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ALEXANDRA DOS ANJOS CASSADO
Papel da flagelina e de lipopolissacarídeos
bacterianos na ativação de populações
heterogêneas de macrófagos
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de mestre
em Cências (Imunologia).
São Paulo
2007
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ALEXANDRA DOS ANJOS CASSADO
Papel da flagelina e de lipopolissacarídeos
bacterianos na ativação de populações
heterogêneas de macrófagos
Orientadora: Drª. Karina Ramalho Bortoluci Bastos
Área de concentração: Imunologia
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de mestre em
Cências (Imunologia).
São Paulo
2007
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FOLHA DE APROVAÇÃO
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CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA
4
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DEDICATÓRIA
.
Dedico o presente trabalho aos meus PAIS, que tiveram a difícil tarefa de
educar, ensinar o que é amor, coragem e compreensão, além de estarem
sempre prontos para enfrentar comigo cada etapa da minha vida, auxiliar na
escolha do melhor caminho a ser seguido nos momentos de dúvidas e
oferecer um consolo e uma segurança que não é encontrado em qualquer
outro lugar nas ocasiões difíceis.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço às pessoas que ajudaram diretamente na realização deste trabalho e
àquelas que, sem o saberem, muito contribuíram para a sua concretude.
À minha família, companheiros de todas as horas que, mesmo à distância,
foram essenciais para minha formação. Meus agradecimentos por terem se privado
da minha companhia, devido aos meus estudos, concedendo-me a oportunidade de
me realizar ainda mais.
Ao meu querido Lucas, que estava comigo nos momentos mais felizes e
mais difíceis, sempre me incentivando e me apoiando. Muito obrigada por todo seu
amor, carinho, atenção e companheirismo...
À minha orientadora Karina Bastos, que transmitiu conhecimentos e
experiências essenciais para minha formação e para meu crescimento intelectual.
Meus agradecimentos por ter acreditado, confiado, ensinado e ter sido minha amiga
ou até mesmo mãe por todo esse tempo...
À Carininha, que dividiu comigo todos os momentos durante essa etapa da
minha vida, tornando-os engraçados e agradáveis. Meus agradecimentos pelo
carinho e atenção, além do grande auxílio durante os experimentos...
Ao Momtchilo Russo, que me recebeu em seu laboratório. Obrigada pelas
valiosas discussões imunológicas que muito contribuíram para minha formação...
Aos companheiros de trabalho Juciane, Lucas, Karina Carla, Esther,
Érica, Juliana, Lili, David e Renato. Obrigada pela amizade e agradáveis dias que
passamos juntos durante esse período...
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Ao grupo da Profª Sonia Jancar, que estavam sempre dispostos a ajudar.
Muito obrigada pelos reagentes cedidos e pelas conversas de corredores que em
muitos momentos me fizeram despertar para as coisas realmente importantes...
Aos colaboradores Profº Luis Carlos Ferreira e Liliana Massis por terem
cedido a flagelina purificada... Lili, obrigada pelas inúmeras purificações...
Aos componentes da Banca de Qualificação Maria Regina D’Império Lima,
Sonia Jancar e Nancy Starobinas, que muito contribuíram para a finalização dessa
dissertação...
Àqueles que por ventura deixei de mencionar e que contribuíram para a
realização desse trabalho.
A todos vocês, o meu muito obrigada!!!
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O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
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Resumo
CASSADO A.A. Papel da flagelina e de lipopolissacarídeos bacterianos na
ativação de populações heterogêneas de macrófagos. 2007.78f. Dissertação
(Mestrado em Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2007.
Os macrófagos (MO) são populações heterogêneas de células residentes em
diversos tecidos, onde iniciam a resposta imune através do reconhecimento de
padrões moleculares de patógenos. Para avaliar a modulação funcional dessas
populações, MO peritoneais (PM) e alveolares (AM), com perfil M1 e M2, foram
ativados in vivo por flagelina (FliCi) e lipopolissacarídeos bacterianos (LPS). Esse
trabalho mostra que o microambiente parece influenciar a resposta diferencial das
populações de MO, uma vez que a expressão de MHCII, CD80, CD86 e CD40 e
produção de NO por PM são mais intensamente modulados por FliCi, enquanto os
AM são mais sensíveis ao LPS. Porém, dentro da população de PM, encontramos
duas subpopulações distintas, nomeadas F4/80
hi
e F4/80
lo
. A população F4/80
hi
parece adquirir um perfil M1 após estimulo com FliCi, com alta expressão de iNOS,
enquanto a população F4/80
lo
apresenta um perfil M2, com maior expressão basal
de mTGF-β, indicando que a heterogeneidade dos MO também pode estar expressa
no mesmo microambiente.
Palavras-chave: Macrófagos, Inflamação, Receptores do tipo Toll, Flagelina,
Lipopolissacarídeo, Heterogeneidade.
9
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ABSTRACT
CASSADO A.A. The role of bacterial flagellin and lipopolysaccharide on
the activation of heterogeneous macrophage subpopulations. 2007.78f. Máster
Thesis (Immunology) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2007.
Macrophages (MO) are a heterogeneous cell population that resides in distinct
tissues, where they trigger the immune response through the recognition of
pathogen-associated molecular patterns. To evaluate the functional modulation of
these populations, peritoneal (PM) and alveolar (AM) MO, from M1 and M2 profile,
were in vivo activated by flagellin (FliCi) and bacterial lipopolysaccharide (LPS). In
this study we show that microenvironment seems to influence the differential
responses of MO populations, since MHCII, CD80, CD86 e CD40 expression and NO
production by PM are more intensely modulated by FliCi whereas AM are more
sensitive to LPS. However, we found two distinct subpopulations within PM, named
F4/80
hi
e F4/80
lo
. F4/80
hi
cells show a M1 profile after FliCi stimulation, with high
iNOS expression, and F4/80
lo
population presents a M2 profile, with higher basal
expression of mTGF-β, indicating that the MO heterogeneity can also be finding in
the same microenvironment.
Key-words: Macrophages, Inflamation, Toll Like Receptors, Flagellin,
Lipopolysaccharide, Heterogeneity.
10
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LISTA DE ABREVIATURAS
Apaf: “Apoptotic protease activating factor” (Fator de ativação de protease
apoptótica)
BAL: “Bronchoalveolar lavage” (Lavado bronqueoalveolar)
CAA: “Adherents alveolar cells” (Células alveolares aderentes)
CPA: “Adherents peritoneal cells“ (Células peritoneais aderentes)
FliCi: “Flagellin” (Flagelina)
GPI: “Phosphatidylinositol” (Glicofosfatidil inositol)
HO-1: “Heme-oxygenase-1” (Heme-oxigenase-1)
IC: “Immune complex” (Imunocomplexo)
ICE: “IL-1 beta Converting enzyme” (Enzima de conversão de IL-1 beta)
IDO: “Indolamina dioxigenase” (Indolamina dioxigenase)
IFN-γ: “Interferon gama” (Interferon gama)
IL: “Interleukin” (Interleucina)
i.n.: “Intranasal” (Intranasal)
Ipaf: “ICE- protease activing factor” (Fator de ativação de protease ICE)
i.p.: “Intraperitoneal” (Intraperitoneal)
LPS: “Lipopolysaccharid” (Lipopolissacarídeo)
LRR: “Leucin rich repeats” (Sequência rica em leucina)
M1: “M1 Macrophages” (Macrófagos M1)
M2: “M2 Macrophages” (Macrófagos M2)
MAL/TIRAP: “MyD88-adaptor like/TIR-associated protein” (Proteína associada ao
TIR)
MHCII: “Major histocompatibility complex” (Complexo principal de
histocompatibilidade)
MIF: “Mean of fluorescence intensity” (Média de intensidade de fluorescência)
11
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MPO: “Mieloperoxidase” (Mieloperoxidase)
MyD88: “Myeloid differentiation factor 88” (Fator de diferenciação mielóide 88)
Naip: “Neuronal apoptosis inhibitor protein” (Proteína inibidora de apoptose
neuronal)
NLR: “NOD like receptors” (Receptores do Tipo NOD)
NO: “Nitric Oxide” (Óxido nítrico)
NOD: “Nucleotide-binding oligomerization domain” (Domínio de oligomerização de
ligação de nucleotídeo)
PEC: “Peritoneal Cavity” (Cavidade Peritoneal)
SA: “Streptoavidin” (Estreptoavidina)
TGF-β: “Transforming growth factor beta” (Fator beta de transformação do
crescimento)
TIR: “Toll/IL-1R domain” (Domínio Toll/IL-1R)
TLR: “Toll like receptors” (Receptores do Tipo Toll)
TRAM: “TRIF- related adaptor molecule” (Molécula adaptadora relacionada ao TRIF)
TRIF: “Toll/IL-1R domain – Containing adaptor inducing IFN-beta”
12
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura da FliCi. Bactérias flageladas apresentam o complexo flagelar, cada flagelo é
composto por protofilamento os quais são formados por monômeros de flagelina (A). Cada
monômero e flagelina é constituído por domínios (B). Flagelina interage com seu receptor
para padrão molecular (TLR5) (C). Página 22.
Figura 2: FliCi total e FliCi purificada após cromatografia. A flagelina é extraída da bactéria
Salmonella enterica serovar typhimurium
SL3261 e a seguir passa por uma coluna de
cromatografia para purificação. A figura mostra o gel de proteína antes e após a
purificação .
Figura 3: Migração celular em resposta à FliCi e ao LPS. Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram
inoculados com FliCi ou LPS (1 µg) pelas vias i.p. ou i.n. e as células presentes nos
compartimentos peritoneal (A) ou alveolar (B), respectivamente, foram coletadas após 48h.
O número total de células foi obtido por contagem em hemocitômetro, utilizando Tripan Blue
para exclusão das células mortas. Cada barra representa a média ± DP, de 3 experimentos,
com n=3. * p<0,05 e ** p<0,01 em relação ao controle da mesma linhagem, # p<0,05 e ##
p<0,01 em relação ao grupo FliCi da mesma linhagem.
Figura 4: Representação absoluta das populações celulares presentes nos lavados peritoneal e
bronqueoalveolar de animais C57Bl/6 e BALB/c, estimulados ou não com FliCi e LPS.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com FliCi ou LPS (1 µg) pelas vias i.p.
ou i.n. e as células presentes nos compartimentos peritoneal ou alveolar, coletadas após
48h foram analisadas por citometria de fluxo. O número de células de cada população
celular presente no lavado peritoneal (A) e alveolar (B) foi obtido multiplicando-se o número
relativo pelo número total de células presentes nos diferentes compartimentos. O número de
células de cada população linfocitária presente nos lavados peritoneal (C) e alveolar (D) foi
obtido da mesma maneira. Os experimentos foram repetidos 3 vezes, mostrando o mesmo
perfil de resultados. Cada barra representa a média ± DP, com n=3, de um experimento
representativo. * p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao grupo controle da mesma
linhagem, #p<0,05; ##p<0,01 e ###p<0,001 em relação ao grupo FliCi da mesma linhagem.
Figura 5: Avaliação da expressão de MHC classe II por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e
48h mais tarde o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de MHC classe II na
população F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram
respectivamente o número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
MHCII
+
. Os
gráficos C e D mostram, respectivamente, o aumento da MIF de MHCII em relação a MIF de
MHCII nos macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ±
DP, de 3 experimentos, com n=3 cada. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; # p<0,05 em relação ao grupo FliCi da mesma linhagem e
&
p<0,05 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os números no interior dos
histogramas (E) representam a MIF de MHC nessas populações obtidas em um
experimento demonstrativo,
&&&
p<0,001 em relação ao grupo controle dos animais C57BL/6.
Os grupos são representados por IC (controle isotípico
), Controle (animais não
inoculados
), FliCi ( ) e LPS ( ).
13
_
Figura 6: Avaliação da expressão de CD80 por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e
48h mais tarde, o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de CD80 na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram, respectivamente, o
número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
CD80
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento da MIF de CD80 em relação a MIF de CD80 nos
macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ± DP, de 3
experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; ## p<0,01 e ### p<0,001 em relação ao grupo FliCi da
mesma linhagem e
&
p<0,05;
&&&
p<0,001
em relação ao grupo controle dos animais
C57Bl/6. Os números no interior dos histogramas (E) representam a MIF de CD80 nessas
populações, obtidas em um experimento demonstrativo com n=3 para cada grupo,
&&&
p<0,001 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são representados
por IC (controle isotípico
), Controle (animais não inoculados ), FliCi ( ) e LPS ( ).
