( PDF ) Papel do óxido nítrico na qualidade de espermatozóides bovinos in natura durante a capacitação in vitro induzida pela heparina

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

ANA CAROLINA DE MACEDO SOARES LEAL

PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NA QUALIDADE DE ESPERMATOZÓIDES

BOVINOS IN NATURA DURANTE A CAPACITAÇÃO IN VITRO INDUZIDA

PELA HEPARINA

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

FEVEREIRO – 2008

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ANA CAROLINA DE MACEDO SOARES LEAL

PAPEL DO OXIDO NITRICO NA QUALIDADE DE ESPERMATOZÓIDES

BOVINOS IN NATURA DURANTE A CAPACITAÇÃO IN VITRO INDUZIDA

PELA HEPARINA

Dissertação apresentada ao Centro de

Ciências e Tecnologias Agropecuárias da

Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em Produção

Animal, na Área de Concentração de

Reprodução e Melhoramento Genético

Animal

Orientadora: Prof.ª Maria Clara Caldas Bussiere

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

FEVEREIRO – 2008

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ANA CAROLINA DE MACEDO SOARES LEAL

PAPEL DO OXIDO NITRICO NA QUALIDADE DE ESPERMATOZÓIDES

BOVINOS IN NATURA DURANTE A CAPACITAÇÃO IN VITRO INDUZIDA

PELA HEPARINA

Dissertação apresentada ao Centro de

Ciências e Tecnologias Agropecuárias da

Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em Produção

Animal, na Área de Concentração de

Reprodução e Melhoramento Genético

Animal

Apresentada em 20 de fevereiro de 2008

Banca Examinadora:

___________________________________________________________________

Prof

Rubens Paes de Arruda (Doutor Associado, Medicina Veterinária) – USP

___________________________________________________________________

Prof. José Frederico Straggiotti Silva (Doutor, Medicina Veterinária) – UENF

___________________________________________________________________

Prof. Claudio Andres Retamal (Doutor, Biociências e Biotecnologia ) – UENF

___________________________________________________________________

Prof

.ª

Maria Clara Caldas Bussiere (Doutora, Fisiologia da Reprodução) – UENF

(Orientadora)

Dedico aos meus pais que acompanharam meu crescimento para a vida e para o

mundo, participando das minhas lutas e conquistas. A vocês, sinais inegáveis das

mãos de Deus em minha vida, pais por natureza, opção e amor, dedico este trabalho

com a mais profunda admiração, respeito e amor. Aos meus irmãos Leonardo,

Isabela e Gabriel pelo carinho. Ao meu namorado Pedro, pela grande dedicação e

auxílio no decorrer deste trabalho, pela cumplicidade, amizade e companheirismo.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, RONALDO E LEONOR, que estiveram sempre do meu lado,

incentivando-me nos estudos, dando-me forças, mesmo que distante, para continuar

lutando pelos meus objetivos;

Ao meu namorado, PEDRO GAMA, pela grande amizade, incentivo,

confiança e ajuda neste trabalho, ombro para minhas ansiedades, ouvidos para

meus desabafos, palavras tão significativas e importantes nos momentos mais

difíceis;

A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) e ao

Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) por oferecer-me esse

curso;

Ao Laboratório de Melhoramento Genético Animal (LMGA) que me acolheu

dando-me os primeiros ensinamentos na área da pesquisa;

A CAPES por oferecer-me a bolsa de estudos;

À professora MARIA CLARA CALDAS BUSSIERE, pela oportunidade,

confiança e orientação para desenvolver este trabalho;

À Mestra e Técnica do LMGA – Laboratório de Melhoramento Genético

Animal, CARLA SOBRINHO PAES DE CARVALHO, pelos grandes ensinamentos,

incentivos e dedicação;

Aos meus amigos, FAUSTO PAES e JOÃO GOMES, pela grande ajuda nas

coletas de sêmen, mesmo fora de seus horários;

Aos meus amigos de trabalho ÂNGELO JOSÉ, KELEN SALAROLI,

HECTOR, GINA MICAN, JANAÍNA BERBARI, pela convivência, ajuda e carinho;

À funcionária e amiga MARIANE AZEVEDO, que muito me ajudou nos

momentos de correria, tendo sempre uma solução para meus problemas;

A toda minha família, que sempre me incentivou, em especial, minha irmã

ISABELA LEAL.

“O que importa não são as cartas que recebemos

do jogo da vida, mas nosso modo de jogar com

elas. Por isso, não importa quais sejam as

dificuldades, conseguimos o que determinamos”.

BIOGRAFIA

ANA CAROLINA DE MACEDO SOARES LEAL, filha de Ronaldo Costa Leal e

Maria Leonor de Macedo Soares Leal, irmã de Leonardo de Macedo Soares Leal, Isabela de

Macedo Soares Leal e Gabriel de Macedo Soares Leal, nasceu em 15 de Março de 1981, na

cidade de Niterói – RJ.

Em 10 de março de 2001, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes – RJ.

Em Junho de 2001 estagiou no Laboratório de Melhoramento Genético Animal

(LMGA) com criopreservação de sêmen caprino, sob orientação de seu hoje amigo Fausto

Paes de Carvalho.

Em 2002, no mesmo laboratório, iniciou o estágio com o estudo do papel do óxido

nítrico na capacitação espermática bovina, orientada pela professora Maria Clara Caldas

Bussiere.

Em 2003, por meio de um processo seletivo na UENF, foi concedida uma bolsa de

iniciação científica para desenvolver o trabalho sobre óxido nítrico na capacitação de

espermatozóides bovinos in natura, sob a orientação da Prof.ª Maria Clara Caldas Bussiere.

No mesmo ano, 2003, ainda estagiou no projeto TAMAR, base do Farol de São

Tomé, Campos dos Goytacazes – RJ, sendo orientada pelo Biólogo Wanderson Lima.

Em 2004, concomitantemente ao trabalho desenvolvido no LRMGA, estagiou no

Centro de Diagnóstico e Tratamento Veterinário (CDTV), sob orientação dos Mestres em

Medicina Veterinária César Ferreira e Ewerton Cardoso.

Em abril de 2006 concluiu o curso de nível superior em Medicina Veterinária na

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.

Em fevereiro de 2008, por meio de um concurso, foi selecionada para o curso de Pós-

graduação em Produção Animal, nível de Mestrado, na Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, com bolsa Capes.

Em fevereiro de 2008, por meio de um concurso, foi selecionada para o curso de Pós-

graduação em Produção Animal, nível de Doutorado, na Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro – UENF.

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do óxido nítrico (NO) na capacitação

in vitro de espermatozóides bovinos in natura induzida pela heparina, por meio da adição de

Nω-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME, inibidor da síntese de NO) e L-arginina (L-arg,

precursor da síntese de NO). No experimento 01 foram adicionadas diferentes concentrações

de L-NAME (0,1; 1; 10 mM) e de L-arg (10 mM) ao meio capacitante. A motilidade e o vigor

foram avaliadas de forma subjetiva com microscopia de luz indireta, a integridade de

membrana pela coloração vital com Tripan Blue 2% e a concentração de nitrato/nitrito (NO

/NO

) pelo método de Griess ao longo de 5 h de capacitação (0,25; 1; 2; 3; 4 e 5 h). A adição

de 10 mM de L-NAME inibiu a síntese de NO, a motilidade progressiva, o vigor e a

integridade de membrana plasmática (P<0,05) em relação ao controle. Foi adicionado 0,6

mM de L-arg ao meio capacitante tratado com 10 mM de L-NAME para avaliar se o efeito

inibitório era reversível. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre 10 mM de L-

NAME + 0,6 mM de L-arg e o controle em todos os parâmetros avaliados no experimento 1.

A adição de 10 mM de L-arg ao meio de capacitação aumentou a síntese de NO, a motilidade

progressiva, o vigor e a integridade de membrana plasmática em relação ao controle (P<0.05).

No experimento 2, foram avaliados a atividade mitocondrial, pelo teste de MTT (sal brometo

de difeniltetrazolium 3 – (4,5 – dimetiltiazol – 2 yl) – 2,5) e a capacitação espermática, pelo

teste de penetração em oócitos homólogos após a adição da concentração de L-NAME (10

mM), que apresentou efeito inibitório e de L-arg (10 mM), que apresentou efeito estimulatório

no experimento 1. A adição de 10 mM de L-NAME diminuiu a atividade mitocondrial (40%)

e a percentagem de oócitos penetrados (23%) em relação ao controle (P<0.05). Após a adição

de 0,6 mM de L-arg + 10 mM de L-NAME não houve reversão total da atividade

mitocondrial (apenas de 20%), contudo este fato não alterou os resultados obtidos em relação

ao teste de penetração (foi até mesmo 5% maior que o controle). A adição de 10 mM de L-arg

aumentou a percentagem de oócitos penetrados em relação ao controle (21%) e ao tratamento

com 10 mM de L-NAME + 0,6 mM de L-arg (16%) (P<0.05). Esses resultados indicam que;

1) o NO está envolvido no controle da motilidade progressiva, do vigor, da integridade de

membrana e atividade mitocondrial espermática ao longo da capacitação de espermatozóides

bovinos in natura induzida pela heparina via NO/NOS; 2) concentrações adequadas de NO no

meio capacitante podem potencializar a ação da heparina ou agir de forma independente

aumentando o número ou qualidade dos espermatozóides capacitados; 3) a L-arg/NO modula

parcialmente a atividade mitocondrial durante a capacitação. Outros mecanismos de ação do

iii

NO/L-arg durante a capacitação espermática devem ser avaliados e se a sua adição no meio de

capacitação irá aumentar a produção in vitro de embriões.

Palavras chave: óxido nítrico, espermatozóides, bovino, L-NAME, L-arginina

ABSTRACT

The objective of this study was to assess the effects of nitric oxide (NO) on heparin-

induced capacitation in vitro of bovine spermatozoa in natura, through the addition of Nω-

nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, a NO-synthesis inhibitor) and L-arginine (L-arg, a

NO-synthesis precursor) to the capacitation medium. In Experiment 1, different

concentrations of L-NAME (0.1; 1; 10 mM) and of L-arg (10 mM) were added to the

capacitation medium. Motility and vigor were appraised in a subjective way using indirect

light microscopy; integrity was observed through vital staining with Tripan Blue (2%) and the

concentration of nitrate/nitrite (NO

/NO

) using the Griess method over 5 h of capacitation

(0.25; 1; 2; 3; 4 e 5 h). The addition of 10 mM L-NAME has inhibited the NO synthesis, the

sperm progressive motility, and sperm vigor and integrity (P<0.05) as compared to control. L-

arg (0.6 mM) was added to the capacitation medium treated with 10 mM L-NAME for

assessing whether the inhibitory effect was reversible. There was no significant difference

(P>0.05) between 10 mM L-NAME + 0.6 mM L-arg and the control for any of the parameters

evaluated in Experiment 1. The addition of 10 mM L-arg to the capacitation medium

increased the NO synthesis, the sperm progressive motility, sperm vigor and integrity in

comparison to the control (P<0.05). In Experiment 2, mitochondrial activity has been assessed

through the MTT test (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), and the

spermatic capacitation has been assessed through the test of penetration in homologue oocytes

after addition of the L-NAME concentration (10 mM), which showed an inhibitory effect, and

of the L-arg concentration (10 mM), which showed a stimulatory effect in Experiment 1. The

addition of 10 mM L-NAME caused a decrease in mitochondrial activity (40%) and in the

percentage of oocytes penetrated (23%), in relation to the control (P<0.05). After addition of

0.6 mM L-arg + 10 mM L-NAME, total reversion of mitochondrial activity has not taken

place (but only 20%), although this fact has not altered the results obtained from the

penetration test (which were in fact 5% higher than those of control). The addition of 10 mM

L-arg has increased the percentage of oocytes penetrated as compared to control (21%) and to

treatment with 10 mM L-NAME + 0.6 mM L-arg (16%) (P<0.05). These results indicate that:

1) NO is involved in the control of progressive motility, vigor, integrity, and spermatic

mitochondrial activity along the period of heparin-induced capacitation of in natura bovine

spermatozoa via NOS/NO; 2) adequate NO concentrations into the capacitation medium can

potentialize heparin action or can act independently for increasing the number or the quality

of capacitated spermatozoa; 3) L-arg/NO partially modulates mitochondrial activity during

capacitation. Other mechanisms of the NO/L-arg action during the spermatic capacitation

should be assessed, as well as if addition of NO/L-arg to the capacitation medium will

increase the production of embryos, in vitro.

Keywords: nitric oxide, spermatozoa, bovine, L-NAME, L-arginine

LISTA DE FIGURAS

Figura 1-

Mapa seqüencial das três isoformas do NO sintase de humanos,

ilustrando o domínio redutase, oxigenase e seus co-fatores......................

