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Universidade de São Paulo
Faculdade de Saúde Pública
Alho (Allium sativum) e produtos: atividade
antioxidante in vitro durante a vida de prateleira
Yara Severino de Queiroz
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Saúde Pública para
obtenção do título de Mestre em Saúde
Pública.
Área de Concentração: Nutrição
Orientadora: Profa. Assoc. Elizabeth
Aparecida Ferraz da Silva Torres
São Paulo
2006
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Alho (Allium sativum) e produtos: atividade
antioxidante in vitro durante a vida de prateleira
Yara Severino de Queiroz
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Saúde Pública para
obtenção do título de Mestre em Saúde
Pública.
Área de Concentração: Nutrição
Orientadora: Profa. Assoc. Elizabeth
Aparecida Ferraz da Silva Torres
São Paulo
2006
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DEDICATÓRIA
Ao Neilson
Por todo o incentivo, amor, companheirismo e
paciência. Sempre esteve ao meu lado me fazendo acreditar
que tudo daria certo.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a DEUS, pela oportunidade de me conceder a
vida com muita saúde, e de realizar mais uma etapa importante da minha vida.
Ao meu marido Neilson, pelo apoio de sempre e principalmente pela
paciência durante todo este período. Indiretamente você é Mestre como eu, afinal a
sua participação em todas as etapas foi muito importante.
Aos meus pais e irmãos que sempre acreditaram na minha capacidade e que
me deram a maior “herança”: a formação acadêmica.
À Professora Dra. Elizabeth Torres, pela oportunidade de realizar o mestrado
e por toda a orientação concedida. Sempre disposta em me ajudar.
À Professora Dra. Deborah Markowicz, sempre com disposição a transmitir
seus conhecimentos que enriqueceram muito este trabalho.
À Professora Dra. Inar Alves de Castro, por suas competentes sugestões que
melhoram o conteúdo deste trabalho.
À Professora Dra. Maria Elisabeth Machado, pelas correções, críticas e
sugestões que melhoram a apresentação deste trabalho.
Ao Professor Dr. Carlos Ferrari, pela importante colaboração para o
desenvolvimento desta dissertação.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela
concessão da bolsa.
Aos amigos Dona Lita e Sr. Romeu da empresa Fresh Garlic que me
forneceram as amostras para a realização desta dissertação.
À Geni, Emília e Rosana, pela importante colaboração, correções e pela
amizade. Vocês tiveram uma participação muito importante neste trabalho.
Aos queridos amigos do laboratório de Bromatologia: Liania, Marcela,
Renata e Guilherme que tiveram participação na realização deste trabalho.
À Vanessa Capriles, Luciane Saldanha, Carla Machado, Vanessa Willison,
Iramaia, pessoas que tenho muita consideração.
Enfim, agradeço a todos que esteve ao meu lado.
RESUMO
Queiroz YS. Alho (Allium sativum) e produtos: atividade antioxidante in vitro
durante a vida de prateleira. São Paulo: 2006. [Dissertação de Mestrado –
Faculdade de Saúde Pública da USP].
Objetivo. A busca por produtos de alho prontos para consumo cresceu na última
década.
O alho contém compostos fenólicos e organosulfurados, que são
responsáveis pelo odor característico, sabor, aroma e ação antioxidante. Este estudo
teve como objetivo avaliar a atividade antioxidante e determinar os compostos
fenólicos totais em alho in natura e em seus produtos comercializados, além de
avaliar o impacto dos aditivos (ácido cítrico, metabisulfito de sódio e benzoato de
sódio) sobre a atividade antioxidante. Métodos. Extratos metanólicos de alho in
natura (AIN) e seus produtos picado com sal (APS), picado sem sal (AP), frito (AF)
e misto – mistura de alho in natura com alho desidratado (AM) foram analisados
pela vida de prateleira (em três momentos), nos parâmetros: teor de fenólicos totais e
atividade antioxidante por três métodos: ensaio DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil),
sistema β-caroteno/ácido linoléico e capacidade protetora da oxidação lipídica
utilizando o aparelho Rancimat®. Resultados. O teor de fenólicos totais do extrato
em relação ao resíduo seco foi maior para o produto frito, nos três momentos. Em
relação à atividade antioxidante, o alho frito foi o produto que apresentou melhor
atividade para todos os testes. Ao longo da vida de prateleira, a atividade
antioxidante diminuiu com o ensaio DPPH, sendo que para os demais testes,
aumentou. Os produtos com aditivos apresentaram melhor atividade antioxidante,
apesar de apresentarem menor teor de fenólicos totais. Conclusões. Este estudo
reforçou o potencial antioxidante do alho, portanto o seu consumo pode ser
recomendado como parte de uma dieta saudável. Além disso, observou-se que a
presença de aditivos melhorou o efeito antioxidante das amostras.
Descritores: alho in natura, produtos comercializados de alho, atividade
antioxidante, vida de prateleira, aditivos.
SUMMARY
Queiroz YS. Garlic (Allium sativum) and byproducts: in vitro antioxidant activity
during shelf life period. São Paulo (BR): 2006. [Dissertação de Mestrado –
Faculdade de Saúde Pública da Universidade de são Paulo Brazil].
Objective. The interest for ready-to-eat garlic byproducts increased in the last
decade. Garlic has phenolic and sulfur compounds, which are responsible for the
singular flavor and antioxidant activity. This study aimed to evaluate the antioxidant
activity (AA) of in natura garlic and its commercialized byproducts, and to correlate
the data with phenolics contents. The impact of additives (citric acid,
sodium
metabisulfite and
sodium benzoate) on the AA was also evaluated. Methodology.
Methanolic extracts of in natura garlic (ING) and its products, i.e., chopped with salt
(CWP), chopped without salt (CS), fried (FG) and mixed garlic - in natura garlic
with dehydrated garlic (MG) were evaluated in three different moments of the shelf
life. This evaluation based on the measurement of the following parameters: total
phenolic compounds and AA. The AA were evaluated using three different methods:
DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) assay, β-carotene/linoleic acid system and
Rancimat® method. Results. The total phenolics content of the extract in relation to
the dried residue was higher in the fried product, in the three moments. Regarding
the AA, fried garlic showed the best activity in all tests. Throughout the shelf life, the
AA decreased with the DPPH assays. In contrast, when the other tests were applied,
the AA increased. The products with additives showed better antioxidant activity
when compared to those without the additives, although the samples with additives
showed lower content of total phenolics. Conclusion. This study strengthened the
antioxidant potential of garlic, therefore its consumption should be recommended as
part of a healthy diet. Moreover, it was observed that the presence of additives
improved the antioxidant effect of the samples.
Descriptors: in natura garlic, commercial garlic byproducts, antioxidant activity,
shelf life, additives.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS............................
v
LISTA DE FIGURAS...................................................................................
viii
LISTA DE QUADROS................................................................................
xi
LISTA DE TABELAS..................................................................................
xii
CAPÍTULO 1 - ALHO: PAPEL NA PROMOÇÃO DE SAÚDE E
CAPACIDADE ANTIOXIDANTE - REVISÃO DE LITERATURA........
13
1.1. Alho.......................................................................................................
13
1.1.1. Condições de cultivo, colheita e armazenamento.........................
14
1.1.2. Principais variedades....................................................................
15
1.1.3. Classificação................................................................................ 17
1.1.4. Composição nutricional................................................................
18
1.1.5. Compostos organosulfurados encontrados no alho......................
19
1.1.5.1 Compostos organosulfurados em alho fresco intacto...........
19
1.1.5.2. Compostos organosulfurados em alho fresco picado..........
22
1.1.6. Alho x saúde.................................................................................
23
1.1.6.1. Atividade antioxidante.........................................................
25
1.2. Antioxidantes: definição, mecanismos de ação, fontes e legislação..... 27
1.2.1. Estudos com alimentos funcionais – ação antioxidante............... 31
1.2.2. Métodos para determinar a atividade antioxidante em alimentos 33
1.3. Radicais livres........................................................................................
35
1.4. Oxidação lipídica...................................................................................
38
1.5. Estresse oxidativo..................................................................................
40
ii
CAPÍTULO 2 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN
VITRO DE ALHO IN NATURA E DE SEUS PRODUTOS
COMERCIALIZADOS DURANTE A VIDA DE PRATELEIRA.............
41
2.1. INTRODUÇÃO.....................................................................................
41
2.2. JUSTIFICATIVA..................................................................................
42
2.3. OBJETIVOS..........................................................................................
43
2.3.1. Objetivo Geral.............................................................................. 43
2.3.2. Objetivos Específicos...........................................................
43
2.4. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................
44
2.4.1. Materiais...............................................................................
44
2.4.1.1. Solventes e reagentes........................................................
44
2.4.1.2. Amostras...........................................................................
44
2.4.1.2.1. Características das amostras....................................
49
2.4.1.2.2. Peso médio dos dentes de alho................................
50
2.4.2. Métodos........................................................................................
51
2.4.2.1. Obtenção do extrato metanólico.......................................
51
2.4.2.2. Determinação do teor de resíduo seco dos extratos..........
53
2.4.2.3. Quantificação de compostos fenólicos............................. 53
2.4.2.4. Avaliação da atividade antioxidante.................................
54
2.4.2.4.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
).
54
2.4.2.4.2. Sistema β-caroteno/ácido linoléico..........................
55
2.4.2.4.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação
lipídica utilizando o aparelho Rancimat®..................................
56
2.4.2.5. Análise Estatística.............................................................
57
2.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................
58
2.5.1. Teor de fenólicos totais.................................................................
58
2.5.2. Avaliação da atividade antioxidante.............................................
63
2.5.2.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
)..........
63
2.5.2.2. Sistema β-caroteno/ácido linoléico...................................
70
2.5.2.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica
utilizando o aparelho Rancimat®..................................................
76
iii
2.5.3. Correlações entre as variáveis...................................................... 89
2.6. CONCLUSÃO……………………………………………………….. 83
2.7. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................
85
CAPÍTULO 3 - “INFLUÊNCIA DOS ADITIVOS ALIMENTARES NA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS PRODUTOS DE ALHO”.............
86
3.1. INTRODUÇÃO.....................................................................................
86
3.2. JUSTIFICATIVA..................................................................................
3.3. OBJETIVOS..........................................................................................
90
91
3.3.1. Objetivo Geral.............................................................................. 91
3.3.2. Objetivos Específicos...................................................................
91
3.4. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................
91
3.4.1. Materiais.......................................................................................
91
3.4.1.1. Solventes e reagentes...........................................................
91
3.4.1.2. Amostras..............................................................................
91
3.4.2. Métodos........................................................................................
94
3.4.2.1. Obtenção do extrato metanólico..........................................
94
3.4.2.2. Determinação do teor de resíduo seco dos
extratos..............................................................................................
94
3.4.2.3. Quantificação dos compostos fenólicos...............................
94
3.4.2.4. Avaliação da atividade antioxidante....................................
95
3.4.2.4.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
)....
95
3.4.2.4.2. Sistema β-caroteno/ácido linoléico.............................
95
3.4.2.4.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação
lipídica utilizando o aparelho Rancimat®..................................
96
3.4.2.5. Análise Estatística................................................................
97
3.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................
97
3.5.1. Teor de fenólicos totais...........................................................
97
3.5.2. Avaliação da atividade antioxidante.......................................
99
3.5.2.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
).......
99
3.5.2.2. Sistema β-caroteno/ácido linoléico................................
100
iv
3.5.2.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação
lipídica utilizando o aparelho Rancimat®..................................
100
3.6. CONCLUSÃO...................................................................................... 102
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................
103
ANEXO 1 - Determinação do teor de umidade das amostras
comercializadas de alho................................................................................
120
ANEXO 2 – Tabela - Valores médios e desvio padrão (dp) da atividade
antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato metanólico do alho in natura
e de seus produtos comercializados dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9)...........
123
ANEXO 3 – Tabela - Valores médios e desvio padrão (dp) da inibição da
oxidação lipídica (IOL), pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico, do
extrato metanólico do alho in natura e de seus produtos comercializados
dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9)...................................................................
124
ANEXO 4 – Tabela - Valores médios e desvio padrão (dp) do índice de
atividade antioxidante (IAA), utilizando o aparelho Rancimat, do extrato
metanólico do alho in natura e de seus produtos comercializados dos
momentos 1, 2 e 3 (n* = 6).........................................................................
125
ANEXO 5 – Figura - Atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do
extrato metanólico dos diferentes produtos de alho com e sem aditivos......
126
ANEXO 6 – Figura - Porcentagem de inibição da oxidação lipídica (%
IOL), pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico, dos produtos de alho com e
sem aditivos..................................................................................................
127
ANEXO 7 – Figura – Índice de atividade antioxidante (IAA), medido
pelo aparelho Rancimat®, dos produtos de alho com e sem aditivos..........
128
v
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AA
Abs.
a.C.
AF
AGE
AIN
AH
AM
AP
APS
ATP
BHA
BHT
cm
CP
DAS
DADS
DCV
DNA
dp
DPPH
.
e
-
EAG
ERN
ERO
FRAP
Fe
+2
Fé
+3
g
atividade antioxidante
absorbância
antes de Cristo
alho frito
extrato de alho envelhecido
alho in natura
antioxidante
alho misto
alho picado sem sal
alho picado com sal
energia (adenosina trifosfato)
butil hidroxianisol
butil hidroxitolueno
centímetro
correlação de Pearson
dialil sulfito
dialil dissulfito
doenças cardiovasculares
ácido desoxiribonucléico
desvio padrão
radical 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil
elétron
equivalentes de ácido gálico
espécies reativas do metabolismo de nitrogênio
espécies reativas do metabolismo do oxigênio
ensaio do poder antioxidante em redução férrica
íon ferroso
íon férrico
grama
vi
GSH
GSH-Px
h
H
+
H
2
O
2
IAA
IOL
L
L
.
LH
LO
.
LOO
.
LOOH
µg
mg
mL
mn
mm
m/m
m/v
n
NAC
Na
2
SO
3
NaHSO
3
Na
2
S
2
O
5
NDGA
NO
-
NO
-
2
NS
O
2
O
-
2
1
O
2
glutationa reduzida
glutationa peroxidase
horas
íon hidrogênio
peróxido de hidrogênio
índice de atividade antioxidante
inibição da oxidação lipídica
litro
radical livre lipídico
ácido graxo insaturado
radical alcoxila
radical peroxila
hidroperóxido
micrograma
miligrama
mililitro
nanômetro
milimitro
relação massa e massa
relação massa e volume
número de amostras
acetil cisteína
sulfito de sódio
sulfito ácido de sódio
metabisulfito de sódio
ácido nordihidroguaiarético
óxido nítrico
dióxido de nitrogênio
nível de significância
oxigênio molecular
radical superóxido
oxigênio singlete
vii
OH
-
ONOO
-
ORAC
%
p
PA
ppm
PG
rpm
SAC
SEC
SO
2
SOD
TBARS
TBHQ
TI
UV
∆T
radical hidroxila
peroxinitrito
ensaio da capacidade de absorbância do radical oxigênio
porcentagem
nível descritivo
padrão analítico
parte por milhão
galato de propila
rotações por minuto
S-alicisteína
S-etil cisteína
dióxido de enxofre
superóxido dismutase
substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico
terbutilhidroquinona
tempo de indução
ultra violeta
variação de temperatura
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Alho...................................................................................................
13
Figura 2 - Reações químicas dos principais compostos organosulfurados
encontrados no alho.............................................................................................
21
Figura 3 - Formação do composto organosulfurado alicina...............................
25
Figura 4 - Esquema das amostras obtidas de alho..............................................
46
Figura 5 - Alho in natura e seus produtos comercializados...............................
48
Figura 6 - Esquema da extração das diferentes amostras de alho, segundo
NUUTILA et al. (2003), com modificações........................................................
52
Figura 7 - Teor de fenólicos totais (g/100g) do alho in natura e de seus
produtos no decorrer da vida de prateleira..........................................................
62
Figura 8 - Teor de fenólicos totais em relação ao resíduo seco do alho in
natura e de seus produtos no decorrer da vida de prateleira...............................
63
Figura 9 - Atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato metanólico
do alho in natura e de seus produtos comercializados, segundo os momentos
(n* = 9)................................................................................................................
64
Figura 10 - Atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, dos extratos de alho in
natura e de seus produtos comercializados no decorrer da vida de prateleira....
68
ix
Figura 11 - Curva cinética da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do
extrato metanólico do alho in natura e de seus produtos do momento
1...........................................................................................................................
69
Figura 12 - Curva cinética da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do
extrato metanólico do alho in natura e de seus produtos do momento
2...........................................................................................................................
69
Figura 13 - Curva cinética da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do
extrato metanólico do alho in natura e de seus produtos do momento
3...........................................................................................................................
70
Figura 14 - Inibição da oxidação lipídica (IOL), pelo sistema β-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho in natura e de seus
produtos comercializados dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9)................................
71
Figura 15 - Inibição da oxidação lipídica (IOL), pelo sistema β-
caroteno/ácido linoléico, dos extratos de alho in natura e de seus produtos
comercializados no decorrer da vida de prateleira..............................................
73
Figura 16 - Curva cinética da inibição da oxidação lipídica, pelo sistema β-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho in natura e de seus
produtos do momento 1......................................................................................
74
Figura 17 - Curva cinética da inibição da oxidação lipídica, pelo sistema β-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho in natura e de seus
produtos do momento 2.......................................................................................
75
Figura 18 - Curva cinética da inibição da oxidação lipídica, pelo sistema β-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho in natura e de seus
produtos do momento 3......................................................................................
75
x
Figura 19 - Índice de atividade antioxidante (IAA), utilizando o aparelho
Rancimat, do extrato metanólico do alho in natura e de seus produtos
comercializados dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 6)...............................................
76
Figura 20 - Índice de atividade antioxidante (IAA), utilizando o aparelho
Rancimat, do extrato metanólico do alho in natura e de seus produtos
comercializados no decorrer da vida de prateleira..............................................
79
Figura 21 - Estrutura química do ácido cítrico...................................................
88
Figura 22 - Estrutura química do benzoato de sódio..........................................
89
Figura 23 - Estrutura química do metabisulfito de sódio...................................
89
Figura 24 - Esquema das amostras obtidas de alho sem aditivos (lote 4).......... 93
xi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Principais variedades de alho e suas características..................................
16
Quadro 2 - Melhores épocas de plantio e colheita do alho, segundo o estado ou a
região.............................................................................................................................
17
Quadro 3 - Classificação do alho por tamanho e cor...................................................
17
Quadro 4 - Propriedades bioativas do alho..................................................................
23
Quadro 5 - Limite máximo de uso de aditivos em alimentos no Brasil.......................
29
Quadro 6 - Alho in natura e seus produtos comercializados, segundo a vida de
prateleira e o momento das análises..............................................................................
47
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição Nutricional do Alho...............................................................
18
Tabela 2 - Número e peso médio (g) dos dentes de alho em dois bulbos de cada
lote.................................................................................................................................
50
Tabela 3 - Teores médios e desvio padrão (dp) de resíduo seco e de fenólicos totais
do alho in natura e de seus produtos comercializados dos momentos 1, 2 e
3....................................................................................................................................
59
Tabela 4 - Correlação entre as variáveis do alho in natura e de seus produtos
comercializados dos momentos 1, 2 e 3........................................................................
80
Tabela 5 - Teores médios e desvio padrão (dp) de resíduo seco e de fenólicos totais
das amostras de alho com e sem aditivos............................................................
98
Tabela 6 - Valores médios e desvio padrão (dp) da atividade antioxidante, pelo
ensaio DPPH, do extrato metanólico das diferentes produtos de alho com e sem
aditivos..........................................................................................................................
99
Tabela 7 - Valores médios e desvio padrão (dp) da porcentagem de inibição da
oxidação lipídica (% IOL), pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico, dos produtos de
alho com e sem aditivos................................................................................................
100
Tabela 8 - Valores médios e desvio padrão (dp) do índice de atividade antioxidante
(IAA), medido pelo aparelho Rancimat®, dos produtos de alho com e sem
aditivos.........................................................................................................................
101
13
CAPÍTULO 1
ALHO: PAPEL NA PROMOÇÃO DE SAÚDE E CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE - REVISÃO DE LITERATURA
1.1. Alho
O alho (Allium sativum) (Figura 1) foi descoberto no Egito, na data de 3.700
a.C., onde era usado como medicamento (FENWICK e HANLEY 1985; BLOCK
1985).
Segundo a ANVISA (2005), o alho é considerado uma especiaria. Por
definição, especiarias são os produtos constituídos de partes (raízes, rizomas, bulbos,
cascas, folhas, flores, frutos, sementes e talos) de uma ou mais espécies vegetais,
tradicionalmente utilizadas para agregar sabor ou aroma aos alimentos e bebidas.
Este vegetal pertence à família Liliaceae, que contém mais de 700 espécies,
incluindo cebola, alho-poró e cebolinha. O porte da planta varia entre 50 a 70 cm de
altura, dependendo da variedade, e suas raízes atingem até 50 cm de profundidade.
Suas folhas, estreitas e alongadas, são recobertas por uma camada de cera
(BARRERA e CAMARGO 1985).
Figura 1- Alho.
Em 1999, a produção mundial de alho foi de 9.280.188 toneladas, sendo a
China o maior produtor mundial (5.964.066 toneladas), seguida da Índia (517.700
toneladas). A Argentina foi o maior produtor da América do Sul em 1999, com uma
14
produção de 150.000 toneladas, representando aumento de 1,3 % em relação ao ano
anterior (FAO 2000, citado por HOLUB et al, 2002). Já a produção mundial em
2003, foi de aproximadamente de oito milhões de toneladas (EMBRAPA 2004).
No Brasil, a produção de alho em 2004 foi de aproximadamente 89.674
toneladas. Essa quantidade coloca o país como o 14º maior produtor mundial de alho
(OLIVEIRA et al. 2004; BAGHALIAN et al. 2005).
O alho tem grande importância econômica e social no Brasil. O valor total da
produção é estimado em mais de R$ 234 milhões por ano. É uma hortaliça cultivada,
na grande maioria, por pequenos produtores, com utilização intensa de mão-de-obra.
Estima-se que sejam criados cerca de 25.000 empregos diretos na cadeia produtiva
(EMBRAPA 2004).
A importância econômica da cultura do alho tem aumentado sensivelmente
nos últimos anos, não só pelo seu uso generalizado como especiaria, mas também por
algumas qualidades terapêuticas que lhe são atribuídas. De fato, o Brasil é um dos
países que mais consome alho no mundo, sendo que a maior parte é comercializada
na forma in natura, ainda que o consumo de pastas e outros produtos processados de
alho venham crescendo gradativamente (OLIVEIRA et al. 2003; OLIVEIRA et al.
