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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
ANA CAROLINE KOPPER
ADEQUAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE E
VIGOR DE SEMENTES DE Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
MARÇO/2008
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ANA CAROLINE KOPPER
ADEQUAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE E
VIGOR DE SEMENTES DE Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Agronomia – Nível Mestrado, para
obtenção do título de Mestre.
ORIENTADOR: PROFª. DRª. MARLENE
DE MATOS MALAVASI
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
MARÇO/2008
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Ata da reunião da Comissão Julgadora da Defesa de Dissertação da Biol. ANA
CAROLINE KOPPER. Aos quinze dias do mês de março do ano de 2008, às 10 horas,
sob a presidência da PROFª. DRª. MARLENE DE MATOS MALAVASI, em sessão
pública reuniu-se a Comissão Julgadora da defesa da Dissertação da Biol. Ana Caroline
Kopper, aluna do Programa de Pós-Graduação em Agronomia – Nível Mestrado com área
de concentração em “PRODUÇÃO VEGETAL”, visando à obtenção do título de
“MESTRE EM AGRONOMIA”, constituída pelos membros: Prof. Dr. Claudemir Zucareli
(UEL); Prof. Dr. Ubirajara Contro Malavasi (UNIOESTE)e Profª. Drª. Marlene de Matos
Malavasi (Orientadora - UNIOESTE).
Iniciados os trabalhos, a candidata submeteu-se à defesa de sua Dissertação, intitulada:
“ADEQUAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE E VIGOR DE
SEMENTES DE Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.”
Terminada a defesa, procedeu-se ao julgamento dessa prova, cujo resultado foi o
seguinte, observada a ordem de argüição:
Prof. Dr. Claudemir Zucareli................................................................ Aprovado
Prof. Dr. Ubirajara Contro Malavasi ...................................................... Aprovado
Profª. Drª. Marlene de Matos Malavasi (Orientadora) ............................. Aprovado
Apurados os resultados, verificou-se que a candidata foi habilitada, fazendo jus,
portanto, ao título de “MESTRE EM AGRONOMIA”, área de concentração:
”PRODUÇÃO VEGETAL”. Do que, para constar, lavrou-se a presente ata, que vai
assinada pelos senhores membros da Comissão Julgadora e por mim, Secretária.
Marechal Cândido Rondon, 15 de março de 2008.
_______________________________________
Prof. Dr. Claudemir Zucareli
_______________________________________
Prof. Dr. Ubirajara Contro Malavasi
____________________________________________
Profª. Drª. Marlene de Matos Malavasi(Orientadora)
_______________________________________
Noili Batschke – Secretária
UNIOESTE - UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
AGRONOMIA
“Os que confiam no Senhor, recebem sempre novas forças. Voam nas alturas como
águias, correm e não perdem as forças, andam e não se cansam”.
(Isaías 40:31)
À Isabelli, meu motivo maior de existir.
Ao Thiago, meu amor e companheiro nas lutas e conquistas.
Aos meus pais e irmãs, distantes, mas sempre presentes em meu coração.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela presença constante em minha vida.
À minha família, meu alicerce e maior incentivador, em especial ao meu
marido Thiago Cacção Villa.
À Universidade Estadual do Oeste do Paraná, que oportunizou a realização
deste curso.
À Fundação Araucária e à Capes, pela concessão da bolsa.
À minha orientadora, Profª Drª Marlene de Matos Malavasi, por me conduzir
na execução deste trabalho, pelos ensinamentos, carinho e compreensão.
Ao Núcleo de Estações Experimentais, pelo fornecimento das sementes.
Aos professores Drª Andréa Maria Teixeira Fortes e Dr. Claudemir Zucareli
pelas colaborações.
A todos os professores do curso, por compartilharem conhecimento e
profissionalismo, colaborando desta forma para minha formação. Agradeço em
especial aos professores Dr. Vandeir Francisco Guimarães, Dr. Eurides Kuster Macedo
Junior e Dr. Ubirajara Contro Malavasi, pelos conselhos e apoio.
Aos colegas, Neusa, Michele, Carla Francieli, Jardel, Vanessa, Vânia, Marcelo
e todos os outros que contribuíram na execução ou com apoio e incentivo.
Àqueles, não menos especiais, aqui esquecidos, mas que contribuíram para a
realização deste trabalho, obrigada.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................15
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................17
2.1 Espécie estudada..................................................................................................17
2.2 Germinação de sementes......................................................................................18
2.2.1 Fatores intrínsecos e ambientais........................................................................19
2.2.1.1 Água e embebição..........................................................................................19
2.2.1.2 Temperatura e substrato .................................................................................21
2.3 Qualidade fisiológica de sementes .......................................................................23
2.3.1 Condutividade elétrica ......................................................................................25
2.3.2 Tetrazólio..........................................................................................................29
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................35
3.1 Obtenção de sementes e local de realização dos experimentos .............................35
3.2 Embebição das sementes......................................................................................35
3.3 Caracterização dos lotes.......................................................................................36
3.3.1 Teor de água .....................................................................................................36
3.3.2 Massa de 1000 sementes...................................................................................37
3.4 Adequação de testes para avaliação da viabilidade e vigor de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.......................................................................37
3.4.1 Teste de germinação..........................................................................................37
3.4.2 Condutividade elétrica ......................................................................................39
3.4.3 Tetrazólio..........................................................................................................41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................45
4.1 Embebição das sementes......................................................................................45
4.2 Caracterização dos lotes.......................................................................................48
4.2.1 Teor de Água ....................................................................................................48
4.2.2 Massa de 1000 sementes...................................................................................48
4.3 Adequação de testes para avaliação da viabilidade e vigor de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.......................................................................49
4.3.1 Teste de Germinação.........................................................................................49
4.3.2 Condutividade elétrica ......................................................................................58
4.3.3 Tetrazólio..........................................................................................................64
5 CONCLUSÕES
.....................................................................................................70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................71
APÊNDICE
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Tegumento e endosperma (indicado por seta) de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze...................................................................42
FIGURA 2 Morfologia de sementes de Cariniana estrellensis (cot = cotilédone; eh =
eixo hipocótilo-radícula; cc = cilindro central; co = córtex; ic = região de
inserção dos cotilédones)......................................................................43
FIGURA 3 Curva de embebição de sementes de Cariniana estrellensis .................47
FIGURA 4 Efeito de diferentes substratos sobre porcentagens de germinação (G), de
plântulas normais (PN), de plântulas anormais (PAN) e de sementes
mortas (SM) em sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze....50
FIGURA 5 Velocidade média (semente/dia
-1
) de germinação de três lotes de
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze submetidas a
diferentes temperaturas e substratos......................................................51
FIGURA 6 Tempo médio de germinação de três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze submetidas a diferentes temperaturas e
substratos. ............................................................................................51
FIGURA 7 Porcentagens de germinação (G), de plântulas normais (PN), de
plântulas anormais (PAN) e de sementes mortas (SM) de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, em função da procedência do
lote.......................................................................................................52
FIGURA 8 Efeito de diferentes temperaturas sobre porcentagens de germinação (G),
de plântulas normais (PN), de plântulas anormais (PAN) e de sementes
mortas (SM) em sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze....52
FIGURA 9 Aspecto da solução de embebição com as sementes de Cariniana
estrellensis no teste de condutividade elétrica após 48 horas de
embebição............................................................................................64
FIGURA 10 Sementes viáveis de C. estrellensis (Raddi) Kuntze, coloridas em
diferentes concentrações de solução de tetrazólio, por períodos de
tempo crescente (2, 3, 4 e 5 horas respectivamente)...........................67
FIGURA 11 Representação das classes de viabilidade para sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze:Viáveis (Classes 1 a 4) e Inviáveis (Classes
5 a 8)....................................................................................................68
FIGURA 12 Alguns danos apresentados pelas sementes de Cariniana estrellensis
(Raddi) Kuntze depois de coloração em sal de tetrazólio. A: Classe 7 –
embrião intacto; B: Classe 7 – embrião em corte longitudinal; C: Classe
5 (dois embriões à esquerda) e Classe 7 (embrião à direita) – intactos; D:
Classe 5 (dois embriões à esquerda) e Classe 7 (embrião à direita) – em
corte longitudinal. ................................................................................69
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Médias de porcentagem de absorção de água em relação ao peso inicial
de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.........................46
TABELA 2 Teor de água inicial dos três lotes analisados de sementes de Cariniana
estrellensis
(Raddi) Kuntze ..................................................................48
TABELA 3 Massa de mil sementes dos três lotes analisados de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze..................................................49
TABELA 4 Porcentagem de plântulas anormais em três lotes de sementes de
Cariniana estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura
e substrato............................................................................................53
TABELA 5 Porcentagem de plântulas normais em três lotes de sementes de
Cariniana estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura
e substrato............................................................................................54
TABELA 6 Porcentagem de germinação de três lotes de sementes de
Cariniana
estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura e
substrato...............................................................................................55
TABELA 7 Porcentagem de sementes mortas em três lotes de sementes de
Cariniana estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura
e substrato............................................................................................55
TABELA 8 Velocidade média de germinação (semente/dia
-1
) de três lotes de
sementes de Cariniana estrellensis submetidas a diferentes condições de
temperatura e substrato.........................................................................56
TABELA 9 Tempo médio de germinação (dias) de três lotes de sementes de
Cariniana estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura
e substrato............................................................................................56
TABELA 10 Valores médios (µScm
-1
g
-1
) da condutividade elétrica de massa, para
dois lotes (LN – normal; LEnv – envelhecido artificialmente) de
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze em quatro
experimentos com combinações distintas de quantidade de sementes e
volume de água, em função do tempo de embebição. ...........................60
TABELA 11 Teor de água (TA), germinação (G) e índice de velocidade de
germinação (IVG) de três lotes de sementes de Cariniana estrellensis
(Raddi) Kuntze.....................................................................................61
TABELA 12 Valores médios (µScm
-1
g
-1
) da condutividade elétrica de massa, para
sementes de três lotes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze em cada
período de embebição...........................................................................62
TABELA 13 Metodologias testadas para emprego do teste de tetrazólio na avaliação
da qualidade fisiológica de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi)
Kuntze..................................................................................................66
TABELA 1A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para embebição de
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze..............................81
TABELA 2A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para teor de água e
massa de mil de três lotes de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi)
Kuntze..................................................................................................81
TABELA 3A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para porcentagens
de germinação (G), de plântulas normais (PN), plântulas anormais
(PAN) e sementes mortas (SM) de sementes de Cariniana estrellensis
(Raddi) Kuntze, em diferentes lotes, substratos e temperaturas.............81
TABELA 4A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para velocidade
média (VM) e tempo médio (TM) de germinação de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, em diferentes lotes, substratos e
temperaturas................................................................................................ 82
TABELA 5A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para condutividade
elétrica de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, nos
quatro experimentos da primeira etapa..................................................... 82
TABELA 6A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para condutividade
elétrica de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, na
segunda etapa (2g/50ml)............................................................................ 83
TABELA 7A Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos no teste de
tetrazólio para sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze. ......83
LISTA DE ABREVIATURAS
UNIOESTE – Universidade Estadual do Oeste do Paraná
RNA
m
– Ácido Ribonucléico mensageiro
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
BOD – Biochemical Oxygen Demand (Demanda Bioquímica de Oxigênio)
AOSA - Association of Official Seed Analysts
RESUMO
A importância da análise de sementes florestais nativas cresceu nos últimos anos,
devido ao impulso econômico e conservacionista que levaram ao aumento de
reflorestamentos. Metodologias de testes que avaliem a qualidade de lotes de sementes
desta natureza foram pouco estudadas. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer
bases para condução de testes de germinação, tetrazólio e condutividade elétrica com
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze. Para o teste de germinação
utilizaram-se dois tipos de substrato (areia e papel) e de temperatura (25°C e 20-30°C).
No teste de tetrazólio foram avaliadas as concentrações 0,05%, 0,1% e 0,25% da
solução de tetrazólio, nos tempos de coloração 2, 3, 4 ou 5 horas. O teste de
condutividade elétrica consistiu no emprego de 2g e 4g de sementes para 50 mL e 75
mL de água. Em todos os testes o delineamento adotado foi o inteiramente casualizado
em esquema fatorial 2 x 2 x 3 (dois substratos, duas temperaturas e três lotes) para o
teste de germinação, 2 x 12 (dois lotes e 12 períodos de embebição) para o teste de
condutividade elétrica e 3 x 4x 3 (três concentrações da solução de tetrazólio, 4 tempos
de coloração e três lotes) para o teste de tetrazólio. O substrato papel e a temperatura
de 25°C mostraram-se mais adequados para a realização do teste de germinação. Para
o teste de condutividade elétrica a utilização de 2 g de sementes em 50 mL de água
com embebição por 48 horas foi eficiente na classificação dos lotes quanto ao vigor. O
teste de tetrazólio apresentou diversos resultados favoráveis, ficando assim a critério
do analista a escolha do método mais adequado as suas necessidades. As
concentrações de 0,05% por 4 ou 5 horas, de 0,1% por 3 ou 4 horas e de 0,25% por 2
ou 3 horas permitiram a avaliação da viabilidade, com resultado semelhante ao teste de
germinação.
Palavras-chave: Lecythidaceae, jequitibá-branco, qualidade fisiológica.
ABSTRACT
The importance of native forest seeds analysis grew in recent years, due to economic
and conservationist impulse that led to the increase of reforestation. Methodologies of
tests to assess the quality of seed lots of this kind were little studied. The objective of
this work was to establish bases for conducting tests of germination, tetrazolium and
electrical conductivity with Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze seeds. For the
germination test were used two types of substrate (sand and paper) and temperature
(25°C and 20-30°C). In the tetrazolium test were evaluated concentrations 0,05%,
0,1% and 0,25% of the tetrazolium solution, in times of colour 2, 3, 4 or 5 hours. The
electrical conductivity test consisted in employment of 2 g and 4 g of seeds to 50 mL
and 75 mL of water. In all tests the design adopted was a completely randomized in a
factorial 2 x 2 x 3 (two substrates, two temperatures and three lots) for the germination
test, 2 x 12 (two lots and 12 periods of soaking) to the electrical conductivity test and 3
x 4 x 3 (three concentrations of the tetrazolium solution, 4 times of color and three
lots) for the tetrazolium test. The substrate role and temperature of 25°C were more
appropriate for the germination test. For the electrical conductivity test use of 2 g of
seeds in 50 mL of water to soak for 48 hours was efficient in the classification of the
lots on the vigor. The tetrazolium test presented several favourable results, thus the
discretion of the analyst to choose the method most appropriate to your needs.