Figura 2-

Esquema ilustrativo do caminho da transdução do sistema NO-cGMP

em células de mamíferos............................................................................

vii

LISTA DE ABREVIATURA

AC – acetilcolinesterase

ADP – difosfato de adenosina

AMPc – monofosfato de adenosina cíclica

ATP – trifosfato de adenosina

BSA – soro albumina bovina

CaM – calmodulina

cGMP – guanasina monofosfato cíclica

CNG – canais de íons

cNOS – óxido nítrico sintase constitutiva

CTC – clortetraciclina

eNOS – óxido nítrico sintase endotelial

FAD – dinucleotídeo adenina flavina

FIV – fertilização in vitro

FMN – mononucleotídeo flavina

FSH – hormônio folículo estimulante

IA – inseminação artificial

iNOS – óxido nítrico sintase induzível

kDa – kilodalton

L-arg – L-arginina

LH – hormônio luteinizante

L-NA – Nω-nitro-L-arginina

L-NAME – Nω-nitro-L-arginina metil éster

M – Molar

mM – milimolar

µM – micromolar

mtNOS – óxido nítrico sintase mitocondrial

MTT – sal brometo de difeniltetrazolium 3 – (4,5 – dimetiltiazol – 2 yl) – 2,5

NADPH – fosfato dinucleotídeo adenina nicotinamida

nNOS – óxido nítrico sintase neuronal

NO – óxido nítrico

NOS – óxido nítrico sintase

PDE – fosfodiesterase

viii

pH – potencial de hidrogênio

Pi – fósforo inorgânico

PIV – produção in vitro de embriões

PKA – proteína kinase A

PKC – proteína kinase C

PLD – fosfolopase D

RA – reação acrossômica

Ser – serina

SFB – soro fetal bovino

SNP – nitroprussiato de sódio

Talp – meio tyroides modificado

Talp-fec – meio tyroides de fecundação

TE – transferência de embrião

Thr – treonina

Tyr – tirosina

UI – unidades internacionais

SUMÁRIO

BIOGRAFIA.................................................................................................................................... i

RESUMO..........................................................................................................................................

ABSTRAT........................................................................................................................................ iv

LISTA DE FIGURAS......................................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................................

vii

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................

2. OBJETIVO....................................................................................................................

2.1. Objetivo geral............................................................................................................

2.1. Objetivo específico....................................................................................................

3. REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................................

3.1. Capacitação espermática......................................................................................................

3.1.1. Capacitação espermática in vitro...................................................................................... 5

3.1.1.1. Duração da capacitação..................................................................................................

3.1.1.2. Óxido nítrico.................................................................................................................. 6

3.1.1.2.1. Isoformas da NOS.......................................................................................................

3.1.1.2.2. Efeito do NO na respiração mitocondrial....................................................................

3.1.1.2.3. Sistema NO-cGMP......................................................................................................

3.1.1.2.4. Inibidores da síntese do NO........................................................................................

3.1.1.2.5. Precursor da síntese de NO......................................................................................... 11

3.1.1.3. Motilidade progressiva na capacitação.......................................................................... 13

3.1.1.3.1. Hiperativação da motilidade espermática................................................................... 13

3.1.1.4. Vigor.............................................................................................................................. 14

3.1.1.5. Integridade da membrana plasmática.............................................................................

3.1.2. Mitocôndria.......................................................................................................................

3.1.3. Citoesqueleto.....................................................................................................................

3.2. Fertilização in vitro (FIV)....................................................................................................

3.3. Teste de penetração em oócitos homólogos.........................................................................

4. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA........................................................................................

5. ARTIGO SUBMETIDO PARA REVISTA ANIMAL REPRODUCTION........................

1- INTRODUÇÃO

O óxido nítrico (NO) é uma espécie de nitrogênio reativa, podendo atuar na sinalização

inter e intracelular, agindo como antioxidante ou radical livre (DIXIT e PARVIZI, 2001). Ele

é um gás incolor à temperatura e pressão ambiente, biologicamente ativo em quase todas as

células do organismo, e se difunde livremente através das membranas, uma vez que tem um

baixo peso molecular (LOWENSTEIN et al., 1994).

O NO é sintetizado durante a conversão da L-arginina (L-arg) em L-citrulina por

reações oxidativas catalisadas pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), utilizando oxigênio,

fosfato dinucleotídeo adenina nicotinamida (NADPH) (MONCADA e HIGGS, 1993),

dinucleotídeo adenina flavina (FAD), mononucleotídeo flavina (FMN) (DONNELLY et al.,

1997) e cálcio/calmodulina (CaM) como co-fatores. Existem quatro isoformas da NOS: três

constitutivas, dependentes de cálcio (NOS neuronal (nNOS); NOS endotelial (eNOS), NOS

mitocondrial (mtNOS) e uma induzível (iNOS), cálcio independente (FRANCAVILLA et al.,

2000; RODRIGUEZ et al., 2004). Contudo, alguns trabalhos já relataram a expressão

constitutiva para a iNOS em algumas células (GATH et al.,1996)

A localização e função de algumas isoformas da NOS têm sido descritas em

espermatozóides de várias espécies animais, como bovinos (MEISER e SCHULZ, 2003;

O’FLAHERTY et al., 2004), roedores (BREDT et al., 1991), humanos (O’BRYAN et al.,

1998; FRANCAVILLA et al., 2000), estando presentes no acrossomo e na cauda dos

espermatozóides bovinos (O’FLAHERTY et al., 2004), humanos (BALERCIA et al., 2004;

O’BRYAN et al., 1998), atuando na motilidade, hiperatividade, capacitação e reação

acrossômica. Contudo, a maior parte destes experimentos tem sido realizada em humanos e

animais de laboratório (roedores).

A capacitação espermática e a reação acrossômica (RA) são eventos imprescindíveis

para o sucesso da fertilização do oócito, tanto in vitro quanto in vivo, dependendo da ação do

NO para que ocorram em bovinos (RODRIGUEZ et al., 2004; O’FLAHERTY et al., 2004),

suínos (FUNAHASHI., 2002) e bubalinos (ROY e ATREJA, 2007). O aumento de NO no

meio de capacitação induz à reação acrossômica em humanos (HERRERO et al., 2000) e

roedores (GUZMAN-GRENFELL et al., 1999).

Nω-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), inibidor da produção de NO por competir

pelo mesmo sítio de ligação da L-arg, precursora da síntese de NO (MONCADA et al., 1991),

tem sido utilizado nos estudos sobre o papel do NO na capacitação espermática e RA. Pouco

se tem na literatura sobre a adição destes no meio de capacitação espermática bovina. No

entanto, trabalhos recentes demonstraram que a adição de L-NAME no meio de cultivo de

espermatozóides bovinos criopreservados inibiu a capacitação após 45 min, contudo, a

motilidade não foi avaliada após o tratamento com L-NAME (1; 10 e 100 mM;

RODRIGUEZ, et al., 2004). O’FLAHERTY et al., (2004) adicionaram L-arg (10, 20, 30, 40,

50 mM) no meio de cultivo e observaram que a adição de 10 mM melhorou a motilidade, a

capacitação e a reação acrossômica de espermatozóides bovinos após 45 min. Concentrações

mais elevadas inibiram a motilidade, não apresentaram diferença significativa do controle na

viavilidade e RA, mas mantiveram o efeito estimulatório na capacitação espermática. ROY e

ATREJA (2007) verificaram que a adição de L-NAME (5 mM) no meio de cultivo em

bubalinos inibiu a capacitação espermática e a L-arg (15 e 20 mM) diminuiu a motilidade e a

integridade da membrana, mas concentrações menores (5 e 10 mM) aumentaram a

capacitação.

No presente estudo, pela primeira vez na literatura, reuniu-se a avaliação da motilidade,

vigor, integridade da membrana, capacitação espermática, atividade mitocondrial e dosagem

de nitrato/nitrito ao longo de 5 h de capacitação espermática bovina, com sêmen in natura,

após a adição de 1; 10 e 100 mM de L-NAME e 10 mM de L-arg, com o objetivo de

contribuir de modo significativo no aprimoramento das biotécnicas reprodutivas, que ainda

apresentam limitações que contribuem para o alto custo do embrião produzido in vitro em

relação ao obtido por transferência de embriões.

2- OBJETIVO

2.1. Objetivo geral

Avaliar o papel do óxido nítrico na qualidade de espermatozóides in natura de bovinos

ao longo da capacitação in vitro induzida pela heparina e seu potencial fecundante.

2.2. Objetivo especifico

O objetivo do presente experimento foi avaliar a motilidade, o vigor, a integridade da

membrana, a atividade mitocondrial e a capacitação espermática após:

2.2.1. a inibição da síntese de NO durante a capacitação in vitro de espermatozóides bovinos

induzida pela heparina por meio da adição do Nω-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME) no

meio de cultivo.

2.2.2. a adição da L-arginina durante a capacitação in vitro de espermatozóides bovinos

induzida pela heparina.

3- REVISÃO DE LITERATURA

3.1. Capacitação espermática

A capacitação espermática em bovinos é determinada pela capacidade do

espermatozóide fertilizar o oócito, seja in vivo ou in vitro. Os espermatozóides mamíferos não

são capazes de fertilizar o oócito imediatamente após ejaculado; necessitam passar por um

período de capacitação que normalmente ocorre no trato reprodutor da fêmea (AUSTIN,

1951; CHANG, 1951). No entanto, tem-se criado meios específicos que permitem a

capacitação in vitro destes. A capacitação espermática envolve vários eventos bioquímicos e

está correlacionada com mudanças na concentração intracelular de íons, entrada de cálcio

(HANDROW et al., 1989; BALDI et al., 1991) e aumento do pH citosólico

(VRENDENBURGH-WILBERG e PARRISH, 1994; FRASER, 1995), diminuição das

proteínas espermáticas pela calmodulina (LECLERC et al., 1992), aumento da concentração

espermática do AMPc (PARRISH et al., 1994; PARINAUD e MILHET, 1996), geração de

baixa concentração do anion superóxido (de LAMIRANDE et al., 1998; O’FLAHERTY et

al., 2004), alteração da motilidade espermática – hiperativação (HARRISON, 1996) e

fosforilação de proteínas especificas de espermatozóides de rato (VISCONTI et al., 1995),

humano (CLELIA e FENICHEL. 1997) e bovino (GALANTINO-HOMER et al., 1997). A

fosforilação de proteínas espermáticas implica na capacitação, manutenção e modificação da

motilidade e da RA (KOPF e GERTON, 1991).

A capacitação está associada com a geração de espécies de oxigênio reativa (ROS) e

ativação da transdução de sinais que levam a fosforilação da tirosina (Tyr), serina (Ser) e

treonina (Thr), residuos de proteína (de LAMIRANDE et al., 1998; VISCONTI et al., 1995).

Espermatozóides humanos incubados em condições capacitantes começam imediatamente a

produzir o anion superóxido (O

) (O’FLAHERTY et al., 2006). Entretanto, a adição da

superóxido dismutase (SOD) após 30 min do início da incubação não previne a capacitação,

sugerindo que a cascata de eventos pela ROS que leva à capacitação inicia-se rapidamente (de

LAMIRANDE et al., 1997). A geração de baixos e controlados níveis de O

, H

e NO pelo

espermatozóide bovino e humano (de LAMIRANDE et al., 1997) está envolvido com a

aquisição da capacidade fertilizante.

3.1.1. Capacitação espermática in vitro

A capacitação espermática em bovinos pode ser iniciada pela incubação dos

espermatozóides em um meio livre do fluido seminal, com heparina (CHAMBERLAND et

al., 2001), simulando o loci do trato reprodutor da fêmea, definido como meio capacitante,

que o retém em um estado competente. A remoção do fluido seminal é essencial, pois ele

contém fatores “decapacitantes”, como o colesterol, que inibem a capacitação

(YANAGIMACHI, 1994).

A heparina, um glicosaminoglicano, presente no trato reprodutor de fêmeas bovinas,

tem sido considerada a principal substância que promove a capacitação in vitro sem induzir a

RA em espermatozóides bovinos (PARRISH et al., 1988; CHAMBERLAND et al., 2001).

No meio de capacitação contendo heparina, a motilidade progressiva (CHAMBERLAND et

al., 2001; ROY e ATRJA., 2007) e a capacitação espermática (RODRIGUEZ et al., 2004;

O’FLAHERTY et al., 2004) foram maiores que no controle (sem heparina). Segundo PAES

de CARVALHO et al., (2002), apenas 30% dos espermatozóides bovinos capacitaram na

ausência de heparina após 4 h de incubação. A capacitação foi avaliada pelo teste de

penetração em oócitos homólogos.

Um estudo mais detalhado feito por ROY e ATRJA (2007) demonstrou um aumento da

capacitação espermática em bubalinos ao adicionar 5 e 10 mM de L-arg, comparado com

controle. Em contrapartida, ao adicionar 0,5 mM de L-NAME, observou uma inibição da

capacitação. No entanto, ao adicionar 10 mM de L-arg. com 0,5 mM de L-NAME, não foi

observado a reversão do efeito inibitório do L-NAME. Logo, os autores concluiram que a L-

arg é um potente indutor da capacitação de espermatozóides de bubalinos e esse efeito foi

mediado pela produção de NO pela NOS.

In vivo, alguns fatores do trato reprodutor da fêmea são descritos como reguladores da

capacitação, sendo eles; fluido do oviduto de bovinos (HUNTER e HALL, 1974),

progesterona (FORESTA et al., 1992; das GUPTA et al., 1994; BARBINI et al., 1995; de

LAMIRANDE et al., 1998), heparina e lipoproteína de alta densidade de bovinos (PARRISH

et al., 1988).