2004).
1.1.1. Condições de cultivo, colheita e armazenamento
As regiões sul e sudeste do Brasil são as mais propícias para o cultivo do
alho. A faixa de temperatura média mais indicada para o bom desenvolvimento das
plantas varia entre 13
o
C e 24
o
C. É necessário que a temperatura no inverno seja
inferior a 15
o
C, porque isso estimula a formação do bulbo (cabeça). Temperaturas
entre 20
o
C e 30
o
C podem prejudicar a formação de bulbo, e acima de 30
o
C não
favorecem a sua formação com bom aspecto comercial. O alho é cultivado na época
fria do ano que, na maioria das regiões produtoras, é também a mais seca
(MENEZES SOBRINHO et al. 1993; MAROUELLI et al. 2002; EMBRAPA 2004).
Os solos muito argilosos (pesados) devem ser evitados porque deformam os
bulbos e dificultam a colheita. Os solos arenosos também não são adequados, pois
15
retêm pouca umidade e são pobres em nutrientes. Areno-argilosos e argilo-arenosos
(chamados solos leves) são os mais indicados. O pH do solo ideal para o cultivo do
alho está em torno de 6,5 (BARRERA e CAMARGO 1985; MENEZES
SOBRINHO et al. 1993).
O alho é plantado por bulbilhos (dentes). O plantio manual consiste de
abertura do sulco, distribuição e incorporação do adubo, semeadura e cobertura dos
bulbilhos (BARRERA e CAMARGO 1985).
A hora certa de colher o alho depende da duração do ciclo e do estado das
folhas. Preferencialmente, a colheita deve ser feita num dia de sol, para que a cura ou
secagem comece na própria lavoura (durante 3 ou 4 dias). A segunda parte da cura é
feita em galpões, à sombra. Durante 20 a 60 dias (com folhas e raízes) devem ser
estendidas sobre estrados, telas ou esteiras. O galpão deve ser seco, escuro e bem
ventilado. Depois da cura ou depois de ser limpo, o alho poderá ser armazenado em
caixas. O armazenamento também pode ser feito em câmara fria por até 8 meses a 0
o
C e umidade relativa de 70 a 75 % (MENEZES SOBRINHO et al. 1993).
1.1.2. Principais variedades
As variedades de alho disponíveis no Brasil diferem a partir da duração do
ciclo de produção. Há variedades precoces (ciclo curto, de 4 a 4,9 meses entre o
plantio e a colheita), médias (5 a 5,9 meses) e tardias (ciclo longo, acima de 5,9
meses). Também, há diferenças quanto à exigência de frio, número de dentes por
cabeça e outras características apresentadas no quadro 1. Neste quadro, verifica-se as
variedades mais propensas à formação de palitos (dentes com peso inferior a 1 g),
pois estes pioram a classificação do alho e, consequentemente, seu valor comercial
(BARRERA e CAMARGO 1985; MENEZES SOBRINHO et al. 1993).
16
Quadro 1 - Principais variedades de alho e suas características.
Ciclo Nome Média de
dentes por
cabeça
Formação
de palitos
Exigência de
frio e dias
longos
Curto
4 a 4,9
meses
Branco-mineiro
Juréia
Cajuru-precoce
Peruano
Cateto-roxo
20 a 25
20 a 25
20 a 25
6 a 12
26 a 30
sim
rara
sim
não
sim
pequena
pequena
pequena
pequena
pequena
Médio
5,0 a 5,9
meses
Amarante
Gigante
Chinês
Gigante-roxo
Roxão
Caturra
Dourados
1
8 a 12
8 a 15
8 a 12
8 a 12
8 a 12
8 a 12
20 a 30
não
não
não
não
não
não
sim
média
média
média
média
média
média
média
Longo
acima de
5,9 meses
Centenário
Contestado
Roxo-pérola-caçador
Quitéria
2
Caxiense
Caçapava
Tupamaro
20 a 35
8 a 12
8 a 12
7 a 12
7 a 10
7 a 12
10 a 15
sim
não
não
não
não
não
não
pequena
grande
grande
grande
grande
grande
grande
Fonte: Barrera e Camargo 1985
1
o ciclo da variedade dourados pode durar 6 meses.
2
o ciclo desta variedade é menor quando plantada em setembro.
No Quadro 2, pode-se verificar as épocas de plantio e colheita para os estados
produtores.
17
Quadro 2 - Melhores épocas de plantio e colheita do alho, segundo o estado ou a
região.
Estado ou região Plantio Colheita
Minas Gerais
fevereiro a abril julho a outubro
São Paulo
fevereiro a abril julho a outubro
Santa Catarina
junho a julho novembro a dezembro
Paraná
março a julho julho a dezembro
Rio Grande do Sul
março a setembro julho a janeiro
Góias e Distrito Federal
março a abril julho a outubro
Nordeste
abril a maio julho a outubro
Roraima e Rondônia
abril a maio julho a outubro
Fonte: Barrera e Camargo 1985
1.1.3. Classificação
A classificação do alho para consumo baseia-se na Comissão Técnica de
Normas e Padrões do Ministério da Agricultura (quadro 3).
Quadro 3 - Classificação do alho por tamanho e cor.
Nobre Até 20 dentes por cabeça
Grupo
Comum Mais de 20 dentes por cabeça
1
2
Subgrupo
3
Casca branca - Película branca
Casca roxa - Película branca
Casca roxa - Película roxa
3 diâmetro horizontal entre 32 e 37 mm
4 diâmetro horizontal entre 37 e 42 mm
5 diâmetro horizontal entre 42 e 47 mm
6 diâmetro horizontal entre 47 e 56 mm
Classe
7 diâmetro horizontal acima de 56 mm
Fonte: Barrera e Camargo 1985
18
1.1.4. Composição nutricional
Apesar do uso frequente do alho em diversos tipos de preparações culinárias,
sua importância nutriticional (tabela 1) na dieta é relativamente pequena, uma vez
que é utilizado em pequenas quantidades. Em contrapartida, foram identificados
vários compostos bioativos, sendo os de maior destaque os organosulfurados, cuja
importância será discutida no próximo item.
Tabela 1 – Composição Nutricional do Alho.
Nutrientes Unidade Valor por 100g
Calorias Kcal 149,00
Água g 58,58
Proteínas g 6,36
Lipídios g 0,50
Ácidos Graxos saturados
g 0,09
Ácidos graxos monoinsaturados
g 0,01
Ácidos graxos poliinsaturados
g 0,25
Colesterol
mg 0,00
Carboidratos por diferença g 33,06
Fibra total dietética g 2,10
Cinzas g 1,50
Cálcio mg 181,00
Ferro mg 1,70
Magnésio mg 25,00
Fósforo mg 153,00
Potássio mg 401,00
Sódio mg 17,00
Zinco mg 1,16
Cobre mg 0,30
Manganês mg 1,67
Selênio
µg
14,20
Vitamina C
mg
31,20
Tiamina mg 0,20
Riboflavina mg 0,11
Niacina mg 0,70
Ácido Pantotênico mg 0,6
Vitamina B6 mg 1,24
Foltato total µg 3,00
Vitamina B12 µg 0,00
Fonte: USDA Nutrient Database for Standard References, release 14 (julho 2001)
19
1.1.5. Compostos organosulfurados encontrados no alho
O alho contém 33 compostos organosulfurados, sendo que em cada grama de
alho fresco podem ser encontrados de 11 a 35 mg destes compostos (FENWICK e
HANLEY 1985).
O teor de compostos organosulfurados no alho, como a alicina, é bastante
variável, dependendo de sua variedade, composição do solo, grau de maturação,
condições climáticas, além de etapas posteriores da cadeia produtiva, como
processamento, armazenamento e manipulação. O controle destas variações é muito
importante, considerando que menores teores dos compostos citados irão resultar na
redução da eficácia farmacológica que esta especiaria possui (HOLUB et al. 2002).
1.1.5.1 Compostos organosulfurados em alho fresco intacto
Os compostos organosulfurados dos dentes de alho intactos são os sulfoxidos
de cisteína (principalmente alliina, e em menor quantidade a metiina e a isoaliina) e
as γ-glutamilcisteínas (principalmente γ-glutamil-S-trans-1-propenilcisteína e menor
quantidade da γ-glutamil-S-alilcisteína e da γ-glutamil-S-metilcisteína). Sulfoxidos
de cisteína são compostos de cor branca, cristalinos, não possuem odor quando
sólidos, sendo altamente solúveis em água e insolúveis na maior parte dos solventes
orgânicos. Os compostos γ-glutamilcisteínas servem como reserva para a formação
das cisteínas, que posteriormente são convertidos em sulfoxidos de cisteína,
conforme apresentado na figura 2, item a. Durante o plantio, a germinação e o
armazenamento, apenas uma parte das γ-glutamilcisteínas são gradualmente
hidrolisadas e depois oxidadas para formarem os sulfoxidos de cisteínas pelo
aumento dos níveis da enzima γ-glutamiltranspeptidase (há aumento da formação,
conforme o decréscimo da temperatura). As γ-glutamilcisteínas que não foram
convertidas a sulfoxidos de cisteína, transformam em S-alilcisteína (SAC) e S-1-
propenilcisteína, quando incubadas em água por um longo período (figura 2, item c).
Os sulfoxidos de cisteínas (8 - 19 mg/g de alho fresco) e as γ-glutamilcisteínas (5 -
16 mg/g de alho fresco) somam aproximadamente 95% do total de enxofre nos alhos
20
frescos. Aproximadamente 85% dos sulfoxidos de cisteína são encontrados no bulbo,
12% nas folhas e 2% nas raízes, enquanto as γ-glutamilcisteínas são apenas
encontradas nos bulbos (HOLUB et al. 2002).
22
Incubação em água ou álcool
S- alilcisteína sulfoxido
(allii
na)
(6 - 14 mg/g)
- alil 2-propeno tiosulfinato
(alicina) (2,5 – 6,6 mg/g)
- alil metano tiosulfinato (0,6 –
0,8 mg/g)
γ
-glutamilcisteínas
γ
-glutamil-S-metilcisteína (0,1 - 0,4 mg/g)
hidrolizada
γ
-glutamiltranspeptidase
cisteínas
oxida
se
Sulfoxidos de cisteína
S- metilcisteína sulfoxido
(metii
na)
(0,5 - 2 mg/g)
S-trans-1-propenilcisteína sulfoxide
(isoallii
na)
(0,5 – 1,5 mg/g)
Ácido sulfênico
a) Durante o plantio, a germinação e armazenamento dos bulbos intactos
Tiosulfinatos
b)
c)
Incubação em óleo ou
solventes orgânicos
- alil metil tiosulfinato (0,3 mg/g)
- alil trans-1-propenil tiosulfinato (0,05 – 1 mg/g)
- metil trans-1-propenil tiosulfinato (0,02 – 0,2 mg/g)
- metil metanotiosulfinato (0,05 – 0,1 mg/g)
S-alilcisteína (SAC)
S-1-propenilcisteína
Disulfitos
- dialil disulfito
- alil metil disulfito
Trisulfitos
- dialil trisulfito
- alil metil trisulfito
Vinil ditiinas
- 2-vinil-4H-1,3-
ditiina
- 3-vinil-4H-1,2-
ditiina
Ajoenos
- E-ajoeno
- Z-ajoeno
(a) bulbos intactos, (b) depois de picado ou macerado e (c) após processamento
oxidada
γ
-glutamil-S-trans-1-propenilcisteína (3 - 9 mg/g)
γ
-glutamil-S-alilcisteína (2 - 6 mg/g)
Fonte: HOLUB 2002
Figura 2 - Reações químicas dos principais compostos organosulfurados encontrados no alho.
Cicloalliína (não ocorre transformação depois do processamento)
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-
Não ocorre reação durante o
processamento (picar e macerar)
Picado ou macerado
alliinase
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Longo tempo de incubação em meio
aquoso
22
1.1.5.2. Compostos organosulfurados em alho fresco picado
Quando o alho é picado mecanicamente, a alliinase cataliza a conversão dos
sulfoxidos de cisteína para a forma biologicamente ativa tiosulfinatos, reação
intermediada pelo ácido sulfênico (BLOCK 1992), conforme apresentado na figura
2, item b. A enzima alliinase é localizada em poucas células vasculares do feixe da
bainha, em volta da veia ou floema, enquanto alliina e outros sulfoxidos de cisteína
são encontrados nas células de estocagem dos mesófilos. Esta enzima é
aproximadamente 10 vezes mais abundante nos dentes de alho do que nas folhas
(ELLMORE e FELDBERG 1994; HOLUB et al. 2002) e é responsável por pelo
menos 10% do total de proteínas nos dentes de alho. A atividade da alliinase é
dependente do pH e da temperatura, tendo uma ótima atividade em pH 5 a 10,
podendo ser desnaturada irreversivelmente em pH 1,5 a 3,0 (KREST e KEUSGEN
1999).
Acredita-se que os tiosulfinatos volatéis e reativos (2 a 9 mg/g em alho
fresco picado) sejam os compostos ativos com propriedades medicinais e
fisiológicas. São formados quando o alho é picado, macerado ou mastigado, e são
responsáveis pela produção do odor característico. O composto alil 2-propeno
tiosulfinato, mais conhecido como alicina, é o produto mais ambundante dentre os
tiosulfinatos (70%), sendo o alil metano tiosulfinato o segundo mais ambundante
(18%). Vários outros tiosulfinatos são formados em menores concentrações. A
conversão de sulfoxidos de cisteína em tiosulfinatos ocorre de 0,2 a 0,5 minutos em
temperatuta ambiente para a alicina e para o alil-metil-tiosulfinato de 1,5 a 5,0
minutos. A estabilidade dos tiosulfinatos depende da concentração e da pureza, bem
como do solvente usado e da temperatura a qual ocorre a reação. A alicina é menos
solúvel em água e mais em solventes orgânicos, especialmente os polares. A vida
média da alicina em água é de 30 dias e em ácido citríco é de 60 dias (LAWSON
1993, citado por HOLUB 2002).
Os tiosulfinatos passam por várias trasnformações para formarem outras
substâncias estáveis, como os di e trisulfitos, vinil ditiinas, ajoenos (figura 2, item c).
Estas reações são dependentes de temperatura, pH e condições de solventes. A
incubação da alicina ou do alil metano tiosulfinato em solventes de baixa polaridade
23
ou em óleo, produz principalmente as vinil ditiinas e em menores quantidades os
ajoenos. Por outro lado, se estes compostos forem incubados em água ou álcool,
diferentes produtos são formandos como, disulfitos, trisulfitos, além dos ajoenos e
vinil ditiinas dependendo da pureza da alicina ou dos dentes de alho (HOLUB et al.
2002).
1.1.6. Alho x saúde
Vários estudos utilizando o alho in natura ou seus produtos foram realizados,
principalmente em relação aos seus efeitos nas doenças cardiovasculares
(WARSHAFSKY et al. 1993; SILAGY e NEIL 1994; DURAK et al. 2004). Entre as
propriedades benéficas identificadas, foram descritas: redução das concentrações
séricas de LDL-colesterol e triglicerídeos, redução da pressão arterial, aumento da
atividade fibrinolítica e inibição da agregação plaquetária. Outros estudos indicam
que o consumo de alho promove outras atividades, como ação antimicrobiana, efeitos
antivirais, atividades imnulógicas, anticanceríginas e antioxidante (BLOCK 1985;
BENKEBLIA 2004; AUGER 2004). Porém, os estudos diferenciam no tipo de
preparação e dosagem, além de serem diferenciados em aspectos metodológicos,
levando, muitas vezes, a resultados conflitantes. O quadro 4 resume alguns estudos
que avaliaram as propriedades bioativas do alho.
Quadro 4 – Propriedades bioativas do alho.
Autores/Ano Objetivo Forma de
administração
do alho
Características Resultados
Warshafsky
et
al. (1993)
Colester
ol e
pressão arterial
in natura Meta-
análise de 5
estudos.
½ a 1 dente de alho /
dia
Redução de 9 a 12
% d
o colesterol
total e 9
% da
pressão arterial
Silagy e Neil
(1994)
Colesterol in natura Meta-
análise de 16
estudos, 592
indivíduos, alho em pó
(600 –
900 mg/dia) ou
alho fresco (10 –
20
g/dia), de 1 a 10 meses
Redução de 12
%
do colesterol, a
partir da quarta
semana
Morris et al.
(1995)
Agregação
Plaquetária
Extrato de alho Duplo-cego,
randomizado, placebo-
controlado
Sem efeito
continuação...
24
...continuação
Autores/Ano Objetivo Forma de
administração
do alho
Características Resultados
Steiner et al.
(1996)
Colesterol,
lipoproteína e
pressão arterial
Extrato de alho
envelhecido (7,2
g), 6 meses
Duplo-
cego, cross
over, homens
moderamente
hipercolesterolêmicos
Redução de 6 % no
colesterol total, 4%
na LDL e 5,5 % na
pressão sistólica
Berthold et al.
(1998)
Lipoproteínas,
absorção e
síntese do
colesterol
Óleo de alho
destilado a vapor
(5 mg, 2x/dia)
Duplo-cego,
randomizado
Sem efeito
Isaacshon et al.
(1998)
Colesterol
900 mg/dia de
alho em pó
(Kwai) 12
semanas
Randomizado,
placebo-controlado,
pacientes
hipercolesterolêmicos
Sem efeito
McCrindle
et
al. (1998)
Colesterol,
lipoproteínas,
triglicerídios
300 mg de extrato
de alho, 3x/dia, 8
semanas
30 pacientes (8 –
18
anos), hiperlipidêmicos
(tipo familiar)
Sem efeito
Durak et al.
(2004)
Colesterol,
pressão arterial
10 g de alho/dia,
período de 4
meses
23 voluntários
hipercolesterolêmicos,
sendo 13 hipertenso e
13 normotenso
Redução do nível
de coleste
rol LDL,
VLDL, triglicerídio
e aumento do HDL.
Dimuição
significante da PA
do grupo
hipertenso.
Khosla et al.
(2004)
Atividade
protetora
gástrica e
atividade
antioxidante
0,125; 0,25 e 0,5
mg/Kg de óleo de
alho.
Administrição do
óleo após 30 min
de ingeri
r o etanol
(indução dos
danos da mucosa
gastrointestinal)
Modelo animal: ratos
Wistar, 5 grupos com
12 animais em cada.
Doses de 0,25 e 0,5
mg/Kg causou
diminuição de
úlceras e da
peroxidação
lipídica.
Singi et al
.
(2005)
Pressão arterial
1 mg de extrato
hidroalcóolico
seco de alho,
dosados no tempo
0, 15, 30, 45, 60 e
120 segundos
Modelo animal: ratos
machos com peso em
média de 400 g e em
jejum de 12 horas
Redução de 19 %
da pressão arterial
média.
Kim et al.
(2005)
Formação de
radicais livres
(RL) e
pe
roxidação da
membrana
lipídica (PML)
Composto dial
il
disulfito (DADS)
nas concentrações
de 0, 10, 25, 50,
100 e 200 µm
Modelo animal: células
neurais de ratos.
Níveis de RL e
PML aumentaram
com doses de
DADS acima de 25
µm
25
enzima aliinase
1.1.6.1. Atividade antioxidante
A atividade antioxidante das plantas da família Allium tem sido motivo de
vários estudos. Especialmente, alhos e seus diferentes extratos têm demonstrado
propriedades antioxidantes em diferentes modelos in vitro (YIN et al. 2002; HOLUB
et al. 2002; WETTASINGHE et al. 2002). Esta propriedade é atribuída às diferentes
variedades de compostos organosulfurados e seus precursores, que são encontrados
nesta especiaria (KIM et al. 1997; LAMPE 1999). Vários estudos demonstraram que
a alicina, S-alilcisteína, S-alilmercaptocisteína, dialil sulfito (DAS), dialil dissulfito
(DADS), e o dialil trisulfito são compostos voláteis do alho que possuem atividade
antioxidante (EGEN et al. 1992; KIM et al. 1997; BOREX 2001; YIN et al. 2002).
A alicina é o composto ativo mais conhecido do alho, representando cerca de
70% de seus compostos organosulfurados. Esta substância é produzida pela interação
do aminoácido não protéico alliina, abundante nos dentes de alho, com a enzima
aliinase (figura 3). Sua formação é influenciada pela maceração do alho, durante o
processo de secagem, pela temperatura em que o alho é seco e pela umidade, além de
diferenças de solo, conforme mencionado anteriormente (KRIS-ETHERTON et al.
2002; BAGHALIAN et al. 2005).
CH
2
S
OH
O
NH
2
O
CH
2
S
S
CH
2
O
Figura 3 – Formação do composto organosulfurado alicina.
LAWSON et al. (1998), citado por NUUTILA (2003) verificaram em modelo
animal que a alicina em baixa concentração foi responsável pela atividade
antioxidante, porém em alta concentração este composto apresentou efeito pró-
oxidante.
alicina
aliina
26
YIN et al. (2002) utilizando o método do poder redutor, verificaram que os
compostos organosulfarados dialil sulfito, dialil disulfito, S-etil cisteína (SEC) e N-
acetil cisteína (NAC), quando comparados com o α-tocoferol, apresentaram
resultados diferentes. O SEC e o NAC apresentaram menor poder redutor do que o
α-tocoferol, ou seja, menor atividade antioxidante, porém o contrário ocorreu com os
compostos dialil sulfito (DAS), dialil dissulfito (DADS).
De acordo com HOLUB et al. (2002) o extrato de alho envelhecido (AGE) é
rico no composto organosulfurado, S-alicisteína (SAC), derivado da substância γ-
glutamilcisteína, que possui propriedades antioxidantes. Para obter este produto, o
alho é incubado em 15 a 20 % de etanol/água por 18 a 20 meses, onde o odor é
removido. Este extrato não contém sulfoxidos de cisteína e produtos derivados da
transformação da alicina.
WETTASINGHE et al. (2002) verificaram em seu estudo que o extrato
aquoso de alho inibiu a descoloração do β-caroteno em torno de 30 %.
NUUTILA et al. (2003) verificando a inibição da peroxidação lipídica em
hepatócitos de ratos, concluíram que o alho hungariano, apresentou 25 % de inibição
da oxidação lipídica, utilizando concentração de 1000 mg/mL.
BENKEBLIA (2004) verificou em seu estudo a capacidade que os extratos de
Allium possuem em remover o peróxido de hidrogênio. O autor concluiu que o alho
removeu cerca de 91% dos peróxidos de hidrogênio, e as cebolas verde, amarela,
vermelha e roxa removeram 35,9, 64,8, 76 e 77%, respectivamente.
