amnésico o composto não altera a atividade exploratória e

locomotora dos animais.

CAPÍTULO VII

CONCLUSÕES

VII. Conclusões.

A partir dos resultados obtidos nos três trabalhos que perfazem essa tese pode-se

sugerir que o disseleneto de difenila parece apresentar maior potência nas suas propriedades

farmacológicas que o seu análogo mais estudado ebselen.

Os resultados com (PhSe)

apontaram uma ação mais potente como neuroprotetor e

antiinflamatório no mesmo modelo de injúria celular do que seu análogo ebselen.

Ambos compostos de selênio, ebselen e (PhSe)

, foram eficazes em reverter o efeito

estimulatório do glutamato na hidrólise de nucleotídeos da adenina, ATP e AMP. Estes

compostos apresentaram ainda uma ação neuroprotetora, frente ao dano celular provocado

pelo agente alquilante NEM, e do mesmo modo preveniram o aumento na hidrólise de

nucleotídeos induzida por este agente. Esses resultados sugerem mais uma vez o

envolvimento do efeito antioxidante destes compostos na modulação de sistemas

neurotransmissores em SNC.

Finalmente, nesta tese foi apresentada pela primeira vez uma outra possível

propriedade farmacológica do (PhSe)2 como uma droga com potencial ansiolítico com

ausência de efeitos secundários no que diz respeito à locomoção e atividade exploratória

dos animais. Além disso, o seu efeito amnésico transitório é similar aos efeitos secundários

já descritos por drogas ansiolíticas que já estão disponíveis. A participação de sistemas

neurotransmissores clássicos nos efeitos ansiolíticos observados pelo (PhSe)

sugere que

este composto possa ser mais bem estudado na tentativa de descobrir outras possíveis

propriedades farmacológicas até então desconhecidas.

CAPÍTULO VIII

DADOS PRELIMINARES E

PERSPECTIVAS

VIII. Dados preliminares e perspectivas.

Tendo em vista que os dois compostos orgânicos de selênio apresentados nesta tese,

apresentaram efeito neuroprotetor por suas propriedades antioxidantes e antiinflamatórias, e

particularmente o disseleneto de difenila apresentou efeito ansiolítico, torna-se necessária

uma investigação mais detalhada sobre os mecanismos envolvidos nesses efeitos. Portanto,

uma abordagem experimental que permita investigar a participação de sistemas de

neurotransmissores, bem como proteínas com funções essenciais para a manutenção do

funcionamento normal das sinapses, podem ser ferramentas que permitam uma melhor

compreensão dos efeitos benéficos desses compostos sobre o sistema nervoso central. Além

disso, torna-se relevante uma correlação dos efeitos comportamentais causados pela

administração dos compostos de selênio com diversos parâmetros neuroquímicos para que

possamos melhor entender seu mecanismo de ação. Finalmente, estudos mais aprofundados

de viabilidade celular, medidas do metabolismo intermediário e marcadores periféricos de

injúria no sistema nervoso central podem auxiliar a estabelecer o limite de administração

desses compostos para que predominem seus efeitos neuroprotetores sobre os efeitos

neurotóxicos.

Para continuidade deste trabalho propomos a investigação dos seguintes aspectos

que já apresentam alguns resultados:

- Estabelecer se o tratamento agudo com ebselen e (PhSe)

alteram os níveis periféricos de

alguns marcadores de lesão cerebral como a proteína S100B e NSE, bem como os níveis de

lactato em amostras de liquor e plasma.

Paralelamente, avaliar atividade das

ectonucleotidases em fatias hipocampais dos animais tratados com ambos compostos.

- Avaliar se os compostos orgânicos de selênio apresentam efeitos neuroprotetores na

neurotoxicidade pelo peptídeo beta-amilóide em culturas de neurônios de hipocampo.

Correlacionar esse possível efeito neuroprotetor com suas propriedades antioxidantes e

antiinflamatórias.

- Investigar se o potencial antiinflamatório já descrito por estes compostos pode ser

observado na inflamação induzida por lipopolissacarídeo, avaliando parâmetros como a

ativação e recrutamento da microglia, e correlacionar com medidas dos níveis de citocinas

pró-inflamatórias, como as interleucinas e fator de necrose tumoral.

Resultados preliminares.

Dosagem de lactato.

1. Níveis de lactato no liquor de ratos injetados com uma única injeção intraperitoneal de

ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas do tratamento.

Control Eb 10 Eb 75 Ph 5 Ph 75

µmol/kg

mmol/L

Dosagem de S100 B.

2. Níveis da proteína S100B no liquor de ratos injetados com uma única injeção

intraperitoneal de ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas do tratamento.

Controle Eb 10 Eb 75 Ph 5 Ph 75

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

µmol/kg

Liquor S100B levels

(

g/L)

Atividade das ectonucleotidases.

3. Medida da atividade de ectonucleotidases em fatias de hipocampo de ratos tratados com

uma única injeção de ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas de tratamento.

Ct 10 25 50 75

ATP

ADP

AM P

Ebselen µmol/kg

(a)

nmol Pi/ min/ mg of protein

Ct 5 10255075

ATP

ADP

AM P

(PhSe)2 µmol/kg

(b)

nmol Pi/ min/ mg of protein

Imunodetecção da proteína pré-sináptica SNAP-25 e do transportador vesicular de

glutamato VGLUT-1.

4. Imunoconteúdo da proteína pré-sináptica SNAP 25 e do transportador vesicular de

glutamato VGLUT1 em fatias hipocampais de ratos tratados com uma única injeção de

ebselen e disseleneto de difenila após 48 horas de tratamento.

SNAP25

5 10 75 75

100

150

(PhSe)2

(a)

µmol/ Kg

VGLUT1

510 7575

100

150

200

(PhSe)2

Ebselen

µmo l / k g

(b)

% of density unit lines

CAPÍTULO IX

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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