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Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Bioquímica e Imunologia
Papel da citocina MIF em modelos de respostas
inflamatórias sistêmicas
Flávio Almeida Amaral
Belo Horizonte
2006
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Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Bioquímica e Imunologia
Papel da citocina MIF em modelos de respostas
inflamatórias sistêmicas
Flávio Almeida Amaral
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação Fisiologia e Farmacologia
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais
como requisito para a obtenção do grau
de mestre em Farmacologia
Orientadora: Profa. Dra. Danielle da
Glória de Souza
Co-orientador: Prof. Dr. Mauro Martins
Teixeira
Belo Horizonte
Julho 2006
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Aos meus pais, Antônio e Maria José, pelo
fundamental apoio na minha vida. São
responsáveis por tudo que sou hoje. Muito
obrigado.
Aos meus irmãos, Déa, Sérgio e Adriana por
me incentivarem e acreditarem em mim em
todos os momentos e à minha sobrinha Alice.
A Bruninha por sempre estar ao meu lado em
todos os momentos.
A Deus, por me guiar nas difíceis decisões
tomadas durante o curso.
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AGRADEÇO
Ao Professor Mauro Martins Teixeira pela oportunidade de trabalho, onde me forneceu as
ferramentas necessárias para a realização desse projeto, além de sabedoria e incentivo.
A Professora Danielle da Glória de Souza por ter me aceitado como aluno de iniciação
científica e agora como aluno de mestrado, sempre me orientando de modo competente.
Obrigado por sua amizade.
A Professora Maria Salete de Abreu Castro, por contribuir com seus conhecimentos tanto
no lado científico quanto no pessoal. Apresentou-me pessoas fundamentais na minha vida
acadêmica.
Ao amigo Caio pelo companheirismo e fundamental participação neste trabalho, seja na
parte experimental ou nas discussões dos resultados.
A Landa e Carla, pelo apoio nos experimentos de Dengue.
Aos demais colegas do laboratório de Imunofarmacologia: Adriana, Adriano, Aline,
Amanda, Angélica, Antônio, Carol, Cristiana, Dani Sachs, Daniel, David, Eduardo, Ester,
Fernanda, Flávio Lopes, Ildeu, Juliana, Kátia, Márcia, Marina, Michele, Pedro, Rafael,
Remo, Rodrigo, Tiça, Vanessa Pinho, Vanessa Mendonça, Vinícius, Vivian.
Aos meus amigos de graduação, sempre presentes nos corredores do ICB e também nos
momentos de lazer.
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A Milena Soares, do Instituto Gonçalo Muniz – Fiocruz/BA, pelo fornecimento dos
animais deficientes em MIF utilizados nesse trabalho.
A Ilma, Valinéria e Dora pelo apoio técnico.
Aos técnicos do CEBIO, em especial ao Gilmar e Elmo.
Ao CNPq e FAPEMIG pelo suporte financeiro.
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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ATP: Trifosfato de adenosina
COX: Ciclooxigenase
DEN 2: Dengue sorotipo 2
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
g: grama
ºC: graus Celsius
ICAM: Moléculas de adesão intercelulares
IFN-γ: Interferon-γ
i.p.: intraperitoneal
i.v.: intravascular
I/R: Isquemia e reperfusão intestinal
KC: Keratinocyte-derived chemokine
KI: Iodeto de potássio
LTB
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: Leucotrieno B4
MAPK: Proteína quinase ativada por mitógenos
MCP-1: Monocyte chemoattractant protein-1
MIF: Fator inibitório da migração de macrófagos
MIF
-/-
: Animais deficientes em MIF
MIP-2: Macrophage inflammatory protein-2
MKP-1: MAP kinase phosphatase-1
MMP-2: Metaloproteinase-2
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µg: micrograma
µm: micrômetro
MPO: Mieloperoxidase
mg: miligrama
NaCl: Cloreto de sódio
NF-κB: Fator nuclear - kappa B
NI: Animais não infectados
NK: célula Natural Killer
nm: nanômetro
NO: Oxido Nítrico
IL: Inteleucina
OD: Densidade óptica
PAF: fator de agregação plaquetária
PBS: Phosphate Buffered Saline
PFU: Unidades formadoras de placas
RANTES: Regulated upon activation, normal T-cell expressed, and presumably secreted
RNA: Acido ribonucléico
SFB: Soro fetal bovino
Th: Linfócito T auxiliar
TNF-α: Fator de necrose tumoral- α
TNFR: Receptor do fator de necrose tumoral
VCAM: Moléculas de adesão de células vasculares
WHO: Organização mundial de saúde
WT: animais do tipo selvagem
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema simplificado mostrando o processo de desencadeamento da resposta
inflamatória mediante isquemia e reperfusão....................................................................32
Figura 2 – Ciclo de vida do vírus da Dengue....................................................................34
Figura 3 – Concentração de MIF no soro de animais selvagens.......................................53
Figura 4 – Comparação de parâmetros inflamatórios após isquemia e reperfusão
intestinal (I/R) entre animais selvagens (WT) e deficientes em MIF (MIF
-/-
)..................55
Figura 5 – Concentração de TNF-α tecidual e no soro após isquemia e reperfusão
intestinal............................................................................................................................57
Figura 6 – Avaliação do infiltrado neutrofílico no intestino e pulmão após isquemia e
reperfusão intestinal..........................................................................................................59
Figura 7 – Análise histológica no intestino entre os animais selvagens e deficientes em
MIF após isquemia e reperfusão intestinal........................................................................61
Figura 8 – Análise histológica no pulmão entre os animais selvagens e deficientes em
MIF após isquemia e reperfusão intestinal........................................................................62
Figura 9 – Curva de letalidade entre os animais selvagens (WT) e deficientes em MIF
(MIF
-/-
) após isquemia e reperfusão intestinal...................................................................64
Figura 10 – Concentração da citocina MIF no soro de animais infectados com o vírus da
Dengue...............................................................................................................................66
Figura 11 - Análise da concentração de citocinas em diferentes órgãos após infecção pelo
vírus da Dengue.................................................................................................................69
Figura 12 Análise da concentração das quimiocinas MCP-1 e de RANTES no baço e
fígado, respectivamente, após a infecção pelo vírus da Dengue.......................................70
13
Figura 13 – Avaliação do infiltrado neutrofílico e da concentração das quimiocinas MIP-
2 e KC no pulmão após infecção pelo vírus da Dengue....................................................72
Figura 14 – Determinação do valor de hematócrito e da concentração de plaquetas
circulantes após infecção pelo vírus da Dengue................................................................74
Figura 15 – Quantificação de unidades formadoras de placas (PFU) presente no sangue e
no baço dos animais infectados com o vírus da Dengue...................................................76
Figura 16 – Curva de letalidade dos animais após infecção pelo vírus da Dengue..........78
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ÍNDICE
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................23
