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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
ADMINISTRAÇÃO PROFILÁTICA E TERAPÊUTICA DA LECTINA
KM
+
PROTEGE CAMUNDONGOS CONTRA INFECÇÃO POR
Paracoccidioides brasiliensis ATRAVÉS DE UM
MECANISMO DEPENDENTE DE INTERLEUCINA-12.
KELY CRISTINE COLTRI
R
IBEIRÃO PRETO - SP
-2007-
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
KELY CRISTINE COLTRI
ADMINISTRAÇÃO PROFILÁTICA E TERAPÊUTICA DA LECTINA
KM
+
PROTEGE CAMUNDONGOS CONTRA INFECÇÃO POR
Paracoccidioides brasiliensis ATRAVÉS DE UM
MECANISMO DEPENDENTE DE INTERLEUCINA-12.
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em
Ciências, Área de Imunologia Básica e
Aplicada.
ORIENTADOR: PROF. DR. ADEMILSON PANUNTO CASTELO
RIBEIRÃO PRETO - SP
-2007-
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Guardo tantos sentimentos...
Ah, como gostaria de livrá-los do cárcere do tempo,
mas o que é o tempo? Será que a distância entre as horas é o bastante para
arrebatar as sensações?
Não. É pequenez acreditar em tamanha fugacidade...
A sublimidade de cada momento é alicerçada em recônditos longínquos,
ziguezagueantes, enigmáticos e por vezes ardilosos. Revela-se assim uma limitada
fração da genuinidade da vida que, pouco a pouco, impele meu espírito errante por
caminhos que se mesclam entre trilhados e ulteriores.
Como reviver cenas singulares em uma jornada tão
inquietante?
Em qual cômodo escuro estarão perdidas as fragrâncias e gargalhadas de outrora?
A distância dos fatos causa-me profundo temor.
O que fazer para entreter o espaço-tempo e resgatar a doçura deliciosa do olhar
daqueles que foram tão próximos, tão intensamente meus...
Começo a compreender a magia existente entre os instantes correntes que,
paulatinamente, iniciam mais uma longa jornada rumo aos abismos desconhecidos
da mente.
A sofreguidão já não me acompanha.
Aprendi a transgredir a tênue linha entre Passado e
Presente, circunstâncias imaginárias que residem no âmago.
Pessoas, lugares, aromas, momentos...
Arquivos que vêm e vão rapidamente como centelhas fascinantes do que há pouco
nutria minha existência.
Kely Coltri
Para Jean C. Zamboni,
meu marido.
Por razões que transcendem o incentivo irrestrito às minhas escolhas.
Por despertar em mim o prazer e a alegria de fazer parte do universo.
A minha mãe Diorandes Coltri e ao meu pai Antônio Carlos Coltri,
por enriquecerem minha vida. Amigos incondicionais que, ternamente,
me ensinaram o que realmente é essencial.
Aos meus irmãos, Estéfano e Diego Coltri,
pelo amor que nos une. A paisagem ganha
belos matizes quando estamos bem acompanhados,
o que torna a caminhada bastante agradável...
AGRADECIMENTOS
Especialmente ao Prof. Dr. Ademilson Panunto Castelo. Não tenho como agradecer
todo o conhecimento que adquiri por ter a sorte de ser sua aluna. Contigo, aprendi que
pesquisar significa bem mais que mera prática, que por trás de dados experimentais, encontra-
se uma pessoa tentando transcender os entraves do dia a dia, na busca de uma melhor
compreensão da vida. Gostaria de acentuar, sobretudo, que desde que esse processo começou
você foi um colaborador ativo, extremamente generoso com suas idéias, críticas e tempo,
inclusive o tempo necessário para ler e sugerir mudanças importantes na primeira versão da
tese. Há que lembrar, ainda, que você foi capaz de indicar, com maestria, como ultrapassar ou
contornar vários obstáculos que encontrei durante os anos. Sou-lhe imensamente grata por ter
preenchido, de maneira singular, as enormes lacunas em meu conhecimento e por resgatar e
preservar em mim o fascínio pela ciência.
À Profa. Dra. Maria Cristina Roque Barreira, pela pronta acolhida em seu laboratório,
por todos os ensinamentos que contribuíram para a minha formação científica. Agradeço pela
oportunidade, confiança e pelo suporte indispensável, que viabilizou a realização desse
trabalho.
Ao Dr. Roberto Martinez, que gentilmente forneceu o isolado Pb18 colaborando
diretamente para a realização desse trabalho. Igualmente, sou grata à Maria Helena B Malta,
por ter me ensinado a arte de cultivar fungos e por ter sido extremamente solícita e amável.
Aos Profs. Dra. Maria Terezinha Peraçoli, Dra. Rosana Puccia, Dr. João Santana da
Silva e Dr. Roberto Martinez, pela disponibilidade em participar da banca examinadora.
À Dra. Cláudia Maffei que gentilmente disponibilizou equipamentos de seu laboratório,
contribuindo para a realização desse trabalho. Agradeço ainda à Marli, por toda a gentileza e
ajuda valiosa.
A todo corpo docente do programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada
pelos preciosos ensinamentos e por disponibilizar os laboratórios.
À Érica Vendruscolo pela disponibilidade constante, amizade e por todos os agradáveis
momentos compartilhados.
Aos funcionários do biotério, Júlio Anselmo Siqueira, Ednelson Aparecido Mazzolo,
Cristiane Carolina Padovan, Sávio H. Falqueto Miranda e Rubens Salomão de Campos pela
presteza em nos atender e pela ajuda e cuidado com os animais.
À Ana Cristine S. Ferreira, pela solicitude, seriedade, respeito, competência e absoluto
desvelo com que conduz a secretaria da Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada.
À Rosângela C. Peral Mesquita, por toda doçura e disponibilidade.
À Vani Maria Alves Correa e à Izilda Rodriguez Violante, pelo excelente auxílio nas
técnicas de histologia e pela incondicional cooperação durante todo o desenvolvimento do
presente trabalho.
À Maria Inês Ambrozio Castania, pela atenção, respeito, solicitude e cuidado com o
material.
À Lúcia Maria Lacerda da Silva pela manutenção da limpeza do laboratório e pela
amabilidade e convivência agradável.
À Sandra Maria de Oliveira Thomaz, muito obrigada pelos ensinamentos, pelo
competente apoio técnico prestado, pela presteza em nos atender sempre e pela amizade,
gentileza e afabilidade.
Um agradecimento especial para Patrícia Edivânia Vendruscolo, que contribuiu
diretamente para a realização desse trabalho. A sua ajuda foi imprescindível. Ainda, não
poderia deixar de agradecer a companhia agradabilíssima durante todos esses anos,
permeados por muitas risadas e descontração. Muitíssimo obrigada por tudo!
Aos colegas, Elaine Vicente Lourenço, Ebert Seixas Hanna, Sandro Soares Gomes,
Vânia S. Mariano, Fernanda Caroline de Carvalho, Fernando Lourenço, Marina Conrado,
Marina Valente e Marcos Rezende de Oliveira, pela amizade, consideração e boa convivência.
Às amigas, Dra. Andréa N. Moreno, Dra. Luciana C. Ferraz, Dra. Gabriela Pereira da
Silva, e Dra. Luciane Ganiko, com as quais compartilhei ótimos momentos. Obrigada pelo
companheirismo, carinho e por todos os ensinamentos.
Ao divertidíssimo e querido amigo Leandro Licursi de Oliveira (Trança), pela amizade
que nos uniu durante todos esses anos. Agradeço por toda solicitude, colaboração e
disponibilidade invariáveis. Não posso deixar de ressaltar que a sua amizade fraterna trouxe
ânimo, muita alegria e leveza durante o dia-a-dia de trabalho.
À Prof. Dra. Arlete Aparecida Martins Coelho Castelo, que tem me ensinado, com
muita naturalidade, a enxergar o mundo de uma maneira mais bela e singela. Amiga com a
qual compartilho pensamentos, aspirações, grandes emoções e inúmeros momentos de
felicidade.
À amiga Dra. Anália Sulamita Casabona Fortunato, por todo desvelo e carinho, por
contribuir para a concretização desse trabalho. Ainda, agradeço a amizade sincera, os
conselhos sempre tão ponderados e os inúmeros gestos de respeito e ternura.
A todos os colegas da pós-graduação, com os quais tive o prazer de conviver durante
esses anos.
A todos os funcionários da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, anônimos, que
cooperam sobremaneira para o bom andamento de todas as pesquisas.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxílio
financeiro que possibilitou a realização desse trabalho.
Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.
Cora Coralina
A
A
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b
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r
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v
i
i
a
a
t
t
u
u
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a
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s
s
As questões realmente importantes
sucumbem diante da riqueza da
natureza. Hei de celebrar a
múltipla variedade da natureza e
deixar a quimera da certeza para os
políticos e os pregadores.
Stephen J. Gould
em “Darwin e os grandes
enigmas da vida”
A/Sn: linhagem de camundongo resistente
Asp: ácido aspártico
B10.A: linhagem de camundongo susceptível
BHI: brain heart infusion
C5: quinto componente do sistema complemento
Con-A: Concanavalina A
CRD: domínio de reconhecimento de carboidrato
CTLA-4: cytotoxic T lymphocyte antigen 4
CXCR: receptor de quimiocinas CXC
GKO: camundongo geneticamente deficiente de IFN-!
Gly: glicina
GMC-SF: fator estimulador de colônias de monócitos e granulócitos
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
IFN: interferon
Ig: imunoglobulina
IL: interleucina
IL-12
-/-
: camundongo geneticamente deficiente de IL-12
KM
+
: lectina ligante de manose de sementes de jaca
MHC: complexo principal de histocompatibilidade
MyD88: fator 88 de diferenciação mielóide
MyD88
-/-
: camundongo geneticamente deficiente de MyD88
NO: óxido nítrico
NOS2
-/-
: camundongo deficiente de óxido nítrico sintase 2
PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida
PBS: solução salina tamponada com fosfato
PCM: paracoccidioidomicose
RIP: proteínas ribossomo-inativantes
RPMI: meio de cultura para células
SDS: duodecil sulfato de sódio
TGF-": fator de crescimento e transformação "
Th: linfócito T auxiliar (helper)
TLR: receptores do tipo Toll
TNF: fator de necrose tumoral
UFC: unidades formadoras de colônias
WT: animal selvagem (wild type)
ÍNDICE
RESUMO ............................................................................................................................01
ABSTRACT ........................................................................................................................03
RESUMEN..........................................................................................................................05
INTRODUÇÃO...................................................................................................................07
1. A Paracoccidioidomicose ........................................................................................08
1.1. Aspectos gerais.................................................................................................08
1.2. Repercussões da interação entre P. brasiliensis e o hospedeiro.......................11
2. Lectinas...................................................................................................................... 20
2.1. Lectinas de plantas ...........................................................................................22
2.2. As lectinas de sementes de Artocarpus heterophyllus......................................23
2.3. Propriedade imunomoduladora da lectina KM
+
...............................................28
OBJETIVOS........................................................................................................................30
MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................32
1. Obtenção da lectina KM
+
..........................................................................................33
2. Animais......................................................................................................................34
3. Cultivo de P. brasiliensis ..........................................................................................35
4. Administração de KM
+
e infecção de camundongos com leveduras de
P. brasiliensis............................................................................................................35
4.1. Administração de KM
+
ou veículo ...................................................................35
4.2. Infecção dos camundongos com leveduras de P. brasiliensis..........................37
5. Histopatologia das lesões formadas no tecido pulmonar...........................................38
6. Recuperação de leveduras dos pulmões e do fígado dos camundongos infectados ..38
7.Quantificação da produção de citocinas.....................................................................39
7.1. Dosagem de TNF-#..........................................................................................39
7.2. Dosagem de IL-4, IL-10, IL-12p70 (molécula bioativa) e IFN-!.....................39
8. Quantificação da produção de NO.............................................................................40
9. Obtenção e plaqueamento de macrófagos do baço....................................................40
10. Análise estatística ....................................................................................................41
RESULTADOS ...................................................................................................................42
Parte 1. Determinação do efeito protetor da lectina KM
+
administrada
profilática ou terapeuticamente em camundongos infectados com P. brasiliensis
$
Análise do regime de tratamento....................................................................................43
1. Análise histológica ....................................................................................................43
2. Determinação de UFC (Recuperação de leveduras)..................................................47
Parte 2. O efeito protetor da lectina KM
+
na PCM experimental é decorrente
de sua capacidade de induzir imunomodulação..................................................................49
1. Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou
após a inoculação não apresentam comprometimento do tecido pulmonar ............49
2. Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou
após a inoculação apresentam baixa carga fúngica nos pulmões..............................52
3. Produção de óxido nítrico é observada em camundongos infectados com
P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou após a inoculação...............................52
4. Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou
após a inoculação apresentam produção de citocinas pró-inflamatórias.......................53
4.1. Produção de IL-12p70 ......................................................................................53
4.2. Produção de IL-10 ............................................................................................54
4.3. Produção de IFN-! e IL-4.................................................................................54
4.4. Produção de TNF-#%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%55
Parte 3. A IL-12 é essencial para o efeito protetor da lectina KM
+
na PCM
experimental, sendo sua produção por macrófagos murinos decorrente de
sinalização dependente de MyD88......................................................................................59
DISCUSSÃO.......................................................................................................................66
CONCLUSÕES...................................................................................................................80
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................82
ANEXO ...............................................................................................................................101
R
R
e
e
s
s
u
u
m
m
o
o
A luz passa, mas animadoramente,
antes de passar, ela nos dá tempo
para compreender um pouco este
lugar em que efemeramente nos
encontramos. Somos os únicos
dentre os animais a prever o nosso
fim, Somos também os únicos
dentre os animais a poder dizer
antes de morrer: “Sim, é por isso
que valeu a pena viver”.
Richard Dawkins
Resumo
2
Demonstrou-se previamente que KM
+
, uma lectina ligante de manose de sementes de
jaca (Artocarpus heterophyllus), induz a produção de interleucina (IL) -12 por macrófagos, o
que propicia o desenvolvimento de uma resposta imunitária do tipo T helper (Th)1 e protege
contra Leishmania major. Devido à resistência a infecção por Paracoccidioides brasiliensis
ser altamente correlacionada com a indução de resposta Th1, no presente estudo objetivamos
determinar o efeito profilático e terapêutico de KM
+
extraído de planta (jfKM
+
), bem como do
recombinante dessa lectina (rKM
+
), no curso da paracoccidioidomicose experimental. Nesse
sentido, jfKM
+
ou rKM
+
foi administrada profilaticamente em camundongos BALB/c, 10 e 3
dias antes da infecção, ou terapeuticamente, 10 dias após a infecção com P. brasiliensis. Nos
dias 14 e 30 pós-infecção, pulmões dos camundongos tratados com KM
+
apresentaram um
número de unidades formadoras de colônias 86% menor que a do grupo controle e ausência
ou poucos granulomas bem organizados. Além disso, macerados dos pulmões dos
camundongos tratados com KM
+
apresentaram maiores níveis de óxido nítrico, IL-12,
interferon-! e fator de necrose tumoral-#, enquanto nos grupos controles foram detectados
altos níveis de IL-4 e IL-10. A fim de estudarmos o papel imunomodulador de KM
+
, usamos
camundongos que eram deficientes de IL-12 e MyD88. Camundongos deficientes de IL-12
infectados com P. brasiliensis, quando tratados com KM
+
, mantinham padrões de gravidade
da infecção similares aos animais WT não vacinados. Além disso, KM
+
não foi capaz de
induzir a produção de IL-12 por macrófagos de animais deficientes de MyD88. Assim,
mostramos que KM
+
induz a proteção contra a infecção por P. brasiliensis por um mecanismo
dependente da produção de IL-12, que é dependente da sinalização via receptores do tipo
Toll. Esses resultados indicam que a profilaxia e terapia com jfKM
+
ou rKM
+
induzem
resposta imune do padrão Th1 contra P. brasiliensis, o que leva a um efeito benéfico na
gravidade da infecção. A proteção mostrada pela terapia com KM
+
expande seu potencial
como uma nova molécula imunoterapêutica.
A
A
b
b
s
s
t
t
r
r
a
a
c
c
t
t
Em algum lugar, alguma coisa
incrível está esperando para ser
conhecida.
Carl Sagan
Abstract
4
It has previously been shown that KM
+
, a mannose-binding lectin from jackfruit
(Artocarpus heterophyllus) seeds, induces interleukin (IL)-12 production by macrophages,
leading to a protective T helper (Th) 1 immune response against Leishmania major. Because
resistance to Paracoccidioides brasiliensis infection has been highly correlated with the
induction of Th1 immune response, in the present study we determined the prophylactic and
therapeutic effect of the jackfruit KM
+
(jfKM
+
) and recombinant (rKM
+
) in the course of
experimental paracoccidioidomycosis. To this end, jfKM
+
or rKM
+
was administered to
BALB/c mice either 10 or 3 days before or 10 days after the challenge with P. brasiliensis.
Fourteen and 30 days postinfection, lungs from KM
+
-treated mice presented 86% less colony-
forming units and absence or very few organized granulomas when compared to the controls.
In addition, lung homogenates from KM
+
-treated mice presented higher levels of nitric oxide,
IL-12, interferon-!& and tumor necrosis factor-#, whereas in the control group higher levels of
IL-4 and IL-10 were detected. By using IL-12 and MyD88-deficient mice we undeniably
demonstrated that the mechanism by which KM
+
lead to protection against P. brasiliensis
infection is due to IL-12 production, which is dependent on Toll-like receptor signalling.
These results indicate that prophylaxis or therapy with jfKM
+
or rKM
+
induces a Th1-biased
immune response against P. brasiliensis, leading to a beneficial effect on the infection
severity. The protection provided by KM
+
therapy further expands its potential use as a novel
immunotherapeutic molecule.