TSAI et al. (2005) observaram que o alho possui 10,2 mg/g de equivalentes
de ácido gálico (EAG) baseando no resíduo, e apresentou capacidade antioxidante
total de 4,4 mmol de equivalentes de trolox/g de resíduo.
Além dos compostos organosulfurados, o alho possui outras substâncias com
efeito antioxidante, ou seja, os compostos fenólicos, como os flavonóides (EGEN et
al. 1992; BOREX 2001).
Os compostos fenólicos estão largamente distribuídos nos alimentos, sendo a
quantidade presente na alimentação humana bastante significativa (DREOSTI 2000).
Eles podem ser definidos quimicamente como substâncias que possuem um anel
aromático ou um anel benzeno com uma ou mais hidroxilas; porém, podem
27
apresentar outros grupos substituintes em sua estrutura, como ésteres, metil-ésteres e
glicosídeos (MARTINEZ-VALVERDE et al. 2000).
O mais importante grupo dos fenólicos em alimentos é o dos flavonóides, que
consiste principalmente nos seguintes compostos:
- catequinas, presentes em frutas e folhas de chá;
- flavonóides e seus glicosídios, como a quercitina, miricetina e rutina presentes em
frutas e outros vegetais (PRATT 1992).
- outros grupos são: (a) fenóis, ácidos fenólicos e ácidos fenil acéticos; (b) ácidos
cinâmicos, cumarinas, isocumarinas e cromonóis; (c) lignanos e neolignanos; (d)
taninos.
Além da capacidade antioxidante como bloqueadores dos radicais livres na
reação em cadeia, os compostos fenólicos são capazes de eliminar os radicais
hidroxila, o superóxido e o oxigênio singlete (DONNELLY e ROBSON 1995). A
inativação de radicais de oxigênio por compostos fenólicos ocorre pela formação de
espécies de menor reatividade, ou pela ação como doador de hidrogênio (SIMIC e
JAVANOVIC 1994). A menor reatividade ocorre devido ao deslocamento do elétron
não pareado para a estrutura do anel aromático (HALLIWELL e GUTTERIDGE
1989). Os compostos fenólicos também podem quelar metais (MOREIRA e
MANCINI-FILHO 2004).
Como o alho é uma especiaria rica em substâncias com propriedades
antioxidantes, então, existe a necessidade de compreender a definição, os
mecanismos de ação, as fontes e a legislação dos antioxidantes; além dos métodos
que podem ser utilizados para avaliar a propriedade antioxidante.
1.2. Antioxidantes: definição, mecanismos de ação, fontes e
legislação
Antioxidante se refere a qualquer substância que, quando presente em baixas
concentrações em relação ao substrato oxidável, atrasa ou inibe consideravelmente a
oxidação do substrato (THOMAS 2000). Do ponto de vista biológico, podemos
conceituar antioxidantes como substâncias que protegem sistemas biológicos contra
28
os efeitos potencialmente danosos de processos ou reações que promovem a
oxidação de macromoléculas ou estruturas celulares (ABDALLA 1993).
Os sistemas de defesa antioxidante do organismo humano compreendem uma
gama variada de substâncias que atuam em diferentes níveis (SHAHIDI e
WANASUNDARA 1992; ABDALLA 2000):
- sistema primário: constitui-se em uma primeira linha de defesa formada por
substâncias que atuam impedindo a geração de espécies reativas, através da retirada
das mesmas, de forma a impedir sua interação com alvos celulares, ou seja,
bloqueiam a etapa de iniciação da cadeia radicalar. Entre os compostos que exercem
este mecanismo de ação estão as enzimas antioxidantes (catalase, peróxido
dismutase, glutationa peroxidase); quelantes de metais e proteínas, como a
transferrina e a ceruloplasmina (transportam ferro e cobre respectivamente,
impedindo que estes metais sejam liberados, e catalisam a formação de espécies
oxidantes); substâncias não-enzimáticas (urato, ascorbato, albubina, bilirrubina,
tocoferóis, carotenóides e bioflavonóides, que seqüestram radicais superóxido e
hidroxila ou suprimem oxigênio singlete);
- sistema de defesa secundário: é formado por compostos que atuam
bloqueando a etapa de propagação da oxidação lipídica, seqüestrando radicais
intermediários (peroxil ou alcoxil). Esses antioxidantes geralmente são compostos
fenólicos ou aminas aromáticas, entre eles estão o α-tocoferol, flavonóides e vários
antioxidantes sintéticos;
- sistema de defesa terciário: é constituído pelos sistemas de reparo do DNA:
proteases e fosfolipases, as quais atuam removendo lesões oxidativas do DNA,
proteínas e lipídios, respectivamente.
Os antioxidantes podem ser encontrados de duas formas nos alimentos:
adicionados por processamento tecnólogico ou como constituinte natural.
Os principais antioxidantes sintéticos utilizados habitualmente nos alimentos
são os compostos fenólicos (BHA – butil hidroxianisol, BHT – butil hidroxitolueno,
TBHQ – tercibutilhidroquinona, PG – galato de propila, NDGA – ácido
nordihidroguaiarético (NAWAR 1996). O BHA, o BHT e o PG possuem alta
estabilidade e baixo custo. No entanto, a utilização destes compostos em alimentos
têm decrescido. Segundo MARTIN e GILBERT (1968) e HALLADAY et al. (1980)
29
os antioxidantes BHA e BHT podem apresentar certa toxicidade e eficiência menor
em relação a alguns antioxidantes naturais. Estes compostos causaram hepatomegalia
e alterações na atividade das enzimas do fígado e do intestino de ratos. Estes
antioxidantes são largamente empregados pela indústria alimentícia em óleos,
gorduras, salgadinhos e produtos cárneos (FERRARI 2000).
Os derivados do tocoferol e do ácido ascórbico, utilizados como substitutos
dos antioxidantes sintéticos, são menos efetivos como antioxidantes de alimentos,
necessitando a identificação de novas fontes naturais alternativas de antioxidantes em
alimentos, junto com uma maior conscientização dos consumidores com relação à
segurança dos aditivos nos alimentos (SHAHIDI e WANASUNDARA 1992).
Nos Estados Unidos a regulamentação para o emprego dos antioxidantes
alimentares em alimentos é controlado pelas instituições: Federal Food, Drug,
Cosmetic Act, Meat Inspection Act, Poultry Inspection Act e várias leis estaduais.
Em geral, a maior parte dos países tem regulamentado a utilização isolada ou
combinada dos antioxidantes sintéticos em quantidades não superiores a 200 ppm.
No Brasil, esta regulamentação é controlada pela Resolução do Conselho Nacional
de Vigilância Sanitária (CNS) n
o
04/88, de 24 de novembro de 1988, publicada no
Diário Oficial da União de 19/12/1988. No quadro 5 estão relacionados os aditivos
classificados como antioxidantes e os limites máximos de segurança permitidos para
o uso.
Quadro 5 - Limite máximo de uso de aditivos em alimentos no Brasil.
Aditivos Alimentos em que podem
ser usados
Limite máximo
g/100 g - g/100
mL
Margarina 0,30
Ácido ascórbico (ácido L-
ascórbico e seus sais
de potássio, sódio e cálcio)
Óleos e gorduras 0,03
Margarinas q.s.p*
Ácido cítrico
Óleos e gorduras q.s.p.*
Margarinas 0,20
Ácido isoascórbico e seu sal de sódio
Óleos e gorduras 0,03
Margarinas 0,01
Ácido fosfórico
Gorduras e compostos
gordurosos
0,01
Margarinas 0,02
Butil hidroxianisol (BHA)
Óleos e gorduras 0,02
continuação...
30
...continuação
Aditivos Alimentos em que podem
ser usados
Limite máximo
g/100 g - g/100
mL
Margarinas 0,02
Butil hidroxitolueno (BHT)
Óleos e gorduras 0,01
Margarinas 0,01
Citrato de monoglicerídeos
Óleos e gorduras 0,02
Margarinas 0,01
Citrato de monoisopropila
Óleos e gorduras 0,01
Gorduras e compostos
gordurosos
0,01
EDTA -
cálcico dissódico (etilenodiaminotetrac
etato cálcico e dissódico)
Margarinas 0,01
Eritorbato de sódio
Carnes, produtos frescais
embutidos ou não embutidos
q.s.p*
Margarinas 0,01
Galato de proprila de duodecila ou de octil
Óleos e gorduras 0,01
Margarinas 0,50
Lecitinas (fosfolipídeos, fosfatídeos e
fosfoluteínas)
Óleos e gorduras 0,20
Margarinas 0,02
Palmitato de ascorbila e estearato de ascorbila
Óleos e gorduras 0,05
Tercibutilhidroquinona (TBHQ)
Óleos e gorduars 0,02
Margarinas 0,03
Tocoferóis
Óleos e gorduras 0,03
* q.s.q = quantidade suficiente para
Fonte: Diário Oficial da União de 19/12/1988
O interesse pela pesquisa sobre novos antioxidantes naturais tem aumentado
nos últimos anos, levando as indústrias de alimentos, de cosméticos e farmacêuticos
a ter maior atenção em novas fontes de antioxidantes naturais. Os compostos
antioxidantes naturais têm sido isolados de diferentes partes de plantas, tais como
sementes, frutas, folhas e raízes; e nas especiarias. Os mais utilizados em alimentos
são o ácido cítrico, ácido ascórbico e palmitato de ascorbila (DORKO 1994).
Segundo WANASUNDARA et al. (1997) muitos são os componentes
naturalmente presentes nos alimentos que apresentam atividade antioxidante, os
quais incluem: carotenóides (α-caroteno, β-caroteno, luteína, licopeno); compostos
fenólicos (ácido clorogênico, cumarinas, ácidos fenólicos, lignanas, flavonóides,
tirosol, antocianinas, taninos, catequina); compostos organosulfurados e tocoferol,
sendo que no alho estão presentes os compostos fenólicos e organosulfurados.
Sendo uma das características dos antioxidantes retardar o desenvolvimento
de sabor e aroma desagradável ocasionado pela oxidação de ácidos graxos
insaturados, usualmente presentes, como triacilgliceróis, hoje em dia há uma
31
tendência geral no processamento de alimentos em substituir os antioxidantes
sintéticos pelos inibidores naturais da oxidação, ou seja, pelo uso de ingredientes
alimentares que naturalmente possuem atividade antioxidante (MANCINI-FILHO et
al. 1998).
1.2.1. Estudos com alimentos funcionais – ação antioxidante
Declarações sobre a capacidade de certos alimentos em reduzir o risco de
doenças e melhorar a qualidade de vida continuam levantando opiniões em pesquisas
de nutrição e na indústria de alimentos. O interesse da população por “alimentos
funcionais” e seus componentes fisiologicamente ativos se deve a estes estarem
relacionados com a redução dos custos com cuidados médicos e à promoção à saúde
(MILNER 1999).
PARRAS e DUAILIBI (2002) relataram que os alimentos funcionais são
alimentos naturais ou produtos alimentícios elaborados que possuem em sua
composição substâncias bioativas que podem influenciar positivamente numa função
fisiológica atuando na redução de riscos de várias doenças. A regulamentação do
conceito de alimentos funcionais têm sido examinada baseada em paramêtros
internacionais, e é geralmente aceito que estes alimentos devem fornecer benefícios à
saúde, além de seus valores nutricionais (KWAK e JUKES 2001).
O efeito das substâncias alimentares bioativas na manutenção da saúde e na
proteção contra doenças, como as cardiovasculares e câncer, além da atenuação do
envelhecimento, tem aumentado o interesse no sentido de ampliar o conhecimento
sobre as mesmas, entre os pesquisadores, fabricantes de alimentos e consumidores
(LOLIGER 1991). Alguns estudos para avaliar a atividade antioxidante que os
alimentos e bebidas apresentam estão citados abaixo:
MELO et al. (1986), quando avaliaram 20 tipos de temperos, observaram
uma alta capacidade antioxidante para extratos obtidos do alecrim, da sálvia, do
orégano, do cravo, da mostarda, e em menor intensidade para salsa e cebolinha,
embora todos os extratos foram efetivos como antioxidantes.
32
FERRARI (2002) analisou a capacidade antioxidante de alimentos in natura e
manufaturados consumidos no município de São Paulo, e concluiu que os alimentos
que apresentaram elevada atividade antioxidante foram a castanha do Brasil,
seguidos do guaraná, café, chocolate, maça, couve manteiga e beterraba, já os
menores valores encontrados foram para o feijão, a banana, a cebola, o limão e a
laranja.
ISHIMOTO (2003) avaliou a atividade antioxidante de diferentes tipos e
marcas de vinhos e sucos de uva brasileiros, e concluiu que os sucos de uva
apresentaram valores de inibição da oxidação lipídica inferiores aos encontrados para
os vinhos tintos. Comparando os vinhos, o tinto apresentou melhor inibição da
oxidação que o rosé e este por sua vez, melhor que o branco. A atividade
antioxidante dos vinhos e dos sucos está relacionada ao teor de compostos fenólicos
presentes nestas bebidas.
MELO et al. (2003) quando avaliaram a atividade antioxidante de extratos de
coentro (extrato etéreo, etanólico e aquoso), isolados, associados entre si e com o
BHT, utilizando o sistema modelo β-caroteno/ácido linoléico, verificaram que os
extratos aquoso, etéreo e etanólico exibiram 69,83%, 61,89% e 40,50%,
respectivamente, de proteção contra a oxidação. Ao combinar os dois primeiros
extratos, em diferentes concentrações, o percentual de inibição da oxidação foi
inferior ao dos extratos isolados, demonstrando não haver sinergismo entre eles.
Associações de diferentes concentrações de BHT com o extrato aquoso exibiram
elevada ação antioxidante, enquanto com o extrato etéreo esta ação foi levemente
superior a do extrato isolado. A habilidade dos extratos aquoso e etéreo em retardar a
oxidação pode ser atribuída, respectivamente, aos seus constituintes fenólicos e
carotenóides.
SALDANHA (2005) estudando a atividade antioxidante in vitro das
diferentes concentrações e extratos de erva-mate verde e tostada e chá verde,
concluiu que, pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico, apenas os extratos aquosos e
étereos de chá verde, na concentração de 0,5 mg/mL, apresentaram resultados
inferiores ao BHT (padrão), sendo que os demais, para ambas as concentrações (0,5 e
1,0 mg/mL) apresentaram ótima inibição da oxidação lipídica (semelhante ao
padrão).
33
BASTOS et al. (in press) avaliaram a atividade antioxidante do chá verde e
do chá mate pelo método do Tiocianato Férrico, e concluíram que as amostras
possuem capacidade antioxidante similar ao padrão BHT (antioxidante sintético).
Embora seja crescente o interesse para o uso de fontes naturais com potencial
antioxidante, apenas um número limitado delas é realmente utilizado em alimentos
(LOLIGER 1991).
1.2.2. Métodos para determinar a atividade antioxidante em alimentos
A determinação da atividade antioxidante em alimentos torna-se cada vez
mais importante nas áreas de tecnologia dos alimentos e de nutrição. Embora exista
uma grande diversidade de métodos, não existem métodos validados ou padronizados
(GIADA e MANCINI-FILHO 2004). Esta grande gama de metodologias empregadas
proporciona resultados numéricos distintos, difíceis de serem comparados (GRAY
1978; MARTÍNEZ-VALVERDE et al. 2000).
A maior parte dos métodos para avaliação da atividade antioxidante in vitro é
baseada na capacidade destes em remover os radicais livres do meio, pela rápida
doação de um átomo de hidrogênio para estes radicais (PRIOR e CAO 2000). Para se
determinar a atividade antioxidante pode ser utilizado o método radical 1,1-difenil-2-
picrilhidrazil (DPPH
.
), o ensaio do poder antioxidante em redução férrica (FRAP), o
método de descoloração do radical 2,2’-azinobis-ABTS
.+
, o ensaio da capacidade de
absorbância do radical oxigênio (ORAC), o com metasulfato-NADH fenazina e o
ensaio da atividade da xantina-oxidase (MOURE et al. 2001).
Também existem os métodos que empregam lipídios como substrato. Neste
grupo de metodologias, há uma grande diversidade de métodos analíticos (químicos,
físicos e/ou físico-químicos). A existência de vários métodos para avaliar a
capacidade antioxidante, gera algumas dificuldades de seleção da metodologia mais
adequada para um determinado estudo. Da mesma forma, a diversidade das
condições de ensaio (substratos lipídicos, concentrações, tempo de oxidação,
temperaturas, oxigenação), e dos sistemas modelos usados dificulta à interpretação e
comparação dos resultados obtidos através destas metodologias. O sistema β-
34
caroteno/ácido linoléico, o aparelho Rancimat®, método de dienos conjugados,
ensaio das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), índice de
peróxidos, LDL-colesterol humana são utilizados para a avaliação da atividade
antioxidante (SILVA et al. 1999; GIADA e MANCINI-FILHO 2004).
Desta forma, a atividade antioxidante in vitro pode e deve ser avaliada por
testes com diferentes mecanismos. Contudo, todos estes diversos ensaios baseados
em reações químicas oferecem resultados diferentes. No capítulo a seguir, foram
escolhidos três métodos com mecanismos diferentes para avaliar a atividade
antioxidante do alho in natura e de seus produtos comercializados, sendo eles o
ensaio DPPH, o sistema β-caroteno/ácido linoléico e avaliação da capacidade
protetora da oxidação lipídica utilizando o aparelho Rancimat®, que estão descritos
abaixo. A escolha destes métodos se deve a grande utilização dos mesmos em outros
estudos (KAUR e KAPOOR 2002; NUUTILA et al. 2003; BENKEBLIA 2005; SUN
e HO 2005), permitindo assim uma comparação de resultados.
- Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
): este método baseia-se na
remoção do radical estável DPPH
.
do meio de reação pelos antioxidantes da amostra
(PULIDO et al. 2000). O radical DPPH
.
foi um dos mais antigos radicais sintéticos
usados para se estudar os efeitos estruturais na atividade antioxidante. Este radical
comercialmente disponível serve como radical oxidável a ser reduzido pelo
antioxidante (AH), bem como indicador para a reação: DPPH
.
+ AH → DPPH-H +
A
.
(YAMAGUCHI et al. 1998; GIADA e MANCINI-FILHO 2004). O grau de
descoloração do radical DPPH
.
, a 517 nm, pela ação dos antioxidantes é medido
espectrofotometricamente em uma solução metanólica até a absorbância permanecer
constante, e indica a eficiência de remoção do radical pelo antioxidante adicionado
(GIADA e MANCINI-FILHO 2004).
- Sistema β-caroteno/ácido linoléico: este método consiste na co-oxidação de
substratos, através de ensaio espectrofotométrico a 450 a 470 nm, baseado na
descoloração (oxidação) do β-caroteno, induzido por produtos da degradação do
ácido linoléico devido a diferentes indutores (oxigênio, luz, calor) (MARCO 1968;
modificado por MILLER 1971). A queda na leitura da densidade ótica das amostras
35
é correlacionada com o controle (sem antioxidante), considerado como 100% de
oxidação, e estabelecida a percentagem de inibição da oxidação, subtraindo-se a
percentagem de oxidação de cada amostra de 100 (MELO e MANCINI-FILHO
1989).
- Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica utilizando o aparelho
Rancimat®: este procedimento requer equipamento simples e pode ser utilizado
como um método para determinar a atividade antioxidante, através de diversos
substratos como a gordura vegetal hidrogenada e os óleos comestíveis. O lipídio é
exposto a uma corrente de ar seco ou de oxigênio, a uma temperatura de 100 a 140
o
C, e o progresso das curvas de oxidação decorrente pode ser seguido pela
determinação periódica do índice de peróxido. Estas curvas compreendem uma fase
de indução, onde não se forma praticamente nenhum dos produtos secundários da
oxidação, e uma fase de oxidação, durante a qual há uma grande elevação no índice
de peróxido, e produtos voláteis (principalmente ácido fórmico) são detectados. A
adição de um antioxidante resulta na inibição da oxidação. O método empregado
neste aparelho baseia-se no registro das variações da condutividade da água
destilada, na qual se faz a coleta dos ácidos de baixo peso molecular obtidos após a
iniciação forçada da oxidação à elevada temperatura (LAUBLI e BRUTTEI 1996;
ANTOLOVICH et al. 2002).
Para melhor compreensão o que é uma substância antioxidante e como esta
age, é necessário conhecer sobre os radicais livres, oxidação lipídica e estresse
oxidativo.
1.3. Radicais livres
O interesse pelo estudo dos radicais livres e por substâncias antioxidantes têm
se intensificado cada vez mais. O termo radical livre refere-se ao átomo ou molécula
que contêm número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica. Nas
moléculas, os elétrons em geral se reúnem em pares. Um par de elétrons é mais
36
estável que quando desemparelhados. A falta de elétron com spin positivo ou
negativo confere alta reatividade às moléculas, provocando reações em cadeia e
desestabilizando as ligações das substâncias do meio molecular (FERREIRA e
MATSUBARA 1997; THOMAS 2000). Eles são formados em um cenário de
reações de óxido-redução, isto é, ou cedem o elétron, oxidando-se, ou recebem,
reduzindo-se. Portanto, os radicais livres ou provocam as reações de óxido-redução
ou resultam delas (FERREIRA e MATSUBARA 1997).
A maior parte dos radicais livres é derivada do metabolismo do oxigênio
molecular (O
2
) utilizado na cadeia respiratória, que se encontra na membrana interna
da mitocôndria para a produção de energia (ATP), sendo portanto, chamados de
“espécies reativas do metabolismo do oxigênio” (ERO), e os principais são:
(1) radical superóxido (O
-
2
) – a adição de um elétron na molécula de O
2
em seu
estado fundamental ocorre em um de seus orbitais. A formação do radical superóxido
com apenas um elétron não pareado pode gerar outras espécies de maior reatividade
como o peróxido de hidrogênio, hidroxila e o peroxinitrito (HALLIWELL e
GUTTERIDGE 1989).
O
2
+ e
-
→ O
-
2
(2) peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) – resultante da redução com 2 elétrons do O
2
,
(O
2
2-
):
O
2
+ 2 e
-
+ 2H
+
→ H
2
O
2
O H
2
O
2
não apresenta a característica de radical livre, pois em seus orbitais os
elétrons estão pareados (HALLIWELL e GUTTERIDGE 1989). Esta espécie torna-
se importante devido à sua característica hidrossolúvel, permitindo sua
permeabilidade através de membranas biológicas, e também devido à produção de
outros radicais de maior reatividade, como o radical hidroxila (HALLIWELL e
GUTTERIDGE 1989; FERREIRA e MATSUBARA 1997).
