( PDF ) Ablação cirúrgica dos bulbos olfatórios em coelhos: modelo para estudos de patogenia de infecções por vírus neurotrópicos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

ABLAÇÃO CIRÚRGICA DOS BULBOS OLFATÓRIOS

EM COELHOS: MODELO PARA ESTUDOS DE

PATOGENIA DE INFECÇÕES POR VÍRUS

NEUROTRÓPICOS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Erika Toledo da Fonseca

Santa Maria, RS, Brasil

2006

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ABLAÇÃO CIRÚRGICA DOS BULBOS OLFATÓRIOS EM

COELHOS: MODELO PARA ESTUDOS DE PATOGENIA DE

INFECÇÕES POR VÍRUS NEUROTRÓPICOS

por

Erika Toledo da Fonseca

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação

em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Cirurgia de Pequenos

Animais, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito

parcial para obtenção do grau de

Mestre em Cirurgia Veterinária.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Mazzanti

Santa Maria, RS, Brasil

2006

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Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Ciências Rurais

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

Departamento de Clínica de Pequenos Animais

A Comissão Examinadora, abaixo assinada,

aprova a Dissertação de Mestrado

ABLAÇÃO CIRÚRGICA DOS BULBOS OLFATÓRIOS EM COELHOS:

MODELO PARA ESTUDOS DE PATOGENIA DE INFECÇÕES POR

VÍRUS NEUROTRÓPICOS

elaborada por

Erika Toledo da Fonseca

Como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Cirurgia Veterinária

COMISSÃO EXAMINADORA:

________________________________

Alexandre Mazzanti, Dr., UFSM

(Presidente/Orientador)

________________________________

Alceu Gaspar Raiser, Dr., UFSM

__________________________________

Émerson Antonio Contesini, Dr., UFRGS

Santa Maria, 21 de dezembro de 2006

RESUMO

Dissertação de Mestrado

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

Universidade Federal de Santa Maria

ABLAÇÃO CIRÚRGICA DOS BULBOS OLFATÓRIOS EM COELHOS: MODELO

PARA ESTUDOS DE PATOGENIA DE INFECÇÕES POR VÍRUS

NEUROTRÓPICOS

AUTORA: ERIKA TOLEDO DA FONSECA

ORIENTADOR: ALEXANDRE MAZZANTI

Santa Maria, 21 de dezembro de 2006.

Coelhos têm sido utilizados como modelo para o estudo da neuropatogenia da infecção pelo

herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5), um importante agente de doença neurológica em bovinos.

O sistema olfatório tem sido apontado como a principal via de acesso do vírus ao cérebro após

replicação na cavidade nasal. Para investigar a importância da via olfatória na patogenia da

infecção neurológica pelo BHV-5, foi elaborada e avaliada técnica operatória de craniotomia

transfrontal para remoção dos bulbos olfatórios (BOs), definindo-se as órbitas como

referência anatômica. Foram utilizados 45 coelhos com 30 a 40 dias de idade, sendo 23

submetidos à ablação cirúrgica dos BOs e posteriormente inoculados pela via intranasal (IN)

ou no saco conjuntival (IC) com o BHV-5. Após incisões de pele, tecido subcutâneo e

periósteo, a craniotomia foi realizada em um ponto eqüidistante entre os cantos mediais dos

olhos, com uma broca sulcada de 3mm acoplada a uma perfuratriz elétrica de baixa rotação. A

remoção dos BOs foi realizada com uma sonda uretral nº6 acoplada a um aspirador. O estudo

macroscópico de três animais após a cirurgia comprovou que o procedimento foi eficiente na

remoção total dos BOs. Isso também foi comprovado pela interrupção do acesso do vírus ao

córtex cerebral: apenas um animal (1/11 ou 9,1%) no grupo submetido à ablação dos BOs

com inoculação IN desenvolveu enfermidade neurológica, contra 100% (10/10) dos coelhos

controle. Conclui-se que a técnica de craniotomia transfrontal utilizando a órbita como

referência anatômica permite o acesso adequado para localização e remoção dos BOs e pode

ser utilizada em estudos de patogenia de infecções por vírus neurotrópicos que exijam a

interrupção completa da via olfatória.

Palavras-chave: herpesvírus bovino tipo 5, BHV-5, bulbo olfatório, cirurgia, modelo

experimental, coelhos.

ABSTRACT

Master’s Dissertation

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

Universidade Federal de Santa Maria

SURGICAL ABLATION OF THE OLFACTORY BULB IN RABBITS: A MODEL TO

STUDY THE PATHOGENISIS OF NEUROTROPIC VIRUS INFECTIONS.