Concentrations of 0,05% by 4 or 5 hours, 0,1% for 3 or 4 hours and 0,25% for 2 or 3
hours allowed the viability assessment, with results similar to germination test.
Keywords:
Lecythidaceae, jequitibá-branco, physiological quality.
15
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos países com maior área de cobertura florestal, incluindo
florestas naturais e plantadas. Grande parte das florestas naturais sofreu, desde o
período de colonização, impactos irreversíveis, sendo tais áreas utilizadas tanto para a
exploração desordenada da madeira como para abertura de áreas agrícolas ou mesmo
para ocupação territorial, entre outros motivos. A Floresta Atlântica é um exemplo da
degradação desses ecossistemas, permanecendo atualmente, de acordo com a OIMT
(2006), apenas cerca de 7% da superfície original.
As florestas desempenham papéis importantes, agindo como reservas da
biodiversidade, atuando no equilíbrio climático e na proteção de mananciais e do solo
e, desta forma, na qualidade de vida humana. A exploração indevida destes
ecossistemas causa problemas que afetam, portanto, direta ou indiretamente o ser
humano. Para minimizar tais problemas uma saída são os programas de regeneração
e/ou recuperação de áreas degradadas.
A visão conservacionista aliada a interesses econômicos impulsionou, a partir
das décadas de 70 e 80, a pesquisa com sementes de espécies florestais nativas.
Contudo, menos de 0,1% das espécies tratadas nas Regras para Análise de Sementes
(RAS) é referente às florestais nativas, o que demonstra a falta de informações sobre
estas (OLIVEIRA et al., 1996).
Sementes de boa qualidade são necessárias para o êxito do empreendimento
florestal, sendo o principal atributo considerado, a capacidade germinativa das
sementes, pois, sem ela, a semente não tem valor para a semeadura, e dela também
dependem a qualidade das mudas e o sucesso de um reflorestamento (MORAES,
2007).
16
A qualidade de sementes usualmente é aferida através de testes de germinação.
Estes testes, no entanto, apresentam alguns inconvenientes que podem dificultar a
distinção da real qualidade fisiológica de sementes de diferentes lotes, sendo
necessário complementar a análise por meio de outros testes, como tetrazólio e
condutividade elétrica.
Para a realização de qualquer teste, o analista precisa dispor de metodologias
padronizadas à espécie em estudo, tanto para facilitar seu trabalho como para
possibilitar que sob tais condições e em diferentes laboratórios os mesmos resultados
sejam obtidos.
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, o conhecido jequitibá-branco, é uma
espécie representativa da flora brasileira que apresenta poucos estudos no que se refere
à qualidade de sementes. Magnanini & Magnanini (2002) a incluíram na lista das
maiores árvores brasileiras e Carvalho (1994) relata a presença desta espécie na lista
de espécies em extinção, categoria vulnerável, no sul de Minas Gerais, e também na
lista de espécies raras ou ameaçadas de extinção no Distrito Federal.
Tendo em vista a falta de estudos relacionados à análise da qualidade de
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, o trabalho teve como objetivo
avaliar metodologia dos testes de germinação, tetrazólio e condutividade elétrica para
avaliação da qualidade fisiológica de sementes dessa espécie.
17
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Espécie estudada
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze (Cariniana excelsa Casaretto,
Couratari estrellensis
Raddi), espécie popularmente conhecida como jequitibá-branco,
bingueiro, cachimbeiro, estopeira, pito de macaco entre outros nomes, pertence à
Família Lecythidaceae que, conforme Joly (1998) compreende 24 gêneros de plantas
restritas às regiões tropicais. Todas as espécies são arbóreas e abundantes nas matas
tropicais das Américas. Para Barroso (1978) esta família é representada no Brasil por
cerca de 13 gêneros com 150 espécies, principalmente encontradas na Região Norte.
Prance et al. (1976), Mori & Lepsch-Cunha (1995) e Oliveira & Mori (1999),
citados por Tsou & Mori (2002), consideraram esta família uma das mais importantes
famílias de árvores da Amazônia Central, em termos de espécies e número de
indivíduos.
De acordo com Carvalho (1994) e Lorenzi (1992),
Cariniana estrellensis
(Raddi) Kuntze ocorre naturalmente no Brasil do sul da Bahia até o Rio Grande do
Sul, no Acre e no Brasil Central, sendo da mesma forma encontrada nos países
vizinhos Bolívia, Paraguai e Peru. Caracteriza-se como espécie secundária tardia ou
clímax exigente de luz, semidecídua no inverno, heliófita ou de luz difusa, seletiva
higrófita, compondo florestas clímax.
Espécie de hábito arbóreo, ela pode ser encontrada no Brasil nas seguintes
formações florestais: Floresta Ombrófila Densa, ocupando na Floresta Amazônica os
estratos arbóreos dominante e co-dominante e, na Floresta Atlântica as formações Das
Terras Baixas e Submontana; Floresta de Tabuleiro e Floresta Estacional
18
Semidecidual, nas formações Submontana onde costuma ser Emergente e Montana; e
ainda em Matas Ciliares (CARVALHO, 1994).
Quanto aos aspectos morfológicos a planta pode apresentar entre 35-45 m de
altura, diâmetro do tronco entre 90-120 cm (LORENZI, 1992), folhas simples
oblongo-elípticas a lanceoladas com filotaxia alterna e flores pequenas (branco-creme)
reunidas em racemos axilares solitários (CARVALHO, 1994).
As Lecythidaceae podem ter frutos deiscentes ou indeiscentes. A espécie
estudada apresenta fruto deiscente do tipo pixídio, sendo este caracterizado por
deiscência transversal, formação de urna e opérculo, pericarpo lenhoso e nos gêneros
Cariniana, Couratari e Allantoma, formato cilíndrico (BARROSO et al., 1999).
Quando floresce, no Paraná de outubro a janeiro, os principais vetores de
polinização são pequenos insetos, como as abelhas. A frutificação ocorre, no mesmo
estado, entre os meses de agosto e outubro. Os frutos e as sementes são dispersos pelo
vento, mas os macacos facilitam esta dispersão (CARVALHO, 1994).
Cada fruto produz em média 20 a 35 sementes, possuindo estas coloração
castanha, testa expandida em asa membranácea com até 4 cm de comprimento e
núcleo basal com aproximadamente 1,2 cm de comprimento e 0,6 cm de largura
(CARVALHO, 1994). A germinação é epígea e abundante nas primeiras semanas da
colheita (95%), iniciando entre 6 e 70 dias após a semeadura. A emergência ocorre em
12 a 25 dias (LORENZI, 1992; CARVALHO, 1994).
Na literatura foram encontradas várias utilidades para esta espécie, dentre elas
Lorenzi (1992) destacou as atribuições de sua madeira, e sua importância ornamental e
ecológica. O autor afirmou que as sementes são muito consumidas por macacos, o que
é confirmado pelo trabalho de Oliveira-Filho & Galetti (1996), e que esta planta é
indispensável para reflorestamentos heterogêneos com fins ecológicos.
2.2 Germinação de sementes
Do ponto de vista fisiológico, o termo germinação denota fenômeno biológico
de retomada do crescimento do eixo embrionário que, nas sementes ortodoxas, fora
19
interrompido por ocasião da maturidade fisiológica e que tem como conseqüência o
rompimento do tegumento pela radícula (CARVALHO & NAKAGAWA, 2000;
LABOURIAU, 1983).
Os tecnólogos de sementes, entretanto, reconhecem a semente como
germinada apenas após ter formado plântula com tamanho suficiente para que se possa
avaliar a normalidade de suas partes e a sua possibilidade de sobrevivência sob
condições favoráveis de campo (BRASIL, 1992).
Malavasi (1988) sintetizou o processo de germinação nos seguintes eventos:
embebição, ativação de enzimas, iniciação do crescimento do embrião, rompimento do
tegumento, emergência e estabelecimento da plântula. Segundo a mesma autora o
processo é influenciado por fatores externos e internos à semente.
2.2.1 Fatores intrínsecos e ambientais
A germinação é um processo que tem seu funcionamento dependente de
diversos fatores internos e externos à semente, tais como: água, temperatura, luz,
oxigênio, substrato, maturidade fisiológica, dormência, longevidade, viabilidade, entre
outros (MALAVASI, 1988; TOLEDO & MARCOS FILHO, 1997; CARVALHO &
NAKAGAWA, 2000).
2.2.1.1 Água e embebição
Dentre os fatores necessários às sementes para que ocorra a germinação, a
água é considerada como essencial (CARVALHO & NAKAGAWA, 2000).
No encerramento do desenvolvimento das sementes ditas ortodoxas, para
atingirem a maturidade fisiológica, estas passam por uma etapa de “secagem ou
dessecação da maturação”, sendo o conteúdo de água no momento da dispersão da
planta-mãe, cerca de 5 a 10% de seu peso fresco (CASTRO et al., 2004).
20
As atividades metabólicas das sementes sob condições de baixo teor de água
são reduzidas. Para que ocorra a reativação das atividades metabólicas, a semente
precisa absorver água do meio. Contudo, em muitas espécies, a testa e/ou tegumentos
são impermeáveis impedindo a absorção até que tal resistência seja superada ou pela
exposição ao tempo, ou por ação biológica (CASTRO et al., 2004).
Por outro lado, algumas sementes quando em contato com a água sofrem
rápida hidratação, o que permite afirmar que a taxa inicial de embebição pode variar
muito, sendo dependente de características da testa e/ou pericarpo que cerca o embrião
(CASTRO et al., 2004).
A absorção de água acarreta na reidratação dos tecidos, na intensificação da
respiração e de outras atividades metabólicas, o que resulta no fornecimento de energia
e nutrientes para a retomada do crescimento do eixo embrionário. Além disso, outro
papel atribuído à absorção de água é o aumento do volume da semente o que provoca o
rompimento da casca, facilitando, consequentemente, a emergência do eixo hipocótilo-
radícula (ou outra estrutura) do interior da semente (MALAVASI, 1988; CARVALHO
& NAKAGAWA, 2000).
Quando a embebição de sementes inicialmente secas é monitorada, geralmente
observa-se um padrão típico trifásico de absorção de água e hidratação (BEWLEY &
BLACK, 1994).
A Fase I foi descrita por Carvalho & Nakagawa (2000), Marcos Filho (2005),
Castro et al. (2004) como uma fase de relativamente curta duração e que é direcionada
pelo potencial matricial dos diversos tecidos da semente. Por não ser dependente da
atividade metabólica da semente, a embebição, durante esta fase, pode ocorrer em
condições anaeróbicas, de baixas temperaturas (de maneira lenta), em sementes
viáveis, dormentes, em tecidos vivos ou não.
Esta primeira fase é marcada pelos primeiros sinais da reativação do
metabolismo, com aumento acentuado da atividade respiratória e liberação de energia
para a germinação, bem como pela ativação de enzimas e síntese de proteínas a partir
do RNA
m
armazenado ao final do processo de maturação (CARVALHO &
NAKAGAWA, 2000; MARCOS FILHO, 2005). Ainda, de acordo com Carvalho &
21
Nakagawa (2000) é nesta fase que há o início da degradação das substâncias de
reserva.
Quando todas as matrizes da semente atingem hidratação plena (Ψ
m
= 0), o Ψ
π
passa a ser a força propulsora para a entrada de água na semente, até que seja
balanceada pela força de turgor ou Ψ
P
(Ψ
π
= Ψ
P
), quando as células no interior das
sementes não podem mais absorver água porque não podem mais expandir-se. Esta
situação refere-se à Fase II da embebição, quando o conteúdo de água da semente
geralmente atinge um nível de platô, que se mantêm relativamente constante ou
aumenta pouco e muito lentamente (CASTRO et al., 2004).
A Fase II caracteriza-se, portanto, pelas reduções da velocidade de hidratação
e da intensidade respiratória, bem como pelo transporte ativo das substâncias
desdobradas na fase anterior, do tecido de reserva para o tecido meristemático
(MARCOS FILHO, 2005; CARVALHO & NAKAGAWA, 2000).
A ocorrência desta fase, conforme citado por Marcos Filho (2005), varia de
acordo com a espécie analisada, e pode ainda, ser necessária para a síntese de enzimas,
DNA e RNA
m
, exauridos durante a Fase I.
A última fase é alcançada apenas por sementes vivas e não-dormentes, sendo
caracterizada pelo aumento, novamente, da absorção de água e intensidade
respiratória, bem como, ao nível bioquímico, pela reorganização de substâncias
desdobradas na Fase I e transportadas na Fase II em substâncias complexas que irão
formar o protoplasma e as paredes celulares, permitindo assim o crescimento do eixo
embrionário, o que resulta na protusão da raiz primária (CARVALHO &
NAKAGAWA, 2000; MARCOS FILHO, 2005).
2.2.1.2 Temperatura e Substrato
A temperatura interfere no processo tanto no que se refere à germinação total
como à velocidade e uniformidade de germinação. Para tanto, este fator atua na
velocidade de absorção de água e também nas reações bioquímicas que determinam
22
todo o processo de germinação (CARVALHO & NAKAGAWA, 2000; CASTRO et
al., 2004).
De acordo com Bewley & Black (1994) a germinação das sementes de cada
espécie ocorre sob uma determinada amplitude de temperatura particular, existindo
uma temperatura ótima, na qual o processo se realiza mais rápido e eficientemente, e
temperaturas máxima e mínima, acima e abaixo das quais as sementes não germinam.