R
R
e
e
s
s
u
u
m
m
e
e
n
n
Ciência é uma aventura
imaginativa da mente buscando a
verdade num mundo de mistérios.
Cyril H. Hinshelwood
Resumen
6
KM
+
es una lectina especifica para manosa extraída de semillas de jaca (Artocarpus
heterophyllus), que induce la producción de interleucina (IL)-12 por los macrófagos,
conduciendo al desarollo de una respuesta inmune del tipo T helper (Th) 1, efectiva para
controlar la infección con
Leishmania major. Debido a la resistencia a infección con
Paracoccidioides brasiliensis ser correlacionada altamente con la inducción de la respuesta
Th1, el presente estudio tiene como objetivo determinar el efecto profiláctico y terapéutico de
KM
+
de jaca (jfKM
+
) y su recombinante (rKM
+
) en el curso de la paracoccidioidomicosis
experimental. Con este fin, jfKM
+
o rKM
+
fue administrado profilacticamente a ratones
BALB/c 10 y 3 días antes de la infección o de manera terapeútica 10 días después del desafío
con P. brasiliensis. A los 14 y 30 días postinfección, los pulmones de los ratones tratados con
KM
+
presentaron 86% menos unidades formadoras de colonias y ausencia o muy pocos
granulomas organizados al ser comparados con los controles. Además, los macerados de los
pulmones de los ratones tratados con KM
+
presentaron niveles altos de óxido nítrico, IL-12,
interferón-! y factor necrosante tumoral-#, mientras que en grupos controles habían sido
detectados niveles altos de IL-4 y de IL-10. Para estudiar el papel inmunomodulador de KM
+
,
utilizamos ratones deficientes de IL-12 y de MyD88. Ratones deficientes de IL-12 infectados
con P. brasiliensis, cuando son tratados con KM
+
mantuvieron un patrón de gravedad de la
infección similar a los animales WT no tratados. Por otra parte, KM
+
no fue capaz de inducir
la producción de IL-12 por los macrófagos de animales deficientes de MyD88. Así,
demostramos que KM
+
induce la protección contra la infección con P. brasiliensis por un
mecanismo dependiente de la producción de IL-12, que por su vez, es dependiente de la
señalización via receptores del tipo Toll. Estos resultados indican que la profilaxis y la terapia
con jfKM
+
o rKM
+
inducen una respuesta inmune del patrón Th1 contra P. brasiliensis,
conduciendo a un efecto beneficioso en la gravedad de la infección. La protección demostrada
por la terapia con KM
+
amplía su potencial como una nueva molécula inmunoterapéutica.
I
I
n
n
t
t
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o
o
d
d
u
u
ç
ç
ã
ã
o
o
Existem muitas hipóteses na
ciência que são erradas. Isso é
perfeitamente correto, elas são a
abertura para descobrir o que é
certo. A ciência é um processo
auto-corretivo. Para serem aceitas,
novas idéias devem sobreviver aos
mais rigorosos padrões de
evidência e escrutínio.
Carl Sagan
Introdução
8
1. A Paracoccidioidomicose
1.1. Aspectos gerais
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo
dimórfico, autóctone da América Latina, Paracoccidioides brasiliensis (ALMEIDA, 1930;
SAN-BLAS, 1993). Dentre as micoses profundas, a PCM é a mais prevalente da América
Latina (RESTREPO; GREER; VASCONCELLOS, 1973), sendo sua maior incidência
registrada no Brasil, Argentina, Colômbia e Venezuela. O Brasil corresponde ao país com
maior número de áreas endêmicas, abrigando 85% de todos os casos relatados de PCM, com
prevalência nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste (RESTREPO, 1985). A notificação da
PCM no Brasil, bem como em outros países latino-americanos, não é obrigatória e, além
disso, não há um programa de controle específico da doença. Dessa maneira, os relatos de
PCM como possível causa de morte têm sido subestimados em relação ao número real de
casos, o que dificulta a formação de uma base de dados que contenha a real incidência e
prevalência da infecção fúngica (DEEPE, 2004; SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). Em
estudo relativo à mortalidade por PCM no Brasil durante um período de 15 anos, Coutinho et
al. (2002) demonstraram que essa micose corresponde à oitava causa de mortalidade entre as
infecções crônicas ou recorrentes e as doenças parasitárias, com uma taxa de mortalidade
superior à relatada para leishmaniose. Ademais, a PCM foi descrita como a micose sistêmica
com a maior taxa de mortalidade no Brasil, com média anual correspondente a 1,45 por
milhão de habitantes. Esta doença acomete principalmente indivíduos do sexo masculino
numa razão que varia entre 10 a 15 homens para cada mulher, com maior freqüência na faixa
etária de 30 a 60 anos de idade, tornando-os muitas vezes incapacitados para o trabalho
(SHIKANAI-YASUDA et al., 2006). A baixa incidência de PCM em mulheres é atribuída
principalmente aos níveis aumentados de estrógenos, que bloqueiam a transformação das
formas infectantes, os fragmentos miceliares ou os conídios, em formas de resistência do
Introdução
9
fungo, as leveduras, e conseqüentemente propiciam ao hospedeiro condições de destruir o
fungo (ARISTIZABAL et al., 1998; KUROKAWA; SUGISAKI; PERAÇOLI, 1998).
O primeiro relato da doença humana foi feito por Lutz (1908 apud NEGRONI, 1993),
que detectou o fungo em lesões da mucosa oral de dois pacientes. Estudos posteriores
permitiram a classificação do fungo que foi denominado Paracoccidioides brasiliensis
(ALMEIDA, 1930). P. brasiliensis é um fungo assexuado e dimórfico que cresce na forma
filamentosa a 25'C e na forma de levedura a 37'C; é encontrado na natureza em determinados
nichos ecológicos (RESTREPO; GREER; VASCONCELLOS, 1973), a partir dos quais o
homem inala os micélios ou conídios (KUROKAWA; SUGISAKI; PERAÇOLI, 1998;
SEVERO et al., 1979). A introdução pode se dar nas mucosas ou na derme (PROENÇA;
MARTINS DE CASTRO: ALONSO, 1981), devido à ocorrência de ferimentos e de outras
situações menos comuns (CASTRO; CUCÉ; FAVA-NETTO, 1975; GONZÁLES-OCHOA,
1972). A principal porta de entrada do fungo no hospedeiro envolve as vias aéreas
(GONZÁLES-OCHOA, 1972), com instalação nos alvéolos pulmonares (SEVERO et al.,
1979). Assim, o estabelecimento da doença, com lesões primárias freqüentes nos pulmões,
marca a transformação do fungo da forma miceliar (infectante) em forma de levedura
(patogênica) (SAN BLAS; SAN BLAS, 1985). A conversão da forma miceliar à forma de
levedura reflete um efeito adaptativo para o aumento de resistência do microorganismo
necessário para a sua sobrevivência no hospedeiro mamífero (DA SILVA; BORBA; DE
OLIVEIRA, 1994).
Considera-se que as manifestações clínicas da PCM sejam decorrentes da progressão
de lesões primárias, pela reativação de focos quiescentes após um período de latência
(reativação endógena), ou pela re-infecção exógena após exposição ao fungo
(MONTENEGRO; FRANCO, 1994). Na dependência de fatores relacionados ao hospedeiro,
como susceptibilidade genética à infecção e estado imunitário (ROBLEDO et al., 1982), e
Introdução
10
relacionados ao fungo, como virulência e patogenicidade (SAN-BLAS; SAN-BLAS, 1977), a
infecção pode regredir com a destruição ou persistência de fungos viáveis em focos
quiescentes ou ainda progredir com o desenvolvimento de lesões ativas, proliferação e
disseminação do fungo (FRANCO et al., 1987; MONTENEGRO; FRANCO, 1994).
Inicialmente, a doença envolve os pulmões, onde são formados os granulomas
responsáveis pelo controle da disseminação do fungo para outros órgãos (DE BRITO;
FRANCO, 1994; FRANCO, 1993).
Há duas principais formas clínicas na PCM (BRUMMER; CASTANEDA;
RESTREPO 1993; MONTENEGRO; FRANCO, 1994): forma crônica (tipo adulto) e forma
aguda ou subaguda (tipo juvenil). A forma crônica da PCM ocorre em mais de 90% dos casos
e acomete principalmente homens adultos, apresenta uma progressão lenta, podendo levar
meses a anos para o completo desenvolvimento. Essa forma clínica parece ser conseqüência
da reativação de focos primários quiescentes após um período de latência de P. brasiliensis
(MENDES, 1994; PERAÇOLI; MOTA; MONTENEGRO, 1982). A forma crônica afeta
primeiramente os pulmões, causando um prejuízo funcional no órgão. A doença pode
subseqüentemente disseminar para outros órgãos e tecidos, formando lesões secundárias nas
membranas mucosas, pele, linfonodos e glândulas adrenais. Nos pacientes que não
apresentam comprometimento da resposta imunitária a doença é menos grave, com lesões
localizadas ou envolvendo mais de um órgão, caracterizada pela formação de granulomas
epitelióides compactos circunscrevendo os fungos (FRANCO, 1993; MENDES, 1994, 1997).
Em contraste, a forma aguda de PCM, é caracterizada pela gravidade, com uma significante
taxa de mortalidade, rápida progressão (desenvolve-se em semanas a meses), e tendência à
disseminação linfática e hematogênica com grande quantidade de fungos originando lesões
secundárias e viscerais, principalmente no baço, fígado e medula óssea. O acometimento
Introdução
11
pulmonar é raro, ocorrendo em 5 a 11% dos pacientes (FRANCO et al., 1987; MENDES,
1994; SIDRIM; ROCHA, 2004).
Para o desenvolvimento da doença, dois aspectos são importantes: (1) a transformação
do fungo de hifa para levedura, mudança que, como anteriormente referida, é responsável
pelo estabelecimento do processo infeccioso (CARBONELL; RODRÏGUEZ, 1965) e (2) a
interação inicial da levedura com o sistema imunitário do hospedeiro, relação que determina a
destruição ou manutenção das formas iniciais infectantes. Nessa interação, diferentes
populações celulares estão envolvidas e são ativadas no sentido de desempenharem papel
efetor direto contra o fungo ou de participarem dos mecanismos imunomodulatórios
desencadeados após o hospedeiro ser infectado (PERAÇOLI; SOARES, 1992).
1.2. Repercussões da interação entre P. brasiliensis e o hospedeiro
As maiores características da resposta imunitária são a interdependência dos vários
componentes do sistema imune e a interação entre os mecanismos patogênicos do fungo e de
defesa do hospedeiro. Alguns estudos demonstraram que células fagocíticas, fundamentais
para integrar imunidade inata e adaptativa, são capazes de reconhecer patógenos através de
receptores que se ligam a padrões moleculares conservados, que em fungos são
principalmente "-glucana, manana e quitina. Dentre esses receptores, os mais estudados
atualmente são os receptores do tipo Toll (TLR) e receptores com propriedade lectínica, sendo
essas as principais classes de receptores que contribuem para o reconhecimento inicial do
patógeno (AKIRA; TAKEDA; KAISHO, 2001; LEVITZ, 2004; NETEA, VAN DER MEER;
KULLBERG, 2006; SHOHAM; LEVITZ, 2005).
Os primeiros estudos histopatológicos da PCM já eram sugestivos de que as interações
iniciais entre P. brasiliensis e o hospedeiro são estabelecidas através de células fagocíticas.
Infecções experimentais mostraram que a primeira resposta do animal frente a P. brasiliensis
Introdução
12
é um acúmulo de neutrófilos nos locais onde se localizam as células fúngicas (BEDOYA et
al., 1986; IABUKI; MONTENEGRO, 1979; McEVEN et al., 1987). Células mononucleares,
por sua vez, foram muito cedo identificadas como participantes da reação granulomatosa na
PCM (KERR et al., 1988).
A importância dos fagócitos no controle da infecção foi experimentalmente
evidenciada a partir da identificação e utilização de linhagens de camundongos resistente
A/Sn e susceptível B10.A à infecção por P. brasiliensis. Os camundongos A/Sn apresentam
intenso infiltrado de neutrófilos e macrófagos em áreas de destruição maciça de fungos. Já os
camundongos B10.A apresentam lesões múltiplas, com pequeno encapsulamento e sem
evidência de destruição fúngica (XIDIEH et al., 1997).
A ativação da via alternativa do sistema complemento, levando à opsonização das
leveduras, foi responsabilizada pela facilitação do contato entre leveduras e fagócitos
(CALICH et al., 1985; SHIKANAI-YASUDA et al., 1997). Entretanto, há que se considerar
que componentes do próprio fungo possam promover a adesão inicial e a internalização da
levedura por células fagocíticas, como descrito para a gp43 (ALMEIDA, UNTERKIRCHER;
CAMARGO, 1998). O fato de camundongos deficientes de C5 serem tão susceptíveis à
infecção por P. brasiliensis quanto camundongos não deficientes (CALICH, 1985) sugere que
a resistência e a susceptibilidade à infecção não é dependente da formação do complexo de
ataque à membrana do sistema complemento.
Os componentes metabólicos e somáticos do fungo, assim como os constituintes de
parede celular são capazes de ativar o sistema complemento e de estimular o burst respiratório
e a quimiotaxia de neutrófilos, os quais participam da imunidade inata durante a PCM
(CALICH; PURCHIO; PAULA, 1979; CROTT et al., 1993; PINA et al., 2006). De fato, tais
células estão presentes nos sítios inflamatórios durante estágios iniciais da doença bem como
nos granulomas desenvolvidos em humanos e animais de experimentação (GONZALEZ et
Introdução
13
al., 2003). Neutrófilos humanos exercem uma importante atividade fungistática e fungicida
sobre leveduras de P. brasiliensis, efeito este que é potencializado por IFN-! e pode contribuir
para a resistência do hospedeiro na fase inicial da infecção por P. brasiliensis (KURITA et
al., 2000).
O sistema mononuclear fagocitário tem sua importância na PCM evidenciada
experimentalmente por bloqueio funcional de macrófagos com a administração de sílica
(KERR et al., 1983) ou de carbono coloidal (KASHINO et al., 1995). O bloqueio resultou em
maior gravidade da doença, multiplicação descontrolada das leveduras e diversas alterações
da resposta imunitária.
Brummer et al. (1989) observaram que macrófagos murinos residentes fagocitam
leveduras de P. brasiliensis e são permissivos quanto à multiplicação fúngica intracelular,
enquanto que macrófagos murinos ativados restringem a multiplicação e matam as leveduras
ingeridas. Em macrófagos não ativados, as leveduras permanecem estruturalmente intactas no
fagossomo, enquanto em macrófagos ativados elas sofrem perda da integridade de
mitocôndrias, seguida de formação de vacúolos, desintegração do citoplasma e
desenvolvimento de células vazias de parede intacta (BRUMMER et al., 1990).
A participação de IFN-! nesse fenômeno, (MOSCARDI-BACCHI; BRUMMER;
STEVENS, 1994; revisto por BORGES-WALMSLEY et al., 2002) foi avaliada in vitro
através da infecção de macrófagos humanos tratados com a citocina recombinante ou com o
sobrenadante de cultura de células mononucleares estimuladas com Con-A. A multiplicação
de leveduras de P. brasiliensis foi inibida em 65% e 95%, respectivamente, inibição que foi
revertida em presença de anticorpos contra IFN-! (MOSCARDI-BACCHI; BRUMMER;
STEVENS, 1994).
A atividade fungicida de macrófagos, otimizada pela ativação com IFN-!, tem sido
atribuída à produção de óxido nítrico (NO) pela enzima NO sintase induzível. A indução
Introdução
14
dessa enzima parece ser decorrente não somente da ação sinérgica de citocinas Th1, como
IFN-! e TNF-#, mas também de produtos liberados pelo próprio agente patogênico. Atribui-
se ao NO um papel essencial no controle da disseminação fúngica, por associar-se à atividade
fungicida de macrófagos (NASCIMENTO et al., 2002). Paradoxalmente, NO também está
envolvido na regulação negativa da resposta contra o patógeno. Há indicações de que a
produção alta e persistente de NO inibe a produção de TNF-#, citocina chave na formação do
granuloma por atrair e ativar macrófagos, que são acumulados localmente e se diferenciam
em células epitelióides (TRACEY; CERAMI, 1993). Menores níveis de TNF-# favorecem o
agravamento das lesões pulmonares (NASCIMENTO et al., 2002), enquanto a produção de
TNF-# por macrófagos associa-se a resistência à infecção por P. brasiliensis (CALVI et al.,
2003). Camundongos geneticamente deficientes do receptor para TNF-# são altamente
susceptíveis à infecção por P. brasiliensis (SOUTO et al., 2000).
Além de interferir nos níveis de TNF-#, a produção exacerbada de NO por macrófagos
ativados na PCM experimental se correlaciona com a menor expressão de moléculas de MHC
de classe II por essas células, além da supressão da linfoproliferação estimulada por antígenos
fúngicos e por mitógenos (BOCCA et al, 1998 e 1999). A reversão desses fenômenos foi
obtida pelo tratamento dos animais com N(-nitro-L-arginina, um inibidor da síntese de NO.
A resposta imunitária humoral não desempenha um papel principal na defesa contra P.
brasiliensis. Tanto pacientes com PCM aguda como camundongos susceptíveis infectados
produzem anticorpos específicos em níveis altos, os quais se correlacionam diretamente com a
gravidade da doença (BENARD et al., 1997; CALICH; KASHINO, 1998; revisto por
BORGES-WALMSLEY et al., 2002). Pacientes com a forma aguda ou subaguda da doença
apresentam um padrão de resposta imune de tipo Th2, associado à depressão da resposta
imune celular, que é muito acentuada nessa forma da doença (BENARD et al., 2001). A
ativação policlonal de linfócitos B é fenômeno característico na infecção por P. brasiliensis,
Introdução
15
dessa maneira, considera-se que o título de anticorpos específicos seja um parâmetro útil para
avaliar o diagnóstico da doença e orientar sua terapêutica, já que há uma queda no título
desses anticorpos com o tratamento da PCM.