2 JUSTIFICATIVA..............................................................................................................39
3 OBJETIVOS......................................................................................................................41
3.1 Objetivo geral.................................................................................................................41
3.2 Objetivos específicos......................................................................................................41
3.2.1 Analisar a participação da citocina MIF no modelo de inflamação induzido por
isquemia e reperfusão intestinal através dos seguintes estudos...........................................41
3.2.2 Demonstrar a importância da citocina MIF no modelo de infecção pelo vírus da
dengue mediante os seguintes testes....................................................................................41
4 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................44
4.1 Isquemia e reperfusão intestinal.....................................................................................44
4.1.1 Animais.......................................................................................................................44
4.1.2 Protocolo experimental...............................................................................................44
4.1.3 Avaliação da permeabilidade vascular........................................................................44
4.1.4 Quantificação de MPO................................................................................................45
4.1.5 Quantificação de citocinas...........................................................................................46
4.1.6 Quantificação de hemoglobina....................................................................................46
16
4.1.7 Histologia....................................................................................................................47
4.1.8 Análise estatística........................................................................................................47
4.2 Infecção pelo vírus da Dengue.......................................................................................48
4.2.1 Vírus............................................................................................................................48
4.2.2 Titulação do vírus da Dengue......................................................................................48
4.2.3 Animais.......................................................................................................................49
4.2.4 Quantificação de citocinas..........................................................................................49
4.2.5 Quantificação dos níveis de plaquetas circulantes......................................................49
4.2.6 Análise do índice de hematócrito................................................................................49
4.2.7 Análise estatística........................................................................................................50
5 RESULTADOS.................................................................................................................52
5.1 Participação da citocina MIF no modelo de isquemia e reperfusão intestinal...............52
5.1.1 Os níveis da citocina MIF encontram-se aumentados após isquemia e reperfusão
intestinal...............................................................................................................................52
5.1.2 Animais deficientes em MIF apresentam menor resposta inflamatória após isquemia
e reperfusão intestinal...........................................................................................................54
5.1.3 Animais deficientes em MIF apresentam diminuição da concentração de TNF-α no
intestino, pulmão e soro quando submetidos à isquemia e reperfusão intestinal.................56
5.1.4 Apesar da diminuição dos parâmetros inflamatórios após isquemia e reperfusão
intestinal, a ausência de MIF não interfere no influxo de neutrófilos..................................58
5.1.5 Os cortes histológicos retratam os ensaios biológicos: menor lesão em animais
deficientes em MIF, porém com grande infiltrado celular...................................................60
5.1.6 A diminuição na taxa de letalidade espelha à menor da inflamação dos animais
deficientes em MIF...............................................................................................................63
5.2 Importância da citocina MIF no modelo de infecção pelo vírus da Dengue..................65
17
5.2.1 A infecção pelo vírus da Dengue leva a um aumento da liberação da citocina MIF
circulante..............................................................................................................................65
5.2.2 Animais deficientes em MIF respondem com menor produção de citocinas e
quimiocinas após infecção....................................................................................................67
5.2.3 Animais deficientes em MIF apresentam menor recrutamento celular no pulmão após
infecção pelo vírus da Dengue.............................................................................................71
5.2.4 Animais deficientes em MIF mantêm valores basais de hematócrito e de plaquetas.73
5.2.5 Animais deficientes em MIF apresentam menor viremia e carga viral no baço.........75
5.2.6 Animais deficientes em MIF apresentam um atraso na letalidade após infecção pelo
vírus da Dengue....................................................................................................................77
6 DISCUSSÃO.....................................................................................................................80
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................94
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RESUMO
A citocina MIF tem sido amplamente estudada devido às suas importantes ações na
patogênese de diversas doenças de origem inflamatória. Seu mecanismo de ação, embora
não totalmente elucidado, consiste na indução de uma série de mediadores responsáveis
pela instalação do processo inflamatório. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi
investigar a importância da citocina MIF na reposta inflamatória em modelos de
inflamação sistêmica. Tanto no modelo de isquemia e reperfusão intestinal (I/R) quanto no
modelo de infecção pelo vírus da Dengue houve aumento de MIF circulantes nos animais
selvagens. Em I/R, animais deficientes em MIF apresentaram menor resposta inflamatória,
como verificada por menor permeabilidade vascular, nível de hemorragia e produção de
TNF-α em relação aos animais selvagens. De forma surpreendente, essa menor resposta
não decorre de menor infiltrado neutrofílico. Em relação à infecção pelo vírus da Dengue,
animais deficientes em MIF apresentaram diminuição no nível de citocinas, quimiocinas e
no infiltrado neutrofílico. Manteve valores basais de hematócrito e no número de plaquetas
circulantes. Em vista da menor resposta inflamatória observada nos animais deficientes em
MIF, houve diminuição ou atraso na letalidade após as lesões. Os dados demonstram que
MIF contribui de modo muito importante para o desencadeamento da patogênese em
ambos os modelos, onde uma intervenção de sua ação pode ser de grande relevância para a
diminuição da resposta inflamatória instalada.