AUTHOR: ERIKA TOLEDO DA FONSECA

ADVISER: ALEXANDRE MAZZANTI

Santa Maria, December, 21

, 2006.

Rabbits have been used as animal models to study the pathogenesis of neurological infection

by bovine herpesvirus type 5 (BHV-5), an important agent of meningoencephalitis in cattle.

The olfactory system has been implicated as the main pathway for the virus to reach the brain

after replication in the nasal mucosa. To investigate the role of the olfactory route in the

pathogenesis of neurological infection, a technique of transfrontal craniotomy for ablation of

the main olfactory bulbs (MOBs), using the eyes as the anatomic reference was developed and

evaluated. Using this technique, twenty three 30 days-old rabbits were submitted to surgical

ablation of the MOBs and subsequently inoculated with BHV-5. After skin, subcutaneous

tissue and periosteum incisions, the craniotomy was performed in a point equidistant to the

medial corner of the eyes, with a 3 mm drill coupled to a low intensity elyptic drilling

machine. The removal of the MOB’s tissue was performed by using a number 6 uretral probe

coupled to a surgical vaccum pump. The anatomic references used were appropriate in

allowing an adequate and easy access to the MOBs. Necropsy performed in three animals

after the surgery demonstrated that the surgical procedure was efficient in completely

removing the MOB tissue. This was also demonstrated by the interruption of the access of the

virus to the brain after intranasal inoculation: only one animal (1/11) in the bulbectomized

group developed neurological infection and disease, against 100% (10/10) of the control

group. The transfrontal craniotomy using the eyes as the anatomical reference allowed for an

adequate access for localization and removal of the MOBs in rabbits. This techique may be

used in studies of viral pathogenesis requiring the complete interruption of the olfactory

connection to the brain.

Key words: vaccines, bovine herpesvirus type 1, BoHV-1, bovine viral diarrhea virus,

(BVDV), experimental model, guinea pigs.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Vista frontal da cabeça de um coelho mostrando o local da incisão de pele

(linha) e o local da craniotomia

(ponto)............................................................................................................................. 26

FIGURA 2a – Corte sagital da cabeça de um coelho submetido à ablação cirúrgica dos bulbos

olfatórios. Observa-se o local da craniotomia e da cavidade antes ocupada pelos bulbos

olfatórios (seta)................................................................................................................ 27

FIGURA 2b – Desenho esquemático do corte sagital da cabeça de um coelho submetido à

ablação cirúrgica dos bulbos olfatórios. Observa-se o local da craniotomia e da cavidade

antes ocupada pelos bulbos olfatórios

(seta)................................................................................................................................ 27

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Tratamentos e resumo do curso clínico em coelhos submetidos ou não a

bulbectomia e inoculados com herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-

5)..................................................................................................................................... 25

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

................................................................................................................ 9

2. CAPÍTULO 1. ABLAÇÃO CIRÚRGICA DOS BULBOS OLFATÓRIOS EM

COELHOS: MODELO PARA ESTUDOS DE PATOGENIA DE INFECÇÕES POR

VÍRUS NEUROTRÓPICOS................................................................................................ 12

Resumo................................................................................................................................... 13

Abstract.................................................................................................................................. 13

Introdução............................................................................................................................... 15

Material e Métodos................................................................................................................. 17

Resultados e discussão............................................................................................................ 19

Fontes de aquisição................................................................................................................. 22

Referências............................................................................................................................. 22

3. REFERÊNCIAS................................................................................................................ 28

1. INTRODUÇÃO

O sistema olfatório localiza-se na parte mais rostral do encéfalo e compreende os

Bulbos Olfatórios (BOs) e os nervos olfatórios, sendo responsável por proporcionar a sensação

de odor (CHRISMAN, 1985). As terminações sensoriais olfatórias estão distribuídas pelo

epitélio da membrana mucosa da concha nasal. As células olfatórias formam um plexo na

submucosa e são agrupadas em numerosos nervos que passam através das aberturas na placa

crivosa do osso etmóide como nervos olfatórios. Essas fibras nervosas terminam fazendo

sinapse com neurônios dos bulbos olfatórios projetando-se dentro do hipotálamo e em outras

partes do sistema límbico para produzir uma resposta comportamental apropriada ao olfato

(regulação do consumo de alimentos, comportamento materno, sexual e social)

(GANDELMAN et al., 1972; LEONARD, 1972; SEEGAL & DENENBERG, 1974; GETTY,

1975; MEGUID et al., 1997; GONZALEZ-MARISCAL et al., 2003).