A temperatura ótima e as extremas (máxima e mínima) constituem as
temperaturas cardeais para a germinação, variando entre as espécies e em função do
grau de maturidade e deterioração das sementes, o que pode dificultar sua
determinação exata (MAYER & POLJAKOFF-MAYBER, 1975; POPINIGIS, 1985;
CARVALHO & NAKAGAWA, 2000). O processo como um todo bem como cada
estádio do processo apresentam temperaturas cardeais (MALAVASI, 1988).
Para germinação da maioria das sementes, a temperatura ótima localiza-se na
faixa de 15 a 30°C, e a temperatura máxima entre 35 e 40°C. Quanto à temperatura
mínima, sementes de algumas espécies podem germinar em temperatura próxima do
ponto de congelamento (MALAVASI, 1988). Muitas espécies arbóreas tropicais e
subtropicais apresentam germinação mais eficiente na faixa de temperatura de 20 a
30°C (BORGES & RENA, 1993).
A distribuição geográfica e ecológica das espécies pode definir os limites de
temperatura para a germinação das sementes (PROBERT, 1992, citado por PACHECO
et al., 2007). Espécies com ampla distribuição e adaptadas a grandes flutuações de
temperatura em seu habitat podem apresentar extensas faixas de temperatura para o
início da germinação (LARCHER, 2000).
Carvalho & Nakagawa (2000) apontaram que pode haver resposta germinativa
mais favorável para determinadas espécies dependente da condição de exposição à
temperatura testada, se constante ou alternada. De acordo com Malavasi (1988), a
dependência de temperatura alternada para a germinação é mais freqüente em espécies
que não possuem histórico de domesticação, como as espécies florestais, e pode estar
associada à dormência das sementes. Entretanto, este regime de temperatura pode
também acelerar a germinação de sementes não dormentes.
23
Para Labouriau (1983) os efeitos da temperatura na germinação podem ser
avaliados a partir de mudanças ocasionadas na porcentagem, velocidade e freqüência
relativa de germinação ao longo do tempo de incubação.
Para a realização do teste de germinação de algumas espécies florestais as
RAS (BRASIL, 1992) prescreveram temperaturas constantes de 15°C, 20°C, 25°C e
30°C e alternadas de 20-30°C e 10-30°C. No regime de temperaturas alternadas a
temperatura mais baixa deve ser mantida por 16 horas e a mais alta por 8 horas.
Com relação ao substrato, as RAS (BRASIL, 1992) indicaram o uso de quatro
tipos: papel, pano, areia e solo. A escolha do substrato, conforme as RAS devem levar
em consideração o tamanho da semente, sua exigência de água, sua sensibilidade à luz
e a facilidade que este oferece para a realização das contagens e avaliação das
plântulas.
De acordo com Popinigis (1985), entre substratos pode haver variação de
alguns fatores, tais como: aeração, estrutura, capacidade de retenção de água e grau de
infestação de patógenos. O substrato pode, assim, interferir na germinação por
fornecer água e oxigênio, além de suporte físico para o desenvolvimento das plântulas.
Por este motivo é importante que o mesmo seja mantido uniformemente úmido, mas
sem excessos, suprindo desta forma a quantidade de água necessária para germinação
das sementes e evitando o decréscimo da germinação e da viabilidade das sementes
pela diminuição da aeração e aumento da incidência de fungos (FIGLIOLIA et al.,
1993).
2.3 Qualidade fisiológica de sementes
O termo “qualidade de semente” pode ser definido como um somatório de
todos os aspectos genéticos, físicos, fisiológicos e sanitários das sementes que afetam
sua capacidade de dar origem a plantas de alta produtividade (POPINIGIS, 1985).
Carneiro (1995) relatou como um dos fatores de importância para o controle
da qualidade das sementes a minimização dos danos provocados por doenças na
produção de mudas. Quando as sementes são de baixo vigor, velhas, mal beneficiadas
24
ou armazenadas de forma incorreta, estas apresentam lenta emergência, e devido a
essas condições, estão mais dispostas ao surgimento do tombamento na fase pré-
emergente.
Com o conhecimento da qualidade das sementes também é possível estimar
como as plantas irão se estabelecer no meio. Se, por exemplo, os testes acusam alto
vigor das sementes, pode-se esperar emergência e crescimento uniforme, o que facilita
o manejo da cultura (MARCOS FILHO, 2005).
A qualidade da semente pode ser avaliada pelo seu potencial fisiológico, que é
caracterizado pela germinação (viabilidade), vigor e longevidade da semente. A
viabilidade procura determinar se a semente encontra-se viva ou morta e germinável.
O vigor representa atributos de qualidade fisiológica, não revelados no teste de
germinação, sendo determinado sob condições de estresse ou medindo o declínio de
alguma função bioquímica ou fisiológica. A longevidade refere-se ao período de
tempo em que a semente permanece viva quando armazenada sob condições
ambientais ideais (POPINIGIS, 1985; MARCOS FILHO, 2005).
O potencial fisiológico das sementes pode ser determinado por vários testes,
entre eles o teste de tetrazólio e de condutividade elétrica (MARCOS FILHO, 2005;
PINÃ-RODRIGUES et al., 2004; CARVALHO & NAKAGAWA; 2000).
Os testes de tetrazólio e de condutividade elétrica são alternativas empregadas
para a determinação da viabilidade e vigor de sementes, superando o convencional
teste de germinação no quesito rapidez de resultados. Os dois testes foram mais
difundidos a partir da década de 60, sendo, portanto, relativamente recentes
(MARCOS FILHO, 2005).
Várias classificações para os testes de potencial fisiológico de sementes já
foram propostas, mas adotando a classificação de Woodstock (1973) que os divide em
testes bioquímicos e fisiológicos, os dois tipos de testes aqui tratados se enquadram na
definição de teste bioquímico. Os testes bioquímicos determinam uma reação química
ou um processo, como atividade respiratória ou enzimática, que se presume estar
relacionada(o) com a capacidade germinativa das sementes. Já nos testes fisiológicos
são avaliados aspectos da germinação ou do crescimento da plântula, tanto em
25
condições favoráveis como quando submetidas a estresse (CARVALHO &
NAKAGAWA, 2000),.
2.3.1 Condutividade elétrica
O princípio deste teste foi inicialmente proposto por Fick & Hibbard, em
1925, quando observaram que a baixa germinação de sementes de capim timóteo
estava associada à elevada liberação de solutos durante a embebição. Contudo,
Matthews & Bradnock (1967), retomaram o estudo desta idéia e desenvolveram
procedimento básico do teste sendo então amplamente disseminado para a aplicação
em várias espécies e considerado padronizado para sementes de ervilha (MARCOS
FILHO, 2005).
Segundo Popinigis (1985) neste teste a saída de grandes quantidades de
eletrólitos das sementes indica que há maior permeabilidade das membranas e, desta
forma, que a semente tem menor vigor (maior deterioração).
Marcos Filho (2005) e Vieira & Krzyzanowski (1999) complementaram esta
explicação afirmando que as sementes menos vigorosas apresentam menor velocidade
de restabelecimento da integridade das membranas celulares durante a embebição,
sendo a liberação de solutos em maior quantidade uma conseqüência deste fato.
A avaliação da condutividade elétrica pode ser realizada de duas formas:
condutividade de massa ou bulk conductivity e condutividade de cada semente,
individualmente. O primeiro sistema é o mais utilizado, e ao contrário do segundo
avalia a condutividade pela liberação de eletrólitos de um conjunto de sementes e não
de apenas uma (VIEIRA, 1994).
A aplicação do teste consiste, basicamente, em imergir as amostras de
sementes (25, 50 ou 75 sementes), previamente pesadas, em recipiente de plástico ou
vidro com volume conhecido de água deionizada (25 a 250 ml), a 20 ou 25°C. Após
24h a leitura da condutividade elétrica da solução deve ser feita empregando-se um
condutivímetro. Os resultados são expressos em µmho.cm
-1
.g
-1
de sementes ou em
26
µS/cm/g de sementes (POPINIGIS, 1985; PIÑA-RODRIGUES et al. 2004; MARCOS
FILHO, 2005).
A leitura após 24 horas é usada por conveniência da organização das
atividades dos laboratórios de análise, mas Vieira & Krzyzanowski (1999)
mencionaram a realização de outros trabalhos envolvendo a condutividade elétrica de
diferentes espécies onde este período foi reduzido. Esta redução do tempo de
embebição para leitura da condutividade elétrica, segundo Custódio (2005), ocorre
devido à necessidade de obtenção de respostas mais rápidas.
Alguns fatores, segundo Vieira & Krzyzanowski (1999), podem interferir nos
resultados do teste de condutividade elétrica, sendo eles referentes às características da
semente e da metodologia.
Quanto às características da semente, são citados os fatores: danos mecânicos
ou por inseto; tamanho; genótipo; teor de água; e tratamento químico. Para as
características próprias da metodologia são mencionados: número de sementes e de
repetição; temperatura de embebição e avaliação; tempo de embebição; entre outros
(VIEIRA, 1994; VIEIRA & KRZYZANOWSKI, 1999).
As sementes danificadas causam aumentos significativos na condutividade
elétrica de um determinado lote de sementes. Contudo, isso não justifica a escolha das
sementes sem danos em trabalhos de rotina dos laboratórios de análise de sementes,
uma vez que os danos fazem parte das características do lote de sementes. Todavia, em
alguns casos específicos, como pesquisas sobre efeitos de determinados fatores
(genótipo, tamanho da semente, teor inicial de água, temperatura de embebição) na
condutividade elétrica, para não haver a influência de nenhum outro fator a não ser o
estudado, a seleção pode não apenas ser necessária como obrigatória (VIEIRA, 1994;
VIEIRA & KRZYZANOWSKI, 1999).
Com relação ao tamanho da semente, Vieira (1994) e Vieira & Krzyzanowski
(1999) afirmaram que quanto maior a semente, maior a condutividade, sendo este
problema minimizado pela expressão dos resultados com base no peso da amostra
avaliada.
Características herdáveis, tal como espessura do tegumento e/ou teor de
lignina no tegumento, podem resultar em diferença de vigor entre genótipos,
27
interferindo, portanto, na condutividade elétrica da amostra (VIEIRA &
KRZYZANOWSKI, 1999).
O teor de água das sementes é de fundamental importância para a
padronização da metodologia deste teste e também para obtenção de resultados
uniformes. Vários autores, segundo Vieira & Krzyzanowski (1999), recomendaram
ajustar o teor de água das sementes na faixa de 10 a 17%. Em muitas espécies, teor
abaixo de 10% causa aumento significativo da condutividade elétrica.
Para solucionar este problema, uma alternativa mencionada por Vieira &
Krzyzanowski (1999) seria a uniformização do teor de água dos lotes, antes da
avaliação da condutividade elétrica, independente do valor. Uma outra alternativa
proposta, seria o uso de um fator de correção para um valor padrão de teor de água.
Loeffler et al. (1988), citados por Vieira & Krzyzanowski (1999), afirmaram
que quanto ao número de repetições e de sementes por repetição, entre os resultados de
condutividade elétrica há maior variabilidade quando se empregam menor número de
repetições e de sementes por repetição, sendo recomendado por alguns autores o uso
de quatro repetições de 50 sementes, uma vez que o coeficiente de variação neste caso
foi menor.
A temperatura também pode interferir na condutividade elétrica, pois atua na
velocidade de embebição e na lixiviação de eletrólitos (em quantidade e velocidade), o
que pode ter relação com a alteração na viscosidade da água. A temperatura de
embebição e avaliação recomendada é 25°C, pois se aproxima mais daquela verificada
normalmente no interior dos laboratórios de análise de sementes (VIEIRA &
KRZYZANOWSKI, 1999).
Quanto ao tempo de embebição, como relatado anteriormente, aconselha-se
utilizar para sementes grandes período de 24 horas. Dentre outros motivos justifica-se
seu emprego por ser tempo suficiente para serem atingidos os picos máximos de
lixiviação dos lotes, independente de seu vigor, o que garante melhor diferenciação
dos lotes mesmo que a variação do nível de vigor entre eles seja estreita (VIEIRA &
KRZYZANOWSKI, 1999).
28
Outros fatores que podem ainda influenciar na condutividade elétrica são:
qualidade e volume de água, tamanho do recipiente durante a embebição, entre outros
(VIEIRA, 1994; VIEIRA & KRZYZANOWSKI, 1999).
O vigor de sementes de Copaifera langsdorffii Desf. foi avaliado por Ferreira
et al. (2004) com o emprego do índice de velocidade de germinação e do teste de
condutividade elétrica. Os autores utilizaram para esta última análise cinco repetições
de 20 sementes colocadas em copos plásticos (200 ml) contendo 100 ml de água
deionizada e então mantidas por 24 horas em câmara de germinação (BOD) à
temperatura de 25° C.
Gemaque et al. (2005) determinaram a condutividade elétrica de sementes de
Tabebuia impetiginosa (Mart.), submetidas a secagens lenta ou rápida, com o emprego
da mesma metodologia utilizada por Ferreira et al. (2004).
Sementes de Chorisia speciosa foram submetidas ao teste de condutividade
elétrica visando avaliar o efeito do envelhecimento precoce sobre seu vigor. Para tanto
foram empregadas quatro repetições de 50 sementes. Estas sementes foram pesadas e
acondicionadas em copos plásticos (200 ml), nos quais se adicionaram 75 ml de água
deionizada, sendo a seguir levados para uma câmara ajustada à temperatura constante
de 20°C, no escuro, durante 24 horas. Após esse período, as amostras foram retiradas,
e procedeu-se à leitura da condutividade elétrica (FANTI & PEREZ, 2005).
Santos & Paula (2005), buscando estabelecer metodologia específica para o
teste de condutividade elétrica em Sebastiania commersoniana (branquilho),
utilizaram diversas combinações de tempos de embebição (2, 4, 6, 12, 18, 24, 30, 36,
42, 48 e 72 horas), número de sementes por repetição (25, 50 e 75) e volumes de água
deionizada (50, 75 e 100ml). Para todos estes parâmetros foram empregadas quatro
repetições de sementes, pesadas em balança eletrônica com precisão de 0,01g e,
posteriormente, incubadas em câmara do tipo BOD, à temperatura de 25ºC. Após cada
período de embebição, a condutividade elétrica foi medida sendo os resultados
expressos em µS.cm
-1
.g
-1
. Para determinar a condutividade elétrica desta espécie os
pesquisadores recomendaram o uso de 75 sementes, embebidas em 75ml de água, por
24 horas à temperatura de 25°C.