3.1.1.1. Duração da capacitação

A capacitação é um processo dependente do tempo e da temperatura que leva o

espermatozóide a se ligar na zona pelúcida que circunda o oócito e induz a RA

(YANAGIMACHI et al., 1994; de LAMIRANDE et al., 1997).

O tempo necessário para completar o processo de capacitação varia entre as diferentes

espécies animais, sendo requeridas 2 h em camundongos (VISCONTI e KOPF, 1998) e 5 h

em bovinos (CHAMBERLAND et al., 2001), quando realizada in vitro. Em humanos, essa

capacitação é mais rápida, ocorrendo ao redor de 1 h de incubação (COHEN-DAYAG et al.,

1995; JAISWAL et al., 1998).

Para induzir a capacitação in vitro em bovinos, PARRISH et al. (1988) incubou

espermatozóides com heparina (10 mg/mL) e observaram que estes requerem um período de 4

h de incubação a 39

C para se tornarem capacitados. Isso se deve ao fato de que, após os

espermatozóides terem sido incubados com oócitos em meio tyroides de fecundação (talp-

fec), na presença de heparina, ter sido observado após 4 h de incubação maior taxa de oócitos

penetrados em relação aos espermatozóides incubados por 25 seg, 1 h, 2 h e 3 horas.

3.1.1.2. Óxido nítrico

O óxido nítrico (NO) é um radical livre (possui um elétron desemparelhado), sintetizado

in vivo durante a conversão da L-arg em L-citrulina por reações oxidativas catalisadas pela

enzima óxido nítrico sintase (NOS), utilizando oxigênio, NADPH (MONCADA e HIGGS,

1993), dinucleotídeo adenina flavina (FAD), mononucleotideo flavina (FMN) (DONNELLY

et al., 1997) e cálcio/calmodulina (CaM) como co-fatores.

Ele é um gás incolor à temperatura e pressão ambiente, que se difunde livremente

através de membranas (DIXIT e PARVIZI, 2001), biologicamente ativo em quase todas as

células do organismo, tendo assim um baixo peso molecular (NATHAN, 1992). No entanto,

possui uma meia vida biológica muito pequena (SANTORO et al., 2001).

A magnitude e duração da síntese de NO pelas células determina se sua ação será

patológica ou fisiológica. Vários estudos in vitro demonstram que baixa concentração de NO

estimula a motilidade de espermatozóides de camundongos (HERRERO et al., 1994),

hamsters (YEOMAN et al., 1998) e humanos (HELLSTROM et al., 1994), a capacitação

espermática de humanos (ZINI et al., 1995; SENGOKU et al., 1998) e a RA de

espermatozóide de camundongo (HERRERO et al., 1997) e bovinos (ZAMIR et al., 1995).

Entretanto, alta concentração de NO parece exercer efeito oposto na motilidade, integridade

da membrana e metabolismo de espermatozóides humanos in vitro (FRANCAVILLA et al.,

2000; ZINI et al., 1996). AKSOY et al. (2000) relataram que a produção de NO aumenta em

pacientes com varicocele e o NO se apresenta negativamente correlacionado com a

motilidade, morfologia e concentração espermática. BALERCIA et al. (2004) demonstraram

que homens férteis com quantidades normais de espermatozóides (normozooespérmicos)

exibem concentrações de NO significativamente menor que os homens inférteis com

quantidades diminuídas de espermatozóides (atenozoospérmicos).

LAMPIAO et al. (2006) mensuraram, diretamente, o NO em espermatozóides humanos

através da citometria de fluxo, usando um diaminofluorescente (DAF-2/DA). Demonstraram a

relação dose dependente da fluorescência da DAF-2/DA com NO ao adicionar doses

crescentes de SNP (30, 50 e 100 µM), no meio de capacitação, tendo como resposta um

aumento crescente da fluorescência quando comparado com o controle, devido ao aumento

exógeno de NO. Em contrapartida, ao centrifugar por 10 min os espermatozóides com L-

NAME, detectou-se uma diminuição da fluorescência, devido a mudanças na produção

endógena de NO (LAMPIAO et al., 2006).

HERRERO et al. (1996) detectaram a enzima óxido nítrico sintase (NOS) no acrossoma

e na cauda de espermatozóides humanos e de camundongos por imunofluorescência. A óxido

nítrico sintase endotelial (eNOS) foi encontrada na cabeça de espermatozóides humanos

(O’BRYAN et al., 1998), na membrana e citosol de espermatozóides de bovinos (MEISER e

SCHULZ, 2003). MEISER e SCHULZ (2003) ainda observaram a presença da enzima óxido

nítrico sintase neuronal (nNOS) no acrossoma e flagelo de espermatozóides de bovinos.

Tem sido relatado que o estresse causa anormalidades nos parâmetros de

espermiogramas (ESKIOCAK et al., 2006). Aflições e angústias têm sido sugeridas como

causa dessas infertilidades inexplicáveis (HARRISON et al., 1986). Estudos indicam que o

estresse tem impacto negativo em vários parâmetros associados com a qualidade do sêmen,

incluindo a concentração, motilidade e morfologia (POOK et al., 1999; CLARKE et al.,

1999).

Muitos estudos ainda são necessários para um maior entendimento do papel do NO nas

funções espermáticas de bovinos. Mais pesquisas devem ser realizadas para identificar qual

isoforma está relacionada com cada atividade desenvolvida pelo espermatozóide, em qual

porção ela se encontra e qual concentração ideal para uma ótima capacitação e reação

acrossômica.

3.1.1.2.1. Isoformas da NOS

Quatro isoformas da NOS têm sido descritas, sendo três constitutivas, dependentes de

cálcio – a óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e a

óxido nítrico sintase mitocondrial (mtNOS) e a quarta, cálcio independente, a óxido nítrico

sintase induzível (iNOS), (FORSTERMANN et al., 1995; FRANCAVILLA et al., 2000;

RODRIGUEZ et al., 2004; MEISSER e SCHULZ, 2003; ZEMOJTEL et al., 2006). A

mtNOS apesar de já ter sido relatada desde há mais de uma década, muito pouco se sabe sobre

ela. A NOS tem sido detectada em epidídimos humanos, testículo (ZINI et al., 1996) e útero

(TELFER et al., 1995), sugerindo que pode estar envolvida na capacitação e maturação

espermática. A presença da NOS também tem sido demonstrada em espermatozóides de

humanos (DONNELLY et al., 1997; O’BRYAN et al., 1998; ROSSELLI et al., 1998;

FRANCAVILLA et al., 2000; BALERCIA et al., 2004), roedores (BREDT et al., 1991,

HERRERO et al., 1994 e KLEIN, 2001) e suínos (FUNAHASHI, 2002), mas não foi

classificada sua isoforma. Análise de imunofluorescência indireta demonstrou que

espermatozóides humanos expressam NOS constitutiva no segmento pós-acrossomal e

equatorial (LEWS et al., 1996).

As três isoformas mais conhecidas são constituídas de um domínio redutase e de um

domínio oxigenase (Figura 1). A porção heme terminal com o NH

pertence ao domínio

oxigenase e a CaM, FMN, FAD, NADPH com o COOH pertence ao domínio redutase

(IGNARRO, 2000). Pela constituição, pode-se observar que as três enzimas são dependentes

de cálcio. No entanto, a quantidade de cálcio requerida pela isoforma induzível é tão

insignificante que se considera cálcio independente. Elas se diferenciam pela distribuição de

seus domínios e pelo peso molecular (Figura 1). A nNOS pesa 161 kDa, a eNOS pesa 133

kDa e a iNOS é a mais leve, pesando 131 kDa (IGNARRO, 2000).

Figura 1- Mapa seguencial das três isoformas mais conhecidas do NO sintase de humanos,

ilustrando o domínio redutase, oxigenase e seus co-fatores (IGNARRO, 2000).

COOH eNOS

133 kDa

COOH nNOS

161 kDa

Heme

NADPH

Heme

CaM

FMN

FAD

COOH iNOS

131 kDa

Domí

nio Oxigenase

Domínio Redutase

100 a.a.

3.1.1.2.2. Efeito do NO na respiração mitocondrial

O primeiro alvo da ação citotóxica do NO é a mitocôndria (HIBBS et al., 1987;

LANCASTER e HIBBS, 1990; MONCADA et al., 1991). LANCASTER e HIBBS (1990)

demonstraram que a iNOS cataliza reações químicas da inibição mitocondrial dentro de fontes

celulares e, potencialmente, causa efeitos tóxicos nas células alvo. Entretanto, os efeitos do

NO também podem ser regulatórios ao invés de deletérios.

O NO pode inibir a fosforilação oxidativa de maneira reversível, por meio da regulação

do nível de cálcio intracelular (LAFFRANCHI et al., 1995; SCHWEIZER e RICHTER,

1994). Adicionalmente, a nitrisilação do citocromo C inibe a atividade da citocromo oxidase

reversível (CASSINA e RADI, 1996; CLEETER et al., 1994; PODEROSO et al., 1996;

LIZASOAIN et al., 1996; ROUSSEAU et al., 1998). A enzima volta para o estado ativo

quando o NO é reduzido a produtos nitrogenados por elétrons da cadeia respiratória

(BORUTAITE e BROWN, 1996; CLARKSON et al., 1995).

Sob condições aeróbicas, o O

é formado quando os elétrons são desviados da

associação Fe-NO, ligando-se ao sítio de O

(PODEROSO et al., 1996). Esse O

dependente

irá participar da redução do NO a OONO

, formará H

e, ainda, estará envolvido junto ao

OONO

, com a inativação da enzima aconitase. O H

e o OONO

aumentarão o estresse

oxidativo resultando na modulação da respiração pelo baixo nível de NO (MIRANDA et al.,

2000).

3.1.1.2.3. Sistema NO-cGMP

No sistema NO-cGMP de mamíferos (Figura 2), o NO oriundo da conversão da L-arg

em L-citrulina vai ativar a enzima guanilato ciclase solúvel, responsável pela conversão do

GTP em cGMP. Esta cGMP pode ser degradada em 5’-GMP ou pode ativar canais de íons

(CNG), proteína cinase (cGK) e fosfodiesterases (PDE, a isoforma PDE II é ativada e a PDE

III é inibida) (IGNARRO, 2000).

As proteínas cinase (cGK), dependentes de cGMP, ativadas são responsáveis pela

conversão do substrato protéico em proteína fosforilada com a utilização de energia na forma

de ATP. Esta proteína fosforilada, por sua vez, será responsável por efeitos biológicos e

desfosforilações protéicas, com a utilização de uma molécula de água ativada por uma enzima

fosfatase protéica (IGNARRO, 2000).

Os efeitos biológicos podem ser inativados por desfosforilações causadas pela proteína

fosfatase. Embora muitas das ações biológicas sejam mediadas pela via cGMP, via transdução

do sinal, alguns efeitos do NO são cGMP-independente, outras enzimas contendo o grupo

heme, S-nitrosilação do grupo tiol, formação do grupo Fe-S, desaminação (IGNARRO, 2000).

Figura 2- Esquema ilustrativo da via de transdução de sinais do sistema NO-cGMP em células

de mamíferos (IGNARRO, 2000).

3.1.1.2.4. Inibidores da síntese do NO

Inibidores da NOS têm importante função para avaliar o papel do processo fisiológico

do NO. Análogos da L-arginina (L-arg), o Nω-nitro-L-arginina methyl ester (L-NAME) e o

Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) são inibidores da NOS muito utilizados, contudo, ainda não se

sabe, especificamente, qual enzima o L-NAME inibe por competir pelo mesmo sítio de

L-arginina

NOS

L-citrulina

cGMP

efeito independente

S-

nitrosilação

grupo tiol

Deaminação

Grupos Fe -

Guanilato

ciclase

solúvel

cGMP

GTP

Fosfodiesterase

5’-GMP

Canais de

ións

(CNG)

Proteina

cinase

cGK

Fosfodiesterase

(PDE)

PDE II

estimulada

PDE III

inibida

Substrato

protéico

Proteina

fosforilada

ATP

ADP

Efeitos

biológicos

Proteina

desfosforilada

Água

Fosfatase proteica

Outras enzimas contendo o

grupamento heme

ligação que a L-arg,, apesar de já ter sido relatado, em catálogos mais antigos (SIGMA.

1999), a inibição irreversível da enzima constitutiva nNOS e reversível da iNOS, citado

também por MONCADA et al. (1991). No entanto, catálogo mais recente (SIGMA 2005-

2006) não cita nada sobre a ação do L-NAME em determinada isoforma, enquanto que o L-

NNA é citado como um inibidor irreversível da NOS constitutiva neural e reversível da NOS

induzível (SIGMA 2005-2006).

RODRIGUEZ et al. (2004) avaliaram o efeito da via NOS/NO na capacitação,

incubando espermatozóides por 45 min, a 38

C, na presença de heparina (10 UI/mL) e

diferentes concentrações de inibidores da NOS, Nω-nitro-L-arginina (L-NA) (1-500 µM) e L-

NAME (1-500 µM). Após a adição de L-NAME e L-NA no meio de capacitação, os

espermatozóides apresentaram menor taxa de capacitação quando comparado com controle.

