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LUANA RISSI SILVA
Produção experimental de inoculantes agrícolas á
base de Azospirillum spp. para Fixação Biológica
de Nitrogênio em gramíneas e Forrageiras
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/IPT/I.BUTANTAN para obtenção
do título de Mestre em Biotecnologia
Área de concentração
Biotecnologia
Orientador
Dr. José Geraldo da Cruz Pradella
São Paulo 2006
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
AGRADECIMENTOS
Ao professor Doutor José Geraldo da Cruz Pradella pela orientação, aprendizado e
amizade ao longo destes anos.
Á memória do Professor Luiz Carlos Urenha, pelo estímulo e críticas.
Aos pesquisadores do Centro de Biotecnologia Industrial pela assitência e amizade.
Aos funcionários do Laboratório de Fermentação Industrial (LFI) pelo auxílio e
colaboração, em especial, ao Régis Norberto de Carvalho e Walter de Oliveira.
Á mestre Marilda pelas sugestões e críticas que muito me influenciaram.
A professora Doutora Vera Lúcia Baldani pelo fornecimento das cepas de
Azospirillum e o insentivo para realização dos ensaios.
A ajuda paciente da minha mãe que agüentou folhas de rascunho espalhadas pela
casa, arengas sobre canetas que tinham sumido, e as numerosas vezes que me apossei
do computador.
Ao Bruno pelo carinho, amor e paciência nos momentos difíceis.
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Em especial a Cristina, Vinícius, Marcelo, Cecília, Fernanda Matias e as colegas da
salinha, Tatiana Strelec, Sra, Caulkins e Cristiane Ottoni. pela amizade, carinho e
imprescindível colaboração para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo (IPT), pelo suporte
técnico e físico.
À Secretaria de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
USP/IPT/I.BUTANTAN pelo auxílio prestado no decorrer do mestrado.
Ao
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
auxílio concedido.
A Todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste trabalho.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Abstract
1 Introdução 1
2 Revisão Bibliográfica 4
2.1 Bactérias associadas às plantas 4
2.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas 6
2.3 A Revolução Verde 9
2.4 Fixação Biológica de Nitrogênio 11
2.5 Diazotrofos associativos 14
2.5.1 Endofíticos facultativos 15
2.5.2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas 16
2.5.3 Resposta da planta à inoculação de Azospirillum spp 18
2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio 23
3 Produção de Inoculantes para a FBN à base de Azospirillum 37
3.1 Fontes de Carbono 28
3.2 Fontes de Nitrogênio 34
4 Objetivos 42
5 Materiais e métodos 43
5.1 Microrganismo 43
5.2 Meios de cultura 43
5.2.1 Soluções-estoque 43
5.2.2 Solução salina 44
5.2.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo 45
5.2.4 Meios de cultura sólidos para preparo do inóculo 46
5.2.5 Meios de cultura líquido 46
5.3 Ensaios em incubador rotativo 47
5.3.1 Equipamento 47
5.3.2 Preparo do Pré-inóculo 48
5.3.3 Preparo do inóculo 48
5.3.4 Inoculação dos frascos 48
5.3.5 Inoculação e amostras 48
5.3.6 Determinações efetuadas 49
5.4 Ensaios em fermentador, processo descontínuo 49
5.4.1 Equipamento 49
5.4.2 Preparo do inóculo 50
5.4.3 Inoculação do fermentador 50
5.4.4 Amostragens 50
5.4.5 Determinações efetuadas 50
5.5 Métodos de análises 51
5.5.1 Determinação de Absorbância (A) 51
5.5.2 Concentração Celular Mássica (X) 52
5.5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas 52
5.5.4 Concentração de Frutose, Sacarose, Etanol, Glicerol e Lactato (S) 52
5.5.5 Avaliação da concentração de Nitrogênio Amoniacal 54
5.5.6 Avaliação da concentração de Fósforo 55
5.6 Cálculo dos Parâmetros Cinéticos 57
5.7 Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios 58
6 Resultados e discussão 60
6.1 Meios sólidos 60
6.2 Fontes de nitrogênio 60
6.3 Ensaios em incubador rotativo 61
6.3.1 Frutose 62
6.3.2 Glicerol 63
6.3.3 Sacarose 63
6.3.4 Lactato 64
6.3.5 Etanol 65
6.4 Observações gerais 71
6.5 Ensaios em biorreator 74
6.5.1 Glicerol 76
6.5.2 Frutose 79
6.5.3 Sacarose 81
6.5.4 Etanol 83
6.6 Comparação entre os ensaios (biorreator) 85
6.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC) 89
6.7.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A. lipoferum 91
6.7.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para A. brasilense 95
7 Conclusões 100
8 Referências Bibliográficas 104
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy, 2004) 7
Figura 2.2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e
projeções do Banco Mumdial e da FAO
(modificado de Mann, 1997) 10
Figura 2.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson &
Cox, 2000) 13
Figura 3.1 Metabolismo central do carbono em Azospirillum 33
Figura 5.1 Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das ams 51
Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E
1
(Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e
E
6
(Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 66
Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E
1
(Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e
E
6
(Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 67
Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E
1
(Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e
E
6
(Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 68
Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio
Amoniacal e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E
1
(Azbr01a
(♦) e Azbr01b (■)) e
E
6
(Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitador
rotativo 69
Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal
e pH dos ensaios em duplicata nos experimentos E
1
(Azbr01a (♦) e
Azbr01b (■)) e
E
6
(Azlp01a (○) e Azlp01b (∆)), em agitadorrotativo 70
Figura 6.6 Evolução das concentrações de biomassa (□); Glicerol (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 78
Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os
ensaios com Glicerol 79
Figura 6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□); frutose (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 80
Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□); sacarose (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 82
Figura 6.10 Evolução das concentrações de frutose, glicose e sacarose em
Azlp01 82
Figura 6.11 Evolução das concentrações de biomassa (□); etanol (◊); Absorbância
( ); Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em
fermentador 84
Figura 6.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e
absorbância para os ensaios em fermentador 87
Figura 6.13 Crescimento de A. lipoferum BR 17 em batelada, ensaio Azlp02 92
Figura 6.14 Resultados do protocolo a ADC para A lipoferum Br 17 94
Figura 6.15 Crescimento de A. brasilense em batelada, ensaio Azbr05 96
Figura 6.16 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7 98
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp –
experimentos desenvolvidos em diversos países 20
Tabela 2.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países 24
Tabela 2.4 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para
fixação biológica de nitrogênio 26
Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp 29
Tabela 3.2 Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes
fontes de N 35
Tabela 5.1 Concentração de glicerol em g/L na amostras 53
Tabelas 5.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A.
brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada
experimento 59
Tabela 6.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados 60
Tabela 6.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de
cultivo) 61
Tabela 6.3 Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A.
lipoferum Br 17 em incubador rotativo (200 rpm, 30ºC) 73
Tabela 6.4 Etapas preliminares dos ensaios em fermentador 75
Tabela 6.5 Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de células (Xo,
Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf) para os diferentes ensaios,
em função da composição do meio de cultura 85
Tabela 6.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em
biorreator em relação ao custo do substrato 88
Tabela 6.7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase
descontínua-alimentada à vazão constante do protocolo de ADC para
cultivo de A. lipoferum BR 17 e A. brasilense Sp 7 91
Tabela 6.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum
BR 17 95
Tabela 6.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp
7 99
RESUMO
Este trabalho objetiva o estudo do cultivo de bactérias do gênero Azospirillum spp.
para o estabelecimento da produção de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em
gramíneas e forrageiras. Alternativas ao meio NFb usado em laboratório são necessárias para
processamento industrial, pois os constituintes ácido málico e vitaminas encareceriam
demasiadamente o custo de produção. Foi efetuado screening de fontes de carbono e
nitrogênio, de baixo custo, capazes de garantir altas concentrações celulares e de propiciar
formulação de meio de cultura reprodutível. A.
brasilense Sp7 e A. lipoferum BR 17, cedidas
pela EMBRAPA-CNPAB, foram cultivadas em um meio básico composto de micronutrientes
(Mo, Mn, B, Cu, Zn) e extrato de levedura (1,0 g/L), variando-se as fontes de carbono frutose,
etanol, glicerol, sacarose e lactato (5g/L) e as fonte de Nitrogênio NH
4
Cl e (NH
4
)
2
HPO
4
suplementado com K
2
HPO
4
. Os ensaios foram realizados em incubador rotativo (200 rpm;
30ºC; pH 6,8) durante 5 dias. Para A. brasilense Sp7 foram escolhidas as fontes de C frutose,
glicerol e etanol obtendo-se, respectivamente, 2,8; 2,1 e 1,8 g/L de biomassa ao final do
ensaio. Para A. lipoferum BR17 foram escolhidas as fontes de C sacarose e glicerol obtendo-
se, respectivamente, 2,2; e 1,4 g/L ao final do ensaio. (NH
4
)
2
HPO
4
foi a fonte de N escolhida
para estas linhagens. A cinética do processo foi estudada em biorreator (pH = 6,8 e 30
o
C,
pO
2
>20%) obtendo-se os parâmetros descritos a seguir. A. brasilense: frutose (µ
m
= 0,20 h
-1
;
Y
X/S
= 0,60 g/g, Y
X/N
= 12,61 g/g e P
X
= 0,17 g/L.h), glicerol (µ
m
= 0,09 h
-1
; Y
X/S
= 0,69 g/g,
Y
X/N
= 9,06 g/g e P
X
= 0,07 g/L.h) e etanol (µ
m
= 0,08 h
-1
, Y
X/S
= 0,62 g/g, Y
X/N
= 7,81 g/g e
P
X
= 0,07 g/L.h). A. lipoferum: sacarose (µ
m
=0,35 h
-1
; Y
X/S
= 0,41 g/g, Y
X/N
= 1,35 g/g e P
X
=
0,24 g/L.h) e glicerol (µ
m
=0,28 h
-1
; Y
X/S
= 0,48 g/g, Y
X/N
= 4,49 g/g e P
X
= 0,21 g/L.h).
Baseados nos resultados, um protocolo a alta densidade celular através do processo
descontínuo-alimentado, obteve cerca de 25g/L para ambas as linhagens.
Title: Experimental production of Azospirillum spp. Inoculant for Biological Nitrogen
Fixation in non-leguminous crops.
Author: Silva, Luana Rissi
Abstract
The subject of the present work was to study the growth of Azospirillum spp. aiming the production of
inoculants for Biological Nitrogen Fixation in non-leguminous crops. A screening of low cost carbon and
nitrogen sources, capable of producing high cell concentration with a reproducible culture medium was
performed. A. brasiliense Sp7 and A. lipoferum BR 17 were cultivated in a medium containing micronutrients,
yeast extract, and K
2
HPO
4,
varying the Carbon (fructose, sucrose, glycerin, lactate, ethanol) and Nitrogen sources
(NH
4
Cl and (NH
4
)
2
HPO
4
)
.
The experiments took place at 30
o
C and pH 6.8. For A. brasiliense Sp7, fructose,
glycerin and ethanol were the best carbon sources attained, respectively, 2,8, 4,0 and 3,0 g/L of biomass in
bioreactor experiments. For A. lipoferum BR17, sucrose and glycerin carbon sources were chosen and the results
were, respectively, 2,0 and 2,6 g/L. (NH
4
)
2
HPO
4
was the best nitrogen source. Based on these results, high cell
density protocol using a fed-batch procedure was developed attained c.a. 25 g/L for both strains.
1 Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
As bactérias diazotróficas utilizam como fonte de nitrogênio para seu
metabolismo o enorme reservatório de nitrogênio gasoso (N
2
) da atmosfera (>79%).
O nitrogênio é pouco reativo e somente um grupo seleto de seres vivos, algumas
espécies de microrganismos procarióticos, bactérias e actinomicetos, possuem o
complexo enzimático chamado nitrogenase, necessário para transformá-lo em
amônia que é subseqüentemente assimilada em aminoácidos e proteínas. Esse
processo é chamado de fixação biológica de nitrogênio (FBN).
O N é um nutriente essencial para a vida e, em regiões tropicais, é
freqüentemente limitante da produção agrícola. São muitos os processos envolvidos
na ciclagem desse elemento: desnitrificação, volatilização da amônia e queimadas
(processos que retornam o N à forma gasosa) e lixiviação de nitratos para as camadas
profundas do solo, conduzindo à perda do N nos ecossistemas. Além disso, o N dos
solos agrícolas é exportado para as cidades, através da comercialização dos produtos.
Como conseqüência, a maioria dos solos das regiões tropicais é deficiente em N,
causando graves limitações à produção de alimentos. Somente os fertilizantes
nitrogenados ou a FBN podem retornar o N perdido aos solos agrícolas. Estima-se
que os fertilizantes nitrogenados representem 40% do custo total da produção da
1 Introdução
2
cultura. Além disso, os fertilizantes nitrogenados são a maior fonte de poluição
ambiental dos sistemas agrícolas (Machado & Magnavaca, 1991). Já a fixação
biológica de nitrogênio é um importante fator de competitividade do setor agrícola
brasileiro. Uma grande variedade de genótipos de plantas de importância agrícola,
como a soja, foi melhorada para que fosse possível uma diminuição no uso deste tipo
de fertilizante. Deste processo de melhoramento obteve-se variedades selecionadas
com maior habilidade de produção em solos pobres, e capazes de se associar com
microrganismos diazotróficos existentes no solo ou na rizosfera, no caso o rizóbio,
para obtenção de nitrogênio.
O mercado de inoculantes agrícolas produzidos com bactérias fixadoras de
nitrogênio para plantas leguminosas movimenta cerca de US$ 8,5 milhões/ano no
país. Cinco empresas brasileiras e algumas argentinas e uruguaias suprem este
mercado, que comercializa cerca de 14 milhões de doses destes inoculantes no Brasil
(IBGE, 2005).
Existe um mercado promissor através da geração de um novo produto, um
inoculante contendo bactérias diazotróficas que pode ser utilizado para gramíneas,
forrageiras e grãos. A associação entre as bactérias do gênero Azospirillum e estas
plantas já foi demonstrada nas décadas de 70 e 80. Entretanto os resultados de
inoculação obtidos até hoje mostraram-se muito variáveis, o que se tornou uma
barreira para o lançamento no mercado brasileiro de inoculantes agrícolas obtidos a
partir desta bactéria. Com o avanço do conhecimento na seleção de estirpes e dos
1 Introdução
3
genótipos das plantas, novos experimentos de inoculação tornam-se necessários.
Bem como o estudo sistematizado para que se estabeleça uma tecnologia de
produção deste tipo de inoculante em larga escala.
2 Revisão Bibliográfica
4
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Bactérias associadas às plantas
Bactérias são habitantes comuns da superfície e do interior dos vegetais,
podendo apresentar relações neutras, simbióticas e de patogenia com a planta
hospedeira. As bactérias associadas às plantas são chamadas de bactérias endofíticas
quando vivem no interior das plantas, habitando, de modo geral, suas partes aéreas,
como folhas, caules e raízes, sem causar aparentemente nenhum dano a seus
hospedeiros (Petrini, 1991; Hallman et al., 1997b; Azevedo, 1998a, Sturz et al.,
2000) e de bactérias epíficas, que vivem na superfície dos órgãos e tecidos vegetais
(Rizoplano) (Petrini, 1991; Jacques & Morris, 1995; Reinhold-Hurek & Hurek,
1998b; Andrews & Harris, 2000). Evidentemente, essas distinções têm finalidades
apenas didáticas, não existindo um claro limite entre grupos e sim um gradiente entre
eles, visto que existem algumas populações bacterianas que podem ficar entre a
colonização endofítica e epífica (Hallmann et al., 1997b), havendo sobreposição
entre esses grupos de microrganismos. Assim, dependendo das condições do
ambiente e do próprio estado fisiológico do hospedeiro, um endófito pode ser
considerado um patógeno latente (Azevedo, 1998a; Azevedo et al., 2000b; Andrews
& Harris, 2000). Este aspecto pode ser melhor entendido com o trabalho de
Whitesides & Spotts (1991) que compararam características fenotípicas de isolados
endofíticos e epíficos de bactéria Pseudomonas syringae e relataram a capacidade de
um mesmo isolado de se estabelecer dentro e fora do hospedeiro.
A origem, forma de penetração, colonização e transmissão de bactérias
endofíticas ainda são muito discutidas. Elas podem ser provenientes de sementes, da
rizosfera e de material propagado vegetativamente (Mclnroy & Klopper, 1995a;
Hallmann et al., 1997b. Reinhold-Hurek & Hurek, 1998). Sua penetração pode
ocorrer pelas aberturas naturais e feridas. Uma das portas de entrada mais utilizadas
pelos endófitos são as raízes; a emergência de raízes secundárias laterais sempre é
2 Revisão Bibliográfica
5
acompanhada por uma “ferida”, que serve de entrada para os microrganismos. O
próprio crescimento das raízes, penetrando no solo, gera abrasões que facilitam a
entrada de germes que podem produzir enzimas hidrolíticas capazes de degradar a
parede celular dos vegetais, sendo este um possível mecanismo de penetração (Di
Fiore & Dell Gallo, 1995; Quadt-Hallmann et al., 1997a; Shishido et al., 1999,
Andrews & Harris, 2000). E adentram também pelas entradas naturais, como
estômatos e hidatódios, aberturas causadas por insetos e até por estruturas de fungos
patogênicos, como os apressórios. Eles podem também ser encontrados dentro de
estruturas fúngicas. Esse é o caso constatado por Paula et al. (1991), que
identificaram um fungo micorrízico, o Glomus clarum, contendo a bactéria
endofítica Acetobacter diazotrophicus no seu interior. Especialmente em plantas
perenes, podem ser causadas feridas como as que fatalmente ocorrem, por exemplo,
na época da colheita de frutos. Elas constituem pontos de penetração de endófitos. A
colonização e distribuição de bactérias endofíticas e epíficas no hospedeiro pode ser
influencia da por interações com outros microrganismos associados à planta,
nematóides parasitas e por características próprias de seu hospedeiro (Lindow &
Anderson, 1996; Quadt-Hallmann et al., 1997b; Hirano & Hupper, 2000). Desta
forma, o habitat associado à planta é um ambiente dinâmico, no qual diversos fatores
podem influenciar a estrutura e composição da comunidade bacteriana associada ao
vegetal.
As bactérias endofíticas têm sido isoladas de raiz, nódulos, caule, folhas e
frutos em uma extensa variedade de plantas, incluindo muitas de interesse agrícola,
tais como cana-de-açúcar (Cavalcanti & Döbereiner, 1988), milho (Fisher et al.,
1992; Mclnroy & Kloepper, 1995b; Araújo et al., 2000), videira (Bell et al., 1995),
algodão (Quadt-Hallmann et al., 1997a); arroz (Stolzfus et al., 1997), tomate (Pillay
& Nowak, 1997), citros (Araújo et al., 2001; Marcon, 2002), batata (Reiter et al.,
2002), trigo e sorgo (Zinniel et al., 2002), entre outras.
2 Revisão Bibliográfica
6
Os microrganismos endofíticos foram mencionados pela primeira vez no
início do século XIX, mas foi Bary (1866) quem primeiro delineou uma possível
distinção entre eles e patógenos de plantas, e foi citado por Azevedo (1998a) e
Peixoto-Neto (2002). Definidos como assintomáticos, não produzindo, portanto,
efeitos benéficos ou prejudiciais aos seus hospedeiros, permaneceram praticamente
esquecidos até o final dos anos 70, quando, por uma série de motivos, foi verificado
que estas bactérias possuíam propriedades de interesse, como por exemplo: i)
conferir proteção contra insetos-pragas, outros microrganismos patogênicos e
inclusive contra herbívoros (Azevedo et al., 2000a; Sturz et al, 2000); ii) podem
também ser utilizados como promotores de crescimento vegetal, produzindo
fitohormônios, fixando N
2
ou por outros mecanismos (Sturz et al., 2000); iii)
endófitos podem ser utilizados como vetores para a expressão de genes heterólogos
nas planta hospedeira (Murray et al., 1992, Downing et al., 2000); iv) endófitos
podem ser combinados em processo de fitorremediação de contaminantes orgânicos
e metais pesados (Siciliano et al., 2001; Lodewyckx et al., 2002); iv) atualmente,
sabe-se que endófitos podem produzir toxinas, antibióticos e outros fármacos, fatores
de crescimento e muitos produtos de interesse biotecnológico (Azevedo et al., 2000b;
Peixoto Neto et al., 2002; Marcon, 2002).
2.2 Dinâmica do Nitrogênio em Sistemas Agrícolas
O ciclo do nitrogênio (N) na natureza é um dos que mais afeta as variadas
formas de vida na Terra (Figura 2.1). O nitrogênio é um importante constituinte das
chuvas, afeta o clima global e influencia as reações de síntese e o balanço de
decomposição do ozônio na estratosfera. Na biosfera e na litosfera o nitrogênio é
essencial para a nutrição de plantas e animais, contudo, sua excessiva concentração
em solos e águas pode acarretar problemas de eutrofização e intoxicação de
organismos (Van Lonn & Duffy, 2001).
2 Revisão Bibliográfica
7
Esse nutriente é essencial para a manutenção e acumulação de proteínas em
plantas, alcançando até 4,77% da matéria seca de parte aérea de arroz aos 19 dias
após o plantio (Breseguello & Stone, 1998). Sua absorção por parte dos vegetais
superiores pode ser tanto na forma nítrica (NO
3
-
) quanto na amoniacal (NH
4
+
) (Britto
et al., 2001). Entretanto, a assimilação de nitrogênio somente ocorre na forma
reduzida.