Figura 7: Avaliação da expressão de CD86 por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n.
e 48h mais tarde, o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de CD86 na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram, respectivamente,
o número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
CD86
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento da MIF de CD86 em relação a MIF de CD86 nos
macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ± DP, de
3 experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; # p<0,05, ## p<0,01 e ### p<0,001 em relação ao grupo
FliCi da mesma linhagem e
&&&
p<0,001 em relação ao grupo controle dos animais
C57Bl/6. Os números no interior dos histogramas (E) representam a MIF de CD86
nessas populações, obtidas em um experimento demonstrativo com n=3 para cada
grupo,
&
p<0,05 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são
representados por IC (controle isotípico
), Controle (animais não inoculados ), FliCi
(
)eLPS(
)
Figura 8: Avaliação da expressão de CD40 por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n.
e 48h mais tarde, o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de CD40 na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram, respectivamente,
o número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
CD40
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento da MIF de CD40 em relação a MIF de CD40 nos
macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ± DP, de
3 experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; # p<0,05 e ## p<0,01 em relação ao grupo FliCi da mesma
linhagem e
&&
p<0,01 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os números no
interior dos histogramas (E) representam a MIF de CD40 nessas populações, obtidas em
um experimento demonstrativo com n=3 para cada grupo,
&&
p<0,01 em relação ao
grupo controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são representados por IC (controle
isotípico
), Controle (animais não inoculados ), FliCi ( ) e LPS ( ).
14
_
Figura 9: Avaliação da produção de NO. Produção de NO por células aderentes obtidas dos
lavados peritoneal (A) e alveolar (B) de camundongos C57Bl/6 e BALB/c. Os animais
foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e 48h mais tarde, o BAL e o PEC
foram removidos. As células foram colocadas em cultura para aderir por 4h, lavadas para
remoção das células não aderentes e estimuladas in vitro por 48h com apenas meio de
cultura (-), 1 μg/mL de FliCi ou 1 μg/mL de LPS. Após esse período, o sobrenadante das
culturas foi removido e o NO mensurado utilizando o Reagente de Griess Os dados
representam a média ± DP de um experimento demonstrativo, com n = 3 cada grupo. *
p<0,05 em relação ao grupo C (-), # p<0,05 em relação ao grupo FliCi (-) e
&
p<0,05 em
relação ao grupo LPS (-). Os estímulos in vivo são representados no gráfico, enquanto
os estímulos in vitro são representados por
(-) ou sem estímulo, estímulo com
FliCi e
LPS.
Figura 10: Caracterização fenotípica e morfológica das populações de macrófagos peritoneais
e alveolares.
As células peritoneais (A) e alveolares (B) de animais C57Bl/6 controles
foram analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão de F4/80.
Em seguida, as
subpopulações peritoneais, F4/80 e F4/80
hi lo
, foram separadas por sorting em um
FacsVantage, de acordo com a intensidade de expressão dessa molécula. As
subpopulações peritoneais, assim como os macrófagos alveolares, foram colocadas em
lâminas de cultura de 8 poços por 24h. As lâminas
foram coradas com o kit de coloração
Instant-Prov. Os slides representam um aumento de 40x em microscopia óptica. Os
experimentos foram repetidos ao menos 3 vezes, mostrando o mesmo perfil de
resultados. Os dados apresentados representam um experimento demonstrativo com
n=3 para cada grupo.
Figura 11: Avaliação da expressão de iNOS por células F4/80 (A) e F4/80 (B).
lo hi
Os animais
foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. e 48h mais tarde o PEC foi removido. As
células foram colocadas em cultura com meio de cultura (-) ou 1 ng/mL de rIFN-γ, na
presença de monensina, por 5h. Após esse período, as células foram manipuladas
utilizando o kit cytofix/cytoperm e marcadas com anti-F4/80 (FITC), IgG de coelho anti-
iNOS de camundondongo, anti-IgG de coelho marcada com biotina e SA (Cy), sendo
que os controles das marcações não foram incubados com o anticorpo anti-iNOS. Os
números apresentados nos plots mostram o número relativo de células iNOS
+
dentro de
cada população celular. Os experimentos foram repetidos ao menos três vezes,
mostrando o mesmo perfil de resultados. Os dados apresentados representam um
experimento demonstrativo com n=4 para cada grupo.
Figura 12: Avaliação da expressão de mTGF-β1 por macrófagos F4/80
lo
(A) e F4/80
hi
(B). Os
animais foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. e 48h mais tarde o PEC foi
removido. As células foram marcadas com anti-F4/80 (FITC), anti-mTGF-β1 (Biotina) e
SA (Cy), sendo que os controles das marcações não foram incubados com anti-mTGF-
β1. Os números apresentados nos plots mostram o número relativo de células mTGF-β
+
dentro de cada população celular. Os experimentos foram repetidos ao menos três
vezes, mostrando o mesmo perfil de resultados. Os dados apresentados representam
um ex
p
erimento demonstrativo com n=4
p
ara cada
g
ru
p
o.
15
_
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
1.1 HETEROGENEIDADE DE MACRÓFAGOS 18
1.2 RECEPTORES PARA PADRÕES MOLECULARES 20
1.3 LPS E FLAGELINA 23
2 OJETIVOS 28
3 MATERIAIS E MÉTODOS 30
3.1 ANIMAIS 31
3.2 PURIFICAÇÃO DA FLAGELINA 31
3.3 TRATAMENTO DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DE CÉLULAS 32
3.4 CULTURA DE MACRÓFAGOS 32
3.5 ANÁLISE FENOTÍPICA DAS CÉLULAS 32
3.6 DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO 33
3.7 DETECÇÃO DE INOS POR CITOMETRIA DE FLUXO 33
3.8 SEPARAÇÃO DAS CÉLULAS F4/80
LO
E F4/80
HI
POR SORTING 34
3.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS 35
4 RESULTADOS 36
4.1 PAPEL DA FLAGELINA E DO LPS NA ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS M1 E M2
37
4.1.1 FLICI É MAIS POTENTE NO RECRUTAMENTO DE CÉLULAS PARA O PERITÔNEO ENQUANTO
O
LPS RECRUTA MAIS CÉLULAS PARA O COMPARTIMENTO ALVEOLAR 37
4.1.2 FLICI É MAIS POTENTE NO RECRUTAMENTO DE MACRÓFAGOS ENQUANTO O LPS INDUZ
A MIGRAÇÃO PREFERENCIAL DE NEUTRÓFILOS
39
4.1.3 MACRÓFAGOS PERITONEAIS SÃO MODULADOS MAIS INTENSAMENTE POR FLICI
ENQUANTO QUE OS MACRÓFAGOS ALVEOLARES SÃO MAIS SENSÍVEIS AO
LPS 43
4.2 POLARIZAÇÃO M1/M2: UM CONCEITO REVISITADO 54
4.2.1 POLARIZAÇÃO M1/M2 É OBSERVADA APENAS NO AMBIENTE PERITONEAL 54
4.2.2 MACRÓFAGOS PERITONEAIS COMO UMA POPULAÇÃO HETEROGÊNEA: POLARIZAÇÃO
M1/M2 NO MESMO MICROAMBIENTE? 57
4.2.3 MACRÓFAGOS F4/80
LO
APRESENTAM MAIOR EXPRESSÃO DE MTGF-Β1 E OS
MACRÓFAGOS
F4/80
HI
EXPRESSAM MAIORES NÍVEIS DE INOS 58
5 DISCUSSÃO 62
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72
16
_
1 INTRODUÇÃO
17
_
1.1 Heterogeneidade de Macrófagos
Os macrófagos são células pertencentes ao sistema fagocítico mononuclear,
originados a partir de um progenitor mielóide, compartilhado também por
granulócitos. Após deixarem a medula óssea, são liberados no sangue periférico,
onde circulam por vários dias como monócitos antes de alcançarem os tecidos e se
diferenciarem em macrófagos (1, 2). Os macrófagos são essenciais para o
funcionamento do sistema imune (3) e dentre suas funções destacam-se a
fagocitose e destruição de microorganismos, apresentação de antígenos para
linfócitos T (4), remoção de células apoptóticas (5), resolução de processos
inflamatórios (6), angiogênese (7) e reparo e remodelamento tissular (8).
Os macrófagos, células residentes em tecidos distintos, representam uma
população celular altamente heterogênea. A heterogeneidade dessas células está
refletida tanto em seus aspectos morfológicos e fenotípicos, como metabólicos e
funcionais (9-11). De maneira geral, os macrófagos são caracterizados
fenotipicamente pela expressão de altos níveis da cadeia CD11b da integrina Mac-1
e da glicoproteína F4/80 (12). Porém, a expressão dessas moléculas não é
homogênea entre as diferentes subpopulações de macrófagos. O exemplo típico da
expressão diferencial desses marcadores pode ser visto nos macrófagos esplênicos,
onde as células encontradas na polpa vermelha apresentam alta expressão de
F4/80, enquanto os macrófagos da polpa branca (tanto os macrófagos da zona
marginal (MZMФ) como os macrófagos metalofílicos) possuem baixa expressão de
F4/80 (13, 14).
Com relação ao perfil metabólico e funcional, os macrófagos podem ser
subdivididos em M1 e M2 (9). De acordo com Mills el at., macrófagos M1,
18
_
provenientes de camundongos de linhagens Th1 (C57Bl/6 e B10.A), o metabolismo
da arginina é caracterizado por alta expressão da enzima NO-sintase induzida
(iNOS), com conseqüente produção de níveis elevados de óxido nítrico (NO) em
resposta aos lipopolissacarídeos (LPS) ou interferon-γ (IFN-γ). Em macrófagos
provenientes de camundongos de linhagens Th2 (BALB/c e DBA.2), denominados
macrófagos M2, a via da arginase, com conseqüente geração de ornitina e
poliaminas, é predominante. Assim, os macrófagos M1 são considerados
macrófagos inflamatórios, ou macrófagos com grande capacidade microbicida, por
seu potencial em produzir NO em resposta a estímulos inflamatórios, enquanto que
macrófagos M2 são conhecidos como macrófagos ativados para o reparo tecidual,
com secreção espontânea de altos níveis de fator beta de transformação do
crescimento (TGF-β) (9-11).
Parece haver um consenso de que a ativação clássica de macrófagos se dá
pelo estímulo com IFN-γ, resultando na geração de macrófagos M1, com alto
potencial microbicida e secretores de citocinas pró-inflamatórias como Interleucina
(IL)-1, IL-6, IL-12 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (15). Nesse caso, a IL-12
parece estar envolvida com o perfil de ativação dos macrófagos, uma vez que na
ausência de IL-12, macrófagos M1 apresentam um desvio para o perfil M2 de
ativação (16). A ativação alternativa parece induzir a diferenciação de macrófagos
M2, que ainda podem ser subdivididos em M2a, M2b e M2c, de acordo com o
estímulo recebido (10). Macrófagos M2a, ditos alérgicos, são induzidos pelas
citocinas IL-4 e IL-13, enquanto que macrófagos M2c, ditos reguladores, são
induzidos por IL-10 e glicocorticóides. Macrófagos expostos a imunocomplexos (IC)
ou a alguns agonistas de receptores do tipo Toll (TLR) diferenciam-se em M2b e
19
_
tornam-se produtores de altos níveis de IL-10 e baixos níveis de IL-12, ainda que
conservem a secreção de IL-1, IL-6 e TNF-α (10).
Ainda que a polarização M1/M2 se apresente numa clara dicotomia, a
heterogeneidade das populações de macrófagos ainda levanta algumas questões,
uma vez que pode expressar fases de diferenciação distintas dessas células ou, até
mesmo, origens distintas. De acordo com Gordon e Taylor (11), os macrófagos
podem ser divididos em duas subpopulações conforme a expressão de CCR2,
CD62-L (L-selectina) e CX
3
CR1. Macrófagos inflamatórios parecem expressar altos
níveis de CCR2, CD62-L e baixos níveis de CX
3
CR1, enquanto que macrófagos
residentes são caracterizados pela expressão de altos níveis de CX
3
CR1 e ausência
de CCR2 e CD62-L (11, 17). Peculiar, nesse caso, é o fato de que esses macrófagos
parecem originar-se de diferentes monócitos sanguíneos, levantando a possibilidade
de que não haja apenas um progenitor mielóide comum (17). Ainda, durante a
diferenciação de monócitos para macrófagos, essas células assumem perfis
transcripcionais bastante diferenciados (18). Em condições fisiológicas, macrófagos
diferenciados tendem a apresentar polarização para o perfil M2, com modificações
transcripcionais mais sutis que aquelas apresentadas pelos macrófagos M1 (18).