29
PINÃ-RODRIGUES et al. (2004) afirmaram que a execução deste teste para
sementes florestais apresenta problemas devido à necessidade de padronização do
volume de água utilizado, tendo em vista que dependendo do tamanho da semente e
quantidade de sementes utilizadas um valor determinado pode não ser suficiente para
mantê-las sob imersão.
2.3.2 Tetrazólio
O teste de tetrazólio foi desenvolvido por Lakon em 1949, sendo empregado
atualmente tanto para estimar a viabilidade como o vigor das sementes. Baseia-se na
alteração de coloração dos tecidos vivos das sementes quando em contato com a
solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio, o que ocorre devido à atividade de
enzimas desidrogenases que atuam no processo de respiração e reduzem o sal para
Formazan, uma substância vermelha, insolúvel e estável (ROBERTS, 1974;
POPINIGIS, 1985; BRASIL, 1992; MARCOS FILHO, 2005).
Este teste pode ser dividido nas seguintes etapas: preparo das soluções,
amostragem, pré-condicionamento das sementes, preparo das sementes,
desenvolvimento da coloração, avaliação das sementes e interpretação dos resultados
(MARCOS FILHO et al., 1987).
A concentração do sal empregada no teste varia de acordo com a espécie
estudada, método de preparo das sementes e permeabilidade do tegumento, sendo mais
freqüente, no entanto, o uso das concentrações 0,075%, 0,1%, 0,2%, 0,5% e 1,0%. As
menores concentrações são preferíveis, pois além da economia com o sal, que
apresenta preço elevado, elas permitem melhor visualização dos distúrbios de
coloração dos tecidos e identificação dos diferentes tipos de danos (MARCOS FILHO
et al., 1987).
O desenvolvimento de coloração adequada depende também do controle do
pH da solução que deve estar entre 6,0 e 8,0 (MARCOS FILHO et al., 1987). De
acordo com Piña-Rodrigues & Santos (1988) soluções mais ácidas ou básicas,
30
dificultam a interpretação dos resultados, pois interferem na velocidade e intensidade
de coloração dos tecidos.
A amostra de sementes utilizada no teste deve ser representativa do lote e
coletada segundo orientações das RAS. De acordo com as RAS, em cada teste devem
ser empregadas duas repetições de 100 ou quatro de 50 sementes (BRASIL, 1992).
Piña-Rodrigues & Santos (1988) fizeram recomendações onde apontam variação da
confiabilidade do teste, sendo elas: duas repetições de 100 sementes (boa estimativa),
duas de 50 ou uma de 100 (informações confiáveis) e, uma repetição de 50 sementes
(estimativa aproximada). Marcos Filho et al. (1987) sugerem, da mesma forma, em
trabalhos de pesquisa ou análises para fins de identificação o uso de duas repetições de
50 sementes.
A menor amostra exigida no teste de tetrazólio em relação ao de germinação
deve-se as condições ambientais às quais são submetidas às sementes, sendo que no
primeiro há mais uniformidade e menos prejuízos por microrganismos. Além disso,
outro fator que aumenta a precisão dos resultados do teste de tetrazólio é o exame
detalhado de cada semente (MARCOS FILHO et al., 1987).
O pré-condicionamento das sementes é realizado no intuito de, ao passarem
por embebição em água ou ambiente úmido, as sementes sofrem amolecimento o que
ativa o sistema enzimático e facilita a retirada do tegumento ou cortes de preparo, a
penetração da solução de tetrazólio e o desenvolvimento de coloração mais nítida e
evidente (MARCOS FILHO et al., 1987; PIÑA-RODRIGUES & SANTOS, 1988;
BRASIL, 1992).
O tempo de permanência em embebição varia de espécie para espécie e a
temperatura recomendada durante este período se encontra na faixa de 30°C a 40°C. O
desenvolvimento de trincas e a liberação excessiva de exsudados pode ocorrer quando
as sementes, principalmente as deterioradas, são submetidas à rápida absorção de água,
causando, desta forma, alterações ou maiores dificuldades para interpretação do teste.
Por este motivo, alguns autores recomendam o uso de papel mata-borrão umedecido e
não que as sementes sejam colocadas diretamente em água (MARCOS FILHO et al.,
1987; PIÑA-RODRIGUES & SANTOS, 1988).
31
Dentre os métodos de preparo usados em sementes de algumas espécies, se
destacam a punção, o corte e a retirada do tegumento. Todos eles possuem por
finalidade facilitar a penetração do tetrazólio. Outras espécies por não possuírem
grandes barreiras à difusão do sal, passam por coloração direta, ou seja, logo após o
pré-condicionamento são colocadas em contato com a solução de tetrazólio para
desenvolvimento da coloração. Este método pode também ser utilizado para prorrogar
o período entre início da coloração e avaliação das sementes (MARCOS FILHO et al.,
1987; PIÑA-RODRIGUES & SANTOS, 1988).
Marcos Filho et al. (1987) afirmaram que a remoção dos tegumentos, mesmo
trazendo maior uniformidade e rapidez do desenvolvimento da coloração, tem como
desvantagem a possibilidade de alteração dos resultados quando são causados danos ao
embrião durante esta remoção.
Para desenvolvimento da coloração, depois do pré-condicionamento e preparo,
as sementes devem ser imersas na solução de tetrazólio e mantidas em germinador ou
câmara à temperatura de 30°C a 40°C e no escuro, pois a luz pode provocar alteração
da coloração da solução levando a erros de interpretação dos resultados (MARCOS
FILHO et al., 1987; PIÑA-RODRIGUES & SANTOS, 1988).
De acordo com Marcos Filho et al. (1987) a velocidade de coloração é
duplicada a cada aumento de 5°C na temperatura ambiente, até o limite de 45°C. A
velocidade de coloração também varia entre as sementes de diferentes espécies ou
mesmo da mesma amostra, mas em geral a duração deste período situa-se entre 60 e
240 minutos (MARCOS FILHO, 2005).
Quando as sementes atingem a coloração de intensidade normal, dentro do
período pré-estabelecido, as mesmas são retiradas da solução de tetrazólio e lavadas
em água corrente. Na seqüência, estas devem ser mantidas imersas em água e dentro
de refrigerador até a avaliação, período que não pode ultrapassar 24 horas (MARCOS
FILHO et al., 1987; PIÑA-RODRIGUES & SANTOS, 1988).
Durante a avaliação devem ser considerados principalmente os seguintes
aspectos das sementes: cor, turgescência, localização de manchas e lesões/fraturas.
Cada semente deve ser examinada individualmente, sendo necessário o conhecimento
32
morfológico para identificação das áreas vitais (MARCOS FILHO et al., 1987; PIÑA-
RODRIGUES & SANTOS, 1988).
Tecidos sadios mostram-se túrgidos quando embebidos, além de colorirem de
maneira gradual e uniforme. Estes tecidos apresentam coloração vermelha viva.
Tecidos em deterioração têm por característica a coloração vermelha intensa, isso
devido à maior difusão da solução de tetrazólio através das membranas celulares que
já estão comprometidas. Quando expostos ao ar, os tecidos em deterioração perdem
sua turgidez mais rapidamente que os sadios ou vigorosos. Finalmente, tecidos mortos,
que são geralmente flácidos, por não apresentarem atividade enzimática necessária
para a produção de formazan não colorem (FRANÇA NETO et al., 1998).
Quanto às manchas e lesões/fraturas, o avaliador deve observar sua extensão e
se as regiões onde ocorrem são vitais (MARCOS FILHO et al., 1987; PIÑA-
RODRIGUES & SANTOS, 1988). Para Marcos Filho et al. (1987) as áreas vitais em
sementes de leguminosas correspondem a: radícula, hipocótilo, plúmula e região de
inserção entre os cotilédones e eixo embrionário. Em gramíneas, para os mesmos
autores, a área vital compreende a plúmula, a região central do escutelo, a parte
superior da radícula e a região entre plúmula e radícula (onde se encontram as raízes
seminais).
Para Marcos Filho et al. (1987) a determinação da viabilidade ou vigor das
sementes pode ser realizada, separando-as em classes. Os autores sugeriram oito
classes, compreendendo da classe 1 a 5 as sementes viáveis e da 6 a 8 as não viáveis.
Quando o analista não possui experiência suficiente foi ainda recomendada à
instalação de teste padrão de germinação para comparar resultados e verificar causas
de possíveis erros.
Marcos Filho (1999) afirmou que tanto o teste de germinação como o de
tetrazólio superestima o potencial fisiológico das sementes, contudo esta
superestimativa é ainda maior para o teste de tetrazólio, uma vez que as sementes neste
teste estão sob condições ambientais ainda mais favoráveis que no teste de
germinação.
Conforme Piña-Rodrigues & Santos (1988) esse teste não tem sido muito
utilizado em sementes florestais, mas seu emprego pode ser justificado no fato de que
33
muitas espécies florestais necessitam de período longo de tempo para germinarem,
como é o caso de Bertholetia excelsa (Lecythidaceae) que apenas germina depois de
um ano, o que torna praticamente impossível a avaliação do potencial fisiológico do
lote de sementes através do teste de germinação.
Outras vantagens apontadas por França Neto (1999), além da rápida avaliação
da viabilidade e vigor, são: não é afetado por diversas condições que afetam o teste
padrão de germinação; exame de cada semente individualmente; identifica diferentes
níveis de viabilidade e causas da queda de viabilidade; e o equipamento necessário é
simples e barato.
Entretanto, algumas desvantagens também são mencionadas pelo mesmo
autor: requer treinamento tanto das estruturas embrionárias da semente como das
técnicas de interpretação; é relativamente tedioso; maior número de homem-hora é
necessário em relação ao teste de germinação; não mostra a eficácia de tratamentos
químicos, nem as injúrias que estes possam causar; e requer do analista capacidade de
decisão pelas características do teste (FRANÇA NETO,1999).
Oliveira et al. (2005a) empregaram o teste de tetrazólio para avaliar a
qualidade de lotes de sementes de Peltophorum dubium (canafístula), sendo os
embriões (sementes sem tegumento) imersos em soluções de tetrazólio a 0,07; 0,1 e
0,3% por 150 minutos a 25°C. A concentração 0,1% da solução de tetrazólio por 150
minutos a 25°C foi indicada por eles como mais eficiente para determinação da
qualidade de lotes de sementes dessa espécie.
Para Tabebuia aurea Oliveira et al. (2006) empregaram a metodologia
proposta por Marcos Filho (1999) e Piña-Rodrigues & Santos (1988), onde sementes
sem alas foram acondicionadas entre duas folhas de papel-filtro, embebidas em
solução de tetrazólio 0,1% e mantidas no escuro durante 24 h, à temperatura de 28°C.
As classes obtidas foram: classe 4 – sementes consideradas viáveis, pois apresentaram
de 76 a 100% de suas áreas vitais, eixo embrionário e cotilédones, corados de
vermelho-carmim-claro, além de turgor dos tecidos e estruturas do embrião
desenvolvidas e intactas; classe 3 - sementes de média viabilidade, com índice entre 51
e 75% de suas áreas vitais coradas; classe 2 - baixa viabilidade com índice entre 26 e
34
50% de suas áreas vitais coradas; e, classe 1 - muito baixa viabilidade, com índice
entre 0 e 25% de suas áreas vitais coradas.
Outro exemplo de trabalho empregando o teste em espécie florestal foi
realizado por Oliveira et al. (2005b) com as espécies Tabebuia serratifolia (ipê-
amarelo) e Tabebuia impetiginosa (ipê-roxo). Os autores realizaram primeiramente
pré-testes para selecionar, por análise visual, as condições mais favoráveis para
coloração das sementes das duas espécies em estudo. As concentrações de tetrazólio,
tempos de imersão e temperaturas testadas foram, respectivamente: 0,05, 0,07, 0,1, 0,5
e 1%; 6, 12, 18, 24 e 48 horas; 25°C, 30°C e 35°C. Além destes parâmetros, para o
ipê-amarelo foram verificadas três condições de preparo das sementes (retirada do
tegumento, corte lateral do tegumento e tegumento intacto). A partir dos resultados
obtidos no pré-teste, os autores optaram pela metodologia descrita na seqüência.
As sementes foram embebidas em papel umedecido em água por 12 horas. Em
seguida as sementes de T. serratifolia foram preparadas com a retirada ou corte dos
tegumentos e imersas em solução 0,5% de tetrazólio a 30°C por um período de 12, 24
e 48 horas. Já as sementes de T. impetiginosa tiveram seu tegumento retirado e foram
imersas em solução de 0,07% e 0,1% de tetrazólio a 30°C por um período de 12 horas.
As melhores condições para realização do teste para T. serratifolia foram pré-
condionamento com retirada do tegumento, solução 0,5% de tetrazólio e período de
imersão de 12 horas. Para T. impetiginosa a solução de tetrazólio indicada foi de
0,07% e os demais parâmetros foram os mesmos indicados para espécie anterior
(OLIVEIRA et al., 2005b).
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção de sementes e local de realização dos experimentos
A pesquisa foi realizada no laboratório de Tecnologia de Sementes da
Universidade Estadual do Oeste do Paraná - UNIOESTE, Campus de Marechal
Cândido Rondon – PR, entre o período de outubro de 2006 a julho de 2007.
As sementes foram fornecidas pelo Núcleo de Estações Experimentais - NEE
da UNIOESTE, sendo os frutos coletados em setembro de 2006, diretamente de três
matrizes localizadas nos municípios de Marechal Cândido Rondon (401 m,
24°32’42”S, 054°02’35”W), Mercedes (375 m de altitude, latitude 24°26’38,2”S e
longitude 054°11’27,3”W) e Quatro Pontes (448 m, 24°35’35”S e 054°57’00”W),
Paraná. As sementes de tais origens passaram a ser designadas de, respectivamente,
Lote 1, Lote 2 e Lote 3.