Entre os gases que formam nossa atmosfera, N
2
apresenta uma posição
privilegiada no que diz respeito à quantidade: 78%. Devido à grande estabilidade
dessa molécula, em virtude de seu baixo potencial de ionização e alta energia de
dissociação, só é observado seu carreamento para o solo pelo arraste através da
chuva dos óxidos de nitrogênio produzidos por descargas elétricas (Fernandes,
1978).
Figura 2.1 Ciclo do nitrogênio na natureza (modificado de Kerbauy, 2004).
2 Revisão Bibliográfica
8
O amônio tem sido subestimado como fonte de nitrogênio para as plantas, no
entanto, em muitas áreas agricultáveis este cátion aparece em níveis milimolares na
solução do solo, alcançando uma relação de 56 de NH
4
+
para 1 de NO
3
-
, podendo ser
a única fonte de nitrogênio mineral para as plantas em certos solos (Britto et al.,
2001). O NH
4
+
do solo surge da protonação da amônia oriunda das desaminações da
matéria orgânica em decomposição no solo (amonificação).
O NH
4
+
é oxidado a NO
3
-
, em pequeno grau na faixa de pH normalmente
encontrada nos solos (Britto et al., 2001). Entretanto, NH
4
+
pode ser acumulado onde
houver inibição da nitrificação, como nos solos com excesso de Al, pH baixo ou no
uso de inibidores de nitrificação (Fernandes, 1990). Já a forma nítrica é facilmente
lixiviada do solo, principalmente em regiões de alta precipitação e temperaturas de
solo elevadas, como é o caso do Trópico Úmido. De maneira diferente, as perdas da
forma amoniacal baseia-se na acentuada volatilização, mesmo após absorvida pelos
vegetais, quando o NH
3
atmosférico estiver abaixo do ponto de compensação de
amônio da planta (Trivelin et al., 2002).
O N é indispensável para a vida e principalmente para a produtividade de
culturas agrícolas, mas se perde do solo facilmente por lixiviação, volatilização e
desnitrificação, se fazendo-se necessário o uso adequado da adubação tanto do ponto
de vista agronômico e ecológico, como econômico.
Indiscutivelmente, depois de carbono, oxigênio e hidrogênio, o nitrogênio é
quantitativamente o mais importante elemento requerido por plantas e animais para o
crescimento tanto na água como na terra, alcançando cerca de 1,5% do peso seco de
inúmeras culturas agrícolas (Van Loon & Duffy, 2001). Dessa forma, este foi um dos
nutrientes que mais contribuiu para a chamada Revolução Verde. Devido seu uso
indiscriminado trouxe consigo problemas ambientais (Bouchard et al., 1992). Ainda
hoje novas metodologias para sua utilização são intensamente estudadas. A busca da
maior eficiência no uso de N (EUN), através do reconhecimento das vias
bioquímicas e moleculares de absorção e assimilação em plantas, bem como, de
2 Revisão Bibliográfica
9
metodologias agroecológicas, como a fixação biológica do nitrogênio (FBN), são
propostas para permitir o uso sustentável deste elemento sem a perda da produção
(Traore & Maranville, 1999; Pradella et al., 2001).
2.3 A Revolução Verde
Entre os anos de 1950 e 1984, a produção mundial de grãos cresceu 2,6 vezes.
Este fato incrementou a produção per capita em 40%, alcançando 80% na China e
130% na Europa Ocidental (Corson, 2002). Estas três décadas de crescimento são
devidas a vários fatores. Dentre eles, destaca-se a expansão de terras cultivadas, o
aumento da irrigação e do uso de agentes químicos agrícolas, o cultivo simultâneo de
várias culturas e as melhorias nas técnicas de produção (Corson, 2002).
Entretanto, já em meados dos anos de 1970, o uso indiscriminado de energia
na produção agrícola trazia preocupações. A agricultura tecnológica desenvolvida na
Europa Ocidental e nos Estados Unidos era totalmente inviável para os trópicos. Para
a produção de 8,2 x 10
6
Kcal de milho no meio-oeste americano, necessitavam-se 2,9
x 10
6
Kcal de energia fóssil e mais 2,043 x 10
6
Kcal de energia solar. Com isso o
balanço energético da produção mostrava-se bastante desfavorável e levaria, em
apenas 13 anos, ao extermínio de todas as reservas de petróleo conhecidas na época
(Pimentel, 1975).
A agricultura de alta tecnologia implantada com a Revolução Verde havia escolhido
a proposta de aumentar a produção pelo aumento da oferta de nutrientes no solo.
Assim, os problemas não demoraram a aparecer. Alguns ganhos obtidos nas décadas
que se seguiram à Revolução Verde foram perdidos juntamente com milhares de
hectares de terras, erodidos pela intensa aragem. Além disso, notou-se o esgotamento
do lençol freático, devido à irrigação excessiva e à salinização e contaminação dos
corpos d’água e do solo promovida pelos insumos químicos utilizados
agressivamente. O problema tornou-se tão flagrante que no início dos anos
2 Revisão Bibliográfica
10
de 1980 o órgão da Organização das Nações Unidas para a Alimentação e
Agricultura (FAO), publicou um relatório mostrando que o potencial do solo em
produzir alimentos encontrava-se limitado em 117 países em desenvolvimento
(Corson, 2002).
A partir de 1984 o milagre parecia ter chegado ao fim (Corson, 2002). A
produção per capita de grãos iniciou uma onda de quedas, mantendo-se longe
daquela projetada pela FAO e pelo Banco Mundial, como mostra a Figura 2.2
(Mann, 1997; Corson, 2002). Várias são as explicações para o declínio da Revolução
Verde. Talvez o problema esteja no fato de que a população não parou de crescer,
além disso, o aumento no consumo de carne levou ao direcionamento de grande
quantidade de grãos para a alimentação animal (Mann, 1997).
Outro fator importante apontado por cientistas, seria o alcance dos limites
físicos da planta. O índice de colheita, isto é, a fração da massa da planta recuperada
em seus grãos, variava em torno de 0,25, no início do século passado. Hoje, alcança-
se 0,5 e acredita-se que se pode chegar no máximo a 0,6 ou 0,65 do peso em grãos.
Assim, o paradigma da Revolução Verde: cultivar pequenas plantas com mais grãos
por pé às custas de muito fertilizante não se torna sustentável (Mann, 1997).
Figura 2.2 Produção mundial de grãos em milhões de toneladas a partir de 1950 e
projeções do Banco mundial e da FAO (modificado de Mann, 1997).
2 Revisão Bibliográfica
11
É ponto factível que nos próximos 30 anos as necessidades globais de grãos
irão crescer e, ainda, que a expansão da produção de cereais tornou-se limitada pelas
necessidades de preservar os ecossistemas, bem como pela perda de terras aráveis
para cidades, indústrias e recreação (Mann, 1997). Com isso, a Revolução Verde tem
dado lugar a uma agricultura sustentável que leva em consideração métodos precisos
para otimizar cada etapa da produção do plantio à colheita. Além disso, tem-se
selecionado novos tipos de plantas mais resistentes à doenças, a solos ácidos ou
capazes de utilizar mais eficientemente a nutrição e cada vez mais estimulado o uso
de inoculantes agrícolas baseados na fixação biológica de nitrogênio (Mann, 1997;
Pradella et al.,2001).
2.4 Fixação Biológica de Nitrogênio
O nitrogênio é o quarto elemento mais abundante nas plantas. É constituinte
essencial de aminoácidos, proteínas, bases nitrogenadas, ácidos nucléicos, hormônios
e clorofila, entre outras moléculas (Kim & Rees, 1994).
A forma molecular do nitrogênio acessa continuamente as plantas através dos
processos de trocas gasosas. No entanto, os vegetais são incapazes de assimilar o
dinitrogênio. Para que o N
2
seja convertido em uma forma assimilável, amônia, se
faz necessário o gasto de 33,5 KJ. mol
-1
(Nelson & Cox, 2000).
Uma possibilidade para tornar o N atmosférico disponível para as culturas
agrícolas é a fixação biológica (FBN). Apenas alguns organismos procariontes
possuidores do complexo enzimático denominado nitrogenase são capazes de efetuar
este processo. Em virtude do sistema enzimático, torna-se possível realizar tal
processo à temperatura biológica e a 0,8 atm de N
2
(Kerbauy, 2004). A equação geral
da FBN é descrita a seguir:
N
2
+ 16ATP + 8e
-
+ 8H
+
→ 2NH
3
+ H
2
+ 16ADP + 16Pi
(onde e
-
simboliza elétron e Pi simboliza o fosfato inorgânico).
2 Revisão Bibliográfica
12
Ainda que a fixação biológica de nitrogênio seja conhecida há mais de um
século, apenas a partir da década de 60 do século XX foi possível ter uma
compreensão aproximada do processo. A primeira bactéria fixadora de nitrogênio foi
isolada por Sergei Winogradsky na última década do século XIX e foi o anaeróbio
Clostridium pasteurianum. Em 1901, Martinus Beijerinck isolou o Azotobacter
chroococcum, outro fixador de nitrogênio. Possivelmente devido à facilidade de
cultivo de aeróbios, a maioria do trabalho bioquímico foi efetuado em Azotobacter
durante muitos anos. O problema mais importante em qualquer intento de estudar a
bioquímica de um processo é obter um sistema de enzimas ativas livres do resto da
célula. Todos os intentos para obter este sistema livre de células que pudesse fixar
nitrogênio não tiveram êxito e ainda muito tempo depois, quando já se conheciam as
vias de metabolismo do carbono, não se conhecia praticamente nada acerca da via
mediante a qual o N
2
era convertido em aminoácido. A incapacidade de preparar
extratos ativos livres de células se devia com toda a segurança à extrema
sensibilidade ao O
2
da nitrogenase, mesmo de aeróbios como o Azotobacter, de
forma que a enzima se inativava ainda antes que se pudesse fazer alguma prova. A
resolução do problema se obteve em 1960 quando um grupo na empresa E. I. DuPont
desenvolveu um sistema livre de células trabalhando com Clostridium pasteurianum.
(Brock. et al., 1984).
Como o processo de fixação se baseia na redução do N
2
a NH
4
+
se faz
necessária uma cadeia de moléculas transportadoras de elétrons capazes de catalisar
também a redução de outras moléculas como o acetileno e o etileno (Figura 2.3).
Esta última reação pode ser utilizada como estimativa da taxa de fixação (Nelson &
Cox, 2000). Na verdade, a enzima nitrogenase é formada por um complexo protéico
altamente conservado constituído essencialmente por duas enzimas: dinitrogenase
redutase e dinitrogenase. A dinitrogenase redutase é formada por um dímero com
subunidades idênticas (Fe-proteína). Nesta proteína, observa-se um centro redox de
4Fe-4S, que pode ser oxidado e reduzido por 1e-. Possui também dois sítios de
ligação de ATP/ADP. Já a dinitrogenase é um tetrâmero com duas cópias de duas
tetrâmero. Metade do Fe e do S está presente em dois pares de sítios 4Fe-4S,
2 Revisão Bibliográfica
13
chamados cluster P. O restante dos metais faz parte de um cofator Fe-Mo. Uma
forma de Nitrogenase contém Vanádio (V) ao invés de Molibdênio (Mo). Porém, as
bactérias que expressam esta enzima também expressam Fe-Mo. Dessa forma, a
enzima V-Fe teria função em certas condições ambientais limitantes (Nelson & Cox,
2000).
Figura 2.3 Esquema cinético do complexo nitrogenase (modificado de Nelson &
Cox, 2000).
2 Revisão Bibliográfica
14
Durante a reação, o complexo Nitrogenase recebe o auxílio de uma
ferredoxina no transporte de e-. A ferredoxina reduzida transfere um elétron para a
enzima dinitrogenase redutase. Esta unidade, por sua vez, se oxida, reduzindo a Fe-
Mo-proteína. A dinitrogenase acumula 8e-, que são utilizados na redução de N
2
a
NH
3
. O NH
3
fixado dá origem no meio aquoso do citoplasma bacterióide ao NH
4
+
que é direcionado para o citoplasma vegetal, onde será assimilado pelas vias de
redução até aminoácidos. Para cada elétron transferido, são utilizados dois ATP.
Assim, no balanço da reação são utilizados 16 ATP para cada N
2
reduzido.
Concomitantemente, é produzida uma molécula de H
2
, que utiliza parte dos e-. A
eficiência da FBN é aumentada em certos organismos que possuem uma hidrogenase
capaz de oxidar o H
2
, restabelecendo ATP e H
2
O.
As pesquisas sobre FBN estão trazendo novas perspectivas a cada dia. Entre
as diversas espécies de bactérias diazotóficas pode-se destacar: os gêneros
Azorhizobium, Bradrhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium e Rhizobium,
associando-se com leguminosas; os gêneros Azospirillum, Azotobacter, Beijirinckia,
Bacillus, Herbaspirillum e Gluconacetobacter, associando-se às culturas de milho,
arroz, trigo, grama batatais e cana-de-açúcar (Vargas & Hungria, 1997; Resende et
al., 2003a; Kerbauy, 2004). Além disso, alguns organismos de vida livre também são
capazes de fazer FBN. São exemplos de microrganismos autotróficos: Thiobacillus
ferrooxidans, Rhodospirillum rubrum, Gloeothece, Oscillatoria, Plectonema,
Anabaena e Nostoc. E. ainda microrganismos heterotróficos como Clostridium
pasteurianum, Klebisiella pneumoniae e Azotobacter vinelandi (Fixação
Biológica...2000).
2.5 Diazotrofos associativos
Dentro deste grupo podemos dividir os diazotrofos em dois grupos de acordo
com a proposição de Baldani et al. (1997a): endofíticos facultativos (podem
2 Revisão Bibliográfica
15
colonizar tanto a rizosfera como o interior das raízes) e os endofíticos obrigatórios
(colonizam o interior das raízes).
2.5.1. Endofíticos Facultativos
Somente após a redescoberta do gênero Azospirillum por Döbereiner & Day
(1975), os cientistas no mundo todo mostraram interesse na associação dos
diazotrofos com as gramíneas (Döbereiner & Baldani, 1982). O isolamento das
espécies de Azospirillum como fixadores de nitrogênio se deveu a introdução de
meios semi-sólidos sem N. O desenvolvimento do meio semi-sólido foi um fato
muito importante para o isolamento de diazotrofos com carácter microaerofílico. No
caso de Azospirillum e outros diazotrofos, o crescimento dependente de fixação de
N
2
ocorre em regiões do meio de cultura onde a taxa de difusão de O
2
está em
equilíbrio com a taxa de respiração das bactérias e, posteriormente, a película
formada vai se deslocando até a superfície do gradiente de oxigênio, graças ao
fenômeno de aerotaxia (Döbereiner et al., 1995). Os microrganismos desse gênero
colonizam tanto o interior quanto a superfície das raízes de várias gramíneas
forrageiras e cereais, sendo então chamado de diazotrofo endofítico facultativo
(Döbereiner & Baldani, 1982).
A distribuição ecológica de Azospirillum spp. é extremamente ampla podendo
ser considerada uma bactéria universal encontrada colonizando plantas crescidas em
diferentes habitats (Döbereiner et al., 1976; Döbereiner & Pedrosa, 1987). Estirpes
têm sido encontradas em associação com plantas monocotiledôneas, incluindo milho,
arroz, cana-de-açúcar, sorgo, gramíneas forrageiras como Digitaria e “Kallar grass”
(Döbereiner et al., 1976; Haahtela et al., 1981; Reinhold et al., 1986; Rennie, 1980;
Wong & Stemberg, 1979) e com as dicotiledôneas (Rao & Vankateswarlu, 1982). O
gênero foi definido por Tarrand et al. em 1978 e hoje compreende seis espécies,
caracterizadas com base fenotípica, análise do DNA:DNA e sequência 16S rRNA: A.
2 Revisão Bibliográfica
16
brasilense e A. lipoferum (Tarrand et al., 1978), A. amazonense (Magalhães et al.,
1983), A. halopraeferens (Reinhold et al, 1987), A. irakense (Khammas et al., 1989)
e A. largimobile (Sly & Stackebrandt, 1999). Após análises fisiológica e
filogenética, muitos destes isolados foram designados para o gênero Herbaspirillum,
constituindo assim uma nova espécie (Kirchhof et al., 2001) e o gênero Azospirllum,
denominado como Azospirillum dobereinense. Sua identificação e detecção foi
através da hibridização fluorescente in situ (Eckert & Hartman, 2001).
Segundo Baldani et al. (1997a), embora várias características ecológicas e
fisiológicas estejam sendo desvendadas, ainda falta conhecimento sobre o
mecanismo envolvido na interação bactéria-planta e como ele contribui para o
nitrogênio acumulado nas plantas. Apesar das diferentes formas de interação, estes
diazotrofos, quando estão em associação com gramíneas, garantem aumentos de 5 a
30% na produção (Baldani et al., 1983; Okon & Labandera-Gonzalez, 1994).
2.5.2 A associação do gênero Azospirillum com as gramíneas
Os estudos sobre o processo de fixação biológica de nitrogênio em gramíneas
iniciaram-se na década dos cinqüenta (Döbereiner & Ruschel, 1958). Esses estudos
avançaram bastante no Brasil na década dos setenta, durante a chamada “revolução
verde”. Enquanto a maioria dos países industrializados procurava auto-suficiência de
alimentos mediante o uso intensivo de fertilizantes na agricultura, países como o
Brasil continuaram a apoiar pesquisas em fontes alternativas de nitrogênio,
buscando, assim, diminuir a sua dependência dos adubos nitrogenados, uma vez que
a crise energética havia elevado seus custos e que não eram subsidiados no Brasil.
Nesse contexto, a associação de bactérias fixadoras de nitrogênio com gramíneas
ganhou uma importância enorme, principalmente com a descoberta de que bactérias
fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. Estas colonizavam os espaços
intercelulares das células da epiderme e do córtex radicular na zona de elongamento
e formação de pêlos radiculares, ou seja, a parte interna das raízes, os quais muitas
2 Revisão Bibliográfica
17
vezes não apresentam nenhum sinal de ruptura, indicando que sua interação com a
planta poderia resultar em uma associação com maior potencial de exploração
agrícola do que as associações de várias bactérias diazotróficas com a rizosfera dessa
plantas (Döbereiner & Day, 1975; Patriquin & Döbereiner, 1978). Assim, dois tipos
de associações radiculares têm sido descritas: uma, ao nível de superfície, e outra,
interna. No primeiro caso, a bactéria coloniza indinstintamente toda a superfície
radicular, formando pequenos agregados, algumas vezes embebida no mucigel, e
raramente coloniza a superfície dos pêlos radiculares (Patriquin & Döbereiner, 1978;
Umali-Garcia et al., 1980). O modo de adesão do Azospirillum à planta se dá
mediante ataque apolar (raramente polar), onde podem estar envolvidas estruturas
fibrilares que realizam o ancoramento da bactéria á célula vegetal, estabelecendo
deste modo a ligação entre células (Levanony et al., 1989). A partir desse
conhecimento, diversos grupos mundiais de pesquisa se interessaram pela associação
gramíneas/bactérias diazotróficas, o que culminou com a identificação de seis
espécies de Azospirillum nos últimos vinte anos. Mas há no meio científico, muita
discussão quanto á classificação das bactérias do gênero Azospirillum como bactérias
endofíticas facultativas ou rizosféricas. As dúvidas emergem, em parte da capacidade
de algumas estirpes em colonizarem o interior das raízes, enquanto outras colonizam
apenas a superfície delas. Estudos, trabalhando em condições de campo com plantas
de trigo inoculadas com diferentes estirpes de Azospirillum e utilizando técnicas
diferentes, concluíram que a utilização de estirpe homóloga (refere-se à estirpe
isolada da espécie de planta à qual está sendo inoculada) Sp 245 colonizam o interior
de raízes de trigo enquanto que a estirpe heteróloga (refere-se à oriunda de outras
espécies) foi incapaz de colonizar o interior das mesmas raízes (Baldani et al., 1987;
Schloter et al., 1994, Assmus et al., 1995). Contudo, foram gerados conhecimentos
sobre ecologia, fisiologia e genética, assim como sobre o processo de infecção e
colonização de cereais, principalmente pelas espécies A. brasilense e A. lipoferum
(Baldani et al., 1997a).
A espécie Spirillum lipoferum foi redescoberta no Brasil como bactéria
diazotrófica associada à rizosfera e raízes de várias gramíneas (Döbereiner & Day,
2 Revisão Bibliográfica
18
1976) e, logo depois, reclassificada como gênero novo Azospirillum (Tarrand et al.,
1978).
Pouco se sabe, porém sobre sobrevivência do Azospirillum no solo na
ausência da planta hospedeira, mas tem sido demonstrado que a bactéria apresenta
vários mecanismos fisiológicos de proteção (formação de cistos, produção de
melanina, de poli-β-hidroxibutirato e de polissacarídeos), que podem facilitar a
sobrevivência em condições desfavoráveis (Del Gallo & Fendrik, 1994).
O padrão de colonização das raízes das gramíneas pelas espécies de
Azospirillum mostra uma tendência de especificidade entre grupos de plantas e as
bactérias: A. lipoferum ocorre preferencialmente no córtex de milho, sorgo e de
diversas outras gramíneas com a via fotossintética C
4
, mas foi também observada em
uma espécie ciperácea (Döbereiner, 1982a), enquanto A. brasilense ocorre
preferencialmente associado a trigo, cevada, aveia, arroz, centeio e gramíneas com
via C
3
(Döbereiner & De-Polli, 1980; Rocha et al., 1981). A. halopraeferans é mais
específica, tendo sido isolada apenas de uma espécie de gramínea, o ‘kallargrass`
(Leptochloa fusca), planta nativa do Paquistão, altamente tolerante a solos salinos
(Reinhold et al., 1987). Já a espécie A. irakense, tem sido apenas isolada de raízes de
arroz (Khalmmas et al., 1989).