1.2 Receptores para padrões moleculares
Os macrófagos iniciam a resposta imune através do reconhecimento de
padrões moleculares freqüentemente presentes em microorganismos. Vários tipos
de receptores para padrões moleculares estão presentes nessas células, como os
receptores do tipo lectina que ligam-se a carboidratos freqüentemente presentes na
superfície de microorganismos (p.e. manose e β-glucanos) (19) e receptores tipo
20
_
scavengers envolvidos no reconhecimento tanto de lipoproteínas de baixa densidade
(LDL) modificadas (envolvidas no processo de aterosclerose), como de eritrócitos e
células apoptóticas, além de uma variedade de patógenos (20).
Nesse contexto, a descoberta dos receptores do tipo Toll (TLR) revolucionou
os mecanismos envolvidos no reconhecimento do sistema imune inato. Os TLR são
moléculas transmembranas que contêm um domínio externo à membrana com
seqüências ricas em leucina (LRR), particular para cada TLR, e uma cauda
intracelular que mostra grande homologia com o domínio intracelular do receptor
para a IL-1 (IL-1R), chamada domínio Toll/IL-1R (TIR) (21). A ativação do TLR por
seus ligantes induz o recrutamento de proteínas adaptadoras específicas. Até o
momento, quatro proteínas adaptadoras foram descritas: fator de diferenciação
mielóide 88 (MyD88), proteína associada ao TIR (MAL/TIRAP), Toll/IL-1R domain –
containing adaptor inducing IFN-beta (TRIF) e molécula adaptadora relacionada ao
TRIF (TRAM) (22). Essas proteínas adaptoras transduzem o sinal do TIR, ativando
quinases e fatores de transcrição como NF-kB e STAT-1 (23). Dá-se, dessa maneira,
a produção de diferentes moléculas efetoras, citocinas pró-inflamatórias, entre outros
mediadores, responsáveis pelas diferentes respostas geradas a partir do
reconhecimento de estruturas padrões de patógenos.
A família dos receptores do tipo Toll compreende, até o momento, onze
proteínas identificadas em mamíferos (11 receptores identificados em camundongos
e 10 receptores em humanos) (24). Entre seus diversos ligantes, os melhores
caracterizados são peptidoglicanas e lipoproteínas bacterianas, âncoras de
glicofosfatidil inositol (GPI) presentes em protozoários e zimosan em fungos (ligantes
de TLR2), RNA dupla-fita, comuns em vírus (ligante de TLR3), LPS presentes na
parede de bactérias gram-negativas (ligante do TLR4), flagelina, componente do
21
_
flagelo microbiano (ligante de TLR5) e seqüências de DNA não metilados, ricas em
CpG, presentes em bactérias e vírus (ligante de TLR9), entre outros (22).
Após a descoberta dos receptores do tipo Toll, uma nova família de
receptores para padrões moleculares tem sido descrita. Os receptores do tipo NOD
(NLR) têm como característica peculiar sua localização citosólica e compreendem
proteínas NOD1 e NOD2 (Nucleotide-binding oligomerization domain containing 1 ou
2), Naip (neuronal apoptosis inhibitor protein), Apaf (apoptotic protease activating
factor), Ipaf (ICE- protease activing factor), entre outras (25). São proteínas formadas
essencialmente por 3 domínios, um domínio N-terminal variável, um domínio central
do tipo NOD e uma porção C-terminal com LRR. O reconhecimento de padrões se
dá pela cauda LRR, o qual induz uma cascata de ativação que culmina na ativação
do fator de transcrição NF-κB ou da protease caspase-1, dependendo do tipo de
receptor recrutado. Como dito anteriormente, o fator de transcrição NF-κB é capaz
de induzir a transcrição de inúmeros genes, culminando na produção de diferentes
moléculas efetoras. A caspase-1 ou enzima de conversão de IL-1
β
(ICE) é uma
protease intracelular necessária para a secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-1
e IL-18. Além disso, a ativação da caspase-1 induz apoptose em macrófagos
infectados, fato que poderia indicar um mecanismo de resistência e controle de
patógenos por essas células (26, 27). Ainda, o mecanismo efetor da caspase-1,
pode estar correlacionado com a clivagem de outros substratos endógenos ainda
não conhecidos.
O conhecimento desses receptores citosólicos é bastante recente e seus
ligantes ainda não estão bem caracterizados. Sabe-se, entretanto, que a mutação de
alguns desses receptores está associado a síndromes inflamatórias (28-30) e
susceptibilidade a infecções bacterianas, como no caso da Legionella pneumophila
22
_
(27). Esses fatos indicam que os receptores do tipo NLR desempenham um
importante papel na regulação da resposta imune (28, 31, 32). Análises genéticas e
bioquímicas têm revelado que as proteínas NLR participam do reconhecimento da
imunidade inata de maneira independente dos TLR, embora esses dois tipos de
receptores possam cooperar para otimizar a resposta contra produtos microbianos
(30). Ainda, não há conhecimento na literatura se uma determinada população de
macrófagos é mais susceptível à ativação por TLR ou NLR ou, ainda, se há uma
cooperação ou regulação entre ambos os receptores.
1.3 LPS e Flagelina
A endotoxina, um produto bacteriano com propriedade adjuvante e
freqüentemente utilizado como ativador de macrófagos, é constituída principalmente
por LPS, presentes na parede celular de todas as bactérias gram-negativas. Até
recentemente, o receptor celular para LPS era misterioso. Porém, há muito se sabia
que macrófagos de animais da linhagem C3H/HeJ não respondiam aos LPS (33) e
que esta deficiência era devido a uma mutação em um único gene, denominado Lps,
localizado no cromossomo 4 (34). No entanto, foram necessários cinco anos de
trabalho, no laboratório de Bruce Beutler, para que Poltorak et al. identificassem o
receptor para LPS, como sendo o receptor do tipo Toll 4 (TLR4) (35). O TLR4 foi o
primeiro TLR identificado em mamíferos e, por isso, é o mais conhecido. Além disso,
o TLR4 apresenta outra particularidade, sendo o único dessa família de receptores a
recrutar dois tipos distintos de moléculas adaptadoras, MyD88 e TRIF (24). Sendo
assim, a ativação celular induzida pelo LPS, inclui produção de moléculas efetoras
induzidas pelos fatores de transcrição NF-kB e STAT-1 (23).
23
_
A flagelina faz parte de uma estrutura de superfície complexa, comum em
bactérias móveis, chamadas de flagelo e que possuem mais de 15 μm de
comprimento. Tal estrutura atua como sensor captando informações químicas e
físicas do ambiente e promove a migração desses microrganismos visando sua
sobrevivência (36). A flagelina tem sido alvo de muitos estudos devido sua
importância na patogenicidade de bactérias flageladas. Esse fato foi demonstrado
por estudos histológicos com linhagens bacterianas de Pseudomonas aeruginosa
desprovidas de flagelo que revelaram infecções localizadas e mais atenuadas que
as linhagens flageladas, as quais causam infecções generalizadas (37).
A estrutura flagelar é constituída por três porções, o corpo basal, um gancho
que liga o corpo basal ao filamento e o filamento flagelar propriamente dito (38). O
filamento flagelar é semelhante a um cilindro formado por 11 protofilamentos
constituídos por polímeros (39). Cada polímero é composto por monômeros, os
quais são formados por domínios, chamados D0 a D4. O monômero de flagelina é
constituído por duas regiões terminais conservadas, chamadas N e C terminais, que
flanqueiam a região central. A região central é também conhecida como região
hipervariável por não conservar seu tamanho nem composição. As regiões
conservadas N e C terminais formam uma estrutura em α-hélice que constitui os
domínios D0 e D1, enquanto as regiões variáveis D2 e D3 são expostas e estão
relacionadas com a adesão bacteriana à superfície celular (38).
24
_
A C
B
Figura 1: Estrutura da FliCi. Bactérias flageladas apresentam o complexo flagelar, cada flagelo é
composto por protofilamento os quais são formados por monômeros de flagelina (A). Cada
monômero e flagelina é constituído por domínios (B). Flagelina interage com seu receptor
para padrão molecular (TLR5) (C).
Em 2001, Hayashi et al., utilizando frações purificadas de Listeria
monocytogenes, caracterizaram a flagelina como ligante para o TLR5 em células
mononucleares (40). Em adição, demonstraram que a ativação de tal receptor
promove a mobilização do fator nuclear NF-κB para o núcleo celular estimulando a
produção de TNF-α e IL-6 de maneira dependente de MyD88 (40). Mais
recentemente, Feuillet et al. (41) demonstraram o papel do TLR5 no reconhecimento
da flagelina de Salmonella typhimurium e Pseudomonas aeruginosa utilizando
animais deficientes de TLR5. Esses autores demonstraram que durante a infecção
por uma dessas bactérias o TLR4 pode compensar a ausência do TLR5, já que
ambos microrganismos possuem LPS em sua parede celular. Contudo o
reconhecimento da flagelina purificada é dependente da expressão de TLR5 (41).
Durante muito tempo, os detalhes das interações entre a flagelina e o TLR5
permaneceram controversos. McDermott et al. (42) relacionou o domínio
25
_
hipervariável (D3) com o TLR5, enquanto o grupo de Eaves-Pyles (43) demonstrou
que a interação ocorre via regiões N e C terminais da flagelina. Finalmente, Smith et
al. (44), utilizando modelos de mutagênese, mapearam o sítio de reconhecimento da
flagelina pelo TLR5 e definiram uma região altamente conservada de 13 resíduos de
aminoácidos da porção N-terminal, os quais participam das interações
intermoleculares que formam o protofilamento flagelar e são requeridas para a
motilidade bacteriana.
Mais recentemente, a flagelina foi descrita por sua habilidade em ativar o
receptor citosólico Naip5. A ativação desse receptor por flagelina é fundamental para
a resistência de macrófagos a infecções pela bactéria Legionella pneumophila,
envolvendo um mecanismo dependente de pro-caspase-1 (27, 45). Porém, ainda
não se sabe qual é a porção da flagelina que se associa aos receptores do tipo NLR.
A ativação de macrófagos a partir do reconhecimento de padrões
moleculares induz a produção de uma série de moléculas efetoras envolvidas na
capacidade microbicida dessas células, na condução e resolução da resposta
inflamatória e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa (46). Essas
moléculas são produtos de genes pró-inflamatórios (como citocinas inflamatórias e
quimiocinas), ou provenientes do metabolismo lipídico (leucotrienos e
prostaglandinas) e bioquímico dessas células (enzimas como iNOS, NADPH-
oxidase, mieloperoxidase (MPO), hemeoxigenase-1 (HO-1) e indoleamina
dioxigenase (IDO)).
Porém, muitos aspectos envolvidos no reconhecimento desses padrões
moleculares por diferentes subpopulações de macrófagos necessitam de maiores
elucidações. Considerando a imensa heterogeneidade existente entre as células da
imunidade inata, especialmente nas subpopulações de macrófagos e células
26
_
dendríticas, e o fato de que a “especialização” funcional dessas populações vem
sendo associada com a expressão diferencial de receptores para padrões
moleculares (46-48), o objetivo principal deste trabalho foi avaliar de maneira
comparativa a ativação de diferentes populações de macrófagos pelos agonistas de
TLR4 e TLR5. Para isso, utilizamos macrófagos provenientes de diferentes
compartimentos (espaços bronqueoalveolar e peritoneal) e com perfis de ativação
distintos, M1 (provenientes de animais C57Bl/6) e M2 (provenientes de animais
BALB/c), como previamente descrito por Mills et al. (9).
27
_
2 OJETIVOS
28
_
O objetivo desse trabalho foi comparar a ativação de diferentes populações
de macrófagos proporcionada pelos agonistas de TLR4 e TLR5. Para isso,
utilizamos macrófagos provenientes de diferentes compartimentos (espaços
bronqueoalveolar e peritoneal) e com perfis de ativação distintos, M1 (provenientes
de animais C57Bl/6) e M2 (provenientes de animais BALB/c).
29
_
3 MATERIAIS E MÉTODOS
30
_
3.1 Animais
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c, com 6-8 semanas de idade, mantidos em
condições “germ-free”, foram fornecidos pelo Biotério de camundongos isogênicos
do Departamento de Imunologia, do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da
Universidade de São Paulo (USP).
3.2 Purificação da flagelina
A flagelina (FliCi) purificada utilizada para o tratamento dos camundongos ou
para cultura de células é proveniente da bactéria Salmonella enterica serovar
typhimurium SL3261 (selvagem ou flagelada), foi obtida como descrito por Luna et
al. (49), purificada por cromatografia e gentilmente cedida pelo grupo do Prof Dr.