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ABSTRACT
Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) is a potent pro-inflammatory
cytokine, which may induce TNF-α release and play an important role in innate immune
and inflammatory responses. The aim of this work was to assess the role of MIF in two
murine models of systemic inflammatory responses: intestinal ischemia and reperfusion
(I/R) and dengue infection. There was an increase in circulating levels of MIF in both
animal models. After I/R, vascular permeability, hemorrhage and production of TNF-α in
the intestine and lungs were lower in MIF-deficient (MIF
-/-
) than in wild type (WT) mice.
Lethality was partially prevented in MIF
-/-
mice. The reperfusion-associated neutrophil
accumulation in the intestine and lungs was similar in WT and MIF
-/-
mice. Thus, MIF
mediates tissue injury and lethality but not the influx of neutrophils, suggesting thar an
effect on the activation of neutrophils, rather than on recruitment, mediates the effects of
MIF in the system. In an experimental model of Dengue infection, MIF-/- mice showed
reduced levels of cytokines and chemokines, and prevention of infection-associated
hemoconcentration and thrombocytopenia. The latter findings were associated with a
delayed lethality in MIF
-/-
mice, but all animals eventually succumbed to the infection. IN
conclusion, our results suggest that there is production of MIF during systemic
inflammation. More importantly, it appears that MIF plays an important role in the
pathogenesis of both reperfusion-associated injury and lethality and dengue infection.
Blockers of MIF function may provide an interesting therapeutic approach for the
treatment of diseases with a systemic inflammatory component.
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1 INTRODUÇÃO
A ciência como um todo tem por objetivo investigar os fenômenos que nos
circundam. Contidos a ela, um leque de ramificações se especializam em assuntos mais
diversificados onde, desde séculos atrás, filósofos, astrólogos ou alquimistas buscavam
explicações para as constantes dúvidas da humanidade. Dentre as áreas da saúde, a
Farmacologia (do grego Farmacon = droga, logos = estudo) pode ser considerada uma
ciência relativamente nova (Wikipedia Encyclopedia). Para muitos, o alquimista
iatroquímico Theophrastus Phillipus Aureolus Bombastus von Hohenhein (Paracelsus –
1493 - 1542) é considerado o pai da Farmacologia Moderna. Ele tinha como propósito
estudar as ações de compostos presentes na natureza e no organismo. Os principais
assuntos em que se concentrava compreendiam as ações do mercúrio, do enxofre e de sais
diversos no organismo. Como teoria, Paracelsus reconhecia que todas as drogas poderiam
ser maléficas ao sistema, onde o conhecimento da dose utilizada iria determinar um efeito
terapêutico ou tóxico (Cockayne, 2002).
Seguindo a constante busca por explicações, especialidades se afunilam com o
objetivo de tornar mais minucioso o processamento de informações sobre um determinado
assunto. Assim, dentre os ramos da Farmacologia, o estudo da resposta inflamatória de um
organismo adquiriu caráter individual, hoje compreendido como um braço da
Farmacologia Moderna. Um processo inflamatório pode ser definido como uma resposta
de um tecido vivo e vascularizado contra um agente infeccioso, um antígeno ou mesmo um
estímulo irritante de natureza física ou química (Rang et al, 2004). Dessa forma, o
organismo reage com o aparecimento de sinais e sintoma característicos, ou seja, rubor,
calor, turgor, dor e perda de função tecidual, os quais variam de intensidade de acordo com
a magnitude e a natureza do estímulo, determinando a gravidade da resposta. Esses
24
indicativos ocorrem em virtude de um conjunto de alterações tanto ao nível celular quanto
molecular. Assim, modificações no fluxo sanguíneo local, alterações nas células
endoteliais dos vasos sanguíneos, aumento de extravasamento de componentes do plasma
bem como a infiltração celular para o tecido atingido pela lesão, aliados à grande produção
de mediadores inflamatórios são os responsáveis em promover toda essa resposta
complexa e estereotipada (Rang et al, 2004).