2.5.3 Resposta da planta á inoculação de Azospirillum spp
O uso de várias técnicas para a quantificação do N em culturas, como:
abundância natural de
15
N, balanço de N total, diluição isotópica de
15
N, uso do gás
15
N
2
e redução de acetileno em raízes, tem mostrado que 60% das necessidades de
nitrogênio da cana-de-açúcar são equacionadas pela FBN (Resende et al., 2003a). A
introdução da FBN nesta cultura torna-se ainda mais importante quando se avalia o
balanço energético da cultura. Dois terços desta cultura são utilizados para a
produção de álcool combustível no Brasil (Resende et al., 2003a). Conquistas como
2 Revisão Bibliográfica
19
esta fizeram com que o Brasil se tornasse o menor usuário de adubos nitrogenados do
mundo. Enquanto países como a Índia ainda seguem os paradigmas da Revolução
Verde (Döbereiner, 1997). Entre as leguminosas, um exemplo de cultura que pode
ser significativamente otimizada pela FBN é o feijoeiro (Vargas & Hungria, 1997).
Este grão corresponde entre 20 e 28% das proteínas ingeridas no Brasil. Apesar da
vasta área plantada, a produtividade ainda é muito baixa, com médias de 505 kg.ha
-1
,
muito limitada pelo fornecimento de N e P. O N necessário à cultura poderia ser
fornecido via FBN. Esta tecnologia de baixo custo reverteria a queda na
produtividade sem o uso de adubos nitrogenados, além de contribuir para a
preservação da fertilidade do solo. Entretanto, estimativas das taxas de FBN obtidas
em campos experimentais na América Latina e África não ultrapassam 40% de N
fixado no feijoeiro, o que pode ser otimizado com condições ambientais favoráveis,
ciclos culturais longos e uso de estirpes e cultivares selecionados, permitindo que o
feijoeiro nodulado alcance produtividade de até 2500 kg.ha-1 em solos pobres em N,
compatível às plantas que recebem N mineral (Vargas & Hungria, 1997).
Durante os últimos anos, tem-se perguntado muito sobre os benefícios da
inoculação com as bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Azospirillum. Nesse
processo, porém, existe o problema de transferência do N fixado para a planta que,
segundo Rao et al, (1986), ocorre muito lentamente e apenas pequena parte se torna
disponível para o vegetal. A alternativa para melhorar a transferência do nitrogênio
fixado para a planta seria o uso de mutantes excretores de NH
4
+
(Machado et al.,
1991) e cuja viabilidade foi demonstrada por Cristiansen-Weniger & Van Veen
(1991). Já a Tabela 2.1 enfatizam que a inoculação pôde ser otimizada através das
condições ambientais favoráveis quando comparados os diversos países que utilizam
a técnica de FBN. A utilização de ciclos culturais longos, como mostra os resultados
obtidos nos cultivos de milho e sorgo no Brasil e na França alcançaram 100% de
resposta no aumento de N na planta.
2 Revisão Bibliográfica
20
Tabela 2.1 Resposta de cereais à inoculação com Azospirillum spp – experimentos
desenvolvidos em diversos países (Baldani et al., 1999).
Aumento
País
Duração dos
experimentos
Cultura Inóculo
N total na
planta
Referência
(Semana)
(%)
EUA 3 Sorgo A. brasilense Cd 11 - 24 Tien et al., 1979
Índia 1 Sorgo Inoculante comercial 19 Rao, 1986
Índia 1
Milheto e
Sorgo
Inoculante comercial 20 - 30 Wani, 1990
Israel 7 Sorgo A. brasilense Cd 15 - 20 Okon et al., 1988
Israel 7 Milho A. brasilense Cd 20 - 30 Okon et al., 1988
França 6 Milho A. lipoferum CRT-1 100 Fages, 1994
Argentina 3 Milho A. brasilense Az-5 37 Barrios et al., 1994
Argentina 7 Trigo Isolados locais 15 - 30
Citado por Okon
&Lanbadera., 1994
México 2 Milho A. brasilense UAP-55 23 - 63
Caballero-Mellado
et al., 1992
Brasil 3 Trigo
A. BrasilenseJA04
+ 15kg de N.ha
-1
53
Didonet et al., 1996
Brasil 5 Trigo
A. brasilense Sp 245+
15kg de N.ha
-1
78,9 Baldani et al., 1987
Brasil 6 Arroz A. lipoferum 58,9 Mirza et al., 2000
Brasil 5 Sorgo A. lipoferum S82 e S65 17-60 Pereira et al., 1989
Brasil 6 Sorgo A. amazonense S 91 90,2 Pereira et al., 1989
Por outro lado, bactérias do gênero Azospirillum são conhecidas pela sua
capacidade de produzir hormônios de crescimento, tais como auxinas, geberelinas e
citoquininas “in vitro” (Hartmann & Zimmer, 1994). A produção pela planta de
substâncias de crescimento em resposta à colonização radicular também tem sido
sugerida como uma possibilidade alternativa para os aumentos de massa seca
observados em plantas inoculadas com Azospirillum (Fallik et al., 1988). Tem-se
verificado que ocorre um aumento da densidade de pêlos radiculares, de taxa de
aparecimento de raízes secundárias e da superfície radicular quando as plantas são
colonizadas por essas bactérias. Tal incremento resulta num aumento da absorção de
água e nutrientes, elevando a capacidade da planta de produzir e suportar estresses
ambientais, até mesmo de resistência a geadas (Baldani et al., 1983; Lin et al., 1983;
Kapulnik et al., 1985, 1987).
2 Revisão Bibliográfica
21
O uso de estirpes e genótipo da planta selecionadas podem influenciar os
resultados de inoculação como mostra a Tabela 2.1. O experimentos realizados com
sorgo no Brasil utilizando A. lipoferum S82 E S85 no inóculo que conseguiu
aumentar o acumulo de até 60% de N na planta, sendo muito favorável, quando se
comparado aos resultados obtidos nos experimentos efetuados nos EUA, índia e
Israel. E com a cultura de milho pode-se efetuar comparações semelhantes, pois os
resultados obtidos para os experimentos na França utilizando A. lipoferum CRT-1
como inóculo obtiveram aumento de 100% de acúmulo de Nitrogênio na planta.
Embora o termo especificidade hospedeira seja usado para caracterizar essas
associações, tem-se demonstrado que existe certa afinidade entre estirpes e cultivares
(Patriquin et al., 1983; Wani et al., 1985) ou entre a bactéria e espécies de plantas
(Baldani & Döbereiner, 1980; Penot et al., 1992). Alguns autores sugerem que
estirpes isoladas do interior das raízes (após a esterilização superficial) são mais
eficientes e que se devem utilizar estirpes homólogas, isto é, isoladas do mesmo tipo
de planta que se deseja inocular, especialmente, quando a população nativa está
presente (Favilli et al., 1987; Boddey & Döbereiner, 1988; Summer, 1990; Wani,
1990). Estudos prévios de seleção de estirpes mostraram que o uso das homólogas
pode promover aumentos de produção, porém esse conceito não tem sido aplicado
com muita freqüência nos trabalhos de inoculação de gramíneas em campo.
Em relação ao estágio fisiológico, estudos foram feitos no sentido de
multiplicar células de forma a melhorar a sobrevivência da bactéria nos inoculantes.
Bactérias do gênero Azospirillum são capazes de acumular poli-β-hidroxibutirato
(PHB), um material de reserva que lhes permite resistir a condições de estresse
ambiental (Tal & Okon, 1985). Fages (1992) relata estudos comparativos de
inoculação de culturas jovens e daquelas mantidas sob crescimento por mais de dez
dias, visando aumentar a sobrevivência da bactéria no inoculante, já que as células
com maior acúmulo de PHB podem resistir por mais tempo a condições adversas.
Vale ressaltar que a competitividade com outras estirpes ou mesmo outros
componentes da microbiologia do solo pode prevenir a colonização radicular por
bactérias do gênero Azospirillum (Döbereiner & Pedrosa, 1987; Fallik et al., 1988b).
2 Revisão Bibliográfica
22
Outra possibilidade de uso da FBN é sua utilização indireta através de adubos
verdes. Este adubo é produzido por uma cultura que fixa nitrogênio anteriormente ou
concomitante à cultura de interesse. No primeiro caso, a cultura fixadora
corretamente manejada, serve de base para o plantio da outra cultura que se beneficia
com a mineralização do nitrogênio. Entretanto, em condições tropicais de alta
temperatura e pluviosidade a mineralização é acelerada produzindo perdas
significantes do adubo. Já o consórcio possibilita a utilização direta pela excreção de
compostos nitrogenados ou decomposição de nódulos radiculares, e ainda, pelo corte
da parte aérea do adubo que irá se decompor concomitante à assimilação pela cultura
de interesse. Adubos verdes podem contribuir com até 150 kg de N.ha
-1
.ano
-1
para as
culturas (Resende et al., 2003b). A inoculação de Azospirillum na presença de
pequenas doses de fertilizantes nitrogenados tem mostrado maior eficiência para o
sistema planta-bactéria quando comparado com o uso isolado da bactéria (Tabela
2.1). Baldani et al., (1987) obtiveram uma incremento de 28% na produção de grãos
de trigo em relação à testemunha crescida com o equivalente a 100 kg/ha de N
quando inocularam a estirpe Sp 245 de A. brasilense e suplementaram as plantas com
15 kg/ha de N (Tabela 2.1). Já Didonet et al, (1996) observaram que a produção de
grãos de trigo inoculado com a estirpe JA04 de A. brasilense e complementada com
15 kg/ha de N, diferiu estatisticamente do tratamento-controle, que recebeu adubação
equivalente a 45 kg/ha e aumentou em até 53% de N em cobertura (Tabela 2.1).
Fages (1994) relata que os aumentos observados na produção de grãos de sete
experimentos de inoculação de milho na presença de pequenas doses de N, se devem
a um melhor desenvolvimento do sistema radicular da planta devido aos
fitohormônios produzidos.
O veículo de inoculação (sólido e líquido) é outro aspecto que se deve
considerar nos experimentos em gramíneas. O substrato sólido mais usado é a turfa
estéril neutralizada, dado o know how já adquirido com o inoculante desenvolvido
para rizóbio e também o seu baixo custo. Ela pode ser empregada pura, na forma de
pó ou granulada e em mistura com argilas (vermiculita) ou carvão. No caso dos
inoculantes líquidos, tem-se feito uso de óleo mineral e de polímero como, por
2 Revisão Bibliográfica
23
exemplo, o alginato e a goma xantana que promovem o encapsulamento das células e
só as liberam após a degradação do polímero e, assim, previnem as células de
estresses ambientais (Jung et al, 1982). Esse processo tem, como desvantagem, a
necessidade de mão-de-obra especializada e, conseqüentemente, o custo elevado.
Fallik & Okon (1996), por exemplo, obtiveram um aumento de 15% na
produção de grãos de milho quando fizeram uso da turfa granulada em comparação
com a pulverização no sulco e semente peletizada, que aumentaram 11 e 3%
respectivamente. Já a pulverização pós-emergência das sementes teve um efeito
negativo de 2% na produção de grãos. Baldani et al., (1983) também obtiveram
maior aumento na produção grãos de trigo usando turfa granulada (35%) em
comparação com inoculante oleoso (19%).
Estudos de inoculação de cereais com bactérias diazotróficas têm mostrado
que as endofíticas têm um maior potencial de contribuição da FBN e que o genótipo
da planta influencia na associação da planta/bactéria. Os avanços alcançados
apontam para uma maior exploração e entendimento desta associação endofítica. Os
programas de sequenciamento do genoma: RIOGENE e GENOPAR mostram a
importância da FBN no Brasil e devem permitir que o país continue na fronteira do
conhecimento em relação ao processo de FBN em gramíneas (Baldani et al, 2005).
2.6 Importância Econômica da Fixação Biológica de Nitrogênio
A agricultura brasileira tradicionalmente usa menos nitrogênio mineral nas
aplicações de fertilizantes, quando comparada com a de outros países. A Tabela 2.2
dá um quadro da quantidade de nitrogênio aplicada como fertilizante em diversos
países:
2 Revisão Bibliográfica
24
Tabela 2.2 Uso de fertilizante nitrogenado em diversos países (Dobereiner, 1997)
País
N (kg/ha)
Países da Europa 172
China 87
USA 58
México 36
Índia 27
Brasil 10
O alto custo do fertilizante nitrogenado no Brasil leva a um processo de
seleção de genótipos de plantas que fornecem altos rendimentos com baixo uso deste
fertilizante. O baixo uso de N mineral faz a agricultura mais lucrativa e gera menor
poluição dos lençóis freáticos. A seleção de genótipos da soja plantada no país foi
feita levando-se em consideração a não aplicação de N mineral. Hoje, toda a soja
plantada no país é feita sem aplicação de N mineral. O rendimento médio desta
cultura é maior que 2 ton/ha. Com um conteúdo médio de 6% de N, praticamente
vindo totalmente da fixação biológica, isto corresponde a cerca de 120 kg/ha de N,
proveniente da ação bacteriana. Estima-se que a economia total pelo não uso de
fertilizantes nitrogenados na soja é de cerca de US$ 3,2 bilhões. No feijão, esta
economia poderia chegar a US$ 375 milhões com o uso de inoculação bacteriana e
seleção de melhores genótipos. Na última década ficou demonstrado que parte do
nitrogênio utilizado por cereais e forrageiras advém da associação destas plantas com
bactérias diazotróficas como Herbaspirillum spp, Burkholderia spp e Azospirillum
spp. Estas bactérias colonizam raízes, troncos e folhas de milho, arroz e trigo. Dentre
todas as não leguminosas, a cana-de-açúcar é provavelmente a que recebe maior
contribuição da fixação biológica de nitrogênio. Cerca de 150 kg N/ha são obtidos
por fixação biológica na cana-de-açúcar (Döbereiner, 1997).
2 Revisão Bibliográfica
25
2.7 O Mercado Brasileiro de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio
Apesar de ter sido largamente demonstrada a fixação biológica de nitrogênio
pela associação entre Azospirillum spp. e gramíneas, não existe ainda um produto
comercial para tal fim.
Em contraste, existe um mercado completamente desenvolvido para a
produção e uso do inoculante para fixação biológica de nitrogênio em leguminosas.
Este mercado é regulado pelo Ministério da Agricultura e conta com associações de
produtores e de pesquisadores, como a Associação Nacional de Produtores e
Importadores de Inoculantes (ANPII) e a Rede de Laboratórios para Recomendação,
Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes Microbiológicos de Interesse
Agrícola (RELARE). A associação entre produtores, pesquisadores e agentes
governamentais gerou uma bem sucedida comunidade, que conta inclusive com um
fundo de pesquisas financiado pelas empresas, à razão de R$ 0,01 por dose de
inoculante vendida.
O mercado brasileiro de inoculantes para fixação biológica de nitrogênio em
leguminosas, fundamentalmente a soja, foi de cerca de 14 milhões de doses em 2001.
Destas, cerca de 10 milhões foram produzidas no país e o restante importado da
Argentina e, em escala bem menor, do Uruguai
1
. Os produtores estrangeiros são
igualmente membros participantes da RELARE e os importadores, da ANPII.
A dose de inoculante é vendida, em média, a US$ 0,60, o que permite estimar
o mercado em cerca de US$ 8,5 milhões
1
, totalmente suprido por indústrias de
pequeno e médio porte.
1
- Laura Machado Ramos. Relatório apresentado durante a XI-RELARE, reunião da Rede
de Laboratórios para Recomendação, Padronização e Difusão de Tecnologia de Inoculantes
Microbiológicos de Interesse Agrícola, ocorrida no Instituto de Pesquisas Tecnológicas do
Estado de São Paulo, entre 18 e 20 de junho de 2002.
2 Revisão Bibliográfica
26
Para as empresas, a abertura de um mercado de inoculantes para fixação
biológica de nitrogênio em não-leguminosas permitiria uma imensa ampliação de
escala de produção. A Tabela 2.3 mostra as áreas plantadas de soja, feijão, cana-de-
açúcar, milho, arroz e trigo no país (IBGE, 2005). A uma razão de aplicação de uma
dose por hectare, a mesma que é recomendada para leguminosas, apenas o mercado
potencial brasileiro total saltaria de 14 milhões para 42 milhões de doses. Com
redirecionamento de parte dos investimentos de marketing das empresas para os
países da América Latina, o mercado poderia ser ainda maior.
Tabela 2.3 Área plantada de culturas potencialmente usuárias de inoculantes para
fixação biológica de nitrogênio (IBGE, 2005).
ÁREA PLANTADA (ha)
CULTURA
Brasil Argentina
Soja 16.314.162 10.280.000
Feijão 3.468.000 257.000
Cana-de-açúcar 5.623.422 265.000
Arroz 3.147.000 151.000
Milho 12.355.000 2.745.000
Trigo 1.702.000 7.000.000
TOTAL 42.009.162 20.698.000
Os benefícios econômicos, sociais e ambientais da abertura deste mercado são
evidentes: (1) menor uso de fertilizante nitrogenado mineral; (2) maior lucratividade
das culturas; (3) menor poluição ambiental; (4) economia da energia empregada na
fabricação de N mineral; (5) geração de empregos nas indústrias.
3 Fontes de Carbono
27
3. Produção de Inoculantes para Fixação Biológica de Nitrogênio à Base de
Azospirillum
A extensão da FBN para plantas não leguminosas, principalmente gramíneas
e cereais, se tornou um dos maiores desafios dos últimos 20 anos. Inicialmente,
pensava-se que havia somente bactérias diazotróficas na rizosfera, já que certas
gramíneas como a grama batatais (Paspalum notatum) crescem bem em solos ácidos,
sem adubo nitrogenado. Nos anos seguintes, foram isoladas de cana-de-açúcar e
cereais como milho, arroz e sorgo três novas espécies de Azospirillum que não
somente colonizam a rizosfera, como também contêm certas estirpes que são capazes
de infectar a planta, e, assim, fornecer o nitrogênio de forma mais eficiente. Baldani
& Döbereiner, em 1980, utilizaram o meio NFB líquido para o cultivo dependente da
fixação de nitrogênio de A. brasilense e A. lipoferum para o cultivo não dependente
da fixação de nitrogênio, o meio NFB era suplementado com 0,53g de NH
4
Cl
(Baldani & Döbereiner, 1980).
Pensando-se em termos industriais, entretanto, devem-se procurar alternativas
ao meio NFB, pois a sua principal fonte de carbono (ácido málico) é uma substância
de difícil obtenção somente possível de utilização em trabalhos de laboratório.
Também a formulação incluindo micronutrientes e vitaminas talvez não seja
adequada pelo alto custo e dificuldade de preparo.
Assim, procurou-se a seguir efetuar um levantamento das fontes de carbono,
nitrogênio e fósforo utilizáveis no processo de produção de A. brasilense e A.
lipoferum.
3 Fontes de Carbono
28
3.1 Fontes de Carbono
Existe uma importante relação em Azospirillum, entre a fixação de nitrogênio
e a escolha correta da fonte de carbono e o suprimento de açúcar na natureza por
hospedeiros em gramíneas (Westby and Vigil, 1983). Alguns compostos estimulam
a atividade da nitrogenase (Okon and Burris, 1976).
Tanto A. lipoferum como A. brasilense utilizam malato como fonte de
carbono, mas somente a primeira consegue utilizar glicose (Baldani et al., 1997a). O
gênero Azospirillum também tem a habilidade para produzir fitohormônios como
AIA (ácido indol acético) (Thuler et al, 2003). Os genes para a biossíntese desse
fitohormônio foram encontrados também em A. amazonense, mas não em A. irakense
(Vandebroek & Vanderleyden, 1995). O ótimo crescimento com relação à
temperatura, está entre 32 e 37ºC, sendo que A. halopraeferens tem um crescimento
ótimo a 41ºC e possui tolerância à condições salinas. A. irakense hidrolisa pectina e
também tolera altas concentrações de sais (Baldani et al., 1997).
Westby et al (1983) estudou o metabolismo do carbono em Azospirillum para
checar a resposta ao crescimento deste organismo usando diversas fontes de carbono
e energia. Utilizou-se A. brasilense e A. lipoferum, estirpes selvagens de Sp7, BR17 e
de dois mutantes, CW-1 e CW-2 nos experimentos de crescimento em meio sólido. A
Tabela 3.1 mostra que os resultados obtidos assemelham-se aos achados por Albrecht
& Okon, 1980; Okon et al., 1976; Tarrand et al., 1978 e confirma o crescimento de
Azospirillum utilizando açúcares ou ácidos orgânicos como fonte de carbono. (Tabela
3.1). Os resultados indicaram que essa fixadora de nitrogênio utiliza a via Entner-
Doudoroff para a dissimilação de gliconato (Figura 3.1). A partir da descoberta da
presença desta via metabólica, pôde-se traçar outras para a utilização de outras fontes
de carbono.
3 Fontes de Carbono
29
Tabela 3.1 Fonte de Carbono utilizada para crescimento de Azospirillum spp.