Luiz Carlos Ferreira (professor titular do Departamento de Microbiologia – ICB –
USP).
50Kda
FliCi
Total
FliCi
Purificada
Figura 2: FliCi total e FliCi purificada após cromatografia. A flagelina é extraída da bactéria
Salmonella enterica serovar typhimurium
SL3261 como citado acima e a seguir passa por
uma coluna de cromatografia para purificação. A figura mostra o gel de proteína antes e
após a purificação.
31
_
3.3 Tratamento dos animais e obtenção de células
Para a avaliação da ativação de macrófagos peritoneais ou alveolares M1 e
M1 por ligantes de TLR, camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados pelas
vias intraperitoneal (i.p.) ou intranasal (i.n.) com LPS de Escherichia coli (1
μg/animal) (Sigma) ou FliCi (1 μg/animal). Após 24, 48 ou 72h, as células presentes
nos compartimentos peritoneal e bronqueoalveolar foram obtidas por lavagens com
5 mL e 1,5 mL de PBS (solução salina tamponada com fosfato), respectivamente.
3.4 Cultura de macrófagos
As células peritoneais e alveolares (5x10
6
) obtidas dos camundongos
controles ou tratados com FliCi e LPS, foram colocadas em cultura em meio RPMI
suplementado (Sigma) por 4h a 37 °C, em atmosfera contendo 5% de CO
2,
em
placas de 6 poços (Costar), para que os macrófagos fossem enriquecidos por
aderência. Após vigorosas lavagens, as células aderentes obtidas foram retiradas
com Accutase (MP Biomedicals) (1 mL/poço), contadas e incubadas em placas de
96 poços (Costar) na concentração de 2 x 10
5
células/poço. As células foram
reestimuladas ou não com FliCi ou LPS (1 μg/mL ou 0,2 μg/poço), e 48h mais tarde
os sobrenadantes das culturas foram coletados para análise da produção de NO.
3.5 Análise fenotípica das células
32
_
Para avaliação fenotípica, as células peritoneais e alveolares foram
incubadas com anticorpos monoclonais para F4/80 (Serotec), CD80 (B7.1, 1G10),
CD86 (B7.2, GL-1), CD40 (3/23), GR1 (RB6), CD4 (H129.19), CD8 (53-6.7) e B220
marcados com FITC, PE ou Cy-Chome. As células peritoneais foram incubadas
também com anticorpo monoclonal para mTGF-β1 marcado com biotina, por isso foi
necessário uma segunda incubação com estreptoavidina (SA) (Cy). As células foram
analisadas por citometria de fluxo em um FacsCalibur (Becton Dickinson) e com
exceção do anticorpo F4/80, os demais reagentes foram obtidos da PharMingen.
3.6 Detecção de óxido nítrico
A produção de óxido nítrico foi analisada pelo método de Griess, como
descrito previamente (50). Resumidamente, 50 µl dos sobrenadantes de cultura
foram incubados com 50 µl do reagente de Griess (preparados com reagentes da
Sigma) por 5 min em temperatura ambiente. A concentração de NO
2
foi determinada
por leitura da densidade óptica a 550 nm em referência ao padrão da solução de
NaNO
2
. As dosagens foram realizadas em duplicata.
3.7 Detecção de iNOS por citometria de fluxo
O ensaio para detecção de iNOS foi realizado conforme protocolo proposto
por Jung et al. (51), com algumas modificações. As células (10
6
) peritoneais, obtidas
de camundongos controles ou previamente inoculados com FliCi ou LPS foram
incubadas com estímulos in vitro (apenas meio de cultura (-) ou IFN-γ (2,5 ng/mL)),
33
_
juntamente com monensina (stop Golgi) (Pharmingen), por 5h, a 37 °C em atmosfera
contendo 5% de CO
2
. Após lavagens com PBS contendo 1% SBF e 0,05% de azida,
foi realizada a marcação extracelular com anticorpos monoclonais anti-F4/80
marcado com FITC por 30 min a 4 °C. Em seguida, as células foram fixadas com
Citofix (Pharmingen) (100 μl/10
6
células) por 10 min. Após lavagens com PBS-soro-
azida, as células foram permeabilizadas com 100 μl de PermWash (Pharmingen).
Nessa etapa, as células foram incubadas com um anticorpo monoclonal de coelho
anti-iNOS de camundongo (Santa Cruz) seguido por incubação de 30 min. em
ambiente protegido de luz. Posteriormente, as células foram lavadas, incubadas com
um anticorpo de cabra anti-IgG de coelho marcado com biotina (Southern
Biotechnology Associates) por 30 min. e em seguida as células foram novamente
lavadas e marcadas com SA (Cy) (Pharmingen). Por fim, as células foram lavadas,
ressuspendidas em 0,2 mL de PBS-soro-azida e analisadas em citômetro de fluxo
FacsCalibur (Becton Dickinson), de acordo com a intensidade de fluorescência (FL1,
FL3) e a dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC) do feixe luminoso.
3.8 Separação das células F4/80
lo
e F4/80
hi
por sorting
Para avaliação individual das populações de macrófagos peritoneais, as
células de animais controles ou inoculados com agonistas de TLR obtidas após
lavagem peritoneal com PBS foram passadas por agulha 23G para remoção de
grumos celulares. Após lavagens com PBS-soro-azida, foi realizada a marcação
extracelular com anticorpos monoclonais anti-F4/80 marcado com PE por 30 min a 4
°C em ambiente protegido de luz. As células foram lavadas com PBS-soro-azida e
ressuspendidas em meio de cultura em concentração de 2-3 milhões de células/mL
34
_
para posterior separação por citometria de fluxo em FacsVantage (Becton
Dickinson). Para coleta após a realização do sorting, os tubos det aleta (Spectrum)
foram preparados com 1 mL de meio de cultura RPMI 3% SFB contendo
gentamicina (1:100). Todas as manipulações foram realizadas em condições
estéreis.
3.9 Análises Estatísticas
Análise estatística foi realizada através do Anova (Teste Turkey). As
diferenças entre os grupos serão consideradas significantes quando o valor de p for
<0.05 (5%).
35
_
4 RESULTADOS
36
_
4.1 PAPEL DA FLAGELINA E DO LPS NA ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS M1 e
M2
4.1.1 FliCi é mais potente no recrutamento de células para o peritôneo
enquanto o LPS recruta mais células para o compartimento alveolar
A avaliação dos efeitos de ligantes de TLR na ativação celular tem sido tema
de grande parte dos estudos da imunologia atual, englobando desde mecanismos
moleculares envolvidos no reconhecimento da resposta inata e desenvolvimento da
resposta imune adaptativa até o potencial desses agonistas como adjuvantes em
vacinas (46, 52). Porém, muitos aspectos envolvidos no reconhecimento diferencial
desses padrões moleculares necessitam de maiores elucidações. Para avaliar, de
maneira comparativa, o papel dos agonistas de TLR4 e TLR5 na ativação de
diferentes populações de macrófagos, camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram
inoculados via i.p. ou i.n. com LPS ou FliCi. Os animais C57Bl/6 e BALB/c foram
escolhidos como modelo experimental, uma vez que os macrófagos provenientes
dessas linhagens apresentam distintos perfis de ativação, e são conseqüentemente
nomeados como macrófagos M1 e M2, respectivamente (9).
Inicialmente, foi realizada uma cinética para verificar a melhor dose dos
agonistas de TLR a ser utilizada, assim como o tempo ideal para a coleta das
células. Para isso, camundongos C57Bl/6 foram imunizados via i.p. com diferentes
doses de LPS (0,1 μg, 1 µg ou 10 μg) e o lavado peritoneal (PEC) foi removido 24,
48 ou 72h mais tarde para avaliação da migração celular. O estímulo com LPS na
dose de 1 μg/animal foi a menor dose capaz de induzir significativa migração de
37
_
células, enquanto que no tempo de 48h após as inoculações foi encontrado o pico
da população de macrófagos, nosso foco (dados não mostrados).
Assim, animais C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados via i.p. ou i.n. com 1 μg
de LPS ou FliCi. Após 48h, os lavados peritoneal (PEC) e bronqueoalveolar (BAL)
foram coletados. Somente a injeção de FliCi foi capaz de induzir uma significativa
migração de células para o compartimento peritoneal em animais C57Bl/6, com um
aumento de cerca de 60% no número total de células em relação ao controle e 35%
em relação ao grupo inoculado com LPS (Fig 3A). Já em animais BALB/c, ambos os
agonistas de TLR induziram uma migração significativa de células, havendo um
aumento similar de aproximadamente 50% em relação aos animais controles (Fig
3A). A inoculação de FliCi e LPS por via i.n. em animais C57Bl/6 e BALB/c
proporcionou uma significativa migração de células para o compartimento
bronqueoalveolar (Fig 3B). Contudo, o LPS se mostrou um estímulo mais potente
que a FliCi, induzindo um aumento de 6 vezes no número total de células presentes
no BAL de ambas as linhagens em relação aos animais controles das respectivas
linhagens (Fig 3B).
Os resultados indicam que a FliCi é mais potente no recrutamento celular
para o compartimento peritoneal de animais C57Bl/6, enquanto o LPS induz a
melhor migração celular para o compartimento alveolar de ambas linhagens
estudadas.
38
_
4.1.2 FliCi é mais potente no recrutamento de macrófagos enquanto o LPS
induz a migração preferencial de neutrófilos
Para caracterizar as populações celulares presentes no PEC e BAL de
animais controles e previamente inoculados com FliCi ou LPS, as células foram
submetidas à análise por citometria de fluxo. As células peritoneais de camundongos
C57Bl/6 controles são constituídas por populações dominantes e equivalentes de
macrófagos (F4/80
+
) (Fig 4A) e linfócitos B (B220
+
) (Fig 4C), além de um número
mínimo de neutrófilos (GR1
+
) (Fig 4A) e linfócitos T (CD4
+
e CD8
+
) (Fig 4C). Nos
animais BALB/c controles, os linfócitos B parecem predominar no compartimento
peritoneal (Fig 4A).
A inoculação i.p. de FliCi em camundongos C57Bl/6 induziu uma significativa
migração de macrófagos (F4/80
+
) e de neutrófilos (F4/80
-
GR1
+
) para a cavidade
C57Bl/6
BALB/c
Número total de Células (x10
5
)
C57Bl/6 BALB/c
Número total de Células (x10
5
)
C FliCi LPS C FliCi LPS
0
10
20
30
40
**
*
#
*
14
12
10
8
16
*
**
#
**
##
*
6
4
2
0
C FliCi LPS C FliCi LPS
Figura 3: Migração celular em resposta à FliCi e ao LPS. Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram
inoculados com FliCi ou LPS (1 µg) pelas vias i.p. ou i.n. e as células presentes nos
compartimentos peritoneal (A) ou alveolar (B), respectivamente, foram coletadas após
48h. O número total de células foi obtido por contagem em hemocitômetro, utilizando
Tripan Blue para exclusão das células mortas. Cada barra representa a média ± DP, de 3
experimentos, com n=3. * p<0,05 e ** p<0,01 em relação ao controle da mesma linhagem,
# p<0,05 e ## p<0,01 em relação ao grupo FliCi da mesma linhagem.
39
_
peritoneal (Fig 4A). Em contrapartida, a inoculação i.p. de LPS não induziu uma
regulação no número de macrófagos, porém aumentou cerca de 10 vezes o número
total de neutrófilos neste compartimento. Nos animais BALB/c, somente a inoculação
i.p. de FliCi induziu um aumento significativo no número de macrófagos (Fig 4A).
Ainda, ambos os agonistas de TLR induziram uma migração bastante acentuada de
neutrófilos, sendo o LPS o estímulo mais potente.
No compartimento bronqueoalveolar, a população de macrófagos é
claramente predominante em camundongos C57Bl/6 e BALB/c controles, ainda que
uma população de neutrófilos seja encontrada em animais BALB/c (Fig 4B). Houve
um expressivo aumento na população de macrófagos no compartimento alveolar de
ambas as linhagens estudadas após a inoculação i.n. de FliCi e LPS, sendo que o
efeito mais potente foi observado com a inoculação de FliCi em animais C57Bl/6 e
LPS em animais BALB/c (Fig 4B). Porém, o efeito mais potente da inoculação i.n.
dos agonistas de TLR foi a entrada de neutrófilos no compartimento
bronqueoalveolar de ambos os animais, especialmente nos animais BALB/c
inoculados com LPS, onde o aumento dessa população foi de aproximadamente 15
vezes.