37
(3) radical hidroxila (OH
-
) – sua formação in vivo pode estar relacionada com a
decomposição do peroxinitrito, do peróxido de hidrogênio ou superóxido, e com a
presença ou não da ação catalítica de metais de transição (ferro), conhecidas como
reações de Fenton e Haber-Weiss, conforme esquema abaixo:
Fe
2+
+ H
2
O
2
→ Fe
3+
+ OH
-
+ OH
.
Fe
3+
+ H
2
O
2
→ Fe
2+
+ HO
2.
+ H
+
Esse radical é o de maior reatividade entre as espécies de oxigênio, e reage
rapidamente com inúmeras biomoléculas, danificando-as (HALLIWELL e
GUTTERIDGE 1989).
(4) oxigênio singlete (
1
O
2
): é a forma excitada do oxigênio molecular e não possui
elétrons desemparelhados em sua última camada. O
1
O
2
possui uma alta reatividade,
sendo um poderoso agente oxidante. Tem importância em certos eventos biológicos,
mas poucas doenças foram relacionadas à sua presença (FERREIRA e
MATSUBARA 1997).
Também existe as “espécies reativas do metabolismo de nitrogênio” (ERN),
como o óxido nítrico e peroxinitrito:
(1) óxido nítrico (NO
-
): é gerado in vivo a partir do aminoácido arginina, possui um
potencial tóxico e está relacionado à formação de outras espécies altamente reativas,
como o radical hidroxila e o peroxinitrito (HALLIWELL et al. 1995).
(2) peroxinitrito (ONOO
-
): este sofre protonação em pH fisiológico e pode se
decompor, gerando radical hidroxila e dióxido de nitrogênio em uma quebra
homolítica dessa molécula, conforme esquema abaixo (HOOG et al. 1992):
ONOO
-
+ H
+
→
.
OH + NO
2
.
O peroxinitrito é também uma espécie potencialmente tóxica, agindo
diretamente sobre moléculas biológicas (RADI et al. 1991), podendo ser encontrado
38
na fumaça gerada pela queima do cigarro e de materiais orgânicos (HALLIWELL et
al. 1995).
As ERO possuem um papel importante nos danos teciduais em humanos,
desencadeando o processo de envelhecimento e na patogênese de mais de 50 doenças
crônicas não transmissíveis como: aterosclerose, diabetes, câncer, Doença de
Parkinson, Doença de Alzheimer. A reação de ERO com biomoléculas tais como
lipídeos de membranas, proteínas e ácido desoxiribonucléico (DNA), pode provocar
mudanças irreversíveis nas suas estruturas (IULIANO et al. 1997; ABDALLA
2000).
Vale ressaltar que nem sempre as ERO e as ERN estão envolvidas com
processos biológicos indesejáveis. Por exemplo, o ânion superôxido possui um papel
importante no combate de infecções provocadas por bactérias, auxiliando os
neutrófilos na destruição dos microorganismos. Outro exemplo é a contribuição do
óxido nitríco no controle da pressão e fluxo sanguíneo do sistema cardiovascular
(BAST et al. 1991; MONCANDA e HIGGS 1993).
1.4. Oxidação lipídica
Todos os componentes celulares encontram-se propensos ao ataque dos
radicais livres, mas a membrana, que é rica em lipídeos insaturados, é uma das mais
atingidas (NAWAR 1996; FERREIRA e MATSUBARA 1997); conseqüentemente,
há perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como
as enzimas hidrolíticas dos lisossomos, e formação de produtos citotóxicos (como o
malonaldeído), culminando com a morte celular. As lesões causadas pelo processo
oxidativo in vivo induzidas por radicais livres podem estar associadas a várias
condições clínicas, como lesões das fibras cardíacas, iniciação e progressão da
carcinogênese, inflamações crônicas, diabetes, doenças auto-imunes e relacionadas
ao próprio processo de envelhecimento (TORRES et al. 1988; ABDALLA 2000;
CHENG et al. 2001; POLIDORI et al. 2001; CAMOUGRANG e RIGOULET 2001).
A oxidação lipídica ocorre também em alimentos. Este aspecto é de grande
importância, não somente sob o enfoque econômico, devido a perdas por diminuição
39
da vida de prateleira, mas também pela possibilidade dos radicais livres formados
reagirem ou interagirem com outros constituintes dos alimentos provocando uma
queda na qualidade nutricional dos mesmos (NAWAR 1996).
A oxidação lipídica é uma reação em cadeia iniciada freqüentemente pelo
radical hidroxila (OH
-
), representada pelas etapas de iniciação, propagação e
terminação. Estas etapas estão apresentadas nas reações seguintes, onde L representa
o lipídio (NAWAR 1996; FERREIRA e MATSUBARA 1997):
(1) Iniciação: LH + OH
.
(ou LO
.
) → L
.
+ H
2
O (ou LOH)
(2) Propagação: L
.
+ O
2
→ LOO
.
LH + LOO
.
→ L
.
+ LOOH
(3) Terminação: LOO
.
+ L
.
→ LOOL
LOO
.
+ LOO
.
→ LOOL + O
2
(1) Ácidos graxos insaturados (LH) são convertidos, via abstração de hidrogênio (H
.
)
da membrana celular, em radicais livres lipídicos (L
.
). Tal seqüestro pode ser
realizado pelo OH
.
(radical hidroxila) ou pelo LO
.
(radical alcoxila).
(2) Os radicais livres gerados são oxidados pelo oxigênio molecular (O
2
), originando
radicais peroxila (LOO
.
), que por sua vez seqüestra novo hidrogênio do ácido graxo
insaturado, formando novamente o L
.
(radical livre lipídico) na segunda equação da
propagação.
(3) A fase de terminação tem como característica a formação de produtos finais
estáveis ou não reativos (FERREIRA e MATSUBARA 1997).
Os principais produtos finais da oxidação lipídica compreendem os derivados
da decomposição de hidroperóxidos, como álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres e outros
hidrocarbonetos. O malonaldeído é o maior produto secundário da oxidação lipídica,
apresentando efeito citotóxico, carcinogênico, mutagênico (FERRARI 1998).
40
Uma vez iniciada, a reação de oxidação lipídica segue em cadeia, e somente
termina quando estiverem esgotadas as reservas de ácidos graxos insaturados e o
oxigênio do meio (KIRK 1984, citado por FERRARI 2000).
Por esta razão, os fatores que desencadeiam, bem como os que previnem a
oxidação lipídica são amplamente discutidos e documentados, sendo objeto de estudo
nas últimas décadas (TORRES 1987; FERRARI e TORRES 2000).
1.5. Estresse oxidativo
Os radicais livres podem ser gerados durante as funções metabólicas normais,
porém as células, através de sistemas naturais de defesa constituídos principalmente
pelas enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH-Px),
catalase e glutationa reduzida (GSH), são protegidas. Entretanto, sob condições em
que há excesso de radicais livres e deficiência no sistema protetor, haverá um
desequilíbrio entre a formação e a remoção destas espécies reativas no organismo,
caracterizando o estresse oxidativo (FERREIRA e MATSUBARA 1997; SIES
2000).
Uma maneira de combater o estresse oxidativo e a oxidação lipídica consiste
na utilização de antioxidantes presentes em alimentos com a propriedade de impedir
ou diminuir o desencadeamento das reações oxidativas (HALLIWELL et al. 1995).
Como o alho é uma especiaria rica em substâncias antioxidantes, justifica-se a
avaliação de sua atividade antioxidante e de seus diferentes produtos comercializados
mediante a vida de prateleira em próximos estudos.
41
CAPÍTULO 2
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DE
ALHO IN NATURA E DE SEUS PRODUTOS
COMERCIALIZADOS DURANTE A VIDA DE PRATELEIRA
2.1. Introdução
O aumento do consumo de frutas, vegetais e hortaliças está associado com o
menor risco de doenças crônicas não transmissíveis, como alguns tipos de câncer,
doenças cardiovasculares, e também na atenuação do processo de envelhecimento
(LOLIGER 1991; VINSON et al. 1998; NUUTILA et al. 2003, SINGI et al. 2005).
Este efeito protetor tem sido atribuído particularmente à presença de várias
substâncias antioxidantes encontradas nestes alimentos, por exemplo a vitamina C e
E, β-caroteno, polifenóis (NUUTILA et al. 2003).
O alho, conhecido cientificamente como Allium sativum, possui
características acentuadas de aroma e sabor que lhe atribuem propriedades
condimentares, conferindo a esta hortaliça destaque na culinária brasileira e também
em outros países. Além desta forma de utilização, o alho tem sido utilizado muito na
indústria farmacêutica, por possuir características de um alimento funcional (RIOS e
PENTEADO 2003; SOUZA e MACEDO 2004). O consumo de produtos de alho
processado (picado, frito, pasta) no Brasil vem crescendo gradativamente
(OLIVEIRA et al. 2003; OLIVEIRA et al. 2004). Isto se justifica pela facilidade e
praticidade de seu uso na culinária, sendo estes produtos encontrados prontos para o
consumo.
Plantas da família Allium têm demonstrado propriedades antioxidantes em
vários estudos (YIN e CHENG 1998; GAZZANI et al. 1998; NUUTILA et al. 2003;
BENKEBLIA 2005; TSAI et al. 2005). Especialmente para o alho e seus diferentes
extratos, observou-se que esta hortaliça possui atividade antioxidante em modelos in
42
vitro, e esta atividade é atribuída à variedade de compostos organosulfurados e seus
precursores, além dos compostos fenólicos (KIM et al. 1997; NUUTILA et al. 2003).
De acordo com KIM et al. (1997), a alicina, dialil disulfito e dialil trisulfito
são alguns dos compostos organosulfurados voláteis, presentes no alho, com
atividade antioxidante. Testes com animais demonstraram que a alicina foi a
responsável pela atividade antioxidante do alho quando utilizada em baixas
concentrações (LAWSON 1998, citado por NUUTILA 2003). HIRATA e
MATSUSHITA (1996) demonstraram que a allina, a precursora da alicina, não
possui atividade antioxidante medida pelo sistema de oxidação do ácido linoléico.
A capacidade antioxidante das frutas e hortaliças depende da forma como o
alimento é consumido, seja na forma in natura ou processado. KAUR e KAPOOR
(2001) consideram que o tratamento térmico é a principal causa da alteração do teor
de antioxidantes naturais em alimentos. O processamento e os procedimentos para a
preservação dos alimentos podem ser responsáveis tanto pelo aumento quanto pelo
decréscimo da atividade antioxidante, dependendo de muitos fatores, tais como:
estrutura química, potencial de oxiredução, sua localização na matriz e possíveis
interações com outros componentes do alimento (NICOLI et al. 1999).
O tratamento térmico, embora geralmente considerado como a principal causa
da redução de antioxidantes naturais, pode também induzir a formação de novos
compostos com propriedades antioxidantes, como os produtos da reação de Maillard
(NICOLI et al. 1997; KAUR e KAPOOR 2001).
2.2. Justificativa
A importância econômica da cultura do alho tem aumentado sensivelmente
nos últimos anos, não só pelo seu uso generalizado como especiaria, mas também por
algumas qualidades terapêuticas que a ele são atribuídas. O alho contém compostos
fenólicos e organosulfurados, que são responsáveis pelo odor característico, sabor,
aroma e ação antioxidante. A atividade antioxidante do alho in natura já foi
demonstrada e está relacionada ao seu teor de compostos organosulfurados e de
43
compostos fenólicos, porém não há trabalho que compare a atividade antioxidante de
extratos de diferentes produtos comercializados de alho.
2.3. Objetivos
2.3.1. Objetivo Geral
Avaliar a atividade antioxidante in vitro do extrato metanólico do alho in
natura e de seus diferentes produtos comercializados na cidade de São Paulo,
verificando possíveis alterações durante a vida de prateleira.
2.3.2. Objetivos Específicos
Os objetivos específicos irão responder as seguintes questões:
- Os resultados das análises da atividade antioxidante e do teor de fenólicos totais
irão variar em função dos diferentes tipos de processamentos do alho?
- Houve modificações na atividade antioxidante e no teor de fenólicos totais no
decorrer da vida de prateleira?
- Qual a correlação da atividade antioxidante avaliada por diferentes metodologias e
do teor de fenólicos totais presentes nestes produtos?
Neste trabalho foi acrescentado, a nível de informação, o teor de umidade das
amostras que encontram-se no anexo 1 (
p. 120
).
44
2.4. Materiais e Métodos
2.4.1. Materiais
2.4.1.1. Solventes e reagentes
Solventes e reagentes de grau analítico como: álcool etílico P.A., álcool
metílico P.A., clorofórmio P.A., Tween 40, ácido gálico, ácido linoléico (W 33-800-
1), β-caroteno (C 9750-5G), DPPH (D-9132), Folin- Ciocalteu e carbonato de sódio
utilizados neste trabalho tiveram as seguintes procedências: CAAL Produtos
Químicos Ltda, Sigma Aldrich Brasil Ltda, Merck S.A. produtos para laboratório
Ltda, Synth- Labsynth produtos para laboratórios Ltda.
2.4.1.2. Amostras
O presente projeto foi desenvolvido com 3 lotes diferentes de uma mesma
marca de alho. As amostras de alho in natura (3 caixas, contendo 5 kg cada) foram
obtidas da Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP).
Segundo o comercializador de alho e informações do rótulo do produto, o local de
plantio das amostras foi na região de Curitibanos – SC. O período de plantio foi julho
de 2004 e a da colheita dezembro do mesmo ano, sendo que este produto chegou à
CEAGESP em janeiro de 2005, quando o mesmo foi adquirido para o
desenvolvimento do projeto.
As amostras estavam armazenadas em caixas de madeira, e constava na
embalagem a seguinte classificação do produto (de acordo com o número de dentes,
cor e tamanho - maiores detalhes no quadro 3) :
grupo - nobre ;
subgrupo - 2;
classe - 7;
45
Posteriormente, estas amostras foram enviadas para a empresa Fresh Garlic,
onde foram processadas, conforme descrito na figura 4. Esta empresa é de médio
porte e está situada na cidade de São Paulo.
46
alho in natura
caixa 3 – 5Kg
Lote 3
caixa 2 – 5Kg
Lote 2
caixa 1 – 5Kg
Lote 1
alho in natura (AIN)
alho in natura (AIN)
alho in natura (AIN)
alho picado sem sal (AP)*
alho picado com sal -2%
(APS)*
alho misto (AM)*
alho picado sem sal (AP)*
alho picado com sal -2%
(APS)*
alho misto (AM)*
alho picado sem sal (AP)*
alho picado com sal- 2%
(APS)*
alho misto (AM)*
alho frito (AF)
alho frito (AF)
alho frito (AF)
* As amostras de alho picado sem sal, picado com sal (2%) e misto, contém em sua composição os seguintes aditivos: ácido citríco, metabisulfito de sódio e benzoato de sódio. Já as
amostras de alho in natura e frito não possuem aditivos.
Figura 4 – Esquema das amostras obtidas de alho.
AQUISIÇÃO - CEAGESP
PROCESSAMENTO -
EMPRESA DE ALHO
47
Para avaliação da possível variabilidade da atividade antioxidante frente a
vida de prateleira (determinada pelo fabricante), foram adquiridas 3 embalagens
fechadas no mesmo momento de cada produto de alho e de cada lote, pois o processo
analítico ocorreu em momentos diferentes, da seguinte forma (quadro 6):
Momento 1 - análise próxima à data de fabricação;
Momento 2 - análise no período intermediário entre a data de fabricação e a data de
validade;
Momento 3 - análise próxima ao fim da data de validade.
Todas as amostras foram armazenadas em temperatura ambiente, conforme
indicação do fabricante.
Quadro 6 – Alho in natura e seus produtos comercializados, segundo a vida de
prateleira e o momento das análises.
Momento das análises
Amostras Vida de
prateleira
Momento 1*
Momento 2
Momento 3
Alho in natura
2 meses 1 dia 30 dias 60 dias
Alho picado sem sal
3 meses 1 dia 45 dias 90 dias
Alho picado com sal
3 meses 1 dia 45 dias 90 dias
Alho misto
3 meses 1dia 45 dias 90 dias
Alho frito
6 meses 1 dia 90 dias 180 dias
* momento 1 = momento da aquisição, considerado o primeiro dia do processamento.
O alho in natura e os quatro produtos utilizados estão apresentados na figura
5.
48
Figura 5 – Alho in natura e seus produtos comercializados.
Alho
in natura
Alho Frito
Alho Misto
Alho Picado sem Sal
Alho Picado com Sal
49
2.4.1.2.1. Características das amostras
De acordo com as informações obtidas junto a empresa fornecedora das
amostras, a retirada da película do alho in natura (AIN) para preparar o alho picado
sem sal (AP), o picado com sal (APS), o misto (AM) e o frito (AF), foi realizada em
descascadeira elétrica, sob pressão de ar comprimido. Para cortar as amostras in
natura foi utilizado processador industrial.
As características específicas do alho in natura e de seus produtos, estão
apresentadas abaixo:
• Alho in natura: para a realização da extração, os bulbos (cabeça) de alho
foram descascados manualmente e triturados em processador (marca Waring,
Estados Unidos);
• Alho frito: o alho in natura foi frito na temperatura de 180
o
C por 2 minutos.
O óleo utilizado foi o de soja e a gordura vegetal hidrogenada, na proporção 1:1,
procedimento padrão;
• Alho misto: este produto é uma mistura do in natura com o desidratado, na
proporção 1:5, pois é mais viável economicamente, segundo a empresa fornecedora
das amostras. O alho desidratado é proveniente da China - informações sobre a
variedade botância deste alho não foram disponibilizadas pela empresa fornecedora
das amostras deste trabalho, pois a mesma não dispunha deste dado. A hidratação do
mesmo é feito com água potável, na proporção 1:1;
• Alho picado com sal: alho in natura picado adicionado de 2 % de sal (m/m),
sendo este um procedimento padrão;
• Alho picado sem sal: alho in natura picado.
Para cada 10 kg dos produtos de alho misto, picado com sal e picado sem sal
foram utilizados 800 g de ácido citríco, 15 g de metabisulfito de sódio e 6 g de
benzoato de sódio como aditivos.
Os diferentes produtos de alho foram adquiridos em embalagens plásticas
transparentes contendo 200 g, semelhantes aos comercializados nos estabelecimentos
de alimentos, conforme ilustrado na figura 5.
50
2.4.1.2.2. Peso médio dos dentes de alho
Os dentes de alho de 2 bulbos, de cada lote, foram pesados. Na tabela 2,
pode-se verificar o peso médio e a quantidade de dentes de alho, segundo o lote. O
número de dentes de alho dos bulbos dos diferentes lotes variaram de 12 a 15,
conforme apresentado na tabela 2. De acordo com a análise de variância, pode-se
afirmar que não existe diferença estatisticamente significativa (p = 0,874) entre o
peso médio dos dentes de alho dos 3 lotes.
Tabela 2- Número e peso médio (g) dos dentes de alho em dois bulbos de cada lote.
Peso dos dentes de alho (g)
Lote 1 Lote 2 Lote 3 Dentes de
Alho
Bulbo 1 Bulbo 2 Bulbo 1
Bulbo 2 Bulbo 1 Bulbo 2
1
4,58 3,58 3,12 5,21 4,20 5,83
2
5,00 2,06 6,22 5,38 4,43 7,00
3
5,61 4,67 5,98 4,02 4,67 6,49
4
6,89 5,42 6,35 6,68 3,39 3,20
5
4,73 3,54 4,18 3,90 1,73 2,24
6
1,67 5,35 2,18 2,82 5,70 1,56
7
3,12 2,21 0,68 2,62 2,95 5,54
8
5,49 4,84 1,37 6,67 2,24 4,98
9
5,18 5,03 3,11 3,53 4,58 6,46
10
2,58 6,09 4,29 6,07 2,91 4,18
11
3,33 2,98 3,05 2,13 3,10 3,39
12
2,30 1,87 2,40 3,38 4,04 3,19
13
2,08 0,80 2,94 3,38
14
1,27 3,55
15
1,50
Peso médio
(g)
3,90 3,75
4,01
Desvio
padrão
1,58 1,81 1,49
51
2.4.2. Métodos
2.4.2.1. Obtenção do extrato metanólico
O processo de extração das substâncias presentes nos alimentos pode ocorrer
de diversas maneiras, variando tanto o tipo de solvente, quanto a metodologia. Por
isso, foram realizados pré-testes com o intuito de avaliar 3 metodologias diferentes
para a obtenção dos extratos de alho e posteriormente, verificar qual seria a melhor
extração para analisar a atividade antioxidante e quantificar os teores de fenólicos
totais. O critério utilizado para escolher o melhor método e solvente foi aquele que
apresentou o maior teor de fenólicos totais e o melhor resultado de atividade
antioxidante. Segundo dados da literatura, o teor de fenólicos totais está diretamente
relacionado a capacidade antioxidante, ou seja, quanto maior o teor de fenólicos
totais, maior a atividade antioxidante (KAUR e KAPOOR 2002; NUUTILA et al.
2003).
A primeira metodologia testada foi a descrita por KAUR e KAPOOR (2002),
que consiste em: pesar, homogeneizar e centrifugar a amostra a temperatura
ambiente a 9800 rpm por 15 minutos, utilizando dois solventes diferentes, obtendo os
extratos aquoso e etanólico 80%.
A segunda foi utilizada por NUUTILA et al.
(2003), onde foi feita extração com metanol em agitador magnético por 1 hora,
seguida de ultrassonificação por 20 minutos e centrifugação a 3000 rpm por 20
minutos. O sobrenadante foi reservado e o resíduo extraído novamente pelo mesmo
processo. Os dois sobrenadantes foram agrupados, obtendo-se o extrato metanólico,
levando o volume a 50 mL. As amostras também foram extraídas com água (extrato
aquoso) pelo mesmo processo. A terceira metodologia foi descrita por NUUTILA et
al. (2003), porém com modificações, ou seja, ao invés de centrifugar o extrato, este
foi filtrado em papel filtro (marca Nalgon, diâmetro 12,5 cm e porosidade 3 micra),
conforme descrito na figura 6.