Concentrações de 1 a 10 µM em ambos tratamentos apresentaram maior taxa de capacitação

quando comparados com concentrações mais elevadas (100 e 500 µM). Logo, pode-se afirmar

que concentrações elevadas inibem a capacitação espermática. O L-NAME, nas mesmas

concentrações que o L-NA, apresentou menor taxa de espermatozóides capacitados, sendo um

inibidor mais potente que L-NA.

DONNELLY et al. (1997) estudaram o efeito da inibição do NO e também constataram

que a produção de NO foi inibida de forma mais eficiente pelo L-NAME, seguida do L-

NMMA (Nω-metil-L-Arginina) e, por fim, o L-NA.

Segundo FRANCAVILLA et al. (2000), o L-NAME inibiu a penetração de

espermatozóides humanos em oócitos, quando comparado com o controle. Essa inibição foi

maior quando se utilizou a concentração de 1,2 mM, comparada com concentrações menores

(0,1 e 0,6 mM) de L-NAME. Já em relação à motilidade não houve diferença significativa

entre as três concentrações utilizadas e o controle.

3.1.1.2.5. Precursor da síntese de NO

O aminoácido L-arg é um substrato para a enzima óxido nítrico sintase (NOS) produzir

NO (MONCADA, 1991). MEISER e SCHULZ (2003) demonstraram essa afirmação ao

adicionar 3 µM de L-arg no meio de capacitação espermática bovina, no qual observaram um

aumento considerável (quase 200%) da percentagem da atividade da NOS, quando comparada

com o controle (100% de atividade).

Já recentemente, ROY e ATREJA (2007) demonstraram um aumento da produção NO

no meio de capacitação espermática de bubalinos, adicionando 5 mM de L-arg, ao dosar a

relação nitrato/nitrito no sobrenadante ao longo de 6 h e verificar um aumento em relação ao

controle a partir de 0 h. O oposto foi observado ao adicionar 0,5 mM de L-NAME no meio de

capacitação, houve uma diminuição da relação nitrato/nitrito formada, quando comparada

com o controle. No entanto, ao associar L-NAME com L-arg, pode-se observar uma reversão

do efeito inibitório do L-NAME pela L-arg, mas não completamente.

O’FLAHERTY et al. (2004) incubaram espermatozóides bovinos criopreservados por

45 min em um meio de capacitação com heparina e diferentes concentrações de L-arg (10, 20,

30, 40, e 50 mM). Observaram que a integridade da membrana espermática, após 45 min, se

manteve constante, quando comparado com os controles (Talp com e sem heparina). No

entanto, a motilidade progressiva decresceu com o aumento da adição da L-arg, quando

comparado com os controles. Já em relação à capacitação, eles observaram que a adição de

concentrações elevadas (10, 20 e 30 mM) de L-arg, durante a incubação de espermatozóides

bovinos, aumentou significativamente a percentagem de espermatozóides capacitados, quando

comparados com o controle e com as demais concentrações (1,25; 2,5; 5 mM).

Para melhor acurácia de seus dados, O’FLAHERTY et al. (2004) incubaram

espermatozóides bovinos criopreservados em um meio de capacitação contendo L-NAME (1

mM) + L-arg (10 mM) e outro apenas com 10 mM de L-arg. No meio apenas com L-arg

observaram um significativo aumento da capacitação, quando comparado com o controle

(Talp com heparina). Já no meio que continha L-NAME + L-arg, observaram uma discreta

inibição da capacitação, quando comparado com o controle (Talp com heparina).

FRANCAVILLA et al. (2000) também analisaram o efeito da L-arg no deslocamento do

L-NAME. No entanto, analisou-o em relação à penetração de espermatozóides humanos em

oócitos. Foi observado que o efeito inibidor do L-NAME (0,6 mM) desapareceu, quando se

adicionou L-arg na concentração de 6 mM.

O fato de altas concentrações de L-arg (40 e 50 mM) terem inibido a motilidade

progressiva, sem alterar a integridade da membrana espermática, sugere que altas

concentrações de NO, produzidas pela conversão do aminoácido em NO, diminui a

motilidade espermática, chegando a tornar o espermatozóide imóvel (O’FLAHERTY et al.,

2004).

ROY e ATREJA (2007) ao adicionar concentrações crescentes de L-arg (2, 5 e 10 mM)

no meio de capacitação de espermatozóides de búfalo não observaram alteração da motilidade

progressiva após 6 h de incubação, no entanto, ao adicionar concentrações maiores de L-arg

(> 10 mM) observaram uma diminuição da motilidade progressiva. No mesmo trabalho, foi

analisado a fosforilação da proteína tyrosina de 38 kDa (p38), chave na sinalização

intracelular de eventos que ocorrem durante a capacitação e regulada pelo NO. Comparada

com o controle, a L-arg. induziu a fosforilação da tirosina p38 e o L-NAME inibiu esse

processo. No entanto, o efeito inibitório do L-NAME foi revertido quando se adicionou L-arg

ao meio, indicando que ocorre uma inibição competitiva da NOS constitutiva no

espermatozóide (ROY e ATREJA, 2007). Assim, ao adicionar um análogo do AMPc (db-

AMPc) com IBMX (inibidor da fosfodiesterase) não foi induzida a fosforilação da p38,

sugerindo que a L-arg, induz a fosforilação da p38 independente do caminho AMPc/PKA.

3.1.1.3. Motilidade progressiva na capacitação

A percentagem de espermatozóides móveis com motilidade progressiva depende do

tempo de incubação no meio de capacitação espermática bovina in vitro. Ao longo da

incubação, os espermatozóides vão se tornando capacitados, assumindo movimentos

circulares, passando pela fase de hiperativação, até começar a diminuir sua motilidade

progressiva.

A motilidade progressiva apresenta um decréscimo mais acentuado com o passar das

horas, no meio contendo heparina, quando comparado com o meio de capacitação sem

heparina (CHAMBERLAND et al., 2001). O decréscimo da motilidade progressiva, na

presença de heparina, é correspondente ao decréscimo da integridade da membrana e ocorre

porque durante a capacitação os espermatozóides tornam-se cada vez mais frágeis, devido às

várias alterações na membrana plasmática (HARRISON, 1996). Depois da capacitação, o

espermatozóide exaure sua reserva energética que é vital para sua motilidade, devido ao efeito

de aceleração da heparina no metabolismo espermático (CHAMBERLAND et al., 2001).

Após três horas de capacitação, os espermatozóides apresentaram maior (70,6%)

motilidade com velocidade curvilínea (VCL) e maior (38,2%) motilidade com velocidade em

linha reta (VSL) incubados em TCM, meio de capacitação, quando comparados com controle,

sem CaCL

e NaHCO

(VCL-57,1%; VSL-29,7%) (GARCÍA HERREROS et al., 2005).

Segundo o Manual para exame andrológico e avaliação para sêmen animal, do Colégio

Brasileiro de Reprodução Animal (1988), a motilidade progressiva é classificada de 0 a 100%,

de acordo com a percentagem de espermatozóides móveis associados com o movimento

linear.

3.1.1.3.1. Hiperativação da motilidade espermática

A hiperativação da motilidade espermática ocorre durante a capacitação e é

caracterizada por movimentos laterais em forma de “oito” (YANAGIMACHI, 1994). A

hiperativação foi primeiro descrita por YANAGIMACHI (1969). Ele propôs que o vigoroso

movimento assumido pelo espermatozóide era vital no papel da penetração na zona pelúcida.

STAUSS et al. (1995) demonstraram que espermatozóides de hamsters hiperativados tiveram

maior sucesso na penetração da zona pelúcida de oócitos in vitro, quando comparados com

espermatozóides não-hiperativados.

Vários componentes do trato reprodutor da fêmea podem servir como estímulo

fisiológico para a hiperativação (SUAREZ e HO, 2003). No entanto, hormônios, íons e

secreção do oviduto variam durante o ciclo estral da fêmea (NICHOL et al., 1992) podendo,

assim, existir um período ótimo para que esse processo ocorra.

O fluido folicular humano tem efeito dose-dependente na freqüência do ritmo flagelar e

hiperativação (YAO et al., 2000), tendo sido sugerido que a progesterona é o fator ativo

porque induz a hiperativação (SUELDO et al., 1993).

BOATMAN e ROBBINS (1991) relataram a essencialidade do bicarbonato, tanto na

capacitação espermática quanto na hiperativação de espermatozóides de hamster in vitro. No

entanto, a hiperativação requer concentrações maiores de bicarbonato, quando comparado

com a capacitação espermática. A hiperativação pode ocorrer independente da capacitação em

espermatozóides de roedores. A procaína pode rapidamente iniciar a hiperativação em

espermatozóides não-capacitados (MUJICA et al., 1994; HO et al., 2002). Desta maneira, a

hiperativação e a capacitação podem ser consideradas eventos independentes, que ocorrem,

em geral, concomitantemente.

A adição de heparina no meio de capacitação in vitro acelera esse processo de

hiperativação. No entanto, a função desses movimentos não direcionais ainda não está muito

clara. Sabe-se que o cálcio extracelular é necessário para manter a hiperatividade, mas ainda

não estão muito entendidos os mecanismos que estimulam o início da motilidade (HO et al.,

2002).

3.1.1.4. Vigor

A força do batimento da cauda do espermatozóide, denominada vigor, declina à medida

que o espermatozóide vai se tornando capacitado. Isso se deve às mudanças ocorridas na

superfície espermática.

Segundo o Manual para exame andrológico e avaliação para sêmen animal, do Colégio

Brasileiro de Reprodução Animal (1988), o vigor é classificado de 0 a 5, de acordo com a

força do batimento flagelar.

A adição de 10

-3

M de nitroprussiato de sódio (SNP, doador de óxido nítrico) no meio

de capacitação espermática bovina diminuiu o vigor após 2 h de incubação, quando

comparado com o controle e demais concentrações (10

-11

, 10

-9

, 10

-7

, 10

-5

M); após 4 h de

incubação apresentou uma maior diminuição do vigor (PAES de CARVALHO, 2002).

3.1.1.5. Integridade da membrana espermática

Durante a capacitação, as membranas dos espermatozóides se tornam fluidificadas,

diminuindo sua integridade da membrana. Segundo DIDION et al. (1989), utilizando a

coloração vital azul de trypan a 0,2%, é possível avaliar a integridade da membrana dos

espermatozóides pela coloração que cada um deles assume. Aqueles com coloração azulada

são os espermatozóides capacitados com perda da integridade da membrana, visto que

permitiram a penetração do corante. Já os que permanecem com sua coloração normal são os

íntegros, sem perda aparente da integridade da membrana, por não permitir a penetração do

corante.

Após três horas de incubação in vitro, em estufa a 38,5

C, com atmosfera umidificada

com 95% de ar e 5% de CO

os espermatozóides bovinos apresentam elevada perda da

integridade da membrana (PARRISH et al., 1988). No entanto, esse tempo pode ser alterado

adicionando-se substâncias ao meio de incubação que aceleram (NO, heparina, L-arg) ou

retardam (L-NAME e L-NA) a capacitação espermática. O L-NAME, apesar de retardar a

capacitação espermática avaliada com o teste de penetração, não altera a motilidade

progressiva, quando comparado com o controle (FRANCAVILLA, 2000).

Ao adicionar L-arg no meio de capacitação, após 45 min, foi observado um aumento da

percentagem de espermatozóides capacitados, principalmente, nas concentrações de 10 a 20

mM (O’FLAHERTY, 2004). No entanto, quando se adicionou L-arg e L-NAME na mesma

concentração e no mesmo meio de capacitação espermática, os efeitos se anulam

(O’FLAHERTY, 2004).

3.1.2. Mitocôndria

Segundo CORREA et al. (1997), as técnicas de análise convencionais do real potencial

de fertilização como concentração, motilidade e morfologia espermática, não têm

possibilitado estimar com acurácia a fertilidade da amostra de sêmen. Deste modo, o

desenvolvimento de técnicas que buscam a avaliação do status funcional das organelas

espermáticas como acrossoma e mitocôndria, permitem uma melhor avaliação da qualidade

espermática (GRAHAM, 2001).

Os espermatozóides são células metabolicamente ativas que realizam tanto a glicólise

anaeróbica como a respiração mitocondrial, mantendo um adequado balanço energético

necessário para o transporte e as demais funções celulares (BARBOSA e ESPER, 1997).

O comprimento da peça intermediária dos espermatozóides tem sido considerado

indicador biológico que pode ser usado como preditor de características importantes em

bovinos (LUKEFAHR e HOHENBOKEN, 1981). A peça intermediária é composta de

mitocôndrias circundando a região proximal do flagelo, sendo possível que um aumento no

seu comprimento poderia estar associado a uma maior taxa de fosforilação oxidativa e assim

com maior atividade metabólica, influenciando na motilidade ou vitalidade da célula, já que

as mitocôndrias são geradoras de energia para a célula (EDDY, 1988).

A perda oxidativa do DNA mitocondrial e da estrutura da membrana podem ser fatores

de grande importância para explicar a diminuição da fertilidade e motilidade do sêmen

criopreservado (CUMMINS et al., 1994). Segundo CAVALCANTE et al. (2005), o número

de espermatozóides bovinos, da raça Alpina, com quase todas as mitocôndrias com bainhas

ativas no sêmen pós-coleta foi maior (84,5%) comparado com sêmen criopreservado (53,5%).