Vários vírus animais se utilizam de fibras nervosas para se disseminar a partir dos sítios

de replicação primária e atingir o Sistema Nervoso Central (SNC). Esse tipo de disseminação

viral foi inicialmente demonstrado por Pasteur para o vírus da raiva e, posteriormente para

outros vírus. Dentre os vírus animais que utilizam a via nervosa para invadir o encéfalo e

causar doença neurológica se incluem o herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), o vírus da doença

de Aujeszky (PRV), o herpesvírus eqüino (EHV), o vírus da raiva e os vírus da encefalite

eqüina venezuelana (VEEV). (STROOP et al., 1984; BABIC et al., 1994; CARD et al., 1994;

LEE et al., 1999).

O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um importante vírus de bovinos e tem sido

associado a surtos de meningoencefalite de repercussões econômicas significativas. A

patogenia da infecção neurológica pelo BoHV-5 envolve a replicação primária na mucosa

respiratória seguida pelo transporte do vírus ao longo de fibras nervosas até o SNC. A partir

daí, o vírus se dissemina, replica e produz infecção neurológica (LEE et al., 1999). Duas vias

nervosas principais têm sido implicadas no transporte do vírus até o encéfalo: a via trigeminal,

através de ramos sensoriais do nervo trigêmeo; e a via olfatória, através das fibras dos nervos

olfatórios que inervam a mucosa olfatória (CARD et al., 1994; BABIC et al., 1994). A

importância de cada uma destas vias na patogenia da infecção tem sido objeto de vários

estudos, pois pode fornecer importantes informações acerca da habilidade do vírus em utilizar

diferentes vias nervosas para se disseminar no organismo. Neste sentido, a interrupção

cirúrgica se constitui em uma abordagem objetiva para se determinar a real importância destas

vias no transporte do vírus até o encéfalo.

A neurocirurgia tem sido muito utilizada para o estudo da patogenia de vírus

neurotrópicos. A neurectomia de fibras supostamente envolvidas no transporte de vírus tem

auxiliado no entendimento dos mecanismos e das vias utilizadas por estes vírus para se

disseminar pelo organismo. Em especial, a patogenia da infecção aguda e latente pelo vírus do

herpes simplex humano (HSV-1) tem sido estudada com o auxílio da neurocirurgia em

modelos animais (WALZ et al., 1974; PRICE & SCHMITZ, 1978; HILL et al., 1983;

SHIMEID et al., 1987; CLEMENTS & SUBAK-SHARPE, 1988; TENSER et al., 1988).

A ablação cirúrgica dos BOs (bulbectomia) tem tido grandes aplicabilidades no estudo

de aspectos fisiológicos e comportamentais de diversas espécies animais. Ratos

bulbectomizados têm sido utilizados como modelo de depressão psíquica (SONG &

LEONARD, 2005), em estudos comparativos dos efeitos bioquímicos e comportamentais da

depressão entre animais jovens e adultos (SLOTKIN et al., 1999) e também na regulação do

consumo alimentar (MEGUID et al., 1997). A habilidade e comportamento materno em

coelhas e camundongas (GANDELMAN et al., 1972; GONZALEZ-MARISCAL et al., 2003)

além de ovelhas e cabras (BALDWIN & SHILLITO, 1974; ROMEYER et al., 1994) também

tem sido objeto de estudo com auxílio desta técnica cirúrgica além do estudo da regeneração

axonal e sináptica em camundongos (GRAZIADEI et al., 1978), e canibalismo em

camundongos e hamsters (LEONARD, 1972; SEEGAL & DENENBERG, 1974).

A via trigeminal de conexão entre a mucosa nasal e o encéfalo é composta pelas fibras

dos neurônios pseudounipolares (ou bipolares) cujas terminações se distribuem sob a mucosa

respiratória e cujos corpos neuronais se situam no gânglio trigêmeo (GT). Além destas, as

fibras sensoriais do ramo oftálmico do nervo trigêmio que se distribuem na mucosa do saco

conjuntival podem servir de via de transporte para o vírus atingir o GT e daí se disseminar pelo

encéfalo (BABIC et al., 1994; CARD et al., 1994). A abordagem cirúrgica com o objetivo de

interromper esta via (nervo trigêmeo) seria complexa e dificilmente resultaria na interrupção

completa das conexões neurais que interligam esta região ao encéfalo. Por isto optou-se, nesta

pesquisa, pela interrupção cirúrgica da via olfatória (bulbectomia).

Embora a remoção dos bulbos olfatórios (bulbectomia) venha sendo largamente

utilizada, não há, na literatura consultada, descrição minuciosa desta técnica operatória em

coelhos. Logo, este estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar uma técnica de

bulbectomia total bilateral em coelhos mediante a craniotomia transfrontal, tendo como

referência as órbitas oculares.