Fontes de Carbono
A. brasilense Sp7 A. lipoferum Br17
Sacarose - - - - - -
D-gliconato +++ +++
Arabinose ++ ++
Frutose +++ +++
Etano
l
++ ++
Glicero
l
++ ++
Fumarato ++/+++ ++/+++
Glicose - - - +++
Malato +++ +++
Lactato +++ +++
Ceto-gliconato +++ +++
As fontes de carbono utilizadas estão presentes no meio sólido Dobereiner-Day-NH
4
Cl (DDN) em
concentração de 5 g/L. Os ácidos estão incorporados nos sais de sódio ou potássio. As bactérias foram
incubadas a 32ºC por 3 ou 4 dias, obtendo-se os seguintes resultados de crescimento em agar:
+ + +, Excelente crescimento; + +, bom crescimento; e ---, nenhum crescimento
As fontes de carbono (Acetato, Galactose, glicose, glicerato, manitol, manose, ribose e
xilose) permitiram pouco crescimento ou nenhum crescimento para Sp 7 (resultados não
apresentados).
A habilidade para utilizar sacarose é a principal característica de A.
amazonense e A. irakense, embora somente a primeira espécie seja hábil para crescer
em vários pHs, sendo que para as demais espécies é requerido um pH perto do
neutro. Supõe-se que para utilização de sacarose, em Azospirillum lipoferum,
necessita-se de uma enzima que hidrolisa as ligações α, β (1→2) da sacarose em
glicose e frutose. Através da glicólise, a glicose é convertida em piruvato. O piruvato
é transformado em acetil CoA que é totalmente oxidado no ciclo do ácido cítrico
com a formação de duas moléculas de CO
2
. Os elétrons oriundos da reoxidação do
NADH
3 Fontes de Carbono
30
em NAD
+
em condições aeróbicas, são transferidos para o oxigênio molecular para a
síntese de ATP pela fosforilação oxidativa. Já a frutose pode entrar na via “EMP
anabólica”, pois a existência da via ED e a ausência da atividade de 6-
fosfofrutoquinase indica ausência da via EMP. Por outro lado, existe a frutose-
bisfosfato e o ciclo de Krebs que são responsáveis pela formação dos sete
precursores biossintéticos, a saber: gliceraldeído-3-fosfato, ácido-3-fosfoglicérico,
ácido fosfoenolpirúvico, ácido pirúvico, acetil-coenzima A, ácido oxaloacético, ácido
α-cetoglutárico (Dawes, 1982; Hurek & Niemann, 1987; Stanier & Painter, 1986).
Quatro precursores restantes são obtidos pela parte não oxidativa das vias das
pentoses, a saber: eritrose 4P, ribose 5-P, frutose 6-P e glicose 6-P. No caso de A.
brasilense, glicose-6-fosfato é produzida por isomeração da frutose-1-fosfato
(Martinez-Drets & Burris, 1984).
Dependendo da espécie bacteriana (e em muitos casos, das condições de
cultivo também) pode-se obter um máximo de 26 moles de ATP por mol de frutose
completamente oxidado a CO
2
e H
2
O, contra por exemplo, 38 moles formados em
levedura pela mesma oxidação (Gottschalk, 1979; Nagai, 1979; Stouthamer, 1977).
Glicerol foi uma das fontes de carbono utilizadas por Tarrand et al (1978)
para a caracterização do gênero Azospirillum com 100% de respostas positivas para o
crescimento nesta substância, para todas as cepas de ambas as espécies, A. brasilense
e A. lipoferum.
O glicerol, em Azospirillum, é catabolizado através da segunda etapa da via
glicolítica, após transformação em gliceraldeído-3-fosfato (GAP) a partir da
desidrogenação e subsequente fosforilação ou invertendo a ordem com a fosforilação
seguida pela desidrogenação com a subseqüente ativação do ciclo dos ácidos
tricarboxílicos (Weatby & Vigil, 1983). Pode-se afirmar com certeza, que a entrada
da substância nas células acorre por difusão facilitada, pois esse é o mecanismo
universal de transporte do glicerol por microrganismo (Hunter, 1985; Lin, 1976).
3 Fontes de Carbono
31
Na maior parte dos microrganismos, apenas uma das rotas de transformação
de glicerol em gliceraldeído-3-fosfato atua de cada vez. Em Klebsiela pneumoniae,
entretanto, determinou-se a existência da glicerol desidrogenase em conjunto com a
gliceralquinase. Nesses microrganismos, verificou-se que a atividade da glicerol
desidrogenase era fortemente influenciada pelo oxigênio dissolvido no meio de
cultura: quanto maior a pressão parcial de O
2
, menor a atividade específica da
enzima. Em função disso, e de outras indicações, foi postulado que a gliceralquinase
opera principalmente para a dissimilação oxidativa do glicerol, enquanto a glicerol
desidrogenase é mais importante no crescimento anaeróbio (Lin, 1976). Como
salientado por esse último autor, a possibilidade da ocorrência simultânea das duas
enzimas aumenta quando o cultivo, embora aeróbio, vai se tornando limitado em
oxigênio, conforme aumenta a concentração celular, caso bastante comum em
culturas em incubador rotativo.
Para glicerol não há gasto de energia no transporte (difusão facilitada)
(Hunter, 1985), mas a formação da di-hidroxiacetona-3-fosfato requer 1 mol de ATP,
qualquer que seja o caminho (figura 3.1). Para a formação de frutose-6-fosfato são
necessárias duas trioses fosforiladas (2 moles de ATP) e na posterior transformação a
frutose-6-fosfato, um mol de ATP é regenerado, com um balanço total de 1 mol de
ATP gasto por mol G6P formado.
O crescimento de bactérias a partir do glicerol, (bem como a partir de outros
compostos de 3 ou 4 carbonos, como ácidos láticos, pirúvico, málico e succinato)
depende da produção de frutose-1-6-bisfosfato, e sua transformação em glicose-6-
fosfato (G6P) (Dawes, 1982; Stainer & Painter, 1986).
Não existe descrição na literatura de uma via metabólica de assimilação de
lactaoto para Azospirillum. Segundo Poole and Ingledew, (1987), para assimilação de
lacato em E. coli há produção de quatro tipos de lactato desidrogenase, duas das
quais não associadas ao NADH. Para esta bactéria, na dissimilação do lactato, tanto
as formas D e L são convertidas em piruvato, e por sua vez oxidado a Acetil CoA.
3 Fontes de Carbono
32
Sabe-se que um número de bactérias gram-negativas sintetizam enzimas com
pirroloquinolina quinona (PQQ) como cofator quando crescidas em glicose ou vários
álcoois. As PQQ-dependente aldolase quinoproteína e álcool desidrogenase são
localizadas no periplasma (Kretzschmar and Gorish, 2002).
A degradação do etanol começa na álcool desidrogenase transformando-o em
acetaldeído que é oxidado mais adiante a acetato pela enzima aldeido desidrogenase.
O acetato é então convertido a acetil- CoA sintetase em uma reação dependente de
ATP. A produção de acetil CoA constitui a ligação entre a utilização do etanol como
fonte de carbono e o matebolismo central (Figura 3.1)
É importante destacar que não há nenhum estudo sistematizado com o
objetivo de seleção destas fontes com a finalidade de se promover o cultivo em
biorreator.
3 Fontes de Carbono
33
Figura 3.1
Metabolismo central do carbono em Azospirillum. As enzimas estão
enumeradas da seguinte manerira: 1 - glicoquinase; 2 - gliconato 2-
desidrogenase; 3 – fosfogliconato desidratase; 4 - fosfo-2-keto-3-
deoxigluconato aldolase; 5 - fosfogluconato desidrogenase; 6 - glicose-6-
fosfato desidrogenase; 7 - gliceraldeído-fosfato desidrogenase (NAD+); 8 -
gliceraldeído-fosfato desidrogenase (NADP+); 9 - fosfoglicerato quinase; 10
- fosfoglicerato mutase; 11 – enolase; 12 – piruvato quinase; 13 - frutose-
bisfosfato aldolase; 14 - frutose bifosfatase; 15 - 6-fosfofrutoquinase; 16 -
glicose-fosfato isomerase; 17 – glicoquinase; 18 - glicose desidrogenase; 19 -
glicerolquinase; 20 - lactato desidrogenase; 21 - malato desidrogenase; 22 –
álcool desidrogenase; 23 – acetaldeído desidrogenase. As linhas pontilhadas
correspondem às reações que não aparecem em A. brasilense ou não são
importantes, tornado-se inutilizáveis pela bactéria. (Baseado em Westby et al.,
1983).
3 Fontes de Nitrogênio
34
3.2 Fontes de Nitrogênio
A princípio, poder-se-ia empregar amônia, nitrato, aminoácidos, e até mesmo
nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano
(Döbereiner & Pedrosa, 1987).
Para iniciar a discussão a respeito de quais fontes poderiam ser
industrialmente viáveis, deve-se levar em consideração os critérios já citados
(Stanbury & Whitaker, 1984), principalmente os que se referem à velocidade da
produção, aos fatores de conversão, e à facilidade de compatibilização da etapa de
crescimento celular com as demais etapas do processo.
Já foi demonstrado para muitas espécies bacterianas que os fatores de
conversão e as velocidades de crescimento para culturas que utilizam nitrogênio
combinado (amônia, nitrato, aminoácidos) são bem maiores do que para culturas que
se desenvolvem às custas da fixação de nitrogênio (ver tabela 3.2). Para A.
Lipoferum, foi determinado que os tempos de geração para cultivo em meio líquido
eram de 1 a 2 horas com amônia, e de 5,5 a 7 h em condições de fixação de
nitrogênio atmosférico (Okon & Burris, 1977).
3 Fontes de Nitrogênio
35
Tabela 3.2 - Fatores de conversão para alguns microrganismos com diferentes fontes
de N.
Microrganismo Fonte de Velocidade Fator de Conversão
Carbono específica de Molar segundo fonte de N
2
Crescimento (g/mol fonte de carbono)
(h
-1
) Amônia Nitrato N
2
Crescimento aeróbio
Aerobacter aerogenes glicose 0,67 48,2 - -
A. aerogenes glicose 0,39 - 24,5 -
A. aerogenes glicose - 72,7 52,0 -
Azotobacter chroococcum manitol 0,05 58,3 - 8,5
Az chroococcum manitol 0,14 60,0 - 38,2
Az chroococcum manitol 0,25 55,8 - 45,3
sacarose
Azotobacter vinelandii
(3 g/L)
0,15 150,0 - 30,0
sacarose
Az vinelandii
(15g/L)
0,15 80,0 - 22,0
Crescimento anaeróbio
Clostridium pasteurianum sacarose 0,22 70,2 - 39,4
C. pasteurianum sacarose 0,39 69,5 - 43,3
Desulfovibro desulfuricans lactato 0,05 9,2 - 3,9
D. desulfuricans lactato 0,10 9,2 - 5,6
Klebsiella pneumoniae glicose 0,13 29,3 - 11,7
K. pneumoniae glicose 0,20 32,7 - 12,1
Fonte: Sthouthamer, (1977); Post et al , (1983)
Outro incoveniente para o uso do nitrogênio gasoso na produção de
microrganismos seria a necessidade de obtenção da baixas pressões de oxigênio
(Nelson & Knowles, 1978; Okon & Tal, 1987; Volpon & Döbereiner, 1981), o que
obrigaria a trabalhar com nitrogênio e oxigênio puros, em mistura, ou, à reciclagem
dos gases efluentes do fermentador com ajuste da concentração através de sensores e
controladores automáticos. Qualquer dos dois sistemas é bastante complexo (e caro)
3 Fontes de Nitrogênio
36
e pode, evidentemente, ser evitado no caso de se utilizar nitrogênio combinado, em
cultivo aeróbio, cuja tecnologia é conhecida e barata.
Algumas fontes de nitrogênio foram estudadas para o crescimento de
Azospirillum. Das e Mishra, 1982 demonstraram que A. brasilense pôde
desenvolver-se adequadamente com NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
ou uréia, mas com a
utilização de nitrato para as cepas A, brasilense sp7 e A. lipoferum sp 59 b houve
aparecimento de intensa floculação, particularmente quando usou-se frutose (de 1,5 a
18 g/L) como fonte de carbono. Dos nitratos testados KNO
3
foi o que induziu maior
floculação, em ambas as cepas. Nesse mesmo caso verificou-se que NH
4
Cl e
glutamato também levaram a formulação de flocos, quando frutose era usada a 1,5
g/L, mas com intensidades bem menor que a obtida com os nitratos.
Fontes de nitrogênio orgânico também foram estudadas (Das & Mishra,
1982): aminoácidos, peptona e extrato de levedura. Diferentes comportamentos
foram obtidos no tocante ao estímulo e repressão da nitrogenase e ao crescimento de
A. brasilense e A. lipoferum. Para diversos aminoácidos (glutamina, asparagina,
leucina, lisina, alanina, ácido aspartico, ácido glutâmico, tirosina, treonina, valina,
prolina, serina, histidina), a velocidade de crescimento aumentou com o aumento da
concentração do aminoácido entre 2 e 8 mM (que foi a faixa estudada);glicina e
cistina, entretanto, causaram efeitos inibitórios ao crescimento na concentração de 8
mM; glutamina foi o aminoácido individualmente consumido com maior rapidez,
seguido por asparagina lisina, alanina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Essa maior
velocidade no consumo de glutamina como fonte de nitrogênio está de acordo com o
que se conhece acerca da assimilação de NH
4
+
e de aminoácidos por Azospirillum,
como será visto no item seguinte, e está de acordo também com os resultados
apresentados por Shawky, (1990).
As outras fontes de nitrogênio orgânico (ácidos casaminados, peptona e
extrato de levedura, testados em concentrações entre 0,05 e 5 g/L) estimularam o
3 Fontes de Nitrogênio
37
crescimento, devendo-se salientar também que concentrações dessas fontes entre
0,05 e 0,50 g/L não reprimiram a atividade da nitrogenase (Das & Mishra, 1982).
Com as informações expostas, pode-se concluir que para o processo de
produção de Azospirillum deve-se preferir amônio (evitando o nitrato) como fonte de
nitrogênio, uma vez que essa substância conduz os maiores fatores de conversão e
velocidades específicas de crescimento.
Para facilitar alguns aspectos da discussão dos resultados, principalmente no
tocante aos efeitos do nitrogênio presentes no extrato de levedura sobre o
crescimento Azospirillum spp é importante descrever as formas de assimilação de
amônia e aminoácidos em bactérias (Brown, 1980; Stanier & Painter,1986; Tibelius
& Knowles, 1983).
A primeira etapa de assimilação de amônia (e de aminoácidos) é o seu
transporte ativo através da membrana celular. Embora não se conheçam exatamente
os mecanismos e gasto energéticos desse transporte sabe-se que a concentração
interna de amônia quando ela mesma é usada como única fonte de nitrogênio varia,
para diferentes microrganismos, de 1,4 a 10,8 nM (Cordts & Gibson ,1987; Gordon
& Moore, 1981; Schreier & Bernlohr, 1982). Também já foi demonstrada a
existência de um sistema ativo de transporte de amônia, repressível e dependente de
energia (Hartmann & Kleiner, 1982), sem entretanto se determinar as concentrações
internas ou dos gradientes máximos.
Após o transporte, a amônia entra no metabolismo bacteriano através de três
reações, para formar glutamato e glutamina, com o envolvimento das seguintes rotas
de assimilação de NH4+: a) GDH – glutamato desidrogenase; b) GS-GOGAT –
Glutamina sintase e glutamina-cetoglutarato amino transferase. Ambas as vias levam
a incorporação do N fixado no grupo amida do aminoácido glutamato. A via GDH
3 Fontes de Nitrogênio
38
opera quando a concentração de NH4+ está acima de 1,5 mM e a via GS-GOGAT é
ativada quando esta concentração é mais baixa de 1,5 mM. Uma possível explicação
se fundamenta na energia gasta para esta assimilação, pois a via GDH opera com o
gasto de 1 NADPH
2
, enquanto a via GS opera com gasto de 1NADH + 2 ATP/ mol
glutamato formado, sendo, dessa maneira, mais onerosa para a célula. As reações
principais de assimilação estão ilustradas na figura 3.2 abaixo.
Figura 3.2 - Esquema de assimilação de amonia em bactérias.
Enzimas envolvidas 1 – GLUTAMATO DESIDROGENASE (GDH)
2 – GLUTAMINA SINTETASE (GS)
3 – GLUTAMATO SINTASE (GOGAT)
4 – TRANSAMINASES
3 Fontes de Nitrogênio
39
Não se conhece ainda exatamente qual sistema enzimático (GDH ou GS-
GOGAT) seria o predominante em Azospirillum para a produção do glutamato, mas
Westby & Meeks, 1987, afirmam que a via pode ser determinado de acordo com a
concentração de amônia disponível, ou seja, quando baixa (como na fixação de
nitrogênio) o sistema principal em atuação seria o GS-GOGAT e quanto mais
elevada, passaria a predominar a catálise pela GDH. E essa questão é relevente do
ponto de vista bioenergético e de processo, pois quando GDH atua não há gasto de
ATP e pode-se obter, no máximo, 28,8 g cel/mol de ATP gerado pela fonte de
carbono e quando GS-GOGAT é o sistema atuante há um gasto de 1 mol de ATP por
mol de NH
4
+
incorporado e o valor máximo de Y
ATP
que se pode esperar é de 23,1 g
cel por mol de ATP (Stouthamer, 1978).
Em relação à produção de aminoácido a partir amônia como fonte de
nitrogênio, as etapas iniciais são melhor conhecidas: o metabolismo passa pela
formação de glutamato , quer pela degradação direta do aminoácido através das rotas
bioquímicas já conhecidas (Lehninger, 2004) ou por reações de transaminação, pela
adição de grupo amino ao ácido α - cetoglutarato, numa reação exatamente inversa à
de nº 4 da figura 3.2.
Quando os aminoácidos são usados não só como fonte de nitrogênio, mas
também como fonte de carbono e energia, há necessidade de formação ou ativação
de sistemas enzimáticos específicos que nem sempre estão presentes quando as
fontes de carbono e energia são açúcares ou ácidos orgânicos (Tyler, 1978; Castillo
and Mora, 2000) e isto pode atrasar o anabolismo, introduzindo “lags” no
crescimento celular.
Deve-se mencionar ainda que no caso de ocorrer suprimento de misturas de
aminoácidos, alguns deles poderão ser usados diretamente pelo anabolismo,
enquanto outros entrarão nas reações de transaminação para formação de glutamato
(e glutamina). Os aminoácidos que são usados diretamente dispensam a ativação dos
sistemas enzimáticos específicos e isto, além de acelerar o metabolismo, ainda
3 Fontes de Nitrogênio
40
aumenta o aproveitamento dos compostos e da energia disponível, o que torna
potencialmente interessante a utilização de extrato de levedura e outros suplementos
protéicos.
3 Cultivo descontínuo alimentado
41
3.3 Cultivo descontínuo alimentado
Os cultivos descontínuo-alimentado são empregados quando se pretende
obter determinadas concentrações celulares (ou de algum metabólito) que demandam
quantidades de substratos que provocariam inibição do crescimento num cultivo
descontínuo comum (“batch”).
O processo consiste em começar o cultivo no fermentador como se fosse um
processo descontínuo comum. A partir do momento em que um ou mais substratos
atinjam concentrações que limitem o crescimento celular (ou produção de um
metabólito), inicia-se a suplementação destes substratos (previamente preparados e
esterilizados) ao meio. A alimentação é feita através de uma ou mais bombas, que
podem ter vazão constante ou, preferencialmente, vazão variável que acompanhe a
velocidade de demanda dos substratos pelo microrganismo. O processo é
interrompido quando se atinge a capacidade volumétrica máxima do fermentador, ou
antes, se o resultado esperado foi alcançado (Schimidel et al, 2001).
Neste processo, a concentração dos subtratos limitantes no fermentador deve
ser mantida sempre num valor baixo, que não provoque limitação. É a adição
contínua que vai garantir o suprimento constante de substrato, necessário ao bom
desempenho microbiano (Yamane & Shimizu, 1984). Através deste processo,
podem-se atingir concentrações celulares elevadas, impossíveis de ser obtidas nos
cultivos descontínuos comuns.
4 Objetivos
42
4. Objetivos
Este trabalho tem por objetivo geral o estudo do cultivo de A. brasilense e A.
lipoferum no sentido de se contribuir para o estabelecimento das bases tecnológicas
para a produção industrial de inoculantes, através da escolha das fontes de carbono e
nitrogênio mais promissoras do ponto de vista industrial e fornecer subsídios para o
estabelecimento de protocolos de produção de biomassa destas bactérias a alta
densidade celular.
5 Materiais e métodos
43
5. Materiais e métodos
5.1 Microrganismo
Foram utilizadas as linhagens de Azospirillum brasilense Sp7 e Azospirillum
lipoferum Br 17 gentilmente cedidas pela Dra. Vera Lúcia Baldani do Centro
Nacional de Pesquisas em Agrobiologia, da Embrapa, em Seropédica, RJ. As
linhagens eram mantidas na coleção de microrganismos do IPT por liofilização e/ou
criopreservação em freezer a -80ºC e em meio sólido NFB que continha L-malato e
NH
4
Cl como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente.
5.2 Meios de Cultura
5.2.1 Soluções-estoque
Para o preparo de diferentes meios de cultura eram utilizadas as soluções-
estoque relacionadas a seguir (todas as porcentagens são em massa/volume):
I
I
–
–
solução de MgSO
4
.7H
2
O a 10%;
I
I
I
I
–
–
solução de NaCl a 10%;
I
I
I
I
I
I
–
–
solução de CaCl
2
.2H
2
O a 1%;
I
I
V
V
–
–
solução de Fe EDTA a 1,64%;
V
V
–
–
solução de micronutrientes
V
V
I
I
–
–
solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%; (solução 0,5% em 0,2N KOH)
V
V
I
I
I
I
–
–
solução de vitaminas.