Uma característica do estado imunitário de indivíduos infectados por P. brasiliensis é
a depressão da resposta celular mediada por células T (JIMENEZ-FINKEL; MURPHY, 1988;
PERAÇOLI; MOTA; MONTENEGRO, 1982). Pacientes com PCM apresentam depressão da
resposta linfoproliferativa tanto a mitógenos como a antígenos de P. brasiliensis (BENARD et
al., 1996; 1997; BOCCA et al, 1998 e 1999; CAMPANELLI et al., 2003). Essa disfunção
imunológica tem sido atribuída a diversos mecanismos, tais como: a produção de óxido
nítrico (BOCCA et al, 1998; NASCIMENTO et al., 2002; SOUTO et al., 2000), distúrbios na
produção de citocinas por células T (BENARD et al., 2001), presença de antígenos solúveis
de P. brasiliensis (JIMENEZ-FINKEL; MURPHY, 1988), aumento da sinalização inibitória
via CTLA-4, bem como aumento da apoptose em células recém isoladas ou cultivadas com
antígenos de P. brasiliensis (CACERE et al., 2002; CAMPANELLI et al., 2003), presença de
complexos imunes circulantes e de populações de células supressoras (ARANGO;
YARZABAL, 1982; MOTA et al., 1985; MUSATTI et al., 1976; RESTREPO et al., 1978;
SUGIZAKI et al., 1999) e elevados níveis séricos de TGF-" em amostras de pacientes com
PCM (MAMONI et al., 2002; MAMONI; BLOTTA, 2005).
Em 1971, Mendes et al. já assinalavam a existência de depressão generalizada da
resposta imunitária celular em pacientes com PCM. A importância das células T na PCM foi
inicialmente sugerida por sua presença na periferia do granuloma, repetidamente demonstrada
tanto na PCM humana (MOSCARDI-BACCHI et al., 1989) como na infecção experimental
(DEFAVERI; MARTIN; FRANCO, 1989 e DEFAVERI, 1996). A correlação positiva entre
gravidade da forma clínica e o nível de imunossupressão foi ressaltada por Mota et al. (1985).
Introdução
16
A integridade do compartimento de células T é considerada essencial para o controle
da PCM sistêmica, sendo fundamentado em observações como as realizadas por Burger et al.
(1996), ao infectarem camundongos atímicos e eutímicos com P. brasiliensis. Os
camundongos atímicos infectados com o isolado virulento (Pb18) desenvolveram doença mais
grave e disseminada, com clara diminuição da sobrevida.
Visando ampliar as formas de acesso à resposta celular na PCM, Benard et al. (1995)
padronizaram ensaios de proliferação de linfócitos frente a antígenos de P. brasiliensis,
utilizando células de indivíduos sadios, sensibilizados ou não para antígenos do fungo. As
células dos indivíduos sensibilizados reagiram vigorosamente através de proliferação,
ativando principalmente linfócitos T CD4+. Em estudo posterior (BENARD et al., 1996), a
resposta proliferativa de células mononucleares do sangue periférico de doentes com PCM,
frente a antígenos de P. brasiliensis ou a outros estímulos foi avaliada, constatando-se
hiporresponsividade, que foi mais marcada em pacientes com forma aguda do que crônica da
doença. Após a cura clínica, a resposta proliferativa específica aumentou. A avaliação da
linfoproliferação frente a dois antígenos purificados de P. brasiliensis, gp43 e gp70, resultou
em baixas respostas por células de pacientes com PCM. Respostas melhores, mas ainda
baixas, foram provocadas por estímulos não específicos. Nos mesmos pacientes, foram
detectados altos níveis de anticorpos séricos contra gp43 e gp70, reforçando a idéia de que um
padrão Th2 de resposta predomine na PCM, associado à incapacidade do sistema imunitário
de controlar a infecção (BENARD, 1997). Por outro lado, a adição de IL-12 e anticorpos
contra IL-10 a culturas de células mononucleares do sangue periférico de pacientes com
PCM, leva a um aumento na síntese de IFN-! e na proliferação celular frente à gp43,
modificando o padrão de hiporresponsividade imunitária (ROMANO et al., 2002).
Embora haja no hospedeiro humano uma complexidade de mecanismos moduladores e
de fatores externos que interferem com o estabelecimento e desenvolvimento da PCM,
Introdução
17
estudos bem definidos em modelos experimentais têm mostrado uma correlação entre o
padrão de resposta imune celular Th1 e menor gravidade da doença (ROBLEDO et al., 1982;
CANO et al., 1998; KASHINO et al., 2000; PINA et al., 2004).
Respostas de tipo Th2, associadas a formas progressivas de PCM, ou Th1, associadas
a formas benignas da doença, dependem fundamentalmente do padrão de citocinas secretadas
pelas células do sistema imune.
Modelo experimental de infecção por P. brasiliensis em camundongos susceptíveis
(B10/A) e resistentes (A/Sn) contribuiu para uma melhor compreensão do papel
imunomodulador das citocinas na PCM (revisto por CALICH; KASHINO, 1998).
Macrófagos de animais susceptíveis secretam altos níveis de TGF-" e baixos níveis de TNF-
#, verificando-se ainda, produções baixas de IFN-! e altas de IL-5 e IL-10. Já nos
camundongos resistentes, constatou-se perfil oposto de secreção de citocinas acompanhado
das produções precoce de IFN-! e IL-2, e tardia de IL-4 e IL-5. Assim, reforça-se a idéia de
que a resistência à infecção por P. brasiliensis esteja associada à secreção de altos níveis de
TNF-# e IFN-!, seguida de produção contínua de IL-2 e IFN-!. Por outro lado, a liberação
pequena e efêmera de TNF-# e IFN-!, associada à produção de IL-5, IL-10 e TGF-", corre
em formas progressivas da PCM, como a que acomete os animais susceptíveis. Vários estudos
têm demonstrado a participação de TNF-# e IFN-! no desenvolvimento de uma resposta
imunitária protetora à infecção experimental por P. brasiliensis (CALVI et al., 2003; CANO
et al., 1998; SOUTO et al., 2000). Cano et al. (1998) observaram que tanto camundongos
resistentes, como os susceptíveis, após serem submetidos à depleção endógena de IFN-! por
anticorpos monoclonais, apresentaram granulomas coalescentes com destruição da arquitetura
pulmonar. Essa observação indica que, independentemente da linhagem utilizada, IFN-!
favorece uma resposta protetora, correspondendo a um dos principais mediadores na
resistência contra a infecção por P. brasiliensis. Souto et al. (2000), verificaram que animais
Introdução
18
geneticamente deficientes de IFN-! (GKO) e infectados com P. brasiliensis sucumbem à
infecção em 15 dias.
Assim como demonstrado em modelos experimentais, pacientes com uma forma
disseminada de PCM apresentam altos níveis de IL-4, IL-5, IL-10, TGF-", e baixos níveis de
IFN-!, quando comparados aos pacientes com uma forma moderada da doença (BAIDA et al.,
1999; BENARD et al., 2001; MAMONI et al., 2002; MAMONI; BLOTTA, 2005;
OLIVEIRA et al., 2002). Diferentemente, indivíduos que vivem em áreas endêmicas e não
desenvolvem a doença, embora apresentem reatividade aos antígenos de P. brasiliensis,
apresentam resposta imunitária típica de padrão Th1, com produção predominante de IFN-! e
TNF-#, e níveis basais de IL-4, IL-5 e IL-10 (OLIVEIRA et al., 2002).
Uma vez que a resistência do hospedeiro ao fungo depende tanto da efetiva indução da
imunidade celular, mediada por células T, no sítio inicial da infecção - os pulmões, como da
secreção de citocinas de padrão Th1 e fagócitos efetores (OLIVEIRA et al., 2002; ROMANI,
2004), propostas de utilização de terapias imunológicas têm surgido como atraentes
estratégias para aumentar a resistência à infecção fúngica e prevenir a resistência aos
antifúngicos.
Até o momento, não foi possível obter um antifúngico que reúna amplo espectro de
ação, baixa toxicidade e mecanismo de ação distinto dos compostos atualmente disponíveis
para o tratamento das infecções fúngicas (GHANNOUM; RICE, 1999; SANGLARD, 2002).
É válido ressaltar que um número variado de fármacos considerados eficazes está disponível
no tratamento da PCM, porém a significativa toxicidade aliada a eles e o período prolongado
de tratamento associado a um custo elevado, são fatores limitantes de sua utilização clínica,
levando à falta de adesão ao tratamento, que é a principal causa da cura clínica não ocorrer em
aproximadamente 30% dos pacientes ou de ser seguida da reativação da doença (GIROIS et
al., 2005; MARQUES, 2003).
Introdução
19
Nos últimos vinte anos, muitos antifúngicos de atividade específica foram licenciados
para serem utilizados em humanos, todavia, eles se enquadram em relativamente poucas
classes químicas, interferem em um limitado número de componentes celulares nos fungos
sensíveis ou ainda, apresentam um mecanismo de ação vagamente conhecido (MARQUES,
2003; WU et al., 2004).
Em síntese, qualquer que seja o tratamento, existem pacientes que apresentam recaídas
ou recidivas, outros exigem tratamento antifúngico permanente como condição sine qua non
para não manifestarem clinicamente a PCM, pois apresentam comprometimento da resposta
imunitária e, portanto não são capazes de controlar a infecção por P. brasiliensis.
Assim sendo, embora muitos progressos concernentes ao desenvolvimento de
antifúngicos tenham sido alcançados, esforços no sentido de identificar moléculas capazes de
aumentar e/ou melhorar a resposta imunitária de pacientes contra as doenças fúngicas
invasivas vêm se tornando cada vez mais patentes.
Um crescente número de trabalhos vem mostrando que a eficácia terapêutica dos
antifúngicos é limitada sem a ajuda da resposta imunitária do hospedeiro (STEVENS, et al.,
2000). Nos últimos anos, os efeitos benéficos das terapias com citocinas, fatores de
crescimento, anticorpos anticitocinas e células dendríticas nas infecções fúngicas
experimentais e humanas foram demonstrados (JORGENSEN et al., 1999; ROMANI, 2004;
ROMANO et al., 2002; STEVENS; BRUMMER; CLEMONS, 2006).
A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode
assumir, à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade, e ainda, à falta de vacinas
aprovadas para a prevenção ou o tratamento das infecções fúngicas de importância médica
(DEEPE, 2004), justificam o elevado grau de interesse no estudo de novos compostos capazes
de modular a resposta imunitária do hospedeiro, e com isso, aumentar a eficácia do tratamento
com os antifúngicos correntes.
Introdução
20
2. Lectinas
Lectinas são proteínas que possuem ao menos um domínio não catalítico que se liga
reversível e especificamente a monossacarídeo ou oligossacarídeo (PEUMANS; VAN
DAMME, 1995), sendo estruturalmente distintas dos anticorpos (LIS; SHARON, 1998). A
história dessas moléculas (revista por GABIUS, H.-J.; GABIUS, S., 1997; RÜDIGER et al.,
2000) se iniciou em 1888 com a primeira descrição de uma atividade lectínica feita por
Stillmark, ao estudar a toxicidade de sementes de mamona (Ricinus communis). O
pesquisador obteve uma preparação que provocava a aglutinação de hemácias do sangue de
animais de diferentes espécies e o princípio ativo de ação tóxica foi denominado ricina.
Substâncias com atividade aglutinante foram descritas em muitas outras plantas, razão pela
qual Elfstrand (1898 apud GABIUS, H.-J.; GABIUS, S., 1997; RÜDIGER et al., 2000)
propôs que coletivamente deveriam ser denominadas hemaglutinina. Landsteiner e
Raubitsheck (1908 apud GABIUS, H.-J.; GABIUS, S., 1997; RÜDIGER et al., 2000)
mostraram que nem todas as hemaglutininas eram tóxicas e fizeram a primeira observação
sobre a seletividade das aglutininas vegetais, demonstrando que diferentes extratos de
sementes apresentavam variações quanto à propriedade aglutinante frente a eritrócitos de
diferentes espécies animais. Em 1936, Summer e Howell, após observarem que extratos de
sementes de Canavalia ensiformes aglutinavam eritrócitos de cavalo, purificaram e obtiveram
a forma cristalizada da hemaglutinina, a concanavalina A. Verificaram que o açúcar obtido da
cana inibia sua atividade hemaglutinante e sugeriram que a aglutinação induzida por
concanavalina A ocorresse por reação com carboidratos da superfície eritrocitária (apud
GABIUS, H.-J.; GABIUS, S., 1997; RÜDIGER et al., 2000). No final da década de 40,
Renkonnem (1948) e Boyd e Reguera (1949) verificaram que algumas aglutininas eram
específicas para diferentes grupos sanguíneos do sistema ABO. Com base nas descrições de
Introdução
21
seletividade para grupos sanguíneos, Boyd e Shapleigh (1954) sugeriram que a denominação
de hemaglutinina fosse substituída para lectina, do latim legere, que significa selecionar (apud
GABIUS, H.-J.; GABIUS, S., 1997; RÜDIGER et al., 2000).
Apesar das lectinas serem inicialmente identificadas em vegetais, hoje se sabe que elas
estão presentes em quase todos os seres vivos (LIS; SHARON, 1986; 1998; SHARON; LIS,
1989), de vírus e bactérias a plantas e animais. Nas últimas décadas, evidenciou-se a
participação das lectinas em uma variedade de processos biológicos, sendo a ligação seletiva a
glicanas da superfície de muitas células um dos fenômenos mais estudados. Essa ligação
modifica a fisiologia da membrana e/ou causa sinalização celular de maneira a causar
fenômenos como aglutinação, mitose ou outras respostas bioquímicas celulares (SHARON;
LIS, 2004).
Em relação à conformação estrutural, as lectinas vegetais podem ser monoméricas ou
compostas por duas ou mais subunidades idênticas ou diferentes. Embora haja uma enorme
diversidade de lectinas, dois aspectos de sua organização auxiliam na compreensão do papel
que exercem. O primeiro se refere ao fato de que a atividade ligante a açúcar é atribuível a
uma porção limitada da molécula, correspondendo tipicamente a um domínio globular de
reconhecimento de carboidrato (CRD) de menos de 200 aminoácidos. O segundo diz respeito
a que os CRDs de muitas lectinas relacionam-se entre si, quanto a seqüência de aminoácidos,
o que faz com que as lectinas conhecidas, em sua grande maioria, possam ser reunidas em um
número relativamente pequeno de grupos (revisto por WEIS; DRICKAMER, 1996).
Devido à complexidade e variabilidade estrutural, as glicanas da superfície celular
correspondem a alvos de reconhecimento (SHARON; LIS, 1993) para lectinas, que
decodificam a informação biológica contida nos açúcares. Tal interação, que é análoga a de
receptor-ligante, envolve lectina de superfície de célula oposta ou lectina solúvel. As lectinas,
em geral, são moléculas multivalentes e, assim, podem estabelecer pontes entre células e
Introdução
22
matriz extracelular, através do reconhecimento concomitante de glicanas contidas em ambas
as estruturas (SHARON; LIS, 1989).
2.1. Lectinas de plantas
A maioria das lectinas vegetais conhecidas, muitas das quais isoladas e caracterizadas,
é proveniente de sementes, ainda que muitas possam ser encontradas em outros tecidos
vegetais, em pequenas quantidades (ETZLER; KABAT, 1970; ETZLER; BORREBAECK,
1980; QUINN; ETZLER, 1987).
Atualmente as lectinas são classificadas em sete famílias relacionadas estrutural e
evolutivamente (VAN DAMME et al., 1998).
1) Lectinas de leguminosas - aproximadamente cem lectinas de leguminosas foram isoladas
de mais de setenta espécies diferentes, incluindo a lectina de lentilha (Lens culinaris),
lectina de ervilha (Pisum sativum), favina de Vicia faba, Phaseolus lunatus e outras;
2) Lectinas ligantes de quitina, com domínio heveína – chave que compreende todas as
proteínas contendo pelo menos um domínio heveína ligante de N-acetilglucosamina;
algumas das lectinas encontradas nesse grupo são a lectina de Hevea brasiliensis, a lectina
de batata (Solanum tuberosum) e a lectina de tomate (Lycopersicom esculentum);
3) Lectinas RIP do tipo 2 - um número limitado dessas proteínas ribossomo-inativantes tem
sido isolado e caracterizado. Nesse grupo, encontram-se as lectinas de Abrus precatorius,
de Viscum álbum e a ricina (Ricinus communis);
4) Lectinas ligantes de manose, de monocotiledôneas - inclui algumas lectinas como as de
orquídea (Listera ovata) e as de alho (Allium sativum);
5) Lectinas relacionadas à jacalina - nome coletivo para todas as lectinas relacionadas
estrutural e evolutivamente com as lectinas da jaca (Artocarpus heterophyllus). Inclui dois
subgrupos específicos: ligantes de N-acetil-D-galactosamina, incluindo a jacalina (A.
Introdução
23
heterophyllus) e a lectina de Maclura pomifera e ligantes de D-manose/maltose incluindo
a lectina KM
+
(A. heterophyllus), a lectina calsepa de Calystegia sepium e a da batata doce
(Ipomea batatas);
6) Lectinas da amarantina - nesse grupo encontram-se as lectinas de Amaranthus caudatus,
de A. spinosus, de A. cruentus e de A. leucocarpus;
7) Cucurbitaceae - inclui as lectinas encontradas na seiva de algumas espécies do gênero
Cucurbita, Luffa, Coccinia e outras.