2. CAPÍTULO 1

Ablação cirúrgica dos bulbos olfatórios em coelhos: Modelo para estudos de patogenia de

infecções por vírus neurotrópicos.

Surgical ablation of the olfactory bulb in rabbits: a model to study the pathogenesis of neurotropic

virus infections.

Erika Toledo da Fonseca

, Alexandre Mazzanti

Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM),

Santa Maria, RS, Brasil.

Departamento de Clínica de Pequenos Animais (DCPA), UFSM, Santa Maria, RS, Brasil. * Autor para

correspondência: E-mail: [email protected]fsm.br

Ablação cirúrgica dos bulbos olfatórios em coelhos: Modelo para estudos de patogenia de

infecções por vírus neurotrópicos.

Surgical ablation of the olfactory bulb in rabbits: a model to study the pathogenesis of neurotropic

virus infections.

Erika Toledo da Fonseca

, Alexandre Mazzanti

RESUMO

Coelhos têm sido utilizados como modelo para o estudo da neuropatogenia da infecção pelo

herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5), um importante agente de doença neurológica em bovinos. O sistema

olfatório tem sido apontado como a principal via de acesso do vírus ao cérebro após replicação na

cavidade nasal. Para investigar a importância da via olfatória na patogenia da infecção neurológica pelo

BHV-5, foi elaborada e avaliada técnica operatória de craniotomia transfrontal para remoção dos bulbos

olfatórios (BOs), definindo-se as órbitas como referência anatômica.

Foram utilizados

coelhos com

30 a 40 dias de idade, sendo 23 submetidos à ablação cirúrgica dos BOs e posteriormente inoculados pela

via intranasal (IN) ou no saco conjuntival (IC) com o BHV-5. Após incisões de pele, tecido subcutâneo

e periósteo, a craniotomia foi realizada em um ponto eqüidistante entre os cantos mediais dos olhos, com

uma broca sulcada de 3mm acoplada a uma perfuratriz elétrica de baixa rotação. A remoção dos BOs foi

Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria

(UFSM), Santa Maria, RS, Brasil.

Departamento de Clínica de Pequenos Animais (DCPA), UFSM.

* Autor para correspondência: DCPA/CCR/UFSM. 97105-900 Santa Maria, RS. E-mail:

mazzal@smail.ufsm.br

realizada com uma sonda uretral nº6 acoplada a um aspirador. O estudo macroscópico de três animais

após a cirurgia comprovou que o procedimento foi eficiente na remoção total dos BOs. Isso também foi

comprovado pela interrupção do acesso do vírus ao córtex cerebral: apenas um animal (1/11 ou 9,1%)

no grupo submetido à ablação dos BOs com inoculação IN desenvolveu enfermidade neurológica, contra

100% (10/10) dos coelhos controle. Conclui-se que a técnica de craniotomia transfrontal utilizando a

órbita como referência anatômica permite o acesso adequado para localização e remoção dos BOs e pode

ser utilizada em estudos de patogenia de infecções por vírus neurotrópicos que exijam a interrupção

completa da via olfatória.

Palavras-chave: herpesvírus bovino tipo 5, BHV-5, bulbo olfatório, cirurgia, modelo experimental,

coelhos.

ABSTRACT

Rabbits have been used as animal models to study the pathogenesis of neurological infection by

bovine herpesvirus type 5 (BHV-5), an important agent of meningoencephalitis in cattle. The olfactory

system has been implicated as the main pathway for the virus to reach the brain after replication in the

nasal mucosa. To investigate the role of the olfactory route in the pathogenesis of neurological infection,

a technique of transfrontal craniotomy for ablation of the main olfactory bulbs (MOBs), using the eyes

as the anatomic reference was developed and evaluated. Using this technique, twenty three 30 days-old

rabbits were submitted to surgical ablation of the MOBs and subsequently inoculated with BHV-5. After

skin, subcutaneous tissue and periosteum incisions, the craniotomy was performed in a point equidistant

to the medial corner of the eyes, with a 3 mm drill coupled to a low intensity elyptic drilling machine.

The removal of the MOB’s tissue was performed by using a number 6 uretral probe coupled to a surgical

vaccum pump. The anatomic references used were appropriate in allowing an adequate and easy access

to the MOBs. Necropsy performed in three animals after the surgery demonstrated that the surgical

procedure was efficient in completely removing the MOB tissue. This was also demonstrated by the

interruption of the access of the virus to the brain after intranasal inoculation: only one animal (1/11) in

the bulbectomized group developed neurological infection and disease, against 100% (10/10) of the

control group. The transfrontal craniotomy using the eyes as the anatomical reference allowed for an

adequate access for localization and removal of the MOBs in rabbits. This techique may be used in

studies of viral pathogenesis requiring the complete interruption of the olfactory connection to the brain.