A solução de Fe EDTA foi preparada misturando-se 16,0 g de Na
2
EDTA (sal
di-sódico do ácido etileno diaminotetra-acético) com 11,95 g de FeSO
4
.7H
2
O e 950
5 Materiais e métodos
44
mL de água, aquecendo-se até dissolução e, após resfriamento, completando-se o
volume até 1,0 litro.
A - A solução de micronutrientes continha, por litro: (Döbereiner, 1995):
0,04 g CuSO
4
.5H
2
O;
1,20 g ZnSO
4
.7H
2
O;
1,40 g H
3
BO
3
;
1,00 g Na
2
MoO
4
.2H
2
O
1,175 g MnSO
4
.H
2
O.
B – A solução de vitaminas continha: (Döbereiner, 1995)
10 mg biotina
20 mg piridoxol-HCl
A solução era dissolvida em banho-maria e completada o volume para 100
mL com água destilada, em seguida era filtrada e mantida a solução em geladeira.
5.2.2 Solução salina
Para diluição do inóculo foi utilizada solução salina com a seguinte
composição, por litro: (Döbereiner, 1995)
3,4 g KH
2
PO
4
;
2,0 mL da solução de MgSO
4
.7H
2
O a 10%;
1,0 mL da solução de NaCl a 10%;
2,0 mL da solução de CaCl
2
.2H
2
O a 1%;
2,0 mL da solução de micronutrientes;
4,0 mL Fe EDTA (solução 1,64%);
4,5 g KOH
O pH desta solução foi ajustado para 7,0 com KOH.
5 Materiais e métodos
45
5.2.3 Meio de cultura para conservação do Microrganismo
A partir dos liófilos armazenados foram preparados tubos com meio de
cultura NFb sólido e incubação em estufa a 30ºC. A composição do meio é a
seguinte:
5 g de ácido málico;
0,5 g de K
2
HPO
4
;
1,0 g de Extrato de Levedura;
2,0 mL da solução de MgSO
4
.7H
2
O a 10%;
1,0 mL da solução de NaCl a 10%;
2,0 mL da solução de CaCl
2
.2H
2
O a 1%;
2,0 mL de solução de micronutrientes;
2,0 mL de solução alcoólica de azul de bromotimol a 5%;
4,0 mL de solução de Fe EDTA a 1,64%;
1,0 mL de solução de vitaminas;
4,5 g de KOH;
15 g de agar-agar.
No preparo do meio adicionavam-se as substâncias na ordem indicada e
ajustava o pH para 6,8 utilizando-se solução de NaOH e completava o volume para
1000 mL com água destilada.
A cultura foi transferida a erlenmeyer contendo o meio citado, com exceção
do agar, em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC por 72 horas. Após o cultivo foi
preparada uma solução a 50% de glicerol (p/v) para ser adicionada à cultura crescida.
Posteriormente, 0,5 mL da solução de glicerol 50% e 0,5 mL do meio NFb foram
dispostos em tubos Eppendorfs estéreis e levados ao freezer à -80ºC.
5 Materiais e métodos
46
5.2.4 Meios de cultura sólido para preparo do inóculo
Pré-inóculo: Um tubo Eppendorf contendo as cepas de Azospirillum spp
foram crescidas em meios sólido que consistiram de Agar nutriente (AN), Luria
Bertani (LB), Agar de Soja-Triptona (TSA), Agar Potato Dextrose (PDA) e NFb (já
descrito no item anterior) para averiguação da adaptação e crescimento por 5 dias em
estufa a 30ºC.
Inóculo: Baseado nos resultados da etapa anterior selecionou-se entre os
meios sólidos testados suas respectivas formulações líquidas para preparação dos
inóculos.
5.2.5 Meios de cultura líquidos
Foram utilizados meios de cultura nos ensaios em incubador rotativo e reator
com as fontes de carbono e nitrogênio selecionadas. A composição básica de todos
os meios, que será identificado como meio F, era composto de: (Dias, 1988).
2,64 g K
2
HPO
4
;
2,0 mL da solução de MgSO
4
.7H
2
O a 10%;
1,0 mL da solução de NaCl a 10%;
2,0 mL da solução de CaCl
2
.2H
2
O a 1%;
4,0 mL da solução solução de Fe EDTA a 1,64%;
5,0 Fonte de C selecionadas (frutose, sacarose, glicerol, lactato e etanol);
1,0g Extrato de Levedura;
1,32g (NH
4
)
2
HPO
4
/NH
4
Cl;
água filtrada ... qsp 1000 mL
5 Materiais e métodos
47
Todos os meios de cultura tiveram seu pH ajustado para 6,8 e foram
esterilizados a 121ºC por 30 minutos. A frutose, a sacarose, o glicerol e o lactato
foram esterilizados em separado, o etanol foi devidamente filtrado com filtro estéril e
posteriormente adicionadas ao meio no momento da inoculação.
Averiguação do crescimento aeróbio de Azospirillum brasilense e
Azospirilum lipoferum em meio mínimo que continha respectivamente por litro
(Martinez & Burris, 1983):
4,0 g KH
2
PO
4
;
6,0 g K
2
HPO
4
;
0,2 g MgSO
4
.7H
2
O;
0,1 g NaCl;
0,026 g CaCl
2
.2H
2
O;
1,0 g NH
4
Cl;
0,01 g FeCl
3
;
0,002 g Na
2
MoO
4
.2H
2
O;
0,001 g biotina;
9,72 g sacarose (pH 6,8)
5.3 Ensaios em incubador rotativo
5.3.1 Equipamento
Foram utilizados incubadores rotativos, com controle de temperatura por
circulação de ar aquecido e freqüência de agitação ajustável.
5 Materiais e métodos
48
5.3.2 Preparo do Pré-inóculo
Foi retirado da cultura estoque mantida em freezer à -80ºC, inoculado em
meio CN (3g Extrato de carne e 5g de Peptona bacteriológica por litro) em frascos
erlenmeyer de 125 mL e colocado em agitador rotativo a 200 rpm e 30ºC, com os
seguintes tempos de incubação: A. brasilense, 40 horas; A. lipoferum, 18 horas.
5.3.3 Preparo do inóculo
Em seguida, cerca de 10% da suspensão foi transferida para Caldo Nutriente e
incubadas novamente por 24 horas. Em alguns experimentos em biorreator a segunda
passagem foi realizada com meio de cultura com a mesma composição do meio
utilizado no ensaio.
5.3.4 Inoculação dos frascos
Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos com frascos erlenmeyer
de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura (meioF). A inoculação de cada um
dos frascos era feita com 10% da suspensão bacteriana preparada e padronizada
como anteriormente descrito.
5.3.5 Incubação e amostragem
Os frascos eram incubados à temperatura constante de 30ºC, com velocidades
de 200 rpm. A amostragem era feita retirando-se, de tempos em tempos, um frasco
de erlenmeyer do incubador.
5 Materiais e métodos
49
5.3.6 Determinações efetuadas
Em cada amostra dos ensaios de incubador rotativo foram determinados;
- pH;
- absorbância celular;
- a concentração celular (massa seca e em termos de número de unidades f
ormadoras de colônias em placas/mL);
- consumo da fonte de carbono (frutose, sacarose, etanol, lactato e glicerol);
- consumo do nitrogênio inorgânico;
- consumo de fósforo.
5.4 Ensaios em fermentador, processo descontínuo
5.4.1 Equipamento
Foram utilizados biorreatores New Brunswick Scientific de 5 L de volume
para os ensaios em batelada e o Biostat Braun ED de 10 L de volume útil, que
permitia o controle da freqüência de agitação, de vazão de ar, temperatura e oxigênio
dissolvido e monitorava automaticamente o pH por adição de solução de HCl ou
NaOH 2N.
A esterilização do meio de cultura, do fermentador, e dos filtros de ar e frasco
com anti-espumante e soluções controladoras de pH era efetuada por autoclavação a
121ºC por 40 minutos. Para o cultivo em alta densidade celular foi utilizado
biorreator.
5 Materiais e métodos
50
5.4.2 Preparo do inóculo
O inoculo de um ensaio descontínuo constituía-se de microrganismos
cultivados em incubador rotativo, segundo a seqüência descrita no item 5.3.2 e 5.3.3,
utilizando-se erlenmeyers de 2 litros com 500 mL de meio utilizado no fermentador.
5.4.3 Inoculação do Fermentador
A inoculação do fermentador era feita com de 24 horas para A. brasilense e
de 18 horas para A. lipoferum.
O volume de inoculo era cerca de 10% do volume total no fermentador.
5.4.4 Amostragem
Para possibilitar a coleta de amostras de forma asséptica, foram utilizados
tubos de ensaios estéreis e auxílio do bico de Bunsen.
5.4.5 Determinações efetuadas
Durante o cultivo são retiradas, em periodicidade e volumes
previamente definidos, amostras assépticas e não-assépticas. As assépticas destinam-
se à avaliação da concentração de unidades formadoras de colônias e a amostra não
asséptica para outras determinações representado na Figura 5.1.
5 Materiais e métodos
51
Figura 5.1 - Esquema da metodologia analítica utilizada no tratamento das amostras.
5.5 Métodos de Análises Físicas, Químicas e Microbiológicas
5.5.1 Determinação da Absorbância (A)
Foi determinada diretamente no caldo fermentado dos cultivos em
incubador rotativo e em fermentador.
A leitura foi feita em espectrofotômetro Thermoelectric cell Holder (U-
2001) modelo 131-0307 no comprimento de onda de 540nm. Como “branco”,
utilizou-se água destilada. A leitura foi realizada na faixa de 0,01 a 0,7 de
absorbância. Quando superior, dilui-se a amostra o número de vezes necessárias.
5 Materiais e métodos
52
5.5.2 Concentração Celular Mássica (X)
Para efetuar a determinação da concentração celular centrifugava-se a 4ºC um
volume adequado do caldo a 9800 xg durante 10 minutos.
Separava-se o sobrenadante, ressuspendia-se o centrifugado em pequeno
volume de água destilada e filtrava-se a suspensão através da membrana Millipore
(diâmetro de poro de 0,45 ųm), previamente pesada.
O resíduo em conjunto com o filtro era colocado em estufa a 105ºC por 4
horas (tempo sulficiente para obter peso constante). Decorrido esse período,
transferia-se o conjunto para um dessecador e, quando frio (após aproximadamente
15 minutos), procedia-se a pesagem.
5.5.3 Concentração de Unidades Formadoras de Colônias em placas (UFC)
A contagem de unidades formadoras de colônias em placas foi realizada
segundo o método de Miles & Misra (1938). As amostras foram convenientemente
diluídas e gotas de 25 µL cada foram semeadas em meio AN (Agar nutriente). Após
incubação por 48 horas, em estufa a 30ºC, obteve-se a média da contagem de 9 gotas
para cada ponto obtido, exprimindo-se os resultados em UFC/mL de amostra.
5.5.4 Concentração de Frutose, Sacarose, Etanol, Glicerol e Lactato
(
(
S
S
)
)
As concentrações de frutose, sacarose, lactato foram determinadas por
cromatografia de fase líquida (HPLC – Waters 510) equipado com uma coluna para
determinação de açúcares. Um volume de µL do sobrenadante da amostra era
injetado no equipamento. E para a determinação de etanol, foi utilizado
Cromatógrafo a gás (HP 5840-A) equipado com detector de ionização por chama de
5 Materiais e métodos
53
hidrogênio, injetor tipo split/splitless e forno com capacidade de realizar de
programação de temperatura. Para o preparo da curva de calibração foram preparadas
soluções padrões contendo diferentes concentrações (% em massa) utilizando o n-
butanol como solvente. As soluções preparadas devem estar numa faixa de
concentrações que normalmente são encontradas nas amostras. Identificados os picos
de etanol, de acordo com o cromatograma padrão anexo, obteve-se as respectivas
áreas. Criou-se uma curva de calibração, colocando no eixo das abscissas os valores
das relações de área e, no eixo das ordenadas os valores de concentração dos
respectivos componentes nas soluções.
Para determinação da concentração de glicerol, foi realizado conforme o
método IPT/DQEQ (1982), determinação de glicerol por oxidação de periodato de
sódio.
a - Pesava-se uma alíquota (filtrada da determinação da massa seca ou sobrenadante
da centrifugação) em pés-filtro ou béquer pequeno, segundo a tabela 5.2:
Tabela 5.2 Concentração de glicerol em g/L na amostras.
Concentração esperada de
Glicerol na amostra (g/L)
Peso da alíquota (g)
8 – 10 5
5 – 8 10
2 – 5 15
< 2 20
b – Transferia a amostra a um béquer de 300 mL, lavando-se algumas vezes com
água destilada o recipiente usado para a pesagem da amostra;
c – Diluia-se a amostra a 50 mL;
d – Adicionava-se H
2
SO
4
0,2N até que o pH se tornasse iguala 3,0;
5 Materiais e métodos
54
e – Em seguida, adicionava-se NaOH 0,05 N até que o pH atingisse o valor 8,1 ± 0,1
(no final, usava NaOH 0,005 N para facilitar este acerto);
f – Preparava-se um branco contendo 50 mL de água destilada e procedia ao mesmo
ajuste de pH;
g – Adicionava-se 10 mL de solução de periodato de sódio (obtida dissolvendo-se 60
g de NaIO
4
em água destilada contendo 120 N de H
2
SO
4
0,1 N e diluído a 1 L),
agitava-se o conteúdo para homogenizar, cobria com vidro de relógio e deixava em
repouso por 30 minutos, no escuro, a temperatura inferior a 35ºC;
h – Adicionava 2 mL de solução de etilenoglicol 50% e deixava por 20 minutos;
i – Diluia a a proximadamente 100 mL e titulava com NaOH aproximadamente 0,125
N (normalidade perfeitamente conhecida), usando medidor de pH, até pH 6,5 para
branco e Ph 8,1 ± 0,1 para a amostra. Perto do ponto final, colocava-se 1 gota ou
fração de gota de cada vez;
j – Cálculo:
% glicerol =
m
NVbVa 20959,**)( −
onde: V
a
= volume de NaOH gasto na titulação da amostra (mL);
V
b
= volume de NaOH gasto na titulação do branco (mL);
N = normalidade do NaOH;
m = massa da alíquota da amostra (g)
5.5.5 Avaliação da concentração de nitrogênio amoniacal
O método permite a determinação de nitrogênio na forma de amônio via
eletrodo específico (Orion ammonia gas-sensing electrod, Model 95-12) através da
conversão de amônio a amônia.
5 Materiais e métodos
55
Esse eletrodo é constituído por uma membrana hidrofóbica gás-permeável
que separa a solução de amostra da sua solução interna. A amônia dissolvida na
amostra difunde-se através da membrana até que as pressões parciais do lado interno
e externo à membrana se igualem. A pressão parcial de amônia será proporcional á
concentração presente na amostra.
Preparo das amostras:
Devem ser preparadas curvas de calibração com solução-padrão de sulfato de
amônio em diferentes concentrações a cada lote de amostras a serem analisadas.
Amostras e soluções-padrão devem ser analisadas sempre à mesma temperatura.
Procedimento analítico:
(1) Adiciona-se 0,2 mL de NaOH de solução 10 N em 2,0 mL de amostra
(sobrenadante do centrifugado) ou solução-padrão, no momento da leitura. Com esse
procedimento o amônio presente na solução passa a forma de amônia, sendo então
determinado;
(2) Amostras e padrões são agitados com agitador magnético;
(3) As leituras são realizadas no condutivímetro (Procyon Model AS 720), em
milivolt, a cada 30 segundos, até que a corrente se estabilize;
(4) O eletrodo deve ser lavado com água destilada entre as medidas de uma
amostra e outra e colocado em uma solução de descanso (solução-padrão 10 ppm);
(5) A concentração de amônio é calculada segundo a curva de calibração obtida
com as soluções-padrão.
5.5.6 Avaliação da concentração de fósforo
O método do ácido ascórbico determina o in fosfato (PO
4
) contido na amostra
por análise colorimétrica (Franson, 1998).
5 Materiais e métodos
56
Para efetuar o procedimento do método do ácido ascórbico é necessário
preparar os seguintes reagentes:
1. H
2
SO
4
5 N – Diluir 70 mL de ácido sulfúrico concentrado em 500 mL de
água destilada;
2. Tartarato de antimônio e potássio – Dissolver 1,3715 g do sal em 400 mL de
água destilada, elevar o volume para 500 Ml. Acondicionar em frasco de vidro.
3. Molibdato de amônio – Dissolver 20 g do sal em 500 mL de água destilada.
(Acondicionar em frasco de vidro).
4. Ácido ascórbico 0,1 M – Dissolver 1,76 g de ácido ascórbico em 100 mL de
água destilada. (A solução fica estável por uma semana à 4ºC).
Em seguida, prepara-se o reativo utilizando as soluções descritas acima:
Para obter 100 mL do reativo prepara-se: 50 mL do reagente 1;
5 mL do reagente 2;
15 mL do reagente 3;
30 mL do reagente 4.
Deve-se preparar o reativo à temperatura ambiente. (Esta mistura é estável
por um período de 4 horas).
Na solução padrão (0,15 a 1,30 mg/L de P) deverá dissolver 219,5 mg de
K
2
HPO
4
anidro em 1000 mL de água destilada e assim prepara-se os padrões por
diluição (1:0; 1:2; 1:4; 1:6; 1:8 e 1:10).
Procedimento para análise colorimétrica:
(1) Prepara-se 200 µL de amostra ou padrão ou água destilada (branco);
(2) Adiciona-se 4,9 Ml de água destilada e deionizada no tubo contendo o item 1;
(3) Adiciona-se 800 µL do reativo;
(4) Incuba-se por 10 minutos;
5 Materiais e métodos
57
(5) Efetua-se as leituras a 880 nm em durante;
(6) Calcular a concentração de Fósforo em mg/L segundo a curva de calibração
obtida com as soluções-padrões.
5.6 Cálculo dos parâmetros cinéticos
Os parâmetros cinéticos µ
max
(velocidade específica máxima de crescimento) e
os fatores de conversão substrato a células, nitrogênio a células, respectivamente
Y
X/S
, Y
X/N
e produtividade de biomassa Px foram calculados conforme Hiss, (2001) e
Carvalho e Sato, (2001).
Determinou-se um tempo “final” (t
f
) em que a concentração celular mássica era
máxima ou que fonte de carbono estava esgotada, e em relação a esse tempo
calcularam-se os fatores de conversão e produtividade, pela equações a seguir:
¾ Fator de conversão de substrato em células (Y
X/S
)
(1)
onde: X
f
= concentração celular final (g/L);
X
O
= concentração celular inicial (g/L);
So = concentração da fonte de carbono inicial (g/L);
S
f
= concentração da fonte de carbono final (g/L).
¾ Fator de conversão de nitrogênio em células (Y
X/N
)
(2)
onde: N
O
= concentração de nitrogênio amoniacal inicial (g/L);
N
f
= concentração de nitrogênio amoniacal final(g/L).
5 Materiais e métodos
58
¾ Produtividade celular mássica
(3)
onde: t
f
= tempo para consumo da fonte de carbono (h).
¾ A velocidade específica máxima de crescimento celular (µ
max
)
Para determinar a fase de crescimento exponencial, foram traçadas curvas de
ln(X) (logaritmo neperiano da massa de célula) em função do tempo. Após traçadas
as curvas, notou-se que os pontos podia, ser correlacionados por uma reta e com isso
foi possível obter o µ
max
(velocidade específica de crescimento), através de uma
regressão linear (o coeficiente angular da correlação linear era o valor utlizado),
segundo a equação (4):
lnX = µ
max
. t (4)
Xo
5.7 – Experimentos realizados e nomenclatura dos ensaios
Para estudar o crescimento de Azospirillum ssp em diversas fontes de carbono
e nitrogênio, em dois sistemas de cultivo, foram desenvolvidos 27 experimentos para
A. brasilense e 22 para A. lipoferum.
O nome de cada ensaio é composto por cinco letras e um número: as duas
primeiras letras (Az) indicam a abreviação da palavra Azospirillum e as duas
seguintes (br ou lp) o organismo que participa no ensaio e a última letra (S ou F)
demonstra o processo/equipamento utilizado; o número é seqüencial por tipo de
ensaio (Tabela 5.1).
5 Materiais e métodos
59
Tabelas 5.2 Experimentos realizados para o estudo do crescimento de A. brasilense
Sp7 e A. lipoferum Br 17 e ensaios componentes de cada experimento.
Experimento Ensaios Fonte de Carbono Fonte de Nitrogênio Tempo de ensaio (h) Título
Azbr01 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
1
Azbr02 (S)
Frutose
NH
4
Cl
120,0
Azbr03 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
2
Azbr04 (S)
Glicerol
NH
4
Cl
120,0
Azbr05 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
3
Azbr06 (S)
Sacarose
NH
4
Cl
120,0
Azbr07 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
4
Azbr08 (S)
Lactato
NH
4
Cl
120,0
Azbr09 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
5
Azbr10 (S)
Etanol
NH
4
Cl
120,0
Azlp01 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
6
Azlp02 (S)
Frutose
NH
4
Cl
120,0
Azlp03 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
7
Azlp04 (S)
Glicerol
NH
4
Cl
120,0
Azlp05 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
8
Azlp 06 (S) Sacarose NH
4
Cl 120,0
Azlp07 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
9
Azlp08 (S)
Lactato
NH
4
Cl
120,0
Azlp09 (S) (NH
4
)
2
HPO
4
E
10
Azlp10 (S)
Etanol
NH
4
Cl
120,0
Influência da concentração das fontes de Carbono e
Nitrogênio sobre o crescimento microbiano.