Devido à diversificada especificidade de ligação com carboidratos, as lectinas vegetais
tornaram-se ferramentas valiosas e vêm sendo usadas em uma série de procedimentos, dentre
os quais, como substâncias mitogênicas para linfócitos, para a detecção e isolamento de
glicoproteínas e caracterização parcial das porções carboidrato dessas glicoproteínas, na
identificação de componentes glicosilados específicos em tecidos animais, assim como o
acompanhamento de mudanças que ocorrem nos açúcares da superfície das células em
processos como desenvolvimento, diferenciação, maturação, transformação neoplásica, para a
tipagem de bactérias (revisto por LIS; SHARON, 1986). Mais recentemente verificou-se que
lectinas induzem produção de citocinas (HOSTANSKA et al., 1995; PANUNTO-CASTELO
et al., 2001; SOUZA, 1998; WALLAYS; CEUPPENS, 1993), além de agirem como
mediadoras do reconhecimento celular em um grande número de sistemas biológicos, como
os de adesão de vírus, bactérias e protozoários às células hospedeiras (SHARON; LIS, 2004).
2.2. As lectinas de sementes de Artocarpus heterophyllus
As sementes de A. heterophyllus (planta da família Moraceae) apresentam três lectinas
denominadas jacalina, KM
+
(freqüentemente referida na literatura como artocarpina)
(BARRE et al., 2004) e jackina (TRINDADE et al., 2006).
Introdução
24
A recém-descrita jackina é uma proteína ligante de quitina (polímero de N-
acetilglicosamina com ligações "1-4), formada por três monômeros de aproximadamente
14kDa, unidos por pontes de dissulfetos. Apesar de sua especifidade, jackina difere
estruturalmente das lectinas com domínio heveína, podendo constituir um novo grupo de
lectinas da superfamília de lectinas quitina-específicas. Interessantemente, jackina inibe o
crescimento de Fusarium moniliforme e Saccharomyces cerevisiae, mostrando assim um
potencial uso biotecnológico (TRINDADE et al., 2006).
A jacalina, lectina ligante de D-galactose, é um tetrâmero de 60-65kDa onde cada
subunidade é constituída por duas cadeias, sendo a maior denominada de # e a menor de "
(YOUNG et al., 1989; YOUNG; JOHNSTON; WATSON, 1991; YANG; CZAPLA, 1993;
SANKARANARAYANAN et al., 1996). A jacalina é sintetizada como uma pré-pró-proteína
no retículo endoplasmático e sofre uma série de etapas de processamento pós-traducionais,
incluindo a remoção de um peptídeo sinal, uma glicosilação parcial, remoção de um pró-
peptídeo N-terminal e de um tetrapeptídeo linker, que proporciona que seus protômeros na
forma madura consistam da associação não covalente de uma cadeia N-terminal de 20
resíduos de aminoácidos (cadeia ") e de uma cadeia C-terminal de 133 resíduos (cadeia #)
(YANG; CZAPLA, 1993; SANKARANARAYANAN et al., 1996). Das lectinas de A.
heterophyllus, jacalina é indiscutivelmente a mais estudada, havendo atualmente mais de 360
trabalhos publicados com essa lectina. Em boa parte desses trabalhos, os autores utilizam a
propriedade mais notável da jacalina, isto é, sua capacidade de capturar proteínas O-
glicosiladas que contém antígeno de Thomsen–Friedenreich (Gal"1-3GalNAc) (KABIR,
1998), como a IgA (ROQUE-BARREIRA; CAMPOS-NETO, 1985) do subtipo 1 (KONDOH
et al., 1986).
Como descrito anteriormente, em sementes de A. heterophyllus é encontrada também
outra lectina relacionada à jacalina, a lectina KM
+
, ligante de D-manose. Como uma das
Introdução
25
propriedades relevantes das lectinas é a de induzir proliferação de populações linfocitárias,
Bunn-Moreno e Campos-Neto (1981) investigaram o papel mitogênico do extrato bruto de
semente de jaca. Demonstraram que o extrato bruto estimula respostas de proliferação de
linfócitos T e ativação policlonal de linfócitos B do sangue humano. Inicialmente se atribuiu o
efeito à jacalina. A purificação de jacalina e sua utilização em ensaios biológicos (ROQUE-
BARREIRA et al., 1986) trouxeram a sugestão de que, dentre as atividades desencadeadas
pelo extrato bruto de A. heterophyllus (BUNN-MORENO; CAMPOS-NETO, 1981; ROQUE-
BARREIRA; CAMPOS-NETO, 1985), a atividade mitogênica sobre monócitos do sangue
periférico humano não era atribuível à jacalina. A sugestão se baseava no fato de que jacalina
purificada não reproduzia a resposta proliferativa desencadeada pelo extrato bruto.
A existência de uma segunda lectina no extrato de A. heterophyllus foi sugerida por
Miranda-Santos et al. (1991) e demonstrada por Santos-de-Oliveira et al. (1994), que
evidenciaram suas atividades mitogênica e indutora da migração de neutrófilos,
respectivamente. Miranda-Santos et al. (1991) passaram a chamar essa segunda lectina de
artocarpina. Por outro lado, Santos-de Oliveira et al. (1994), ao caracterizarem a lectina,
observaram que essa segunda lectina estava presente no material não adsorvido à D-galactose-
agarose, e por ser anterior a fração J (jacalina) passou a ser chamada de fração K. Essa fração,
quando submetida à cromatografia de afinidade em coluna de D-manose, apresentava material
adsorvido à coluna, que era especificamente eluído com D-manose, sendo então denominada
fração K/manose+, ou simplesmente KM
+
. Essa é uma lectina minoritária no extrato bruto de
A. heterophyllus, corresponde a 0,5 a 1% do total de proteína extraída, e, apesar de ligar o
monossacarídeo D-manose, reconhece com alta especificidade manotriose Man#1-3[Man# 1-
6]Man (MISQUITH et al., 1994; RANI et al., 2000). Em termos de especificidade, a lectina
KM
+
difere de outras lectinas ligantes de manose, como Con-A, especialmente por ligar-se
fracamente a Man#1-2Man (MISQUITH; RANI; SUROLIA, 1994). KM
+
apresenta massa
Introdução
26
molecular aparente de 52kDa, corresponde a um homotetrâmero formado pela associação não
covalente de subunidades de 16kDa, sendo que cada subunidade apresenta um CRD (ROSA
et al., 1999) e migra em SDS-PAGE como um peptídeo de 13kDa (SANTOS-DE-OLIVEIRA
et al., 1994). KM
+
apresenta alta homologia com jacalina – o alinhamento das seqüências
primárias mostrou haver 52% de identidade entre essas lectinas (ROSA et al., 1999).
A elaboração de um modelo molecular tridimensional para KM
+
foi viabilizada
(ROSA et al., 1999) pela prévia determinação da estrutura cristalográfica da jacalina
(SANKARANARAYANAN, 1996). A estrutura cristal de KM
+
resolvida por Pratap et al.
(2002) demonstra a validade da modelagem molecular proposta. A despeito da manutenção de
uma mesma topologia geral entre jacalina e KM
+
, pequenas mudanças, ocorridas no segmento
responsável pelo reconhecimento de açúcar, conferem diferentes especificidades a essas
lectinas. Jacalina é capaz de ligar tanto galactose quanto manose, enquanto KM
+
apresenta
altamente específica por manose.
A manose ligada ao CRD da jacalina estabelece contato muito similar ao observado
para a galactose, exceção feita ao grupamento hidroxila do carbono 4 (C4) em posição
equatorial na manose, o que leva a formação de apenas uma ponte de hidrogênio com a cadeia
lateral do ácido aspártico na posição 125 (Asp125). Já a posição axial do grupamento
hidroxila do C4 da galactose proporciona três ligações, duas com Asp125 e outra com a
glicina N-terminal livre na cadeia # (Gly#1). O resíduo de Gly#1 é gerado pela clivagem
proteolítica do tetrapeptídeo linker na jacalina, tornando-se um resíduo fundamental para
maior especificidade da jacalina por D-galactose, já que Gly#1 não se liga à hidroxila C4 em
posição equatorial (BOURNE et al., 2002; SANKARANARAYANAN, 1996).
Diferentemente, KM
+
não sofre processamento pós-traducional e remoção do peptídeo linker,
cuja posição leva a um impedimento estérico da rotação da cadeia lateral do Asp141 no CRD
de KM
+
. Nessa condição, o Asp141, quando comparada ao Asp125 da jacalina, passa a ter
Introdução
27
conformação que só é adequada para o reconhecimento de grupo hidroxila equatorial de C4,
como ocorre em D-manose e D-glucose, mas não em D-galactose. Portanto, a presença do
peptídeo linker é o principal responsável pela incapacidade de KM
+
ligar-se à galactose
(BOUCKAERT et al., 1999; ROSA et al., 1999).
Quanto à atividade biológica, demonstrou-se que KM
+
induz a migração de neutrófilos
in vivo e in vitro através de um mecanismo haptotático, possibilitado pela interação de KM
+
com componentes glicosilados presentes no endotélio e no tecido perivascular (GANIKO et
al., 1998; 2005). Ademais, a lectina KM
+
desgranula mastócitos através do reconhecimento
de glicanas em sua superfície, levando à liberação de mediadores contidos em seus grânulos,
como TNF-#. A capacidade de KM
+
desgranular mastócitos proporciona uma alça
amplificadora de sua atividade de recrutar de neutrófilos (MORENO et al., 2003).
Recentemente, observou-se que KM
+
exerce ação nos receptores para quimiocinas CXC,
envolvidos na migração de neutrófilos dos vasos sanguíneos para os tecidos perivasculares,
através da indução do aumento da expressão basal do receptor CXCR1, constitutivamente
presente em neutrófilos não estimulados, e do desencadeamento da expressão do receptor
CXCR2, indetectável em neutrófilos não estimulados (PEREIRA-DA-SILVA et al., 2006).
O influxo agudo de células inflamatórias induzido por KM
+
suscitou a hipótese de que
a lectina pudesse ter, indiretamente, ação antimicrobiana ao ser aplicada em superfícies
cutâneas lesadas que, sabidamente, correspondem a importante porta de entrada de patógenos.
De fato, KM
+
foi capaz de interferir na resolução de lesões teciduais, uma vez que animais
submetidos à agressão térmica na região dorsal e topicamente tratados com pomada contendo
KM
+
apresentaram rápida regeneração, com cicatrização precoce da ferida, manifesta por
reepitelização local e ressurgimento de pilificação (Universidade de São Paulo. Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto. Silva et al. Composition for preventing or treating appearance of
epithelia wounds such as skin and corneal wounds or for immunomodulating, comprises
Introdução
28
lectin. n
o
patente: PI0301547-5 – 19/05/2003; INPI/P040101722 – 18/05/2004;
PCT/BR04/000070 – 19/05/2004; WO20041008. 21/11/2004).
2.3. Propriedade imunomoduladora da lectina KM
+
As lectinas de sementes de A. heterophyllus são ainda dotadas da propriedade de
induzir a produção de citocinas.
Jacalina estimula a síntese de altos níveis de TGF-", IL-3/GMC-SF e IL-6, não tendo
qualquer efeito sobre a secreção de IFN-!, IL-2 ou IL-4 por células esplênicas de
camundongos (DELGADO, 1993). Outros autores têm mostrado que jacalina é capaz de
induzir a produção de altos níveis de IL-6 por células mononucleares do sangue periférico
humano (BLASCO et al., 1995) e linhagem de células leucêmicas monocíticas U937. Além
disso, jacalina potencia as respostas imunitárias humorais específicas para o hapteno TNP
(trinitrofenil) e para o Trypanosoma cruzi (ALBUQUERQUE et al., 1999).
A lectina KM
+
, por sua vez, induz a produção in vitro por macrófagos ou in vivo de
IL-12, e, dessa forma, é capaz de mudar o perfil de secreção de citocinas de um padrão Th2
para Th1, conferindo o desenvolvimento de uma resposta protetora Th1 contra Leishmania
major, em um modelo de infecção em camundongos BALB/c (PANUNTO-CASTELO et al.,
2001).
Substâncias imunomoduladoras vêm sendo utilizadas isoladamente, ou em associação
à terapia antifúngica convencional, como uma alternativa atraente de tratamento de doenças
fúngicas sistêmicas (ARRUDA et al., 2002; CLEMONS; LUTZ; STEVENS, 2001;
CLEMONS; STEVENS, 2006). Esse tipo de abordagem poderá permitir uma redução nas
doses das drogas utilizadas, as quais muitas vezes, apresentam acentuada toxicidade que
acaba sendo fator limitante no tratamento da doença fúngica.
Introdução
29
Respostas imunológicas do tipo Th1 são responsáveis pela proteção contra um grande
número de microrganismos intracelulares (FOULDS; WU; SEDER, 2006), dentre os quais
inclui-se o P. brasiliensis. Na PCM, bem como, em outras doenças granulomatosas crônicas,
a resposta imunitária celular representa o principal mecanismo de defesa (CALVI et al., 2003;
CANO et al., 1998; SOUTO et al., 2000).
Considerando que KM
+
é capaz de modular a resposta imunitária através da produção
de IL-12 por macrófagos, favorecendo o desenvolvimento do eixo Th1 e a conseqüente
proteção contra a infecção por L. major; aventamos a hipótese de que a lectina KM
+
extraída
de planta, bem como a molécula recombinante, pudessem modificar o curso da PCM
experimental murina, levando à proteção de camundongos infectados. Além disso,
vislumbramos a possibilidade de usar KM
+
profilática e terapeuticamente, bem com
identificar os mecanismos responsáveis pela indução de IL-12.
O
O
b
b
j
j
e
e
t
t
i
i
v
v
o
o
s
s
Deixemos, pois, que nossas mentes
brinquem com idéias e que nossos
sentidos acumulem informações. E
deixemos também que ocorra uma
produtiva interação entre ambos, pois a
mente processa o que os sentidos reúnem,
um cérebro apático, destituído de qualquer
dado sensório exterior, seria uma
ferramenta deveras lamentável.
Stephen J. Gould
Objetivos
31
Avaliar se a administração profilática e terapêutica da lectina KM
+
, bem como a
molécula recombinante, são capazes de modificar o curso da PCM experimental murina,
levando à proteção de camundongos infectados.
Identificar possíveis mediadores responsáveis pela proteção conferida pela lectina
KM
+
.
M
M
a
a
t
t
e
e
r
r
i
i
a
a
l
l
e
e
M
M
é
é
t
t
o
o
d
d
o
o
s
s
Toda vez que um trabalho
científico apresenta um conjunto
de dados, ele é acompanhado por
uma barra de erro – uma
lembrança silenciosa, porém
insistente de que nenhum
conhecimento é completo ou
perfeito.
Carl Sagan
Material e Métodos
33
1. Obtenção da lectina KM
+
A lectina de planta KM
+
(jfKM
+
) foi purificada de acordo com o procedimento
descrito por Santos-de-Oliveira et al. (1994). Sementes de jaca (Artocarpus heterophyllus
Lam., Syn. A. integrifolia L.f.) foram coletadas, lavadas em água e secas por 24h a 37'C. O
pó obtido pela moagem das sementes foi pesado e ressuspendido em solução salina
tamponada com fosfato a 10mM, pH 7.2 (PBS), numa concentração final de 10% (m/v). A
mistura foi incubada por 24h, a 4'C, seguindo-se centrifugação a 10.000 × g por 10min. O
sobrenadante foi dialisado exaustivamente contra PBS, utilizando-se a membrana YM10 em
células de agitação Amicon (Millipore, Billerica, EUA). Tal preparação foi seqüencialmente
submetida à cromatografia de afinidade em coluna de D-galactose-agarose e D-manose-
agarose (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, EUA). As colunas foram equilibradas e
lavadas com PBS, a 4
o
C. O material não adsorvido à coluna de D-galactose-agarose (fração
K) foi recromatografado para garantir que estivesse isento de jacalina, sendo posteriormente
submetido à cromatografia de afinidade em coluna de D-manose-agarose. O material
adsorvido à coluna de D-manose-agarose foi eluído com solução de D-manose a 0,4M (fração
K, manose+, ou KM
+
). As corridas foram monitoradas em espectrofotômetro pela leitura de
absorbância em 280nm. As frações contendo KM
+
foram colecionadas em um pool e
ultradiafiltradas contra PBS, utilizando-se a membrana YM10 em células de agitação Amicon
(Millipore). Alíquotas da lectina foram estocadas a -20
o
C.
A lectina recombinante (rKM
+
) expressa em Escherichia coli BL21 transformada com
um plasmídeo que continha o gene da KM
+
, pExp-KM
+
(Gateway System, Invitrogen,
Carlsbad, EUA), como descrito previamente por Silva et al. (2005), foi gentilmente cedida
pela Profa. Dra. Maria Helena Goldman da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, USP. A fim de se extrair as proteínas solúveis, a suspensões bacterianas foram
sonicadas e centrifugadas a 25.000 × g por 15min. Os sobrenadantes contendo proteínas
Material e Métodos
34
solúveis foram submetidos à cromatografia de afinidade em coluna de D-manose (Pierce
Biotechnology), como descrito acima para jfKM
+
. Análises para detecção de endotoxina pelo
método do lisado de amebócito de Lymulus (LAL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA)
revelaram que as preparações de jfKM
+
e rKM
+
continham quantidade menor que 0,05ng de
endotoxina/ml de preparação.
O grau de homogeneidade das preparações de jfKM
+
e rKM
+
foi analisado por
eletroforese em gel de poliacrilamida em condições dissociantes (SDS-PAGE) (LAEMMLI,
1970), utilizando-se o sistema Mini Protean 3 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, EUA).
As amostras foram ressuspendidas em tampão de amostra cinco vezes concentrado (Tris-HCl
a 0,5M, pH 6,5, contento 12,5% de SDS, 12,5% de 2-mercaptoetanol, 50% glicerol e 0,005%
de azul de bromofenol) e aplicadas no gel de acrilamida a 12,5%. As corridas eletroforéticas
tiveram duração aproximada 40min (80-120mA, 200V). Os géis foram corados pelo método
da prata (BLUM; BEIER; GROSS, 1987).