Entre as populações linfóides presentes no peritôneo de camundongos
C57Bl/6 e BALB/c controles, os linfócitos B (F4/80
-
B220
+
) claramente predominam,
constituindo uma população bastante representativa (Fig 4C). O estímulo com FliCi
ou LPS induziu uma migração significativa de linfócitos B e T, especialmente
linfócitos TCD8
+
, para o peritôneo de ambos os animais, sendo o LPS o estímulo
mais potente.
Como dito anteriormente, o espaço bronqueoalveolar dos animais C57Bl/6 e
BALB/c controles não possuem uma população linfocitária predominante, ainda que
40
_
haja mais linfócitos B e TCD4
+
nos animais BALB/c (Figura 4D). A inoculação i.n. de
LPS induziu uma migração acentuada de linfócitos T, em especial de linfócitos
TCD8
+
, para o BAL de camundongos C57Bl/6, um efeito também observado em
animais BALB/c, porém em menor escala. Além disso, a inoculação de LPS em
animais BALB/c induziu um aumento de cerca de 8 vezes no número de linfócitos B
encontrados nesse espaço (Fig 4D).
Os dados, em conjunto, mostram o potencial da FliCi e LPS na indução da
migração celular para os compartimentos peritoneal e alveolar de camundongos
C57Bl/6 e BALB/c. A FliCi parece induzir a migração preferencial de macrófagos
para o compartimento peritoneal, enquanto que o LPS claramente é um potente
estímulo para a entrada de neutrófilos nos dois compartimentos, especialmente no
compartimento bronqueoalveolar de camundongos BALB/c.
41
_
Macrófagos Neutrófilos
Linfócitos
B
A
C57Bl/6
LyB
LyCD4
+
D
C
Macrófagos Neutrófilos
Linfócitos
LyCD8
+
C57Bl/6
BALB/c
C FliCi
LPS
C
FliCi
LPS
5.0
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
*
*
***
##
***
**
***
*
#
C FliCi LPS C FliCi LPS
0.0
2.5
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
*
D
C
Númer
Figura 4: Representação absoluta das populações celulares presentes nos lavados peritoneal
e bronqueoalveolar de animais C57Bl/6 e BALB/c, estimulados ou não com FliCi e
LPS.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com FliCi ou LPS (1 µg) pelas
vias i.p. ou i.n. e as células presentes nos compartimentos peritoneal ou alveolar, coletadas
após 48h foram analisadas por citometria de fluxo. O número de células de cada população
celular presente no lavado peritoneal (A) e alveolar (B) foi obtido multiplicando-se o número
relativo pelo número total de células presentes nos diferentes compartimentos. O número
de células de cada população linfocitária presente nos lavados peritoneal (C) e alveolar (D)
foi obtido da mesma maneira. Os experimentos foram repetidos 3 vezes, mostrando o
mesmo perfil de resultados. Cada barra representa a média ± DP, com n=3, de um
experimento representativo. * p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001 em relação ao grupo controle
da mesma linhagem, #p<0,05; ##p<0,01 e ###p<0,001 em relação ao grupo FliCi da
mesma linhagem.
o de u
5
)
C57Bl/6
BALB/c
###
***
###
***
Cél las (X10
C
FliCi
LPS
C
FliCi
LPS
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
***
###
***
*
###
***
*
*
***
**
###
***
***
C
FliCi
LPS
C FliCi
LPS
*
C57Bl/6
BALB/c
#
***
***
***
LPS
LPS
C FliCi C FliCi
0
10
20
30
**
*
*
*
###
Número de Células (X10
5
)
Número de Células (X10
5
)
Número de Células (X10
5
)
BALB/c
FliCi
LPS
LPS
C C
FliCi
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
***
*
***
#
*
###
***
###
***
###
***
***
###
***
***
FliCi
LPS
LPS
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
12
***
***
**
0
C C
FliCi
42
_
4.1.3 Macrófagos peritoneais são modulados mais intensamente por FliCi
enquanto que os macrófagos alveolares são mais sensíveis ao LPS
Para verificar o efeito da FliCi e do LPS na modulação das diferentes
populações de macrófagos, o primeiro parâmetro que utilizamos foi a avaliação da
expressão de moléculas MHC classe II (MHCII) e das moléculas coestimulatórias
CD80, CD86 e CD40. Essas moléculas estão envolvidas com a função de células
apresentadoras de antígeno dos macrófagos e caracterizam seu estado de ativação
(53, 54). As células F4/80
+
viáveis foram selecionadas em uma janela e
consideradas positivas para MHCII, CD80, CD86 ou CD40 em relação aos
respectivos controles isotípicos.
Quase 50% das células peritoneais F4/80
+
de animais C57Bl/6 controles
expressam MHCII, enquanto uma proporção superior de células peritoneais
F4/80
+
MHCII
+
é encontrada em animais BALB/c, aproximadamente 62% (Fig. 5A). A
inoculação dos agonistas de TLR não foi capaz de modular de maneira positiva a
porcentagem de células MHCII
+
nos macrófagos peritoneais de ambas linhagens,
sendo que a FliCi induziu até mesmo uma significativa diminuição na porcentagem
de células F4/80
+
MHCII
+
provenientes de animais BALB/c (Fig. 5A).
No compartimento bronqueoalveolar é encontrado uma porcentagem menor
de células F4/80
+
MHCII
+
quando comparado com a cavidade peritoneal. Apenas
cerca de 20% de macrófagos M1 e menos de 10% de macrófagos M2 apresentam
expressão basal de MHCII (Fig. 5B). Porém, a porcentagem de células
F4/80
+
MHCII
+
em ambas linhagens estudadas foi modulada positivamente pela FliCi,
e, principalmente pelo LPS, o qual induziu um aumento de até 5 vezes na
porcentagem de macrófagos M2 MHCII
+
, nesse microambiente (Fig. 5B).
43
_
Os macrófagos peritoneais de animais BALB/c apresentam uma maior média
de intensidade de fluorescência (MIF) de MHCII do que os macrófagos provenientes
do peritôneo de animais C57Bl/6 (Fig 5E). Contudo, a expressão desse marcador
nos macrófagos peritoneais de ambas as linhagens não foi modulada de maneira
significativa após os estímulos com FliCi ou LPS (Fig. 5C/E). Já no compartimento
alveolar, somente o estímulo com LPS foi capaz de modular de maneira significativa
a intensidade de fluorescência de MHCII em ambos os animais, com um aumento de
quase 2 vezes na MIF dessa molécula (Fig. 5D/E).
Esses dados nos sugerem que os macrófagos peritoneais M2 apresentam
maior expressão basal de MHCII do que macrófagos M1, contudo, somente os
macrófagos alveolares mostram uma modulação positiva na expressão de MHCII,
principalmente após estímulo com LPS.
44
_
C
FliCi
LPS
C FliCi LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
*
**
*
**
C57Bl/6 BALB/c
% Macrófagos MHC classe II
+
&
C
FliCi
LPS C FliCi
LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
*
#
C57Bl/6
BALB/c
% Macrófagos MHC classe II
+
&
A
B
D
1,4
4,5
7,1
11,6
2,1
1,3
2,1
5,5
5,7
27,8
26,8
36,1
9,2
119,2
&&&
115,8
143,1
PEC
BAL
BALB/c
C57Bl/6
E
C
MHCII
0.5
1.0
1.5
2.0
*
**
##
*
C
FliCi
LPS
C
FliCi
LPS
C57Bl/6
BALB/c
C FliCi
LPS
C FliCi LPS
C57Bl/6
BALB/c
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.5
Aumento da MIFde MHCII/Controle
2.5
0.0
Aumento da MIFde MHCII/Controle
Figura 5: Avaliação da expressão de MHC classe II por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n.
e 48h mais tarde o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de MHCII na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram respectivamente o
número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
MHCII
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento na média de intensidade de fluorescência (MIF)
em relação a MIF de MHCII nos macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada
barra representa a média ± DP, de 3 experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05, **
p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao controle da mesma linhagem; # p<0,05 em relação
ao grupo FliCi da mesma linhagem e
&
p<0,05 em relação ao grupo controle dos animais
C57Bl/6. Os números no interior dos histogramas (E) representam a MIF de MHCII
nessas populações obtidas em um experimento demonstrativo com n=3 para cada
grupo,
&&&
p<0,001 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são
representados por IC (controle isotípico
), Controle (animais não inoculados ), FliCi
(
) e LPS ( ).
45
_
Animais C57Bl/6 possuem cerca de 35% de células F4/80
+
CD80
+
no
peritôneo, antes da inoculação com os agonistas de TLR, enquanto cerca de 75%
dos macrófagos peritoneais provenientes de animais BALB/c expressam CD80 (Fig
6A). A inoculação de FliCi e LPS por via i.p. em animais C57Bl/6 foi capaz de
modular significativamente a expressão desse marcador, induzindo um aumento de
cerca de 2 vezes na porcentagem de células F4/80
+
CD80
+
. Contudo, em animais
BALB/c, a modulação dessa molécula foi exercida de maneira significativa somente
após estímulo com FliCi, ainda que menos intensamente do que observado em
animais C57Bl/6 (Fig 6A).
Assim como a cavidade peritoneal, o compartimento bronqueoalveolar de
camundongos BALB/c apresenta mais células F4/80
+
CD80
+
que animais C57Bl/6
(Fig 6B). Apesar da inoculação i.n. de LPS induzir um aumento de aproximadamente
40% no número de macrófagos CD80
+
em ambas linhagens, esses valores foram
considerados estatisticamente diferentes apenas nos macrófagos de animais
BALB/c. (Fig 6B).
A intensidade de fluorescência basal de CD80 observada nos macrófagos
peritoneais foi correspondente ao perfil observado no número relativo de células
CD80
+
. Macrófagos peritoneais M2 apresentam uma maior intensidade de
fluorescência basal de CD80 do que macrófagos peritoneais M1 (Fig 6E). A
inoculação dos agonistas, e em especial o LPS, modulou de maneira positiva a
expressão de CD80 nos macrófagos peritoneais M1 e M2, sendo claramente mais
expressiva nos macrófagos M1 (Fig. 6C/E). Diferentemente dos macrófagos
peritoneais, os macrófagos alveolares provenientes de animais C57Bl/6 mostram
uma maior intensidade de fluorescência de CD80 do que macrófagos de animais
BALB/c (6E). Contudo, a intensidade de fluorescência de CD80 nos macrófagos
46
_
alveolares M1 não foi modulada significativamente pelos agonistas de TLR,
enquanto a expressão de CD80 nos macrófagos alveolares M2 foi significativamente
modulada após estímulo com LPS (Fig. 6D/E).
47
_
% Macrófagos CD80
+
Aumento da MIF de CD80/Controle
LPS
C FliCi LPS C FliCi
0
1
2
3
4
***
***
###
**
***
C57Bl/6 BALB/c
C FliCi LPS C FliCi LPS
0
1
2
3
4
**
##
C57Bl/6
BALB/c
Aumento da MIF de CD80/Controle
D
5,7
35,5
90,8
124,3
1,4
47,8
&&&
46,1
46,7
2,2
22,7
23,4
46,0
9,9
136,0
&&&
182,2
214,7
PEC
BAL
BALB/c
C57Bl/6
E
CD80
A
C
+-
-
C FliCi LPS C FliCi LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C57Bl/6
BALB/c
% Macrófagos CD80
+
B
C57Bl/6
BALB/c
C FliCi LPS C FliCi LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
*
*
*
*
&&&
&
Figura 6: Avaliação da expressão de CD80 por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e
48h mais tarde, o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de CD80 na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram, respectivamente, o
número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
CD80
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento da MIF de CD80 em relação a MIF de CD80 nos
macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ± DP, de 3
experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; ## p<0,01 e ### p<0,001 em relação ao grupo FliCi da
mesma linhagem e
&
p<0,05;
&&&
p<0,001
em relação ao grupo controle dos animais
C57Bl/6. Os números no interior dos histogramas (E) representam a MIF de CD80 nessas
populações, obtidas em um experimento demonstrativo com n=3 para cada grupo,
&&&
p<0,001 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são representados
por IC (controle isotípico
), Controle (animais não inoculados ), FliCi ( ) e LPS ( ).