Dentre os mediadores envolvidos, um grupo de compostos recebe especial atenção
devido à ampla capacidade de regular variadas funções do sistema. Essas moléculas, as
citocinas, compreendem um conjunto de mediadores polipeptídios produzidos e liberados
por vários tipos celulares em resposta a microrganismos e outros antígenos, onde
contribuem para o desenvolvimento de uma resposta imunológica e inflamatória adequada
(Hanada & Yoshimura, 2002). Essas proteínas podem apresentar atividades
antiinflamatórias ou pró-inflamatórias, desempenhando funções pleiotrópicas, redundantes,
sinérgicas ou totalmente antagônicas umas das outras, onde o determinante dessa variação
será o estímulo para a secreção e também o órgão alvo. Além disso, determinadas citocinas
podem apresentar comportamentos ambíguos, ou seja, atuam tanto como antiinflamatórias
quanto pró-inflamatórias, dependendo do tipo de estímulo (Cavaillon, 2001). As citocinas
são capazes de exercer suas ações ao atuarem em receptores específicos presentes nas
membranas das células alvo. A ligação ao receptor é feita com alta especificidade na
porção extracelular, a partir de onde ocorre uma sinalização intracelular envolvendo
proteínas da porção citossólica (Hanada & Yoshimura, 2002).
Vários estudos têm demonstrado que a citocina MIF (Macrophage Migration
Inhibitory Factor) possui um importante papel como mediadora em processos
inflamatórios (Bozza et al., 1999; Calandra et al., 2000; Radstake et al., 2005). MIF foi
primeiramente descrita como uma linfocina liberada a partir de células T ativadas (David,
25
1966; Bloom & Bennett, 1966). Nestes trabalhos, onde os pesquisadores estudavam
reações de hipersensibilidade do tipo tardia, foi constatado que esta molécula era a
responsável pela inibição da migração randômica de macrófagos para o local atingido pela
lesão. Dessa forma, essas células passavam a ser direcionadas de maneira ordenada sob a
orientação de MIF. Entretanto, como ocorre com outras citocinas, o nome atribuído não faz
justiça ao amplo espectro de ações das quais participam. Posteriormente, a esta citocina
foram atribuídas importantes funções na resposta imune como um todo (Calandra et al.,
1994).
Em reações inflamatórias, MIF é liberada principalmente por macrófagos (Calandra
et al., 1994), células T (Calandra et al., 1994; Bacher et al., 1996; Bozza et al., 1999),
neutrófilos (Riedemann et al., 2004), células endoteliais (Shimizu et al., 2004) e pela
hipófise anterior (Bucala, 1996). MIF pode ser considerada uma proteína ubíqua, uma vez
que pode ser encontrada em uma grande variedade de células, tanto aquelas responsáveis
pela resposta imune quanto em células não relacionadas diretamente com essa atividade
(Calandra & Roger, 2003). Em vista da presença de MIF em células não associadas
ativamente com o mecanismo de defesa do organismo, atribui-se a essa citocina uma
função fisiológica (Ohkawara et al., 2005). Por exemplo, MIF já foi encontrada em grandes
quantidades em células parietais do estômago, onde estaria contribuindo para a secreção
ácida neste local (Maaser et al., 2002). Também são encontrados níveis elevados de MIF
em células β-pancreáticas, interferindo na liberação de insulina (Waeber et al., 1997).
MIF apresenta uma série de características peculiares, o que a torna distinta em
vários aspectos quando é comparada a outras citocinas. Neste contexto, uma importante
característica dessa molécula, aqui salientando seu papel crucial em respostas inflamatórias
agudas, consiste em seu processo de liberação. MIF já se encontra pré-formada e
armazenada no interior de glândulas e células, necessitando apenas do estímulo para ser
26
liberada (Calandra & Roger, 2003). Outro interessante aspecto de MIF diz respeito à sua
estreita relação com glicocorticóides, importantes agentes esteróides liberados pelas supra-
renais e que desempenham potente atividade antiinflamatória e imunossupressora (Barnes,
2006). Alguns trabalhos demonstraram que MIF é capaz de ser induzido e liberado por
glicocorticóides em baixas concentrações (Daun, 2000; Fingerle-Rowson et al., 2003). Um
trabalho recente demonstra que essa interação entre MIF e glicocorticóide pode ocorrer
através de uma regulação na cascata de fosforilações na via das MAPK (mitogen-activated
protein kinase), mais especificamente ao nível de MKP-1 (MAP kinase phosphatase 1), um
regulador do processo de fosforilação (Aeberli et al. 2006).
Como agente pró-inflamatório, MIF participa da indução da resposta inflamatória
em vários modelos experimentais de inflamação. Dentre os modelos estudados, podemos
citar a artrite reumatóide (Leech et al., 2003; Onodera et al., 2004), infarto do miocárdio
(Yu et al., 2003), sepse (Bozza et al., 1999; Calandra et al., 2000), colite (Ohkawara et al.,
2005), imunopatogênese da asma (Mizue et al., 2005) e desenvolvimento de tumores
(Wilson et al., 2005). Através do uso de várias e distintas ferramentas de estudo,
pesquisadores mostraram que, em vários modelos experimentais, MIF age na produção ou
expressão de outras moléculas de caráter pró-inflamatório, tais como algumas citocinas
(TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8) (Calandra et al., 1994), liberação de NO (Bozza et
al., 1999), ativação da via de ciclooxigenase 2 (COX-2) (Mitchell et al., 1999) e expressão
de matriz de metaloproteinases (MMP)-2 (Meyer-Siegler, 2000).