No entanto, quando eles analizaram espermatozóides com a bainha mitocondrial fragmentada,

com segmentos ativos e inativos, o número de espermatozóides pós-coleta foi muito menor

(0,5%) quando comparado com espermatozóides criopreservados (12%).

3.1.3. Citoesqueleto

A capacidade que as células espermáticas possuem de adotar uma variedade de formas e

executar movimentos coordenados e direcionados depende de uma rede complexa de

filamentos de proteína que se estendem por todo o citoplasma. Essa rede é chamada de

citoesqueleto (BERSHADSKY e VASILIEV, 1988). O citoesqueleto é o responsável direto

pelo deslocamento das células sobre um substrato, contração muscular, alterações na forma de

um embrião de vertebrado, além de fornecer a maquinaria necessária para os movimentos

intracelulares, como transporte de organelas de um lugar para outro no citoplasma e

segregação dos cromossomos na mitose (BRAY, 1992).

As diferentes atividades do citoesqueleto dependem de três tipos de filamentos protéicos

– microtúbulos, filamentos de actina e filamentos intermediários (BERSHADSKY e

VASILIEV, 1988). Os microtúbulos são estruturas rígidas, formadas por moléculas de

tubulina, que normalmente apresentam uma das extremidades ancoradas no centrossomo e a

outra livre no citoplasma (AMOS e AMOS, 1991). Em muitas células, os microtubulos são

estruturas altamente dinâmicas que podem aumentar ou diminuir em comprimento pela adição

ou perda de subunidades de tubulina. Os filamentos de actina, presentes em alta concentração

nas células eucariotas, também são estruturas dinâmicas, mas ao contrário dos microtúbulos

que são filamentos isolados, se organizam em feixes e redes (BERSHADSKY e VASILIEV,

1988). As variadas formas e funções da actina nas células eucarióticas dependem de várias

proteínas que se ligam a actina. Já os filamentos intermediários, são estruturas resistentes que

proporcionam estabilidade mecânica às células e tecidos. São polímeros fortes, semelhantes a

cabos, constituídos de polipeptídeo fibroso que resiste ao estiramento mantendo a integridade

celular (AMOS e AMOS, 1991). Os três tipos de filamentos protéicos (microtúbulos,

filamentos de actina e filamentos intermediários) são conectados entre si e suas funções são

coordenadas (KREIS e VALE, 1993).

Na espermatogênese, filamentos de actina têm sido descritos primeiramente no espaço

subacrossomal entre o núcleo e o acrossoma da espermátide de espécies mamíferas (VOGL,

1989). Em espermatozóides humanos as regiões relatadas contendo actina incluem o espaço

acrossomal, região equatorial e pós-acrossomal, e a cauda (CLARKE et al., 1982;

VIRTANEN et al., 1984). Os filamentos de actina na região acrossomal de bovinos,

humanos, suínos, ratos (TALBOT e KLEVE, 1978; YAGI e PARANKO, 1995) sugerem o

possível papel na capacitação espermática e RA (BREITBART et al., 2005).

BRENER et al. (2003) demonstraram que a polimerização de actina ocorre durante a

capacitação espermática de bovinos, ovinos, ratos e humanos, quando a G-actina é

polimerizada formando a F-actina (actina na sua forma ativa). Esse processo revelou-se tempo

dependente no aumento da formação de F-actina, primeiro na peça intermediária e mais tarde,

na cabeça espermática. BREITBART et al. (2005) demonstraram que a polimerização de

actina aumenta significativamente após pequena incubação dos espermatozóides com

ativadores da polimerização (dbcAMP e PMA) os quais ativam a PKA ou PKC. A formação

da F-actina é quase totalmente bloqueada pela incubação dos espermatozóides com inibidores

da tirosina cinase, sugerindo que a fosforilação da tirosina está envolvida na indução da

polimerização de actina da PKA e PKC (BREITBART et al., 2005).

Recente estudo demonstrou que a fosfolipase D (PLD) está envolvida com a

polimerização de actina no espermatozóide durante a capacitação (COHEN, 2004). GARBI

(2000) demonstrou que a PLD1 está localizada na região acrossomal de

espermatozóides

bovinos.

Atualmente não há relatos do papel do NO no citoesqueleto de espermatozóides durante

a capacitação, contudo, vários estudos vêm demonstrando que o NO está envolvido no

controle da motilidade espermática (HARRISON, 1996; CHAMBERLAND et al., 2001;

GARCÍA HERREROS et al., 2005), sugerindo que sua ação seja por meio da mudança da

conformação/ atividade do citoesqueleto, visto que sua ação já foi demonstrada no

citoesqueleto de oócitos.

3.2. Fertilização in vitro (FIV)

Fertilização é a capacidade do espermatozóide fertilizar o oócito. Para que isso ocorra é

necessário que o espermatozóide esteja capacitado e o oócito maturado, seja in vitro ou in

vivo.

Para realização da FIV, os espermatozóides previamente capacitados e os oócitos

maturados, ambos in vitro, são incubados, juntos, por 5 h. São utilizados oócitos de grau um e

dois para realização da FIV em virtude do seu maior potencial para desenvolver-se

(ROSENKRANZ e HOLZMANN, 1997; DOMINKO e FIRST, 1997; ANGUITA et al.,

2007). Segundo ROSENKRANZ e HOLZMANN (1997), os espermatozóides selecionados

por transmigração (capacidade dos espermatozóides atravessarem uma membrana com poros

de 8 µm para alcançar o meio de maturação) obtiveram maior sucesso que os selecionados por

swim-up na fertilização, alcançando após 7 h de cultivo 84,8% e 4,2% de oócitos penetrados,

respectivamente. No entanto, após 3 h de cultivo já é possível observar oócitos penetrados e

segundo SAEKI et al. (1991) e XU e GREVE (1988), a incidência de polispermia na FIV

utilizando espermatozóides criopreservados aumenta com o aumento das horas de cultivo. Já

em outros estudos (ROSENKRANZ et al., 1994; ROSENKRANZ e HOLZMANN, 1995) o

aumento da percentagem de oócitos com polispermia demonstrou ser conseqüência do

tratamento dos espermatozóides com swim-up, visto que quando tratados com transmigração

essa percentagem foi muito menor.

3.3. Teste de penetração em oócitos homólogos

O teste de penetração é um importante método para avaliar a qualidade do

espermatozóide e do oócito. É muito utilizado quando se usa tratamento em ambas as células

para avaliar seus efeitos na funcionalidade dessas células. Segundo ROSENKRANZ e

HOLZMANN (1997), a penetração é classificada em três tipos: Tipo A – a cabeça do

espermatozóide e os cromossomos do oócito são visíveis no ooplasma; Tipo B – já ocorreu a

descondensação dos cromossomos e ambos os pró-nucleos formaram a membrana nuclear,

mas, ainda são pequenos e distantes; Tipo C – pró-nucleos atingiram seu maior tamanho e

estão mais próximos um do outro. Os mesmos autores demonstraram que o tipo A ocorre com

maior incidência (81,8%) quando comparado com o tipo B (18,2%) e o tipo C (0%) após 5 h

de cultivo e após 7 h de cultivo predomina o tipo B (44,8%) em relação ao tipo A (38,8%) e

tipo C (16,4%). No entanto, de acordo com os estudos feitos por SAEKI et al. (1991), o

desenvolvimento dos pró-núcleos leva 4 h para se formarem. HYTTEL et al. (1988)

inseminnaram vacas superovuladas com sêmen criopreservado e lavaram o oviduto em várias

horas para estudar o processo de fertilização. Com isso, eles podem observar que a formação

dos pró-núcleos se dá de uma a 3 h após a penetração dos espermatozóides. ROSENKRANZ

e HOLZMANN (1997) concluíram que os espermatozóides tratados com transmigração para

realizar FIV penetraram mais cedo no oócito quando comparado com tratamentos com swim-

up.

4- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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5- ARTIGO SUBMETIDO PARA REVISTA ANIMAL REPRODUCTION

PAPEL DO OXIDO NITRICO NA QUALIDADE DE ESPERMATOZÓIDES BOVINOS

DURANTE A CAPACITAÇÃO IN VITRO INDUZIDA PELA HEPARINA

Leal, A.C.M.S.; Caldas-Bussiere, M.C.; Paes de Carvalho, C.S.;

Viana, K.S.; M.R.; Quirino, C. R.

Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal, Centro de Ciências e Tecnologias

Agropecuárias, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Parque Califórnia,

Campos dos Goytacazes, RJ, Brazil, 28013-602

Corresponding author: Tel: +55 22 27261665; fax: +55 22 27262003

E-mail address: [email protected]

Resumo

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do óxido nítrico (NO) na

capacitação in vitro de espermatozóides bovinos in natura induzida pela heparina, por meio

da adição de Nω-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME, inibidor da síntese de NO) e L-

arginina (L-arg, precursor da síntese de NO). No experimento 01 foram adicionadas diferentes

concentrações de L-NAME (0,1; 1; 10 mM) e de L-arg (10 mM) ao meio capacitante. A

motilidade e o vigor foram avaliadas de forma subjetiva com microscopia de luz indireta, a

integridade da membrana pela coloração vital com Tripan Blue 2% e a concentração de

nitrato/nitrito (NO

/NO

) pelo método de Griess ao longo de 5 h de capacitação (0,25; 1; 2;

3; 4 e 5 h). A adição de 10 mM de L-NAME inibiu a síntese de NO, a motilidade progressiva,

o vigor e a integridade da membrana espermática (P<0,05) em relação ao controle. Foi

adicionado 0,6 mM de L-arg ao meio capacitante tratado com 10 mM de L-NAME para

avaliar se o efeito inibitório era reversível. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre

10 mM de L-NAME + 0,6 mM de L-arg e o controle em todos os parâmetros avaliados no

experimento 1. A adição de 10 mM de L-arg ao meio de capacitação aumentou a síntese de

NO, a motlidade progressiva, o vigor e a integridade da membrana espermática em relação ao

controle (P<0.05). No experimento 2 foram avaliados a atividade mitocondrial, pelo teste de

MTT (sal brometo de difeniltetrazolium 3 – (4,5 – dimetiltiazol – 2 yl) – 2,5) e a capacitação

espermática, pelo teste de penetração em oócitos homólogos após a adição da concentração de

L-NAME (10 mM), que apresentou efeito inibitório e de L-arg (10 mM), que apresentou

efeito estimulatório no experimento 1. A adição de 10 mM de L-NAME diminuiu a atividade

mitocondrial (40%) e a percentagem de oócitos penetrados (23%) em relação ao controle

(P<0.05). Após a adição de 0,6 mM de L-arg + 10 mM de L-NAME não houve reversão total

da atividade mitocondrial (apenas de 20%), contudo, este fato não alterou os resultados

obtidos em relação ao teste de penetração (foi até mesmo 5% maior que o controle). A adição

de 10 mM de L-arg aumentou a percentagem de oócitos penetrados em relação ao controle

(21%) e ao tratamento com 10 mM de L-NAME + 0,6 mM de L-arg (16%) (P<0.05). Esses

resultados indicam que; 1) o NO está envolvido no controle da motilidade progressiva, do

vigor, da integridade da membrana e atividade mitocondrial espermática ao longo da

capacitação in vitro de espermatozóides bovinos in natura induzida pela heparina via

NO/NOS; 2) concentrações adequadas de NO no meio capacitante podem potencializar a ação

da heparina ou agir de forma independente aumentando o número ou qualidade dos

espermatozóides capacitados; 3) a L-arg/NO modula parcialmente a atividade mitocondrial

durante a capacitação. Outros mecanismos de ação do NO/L-arg durante a capacitação

espermática devem ser avaliados e se a sua adição no meio de capacitação irá aumentar a

produção in vitro de embriões.

Palavras chave: óxido nítrico, espermatozóides, bovino, L-NAME, L-arginina

1- Introdução

O óxido nítrico (NO) é uma espécie de nitrogênio reativo, podendo atuar na sinalização

inter e intracelular, agindo como antioxidante ou radical livre (Dixit e Parvizi, 2001). Ele é

um gás incolor à temperatura e pressão ambiente, biologicamente ativo em quase todas as

células do organismo, e se difunde livremente através das membranas, uma vez que tem um

baixo peso molecular (Lowenstein et al., 1994).

O NO é sintetizado durante a conversão da L-arginina (L-arg) em L-citrulina por

reações oxidativas catalisadas pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), utilizando oxigênio,

fosfato dinucleotídeo adenina nicotinamida (NADPH) (Moncada e Higgs, 1993),

dinucleotídeo adenina flavina (FAD), mononucleotídeo flavina (FMN) (Donnelly et al., 1997)

e cálcio/calmodulina (CaM) como co-fatores. Existem quatro isoformas da NOS: três

constitutivas, dependentes de cálcio (NOS neuronal (nNOS); NOS endotelial (eNOS), NOS

mitocondrial (mtNOS)) e uma induzível (iNOS), cálcio independente (Moncada et al., 1991).

Contudo, alguns trabalhos já relataram a expressão constitutiva para a iNOS em algumas

células (Gath et al.,1996).

