( PDF ) Papel dos gangliosídios de células estromais sobre a proliferação e sobrevivência de células precursoras mielóides

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

Papel dos gangliosídios de células estromais sobre a proliferação e

sobrevivência de células precursoras mielóides

Ana Luiza Ziulkoski

Orientador: Prof. Dr. Radovan Borojevic

Co-orientadora: Profª Drª Fátima T.C.R. Guma

Tese de doutorado apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas –

Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito parcial para

obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas: Bioquímica.

Porto Alegre

2006

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Ao Arthur, meu filho, meu sonho

Ao Günther, meu porto seguro

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III

“Aproveite tudo que puder a cada hora, cada dia e cada época da vida.

Assim você poderá olhar para frente com confiança e para trás sem ressentimentos.

Seja você mesmo, mas dê o melhor de você.

Atreva-se a ser diferente e seguir sua própria estrela...

E nunca tenha medo de ser feliz!"

AGRADECIMENTOS

Ao professor Radovan Borojevic, pela orientação, pelo exemplo, pela oportunidade.

A Fátima, pela orientação, pela amizade, pela confiança, pela paciência e pelos dez anos

de convivência.

A Vera (Trindade), por um dia ter me catado no corredor do antigo Biociências pra me

falar da bolsa de monitoria com a Fátima, a qual fez tudo começar. Obrigada também pelas

dicas, pela força e por Córdoba.

Ao professor José Luiz Daniotti, pelo período que passei em seu laboratório, pelas

discussões dos resultados, pela ótima crítica e pelas idéias.

Ao Laboratório de Imunogenética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, pelo

empréstimo da citocentrífuga.

A professora Elena, pela disposição em ajudar a esclarecer as dúvidas químicas

protocolo.

A Claúdia, incansável, prestativa, companheira, amiga. Obrigada pela presença, pelos

papos, pelos cafezinhos, pela ajuda inestimável e por ensinar tudo que sabes de gangliosídios.

A Pilar, pelo companheirismo, pelo auxílio, pela dedicação com as imagens e por tornar

meus dias em Córdoba mais fáceis.

A Elisa, meu braço direito, por sua preciosa colaboração e por sobreviver ao meu jeito

“faz duas coisa ao mesmo tempo” de trabalhar.

A Ju e a Mari, por todo o auxílio no início desta jornada.

A Gis, pela colaboração com os meios e manutenção das células. A Lica, pela ajuda nos

experimentos finais. Ao Dudu, pelos “chimas” e aos demais bolsistas do Lab 21 pela

convivência.

A Dona Lia, cujo trabalho é essencial para que o nosso ande bem. Obrigada pelo bom

humor e pela prestatividade.

A Cléia, pelo sorriso gentil e pela ajuda com os problemas burocráticos.

Às minhas culturas de células, como prometido.

Aos colegas da Farmácia Escola da Feevale, especialmente a Ane, Eliane, Letícia e

Paola, por compartilharem das preocupações nos últimos dois anos deste trabalho.

Aos meus pais e ao meu irmão, pelo carinho, pelo apoio e pelo interesse.

À minha vó Marietinha, que mesmo sem fazer idéia do que é uma tese de doutorado, se

preocupava em saber quando eu iria terminar.

Ao Günther, por ouvir meus desabafos, por suportar minhas ausências e entender que

culturas de células precisam de cuidados quase que diários.

APRESENTAÇÃO

Esta tese encontra-se apresentada no formato de artigos científicos e organizada da

seguinte forma:

PARTE I

Introdução, contendo uma revisão da literatura sobre os aspectos que fundamentaram

este trabalho.

Objetivos gerais e específicos do trabalho.

PARTE II

Capítulo 1, contendo artigo científico publicado em periódico internacional.

Capítulo 2, contendo dados complementares do artigo científico já publicado.

Capítulo 3, contendo manuscrito a ser submetido.

Capítulo 4, contendo dados preliminares.

PARTE III

Discussão, contendo uma interpretação geral dos resultados apresentados nos

diferentes capítulos, além da conclusão final.

Perspectivas originadas a partir deste trabalho.

REFERÊNCIAS

Referências bibliográficas citadas nas Partes I e III.

ANEXOS

Anexo 1, contendo a lista de figuras.

Anexo 2, contendo a lista de tabelas.

ÍNDICE

PARTE I

RESUMO....................................................................................................................................2

ABSTRACT ...............................................................................................................................3

LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................................4

INTRODUÇÃO..........................................................................................................................5

1. Gangliosídios.................................................................................................................5

1.1. Gangliosídios e receptores.................................................................................8

1.2. Gangliosídios e hematopoiese...........................................................................9

1.3. Glicosinapses....................................................................................................11

2. Rafts.............................................................................................................................12

3. Hematopoiese ..............................................................................................................15

3.1. O GM-CSF ......................................................................................................17

OBJETIVOS.............................................................................................................................19

1. Objetivos específicos...................................................................................................20

PARTE II

CAPÍTULO 1 ...........................................................................................................................22

CAPÍTULO 2 ...........................................................................................................................32

CAPÍTULO 3 ...........................................................................................................................49

CAPÍTULO 4 ...........................................................................................................................76

PARTE III

DISCUSSÃO............................................................................................................................87

PERSPECTIVAS .....................................................................................................................96

REFERÊNCIAS .......................................................................................................................97

ANEXO 1 – Lista de figuras ..................................................................................................107

ANEXO 2 – Lista de tabelas ..................................................................................................109

PARTE I

RESUMO

A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a

produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente

intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui

características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a

sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido

siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de

células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos

gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma

derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o

monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora

mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O

GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides,

sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio

foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado

pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a

cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração

insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas

frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em

rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das

séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal

gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas

com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de

imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a

cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro

grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um

estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX,

derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória;

e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade

destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras

mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas.

Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no

conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio

envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao

perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi

diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a

proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células

estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi

neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade

de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento

solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de

gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo

assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de

crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O

estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as células-

alvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares

que incluem os receptores para fatores de crescimento.

ABSTRACT

Stroma-mediated myelopoiesis depends upon myelosupportive stroma required

production of growth factors and heparan-sulfate proteoglycans, as well as generation of

negatively-charged sialidase-sensitive intercellular environment between the stroma and the

myeloid progenitors. Gangliosides, sialic acid-containing glycosphingolipids had been related

to modulation of growth factors receptors and differentiation of hematopoietic cells. Here we

studied production, distribution and role of gangliosides in the experimental model of in vitro

myelopoiesis dependent upon AFT-024 murine fetal liver-derived stroma. We used the FDC-

P1 cell line that is dependent upon GM-CSF for both survival and proliferation as a reporter

system to monitor bioavailability and local activity of GM-CSF. GM3 was the major

ganglioside produced by stroma, but not by myeloid cells, and it was required for the optimal

stroma myelosupportive function. It was released into the supernatant and selectively

incorporated into the myeloid progenitor cells, where it segregated into rafts in which it co-

localized with the GM-CSF receptor α chain. Indeed, this ganglioside was found into

insoluble fraction of Triton X-100 treatment at 4°C and into buoyant sucrose gradient

fractions. The GM3 uptaked was also further metabolized by myeloid cells into gangliosides

of the a and b series, similar to the endogenous GM3. In these cells, GM1 was the major

ganglioside, and it was segregated at the interface by stroma and myeloid cells, partially

colocalizing with the GM-CSF receptor α chain. In addition, the ganglioside GM1 showed

none significant co-localization with ganglioside GM3, GM-CSF receptor β chain or CD44.

Moreover, we analyzed the pattern cell production and shedding of gangliosides in a S17 bone

marrow stroma, a murine hepatic stellate cell line derived from inflammatory fibro-

granulomatous reactions that sustain myelopoiesis (GRX cell line) and primary skin

fibroblasts, and compared the ability of these stromata to sustain the survival and proliferation

of the myelopoietic progenitor cells. The concentration of sialic acid reflects the

myelosupportive capacity of the studied cell stromas. Although the stromal cells synthesize

the same gangliosides their relative content were quite different and GM3 being apparently

the major ganglioside species involved for optimal activity of the growth factors. The

shedding was similar to the ganglioside synthesis pattern, but the net myelosupportive activity

was quite different. FDC-P1 proliferation decreased in stroma cells supernatants obtained

from cultures in which ganglioside synthesis was inhibited, as well as in presence of

supernatants in which GM3 was neutralized by the anti-GM3 monoclonal antibody. Then, the

differences in the capacity of sustain myeloid cell proliferation by presented or soluble growth

factor could be related to differences in the concentration of gangliosides present in

membrane or shed to supernatants. We conclude that myelosupportive stroma cells produce

and secrete the required growth factors, the cofactors such as heparan-sulfate proteoglycans,

and also supply gangliosides that are transferred from stroma to target cells, generating on the

latter ones specific membrane domains with molecular complexes that include growth factor

receptors.

LISTA DE ABREVIATURAS

EGF, epidermal growth factor

EGFR, epidermal growth factor receptor

FAK, focal adhesion kinase

FBS, fetal bovine serum

FGF, fibroblast growht factor

FGFR, fibroblast growht factor receptor

GalNAc-T, UDP-GalNAc:LacCer/GM3/GD3/GT3 N-acetilgalactosamiltransferase

Gal-T, UDP-Gal:glicosilceramida galactosiltransferase

GEMs, glycosphingolipid-enriched microdomains

GlcCer, glicosilceramida

GM-CSF, granucoyte-macrophge colony stimulator factor

GM-CSFR, granucoyte-macrophge colony stimulator factor receptor

GPI, glicosilfosfatidilinositol

GSLs, glicoesfingolipídios

HPTLC, high performance thin layer cromatography

HSPGs, heparan-sulphate proteoglicans

IL-3, interleucina-3

IL-5, interleucina-5

MAP, mitogen-activated protein

MAPK, mitogen-activated protein kinase

NBD, N-(7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-il)-ceramida

PBS, phosphate buffered solution

PDGF, plateled-derive growth factor

PDMP, D-L-threo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol

SCF, stem cell factor

Sial-T1, CMP-NeuAc:lactosilceramida sialiltransferase

Sial-T2, CMP-NeuAc:GM3 sialiltransferase

Sial-T3, CMP-NeuAc:GD3 sialiltransferase

SFB, soro fetal bovino

TIFF, Triton X-100 insoluble floating fraction

INTRODUÇÃO

1. Gangliosídios

Os gangliosídios, glicoesfingolipídios complexos contendo pelo menos um resíduo de

ácido siálico, foram descobertos por Ernst Klenk (1942) e nomeados com base em seu

isolamento e altas concentrações em algumas células. No entanto, a nomenclatura comumente

utilizada foi proposta por Svennerholm (1956; 1963) e fundamenta-se no número de ácidos

siálicos presentes na molécula e na sua mobilidade cromatográfica, condizente com a

complexidade estrutural dos gangliosídios (Figura 1). Essas moléculas pertencem a grande e

heterogênea família dos glicolipídios e participam da constituição das membranas celulares,

estando enriquecidos na membrana plasmática. Encontram-se embebidos na face extra-

citoplasmática destas membranas através de sua porção ceramida e expõem a porção

hidrofílica contendo carboidrato para o lado extra-citoplasmático (Maccioni et al., 1999).

A síntese de novo dos gangliosídios se inicia na face citossólica do Golgi proximal com

a geração de glicosilceramida (GlcCer) (Figura 2). Ocorrem então adições seqüenciais de

unidades de oses a uma molécula de GlcCer, catalisadas por glicosiltransferases ligadas à

membrana, ainda no Golgi proximal. Diferentes sialiltransferases (Sial-T1, Sial-T2/Sial-T3)

são responsáveis pela geração dos gangliosídios GM3, GD3 e GT3. Estes três gangliosídios

são convertidos nos diferentes constituintes das séries ganglio a, b e c, respectivamente. Essas

reações de glicosilação, também, são seqüenciais e catalisadas pelas enzimas GalNAc-T e

Gal-T, formando os intermediários das séries o, a, b e c (Maccioni et al., 1999). Além da

síntese de novo dos gangliosídios, a reciclagem desses compostos através do transporte

retrógrado de endossomas para o complexo de Golgi também tem sido bem documentada. As

rotas de reciclagem predominam em células que se dividem lentamente, enquanto a síntese de

novo predomina nas células de multiplicação rápida (Gillard et al., 1998).

Figura 1. Estrutura química de alguns gangliosídios. O gangliosídio em detalhe corresponde ao

gangliosídio GM1. O quadro ilustra a estrutura de diferentes gangliosídios. A nomenclatura de

Svennerholm é utilizada: G, gangliosídio; M, monosialo; D, disialo; T, trisialo. A porção

carboidrato consiste dos seguintes carboidratos: glicose, galactose, N-acetilgalactosamina, ácido N-

acetilneuramínico ou ácido siálico. A porção ceramida é composta de esfingosina unida por uma

ligação amida a um ácido graxo, geralmente ácido esteárico (18:0) ou ácido palmítico (16:0).

Adaptado de Tettamanti (2004).

Esses glicoesfingolipídios têm sido relacionados à regulação da adesão, à proliferação e

à diferenciação celular, bem como a processos de progressão tumoral, a imunossupressão e ao

aparecimento de resistência a múltiplas drogas (Hakamori, 1981; Sietsma et al., 1998). Os

gangliosídios foram os primeiros antígenos descritos como associados a tumores. Além disso,

modificações na composição celular de gangliosídios têm sido relacionadas com alterações na

proliferação celular. De fato, além de seu papel estrutural na organização da membrana

plasmática, essas moléculas têm sido implicadas na regulação dos processos de sinalização

mediados por fatores de crescimento (Miljan & Bremer, 2002).

Figura 2. Representação esquemática da síntese de gangliosídios. Os passos ilustrados

dentro dos retângulos representam reações ligadas à membrana e que ocorrem na face

luminal, cujos produtos se deslocam para a membrana plasmática por transporte vesicular.

Os passos ilustrados fora dos retângulos representam reações ligadas à membrana que

ocorrem na face citosólica dos compartimentos membranares do Golgi, cujos produtos se

deslocam para a membrana plasmática por transporte não-vesicular. Glc-T, UDP-

Glc:ceramida glicosiltransferase; Gal-T1, UDP-Gal:glicosilceramida galactosiltransferase;

GalNAc-T, UDP-GalNAc:LacCer/GM3/GD3/GT3 N-acetilgalactosamiltransferase; Sial-T1,

CMP-NeuAc:lactosilceramida sialiltransferase; Sial-T2, CMP-NeuAc:GM3 sialiltransferase;

Sial-T3; CMP-NeuAc:GD3 sialiltransferase; Sial-T4, CMP-NeuAc:GA1/GM1/GD1b/GT1c

sialiltransferase; Sial-T5, CMP-NeuAc:GM1b/GD1a/GT1b:GQ1c sialiltransferase. Ainda é

incerto se Sial-T2 e Sial-T3 sejam enzimas diferentes ou a mesma enzima. Os gangliosídios

estão nomeados segundo Svennerholm. ER, retículo endoplasmático, GlcCer,

glicosilceramida; GalCer, galactosilceramida, LacCer, lactosilceramida.

Adaptado de

Maccioni e colaboradores (1999).

1.1. Gangliosídios e receptores

Uma série de trabalhos tem demonstrado a participação de gangliosídios nos fenômenos

de adesão celular, geralmente, interferindo na ligação de moléculas de adesão aos receptores

de integrina. Por exemplo, alguns trabalhos relatam que gangliosídios altamente sialilados,

como GT1b, estão envolvidos na inibição da adesão celular de células epiteliais sobre

fibronectina mediada pela integrina α

(Wang et al., 2001b), enquanto o gangliosídio GM3

exerce regulação positiva sobre este receptor de integrina (Zheng et al., 1993). Este mesmo

gangliosídio promove a interação entre a integrina α3 e a tetraspanina CD9 (Kawakami et al.