Depois de realizado o pré-teste, optou-se por trabalhar com o método de
extração 3 (NUUTILA et al. 2003, com modificações) e com o solvente metanol,
pois foi o que apresentou o melhor resultado em teor de fenólicos totais
(SINGLETON e ROSSI 1965, modificado por NUUTILA et al. 2003) e em atividade
52
antioxidante pelo ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
), segundo método
desenvolvido por YAMAGUCHI et al. 1998. Estes dois métodos são citados com
maiores detalhes nos itens 2.4.2.3 e 2.4.2.4.1.
Figura 6 - Esquema da extração das diferentes amostras de alho, segundo NUUTILA
et al. (2003), com modificações.
Descrição do método de extração
Conforme apresentado na figura 6, foram pesadas 3 g de amostra e
adicionados 20 mL de metanol P.A, em seguida, a amostra foi agitada por 1 hora em
agitador magnético (marca Quimis, modelo Q.261.2) e ultrassonificada (marca
Thornton) por 20 minutos, sendo em seguida filtrada, utilizando papel filtro (marca
Nalgon, diâmetro 12,5 cm e porosidade 3 micra). O sobrenadante foi armazenado em
amostra - 3 g
extraçaõ com 20 mL de metanol
agitação por 1 hora
resíduo
ultrassonificação por 20
minutos
filtração
volume completado para
50
mL
sobrenadante
2
a
extração
53
balão volumétrico de 50 mL. O resíduo retido no filtro sofreu nova extração, sendo
que o seu sobrenadante foi direcionado para o mesmo balão do anterior. Foram
utilizados 10 mL de metanol para lavagem final do resíduo, sendo este descartado.
Os sobrenadantes foram completados para o volume de 50 mL com metanol.
Os extratos foram colocados em frascos âmbar, sob atmosfera de nitrogênio e
armazenados no freezer à -18
o
C até o momento das análises.
2.4.2.2. Determinação do teor de resíduo seco dos extratos
A quantificação do resíduo seco das amostras foi determinada pelo método
gravimétrico. O volume de 1 mL do extrato foi transferido para vidro relógio,
previamente tarado, e este foi colocado em estufa à 105
0
C, por 16 horas, seguido de
resfriamento em dessecador e pesagem, sendo a operação repetida até peso constante,
obtendo então o resíduo seco em mg/mL de extrato (AOAC 1995). A finalidade de
determinar o resíduo seco se deve a padronização da concentração das diferentes
amostras para avaliação da atividade antioxidante.
2.4.2.3. Quantificação de compostos fenólicos
A obtenção do teor de compostos fenólicos presentes nos diferentes produtos
comercializados de alho foi realizada pelo método desenvolvido por SINGLETON e
ROSSI (1965), modificado por NUUTILA et al. (2003), empregando-se o reagente
de Folin-Ciocalteu. Este método colorimétrico baseia-se na redução dos ácidos
fosfomolíbdico e fosfotúngstico em solução alcalina, e é o mais utilizado para a
determinação de compostos fenólicos totais em alimentos. A cor azul produzida pela
redução do reagente Folin-Ciocalteu pelos fenólicos é medida
espectrofotometricamente, na faixa de absorção de 735 nm. Em tubos de ensaio,
foram adicionados 400 µL do extrato, 400 µL de metanol, 400 µL de Folin-
Ciocalteu e 2000 µL da solução de carbonato de sódio (20 % m/v). A mistura foi
homogeneizada em agitador de tubos, sendo adicionados mais 800 µL da solução de
54
carbonato de sódio (20 % m/v). Posteriormente, as amostras foram centrifugadas
(centrífuga marca ALC, modelo 4239R - Itália) por 3 minutos a 14000 rpm e
mantidas em repouso por 20 minutos à temperatura ambiente. A leitura da
absorbância foi mensurada em comprimento de onda de 735 nm, utilizando-se o
espectrofotômetro UV-visível, marca Micronal, modelo B 542 – Brasil. O ácido
gálico foi utilizado como padrão. O cálculo do teor de fenólicos foi realizado através
da elaboração da curva padrão do ácido gálico em 6 concentrações diferentes (0,005
a 0,03 mg/mL), da qual se obteve a seguinte equação:
y = 13,2x + 0,0193 (R
2
= 0,9999)
onde: y = valor da absorbância
x = teor de fenólicos totais
R
2
= coeficiente de determinação do modelo
Os resultados obtidos foram expressos em µg/mL ou µg/mg em relação ao
resíduo seco, ambos os valores em equivalentes de ácido gálico (µg/mL/EAG ou
µg/mg/EAG).
2.4.2.4. Avaliação da atividade antioxidante
2.4.2.4.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
)
A capacidade das amostras em sequestrar radicais livres foi determinada através
do ensaio DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), descrito por YAMAGUCHI et al.
(1998), com modificações. Os extratos e o BHT (antioxidante padrão) foram diluídos
em metanol na concentração de 1 mg/mL. Uma alíquota de 1,5 mL da solução
metanólica de DPPH na concentração de 20 mg/mL (preparado diariamente) foi
acrescentada a 750 µL dos extratos das amostras. O decréscimo da absorbância a 517
nm foi monitorada em espectrofotômetro (marca Micronal, modelo B 542 – Brasil),
em diferentes intervalos de tempo (0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 e 20 minutos).
55
Para se calcular a porcentagem da atividade antioxidante (AA) foi utilizado o
valor de absorbância no tempo de 20 minutos na fórmula abaixo:
% AA =
[(abs. do branco do DPPH) - (abs. final da amostra – abs. do branco da amostra) ]
abs. do branco do DPPH
onde: abs. = absorbância
Branco do DPPH = 750 µL de metanol + 1,5 mL da solução de DPPH
Branco da amostra = 750 µL da amostra + 1,5 mL de metanol
As leituras da absorbância dos brancos (amostras e DPPH) foram feitas
imediatamente após o seu preparo.
2.4.2.4.2. Sistema β
ββ
β-caroteno/ácido linoléico
A determinação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/ácido
linoléico foi realizada de acordo com a metodologia descrita por MARCO (1968) e
modificada por MILLER (1971). Como substrato, foi utilizado a emulsão de β-
caroteno/ácido linoléico. Em 28 µL da solução de β-caroteno (preparada na
proporção de 20 mg de β-caroteno/mL de clorofórmio) foi adicionada 28 µL de ácido
linoléico e 200 mg de Tween 40 (emulsificante). Em seguida, o clorofórmio foi
evaporado sob atmosfera de nitrogênio e acrescentado 140 mL de água oxigenada
(água destilada tratada com oxigênio por 30 minutos). No tubo de ensaio, 5 mL desta
solução foi adicionada a 1 mL dos extratos diluídos (1mg/mL). Após ser
homogeneizado, a leitura foi feita em espectrofotômetro a 470 nm, sendo esta a
leitura do tempo zero (tempo inicial). Os tubos foram então colocados em banha-
maria (50
o
C) e as próximas leituras foram feitas a cada 15 minutos, até atingir o
tempo de 2 horas. O padrão (BHT) foi preparado da mesma forma que as amostras,
assim como o controle, porém para este no lugar da amostra foi adicionado 1 mL de
metanol.
56
A oxidação do β-caroteno, obtida pelas medidas espectrofotométricas, indica
a velocidade de transformação desse composto sob condições oxidantes (oxigênio e
temperatura). Para o cálculo da porcentagem da inibição da oxidação lipídica (%
IOL) foram utilizadas as seguintes fórmulas:
100% da oxidação =
absorbância inicial do controle – absorbância final do controle
Correlacionou-se a queda na leitura da absorbância das amostras com o
controle e foi estabelecida a porcentagem de inibição da oxidação lipídica a partir da
subtração da porcentagem da oxidação de cada amostra de 100, segundo a fórmula
abaixo:
% IOL =
100 – (absorbância inicial da amostra – absorbância final da amostra) x 100
absorbância inicial do controle – absorbância final do controle
Todas as emulsões e soluções foram preparadas diariamente.
2.4.2.4.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica utilizando o
aparelho Rancimat®
Para avaliar a capacidade protetora utilizou-se o aparelho Rancimat® 743,
marca Metrohm, conectado ao programa PC: 743 Rancimat 1.0, onde foi medido o
período de indução da gordura vegetal hidrogenada (marca Sadia) contendo o extrato
metanólico. O volume do extrato foi previamente calculado com base no resíduo
seco do mesmo para que a sua concentração no substrato (gordura vegetal
hidrogenada) fosse de 1 mg/mL. O volume dos extratos foram colocados nos tubos
do Rancimat® e evaporados sob atmosfera de nitrogênio. Em seguida, +
3,00 g de
gordura vegetal hidrogenada sem antioxidante foram adicionados em cada tubo e a
57
mistura homogeneizada por 15 minutos em ultrasonificador. Depois, com a
programação de temperatura de 110
o
C, ∆T = 1,5
o
C, fluxo de ar de 20 L/h, os tubos
foram acoplados ao aparelho Rancimat®, até que a curva de condutividade em
relação ao tempo de indução (TI) fosse finalizada para se calcular o Índice de
Atividade Antioxidante (IAA). Um controle foi também preparado com a gordura
vegetal hidrogenada sem antioxidante. O BHT a 1,0 mg/mL foi utilizado como
padrão.
Os resultados foram expressos como Índice de Atividade Antioxidante (IAA),
calculado pela fórmula:
IAA = TI amostra
TI controle
Onde: TI amostra = tempo de indução (h) da gordura vegetal hidrogenada +
extrato contendo a amostra.
TI controle = tempo de indução (h) da gordura vegetal hidrogenada
sem o extrato.
2.4.2.5. Análise Estatística
Os resultados das diferentes análises foram apresentados como média e
desvio padrão.
Para comparar os resultados do alho in natura e de seus produtos
comercializados foi realizada análise de variância (NETER et al. 1996), e o teste de
Tukey para as comparações múltiplas. A mesma análise foi realizada para os
diferentes momentos da vida de prateleira.
Para quantificar a relação linear entre os pares de variáveis numéricas, foi
utilizada a correlação linear de Pearson.
Todas as análises foram realizadas em triplicata, com exceção do método
utilizando o aparelho Rancimat, onde se utilizaram amostras em duplicata. O nível de
significância estabelecido para todas os testes estatísticos aplicados foi de 5%, sendo
58
utilizado o ”software” Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versão 10.0
for Windows.
2.5. Resultados e Discussão
2.5.1. Teor de fenólicos totais
Além dos compostos organosulfurados que conferem atividade antioxidante
ao alho, também há a presença dos compostos fenólicos nesta especiaria, dentre eles
os flavonóides (quercitina, miricetina e caempferol) (BILYK e SAPERS 1985;
LANZOTTI 2006)
. Sabe-se que os compostos fenólicos constituem um dos maiores
grupos de compostos presentes em plantas, atuando como antioxidantes primários ou
sequestradores de radicais livres (SINEIRO et al. 1989; SHAHIDI et al. 1992) em
sistemas biológicos.
Desta forma, foi determinado o teor de fenólicos totais das amostras
estudadas. Os resultados obtidos indicaram que o alho in natura e todos os seus
produtos contêm fenólicos entre seus constituintes, um fator importante na avaliação
da atividade antioxidante. Os teores encontrados dos três momentos encontram-se na
tabela 3.
59
Tabela 3 – Teores médios e desvio padrão (dp) de resíduo seco e de fenólicos totais do alho in natura e de seus produtos comercializados
dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9).
Resíduo Seco (mg/mL)
Fenólicos totais (µ
µµ
µg/mL/EAG**)
do extrato
Fenólicos totais
(µ
µµ
µg/mg/EAG**) do extrato em
relação ao resíduo seco
Alho
Momento
1
Momento
2
Momento
3
Momento
1
Momento
2
Momento
3
Momento
1
Momento
2
Momento
3
Alho in natura
(AIN)
2,90 3,19 2,61 20,29
c
(2,87)
23,06
d
(2,13)
22,70
d
(4,06)
6,99
b
(0,39)
7,23
c
(0,33)
8,70
c
(1,83)
Alho frito
(AF)
1,49 1,39 1,08 12,36
a
(2,27)
9,81
a
(0,63)
6,96
a
(1,33)
8,32
c
(1,32)
7,07
c
(0,64)
6,45
b
(2,15)
Alho picado sem sal
(AP)
3,74 6,23 6,58 23,76
d
(1,82)
18,39
c
(0,97)
16,77
c
(1,77)
6,36
b
(0,54)
2,95
b
(0,38)
2,55
a
(0,35)
Alho picado com sal
(APS)
4,58 7,85 8,09 21,91
c,d
(1,57)
19,16
c
(1,37)
16,98
c
(1,75)
4,78
a
(0,37)
2,44
a
(0,17)
2,10
a
(0,19)
Alho misto
(AM)
2,68 4,45 4,90 16,64
b
(3,73)
14,01
b
(3,42)
13,43
b
(2,46)
6,21
b
(1,10)
3,15
b
(0,65)
2,74
a
(0,47)
* n = número de amostras.
** EAG = equivalentes de ácido gálico.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
60
Os valores de compostos fenólicos totais do extrato metanólico do alho in
natura e de seus produtos do momento 1 (análise próxima à data de fabricação)
variaram de 12,36 a 23,76 µg/mL/EAG (tabela 3). Os extratos de alho picado sem sal
e com sal apresentaram maior teor de fenólicos, enquanto que o alho frito (AF)
apresentou em média menor quantidade, quando comparado com os demais produtos
(p < 0,001). Com base nos resultados de fenólicos totais do extrato em relação ao
resíduo seco, o AF foi o produto que apresentou maior quantidade destes compostos.
Para as demais amostras, AIN, AP e AM não houve diferença estatisticamente
significante.
No momento 2 (análise no período intermediário entre a fabricação e a
validade), o alho in natura foi a amostra que apresentou maior teor de fenólicos
totais e o frito menor teor. Não foi observado diferença entre o picado sem sal e o
com sal (p = 0,920). Em relação aos fenólicos totais, de acordo com o resíduo seco, o
produto frito e o alho in natura foram as amostras que apresentaram o maior teor
destes compostos.
Os resultados dos compostos fenólicos totais das análises próxima ao fim da
data de validade (momento 3) também estão apresentados na tabela 3. Pela análise
de variância, pode-se observar que existe diferença estatisticamente significante entre
as amostras. O extrato de alho in natura foi o que apresentou maior quantidade de
fenólicos totais, enquanto que o frito apresentou o menor teor. Não foi observado
diferença entre o picado sem sal e o com sal. Com base no resíduo seco, o extrato de
alho in natura apresentou o maior teor médio destes compostos, seguido do produto
frito.
Os maiores valores de fenólicos em relação ao resíduo seco não
corresponderam necessariamente aos maiores teores de fenólicos totais nos extratos.
Este fato também foi constatado por ISHIMOTO (2003) que pesquisou a atividade
antioxidante in vitro em diferentes vinhos e sucos de uva. Isto se deve à diferença de
resíduo seco entre o alho in natura e seus produtos. O alho frito foi a preparação que
obteve o menor teor de matéria seca nos 3 momentos (respectivamente 1,49; 1,39 e
1,08 mg/mL).
Portanto, o alho frito tende a possuir maior quantidade de fenólicos em
relação ao resíduo seco (µg/mg), porém quando não se baseia em resíduo seco este
61
produto é o que possui menor teor destes compostos em µg/mL de extrato.
LANZOTTI (2006) em seu artigo de revisão verificou que o teor de quercitina
diminuiu com a fritura. Tal fato ocorreu neste estudo com relação ao teor de
fenólicos totais do extrato de alho frito com o alho in natura, sendo respectivamente
12,36 e 20,29 µg/mL/EAG (tabela 3). Nos outros momentos também houve perda de
fenólicos quando o alho foi frito. O tratamento térmico é um importante passo no
processamento dos alimentos, porque pode trazer muitos benéficios para a
preservação do mesmo, mas por outro lado pode trazer impactos negativos com
relação ao teor das substâncias antioxidantes presentes nestes alimentos (DIPLOCK
et al. 1998).
Apesar do conteúdo de fenólicos totais ser expressivo, este parâmetro não é
necessariamente proporcional à atividade antioxidante (MOURE et al. 2001),
considerando que as amostras estudadas também possuem outros compostos com
atividade antioxidante, como os organosulfurados.
MILLER et al. (2000), estudando os compostos antioxidantes em vários
vegetais frescos, verificaram que o alho (1300 equivalentes de trolox/100g) e a
beterraba (800 equivalentes de trolox/100g) possuem maior teor de compostos
fenólicos com ação antioxidante, quando comparados ao pepino (100 equivalentes de
trolox/100g), ao salsão (50 equivalentes de trolox/100g), a cenoura (200 equivalentes
de trolox/100g) e ao repolho verde (150 equivalentes de trolox/100g).
KAUR e KAPOOR (2002) quantificaram os compostos fenólicos totais de
diferentes vegetais, inclusive o do alho in natura. Os resultados demonstraram que o
alho possui um teor médio de fenólicos totais de 145 mg em equivalentes de
catecol/100 g do produto. Neste caso, o padrão utilizado foi o catecol, e sendo que
nesse estudo foi o ácido gálico, por isso a diferença de resultados.
NUUTILA et al. (2003) relataram que o alho in natura liofilizado, contém
11,5 mg EAG/100 g de compostos fenólicos e a sua casca 70,5 mg EAG/100 g; a
cebola possui 84,5 mg EAG/100 g. Neste estudo, os teores de fenólicos totais por
100 g de alho in natura do momento 1, 2 e 3 foram respectivamente 33,78; 38,37 e
37,81 mg EAG/100 g de alho (figura 7), valor maior que o achado por NUUTILA,
uma vez que a amostra do presente estudo é in natura enquanto que a do autor citado
é liofilizada. Também a diferença de resultados pode-se justificar pelas diferentes
62
condições climáticas, solo, variedade botânica, técnicas de manuseio e
armazenamento pós-colheita, que podem influenciar a composição química, segundo
RIOS e PENTEADO (2003).
BENKEBLIA (2005) estudando alguns extratos de cebola e de alho verificou
que o alho in natura possui elevado teor de fenólicos totais (49 mg/100 g em
equivalente de ácido clorogênico) em comparação aos diferentes tipos de cebola
(amarela = 34,7; vermelha = 44 e verde = 47,3 mg/100 g em equivalente de ácido
clorogênico).
Os dados apresentados por MILLER et al. (2000), por KAUR e KAPOOR
(2002) e por BENKEBLIA (2005) não são condizentes aos apresentados por este
trabalho, apesar de terem utilizado alho in natura. Este fato se deve provavelmente as
diferentes metodologias e padrões empregados.
38,37
33,78
37,81
11,59
16,33
20,58
27,88
30,62
40,47
28,25
31,89
36,45
27,69
23,32
22,34
0
10
20
30
40
50
Momento 1 Momento 2 Momento 3
Fenólicos totais (g/100g)
AIN
AF
AP
APS
AM
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
* n = número de amostras.
Figura 7 - Teor de fenólicos totais (g/100g) do alho in natura e de seus produtos,
segundo os momentos (n* = 9).
Observando-se as modificações ao longo da vida de prateleira (figura 8),
verifica-se que o teor de fenólicos totais em relação ao resíduo seco tende a diminuir
para todos os produtos, com exceção para o alho in natura, que aumentou
significativamente no momento 3. Tal fato pode ser explicado pelo processamento
ocasionado na industrialização das amostras de alho frito, picado sem sal, picado
com sal e misto, não ocorrendo para in natura que foi mantido intacto. A integridade
63
na estrutura dos alimentos tem papel importante em proteger os antioxidantes quando
em contato com o oxigênio atmosférico impedindo a oxidação dos mesmos
(DIPLOCK et al. 1998). É importante ressaltar que os extratos correspondem a
diferentes amostras do mesmo lote, o que pode justificar as diferenças do alho in
natura.
6,21
4,78
6,36
8,32
6,99
3,15
2,44
2,95
7,07
7,23
2,74
2,1
2,55
6,45
8,7
0
2
4
6
8
10
12
AIN AF AP APS AM
Amostras
Fénolicos totais (µg/mg/EAG)
Momento 1
Momento 2
Momento 3
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
Letras diferentes na mesma amostra indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Figura 8 - Teor de fenólicos totais em relação ao resíduo seco do alho in natura e de
seus produtos no decorrer da vida de prateleira.
2.5.2. Avaliação da atividade antioxidante
2.5.2.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
)
Inicialmente, realizou-se o ensaio DPPH nas concentrações de 0,2 e 0,3
mg/mL, em que se observou que a atividade antioxidante nestas concentrações são
baixas. Com isso optou-se por continuar a testar outras concentrações (1,0; 1,5 e 2,0
mg/mL), a fim de definir qual seria a melhor concentração. Foi verificado que não
houve diferença considerável entre as concentrações, optando por trabalhar com a
concentração de 1 mg/mL para este ensaio e para os demais testes realizados de
atividade antioxidante.
b
a
a a
a
b
c
a,b
b
b
c
a
a
a
b
64
Pode-se constatar que a atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do alho in
natura e de seus produtos, do momento 1 (análise próxima à data de fabricação), são
diferentes estatisticamente (figura 9 e/ou tabela no anexo 2, p. 123). O alho frito é o
produto com maior atividade antioxidante, ou seja, possui 60,85 % (p < 0,001). O
alho picado sem sal apresentou melhor atividade antioxidante quando comparado
com o alho in natura (p = 0,002). Não houve diferença entre o in natura, o picado
com sal e o misto. No momento 2 (análise no período entre a fabricação e validade),
o alho frito também foi o produto que apresentou melhor atividade antioxidante
(46,04 %). O AIN apresentou o segundo melhor resultado, ou seja, 19,78 % de
atividade antioxidante. Em relação ao alho picado sem sal, o com sal e o misto não
houve diferença. Os resultados do momento 3 (análise próxima ao fim da data de
validade) foram iguais aos do momento 2, isto é, o frito teve a melhor atividade
antioxidante, e também não foi observado diferença estatisticamente significante
entre o picado sem sal, picado com sal e o misto.
21,68
19,78
21,69
49,83
46,04
60,85
7,3
5,63
28,8
7,76
6,87
23,11
9,57
9,04
24,92
0
10
20
30
40
50
60
70
Momento 1 Momento 2 Momento 3
% atividade antioxidante
AIN
AF
AP
APS
AM
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
Letras diferentes no mesmo momento indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
* n = número de amostras.