Mediante ao importante papel que essa citocina representa em um processo
inflamatório, é de grande interesse o conhecimento de qual o seu mecanismo de ação.
Assim, vários estudos são desenvolvidos com o propósito de elucidar todo o mecanismo
intracelular desencadeado por MIF. Foi verificado que MIF se liga com grande afinidade a
uma molécula de membrana, identificada como CD74 (Leng et al., 2003). Porém, essa
27
proteína não possui um domínio citossólico capaz de transduzir um sinal intracelular (Leng
et al., 2003). Em um estudo posterior, foi observado que a ligação de MIF com esse
receptor se faz mediante uma prévia interação com outra proteína de membrana, o CD44, a
qual possui uma propriedade de ativação de tirosina quinase (Meyer-Siegler et al., 2005).
Outro fato visto por pesquisadores em relação à atividade de MIF é o fato de que não é
necessária a ligação dessa citocina com uma proteína de membrana com conseqüente
sinalização intracelular. MIF pode ser endocitada pela célula alvo (Calandra & Roger,
2003). Seja por um modo ou por outro, um dos mecanismos de nível intracelular induzido
por MIF diz respeito a cascatas de fosforilação da via de sinalização ERK MAPK (Mitchell
et al., 1999; Leng et al., 2003; Lue et al., 2006). MIF tem importante papel na
superexpressão de receptor tipo Toll (TLR)-4 em macrófagos, onde pode haver a ativação
do fator de transcrição NF-κB, com a produção de citocinas pró-inflamatórias (Roger et al.,
2001). Através da fosforilação da proteína ERK, MIF promove a ativação da fosfolipase
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, promovendo a síntese dos produtos do ácido araquidônico, como a prostaglandina E
2
(Mitchell et al., 1999). Porém, as vias de sinalização intracelulares necessitam ser melhores
compreendidas.
Todo esse prévio conhecimento a respeito da citocina MIF incentivou vários
pesquisadores a buscarem maneiras de impedir que essa molécula exerça seu papel pró-
inflamatório em várias doenças. Assim, testes com as ferramentas utilizadas até o
momento, como anticorpos anti-MIF ou pequenas moléculas inibidoras do sítio ativo de
MIF, poderiam ser utilizadas como terapêutica para o controle de várias patologias
associadas com a lesão inflamatória (Morand, 2005). Outras maneiras para inibir a ação de
MIF seria o desenvolvimento de antagonistas intracelulares ou a produção de espécies
solúveis de CD74. Dessa forma, as ações de MIF podem ser inibidas tanto ao nível
intracelular, onde MIF age diretamente em proteínas intracelulares, quanto
28
extracelularmente, onde impediriam sua ligação ao CD74 de membrana (Morand et al.,
2006). Acredita-se que essas opções terapêuticas estão diretamente associadas com uma
redução de níveis de RNA mensageiro da citocina TNF-α e também menor ativação do
fator de transcrição NF-κB (Al-Abed et al., 2005).
TNF-α é uma citocina com potente atividade pró-inflamatória, associada a
múltiplos efeitos biológicos em vários tipos celulares. Está envolvida na estimulação da
expressão de moléculas de adesão tanto em células polimorfonucleares circulantes quanto
em células endoteliais, atua estimulando a síntese de outras citocinas, age em células
endoteliais induzindo a síntese de prostaciclinas, ativa fibroblastos, osteoclastos e
condrócitos (Aggarwal, 2003). Age, ainda, causando febre e liberação de proteínas de fase
aguda (Montrucchio et al., 2000). Sua ação baseia-se na ligação a dois distintos receptores
de membrana, TNF-R1 e TNF-R2 (também chamados p55 e p75, respectivamente), onde
os processos de sinalização intracelular culminam na ativação do fator de transcrição NF-
κB e também do oncogene c-jun. Assim, há uma indução da transcrição de genes
diretamente relacionados com uma resposta inflamatória (Chen et al., 2002). A produção
inapropriada de TNF-α está implicada na patogênese de um amplo espectro de importantes
doenças, como sepse (Carvalho et al., 2005), câncer (Szlosarek et al., 2006), artrite
reumatóide (Bongartz et al., 2006) e em doenças do trato gastrintestinal (Wang & Fu,
2005). Dessa forma, estratégias terapêuticas que possam impedir a ação ou mesmo
bloquear a síntese exacerbada dessa citocina tornaram-se alvo de grande investimento entre
os pesquisadores e indústrias relacionadas.