48
_
A porcentagem de macrófagos peritoneais, M1 e M2, provenientes de animais
controles, que expressam CD86 foi muito semelhante ao perfil encontrado para
CD80, com cerca de 45% e 65%, respectivamente, de macrófagos M1 e M2
positivos para essa molécula (Fig. 7A). A inoculação de FliCi foi capaz de modular
significativamente somente a proporção de macrófagos peritoneais M1 CD86
+
,
enquanto o LPS não induziu uma modulação significativa na porcentagem de
macrófagos peritoneais M1 ou M2 CD86
+
(Fig 7A).
O compartimento alveolar de ambas as linhagens apresenta menos de 10%
de células F4/80
+
CD86
+
(Fig. 7B). Contudo, a porcentagem de macrófagos
alveolares CD86
+
de ambas as linhagens aumentou de maneira significativa após a
inoculação de LPS, ainda que permanecendo em valores baixos (Fig 7B).
A intensidade de fluorescência basal de CD86 apresentada pelos macrófagos
peritoneais de ambas linhagens foi semelhante ao observado na expressão de
CD80, sendo que os macrófagos peritoneais M2 apresentam maior intensidade de
fluorescência basal de CD86 do que os macrófagos peritoneais M1 (Fig 7E). A
inoculação de FliCi induziu um aumento significativo na MIF de CD86 nos
macrófagos peritoneais M1 e M2. Porém, o LPS não foi capaz de proporcionar o
mesmo efeito, induzindo até uma modulação negativa na expressão desse marcador
nos macrófagos M2 (Fig. 7C/E). Nos macrófagos alveolares M1 e M2, a expressão
basal de CD86 foi similar (Fig. 7E). A injeção de FliCi induziu um aumento mais sutil
na expressão de CD86 nos macrófagos alveolares de animais C57Bl/6 e BALB/c,
enquanto a inoculação de LPS mostrou uma modulação significativa, com um
aumento de aproximadamente 2 vezes na MIF de CD86 nos macrófagos de ambas
linhagens (Fig 7D/E).
49
_
E
C FliC LPS C FliCi LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
*
##
##
% Macrófagos CD86
+
C57Bl/6
BALB/c
C
FliCi
LPS
C
FliCi
LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
**
#
**
C57Bl/6
BALB/c
% Macrófagos CD86
+
C
FliCi LPS
C
FliCi
LPS
0
1
2
3
**
#
*
C57Bl/6
BALB/c
Aumento da MI
1,4
3,1
5,5
29,0
2,1
3,0
5,5
5,7
65,6
137,9
108,4
10,2
123,7
&
246,7
104,8
PEC
BAL
BALB/c
C57Bl/6
B
CD86
3,6
Aumento da MIF de CD86/Controle
C FliCi
LPS
C FliCi
LPS
0
1
2
3
***
###
*
**
##
C57Bl/6
BALB/c
A
C D
&&&
Figura 7: Avaliação da expressão de CD86 por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e
48h mais tarde, o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de CD86 na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram, respectivamente,
o número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
CD86
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento da MIF de CD86 em relação a MIF de CD86 nos
macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ± DP, de 3
experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; # p<0,05, ## p<0,01 e ### p<0,001 em relação ao grupo
FliCi da mesma linhagem e
&&&
p<0,001 em relação ao grupo controle dos animais
C57Bl/6. Os números no interior dos histogramas (E) representam a MIF de CD86 nessas
populações, obtidas em um experimento demonstrativo com n=3 para cada grupo,
&
p<0,05 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são representados
por IC (controle isotípico
), Controle (animais não inoculados ), FliCi ( ) e LPS ( ).
50
_
O número relativo de macrófagos M1 e M2 que expressam CD40 no peritôneo
de animais controles foi similar ao perfil observado para a expressão de CD80 e
CD86, com os macrófagos M2 mostrando a maior porcentagem basal de células
F4/80
+
CD40
+
(Fig 8A). Em camundongos C57Bl/6, a inoculação de FliCi induziu um
aumento de 50% na porcentagem de macrófagos CD40
+
, sendo superior ao efeito
do LPS. Já os animais BALB/c revelaram um aumento de 17% na porcentagem de
macrófagos CD40
+
após a inoculação de ambos os agonistas (Fig 8A). Semelhante
ao observado na porcentagem de macrófagos alveolares CD86
+
, apenas cerca de
2% das células alveolares F4/80
+
de ambos os animais apresentam expressão basal
de CD40 (Fig 8B). Enquanto a FliCi não modulou significativamente a porcentagem
de células alveolares F4/80
+
CD40
+
, a inoculação de LPS induziu um aumento
bastante significativo na porcentagem dessas células em ambas as linhagens (Fig
8B).
A intensidade de fluorescência basal de CD40 nos macrófagos peritoneais
M2, assim como para expressão de CD80 e CD86, é superior aos macrófagos
peritoneais M1 (Fig. 8E). A inoculação de FliCi, em ambos os animais, induziu uma
modulação significativa na expressão de CD40 dos macrófagos peritoneais, sendo
mais expressiva nos macrófagos M1. Além disso, somente os macrófagos
peritoneais M1 foram responsivos ao LPS, ainda que de maneira mais sutil quando
comparado com a FliCi (Fig. 8C/E).
Nos macrófagos alveolares, a MIF de CD40 é semelhante nos macrófagos M1
e M2 (Fig.8E). A inoculação dos agonistas de TLR induziu uma modulação
significativa na intensidade de fluorescência de CD40 nos macrófagos alveolares de
ambas as linhagens, contudo o LPS foi um estímulo mais potente (Fig. 8D/E).
51
_
Esses dados nos sugerem que os macrófagos peritoneais M2 apresentam a
maior intensidade de fluorescência basal de MHCII, CD80, CD86 e CD40 que os
macrófagos M1. Ainda, a FliCi é o estímulo mais potente na modulação da
expressão desses marcadores nos macrófagos peritoneais, ainda que macrófagos
M2 se mostrem sensíveis também ao estímulo com LPS. De maneira interessante, o
compartimento bronqueoalveolar apresenta um número reduzido de macrófagos
CD86
+
e CD40
+
e essas células são mais responsivas ao LPS do que a FliCi. Assim,
podemos dizer que os macrófagos residentes em diferentes tecidos mostram
diferenças basais na expressão de MHCII e moléculas coestimulatórias e são
sensíveis a agonistas de TLR particulares.
52
_
C
FliCi LPS
C
FliCi
LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
***
#
**
**
C57Bl/6 BALB/c
% Macrófa
g
os CD40
+
C
FliCi
LPS C
FliCi
LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
***
##
**
C57Bl/6 BALB/c
% Macrófagos CD40
+
C
FliCi LPS
C
FliCi LPS
0
1
2
3
*
***
#
**
***
C57Bl/6
BALB/c
Aumento da MIF de CD40/Controle
1,4
1,7
3,1
16,2
2,1
2,6
3,1
3,6
5,7
51,4
141,0
63,3
9,6
118,6
&&
218,4
134,3
PEC
BAL
BALB/c
C57Bl/6
CD40
B
D
E
C
A
Aumento da MIF de CD40/Controle
C FliCi LPS C
FliCi
LPS
0
1
2
3
***
#
**
*
C57Bl/6 BALB/c
&&
Figura 8: Avaliação da expressão de CD40 por células F4/80
+
peritoneais e alveolares.
Camundongos C57Bl/6 e BALB/c foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e
48h mais tarde, o PEC e o BAL foram removidos. A expressão de CD40 na população
F4/80
+
foi avaliada por citometria de fluxo. Os gráficos A e B mostram, respectivamente,
o número relativo de células peritoneais e alveolares F4/80
+
CD40
+
. Os gráficos C e D
mostram, respectivamente, o aumento da MIF de CD40 em relação a MIF de CD40 nos
macrófagos controles peritoneais e alveolares. Cada barra representa a média ± DP, de 3
experimentos, com n=3 cada grupo. * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001 em relação ao
controle da mesma linhagem; # p<0,05 e ## p<0,01 em relação ao grupo FliCi da mesma
linhagem e
&&
p<0,01 em relação ao grupo controle dos animais C57Bl/6. Os números no
interior dos histogramas (E) representam a MIF de CD40 nessas populações, obtidas em
um experimento demonstrativo com n=3 para cada grupo,
&&
p<0,01 em relação ao grupo
controle dos animais C57Bl/6. Os grupos são representados por IC (controle isotípico
),
Controle (animais não inoculados
), FliCi ( ) e LPS ( ).
53
_
4.2 POLARIZAÇÃO M1/M2: UM CONCEITO REVISITADO
4.2.1 Polarização M1/M2 é observada apenas no ambiente peritoneal
Mills et al. (9), tomaram por base a produção de NO e TGF-β por
macrófagos peritoneais para descreverem o conceito de polarização dessas células.
Assim, macrófagos peritoneais provenientes de linhagens Th1 como C57Bl/6 e
B10.A foram descritos como macrófagos M1 por sua habilidade em produzir altos
níveis de NO em resposta a estímulos clássicos como LPS e IFN-γ. Em
contrapartida, macrófagos de BALB/c e DBA/2 são incapazes de produzir NO em
resposta a esses estímulos, fato que poderia ser explicado pelos altos níveis de
TGF-β secretados por essas células. Para verificar o perfil de produção de NO das
diferentes populações de macrófagos, as células aderentes obtidas do PEC ou BAL
de camundongos C57Bl/6 ou BALB/c, controles e previamente inoculados com FliCi
ou LPS, foram colocadas em cultura por 48h, com meio ou com FliCi ou LPS (1
μg/mL).
A Fig. 9A mostra que as células peritoneais aderentes (CPA) de animais
controles apresentam produção de baixos níveis de NO em resposta aos estímulos
in vitro com FliCi ou LPS. Porém, CPA obtidas de animais C57Bl/6 previamente
inoculados com FliCi, apresentam produção espontânea de níveis consideráveis de
NO, fato não observado com CPA de animais inoculados com LPS. O reestímulo in
vitro com os agonistas induziu a secreção de altos níveis de NO por CPA de animais
previamente inoculados com FliCi e LPS, sendo encontrado, na cultura desses
últimos, metade da concentração de nitrito. Em nenhuma das situações descritas
acima foi possível encontrar níveis significantes de nitrito nas culturas de CPA de
54
_
animais BALB/c, confirmando a polarização M1/M2 no ambiente peritoneal e a
deficiência dos macrófagos M2 para a produção de NO.
A produção de NO por células alveolares aderentes (CAA) foi até 7 vezes
menor do que encontrado em CPA (Fig. 9B). Interessantemente, o perfil de resposta
dos macrófagos M1 e M2 alveolares foi muito semelhante, sendo o LPS o único
estímulo capaz de induzir a secreção de níveis consideráveis de NO por CAA de
animais previamente inoculados com os agonistas de TLR in vivo.
Assim, esses resultados indicam que a FliCi é um estímulo in vivo mais
potente que o LPS para a produção de NO por macrófagos M1 peritoneais,
enquanto os macrófagos alveolares se mostram mais sensíveis ao estímulo com
LPS. Ainda, o conceito da polarização M1/M2 pode ser aplicado no compartimento
peritoneal, mas não no compartimento bronqueoalveolar.
55
_
(-)
FliCi LPS
C FliCi LPS C FliCi LPS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
[
Nitrito
]
uMol
*
#
#
&
&
C57Bl/6
BALB/c
C57Bl/6
BALB/c
*
&
C
FliCi
LPS
C
FliCi
0
10
20
30
40
50
60
70
80
&
#
#
[
Nitrito
]
uMol
A
B
LPS
Figura 9: Avaliação da produção de NO. Produção de NO por células aderentes obtidas dos
lavados peritoneal (A) e alveolar (B) de camundongos C57Bl/6 e BALB/c. Os animais
foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. ou i.n. e 48h mais tarde, o BAL e o PEC
foram removidos. As células foram colocadas em cultura para aderir por 4h, lavadas para
remoção das células não aderentes e estimuladas in vitro por 48h com apenas meio de
cultura (-), 1 μg/mL de FliCi ou 1 μg/mL de LPS. Após esse período, o sobrenadante das
culturas foi removido e o NO mensurado utilizando o Reagente de Griess Os dados
representam a média ± DP de um experimento demonstrativo, com n = 3 cada grupo. *
p<0,05 em relação ao grupo C (-), # p<0,05 em relação ao grupo FliCi (-) e
&
p<0,05 em
relação ao grupo LPS (-). Os estímulos in vivo são representados no gráfico, enquanto os
estímulos in vitro são representados por
(-) ou sem estímulo, estímulo com
FliCi e
LPS.
56
_
4.2.2 Macrófagos peritoneais como uma população heterogênea: polarização
M1/M2 no mesmo microambiente?