2002), assim como a adesão de células de melanoma a células endoteliais parece ser um

fenômeno dependente de GM3 (Song et al., 1998).

Os gangliosídios também têm sido relacionados à regulação de receptores envolvidos

com transdução de sinal. Nesse sentido, várias metodologias têm sido utilizadas para

demonstrar os efeitos de gangliosídios sobre a atividade desses receptores, sendo que duas

formas de abordagem experimental são bastante utilizadas: a adição de gangliosídios

exógenos ao sistema em estudo e a manipulação da síntese endógena destes glicolípidios

(Miljan & Bremer, 2002). A maioria dos trabalhos relata efeitos de gangliosídios sobre

receptores de fatores de crescimento tipo tirosina quinase, com maior ênfase nos gangliosídios

GM1 e GM3. No entanto, o gangliosídio GM1 já foi relacionado com a modulação de

receptores tipo proteína G, como os receptores β

-adrenérgicos (Saito et al., 1995).

Estudo realizado por Hynds e colaboradores (1995) relata a inibição da dimerização e da

conseqüente autofosforilação do receptor de PDGF pelos gangliosídios GM1, GM2, GD3,

GD1b e GT1b. Os vários trabalhos que relacionam o gangliosídio GM3 e o receptor de EGF

também propõem a inibição da autofosforilação deste receptor, assim como a inibição da

fosforilação de componentes da cascata de sinal subseqüente (Rebbaa et al., 1996, Zurita et

al., 2001) e da ligação do receptor ao seu ligante (Wang et al., 2001a). Além disso, o GM3

co-imunoprecipita com EGFR (Hanai et al., 1988) e demonstra ter capacidade de ligar-se ao

mesmo através de resíduos de carboidrato existentes no EGFR glicosilado (Wang et al.,

2001c).

O receptor de insulina, também, interage com o gangliosídio GM3, podendo haver

participação do GM3 no processo patológico de resistência à insulina presente no diabetes

melito tipo 2 e na obesidade (Tagami et al., 2002; Yamashita et al., 2003). O excesso do

gangliosídio GM1, provavelmente, inibe o receptor de FGF por competição com o fator de

crescimento, enquanto concentrações fisiológicas de GM1 podem auxiliar na ativação de

FGFR (Miljan & Bremer, 2000). Nesse caso, o GM1 poderia estar atuando como um co-

receptor, apresentando o FGF ao seu receptor de forma análoga ao descrito para os

proteoglicanos de heparan sulfato (Rusnati et al., 2002).

O conjunto destes trabalhos, principalmente, os que relatam a influência de

gangliosídios sobre os receptores de FGF, PDGF e EGF, culminou na proposição de três

modelos mecanísticos para a ação de gangliosídios sobre receptores: interação gangliosídio-

ligante, regulação da dimerização do receptor, e modulação da localização sub-celular e

atividade do receptor (Miljan & Bremer, 2002). Estes modelos não são excludentes, ou seja,

um determinado gangliosídio pode estar atuando sobre um mesmo receptor por mais de uma

forma.

1.2. Gangliosídios e hematopoiese

A partir do conhecimento do potencial modulador de proliferação exercido por

gangliosídios presentes na superfície celular, Kaucic e colaboradores (1994) sugeriram que

gangliosídios liberados (shedding) por células tumorais poderiam contribuir para supressão da

hematopoiese associada a tumores, podendo, também, estar associados com a hipoplasia da

medula óssea, observada em certos processos malignos. Seus resultados mostraram que

moléculas mais complexas (GD1a, GD1b e GT1b) demonstram um maior potencial inibitório,

indicando que os níveis de inibição estão relacionados à complexidade estrutural do

gangliosídio.

O tratamento in vivo ou in vitro de células de medula óssea com gangliosídios derivados

de linfoma de Dalton resulta na inibição da capacidade proliferativa e da formação de

colônias (Bharti & Singh, 2001). O tratamento dos extratos contendo esses gangliosídios com

neuraminidase impede a sua ação inibitória sobre a medula óssea. Anticorpos contra GD3 e,

em menor extensão, contra GM2, também, neutralizam os efeitos inibitórios dos gangliosídios

derivados de linfoma de Dalton. Além disso, os efeitos inibitórios dos gangliosídos isolados

de pacientes com leucemia linfoblástica aguda, na eritropoiese in vitro sugerem que a

supressão hematopoiética in vivo deva ter origem nos gangliosídios presentes nas células

tumorais, e que esses gangliosídios provavelmente sejam liberados tanto para o

microambiente intercelular e como para o plasma. Sietsma e colaboradores (1999) mostraram

que gangliosídios inibem a eritropoiese in vitro em vários estágios de diferenciação, através

de um mecanismo que envolve a modulação da maturação de células eritróides.

Gangliosídios isolados do plasma de pacientes com neuroblastoma inibem tanto a

eritropoiese quanto a mielopoiese normais em maior extensão do que os isolados do plasma

de pacientes sadios (Sietsma et al., 1998). A extensão da inibição parece depender da espécie

e da quantidade total dos gangliosídios liberados. Na presença de gangliosídios exógenos,

células imaturas hematopoiéticas humanas CD34(+), estimuladas por SCF e eritropoietina,

diferenciam-se, predominantemente, para a linhagem mielóide ao invés da linhagem eritróide.

Esta diferenciação é acompanhada por uma redução da capacidade proliferativa (Kawishima

et al., 1993).

Estudos, realizados com células da linhagem leucêmica multipotente K562, mostraram

que o gangliosídio GM3 tem papel crucial na diferenciação dessas células, aumentando a

diferenciação para megacariócitos induzida por éster de forbol e inibindo a diferenciação

eritróide induzida por hemina (Nakamura et al., 1991). Já, em células da linhagem HL-60, o

GM3 está aumentado durante a diferenciação monocítica, enquanto gangliosídios da série

neolacto estão enriquecidos durante a diferenciação granulocítica (Nakamura et al., 1992).

1.3. Glicosinapses

Uma das possíveis funções descritas para os gangliosídios na superfície celular é a de

fazer parte de sítios de identificação de interações célula-célula específicas. Células em

diferentes estágios de diferenciação apresentam diferentes tipos de moléculas glicosiladas, as

quais devem reconhecer moléculas complementares existentes na superfície das células com

as quais devem interagir. As moléculas para reconhecimento de carboidratos podem ser

proteínas (glicoproteínas ou lectinas endógenas), ou carboidratos idênticos (interação

homotípica) ou carboidratos diferentes (interação heterotípica). Em 1991, Kojima e Hakamori

sugeriram a interação célula–célula heterotípica como um novo sistema de reconhecimento,

independente do bem conhecido sistema mediado por integrinas. De fato, durante o

desenvolvimento e progressão tumoral, uma série de glicoesfingolipídios (GSLs) têm sido

identificada como moléculas reguladoras da adesão celular através deste tipo de interação

(Varki, 1994; Song et al., 1998).

Baseado nestes achados e nas descrições de GSLs, particularmente, gangliosídios,

interagindo com receptores transmembranares e moléculas transdutoras de sinal envolvidas na

adesão ou sinalização celular, Hakomori (2002) construiu o conceito de glicosinapses e

propôs três arranjos moleculares para as mesmas. A glicosinapse tipo 1, corresponde a

agregados de GSLs associados com transdutores de sinal citoplasmáticos e tetraspanina, com

ou sem receptores de fatores de crescimento. A glicosinapse tipo 2, corresponde a

microdomínios de membrana ricos em colesterol, contendo glicoproteínas transmembranares

tipo mucina com glicoepitopos o-ligados e associados a transdutores de sinal. Já, a

glicosinapse tipo 3 constitui-se em microdomínios de membrana contendo receptores de

adesão transmembranares N-glicosilados e complexados com tetraspanina e gangliosídios.

As funções dos GSLs como antígenos, mediadores da adesão celular ou moduladores da

transdução de sinal, estão baseadas em sua organização na membrana (Hakomori, 2003). O

microambiente formado na interface entre células que estão interagindo, como proposto nas

glicosinapses, possui um papel central na definição de mudanças fenotípicas após a adesão

celular, tais como as que ocorrem na progressão tumoral e no desenvolvimento ontogênico.

2. Rafts

Durante anos a bicamada lipídica da membrana plasmática de células eucarióticas foi

considerada como uma estrutura bidimensional seguindo o modelo de mosaico fluído de

Singer-Nicholson (1972). No entanto, inúmeras evidências apontam para a existência de pelo

menos dois estados da bicamada lipídica: líquido-ordenado (L

) e líquido-desordenado (L

Na fase líquida-ordenada, fosfolipídios saturados associam-se ao colesterol formando

agregados, onde os lipídios encontram-se gelificados. Esses agregados encontram-se dispersos

em uma matriz líquida-desordenada de glicerolipídios insaturados e conservam a capacidade

de mover-se no plano da membrana (Wisniewska et al., 2003).

O termo lipid raft (Simons & Ikonem, 1997) foi introduzido para referir-se a uma sub-

população de membranas celulares isoladas por sua característica de insolubilidade em

detergentes não-iônicos, na temperatura de 4°C. Os rafts são enriquecidos em colesterol,

esfingomielina e glicolipídios, e sua densidade baixa faz com que flutuem em gradientes de

sacarose (Figura 3). A utilização de diferentes metodologias para estudar os rafts gerou uma

certa heterogeneidade na nomenclatura atual, a qual reflete a própria heterogeneidade desses

microdomínios. Outros termos são utilizados para descrever o mesmo tipo de estrutura

membranar, tais como domínios de GPI (glicosilfosfatidilinositol), TIFF (fração flutuante

insolúvel a Triton X-100) e GEMs (microdomínios enriquecidos em glicoesfingolipídios). No

entanto, é consenso que os rafts se diferenciam das cavéolas por não possuir caveolina como

componente e não apresentarem invaginações da membrana em análises morfológicas

(Simons & Toomre, 2000).

Figura 3. Esquema de um raft na membrana plasmática. O desenho representa um

modelo de um raft biológico. As faces interna e externa de um raft possuem composição

lipídica distinta enriquecida em glicoesfingolipídios (GSL), esfingolipídios (SL),

fosfolipídios saturados (PL), esfingomielina (SM) e esteróis, como colesterol (mamíferos) e

ergosterol (leveduras). Rafts são mais espessos do que o restante da bicamada e contém

proteínas que se associam a eles por acilação (proteína 1), domínios transmembrana (proteína

2), interação proteina-proteína (proteína 3), interação lipídio-proteína (proteína 4) e ancoras

de GPI (proteína 7). Algumas proteínas transmembranares (proteína 5) podem juntar-se aos

rafts temporariamente. Setas duplas indicam associação supostamente reversível com o raft.

É possível que proteínas ancoradas a GPI, como a proteína 7 do modelo, possam afastar-se da

membrana após liberação da ancora, resultando em modificações conformacionais (proteína

7a). Também é possível que proteínas ancoradas a GPI possam carrear com elas proteínas do

lúmem do retículo endoplasmático (proteína 6). O modelo descreve interações horizontais no

plano da membrana entre alguns constituintes dos rafts e componentes não-rafts da

membrana, e interações verticais entre certos constituintes membranares e a matriz

extracelular ou o citoesqueleto subplasmalemal. Os dois tipos de constituintes membranares

(lipídios e proteínas) podem engajar-se em cada uma dessas classes de interação molecular.

Adaptado de Lucero e Robbins (2004).

Uma das mais importantes propriedades dos rafts é a sua capacidade de inclusão e

exclusão de proteínas em extensão variável. A residência temporária de proteínas em rafts

tem sido correlacionada com alterações na atividade dessas proteínas (Lucero & Robbins,

2004). É provável que as proteínas possam se associar aos rafts com diferentes coeficientes

cinéticos e de partição. Proteínas com alta afinidade por rafts incluem proteínas ancoradas a

GPI; proteínas com dupla acilação, como a família das Src quinases; subunidade α de

proteínas G heterotriméricas; proteínas palmitoiladas e ligadas a colesterol, como a

Hedgehog; e proteínas transmembranares, particularemnte, aquelas palmitoiladas (Simons &

Toomre, 2000).

A heterogeneidade lateral criada pelos rafts na membrana plasmática é acoplada à

comunicação vertical entre os ambientes extra e intracelular (Lucero & Robbins, 2004). Pode-

se considerar que os rafts formam plataformas de distribuição lateral de proteínas que se

associam a eles, de forma a concentrar receptores isolados, ativados pela ligação do ligante

respectivo (Hansen et al., 2000). Além disso, acredita-se que o agrupamento de rafts expõe as

proteínas a um novo ambiente, enriquecido em enzimas específicas, tais como quinases e

fosfatases, palmitoilases e depalmitoilases. Dessa forma, pequenas modificações da partição

em rafts poderiam, através de amplificação, iniciar cascatas de sinalização (Simons &

Toomre, 2000).

Os gangliosídios não apenas participam da composição dos rafts, uma vez que são

glicoesfingolipídios, como alguns deles, tais como o gangliosídio GM1, são considerados

componentes típicos de rafts (Santos et al., 2000; Millán et al., 2001). A toxina colérica, a

qual liga-se em GM1, e os anticorpos contra gangliosídios têm sido utilizados para separar

rafts de diferente composição em gangliosídios (Miljan & Bremer, 2000), os quais podem

estar associados a diferentes funções. Por exemplo, rafts enriquecidos em GM3 e em GM1 se

distribuem em diferentes regiões de células polarizadas (Gómez-Moutón et al., 2001; Giebel

et al., 2004). Rafts de GM1 têm sido associados ao CD44 e outras moléculas de adesão

(Gómez-Moutón et al., 2001). Por outro lado, existem trabalhos demonstrando que rafts de

GM3 são enriquecidos em FAK, Src quinases e Rho GTPases (Yamamura et al., 1997;

Iwabuchi et al., 1998; Chigorno et al., 2000)

3. Hematopoiese

A hematopoiese corresponde a uma série de eventos de proliferação e diferenciação

celular rigorosamente regulados, onde, células tronco totipotentes indiferenciadas originam

todas as células sanguíneas (Figura 4). As células-tronco podem proliferar, formando novas

células totipotentes (auto-renovação), ou seguir processos de diferenciação, originando células

multipotentes, e posteriormente, células hematopoiéticas unipotentes, as quais ficam

comprometidas com cada linhagem de células sanguíneas. O fenômeno hematopoiético

compreende dois eventos distintos: a linfopoiese, responsável pela diferenciação e maturação das

linhagens B e T; e a mielopoiese, a qual origina as demais células sangüíneas (Heyworth et al.,

1988).

Durante o período embrionário, a hematopoiese ocorre, inicialmente, na parede do saco

vitelínico, deslocando-se, posteriormente, para a região para-aórtica, fígado e baço com o

desenvolvimento fetal e, a partir do crescimento dos ossos longos e chatos, a medula óssea

começa a produzir ativamente as células sanguíneas (Tavian et al., 1999). Esta atividade

continua no período pós-natal e durante a vida adulta, onde a hematopoiese é restrita à medula

óssea situada no interior de ossos como esterno, ossos da pelve e do crânio (Zon, 1995).