Muitos dos mediadores inflamatórios, como TNF-α, estão envolvidos em lesões de
ordem aguda, como por exemplo, isquemia e reperfusão de um órgão (Souza et al., 2001,
2002). A redução prolongada do fluxo sanguíneo (isquemia) que irriga um órgão ou um
vaso pode levar a uma significativa lesão tecidual com conseqüente morte celular. As
29
conseqüências posteriores a esse fenômeno estão entre as principais causas de morbidade e
de mortalidade no mundo (Carden e Granger, 2000). Dando ênfase à isquemia e reperfusão
intestinal, as principais situações em que há potencial interrupção do fornecimento
sanguíneo para o intestino são aneurisma da artéria aorta abdominal, estrangulamento
oriundo de hérnia e transplante intestinal (Collard & Gelman, 2001). Em outras situações
como choque séptico e hipovolêmico, este processo também pode ser instalado (Mallick et
al. 2004). A interrupção do fornecimento de oxigênio ao tecido desencadeia um conjunto
de alterações nas células endoteliais bem como nos enterócitos e células lábeis da mucosa
intestinal. Essas mudanças incluem tanto variações de ordem física, como fluidez de
membrana e desorganização de citoesqueleto, quanto à produção de agentes bioativos. A
opção terapêutica para revitalizar o tecido isquêmico é a restauração do fluxo sanguíneo
(reperfusão), seja por método cirúrgico (revascularização de urgência) ou clínico (uso de
agentes trombolíticos). Entretanto, essa restauração do fluxo sanguíneo, embora necessária
para a revitalização da função e mecanismos de reparação do tecido, acaba por exacerbar a
lesão já iniciada, pela exacerbação da resposta inflamatória, sendo comumente denominada
lesão (“injúria”) de reperfusão (para revisão ver Souza & Teixeira, 2005).
A partir do momento da instalação do processo de isquemia e reperfusão intestinal,
alguns fatores importantes explicam, de modo geral, como esta resposta sistêmica leva a
um grave desequilíbrio do organismo. Uma das graves conseqüências deste quadro refere-
se a disfunções no processo de absorção de nutrientes por parte das células intestinais, o
que pode contribuir com a alta taxa de mortalidade (Kuenzler et al., 2002). Outro
considerável aspecto diz respeito a uma translocação bacteriana, ou seja, a passagem de
bactérias do trato gastrintestinal para outros locais por meio da mucosa epitelial, provocado
por uma hiperpermeabilidade intestinal (Cicalese et al., 2001). Com isso, a probabilidade
de disseminação de bactérias para todo o sistema é muito alta, onde o quadro de sepse,
30
choque e falência múltipla dos órgãos pode ser instalado. Somado aos itens acima, pode
ocorrer também sérias lesões em órgãos distantes. Dependendo da intensidade da reação
inflamatória a partir do local onde houve o processo de isquemia e posteriormente de
reperfusão, os mediadores inflamatórios atingem a circulação sanguínea e alcançam órgãos
como o pulmão e o sistema cardiocirculatório (Souza et al., 2003a; Tian et al., 2006).
Dentre os mediadores responsáveis por estas lesões, as espécies reativas de
oxigênio (peróxido de hidrogênio e íon superóxido) e as citocinas pró-inflamatórias têm
crucial participação. A disseminação dessas moléculas pelo organismo pode levar à
síndrome de resposta inflamatória sistêmica, o que pode prosseguir para uma falência
múltipla de órgãos (Mallick et al., 2004). Grande parte da produção dessas espécies
reativas de oxigênio resume-se à ação da enzima xantina oxidase, a qual está aumentada
nos processos isquêmicos (Wattanapitayakul & Bauer, 2001). Uma outra enzima, a
hipoxantina, oriunda da catabolização do ATP, também se encontra em maior quantidade
neste período. Com a chegada de oxigênio, mediante o processo de reperfusão, tanto a
hipoxantina quanto a xantina oxidase reagem com o íon O
2
-
, levando à produção dos
radicais livres (Wattanapitayakul & Bauer, 2001). Como conseqüência das ações dessas
moléculas, há uma série de eventos que podem levar ao início de uma resposta inflamatória
ou mesmo a uma exacerbação do processo já instalado. Dentre suas ações, pode ser citada
a produção do fator de ativação plaquetária (PAF), formação de moléculas do sistema de
complemento e ativação de fatores de transcrições, com a formação de moléculas de
adesão(Carden & Granger, 2000).
Todo o desenvolvimento da resposta inflamatória após isquemia e reperfusão
intestinal, além de interferir na parte física das células, como vasodilatação e aumento de
permeabilidade vascular, contribui de forma marcante no recrutamento de células
inflamatórias para o local da lesão e também em órgãos distantes (Carden & Granger,
31
2000). Assim, os neutrófilos, principais células envolvidas, migram de maneira ativa e
coordenada (processo de rolamento, adesão e transmigração), com crucial participação das
moléculas de adesão (selectinas, integrinas, ICAMs e VCAMs) e dos fatores
quimioatraentes, como o leucotrieno B4 (LTB4), moléculas do sistema de complemento,
PAF e quiomicinas. Uma vez ativadas, estas células contribuem ainda mais para a
exacerbação da inflamação devido à liberação de uma série de outros mediadores
inflamatórios, como as citocinas, produção de radicais livres e secreção de enzimas
proteolíticas.