2. Animais
Foram utilizados camundongos machos da linhagem BALB/c e C57BL/6, sendo esses
últimos usados como background controle (WT) dos experimentos com camundongos
deficientes de IL-12 (IL-12
-/-
), óxido nítrico sintase 2 (NOS2
-/-
) e molécula adaptadora de
sinalização intracelular MyD88 (MyD88
-/-
). Os animais tinham entre 6 e 8 semanas de idade e
foram provenientes do Biotério de Camundongos Isogênicos do Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), USP. Esses animais foram mantidos no
Biotério do Departamento de Bioquímica e Imunologia da FMRP-USP, com livre acesso à
água e ração. Os animais deficientes foram mantidos em microisoladores em uma sala com
aeração e temperatura controladas automaticamente. Após o término dos experimentos, os
Material e Métodos
35
animais foram mortos por deslocamento cervical, colocados em sacos plásticos e incinerados
segundo as normas de segurança.
3. Cultivo de P. brasiliensis
Foi utilizado o isolado Pb18 de P. brasiliensis, fornecido pelo Laboratório de
Sorologia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, USP (gentilmente cedido pelo Prof. Dr.
Roberto Martinez), o qual é mantido em meio Fava-Netto, tendo sua virulência conservada
por passagens periódicas em animais. Pré-inóculos de 2,0 × 10
6
células/ml foram adicionados
em 25ml de meio de cultura líquido F-12 Nutrient Mixture (HAM) com L-glutamina
(Invitrogen) e mantidos por 7 dias a 37'C, sob agitação constante a 100rpm.
4. Administração de KM
+
e infecção de camundongos com leveduras de P. brasiliensis
4.1. Administração de KM
+
ou veículo: Para avaliar o efeito profilático e terapêutico
da lectina jfKM
+
sobre a infecção experimental por P. brasiliensis, camundongos BALB/c (3
animais por grupo) foram injetados com jfKM
+
utilizando-se dois protocolos experimentais
(Esquema 1). Todas as injeções foram feitas com 0,5)g KM
+
em 50)l de PBS. No protocolo
A, os animais foram tratados com KM
+
previamente à infecção com leveduras de P.
brasiliensis, enquanto no protocolo B, os animais foram tratados com KM
+
após à infecção
com P. brasiliensis. Os animais de cada um dos protocolos experimentais foram subdivididos
em 7 grupos de acordo com o regime de tratamento com KM
+
, que variou em número de
injeções (entre 1 e 3) em intervalos de tempo pré-estabelecidos (Tabela 1). A primeira injeção
foi feita por via intraperitoneal (i.p.), a segunda por via subcutânea (s.c.) no flanco esquerdo e
a terceira foi mais uma vez por via i.p.
Material e Métodos
36
Esquema 1. Cinética da infecção com P. brasiliensis e do tratamento com a lectina KM
+
dos
animais dos grupos de profilaxia e terapia.
Tabela 1. Intervalo de tempo utilizado para a administração profilática ou terapêutica
da lectina jfKM
+
em camundongos BALB/c.
Grupo A
Profilaxia
Dia(s) de tratamento antes da
infecção
Grupo B
Terapia
Dia(s) de tratamento após a
infecção
A.I 17, 10 e 3 B.I 3, 10 e 17
A.II 10 e 3 B.II 10 e 17
A.III 3 B.III 17
A.IV 10 B.IV 10
A.V 17 B.V 3
A.VI 17 e 10 B.VI 3 e 10
A.VII 17 e 3 B.VII 3 e 17
Os resultados obtidos direcionaram a escolha, dentre os 14 grupos ensaiados, de dois
grupos como representantes dos dois protocolos experimentais para a realização dos ensaios
subseqüentes. Assim, camundongos BALB/c (3 animais por grupo) foram injetados com
Material e Métodos
37
jfKM
+
ou com rKM
+
profilática (dias 10 e 3 antes da infecção) ou terapeuticamente (10 dias
após a infecção), na dose de 0,5)g em 50)l de PBS, utilizando as mesmas vias de
administração acima descritas. Os experimentos com camundongos IL-12
-/-
e NOS2
-/-
, bem
como os controles C57BL/6 (3 animais por grupo) foram feitos como descrito para o grupo de
terapia, ou seja, com injeção subcutânea de jfKM
+
na dose de 0,5)g em 50)l de PBS 10 dias
após a infecção com leveduras de P. brasiliensis.
Como procedimento controle do curso da infecção, os camundongos foram injetados
com apenas 50)l de PBS (veículo).
4.2. Infecção dos camundongos com leveduras de P. brasiliensis: Os camundongos
foram infectados por via intravenosa (i.v.), na veia caudal, com 1 × 10
6
leveduras de P.
brasiliensis contidas em 100)l de PBS. Para preparação dos fungos para esses experimentos
de infecção, as leveduras foram ressuspendidas em PBS estéril, colocadas em tubo de vidro
contendo pérolas de vidro (4mm de diâmetro) e agitadas em Vortex, com 3 ciclos de 10seg.
Após lavagem com PBS estéril, as leveduras foram ressuspendidas em 5ml de PBS estéril,
aspiradas em seringa descartável de 10ml e passadas através de agulha 25 × 8 para a completa
separação dos agregados fúngicos. A concentração das células fúngicas foi ajustada para 1 ×
10
7
células viáveis/ml em PBS estéril, sendo a viabilidade determinada por fluorescência
(CALICH, 1979) com 100)l de brometo de etídio (50)g/ml) (Sigma Chemical Co.) e 100)l
de diacetato de fluoresceína (2)g/ml) (Sigma Chemical Co.). Apenas as suspensões de
leveduras com viabilidade superior a 90% foram utilizadas para infectar os camundongos.
Decorridos 14, 30 ou 60 dias de infecção, os animais foram anestesiados por via i.p. com
2,2,2 tribromoetanol (250)g/g) e em seguida mortos por deslocamento cervical.
Material e Métodos
38
5. Histopatologia das lesões formadas no tecido pulmonar
Fragmentos de um dos pulmões dos camundongos dos diferentes grupos
experimentais foram fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato a 0.1M,
desidratados, embebidos em parafina, seccionados (5)m) e corados com Hematoxilina-Eosina
(HE) para análise histológica, por microscopia óptica.
6. Recuperação de leveduras dos pulmões e do fígado dos camundongos infectados
Pulmões dos camundongos dos diferentes grupos experimentais foram removidos,
pesados e homogeneizados em 1ml de PBS estéril com um homogeneizador de tecido (Ultra-
Turrax T25 Basic, IKA Works, Inc., Wilmington, EUA). Alíquotas de 100)l das suspensões
diluídas 1/10 foram semeadas, em duplicata, em placas de Petri contendo ágar BHI (Oxoid
Limited, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) suplementado com 4% (v/v) de soro bovino
fetal (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, EUA). Após 7 e 14 dias de incubação a 37'C, as
colônias de fungos formadas foram contadas. Os resultados foram expressos como números
de unidades formadoras de colônias (UFC) por grama de tecido. Alternativamente, o fígado
dos camundongos infectados com leveduras de P. brasiliensis e tratados terapeuticamente
com jfKM
+
foi submetido ao mesmo protocolo experimental acima descrito. Além disso, os
macerados pulmonares, contendo 1,6mM de inibidor de protease fluoreto de
fenilmetilsulfonila (PMSF, Sigma Chemical Co.), foram centrifugados a 2.000 × g por 15min
e os sobrenadantes obtidos foram estocados a -20'C até a realização de ensaio
imunoenzimático (ELISA) para detecção de citocinas e da reação de Griess para detecção de
óxido nítrico (NO).
Material e Métodos
39
7. Quantificação da produção de citocinas
A dosagem das citocinas foi realizada por ELISA, utilizando OptEIA Set: Mouse (BD
Biosciences Pharmingen, San Diego, EUA).
7.1. Dosagem de TNF-#: Microplacas de poliestireno de 96 poços foram recobertas
com anticorpo monoclonal anti-TNF-# (anticorpo de captura), diluído 1/250 em tampão
carbonato 0,1M, pH 9,6 (100)l/poço). A placa foi incubada por uma noite a 4'C, para
adsorção dos anticorpos. Em seguida, a placa foi lavada uma vez com PBS contendo 0,05%
de Tween 20 (PBS-T) e incubada com uma solução de PBS contendo 10% de soro fetal
bovino inativado (tampão de bloqueio), durante 2h a temperatura ambiente (TA). Aos poços
foram então adicionados TNF-# recombinante (curva padrão obtida por diluição na base 2,
iniciada na concentração 1000pg/ml) ou as amostras, em duplicata. Após incubação por 2h a
TA, a placa foi lavada cinco vezes com PBS-T, sendo então adicionado anticorpo policlonal
anti-TNF-# biotinilado (anticorpo de detecção), diluído 1/500 em tampão de bloqueio. A
reação foi incubada por 1h a TA. Após serem lavados cinco vezes com PBS-T, aos poços foi
adicionada avidina conjugada à peroxidase (1/250), sendo a reação incubada por 30min a TA.
Nova etapa de lavagem foi realizada, seguindo-se a adição de peróxido de hidrogênio a 0,03%
e do revelador tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi bloqueada após 20min com ácido
sulfúrico 1M e a leitura realizada a 450nm em leitor de microplacas (Power Wavex – BIO-
TEK Instruments, Inc., Winooski, EUA).
7.2. Dosagem de IL-4, IL-10, IL-12p70 (molécula bioativa) e IFN-!: Foram utilizados
pares de anticorpos específicos para cada uma dessas citocinas, sendo usado anticorpos
monoclonais para a captura e revelação (BD Biosciences Pharmingen). A metodologia para a
detecção foi semelhante à descrita no subitem anterior, com exceção da etapa de adição do
Material e Métodos
40
anticorpo de detecção, que foi pré-incubado por 15min com avidina conjugada à peroxidase,
seguindo-se a adição dessa solução à placa para incubação a TA durante 1h.
8. Quantificação da produção de NO
A concentração de NO nos sobrenadantes dos macerados pulmonares dos diferentes
grupos experimentais foi inferida pela determinação dos níveis de nitritos, utilizando-se o
método de Griess (GREEN et al., 1982). Em placas de 96 poços, 50)l das amostras foram
incubadas com igual volume do reagente de Griess, por 10 minutos a TA. Posteriormente, a
absorbância em 540nm foi determinada em leitor de ELISA. Os resultados expressos em )M
de NO
2
foram determinados com base na regressão linear obtida de uma curva de
concentrações de nitrito de sódio que variaram de 200 a 12,5)M.
9. Obtenção e plaqueamento de macrófagos do baço
Visando-se obter células aderentes do baço, camundongos C57BL/6 (WT) e MyD88
-/-
(5 animais por grupo) foram mortos por deslocamento cervical com subseqüente remoção de
seus baços. As células esplênicas, obtidas por debridamento do órgão em meio RPMI
incompleto (bicarbonato de sódio e Hepes), foram tratadas com tampão de lise (cloreto de
amônio a 0,16M e Tris-HCl a 0,17M, pH 7,5) por 4min, centrifugadas a 250 × g, por 10min a
4'C, lavadas 3 vezes com meio RPMI incompleto (Sigma Chemical Co.) e ressuspendidas em
meio RPMI contendo 5% de soro bovino fetal (RPMI-c). As células foram distribuídas em
placas de 24 poços (1 × 10
7
células/poço em um volume de 1ml) e incubadas por 2h a 37'C
em estufa contendo atmosfera umidificada e 5% de CO
2
. As células não aderentes foram
então removidas por lavagem exaustiva com RPMI incompleto e as células aderentes foram
estimuladas com jfKM
+
*+,)g/ml) ou LPS (controle positivo, 10)g/ml) em meio RPMI-c,
reincubadas nas condições descritas acima. Após 48h, os sobrenadantes das culturas foram
Material e Métodos
41
coletados, centrifugados e estocados a -20'C até a realização do ensaio de ELISA para a
dosagem de IL-12.
10. Análise estatística
A determinação estatística das diferenças entre as médias dos grupos experimentais foi
feito por análise da variância (ANOVA), seguido pelo pós-teste de Bonferroni. Diferenças
com p < 0.05 foram consideradas estatisticamente significativas. Todos os experimentos
foram realizados pelo menos três vezes.
R
R
e
e
s
s
u
u
l
l
t
t
a
a
d
d
o
o
s
s
É um erro capital teorizar antes de
ter os dados. Insensivelmente,
começa-se a distorcer os fatos para
adaptá-los às teorias, em vez de
fazer com que as teorias se
adaptem aos fatos.
Conan Doyle
Resultados
43
Parte 1. Determinação do efeito protetor da lectina KM
+
administrada
profilática ou terapeuticamente em camundongos infectados com P. brasiliensis
$
Análise do regime de tratamento.
A fim de se avaliar qual regime de tratamento com KM
+
de planta (jfKM
+
)
apresentava maior impacto no controle da infecção com P. brasiliensis, diminuindo lesão
pulmonar e carga fúngica, grupos de camundongos BALB/c foram tratados profilática ou
terapeuticamente com a lectina em regimes de tratamentos que variaram em número de
injeções (entre 1 e 3) em intervalos de tempo pré-estabelecidos (Tabela 1).
1. Análise histológica
Dos grupos injetados profilaticamente com KM
+
, os animais do grupo A.II, injetados
com jfKM
+
nos dias 10 e 3 antes da infecção, foram os que apresentaram uma maior proteção
contra a infecção com P. brasiliensis. Os pulmões desses animais apresentaram densidade de
0,66 granulomas/mm
2
(Figura 1F), sendo que um deles, surpreendentemente, não apresentou
granulomas no tecido pulmonar, havendo apenas espessamento dos septos alveolares (Figura
1B). Quando comparado com o grupo A.II, um quadro histopatológico indicativo de maior
comprometimento pulmonar foi observado nos animais dos grupos A.I (injetados com jfKM
+
17, 10 e 3 antes da infecção) (Figura 1A), A.III (injetados com jfKM
+
3 dias antes da
infecção) (Figura 1C) e A.IV (injetados com jfKM
+
10 dias antes da infecção) (Figura 1D),
que apresentaram densidade média de 2 granulomas/mm
2
(Figura 1F), constituídos de
neutrófilos, linfócitos, macrófagos e células epitelióides circunscrevendo inúmeros fungos
(Figura 1C) e espessamento dos septos alveolares. Ainda que houvesse certa variação na
proteção observada nos diferentes grupos injetados com jfKM
+
, mesmo os grupos com piores
resultados apresentavam um comprometimento inferior ao observado nos cortes histológicos
Resultados
44
pulmonares dos animais do grupo controle (injetados com PBS antes da infecção), que
apresentaram o parênquima pulmonar quase todo substituído por lesões granulomatosas
contendo inúmeros fungos (Figura 1E) e densidade de 3,7 granulomas/mm
2
(Figura 1F).
A análise dos cortes histológicos pulmonares dos animais dos grupos tratados com
jfKM
+
revelou que os animais do grupo B.IV, injetados com jfKM
+
10 dias após a infecção,
apresentavam um inequívoco controle da infecção, com características histológicas próximas
às de um tecido pulmonar normal, com ausência de granulomas e leveduras, apresentando
apenas um leve espessamento de septos alveolares (Figura 2D). Diferentemente do grupo
B.IV, a análise dos cortes histológicos pulmonares dos demais grupos mostrou que esses
animais apresentavam maior comprometimento pulmonar. Nos animais do grupo B.I,
injetados com jfKM
+
nos dias 3, 10 e 17 após a infecção, observamos espessamento de septos
alveolares e granulomas epitelióides organizados constituídos de neutrófilos, linfócitos,
macrófagos e células epitelióides, circunscrevendo inúmeros fungos (Figura 2A), com
densidade de ocorrência de granulomas de 2,63 granulomas/mm
2
(Figura 2H). Essas
características histopatológicas também foram observadas nos animais dos grupos
experimentais B.II (injetados com jfKM
+
nos dias 10 e 17 após a infecção) (Figura 2B), B.III
(injetados com jfKM
+
17 dias após a infecção) (Figura 2C), B.VI (injetados com jfKM
+
nos
dias 3 e 10 após a infecção) (Figura 2E) e B.VII (injetados com jfKM
+
nos dias 3 e 17 após a
infecção) (Figura 2F). A densidade média de ocorrência de granulomas nos pulmões desses
animais foi de 2,2 granulomas/mm
2
(Figura 2H). Similarmente ao que ocorreu com os
animais dos grupos injetados com jfKM
+
antes da infecção, o tratamento dos animais dos
diversos grupos experimentais com a lectina proporcionou um maior controle da infecção
quando comparado aos animais do grupo controle (injetado apenas com PBS), cujos cortes
histológicos pulmonares apresentaram grande comprometimento tecidual com densidade de
Resultados
45
3,72 granulomas/mm
2
, constituídos de macrófagos, células epitelióides, neutrófilos, e
linfócitos ao redor de numerosos fungos (Figura 2G).
Resultados
46
Resultados
47
A análise histopatológica ficou restrita aos grupos acima descritos, uma vez que
alguns animais do grupo controle e os animais dos grupos A.V, A.VI, A.VII e B.V haviam
morrido aos 30 dias de infecção.