Key words: bovine herpesvirus 5, BHV-5, olfactory bulbs, surgery, experimental model, rabbits.

INTRODUÇÃO

O sistema olfatório desempenha funções importantes na fisiologia e comportamento dos

mamíferos. Além da importância da sensação de odor, a olfação também exerce influência na regulação

do consumo de alimentos e interfere no comportamento social, sexual e materno (GANDELMAN et al.,

1972; LEONARD, 1972; SEEGAL & DENENBERG, 1974; MEGUID et al., 1997; GONZALEZ-

MARISCAL et al., 2003). Os neurônios receptores do sistema olfatório localizam-se no epitélio olfatório

da mucosa nasal, onde seus dendritos estão em contato com o meio externo. Esses neurônios emitem

numerosos filamentos, que em conjunto formam o nervo olfatório, e passam através de perfurações na

lâmina cribriforme do osso etmóide convergindo para os bulbos olfatórios (BOs) onde fazem sinapse

(FRISCH, 1967; LOHMAN & LAMMERS, 1967). Os axônios dos neurônios dos BOs conectam-se ao

córtex através do trato olfatório, de onde projetam-se para várias regiões do cérebro onde as sensações

olfatórias são processadas (JENKINS, 1978; BROADWELL, 1975; FRISCH, 1967). Os BOs de coelhos

possuem uma forma elíptica e localizam-se rostralmente ao encéfalo, em recessos do osso etmóide

situados em cada lado da linha mediana (BROADWELL, 1975).

Vírus neurotrópicos como o do herpes simplex (HSV), da raiva (RV) e da pseudoraiva (PRV)

utilizam fibras nervosas que se distribuem na mucosa nasal para invadir e replicar no sistema nervoso

central (SNC) causando doença neurológica (STROOP et al., 1984; LAFAY et al., 1991; BABIC et al.,

1994). O herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) é um alfaherpesvírus associado com meningoencefalite de

curso geralmente fatal em bovinos (ROIZMAN, 1992). A exemplo de outros vírus neurotrópicos, o

BHV-5 parece utilizar as vias olfatória e/ou trigeminal para invadir o encéfalo a partir da cavidade nasal.

Em coelhos utilizados como modelo, o BHV-5 atinge o SNC mais precoce e massivamente através da

via olfatória, porém a via trigeminal também parece contribuir para o transporte do vírus

(CHOWDHURY et al., 1997; LEE et al., 1999; BELTRÃO et al., 2000; DIEL et al., 2005). A

determinação das vias de invasão viral do SNC é fundamental para o entendimento da patogenia e para

a elaboração de estratégias de controle e/ou tratamento de infecções herpéticas humanas e de animais.

A ablação cirúrgica dos BOs (bulbectomia) tem sido utilizada para se estudar vários aspectos

fisiológicos e comportamentais de animais, dentre esses a habilidade e comportamento materno em

coelhas e camundongas (GANDELMAN et al., 1972; GONZALEZ-MARISCAL et al., 2003),

regeneração axonal e sináptica em camundongos (GRAZIADEI et al., 1978), regulação do consumo

alimentar em ratos (MEGUID et al., 1997) e canibalismo em hamsters e camundongos (LEONARD,

1972; SEEGAL & DENENBERG, 1974). A cirurgia também já foi utilizada para se estudar o

comportamento materno de ovelhas e cabras (BALDWIN & SHILLITO, 1974; ROMEYER et al., 1994).

Apesar das diversas aplicabilidades desta intervenção cirúrgica, não há padronização ou pontos

anatômicos de referência para realização da técnica operatória. O presente estudo teve como objetivo

desenvolver uma técnica de craniotomia transfrontal para remoção dos BOs de coelhos, utilizando-se as

órbitas como referência anatômica, avaliando o modelo no estudo da patogenia de infecção viral quanto

ao desenvolvimento de sinais clínicos neurológicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Animais e desenho experimental

O estudo foi desenvolvido no laboratório de Cirurgia Experimental e no Setor de Virologia da

Universidade Federal de Santa Maria. Foram utilizados coelhos da raça Nova Zelândia, machos e fêmeas,

recém- desmamados, com idade entre 30 e 40 dias, pesando entre 700g e 1,1kg. De um total de 45

coelhos, 23 foram submetidos à bulbectomia; os demais permaneceram como controles (22). Seis dias

após a intervenção cirúrgica, os animais bulbectomizados e os controles foram distribuídos

aleatoriamente em dois grupos cada e inoculados com o BHV-5 pela via intranasal (IN) ou conjuntival

(IC).