Nosso grupo, nos últimos anos, tem se dedicado ao estudo de estratégias que
diminuam lesões induzidas por isquemia e reperfusão intestinal em modelos animais (para
revisão ver Souza & Teixeira, 2005). Esses estudos incluem o estudo da citocina TNF-α,
onde a utilização de anticorpos anti-TNF-α (Souza et al., 2001) foi eficaz na redução do
infiltrado neutrofílico, na produção de mediadores inflamatórios e prevenção da letalidade.
Outras estratégias basearam-se na utilização de compostos que bloqueiam o recrutamento
de neutrófilos, como a fucoidina, que inibe a expressão de moléculas de adesão (selectinas)
(Souza et al., 2000), e a repertaxina, antagonista de CXCR2 (Souza et al., 2004a). Ainda, a
utilização de camundongos deficientes do receptor de PAF e também a utilização de
antagonistas deste receptor evidenciaram a importante participação do PAF no processo
inflamatório provocado por isquemia e reperfusão, onde houve diminuição de TNF-α e
aumento de IL-10 (Souza et al., 2000, 2003b).
Todos estes fatores que levam ao desenvolvimento da resposta inflamatória
encontram-se esquematizado de forma sucinta na figura 1.
32
Conforme mostrado acima, vários estudos relacionados à isquemia e reperfusão
descrevem a importância da citocina TNF-α como responsável por grande parte da lesão.
Uma vez liberada essa citocina é capaz de induzir a produção de mediadores inflamatórios
no local e em órgãos distantes, promovendo um recrutamento de neutrófilos para essas
áreas (Souza et al., 2000, 2004; Cavriani et al., 2004). Estas ações pró-inflamatórias da
citocina TNF-α também são constantemente observadas em casos de infecções, seja por
Figura 1: Esquema mostrando o processo de desencadeamento da resposta inflamatória
após isquemia e reperfusão. O processo de isquemia e reperfusão leva a uma disfunção na
produção de espécies reativas de oxigênio, com conseqüente produção de fatores
quimiotáticos pelas células endoteliais, os quais são responsáveis pelo infiltrado de
neutrófilos no tecido lesado. Retirado da revisão de Carden, 2000.
33
bactérias, vírus ou outros parasitas (Schluter & Deckert, 2000). Mais especificamente, já
foi demonstrado uma importante participação dessa citocina no desencadeamento da
resposta inflamatória induzida por infecção pelo vírus da Dengue, tanto em modelos com
animais de experimentação (Atrasheuskaya et al., 2003), quanto em casos clínicos (Lei et
al., 2001). Dessa forma, o tratamento com anticorpo anti-TNF-α foi eficaz na redução de
mortalidade em camundongos infectados como o vírus da Dengue (Atrasheuskaya et al.,
2003).
A dengue é uma doença que vem recebendo especial atenção pelo setor de saúde
em virtude do aumento espantoso do número de pessoas infectadas em todo o mundo ao
longo das últimas décadas. Estima-se que cerca de 50 a 100 milhões de pessoas sejam
infectadas a cada ano pelo vírus da dengue e que, dentre esses casos, 250 a 500 mil pessoas
desenvolvem a forma mais grave da doença, ou seja, a forma hemorrágica (Shresta et al.,
2004). Dados da Organização Mundial de Saúde registraram em 2005 o número superior a
158.000 casos de dengue no Brasil, sendo que houve 25 mortes entre os contaminados
(WHO). Em Belo Horizonte, até o mês de Maio deste ano, já foram confirmados 105 casos
de Dengue clássico, com 782 casos notificados (http://www.pbh.gov.br/smsa/bhdengue/).
O vírus da Dengue pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus. Ele é
composto por um filamento único de ácido ribonucléico (RNA), de sentido positivo, sendo
revestido por 3 proteínas de ordens estruturais que dão um formato icosaédrico. São
representados por quatro sorotipos distintos, nomeados em ordem numérica de 1 a 4
(Mukhopadhyay, 2005). Até meados de 2005, o sorotipo 4 não se encontrava circulante
pelas limitações do território brasileiro. Porém, no final do mesmo ano, pesquisadores já
alertaram sobre a presença desse sorotipo, oriundo, provavelmente, através da fronteira
com a Venezuela (http://www.unb.br/fm/noticias/not171105.htm). É classificado como
um arbovírus, uma vez que é transmitido para o ser humano através da picada de fêmeas de
34
duas espécies distintas, Aedes aegypti e A. albopictus, sendo que esta última não se
encontra no continente americano (Mukhopadhyay et al., 2005).
O ciclo de transmissão do vírus da Dengue tem início a partir da picada do
mosquito em uma pessoa contaminada, onde o vírus presente na circulação é ingerido pelo
artrópode. Uma vez dentro do mosquito, o vírus se multiplica no intestino médio e,
posteriormente, são encontrados vírus também no ovário, sistema nervoso e, finalmente,
nas glândulas salivares, local este por onde o vírus é transmitido através da picada do
vetor. O vírus da Dengue, quando cai na circulação sanguínea, passa a se multiplicar em
órgãos específicos, como o baço, fígado e tecidos linfáticos. Após este período, que varia
de quatro a sete dias, retorna à circulação sanguínea, onde há o aparecimento dos primeiros
sintomas.
Figura 2: Ciclo de vida do vírus
da Dengue. A transmissão do
vírus da Dengue ao homem
(hospedeiro definitivo) ocorre
através da picada do mosquito
infectado (hospedeiro
intermediário), que, por sua vez,
se contamina ao picar um
homem infectado. Em cada
hospedeiro, o vírus infecta
órgãos específicos, nos quais
ocorre multiplicação viral.