2. Determinação de UFC (Recuperação de leveduras)
Os resultados ora obtidos fundamentaram a escolha dos grupos que foram submetidos
ao ensaio de recuperação de colônias do tecido pulmonar, uma vez que permitiram definir,
dentro dos dois protocolos experimentais, os grupos em que a ação benéfica de jfKM
+
se
destacava. Assim, a recuperação de fungos dos animais dos grupos I, II, III e IV injetados
com jfKM
+
previamente (profilaxia) ou após (terapia) a infecção com leveduras de P.
brasiliensis foi avaliada pelo número de UFC do macerado pulmonar coletado 30 dias após a
infecção. A quantidade de colônias recuperada dos pulmões dos camundongos do grupo A.II
(injetados com jfKM
+
nos dias 10 e 3 antes da infecção) foi significativamente inferior (p <
0,05) à obtida nos pulmões dos camundongos dos grupos A.I, A.III e A.IV e 95% menor que
a obtida nos pulmões dos animais controles (injetados com PBS antes da infecção) (Figura 3
– Painel A). Nos grupos tratados com jfKM
+
posteriormente à infecção, todos os animais
tiveram redução significativa no número de UFC quando comparados aos animais do grupo
controle (injetados com PBS após a infecção), sendo tais reduções da ordem de 75% para os
animais dos grupos B.I, B.II e B.III, (Figura 3 – Painel B). Surpreendentemente, não foi
observado o crescimento de leveduras nos pulmões dos animais do grupo B.IV (injetados com
KM
+
10 dias após a infecção) (Figura 3 – Painel B).
Resultados
48
Figura 3 Pulmões de camundongos infectados com P. brasiliensis e injetados com
KM
+
antes e após a inoculação apresentam menor número de UFC quando
comparados com os de animais controles não tratados. Número de colônias
recuperadas dos camundongos dos grupos I, II, III e IV infectados com P. brasiliensis
e injetados profilática (A) e terapeuticamente (B) com KM
+
. As colônias de fungos
foram contadas e os resultados expressos como número de unidades formadoras de
colônias (UFC) por grama de tecido. Cada ponto corresponde a três camundongos e as
barras representam a média - DP.
. p < 0,05 em relação aos demais grupos experimentais.
.. p < 0,05 em relação ao grupo controle (PBS).
Resultados
49
Parte 2. O efeito protetor da lectina KM
+
na PCM experimental é decorrente de
sua capacidade de induzir imunomodulação.
A análise conjunta dos achados histológicos e de carga fúngica norteou a escolha de
um grupo de cada um dos dois protocolos experimentais para a realização dos ensaios
subseqüentes. Desse modo, para o grupo profilaxia, KM
+
de planta (jfKM
+
) ou recombinante
(rKM
+
) foi administrada nos dias 10 e 3 antes da infecção com P. brasiliensis, enquanto que
para o grupo terapia, KM
+
foi administrada 10 dias após a infecção.
1. Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou após a
inoculação não apresentam comprometimento do tecido pulmonar
Cortes histológicos de pulmão dos camundongos BALB/c dos diferentes grupos
experimentais (tratados com KM
+
e controle) foram analisados por microscopia óptica.
Observamos que os pulmões tanto dos animais do grupo profilaxia (Figura 4) quanto do
grupo terapia (Figura 5), independentemente se a fonte de KM
+
era planta (Figura 4B e 5B)
ou recombinante (Figura 4D e 5D), apresentaram características histológicas próximas às de
um tecido pulmonar normal, havendo apenas um leve espessamento dos septos alveolares.
Quadro histopatológico indicativo de maior gravidade da infecção foi observado nos pulmões
dos animais pertencentes ao grupo controle (injetados com PBS antes ou após a infecção), que
apresentaram vários granulomas coalescentes compostos de macrófagos, células epitelióides
circundadas por linfócitos, além de apresentarem espessamento dos septos alveolares,
comprometimento tecidual, com o parênquima pulmonar quase todo substituído por lesões
granulomatosas ao redor de inúmeros fungos (Figuras 4A, 4C, 5A e 5C).
Resultados
50
Figura 4. Tratamento dos camundongos com KM
+
antes da infecção com P. brasiliensis
mantém a arquitetura pulmonar similar aos controles não infectados.
Camundongos BALB/c foram injetados com PBS (A e C) ou com jfKM
+
(B) ou
rKM
+
(D), 10 e 3 dias antes da infecção, infectados com P. brasiliensis e mortos
30 dias após a infecção. Em A e C, observa-se comprometimento tecidual e vários
focos de granulomas isolados ou coalescentes, circunscrevendo diversos fungos.
Em B e D, o tecido pulmonar se apresenta com leve espessamento dos septos
alveolares e ausência de granulomas. Coloração H&E. Barras em A, B e D =
200)m; barra em C = 20)m.
Resultados
51
Figura 5. Tratamento dos camundongos com KM
+
após a infecção com P. brasiliensis
mantém a arquitetura pulmonar similar aos controles não infectados.
Camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis foram injetados com PBS
(A e C) ou tratados com jfKM
+
(B) ou rKM
+
(D), 10 dias após a infecção, e
mortos 30 dias após a infecção. Em A e C, observa-se vários focos de granulomas
isolados ou coalescentes, circunscrevendo diversos fungos. Em, B e D, tecido
pulmonar apresentando leve espessamento dos septos alveolares e ausência de
granulomas. Coloração H&E. Barras em A, B e D = 200)m; barra em C = 20)m.
Resultados
52
2. Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou após a
inoculação apresentam baixa carga fúngica nos pulmões
A recuperação de fungos dos pulmões dos animais injetados profilática (Figura 6) ou
terapeuticamente (Figura 7) com jfKM
+
ou rKM
+
, 30 dias após a infecção com leveduras de
P. brasiliensis, revelou uma redução significativa (p < 0,05) no número de UFC quando
comparada à obtida nos pulmões dos animais do grupo controle (injetados com PBS antes ou
após a infecção) (Figuras 6A e 7A). Uma vez que os quadros obtidos dos animais dos grupos
profilaxia e terapia eram muito similares aos 30 dias de infecção, independentemente da fonte
de KM
+
, elegemos um grupo injetado terapeuticamente com jfKM
+
para análise do número de
UFC 60 dias após a infecção. Como mostrado na Figura 8A, a quantidade de colônias
recuperada nos fragmentos de pulmão desses camundongos tratados com jfKM
+
foi
significativamente menor à obtida nos pulmões do grupo controle (injetados com PBS após a
infecção), mantendo-se assim o controle, já observado no dia 30 da infecção (Figura 7A), até
60 dias após a infecção. Um dado muito relevante e surpreendente foi obtido ao se analisar o
número de UFC obtido do fígado desses animais tratados com jfKM
+
30 e 60 dias após a
infecção. Diferentemente dos animais do grupo controle (injetados com PBS após a infecção)
que apresentavam grande número de UFC aos 30 dias após infecção, número esse que
aumentou significativamente (p < 0,05) aos 60 dias de infecção, não foram recuperadas
leveduras no fígado dos animais tratados com jfKM
+
durante o período analisado (Figura
8B).
3. Produção de óxido nítrico é observada em camundongos infectados com P. brasiliensis
e tratados com KM
+
antes ou após a inoculação
A produção de NO pelos animais pertencentes aos diferentes grupos experimentais
(tratados com KM
+
e controle) foi avaliada no macerado de tecido pulmonar coletado 14 e 30
dias após a infecção com leveduras de P. brasiliensis. Aos 14 dias posteriores à infecção, não
Resultados
53
foi observada diferença significativa na produção de NO entre os animais injetados com
jfKM
+
ou rKM
+
antes da infecção e os animais do grupo controle (injetados com PBS antes da
infecção) (Figura 6B). No entanto, no dia 30 pós-infecção, esses animais injetados com
jfKM
+
ou rKM
+
produziram NO em níveis significativamente superiores aos verificados no
macerado pulmonar dos animais do grupo controle (Figura 6B). Diferentemente, os animais
tratados com jfKM
+
ou rKM
+
após o inóculo, já aos 14 dias após a infecção, produziram NO
em níveis significativamente superiores aos produzidos pelos animais do grupo controle
(injetados com PBS após a infecção) (Figura 7B). A produção elevada de NO por esses
animais (3,0 a 4,9 vezes superior) sobre os animais do grupo controle, manteve-se aos 30 dias
de infecção (Figura 7B).
4. Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
antes ou após a
inoculação apresentam produção de citocinas pró-inflamatórias
A dosagem das citocinas no macerado de tecido pulmonar dos animais que receberam
jfKM
+
ou rKM
+
, antes ou após a infecção, e dos animais do grupo controle, foi realizada aos
14 e 30 dias após a infecção com leveduras de P. brasiliensis.
4.1. Produção de IL-12p70
Os animais dos grupos injetados profilática e terapeuticamente com jfKM
+
ou rKM
+
apresentaram no macerado pulmonar, aos 14 dias de infecção, níveis de IL-12p70 similares
aos produzidos pelos animais do grupo controle (injetados com PBS antes ou após a infecção)
(Figura 6C e 7C). Entretanto, a análise do macerado pulmonar, aos 30 dias de infecção,
revelou um declínio na produção de IL-12p70 pelos animais do grupo controle, fato não
observado nos animais injetados com jfKM
+
ou rKM
+
antes ou após a infecção, cujos níveis
de produção de IL-12p70 se mantiveram ou até aumentaram nesse período de infecção
Resultados
54
(Figuras 6C e 7C). Tanto os animais do grupo profilaxia quanto os animais do grupo terapia
produziram níveis de IL-12p70, aos 30 dias de infecção, 2 vezes superiores aos observados no
macerado pulmonar dos animais do grupo controle, sendo que os animais injetados com rKM
+
nos dias 10 e 3 antes da infecção, produziram ainda mais IL-12p70, alcançando níveis 4 vezes
superiores aos dos animais do grupo controle (Figura 6C).
4.2. Produção de IL-10
Os animais do grupo controle produziram no macerado pulmonar, aos 14 dias de
infecção, níveis de IL-10 superiores aos produzidos pelos animais do grupo profilaxia
injetados com jfKM
+
ou rKM
+
(Figura 6D). A análise da produção de IL-10, aos 30 dias de
infecção, revelou que os animais do grupo controle produziram níveis de IL-10 duas vezes
superiores aos produzidos pelos animais do grupo profilaxia injetados com jfKM
+
ou rKM
+
(Figura 6D). Os níveis de IL-10 produzidos no macerado pulmonar dos animais do grupo
terapia tratados com jfKM
+
ou rKM
+
não foram estatisticamente diferentes dos níveis de IL-
10 produzidos pelos animais do grupo controle aos 30 dias de infecção (Figura 7D).
4.3. Produção de IFN-! e IL-4
Observou-se que os animais do grupo profilaxia injetados com jfKM
+
apresentaram
produção de IFN-!, aos 14 dias de infecção, discretamente superior à verificada nos animais
do grupo controle (injetados com PBS antes da infecção), enquanto os níveis de IL-4 foram
similares (Figura 6E). Por outro lado, aos 30 dias de infecção, a produção de IFN-! no
macerado pulmonar desses animais foi 60% superior à verificada nos animais do grupo
controle, que apresentaram queda de aproximadamente 58% na produção de IFN-!*( Figura
6E). Apesar da diminuição de IFN-! nos grupos injetados com KM
+
e controle no dia 30 pós-
infecção, a produção de IL-4 no macerado pulmonar dos animais do grupo controle, foi 36%
Resultados
55
superior à verificada nos animais injetados profilaticamente com jfKM
+
(Figura 6E). Os
animais tratados com jfKM
+
, aos 14 dias de infecção, apresentaram níveis de IFN-!
discretamente inferiores aos verificados nos animais do grupo controle (injetados com PBS
após a infecção), enquanto os níveis de IL-4 foram 43% menores que o grupo controle
(Figura 7E). Contrariamente, aos 30 dias de infecção, a produção de IFN-! no macerado
pulmonar desses animais tratados com jfKM
+
foi 124% superior à verificada nos animais do
grupo controle, enquanto os níveis de IL-4 permaneceram inferiores (60%) aos observados no
macerado pulmonar dos animais controle (Figura 7E). Resultados similares foram
observados nos animais tratados com rKM
+
antes ou após a infecção (dados não mostrados).
Tais resultados evidenciaram uma tendência, aos 30 dias de infecção, dos camundongos dos
grupos injetados com jfKM
+
em manter o perfil Th1, ocorrendo uma reversão no grupo
controle, com predomínio de resposta Th2.
4.4. Produção de TNF-#
A análise da produção de TNF-#, aos 14 dias de infecção, revelou que os animais
injetados com jfKM
+
ou rKM
+
antes da infecção, produziram níveis de TNF-# 54%
superiores aos verificados nos animais do grupo controle (injetados com PBS antes da
infecção) (Figura 6F). Nesses animais, aos 30 dias de infecção, os níveis de TNF-# foram
aproximadamente 2 vezes superiores aos produzidos pelos animais do grupo controle (Figura
6F). Níveis similares de TNF-# foram detectados, aos 14 dias de infecção, no macerado
pulmonar dos animais do grupo controle em relação aos animais tratados com jfKM
+
ou rKM
+
(Figura 7F). Contrariamente, aos 30 dias de infecção, os animais tratados com rKM
+
ou
jfKM
+
produziram níveis de TNF-# no macerado pulmonar significativamente superiores (2 a
3 vezes, respectivamente) aos produzidos pelos animais do grupo controle, injetados com PBS
após a infecção (Figura 7F).
Resultados
56
Figura 6. Uso profilático de KM
+
induz proteção em camundongos BALB/c infectados com P.
brasiliensis. As seguintes análises foram realizadas com os pulmões de animais tratados
ou não profilaticamente com jfKM
+
ou rKM
+
. (A) Recuperação de fungos (UFC) aos 30
dias após a infecção com P. brasiliensis. As colônias de fungos foram contadas e os
resultados expressos como número de UFC por grama de tecido; (B) concentração de
nitrito no macerado pulmonar, 14 e 30 dias após a infecção; e (C - F) níveis de citocinas
no macerado pulmonar, 14 e 30 dias após a infecção. Os resultados representam a média -
DP de três camundongos e são representativos de 3 experimentos independentes. . p <
0,05 significante em relação ao grupo controle (PBS). .. p < 0,05 quando comparado aos
14 dias.
Resultados
57
Figura 7. Tratamento com KM
+
induz proteção em camundongos BALB/c infectados com P.
brasiliensis. As seguintes análises foram realizadas com os pulmões de animais tratados
ou não com jfKM
+
ou rKM
+
. (A) Recuperação de fungos (UFC) aos 30 dias após a
infecção com P. brasiliensis. As colônias de fungos foram contadas e os resultados
expressos como número de UFC por grama de tecido; (B) concentração de nitrito no
macerado pulmonar, 14 e 30 dias após a infecção; e (C - F) determinação dos níveis de
citocinas no macerado pulmonar, 14 e 30 dias após a infecção. Os resultados representam
a média - DP de três camundongos e são representativos de 3 experimentos
independentes. . p < 0,05 em relação ao grupo controle (PBS).
Resultados
58
Figura 8. Tratamento com KM
+
leva ao aumento do clearance de P. brasiliensis no
tecido pulmonar e hepático. Determinou-se o número de colônias recuperadas do
tecido pulmonar e hepático de camundongos BALB/c infectados com P.
brasiliensis e tratados ou não com jfKM
+
. (A) Número de colônias recuperadas
(UFC) do tecido pulmonar 60 dias após a infecção com P. brasiliensis. (B)
Número de colônias recuperadas (UFC) do fígado 30 e 60 dias após a infecção
com P. brasiliensis. As colônias de fungos foram contadas e os resultados
representam a média - DP do número de unidades formadoras de colônias (UFC)
por grama de tecido de três camundongos e são representativos de 3 experimentos
independentes. . p < 0,05 em relação ao grupo controle (PBS). .. p < 0,05 quando
comparado aos 30 dias após a infecção.
Resultados
59
Parte 3. A IL-12 é essencial para o efeito protetor da lectina KM
+
na PCM
experimental, sendo sua produção por macrófagos murinos decorrente de
sinalização dependente de MyD88.
Para determinar se IL-12 e iNOS estavam envolvidos na proteção induzida pela lectina
KM
+
contra a infecção por P. brasiliensis, experimentos adicionais foram realizados com
camundongos NOS2
-
/
-
, IL-12
-
/
-
e WT tratados ou não terapeuticamente com jfKM
+
. Após 14
dias de infecção, tanto os camundongos WT como os NOS2
-
/
-
tratados, 10 dias após a
infecção, com jfKM
+
apresentaram característica histológica similar à descrita para
camundongos BALB/c tratados com a lectina, qual seja, leve espessamento dos septos
alveolares. Apenas um dos animais apresentou um pequeno granuloma bem organizado,
circunscrevendo poucos fungos (Figura 9B e 9D). Contrariamente, camundongos IL-12
-
/
-
tratados ou não terapeuticamente com jfKM
+
apresentaram, aos 30 dias de infecção, múltiplos
granulomas confluentes, com o parênquima pulmonar quase todo substituído por lesões
granulomatosas ao redor de numerosos fungos levando ao comprometimento do órgão
(Figura 10A e 10B). Apenas os camundongos WT responderam ao tratamento com jfKM
+
apresentando características histológicas similares às descritas anteriormente para os
camundongos BALB/c tratados com a lectina (Figura 10D). Concomitantemente, os animais
IL-12
-
/
-
tratados ou não com jfKM
+
apresentaram, no período de 30 dias pós-infecção,
inúmeros infiltrados granulomatosos no fígado e no baço (dados não mostrados).
Constatamos ainda que aos 14 dias pós-infecção, a quantidade de colônias recuperada
nos pulmões dos camundongos NOS2
-
/
-
e WT tratados, 10 dias após a infecção, com jfKM
+
foi significativamente menor à obtida nos pulmões dos animais dos grupos controles WT e
NOS2
-
/
-
injetados com PBS (Figura 11). Diferentemente, aos 30 dias pós-infecção, o número
de colônias recuperadas nos pulmões dos animais IL-12
-
/
-
tratados ou não com a lectina
jfKM
+
foi significativamente superior ao recuperado nos animais WT tratados com jfKM
+
Resultados
60
(Figura 12A). Comparando os animais IL-12
-
/
-
tratados com jfKM
+
com os não tratados,
observamos que não houve diferença significativa entre o número de fungos recuperados dos
órgãos dos animais desses dois grupos (Figura 12A).