Pré-operatório e procedimento cirúrgico

O pré-operatório constou de jejum alimentar de seis horas. Como medicação pré-anestésica

utilizou-se cloridrato de cetamina

(25mg/kg) associado ao cloridrato de xilazina

(5mg/kg),

administrados pela via intramuscular. A tricotomia foi realizada na região frontal da cabeça, estendendo-

se caudalmente desde o focinho até a base das orelhas.

Canulou-se a veia marginal de uma das orelhas com cateter nº 24 e por esta via administrou-se

ampicilina sódica

(20mg/kg) como terapia antibiótica profilática e butorfanol

como terapia analgésica

(0,2mg/kg). A anestesia foi mantida com cloridrato de cetamina (10mg/kg) associado ao cloridrato de

xilazina (3mg/kg) por esta via. Após o posicionamento em decúbito esternal, procedeu-se a antissepsia

da região tricotomizada, observando-se a seqüência álcoo-iodo-álcool. Em seguida a pele, tecido

subcutâneo e periósteo sofreram duas incisões paralelas, iniciadas a aproximadamente 0,5cm dorsal ao

canto lateral dos olhos e estendidas ventralmente, terminando a 0,5cm do canto medial. Em seguida, as

incisões foram unidas ventralmente por outra transversal, tornando-a em forma de “U”. A craniotomia

foi realizada na linha mediana, em ponto eqüidistante entre os cantos mediais dos olhos, com a utilização

de uma broca sulcada de 3mm, acoplada a uma perfuratriz elétrica de baixa rotação. Posteriormente

procedeu-se a remoção dos BOs por aspiração. Para isso, utilizou-se uma sonda uretral nº6 acoplada a

um aspirador, inserida na abertura em ângulo de 90º até atingir o assoalho da cavidade craniana e movida

rostralmente até atingir o limite caudal da cavidade nasal. Após a aspiração completa dos BOs, o

periósteo e a pele foram aproximados individualmente com sutura isolada simples, empregando fio

mononáilon 5-0. No período pós-operatório foi administrada dexametasona

(2mg/kg), via intravenosa

e em dose única, e procedeu-se a limpeza diária da ferida cirúrgica até a retirada dos pontos de pele, seis

dias após a intervenção cirúrgica. Os animais foram transferidos para o Setor de Virologia no dia

seguinte, onde foram mantidos em alojamentos coletivos (quatro a seis animais) recebendo ração

comercial balanceada e água ad libitum.

Vírus, inoculação e monitoramento clínico.

Seis dias após o ato operatório, os animais bulbectomizados (n=23) e os controles (n=22) foram

distribuídos em dois grupos cada e inoculados com o BHV-5, de acordo com a tabela 1. Grupo A (n=11):

bulbectomizados, inoculados pela via intranasal (IN); grupo B (n=12): bulbectomizados, inoculados pela

via conjuntival (IC); grupo C (n=10): controles (não submetidos ao procedimento), inoculados pela via

IN; grupo D (n=12): controles, inoculados pela via IC.Os animais foram inoculados com 1ml do

sobrenadante de cultivos celulares infectados com uma cepa brasileira do BHV-5 (SV-507; DELHON

et al., 2003), contendo 10

8,3

doses infectantes para 50% dos cultivos (DICC

/ml). Após a inoculação, os

coelhos foram monitorados clinicamente com três observações diárias de uma hora cada, durante 20 dias.

As taxas de morbidade, mortalidade e o curso clínico da enfermidade neurológica (depressão, bruxismo,

opistótono, andar em círculos e convulsões) nos animais dos diferentes grupos foram registrados e

comparados. Em um experimento piloto, três animais foram submetidos à intervenção cirúrgica e dois

dias após foram submetidos à eutanásia e necrópsia para verificar se o procedimento fora eficaz na

remoção total dos BOs. Todos os procedimentos com os animais foram realizados estritamente de acordo

com as normas do COBEA (lei número 6.638 de 8 de maio de 1979).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A utilização das órbitas como referência anatômica para a craniotomia transfrontal demonstrou

ser adequada para a localização e acesso aos bulbos olfatórios (BOs) (Figura 1). A técnica operatória

mostrou-se efetiva e de fácil execução, com um tempo cirúrgico que variou de 15 a 35 minutos por

animal. A realização da intervenção cirúrgica preliminarmente em três coelhos, para a padronização da

técnica, com necropsias realizadas posteriormente, demonstrou que o tecido dos BOs foi totalmente

removido pelo procedimento. A remoção dos BOs resultou em cavidades bilaterais, alongadas, situadas

entre a lâmina crivosa do osso etmóide e o encéfalo.