Porém, em algumas situações patológicas na vida adulta e, geralmente associadas a processos

inflamatórios, a hematopoiese pode ocorrer em sítios extramedulares, especialmente no fígado

e no baço (Borojevic et al., 1993). Esse fato sugere que o estroma de tecidos conectivos possa

substituir, pelo menos em parte, o estroma medular (Carvalho et al., 2000).

Figura 4. Esquema representativo da hematopoiese. Na medula óssea, encontramos as células

pluripotentes capazes de auto-renovação (células-fonte), células progenitoras comprometidas com a

linhagem linfóide ou mielóide (células progenitoras comprometidas) e células em diferenciação terminal

(células em amadurecimento). As células precursoras de cada linhagem em diferenciação se originam

das células formadoras de colônia (CFU). A célula-fonte mielóide origina as CFU responsáveis pela

formação dos eritrócitos, das plaquetas, dos basófilos e dos eosinófilos. Os monócitos e os neutrófilos

derivam de uma célula progenitora comprometida comum. A célula progenitora linfóide gera a progênie

da célula B, na medula óssea e as progênies da célula T, no timo (Kierszenbaum, 2004).

Para a manutenção da atividade hematopoiética é necessário um microambiente

complexo na cavidade medular, formado por uma rede vascular especializada e por células

estromais que sustentam a manutenção dos progenitores mielóides e linfóides (Zon, 1995). A

regulação estrita da proliferação, do comprometimento e da diferenciação terminal dos

precursores hematopiéticos exige um matriz extracelular especializada e proteínas específicas,

como fatores de crescimento e citocinas, as quais podem ser produzidas localmente ou atingir

o sítio hematopoiético através da circulação sangüínea (Carvalho et al., 2000). Cada estágio

da proliferação e diferenciação das células sangüíneas depende da presença de um grupo

apropriado de fatores de crescimento. O que torna um dado estroma capaz de sustentar ou não

a produção de células sangüíneas é justamente a produção das citocinas requeridas (Metcalf,

1993) e a apresentação destes fatores às células-alvo em um contexto de ambiente intercelular

apropriado (Allen et al., 1990).

3.1. O GM-CSF

O GM-CSF

(fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos), a IL-3

(interleucina 3) e a IL-5 (interleucina 5) são hemopoietinas centrais que controlam a

proliferação, diferenciação e ativação das células mielóides na cascata hematopoiética. Além

de suas funções na mielopoiese medular, GM-CSF e IL-5 também participam dos processos

de reparo e regeneração tecidual (Holgate, 2000; Franzen et al., 2004). O GM-CSF também

está associado à regulação das células mielóides mais maduras das linhagens granulocítica e

macrofágica, particularmente durante a defesa do hospedeiro e reações inflamatórias

(Hamilton & Anderson, 2004).

A ativação crônica da produção de GM-CSF em tecidos lesados leva a reações

exacerbadas, tais como proliferação e ativação de miofibroblastos e a formação de tecido

granulomatoso e/ ou fibrótico (Desmoulière, et al., 1995; Mann et al., 2001). Trabalhos

recentes apontam o GM-CSF como um participante-chave em doenças inflamatórias e auto-

imunes (Fleetwood et al., 2005). A expressão de GM-CSF também ocorre em muitas células

tumorais, correlacionando-se à agressividade do tumor e à extensão da reação estromal

peritumoral (Bretscher et al., 2000). Sendo assim, o controle local da atividade de GM-CSF é

relevante para a patofisiologia e evolução das reações teciduais em estados patológicos.

Apesar de não apresentar qualquer homologia significativa em seus genes, IL-3, IL-5 e

GM-CSF exibem estruturas terciárias análogas, com um arranjo espacial formado por quatro

alfa hélices (Lopez et al., 1991). Estas hemopoietinas atuam através de receptores tipo tirosina

quinase que possuem cadeia α específica e cadeia β comum (Hamilton, 2002). Sendo assim, a

transdução de seus sinais possivelmente envolve a mesma cascata de sinalização, embora os

componentes desta rota ainda não sejam totalmente compreendidos (Guthridge et al., 2004).

Atualmente, propõe-se que a mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no

que diz respeito à produção de fatores de crescimento e dos glicoconjugados pericelulares,

quanto na geração de um microambiente entre estroma e progenitores mielóides. Sabe-se que

para que a sinalização mediada por GM-CSF seja funcional é necessária a interação entre este

fator e proteoglicanos de heparan-sulfato (HSPGs) e que estromas com diferentes capacidades

de sustentação hematopoiética produzem diferentes proteoglicanos de heparan-sulfato

(Alvarez Silva & Borojevic, 1996; Arcanjo et al., 2002). Além disso, foi demonstrado que a

interação entre as formas solúveis de GM-CSF e heparina depende das propriedades físico-

químicas do ambiente, ocorrendo somente a valores de pH baixos, com níveis ótimos de

interação observados entre valores de pH de 4,0 a 5,0 (Wettreich et al., 1999).

A caracterização da organização espacial entre células estromais e células precursoras

mielóides, realizada por microscopia eletrônica (Borojevic et al., 2003), evidenciou um

extensivo deslocamento (capping) de moléculas carregadas negativamente para a região de

contato e interface entre os dois tipos celulares, provavelmente, associado a diminuição do pH

local. Essas moléculas carregadas negativamente demonstraram suscetibilidade à ação de

sialidase, sugerindo a participação de glicoproteínas sialiladas e/ ou gangliosídios na

formação de complexos macromoleculares que determinam as características físicas e

químicas necessárias para a diminuição local de pH.

OBJETIVOS

Vários trabalhos têm demonstrado a influência de gangliosídios sobre fatores de

crescimento e sobre o sistema hematopoiético. Por outro lado, estudos anteriores propõem que

a interação entre fatores de crescimento e os receptores correspondentes no sistema

hematopoiético, especialmente entre GM-CSF e seu receptor, é controlada por complexos

macromoleculares incluindo proteoglicanos contendo heparam sulfato e moléculas polares

contendo ácido siálico. O conjunto desses dados evidencia a relevância da análise da

composição de gangliosídios dos estromas e de seu papel na capacidade de suporte

mielopoiético de um determinado estroma.

Sendo assim, o objetivo geral deste estudo foi analisar a composição de gangliosídios

de diferentes estromas e verificar a participação destes no microambiente de contato entre

células estromais e células progenitoras mielóides, assim como a possível participação destes

glicolipídios sialilados sobre a capacidade de sustentação da mielopoiese de um dado estroma.

O modelo experimental utilizado apresenta como sistema de resposta para o monitoramento

da disponibilidade e atividade local de fatores de crescimento, especialmente de GM-CSF, a

linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF ou IL-3 para

sua sobrevivência e proliferação. Foram utilizados dois sistemas de suporte para as células

FDC-P1, cocultura sobre uma camada semiconfluente de células estromais e cultivo em meio

condicionado por esses mesmos estromas.

1. Objetivos específicos

1. Identificar o perfil de gangliosídios de estromas secretores de GM-CSF de

diferentes origens: linhagem celular AFT-024, derivada de fígado fetal; linhagem celular S17,

derivada de medula óssea; linhagem celular GRX, representativa de células estreladas

hepáticas murinas isoladas de reações fibro-granulomatosas, e cultura primária de fibroblastos

de pele de camundongos C3H.

2. Analisar os gangliosídios liberados para o meio de cultura pelos diferentes estromas.

3. Determinar a capacidade mielosuportiva dos meios condicionados e dos estromas

em situações de depleção de um ou de todos os gangliosídios do estroma.

4. Verificar a expressão dos gangliosídios nas diferentes linhagens celulares estudadas

e na região de contato entre células precursoras mielóides e células do estroma, utilizando

microscopia de fluorescência nos sistemas de cocultivo.

5. Avaliar a colocalização dos gangliosídios com o receptor de GM-CSF em um dos

modelos in vitro de mielopoiese estudados, utilizando imunodetecção de fluorescência e

microscopia confocal.

6. Detectar a presença de gangliosídios em frações de membrana insolúveis a

detergente em células do estroma e na linhagem precursora mielóide.

PARTE II

CAPÍTULO 1

Gangliosides of myelosupportive stroma cells are transferred to myeloid progenitors and

are required for their survival and proliferation

(artigo publicado)

Referência: Biochemical Journal, v. 394, p. 1-9, 2006.

CAPÍTULO 2

Transferência de esfingolipídios de células estromais para células precursoras mielóides

e determinação do perfil de gangliosídios de frações de membrana correspondentes a

rafts em células AFT-024.

(Dados complementares)

INTRODUÇÃO

Um dos fatores de crescimento envolvidos no processo de diferenciação

hematopoiética é o GM-CSF (fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos),

cujo papel na regulação do crescimento e diferenciação de células mielopoiéticas parece estar

associado à sua interação eletrostática com glicosaminoglicanos presentes nas membranas de

células do estroma (Griffin et al., 1990; Alvarez-Silva & Borojevic, 1996). Essa associação

depende de uma diminuição no pH local, a qual promove mudanças conformacionais no GM-

CSF, tornando-o capaz de interagir com os glicosaminoglicanos. A acidificação do

microambiente pode estar relacionada com a presença de lipídios carregados negativamente

na membrana celular tanto de células do estroma quanto de células hematopoiéticas

(Wettreich et al., 1999; Borojevic et al., 2003).

Estudos de nosso grupo de pesquisa sobre a produção, a distribuição e a função dos

gangliosídios em modelos experimentais de mielopoiese têm demonstrado que o GM3 é o

principal gangliosídio em diferentes estromas mielossuportivos, como as linhagens celulares

AFT-024, S17 e GR (Ziulkoski et al., 2006a; Ziulkoski et al., 2006b; Andrade et al., 2006). Já

a linhagem precursora mielóide FDC-P1 acumula apenas pequena quantidade de GM3. Sabe-

se também que o gangliosídio GM3 liberado pelas células AFT-024 é incorporado

seletivamente pelas células FDC-P1, com segregação em rafts e colocalização com a cadeia α

do receptor de GM-CSF, indicando uma possível relação deste gangliosídio com a sinalização

mielopoiética intermediada por GM-CSF (Ziulkoski et al., 2006a).

Sendo assim, o objetivo deste estudo foi determinar a composição em gangliosídios

das frações de membrana insolúveis a detergente das linhagens FDCP-1, derivada de células

precursoras mielóides e AFT-024, representativa do estroma mielossuportivo de fígado fetal

murino. Além disso, este capítulo contém dados que complementam os resultados já

publicados da transferência de GM3 das células AFT-024 para as células FDC-P1.

METODOLOGIA

Materiais

Os meios de cultivo celular DMEM e RPMI 1640, a C

-N-(7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-

diazol-4-il)-ceramida (C

-NBD-ceramida) e os padrões lipídicos foram obtidos da Sigma-

Aldrich; o soro fetal bovino (SFB) da Cultilab; D-[U-

C]galactose (300 mCi/mmol) e o ECL

da Amersham; as garrafas e placas plásticas para cultura da Nunc; o Fluorsave

Calbiochem; as placas cromatográficas de sílica-gel para cromatografia em camada delgada

de alta performance (HPTLC) da Merck; os anticorpos secundários anti-mouse conjugado a

CY3 e anti-mouse acoplado a peroxidase da Jackson ImmunoResearch; os filmes

autorradiográficos da Kodak. O anticorpo monoclonal anti-GM3 secretado pelo hibridoma

DH2 foi generosamente cedido pelo Dr. Sen-itiroh Hakomori, Universidade de Washington,

Seattle, EUA, e o anticorpo policlonal anti-βintegrina foi generosamente cedido pela Drª.

Carmem Gottfried, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil.

Cultura de células

A linhagem precursora mielopoiética FDCP-1, dependente de IL-3 ou GM-CSF, foi

obtida do Banco de Células do Rio de Janeiro, foi mantida em meio RPMI 10% SFB,

suplementado com 10% de meio condicionado de WeHi como fonte exógena de IL-3,

mantida a 37°C e atmosfera de 5% de CO

. A linhagem celular AFT-024, derivada de fígado

fetal murino, obtida do Banco de Células do Rio de Janeiro, foi cultivada em meio RPMI 10%

SFB e mantida nas mesmas condições citadas acima. Para obter coculturas, células FDC-P1

foram lavadas com solução salina tamponada livre de cálcio e magnésio (CMF-BSS) para

remover IL-3 e GM-CSF e inoculadas (1 x 10

células por poço) sobre as camadas semi-

confluente de células AFT-024 cultivadas em placas de 24 poços.

Imunocitoquímica

Camadas semi-confluentes de células AFT-024 e coculturas (mantidas por 12 h)

cultivadas sobre lamínulas foram fixadas com paraformaldeído 4% por 30 min, lavadas com

PBS e incubadas em PBS contendo 3% de albumina de soro bovino por 1 h a 37°C para

bloquear sítios de ligação inespecíficos. Os procedimentos imunocitoquímicos foram

realizados como descrito por Crespo e colaboradores (2004). Como anticorpo primário foi

utilizado anticorpo monoclonal anti-GM3 (clone DH2, mouse) e como anticorpo secundário

anticorpo monoclonal anti-mouse conjugado a CY3 (1:1000). Após lavagem final com PBS,

as preparações foram montadas com Fluorsave

. Imagens confocais foram obtidas usando

microscópio confocal Carl Zeiss LSM5 Pascal (Facultad de Ciencias Químicas, Universidad

Nacional de Córdoba, Argentina) equipado com um laser de argônio/hélio/neon e uma

objetiva de imersão em óleo de 63 x (abertura de 1,4) (Zeiss Plan-Apochromat).

Alternativamente, os esfingolipídios das culturas de AFT-024 coculturas foram visualizados

pela fluorescência intrínseca da C

-NBD-ceramida, 15 minutos após a adição de meio

contendo 5 µM de C

-NBD-ceramida e após 2 horas de incubação. A transferência de

fluorescência derivada de C

-NBD-ceramida de células AFT-024 para as células FDC-P1 foi

visualizada em coculturas em que o estroma havia sido previamente incubado por 12 h com

-NBD-ceramida. As células FDC-P1 foram semeadas após a retirada do meio contendo a

ceramida fluorescente e as coculturas visualizadas após incubação por 6 h.

Marcação metabólica e análise dos glicoesfingolipídios

As culturas foram incubadas em meio contendo [

C]-galactose 0,5 µCi/mL por 12 h,

lavadas com PBS e raspadas. Os lipídios foram extraídos com clorofórmio/ metanol (2:1, v/v),

purificados em coluna Sep Pack C18 (Williams & McCluer, 1980) e separados por HPTLC

desenvolvida em cuba descrita por Nores e colabordores (1994) no seguinte sistema: uma

primeira eluição com clorofórmio: metanol (4:1, v/v) e uma segunda eluição com

clorofórmio/ metanol/ cloreto de cálcio 0,25% (60:36:8, v/v/v). As bandas radioativas

foram visualizadas por fluorografia da placa cromatográfica, identificadas por comparação

com padrão e quantificadas por densitometria do filme fluorográfico em densitômetro CS 930

Shimadzu UV/vis.

Solubilidade ao Triton X-100

Células marcadas metabolicamente com [

C]-galactose 0,5 µCi/mL por 12 h foram

lavadas com PBS, coletadas e imediatamente tratadas com Triton X-100 1% por 1 h a 4°C,

sob agitação periódica (a cada 10 min). Após, as amostras foram centrifugadas por 1 h, 4°C, a

100 000 x g e as frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel (pellet) foram separadas (Crespo

et al., 2004). Os lipídios das duas frações foram extraídos por partição lipídica de Folch

(1957). A fração clorofórmica foi purificada por coluna DEAE Sephadex A50 seguida de

coluna Sep Pack C18 e os lipídios foram analisados por HPTLC como descrito acima.