Em ensaios paralelos, determinamos os níveis de IFN-!*produzidos no macerado
pulmonar de camundongos IL-12
-/-
e WT tratados ou não terapeuticamente com jfKM
+
. Os
níveis de IFN-!*detectados no macerado pulmonar de camundongos IL-12
-/-
tratados ou não
com jfKM
+
foram significativamente inferiores (p < 0,05) aos detectados no macerado
pulmonar dos camundongos WT tratados com jfKM
+
(Figura 12B). Além disso, a produção
de IFN-!* no macerado pulmonar dos camundongos C57BL/6 WT tratados com jfKM
+
foi
significativamente superior aos níveis de IFN-!* produzidos nos pulmões dos animais WT
controles (Figura 12B).
Usando camundongos IL-12
-/-
, foi possível evidenciar que a proteção conferida pela
lectina KM
+
é fundamentalmente exercida através da indução da produção de IL-12. Tal
resultado conduziu a etapa seguinte do trabalho, na qual se avaliou o potencial da referida
lectina em estimular in vitro a produção de IL-12p70 por macrófagos provenientes do baço de
animais deficientes de MyD88 (MyD88
-
/
-
). Assim, células aderentes do baço, provenientes de
animais MyD88
-/-
e WT foram incubadas com jfKM
+
na concentração de ,)g/ml ou LPS
(controle positivo, 10 )g/ml). Após 48h de incubação, os sobrenadantes foram submetidos à
dosagem de IL-12p70. Surpreendentemente, verificamos que macrófagos provenientes dos
animais deficientes de MyD88 não produzem IL-12p70 quando estimuladas com jfKM
+
,
sugerindo que KM
+
induz a produção de IL-12 provavelmente via receptor do tipo Toll
(Tabela 2).
Resultados
61
Figura 9. Camundongos NOS2
-
/
-
infectados com P. brasiliensis e tratados com KM
+
apresentam pequeno número de lesões pulmonares, similarmente ao que
ocorre com os camundongos WT. Camundongos C57BL/6 WT e NOS2
-
/
-
foram
infectados com P. brasiliensis e tratados com jfKM
+
(B e D) ou injetados com
PBS (A e C). Aos 14 dias após a infecção, as lesões granulomatosas foram
observadas nos pulmões dos animais NOS2
-
/
-
(A e B) e WT (C e D). Observa-se
no tecido pulmonar tanto dos animais WT (C) como dos NOS2
-
/
-
(A) injetados
com PBS, vários focos de granulomas isolados ou coalescentes, circunscrevendo
diversos fungos. Nesse mesmo período, o tecido pulmonar dos animais WT (D) e
NOS2
-
/
-
(B) tratados com jfKM
+
apresentou leve espessamento dos septos
alveolares e pequeno infiltrado mononuclear. Coloração H&E. Barras = 200)m.
Resultados
62
Figura 10. Camundongos IL-12
-
/
-
infectados com P. brasiliensis e tratados ou não com
KM
+
apresentam grande comprometimento pulmonar. Camundongos
C57BL/6 WT e IL-12
-
/
-
foram infectados com P. brasiliensis e tratados com
jfKM
+
(B e D) ou injetados com PBS (A e C). Aos 30 dias após a infecção, as
lesões granulomatosas foram observadas nos pulmões dos animais IL-12
-
/
-
(A e
B) e WT (C e D). Observa-se no tecido pulmonar tanto dos animais WT (C) como
dos IL-12
-
/
-
(A) injetados com PBS, vários focos de granulomas isolados ou
coalescentes, circunscrevendo diversos fungos. Nesse período, o tecido pulmonar
dos animais WT tratados com jfKM
+
(D) apresentou leve espessamento dos septos
alveolares. Já, nos animais IL-12
-
/
-
tratados com jfKM
+
, observa-se o parênquima
pulmonar quase todo substituído por lesões granulomatosas coalescentes (B).
Coloração H&E. Barras = 200)m.
Resultados
63
Figura 11. Recuperação de fungos dos pulmões de camundongos C57BL/6 WT e NOS2
-
/
-
infectados (UFC). O número de colônias recuperadas do tecido pulmonar de
camundongos C57BL/6 WT e NOS2
-
/
-
infectados com P. brasiliensis e tratados ou
não com jfKM
+
foi determinado 14 dias após a infecção. As colônias de fungos
foram contadas e os resultados expressos como número de unidades formadoras de
colônias (UFC) por grama de tecido. Os resultados representam a média - DP de
três camundongos. . p < 0,05 em relação ao grupo controle (PBS).
Resultados
64
Figura 12. Recuperação de fungos e produção de IFN-! dos macerados pulmonares dos
camundongos IL-12
-
/
-
e WT. Aos 30 dias após a infecção com P. brasiliensis, os
pulmões dos camundongos IL-12
-
/
-
e WT infectados e tratados ou não com jfKM
+
foram removidos, um deles pesado e homogeneizado em 1 ml de PBS. (A)
Número de colônias recuperadas (UFC). As colônias de fungos foram contadas e
os resultados expressos como número de unidades formadoras de colônias (UFC)
por grama de tecido. (B) Níveis de IFN-! no macerado pulmonar. Os resultados
representam a média - DP de três camundongos.
. p < 0,05 em relação aos animais selvagens (WT).
Resultados
65
Tabela 2. Produção de IL-12 por macrófagos de camundongos WT e MyD88
-
/
-
.
IL-12p70 (pg/ml) - DP
a
Sobrenadantes de cultura
de macrófagos do baço
Meio LPS KM
+
WT (C57BL/6)
ND
b
37,07 - 17,01 75,97 - 29,40
MyD88
-
/
-
ND ND ND
a
Valores correspondem às médias - DP (triplicata) para IL-12p70 liberada no sobrenadante de
cultura de macrófagos de baço (1 x 10
7
) estimulados ou não com jfKM
+
(5)g/ml), ou ainda
com LPS (10)g/ml), por 48h.
b
ND, Não Detectado.
D
D
i
i
s
s
c
c
u
u
s
s
s
s
ã
ã
o
o
Um homem deixa de ser um
principiante em qualquer ciência e
se torna um mestre quando aprende
que vai ser um principiante a vida
inteira.
Robin Collingwood
Discussão
67
A IL-12 é uma citocina pró-inflamatória heterodimérica que induz a produção de IFN-
!, favorece a diferenciação de linfócitos Th1 e interliga a imunidade inata à adaptativa. Esse
tipo de diferenciação induzida por IL-12 é crucial para a eliminação de microorganismos
intracelulares, tais como Listeria monocytogenes, Toxoplasma gondii, alguns tipos de
micobactérias, leishmanias e fungos (ALIBERTI; JANKOVIC; SHER, 2004; CLEMONS et
al., 2000; GOTO; LINDOSO, 2004; KANG; KIM, E.; KIM, S, 2005; TRINCHIERI, 2003).
Dessa forma, muitos estudos têm analisado o papel de IL-12 endógena na resistência a
infecções, bem como a possibilidade de seu uso como terapia nessas infecções. (AOKI;
XING, 2003; KAWAKAMI, 2003; TRINCHIERI, 1998). Lectinas figuram entre as moléculas
com potencial de induzir citocinas, modular a resposta imunitária e, assim, serem usadas
terapeuticamente. Previamente foi demonstrado que a lectina KM
+
tem a capacidade de
induzir a produção de IL-12 in vitro por macrófagos ou in vivo, e, dessa forma, ser capaz de
mudar o perfil de secreção de citocinas de um padrão Th2 para Th1, conferindo o
desenvolvimento de uma resposta protetora Th1 contra Leishmania major, em um modelo de
infecção em camundongos BALB/c (PANUNTO-CASTELO et al. 2001). Uma vez que o
efeito profilático de KM
+
se mostrou ser independente do antígeno, ou seja, a administração
apenas da lectina foi capaz de proteger os camundongos contra a infecção por L. major,
aventamos a hipótese de que talvez a lectina obtida da planta (jfKM
+
), bem como sua forma
recombinante (rKM
+
), pudessem modificar, da mesma maneira, o curso da PCM experimental
murina, levando à proteção de camundongos infectados. Além disso, vislumbramos a
possibilidade de usar KM
+
profilática e terapeuticamente, bem como identificar os
mecanismos responsáveis pela indução de IL-12.
A reação granulomatosa $ tipo específico de reação inflamatória crônica
desencadeada por uma variedade de agentes infecciosos e não infecciosos, na qual coexistem
inflamação ativa, destruição tecidual e tentativa de reparo, caracterizada por acúmulos de
Discussão
68
macrófagos modificados (células epitelióides) $ é predominante na PCM humana e
experimental e desempenha um importante papel na defesa do hospedeiro contra o fungo.
Diante da importância dos granulomas na PCM, estabelecemos a histopatologia do tecido
pulmonar como o parâmetro para a avaliação da interferência da administração de jfKM
+
no
curso da infecção experimental por P. brasiliensis em modelo murino. A análise
histopatológica, por microscopia óptica dos pulmões dos camundongos dos sete grupos
experimentais, tratados com KM
+
antes (profilaxia) ou após (terapia) a infecção com
leveduras de P. brasiliensis, revelou que todos esses grupos foram capazes de prevenir a
disseminação do fungo dos pulmões para outros órgãos, porém, detectamos um grupo em
cada um dos dois protocolos experimentais nos quais a ação benéfica de KM
+
sobressaiu-se: o
grupo A.II (animais injetados com KM
+
nos dias 10 e 3 antes da infecção) e o grupo B.IV
(animais injetados com KM
+
10 dias após a infecção). O efeito de KM
+
nesses dois grupos foi
tão extraordinário que reduziu em até 3 vezes a ocorrência de granulomas nos animais do
grupo A.II quando comparada aos outros grupos tratados com KM
+
e infectados com P.
brasiliensis, grupos esses com menor quantidade de granuloma que os controles. Um fato
bastante interessante foi a ausência de graulomas no tecido pulmonar em um dos animais
desse grupo A.II, havendo apenas espessamento dos septos alveolares. De forma similar, os
animais do grupo B.IV (injetados com KM
+
10 dias após a infecção) apresentaram
características histológicas próximas às de um tecido pulmonar normal e, de forma ainda mais
surpreendente, houve uma total ausência de granulomas e de leveduras nos pulmões desses
animais, apresentando apenas um leve espessamento de septos alveolares.
Nos ensaios de UFC, assim como nos ensaios histopatológicos, a ação benéfica de
KM
+
destacou-se nos camundongos do grupo A.II e nos camundongos do grupo B.IV. A
quantidade de colônias recuperada dos pulmões dos camundongos do grupo A.II (injetados
com KM
+
nos dias 10 e 3 antes da infecção), foi significativamente inferior à obtida nos
Discussão
69
pulmões dos grupos A.I, A.III e A.IV, e 95% menor que a obtida nos pulmões dos animais
injetados com PBS antes da infecção. Quando analisamos a quantidade de colônias
recuperada dos pulmões dos camundongos dos grupos B.I, B.II e B.III (tratados com KM
+
após a infecção), vimos que também era menor em relação à quantidade de colônias obtida
nos pulmões dos animais do grupo controle (PBS). Coerentemente com os resultados obtidos
nas análises histopatológica e histocitométrica, os animais do grupo B.IV (tratados com KM
+
10 dias após a infecção), não apresentaram qualquer crescimento de células fúngicas no
macerado pulmonar.
Os dados obtidos mostram haver ação benéfica de KM
+
não somente quando
administrada antes da infecção por P. brasiliensis, mas também quando administrada após a
infecção, confirmando seu efeito terapêutico. A análise de todos os resultados preliminares
suscitou a hipótese de que a resistência observada na PCM é um possível reflexo de mudanças
induzidas pela lectina no perfil de citocinas produzidas, levando à produção de IL-12 por
macrófagos, favorecendo o estabelecimento de resposta polarizada do tipo Th1. Diversas
evidências na literatura vêm mostrando reiteradamente que a resistência a esse fungo é
decorrente da produção de citocinas que favorecem respostas imunitárias de tipo Th1
(AMARAL et al., 2005; KARHAWI et al., 2000; KASHINO et al., 2000; MAMONI et al.,
2002; OLIVEIRA et al., 2002). Panunto-Castelo et al. (2001) verificaram que células do baço
de camundongos BALB/c pré-tratados com jfKM
+
produzem altas concentrações de IFN-!, e
tal produção é uma conseqüência da ação direta da lectina sobre macrófagos, indutora da
liberação de IL-12.
Dessa forma, para avaliar se o efeito protetor de KM
+
na PCM experimental era
decorrente de sua propriedade imunomoduladora, escolhemos o melhor tratamento, dentro de
cada um dos dois protocolos experimentais ensaiados, para dar seguimento ao nosso estudo.
Discussão
70
A análise histopatológica dos pulmões dos animais infectados com leveduras de P.
brasiliensis e tratados com jfKM
+
ou rKM
+
antes ou após a inoculação revelou, aos 30 dias de
infecção, características histológicas próximas às de um tecido pulmonar normal. Os pulmões
dos animais injetados com PBS apresentaram quadro histopatológico com considerável
comprometimento tecidual e substituição de quase todo o parênquima pulmonar por lesões
granulomatosas, criando uma área confluente de consolidação. Comparando os resultados
histopatológicos obtidos nos pulmões dos camundongos que receberam jfKM
+
ou rKM
+
,
previamente ou após a infecção, com os resultados obtidos nos pulmões dos animais do grupo
controle (PBS), evidenciamos que a susceptibilidade dos camundongos BALB/c ao P.
brasiliensis foi satisfatoriamente modificada. Tais dados reafirmam os resultados prévios de
que KM
+
independente, do regime utilizado para sua administração, antes ou após a infecção
com P. brasiliensis, protege os animais infectados experimentalmente e mostram que a ação
benéfica de KM
+
foi independente da procedência da lectina administrada, de planta ou
recombinante.
Nascimento et al. (2002) demonstraram que camundongos resistentes à PCM, com
resposta imunitária efetiva, apresentam poucos e pequenos granulomas nos pulmões, quadro
atribuído a elevados níveis de TNF-#, citocina importante na formação do granuloma por
exercer atração de células efetoras ativadas, acúmulo de macrófagos e sua diferenciação em
células epitelióides. Os dados obtidos em nossos experimentos guardam relação com a
literatura atual sobre a resposta imune na PCM. Os cortes histológicos pulmonares dos
animais submetidos ao tratamento com KM
+
após a infecção com P. brasiliensis
apresentaram, sobretudo, apenas um leve espessamento dos alvéolos, conservando a
integridade do parênquima pulmonar, quadro característico de resposta imune efetiva. É
importante ressaltar que a administração profilática ou terapêutica de KM
+
não leva a uma
intensa inflamação nos pulmões como a observada após o tratamento com IL-12
Discussão
71
recombinante (ARRUDA et al., 2002). Além disso, animais tratados com apenas uma dose de
KM
+
não apresentaram resposta imunitária humoral contra essa lectina (dados não
mostrados), impedindo assim que sua meia-vida seja diminuída pelo clearance efetuado por
anticorpos.
O benefício trazido pela administração de jfKM
+
e de rKM
+
não foi restrito à análise
histopatológica, estendendo-se para a recuperação de UFC nos pulmões. Como descrito na
literatura, a recuperação de UFC é um parâmetro confiável para analisar o curso de uma
infecção $ progressão ou cura $ discriminando animais resistentes de susceptíveis
(CLEMONS et al., 2005). A queda do número de colônias recuperadas dos pulmões de
animais infectados é um traço reconhecido de resistência a P. brasiliensis, como previamente
verificado (MATTOS-GROSSO et al., 2003, NASCIMENTO et al., 2002; PINA et al., 2004;
SINGER-VERMES et al., 1993, 1995; SOUTO et al., 2000; 2003). No ensaio de UFC, assim
como no ensaio histopatológico, a administração profilática ou terapêutica de jfKM
+
ou rKM
+
beneficiou os camundongos. A quantidade de colônias recuperada tanto dos pulmões dos
camundongos BALB/c injetados com jfKM
+
ou rKM
+
, nos dias 10 e 3 antes da infecção como
dos que foram tratados com jfKM
+
ou rKM
+
10 dias após a infecção, foi significativamente
inferior à obtida nos pulmões dos animais do grupo controle (PBS), aos 30 dias pós-infecção.
Resultado similar foi observado, aos 60 dias de infecção, nos pulmões dos animais tratados
com jfKM
+
. Além disso, diferentemente dos animais do grupo controle (PBS) que
apresentavam grande número de UFC aos 30 dias após infecção, número esse que aumentou
significativamente aos 60 dias de infecção, não foram recuperadas leveduras no fígado dos
animais tratados com jfKM
+
durante o período analisado (30 e 60 dias pós-infecção). Nossos
resultados são indicativos de que tanto a lectina jfKM
+
como sua forma recombinante rKM
+
,
levam ao aumento do clearance de fungos dos pulmões.