E
11
Azlp01 (F) Sacarose (NH
4
)
2
HPO
4
7,5
E
12
Azlp02 (F) Glicerol (NH
4
)
2
HPO
4
11,0
Azbr01(F) 15,0
Azbr02 (F) 13,0
E
13
Azbr03 (F)
Frutose (NH
4
)
2
HPO
4
13,0
Azbr04 (F) 18,0
E
14
Azbr05 (F)
Glicerol (NH
4
)
2
HPO
4
37,0
Azbr06 (F) 26,0
E
15
Azbr07 (F)
Etanol (NH
4
)
2
HPO
4
12,0
Determinar quais das fontes
de C e N é melhor do ponto
de vista de processo e do
ponto de vista econômico.
(S) = shaker e (F) = Fermentador
Obs:. Todos os ensaios em incubador rotativo foram feitos em duplicata.
6 Resultados e Discussão
60
6. Resultados e Discussão
6.1 Meios sólidos
Os resultados obtidos após incubação por cinco dias, em meio sólido a 30ºC estão
resumidos na tabela 6.1. Dos meios de cultura testados: Agar nutriente (AN), Luria Bertani
(LB) e Agar de Soja-Triptona (TSA) demonstraram colônias bem caracterizadas quanto à
cor, diâmetro, consistência das colônias e excelente crescimento celular para ambas as
linhagens. Entretanto, o meio de cultura que atendeu tanto o critério de maior velocidade de
crescimento e maior quantidade de células quanto aos critérios de disponibilidade e preço,
evitando a utilização de matéria-prima que tenha apenas um único fabricante ou fornecedor
foi o Agar nutriente (AN).
Tabela 6.1 Crescimento das bactérias nos meios sólidos selecionados.
Meio de cultura A. brasilense Sp7 A. lipoferum BR 17
NA
+++ +++
LB
+++ +++
PDA
+ +++
TSA
+++ +++
NFb
++ ++
Símbolos: +++, excelente crescimento; ++ bom crescimento; + pouco crescimento. Agar nutriente
(AN), Luria Bertani (LB), Agar de Soja-Triptona (TSA), Agar Potato Dextrose (PDA) e Novo Fábio
Pedrosa. (NFb)
6.2 Fonte de Nitrogênio
A princípio, poder-se-ia empregar amônia, aminoácidos, proteínas e até mesmo
nitrogênio gasoso como fontes desse elemento para o crescimento microbiano, mas deve-se
levar em consideração critérios que se referem à velocidade da produção, aos fatores de
6 Resultados e Discussão
61
conversão, e à facilidade de compatibilização da etapa de crescimento celular com as
demais etapas do processo. A tabela 6.2 apresenta os melhores resultados da seleção
realizada nos ensaios em duplicata em incubador rotativo e suas respectivas biomassas. Das
duas fontes suplementadas ao meio de cultura, NH
4
Cl, conforme citado por Döbereiner,
(1995) e (NH
4
)
2
HPO
4
mencionada em Dias, (1988). Os resultados mostram que elas são
equivalentes em termos de crescimento e, por facilidade de preparação já que (NH
4
)
2
HPO
4
é fornecedor de P ao sistema, este foi o escolhido.
Tabela 6.2 Concentração final de biomassa para as fontes de N testadas (120 h de cultivo)
Ensaios
A. brasilense Sp7 A. lipoferum BR17
(NH
4
)
2
HPO
4
/frutose 2,82 g/L 1,58 g/L
NH
4
Cl/frutose 2,38 g/L 1,27 g/L
(NH
4
)
2
HPO
4
/glicerol 2,20 g/L 1,62 g/L
NH
4
Cl/glicerol 2,19 g/L 2,04 g/L
(NH
4
)
2
HPO
4
/sacarose 0,89 g/L 2,21 g/L
NH
4
Cl/sacarose 0,57 g/L 2,19 g/L
(NH
4
)
2
HPO
4
/lactato 2,01 g/L 1,82 g/L
NH
4
Cl/lactato 1,73 g/L 1,76 gL
(NH
4
)
2
HPO
4
/etanol 1,85 g/L 1,26 g/L
NH
4
Cl/etanol 1,57 g/L 1,06 g/L
* fontes testadas nos ensaios em incubador rotativo
6.3 Ensaios em incubador rotativo
São apresentados na tabela 6.3 o resumo de todos os resultados obtidos nos ensaios
em incubador rotativo e nas figuras 6.1 a 6.5 as curvas dos resultados destes ensaios, todos
realizados à temperatura de 30ºC e 200 rpm.
6 Resultados e Discussão
62
O principal objetivo destes ensaios foi avaliar a influência das fontes de carbono e
nitrogênio no crescimento de Azospirilla e nos correspondentes fatores de conversão e
produtividade.
6.3.1 Frutose
O desenvolvimento das bactérias do gênero Azospirillum utilizando frutose como
principal fonte de carbono, apresentaram-se bem caracterizado.
Nos ensaios em duplicata em Azbr01, Azbr02, Azlp01 e Azlp02, utilizando fontes
de nitrogênio diferentes (NH
4
)
2
HPO
4
e NH
4
Cl)
pôde-se observar que antes de completar 24
horas de ensaio, as células iniciavam uma fase de aumento da concentração celular que era
acompanhada pelo decréscimo da concentração de frutose e de nitrogênio. Esta fase de
crescimento terminou quando a concentração de C limitante. Nos ensaios utilizando
(NH
4
)
2
HPO
4
com A. brasilense Sp7 observou-se um pequeno decréscimo no pH até o final
dos ensaios. Já para o NH
4
Cl usando o mesmo organismo, há aumento do pH a partir de
100 horas de ensaio, em resposta à liberação de íons fosfato (a parte não foi utilizada pelas
bactérias) pelo consumo de amônia e por conseqüência da lise celular, que libera N protéico
para o meio. Houve consumo de nitrogênio e frutose em ambas e não se percebe o
crescimento subseqüente a partir de aproximadamente 30 horas de ensaio (Figuras 6.1).
Deve-se salientar que foi observado a formação de flocos, sendo mais intensa quando maior
o tempo do ensaio.
6 Resultados e Discussão
63
6.3.2 Glicerol
Uma primeira característica de todos os cultivos com glicerol foi um período de
crescimento celular com baixo consumo de N presente no meio de cultura. Esse período foi
acompanhado por valores de pH constantes ou ligeiramente ascendentes. Quando se iniciou
o consumo de nitrogênio inorgânico, o pH decresceu. Não se verificou o aparecimento de
duas fases exponenciais de crescimento nos ensaios utilizando glicerol e extrato de
levedura. Mas também houve o consumo de nitrogênio e glicerol sem o crescimento
subseqüente. Foi observado o aparecimento de flocos (Figuras 6.2). Para o glicerol obteve-
se o dobro dos valores dos fatores de conversão e das produtividades de A. brasilense Sp7
em relação a A. lipoferum Br 17 (Tabela 6.4).
6.3.3 Sacarose
Para averiguar o crescimento de Azospirillum utilizando sacarose como fonte de
carbono, o meio de cultura (MM), descrito na página 46, foi preparado e inoculado com as
linhagens utilizadas neste trabalho. Pois Martinez & Buris, (1983), cresceram aerobiamente
A. brasilense e A. lipoferum e concluíram que ambas as linhagens não crescem utilizando
sacarose como fonte de carbono.
Os resultados confirmaram que Azospirillum realmente não cresce no meio mínimo
proposto, por ser um meio pobre, não contêm os nutrientes necessários para a mesma
desenvolver-se adequadamente. Levando-se essas informações em consideração, foi
acrescentado ao meio mínimo (MM), extrato de levedura, numa concentração pré-
determinada (0,075 g/L). Observou-se que para o crescimento sem fixação de nitrogênio,
nas temperaturas de 30 ou 35ºC, há necessidade da adição de extrato de levedura ao meio
de cultura, sendo ele provavelmente um dos nutrientes essenciais que age em conjunto com
os outros componentes para o desenvolvimento da bactéria. Constatou-se que a introdução
do estrato de levedura no meio propiciou o crescimento apenas de A. lipoferum BR17.
6 Resultados e Discussão
64
Para os ensaios com sacarose, as linhagens crescidas em meio F, foram obtidos
resultados desfavoráveis para A. brasilense Sp7, pois a concentração celular encontrada foi
baixa (0,3 g/L) e em momento algum do ensaio as fontes de carbono e nitrogênio foram
consumidas, implicando, conseqüentemente, em uma baixa produtividade (0,006 g/L.h),
dado apresentado na tabela 6.3. Entretanto, para A. lipoferum Br 17, obteve-se um
excelente crescimento celular, acompanhada pelo decréscimo da concentração das mesmas
fontes. A concentração de sacarose, glicose e frutose determinada por cromatografia de fase
líquida (HPLC) (resultados não apresentados), mostraram o consumo total deste substrato
antes de atingir 24 horas de ensaio. Ao contrário, para A. brasilense, em todas as amostras
analisadas, a concentração de sacarose permeneceu constante, e a concentração de glicose e
frutose não aparecem. Por ser um carboidrato, o decréscimo do pH ao longo do cultivo
pode ter ocorrido pela mesma razão verificada em frutose (Figura 6.3). Notou-se ainda,
mudança de cor e formação de flocos.
6.3.4 Lactato
Na utilização de sais de ácidos orgânicos (lactato) como fonte de carbono, a
tendência do pH foi aumentar em decorrência à liberação de íons de sódio que libera N
protéico para o meio. Como demonstrado nos ensaios, alterou-se o pH de 6,8 para 9,0 não
prejudicando, aparentemente, o crescimento celular ou o consumo dos substratos (Figuras
6.4). Em A. brasilense, os ensaios suplementados com DAP (diamônio-fosfato), o lactato
foi consumido mais rapidamente quando comparada a A. lipoferum. Metabolicamente o
lactato é convertido em piruvato e são utilizados como fonte de energia,
acelerando o
consumo do substrato nesta bactéria.
Nos ensaios observou-se a formação de flocos.
6 Resultados e Discussão
65
6.4.5 Etanol
É possível que as linhagens não tenham se adaptado ao meio de cultura que
continha etanol como única fonte de carbono. Pela análise da variação dos parâmetros
obtidos, pode-se observar que houve diferenças significativas para fatores de conversão,
produtividade e a diferença nos pHs apresentados na Tabela 6.3 para a interação entre os
fatores linhagens e substrato.
O crescimento de A. brasilense Sp7 foi superior à outra linhagem, obteve
concentração celular final de 2,0 g/L e pH 6,0. Já A. lipoferum BR 17, apresentou
comportamento diferente, onde o pH final foi 7,6 e concentração celular
consideravelmente baixa (1,030 g/L), e os devidos comportamentos durante os ensaios
estão representados nas figuras 6.5. Sabe-se que quanto maior o valor do pH, maior será a
degradação dos nutrientes contidos no meio, e nesses ensaios ocorre aumento do pH. O fato
dos ensaios durarem 120 horas, com agitação e temperatura definidas, também é um fator
que auxilia na degradação dos nutrientes, assim, soluções de DAP, nas mesmas condições
foram utilizadas como teste para averiguar o grau de degradação de N num período de 5
dias. E após análises de nitrogênio amoniacal, constatou-se que a solução inicial continha
0,5 g/L de Nitrogênio inorgânico enquanto que a solução final tinha apenas 0,2 g/L, sem
que se tenha consumo pelas bactérias. Observou-se em A. brasilense, o consumo de
carbono associado ao crescimento celular quando utilizado DAP na composição do meio de
cultura, sendo que ocorre limitação desta fonte a partir das 40 horas de ensaio. E o consumo
de nitrogênio não associado ao crescimento celular para ambas as linhagens.
6 Resultados e Discussão
66
(NH
4
)
2
HPO
4
NH
4
Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20406080100120140
tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20406080100120140
tempo (h)
g/L
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 20406080100120140
tempo (h)
pH
Figura 6.1 Evolução das concentrações de Biomassa, Frutose, Nitrogênio Amoniacal e pH
dos ensaios em duplicata nos experimentos E
1
(Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e
E
6
(Azlp01a
(○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
Frutose
Nitrogênio
Amoniacal
Biomassa
6 Resultados e Discussão
67
(NH
4
)
2
HPO
4
NH
4
Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20406080100120140
tempo (h)
g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
g/L
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 20406080100120140
tempo (h)
pH
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
Figura 6.2 Evolução das concentrações de Biomassa, Glicerol, Nitrogênio Amoniacal e pH
dos ensaios em duplicata nos experimentos E
2
(Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e
E
7
(Azlp01a
(○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Glicerol
Nitrogênio
Amoniacal
6 Resultados e Discussão
68
(NH
4
)
2
HPO
4
NH
4
Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20406080100120140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
Figura 6.3 Evolução das concentrações de Biomassa, Sacarose, Nitrogênio Amoniacal e pH dos
ensaios em duplicata nos experimentos E
2
(Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e
E
7
(Azlp01a (○) e
Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Sacarose
Nitrogênio
Amoniacal
6 Resultados e Discussão
69
(NH
4
)
2
HPO
4
NH
4
Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20406080100120140
tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
pH
Figura 6.4 Evolução das concentrações de Biomassa, Lactato, Nitrogênio Amoniacal e pH dos
ensaios em duplicata nos experimentos E
2
(Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e
E
7
(Azlp01a (○) e
Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Lactato
Nitrogênio
Amoniacal
6 Resultados e Discussão
70
(NH
4
)
2
HPO
4
NH
4
Cl
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20406080100120140
tempo (h)
(g/L)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 20 40 60 80 100 120 140
tempo (h)
(g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 20406080100120140
tempo (h)
pH
Figura 6.5 Evolução das concentrações de Biomassa, Etanol, Nitrogênio Amoniacal e pH
dos ensaios em duplicata nos experimentos E
2
(Azbr01a (♦) e Azbr01b (■)) e
E
7
(Azlp01a
(○) e Azlp01b (∆)), em agitador rotativo.
Biomassa
Etanol
Nitrogênio
Amoniacal
6 Resultados e Discussão
71
6.4 Observações gerais
Os flocos formados nestes ensaios eram aproximadamente esféricos e decantavam
quando em repouso. Os flocos tornaram-se visíveis a partir das 6h de cultivo.
Nos ensaios em que houve floculação notou-se também que os meios de cultura e as
células retidas nos filtros apresentavam-se rosadas, denotando a formação de carotenóides.
Esses dois eventos (floculação e formação de carotenóides) foram observados para A.
brasilense cd (Nur & Henis, 1981). Deve-se ressaltar que a hipótese de produção de alguma
substância extracelular poderia explicar a ocorrência de floculação. Em relação aos valores
obtidos nas análises de fósforo, não se observa coerência nos resultados, devido à presença
de carotenóides.
A formação de subprodutos durante o crescimento de Azospirillum não chega a
preocupar. Goebel & Krieg, (1984), demonstraram que os produtos finais do cultivo deste
microrganismo além de CO
2
e H
2
O são apenas alguns ácidos orgânicos, principalmente
acético, lático, glioxálico, málico, 2-oxoglutárico e β-hidroxibutírico; estes ácidos eram
formados em quantidades reduzidas, que consequentemente decrescem o pH e não
apresentavam efeito inibidor no metabolismo bacteriano.
Quase todos os ensaios com residual de substrato superior a 1 g/L indicavam que
possivelmente outro componente do meio de cultura era o limitante, quando não se
observou crescimento celular satisfatório. Esse limitante, entretanto, não era o nitrogênio
inorgânico, como pode ser visto nos resultados apresentados. Pois quando ocorria o
consumo total de substrato consequentemente ocorreu o aumento da concentração celular
final.
Para facilitar as comparações entre os resultados obtidos com substratos diferentes,
diversas grandezas, a tabela 6.3 reúne os valores iniciais e finais de pH, X, S, UFC (unidade
6 Resultados e Discussão
72
formadora de colônias), N, P, os fatores de conversão e a produtividade, para os ensaios em
incubador rotativo com A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17.
Para A. brasilense Sp7, foram avaliadas como mais eficientes as seguintes fontes de
carbono: frutose, glicerol, lactato e etanol.
As concentrações celulares e as produtividades nos cultivos com frutose foram
quase sempre superiores às obtidas com as demais fontes de carbono. Os fatores de
conversão de substrato e de nitrogênio em células apresentaram comportamentos distintos
para cada fonte de carbono. Considerando o mesmo tempo de ensaio para as linhagens, os
valores de pH, como pode ser visto na tabela 6.3, apresentam comportamento diferenciado,
ambas decresceram, pois com etanol as variações foram pequenas e suaves, mas com
glicerol e frutose foram bem mais abruptas. Com sacarose, observou-se o não consumo do
substrato, e consequentemente o retardamento do crescimento celular.
Já para A. lipoferum Br 17, foram avaliadas como melhores fontes de carbono em
ordem decrescente, de acordo com os valores numéricos da concentração celular e dos
fatores Y
X/S
,
os seguintes substratos: sacarose e glicerol. As demais fontes de C
conduziram os experimentos com resultados insatisfatórios.
Alguns comportamentos foram semelhantes para as fontes de carbono estudadas,
como por exemplo, o consumo de nitrogênio e substrato sem efetuar o crescimento celular.
Provavelmente, o oxigênio atuou como fator limitante, pois os nutrientes (nitrogênio e
substrato), que são consumidos após a velocidade específica de crescimento terem tendido
a zero, devem ter sido utilizadas somente para manutenção celular.
Nos ensaios em incubador rotativo, foram obtidas nas contagens de UFC valores
acima de 10
9
para ambas as linhagens, diferenciando-se segundo as fontes de carbono
utilizadas. Para A. brasilense utilizou-se frutose (3,22x10
9
), glicerol (2,25x10
9
) e etanol
(2,00x10
9
) e para A. lipoferum, utilizou-se sacarose (3,21x10
9
) e glicerol (1,02x10
9
).
6 Resultados e Discussão
73
Tabela 6.3 - Dados experimentais obtidos nos ensaios com A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 em
incubador rotativo (200 rpm, 30ºC).