Após a coleta, os frutos permaneceram em ambiente coberto e ventilado até
deiscência das sementes. As sementes foram beneficiadas manualmente com a retirada
das alas e armazenadas, durante a realização do trabalho, inicialmente em embalagens
plásticas sob condições ambientais não controladas e no período de janeiro a julho de
2007 em embalagens de papel sob condições controladas de temperatura (17 a 20°C) e
umidade relativa (32 a 52%), dentro de câmara seca.
3.2 Embebição das sementes
Para determinação da curva de embebição, quatro repetições com
aproximadamente 1g de sementes do Lote 1 foram pesadas inicialmente em balança
36
analítica digital com sensibilidade de 0,1 mg. Na seqüência estas sementes foram
acondicionadas em beckers de 100 ml, aos quais se acrescentou 5 ml de água destilada,
volume suficiente para cobrir as sementes. A embebição ocorreu em câmara de
germinação, tipo BOD, a 25°C e no escuro.
Pesagens subseqüentes foram realizadas após transcorridas 1/2, 1, 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156 e 168
horas, sendo também executadas em balança analítica digital com sensibilidade de 0,1
mg.
Antes de cada pesagem, removeu-se a umidade superficial das sementes com
uso de papel absorvente e, posteriormente, as mesmas foram recolocadas em água
destilada. Com os valores das porcentagens consecutivas foi calculada a porcentagem
de ganho de água em relação ao peso inicial das sementes, a fim de se estabelecer a
curva de embebição, utilizando-se o cálculo proposto por Santos et al. (1994):
% embebição = Pf – Pi x 100
Pi
Onde:
Pf = Peso final
Pi = Peso inicial
O delineamento estatístico foi o inteiramente casualizado, sendo os dados de
porcentagem de ganho de água em função do tempo transformados em arco seno raiz
quadrada de x/100 e submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo
teste de Tukey à 5% de probabilidade.
3.3 Caracterização dos Lotes
3.3.1 Teor de água
O teor de água das sementes foi determinado pelo método de estufa a 105 °C ±
3 ºC por 24 h, conforme as RAS (BRASIL, 1992), utilizando-se 4 repetições de 2 g de
sementes inteiras. Para cada experimentação, procedeu-se nova análise do teor de
37
água. O cálculo do teor de água foi realizado com base na massa de matéria úmida das
sementes.
3.3.2 Massa de 1000 sementes
Como informação adicional à qualidade das sementes para os três lotes,
determinou-se a massa de 1000 sementes, mas adaptando a metodologia indicada pelas
Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) à quantidade de sementes
disponível, diminuindo assim o número de repetições de 8 para 4, sendo em cada
repetição efetuada pesagem de 100 sementes em balança analítica digital com
sensibilidade de 0,1 mg.
3.4 Adequação de testes para avaliação da viabilidade e vigor de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze
3.4.1 Teste de germinação
Quatro repetições de 25 sementes, por tratamento, passaram por procedimento
fitossanitário em solução de hipoclorito de sódio a 10 % por 10 minutos, sendo na
seqüência lavadas com água destilada e semeadas em bandejas plásticas (37 cm x 23
cm x 7 cm) sobre areia (peneirada e autoclavada por 30 minutos a 120°C) e em caixas
plásticas do tipo “gerbox” sobre duas folhas de papel filtro autoclavado (120°C por 30
minutos). A quantidade de areia utilizada foi de 4 Kg por bandeja, sendo a mesma
embebida com 800 ml de água destilada. O papel filtro foi embebido com 2,5 vezes o
seu peso. Nos dois substratos acrescentou-se mais água destilada à medida que se
verificou tal necessidade, visando conservar a umidade dos mesmos.
Os tratamentos foram mantidos em BOD nas condições de temperatura 20-
30°C alternadas ou 25°C constante e fotoperíodo de 8h luz e 16h escuro, sendo
38
realizadas avaliações diárias até o 47º dia após semeadura (pois a germinação já estava
praticamente estagnada).
Os parâmetros analisados foram emissão de radícula (sendo considerada
germinada a semente que apresentasse radícula ≥ 2 mm, segundo Labouriau, 1983),
formação de plântulas normais (com todas as estruturas essenciais) e anormais, e ao
final do teste, número de sementes deterioradas ou mortas.
Com base nos dados obtidos foram calculados a porcentagem de germinação,
a porcentagem de plântulas normais e anormais, a porcentagem de sementes
deterioradas ou mortas, a velocidade média de germinação (VM) e o tempo médio de
germinação (TM). Os cálculos da porcentagem de germinação, da VM e do TM foram
realizados de acordo com Labouriau (1983):
G (%) = (N/A)x100
Onde: G - é a porcentagem de germinação; N - é o número de sementes
germinadas; e A - é o número total de sementes colocadas para germinar;
ntotal
tini
t (dias)
t
v
1
(sementes/dia)
Onde : t –refere-se ao tempo médio de germinação em dias; ni – é o número de
sementes germinadas num intervalo de tempo; ti – é o intervalo de tempo; ntotal – é o
número total de sementes germinadas; v – é a velocidade média de germinação.
O delineamento empregado foi o inteiramente casualizado em esquema
fatorial 2 x 2 x 3 (dois substratos, duas temperaturas e três lotes de sementes). Os
resultados foram submetidos à análise de variância, sendo os dados percentuais
transformados em arco seno raiz quadrada de x/100. As médias dos tratamentos foram
comparadas pelo teste de Tukey à 5% de significância, sendo utilizado o programa
SANEST (ZONTA & MACHADO, 1986).
39
3.4.2 Condutividade elétrica
Este teste foi realizado em duas etapas, tendo a primeira o objetivo de definir
entre os métodos analisados, o mais adequado para a espécie em estudo, e a segunda
de avaliar o método então escolhido sobre três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze.
Primeira etapa
Nesta etapa foram empregadas sementes de um mesmo lote, sendo, contudo,
parte das sementes submetida a envelhecimento acelerado. Para isso, primeiramente
pesou-se em balança analítica digital com sensibilidade de 0,1 mg 8 repetições de 2 g e
outras 8 repetições de 4 g de sementes, com teor de água próximo a 8%. Estas
sementes foram distribuídas sobre tela plástica em caixas plásticas do tipo “gerbox”,
dentro das quais, e sob a tela, foram colocados 40 ml de água destilada. Em seguida, as
caixas foram tampadas e levadas à câmara de germinação, tipo BOD, previamente
regulada para temperatura constante de 42°C, onde foram mantidas durante período de
72 horas (MARCOS FILHO, 2005).
O delineamento adotado para todos os experimentos desta etapa, analisados
separadamente, foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x12 (dois lotes de
sementes – envelhecidas ou não, e 12 períodos de embebição – 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20,
24, 28, 36, 48 e 60 horas), totalizando 24 tratamentos por experimento com 4
repetições cada. Os resultados da condutividade elétrica, expressos em µScm
-1
g
-1
,
foram submetidos à análise de variância e as médias, transformadas em
X
, foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o programa
SANEST (ZONTA & MACHADO, 1984).
Os procedimentos e diferencial de cada experimento estão detalhados na
seqüência, cabendo observar que em cada um houve combinação distinta da
quantidade de sementes e volume de água deionizada.
Experimento 1: 2g e 50ml
O primeiro experimento desta etapa, consistiu em utilizar 50ml como volume
de água deionizada por repetição, que foi acondicionado em becker de 100ml, e 2g de
sementes, envelhecidas ou não. As sementes foram colocadas para embeber neste
40
volume, durante 60 horas, sendo efetuadas leituras da condutividade elétrica em 1, 2,
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 36, 48 e 60 horas, com aparelho portátil Lutron, modelo 4303.
Experimento 2: 2g e 75ml
Neste experimento, testou-se a mesma quantidade de sementes do anterior (2g
de sementes envelhecidas ou não), modificando-se o volume de água, que aumentou
de 50 para 75ml de água deionizada. As leituras da condutividade elétrica foram
realizadas da maneira descrita no experimento 1.
Experimento 3: 4g e 50ml
No experimento 3 analisou-se a condutividade elétrica a partir da conjunção
de 4 g de sementes (envelhecidas ou não) com o volume de 50 ml de água deionizada.
Todos os demais procedimentos foram idênticos aos descritos acima.
Experimento 4: 4g e 75ml
Da mesma forma que no experimento 3, utilizou-se neste experimento 4g de
sementes mas para o volume conhecido de 75 ml de água deionizada. Os demais
procedimentos estão de acordo com os experimentos anteriores.
Segunda etapa
Visto tratar-se de espécie florestal, a disponibilidade de sementes geralmente é
pequena sendo necessário reduzir, quando possível, à quantidade de sementes nos
testes realizados. Desta forma, a aplicação do primeiro experimento foi escolhida para
esta segunda etapa, pois também apresentou resultados satisfatórios e com menor
quantidade de sementes (2g).
Assim, quatro repetições de 2g de sementes por lote foram pesadas em balança
eletrônica com precisão de 0,01g sendo posteriormente colocadas em beckers de
100ml com 50ml de água deionizada e incubadas em câmara do tipo BOD, à
temperatura de 25ºC, sem luminosidade. Após cada período de embebição (0, 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 12, 24, 36 e 48h) a condutividade elétrica foi medida em condutivímetro
Lutron, modelo 4303.
Nos experimentos 1 e 4 da primeira etapa ficou evidente que a partir de 12
horas não há mais variação significativa da condutividade elétrica. Por este motivo
optou-se por aumentar o número de períodos de embebição anterior às 12h e também
aumentar o intervalo de tempo entre as leituras posteriores a este período.
41
Os dados de condutividade elétrica foram analisados seguindo o delineamento
inteiramente casualizado, e em esquema fatorial 3x13 (3 lotes e 13 períodos de
embebição), sendo submetidos a análise de variância e as médias comparadas pelo
teste de Tukey, a 5% de probabilidade utilizando o programa SANEST (ZONTA &
MACHADO, 1984).
3.4.3 Tetrazólio
Inicialmente, um pré-teste foi realizado no intuito de selecionar as condições
mais favoráveis para a coloração das sementes de Cariniana estrellensis.
Vários períodos de embebição foram testados ficando evidente que a partir de
24 horas já era possível realizar o teste, tanto pela coloração dos embriões quanto pela
facilidade de retirada do tegumento. No pré-teste também foi observado o modo de
preparo da semente para coloração: sementes intactas (com tegumento e endosperma),
sementes sem tegumento, mas com endosperma, sementes com corte longitudinal e
sementes sem tegumento e endosperma. Ainda, as concentrações do sal de tetrazólio
avaliadas foram 0,075%, 0,1%, 0,175%, 0,25%, 0,5% e 0,75%, nos períodos de 1, 2, 3,
5, 6, 10, 14 e 90 horas. Não foram testadas todas as combinações período de
embebição x preparo da semente x concentração de tetrazólio x período de coloração,
sendo, por exemplo, os períodos de coloração de 10, 14 e 90 horas testados apenas
para a concentração de 0,75% de tetrazólio e em sementes com tegumento.
Para realização definitiva do teste de tetrazólio foi primeiramente determinado
o teor de água das sementes pelo método de estufa a 105°C ± 3°C por 24 horas
(BRASIL, 1992), utilizando-se 4 repetições de 2g de sementes.
As sementes passaram então por embebição direta em água destilada por 30
horas, estando acondicionadas em beckers de 100 ml e mantidas em câmara de
germinação sob temperatura constante de 25°C. Na seqüência, tegumento e
endosperma (Figura 1) das sementes foram removidos manualmente com o uso de
bisturis, sendo para tanto utilizadas 4 repetições de 20 sementes para cada tratamento,
considerando que durante tal preparo algumas sementes poderiam ser perdidas.
42
Figura 1 - Tegumento e endosperma (indicado por seta) de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze.
Para o processo de coloração foram utilizadas 4 repetições de 10 sementes
(embriões) por tratamento. Os embriões foram acondicionados em beckers de 100ml
sendo adicionado volume suficiente da solução de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio
para cobri-los, nas seguintes concentrações: 0,05%, 0,1% e 0,25%. A coloração
ocorreu em período de 2, 3, 4 ou 5 horas em câmaras tipo BOD a 35°C, na ausência de
luz. Após cada período de coloração, as soluções foram drenadas e os embriões
lavados em água corrente, sendo então mantidos imersos em água destilada em
ambiente refrigerado até o momento da avaliação.
Cada embrião foi analisado individualmente, externa e internamente, após
seccionamento longitudinal através do centro do eixo embrionário, com auxílio de
bisturi. Os embriões foram avaliados de acordo com a ocorrência de danos (quanto à
profundidade e localização) e condições físicas das estruturas embrionárias
(apresentadas na Figura 2). A interpretação foi feita com auxílio de lupa de seis
aumentos (6x), com iluminação fluorescente.
43
Figura 2 - Morfologia de sementes de Cariniana estrellensis (cot = cotilédone; eh =
eixo hipocótilo-radícula; cc = cilindro central; co = córtex; ic = região de
inserção dos cotilédones).
1
Considerou-se na diferenciação de cores dos tecidos embrionários, os
seguintes critérios estabelecidos para o teste de tetrazólio (DELOUCHE et al., 1976;
BHÉRING et al., 1996; e FRANÇA NETO, 1999): vermelho brilhante ou rosa (tecido
vivo e vigoroso); vermelho-carmim forte (tecido em deterioração) e branco leitoso ou
amarelado (tecido morto).
Para definição das melhores condições de realização do teste foram
considerados os aspectos dos tecidos e a intensidade e uniformidade de coloração,
sendo a eficiência do teste avaliada pela comparação com os resultados do teste de
germinação (FOGAÇA, 2003).
Desta forma, paralelamente ao teste de tetrazólio, foi conduzido teste de
germinação, seguindo a metodologia descrita anteriormente utilizando-se substrato
sobre papel e temperatura constante da BOD de 25°C. As avaliações realizadas
diariamente definiram a porcentagem de germinação por lote, parâmetro utilizado para
comparar com os resultados do teste de tetrazólio.