F4/80 é uma glicoproteína presente na superfície celular e considerada um
dos marcadores mais específicos de macrófagos murinos (55). Porém, como revisto
por Gordon et al. (11), a expressão desse marcador não é homogênea entre as
diferentes populações de macrófagos. Surpreendentemente, durante a análise do
papel da FliCi e do LPS na ativação de macrófagos M1 e M2 foi observado que os
macrófagos peritoneais se apresentam como duas populações distintas, com
expressão heterogênea de F4/80, sendo uma delas F4/80
high
e a outra F4/80
low
(Fig.
10A). Diferente do compartimento peritoneal, o compartimento alveolar apresenta
uma população homogênea de macrófagos com expressão intermediária de F4/80,
denominada F4/80
int
(Fig. 10B).
Para verificar a morfologia dessas células, as populações peritoneais F4/80
hi
e F4/80
lo
de camundongos controles foram separadas por sorting, utilizando o
FacsVantage. As subpopulações peritoneais, obtidas com uma pureza de cerca de
95% (dados não mostrados), foram colocadas em cultura por 24h em lâminas de 8
poços e coradas com o kit de coloração Instant-Prov. A análise microscópica
mostrou diferenças exuberantes entre a população F4/80
lo
e F4/80
hi
(Fig. 10A).
Enquanto a população F4/80
lo
se mostra mais alongada e polarizada, com
prolongamentos semelhantes aos dendritos presentes células dendríticas, a
população F4/80
hi
é mais arredondada, com grande citoplasma, e tem a morfologia
classicamente descrita para os macrófagos (Fig. 10A). Nesse sentido, a população
de macrófagos alveolares apresenta as mesmas características descritas acima para
a população F4/80
hi
, confirmando a morfologia clássica de macrófagos (Fig. 10B).
57
_
F4/80
high
4.2.3 Macrófagos F4/80
lo
apresentam maior expressão de mTGF-β1 e os
macrófagos F4/80
hi
expressam maiores níveis de iNOS
Como já mencionado, os macrófagos podem ser classificados em M1 e M2,
com relação ao perfil metabólico e funcional apresentado. Em resposta ao LPS ou
IFN-γ, macrófagos M1 secretam altos níveis de NO (9), uma das principais
moléculas envolvidas na capacidade microbicida dessas células (56, 57). Os
F4/80
l
ow
F4/80
A
B
F4/80
Figura 10: Caracterização fenotípica e morfológica das populações de macrófagos peritoneais
e alveolares.
As células peritoneais (A) e alveolares (B) de animais C57Bl/6 controles
foram analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão de F4/80.
Em seguida, as
subpopulações peritoneais, F4/80 e F4/80
hi lo
, foram separadas por sorting em um
FacsVantage, de acordo com a intensidade de expressão dessa molécula. As
subpopulações peritoneais, assim como os macrófagos alveolares, foram colocadas em
lâminas de cultura de 8 poços por 24h. As lâminas
foram coradas com o kit de coloração
Instant-Prov. Os slides representam um aumento de 40x em microscopia óptica. Os
experimentos foram repetidos ao menos 3 vezes, mostrando o mesmo perfil de
resultados. Os dados apresentados representam um experimento demonstrativo com
n=3 para cada grupo.
58
_
macrófagos M2 são conhecidos por secretarem espontaneamente altos níveis de
TGF-β e parecem ativados para o reparo tecidual (9-11). Assim, tomamos por base
a expressão intracelular da enzima iNOS e de TGF-β1 da membrana dessas células
para avaliar o perfil funcional das populações F4/80
lo
e F4/80
hi
.
Para verificar o perfil basal e induzido da expressão da iNOS nas
subpopulações de macrófagos peritoneais, as células obtidas do lavado peritoneal
de camundongos controles e inoculados com os agonistas de TLR foram colocadas
em cultura com meio apenas ou reestimuladas in vitro com baixas doses de rIFN-γ (1
ng/ml) por 5h, na presença de monensina (stop golgi). As células foram manipuladas
como descrito em Material e Métodos e analisadas por citometria de fluxo. Como
controle foi realizada a marcação intracelular apenas com o anticorpo secundário
marcado com biotina seguido da marcação com SA fluorescente. As populações
F4/80
hi
e F4/80
lo
foram selecionadas em janelas separadas, e foram consideradas
células positivas para iNOS, aquelas com marcação acima de seu respectivo
controle.
A população de macrófagos F4/80
hi
(Fig.11B) apresenta um número basal
30% maior de células que expressam iNOS que o encontrado na população F4/80
lo
(Fig. 11A). Porém, o comportamento das duas populações em resposta aos
agonistas de TLR foi muito semelhante, sendo que o estímulo com FliCi aumentou
de 2 a 3 vezes a frequência de células iNOS
+
dentro das duas subpopulações,
enquanto o LPS não proporcionou o mesmo efeito.
Claramente, a expressão de iNOS se torna mais estável na presença de
baixas doses de rIFN-γ, como previamente descrito (58, 59). Na presença de rIFN-γ,
a freqüência de células que expressam iNOS aumentou até 10 vezes em relação às
células obtidas dos animais controles e cerca de 3 vezes em relação às células
59
_
obtidas dos animais previamente inoculados, inclusive com LPS (Fig 11).
Curiosamente, esse efeito foi observado nas duas subpopulações, ainda que
freqüências mais altas são sempre encontradas na população F4/80
hi
.
A expressão de mTGF-β1 foi avaliada em células F4/80
lo
e F4/80
hi
obtidas de
animais controles ou inoculados previamente com os agonistas de TLR, como
previamente descrito. As células foram consideradas positivas para mTGF-β1 de
1,4
0,7
0,9
7,2
5,0
36,6
25,5
0,4
0,1
0,5
F4/80
Controle
FliCi
LPS
17
,
4
7,4
IFN-
γ
Controle
FliCi
LPS
Controle
F4/80
FliCi
LPS
(
-
)
A
F4/80
in vivo
SA
SA
in vitro
IC
IC
iNOS
B
11,4 2,8
1,0
14,3
1,4
4,5
FliCi
LPS
Controle
(
-
)
F4/80
in vivo
in vitro
iNOS
IFN-
γ
Figura 11: Avaliação da expressão de iNOS por células F4/80 (A) e F4/80 (B).
lo hi
Os animais
foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. e 48h mais tarde o PEC foi removido. As
células foram colocadas em cultura com meio de cultura (-) ou 1 ng/mL de rIFN-γ, na
presença de monensina, por 5h. Após esse período, as células foram manipuladas
utilizando o kit cytofix/cytoperm e marcadas com anti-F4/80 (FITC), IgG de coelho anti-
iNOS de camundondongo, anti-IgG de coelho marcada com biotina e SA (Cy), sendo
que os controles das marcações não foram incubados com o anticorpo anti-iNOS. Os
números apresentados nos plots mostram o número relativo de células iNOS
+
dentro de
cada população celular. Os experimentos foram repetidos ao menos três vezes,
mostrando o mesmo perfil de resultados. Os dados apresentados representam um
experimento demonstrativo com n=4 para cada grupo.
60
_
acordo com o controle de marcação de cada população, o qual foi obtido apenas
com a marcação de F4/80 e SA.
De maneira oposta à expressão de iNOS, a população F4/80
lo
é a única que
apresenta expressão basal de mTGF-β1, ainda que em apenas 3% das células (Fig.
12A). Curiosamente, porém, a inoculação dos agonistas de TLR induziu uma
modulação positiva no número relativo de células F4/80
hi
(Fig. 12B) e F4/80
lo
positivas para mTGF-β1, sendo as maiores freqüências reservadas à população
F4/80
lo
(Fig. 12A).
Esses resultados demonstram que há uma expressão preferencial de iNOS
na população F4/80
hi
e de mTGF-β1 na população F4/80
lo
, o que poderia indicar
que, em um mesmo ambiente, há macrófagos com perfis basais de ativação
distintos.
5
,
7
7,6
3,2
0
,
10,1 0,5
Controle
FliCi
LPS
0,4
0,5
0,6
Controle
FliCi
LPS
SA
SA
3,3
0
,
3
F4/80
Controle
FliCi
LPS
8,9
Controle
FliCi
LPS
mTGF-β1
F4/80
mTGF-β1
F4/80
F4/80
IC
IC
B
A
Figura 12: Avaliação da expressão de mTGF-β1 por macrófagos F4/80
lo
(A) e F4/80
hi
(B). Os
animais foram inoculados com 1 μg de FliCi ou LPS i.p. e 48h mais tarde o PEC foi
removido. As células foram marcadas com anti-F4/80 (FITC), anti-mTGF-β1 (Biotina) e
SA (Cy), sendo que os controles das marcações não foram incubados com anti-mTGF-
β1. Os números apresentados nos plots mostram o número relativo de células mTGF-β
+
dentro de cada população celular. Os experimentos foram repetidos ao menos três
vezes, mostrando o mesmo perfil de resultados. Os dados apresentados representam
um ex
p
erimento demonstrativo com n=4
p
ara cada
g
ru
p
o.
61
_
5 DISCUSSÃO
62
_
A descoberta dos receptores do tipo Toll em mamíferos revolucionou os
conhecimentos científicos a respeito do reconhecimento da imunidade inata e fez
com que esse assunto fosse amplamente explorado na literatura (46, 52). Desde
então, o que era tido como inespecífico ganhou certa especificidade, uma vez que
diferentes padrões moleculares, pertencentes a grupos distintos de patógenos,
ligam-se a receptores específicos, gerando respostas particulares. Isso quer dizer
que cada TLR liga o(s) seu(s) padrão(ões) molecular(es) e essa ligação induz uma
resposta celular peculiar que depende das moléculas adaptadoras e fatores de
transcrição envolvidos (60, 61). Nos últimos 10 anos, foram muitas as contribuições
nesse assunto, porém muitos aspectos envolvidos no reconhecimento diferencial
desses padrões moleculares necessitam de maiores elucidações.
Esses aspectos ganham ainda mais importância quando consideramos a
imensa heterogeneidade existente entre as células da imunidade inata,
especialmente nas subpopulações de macrófagos e células dendríticas. Essas
células, presentes em diferentes tecidos do organismo, são consideradas as
sentinelas imunológicas, que reconhecem o non self e iniciam e conduzem a
resposta imunológica. Assim, esse trabalho teve como objetivo principal a avaliação
comparativa da ativação de diferentes populações de macrófagos pelos agonistas
de TLR4 e TLR5. Utilizamos macrófagos provenientes de diferentes compartimentos
(espaços bronqueoalveolar e peritoneal) e com perfis de ativação distintos, M1
(provenientes de animais C57Bl/6) e M2 (provenientes de animais BALB/c), como
previamente descrito por Mills et al. (9). Dentro de todas as particularidades
encontradas, o padrão fica restrito ao fato de que o microambiente no qual as
populações celulares se encontram parece influenciar os tipos celulares recrutados
em resposta aos agonistas de TLR e a sensibilidade dos macrófagos aos mesmos,
63
_
além de determinar a expressão basal e induzida de moléculas envolvidas com a
apresentação de antígenos.
No espaço bronqueoalveolar, os dois agonistas de TLR induzem o
recrutamento de neutrófilos, como previamente demonstrado por vários grupos (37,
41, 62). Nossos dados ainda indicam que os neutrófilos são recrutados
preferencialmente em camundongos BALB/c, pelo estímulo com LPS, quando houve
um aumento bastante expressivo, de 15 vezes, no número dessas células. O LPS
apresenta o mesmo potencial neutrofílico no compartimento peritoneal, porém, de
maneira interessante, há uma clara migração preferencial de macrófagos em
resposta à FliCi para esse espaço, dados não encontrados na literatura. Uma
possível explicação para os efeitos distintos da FliCi no compartimento
bronqueoalveolar e peritoneal poderia ser dada pelo fato de que a FliCi parece ser
reconhecida de maneira distinta nesses dois compartimentos (41). Utilizando
quimeras nas quais células de medula óssea de animais TLR5
+/+
foram transferidas
para animais TLR5
-/-
irradiados, Feuillet et al. (41) demonstraram que a inoculação
i.p. de FlijB (1 µg/animal) foi capaz de induzir uma reação inflamatória caracterizada
por níveis séricos elevados de IL-6 e IL-12, mostrando a dependência da expressão
de TLR5 em células imunes para essa resposta. Porém, a intensa inflamação
neutrofílica com a presença de IL-6 e IL-12 no lavado bronqueoalveolar só foi
alcançada nos animais TLR5
+/+
, mesmo quando esses animais foram irradiados e
posteriormente reconstituídos com células da medula óssea de animais TLR5
-/-
,
sugerindo, nesse caso, o reconhecimento da FliCi por células não imunes.