Os BOs de coelhos possuem forma elíptica (definida pela cavidade onde se encontram alojados)

e são constituidos de tecido mole que fragmenta-se facilmente ao ser manipulado ou contido por pinças

ou outros instrumentais cirúrgicos. Por isso optou-se pela aspiração do tecido, utilizando-se uma sonda

uretral acoplada a um aspirador. Pela utilização da sonda também evitou-se de efetuar uma abertura maior

na caixa craniana, como relatada anteriormente (BELTRÃO et al., 2000). Além de resultar em trauma

menor, a abertura limitada realizada com a broca sulcada de 3mm de diâmetro, foi suficiente para a

introdução da sonda e aspiração dos BOs (Figura 2). Após a remoção/aspiração da massa principal dos

BOs, procedeu-se a aspiração cuidadosa do assalho da cavidade, para remover restos teciduais que

eventualmente tenham ficado aderidos à lâmina óssea. Procedimento semelhante, porém utilizando

pipetas de pasteur foi utilizado para estudar o efeito da remoção dos bulbos olfatórios acessórios no

comportamento materno em coelhas primíparas. A técnica utilizada, no entanto, não foi descrita em

detalhes (GONZALEZ-MARISCAL et al., 2003).

O período pós-operatório decorreu sem maiores ocorrências. Um coelho removeu a sutura de pele

no terceiro dia de pós-operatório, tendo a cicatrização ocorrida por segunda intenção. Nos animais

restantes, a sutura de pele foi removida entre o quarto e sexto dia de pós-operatório. Durante o intervalo

de seis dias antes da inoculação do vírus, nenhum animal evidenciou sinal de dor ou desconforto como

apatia, inapetência ou hipersensibilidade na ferida cirúrgica; o consumo de ração ficou levemente

aumentado, o mesmo sendo observado com relação ao consumo de água. Não foram observadas

alterações de comportamento (ex:canibalismo) ocasionalmente observadas em outras espécies submetidas

à bulbectomia (LEONARD, 1972; SEEGAL & DENENBERG, 1974). No trabalho realizado por

BELTRÃO et al. (2000), foi observada alteração de seletividade alimentar, com alguns animais

bulbecomizados alimentando-se de pedaços de papel utilizados para forrar as gaiolas. Por essa razão no

presente experimento evitou-se deixar qualquer material ao acesso dos animais, com exceção do alimento

e água.

Pelo número limitado de animais que se dispunha, não foi possível reservar-se um grupo de

coelhos bulbectomizados sem inoculação do vírus. Esse grupo serviria para se avaliar possíveis alterações

clínicas causadas por complicações (infecções/processo inflamatório) neurológicas derivadas do

procedimento cirúrgico e complicações pós-cirúrgicas. Com o decorrer do experimento esse grupo

controle demonstrou ser desnecessário, pois os animais do grupo A (bulbectomizados e inoculados) não

apresentaram quaisquer complicações pós-cirúrgicas. O único animal desse grupo que apresentou

alterações foi o que desenvolveu enfermidade neurológica característica da infecção pelo BHV-5,

confirmada pelo isolamento do vírus do cérebro (DIEL et al., 2005). Portanto, o procedimento cirúrgico

e remoção dos BOs em si não resultaram em complicações/alterações clínico-patológicas detectáveis.

A remoção total do tecido dos BOs e a conseqüente interrupção da via olfatória constituem-se em

pontos críticos para a utilização desses animais em estudos virológicos dessa natureza. Em trabalho

anterior, vários coelhos submetidos à ablação dos BOs e inoculados com o BHV-5 desenvolveram

infecção neurológica com período de incubação e curso clínico compatível com a invasão pela via

olfatória (BELTRÃO et al., 2000). Como a técnica utilizada naquele estudo não foi posteriormente

avaliada para assegurar-se da remoção total dos BOs, é provável que a remoção tenha sido parcial, sem

interrupção da conexão olfatória entre o epitélio olfatório e o encéfalo (BROADWELL, 1975). A

integridade, pelo menos parcial dessa conexão, provavelmente tenha servido para o BHV-5 invadir o

cérebro e causar doença neurológica nos animais (BELTRÃO et al., 2000; DIEL et al., 2005). Da mesma

forma, tem sido demonstrado que interrupções da via olfatória através de neurectomia podem ser

seguidas de regeneração neuronal e reconstituição da via nervosa em camundongos recém-nascidos

(GRAZIADEI et al., 1978). Essas observações também justificam a estratégia para a interrupção da via

olfatória utilizada no presente experimento, ou seja, a remoção completa dos BOs. A regeneração da via

olfatória a partir das extremidades neurais proximal e distal produzidas pelo procedimento utilizado, e

em curto espaço de tempo, seria altamente improvável.