1
Adaptação de: BELTRATI, C.M.; PAOLI, A.A.S.; TIMONI, J.L. Morfologia e anatomia das sementes de
Cariniana legalis (Mart.) O. Ktze. e de C. estrellensis (Raddi) O. Ktze. (Lecytidaceae). Silvicultura, v. 16, n. 1,
p. 293-300, 1982.
44
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado em
esquema fatorial 3 x 4 x 3 (três concentrações da solução de tetrazólio, quatro períodos
de coloração e três lotes). Os resultados obtidos foram submetidos à análise de
variância, sendo transformados em arco seno raiz quadrada de x/100. As médias dos
tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância,
sendo utilizado o programa SANEST (ZONTA & MACHADO, 1984).
45
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Embebição das sementes
Na ocasião da realização do experimento, as sementes apresentaram teor de
água inicial de 9,5%. Com o decorrer das horas, observou-se que as sementes estando
imersas absorvem água normalmente do meio, sem haver restrição do tegumento,
sendo esta absorção maior até 12 horas, quando as sementes atingem porcentagem de
absorção que varia muito pouco e que se estabiliza a partir de 96 horas.
De acordo com a tabela. 1, até 12 horas depois do início da embebição, a taxa
de absorção de água é de aproximadamente 35%. A partir deste momento, a variação
da embebição entre os tempos torna-se cada vez menor atingindo ao final de 168
horas, cerca de 47%, ou seja, 12% a mais que no período inicial de 12 horas. Este
valor é pouco significativo tendo em vista que em aproximadamente 7 dias depois
houve apenas entrada de água próxima a 2% ao dia.
Desta forma, pode-se afirmar, conforme Castro et al. (2004), que para a
espécie em estudo o período até 12 horas refere-se à Fase I da embebição quando tem
início e é rápida a absorção de água. A duração observada está de acordo com Marcos
Filho (2005) que a descreve como fase de 8 a 16 horas de captação de água, no geral.
O período compreendido entre 12 e 168 horas refere-se à Fase II, quando
praticamente não há mais entrada de água. Para Taylor (1997) e Carvalho &
Nakagawa (2000), quando sementes cotiledonares atingem teores de água de 35 a
40%, geralmente a absorção se estabiliza ou aumenta muito pouco, como verificado
neste trabalho, começando uma fase estacionária, ou Fase II da curva de embebição.
Marcos Filho (2005) acrescentou que a ocorrência e duração da Fase II variam
de acordo com a espécie analisada, e que esta se caracteriza tanto pela redução drástica
46
da velocidade de hidratação e da atividade respiratória, como pela realização de
atividades do processo bioquímico preparatório.
Tabela 1 - Médias de porcentagem de absorção de água em relação ao peso inicial de
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.
Tempo (h) Médias 5%
0,5 12,2134 h
1 15,0106 gh
2 18,8695 fgh
4 22,9399 efg
6 26,3589 def
8 29,7094 cdef
10 31,6494 bcde
12 35,1796 abcd
14 35,0444 abcd
16 35,4624 abcd
18 36,3911 abcd
20 37,0233 abcd
22 38,7352 abc
24 39,0953 abc
30 39,4182 abc
36 40,0352 abc
48 41,1581 abc
60 42,0294 abc
72 43,5246 ab
84 44,2557 ab
96 45,2269 a
108 44,9500 a
120 47,0575 a
132 46,9341 a
144 46,5769 a
156 46,7134 a
168 46,7309 a
C.V.
7,539%
Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
(C.V.) coeficiente de variação
47
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0,5 2 6 10 14 18 22 30 48 72 96 120 144 168
Tempo (horas)
Absorção de água (%)
Verifica-se, ainda com base nos dados da Tabela 1, que o período entre 12 e
96 horas, correspondente a Fase II da embebição, pode ser considerado de transição,
ocorrendo neste, gradativa redução na porcentagem de absorção de água até alcançar a
estabilização em cerca de 45%.
A Figura 3 ilustra a curva obtida com os dados de porcentagem de absorção de
água.
Figura 3 - Curva de embebição de sementes de Cariniana estrellensis.
Com base na Figura 3 é possível observar a estabilização da porcentagem de
absorção de água a partir de 96 horas de embebição. Após 168 horas poderia ser
verificado o início da Fase III, mas como o objetivo do experimento foi apenas de
observar se as sementes apresentavam dormência tegumentar, não se estendeu para
depois deste período. Contudo, é bem possível, com base nos resultados dos testes de
germinação, que a partir deste momento, conforme caracterizam esta fase Carvalho &
Nakagawa (2000) e Marcos Filho (2005), reiniciaria a absorção de água e o
crescimento do embrião seria retomado com a protusão da raiz primária.
48
4.2 Caracterização dos lotes
4.2.1 Teor de água
A Tabela 2 apresenta o teor de água inicial para cada lote. Constatou-se que
houve diferença significativa entre os lotes, decorrente provavelmente de fatores
edafoclimáticos do local de coleta dos frutos; das condições de beneficiamento e
armazenamento das sementes; do grau de maturação das sementes; ou ainda, de
características genéticas das sementes (por exemplo, diferenças na composição
química).
Tabela 2 -
Teor de água inicial dos três lotes analisados de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze.
Lote 1 Lote 2 Lote 3
Teor inicial (%)
9,5 B 10,3 A 9,0 C
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
4.2.2 Massa de 1000 sementes
Conforme a Tabela 3, observa-se que houve entre os lotes variação
significativa na massa de 1000 sementes, sendo essa maior para o Lote 2, que também
apresentou maior teor de água. Assim, parte da massa das sementes deste lote pode ser
atribuída a maior quantidade de água presente em suas sementes, o que condiz com as
RAS (BRASIL, 1992) que afirmam que esta pode ser influenciada pelo grau de
umidade. Entretanto, outros fatores podem ainda interferir na massa das sementes,
como o espessamento do tegumento em função de características edafoclimáticas da
procedência e o tamanho das sementes. Dos três lotes analisados, as menores sementes
pertenciam ao Lote 1 e as maiores ao Lote 2, contudo não foi realizada coleta destes
parâmetros biométricos.
49
Tabela 3 - Massa de mil sementes dos três lotes analisados de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze.
Lote 1 Lote 2 Lote 3
Massa de mil sementes (g)
5,568 C 8,913 A 7,832 B
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Alves et al. (2005) verificaram que, embora não tenha influenciado a
germinação de sementes de Mimosa caesalpiniifolia Benth., o tamanho das sementes
afetou o vigor das mesmas.
Segundo Nakagawa (1994) este fator deve ser considerado nos trabalhos de
pesquisa, pois pode interferir nos resultados de vigor de diferentes lotes. Carvalho
(1986), citado por Nakagawa (1994), afirmou que sementes menores, por necessitarem
de menor quantia de água, germinam primeiro; por outro lado, sementes maiores, que
possuem conteúdo de tecido de reserva maior, originam plântulas de maior tamanho
ou peso.
4.3 Adequação de testes para avaliação da viabilidade e vigor de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze
4.3.1 Teste de germinação
As análises de variância para o teste de germinação são apresentadas em
Apêndice (Tabela 3A e Tabela 4A).
Em todos os parâmetros analisados, houve efeito significativo do fator
substrato. Os resultados foram mais satisfatórios quando se realizou semeadura sobre
papel (Figuras 4, 5 e 6).
O fator lote não apresentou efeito significativo apenas para a porcentagem de
plântulas normais. O lote 3 mostrou qualidade superior a dos demais nos quesitos
50
porcentagem de germinação e de sementes mortas, mas apresentou índice de plântulas
anormais maior (Figura 7).
Figura 4 - Efeito de diferentes substratos sobre porcentagens de germinação (G), de
plântulas normais (PN), de plântulas anormais (PAN) e de sementes
mortas (SM) em sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.
Entretanto, com base na interação significativa dos substratos e lotes, esta
maior porcentagem de plântulas anormais apenas foi verificada no substrato sobre
areia (Tabela 4), havendo possibilidade de influência negativa deste substrato sobre o
Lote 3. Em relação à velocidade média e ao tempo médio de germinação, verificou-se
diferença significativa entre os lotes 1 e 2, com maior velocidade e menor tempo
médio para o primeiro (Figuras 5 e 6).
Quanto à temperatura, observou-se efeito significativo somente na velocidade
média e tempo médio de germinação (Figuras 5, 6 e 8), sendo que nestes, a
temperatura constante de 25ºC proporcionou germinação significativamente melhor
que a de 20-30ºC, com maior número de sementes germinadas por dia e em menor
intervalo de tempo.
B
B
A
A
A
AB
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
G PN PAN SM
Porcentagem
Papel
Areia
Médias seguidas pela
mesma letra maiúscula,
em colunas de um mesmo
parâmetro analisado, não
diferem entre si pelo teste
de Tukey
a 5% de
probabilidade.
51
Figura 5 - Velocidade média (semente/dia
-1
) de germinação de três lotes de sementes
de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze submetidas a diferentes
temperaturas e substratos.
Figura 6 - Tempo médio de germinação de três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze submetidas a diferentes temperaturas e
substratos.
A
B
A
B
A
B
AB
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
Temperatura Substrato Lote
semente/dia
-1
25ºC
20-30ºC
Papel
Areia
Lote 1
Lote 2
Lote 3
B
A
B
A
B
A
AB
0
1
2
3
4
5
6
Temperatura Substrato Lo te
Tempo médio (dias)
25ºC
20-30ºC
Papel
Areia
Lote 1
Lote 2
Lote 3
Médias seguidas pela
mesma letra maiúscula,
em colunas de um
mesmo fator, não
diferem entre
si pelo
teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
Médias seguidas pela
mesma letra maiúscula,
em colunas de um
mesmo fator, não
diferem entre si pelo
teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
52
Figura 7 - Porcentagens de germinação (G), de plântulas normais (PN), de plântulas
anormais (PAN) e de sementes mortas (SM) de sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze, em função da procedência do lote.
Figura 8 - Efeito de diferentes temperaturas sobre porcentagens de germinação (G), de
plântulas normais (PN), de plântulas anormais (PAN) e de sementes
mortas (SM) em sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.
B
A
B
A
B
A
B
A
A
A
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
G PN PAN SM
Porcentagem
Lote 1
Lote 2
Lote 3
A
A
A
A
A
A
A
A
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
G PN PAN SM
Porcentagem
25ºC
20-30ºC
Médias seguidas pela
mesma letra maiúscula,
em colunas d
e um
mesmo parâmetro
analisado, não diferem
entre si pelo teste de
Tukey a 5% de
probabilidade.
Médias seguidas pela
mesma letra maiúscula,
em colunas de um
mesmo parâmetro
analisado, não diferem
entre si pelo teste de
Tukey a 5% de
probabilidade.
53
A única interação significativa observada foi dos fatores lote e substrato nos
parâmetros porcentagem de plântulas normais e anormais. Assim, pela interação, a
diferença entre lotes na porcentagem de plântulas normais e anormais depende do
substrato analisado (Tabelas 4 e 5).
No caso, quando utilizado sobre papel como substrato, não houve diferença
entre lotes para a porcentagem de plântulas anormais (Tabela 4), no entanto para a
porcentagem de plântulas normais (Tabela 5) o lote 3 apresentou melhores resultados,
com valor estatisticamente semelhante ao apresentado pelo lote 2 mas diferente ao do
lote 1. Com relação ao substrato sobre areia, ocorreu o contrário. Os lotes responderam
estatisticamente da mesma forma à porcentagem de plântulas normais, mas houve
diferença significativa na anormalidade de plântulas, sendo esta superior para o lote 3.
Tabela 4 - Porcentagem de plântulas anormais em três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura e substrato.
Substrato Médias Lotes Temperaturas
Papel Areia (Lote)
Lote 1 25°C
12 25
20-30°C
16 26 20 b
Médias
14 aB 26 bA
Lote 2 25°C
10 32
20-30°C
17 31 23 b
Médias
14 aB 32 bA
Lote 3 25°C
18 62
20-30°C
24 52 39 a
Médias
21 aB 57 aA
Média Geral
16 B 38 A
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
54
Tabela 5 - Porcentagem de plântulas normais em três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura e substrato.
Substrato Médias Lotes Temperaturas
Papel Areia (Lote)
Lote 1 25°C
64 44
20-30°C
56 39 51
Médias
60 bA 42 aB
Lote 2 25°C
61 41
20-30°C
63 39 51
Médias
62 abA 40 aB
Lote 3 25°C
75 28
20-30°C
74 36 54
Médias
75 aA 32 aB
Média Geral
66 A 38 B
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
Com base na interação, observou-se ainda que todos os lotes apresentaram
porcentagens de plântulas normais maior e de anormais menor quando o substrato
utilizado foi sobre papel.
Os resultados mais satisfatórios ao substrato sobre papel indicam que este
proporcionou de alguma forma vantagens germinativas às sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze. Por tratar-se de um ambiente fechado (em caixas
“gerbox”), a umidade do substrato sobre papel foi melhor conservada e desta forma,
houve disponibilidade constante de água para as sementes. No substrato areia, e por
ser realizada semeadura sobre areia, pode ter havido em algum momento água
insuficiente para a germinação das sementes e desenvolvimento adequado das
plântulas o que resultou em menor porcentagem de germinação (Tabela 6) e de
plântulas normais (Tabela 5) e maior porcentagem de plântulas anormais (Tabela 4) e
sementes mortas (Tabela 7), além de acarretar em menor velocidade (Tabela 8) e
maior tempo médio de germinação (Tabela 9).
55
Tabela 6 - Porcentagem de germinação de três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura e
substrato.
Substrato Médias Lotes Temperaturas
Papel Areia (Lote)
Lote 1 25°C
76 69 71 b
20-30°C
72 65
Lote 2 25°C
71 73 74 b
20-30°C
80 70
Lote 3 25°C
93 90 92 a
20-30°C
98 88
Médias
82 A 76 B
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
Tabela 7 - Porcentagem de sementes mortas em três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura e substrato.