O reconhecimento particular da FliCi nos dois microambientes também
poderia explicar o potencial desse agonista em aumentar a expressão de moléculas
coestimulatórias preferencialmente em macrófagos peritoneais, enquanto o LPS
64
_
modula a expressão dessas moléculas mais intensamente em macrófagos
alveolares. Experimentos conduzidos com células dendríticas humanas também
mostram efeitos distintos da FliCi e do LPS na expressão de moléculas
coestimulatórias, em que a FliCi é mais eficaz em induzir a expressão de CD80,
enquanto o LPS modula mais visivelmente a expressão de CD86, estimulando,
assim, a capacidade de apresentação de aloantígenos por essas células (63).
Porém, em células dendríticas esplênicas de camundongos, a inoculação i.p. com
FlijB ou LPS aumenta igualmente a expressão de CD80, CD86 e CD40 (41). Nesse
sentido, a resposta diferencial das populações de macrófagos a agonistas
particulares mostrou-se independente do perfil de ativação dos macrófagos
avaliados, uma vez que o comportamento foi semelhante nos macrófagos obtidos de
camundongos C57Bl/6 (M1) e BALB/c (M2). Porém, mostrou ser claramente
determinada pelo microambiente no qual essas células se encontram.
Muitas das diferenças entre as heterogêneas populações de macrófagos são
geralmente justificadas pela localização dessas células nos distintos tecidos, onde
adquirem funções especializadas (11). No entanto, as diferenças basais entre os
macrófagos residentes em tecidos distintos não são bem esclarecidas pela literatura.
Nesse sentido, nossos dados demonstram que os macrófagos peritoneais
apresentam uma expressão basal e induzida mais elevada de moléculas envolvidas
com a apresentação de antígenos do que os macrófagos alveolares. Além disso,
mostram uma modulação sutil na expressão de MHCII e CD86 quando comparada
com a expressão de CD80 e CD40. No compartimento bronqueoalveolar é
encontrado um número basal bastante reduzido de macrófagos MHCII
+
, CD86
+
e
CD40
+
, porém, a porcentagem basal de macrófagos alveolares que expressam
CD80
pode ser considerada relevante.
65
_
Ao contrário das características fenotípicas induzidas pelos agonistas, o
fenótipo basal dos macrófagos parece ser determinado também por seu perfil de
ativação. Assim, nossos experimentos demonstraram que macrófagos peritoneais e
alveolares, M1 e M2, apresentam níveis distintos de moléculas relacionadas com a
apresentação de antígenos. Surpreendentemente, a maior MIF e porcentagem basal
de células expressando MHCII, CD80, CD86 e CD40 ficam sempre reservadas aos
macrófagos peritoneais M2. Esses dados sugerem que essas células poderiam
desempenhar outras funções de maneira mais eficaz que os macrófagos M1, como a
apresentação de antígenos, apesar do menor potencial microbicida (9) e da baixa
produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-12, TNF-α e IL-23, e elevada
produção de IL-10 e TGF-β (64). Porém, nos macrófagos alveolares esse perfil não
é tão aparente, sendo ainda que os macrófagos M1 apresentam uma expressão
mais elevada de CD80 do que macrófagos M2.
Além do aumento na expressão de moléculas envolvidas com a apresentação
de antígeno, a FliCi também se mostrou mais eficaz que o LPS na indução da
produção de NO por macrófagos M1 peritoneais. Já os macrófagos M2 do peritôneo
não produziram NO em nenhuma das situações descritas, como esperado. Sabe-se
que o LPS é capaz de induzir a produção de NO em culturas de macrófagos
somente quando é administrado em altas doses (> 10 μg) (65, 66). Porém, quando
as células são pré-ativadas com IFN-γ ou IL-12 e/ou IL-18, baixas doses de LPS são
capazes de induzir a produção de níveis bastante altos de NO. Isso se explica pelo
fato de que o promotor gênico da iNOS contém dois sítios de ligação, um que se liga
ao NF-κB (ativado pela cascata intracelular dos TLR) e outro para IRF-1 (induzido
por IFN-γ) (58, 59). Assim, a produção de altos níveis de NO requer os dois sinais,
ainda que alta concentração de LPS poderia dispensar o sinal dado via IRF-1. A
66
_
mesma explicação parece se aplicar para a FliCi, uma vez que nenhum dos dois
agonistas (na dose de 1 μg/mL) foi capaz de estimular in vitro a produção de NO por
macrófagos peritoneais de animais controles. Porém, a inoculação de FliCi foi o
único estímulo capaz de induzir a produção de níveis consideráveis de nitrito (27
μM) pelos macrófagos, sugerindo que esse efeito advenha de fatores
programadores induzidos por esse agonista in vivo, como a produção de IL-12, IL-18
e IFN-γ, que estariam induzindo a ativação da iNOS via IRF-1.
De maneira interessante, o reestímulo in vitro com FliCi ou LPS dos
macrófagos provenientes de animais previamente inoculados com os agonistas
induziu uma secreção ainda mais elevada de NO, chegando a níveis de 70 μM. No
corrente ano, Bagchi et al. (66) demonstraram que o sinergismo, a programação e a
tolerância exercida por agonistas de TLR dependem da via de sinalização utilizada.
Quando macrófagos são estimulados com um agonista D (MyD88-dependente) e um
agonista I (MyD88-independente) concomitantemente, pode-se notar uma resposta
mais acentuada na produção de TNF-α, IL-6 e MIP-1α, indicando sinergismo.
Quando os macrófagos são estimulados com esses agonistas, porém com intervalo
de 20h entre os estímulos, nota-se a programação proporcionada pelo primeiro
estímulo. De maneira interessante, o estímulo seqüencial com dois agonistas D ou I
confere um estado de tolerância ou tolerância cruzada (66). Nossos resultados
sugerem que o estímulo realizado in vivo com FliCi ou LPS foi capaz de programar
os macrófagos fazendo com que, diante de um segundo estímulo com os mesmos
agonistas, a resposta fosse potencializada. Esse perfil é encontrado até mesmo
quando é utilizado o mesmo agonista para o estímulo in vivo e in vitro, contradizendo
os dados de Bagchi et al. (66).
67
_
Ao contrário do peritôneo, o LPS foi o único estímulo capaz de induzir a
secreção de níveis consideráveis de NO nos macrófagos alveolares, ainda que até 7
vezes menores do que encontrados em macrófagos peritoneais. Ainda, o perfil de
resposta dos macrófagos M1 e M2 alveolares para a produção de NO, parâmetro
fundamental para essa caracterização (9), foi muito semelhante. Esse fato parece
importante, uma vez que a polarização M1 e M2 de macrófagos, amplamente
empregada na literatura (9, 10, 16, 67), parece restringir-se ao microambiente no
qual se encontram essas células.
Porém, além das diferenças existentes entre os macrófagos residentes em
distintos microambientes, a mesma localização anatômica pode também apresentar
populações heterogêneas de macrófagos. Nesse sentido, nossos dados revelaram
que a cavidade peritoneal é constituída por duas subpopulações de macrófagos com
expressão heterogênea de F4/80, sendo uma delas F4/80
high
e a outra F4/80
low
. Já o
compartimento alveolar apresenta uma população homogênea de macrófagos com
expressão intermediária de F4/80, denominada F4/80
int
. Taylor et al. demonstraram
que a inoculação i.p. de zimosam induz um recrutamento bastante expressivo de
neutrófilos associado a um aumento no número de macrófagos F4/80
lo
, nomeados
como macrófagos inflamatórios. Ainda, a inoculação de zimosam induz uma
depleção nos macrófagos F4/80
hi
, nomeados por esses autores como macrófagos
residentes, podendo refletir a migração dessas células para o linfonodo drenante
(12). Apesar desses resultados, os autores não explicam de maneira detalhada a
existência de duas populações heterogêneas na cavidade peritoneal, sendo a
heterogeneidade dos macrófagos peritoneais um assunto ainda não abordado na
literatura.
68
_
A maioria dos trabalhos encontrados na literatura aborda as diferenças
morfológicas e funcionais existentes entre populações de macrófagos residentes em
tecidos distintos, justificando essas diferenças pela especialização e a função
adotada pelos macrófagos nos diferentes microambientes (11). Nesse sentido,
podemos citar a capacidade de remodelamento ósseo dos osteoclastos, a alta
expressão de receptores scavenger e receptores para padrões moleculares em
macrófagos alveolares e a alta capacidade fagocítica e bactericida, porém baixa
produção de citocinas pró-inflamatórias apresentada pelos macrófagos da lâmina
própria (11). Contudo, a presença de populações heretogêneas num mesmo
microambiente é compartilhada por órgãos como o baço, onde parece haver ao
menos três diferentes subpopulações de macrófagos (11, 14). Macrófagos
encontrados na polpa vermelha são células com alta expressão de F4/80 e estão
envolvidos com a remoção de eritrócitos. Já na polpa branca deste órgão, foi
demonstrada a existência de duas populações distintas de macrófagos, macrófagos
metalofílicos e macrófagos da zona marginal, os quais possuem baixa expressão de
F4/80. Os macrófagos da zona marginal são caracterizados pela expressão de altos
níveis de receptores para padrões moleculares e receptores scavenger, sendo então
associados com o clearance de patógenos. Já os macrófagos metalofílicos são
encontrados adjacentes à polpa branca e, embora sua função ainda não seja
totalmente clara, essas células parecem estar envolvidas na resposta a infecções
virais (13).
A regulação negativa na expressão de F4/80 nos macrófagos residentes
poderia explicar a existência da população F4/80
lo
. Esse fenômeno foi observado
após a infecção intraperitoneal de camundongos com o bacilo Calmette-Guérin, a
qual foi acompanhada por uma diminuição da expressão do receptor FcγR, sendo
69
_
essas modificações associadas à ativação celular (68). Fenômeno semelhante foi
observado após tratamento dos macrófagos com IFN-γ exógeno (69). Porém, a
presença das subpopulações F4/80
hi
e F4/80
lo
, em proporções bastante
semelhantes, em animais controles, levanta a hipótese da co-existência de duas
populações distintas. Ainda, as diferenças exuberantes encontradas na análise
morfológica dessas subpopulações poderia ser mais um argumento a favor dessa
hipótese. Enquanto a população F4/80
hi
apresenta morfologia clássica de
macrófagos, arredondadas, com grande citoplasma e núcleo irregular, a população
F4/80
lo
se mostra alongada e adere-se ao plástico de maneira polarizada, com
prolongamentos semelhantes aos encontrados em células dendríticas.
Esse fato nos levou a questionar a importância da co-existência dessas duas
populações no mesmo microambiente. Uma possibilidade para explicar a
convivência das duas populações no peritôneo seria dessas células assumirem
papéis distintos durante a resposta imune, como controle de patógenos,
desempenhado por macrófagos M1, e reparo tecidual, descrito para macrófagos M2
(9, 10, 67). Com relação aos parâmetros utilizados por Mills et al. (9, 10, 67) para
diferenciar macrófagos M1 e M2, nossos dados sugerem que a população F4/80
hi
apresenta uma tendência ao perfil de polarização M1, uma vez que mostra um
número basal e induzido de células iNOS
+
maior que a população F4/80
lo
. Por sua
vez, a população F4/80
lo
apresenta uma porcentagem maior de células mTGF-β1
+
do que a população F4/80
hi
, demonstrando uma tendência ao perfil M2. As duas
proteínas foram reguladas positivamente a partir dos estímulos com FliCi e LPS em
ambas as populações, mas sempre os maiores valores de células iNOS
+
ficaram
reservados aos macrófagos F4/80
hi
e a maior porcentagem de células mTGF-β1
+
foram encontradas na população F4/80
lo
. Mais uma vez, a FliCi foi o estímulo mais
70
_
eficaz na indução da expressão de iNOS, fato que poderia estar relacionado ao seu
potencial para a ativação de IL-12, uma vez que essa citocina está estritamente
ligada ao direcionamento para o perfil M1 (16).
Assim, ainda que muitas questões permaneçam abertas, tornando a
heterogeneidade desse sistema ainda mais fascinante, nossos dados nos permitem
especular que, em um mesmo microambiente, podem ser encontradas populações
de macrófagos com perfis de ativação distintos, que poderiam assumir papéis
específicos durante a resposta imune, justificando a co-existência das mesmas em
um mesmo ambiente.
.
71
_
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
_
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Br J Exp Pathol. 1965;46:62-70.
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