A localização e função de algumas isoformas da NOS têm sido descritas em

espermatozóides de várias espécies animais, como bovinos (Meiser e Schulz, 2003;

(O’Flaherty et al., 2004), roedores (Herrero et al., 1994 e 1996; Bredt et al., 1991) e humanos

(O’Bryan et al., 1998; Francavilla et al., 2000). Contudo, a maior parte desses experimentos

têm sido realizados em humanos e animais de laboratório (roedores).

A capacitação espermática e a reação acrossômica (RA) são eventos imprescindíveis

para o sucesso da fertilização do oócito, tanto in vitro quanto in vivo, dependendo da ação do

NO para que ocorram em bovinos (Rodriguez et al., 2004; O’Flaherty et al., 2004), suínos

(Funahashi et al., 2002) e bubalinos (Roy e Atreja, 2007). O aumento de NO no meio de

capacitação induz a RA em bovinos (Rodriguez et al., 2005), humanos (Herrero et al., 2000) e

roedores (Guzman-Grenfell et al., 1999).

Nω-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), inibidor da produção de NO por competir

pelo mesmo sítio de ligação da L-arg, precursora da síntese de NO, na NOS (Moncada et al.,

1991), tem sido utilizado nos estudos sobre o papel do NO na capacitação espermática e RA.

Pouco se tem na literatura sobre a adição do L-NAME e da L-arg no meio de capacitação

espermática bovina. No entanto, trabalhos recentes demonstraram que a adição de L-NAME

no meio cultivo de espermatozóides bovinos criopreservados, inibiu a capacitação após 45

min, contudo, a motilidade não foi avaliada após o tratamento com L-NAME (1, 10 e 100

mM; Rodriguez et al., 2004). O’Flaherty et al. (2004) adicionaram L-arg (10, 20, 30, 40, 50

mM) no meio de cultivo e observaram que a adição de 10 mM melhorou a motilidade, a

capacitação e a reação acrossômica de espermatozóides bovinos após 45 min. Concentrações

mais elevadas inibiram a motilidade e não apresentaram diferença significativa do controle na

integridade da membrana e RA, mas mantiveram o efeito estimulatório na capacitação

espermática. Roy e Atreja (2007) verificaram que a adição de L-NAME (0,5 mM) no meio de

cultivo em bubalinos inibiu a capacitação espermática e a adição de L-arg (15 e 20 mM)

diminuiu a motilidade e a integridade da membrana, mas concentrações menores (5 e 10 mM)

aumentaram a capacitação.

No presente estudo, reuniu-se a avaliação da motilidade, vigor, integridade da

membrana, capacitação espermática, atividade mitocondrial e dosagem de nitrato/nitrito ao

longo de 5 h (Chamberland et al., 2001) de capacitação espermática bovina, com sêmen in

natura, após a adição de 0,1; 1 e 10 mM de L-NAME e 10 mM de L-arg (O’Flaherty et al.,

2004), com o objetivo de contribuir de modo significativo no aprimoramento das biotécnicas

reprodutivas, que ainda apresentam limitações que contribuem para o alto custo do embrião

produzido in vitro em relação ao in natura, obtido por transferência de embriões.

2- Material e métodos

2.1- Meios de cultura e reagentes

O meio-base utilizado na capacitação espermática foi o Tyrodes modificado (Talp-sp)

(Parrish et al., 1988), suplementado com 6 mg/mL de BSA, livre de ácidos graxos, 100 UI/mL

de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina.

O meio de lavagem empregado na capacitação espermática foi o Tyrodes, modificado

por Chamberland (Chamberland et al., 2001).

Todos os reagentes utilizados foram da marca Sigma (St Louis, MO, USA). Os meios

foram esterilizados antes do uso por filtração, com unidades filtrantes estéreis de 0,22 µm, ou

esterilização a vácuo sob pressão com membrana (Millipore), tendo passado por um período

de 30 min a 1 h de pré-incubação em estufa, a 38,5

C, com atmosfera umidificada com 95%

de ar e 5% de CO

para estabilização. Após esse processo, foram armazenados à temperatura

de 4

C. O L-NAME (C

. HCl e PM 269,7) e a L-arginina (C

. HCl e PM

174,2) foram diluídos e colocados no meio de capacitação apenas quando os experimentos se

iniciaram.

2.2- Coleta de sêmen

Foi utilizado sêmen in natura de um touro (Bos indicus) da raça Nelore mantido a pasto

longe de fêmeas. Foi realizada coleta seriada, uma vez por semana, mesmo quando não se

utilizou o sêmen, com o objetivo de manter a qualidade do mesmo.

O sêmen foi coletado com eletroejaculador após prévia massagem manual da glândula

vesicular. Em seguida, foi transportado em no máximo 10 segundos para o laboratório que

está localizado a 30 m do local da coleta, não necessitando de acondicionamento.

2.3- Preparação dos espermatozóides e capacitação espermática

O sêmen foi submetido à centrifugação a 700 g/ 10 min, em um gradiente de Percoll 45

e 90% (Parrish e Eid, 1994), com o objetivo de separar os espermatozóides com maior

integridade da membrana para o uso, nos diferentes tratamentos. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi descartado e o sedimento formado (pellet) foi lavado em 3 mL de meio de

lavagem (Chamberland et al., 2001) e submetido à nova centrifugação a 200 g/ 3 min. Do

sedimento resultante, foi avaliado a motilidade, o vigor e, a seguir, foi calculada a

concentração espermática.

A capacitação espermática in vitro foi induzida em 200 µL de meio de capacitação, Talp

sp, acrescido de 20 µg/mL de heparina, em estufa a 38,5

C com atmosfera umidificada com

95% de ar e 5% de CO

, por um período de 5 h (Parrish et al., 1988). A concentração

espermática utilizada em cada experimento foi ajustada para 50 x 10

espermatozóides/mL.

2.4- Avaliação in vitro da qualidade espermática ao longo da capacitação

2.4.1- Motilidade e vigor

A avaliação da motilidade (percentagem de espermatozóide com motilidade

progressiva) e do vigor das células espermáticas foi realizada de forma subjetiva utilizando-se

microscópio óptico invertido (700X, ZEIZZ), de acordo com o Manual para exame

andrológico e avaliação de sêmen animal, do Colégio de Reprodução Animal (1998).

2.4.2- Integridade da membrana plasmática

Os espermatozóides foram avaliados quanto à viabildade da membrana plasmática,

utilizando-se a coloração vital de azul de trypan 2% (Didion et al., 1989). Foram avaliados

200 espermatozóides, classificando-os como espermatozóide não capacitado (não corados) ou

espermatozóides capacitados (corados em azul).

2.5- Dosagem de nitrato/nitrito (NO

/NO

)

A concentração de NO

/NO

, no meio de capacitação, foi mensurada utilizando-se o

método colorimétrico de Griess (Ricart-Jané et al., 2002), ao longo de 5 h (0,25; 1, 2, 3, 4, 5

h). O reagente de Griess é composto de uma mistura de sulfanilamida 2% e N-(1-naphthyl)

ethylene-diamine 0,2% em água destilada. A primeira reação na amostra ocorre com o nitrito

para formar o sal diazonium, que reage com o segundo reagente para formar a cor púrpura

com um pico de absorbância de 540 nm. Para reduzir o nitrato a nitrito, 40 µl das amostras

foram incubadas com 40 µl de uma mistura contendo 1000 µl da enzima nitrato redutase

oriunda de bactéria (100 µl da enzima (10 UI) diluída em água deionizada + 900 µl de água

deionizada), 1000 µl do co-fator NADPH (5 mg/ml diluído em água deionizada) e 1000 µl de

tampão fosfato de potássio (0,5 M). As amostras foram incubadas a 37

C por 14-16 h.

Posteriormente, 80 µl do reagente de Griess foram adicionados às amostras.

O método foi realizado em placa de 96 poços. Todas as soluções foram protegidas da

luz. Uma curva padrão de nitrito de sódio diluída em Talp-sp contendo valores conhecidos de

nitrito foi realizada, onde o valor mínimo de nitrito foi de 0,5 µM e o máximo de 100 µM.

Com os valores da absorbância foi montado um gráfico de dispersão. A relação entre a

absorbância e concentração de NO

/NO

foi linear (R

=1; P<0,05).

Ao inibir a capacitação com L-NAME, espera-se que ocorra uma diminuição da

produção de NO por estar inibindo a NOS constitutiva, enzima responsável pela conversão da

L-arg em L-citrulina e liberação de NO. No entanto, isso nem sempre ocorre porque ao se

inibir uma enzima, pode haver aumento da atividade de outra enzima para compensá-la. Por

isso, a importância dessa etapa.

2.6- Determinação da atividade mitocondrial

A atividade mitocondrial foi verificada no final de 5 h de capacitação por meio do

método MTT. Não foi realizada cinética devido ao grande número de amostras,

impossibilitando sua avaliação ao mesmo tempo e ao longo das 5 h. Este ensaio é baseado na

habilidade das células vivas com mitocôndria ativa reduzirem o sal brometo de

difeniltetrazolium 3-[4,5-dimetiltrazol-2yl]-2,5 ao produto final azul de formazan

(metiltriazole) (Mosmann, 1983). No final da capacitação, 100 µl de meio de cultivo foram

retirados para realizar as dosagens necessárias, restando apenas 100 µl de meio. Assim, 10 µl

de MTT (5 mg/ml) foram adicionados em cada poço, e em seguida, os espermatozóides

foram incubados na estufa, por 3 h a 37º C. Posteriormente, foram adicionados 110 µl de

isopropanol acidificado com HCl (0,04 N) contendo 10 % de Triton X 100 para solubilizar os

cristais formados por 14-16 h em temperatura ambiente. Após este período, foi realizada a

leitura em um espectrofotômetro (Multiskan EX Primary EIA V 2.1-0), com comprimento de

onda de 570 nm, com subtração do background (670 nm). A relação entre a absorbância e o

número de células foi determinado pela incubação prévia de quantidades conhecidas de

células com MTT, criando assim, uma curva padrão.

2.7- Avaliação da capacitação espermática pelo teste penetração em oócitos homólogos

2.7.1- Seleção e maturação dos oócitos in vitro

Foram selecionados oócitos com graus 1 e 2, de acordo com a classificação de

qualidade relatada por de Loos et al. (1989). Após a seleção, estes foram lavados 3 a 4 vezes

em meio de lavagem (meio de cultura de tecidos - TCM 199 com Hepes, suplementado com

5% de SFB, 10 UI/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina), e posteriormente

transferidos para o meio de maturação (TCM 199, acrescido de 10% de SFB, 5 µg de LH e

0,5 µg de FSH, assim como dos antibióticos citados anteriormente). A maturação foi realizada

em gotas de 100 µL sob óleo mineral em estufa a 38,5

C sob atmosfera de 5% de CO

durante 22 h. Após este período, foi realizada a remoção das células do cumulus pelo método

mecânico de pipetagem.

2.7.2- Fertilização in vitro

Os espermatozóides previamente capacitados foram lavados em Talp-sp + BSA para

remoção dos tratamentos. Foi fixada a concentração de 1,6 x 10

espermatozóides/mL.

Estes foram co-incubados, durante 5 h (Rosenkranz e Holzmann, 1997) a 38,5

C com

atmosfera umidificada com 95% de ar e 5% de CO

, juntamente com os oócitos em meio

Talp, acrescido de 6 mg/mL de BSA livre de ácidos graxos, 2 mM de penicilamina, 1 mM de

hipotaurina, 250 mM de epinefrina, 100 UI/mL de penicilina e 100 µg de estreptomicina

(Talp-fecundação), segundo Parrish et al. (1988).

2.7.3- Avaliação da percentagem de penetração

Os oócitos, após o período de 5 h, foram montados entre lâmina e lamínula, fixados em

ácido acético: etanol (1:3), por 24 a 72 h e corados com orceína a 2% em ácido acético 40%.

A taxa de penetração espermática foi determinada de acordo com Rosenkranz e

Holzmann (1997), classificados em não penetrados ou penetrados, onde se observou a cabeça

do espermatozóide; descondensação dos cromossomos ou formação de pró-nucleo masculino

e feminino. O controle consistiu de espermatozóides capacitados em meio de capacitação com

heparina. Esse teste avalia indiretamente a capacitação espermática e reação acrossômica

(Brackett et al., 1982), pois somente espermatozóides capacitados se ligam ao oócito, sofrem

reação acrossômica e penetram através da sua membrana plasmática.

2.8- Experimentos

2.8.1- Experimento I: Cinética da ação do L-NAME e L-arg durante a capacitação

Foi avaliado o efeito da adição de diferentes concentrações de L-NAME (0,1; 1 e 10

mM) após ter sido realizado experimento dose resposta, e 10 mM de L-arg (O’Flaherty et al.,

2004) no meio de capacitação espermática in vitro induzida pela heparina (T-H) nos tempos

0,25; 1; 2; 3; 4 e 5 h. O controle consistiu de espermatozóides cultivados em T+H e com 10

mM de D-NAME , enantiômero do L-NAME. Para avaliar se os efeitos observados após o

tratamento com L-NAME foram devido à inibição da síntese de NO, adicionou-se 0,6 mM de

L-arg (Francavilla et al., 2000) no tratamento com a concentração que alterou os parâmetros

acima avaliados.