Substrato Médias Lotes Temperaturas
Papel Areia (Lote)
Lote 1 25°C
24 29 29 a
20-30°C
28 35
Lote 2 25°C
29 27 27 a
20-30°C
20 30
Lote 3 25°C
07 10 8 b
20-30°C
02 12
Média Geral
18 B 24 A
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
56
Tabela 8 - Velocidade média de germinação (semente/dia
-1
) de três lotes de sementes
de Cariniana estrellensis submetidas a diferentes condições de
temperatura e substrato.
Substrato Médias Médias Lotes Temperatura
Papel Areia 25°C 20-30°C Lote
Lote 1 25°C
0,3134 0,2572 0,2853 0,2291 0,2572a
20-30°C
0,2850 0,1731
Lote 2 25°C
0,2747 0,2096 0,2422 0,1845 0,2133b
20-30°C
0,2146 0,1544
Lote 3 25°C
0,2991 0,2013 0,2502 0,2153 0,2327ab
20-30°C
0,2403 0,1902
Médias Substrato
0,2712A 0,1976B ---- ---- ----
Médias Temperatura
---- ---- 0,2592A 0,2096B ----
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
Tabela 9 - Tempo médio de germinação (dias) de três lotes de sementes de Cariniana
estrellensis submetidas a diferentes condições de temperatura e substrato.
Substrato Médias Médias Lotes Temperatura
Papel Areia 25°C 20-30°C Lote
Lote 1 25°C
3,2368 3,9529 3,5949 4,7238 4,1593b
20-30°C
3,5590 5,8885
Lote 2 25°C
3,7042 4,9007 4,3025 5,8648 5,0836a
20-30°C
4,7688 6,9607
Lote 3 25°C
3,4032 5,1917 4,2975 4,8406 4,5690ab
20-30°C
4,1811 5,5000
Médias Substrato
3,8089B 5,3991A ---- ---- ----
Médias Temperatura
---- ---- 4,0650B 5,1431A ----
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
57
Esta explicação também foi dada por Andrade et al. (2006) e por Varela et al.
(2005) às melhores respostas germinativas de sementes de Dalbergia nigra (Vell.) Fr.
All. e Acosmium nitens (Vog.) Yakovlev, respectivamente, ambas semeadas sobre
substrato vermiculita.
No substrato sobre papel, respostas germinativas positivas também foram
encontradas para Mimosa caesalpiniaefolia Benth. (NOVEMBRE, 2007).
Segundo Marcos Filho (2005), se depois de iniciada a captação de água pela
semente houver carência de água para continuidade do metabolismo, a germinação é
paralisada. O restabelecimento do suprimento de água deve ser realizado o mais rápido
possível, pois do contrário ocorre a liberação de exsudados, dentre eles os açúcares, o
que estimula o desenvolvimento de fungos e prejudica a germinação.
Marcos Filho (2005) ainda acrescenta que à medida que o teor de água do solo
(substrato) diminui, verifica-se inicialmente redução da velocidade de germinação;
com restrições mais severas a porcentagem de germinação também passa a ser
prejudicada.
Quanto às diferenças encontradas na germinação de lotes de procedências
distintas, elas podem ocorrer, conforme Wielewicki et al. (2006), devido: 1) a grande
variabilidade genética que espécies silvestres em seu estado natural comportam e que
resultam em ampla variedade de características morfofisiológicas que, por sua vez, são
determinantes no comportamento ecológico dos indivíduos de mesma espécie; 2)
distribuição em grande extensão geográfica, sujeitando essas espécies a variações
edafoclimáticas em escalas espaciais e temporais; e, 3)manejo de coleta e pós-coleta
capaz de influenciar diretamente na qualidade germinativa das sementes.
A temperatura constante de 25ºC pode ter sido favorável devido a possível
necessidade das sementes a maiores temperaturas, pois no regime alternado de 20-
30ºC as sementes estavam expostas por período maior de tempo (16 horas) à menor
temperatura (20ºC). Para Bilia et al. (1995), citados por Carvalho (1994), a maior
velocidade de germinação de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze foi
encontrada sob a temperatura de 30ºC.
58
Em Cariniana legalis (Martius) Kuntze, dentre as temperaturas testadas de 20,
25, 30, 20-30 e 35ºC, Rêgo & Possamai (2004) verificaram maior velocidade e
porcentagem de germinação sob 30ºC e 20-30ºC.
Oliveira et al. (1996) recomendaram que em estudos relacionados à
metodologia de análise de germinação de sementes florestais sejam incluídas
temperaturas alternadas, pois essas simulariam flutuações de temperaturas que
ocorrem próximo ao solo, em condições naturais de floresta.
Neste trabalho, os resultados demonstraram que as sementes de
Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze não necessitam de alternância de temperatura para iniciar o
processo germinativo ou acelerá-lo, pois para os dois regimes de temperaturas testados
as porcentagens de germinação e de plântulas normais foram estatisticamente
semelhantes, além de haver valores superiores de velocidade média e inferiores de
tempo médio de germinação para temperatura constante de 25ºC.
A alternância de temperatura também não favoreceu a germinação de
sementes de Cedrela odorata L. (ANDRADE & PEREIRA, 1994) e de Acacia
polyphylla DC (ARAÚJO NETO et al., 2003), sendo que, da mesma forma que em
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze houve apenas diferença significativa entre 25ºC
constante e 20-30ºC alternada para tempo médio e/ou velocidade de germinação. Para
Myracrodruon urundeuva Fr. All. (PACHECO et al., 2006) também foram
encontrados resultados favoráveis à germinação sob temperatura constante nos
quesitos porcentagem de germinação e primeira contagem.
4.3.2 Condutividade elétrica
Primeira etapa
Todos os experimentos, com exceção do segundo (2g e 75ml), apresentaram
resultados satisfatórios para diferenciação de lotes quanto ao vigor das sementes
(Tabela 5A e Tabela 10). No experimento 2, a quantidade de sementes (2g) pode ter
sido muito pequena para o volume de água utilizado (75ml) o que gerou maior diluição
59
dos lixiviados no meio diminuindo a condutividade e conseqüentemente interferindo
na diferenciação dos lotes.
No experimento 3, a maior quantidade de sementes e menor volume de água
empregados no teste (4g e 50 ml) concentrou mais o meio com lixiviados o que
possivelmente afetou a variação da condutividade elétrica entre os tempos testados.
Houve assim diferença significativa na leitura da condutividade elétrica em intervalos
de tempo menores que nos demais experimentos, sendo possível detectar grandes
discrepâncias de vigor entre lotes com tempos menores de embebição. A concentração
desta relação quantidade de sementes/volume de água poderia ser obtida com o uso de
2g de sementes e 25ml de água, por exemplo, sendo mais uma opção para realização
deste teste para a espécie em estudo e com menor gasto de sementes.
Verificou-se, ainda no experimento 3, interação significativa entre os fatores
lote e tempo, sendo que nos tempos 4 h e 48 h não houve diferença significativa da
condutividade elétrica entre os lotes normal e envelhecido.
Como esperado, e indicado pela Tabela 10, a concentração do meio variou
entre os experimentos, apesar de não comparados estatisticamente, com maior
condutividade elétrica nos meios mais concentrados, sendo em ordem decrescente
maior no experimento 3, 4, 1 e por último 2. Além disso, com exceção do experimento
2, a maior condutividade elétrica foi observada no lote com sementes envelhecidas
artificialmente, o que também era esperado.
Apesar dos dados mostrarem que maiores concentrações são mais indicadas
para realização do teste de condutividade elétrica para a espécie em estudo, o
experimento 1 apresenta uma vantagem entre os demais (3 e 4), a menor quantidade de
sementes utilizada. Assim, esse experimento foi escolhido para a segunda etapa do
teste de condutividade elétrica.
60
Tabela 10 - Valores médios (µScm
-1
g
-1
) da condutividade elétrica de massa, para dois lotes (LN – normal; LEnv – envelhecido
artificialmente) de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze em quatro experimentos com combinações distintas
de quantidade de sementes e volume de água, em função do tempo de embebição.
Médias de um mesmo experimento seguidas da mesma letra, maiúscula nas colunas e minúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Experimentos
2g/50ml 2g/75ml 4g/50ml 4g/75ml
Lote
Hora
LN LEnv
Média
LN LEnv
Média
LN LEnv
Média
LN LEnv
Média
1 57,7 77,9 67,8 f 37,6 39 38,3h 109gB 154,3fA 131,7h 69,1 127,9 98,5f
2 69,1 91 80,1ef 45 45,1 45,1gh 124,2gB 178,6fA 151,4h 80,9 149,9 115,4ef
4 99,6 116,3 108def 63,6 63,6 63,6fg 172fA 195,5fA 183,8g 108,6 175,4 142def
8 121,2 139,3 130,3cde 79 78,4 78,7ef 190,8fB 324eA 257f 133,1 257,5 195,3cde
12 143,2 152,8 148bcd 92,9 91,9 92,4de 249,3eB 376,5deA
312,9e 153,2 296,8 225bcd
16 158,2 160,5 159,4abcd
101,8 101,7 101,8cde
319,3dB 407cdA 363,2d 163 320,5 241,8bcd
20 175,9 214,6 195,3abc 119,9 117,7 118,8bcd
371,8cdB
446bcdA 408,9cd 202,9 342,5 272,7abc
24 179,9 171,9 175,9abc 125,3 118,1 121,7bc 395bcB 456,8bcA
425,9c 208,6 365,5 287,1abc
28 188 223,8 205,9ab 131,6 126,7 129,2abc
403,3bcB
489,3abA
446,3bc 218,7 403,5 311,1abc
36 193,4 240,7 217,1ab 145,2 138,2 141,7ab 461abB 517,8abA
489,4ab 264,3 408 336,2ab
48 197 253,5 225,3a 154,9 145,2 150,1ab 481aA 525,5abA
503,3a 274 411,8 342,9ab
60 196,3 283,5 239,9a 162 157,9 160a 515aB 571,8aA 543,4a 288,8 449,8 369,3a
Média
148,3B
177,2A
162,8 104,9A
102A 103,5 316B 386,9A 351,4 180,4B
309,1A
244,8
61
Segunda etapa
Houve efeito significativo dos lotes e tempos de embebição sobre a
condutividade elétrica, sendo ainda observada interação significativa desses fatores
(Tabela 6A).
Os resultados obtidos na época da montagem desta etapa do teste de
condutividade elétrica, referentes ao teor de água, porcentagem de germinação e índice
de velocidade de germinação, estão apresentados na Tabela 11. Observa-se que os
valores de teor de água são inferiores ao recomendado pela AOSA (1983) para soja
(entre 11 e 17%), o que, segundo Loeffler et al. (1988), aumenta significativamente o
valor da condutividade elétrica (VIEIRA & KRZYZANOWSKI, 1999). Contudo,
Marques (2001) em seu estudo com sementes de Dalbergia nigra, considerou que o
teor de água, que variou de 9,4% a 10,6%, não afetou os resultados do teste.
Embora os teores de água dos lotes analisados tenham sido inferiores aos do
trabalho de Marques (2001), a variação entre eles foi menor, um fator positivo na
análise de condutividade elétrica. Mesmo assim, houve diferença significativa entre os
lotes 1 e 3 tendo eles, respectivamente, o maior e o menor teor de água. Apesar do teor
de água ser menor para o lote 3, a condutividade elétrica foi maior para o lote 1,
demonstrando não haver interferência deste fator na realização do teste.
Tabela 11 - Teor de água (TA), germinação (G) e índice de velocidade de germinação
(IVG) de três lotes de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.
Lote TA (%) G (%) IVG
1
8,5 A 53 B 0,77 B
2
8,3 AB 32 B 0,45 B
3
8,1 B 90 A 1,17 A
CV (%)
1,48 16,90 25,14
Médias seguidas por uma mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
62
Os resultados apresentados na Tabela 11 para porcentagem de germinação e
índice de velocidade de germinação (IVG) indicam que o lote 3 é o que possui melhor
qualidade fisiológica e que entre os lotes 1 e 2 não há diferença significativa.
De acordo com os dados apresentados na Tabela 12, o experimento escolhido
para realização desta segunda etapa do teste de condutividade elétrica obteve
resultados de certa forma satisfatórios para diferenciação dos lotes quanto ao vigor.
Nos primeiros períodos de embebição já é possível distinguir os lotes 1 e 3, sendo a
condutividade elétrica maior para o lote menos vigoroso (Lote 1). Contudo, nos
períodos compreendidos entre 1 e 48 horas de embebição, os lotes 2 e 3 apresentam
vigor estatisticamente semelhante, o que difere dos resultados de porcentagem de
germinação e IVG.
Para Bonner et al. (1994), utilizar apenas dados de teste de germinação para
discriminar lotes de sementes não é adequado, pois a queda na germinação é um dos
últimos eventos que ocorrem no declínio da qualidade fisiológica de sementes. Desta
forma, segundo eles, resultados semelhantes de porcentagem de germinação podem
esconder qualidades fisiológicas distintas.
Conforme Marcos Filho (2005), em sementes de alto vigor a reestruturação
das membranas ocorre mais rapidamente o que acarreta em diminuição da liberação de
exsudados, até que essa praticamente cesse. Verificou-se que no Lote 3 a
condutividade elétrica foi estatisticamente semelhante a partir de 7 horas de embebição
o que aconteceu para os lotes 1 e 2 somente a partir de 24 horas, indicando qualidade
inferior das sementes desses lotes.
Considerando o exposto acima, é possível afirmar que o Lote 2, apesar de
estatisticamente semelhante ao 1 quanto ao vigor pelo IVG, é mais vigoroso que este e
menos vigoroso que o Lote 3 pelo teste de condutividade elétrica, o que apenas é
visível a partir de 48 horas de embebição.