Separação por gradiente de sacarose

As células foram lisadas em 0,5 mL de tampão de lise TNE (NaCl 150 mM, EDTA 5

mM, Na

0,1 M, aprotinina 5 µg/mL, leupeptina 0,5 µg/mL, pepstatina 0,7 µg/mL e

Tris/HCl 25 mM, pH 7.5) contendo Triton X-100 1% (m/v), a 4 ◦C por 1 h. Os lisados foram

adicionados sobre gradiente de sacarose contínuo (5 – 35 %) em tampão TNE e centrifugados

por 10 h, 150 000 x g a 4 ◦C (Zurita et al., 2004). Doze frações foram coletadas a partir do

fundo do tubo. Os lipídios de cada fração foram extraídos por partição lipídica de Folch,

purificados em coluna DEAE Sephadex A50 e Sep Pack C18, e analisados por HPTLC como

descrito acima. A fração protéica resultante da partição de Folch foi solubilizada em tampão

Laemmli e submetida à eletroforese e Western blotting.

Eletroforese e Western blotting

Frações obtidas do gradiente de sacarose foram submetidas à eletroforese com SDS

(12%, m/v) sob condições redutoras (2-mercaptoetanol 2%, m/v). As proteínas foram

transferidas eletroforéticamente para membranas de nitrocelulose por 1 h a 300 mA (Towbin

et al., 1979) e as bandas foram reveladas por coloração com Ponceau S. Para imunoblotting

(Zurita et al., 2001), os sítios de ligação inespecífica foram bloqueados por incubação com

solução salina Tris-tamponada (NaCl 400 mM/ tampão Tris 100mM/ HCl tampão, pH 7,5)

contendo polivinilpirrolidona 40 2,5 % (m/v) e albumina 2,5 % (m/v). As membranas foram

incubadas com anticorpo anti-β integrina (1:200, mouse) e depois com anticorpo secundário

anti-mouse acoplado a peroxidase (1:1000). As bandas imunoreativas foram reveladas com

um sistema amplificador de quimioluminescência (ECL, Amershan Pharmacia Biotech) e

detectadas em filme Kodak Biomax MS.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tendo em vista nossos resultados prévios da transferência de GM3 das células

estromais AFT-024 para as células mielóides FDC-P1 e no intuito de obter uma evidência

direta da transferência de esfingolipídios no modelo de estroma mielossuportivo, realizamos

experimentos de adição de C

-NBD-ceramida, a qual é intrinsecamente fluorescente, ao meio

de cultura. As imagens obtidas 15 minutos após a adição do fluoróforo às células AFT-024

demonstram uma marcação concentrada na região perinuclear (Figura 1A), com a marca

fluorescente deslocando-se para a região citosólica e membrana plasmática após 2 horas de

incubação (Figura 1B). Esses resultados sugerem que após captação e transporte intracelular,

uma fração da C

-NBD-ceramida pode, eventualmente, ser utilizada como substrato para a

síntese de esfingolipídios e seus metabólitos fluorescentes podem ser visualizados,

conforme previamente relatado por Koval e Pagano, (1991) e van der Bijl e colaboradores

(1996).

Quando células FDC-P1 foram inoculadas sobre as células estromais previamente

incubadas com C

-NBD-ceramide, uma fluorescência intensa pode ser observada nas células

progenitoras mielóides (Figure 2 A e D). Uma distribuição subcelular similar pode ser

observada quando o gangliosídio GM3 foi imunodetectado com o anticorpo monoclonal DH2

(Figure 2 B e E). Em ambos os casos, as células estromais permaneciam marcadas na área

perinuclear, correspondendo à área do complexo de Golgi onde a ceramida é metabolizada. A

sobreposição das imagens indica que uma fração dos metabólitos derivados da ceramida

fluorescente pode corresponder ao gangliosídio GM3 (Figura 2 C e F, coloração amarelada).

O capping de GM3, já observado em estudos anteriores (Ziulkoski et al., 2006), também foi

evidente nestes experimentos (Figura 2B). Estes resultados vão ao encontro das observações

prévias de um capping extensivo de estruturas semelhantes à rafts na membrana dos estromas

em contato com células FDC-P1 (Borojevic et al., 2003). O conjunto desses resultados

contribui para a confirmação da transferência de GM3 de células estromais para células

precursoras mielóides e para a hipótese da formação de regiões de membrana enriquecidas em

proteoglicanos, glicoesfingolipídios e fatores de crescimento na interface entre estromas e

células-alvo.

Uma vez que nossos resultados indicam a presença de glicoesfingolipídios em rafts,

resolvemos analisar a distribuição desses lipídios nas frações de membrana solúvel e insolúvel

a detergente. O perfil de gangliosídios encontrado para as duas linhagens celulares está em

conformidade com resultados anteriores (Ziulkoski et al., 2006a), sendo os gangliosídios

GM3 e GD1a encontrados em maior quantidade na linhagem AFT-024, enquanto a linhagem

FDC-P1 acumula principalmente GM1 e GD1a (Figura 3 e Tabela 1). Todos os gangliosídios

encontrados nas duas linhagens celulares estudadas se distribuem entre as frações solúvel e

insolúvel a Triton X-100. No entanto, proporções maiores de GM1 são encontradas na

fração insolúvel das células FDC-P1, enquanto proporções maiores de GM3 são encontradas

na mesma fração das células AFT-024 (Figura 3 e Tabela 1). Esses resultados sugerem para a

presença de GM1 e de GM3 em rafts nas células FDC-P1 e AFT-024, respectivamente, e

apontam para uma diferença na constituição dessas estruturas membranares nos dois tipos

celulares quando cultivados isoladamente.

Com o objetivo de confirmar a presença de GM3 em rafts nas células AFT-024,

submetemos a fração insolúvel a Triton X-100 de células AFT-024 a fracionamento em

gradiente de sacarose e analisamos sua composição em glicoesfingolipídios. Pode-se observar

a presença de GD1a em praticamente todas as frações do gradiente (Figura 4A), enquanto

bandas correspondentes ao gangliosídio GM1 não foram detectadas, possivelmente por este

ser um gangliosído persente em menor quantidade neste tipo celular. Por outro lado, o

gangliosídio GM3 somente foi detectado nas frações superiores do gradiente de sacarose, as

quais constituem frações menos densas e nas quais ficam retidas as estruturas de membrana

correspondentes a rafts ou GEMs (frações de membrana enriquecidas em

glicoesfingolipídios). Esses resultados sugerem a presença de rafts contendo tanto GM3 como

GD1a nas células AFT-024, ou de dois tipos de rafts diferentes: rafts enriquecidos em GM3 e

rafts enriquecidos em GD1a, podendo cada qual ter uma função celular distinta. Diferenças na

distribuição celular de rafts enriquecidos em diferentes gangliosídios já foram descritas para

células polarizadas (Gómez-Moutón et al., 2001; Giebel et al., 2004), assim como rafts com

composição distinta em gangliosídios têm sido associados a diferentes moléculas de adesão e

sinalização celular (Gómez-Moutón et al., 2001; Chigorno et al., 2000)

Vários trabalhos têm demonstrado a interferência do gangliosídio GM3 sobre a ligação

de moléculas de adesão a receptores de integrina. O GM3 exerce regulação positiva sobre o

receptor de integrina α

(Zheng et al., 1993) e promove a interação entre a integrina α3 e a

tetraspanina CD9 (Kawakami et al., 2002). Além disso, a adesão de células de melanoma

a células endoteliais parece ser um fenômeno dependente de GM3 (Song et al., 1998). Sendo

assim, resolvemos analisar a distribuição de β integrina nas frações do gradiente de sacarose.

Os resultados demonstram a presença da cadeia β de integrina nas frações mais densas do

gradiente (Figura 4B). Além disso, a banda correspondente a β integrina também foi detectada

nas frações menos densas do gradiente, indicando sua possível presença em rafts. No entanto,

é impossível determinar o quanto a presença de β integrina se correlaciona com os

gangliosídios GM3 ou GD1a. Experimentos de co-localização e/ou co-imunoprecipitação são

necessários para esclarecer essa questão.

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Tabela 1: Análise densitométrica das bandas autorradiográficas dos

glicoesfingolipídios das frações solúvel e insolúvel a Triton X-100 de células

AFT-024 e FDC-P1. As culturas foram marcadas com [

C]-galactose e tratadas

ou não com Triton X-100. Os lipídios foram extraídos, purificados, separados por

HPTLC e visualizados por fluorografia. Os resultados estão expressos como

percentual da incorporação total e são representativos de três experimentos com

resultados similares. C, controle; FS, fração solúvel a detergente; FI, fração

insolúvel a detergente.

AFT-024 FDC-P1

C FS FI C FS FI

GD1b Nd Nd Nd 9,3 21,0 13,5

GD1a 24,3 66,1 48,7 26,5 43,1 43,1

GD3 Nd Nd Nd 4,5 4,0 4,6

GM1 7,1 8,1 9,4 25,7 29,0 35,9

GM2 3,4 3,2 3,1 3,5 1,3 0,4

GM3 32,4 22,7 38,8 3,2 1,5 2,4

CTetH 8,8 Nd Nd Nd Nd Nd

PC 8,2 Nd Nd 7,5 Nd Nd

CDH 3,3 Nd Nd 2,5 Nd Nd

CMH 12,4 Nd Nd 17,2 Nd Nd

GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b: gangliosídeos; CTetH: ceramida

tetrahexose; CDH: ceramida dihexose; CMH, ceramida monohexose;

PC: fosfatidilcolina; Nd: não detectado.

Figura 1 Imagens representativas de esfingolipídios marcados com ceramida

fluorescente em células AFT-024. As células AFT-024 foram incubadas com C

-NBD-

ceramida 5 µM for 15 min. Em seguida, as culturas foram lavadas com solução salina e

incubadas por 2 horas em meio fresco. A, fluorescência observada após 15 minutos de

incubação com C

-NBD-ceramida. B, fluorescência observada após 2 horas de incubação das

células estromais em meio fresco. Secções confocais simples de 0,6 µm tomadas

paralelamente às preparações. As pontas de setas indicam região perinuclear, enquanto a seta

indica região de membrana plasmática. Barras: 10 µm.

Figura 2 Imagens representativas da transferência de esfingolipídios das células AFT-

024 para as células FDC-P1 em sistemas de cocultivo. As células AFT-024 foram

incubadas com C

-NBD-ceramida 5 µM por 12 h. O meio de cultura foi retirado, os estromas

foram lavados, as células FDC-P1 previamente lavadas foram inoculadas e cultivadas por 6 h.

Após fixação, as células foram immunomarcadas para GM3 com anticorpo monoclonal DH2.

A e D, esfingolipídios de coculturas examinadas pela fluorescência intrínseca da C

-NBD-

ceramida incorporada pelas células AFT-024. B e E, cocultura immunomarcada para GM3

com anticorpo monoclonal DH2. C e F correspondem às imagens sobrepostas de A e B, C e

D, respectivamente. Secções confocais simples de 0,6 µm tomadas paralelamente às

preparações. Inset: representa a região de contato entre as células AFT-024 e FDC-P1.

Barras: 10 µm.

Figura 3 Solubilidade de glicoesfingolipídios das linhagens AFT-024 e FDCP-1 a Triton

X-100. As culturas foram marcadas com [

C]-galactose 0,5 µCi/ mL e tratadas ou não com

Triton X-100. Os lipídios foram extraídos, purificados, separados por HPTLC e visualizados

por fluorografia. C, controle; FS, fração solúvel a detergente, ou sobrenadante; FI, fração

insolúvel a detergente, ou pellet. GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b: gangliosídios;

CTetH: ceramida tetrahexose; CDH: ceramida dihexose; CMH, ceramida monohexose; PC:

fosfatidilcolina.

Figura 4 Distribuição de gangliosídios (A) e imunodetecção de β integrina (B) nas

frações obtidas do gradiente de sacarose contínuo (5 - 35%) após lise das células AFT-

024 com Triton X-100 a 4°C. As células foram lisadas a 4 °C por 1 h contendo Triton X-100

1%, os lisados foram adicionados sobre gradiente de sacarose contínuo (5 – 35 %) em tampão

TNE e centrifugados por 10 h, 150 000 x g a 4 °C. Os lipídios de cada uma das 12 frações

coletadas foram extraídos, purificados e analisados por HPTLC, enquanto as proteínas foram

precipitadas, solubilizadas e submetidas à Western blotting.

CAPÍTULO 3

Relationship between gangliosides and myelosupportive capacity of stromal cells

(Manuscrito)

Será submetido ao periódico Journal of Cellular Biochemistry

Relationship between gangliosides and myelosupportive capacity

of stromal cells.

Ana L. Ziulkoski

1,2

, Cláudia M.B. Andrade

, Elisa Sisti

1,2

, Aline X.S. dos Santos

, Vera M.T.

Trindade

, Fátima C.R. Guma

, Radovan Borojevic

1, Laboratório de Bioquímica e Biologia Celular de Lipídios, Departamento de Bioquímica,

Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto

Alegre, Brasil.

2, Instituto de Ciências da Saúde, Centro Universitário Feevale, Novo Hamburgo, Rio Grande

do Sul, Brasil.

3, Departamento de Histologia e Embriologia e Programa Avançado de Biologia Celular

Aplicada à Medicina, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal

do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil.

Correspondence to: Radovan Borojevic, Caixa Postal 68021, Cidade Universitária, 1941-

970 Rio de Janeiro, Brazil. Tel. 55 21 2590 8736; Fax 55 21 2562 6483; E-Mail:

[email protected]

Running head: Gangliosides and myelopoiesis support

This manuscript contains two tables and three figures.

ABSTRACT

Stroma-mediated myelopoiesis depends upon growth-factors and an appropriate

intercellular microenvironment, whose polarity is relevant for granulocyte-macrophage

colony stimulating factor mediated myeloid cell proliferation. In previous studies we have

shown that gangliosides produced by fetal liver-derived stromal cells and liver inflammatory

granuloma-derived stromal cells were required for the optimal stroma myelosupportive

function. Here, we analyzed the pattern cell production and shedding of gangliosides in a

bone marrow stroma, a murine hepatic stellate cell line derived from inflammatory fibro-

granulomatous reactions that sustain myelopoiesis and primary skin fibroblasts, and compared

the ability of these stromata to sustain the survival and proliferation of the myelopoietic

progenitor cells. The concentration of sialic acid reflects the myelosupportive capacity of the

studied cell stromas. Although the three stromal cells synthesize the same gangliosides their

relative content were quite different and GM3 being apparently the major ganglioside species

involved for optimal activity of the growth factors. The shedding was similar to the

ganglioside synthesis pattern, but the net myelosupportive activity was quite different. FDC-

P1 proliferation decreased in stroma cells supernatants obtained from cultures in which

ganglioside synthesis was inhibited, as well as in presence of supernatants in which GM3 was

neutralized by the anti-GM3 monoclonal antibody. Then, the differences in the capacity of

sustain myeloid cell proliferation by presented or soluble growth factor could be related to

differences in the concentration of gangliosides present in membrane or shed to supernatants.

INTRODUCTION

Hematopoiesis occurs in liver and spleen during the fetal life and within bone marrow

in the adults [Muller et al., 1994; Zon, 1995]. The tightly regulated proliferation, commitment,

terminal differentiation and release of hematopoietic precursors occurs normally within the

bone marrow microenvironment composed of stroma cells, associated growth factors or

cytokines and extracellular matrix. Myeloid cells can further proliferate in peripheral tissues,

usually associated with inflammatory reactions, in which local expansion of myeloid cells

may contribute to reaction to injury, repair and regeneration. This proliferation has to be

tightly controlled in order to avoid adverse effects of chronic inflammation. It is dependent

upon locally produced cytokines, or factors brought into the tissue by biological fluids.