Figura 9 – Atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos comercializados, segundo os momentos (n* = 9).
a,b
b
c
a
c
b a
b
a
c
a
a a
a
a
65
O alho frito foi o produto que obteve melhor porcentagem de atividade
antioxidante em relação as demais amostras, nos três momentos. Este fato pode ser
justificado da seguinte maneira:
(1) as amostras de alho frito apresentaram um maior teor de fenólicos totais
em relação ao resíduo seco, e a concentração utilizada para os testes de atividade
antioxidante foi padronizada em 1 mg/ml. Como já foi citado, os compostos
fenólicos são excelentes sequestradores de radicais livres;
(2) como se utiliza o óleo de soja para o processo de fritura, poderia estar
ocorrendo aumento dos compostos fenólicos neste produto, pois o óleo é adicionado
de antioxidantes sintéticos tercibutilhidroquinona –TBHQ (composto fenólico
sintético) e ácido citríco;
(3) em virtude do processamento, ocorre a formação de compostos
antioxidantes que são originados da reação de Maillard. Esta é uma reação de
escurecimento não enzimático que pode ocorrer durante processos térmicos muito
intensos. Envolve inicialmemte um acúcar redutor (aldeído) e grupos amina (de
aminoácidos, peptídios e/ou proteínas) presentes no alho, finalizando com a
formação do pigmento escuro melanoidina, as quais estão associadas a atividade
antioxidante que, interropem a cadeia da oxidação lipídica, removendo o oxigênio
molecular e quelando metais. Lipídios também podem participar da reação. O
principal requisito é a presença de grupos redutores, como grupos carbonila, que são
formados durante a oxidação de lipídios insaturados (NICOLI
et al.
1997; BOBBIO
e BOBBIO 2001; MANZOCCO
et al
, 2001). NICOLI
et al.
(1997) e DAGLIA
et al.
(2000) verificaram em seus estudos que os grãos torrados de café apresentaram
maior atividade antioxidante que os grãos verdes (crus), que por sua vez contêm
maiores concentrações de antioxidantes polifenólicos, sugerindo então, que a
atividade antioxidante em grão de café submetidos a temperatura (torrefação),
poderiam ser referentes a outros compostos. SALDANHA (2005) também verificou
que com o processo de torrefação da erva-mate, a atividade antioxidante (utilizado o
sistema β-caroteno/ácido linoléico) aumentou, mas não pelo aumento de fenólicos
totais, e sim talvez, pela formação dos compostos antioxidantes originados da reação
de Maillard. Um estudo realizado por MORALES e BABBEL (2002) concluiu que
as melanoidinas em meio aquoso exerciam maior atividade antioxidante quando
66
comparado ao ácido gálico, caféico, tânico e também ao Trolox®. Apesar de haver
fortes razões da presença de melanoidinas e consequente atividade antioxidante no
alho frito, é necessário realizar novos estudos a fim de investigar essa hipótese.
A combinação destes fatores justifica o fato do alho
in natura
, apesar de
apresentar o maior teor de fenólicos totais em relação ao resíduo seco (figura 8) no
momento 3 não refletir na atividade antioxidante em comparação ao alho frito (figura
9). Como já foi relatado anteriomente, apesar da quantidade de fenólicos totais ser
expressiva, o conteúdo destes não é necessariamente diretamente proporcional à
ativdade antioxidante (MOURE
et al.
2001).
NUUTILA
et al.
(2003) estudando a atividade antioxidante do extrato
metanólico do alho e da cebola, concluíram que o alho
in natura
liofilizado possui
60,90 % de atividade antioxidante pelo método DPPH, utilizando uma concentração
de 1000 mg/mL; e a cebola 44,4 % (concentração de 67 mg/ml), concluindo que o
alho apresentou atividade antioxidante 15 vezes menor que a cebola. Por outro lado,
BENKEBLIA (2005) estudando alguns extratos metanólicos de cebola e de alho,
verificou que o alho possui maior atividade antioxidante (método DPPH) do que a
cebola, ao contrário do que foi observado no estudo de NUUTILA
et al.
(2003). No
presente estudo, a atividade antioxidante do alho
in natura
variou de 19,78 a 21,69 %
(conforme a vida de prateleira), utilizando concentração de 1 mg/mL. Estes
resultados são 300 vezes superior ao do estudo de NUUTILA
et al.
(2003).
Além da concentração padronizada para as análises (1,0 mg/mL), realizou-se
os ensaios para o padrão sintético BHT, na concentração máxima permitida pela
Legislação Brasileira (0,2 mg/ml), afim de se avaliar possíveis variações. Isto se
repetiu para os demais métodos utilizados para avaliar atividade antioxidante.
Os valores da porcentagem de captação do DPPH para o BHT do ensaio foi
de 92,70 e 92,32 % para as respectivas concentrações de 0,2 mg/mL e 1,0 mg/mL.
Todos os extratos de todos os momentos apresentaram menor atividade antioxidante
em relação ao padrão BHT. De acordo com NAMIKI (1990) os antioxidantes
naturais são menos efetivos do que os sintéticos. Convém salientar que os testes de
atividade antioxidante, deste trabalho, foram feitos com extratos de alho, ou seja,
diversas substâncias foram extraídas, além dos compostos fenólicos. Considerando
que a proporção de fenólicos presentes nas amostras é bastante inferior ao padrão
67
BHT (tabela 3), os resultados de atividade antioxidante estão acima do esperado, ou
seja, outros compostos presentes nos extratos podem ter apresentando ação
antioxidante, como organosulfurados alicina, dialil dissulfito, entre outros (KIM
et
al.
1997; BOREX 2001). Tais resultados, também foram verificados por
BENKEBLIA (2005), que utilizou extratos metanólicos de alho
in natura
pelo ensaio
DPPH. Ao comparar os resultados com os padrões rutina e quercitina (compostos
fenólicos) os valores do extrato de alho foram inferiores.
A atividade antioxidante no decorrer da vida de prateleira diminuiu para todos
os produtos de alho, porém para o alho
in natura
não foi observado esta alteração
(figura 10). O desempenho dos extratos pode ser justificado pela queda no teor de
fenólicos totais no decorrer da vida de prateleira para as amostras de alho frito,
picado sem sal, picado com sal e misto, enquanto que no alho
in natura
não foi
observado esta diminuição (figura 8). Os processos de pasteurização, desidratação,
cozimento e armazenamento podem diminuir significativamente o teor de
substâncias antioxidantes nos alimentos (NICOLI
et al.
1997). Segundo SHAHIDI
et
al.
(1992), os compostos fenólicos são excelentes sequestradores de radicais livres, e
como houve uma diminuição no teor de fenólicos, consequentemente houve redução
na atividade antioxidante pelo método de sequestrar os radicais livres (DPPH).
PRIOR
et al.
(1998) relataram em seu estudo que a atividade antioxidante de
cereais matinais não diminui substancialmente durante o armazenamento em
temperatura ambiente. A atividade antioxidante da aveia foi analizada por 6 meses e
foi verificado pequena diferença ente o primeiro e o sexto mês. Esta diferença era
esperada, pois os antioxidantes são dispersos em uma matriz seca e sólida e com
pequena exposição oxidativa.
Em outro estudo realizado por estes autores, cereais
matinais foram estocados a 37,8
0
C (equivalente a 8 meses quando em temperatura
ambiente). Depois de 8 semanas, a atividade antioxidante dimiuiu menos que 10 %.
Antioxidantes solúveis em lipídios são mais vulneráveis. Houve redução da atividade
antioxidante, porém estes resultados são normais quando se estuda a vida de
prateleira de cereais matinais. Comparando o estudo de PRIOR
et al.
(1998) com o
presente estudo, observa-se diferença no comportamento das amostras no decorrer da
vida de prateleira.
68
21,69
60,85
28,8
23,11
24,92
19,78
46,04
9,04
6,87
5,63
21,68
49,83
9,57
7,3
7,76
0
10
20
30
40
50
60
70
AIN AF AP APS AM
% atividade antioxidante
Momento 1
Momento 2
Momento 3
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
Letras diferentes na mesma amostra indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Figura 10 – Atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, dos extratos de alho
in natura
e de seus produtos comercializados no decorrer da vida de prateleira.
Foram construídas as curvas cinéticas da captação do DPPH de todos os
extratos durante os 20 minutos de ensaio, para uma melhor ilustração do mecanismo
de ação antioxidante. Os resultados foram comparados ao padrão BHT em duas
concentrações distintas (figuras 11, 12 e 13). Nos três momentos, é possível observar
que o alho frito apresentou uma elevada atividade antioxidante, mas abaixo do
padrão BHT em ambas as concentrações (0,2 e 1,0 mg/mL). Quanto menor os
valores de absorbância, melhor a atividade antioxidante.
b
a
a
a
a
a
b
b
b
a
b
a
b
b
b
69
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 5 10 15 20
Tempo (minutos)
Absorbância 517 nm
Padrão BHT (1 mg/mL)
Padrão BHT (0,2 mg/ml)
AIN
AF
AP
APS
AM
Figura 11 – Curva cinética da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato
metanólico do alho
in natura
e de seus produtos do momento 1.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 5 10 15 20
Tempo (minutos)
Absorbância 517 nm
Padrão BHT (1 mg/mL)
Padrão BHT (0,2 mg/ML)
AIN
AF
AP
APS
AM
Figura 12 – Curva cinética da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato
metanólico do alho
in natura
e de seus produtos do momento 2.
70
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 5 10 15 20
Tempo (minutos)
Absorbância 517 nm
Padrão BHT (1mg/mL)
Padrão BHT (0,2 mg/mL)
AIN
AF
AP
APS
AM
Figura 13 – Curva cinética da atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato
metanólico do alho
in natura
e de seus produtos do momento 3.
2.5.2.2. Sistema β
ββ
β-caroteno/ácido linoléico
O sistema
β
-caroteno/ácido linoléico é constituído por uma emulsão, sendo
considerado um sistema aquoso-lipídico. Neste método a atividade antioxidante é
avaliada pela capacidade de um extrato ou um antioxidante em inibir o processo de
oxidação lipídica no sistema, ao longo de 120 minutos. Diferentemente do ensaio
DPPH, os antioxidantes deverão apresentar maiores valores de absorbância
indicando maior inibição da oxidação lipídica. Os resultados obtidos para os extratos
estão apresentados na figura 14 e ou/tabela do anexo 3, p. 124.
Pode-se verificar que os resultados da inibição da oxidação lipídica do alho
in
natura
e de seus produtos, dos três momentos, são diferentes estatisticamente. Nas
análises próximas à data de fabricação (
mometo 1)
, o AF foi o produto que obteve a
maior porcentagem da inibição da oxidação lipídica (79,09 %), seguido do AM
(40,94 %). Em relação ao AIN, AP, e APS não foi observado diferença significativa.
Para as análises entre a fabricação e validade (
momento 2)
, o produto frito também
foi o que apresentou melhor % IOL (85,49), seguido do AM e do APS. O AIN
apresentou menor inibição, ou seja, 39,84 %. Já no
momento 3
(análise próxima à
data de validade), não houve diferença entre o AF, o APS e o AM, sendo que estes
71
produtos apresentaram maior porcentagem da inibição da oxidação lipídica em
relação ao AP e ao AIN. O alho
in natura
também apresentou menor inibição da
oxidação lipídica, como ocorreu no momento 2.
44,97
39,84
35,74
78,03
85,49
79,09
68,16
65,14
34,42
78,82
69,85
38,11
82,25
72,03
40,94
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Momento 1 Momento 2 Momento 3
% Inibição da oxidação lipídica
AIN
AF
AP
APS
AM
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
Letras diferentes no mesmo momento indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
* n = número de amostras.
Figura 14 – Inibição da oxidação lipídica (IOL), pelo sistema
β
-caroteno/ácido
linoléico, do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos comercializados
dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9).
KAUR e KAPOOR (2002) determinaram a atividade antioxidante pelo
sistema
β
-caroteno/ácido linoléico de diferentes vegetais, incluindo o alho
in natura
.
Os autores obtiveram dois extratos, sendo um aquoso e o outro etanólico 80 %. Os
resultados demonstraram que o alho inibiu em média 62,1 % (extrato etanólico) e
61,8 % (extrato aquoso) a oxidação lipídica. Neste estudo, não foi relatado à
concentração utilizada para realizar o teste. Já no presente estudo o alho
in natura
inibiu em média para os momentos 1, 2 e 3 respectivamente 35,74, 39,84 e 44,97 %
utilizando uma concentração de 1 mg/mL. A diferença dos resultados encontrados
neste estudo com o estudo de KAUR e KAPOOR (2002) pode ser devido à
concentração, as diferenças no solvente utilizado, além de outras características
como cultivo, manuseio do alho, clima, solo, data de colheita e armazenamento.
HOLUB
et al.
(2002) relataram que a adição de sulfato de amônio no solo para o
plantio do alho, aumenta a concentração do composto sulfoxido de cisteína
a,b
c
a,b
b
a
a
c
d
c
a
c
b
b
c c
72
(composto organosulfurado) nos bulbos de alho, que está relacionado à formação dos
compostos bioativos do alho com propriedades antioxidantes. Outro fator importante,
que influencia a composição do alho, é o período da colheita e armazenamento. Se o
tempo da colheita atrasar em duas semanas, as substâncias allina e γ-gltamicisteína
nos bulbos aumenta cerca de 20 %. Durante a cura, onde os bulbos ficam na sombra
por duas semanas, a aliina aumenta em 25 %.
No presente estudo, o alho frito foi o produto que obteve a maior
porcentagem de inibição da oxidação lipídica, e consequentemente melhor atividade
antioxidante em relação às demais amostras. Como já foi relatado anteriormente no
item 2.5.2.1, a explicação para o ocorrido, deve-se ao fato de:
(1) as amostras de alho frito apresentar maior teor de fenólicos totais em
relação ao resíduo seco;
(2) o óleo de soja contém antioxidantes sintéticos (TBHQ e ácido cítrico), o
que pode ter contribuido para o resultado encontrado. MELO
et al.
(2003) estudando
a atividade antioxidante dos extratos de coentro, observaram que o extrato aquoso
isolado exibiu 69,83 % de inibição da oxidação lipídica, pelo método β-
caroteno/ácido linoléico, e evidenciou que a sua combinação com BHT maximizou a
ação antioxidante para 90,25 %, demonstrando forte sinergismo entre eles;
(3) ocorrer a formação de compostos com atividade antioxidante devido as
reações de Maillard. NICOLI
et al.
(1997) estudando o processamento de tomates,
verificaram que houve formação de compostos antioxidantes derivados da reação de
Maillard, quando a temperatura de aquecimento foi de 95
o
C.
O alho
in natura
foi o menos eficaz na inibição da oxidação lipídica nos três
momentos. Como o alho
in natura
encontrava-se intacto até o manuseio, isto é, não
foi processado (picado e/ou frito), é provável que houve menor formação de
tiosulfinatos volatéis e reativos, que são os compostos ativos com propriedades
medicinais, entre as quais se inclui a alicina, que possui atividade antioxidante. Os
compostos organosulfurados presentes no alho e em outras formas de preparação,
depende das condições de processamento (HOLUB
et al.
2002).
Na figura 15, pode ser verificado a inibição da oxidação lipídica no decorrer
da vida de prateleira. Ao contrário do que ocorreu no ensaio DPPH, as amostras
apresentaram aumento da atividade antioxidante no decorrer da vida de prateleira,
73
pelo sistema
β
-caroteno/ácido linoléico, sugerindo que outros compostos
(organosulfurados ou melanoidinas) formados durante este período, contribuiram
para o ocorrido.
O alho frito continua sendo a preparação que obteve a maior atividade
antioxidante no decorrer da vida de prateleira. O alho
in natura
e o frito
apresentaram inibição da oxidação lipídica maior no decorrer da vida de prateleria,
mas não tão acentuada como nos alhos picado sem sal, picado com sal e misto, onde
se nota resultados com valores dobrados. Esta elevação abrupta, pode ser explicada
pela adição do conservador metabisulfito de sódio e do acidulante e antioxidante
ácido cítrico nos produtos. O ácido cítrico e metabisulfito de sódio são substâncias
que possuem a capacidade de sequestrar metais, formando quelatos e inibindo sua
ação. Os agentes sequestrantes juntamente com os antioxidantes geram um efeito
sinérgico em evitar oxidações em alimentos (FAGUNDES e AYUB 2005).
40,94
38,11
34,42
79,09
35,74
72,03
69,85
65,14
85,49
39,84
82,25
78,82
68,16
78,03
44,97
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
AIN AF AP APS AM
% inibição da oxidação lipídica
Momento 1
Momento 2
Momento 3
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
Letras diferentes na mesma amostra indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Figura 15 - Inibição da oxidação lipídica (IOL), pelo sistema
β
-caroteno/ácido
linoléico, dos extratos de alho
in natura
e de seus produtos comercializados no
decorrer da vida de prateleira.
As curvas cinéticas que possibilitam verificar o comportamento dos extratos
durante os 120 minutos do teste estão representados nas figuras 16, 17 e 18. Os
resultados foram comparados ao controle e ao padrão BHT, sendo que este obteve a
a
c b
a
b
a
a
b
b
a
c
b
a
b
c
a
74
porcetagem de inibição da oxidação lipídica de 95,32 e 97,23 % para as respectivas
concentrações de 0,2 mg/mL e 1,0 mg/mL. Todos os extratos apresentaram valores
inferiores ao padrão BHT em ambas as concentrações. Um estudo realizado por
MELO
et al.
(2003) também verificou que os extratos aquoso, étereo e etanólico do
coentro apresentaram proteção contra a oxidação lipídica inferior ao BHT. Segundo
KULISIC
et al.
(2004) a atividade antixiodante do óleo de orégano, pelo sistema
β
-
caroteno/ácido linoléico foi menor quando comparado ao BHT e ao α-tocoferol.
Convém salientar que os testes de atividade antioxidante, deste trabalho e dos citados
acima, foram feitos com extratos, ou seja, diversas substâncias foram extraídas.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (minutos)
Absorbância 470 nm
Controle
Padrão BHT (1 mg/mL)
Padrão BHT (0,2 mg/mL)
AIN
AF
AP
APS
AM
Figura 16 – Curva cinética da inibição da oxidação lipídica, pelo sistema
β
-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos
do momento 1.
75
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (minutos)
Absorbância 470 nm
Controle
Padrão BHT 1,0 mg/mL
Padrão BHT 0,2 mg/mL
AIN
AF
AP
APS
AM
Figura 17 – Curva cinética da inibição da oxidação lipídica, pelo sistema
β
-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos
do momento 2.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (minutos)
Absorbância 470 nm
Controle
Padrão BHT 1,0 mg/mL
Padrão BHT 0,2 mg/mL
AIN
AF
AP
APS
AM
Figura 18 – Curva cinética da inibição da oxidação lipídica, pelo sistema
β
-
caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos
do momento 3.
76
2.5.2.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica utilizando o
aparelho Rancimat®
O aparelho Rancimat® tem sido apresentado como um método para
determinar a resistência de um óleo à oxidação, e pode ser usado como um método
para determinar a atividade antioxidante. As vantagens da técnica utilizando o
aparelho Rancimat®, consistem no fato de se basear em medidas contínuas, ou seja,
não requer determinações períodicas; além disso, o aparelho não requer supervisão
no decorrer do experimento (HASENHUTTI e WAN 1992).
O alho
in natura
e seus produtos foram testados pelo aparelho Rancimat®,
sendo que o índice de atividade antioxidante (IAA) dos extratos metanólicos das
amostras nos três momentos estão apresentados na figura 19 e/ou tabela do anexo 4,
p. 125. Quanto maior o valor do IAA, melhor a proteção oxidativa, e
consequentemente melhor a atividade antioxidante.
1,41
1,35
1,54
1,63
1,60
1,67
1,57
1,66
1,64
1,35
1,35
1,43
1,39
1,50
1,64
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
Momento 1 Momento 2 Momento 3
IAA
AIN
AF
AP
APS
AM
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
IAA = tempo de indução (h) da amostra / tempo de indução (h) do controle
Letras diferentes no mesmo momento indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
* n = número de amostras.
Figura 19 – Índice de atividade antioxidante (IAA), utilizando o aparelho Rancimat,
do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos comercializados dos
momentos 1, 2 e 3 (n* = 6).
a
b,c c
a
a,b
a,b
b
a
a,b
b
a
a,b
a,b
a,b
a,b
77
Todas as amostras apresentaram atividade antioxidante. Conforme citado no
item 2.4.2.4.3, o IAA foi calculado considerando-se o tempo de indução da amostra
dividido pelo tempo de indução do controle. Ou seja, valores de IAA acima de 1,0
indicam que a amostra apresentou atividade antioxidante. No
momento 1
(análise
próxima à data de fabricação), o alho picado sem sal e o frito apresentaram os
melhores resultados de IAA, respectivamente 1,66 e 1,60. No
momento 2
(análise no
período entre data de fabricação e data de validade), o frito apresentou um IAA =
1,63, sendo superior às demais amostras, e no
momento 3
(análise próxima ao fim da
data de validade) este índice foi de 1,67.
Segundo GUERRA e LAJOLO (2005), a eliminação da água de um alimento
pode acelerar a oxidação lipídica, tornando-se, portanto, um problema para produtos
desidratados. Mas esta aceleração, depende não só do teor de umidade, mas,
principalmente da atividade de água presente. Os efeitos da atividade de água
também tem importância em termos de ação antioxidante, pois o estudo destes
autores concluiram que os compostos apolares do coentro e da salsa são mais
eficientes em baixas atividade de água tendo a sua ação diminuída com o aumento da
água no sistema; com os compostos polares ocorreu o inverso. No presente estudo, o
extrato metanólico de AP em comparação com o extrato de AM, apresentou
diferença significante no IAA. Então, pode-se concluir que o alho desidratado
adicionado ao alho
in natura
picado, para se obter o alho misto, pode ter acelerado o
processo de oxidação lipídica, sendo este dado condizente ao citado por GUERRA e
LAJOLO (2005).
Novamente o alho frito foi o produto com maior índice de atividade
antioxidante, fato este também observado nos outros dois métodos utilizados no
presente estudo. Este resultado era esperado, pois conforme mencionado nos itens
2.5.2.1 e 2.5.2.2,
o extrato de AF possui uma maior concentração de fenólicos em
relação as outras amostras, além dos produtos da reação de Maillard e antioxidantes
do óleo de soja, que podem ter contribuido com os resultados superiores.
MOREIRA e MANCINI-FILHO (2003) empregando o aparelho Rancimat®
a 110
0
C, com fluxo de gás de 20L/h, e utilizando 5 g de óleo de soja sem aditivos,
verificaram que os extratos das especiarias canela, erva-doce e semente de mostarda,
obtidos de forma sequencial, apresentaram atividade antioxidante, sendo que o
78
extrato aquoso da semente de mostarda a 100 ppm apresentou o maior índice de
atividade antioxidante (IAA = 1,19). MURCIA
et al.