Ensaio
Tempo
dos
ensaios
(h)
pHo pHf
Xo
(g/L)
Xf
(g/L)
So
(g/L)
Sf
(g/L)
U.F.C
inicial
(U.F.C/mL)
U.F.C final
(U.F.C/mL)
No
(g/L)
Nf
(g/L)
Po
(g/L)
Pf
(g/L)
Yx/s
(g/g)
Y
X/ N
(g/g)
Px
(g/L.h)
Azbr01 (a)
1
24 6,80 4,89 0,11 2,82 5,04 0,80 9,53E+06 1,62E+09 0,28 0,11 0,75 0,80 0,64 15,94 0,11
Azbr01 (b)
1
24 6,81 4,23 0,22 2,60 5,30 0,35 8,88E+06 2,31E+09 0,20 0,09 0,72 0,65 0,48 21,63 0,10
Azbr02 (a)
2
24 6,80 5,77 0,19 2,39 5,20 0,00 8,66E+06 3,22E+09 0,22 0,09 0,73 0,03 0,42 16,75 0,09
Azbr02 (b)
2
24 6,81 5,68 0,23 2,48 5,10 0,21 6,25E+06 1,43E+09 0,19 0,11 0,74 0,31 0,46 28,13 0,09
Azlp01 (a)
1
24 6,92 4,72 0,27 1,58 4,83 0,55 7,53E+06 9,80E+08 0,28 0,09 0,64 0,72 0,31 6,52 0,05
Azlp01 (b)
1
24 6,88 4,59 0,21 1,42 5,30 0,02 4,25E+06 6,78E+08 0,21 0,12 0,45 0,80 0,23 13,65 0,05
Azlp02 (a)
2
24 6,82 4,73 0,17 1,13 5,00 0,00 4,66E+06 5,28E+08 0,22 0,03 0,56 0,43 0,19 5,02 0,03
Azlp02 (b)
2
24 6,80 4,75 0,25 1,27 4,98 0,02 6,48E+06 6,66E+08 0,23 0,11 0,55 0,66 0,21 8,65 0,05
Azbr03 (a)
3
44 6,80 5,79 0,15 2,10 4,96 0,30 4,59E+08 2,02E+09 0,28 0,07 0,74 0,79 0,42 9,41 0,04
Azbr03 (b)
3
44 6,79 5,69 0,13 2,04 5,02 0,33 5,25E+06 7,05E+08 0,20 0,03 0,74 0,58 0,41 11,33 0,04
Azbr04 (a)
4
44 6,81 6,66 0,14 2,07 5,00 0,32 7,51E+06 1,22E+09 0,20 0,10 0,80 0,85 0,41 19,04 0,04
Azbr04 (b)
4
44 6,76 5,63 0,16 2,20 4,68 0,16 3,33E+06 2,25E+09 0,21 0,09 0,75 0,77 0,45 17,15 0,05
Azlp03 (a)
3
48 7,04 4,77 0,18 1,56 5,00 0,68 3,59E+07 1,02E+09 0,28 0,12 0,74 0,72 0,32 8,48 0,03
Azlp03 (b)
3
48 7,06 4,86 0,19 1,62 4,95 0,31 1,22E+07 9,28E+08 0,23 0,12 0,12 0,46 0,31 12,48 0,03
Azlp04 (a)
4
48 6,98 4,33 0,15 2,04 4,86 0,25 4,93E+06 7,37E+08 0,29 0,06 0,68 0,25 0,41 8,12 0,04
Azlp04 (b)
4
48 7,02 4,23 0,12 1,62 5,25 0,88 1,21E+07 8,48E+08 0,24 0,04 0,15 0,16 0,34 7,51 0,03
Azbr05 (a)
5
48 6,78 5,72 0,18 0,90 4,88 4,05 3,93E+07 3,99E+08 0,28 0,19 0,80 0,68 0,25 6,88 0,02
Azbr05 (b)
5
48 6,82 5,73 0,19 0,36 5,00 3,85 1,05E+07 2,86E+08 0,29 0,19 0,73 0,69 0,23 2,90 0,003
Azbr06 (a)
6
48 6,79 5,31 0,20 0,50 5,00 4,30 1,60E+07 3,28E+08 0,21 0,18 0,85 0,60 0,43 9,67 0,006
Azbr06 (b)
6
48 6,78 5,73 0,21 0,57 4,99 4,26 2,02E+07 5,21E+08 0,22 0,19 0,75 0,60 0,49 11,31 0,007
Azlp05 (a)
5
48 7,00 5,10 0,33 2,20 5,00 1,45 4,45E+06 2,21E+09 0,22 0,02 0,76 0,61 0,53 9,32 0,04
Azlp05 (b)
5
48 6,95 5,05 0,29 2,14 4,90 0,01 6,44E+06 3,21E+09 0,20 0,01 0,12 0,14 0,38 9,63 0,04
Azlp06 (a)
6
48 6,88 5,21 0,32 2,19 4,77 0,02 8,77E+06 1,25E+09 0,21 0,03 0,46 0,56 0,40 10,02 0,04
Azlp06 (b)
6
48 6,74 4,88 0,26 2,04 5,20 0,00 3,58E+06 1,11E+09 0,22 0,00 0,13 0,85 0,34 8,08 0,04
Azbr07 (a)
7
24 6,76 9,27 0,11 1,90 5,00 0,01 9,68E+06 1,06E+09 0,22 0,12 0,73 0,74 0,36 17,68 0,07
Azbr07 (b)
7
24 6,79 9,35 0,11 2,10 4,98 0,01 6,79E+06 1,02E+09 0,23 0,03 0,76 0,81 0,40 9,88 0,08
Azbr08 (a)
8
24 6,81 9,49 0,36 1,74 5,00 0,00 5,82E+06 1,00E+09 0,22 0,02 0,75 0,68 0,28 6,74 0,06
Azbr08 (b)
8
24 6,81 9,77 0,34 1,64 5,00 0,00 2,25E+06 2,22E+09 0,21 0,03 0,76 0,71 0,26 6,88 0,05
Azlp07 (a)
7
24 7,07 9,62 0,11 1,82 4,85 1,13 2,12E+06 7,89E+08 0,21 0,06 0,54 0,36 0,46 11,21 0,07
Azlp07 (b)
7
24 7,01 9,51 0,12 1,68 5,02 1,42 1,44E+07 6,89E+08 0,23 0,06 0,14 0,14 0,43 9,07 0,07
Azlp08 (a)
8
24 6,95 9,68 0,14 1,66 5,32 1,90 1,26E+07 5,88E+08 0,24 0,07 0,13 0,70 0,44 8,95 0,06
Azlp08 (b)
8
24 7,02 9,77 0,13 1,77 5,00 1,62 3,22E+06 1,06E+09 0,220 0,078 0,140 0,182 0,485 11,55 0,07
Azbr09 (a)
9
117 6,81 6,00 0,16 1,80 4,84 0,06 7,55E+08 2,00E+09 0,27 0,06 0,75 0,72 0,34 7,72 0,01
Azbr09 (b)
9
117 6,82 6,12 0,22 1,85 5,00 0,85 1,25E+06 8,47E+08 0,26 0,10 0,59 0,70 0,39 10,49 0,02
Azbr10 (a)
10
72 6,80 6,21 0,13 1,43 5,00 0,99 2,58E+07 2,88E+08 0,26 0,15 0,71 0,26 0,32 12,19 0,02
Azbr10 (b)
10
72 6,79 6,02 0,16 1,57 5,00 0,66 2,68E+07 6,48E+08 0,24 0,10 0,58 0,16 0,32 10,31 0,02
Azlp09 (a)
9
120 6,81 7,21 0,14 1,03 5,02 0,07 1,33E+07 1,98E+08 0,28 0,11 0,74 0,70 0,18 5,05 0,007
Azlp09 (a)
9
120 6,85 7,44 0,12 1,26 5,00 0,04 1,29E+07 6,69E+08 0,23 0,09 0,48 0,99 0,23 8,21 0,011
Azlp10 (a)
10
72 6,81 7,60 0,22 0,99 4,95 1,02 2,22E+07 1,09E+08 0,25 0,08 0,59 0,65 0,20 4,57 0,010
Azlp10 (b)
10
72 6,81 7,26 0,14 1,06 4,87 0,55 1,65E+07 1,58E+08 0,21 0,10 0,16 0,46 0,21 8,42 0,013
1 - Frutose / (NH
4
)
2
HPO
4
; 2 - Frutose / NH
4
Cl; 3 - Glicerol / (NH
4
)
2
HPO
4
; 4 - Glicerol /NH
4
Cl; 5 - Sacarose / (NH
4
)
2
HPO
4
; 6 - Sacarose / NH
4
Cl;
7 - Lactato / (NH
4
)
2
HPO
4
; 8 - Lactato / NH
4
Cl; 9 - Etanol / (NH
4
)
2
HPO
4
; 10 - Etanol / NH
4
Cl.
Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de Células (Xo, Xf), Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf), Fósforo (Po, Pf), pH e U.F.C; e
Fatores de conversão do substrato (Y
X/S
), de nitrogênio (Y
X/N
) em células e produtividade (P
X
) para todos os ensaios realizados.
6 Resultados e Discussão
74
6.5 Ensaios em biorreator
Os experimentos foram realizados com o intuito de se estabelecer melhores
condições para a produção de A. brasilense Sp7 e A. lipoferum Br 17 em processo
descontínuo, a partir dos resultados já obtidos em incubador rotativo. Para o processo
industrial deve-se utilizar a concentração inicial de nutrientes que proporcione os maiores
fatores de conversão (que estão associados aos custos dos reagentes e matérias-primas) e
produtividade (que é inversamente proporcional ao tamanho dos equipamentos e aos custos
operacionais) e, no caso dos inoculantes, as maiores concentrações de células viáveis.
Todos os ensaios foram realizados segundo a metodologia descrita no item 9.4, à
temperatura de 30ºC e a uma vazão de ar entre 0,5 e 1,0 L/min de O
2
(oxigênio dissolvido),
e aumento da agitação conforme necessidade das bactérias durante o cultivo. Dias (1988),
estudou diferentes concentrações de substrato e concluiu que os meios de cultura com 1,0
g/L de extrato de Levedura, concentrações iniciais de substratos maiores que 11,5 g/L não
seriam vantajosas, pois não aumentariam os fatores de conversão nem a produtividade
celular. Concentrações iniciais de substrato inferiores a 5,2 g/L trariam acentuados
decréscimos na concentração celular final e na produtividade, embora pudessem conduzir a
fatores Y
X/S
bastante elevados. Assim, para programar os ensaios em processo descontínuo,
em fermentador, pôde-se restringir a faixa de experimentação para 5,2 < So < 11,5 g/L para
frutose.
O controle de pH, não foi realizado. Foi adotado esse procedimento levando-se em
consideração que o crescimento bacteriano não é muito sensível à variação de pH, como
pôde ser verificado nos cultivos em agitador rotativo, em que houve crescimento
exponencial para variações de pH bem pronunciadas.
6 Resultados e Discussão
75
A tabela 6.4, resume as condições preliminares dos ensaios realizados em
fermentador.
Tabela 6.4 - Etapas preliminares dos ensaios em fermentador.
Ensaios Pré-inóculo Fonte de Carbono (5 g/L) Inóculo
Azlp01 CN Sacarose MEIO F
Azlp02 CN Glicerol MEIO F
Azbr01 CN Frutose CN
Azbr02 CN Frutose MEIO F
Azbr03 CN Frutose MEIO F
Azbr04 CN Glicerol MEIO F
Azbr05 CN Glicerol CN
Azbr06 CN Etanol CN
Azbr07 CN Etanol MEIO F
Meio F: Meio de fermentador CN: Caldo nutriente
Observando-se as variações de oxigênio dissolvido, notou-se um mesmo padrão de
comportamento, ou seja, ao longo dos ensaios a concentração de oxigênio tendia a
decrescer de 10% até 40% de saturação e ao término da fonte de carbono, as bactérias não
tinha o que oxidar e a mesma concentração subia de forma acentuada (dados não
apresentados).
Esse parâmetro poderá, então, ser de grande utilidade no controle do processo
descontínuo, indicando rapidamente o término do crescimento e evitando que o reator fique
em operação com células em estado estacionário ou de declínio.
Tendo em vista que a taxa de respiração para adequar ao fermentador seja
suficiente para atender às necessidades do crescimento da cultura microbiana, faz-se
necessário conhecer a concentração crítica de O
2
dissolvido para Azospirilla em cultivo
submerso. Tal & Okon, (1985) concluíram que as bactérias do gênero Azospirillum
6 Resultados e Discussão
76
desenvolvem-se em uma ampla faixa de oxigênio dissolvido (OD). Mas em concentrações
de 0,5 a 0,9 g/L de NH
4
+
contida no meio de cultura, o crescimento de Azospirillum
lipoferum ficou restringido quando a OD era de 30 µM (cerca de 10% de saturação)
(Tsagou and Aggelis, 2003).
6.5.1 Glicerol
Provavelmente, uma primeira característica muito interessante dos ensaios com A.
brasilense, foi o aumento de NH
4
+
devido o consumo do extrato de levedura presente no
meio de cultura. No caso do A. lipoferum, no ensaio Azlp02, pode-se afirmar que em todos
os ensaios com glicerol houve um período de crescimento celular (e de consumo de
glicerol) sem que houvesse o decréscimo de N (Figura 6.6).
No ensaio Azbr04 o inóculo utilizado foi preparado com meio F e no ensaio Azbr05
utilizou-se CN (Tabela 6.5). Supõe-se que em Azbr05, o cultivo vindo de caldo nutriente
carreou algum nutriente para o meio fermentador, aparentando uma pequena diferença na
velocidade de crescimento entre um ensaio e outro, pois ao alcançar 18 horas de cultivo, no
ensaio Azbr05 obteve-se 2 g/L de biomassa, enquanto que para Azbr04, o valor obtido foi
de 1,33 g/L.
Verificou-se na figura 6.6 que em Azlp02, A. lipoferum pára de crescer, com 9
horas de cultivo, quando utilizou inóculo crescido em meio F, e quando ocorre decréscimo
do pH juntamente com a queda do Nitrogênio.
Apesar de serem linhagens diferentes, as curvas mostram alguns comportamentos
semelhantes, como a utilização total da fonte de carbono e nitrogênio, o aumento da
absorbância em conseqüência do acúmulo da biomassa, maior variação do pH e menor
tamponamento das soluções.
6 Resultados e Discussão
77
Esses períodos foram acompanhados por valores de pH constantes, ou ligeiramente
ascendentes e quando se iniciava o consumo de nitrogênio o pH decrescia.
É provável que nesse período de concentração constante de nitrogênio inorgânico, o
microrganismo tenha utilizado nitrogênio orgânico presente no extrato de levedura através
das reações da assimilação de aminoácidos e proteínas.
Mais uma vez a floculação pôde ser associada, ainda que de forma qualitativa à
formação de carotenóides, pois os ensaios com maior densidade de flocos eram também os
mais rosados. Entretanto, a floculação não afetou o crescimento celular, embora tenha
interferido nas leituras de absorbância (Tabela 6.6).
Na figura 6.7 foram calculadas as velocidades específicas máximas de crescimento
celular e como se observa não foi obtida duas fases de crescimento exponencial, pois há
consumo simultâneo de ambas as fontes, diferenciando do resultado observado por Dias,
(1988). Este autor concluiu que o aparecimento de duas fases de crescimento nos cultivos
de A. brasilense Sp 245 em glicerol e extrato de levedura não era devido a diauxia, devia-se
ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato de levedura.
Uma observação final a respeito dos ensaios com glicerol é que as pequenas
diferenças entre eles parecem provir do uso de inóculo com diferentes concentrações da
composição do meio utilizado no preparo do mesmo.
6 Resultados e Discussão
78
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20
tempo (h)
Variáveis
0,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,3
0,3
0,4
0,4
0,5
0,5
N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
tempo (h)
Variáveis
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15
tempo (h)
Variáveis
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
N (g/L)
FiGURA 6.6 Evolução das concentrações de biomassa (□); Glicerol (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
Azbr04
(
inóculo = Meio F
)
Azbr05
(
inóculo = CN
)
Azl
p
02
(
inóculo = Meio F
)
6 Resultados e Discussão
79
Figura 6.7 Concentração celular LN(X) segundo o tempo de incubação para os ensaios
com Glicerol.
6.5.2 Frutose
Nos ensaios com A. brasilense, o meio de cultura diferenciado no preparo do pré-
inóculo pode ter sido um fator representativo para o crescimento da bactéria em
fermentador, pois os ensaios foram efetuados em condições semelhantes. Para o ensaio
Azbr01, utilizou-se caldo nutriente, em cultivo de 15 horas, resultando a concentração
celular final em 4,01 g/L e consumo total do substrato, diferenciando-se dos resultados
obtidos em Azbr02 e 03 com concentrações finais de 0,6 g/L e 0,69 g/L, houve decréscimo
de N semelhante entre os três ensaios. Comparando-se os valores de pH, nota-se que há
decréscimo no ensaio Azbr01 nos outros dois ensaios, o pH permance praticamente
constante (Figura 6.8).
-2,50
-2,00
-1,50
-1,00
-0,50
0,00
0,50
1,00
1,50
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40
tempo (h)
LN(X)
Azlp02
Azbr05
Azbr04
6 Resultados e Discussão
80
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20 25 30
tempo (h)
Variáveis
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15
tempo (h)
Variáveis
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
N (g/L)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 5 10 15 20
tempo (h)
Variáveis
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
N (g/L)
Figura
6.8 Evolução das concentrações de biomassa (□); frutose (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
Azbr02 –
(
inóculo = Meio F
)
Azbr03 –
(
inóculo = Meio F
)
Azbr01 –
(
inóculo = CN
)
6 Resultados e Discussão
81
Não se conhece muito a respeito da influência do pH sobre os aspectos fisiológicos
e bioquímicos em Azospirillum. De uma maneira, variações de pH podem causar: alterações
nas funções das membranas, modificações no consumo de substrato e no perfil de produtos
metabólicos, alterações na morfologia e estruturas celulares e na floculação e/ou adesão a
superfícies (Forage & Pitt, 1985).
6.5.3 Sacarose
Como os ensaios foram determinados de acordo com os resultados em incubador
rotativo, utilizou-se a fonte de carbono sacarose apenas com A.lipoferum (Figura 6.9), no
qual, utilizou-se o mesmo meio de cultura do fermentador na etapa do pré-inóculo. O tempo
de crescimento para esta linhagem foi de 7,5 horas e obtendo-se um crescimento celular
não muito satisfatório (1,92 g/L), acompanhada pelo decréscimo da concentração do
substrato e de nitrogênio, atingindo-se um valor consideravelmente alto de velocidade
específica máxima de crescimento (0,35 h
-1
). Como ocorreu nos ensaios em shaker, o pH
neste processo também decresceu.
Nos ensaios em biorreator, pôde-se observar as variações mais detalhadamente,
devido a periodicidade das amostragens. Esse caso especificamente, detectou-se
concentrações de glicose e frutose. As curvas nas figuras 6.9 e 6.10 mostram o consumo
total de sacarose e sua associação com a término de crescimento celular. Da mesma
maneira, as concentrações de glicose e frutose caíram sem nenhum acúmulo no meio de
cultura. De acordo com Jackson and Ricard, (2003), sacarose é hidrolisada a glicose e
frutose e posteriormente oxidada (Figura 3.1). De acordo também com a figura 6.10, a
etapa principal da enzima da sacarose é sua hidrólise a glicose e frutose, uma vez que
aparentemente toda sacarose transformada em glicose e frutose é consumida, não havendo
acúmulo destas fontes de carbono no meio.
6 Resultados e Discussão
82
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0246810
tempo (h)
Variáveis
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
N (g/L)
Figura 6.9 Evolução das concentrações de biomassa (□); sacarose (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
0246810
tempo (h)
g/L
Frutose Glicose Sacarose
Figura 6.10 Evolução das concentrações de frutose, glicose e sacarose em Azlp01.
Foi observada dois tipos de floculação bacteriana caracterizados por sua densidade e
aparência. Um dos tipos, menor e mais compacto sedimentava com rapidez quando em
repouso e era facilmente colocado em suspensão quando a agitação era reiniciada. O outro
tipo de floco apresentava tamanho maior, densidade menor e aparência de “algodão”, com
ramificações (“fiapos”) visíveis. Pensou-se inicialmente em contaminação por outras
Azl
p
01 –
(
inóculo = Meio F
)
Azl
p
01 –
(
inóculo = Meio F
)
6 Resultados e Discussão
83
bactérias ou fungos, mas observações microscópicas efetuadas não demonstraram a
presença de outros microrganismos que não Azospirillum.
Este tipo de floco talvez tenha se formado, principalmente, pela adesão inicial das
células em bolhas de ar depois permanecido ocluso, inflando o floco.
6.5.4 Etanol
Os ensaios com etanol também foram processados somente com A. brasilense, e
observou-se que o tempo de crescimento e a formação de biomassa podem estar envolvidos
com o fato de utilizar caldo nutriente no inóculo, pois para o mesmo crescido em meio
fermentador o cultivo atingiu 12 h, sem consumo do etanol. Os resultados comparativos nos
ensaios com etanol, estão apresentados na tabela 6.6, e mostram resultados satisfatórios,
baseando–se nos valores de concentração final (3,03 g/L), µ
max
(0,103 h
-1
) e produtividade
(0,110 g/L.h). Os acompanhamentos realizados durante os experimentos podem ser
observados na figura 6.11.
6 Resultados e Discussão
84
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15 20 25 30
tempo (h)
V
a
r
i
á
v
e
i
s
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
N (g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
0 5 10 15
tempo (h)
Variáveis
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
N (g/L)
Figura 6.11 - Evolução das concentrações de biomassa (□); etanol (◊); Absorbância ( );
Nitrogênio amoniacal (▲) e pH (×) ao longo dos ensaios em fermentador.
Azbr06 – (inóculo = CN)
Azbr07 – (inóculo = Meio F)
6 Resultados e Discussão
85
6.6 Comparação entre os ensaios
A comparação entre os ensaios foi realizada levando-se em conta os fatores de
conversão e produtividade no desenvolvimento do processo de produção de Azospirillum,
bem como a tendência à formação de flocos e carotenóides. As comparações entre as
fontes de carbono foram efetuadas preponderantemente nos resultados obtidos em
fermentador de 5L (Tabela 6.5).
Tabela 6.5 – Tempo de crescimento, concentrações iniciais e finais de células (Xo, Xf),
Substrato (So, Sf), Nitrogênio (No, Nf) para os diferentes ensaios, em
função da composição do meio de cultura.
ENSAIOS Pré-inóculo Fonte de Inóculo Tempo de Xo Xf So Sf No (N)f µmax Y
X/S
Y
X/ N
P
X
Carbono (5g/L) cresc. (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (h-1) (g/g) (g/g) (g/L.h)
Azlp01 CN Sacarose MEIO F 7,5 0,11 1,93 4,55 0,08 1,43 0,08 0,35 0,41 1,35 0,24
Azlp02 CN Glicerol MEIO F 11 0,11 2,56 5,20 0,05 0,60 0,07 0,28 0,46 4,49 0,22
Azbr01 CN Frutose CN 15 0,11 2,67 5,04 0,80 0,28 0,07 0,20 0,60 12,61 0,17
Azbr02 CN Frutose MEIO F 13 0,18 0,62 4,82 3,02 0,30 0,21 0,05 0,24 5,24 0,03
Azbr03 CN Frutose MEIO F 13 0,26 0,69 5,69 0,29 0,30 0,11 0,07 0,08 2,31 0,03
Azbr04 CN Glicerol MEIO F 18 0,20 1,33 5,26 3,24 0,24 0,09 0,09 0,69 9,06 0,08
Azbr05 CN Glicerol CN 37 0,13 4,04 5,70 0,00 0,50 0,05 0,10 0,69 8,61 0,10
Azbr06 CN Etanol CN 26 0,17 3,03 5,06 0,05 0,28 0,06 0,10 0,57 12,83 0,11
Azbr07 CN Etanol MEIO F 12 0,24 0,67 5,53 4,84 0,53 0,48 0,09 0,62 7,81 0,07
Velocidade específica máxima de crescimento (µ
x
), fatores de conversão de Substrato (Y
X/S
) e de nitrogênio
(Y
X/N
) em células, produtividade (P
X
).