Carvalho and col. [Carvalho et al., 2000] proposed that the activity of these hemopoietins is

dependent upon the quality of the tissue stroma, and in particular of the pericellular

glycoconjugates.

Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) is one of the major

hemopoietins involved in the control of proliferation and differentiation of myeloid lineages

both in bone marrow and in extramedullary sites [Griffin et al., 1994]. Its biological activity

has been shown to depend upon the molecular composition and the physicochemical

conditions of the microenvironment provided by the supporting stroma. This

microenvironment has acid properties, and contains glycoconjugates containing sialic acid

and proteoglycans, including heparan-sulfate [Alvarez-Silva and Borojevic, 19996; Borojevic

et al., 2003]. In vitro studies demonstrated that GM-CSF and heparin interacted only at low

pH, with optimal levels observed between pH 4 and 5. This decrease in pH induces a

conformational change in GM-CSF, which would then become able to interact with

glycosaminoglycans [Wettreich et al., 1999].

Therefore, negatively charged glycolipids present on the plasma membrane of

haematopoietic or/and stromal cells may be required for functional signaling of GM-CSF.

Gangliosides, sialic acid-containing glycosphigolipids, have been associated with cell

growth and differentiation in the hematopoietic system. Leukemic cells and normal

hematopoietic stem cells are influenced by gangliosides [Nakamura et al. 1991, 1992; Kaucic

et al, 1994; Barthi and Singh 2000, 2001], while gangliosides shed by neuroblastoma inhibit

haematopoiesis [Sietsma et al., 1998]. Moreover, adhesion, spreading, and motility of cells

based on glycolipid-glycolipid interaction [Kojima and Hakomori, 1991] and interactions of

gangliosides with integrin α5β1 receptor [Zheng et al, 1993; Wang et al., 2001], EGF receptor

[Zhou et al., 1994; Wang et al., 2003], FGF receptor [Rusnati et al., 2002] and insulin receptor

[Tagami et al., 2002; Yamashita et al., 2003] have been described. The ability of ganglioside

GM3 to activate Src phosphorylation and MAPK was described for Neuro2a cells [Prinetti et

al., 1999] and for fibroblast cells [Li et al., 2001], leading to neuritogenesis and to enhanced

cell proliferation, respectively.

In a previous study we have shown that GM3 was the major ganglioside produced by

fetal liver-derived stromal cells and was required for the optimal stroma myelosupportive

function. This ganglioside was released into the supernatant and selectively incorporated into

the myeloid progenitor cells, where it segregated into rafts in which it co-localized with the

GM-CSF receptor α chain [Ziulkoski et al., 2006].

Moreover, two liver inflammatory

granuloma-derived stromal cells (GRWT and GR-IFNγ-R

) with a distinct quantitative

pattern of gangliosides showed a different myelopoiesis supportive capacity, and the

inhibition of ganglioside synthesis decreased the myelopoietic proliferation in both stromal

cells. The stroma with higher myelopoietic capacity synthesized more GM3 than GD1a, while

the stroma with lower capacity synthesized more GD1a than GM3 [Andrade et al., 2006]. The

purpose of the present study was to further evaluate the role of gangliosides in myelopoiesis,

monitoring the pattern cell production and shedding of gangliosides in a bone marrow stroma

(S17 cell line), a murine hepatic stellate cell line derived from inflammatory fibro-

granulomatous reactions that sustain myelopoiesis (GRX cell line) and primary skin

fibroblasts. We compared the ability of these stromata to sustain the survival and

proliferation of the myelopoietic progenitor cell line FDC-P1.

MATERIALS AND METHODS

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), RPMI 1640 medium, and lipid

standards were purchased from Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA. Fetal bovine serum

(FBS) was obtained from Cultilab, Campinas, SP, Brazil. D-[U-

C] galactose (300

mCi/mmol) was obtained from Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK. Plastic tissue

culture dishes were purchased from Nunc, Roskilde, Denmark. DL-threo-1-phenyl-2-

decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (PDMP), the glucosyl ceramide syntase inhibitor,

from Calbiochem

San Diego, CA, USA. Silica-gel high performance thin layer

chromatography (HPTLC) plates were from Merck, Darmstadt, Germany. DH2 monoclonal

antibody anti-GM3 was generously supplied by Sen-itiroh Hakomori, University of

Washington, Seattle, USA.

Cells and cell cultures

Permanent cell lines were obtained from the Rio de Janeiro Cell Bank (PABCAM,

Federal University, Rio de Janeiro, RJ, Brazil). The murine hematopoietic bone marrow

stroma cell line S17 sustains both murine and human hematopoietic cells in vitro [Sczikowski

et al., 1992]. The S17 cells were maintained in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS. The

GRX and WeHi-3B cells were maintained in DMEM supplemented with 5% and 10% FBS,

respectively. The FDC-P1 cell line was maintained in RPMI 1640 medium containing 10%

FBS and 10% supernatant of WeHi-3B cells that secrete IL-3 and GM-CSF constitutively.

The cultures were maintained under a humidified 5% CO

atmosphere at 37°C. Primary

cultures of skin fibroblasts that do not sustain myelopoiesis [Carvalho et al., 2000] were

obtained from newborn C3H/HeN mice. Mice were killed, their skin harvested and digested

by collagenase (1 mg/ mL in DMEM) for 1 h, at 37°C, under stirring. This treatment was

followed by trypsin (0.125% in calcium- and magnesium- free balanced salt solution (CMF

BSS)) supplemented with 0.05% EDTA, for 30 min at 37°C. The cells were seeded into 25

tissue culture flask in RPMI 1640 10% FBS and subcultured by trypsinization that

eliminated the trypsin-resistant macrophages. The obtained skin fibroblasts, referred to as

“SF-C3H”, were maintained in culture as described for S17 cells. After the third passage, the

cultures were discarded. For a typical coculture experiment, FDC-P1 cells were washed with

CMF-BSS in order to remove IL-3. They were inoculated on to the semi-confluent

monolayers of S17 or SF cells in 24-well plates (1 x 10

cells per well), and maintained in

culture for 24 or 48 h. Cell proliferation was monitored under a phase-contrast-equipped

inverted microscope.

Thiobarbituric acid assay for sialic acid

Cells were washed three times with cold phosphate buffered saline (PBS), harvested

from the plate with rubber policeman and pelleted by brief centrifugation. Lipids were

extracted from cell pellets with chloroform / methanol (2:1, v/v) [Andrade et al., 2006], dried

under N

atmosphere and hydrolyzed in 0.05 M H

at 80°C for 60 min. Then, the samples

were oxidized by addition of 25 µM periodic acid/ 62.5 mM H

at 37°C for 30 min.

Oxidation was interrupted by addition of 2% sodium arsenite/ 0.5 M HCl (w/v). This was

followed by the addition 6% thiobarbituric acid (w/v), adjusted to pH 9.0 with NaOH, to give

a final concentration of at least 1%. The chromophore was developed by heating the reaction

mixture in a boiling-water bath for 7.5 min. The color was intensified by the addition of an

equal volume of dimethyl sulfoxide [Skoza and Nohos, 1976]. The test mixture was read at

the absorption maximum for sialic acid (549 nm). The same test was performed with lipid

extract without hydrolysis. The sialic acid amount was determined by the difference

between the absorbance obtained for hydrolyzed and not hydrolyzed samples.

Metabolic labeling and lipid extraction

Cultures of stromal cells that reached confluence and cultures of FDC-P1 cells were

incubated with 0.5 µCi/mL [

C]galactose for 12 h. Subsequently, cells were washed three

times with cold PBS, harvested from the plate and pelleted by brief centrifugation. Lipids

were extracted from radiolabeled cell pellets with chloroform / methanol (2:1, v/v) [Andrade

et al, 2006], and glycosphingolipids were purified by Sep-Pack C18 column [Williams and

McCluer, 1980]. The inhibition of PDMP was determined after incubation of stromal cells for

72 h with 10 µM PDMP and incubation with 0.5 µCi/ mL [

C]galactose for the last 12 h of

incubation [Zurita et al., 2001].

Chromatography and analysis of the gangliosides

The purified lipid extract was evaporated under N

and run on HPTLC silica gel 60

plates with two successive solvent systems: first chloroform/ methanol (4:1, v/v) and second

chloroform/ methanol/ 0.25% aqueous CaCl

(60:36:8, v/v). The last migration was developed

in a tank described by Nores and col. [1994]. Radioactive sphingolipids were visualized by

exposition of a radio-film at -70°C and their relative contribution was determined by

densitometric scanning of the X-ray film in a CS 930 Shimadzu UV/ vis densitometer. The

standards were visualized by exposure to resorcinol-HCl [Svennerholm, 1963].

Shedding of gangliosides

The S17 cells and SF-C3H cells were metabolically labeled with 0.5 µCi/ mL

[

C]galactose for 12 h, the cells were washed and cultured in fresh medium for 48 h.

Subsequently, the culture supernatant was collected, dialyzed against distilled water,

lyophilized and the total lipids were extracted from lyophilized powder with chloroform/

methanol (1:1, v/v). The cells were harvested and lipids extracted with chloroform/ methanol

(2:1, v/v). The gangliosides present in the cells and in the supernatant were purified and

analyzed as previously described [Sietsma et al., 1998].

Determination of FDC-P1 proliferation rate

FDC-P1 cells were inoculated onto 24 culture plates, at 1 x 10

cells per well and

maintained in four different medium preparations: (a) RPMI supplemented with 10% FBS and

50% medium conditioned by S17 or GRX cells; (b) RPMI supplemented with 10% FBS and

50% medium conditioned by S17 or GRX cells pre-treated with 10 µM PDMP; (c) RPMI

supplemented with 10% FBS and 50% of medium conditioned by S17 or GRX cells with

addition of 10% DH2 hybridoma supernatant (producing monoclonal antibody anti-G

); (d)

RPMI supplemented with 10% FBS, 50% of medium conditioned by S17 cells and 2 µg/ mL

of murine recombinant GM-CSF. After 24 h, the viable cells were counted in a

hemocytometer. RPMI supplemented only with 10% FBS was the negative control. RPMI

supplemented with 10% FBS and 10% WeHi-3B cell-conditioned medium or with 2 µg/ mL

of murine recombinant GM-CSF were the positive controls. In order to monitor the potential

non specific effect of DH2 over FDC-P1 proliferation, cells were maintained in RPMI

supplemented with 10% FBS and 20% of DH2. No effect of DH2 antibody was found (data

not shown).

Protein quantification

The protein sediments obtained after lipid extractions were dissolved in 1.0 N NaOH

and measured as described by Peterson [1977] using bovine serum albumin as standard.

Statistical analysis

Differences among the experimental groups were analyzed by one-way analysis of variance

and means were compared by the Duncan test.

RESULTS

Stroma-induced myelopoiesis was monitored using the FDC-P1 myeloid progenitor

cell line, which is dependent upon GM-CSF or IL-3. In accordance with previous results on

co-cultures of stroma and FDC-P1 cells [Carvalho et al., 2000; Borojevic et al., 2003] the

bone marrow stroma-derived S17 cells

induced a rapid and intense proliferation of FDC-P1

cells, while SF cells could sustain neither the proliferation nor the survival of the

myelopoietic progenitors cells (Figure 1). Co-cultures of GRX and myeloid cells showed that

GRX cells were able to sustain the survival and a low proliferation of FDC-P1 cells for 24

hours (Figure 1).

In view of the described role of negatively-charged sialic-acid-containing molecules at

the membrane interface between the supporting stroma and the hematopoietic cells [Borojevic

et al., 2003], we questioned whether there are differences in the total sialic (N-

acetylneuramin) acid amount in the three studied stroma cells. The results indicated a high

concentration of sialic acid in the bone marrow stroma S17 cells, and smaller amounts in the

GRX cells, and a very low level in skin fibroblasts, corresponding to the myelosupportive

capacity of the studied cell stromata (Table 1).

We had previously demonstrated that the presence of gangliosides on myeloid FDC-

P1 cells was required both for their survival and proliferation in response to growth factors,

and that their ganglioside pool could be provided, at least in part, by the myelosupportive

stroma [Ziulkoski et al., 2006; Andrade et al., 2006]. Therefore, we analyzed the ganglioside

synthesis and shedding from S17, SF and GRX cells (Figure 2). The studied stromata

presented gangliosides of the series a (GM3, GM2, GM1 and GD1a), similar to the previously

studied AFT-024 and GR cells [Andrade et al., 2006; Ziulkoski et al., 2006]. All the

major gangliosides run as doublets, in agreement with the fact of sphingolipids have

differences in ceramide structures [Ziulkoski et al., 2001, Andrade et al., 2003]. S17 cells

accumulated essentially GM3, to a lower extent a neutral ceramide trihexoside, and a minor

amount of GD1a. The SF cells synthesized GM3 and GD1a in similar quantities, while GRX

cells synthesized more GD1a than GM3 (Figure 2A, Table 2). These results are similar to

those obtained for AFT-024 [Ziulkoski et al., 2006], GRWT and GR-IFNγ-R

cells [Andrade

et al., 2006] (Table 3), suggesting that myelosupportive stromata accumulated the ganglioside

GM3. Interestingly, the amount of GD1a increased with the reduction of the myelosupportive

capacity.

The GM3 ganglioside can be transferred from fetal liver-derived stroma to FDC-P1

cells, on which it co-localizes with the GM-CSF receptor α-chain at the contact region

[Ziulkoski et al., 2006]. Therefore, we monitored the shedding of radiolabeled gangliosides

from S17, SF and GRX cells. The shedding was similar to the ganglioside synthesis pattern.

The only ganglioside shed by S17 was the GM3. SF cells shed GM3, GD1a and GM1 in a

lower extent, while GRX conditioned medium contained GD1a, GM1, GM3 and a low

amount of GM2 gangliosides (Figure 2B and Table 2).

Taken in consideration the fact that the ganglioside GM3 was present in the

conditioned medium of cells that sustained or not the myelopoiesis by contact, as well as the

previous reports that the FDC-P1 cell proliferation may be sustained by conditioned medium

of stroma cells [Borojevic et al., 2003, Ziulkoski et al., 2006], we questioned whether the

capacity of stroma supernatants to support myelopoiesis reflected the presence of

gangliosides, and in particular of the ganglioside GM3, when withdrawn from the intercellular

microenvironment. The FDC-P1 proliferation was monitored in the standard medium

conditioned by S17, SF or GRX cells, as well as in conditioned medium obtained from cells

treated with PDMP that inhibited synthesis of all the ganglioside, and in conditioned medium

with addition of neutralizing monoclonal antibody anti-GM3. We found that S17-

conditioned medium had a very low capacity to sustain the FDC-P1 cell survival and/ or

proliferation (Figure 3A) in accordance with previous results [Borojevic et al., 2003].

Nevertheless, the survival of FDC-P1 cells was even minor in S17-conditioned medium in

which the GM3 was depleted (Figure 3A). Notably, the supplementation of S17 supernatant

with GM-CSF restored its myelosupportive capacity (Figure 3B), suggesting that S17 cells

released soluble GM-CSF in a very low and limiting quantity. This activity could be

dependent upon GM3.