(2004) avaliando as
propriedades antioxidantes de sete especiarias e comparando-as com a do BHA, BHT
e propil galato, empregando o aparelho Rancimat® a 100
0
C, encontraram que a noz
moscada, o gengibre e o alcaçuz protegeram os óleos de girassol, milho e oliva, bem
como a manteiga e a margarina, contra a oxidação. SALDANHA (2005) observou
que os extratos (aquoso, etanólico e etéreo) de erva-mate tostada possui maior
atividade antioxidante do que o da erva-mate verde (utilizando as mesmas condições
e substrato do presente trabalho). Estes resultados foram discutidos considerando-se
a possibilidade dos produtos da reação de Maillard terem potencializado a atividade
antioxidante, assim como pode ter ocorrido com o alho frito deste trabalho.
FERNÁNDEZ-LÓPEZ
et al
. (2005) verificaram que o suplemento de alho, rico em
alicina, quando utilizado em almôndegas bovina, não inibiu a oxidação lipídica,
medida pelo aparelho Rancimat®, pois o índice de estabilidade lipídica foi menor
quando comparado ao controle. Segundo o autor, isto pode ser justificado pela alta
concentração do composto alicina que está presente neste suplemento, sendo que a
alicina em altas concentrações tem efeito pró-oxidante.
O valor do índice de atividade antioxidante para o padrão BHT do ensaio foi
de 2,00 e 2,50 para as respectivas concentrações de 0,2 mg/mL e 1,0 mg/mL. Todas
as amostras apresentaram valores inferiores ao padrão, sendo este um resultado
esperado, pois conforme citado anteriormente, o padrão foi utilizado na forma pura, e
as amostras de alho contém, em seu extrato, diversas outras substâncias além dos
compostos antioxidantes.
Verifica-se que o índice de atividade antioxidante (IAA) no decorrer da vida
de prateleira (figura 20) tende a manter ou aumentar ao longo do tempo estudado,
assim como já foi verificado para o sistema β-caroteno/ácido linoléico. Já no ensaio
DPPH, a atividade antioxidante decaiu ao longo do tempo. Vale ressaltar a
importância de se utilizar vários métodos para avaliar a capacidade antioxidante de
um alimento, pois cada método possui um mecanismo diferente, o que pode gerar
diferentes resultados.
79
1,39
1,35
1,66
1,60
1,35
1,50
1,35
1,57
1,63
1,41
1,64
1,43
1,64
1,67
1,54
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
AIN AF AP APS AM
IAA
Momento 1
Momento 2
Momento 3
AIN = alho in natura; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto.
IAA = tempo de indução (h) da amostra / tempo de indução (h) do controle
Letras diferentes na mesma amostra indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Figura 20 – Índice de atividade antioxidante (IAA), utilizando o aparelho Rancimat,
do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos comercializados no
decorrer da vida de prateleira.
2.5.3. Correlações entre as variáveis
Com os valores obtidos de fenólicos totais e da atividade antioxidante (ensaio
DPPH, sistema
β
-caroteno/ácido linoléico e avaliação da capacidade protetora da
oxidação lipídica, utilizando o aparelho Rancimat),
foi verificada as correlações entre
os métodos, conforme indicado na tabela 4.
a a a
a
a a
a
a
a
a
a
a a
a,b b
80
Tabela 4 – Correlações entre as variáveis do alho
in natura
e de seus produtos comercializados dos momentos 1, 2 e 3.
Momento Amostra Variável Fenólicos Totais* Sistema β-caroteno/ácido linoleico DPPH Rancimat
alho in natura (AIN)
CP
NS
1,000
-
alho frito (AF)
CP
NS
1,000
-
alho picado sem sal (AP)
CP
NS
1,000
-
- 0,786
0,012
0,829
0,006
alho picado com sal (APS)
CP
NS
1,000
-
1
alho misto (AM)
Fenólicos Totais*
CP
NS
1,000
-
0,923
0,000
alho in natura (AIN)
CP
NS
1,000
-
alho frito (AF)
CP
NS
1,000
-
alho picado sem sal (AP)
CP
NS
1,000
-
alho picado com sal (APS)
CP
NS
1,000
-
2
alho misto (AM)
Fenólicos Totais*
CP
NS
1,000
-
0,754
0,019
alho in natura (AIN)
CP
NS
1,000
-
- 0,831
0,006
alho frito (AF)
CP
NS
1,000
-
0,730
0,025
alho picado sem sal (AP)
CP
NS
1,000
-
- 0,693
0,038
0,922
0,009
alho picado com sal (APS)
CP
NS
1,000
-
- 0,837
0,005
0,842
0,035
3
alho misto (AM)
Fenólicos Totais*
CP
NS
1,000
-
- 0,723
0,028
* Fenólicos totais em relação ao resíduo seco.
CP = Correlação de Pearson; NS = Nível de significância; espaços em branco não houve correlação.
81
Quando as amostras foram analisadas próximas à data de fabricação -
momento 1
houve correlação positiva entre fenólicos totais e o ensaio DPPH para os
alhos picado sem sal (AP) e para o misto (AM), sugerindo que os compostos
fenólicos são bons sequestradores de radicais livres. Entre fenólicos totais e sistema
β-caroteno/ácido linoléico ocorreu correlação negativa para o alho picado sem sal
(CP = - 0,786), ou seja, a inibição da oxidação lipídica pelo sistema
β
-caroteno/ácido
linoléico é inversamente proporcional ao teor de fenólicos totais.
Para as análises no período entre a data de fabricação e a data de validade
(
momento 2
), não houve correlação para a maior parte das amostras. Somente para o
AM, verificou-se correlação positiva entre fenólicos totais e o sistema β-
caroteno/ácido linoléico, dado também verificado em outro estudo, que relatou
correlação positiva (CP = 0,657, p < 0,005) do teor de fenólicos de diferentes
vegetais, incluindo o alho, com sistema β-caroteno/ácido linoléico (KAUR e
KAPPOR 2002).
Quanto às análises próximas ao fim da data de validade (
momento 3
), os
resultados foram:
- houve correlação negativa entre fenólicos totais e o sistema β-caroteno/ácido
linoléico para o alho picado com sal e para o misto;
- correlação negativa entre o ensaio DPPH e fenólicos totais para os produtos AIN e
AP, sendo - 0,831 e - 0,693 respectivamente. Já para o AF houve correlação positiva
entre estes dois métodos;
- resultados do aparelho Rancimat® e fenólicos totais houve correlação positiva para
o alho picado sem sal e com sal.
Como se verifica na tabela 4, algumas correlações entre os métodos e teor de
fenólicos totais se apresentaram negativa. Tal fato pode ser justificado pela presença
de outros compostos, que não os fenólicos, que podem ter contribuído para a
atividade antioxidante. Como citado anteriormente, o alho é fonte de compostos
organosulfurados que também apresentam potencial antioxidante.
Para o alho misto foram verificadas respostas diferentes de correlação entre
fenólicos totais e o sistema β-caroteno/ácido linoléico, quando se observa os três
momentos da vida de prateleira. No momento 1 não houve correlação entre estes
métodos, enquanto que no momento 2 a correlação foi positiva (CP = 0,754), e no
82
momento 3 foi negativa (CP = - 0,723). A variação das correlações encontradas se
devem, provavelmente, a dois fatores:
(1)
teor de compostos organosulfurados (mencionado no parágrafo anterior);
(2) composição da amostra. O alho misto, como citado anteriormente, é composto de
alho
in natura
(origem brasileira) e alho desidratado (origem chinesa). Como a
variedade botânica do alho desidratado é desconhecida, pode-se supor que a
composição de compostos bioativos deste produto é diferente das amostras
brasileiras. Como citado por HOLUB
et al.
(2002), o teor de compostos bioativos no
alho pode variar consideravelmente conforme sua variedade botânica, condições
climáticas e tipo de processamento, entre outros fatores.
Para alguns resultados deste trabalho verificou-se correlação positiva entre
atividade antioxidante e fenólicos totais como também foi verificado por NUUTILA
et al.
(2003) em extratos de alho e cebolas; PAREJO
et al
. (2003), em plantas
Bolivianas; ISHIMOTO (2003) em vinhos e sucos de uva brasileiros. Por outro lado,
também foi detectada ausência de correlação entre estas duas variáveis. Da mesma
forma, este dado foi verificado por BOCCO
et al.
(1998) que pesquisaram a
atividade antioxidante em frutas e resíduos de frutas cítricas.
83
2.6. Conclusão
•
O teor de fenólicos totais em relação ao resíduo seco foi maior para o produto
frito (momentos 1 e 2). Em relação à vida de prateleira foi observado que o
processamento influenciou no teor de fenólicos totais para todas as amostras;
•
O AF foi o produto comercializado que apresentou melhor atividade
antioxidante pelo ensaio DPPH (captação de radicais livres), melhor inibição
da oxidação lipídica pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico e melhor índice
de atividade antioxidante (IAA) utilizando o aparelho Rancimat®, em todos
os momentos;
•
O processo de fritura, possivelmente, contribuiu para a formação de novas
substâncias com propriedades antioxidantes, como as melanoidinas, o que
pode ter contribuído para os melhores resultados de atividade antioxidante,
bem como os aditivos adicionados no óleo de fritura;
•
A atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, diminuiu no decorrer da vida de
prateleira para todos os produtos de alho, porém para o alho
in natura
não foi
observado esta alteração;
•
O AIN foi a amostra menos eficaz na inibição da oxidação lipídica, pelo
sistema β-caroteno/ácido linoléico, nos três momentos;
•
Ao longo da vida de prateleira, pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico, todas
as amostras apresentaram aumento da atividade antioxidante, onde se
constataram resultados com valores dobrados para o AP, APS e AM;
•
O índice de atividade antioxidante medido pelo aparelho Rancimat® ao longo
da vida de prateleira apresentou uma tendência em manter ou aumentar;
•
Os diferentes métodos utilizados para avaliar a atividade antioxidante do alho
in natura
e seus produtos apresentaram respostas diferentes, sendo que para
os métodos que continham lipídio como substrato (sistema β-caroteno/ácido
linoléico e Rancimat) houve aumento da capacidade antioxidante no decorrer
84
da vida de prateleira. Por outro lado, no ensaio do DPPH, que se baseia na
remoção de radicais livres, ocorreu diminuição da atividade antioxidante,
sendo este resultado esperado, considerando a redução de compostos
fenólicos ao longo da vida de prateleira;
•
Entre fenólicos totais e atividade antioxidante foi verificado tanto ausência de
correlação, quanto presença de correlação positiva e negativa. Fatores como
variedade botância, condições climáticas, qualidade e quantidade de
compostos bioativos, processamento e a presença de aditivos podem justificar
a variabilidade entre as correlações.
85
2.7. Considerações finais
Os resultados obtidos neste estudo reafirmam a hipótese de que os compostos
bioativos do alho
in natura
e seus produtos comercializados são potencialmente
benéficos à saúde, uma vez que foi demonstrada a sua capacidade em seqüestrar os
radicais livres e inibir a oxidação lipídica, em todas as amostras e em todos os
momentos estudados, ainda que algumas amostras tenham apresentado melhor
atividade antioxidante.
Contudo, vale ressaltar que resultados obtidos em experimentos
in vitro
nem
sempre são reproduzidos
in vivo
, portanto não necessariamente o consumo de alho
irá reproduzir o mesmo efeito no organismo.
Com relação aos compostos responsáveis pela atividade antioxidante, outros
compostos, além dos fenólicos, podem ter contribuido com os resultados
apresentados. Isto vale particularmente para as amostras de alho frito que
apresentaram um potencial antioxidante superior às demais amostras. Assim, outros
estudos são necessários para avaliar o comportamento destas outras substâncias,
tanto em sistemas
in vitro
quanto
in vivo.
No próximo capítulo, será abordada a influência dos aditivos alimentares na
atividade antioxidante dos produtos de alho.
86
CAPÍTULO 3
“INFLUÊNCIA DOS ADITIVOS ALIMENTARES NA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS PRODUTOS DE ALHO”
3.1. Introdução
A cultura do alho (
Allium sativum
) é importante não apenas por seu valor
comercial, mas, também, por suas propriedades medicinais. Todavia, a quantidade e
qualidade da produção nacional de alho não atendem à crescente demanda e às
exigências do mercado consumidor brasileiro, o que induz à importação. Nos últimos
anos, com a geração de novas tecnologias, principalmente em Santa Catarina e Minas
Gerais, onde se concentram as maiores áreas de cultivo e produtividade, vem
aumentando a qualidade na produção nacional (AMORIM
et al
. 2002).
O consumo de produtos obtidos a partir do alho
in natura
tem aumentado nos
últimos anos, não só por ser apreciado como especiaria e ser de fácil utilização na
culinária, mas também por algumas qualidades terapêuticas que a ele são atribuídas.
A principal perda de qualidade do processsamento do alho é causada pelo
escurecimento, que ocorre devido à ação da enzima polifenoxidase sobre os
compostos fenólicos, os quais são oxidados a ortoquinonas e estes polimerizam
facilmente formando compostos escuros, ou seja, as melaninas (BERBARI e
t al.
2003).
Atualmente, a indústria de alimentos tem sido beneficiada pelo surgimento de
novas substâncias que podem ser adicionadas aos alimentos com o objetivo de
melhorar a cor, o aroma, a textura e o sabor. Estas substâncias são conhecidas como
aditivos alimentares. Os aditivos alimentares correspondem a qualquer substância
presente por adição intencional, ou não, a um alimento, com finalidades tecnológicas
como conservação contra deteriorações bacterianas, proteção contra alterações
oxidativas e fornecimento de características sensoriais (BARUFFALDI e OLIVEIRA
1998; SILVA 2000).
87
Segundo BOBBIO e BOBBIO (1995); BARUFFALDI e OLIVEIRA (1998) e
SILVA (2000), a legislação brasileira reconhece e permite o uso das seguintes
classes de aditivos em alimentos:
•
corante: a substância que confere ou intensifica a cor dos alimentos;
•
aromatizante: a substância ou mistura de substâncias, possuidoras de
propriedades odoríferas, capazes de conferir ou intensificar aroma e/ou sabor dos
alimentos, incluindo as bebidas;
•
antioxidante: substância que retarda o aparecimento de alterações oxidativas
nos alimentos;
•
estabilizante: substância que favorece e matém as características físicas das
emulsões e suspensões;
•
espessante: substância capaz de aumentar, nos alimentos, a viscosidade de
soluções, emulsões e suspensões;
•
edulcorante: substância orgância artificial, não glicídica, capaz de conferir
sabor doce aos alimentos;
•
umectante: substância capaz de reduzir as características higroscópicas dos
alimentos;
•
acidulante: substância capaz de comunicar ou intensificar o sabor acídulo dos
alimentos. O ácido cítrico (figura 21), aditivo normalmente adicionado ao alho, é um
acidulante versátil e muito utilizado pelas indústrias de alimentos, tendo como
características a alta solubilidade, a ação sequestrante de íons metálicos (que previne
reações indesejáveis de oxidação de cor e aromas), segurança na manipulação,
inocuidade do ponto de vista de saúde e baixa corrosividade das instalações
industriais. Desta forma, sua utilização se constitui em uma alternativa simples e
segura para o processamento industrial dos produtos de alho (LINDSAY 1993;
BERBARI 2003). O ácido cítrico também atua como antioxidante e como sinergista
(SILVA 2000).
•
conservadores: substâncias que impedem ou retardam as alterações dos
alimentos, provocadas por microorganismos ou enzimas. Nas amostras de alho estão
presentes os conservadores benzoato de sódio e metabisulfito de sódio. O ácido
benzóico e benzoatos são os conservadores mais antigos utilizados em alimentos.
Tanto o ácido quanto seus sais são eficazes contra bolores e leveduras. A maior
88
solubilidade em água e a não interferência na coloração tornam o benzoato de sódio
(figura 22) o mais utilizado, sendo este outro aditivo também adicionado nos
produtos de alho. Os benzoatos têm a propriedade de serem inócuos para o emprego
em alimentos, porém é estabelecido um nível máximo de 0,3 g/100g. Outro
conservador muito utilizado em alimentos é o dióxido de enxofre e derivados. Hoje
em dia, o gás é raramente utilizado, sendo substituído por outros compostos
geradores de dióxido de enxofre (SO
2
), como o sulfito de sódio (Na
2
SO
3
), o sulfito
ácido de sódio (NaHSO
3
) e o metabisulfito de sódio (dissulfito de sódio – Na
2
S
2
O
5
)
(figura 23). Os sais de sulfito possuem a vantagem de serem facilmente manuseáveis
e quando dissolvidos em água formam ácido sulfuroso, íon bissulfito e íon sulfito,
que agem sobre as bactérias e fungos. Os metabissulfitos são mais estáveis que os
bissulfitos (BARUFFALDI 1998; SILVA 2000; TFOUNI e TOLEDO 2002;
ARAÚJO 2004; COULATE 2004). O metabisulfito de sódio, além de atuar sobre as
bactérias e fungos, também atua como antioxidante para prevenir a oxidação
(seqüestrador de oxigênio e agentes redutores); na inibição de várias enzimas,
incluindo proteases, oxidases e peroxidades, e por último, atuam como agentes
quelantes (POPOLIM 2004).
COOH
COOH
HO
HOOC
Figura 21 - Estrutura química do ácido cítrico
89
ONa
O
Figura 22 - Estrutura química do benzoato de sódio
S
S
O
-
O O
O
-
O
Na
+
Na
+
Figura 23 - Estrutura química do metabisulfito de sódio
Poucas são as informações bibliográficas disponíveis sobre o processamento e
conservação dos produtos de alho, pois a maioria delas encontra-se na forma de
patentes (BERBARI e
t al.
2003).
O consumo de aditivos sintéticos em alimentos e seu potencial tóxico
(NAMIKI 1990, AMARAL
et al.
2002) é uma preocupação, não somente por parte
do consumidor, como também de pesquisadores, impulsionando a busca de
compostos de origem natural. No caso dos antioxidantes, estes podem ser
substituidos total ou parcialmente por antioxidantes naturais presentes nos alimentos.
De fato, as pesquisas na área de antioxidantes naturais estão aumentando. O
alho é uma das principais especiarias utilizadas na culinária do Brasil, e de vários
90
outros países. Suas excepcionais características de sabor e principalmente de aroma
contribuem diretamente para sua excelente aceitação como especiaria. Os compostos
organosulfurados voláteis são responsáveis pelas características de odor dos mesmos
(CARVALHO
et al.
1991). Além dos compostos organosulfurados, o alho contém
compostos fenólicos, sendo que ambos possuem propriedades antioxidantes.
Além da utilização em alimentos a fim da preservação da oxidação lipídica,
melhorando a qualidade sensorial e nutricional, os antioxidantes são vistos como
benéficos ao organismo, pois já foi verificado que reações de oxidação de
biomoléculas podem estar relacionadas a distúrbios nos organismos, especialmente
ao câncer (MENEGHINI 1988) e as doenças cardiovasculares (ESTERBAUER
et al.
1992).
3.2. Justificativa
A busca por produtos prontos para consumo cresceu na última década,
incentivando o desenvolvimento de tecnologias que permitam a fabricação do alho
com qualidade. O processamento do alho em pasta ou picado para consumo, de modo
que se mantenha estável à temperatura ambiente, facilita a sua utilização pelo
consumidor. Assim, a tecnologia empregada permite que o alho e seus produtos
apresentem as seguintes vantagens: segurança do ponto de vista microbiológico e
manutenção das características sensoriais.
Considerando o interesse na manutenção das propriedades citadas acima,
além da ação antioxidante, o alho e seus produtos processados necessitam do
acréscimo de aditivos. Assim, julga-se necessário comparar a atividade antioxidante
nos diferentes produtos de alho, com e sem aditivos.
91
3.3. Objetivos
3.3.1. Objetivo Geral
Avaliar e comparar a atividade antioxidante
in vitro
do extrato metanólico de
diferentes produtos de alho, com e sem aditivos.
3.3.2. Objetivos Específicos
- Quantificar os compostos fenólicos totais dos produtos de alho
sem aditivos, e
comparar os resultados com os produtos com aditivos;
- Determinar a atividade antioxidante por três métodos analíticos nos produtos sem
aditivos, e comparar os resultados com os produtos com aditivos;
3.4. Materiais e Métodos
3.4.1. Materiais
3.4.1.1. Solventes e reagentes
A procedência dos solventes e reagentes utilizados nos experimentos foi:
CAAL Produtos Químicos Ltda, Sigma Aldrich Brasil Ltda, Merck S.A. produtos
para laboratório Ltda, Synth- Labsynth produtos para laboratórios Ltda. Estes
produtos são de grau analítico.
3.4.1.2. Amostras
As amostras de alho
in natura
foram obtidas na Companhia de Entrepostos e
Armazéns Gerais de São Paulo (CEAGESP). Posteriormente, estas amostras foram
92
enviadas para a empresa Fresh Garlic, onde foram processadas em alho picado com
sal, sem sal e misto, todas sem aditivos, conforme descrito na figura 24. As amostras
foram armazenadas em temperatura ambiente.
As amostras dos produtos de alho sem aditivos correspondem ao lote quatro.
93
AQUISIÇÃO -
CEAGESP
alho in natura
caixa 3 – 5Kg
Lote 3
caixa 2 – 5Kg
Lote 2
caixa 1 – 5Kg
Lote 1
caixa 4- 5Kg
Lote 4
alho
in natura
- bulbo (AIN)
alho
in natura
- bulbo (AIN)
alho
in natura
- bulbo (AIN)
alho picado sem sal (AP)*
alho picado com sal
-
2%
(APS)*
alho misto (AM)*
alho picado sem sal (AP)**
alho picado sem sal (AP)*
alho picado com sal - 2%
(APS)*
alho misto (AM)*
alho picado
sem sal (AP)*
alho picado com sal - 2%
(APS)*
alho misto (AM)*
alho picado com sal
-
2%
(APS)**
alho misto (AM)**
alho frito (AF)
alho frito (AF)
alho frito (AF)
* As amostras de alho picado sem sal, picado com sal (2%) e misto dos lotes 1, 2 e 3, contém em sua composição os seguintes aditivos: ácido citríco, metabisulfito de sódio e benzoato de sódio. Para cada 10 Kg destes
produtos foram utilizados 800 g de ácido citríco, 15 g de metabisulfito de sódio e 6 g de benzoato de sódio. Já as amostras de alho in natura e frito não possuem nenhum aditivo.
** As amostras do lote 4 não contém aditivos.
Figura 24 – Esquema das amostras obtidas de alho sem aditivos (lote 4).