No presente estudo, os resultados da inoculação do BHV-5 indicam que a interrupção da via

olfatória foi completa, impedindo o vírus de invadir o cérebro por essa via (DIEL et al., 2005). O único

animal bulbectomizado que desenvolveu doença neurológica (1/11) apresentou sinais clínicos tardios

(17 dias pós-inoculação), ao contrário dos controles não-bulbectomizados que apresentaram período de

incubação médio de 7,5 dias. O longo período de incubação da infecção neurológica nesse animal indica

que o vírus invadiu o cérebro por outra via, que não a olfatória. Para assegurar-se disso, realizou-se um

experimento adicional, no qual coelhos bulbectomizados (grupo B) ou não (grupo D) foram inoculados

com o BHV-5 pela via conjuntival (Tabela 1). A replicação do vírus na mucosa conjuntival é seguida de

transporte do BHV-5 pelo ramo oftálmico do nervo trigêmeo ao cérebro, resultando em doença

neurológica de curso tardio (CHOWDHURY et al., 1997; BELTRÃO et al., 2000). Corroborando esse

achado, os animais inoculados pela via conjuntival (grupos B e D) apresentaram período de incubação

e curso semelhantes ao animal do grupo A (Tabela 1). Em resumo, tanto os achados da necropsia

realizada em alguns animais bulbectomizados, como os achados virológicos indicam que a técnica foi

efetiva na interrupção completa da via olfatória. Esses resultados permitem a recomendação dessa técnica

para estudos que necessitem a interrupção da via olfatória para estudos de patogenia de infecções por

vírus neurotrópicos. Estudos em andamento visam à interrupção das duas vias principais de acesso ao

cérebro (olfatória e trigeminal), a fim de investigar-se vias alternativas de acesso (e.g. outras vias

nervosas ou via hematógena).

Agradecimentos: Ao Diretor do Biotério Central da UFSM, Médico Veterinário Silvandro Noal pela

cedência e alojamento dos animais durante parte do experimento. Aos bolsistas de iniciação científica

pelo auxílio com a manipulação e monitoramento dos animais. Ao CNPq pelos recursos e bolsas (E.F.F.

[301666/2004-0] e R.W. [301339/2004-0]) são bolsistas PQ do CNPq.

FONTES DE AQUISIÇÃO

Dopalen. Agribrands Purina do Brasil Ltda. Paulínia – SP.

Anasedan. Agribrands Purina do Brasil Ltda. Paulínia – SP.

Ampicilina Sódica. Rambaxy Farmacêutica Ltda. São Paulo – SP.

Torbugesic. Fort Dodge Saúde Animal Ltda. Campinas – SP.

Azium solução Injetável. Indústria Química e Farmacêutica Schering-Plough S.A. Rio de Janeiro – RJ.

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Tabela 1. Tratamentos e resumo do curso clínico em coelhos submetidos ou não a bulbectomia e

inoculados com o herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5).

Grupo Tratamento Via de

inoculação

Número Doença neurológica

N (%)

Início dos sinais

dpi

(média)

A Bulbectomia IN 11 1 (9,1%) 17

B Bulbectomia IC 12 10 (83,3%) 9-15 (12,7)

C Controle IN 10 10 (100%) 5-10 (7,5)

D Controle IC 12 10 (83,3%) 11-20 (15,3)

IN:intranasal; IC:conjuntival.

Dias pós-inoculação.

Figura 1: Vista frontal da cabeça de um coelho mostrando o local da incisão de pele (linha) e o local

da craniotomia (ponto)

Figura 2a: Corte sagital da cabeça de um coelho submetido à ablação cirúrgica dos bulbos olfatórios.

Observa-se o local da craniotomia e da cavidade antes ocupada pelos bulbos olfatórios

(seta).

Figura 2b: Desenho esquemático do corte sagital da cabeça de um coelho submetido à ablação

cirúrgica dos bulbos olfatórios. Observa-se o local da craniotomia e da cavidade antes

ocupada pelos bulbos olfatórios (seta).

3. REFERÊNCIAS

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after intranasal inoculation. Virology, v. 204, p. 616-625, 1994.

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