On the other hand, the GRX-conditioned medium was able to sustain both survival and

proliferation of FDC-P1 cells, having thus a stronger myelosupportive capacity than the S17-

condition medium, despite the lower capacity of the former cell line to sustain myelopoiesis

in co-culture. This result is similar to the one described for SF cells, which are unable to

maintain myelopoiesis in co-cultures through a cell-cell contact with target cells, but whose

supernatant sustained the FDC-P1 proliferation [Carvalho et al., 2000]. Moreover, the

inhibition of the total ganglioside synthesis in GRX and SF cells, as well as neutralization of

GM3 by monoclonal antibody in the conditioned medium, decreased both the FDC-P1

proliferation and survival (Figure 3A).

DISCUSSION

In agreement with previously reported observations, the present study indicated that

gangliosides are required for optimal activity of the growth factors that sustain survival and

proliferation of myeloid cells in coculture with stroma, the GM3 being apparently the major

ganglioside species involved. However, the comparative study of cell-cell versus cell

supernatant-dependent myelosupportive activity disclosed an apparent paradox. Supernatants

of the stromata that sustained well myelopoiesis had only a low stimulatory activity, while

those from stromata that do not sustain myelopoiesis in co-culture sustained it in

suspension. Hence, GM-CSF and GM3 are required and sufficient to promote the signal

reception and transduction on FDC-P1 cells. This corroborates our finding that stroma

supplies to FDC-P1 cells both the growth factor and the GM3 that is not accumulated in FDC-

P1 cells (Ziulkoski et al, 2006), and when both are present in appropriate quantities, the

myelosupportive activity is high. Conversely, in cell-cell interactions other components of the

myelosupportive stroma activity contribute to the controls. High quantities of GM3 apparently

generate optimal conditions for sequestering GM-CSF on the cell membranes, putatively on

heparan sulfate proteoglycans as indicated by our previous studies [Alvarez-Silva and

Borojevic, 1996; Borojevic et al, 2003]. GM3 can be shed, but heparan sulfate-bound GM-

CSF can be only released by high-salt solutions [Carvalho et al. 2000]. Hence, the supernatant

of S17 cells contains sufficient GM3 but suboptimal quantity of GM-CSF, having a poor

myelosupportive capacity that can be enhanced by supplementation with GM-CSF. The other

stromas, which have not a primary myelosupportive function such as the bone marrow stroma,

have apparently suboptimal interaction among gangliosides and GM-CSF-binding molecules.

In these cells, the growth factor and the gangliosides can be spontaneously released into the

supernatant.

The profile of gangliosides released into the supernatant corresponded to that of the

synthesized ones in the stroma, with only a few exceptions (such as GD1a in S17 cells).

Hence, besides the quantity of the involved compounds, the spatial organization of

gangliosides in the cell membranes and/or their association with other membrane components

may be required in high cell-cell myelosupportive activity of S17 cells. Conversely, in case of

SF, and to lower degree in GRX stromata, the membrane context of molecular complexes

required for myelosupportive activity is not optimal or it is even inhibitory. Their shedding

into the supernatant releases them from the molecular context of cell membranes, and under a

soluble form they display their intrinsic capacity to sustain survival and/or proliferation of

FDC-P1 myeloid progenitors. It should be noted that even in this context, the presence of

gangliosides, the major one being apparently the GM3, is still required, and their absence or

neutralization in the supernatant is adverse for optimal myelopoiesis. Table 3 summarizes the

differents results obtained to all stromal cells studied by our group. In mirror experiments to

those of the S17 supernatant supplementation with GM-CSF reported in the present study, the

conditioned medium of GR IFNγ-R

treated with PDMP and supplemented with GM3

recovered the ability to sustain the FDC-P1 proliferation. Similar results were obtained when

the GRWT supernatant was supplemented with GM3 (Table 3).

The stroma-dependent growth stimulatory activity has been related to the non-covalent

binding of growth factors with cell membrane-associated molecules or with the adjacent

extracellular matrix components, suggesting that growth factors might be retained on the

stroma layer and presented to the target cells [Gallagher and Dexter, 1988]. Our previous

studies have indicated that the biological activity of GM-CSF heavily depended upon tissue

cofactors, including both heparan-sulfate proteoglycans and gangliosides [Alvarez-Silva and

Borojevic, 1996; Carvalho et al., 2000; Andrade et al., 2006; Ziulkoski et al, 2006]. These

results showed the capping of proteoglycans and gangliosides to interface between

haemopoietic and stromal cells, suggesting that GM-CSF receptors are sequestered in lipid

rafts and modulated by macromolecular complexes, placing the growth factor message in the

appropriate required context [Metcalf, 1993]. The local concentration of gangliosides in the

intercellular space within the myelopoietic microenvironment is difficult to estimate, but we

found that cells with a higher content of sialic acid in lipids showed higher myelosupportive

ability. The increased amount of sialic acid could be related to local decreased of pH

necessary to interaction of heparan-sulfate and GM-CSF [Wettreich et al., 1999].

The quality of gangliosides can be determinant for the inclusion of receptors into

glycolipid-enriched membrane regions (GEM) like rafts, which control the activation, the

turnover and the subcellular localization of the signaling compounds [Miljan and Bremer,

2002]. GM3-enriched rafts have been related with FAK, Src kinases and Rho GTPases

[Yamamura et al., 1997; Iwabuchi et al., 1998; Chigorno et al., 2000] and this ganglioside has

been related with enhanced c-Src phosphorylation and MAPK activation induced by EGF

[Prinetti et al., 1999; Li et al., 2001]. The accumulation of GM3 at the cellular monolayer,

such as S17 cells, could represent its presence in rafts. Skin fibroblasts have a relatively high

amount of GM3, but either the GM3 is not segregated in rafts, or it is associated with

molecules that reduce its capacity to interact with the myelopoietic signaling. On the other

hand, the ganglioside GD1a has been also involved with EGF signaling, increasing the

effective number of EGFRs and stimulating EGFR dimerization [Liu et al., 2004]. Curiously,

the amount of GD1a in cells that do not sustain the myeloid cells is higher than in S17 cells

and the conditioned medium showed the same result. The role of GD1a in the

myelosupportive capacity needs future studies.

Differences in the effects of gangliosides may be dependent upon its concentration

and/or location. Gangliosides added to the culture medium can insert into the cell plasma

membrane and modify the biological responses of cells to various growth factors [Li et al.,

2000]. High concentration of gangliosides inhibited cell growth when continuously present in

culture medium during incubation of cells with growth factors but low concentrations caused

an increase in phosphorylation of transducers and enzymes such as MAPK [Li et al., 2001].

Moreover, it has been suggested that the exogenous ganglioside effect depends on the state of

cell confluence in culture, and that gangliosides have a bimodal effect on DNA synthesis

[Saqr et al., 1995]. Conversely, clustered glycosphingolipids themselves may also initiate

signal transduction through the interaction of aliphatic chains of the transducer molecules

with the lipid portion of glycosphingolipids in the microdomains [Iwabuchi et al., 1998]. The

differences in the capacity of sustain myeloid cell proliferation by presented or soluble growth

factor could be related to differences in the concentration of gangliosides present in rafts or

shed to supernatant and their uptake by myeloid cells. Further studies are needed to determine

whether gangliosides are transferred to myeloid cells from the studied stromal cells like

to fetal liver derived stroma and how gangliosides interact with the growth factor receptor.

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Table 1. Sialic acid determination in lipids of the S17, SF and GRX cells.

Sialic acid

(nmol/ mg protein)

S17 cell line

10.0 ± 0.23

SF cells

0.95 ± 0.16

GRX cell line

5.2 ± 1.82

Lipids were extracted with chloroform/ methanol and the

sialic acid was determined by thiobarbituric acid assay. The

protein correspondent to lipid extract was quantified by

Lowry method modified by Peterson. Results represent mean

± SEM of tree experiments done in duplicate.

Table 2. Densitometric analysis of lipids synthesized and shed from S17, SF and

GRX cells.

% of total incorporation

S17 cells SF cells GRX cells

cells shedding cells shedding cells shedding

GD1a 5.3 Nd 40.7 33.1 27.8 25.8

GM1 1.3 Nd 6.7 10.2 14.0 18.9

GM2 1.4 Nd Nd Nd 13.1 2.3

GM3 64.3 80.0 52.6 35.9 10.9 13.1

PC 1.3 Nd Nd 12.9 23.7 33.6

CTH 24.5 13.2 Nd 3.1 5.7 Nd

CDH 0.7 6.9 Nd 4.7 1.4 Nd

CMH 1.1 Nd Nd Nd 3.3 6.3

Cell cultures were incubated 12 h with 0.5 µCi/ mL [

C]-galactose and the lipids were shed

to medium for 48 h. Lipids were extracted, purified, analyzed by HPTLC and visualized by

fluorography. Results are expressed as % of total radioactivity incorporated. GD1a, GM1,

GM2, GD3 and GM3: gangliosides; CTH: ceramide trihexoside; CDH: ceramide dihexoside;

CMH: ceramide monohexoside; PC: phosphatidylcholine; Nd: non detected.

Table 3. FDC-P1 proliferation in presence of cytokines, stromas conditioned

mediums and gangliosides.

Medium suplementation Effect Reference

IL3* or GM-CSF

↑P

Carvalho et al., 2000

GM3

↓S

Andrade et al., 2006

GM-CSF + GM3

↑↑P

Andrade et al., 2006

IL3 + PDMP*

↑P

Ziulkoski et al., 2006

IL3 + DH2*

↑P

Ziulkoski et al., 2006

CM of stromas

AFT-024

↑P

Ziulkoski et al., 2006

S17

↓S

Present work

GR-IFNγ-R

↑P

Andrade et al., 2006

GRWT S Andrade et al., 2006

GRX S Present work

SF S Carvalho et al., 2000

CM of stromas treated with PDMP

AFT-024

↓S

Ziulkoski et al., 2006

GRWT and GR-IFNγ-R

↓S

Andrade et al., 2006

S17, GRX and SF

↓S

Present work

CM of stromas with 10% DH2 antibody

AFT-024

↓S

Ziulkoski et al., 2006

GRWT and GR-IFNγ-R

↓S

Andrade et al., 2006

S17, GRX and SF

↓S

Present work

CM of GR-IFNγ-R

stroma treated with PDMP

and supplemented with GM3

↑P

Andrade et al., 2006

CM of GRWT stroma supplemented with GM3

↑S

Andrade et al., 2006

CM of S17 stroma supplemented with GM-CSF

↑S

Present work

Proliferation of FDC-P1 cells in basal culture medium plus cytokines or gangliossides.

(*) medium conditioned by WeHi cells that contained IL3, with the addition of 10 µM

PDMP, a glycosiltransferase inhibitor, or 10% of DH2 monoclonal antibody anti-GM3.

↑P, proliferation induction; S, maintain the survival; ↓S, survival reduction or cell death.

FIGURE LEGENDS

Figure 1 FDC-P1 cell survival and proliferation in coculture with different stroma cells.

FDC-P1 cells previously washed with CMF BSS were inoculated on to the semi-confluent

monolayers of S17, SF or GRX cells at 1 x 10

cells per well (above) and maintained by 24 h

(below). Phase contrast microscopy, scale bars: 20 µm.

Figure 2 Ganglioside synthesis and shedding by S17, SF and GRX cells. (A) synthesis of

glycosphingolipids in S17, SF and GRX cells. Cell cultures were incubated 12 h with 0,5 µCi/

mL [

C]-galactose. (B) glycosphingolipids shed by S17, SF and GRX cells. Cell cultures

were incubated 12 h with [

C]-galactose and the lipids were shed to medium for 48 h. Lipids

were extracted, purified, analyzed by HPTLC and visualized by fluorography. The radioactive

bands correspond to lipids indicated. GD1a, GD3, GM1, GM2, GM3: gangliosides; CTH,

ceramide trihexoside; CDH, ceramide dihexoside; CMH, ceramide monohexoside; PC,

phosphatidylcoline.

Figure 3 Inhibition of proliferation of FDC-P1 cells in conditioned medium of S17 and

GRX cells. (A) FDC-P1 cell proliferation in the presence of the supernatant of S17, GRX or

SF cells (white bars), of the supernatant of S17, GRX or SF cells treated with 10 µM PDMP

(gray bars) and supernatant of S17, GRX or SF cells in the presence of DH2 (a monoclonal

antibody to GM3) (black bars). FDC-P1 cells cultivated in medium with supernatant of WeHi

cells were the positive control. (B) FDC-P1 cell proliferation in the presence of supernatant of

S17 or in the presence of this supernatant supplemented with 2 µg/mL GM-CSF. The positive

control was RPMI 1640 with 2 µg/mL GM-CSF. Data are from two separated experiments,

each done in triplicate. Values are mean ± SEM. (a), (b) and (c), significant difference to P <

0.05.

FIGURE 1

FIGURE 2

100

150

200

250

300

350

400

C+

MCSF

S17+GMCSF

% of inoculated cells

FIGURE 3

100

120

140

S17 GRX SF

% of inoculated cells

CAPÍTULO 4

Investigação imunocitoquímica do gangliosídio GM1 no estroma de medula óssea S17,

em fibroblastos de pele e em coculturas de células estromais AFT-024 com células

precursoras mielopoiéticas FDC-P1

(Dados preliminares)

INTRODUÇÃO

O sistema hematopoiético é altamente hierarquizado e todas as suas células derivam de

células-tronco, as quais devem estabelecer relações adesivas com o estroma medular, cujos

elementos compõem os microambientes específicos necessários para a progressão da cascata

hematopoiética (Heyworth et al., 1988). A regulação da proliferação, do comprometimento e

da diferenciação terminal das células precursoras hematopoiéticas ocorre normalmente no

microambiente da medula óssea. Durante o período fetal, este processo ocorre no fígado, baço

e região para-aórtica deslocando-se para os ossos longos e chatos durante o desenvolvimento

(Tavian et al., 1999). Em estados patológicos, nos quais o ambiente da medula óssea sofre

alterações, a hematopoiese pode ser deslocada para tecidos periféricos como o fígado e o baço

(Borojevic et al., 1993). A presença de células precursoras totipotentes e comprometidas em

tecidos periféricos indica a necessidade da regulação local da atividade dos fatores de

crescimento e citocinas envolvidos no controle da homeostasia da mielopoiese extramedular.

Supõe-se que a interação entre os fatores de crescimento produzidos pelo estroma e os

receptores correspondentes é controlada por complexos macromoleculares, que constituem

frações de membrana insolúveis em detergente e ricas em glicoesfingolipídios (GEMs), entre

eles os gangliosídios. Estudos anteriores demonstraram que a atividade biológica do GM-CSF

depende da sua associação com heparam sulfato, e essa interação molecular depende de

cargas polares negativas providenciadas por moléculas sialiladas presentes na membrana, cuja

distribuição espacial evoca a estrutura de rafts (Wettreich et al., 1999; Borojevic et al., 2003).

Também demonstramos que os gangliosídios contribuem para a determinação da capacidade

mielossuportiva de diferentes estromas (Ziulkoski et al., 2006; Andrade et al., 2006), sendo o

gangliosídio GM3 acumulado na maioria dos estromas. No entanto, os gangliosídios GM1 e

GD1a também são encontrados em várias das células estromais estudadas. Análises

imunocitoquímicas realizadas com células derivadas de estroma de fígado fetal murino

demonstraram a ocorrência de capping de GM3 e de GM1 para a região de contato entre

as células estromais e células precursoras mielóides (Ziulkoski et al., 2006)

Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (a) analisar a possível colocalização do

gangliosídio GM1 com moléculas envolvidas com a sinalização de GM-CSF ou com adesão

celular em células AFT-024; (b) determinar a distribuição subcelular deste gangliosídio na

linhagem celular mielossuportiva S17 (derivada de medula óssea murina) e em fibroblastos de

pele, os quais não sustentam a hematopoiese.