Os seguintes parâmetros foram analisados: motilidade (%), vigor (0 – 5) e integridade da

membrana (%) dos espermatozóides. Em todos os tempos avaliados, o meio de capacitação

foi coletado e estocado a -20

C para posterior dosagem de nitrato/nitrito (NO

/NO

). O

experimento foi concluído com 6 repetições.

2.8.2- Experimento II: Papel do NO na capacitação espermática in vitro e atividade

mitocondrial

A atividade mitocondrial e a capacitação espermática foram avaliadas após 5 h e ao

longo de 5 h de cultivo, somente com a concentração de L-NAME (10 mM) e de L-arg (10

mM), que apresentaram resultados significativamente diferentes do controle no experimento

1. O controle consistiu de T+H, 10 mM de D-NAME e 0,01 M de L-NAME + 0,6 mM de L-

arg. Foram utilizados 20 oócitos na FIV em cada tratamento e o experimento foi repetido 6

vezes.

2.9- Análise estatística

No experimento 01, os resultados referentes à adição de diferentes concentrações de L-

NAME e L-arg na motilidade, no vigor, na integridade da membrana espermática e na

concentração de nitrato/nitrito foram avaliados em função da concentração e do tempo.

No experimento 02, a atividade mitocondrial e a capacitação de espermatozóides

(percentagem de oócitos penetrados) foram avaliadas em função da concentração (10 mM de

L-NAME e 10 mM de L-arg).

Os dados foram analisados no programa SAS (Statistical Analysis System, 1996) e

submetidos à análise de variância (PROC GLM) para verificar os efeitos de concentração e do

tempo sobre as características estudadas e as médias comparadas pelo teste Tukey, em nível

de 5% de probabilidade.

3- Resultados

3.1- Experimento I: Cinética da ação do L-NAME e L-arg durante a capacitação

3.1.1- Avaliação da motilidade

A análise de variância mostrou que houve interação entre o tratamento e o tempo

quando a motilidade espermática foi analisada durante a capacitação ao longo de 5 h

(P<0,05), ou seja, houve diferença significativa de cada tratamento ao longo do tempo e dos

tratamentos entre si no mesmo tempo (Tabela 1).

A adição de 10 mM de L-NAME diminuiu a percentagem de espermatozóides bovinos

com motilidade progressiva durante a capacitação in vitro a partir de 3 h, quando comparada

com o controle e as demais concentrações (Tabela 1). A adição de 0,6 mM L-arg à 10 mM L-

NAME no meio de capacitação, reverteu o efeito inibitório em todos os tempos. A adição de

10 mM de L-arg no meio de capacitação aumentou a motilidade progressiva comparado com

o controle e demais concentrações a partir de 4 h (Tabela 1).

3.1.2- Avaliação do vigor

A análise de variância mostrou que não houve interação do tratamento e do tempo

(P<0,05), quando o vigor foi analisado nos espermatozóides durante a capacitação. Logo,

pode-se dizer que houve diferença (P<0,05) dos tratamentos e dos tempos em particular (Fig.

03, painel a).

A adição de 10 mM de L-NAME diminuiu o vigor de espermatozóides bovinos durante

a capacitação in vitro, quando comparados com o controle. No entanto, essa concentração não

diferiu das outras duas concentrações de L-NAME. A adição de 0,6 mM L-arg a 10 mM L-

NAME no meio de capacitação reverteu o efeito inibitório do 10 mM L-NAME. A adição de

10 mM L-arg no meio de capacitação melhorou o vigor dos espermatozóides bovinos,

comparado com o controle e demais concentrações (Fig. 03 painel a).

3.1.3- Avaliação da integridade da membrana espermática

A análise de variância mostrou que houve interação do tratamento e do tempo quando a

integridade da membrana espermática foi analisada durante a capacitação ao longo de 5 h

(P<0,05), ou seja, houve diferença (P<0,05) de cada tratamento ao longo do tempo e dos

tratamentos entre si no mesmo tempo (Tabela 2).

A adição de 10 mM de L-NAME diminuiu a integridade da membrana durante a

capacitação a partir de 3 h, quando comparada com os controles e as demais concentrações. A

adição de 0,6 mM L-arg à 10 mM de L-NAME no meio de capacitação reverteu o efeito

inibitório do 10 mM L-NAME, apresentando valores mais elevados do que o controle a partir

de 1 h. A adição de 10 mM de L-arg aumentou a integridade da membrana comparado com o

controle e demais concentrações a partir de 0,25 h (Tabela 2).

3.1.4- Concentração NO

/NO

no meio de capacitação

A análise de variância mostrou que houve efeito significativo (P<0,05) para os

tratamentos ao longo da capacitação (5 h) (Fig. 03, painel b).

Houve um efeito dose resposta na concentração de nitrato/nitrito após a adição de

diferentes concentrações de L-NAME, quando comparados com o controle e seu enantiômero.

A adição de 0,6 mM de L-arg a 10 mM L-NAME, no meio de capacitação, reverteu o efeito

inibitório do L-NAME na síntese de NO, apresentando concentrações mais elevadas (5%) do

que o controle. A adição de 10 mM de L-arg aumentou (21%) a concentração de NO

/NO

quando comparado com o controle (Fig. 03, painel b).

3.2- Experimento II: Papel do NO na atividade mitocondrial capacitação espermática in vitro

3.2.1- Atividade mitocondrial

A análise de variância mostrou que houve efeito significativo (P<0,05) para os

tratamentos quando o MTT foi avaliado após a capacitação in vitro (5 h) (Fig. 04, painel a).

Espermatozóides tratados com 10 mM de L-NAME apresentaram uma menor

absorbância (40%) quando comparado com o controle e D-NAME. A associação de 0,6 mM

L-arg com 10 mM L-NAME no meio de capacitação, apresentou maior absorbância (20%) do

que os espermatozóides tratados com 10 mM de L-NAME, mas não foi suficiente para

reverter o efeito inibitório (Fig. 04, painel a). A adiçaõ de 10 mM de L-arg aumentou a

atividade mitocondrial (11%) quando comparado com os resultados obtidos no controle

(P<0,05).

3.2.2- Capacitação espermática

A análise de variância mostrou que houve efeito significativo (P<0,05) para os

tratamentos quando o papel do NO foi avaliado após a capacitação in vitro (5 h).

Oócitos co-incubados com espermatozóides tratados com 10 mM de L-NAME

apresentaram uma menor percentagem de penetração (23%) quando comparados com os

observados no controle e no seu enantiômero. A adição de 0,6 mM de L-arg reverteu o efeito

inibitório da adição do L-NAME (10 mM) (Fig. 04, painel b).

Oócitos co-incubados com espermatozóides tratados com 10 mM de L-arg apresentaram

uma percentagem maior de penetração (21%) do que a observada no controle (P<0,05)

(Figura 4, painel b).

4- Discussão

O presente estudo demonstrou que a inibição da síntese de NO pelo L-NAME (10 mM)

no meio de cultivo capacitante de espermatozóides bovinos diminuiu a motilidade, vigor,

integridade da membrana, atividade mitocondrial e capacitação in natura de espermatozóides

bovinos induzida pela heparina a partir de 3 h.

A diminuição da motilidade após adição de L-NAME foi descrita em espermatozóides

de hamster (Kameshwari et al., 2003). Contudo, Francavilla et al. (2000) não observaram

nenhuma alteração na motilidade de espermatozóides humanos ao adicionarem diferentes

concentrações de L-NAME (0,1; 0,6 e 1,2 mM) no meio de capacitação após 30 min de

incubação. Rodriguez et al. (2004) também não observaram em bovinos nenhuma alteração ao

adicionarem L-NAME (0,001, 0,01, 0,1 e 0,5 mM) após 45 min de cultivo. No entanto, o

tempo e a concentração podem ter sido insuficientes para a ação do L-NAME, visto que a

maior percentagem de capacitação espermática em humanos ocorre com 1 h (Cohen-Dayag et

al., 1995) e em bovinos com 5 h de incubação (Chamberland et al., 2001). No presente

trabalho, observou-se a inibição da motilidade e vigor após 3 h de incubação utilizando-se

uma concentração mais elevada de L-NAME (10 mM) do que nos trabalhos acima citados.

Não há relato na literatura a respeito do vigor após a adição de L-NAME no meio de

capacitação.

A diminuição da integridade da membrana após adição de inibidores da síntese de NO

tem sido descrita em humanos (Rosselli et al., 1995). Os espermatozóides são protegidos por

substâncias antioxidantes e enzimas antioxidantes presentes no plasma e no próprio

espermatozóide (Kim e Parthasarathy, 1998). Quando cultivados in vitro, tornam-se

suscetíveis aos danos oxidativos, devido ao desequilíbrio no status redox (Kim e

Parthasarathy, 1998). A via NOS/NO apresenta uma importante ação antioxidante que previne

a célula da peroxidação lipídica, ou seja, reação de radicais livres com lipídios da membrana

celular (Santanam et al., 1998; Srivastava et al., 2006), resultando na destruição/modificação

de numerosas moléculas lipídicas que podem resultar na perda da integridade da membrana.

O outro mecanismo pelo qual o NO pode proteger o espermatozóide como antioxidante

é pelo controle da transcrição da γ-glutamil-cysteina sintase, enzima taxa-limitante para a

síntese da glutationa sintase (GSH), um dos mais importantes antioxidantes encontrados nas

células (Kuo et al., 1998). Componentes do ciclo da glutationa foram descritos no plasma

seminal e em espermatozóides humanonss (Li, 1975), sendo observada uma correlação entre a

baixa concentração da glutationa e espermatozóides com baixo potencial fecundante

(Ochsendorf et al., 1998). Os resultados sugerem que a diminuição da concentração de NO

após a adição de L-NAME pode levar a uma diminuição da síntese de glutationa, tornando o

espermatozóide suscetível a peroxidação lipídica, com uma perda da integridade da

membrana espermática. Foi observada diminuição da integridade da membrana após 3 h de

incubação com a concentração 10 mM L-NAME. Em bovinos, esse é o primeiro relato que

demonstra que a adição de L-NAME no meio de capacitação espermática diminui a

integridade da membrana.

O L-NAME é um análogo da L-arginina que inibe a produção de NO (Moncada et al.,

1991; Roy e Atreja, 2007) por competir pelo mesmo sítio de ligação da L-arg (Rosselli et al.,

1998). Poucos pesquisadores verificam a concentração de NO após o tratamento tanto com

inibidores, quanto com precursores ou doadores de NO no estudo do seu papel na fisiologia

espermática. Nesse trabalho, a adição de L-NAME apresentou um efeito dose-resposta na

diminuição da síntese de NO, demonstrando que seu efeito no controle da motilidade, vigor,

integridade da membrana e capacitação de espermatozóides bovinos foi devido à diminuição

na síntese de NO. Esta hipótese é reforçada pelo fato de que a adição de seu enantiômero (D-

NAME) não apresentou efeito em nenhum dos parâmetros avaliados, além do fato de que a

adição de 0,6 mM L-arg reverteu todos os efeitos inibitórios promovidos pelo L-NAME.

A diminuição da concentração de NO celular afeta a atividade mitocondrial (Brookes et

al., 2003) por causar desequilíbrio do balanço de NO/O

. Existe uma competição entre ambos

pelo centro de reação da enzima citocromo oxidase (Boveris et al., 1999). Alta concentração

de NO ou muito baixa, diminuem a concentração de O

(Brookes et al., 2003) na mitocôndria,

sugerindo uma menor produção de ATP pela cadeia respiratória (Brookes et al., 2003),

podendo levar a uma alteração não apenas na motilidade e vigor, mas também em reações

bioquímicas que resultem na diminuição do potencial fecundante do espermatozóide bovino.

Para o espermatozóide se ligar e fertilizar o oócito, ele primeiro precisa sofrer uma série

de mudanças na membrana e intracelulares referidas como capacitação (Chang, 1951; Graham

e Mocé, 2005). Para o espermatozóide se ligar à zona pelúcida ele deve ter o acrossoma

intacto e ter sido capacitado adequadamente para expor suas proteínas de ligação com a zona

pelúcida. Assim, a habilidade dos espermatozóides de se ligar ao oócito (Zhang et al., 1998)

tem sido correlacionada com o potencial fecundante do macho. Logo, a avaliação do papel do

NO na capacitação espermática in vitro foi realizada pelo teste de penetração após a adição de

10 mM L-NAME. Houve uma diminuição na taxa de penetração dos espermatozóides bovinos

(23%) em oócitos homólogos, sugerindo que esta tenha ocorrido em função da diminuição da

síntese de NO. Estes resultados corroboram com os observados por Francavilla et al. (2000)

em humanos, que demonstraram uma diminuição na percentagem de penetração de

espermatozóides tratados com L-NAME em hemi-zonas após 5 h de cultivo, porém com

concentrações menores (0,1; 0,6 e 1,2 mM). Rodriguez et al. (2004) demonstraram em

bovinos que a capacitação foi inibida com a adição de L-NAME (0,001, 0,01 e 0,1 mM) no

meio de cultivo, avaliados pelo teste de clortetraciclina (CTC) ao longo de 45 min.