Discussão
72
A produção precoce de IL-12, seguida da produção contínua de IFN-! tem sido
associada com fenótipo de resistência por levar à efetiva resposta imunitária adaptativa e
conseqüente proteção contra P. brasiliensis (CALICH; KASHINO, 1998). A capacidade da
IL-12 induzir e manter respostas Th1 antígeno específicas é essencial para controlar infecções
provocadas por diferentes tipos de patógenos intracelulares e fungos, dentre eles o P.
brasiliensis. Uma vez que KM
+
induz a produção de IL-12 por macrófagos (PANUNTO-
CASTELO et al. 2001), ponderamos que os resultados observados tanto nos ensaios
histopatológicos como nos ensaios de UFC poderiam ser decorrentes de mudanças induzidas
no perfil das citocinas produzidas. Dessa maneira, avaliamos in vivo a interferência exercida
pela administração de jfKM
+
ou rKM
+
sobre o curso do modelo murino de infecção com P.
brasiliensis, comparando os níveis de citocinas pró-inflamatórias produzidas no macerado
pulmonar dos animais injetados ou não com a lectina. Nossos resultados mostram que, aos 30
dias de infecção, os níveis de IL-12p70 no macerado pulmonar dos animais injetados
profilática e terapeuticamente com jfKM
+
ou rKM
+
foram significativamente superiores aos
produzidos pelos animais do grupo controle (PBS), os quais apresentaram, nesse período, uma
queda na produção de IL-12p70.
De maneira geral, enquanto os animais tratados com KM
+
antes ou após a infecção
apresentaram aumento nos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNF-#& e IFN-!) aos
30 dias de infecção, os animais pertencentes ao grupo controle (PBS), apresentaram uma
diminuição da produção dessas citocinas e aumento na produção das citocinas
antiinflamatórias IL-4 e IL-10.
O aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias nos animais tratados com KM
+
antes ou após a infecção coincidiu com a menor recuperação de fungos nos pulmões desses
animais aos 30 dias de infecção. Nossos resultados indicam que tanto a profilaxia como a
terapia com KM
+
foram capazes de estimular a formação de um microambiente pró-
Discussão
73
inflamatório que, possivelmente, resultou no melhor controle da infecção fúngica, como
determinado anteriormente através dos parâmetros histológicos e de UFC.
Respostas Th1 atendem a necessidade de produção precoce das citocinas IFN-!, TNF-
#, e IL-2, estabelecida por CANO et al. (1998), como primordial no mecanismo de resistência
a P. brasiliensis. A importância da participação dessas citocinas produzidas em decorrência
da ativação do eixo Th1 da imunidade vem sendo claramente reforçada por estudos
demonstrativos de que animais geneticamente deficientes de IFN-! ou de receptor de TNF-#
são extremamente susceptíveis à infecção com leveduras de P. brasiliensis (SOUTO et al.,
2000). Coerentemente, a resistência à infecção foi correlacionada à produção persistente de
TNF-# por macrófagos (NASCIMENTO et al., 2002). Por outro lado, Oliveira et al. (2002)
mostraram haver associação entre produção de elevados níveis de IL-4 e IL-10 e maior
gravidade da PCM humana e experimental. IL-4 é uma citocina imunomoduladora, capaz de
induzir o desenvolvimento de resposta tipo Th2 durante a fase inata da resposta imune,
levando a uma inibição da produção de IFN-!& e por conseqüência, à supressão da ativação de
macrófagos, mediada por essa citocina (TANAKA et al., 1993). Pina et al. (2004)
demonstraram que camundongos deficientes de IL-4 (IL-4
-
/
-
) são mais resistentes à PCM
experimental. Para vários patógenos intracelulares, obrigatórios ou facultativos, a
neutralização de IL-4 endógena induz proteção em hospedeiros susceptíveis, permitindo o
desenvolvimento preferencial de resposta imune Th1 (ROMANI et al., 1992). Os resultados
obtidos no presente estudo corroboram os dados da literatura, mostrando haver doença mais
grave nos animais do grupo controle (PBS) que apresentaram menor produção de citocinas
Th1.
Uma vez que camundongos BALB/c tratados com jfKM
+
produzem níveis de IL-
12p70 superiores aos produzidos pelos animais do grupo controle (PBS), e que, estudos
realizados por Panunto-Castelo et al. (2001) mostraram haver relação direta entre a produção
Discussão
74
dessa citocina e a proteção contra L. major, aventamos a hipótese de que a lectina KM
+
pudesse estar favorecendo a resistência à infecção fúngica, fundamentalmente através da
indução da produção de IL-12, favorecendo o desenvolvimento de resposta do tipo Th1. Para
confirmar tal hipótese, ampliamos nossos estudos para o uso de camundongos geneticamente
deficientes de IL-12 (IL-12
-
/
-
) tratados ou não com jfKM
+
, 10 dias após a infecção com
leveduras de P. brasiliensis, tendo a linhagem C57BL/6 como controle (animais selvagens -
WT) de mesmo background genético. A análise histopatológica do tecido pulmonar dos
camundongos IL-12
-
/
-
tratados ou não com jfKM
+
revelou, aos 30 dias de infecção,
características histológicas similares, havendo a presença de múltiplos granulomas
confluentes, com o parênquima pulmonar quase todo substituído por lesões granulomatosas
ao redor de numerosos fungos levando ao comprometimento do órgão. Apenas os
camundongos WT responderam ao tratamento com jfKM
+
apresentando características
histológicas similares às descritas anteriormente para os camundongos BALB/c tratados com
a lectina. Simultaneamente, os animais IL-12
-
/
-
tratados ou não com jfKM
+
apresentaram
número de colônias recuperadas no pulmão significativamente superior ao recuperado nos
animais WT tratados com jfKM
+
. Não houve diferença estatística na quantidade de UFC
recuperada dos órgãos dos animais IL-12
-
/
-
tratados ou não com jfKM
+
. Paralelamente,
determinamos os níveis de IFN-! produzidos no macerado pulmonar desses camundongos. Os
camundongos IL-12
-/-
tratados ou não com jfKM
+
produziram níveis de IFN-!*
significativamente inferiores aos detectados no macerado pulmonar dos camundongos WT
tratados com jfKM
+
. Os camundongos WT tratados com jfKM
+
apresentaram produção de
IFN-!, superior à verificada nos animais WT controles. Esses resultados são extremamente
elucidativos, tornando clara a proposição de que a proteção conferida pela lectina KM
+
na
PCM experimental é fundamentalmente exercida através da indução da produção de IL-12.
Discussão
75
Tem sido mostrado que animais IL-12
-
/
-
ou com neutralização da IL-12 endógena,
apresentam aumento da carga fúngica, com desenvolvimento de graves lesões pulmonares e
susceptibilidade a infecções fúngicas diversas (CAIN; DEEPE, 2000; DEEPE et al., 2000).
Camundongos IL-12
-
/
-
, nos quais a via de produção de IFN-! é deficiente, são extremamente
susceptíveis à PCM, apresentando respostas muito similares às encontradas em camundongos
geneticamente deficientes de IFN-!, que apresentam granulomas coalescentes incapazes de
conter a disseminação fúngica (SOUTO et al., 2000).
SOUTO et al. (2003) demonstraram que IFN-! estimula a migração preferencial, para
o foco inflamatório, de linfócitos Th1 que, uma vez nos tecidos inflamados, podem amplificar
a produção de IFN-!, a ativação de macrófagos e sua capacidade fungicida, atribuída à
produção de óxido nítrico (NO), limitando assim, o crescimento do fungo e sua disseminação,
além de estimular a formação de granulomas compactos. O fato de NO apresentar um efeito
dualista, ora mediando a morte de fungos por macrófagos, ora deprimindo a resposta celular
(Nascimento et al., 2002), motivou-nos a determinar se a produção desse composto estava,
assim como a IL-12, diretamente vinculada à proteção induzida pela lectina KM
+
. Deste
modo, camundongos geneticamente deficientes de NOS2 (NOS2
-
/
-
) e WT foram infectados
com leveduras de P. brasiliensis e tratados ou não com jfKM
+
. Devido a maior
susceptibilidade desses animais a infecções diversas e o número limitado de animais para
experimentação, decidimos fazer as análises apenas no tempo de 14 dias após a infecção.
Utilizamos como parâmetro para analisar o curso da infecção os ensaios de histopatologia de
lesões teciduais e de recuperação de leveduras dos pulmões. Os camundongos NOS2
-
/
-
tratados com jfKM
+
10 dias após a infecção, apresentaram características histológicas
similares às observadas nos pulmões dos camundongos WT tratados com a lectina, quais seja,
leve espessamento dos septos alveolares e a presença de um único pequeno granuloma bem
organizado, circunscrevendo poucos fungos. Da mesma forma, a quantidade de colônias
Discussão
76
recuperada nos pulmões dos camundongos NOS2
-
/
-
tratados com jfKM
+
, foi similar à
recuperada nos pulmões dos WT tratados com jfKM
+
. Esses animais, NOS2
-
/
-
e WT tratados
com jfKM
+
, apresentaram um número de fungos nos pulmões significativamente inferior ao
obtido nos pulmões dos animais NOS2
-
/
-
e WT injetados com PBS. Além disso, não houve
diferença significativa na quantidade de colônias recuperada nos pulmões dos camundongos
WT ou NOS2
-
/
-
injetados com PBS. Esses dados estão em consonância com a recente
descrição feita por Bernardino e Calich (2005), onde animais NOS2
-
/
-
não apresentam maior
susceptibilidade à PCM que animais WT.
Esses resultados indicam claramente que a proteção conferida pela lectina jfKM
+
não
está vinculada, essencialmente, à produção de NO. Outros compostos podem estar envolvidos
na destruição dos fungos por fagócitos. A capacidade microbicida de macrófagos está ligada à
produção tanto de reativos intermediários do oxigênio, como à produção de reativos do
nitrogênio (NO). Embora tenha sido descrito que a resistência à infecção por P. brasiliensis
não está diretamente relacionada aos níveis de H
2
O
2
, uma vez que tanto camundongos
resistentes (A/Sn), quanto susceptíveis (B10/A), produzem níveis similares desse composto
(NASCIMENTO et al., 2002), evidências na literatura vêm demonstrando o envolvimento de
H
2
O
2
na morte dos fungos. A liberação de H
2
O
2
e de ânion superóxido (O
2
-
) por macrófagos e
monócitos é essencial para promover a morte de Candida albicans (VAZQUEZ-TORRES;
BALISH, 1997). Calvi et al. (2003) demonstraram haver associação entre elevados níveis de
H
2
O
2
por macrófagos e aumento da atividade fungicida em pacientes com PCM, o que sugere
o envolvimento de metabólitos do oxigênio na morte de P. brasiliensis por essas células.
Além disso, Carmo et al. (2006) demonstraram haver associação direta entre a produção de
H
2
O
2
por monócitos humanos ativados por TNF-# e a morte intracelular de P. brasiliensis do
isolado Pb18. Não descartamos que outros mecanismos microbicidas dependentes de IFN-!,
quais seja, degradação de triptofano pela enzima INDO (indolamina 2,3 dioxigenase) e
Discussão
77
diminição de ferro intracelular, possam estar envolvidos e somar para a ação benéfica que
KM
+
tem sobre o curso da infecção com P. brasiliensis, como ocorre em infecções com
Toxoplasma gondii (DAUBENER; MACKENZIE, 1999; HALONEN; WEISS, 2000).
Demonstramos anteriormente, que KM
+
de planta ou recombinante apresenta a
propriedade de estimular, in vitro, a produção de IL-12 por macrófagos murinos. Esse
resultado, somado àqueles que indicam o efeito imunomodulador exercido pela lectina jfKM
+
in vivo, conduziram a etapa seguinte do trabalho, na qual fomos avaliar se a referida lectina
era capaz de estimular, in vitro, a produção de IL-12p70 por macrófagos provenientes do baço
de animais geneticamente deficientes de MyD88 (MyD88
-
/
-
), uma molécula adaptadora
importante na sinalização para produção de IL-12 via receptores que reconhecem padrões
moleculares associados a patógenos, chamados receptores do tipo Toll (TLRs). A produção de
citocinas é uma conseqüência da ativação celular, a qual pode ser induzida por interações
entre lectinas e a porção glicosilada de um determinado receptor na superfície celular
(VILLALOBO; GABIUS, 1998). A estimulação dos TLRs inicia uma série de processos de
sinalização intracelular que culminam na liberação de proteínas pró-inflamatórias. Estudos
realizados em camundongos deficientes de TLRs e de MyD88
-
/
-
têm demonstrado a
importância dessa família de moléculas em uma ampla gama de respostas inflamatórias,
ligando as respostas imunitárias inata e adaptativa (TAKEDA et al., 2003, 2005). Nossos
resultados indicam que a liberação de IL-12p70 nos sobrenadantes de cultura de macrófagos
estimulados com jfKM
+
foi totalmente dependente de MyD88, uma vez que macrófagos de
animais MyD88
-
/
-
não foram capazes de produzir IL-12 em resposta ao estímulo in vitro de
jfKM
+
. Tal resultado sugere que KM
+
é capaz de ligar, ativar receptores tipo Toll e estimular
a síntese de IL-12p70 por macrófagos através de vias mediadas pela molécula adaptadora
MyD88. Uma vez que todos os TLRs são glicosilados, podendo portanto, apresentar sítios que
contêm a manotriose (Man#1-3[Man#1-6]Man), à qual é altamente específica para KM
+
Discussão
78
(RANI et al., 1999), não foi possível identificarmos em qual TLR KM
+
se liga. Estudos
anteriores demonstraram que a sinalização por TLR3 não é dependente de MyD88, mas sim
de outra molécula adaptadora chamada TRIF (TAKEDA et al., 2005). Além disso, Panunto-
Castelo et al. (2001) mostraram que KM
+
induz a produção de IL-12 por macrófagos de
camundongos C3H/HeJ, os quais apresentam uma mutação espontânea no domínio
citoplasmático de TLR4 (P712H), (POLTORAK et al., 1998). Assim, provavelmente os
TLR3 e TLR4 não devem estar envolvidos no processo de sinalização induzido por KM
+
.
Em síntese, em todo o período analisado (60 dias), verificamos haver efeito benéfico
da administração da lectina KM
+
, de planta ou recombinante, nos animais infectados com P.
brasiliensis e submetidos à profilaxia ou à terapia com essa lectina. Aos 30 dias de infecção,
os animais tratados com KM
+
apresentaram simultaneamente à diminuição do número de
UFC recuperadas no tecido pulmonar, uma menor produção de IL-4, bem como um aumento
nos níveis de IL-12p70, IFN-!, e TNF-#, com claro desenvolvimento de resposta polarizada
do tipo Th1. Esse singular microambiente estabelecido parece ter levado a uma ativação mais
eficiente dos macrófagos alveolares, contribuindo para efetiva destruição das leveduras e
conseqüente preservação do parênquima do órgão. Além disso, não foram recuperadas
leveduras no fígado e no baço desses animais (dados não mostrados).
O modelo murino de infecção com P. brasiliensis, utilizado em nosso estudo,
proporciona várias evidências de que a lectina KM
+
favorece a resistência à infecção por P.
brasiliensis essencialmente através de sua capacidade de ativar macrófagos, via receptores
tipo Toll, e induzir a produção de IL-12 com conseqüente desenvolvimento de resposta
polarizada do tipo Th1. A propriedade terapêutica de KM
+
na PCM suscita a idéia de que essa
lectina possa ser utilizada como molécula imunomoduladora, regulando a produção de IL-12
em infecções pré-estabelecidas onde respostas Th1 são imprescindíveis. Tal proposição se
viabiliza por expressão do gene que codifica KM
+
em E. coli (SILVA et al., 2005) e por
Discussão
79
resultados obtidos com a lectina recombinante, que conserva as propriedades de
reconhecimento de carboidrato e ativação celular verificadas na molécula nativa, obtida de
planta.
O aumento substancial do número de casos de doenças fúngicas sistêmicas nos últimos
anos, aliado às dificuldades na obtenção de vacinas eficazes, torna patente a necessidade de
aprimoramento das terapias antifúngicas utilizadas (DEEPE, 2004). Diante disso, substâncias
imunomoduladoras vêm sendo utilizadas isoladamente, ou em associação à terapia antifúngica
convencional, como uma alternativa atraente de tratamento da doença (ARRUDA et al., 2002;
CLEMONS; BRUMMER; STEVENS, 1994; CLEMONS; LUTZ; STEVENS, 2001;
CLEMONS; STEVENS, 2006; DEEPE et al., 1996). Espera-se que essas abordagens possam
permitir uma redução nas doses das drogas utilizadas, as quais muitas vezes, apresentam
acentuada toxicidade que acaba sendo fator limitante no tratamento da doença fúngica. Uma
vez que substâncias imunomoduladoras podem induzir a imunidade mediada por células, e
que tal resposta vem sendo descrita por vários pesquisadores como protetora contra patógenos
intracelulares, o conjunto de resultados apresentados nesse estudo indica que a lectina KM
+
possa desempenhar papel importante como imunoterápico contra infecções por
Paracoccidioides brasiliensis, e abre perspectivas de que seu uso terapêutico possa ser
estendido a outras doenças cuja imunidade protetora dependa da indução de resposta Th1.
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Toda a nossa ciência, comparada
com a realidade, é primitiva e
infantil – e no entanto, é a coisa
mais preciosa que temos.
Albert Einstein
Conclusões
81
Os resultados obtidos nesse trabalho nos permitem concluir que a lectina KM
+
,
independentemente de sua fonte – de planta ou recombinante, apresenta ações profilática e
terapêutica eficazes contra infecção experimental por P. brasiliensis, monitorada através da
baixa recuperação de UFC e ausência ou pequeno número de lesões pulmonares. A eficácia
das ações profilática e terapêutica foi decorrente principalmente da indução de resposta
imunitária do padrão Th1, sendo a IL-12 uma citocina fundamental nesse processo, uma vez
que camundongos deficientes dessa citocina não se beneficiaram dos efeitos da KM
+
. Além
disso, podemos concluir que KM
+
induz a produção de IL-12 por se ligar a receptores que
cumprem suas funções de sinalização via molécula co-adaptadora MyD88, desde que
macrófagos de animais deficientes dessa molécula não produzem IL-12 em resposta a lectina.
É importante ressaltar que KM
+
exerce seu efeito por um mecanismo independente de NO.
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A ciência progride corrigindo erros
e não faz segredo do que ainda não
compreende.
Richard Dawkins
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