METODOLOGIA

Materiais

Os meios de cultivo celular DMEM e RPMI 1640, a colagenase, a tripsina, os padrões

lipídicos, a toxina colérica acoplada a fluoresceína, a subunidade B da toxina colérica e o

anticorpo anti-toxina colérica foram obtidos da Sigma-Aldrich; o soro fetal bovino (SFB) da

Cultilab; D-[U-

C]galactose (300 mCi/mmol) da Amersham Life Science; as garrafas e

placas plásticas para cultura da Nunc; o Fluorsave

da Calbiochem; o anticorpo policlonal

anti-GM-CSF-Rβ (rabbit) da Santa Cruz Biotechnology; e os anticorpos secundários anti-

mouse conjugado a CY3 e anti-rabbit acoplado a rodamina da Jackson Immuno Research. O

anticorpo anti-CD44 foi gentilmente cedido pela Drª Márcia Cury El-Cheikh, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil.

Cultura de células

A linhagem precursora mielopoiética FDCP-1, dependente de IL-3 ou GM-CSF, foi

mantida em meio RPMI 10% SFB, suplementado com 10% de meio condicionado de WeHi

como fonte exógena de IL-3, a 37°C e atmosfera de 5% de CO

. As linhagens celulares S17

(derivada de medula óssea murina), e AFT-024 (derivada de fíguda fetal murino) foram

cultivada em meio RPMI suplementado com 10% SFB e mantidas nas mesmas condições

citadas acima. Para obtenção de coculturas, células FDC-P1 foram lavadas com CMF-BSS

para remover IL-3 e GM-CSF e inoculadas (1 x 10

células por poço) sobre as camadas semi-

confluente de células S17 ou AFT-024 cultivadas em placas de 24 poços. Culturas primárias

de fibroblastos de pele, os quais não sustentam a hematopoiese (Carvalho et al., 2000) foram

obtidas a partir de camundongos neonatos C3H/HeN. Os animais foram sacrificados e sua

pele dissecada e digerida com colagenase (1 mg/ mL em DMEM) por 1 h, a 37°C, sob

agitação). Este tratamento foi seguido por digestão com tripsina (0,125% em CMF BSS)

suplementada com EDTA 0,05%, por 30 min a 37°C. As células obtidas foram semeadas em

garrafas de cultura de 25 cm

em RPMI 1640 suplementado com 10% SFB e subcultivadas

por tripsinização, a qual elimina macrófagos resistentes à tripsina. Os fibroblastos de pele

assim obtidos, referidos como SF, foram mantidos em cultura como descrito para as linhagens

celulares S17 e AFT-024.

Imunocitoquímica

Camadas semi-confluentes de células SF, S17 e coculturas (mantidas por 12 h)

cultivadas sobre lamínulas foram fixadas com paraformaldeído 4% por 30 min, lavadas com

PBS e incubadas em PBS contendo 3% de albumina de soro bovino por 1 h a 37°C para

bloquear sítios de ligação inespecíficos. Os procedimentos imunocitoquímicos foram

realizados como descrito por Crespo e colaboradores (2004). Como anticorpos primários

foram utilizados: anticorpo monoclonal anti-GM3 (clone DH2, mouse), anticorpo policlonal

anti-GM-CSFRβ (1:200, rabbit) e anticorpo monoclonal anti-CD44 (1:100, mouse). Os

anticorpos secundários utilizados foram: anticorpo monoclonal anti-mouse conjugado a CY3

(1:1000) e anticorpo monoclonal anti-rabbit conjugado a rodamina (1:500). Após lavagem

final com PBS, as preparações foram montadas com Fluorsave

. Imagens confocais foram

obtidas usando microscópio confocal Carl Zeiss LSM5 Pascal (Facultad de Ciencias

Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina) equipado com um laser de

argônio/hélio/neon e uma objetiva de imersão em óleo de 63 x (abertura de 1,4) (Zeiss Plan-

Apochromat). Para a imunodetecção de GM1 dois métodos foram utilizados: (a) células

fixadas foram incubadas com toxina colérica 4 µg/ mL (subunidade B, atóxica), seguida de

incubação com anticorpo monoclonal anti-toxina colérica (1;100, rabbit) e anticorpo

secundário anti-rabbit conjugado a rodamina (1:500); (b) células fixadas foram diretamente

incubadas com toxina colérica conjugada a fluoresceína (subunidade B, atóxica). Os demais

procedimentos imunocitoquímicos foram os mesmos descritos acima.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em estudo anterior demonstramos que o gangliosídio GM3 colocaliza-se

extensivamente com a cadeia α do receptor de GM-CSF, enquanto o gangliosídio GM1

apresenta apenas uma colocalização parcial, apesar de ambos apresentarem capping para a

região de contato entre as células AFT-024 e FDC-P1 (Ziulkoski et al., 2006). Trabalhos

recentes têm relatado que rafts enriquecidos em diferentes gangliosídios podem desempenhar

diferentes funções em um mesmo tipo celular (Gómez-Moutón et al., 2001; Chigorno et al.,

2000). Sendo assim, resolvemos analisar a possível colocalização de GM1 e GM3 em nosso

modelo de mielopoiese extramedular. Os resultados demonstraram a presença do gangliosídio

GM1 na membrana plasmática das células precursoras mielóides (Figura 1 A, D e G), em

conformidade com os resultados obtidos anteriormente (Ziulkoski et al., 2006). No entanto, a

sobreposição das imagens obtidas para GM1 e GM3 (Figura 1C) demonstrou pouca

colocalização entre estes dois gangliosídios, levando-nos a supor que esses gangliosídios

estejam em rafts diferentes e desempenhem papéis diferentes na interação entre células

estromais e células progenitoras mielóides.

Tendo em vista os indícios de uma função diferenciada para o gangliosídio GM1,

analisamos a possível colocalização deste gangliosídio com a cadeia β do receptor de GM-

CSF, a qual é compartilhada com os receptores para IL-3 e IL-5 (Hamilton, 2002). As

imagens obtidas nas coculturas também demonstram marcação típica de membrana

plasmática nas células FDC-P1 (Figura 1E), sendo possível visualizar o capping do receptor

para a região de contato com as células estromais. No entanto, a sobreposição das imagens

evidencia a ausência de colocalização significativa do gangliosídio GM1 com GM-CSF-Rβ

(Figura 1F), sugerindo que o GM1 não está envolvido com a transdução de sinal

desencadeada por esta subunidade.

Uma vez que o gangliosídio GM1 tem sido relacionado com moléculas de adesão como

o CD44 (Gómez-Moutón et al., 2001) e os resultados anteriores que demonstraram o capping

deste gangliosídio nas células estromais para a região de contato com as células precursoras

mielóides (Ziulkoski et al., 2006), resolvemos analisar a possível colocalização de GM1 e

CD44. Os resultados indicam a presença desta molécula de adesão na membrana das células

FDC-P1 (Figura 1H). No entanto, não observamos colocalização entre GM1 e CD44 (Figura

1I), indicando que o GM1 não está relacionado com a adesão celular mediada pelo CD44.

Todavia, são necessários novos estudos para determinar se este gangliosídio está envolvido ou

não com as interações adesivas existentes entre células estromais e células precursoras

mielóides.

Como os resultados obtidos na análise do perfil de gangliosídios por marcação

metabólica e HPTLC para fibroblastos de pele e para a linhagem S17 mostraram a presença

de GM1 (capítulo 3, Figura 2 e Tabela 2), ainda que em quantidades pequenas (6,7 e 1,3 %,

respectivamente), investigamos a distribuição subcelular deste gangliosídio nessas células

através de imunocitoquímica. Pode se observar uma marcação típica de membrana plasmática

em ambos os tipos celulares (Figura 2 A e B), ocorrendo capping de GM1 nas células

progenitoras mielóides quando estas são cocultivadas com as células estromais de medula

óssea S17 (Figura 2 C e D). Estes resultados contribuem para a hipótese de que o gangliosídio

GM1 participe do microambiente formado na região de contato entre as células mielóides e as

células estromais; entretanto, a elucidação de seu papel necessita de estudos adicionais.

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Figura 1 Imagens representativas da localização subcelular dos gangliosídios GM1 e

GM3, GMCSFRβ e CD44 em coculturas de células AFT-024 e FDC-P1. O GM1 foi

imunodetectado nas células AFT-024 com toxina colérica acoplada a fluoresceína, a detecção

do GM3 foi realizada com anticorpo monoclonal DH2, a da cadeia β do receptor de GM-CSF

com anticorpo policlonal anti-GMCSFRβ e a de CD44 com anticorpo monoclonal anti-CD44.

A, D e G, imunodetecção de GM1. B, imunodetecção de GM3. C, sobreposição das imagens

mostradas em A e B. E, imunodetecção da cadeia β do receptor de GM-CSF. F, sobreposição

das imagens mostradas em D e E. H, imunodetecção de CD44. I, sobreposição das imagens

mostradas em G e H. Secções confocais simples de 0,6 µm tomadas paralelamente às

preparações. Barras: 10 µm.

Figura 2 Imagens representativas da localização subcelular do gangliosídio GM1 em

fibroblastos de pele e na linhagem celular S17. As células foram imunodetectadas para

GM1 com toxina colérica e anticorpo monoclonal anti-toxina colérica. A, imunodetecção do

gangliosídio GM1 em fibroblastos de pele. B, imunodetecção do gangliosídio GM1 em

células S17. C e D, imunodetecção do gangliosídio GM1 em cocultura de células S17 e

células FDC-P1. Secções confocais simples xy de 0,6 µm foram tomadas paralelamente às

preparações nas figuras A e B. As imagens contidas em C e D correspondem a secções yz.

Barras: 10 µm.

PARTE III

DISCUSSÃO

O conjunto de resultados aqui apresentados demonstra que os gangliosídios

sintetizados e liberados pelas células estromais estão relacionados com a capacidade de

sustentação da proliferação e sobrevivência das células FDC-P1, utilizadas como sistema de

resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF. Todos os

estromas estudados sintetizam gangliosídios da série a e acumulam o gangliosídio GM3,

existindo uma tendência de maior quantidade deste gangliosídio nos estromas que apresentam

maior capacidade de sustentação mielopoiética nos sistemas de cocultivo. O único estroma

que não se enquadra nesta tendência são os fibroblastos de pele; porém, como a concentração

de ácido siálico nestas células foi a mais baixa, o acúmulo de GM3 pode não refletir a

quantidade absoluta real de GM3 e sim a velocidade de síntese dos gangliosídios neste tipo

celular. Interessantemente, a quantidade de GD1a é maior nos estromas que apresentam

menor capacidade mielossuportiva. Por outro lado, o perfil obtido para a linhagem de células

precursoras mielóides demonstra gangliosídios das séries a e b, mas com uma quantidade

relativa bastante pequena de GM3.

A transferência de GM3 das células de estroma de fígado fetal murino (linhagem AFT-

024) para as células precursoras mielóides foi evidenciada através de experimentos

imunocitoquímicos e com precursores radioativos e fluorescentes. Uma vez que este

gangliosídio sempre esteve presente nos meios condicionados de todos os estromas estudados,

é possível supor que este seja um fenômeno cooperativo comum entre os demais estromas e as

células precursoras mielóides. De fato, os ensaios de proliferação realizados com os

sobrenadantes obtidos dos estromas depletados em gangliosídios ou em que o GM3 foi

neutralizado pela adição de anticorpo monoclonal anti-GM3 apresentaram redução na

capacidade de sustentação da proliferação e sobrevivência das células FDC-P1. Além disso,

quando os sobrenadantes obtidos de estromas depletados em gangliosídios foram

suplementados com GM3 exógeno, verificou-se a recuperação da capacidade de sustentação

mielopoiética (Andrade et al., 2006). Os mesmos experimentos citados demonstraram que a

capacidade de sustentação das células FDC-P1 pelos meios condicionados dos diferentes

estromas pode diferir daquela obtida nos modelos de cocultivo, sugerindo diferenças no

ambiente de ligação ao receptor entre as formas solúvel e apresentada do fator de crescimento,

conforme previamente proposto por Borojevic e colaboradores (2003).

Os estudos imunocitoquímicos também revelaram o capping dos gangliosídios GM3,

GM1 e do receptor de GM-CSF para apenas um dos lados das células FDC-P1, resultado

condizente com a polarização e redistribuição de regiões de membrana especializadas que

ocorre durante o processo de diferenciação das células mielóides e seus progenitores (Giebel

et al., 2004). Essas imagens ainda evidenciam a colocalização da cadeia α do receptor de

GM-CSF com o gangliosídio GM3, sugerindo a participação deste gangliosídio no

microambiente necessário para que ocorra a ligação de GM-CSF ao seu receptor e/ ou na

sinalização celular mediada pelo mesmo. Já o gangliosídio GM1 apresenta apenas uma co-

distribuição parcial com a cadeia α de GM-CSF-R, e não foi detectada colocalização

significativa deste gangliosídio com a cadeia β deste receptor, com o próprio gangliosídio

GM3 ou com CD44. Esses dados indicam que os gangliosídios GM3 e GM1 estão localizados

em diferentes regiões da membrana plasmática ou em diferentes rafts, possivelmente

exercendo papéis diferentes na interação entre células estromais e células progenitoras

mielóides, como já proposto para células T polarizadas (Gómes-Mountón et al., 2001).

Finalmente, as análises dos glicoesfingolipídios das células AFT-024 e FDC-P1 após

tratamento dos lisados celulares com Triton X-100 demonstram a presença dos gangliosídio

GM3, GM1 e GD1a nas frações correspondentes a rafts. O fracionamento em gradiente

de sacarose confirma a presença de GM3 nas frações menos densas obtidas das células AFT-

024, demonstrando também a presença de GD1a em todas as frações coletadas. Esses

resultados sugerem a presença de rafts contendo tanto GM3 como GD1a nas células AFT-

024, ou de dois tipos de rafts diferentes: rafts enriquecidos em GM3 e rafts enriquecidos em

GD1a. Um desses gangliosídios pode estar interagindo com a β integrina detectada nas

frações mais densas e menos densa do gradiente, como previamente reportado em outros

estudos (Zheng et al., 1993, Kawakami et al., 2002).

Estudos anteriores de nosso grupo de pesquisa (Alvarez-Silva & Borojevic, 1993;

Carvalho et al., 2000; Borojevic et al., 2003) e os resultados relatados acima permitem propor

que a interação entre fatores de crescimento e os receptores correspondentes no sistema

hematopoiético é controlada por complexos macromoleculares, incluindo proteoglicanos

contendo heparam sulfato e gangliosídios. Esses conjuntos macromoleculares estariam

organizados na forma de rafts, os quais possuem a capacidade de migração no plano da

membrana celular (capping), gerando regiões com alta densidade de carga e de receptores

transmembranares na interface entre células do estroma e células hematopoiéticas. Sendo

assim, a organização espacial dos gangliosídios nas membranas celulares e/ ou sua associação

com outros componentes da membrana pode ser requerida para que um determinado estroma

estabeleça uma capacidade mielossuportiva elevada, como para a linhagem estromal derivada

de medula óssea S17 e, em menor grau, para o estroma derivado de fígado fetal murino AFT-

024. Por outro lado, o conjunto macromolecular formado na interface entre estroma e células

progenitoras mielóides pode não ser ideal ou até mesmo ser inibitório, fazendo com que a

sustentação mielopoiética, no contexto de uma sinalização justácrina, seja reduzida ou até

mesmo nula, como para a linhagem celular GRX e as culturas primárias de fibroblastos de

pele, respectivamente.