PROCESSAMENTO -
EMPRESA DE ALHO
94
3.4.2. Métodos
3.4.2.1. Obtenção do extrato metanólico
A metodologia utilizada para obter os extratos das amostras sem aditivos
(alho picado sem sal, picado com sal e misto) foi a mesma utilizada para obter os
extratos de alho comercializado, ou seja, metodologia descrita por NUUTILA
et al.
(2003), porém com modificações (item 2.4.2.1).
Os extratos foram colocados em frascos âmbar, sob atmosfera de nitrogênio e
armazenados no freezer à -18
o
C até o momento das análises.
3.4.2.2. Determinação do teor de resíduo seco dos extratos
A obtenção do teor de do resíduo seco dos extratos foi por processo
gravimétrico, conforme AOAC (1995).
3.4.2.3. Quantificação dos compostos fenólicos
A quantificação do teor de compostos fenólicos presentes nos produtos de alho
sem aditivos foi similar ao das amostras comercializadas, de acordo com o método
desenvolvido por SINGLETON e ROSSI (1965), citado por NUUTILA (2003) com
o reagente de Folin-Ciocalteu, conforme descrito no item 2.4.2.3. Foi utilizado como
padrão o ácido gálico. Os resultados obtidos foram expressos em
µ
g/mL ou
µ
g/mg
em relação ao resíduo seco, ambos os valores em equivalentes de ácido gálico
(
µ
g/mL/EAG ou
µ
g/mg/EAG).
95
3.4.2.4. Avaliação da atividade antioxidante
3.4.2.4.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
)
O ensaio DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) determina a capacidade das
amostras em sequestrar radicais livres. O método utilizado foi descrito por
YAMAGUCHI
et al.
(1998) com modificações, no qual os compostos antioxidantes
reagem com o radical estável em uma solução de metanol. Assim, como descrito no
capítulo 2 (item 2.4.2.4.1), a porcentagem da atividade antioxidante (% AA) foi
calculada de acordo com a seguinte fórmula:
% AA
=
[(abs. do branco do DPPH) - (abs. final da amostra – abs. do branco da amostra) ]
abs. do branco do DPPH
onde: abs. = absorbância
Branco do DPPH = 750 µL de metanol + 1,5 mL da solução de DPPH
Branco da amostra = 750 µL da amostra + 1,5 mL de metanol
3.4.2.4.2. Sistema β
ββ
β-caroteno/ácido linoléico
Para determinar a atividade antioxidante pelo sistema
β
-caroteno/ácido
linoléico, foi utilizada a metodologia descrita por MARCO (1968) e modificada por
MILLER (1971) empregando-se como substrato a solução de
β
-caroteno/ácido
linoléico, de acordo com o item 2.4.2.4.2. O padrão utilizado foi o BHT. Para o
cálculo da porcentagem da inibição da oxidação lipídica (% IOL) foram utilizadas as
seguintes fórmulas:
100% da oxidação
=
absorbância inicial do controle – absorbância final do controle
96
Correlacionou-se a queda na leitura da absorbância das amostras com o
controle e foi estabelecida a porcentagem de inibição da oxidação lipídica a partir da
subtração da porcentagem da oxidação de cada amostra de 100, segundo a fórmula
abaixo:
% IOL =
100 – (absorbância inicial da amostra – absorbância final da amostra) x 100
absorbância inicial do controle – absorbância final do controle
3.4.2.4.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica utilizando o
aparelho Rancimat®
Um terceiro teste
in vitro
foi utilizado para avaliar a capacidade protetora das
amostras estudadas. Utilizou-se o aparelho Rancimat® 743, marca
Metrohm
,
conectado ao programa PC: 743 Rancimat® 1.0, onde foi medido o período de
indução da gordura vegetal hidrogenada (marca Sadia) contendo o extrato
metanólico, segundo o item 2.4.2.4.3. Os resultados foram expressos como Índice de
Atividade Antioxidante (IAA), calculado pela fórmula:
IAA =
TI amostra
TI controle
Onde: TI amostra = tempo de indução (h) da gordura vegetal hidrogenada +
extrato contendo a amostra
TI controle = tempo de indução (h) gordura vegetal hidrogenada sem
o extrato
97
3.4.2.5. Análise Estatística
Os resultados das diferentes análises foram apresentados como média e
desvio padrão.
Para comparar os produtos de alho com e sem aditivos (alho picado sem sal,
com sal e misto), foi realizado o teste t-student.
Todas as análises foram realizadas em triplicata, com exceção do método
utilizando o aparelho Rancimat®, onde se utilizaram amostras em duplicata. O nível
de significância estabelecido para todos os testes estatísticos aplicados foi de 5%,
sendo utilizado o ”software” Statistical Package for the Social Sciences (SPSS),
versão 10.0 for Windows.
3.5. Resultados e Discussão
Para a comparação dos resultados encontrados em todos os testes, utilizaram-
se os valores das amostras referentes ao momento 1. Os dados sobre as amostras com
aditivos estão apresentados no capítulo 2.
3.5.1. Teor de fenólicos totais
Na tabela 5, nota-se que os extratos de alho picado sem sal e com sal com e
sem aditivos, não apresentaram diferenças estatisticamente significante nos teores de
fenólicos totais. Já o misto com aditivos apresentou menor teor de fénolicos totais, o
que já era esperado, pois este produto apresentou maior teor de umidade em relação
as amostras sem aditivos.
Quando quantificado os fenólicos totais em relação ao resíduo seco, todas os
produtos com aditivos apresentaram menor teor destes compostos em relação ao sem
aditivos. Provavelmente ocorreu uma interação entre os aditivos e os compostos
fenólicos do alho. Nenhum dos aditivos presentes no alho se classifica como
composto fenólico (figuras 21, 22 e 23). Além disso, o teor de fenólicos totais foi
proporcional ao teor de resíduo seco.
98
Segundo ARAÚJO (2004) o aditivo metabisulfito reage rapidamente com
vários compostos. Este aditivo é o principal composto usado na conservação de
alimentos, gerando o dióxido de enxofre (SO
2
) e seus ânions bisulfito (HSO
3
-
) e
sulfito (SO
3
2-
). As reações químicas originadas quando o dióxido de enxofre é
adicionado aos alimentos são complexas, sendo convertido, principalmente, em íon
bissulfito (HSO
3
-
). Este íon pode permanecer livre e disponível para retardar a
formação de compostos tipo da reação de Maillard, e pode também se ligar,
reversivelmente, a certos compostos, como os grupos carbonilas de aldeídos
(TAYLOR e BUSH 1987).
De acordo com CARBONELL-BARRACHINA
et al.
(2003) quando o alho
in natura
é picado ocorre a oxidação dos compostos fenólicos, formando as quinonas
que apresentam coloração marrom. Os aditivos, como ácido cítrico, bisulfito de
sódio, entre outros, podem retardar a oxidação dos compostos fenólicos, inibindo a
formação destes compostos indesejados (quinonas). Este dado não foi observado
neste estudo, ou seja, o teor de fenólicos nas amostras com aditivos não foi superior
as amostras sem aditivos.
Tabela 5 – Teores médios e desvio padrão (dp) de resíduo seco e de fenólicos totais
das amostras de alho com e sem aditivos.
Alho n* Resíduo
Seco
(mg/mL)
Fenólicos totais
(µ
µµ
µg/mL/EAG**) do
extrato
Fenólicos totais
(µ
µµ
µg/mg/EAG**) do
extrato em relação
ao resíduo seco
Nível de
significância
(p)***
com
aditivos
9 3,74 23,77 (1,82) 6,36 (0,54)
Alho picado
(AP)
sem
aditivos
3 2,46 22,11 (0,84) 8,97 (0,25)
0,000
com
aditivos
9 4,58 21,91 (1,57) 4,78 (0,37)
Alho picado
com sal
(APS)
sem
aditivos
3 3,73 22,86 (0,82) 6,13 (0,09)
0,000
com
aditivos
9 2,68 16,64 (3,73) 6,21 (1,10)
Alho misto
(AM)
sem
aditivos
3 2,57 21,50 (0,69) 8,36 (0,63)
0,005
* n = número de amostras.
** EAG = equivalentes de ácido gálico.
*** p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante de fenólicos totais do extrato em relação ao resíduo seco.
99
3.5.2. Avaliação da atividade antioxidante
3.5.2.1. Ensaio radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH
.
)
Na tabela 6 e/ou figura do anexo 5, p. 126 estão apresentados os valores da
atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH das amostras com e sem aditivos. O AP e
APS com aditivos apresentaram melhor atividade antioxidante quando comparados
as mesmas amostras sem aditivos. O AM com e sem aditivos não apresentou
diferença estatística.
Este resultado se justifica pela presença do ácido cítrico e do metabisulfito de
sódio, aditivos empregados nas amostras, os quais atuam como antioxidante. O ácido
cítrico pode apresentar sinergismo com outras substâncias que possuem ação
antioxidante, conforme relatado por SILVA (2000). ASSIMOPOULOU
et al.
(2005)
relataram que o ácido citríco apresentou sinergismo com os compostos antioxidantes
presentes na resina
Pistacia lentiscus
, que é um produto natural com proposta de uso
farmacêutico.
Tabela 6 – Valores médios e desvio padrão (dp) da atividade antioxidante, pelo
ensaio DPPH, do extrato metanólico dos diferentes produtos de alho com e sem
aditivos.
Alho n* Atividade
antioxidante (%)
Nível de significância
(p)**
com aditivos
9 28,80 (4,11)
Alho picado
(AP)
sem aditivos
3 17,16 (0,18)
0,005
com aditivos
9 23,11 (1,78)
Alho picado com sal
(APS)
sem aditivos
3 19,08 (0,43)
0,024
com aditivos
9 24,92 (4,76)
Alho misto
(AM)
sem aditivos
3 25,36 (0,22)
0,880
* n = número de amostras
** p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.
100
3.5.2.2. Sistema β
ββ
β-caroteno/ácido linoléico
De acordo com a tabela 7 e/ou figura do anexo 6, p. 127, verifica-se que as
amostras de AP, APS e AM com a apresença de aditivos, apresentaram melhor
inibição da oxidação lipídica do que as amostras sem aditivos, resultados do teste t-
student.
Os aditivos ácido cítrico e metabisulfito de sódio, utilizados nas amostras,
atuam como antioxidante e como sinergista com outras substâncias com ação
antioxidante, conforme mencionado no item 3.5.2.1.
Tabela 7 – Valores médios e desvio padrão (dp) da porcentagem de inibição da
oxidação lipídica (% IOL), pelo sistema
β
-caroteno/ácido linoléico, dos produtos de
alho com e sem aditivos.
Alho n* % IOL Nível de
significância
(p)**
com aditivos
9 34,42 (4,47)
Alho picado
(AP)
sem aditivos
3 30,21 (0,56)
0,050
com aditivos
9 38,11 (2,56)
Alho picado com sal
(APS)
sem aditivos
3 26,51 (1,56)
0,012
com aditivos
9 40,94 (4,94)
Alho misto
(AM)
sem aditivos
3 37,38 (1,10)
0,025
* n = número de amostras
**p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.
3.5.2.3. Avaliação da capacidade protetora da oxidação lipídica utilizando o
aparelho Rancimat®
Na tabela 8 e/ou figura do anexo 7, p. 128, está apresentado o índice de
atividade antioxidante das amostras com e sem aditivos. A presença do ácido citríco
e do metabisulfito de sódio foi o fator determinante nos outros dois testes, conforme
mencionado nos itens 3.5.2.1 e 3.5.2.2. Verifica-se que não houve diferença entre as
amostras de alho picado sem sal, com sal e misto com a adição de aditivos quando
comparadas as amostras sem aditivos, pelo teste t-student. Assim, pode-se supor que
101
no teste utilizando o aparelho Rancimat® a presença do ácido cítrico e do
metabisulfito de sódio não causou o mesmo impacto verificado nos outros dois
métodos. É possível que a atuação do ácido cítrico e do metabisulfito de sódio como
antioxidantes seja dependente do perfil lipíco do substrato ou das condições de
oxidação do meio. No aparelho Rancimat® é utilizado a gordura vegetal hidrogenada
(marca Sadia), que é rica em ácidos graxos saturados (60%), enquanto que no
sistema
β
-caroteno/ácido linoléico é utilizado somente o ácido linoléico, que é um
ácido graxo poliinsaturado. Além do que, no aparelho Rancimat® há um fluxo
contínuo de oxigênio, enquanto que no outro método não existe. A disponibilidade
de oxigênio no sistema é um fator que influencia a ligação do dióxido de enxofre.
Com o oxigênio presente, parte do dióxido de enxofre pode ser oxidada,
irreversivelmente, à forma sulfato, um composto único, podendo assim, ocorrer uma
menor atuação deste aditivo (WEDZICHA 1992).
Tabela 8 – Valores médios e desvio padrão (dp) do índice de atividade antioxidante
(IAA), medido pelo aparelho Rancimat®, dos produtos de alho com e sem aditivos.
Alho n* IAA**
Nível de
significância
(p)***
com aditivos
6 1,66 (0,13)
Alho picado
(AP)
sem aditivos
2 1,62 (0,08)
0,642
com aditivos
6 1,35 (0,08)
Alho picado com sal
(APS)
sem aditivos
2 1,38 (0,13)
0,704
com aditivos
6 1,39 (0,12)
Alho misto
(AM)
sem aditivos
2 1,21 (0,07)
0,071
* n = número de amostras.
** IAA = tempo de indução (h) da amostra / tempo de indução (h) do controle.
*** p < 0,05 representa diferença estatisticamente significante.
O emprego dos aditivos ácido cítrico e do metabisulfito de sódio foi
importante, pois exerceu o seu efeito antioxidante e manteve a cor original do
produto, uma das mais importantes características sensoriais.
102
3.6. Conclusão
•
A presença de aditivos pode ter contribuído para a redução do teor de
fenólicos totais do extrato em relação ao resíduo seco, através de uma
possível interação destes aditivos com os fenólicos;
•
A presença dos aditivos ácido cítrico e metabisulfito de sódio contribuiram de
modo significativo para o efeito antioxidante nos ensaios DPPH e no sistema
β
-caroteno/ácido linoléico, o que não ocorreu no método utilizando o
aparelho Rancimat, possivelmente em função dos diferentes perfis lipídicos
dos substratos e diferentes condições metodológicas.
103
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120
ANEXO 1
Determinação do teor de umidade das amostras comercializadas de
alho.
A determinação de umidade foi realizada por processo gravimétrico, o qual se
baseia na determinação da perda de peso da amostra submetida ao aquecimento em
estufa a 105
0
C, resultando na amostra seca ou dessecada. A pesagem foi realizada
após resfriamento em dessecador, sendo a operação repetida até peso constante
(AOAC 1995).
A umidade média do
momento 1
(análise próxima à data de fabricação), do
momento 2
(análise no período intermédiario entre a fabricação e a validade) e do
momento 3
(análise próxima ao fim da data de validade), estão apresentadas na
figura abaixo.
6,8
5,5
5,52
6
9
,
6
8
6
8
,
7
6
6
7
,
4
5
68,83
70,27
71,44
67,66
68,19
69,79
79,55
77,77
82,6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Momento 1 Momento 2 Momento 3
Umidade g/100g
AIN AF AP APS AM
* n = número de amostras
Letras diferentes no mesmo momento indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Figura – Teor de umidade do alho
in natura
e de seus produtos comercializados dos
momentos 1, 2 e 3 (n* = 9).
Pode-se constatar pela análise de variância que existe diferença
estatisticamente significante entre as amostras de alho
in natura
e seus produtos
comercializados nos três momentos. O alho frito apresentou menor teor de umidade
em todos os momentos, quando comparado com o alho
in natura
e os demais
b
c c
d
a
b
a
b
b
a
b
c
b
c
b
121
produtos (p < 0,001), e o contrário ocorreu com o alho misto. Como esperado, as
amostras de alho misto em todos os momentos apresentaram valores superiores de
umidade do que as demais amostras, justificado pelo fato de que este produto é uma
mistura de alho desidratado com
in natura
, conforme mencionado anteriormente.
Para ocorrer o processamento deste produto é necessário a adição de água.
Comparando o alho picado sem sal e o picado com sal, em todos os momentos da
vida de prateleira, pode-se dizer que não há diferença entre estas amostras.
De acordo com as tabelas de composição de alimentos do USDA (2001) e da
FCF/USP (2006) o teor de umidade para o alho
in natura
cru é de 58,58 e 65,51
g/100g respectivamente, enquanto que no presente estudo, este dado variou de 67,45
a 69,68 g/100g, ao longo da vida de prateleira. Esta diferença pode se justificar em
função das variações climáticas, solo, tipos de alho, técnicas de manuseio, período de
cura e armazenamento pós-colheita, conforme citado por CARVALHO
et al.
(1991)
e por RIOS e PENTEADO (2003). HOLUB
et at
. (2002) relataram que o alho
in
natura
possui em média de 56 a 68 g/100g de umidade.
Com base nos resultados encontrados na próxima figura, verifica-se uma
tendência em diminuir o teor de umidade das amostras de AF, AP, APS e AM no
decorrer da vida de prateleira, porém o contrário ocorreu com o AIN, para o qual se
observou um pequeno incremento de umidade significativa. Alguns estudos
verificaram que houve perda de peso e alterações na composição química dos bulbos
de alho no decorrer do armazenamento (CARVALHO
et al.
1991; RIOS e
PENTEADO 2003), porém este fato não aconteceu com o alho
in natura
nas
condições de armazenamento do presente estudo.
122
6,8
5,5
5,52
82,6
69,79
71,44
67,45
77,77
68,19
70,27
68,76
79,55
67,66
68,83
69,68
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
AIN AF AP APS AM
Umidade g/100g
Momento 1
Momento 2
Momento 3
AIN = alho
in natura
; AF = alho frito; AP = alho picado sem sal; APS = alho picado com sal; AM = alho misto
Letras diferentes na mesma amostra indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Figura – Teor de umidade do alho
in natura
e de seus produtos comercializados no
decorrer da vida de prateleira.
a
a,b b a
a
b c
b a
b a
a
b a
a
123
ANEXO 2
Tabela – Valores médios e desvio padrão (dp) da atividade antioxidante, pelo ensaio
DPPH, do extrato metanólico do alho
in natura
e de seus produtos comercializados
dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9).
% Atividade antioxidante Alho
Momento 1 Momento 2 Momento 3
Alho in natura (AIN)
21,69
a
a
(3,22) 19,78
b
a
(6,95) 21,68
b
a
(1,76)
Alho frito (AF)
60,85
c
a
(6,03) 46,04
c
b
(3,60) 49,83
c
b
(1,23)
Alho picado sem sal (AP)
28,80
b
a
(4,11) 5,63
a
b
(0,45) 7,30
a
b
(0,98)
Alho picado com sal (APS)
23,11
a
a
(1,78) 6,87
a
b
(0,54) 7,76ª
b
(1,23)
Alho misto (AM)
24,92
a,b
a
(4,76) 9,04
a
b
(3,42) 9,57ª
b
(0,86)
* n = número de amostras.
Letras diferentes na mesma
coluna
indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Letras diferentes em negrito na mesma
linha
indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
124
ANEXO 3
Tabela – Valores médios e desvio padrão (dp) da inibição da oxidação lipídica (IOL),
pelo sistema
β
-caroteno/ácido linoléico, do extrato metanólico do alho
in natura
e de
seus produtos comercializados dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 9).
% IOL Alho
Momento 1 Momento 2 Momento 3
Alho in natura – bulbo (AIN)
35,74
a,b
a
(3,65) 39,84ª
b
(2,12) 44,97ª
c
(2,06)
Alho frito (AF)
79,09
c
a
(2,97) 85,49
d
b
(0,87) 78,03
c
a
(3,20)
Alho picado sem sal (AP)
34,42
a
a
(4,47) 65,14
b
b
(3,13) 68,16
b
b
(13,62)
Alho picado com sal (APS)
38,11
a,b
a
(2,56) 69,85
c
b
(3,08) 78,82
c
c
(7,07)
Alho misto (AM)
40,94
b
a
(4,94) 72,03
c
b
(4,26) 82,25
c
c
(5,18)
* n = número de amostras.
Letras diferentes na mesma
coluna
indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Letras diferentes em negrito na mesma
linha
indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
125
ANEXO 4
Tabela – Valores médios e desvio padrão (dp) do índice de atividade antioxidante
(IAA), utilizando o aparelho Rancimat, do extrato metanólico do alho
in natura
e de
seus produtos comercializados dos momentos 1, 2 e 3 (n* = 6).
IAA** Alho
Momento 1 Momento 2 Momento 3
Alho in natura – bulbo (AIN)
1,35
a a
(0,19) 1,41ª
,b a
(0,06) 1,54ª
,b a
(0,23)
Alho frito (AF)
1,60
b,c a
(0,19) 1,63
b a
(0,19) 1,67
b a
(0,15)
Alho picado sem sal (AP)
1,66
c a
(0,13) 1,57ª
,b a
(0,10) 1,64ª
,b a
(0,23)
Alho picado com sal (APS)
1,35
a a
(0,08) 1,35ª
a
(0,16) 1,43ª
a
(0,16)
Alho misto (AM)
1,39
a,b a
(0,12) 1,50
a,b a,b
(0,17) 1,64ª
,b b
(0,08)
* n = número de amostras
** IAA = tempo de indução (h) da amostra / tempo de indução (h) do controle
Letras diferentes na mesma
coluna
indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
Letras diferentes em negrito na mesma
linha
indicam diferença estatisticamente significante (p < 0,05).
126
ANEXO 5
28,80
23,11
24,92
17,16
19,08
25,36
0
5
10
15
20
25
30
35
alho picado alho picado com sal alho misto
% atividade antioxidante
com aditivos
sem aditivos
Figura – Atividade antioxidante, pelo ensaio DPPH, do extrato metanólico dos
diferentes produtos de alho com e sem aditivos.
127
ANEXO 6
34,42
38,11
40,94
30,21
26,51
37,38
0
10
20
30
40
50
alho picado alho picado com
sal
alho misto
% IOL
com aditivos
sem aditivos
Figura – Porcentagem de inibição da oxidação lipídica (% IOL), pelo sistema
β
-
caroteno/ácido linoléico, dos produtos de alho com e sem aditivos.
128
ANEXO 7
1,66
1,35
1,39
1,62
1,38
1,21
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
alho picado alho picado com
sal
alho misto
IAA
com aditivos
sem aditivos
Figura – Índice de atividade antioxidante (IAA), medido pelo aparelho Rancimat®,
dos produtos de alho com e sem aditivos.
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