Quando os lotes apresentam-se muito discrepantes quanto ao vigor, a
condutividade elétrica já é significativamente diferente nos primeiros períodos de
embebição, o que pode ser observado na Tabela 12 desde o período 1 hora, onde o lote
1 já mostrava ser o menos vigoroso. Contudo, quando a diferença de vigor entre os
lotes não é tão grande, como entre os lotes 2 e 3, é necessário um tempo maior de
63
embebição para diferenciá-los, o que foi visível para os três lotes somente a partir de
48 horas de embebição, quando provavelmente o sistema de membranas já estava
reestruturado para o Lote 3 enquanto que as sementes do Lote 2 ainda estavam
perdendo exsudados pelo sistema de membranas. A Figura 8 ilustra esta diferença de
vigor pelo aspecto da solução de embebição de cada lote.
Desta forma, o emprego desta metodologia do teste de condutividade elétrica
pode ser considerado mais seguro apenas a partir de 48 horas de embebição, quando
ficou evidente a diferença de vigor entre os três lotes.
Tabela 12 - Valores médios (µScm
-1
g
-1
) da condutividade elétrica de massa, para
sementes de três lotes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze em cada
período de embebição.
Lote
Períodos de embebição (h) 1 2 3
0
9,05 hA 4,78 fA 4,03 eA
1
46,08 gA 23,85 efAB 19,25 deB
2
69,55 fgA 38,47 deB 33,42 cdeB
3
80,43 efA 42,40 deB 36,80 cdeB
4
89,95 defA 46,75 deB 41,08 cdB
5
99,08 defA 50,65 deB 44,48 bcdB
6
106,55 cdeA 53,83 cdeB 47,03 bcdB
7
113,30 cdeA 57,95 cdB 50,43 abcdB
8
117,55 cdA 59,48 cdB 51,83 abcdB
12
138,60 bcA 69,68 bcdB 59,23 abcB
24
171,08 abA 84,85 abcB 65,50 abcB
36
181,10 aA 96,18 abB 74,98 abB
48
187,90 aA 114,08 aB 81,50 aC
Média
108,48 A 57,14 B 46,89 C
Médias seguidas da mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
64
Figura 9 -
Aspecto da solução de embebição com as sementes de Cariniana
estrellensis no teste de condutividade elétrica após 48 horas de
embebição.
4.3.3 Tetrazólio
O pré-teste forneceu informações importantes para a realização do teste de
tetrazólio definitivo.
O período de embebição escolhido (30 horas) baseou-se na constatação no
pré-teste que a partir de 24 horas já era possível obter uma coloração adequada dos
tecidos embrionários bem como remover o tegumento com maior facilidade.
Quanto ao preparo das sementes para coloração, verificou-se que mesmo
submetendo as sementes à alta concentração de tetrazólio e por período de tempo
prolongado (10, 14 e 90 h), sementes com tegumento e endosperma intactos, ou apenas
endosperma, não foram coloridas. Sementes com corte longitudinal obtiveram
coloração desuniforme e o corte influenciou na coloração, o que poderia dificultar na
interpretação dos resultados. Assim, optou-se por remover tanto tegumento quanto
endosperma para melhor disseminação do sal de tetrazólio nos tecidos embrionários de
sementes de jequitibá-branco e conseqüente uniformidade de coloração.
L1
L2
L3
65
Para algumas espécies apenas cortes ou punções não são suficientes para a
penetração da solução de tetrazólio, sendo necessária à retirada total do tegumento, o
que foi observado para sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze neste
trabalho assim como por Oliveira et al. (2005) para sementes de ipê-amarelo e de ipê-
roxo e por Fogaça et al. (2006) para sementes de Gleditschia amorphoides Taub.
Das concentrações do sal de tetrazólio analisadas no pré-teste, ficaram
evidentes semelhanças nas colorações resultantes de concentrações próximas, como
0,075% e 0,1%. As maiores concentrações testadas (0,5% e 0,75%) produziram
coloração muito intensa dos tecidos, sendo exceção à produzida pela concentração de
0,5% em período de exposição dos tecidos de 1h. Estas constatações influenciaram na
escolha de número menor de concentrações com rejeição das maiores concentrações e
maior diferença entre as menores. Além disso, observou-se que para as concentrações
escolhidas, períodos curtos de exposição do embrião ao tetrazólio (2 a 4 h) obtiveram
bons resultados, o que influenciou na escolha dos períodos de 2, 3, 4 e 5 horas no teste
definitivo.
A comparação da porcentagem de viabilidade das sementes obtida através do
teste de tetrazólio definitivo com a porcentagem de germinação (Tabela 11) indica
que, apesar de superestimar a viabilidade dos lotes devido as condições de execução
do teste, o tetrazólio diferenciou-os da mesma forma que o teste de germinação, com
qualidade fisiológica superior do Lote 3. Os resultados das diferentes metodologias
testadas para coloração das sementes de jequitibá-branco pelo teste de tetrazólio
definitivo são apresentados na Tabela 13.
Dos fatores testados (concentração da solução, tempo de coloração e lote)
verificou-se apenas efeito significativo do fator lote (Tabela 7A). Assim, independente
da concentração de sal de tetrazólio ou do tempo de coloração, a viabilidade foi maior
para o Lote 3, o que demonstra que todas as metodologias podem ser utilizadas.
66
Tabela 13 - Metodologias testadas para emprego do teste de tetrazólio na avaliação da
qualidade fisiológica de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi)
Kuntze.
Viabilidade (%) Concentração da
solução (%)
Tempo de
coloração (h)
L1 L2 L3
0,05 2 90 73 100
3 88 63 100
4 95 78 98
5 85 78 95
0,1 2 90 73 95
3 88 83 100
4 83 85 93
5 90 73 95
0,25 2 80 75 95
3 83 83 93
4 75 80 95
5 93 70 98
Média
87 B 76 C 96 A
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Na prática, maiores concentrações com maior tempo de exposição dos tecidos
produziram coloração forte enquanto que concentrações menores da solução de
tetrazólio com menor tempo de coloração resultaram em coloração fraca do embrião o
que pode dificultar a avaliação da viabilidade dos lotes. Assim, recomenda-se a
coloração durante 4 ou 5 horas com concentração de 0,05% de tetrazólio, ou 3 ou 4
horas com concentração de 0,1%, ou 2 ou 3 horas com concentração de 0,25% (Figura
10). Dentre esses, a escolha do método pelo analista pode ser pautada na economia de
sal ou na rapidez de coloração das sementes, uma vez que os métodos aqui
mencionados apresentaram coloração semelhante.
A menor concentração da solução de tetrazólio aqui testada (0,05%), com
período de coloração de 5 horas, também permitiu avaliar com mais eficácia a
viabilidade de sementes de guapuruvu que a concentração de 0,1% em igual período
de coloração (FERREIRA et al., 2007).
67
Figura 10 - Sementes viáveis de C. estrellensis (Raddi) Kuntze, coloridas em
diferentes concentrações de solução de tetrazólio, por períodos de
tempo crescente (2, 3, 4 e 5 horas respectivamente).
Na Figura 11, está representada, em diagrama, a classificação dos níveis de
viabilidade empregados na definição da viabilidade dos lotes de sementes de C.
estrellensis (Raddi) Kuntze, conforme descrito a seguir:
Classe 1 – Viável: semente apresentando coloração rósea uniforme e integral,
com tecidos de aspecto normal e firme;
Classe 2 – Viável: semente com pequenas áreas nos cotilédones sem coloração
ou coloridas mais intensamente, não atingindo regiões vitais;
Classe 3 – Viável: semente com coloração da extremidade da radícula branca
leitosa ou vermelha intensa, sem atingir o cilindro central, podendo ainda apresentar
pequenas áreas sem coloração nos cotilédones;
Classe 4 – Viável: semente apresentando menos de 50% da região cotiledonar
com coloração branca leitosa e, a mesma coloração na extremidade da radícula sem
atingir, contudo, o cilindro central; ou, presença de estrias sobre o eixo embrionário
0,05%
0,1%
0,25%
68
que não atingem o cilindro central; ou, mancha vermelha intensa sobre o eixo
embrionário afetando apenas o cortex;
Classe 5 – Inviável: eixo embrionário apresentando coloração vermelha
intensa podendo ainda ocorrer tal coloração em parte dos cotilédones;
Classe 6 – Inviável: semente apresentando coloração vermelha intensa em toda
sua extensão;
Classe 7 – Inviável: semente apresentando cotilédones total ou parcialmente
brancos com eixo embrionário de coloração vermelha intensa; ou, eixo embrionário e
região vascular com coloração branca e leitosa;
Classe 8 – Inviável: semente com coloração branca e leitosa, amarelada ou
acinzentada em sua totalidade, estando os tecidos firmes ou flácidos.
Classe 1 Classe 2 Classe 3
Classe 4 Classe 5 Classe 6
Classe 7 Classe 8
69
Figura 11 - Representação das classes de viabilidade para sementes de Cariniana
estrellensis (Raddi) Kuntze:Viáveis (Classes 1 a 4) e Inviáveis (Classes
5 a 8).
A Figura 12 complementa o diagrama acima, pois mostra não
esquematicamente, mas o aspecto real de sementes quanto ao estado de viabilidade.
Figura 12 - Alguns danos apresentados pelas sementes de Cariniana estrellensis
(Raddi) Kuntze depois de coloração em sal de tetrazólio. A: Classe 7 –
embrião intacto; B: Classe 7 – embrião em corte longitudinal; C: Classe
5 (dois embriões à esquerda) e Classe 7 (embrião à direita) – intactos; D:
Classe 5 (dois embriões à esquerda) e Classe 7 (embrião à direita) – em
corte longitudinal.
A
B
D
C
70
5 CONCLUSÕES
1. Sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze não apresentam
restrição tegumentar à permeabilidade de água, completando a Fase I da
embebição com 12 horas.
2. Temperatura constante de 25°C e semeadura sobre papel mostraram-se mais
adequadas para condução do teste de germinação.
3. A utilização de 2 g de sementes em 50 ml de água com embebição por 48
horas foi eficiente na classificação dos lotes quanto ao vigor.
4. As concentrações de 0,05% por 4 ou 5 horas, de 0,1% por 3 ou 4 horas e de
0,25% por 2 ou 3 horas permitiram a avaliação da viabilidade, com resultado
semelhante ao teste de germinação.
71
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APÊNDICE
81
Tabela 1A – Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para embebição de
sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.
Causa de variação GL Valor F
Tempo 26 20,9056**
Resíduo 81
Coeficiente de variação
7,539 %
** significativo a 1%.
Tabela 2A - Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para teor de água e
massa de mil de três lotes de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi)
Kuntze.
Causa de variação GL Valor F
Teor de água Massa de mil
Lote 2 25,3598 ** 634,1116 **
Resíduo 9
Coeficiente de variação
1,457 % 1,823 %
** significativo a 1%.
Tabela 3A - Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para porcentagens
de germinação (G), de plântulas normais (PN), plântulas anormais
(PAN) e sementes mortas (SM) de sementes de Cariniana estrellensis
(Raddi) Kuntze, em diferentes lotes, substratos e temperaturas.
** significativo a 1%; * significativo a 5%.
(C.V.) Coeficiente de variação
Valor F Causa de variação GL
G PN PAN SM
Lote (L) 2 39,9537 ** 0,2350
ns
17,4864 **
37,9794 **
Substrato (S) 1 9,0785 ** 67,6198 **
63,8502 **
8,1302 **
Temperatura (T) 1 0,1899
ns
0,1465
ns
0,6146
ns
0,0959
ns
L x S 2 1,4508
ns
5,4579 ** 4,9740 * 1,4930
ns
L x T 2 0,8291
ns
0,6598
ns
0,2760
ns
1,0353
ns
S x T 1 2,4074
ns
0,0951
ns
3,5074
ns
2,7233
ns
L x S x T 2 0,6435
ns
0,3098
ns
0,3304
ns
0,4502
ns
Resíduo 36
C.V.
9,938 % 15,219 % 20,716 % 25,189 %
82
Tabela 4A - Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para velocidade
média (VM) e tempo médio (TM) de germinação de sementes de
Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, em diferentes lotes, substratos e
temperaturas
.
** significativo a 1%; * significativo a 5%.
Tabela 5A - Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para condutividade
elétrica de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, nos
quatro experimentos da primeira etapa
.
Causa de variação
GL
Valor F
2g/50ml 2g/75ml 4g/50ml 4g/75ml
Lote 1 8,5116 ** 0,3054
ns
168,8408 **
95,4431 **
Tempo 11 16,8135 ** 53,9496 ** 233,9883 **
16,9993 **
Lote x Tempo 11 0,4476
ns
0,0606
ns
3,5937 * 0,2901
ns
Resíduo 72
C.V.
13,057 % 8,246 % 4,161 % 13,916 %
** significativo a 1%; * significativo a 5%.
(C.V.) Coeficiente de variação
Valor F Causa de variação GL
Velocidade média
Tempo médio
Lote 2 4,7249 * 3,3213 *
Substrato 1 39,6870 ** 29,3669 **
Temperatura 1 18,0376 ** 13,4980 **
Lote x Substrato 2 0,2803
ns
0,0323
ns
Lote x Temperatura 2 0,3975
ns
1,0127
ns
Substrato x Temperatura 1 0,0021
ns
1,4764
ns
Lote x Substrato x Temperatura 2 1,6542
ns
1,1076
ns
Resíduo 36
Coeficiente de variação 17,256 % 22,079 %
83
Tabela 6A - Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos para condutividade
elétrica de sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze, na
segunda etapa (2g/50ml).
Causa de variação GL Valor F
Lote 2 279,2676 **
Tempo 12 69,3449 **
Lote x Tempo 24 5,4062 **
Resíduo 117
Coeficiente de variação
20,103 %
** significativo a 1%; * significativo a 5%.
Tabela 7A - Análise de variância (Teste F) dos resultados obtidos no teste de
tetrazólio para sementes de Cariniana estrellensis (Raddi) Kuntze.
Causa de variação GL Valor F
Lote 2 34,0945 **
Tempo 3 0,1050
ns
Concentração 2 1,0533
ns
Lote x Tempo 6 0,5713
ns
Lote x Concentração 4 0,8796
ns
Tempo x Concentração 6 0,7734
ns
Lote x Tempo x Concentração 12 0,8362
ns
Resíduo 108
Coeficiente de variação
16,772 %
** significativo a 1%; * significativo a 5%.
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