O extenso espectro de efeitos biológicos exercidos pelos gangliosídios pode ser

explicado pela interação direta destes com moléculas de sinalização ou por sua influência

sobre a formação de rafts (Simons et al., 1999). Ainda não se conhece exatamente como os

rafts participam da transdução de sinal, embora seja tema comum a teoria de que rafts

isolados agregam-se para conectar as proteínas residentes e promover a interação destas em

um complexo de sinalização. Três modelos são propostos: 1, subunidades dos receptores já

associadas com rafts no estado de equilíbrio seriam dimerizadas através da união ao ligante;

2, receptores isolados que possuem fraca afinidade por rafts sofreriam oligomerização após a

união ao ligante, o que levaria a um aumento do tempo de residência destes receptores em

rafts; 3, receptores ativados poderiam recrutar proteínas, as quais se ligariam a proteínas

residentes em outros rafts (crosslinking), resultando em um fenômeno de coalescência destes

microdomínios de membrana (Simons & Toomre, 2000). A formação de agregados de rafts

permite a organização espacial e temporal dos complexos de sinalização, facilitando as

interações entre proteínas adaptadoras, proteínas de ancoragem e scaffolds, levando à

amplificação do sinal através da concentração ou exclusão de moléculas sinalizadoras.

As diferenças encontradas na atividade mielopoiética dos diferentes estromas podem

estar relacionadas, entre outros fatores, com as diferenças no perfil e localização sub-celular

dos gangliosídios nestas células. Dessa forma, em nosso modelo experimental, os

gangliosídios poderiam estar contribuindo não só para a geração do ambiente ácido necessário

para a interação entre HSPGs e GM-CSF, como para a inclusão de receptores em GEMs ou

rafts, e para o controle da ativação, do turnover e da localização sub-celular dos componentes

envolvidos na sinalização celular mediada por fatores de crescimento (Miljan & Bremer

2002). Uma hipótese para tal é que o gangliosídio GM3, o qual se mostrou essencial para a

atividade mielopoiética dos estromas estudados, esteja envolvido na inclusão do receptor de

GM-CSF em rafts nas células progenitoras mielóides, ou de componentes da transdução de

sinal mediada por este fator. A associação de proteínas transdutoras com GM3 em GEMs já

foi demonstrada para linfócitos T (Sorice et al., 2004). Outra possibilidade é que o GM3

participe da exclusão de outros receptores dos rafts, ou ainda que exerça efeitos inibitórios

sobre esses receptores. Efeitos inibitórios do gangliosídio GM3 já foram descritos para PDGF

(Hynds et al., 1995) e para EGF (Rebbaa et al., 1996, Wang et al., 2001a), sendo proposto

que GEMs enriquecidas em GM3 retém o receptor de EGF em rafts e promovem sua

inativação (Miljan & Bremer, 2002).

Nesse sentido, a transferência de GM3 das células estromais para as células

precursoras mielopoéticas seria fundamental, pois as últimas acumulam uma quantidade

bastante baixa de GM3. De fato, existem relatos de que a adição de gangliosídios exógenos

pode levar a sua incorporação em rafts e, como resultado, causar também a dissociação de

proteínas desses rafts, tais como proteínas ancoradas a GPI (Simons et al., 1999; Simons &

Toomre, 2000), além de modificar a resposta biológica das células a vários fatores de

crescimento (Li et al., 2000). A transferência de gangliosídios de uma célula para outra é um

processo altamente eficiente (Olshefski & Ladisch, 1996) e classicamente pode ocorrer de três

formas: como monômeros, como micelas e através de vesículas enriquecidas em caveolina-1

(Kong et al., 1998; Dolo et al., 2000). Além disso, lipídios incorporados na face externa da

membrana plasmática são eficientemente distribuídos e secretados em associação com

exossomas, podendo inclusive estar arranjados na forma de rafts (de Gassart et al., 2003). Os

exossomas correspondem a endossomas formados por corpos multivesiculares e são liberados

para o meio extracelular após fusão com a membrana plasmática (Denzer et al., 2000). Visto

que encontramos um percentual importante de gangliosídios na fração exossomal isolada do

meio condicionados das células estromais AFT-024, é possível que esse tipo especializado de

transporte intercelular contribua para a transferência de GM3 detectada em nosso modelo de

mielopoiese extramedular. Skokos e colaboradores (2001) demonstraram que mastócitos

utilizam a secreção de exossomas como um vetor de comunicação intercelular para

desempenhar suas funções imunoregulatórias e inflamatórias, em adição ao contato

célula-célula e à liberação de citocinas.

A presença de gangliosídios, especialmente de GM3, nos meios condicionados se

mostrou importante não apenas para a inserção deste lipídio na membrana das células FDC-P1

como também para a habilidade de suporte mielopoiético dos próprios sobrenadantes mediada

por fatores de crescimento solúveis. Esse resultado contribui para a hipótese de que o

gangliosídio GM3 esteja envolvido com a segregação dos receptores de fator de crescimento

em rafts e/ ou com a transdução de sinal mediada pelos mesmos. Além disso, os próprios

agregados de glicoesfingolipídios podem iniciar a transdução de sinal através da interação

entre as porções lipídicas dos GSLs e as cadeias alifáticas das moléculas transdutoras

presentes nos microdomínios de membrana (Iwabuchi et al., 1998). Todavia, tem sido

sugerido que os efeitos de gangliosídios exógenos dependem do estado de confluência das

células em cultivo (Saqr et al., 1995) e que seus efeitos sobre a fosforilação das moléculas

envolvidas na sinalização celular se correlacionam com a concentração e o tempo de

permanência no meio de incubação (Li et al., 2001). A participação de gangliosídios do meio

extracelular sobre a regulação da cooperatividade entre células já foi demonstrada para

culturas de hepatócitos sincronizadas, onde a inibição do shedding de GM1 causou alterações

na síntese protéica (Brodsky et al., 2003). Finalmente, a ação de gangliosídios exógenos sobre

a diferenciação e sobrevivência de células hematopoiéticas já foi descrita para gangliosídios

liberados por células leucêmicas (Nakamura et al., 1991; McKallip et al., 1999), linfomas

(Barthi & Singh, 2000) e neuroblastomas (Sietsma et al., 1998).

Também existem relatos de que a adição de GD1a ao meio de cultura de fibroblastos

de pele humana aumenta a ligação de EGF ao seu receptor, a disponibilidade de receptores na

membrana plasmática, a sua dimerização (Liu et al., 2004) e a ativação de Src quinase (Li et

al., 2001). Tem sido proposto que a interação dos gangliosídios inseridos na membrana com

uma Src quinase pode ocorrer de duas formas: interação direta com uma Src quinase

localizada na face interna da membrana através de modificação lipídica N-terminal

(palmitoilação e miristalização), ou interação com moduladores negativos de Src quinase,

ocasionando a remoção dos mesmos e, conseqüentemente, a ativação da Src quinase (Simons

& Ikonem, 1997). Rafts enriquecidos em GM3 também tem sido relacionados com Src

quinases, além de com FAK e com Rho GTPases (Yamammura et al., 1997; Iwabuchi et al.,

1998; Chigorno et al., 2000).O GM3 também parece causar aumento da fosforilação de c-Src

e MAPK em neuroblastomas (Prinetti et al., 1999) e em fibroblastos de pele humana (Li et

al., 2001). Sendo assim, torna-se relevante o estudo futuro das ações dos gangliosídios sobre a

rota de sinalização mediada por GM-CSF, especialmente sobre o grau de fosforilação do

próprio receptor, de Src quinases e MAP quinases, uma vez que nossos resultados

demonstram um aumento na quantidade de GM3, paralelamente a uma diminuição na

quantidade de GD1a, a medida que aumenta a habilidade dos estromas em sustentar a

mielopoiese nos sistemas de cocultivo.

Comparando nossos resultados com os três modelos mecanísticos propostos por

Milján e Bremer (2002) para a ação de gangliosídios sobre receptores podemos encontrar

algumas semelhanças com o modelo de interação gangliosídio-ligante. Essa proposta de

interação entre gangliosídios e fatores de crescimento baseia-se nos resultados encontrados

para FGF, onde HSPGs são requeridos para a ligação de FGF a seu receptor. Células que não

produzem esses proteoglicanos se mostraram não-responsivas a FGF. No entanto, a adição de

GM1 exógeno restabeleceu a capacidade de resposta ao FGF dessas células, sugerindo que o

GM1 possa apresentar o FGF ao seu receptor de forma análoga ao descrito para os HSPGs

(Rusnati et al., 2002). Em nosso modelo de estudo, os HSPGs também se mostram

necessários para a apresentação do GM-CSF ao seu receptor (Alvarez-Silva & Borojevic,

1993; 1996), e os gangliosídios parecem contribuir para que essa interação ocorra. Todavia,

novos estudos são necessários para determinar se os próprios gangliosídios podem apresentar

esse fator de crescimento ao receptor.

Além dos possíveis efeitos sobre a ligação de GM-CSF ao seu receptor e a rota de

sinalização celular subseqüente, os gangliosídios também podem estar envolvidos nas

interações adesivas existentes entre células do estroma e células progenitoras mielóides. A

influência de gangliosídios sobre a ligação de moléculas de adesão aos receptores de integrina

tem sido extensivamente estudada, sendo encontrados resultados de promoção (Zheng et al.,

1993; Kawakami et al. 2002) e de inibição dessas interações (Wang et al., 2001b). Além

disso, a adesão de células de melanoma a células endoteliais parece ser um fenômeno

dependente de GM3 (Song et al., 1998), e este gangliosídio também têm sido associado ao

microdomínio de interação entre FGFR e integrina (Toledo et al., 2005). Uma vez que

encontramos gangliosídios e integrina nas mesmas frações obtidas de gradiente de sacarose,

torna-se interessante a realização de novos estudos em nosso modelo experimental para

elucidar essa questão.

O gangliosídio GM1, cujo capping para a região de contato entre células do estroma e

células FDC-P1 foi evidenciado em nosso estudo, também tem sido relacionado a interações

adesivas. Em linfócitos T, rafts contendo CD44 e outras moléculas de adesão são

enriquecidos em GM1 e perdem GM3 (Gómez-Mountón et al., 2001). Além disso, o capping

de GM1 em linfócitos murinos é acompanhado pelo capping de α-actina, indicando uma

possível participação deste gangliosídio na reorganização do citoesqueleto imediatamente

abaixo da membrana plasmática (Kellie et al., 1983). As interações adesivas entre células

também podem ocorrer no contexto de um sistema de reconhecimento, independente do bem

conhecido sistema mediado por integrinas, onde carboidratos atuariam como moléculas de

reconhecimento (Kojima & Hakomori, 1991) e se organizariam em arranjos estruturais que

lembram as sinapses imunorregulatórias, sendo definidos por Hakomori (2002) como

glicosinapses. Esses arranjos exerceriam um papel central na definição de mudanças

fenotípicas após a adesão celular (Hakomori, 2003).

Concluindo, propomos que o estroma fornece os fatores de crescimento

requeridos para a sobrevivência e proliferação das células mielóides, assim como os

proteoglicanos necessários para a otimização da sinalização destes fatores. Providencia

também gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as células-alvo, gerando

domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os

receptores para fatores de crescimento envolvidos por moléculas associadas. Esse conjunto

seria essencial para colocar as células mielopoiéticas em um contexto adequado de sinalização

celular capaz de conduzi-las à proliferação e/ ou diferenciação celular.

PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos neste estudo culminaram em uma proposta de participação dos

gangliosídios na determinação da capacidade de suporte mielopoiético de diferentes estromas,

especialmente no que diz respeito à sinalização mediada por GM-CSF. No entanto, muitas

questões ainda necessitam ser esclarecidas, as quais geram as seguintes perspectivas de

trabalho:

1. Estudar a influência do gangliosídio GM3 sobre a sinalização celular mediada por

GM-CSF, analisando tanto alterações da fosforilação do receptor de GM-CSF como a

possível interação molecular entre GM3 e GM-CSF.

2. Investigar o mecanismo de transferência de GM3 das células AFT-024 para as

células FDC-P1, verificando também se esse fenômeno se repete nos demais modelos de

mielopoiese in vitro estudados.

3. Verificar o papel do gangliosídio GM1 no microambiente estabelecido na região de

contato entre células do estroma e células progenitoras mielóides.

4. Avaliar a participação do gangliosídio GD1a na determinação da capacidade de

sustentação mielopoiética.

5. Isolar rafts de cocutluras nos modelos de mielopoiese estudados e determinar sua

composição em glicoesfingolipídios e proteínas.

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ANEXO 1 – LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1. Estrutura química de alguns gangliosídios .......................................................

Figura 2. Representação esquemática da síntese de gangliosídios ..................................

Figura 3. Esquema de um raft na membrana plasmática .................................................

Figura 4. Esquema representativo da hematopoiese .........................................................................

CAPÍTULO 1

Figure 1. Myelosupportive activity of AFT-024 cells for survival and proliferation of

FDC-P1 cells .....................................................................................................................

Figure 2. Inhibition of FDC-P1 cell survival and proliferation in co-culture with AFT-

024 cells in which ganglioside synthesis was inhibited by PDMP ...................................

Figure 3. Analysis of glycosphingolipids in AFT-024 and FDC-P1 cells .......................

Figure 4. Subcellular location of GM3 and GM-CSF-R

in cell cultures and co-culture

systems ..................................................................................................................................................

Figure 5. Subcellular location of GM1 and GM-CSF-R

in cell cultures and co-culture

systems ..................................................................................................................................................

Figure 6. Analysis of FDC-P1 uptake of ganglioside GM3 and GD1a from AFT-024-

cell-conditioned medium ..................................................................................................

108

CAPÍTULO 2

Figura 1. Imagens representativas de esfingolipídios marcados com ceramida

fluorescente em células AFT-024 .....................................................................................

Figura 2. Imagens representativas da transferência de esfingolipídios das células AFT-

024 para as células FDC-P1 em sistemas de cocultivo .....................................................

Figura 3. Solubilidade de glicoesfingolipídios das linhagens AFT-024 e FDCP-1 a

Triton X-100 .....................................................................................................................

Figura 4. Distribuição de gangliosídios (A) e imunodetecção de

integrina (B) nas

frações obtidas do gradiente de sacarose contínuo (5 - 35%) após lise das células AFT-

024 com Triton X-100 a 4°C ...........................................................................................................

CAPÍTULO 3

Figure 1. FDC-P1 cell survival and proliferation in coculture with different stroma cells

Figure 2. Ganglioside synthesis and shedding by S17, SF and GRX cells ......................

Figure 3. Inhibition of survival and proliferation of FDC-P1 cells in conditioned medium

of S17, SF and GRX cells ...................................................................................

CAPÍTULO 4

Figura 1. Imagens representativas da localização subcelular dos gangliosídios GM1 e

GM3, GMCSFRβ e CD44 em coculturas de células AFT-024 e FDC-P1 .......................

Figura 2. Imagens representativas da localização subcelular do gangliosídio GM1 em

fibroblastos de pele e na linhagem celular S17 .................................................................

109

ANEXO 2 – LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Table 1. Densitometric analysis of metabolically labelled lipids from AFT-024 cells ....

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Análise densitométrica das bandas autorradiográficas dos glicoesfingolipídios

das frações solúvel e insolúvel a Triton X-100 de células AFT-024 e FDC-P1 ...............

CAPÍTULO 3

Table 1. Sialic acid determination in lipids of the S17, SF and GRX cells …………….

Table 2. Densitometric analysis of lipids synthesized and shed from S17, SF and GRX

cells ...................................................................................................................................

Table 3. FDC-P1 proliferation in presence of cytokines, stromas conditioned mediums

and gangliosides ...................................................................................

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