Obs:. Meio F.= acrescentado da fonte de carbono em estudo, CN = caldo nutriente
A tabela 6.5 demonstra que para A. lipoferum, a utilização do próprio meio de
cultura utilizado em fermentador igual ao do inóculo como forma de adaptação da bactéria,
foram obtidos resultados expressivos. Para sacarose e glicerol como fonte de carbono foram
obtidas, respectivamente, após 7,5 e 11 h de cultivo, concentrações celulares finais de 1,93
e 2,56 g/L. Foram obtidos altos valores de produtividade, velocidade específica máxima de
crescimento e fator de conversão em células (0,24 g/L.h, 0,35 h
-1
e 0,41 g/g), quando foi
6 Resultados e Discussão
86
comparada sacarose ao segundo substrato escolhido, glicerol (0,22 g/L.h, 0,28 h
-1
e 0,46
g/g). Nos ensaios com A. brasilense, não foram obtidos bons resultados quando o meio de
crescimento do inoculo (CN) foi substituído pelo meio utilizado em fermentador (ensaios
Azbr02, 03, 04 e 07). Por outro lado, utilizando-se inoculo com CN, o tempo de ensaio para
A. brasilense no esgotamento total das fontes de C, frutose, glicerol e etanol foram,
respectivamente, 15h, 37h e 26h. A concentração celular final, a velocidade específica
máxima de crescimento, os fatores de conversão substrato e nitrogênio em células e
produtividade foram altas (Tabela 6.6). As concentrações celulares finais foram,
respectivamente de 2,67 g/L, 4,04 g/L e 3,03 g/L.
Percebe-se que os ensaios em biorreator desenvolveram-se de forma semelhante aos
ensaios em incubador rotativo. Entretanto, observou-se uma importante diferença em
relação a influência das condições ambientais melhor controladas obtidas no biorreator
relativa à agitação, aeração e nível de O
2
dissolvido, que contribuíram positivamente para
aumentar os parâmetros cinéticos do cultivo.
Para o desenvolvimento de um processo aeróbio de produção de microrganismos, a
adequação do binômio agitação-aeração é de fundamental importância devido aos efeitos
diretos (falta de homogeneidade do sistema, ruptura de células por cisalhamento,
floculação, formação de espuma, etc.) ou indiretos (limitação pelo oxigênio dissolvido) que
influem no metabolismo celular, nas velocidades de crescimento e de respiração, na
formação de subprodutos e de materiais de reserva e na eficiência energética.
Taciro (1986) obteve para A. brasilense Sp 7 cultivada em biorreatore valor de
produtividade de 0,4 g/Lh, Yx/s = 0,45 g/g e µmax = 0,3 h
-1
usando frutose (10 g/L) como
fonte de C DAP como fontes de nitrogênio e fósforo (2,64 g/L), extrato de levedura (1g/L)
e outros sais minerais. Os valores destes parâmetros para esta linhagem foram superiores
aos encontrados no presente trabalho (Tabela 6.6), devido provavelmente a diferenças
fisiológicas entre as linhagens.
6 Resultados e Discussão
87
Em todas as amostras coletadas durante os cultivos, foram efetuadas em paralelo,
determinações de absorbância e concentração celular mássica. Na Figura 6.12 reuniram-se
os valores de absorbância e concentração celular obtidos nos ensaios em fermentador,
obtendo-se através de uma regressão linear a equação abaixo, com o coeficiente de
correlação de 0,9799. O correu uma correlação linear entre os pontos obtidos até 0,6 g/L,
após este valor, houve algumas diferenças entre as grandezas devido à floculação e à
formação de carotenóides. Já a correlação logarítmica, a absorbância acompanhou bem de
perto a concentração celular ao longo dos ensaios.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
X (g/L)
A
Azlp01 Azlp02 Azbr02 Azbr03
Azbr04 Azbr05 Azbr06 Azbr07
Figura 6.12 Correlação obtida entre os valores de concentração celular (X) e absorbância
para os ensaios em fermentador.
6 Resultados e Discussão
88
Os ensaios realizados ainda permitiram a comparação do custo de produção da
biomassa em biorreator relativo às fontes de carbono empregada (Tabela 6.6). Esta tabela
mostra os valores.
Tabela 6.6 Comparação do custo de produção de biomassa de Azospirillin em biorreator
em relação ao custo do substrato.
Fonte de
carbono
Linhagem
Yx/s
(g/g)
Px
(g/Lh)
Custo de
substrato
(R$/kg)
Custo
produção
(R$/kg)
Frutose A. brasilense 0,52 0,17 4,00 7,75
Sacarose A.lipoferum 0,41 0,24 0,90 2,21
Glicerol A. lipoferum 0,45 0,21 3,80 5,51
Glicerol A. brasilense 0,69 0,11 3,80 5,54
Etanol A.brasilense 0,50 0,11 1,00 1,99
Revista Química e derivados - Jan 2006.
Custo de produção = Custo de substrato/Yx/s
Para A. brasilense Sp 7 o menor custo de produção é alcançado com etanol.
Entratanto, a produtividade conseguida com esta fonte de C é muito baixa (0,11 g/Lh).
glicerol seria a fonte de C de escolha, uma vez que o custo de produção da biomassa é o
segundo mais baixo e a produtividade alcançada é a maior entre as fontes de C estudas.
Este resultado corrobora a escolha da fonte de C feita segundo os dados da tabela 6.6. Esta
conclusão é diversa da encontrada por Dias (1988) que propôs a frutose como a fonte de
Carbono de escolha para produção industrial de A. brasilense Sp 245.
Para A. lipoferum Br 17 a escolha recairia sobre sacarose uma vez que foram
atingidas com esta fonte de C a maior produtividade e o menor custo de produção de
biomass, seguido de glicerol. Entretanto, considerações de ordem prática como
possibilidade de utilizar a fonte de C sem diluição da mesma em cultivo descontínuo-
alimentado, diminundo gasto de água de diluição e possibilitando maiores concentrações
de biomassa, e o fato das indústrias de inoculantes para FBN à base de rizóbio já utilizarem
6 Resultados e Discussão
89
glicerol no meio de cultura, propõe-se o uso deste substrato também para o cultivo de A.
lipoferum.
6.7 Cultivo em alta densidade celular (ADC)
Neste item foram desenvolvidos protocolos em ADC para as linhagens de
Azospirilla utilizadas no presente trabalho, usando glicerol como fonte de carbono,
condição experimentada como modelo para confirmar a possibilidade de se obter cultivos a
alta densidade celular para esta categoria de microrganismos.
Como já explicitado na revisão de literatura, a obtenção de alta densidade celular
pode ser alcançada com a condução do processo de forma descontínua alimentada
(Schmidell, 2001; Yamane et al., 1984).
De acordo com este processo, meio de cultura é disponibilizado aos microrganismos
de forma parcelada, de tal forma que os efeitos de inibição pelo substrato ou,
eventualmente, algum desvio metabólico não desejável, como por exemplo, produção de
ácido orgânico, como é o caso em E. coli (Yamane et al., 1984), tende a ser minimizado. O
metabolismo dos Azozpirilla é desconhecido sob este aspecto.
Baseados nos experimentos em batelada realizados foram propostos protocolos
descontínuo-alimentado para obtenção de ADC para as duas linhagens estudadas. A fonte
de carbono de escolha foi o glicerol, devido aos bons resultados atingidos nos ensaios
realizados em batelada em biorreator, a facilidade de manipulação desta fonte de C,
podendo ser alimentada ao biorreator sem diluição prévia, grande disponibilidade e baixa
custo.
Basicamente os protocolos constituíram-se de uma batelada inicial igual ao ensaio
em bataleda conduzido em biorreator, Azlp 02 e Azbr 05, respectivamente, para as
6 Resultados e Discussão
90
linhagens A. lipoferum BR 17 e A. brasilense Sp 7, seguido de uma fase de alimentação a
uma vazão constante.
Para o desenvolvimento deste protocolo em ADC assumimos as seguintes hipóteses:
a) O crescimento microbiano se dava segundo a cinética de Monod (Schimidell, 2001),
acrescido do coeficiente de morte, Kd, quando necessário, dado pela equação 5:
µ
- Kd =
µ
max
KsS
S
+
(5)
b) Os valores paramétricos da equação foram estimados dos experimentos conduzidos em
batelada;
c) Considerou-se que o meio de cultura em ensaios em batelada estava balanceada;
d) para o crescimento celular e que o substrato limitante S da equação 5 era o glicerol.
e) Como meta foi proposto a obtenção de concentração final de biomassa cerca de 10
vezes superior aos ensaios em batelada. Assim, pretendia-se ao final dos ensaios, 30 g/L de
biomassa. Para um volume útil de 10L, esta concentração corresponde a cerca de 300 g de
biomassa.
f) Pela hipótese (c), o meio de cultura concentrado foi obtido simplesmente pela
multiplicação por 10 vezes das concentrações descritas do meio utilizado nos ensaios em
batelada. Levamos em consideração que as quantidades de Mg SO
4
.7H
2
O; NaCl, Fe
(EDTA), K
2
HPO
4
e micronutrientes da solução de elementos traço já estavam em
quantidade suficiente para sustentar o crescimento de 30 g/L.
6 Resultados e Discussão
91
g) Assim, o meio de cultura para a fase do protocolo constituída pela operação
descontínuo- alimentada que sucedeu à batelada inicial, foi composto segundo o descrito na
tabela 6.7.
Tabela 6.7 Composição do meio de cultura alimentado durante a fase descontínua-
alimentada à vazão constante do protocolo de ADC para cultivo de
A.
lipoferum
BR 17 e A. brasilense Sp 7.
Componente Massa (g)
Glicerol 500
(NH
4
)
2
HPO
4
132
Extrato de levedura 100
CaCl
2
.2H
2
O 2
Água 2 litros
6.7.1 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para linhagem A. lipoferum
BR 17
Como se disse, o protocolo consistiu em conduzir o processo iniciando por uma
batelada exatamente igual ao ensaios Azlp02 seguida de alimentação a vazão constante de
meio de cultura concentrado composto por todos os nutrientes do meio descrito na tabela
6.9.
Para estimar o valor da vazão de alimentação, F, foi utilizado o programa de
computador ANABIO (Silva e Badino Jr, 2003) que simula a cinética de crescimento
microbiano, dado um modelo matemático de crescimento celular, os valores dos parâmetros
do modelo, o tipo de condução do processo e suas condições iniciais. Foi utilizado a
cinética de Monod, equação A. Os valores de
µmax e Yx/s foram retirados dos
experimentos em batelada realizadas em biorreator da (Tabela 6.6). O valor de Ks foi
estimado utilizando-se o programa ANABIO através de sua variação e visualização das
curvas calculadas de X e G e sua comparação com os dados experimentais do ensaio
6 Resultados e Discussão
92
Azlp02, como mostra a figura 6.13. O valor da vazão de alimentação F durante a fase
descontínua-alimentada foi estimada levando-se em conta um perfil de concentração de
glicerol que não excedesse 5 g/L, para evitar possíveis efeitos inibitórios por substrato.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 5 10 15
tempo (h)
X (g/L)
X exp X simul
G ex
p
G simul
Figura 6.13 Crescimento de
A. lipoferum BR 17 em batelada, ensaio Azlp02.
Os seguintes parâmetros foram utilizados na simulação do processo em ADC para
A
lipoferum
e cujos resultados estão apresentados na figura 6.14:
6 Resultados e Discussão
93
Xo; concentração inicial de biomassa na batelada: 0,13 g/L
So: concentração inicial de glicerol na batelada: 5 g/L
µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular 0,28 h
-1
Ks: constante de Monod 0,5 g/L
Kd: coeficiente de morte celular: 0,0 h
-1
Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 0,47 g/g
T bat: tempo da batelada inicial: 13 h
Se: concentração de glicerol na solução de alimentação 250 e 300 g/L
Xe: concentração inicial do processo descontínuo alimentado 2,48 g/L
T total: tempo total do ensaio: 30 h
A vazão obtida pela simulação foi de 100 ml/h.
6 Resultados e Discussão
94
Figura 6.14 Resultados do protocolo a ADC para
A lipoferum Br 17.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
0 10203040
tempo (h)
X (g/L)
X exp
X
simul (G=300 g/ L)
X simul (G= 250 g/L)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
010203040
tempo (h)
G (g/L)
G exp G simu (G=300 g/L)
G simul (G=250 g/L)
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
0 1020304050
tempo (h)
F (mL/h)
Fmédio = 102 mL/h
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10203040
tempo (h)
X (g/L)
6 Resultados e Discussão
95
Tabela 6.8 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A lipoferum BR 17.
Tempo (h) UFC/mL
0 2.35x10
8
0 6.67x10
8
0 1.33x10
9
28 1,01x10
10
28 1.93x10
10
A. lipoferum BR 17
28 6,13x10
10
Nota-se que as curvas calculadas e experimentais mostraram tendência parecidas,
embora não conseguissem prever com exatidão os valores das concentrações experimentais,
principalmente no que se refere ao glicerol, levando-nos a concluir que a metodologia
usada para o proposição do protocolo em ADC foi adequada. Desta forma, foi obtido cerca
de 25 g/L em 30 h de fermentação, atingindo-se produtividade de cerca de 0,8 g/Lh, 300%
superior ao obtido ao experimento em batelada. A concentração celular atingida em UFC
também foi bastante elevada, superior a 1x 10
10
UFC/mL, para amostras em triplicata
(Tabela 6.8).
6.7.2 Protocolo ADC com vazão constante de alimentação para linhagem A brasilense
Sp 7
Da mesma maneira, para a linhagem
A brasilense Sp 7, estimou-se o valor inicial da
vazão de alimentação utilizando-se o programa de computador ANABIO. Os valores de
µmax e Yx/s foram retirados da tabela (valores de batch). O valor de Ks foi estimado
utilizando-se o programa ANABIO através de sua variação e visualização das curvas
simuladas de X e G e sua comparação com os dados experimentais do ensaio Azbr05, como
mostra a figura C. Neste caso, foi utilizado o modelo de Monod acrescido do coeficiente de
morte celular, Kd.
6 Resultados e Discussão
96
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1020304050
tempo (h)
X (g/L)
X exp X simul G exp G simul
Figura 6.15 Crescimento de
A. brasilense em batelada, ensaio Azbr05.
Os seguintes parâmetros foram utilizados na simulação do processo a ADC para
A
brasilense
e cujos resultados estão apresentados na figura 6.16:
Xo: concentração inicial de biomassa na batelada: 0,13 g/l
So: concentração inicial de glicerol na batelada: 5 g/l
µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular 0,102 h
-1
Ks: constante de Monod 0,1 g/l
Kd: coeficiente de morte celular 0,16 h
-1
(quando a concentração de glicerol for
≤ 0,0001 g/L)
Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 0,69 g/g
T bat: tempo da batelada inicial: 35 h
Se: concentração de glicerol na solução de alimentação 250 g/l
Xe: concentração inicial do processo descontínuo alimentado 4 g/l
T total: tempo total do ensaio: 100 h
A vazão obtida pela simulação foi de 50 ml/h.
Da mesma forma como ocorrido anteriormente, a evolução da simulação e dos dados
experimentais relativos às concentrações de biomassa e do substrato com o tempo, embora
6 Resultados e Discussão
97
não tenham sido previstas com exatidão, apresentaram tendências semelhantes. Pelo
protocolo em ADC proposto foi obtido cerca de 25 g/L em 74 h de fermentação
atingindo-se produtividade de cerca de 0,34 g/Lh, 200% superior ao obtido ao experimento
em batelada. A concentração celular atingida em UFC também foi bastante elevada,
superior a 1x 10
10
UFC/mL (Tabela 6.9).
6 Resultados e Discussão
98
Figura 6.16 Resultados do protocolo de cultivo a ADC de A brasilense Sp 7
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
40.0
0 102030405060708090
tempo (h)
X (g/L)
X exp X simul
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0 102030405060708090
tempo (h)
G (g/L)
G exp G simul
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
140.0
160.0
0 102030405060708090
tempo (h)
F (mL/h)
Fmédio = 69,7 mL/h
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 20406080100
tempo (h)
N (g/L)
Fmédio = 69,7 mL/h
6 Resultados e Discussão
99
Tabela 6.9 Concentração em UFC/mL para o protocolo a ADC de A brasilense Sp 7.
Tempo (h) UFC/mL
0 2.92x10
8
0 6.33x10
8
0 8.00x10
8
74 3.29x10
9
74 1.35x10
10
A. brasilense Sp 7
74 3.27x10
10
7 Conclusões
142
7. Conclusões
Dos experimentos e análises realizadas neste trabalho, as seguintes
conclusões puderam ser obtidas:
Ensaios em incubador rotativo
A. brasilense Sp7
1) O crescimento de A. brasilense Sp7 com frutose como fonte de carbono foi mais
rápido do que as demais; as velocidades específicas máximas de crescimento em
processo descontínuo foi 0,20 h
-1
quando utilizou-se caldo nutriente no crescimento
do inóculo..
2) Para todas as fontes de carbono, observou-se crescimento celular significativo
antes de completar 24 horas de ensaio.
3) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. brasilense
Sp 7 foram frutose (2,82 g/L), glicerol (2,10 g/L), lactato (2,09 g/L) e etanol (1,85
g/L). O fator de conversão de substrato em células (Y
X/S
= 0,54 g/g) e a
produtividade (Px = 0,12 g/L.h) nos cultivos com frutose foram superiores às obtidas
com as demais.
A. lipoferum Br 17
1) As fontes de carbono e nitrogênio que possibilitaram melhor desempenho no
crescimento de A. lipoferum foram sacarose e (NH
4
)
2
HPO
4,
obtendo-se µ
max
0,350
2) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. lipoferum
BR17 foram: sacarose (2,21 g/L), glicerol (2,19 g/L) e lactato (1,82 g/L).
7 Conclusões
143
3) O consumo das fontes de nitrogênio e de carbono após a cessação do
crescimento celular foi atribuido à manutenção celular
4) Houve associação entre a floculação e a formação de carotenóides para os
cultivos.
Ensaios de batelada em biorreator
A. brasilense Sp7
1) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. brasilense
Sp 7 foram glicerol (4,04 g/L), etanol (3,03 g/L) e frutose (2,67 g/L). Os fatores de
conversão de substrato em células para estas fontes foram, respectivamente, Y
X/S
=
0,69 g/g, Y
X/S
= 0,57 g/g e Y
X/S
= 0,60 g/g. As produtividade foram respectivamente,
Px = 0,11 g/L.h , Px = 0,11 g/L.h e Px = 0,17 g/L.h.
A. lipoferum BR17
2) As fontes de carbono que propiciaram melhor crescimento de A. lipoferum
BR 17 foram: glicerol (2,56 g/L) e sacarose (1,93 g/L). Os fatores de conversão de
substrato em células para estas fontes foram, respectivamente, Y
X/S
= 0,46 g/g, Y
X/S
=
0,41 g/g e Y
X/S
= 0,60 g/g. As produtividade foram respectivamente, Px = 0,22
g/L.h e Px = 0,24 g/L.h.
A. brasilense Sp7 e A. lipoferum BR17
1) Para uma definição com vista à utilização industrial, levando-se em
consideração aspectos econômicos da aquisição das matérias-primas (custo e
disponibilidade) bem como praticidade de preparação de meio de cultura visando
7 Conclusões
144
produção a alta densidade celular, a fonte de carbono glicerol pode ser uma
alternativa para ambas as linhagens.
2) A utilização do meio de cultura diferenciado no preparo do pré-inóculo foi
um fator representativo para o crescimento dos microorganismos em biorreator e
foram observadas variações para as bactérias e fontes de carbono testadas.
3) O aumento da concentração de NH
4
+
no início dos cultivos em biorreator, foi
atribuído ao consumo preferencial de compostos nitrogenados presentes no extrato
de levedura, embora não tenha sido observado diauxia.
4) Nos cultivos em biorreator, a queda do pH abaixo de 5,0 provavelmente
ocasionou limitação do crescimento celular.
5) Houve uma correlação linear (r
2
= 0,9799) entre absorbância e biomassa
somente até concentração celular de 0,6 g/L, após a qual floculação e produção de
carotenóides produziram desvio desta relação.
Ensaios em alta densidade celular (ADC)
1) Os resultados para ambas as linhagens foram modelados satisfaroriamente por
uma cinética de crescimento segundo Monod , acrescido do coefeiciente de morte
Kd, para A.brasilense Sp 7.
2) Os valores dos parâmteros da equação de Monod foram os seguintes:
A. brasilens Sp 7.
µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular 0,102 h
-1
Ks: constante de Monod 0,1 g/l
7 Conclusões
145
Kd: coeficiente de morte celular 0,16 h
-1
(quando a concentração de glicerol for ≤ 0,0001 g/L)
Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 0,69 g/g
A. lipoferum BR 17
µmax: velocidade específica máxima de crescimento celular 0,28 h
-1
Ks: constante de Monod 0,5 g/L
Kd: coeficiente de morte celular: 0,0 h
-1
Yx/s: fator de conversão glicerol a biomassa 0,47 g/g
3) Nos experimentos em sistema descontínuo alimentado, a concentração final
de biomassa atingida para A. brasilense foi de 24,78g/L e em A. lipoferum foi de
23,87 g/L., com produtividades, respectivamente, de 0,34 g/L.h e 0,8 g/L.h
4) Os valores de UFC foram superiores a 1x10
10
/mL para ambas as linhagens,
cerca de 10 vezes superiores aos ensaios em batelada conduzidos em incubador
rotativo.
5) A metodologia usada para a proposição do protocolo em ADC foi adequada,
atingindo-se valor muito próximo da concentração de biomassa pretendida que era de
30 g/L.
6) Glicerol é uma fonte de carbono conveniente para o cultivo de Azospirilla
em alta densidade celular.
8 Referências Bibliográficas
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