Recentemente, foi demonstrado a inibição da capacitação também em bubalinos avaliado pela

indução da reação acrossômica após 6 h de capacitação ao se adicionar 0,5 mM L-NAME

(Roy e Atreja, 2007). Essas diferenças entre concentrações que inibem a capacitacão entre

esses trabalhos podem ser explicadas pelo fato de terem usado sêmen in natura ao invés de

criopreservado e de haverem diferenças fisiológicas entre as espécies bovina (Rodriguez et

al., 2004), humana (Francavilla et al., 2000) e bubalina (Roy e Atreja, 2007) quanto à

sensibilidade à diminuição da concentração de NO no meio de cultivo, além do tempo de

avaliação.

No presente trabalho, observou-se que houve uma diminuição da atividade mitocondrial

(40%) do espermatozóide após 5 h de cultivo em meio capacitante com 10 mM L-NAME.

Entretanto, após a adição de 0,6 mM L-arg a 10 mM L-NAME houve reversão apenas de 20%

da atividade mitocondrial, diferente da reversão total observada nos outros parâmetros

avaliados. Estes dados demonstram que a inibição da síntese de NO pela adição de L-NAME

promove um bloqueio da atividade mitocondrial parcialmente reversível após a adição de 0,6

mM L-arg, contudon, a retomada parcial observada foi suficiente para o restabelecimento da

motilidade, vigor, integridade da membrana, concentração de NO e capacitação e/ou que o

NO apresenta outros mecanismos de ação adicionais à atividade mitocondrial. Ainda assim,

não se pode descartar a hipótese de que a retomada parcial da atividade mitocondrial possa ter

reflexo no prosseguimento do desenvolvimento do embrião.

Outro possível mecanismo de ação do NO durante a capacitação é na dinâmica do

citoesqueleto (Brener et al., 2003; Breitbart et al., 2005). Brener et al. (2003) demonstraram

que a capacitação in vitro de espermatozóides de bovino, ovino, ratos e humanos foi

acompanhada do aumento da polimerização de actina tempo-dependente, formando a F-actina

primeiro na peça intermediária e em seguida, na cabeça do espermatozóide. Assim, a

diminuição da concentração de NO após o tratamento com 10 mM L-NAME pode ter

ocasionado impedimento da polimerização dos filamentos de actina, que ocorre durante este

processo no acrossoma (Brener et al., 2003; Cohen, 2004), sugerindo também diminuição da

motilidade e vigor, visto que este filamento está presente também na cauda do espermatozóide

estando envolvido na motilidade espermática (Virtanem et al., 1984).

A adição de 10 mM L-arg melhorou todos os parâmetros de qualidade espermática

avaliados nesse trabalho: motilidade, vigor, integridade da membrana, atividade mitocondrial

e capacitação induzida pela heparina de espermatozóides bovinos.

A melhora da motilidade após a adição L-arg foi descrita em espermatozóides humanos

(Keller e Polakoski, 1975; Méndez e Herfrández, 1993) e tem sido utilizada com êxito em

tratamentos de alguns problemas de fertilidade (Méndez e Herfrández, 1993). Nesse trabalho,

o aumento da motilidade e integridade da membrana observado após a adição de 10 mM L-

arg pode ser devido ao fato deste aminoácido servir como substrato para a síntese de NO, ao

invés de utilizá-lo da sua própria reserva, preservando a sua constituição. Roy e Atreja (2007)

e O’Flaherty et al. (2004) não observaram diferença significativa na motilidade e na

integridade da membrana após a adição de L-arg (10 mM) no meio capacitante de

espermatozóides bubalinos e bovinos cultivados por 6 h e 45’, respectivamente. Essa

diferença pode ser explicada pelo fato de haver em bubalinos, L-arg suficiente para que ocorra

a capacitação (Roy e Atreja, 2007) e pelo fato do curto tempo de cultivo utilizado por

O’Flaherty et al. (2004) em bovinos, visto que neste experimento demonstra-se que só a partir

de 4 h ocorreu aumento significativo tanto na motilidade como na integridade da membrana.

Não há nenhum trabalho na literatura a respeito do vigor após a adição de L-arg no meio de

capacitação espermática.

Neste experimento avaliou-se o efeito da adição de 10 mM de L-arg na capacitação pelo

teste de penetração. O aumento da concentração de NO e da percentagem de oócitos

penetrados com espermatozóides tratados (21%), sugerem que a L-arg tenha promovido um

aumento da percentagem de espermatozóides capacitados aumentando a biosíntese de NO,

seja pelo aumento do metabolismo glicolítico ou diminuição da peroxidação lipídica do

espermatozóide (Srivastava et al., 2006). Estes resultados corroboram com os observados por

Funahashi et al. (2002) (suínos), Roy e Atreja. (2007) (bubalinos) e O’Flaherty et al. (2004)

(bovinos), que demonstraram um aumento da taxa de capacitação após adição de 2 mmol; 5 e

10 mM e 10 a 30 mM L-arg no meio de cultivo, respectivamente. Essas diferenças das

concentrações que começam estimular a capacitação devem ser devido a diferenças

fisiológicas entre as espécies animais e o tempo de avaliação da capacitação in vitro. Além

disso, nesse trabalho incubou-se os espermatozóides com L-arg e heparina, enquanto os

trabalhos citados utilizaram apenas L-arg no meio capacitante, sugerindo que a L-arg pode ser

usada juntamente com a heparina potencializando a sua ação capacitante em espermatozóides

bovinos.

Nesse estudo, observou-se um aumento da integridade da membrana após a adição de 10

mM L-arg a partir dos primeiros 15 min em relação ao controle. Este aumento se manteve ao

longo das 5 h de cultivo, não havendo diferença significativa do controle aos 0,25 h. Apesar

do fato de que durante a capacitação ocorreram alterações na membrana

plasmática/acrossomal do espermatozóide (Didion et al., 1989), a manutenção da integridade

da membrana ao longo da capacitação observada no presente experimento não está

relacionada com diminuição na capacitação, pois houve um aumento de 21% de oócitos

penetrados com espermatozóides tratados com 10 mM L-arg. Isso pode ser explicado

juntamente com a ação protetora do NO, descrita quando avaliou-se a adição do L-NAME,

por Srivastava et al. (2006) ao demonstrarem que a adição de L-arg no meio de capacitação

aumenta a proteção dos espermatozóides ovinos contra os danos da peroxidação lipídica in

vitro preservando sua integridade da membrana.

Além de ter havido um aumento na motilidade, vigor, integridade da membrana e

capacitação após a adição de 10 mM L-arg, houve também uma aumento na atividade

mitocondrial dos espermatozóides (11%) após 5 h de cultivo com meio capacitante (Talp +

heparina) em relação ao controle. Esses dados sustentam a hipótese juntamente com os dados

observados após a adição de 10 mM L-NAME de que um dos mecanismos de ação do NO na

capacitação espermática seja atuando no controle da respiração mitocondrial (Boveris et al.,

1999; (Brookes et al., 2003).

Esses resultados indicam que; 1) o NO está envolvido no controle da motilidade

progressiva, vigor, integridade da membrana e atividade mitocondrial espermática ao longo da

capacitação de espermatozóides bovinos in natura induzida pela heparina via NOS/NO; 2)

concentrações adequadas de NO no meio capacitante podem potencializar a ação da heparina

ou agir de forma independente aumentando o número ou qualidade dos espermatozóides

capacitados; 3) a L-arg/NO modula parcialmente a atividade mitocondrial durante a

capacitação. Outros mecanismos de ação do L-arg/NO durante a capacitação espermática

devem ser avaliados para verificar se o aumento da motilidade, vigor, integridade da

membrana e atividade mitocondrial, promovida pela adição da L-arg estão associados com o

potencial fecundante do espermatozóide e conseqüentemente, com o aumento da produção in

vitro de embriões bovinos.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Márcia Resende Faes, Janaína Barcelos Porto Ferreira-Berbari, João

Gomes Siqueira e Fausto Paes de Carvalho pelo suporte técnico e a Prof

Elena Lassovnskaya

pela ajuda com seu laboratório (LRBCT-CBB-UENF). Este trabalho foi financiado pela

CAPES e FAPERJ. A.C. M.S. Leal foi bolsista da CAPES.

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Tabela 01- Efeito da adição de diferentes concentrações de L-NAME, D-NAME e L-arg na motilidade (%) ao longo da

capacitação in vitro de espermatozóides bovinos (5 h).

Médias seguidas de diferentes letras (A-C) na mesma coluna mostram diferenças (P<0,05) dentro de cada tempo entre as diferentes concentrações.

Médias seguidas de diferentes letras na mesma linha (a-d) mostram diferenças (P<0,05) dentro de cada concentração nos diferentes tempos.

Dados são apresentados como média ± DP de seis replicatas.

Tempo (horas)

Concentração (%)

0.25 1 2 3 4 5

Controle

80,0±0,0

76,6±5,2

Aab

73,3±5,2

ABCb

65,0±5,5

Abc

55,0±5,5

36,6±8,2

mM D-NAME

80,0±0,0

73,3±5,2

70,0±0,0

BCbc

66,6±5,5

55,0±5,5

38,3±7,5

0,1

mM L-NAME

80,0±0,0

78,3±4,1

Aab

73,3±5,1

ABCbc

66,6±5,2

50,0±6,3

BCd

35,0±4,3

1 mM L-NAME

80,0±0,0

78,3±4,1

75,0±5,4

ABCab

66,6±5,2

50,0±6,3

BCc

33,3±4,1

10 mM L-NAME

80,0±0,0

75,0±5,5

68,3±4,1

55,0±8,4

41,6±9,8

25,0±2,5

10 mM L-NAME +

0,6 mM L-arginina

80,0±0,0

78,3±4,1

76,6±5,2

ABa

70,0±0,0

60,0±1,0

40,0±5,4

10 mM L-arginina 80,0±0,0

80,0±0,0

73,3±5,1

66,6±5,1

Abc

60,0±6,3

Tabela 02- Efeito da adição de diferentes concentrações de L-NAME, D-NAME e L-arg na integridade da membrana ao

longo da capacitação in vitro de espermatozóides bovinos (5 h).

Médias seguidas de diferentes letras (A-D) na mesma coluna mostram diferenças (P<0,05) dentro de cada tempo entre as diferentes concentrações.

Médias seguidas de diferentes letras na mesma linha (a-e) mostram diferenças (P<0,05) dentro de cada concentração nos diferentes tempos.

Dados são apresentados como média ± DP de seis replicatas.

Tempo (horas)

Concentração (%)

0.25 1 2 3 4 5

Controle

76,3±8,6

BCa

70,5±3,2

57,0±6,3

48,3±5,3

38,6±3,6

35,5±6,1

mM D-NAME

75,6±4,8

BCa

72,3±3,5

58,5±3,2

50,8±5,3

40,5±3,4

32,6±5,5

0,1

mM L-NAME

70,8±9,1

67,6±8,8

Bab

55,5±8,1

51,1±8,9

Cbc

39,3±3,7

33,4±5,3

1 mM L-NAME

73,5±11,4

BCa

64,6±10,6

Bab

58,3±11,2

Cbc

51,5±9,7

Ccd

39,8±4,3

Cde

33,9±5,3

10 mM L-NAME

73,2±9,3

BCa

62,1±7,9

54,5±9,2

Cab

44,3±9,2

Dbc

30,3±4,6

Dcd

22,6±3,1

10 mM L-NAME +

0,6 mM L-arginina

85,3±3,0

ABa

62,3±1,6

74,5±3,1

64,6±4,9

Bcd

54,6±4,7

41,6±2,8

10 mM L-arginina 88,2±2,5

88,3±1,8

85,8±2,1

Aab

83,8±2,2

81,0±3,5

77,8±2,2

Vigor

bc cd

Nitrato/ Nitrito (micro M)

Fig. 03. (a) Vigor de espermatozóides bovinos tratados com diferentes concentrações de L-NAME

e L-arg, durante a capacitação in vitro (5 h) e (b) concentração de nitrato/nitrito no meio

de capacitação in vitro de espermatozóides bovinos tratados com diferentes

concentrações de L-NAME e L-arg ao longo da capacitação (5 h). Diferentes letras sobre

barras indicam diferenças (P<0,05), n=6.

D-NAME (mM)

__ __

__ __ __

L-NAME (mM)

__ __

0,1 1 10

L-arginina (mM)

-- -- 0,6 10

(a)

D-NAME (mM)

__ __ __ __ __

L-NAME (mM)

__ __

0,1 1 10

L-arginina (mM)

-- -- 0,6 10

(b)

200

400

600

800

1000

Absorbância (nm)

100

Oócitos penetrados (%)

Fig. 04. (a) Atividade mitocondrial de espermatozóides bovinos tratados com diferentes

concentrações de L-arg e L-NAME após a capacitação in vitro (5 h) e (b)

Percentagem de oócitos penetrados resultantes da FIV com espermatozóides

capacitados previamente (5 h) com diferentes concentrações de L-NAME e L-arg.

Diferentes letras sobre as barras indicam diferenças (P<0,05), n=6.

D-NAME (mM)

__ __

L-NAME (mM)

__ __

10 10

L-arginina (mM)

0,6 10

D-NAME (mM)

__ __

L-NAME (mM)

__ __

10 10

L-arginina (mM)

0,6 10

(a)

(b)

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