35
Há consideráveis motivos que explicam um número tão alto de casos de dengue
pelo mundo. A transição rural-urbana que ocorreu em vários países na busca de melhores
perspectivas de vida culminou em um desordenado alojamento de pessoas nas grandes
cidades. Uma vez que estas cidades não estavam estruturalmente preparadas para atender
uma demanda tão alta de migrantes, carências no saneamento básico, como fornecimento
adequado de água, coleta de lixo e rede de esgoto adequados contribuíram para a
multiplicação do vetor e conseqüente disseminação do vírus (Rigau-Perez et al., 1998).
Isso, aliado à falta de educação ambiental da população, como o armazenamento de
garrafas plásticas, potes, pneus, dentre outros, em locais inapropriados, aumentou
consideravelmente o número de criadouros do mosquito transmissor.
A infecção pelo vírus da Dengue pode desencadear dois tipos de respostas: a
primeira caracteriza-se pela forma clássica, onde são observados sinais e sintomas comuns
a outras doenças, como dor de cabeça, dor retro-orbital, mialgia, artralgia, eritema,
leucopenia e trombocitopenia (Lei et al., 2001). A segunda forma, extremamente grave, é
conhecida como dengue hemorrágico, onde há uma síndrome de aumento permeabilidade
vascular aguda acompanhada por anormalidades na hemostasia, o que pode levar ao
quadro de choque em virtude de hemoconcentração e de considerável trombocitopenia (Lei
et al., 2001). O quadro clínico inclui vazamento plasmático, tendência a sangramento (Lei
et al., 2001) e envolvimento hepático (Paes et al., 2002). Em raras circunstâncias, a forma
hemorrágica seguida pela síndrome de choque pode envolver sintomas graves no sistema
nervoso central, como perda de consciência, convulsões e encefalite (Ramos et al., 1998;
Solomon et al., 2000).
A principal hipótese que explica o desencadeamento do quadro de dengue
hemorrágico seria uma reinfecção viral com um sorotipo diferente ao previamente
diagnosticado. Dessa forma, uma produção de anticorpos contra o primeiro sorotipo
36
aumentaria as possibilidades de entrada na célula por um outro sorotipo (Lin, et al., 2002;
Rothman, 2004). Esta facilitação estaria relacionada com o receptor da porção Fc (FcR) do
anticorpo, presente em alguns tipos celulares (Huang et al., 2006), onde a interação Fc-FcR
provocaria um aumento da infecção. Porém, uma infecção primária pode desenvolver o
quadro de dengue hemorrágico, variando de indivíduo para indivíduo, com mecanismos
ainda não esclarecidos.
A partir do momento em que uma pessoa ou animal são infectados pelo vírus da
Dengue, o organismo responde com uma grande produção de moléculas pró-inflamatórias
(Chaturvedi et al., 2000; Lei et al., 2001; Lin et al., 2002). Há um aumento na expressão de
citocinas (IFN-γ, IL-6, TNF-α), quimiocinas (RANTES, IL-8), moléculas do sistema de
complemento e moléculas de adesão. Em um estudo com o vírus causador da Encefalite
Japonesa, pertencente à mesma família do Dengue, foi verificada uma importante
participação da citocina MIF no desencadeamento da resposta inflamatória (Suzuki et al.,
2000). Neste trabalho, os pesquisadores observaram a presença de MIF no cérebro dos
camundongos infectados e também um aumento na expressão de TNF-α no mesmo local.
Em estudo mais recente, foi diagnosticado que, em pacientes infectados com dengue, há
um elevado nível circulante de MIF, onde seu aparecimento se sobrepõe com os casos mais
graves da doença (Chen et al., 2006).
Um outro aspecto que acompanha a evolução dessa doença é uma lesão em células
endoteliais. Devido a isso, plaquetas presentes na circulação são passíveis de seqüestro
pelas células danificadas, contribuindo para o desenvolvimento de trombocitopenia. Além
do mais, a infecção pelo vírus da Dengue em células endoteliais induz a produção de
citocinas e altera a expressão de moléculas de adesão (Dewi et al., 2004). Células ativas do
sistema imune também são alvos da infecção pelo vírus da dengue. Tais células englobam
as células dendríticas, células Natural Killer (NK), linfócitos T e B, macrófagos e
37
monócitos (Lei et al., 2001). Assim, uma gama de mediadores inflamatórios é produzida,
os quais podem tanto proteger quanto prejudicar o organismo, de acordo com variações
individuais ou número de infecções.
Além de pesquisas em busca de fármacos que diminuam os sintomas da Dengue, há
intenso estudo pela busca de medidas profiláticas que visam reduzir o número de infecções
por este vírus. Neste contexto, o desenvolvimento de vacinas seria de grande importância.
Porém, ainda não foi desenvolvida qualquer vacina que combata, de maneira eficaz, essa
enfermidade. O grau de dificuldade baseia-se no fato de que é preciso desenvolver uma
vacina contra os quatro sorotipos diferentes, visto que uma vacina que combata apenas um
sorotipo pode ser muito perigosa no caso de uma reinfecção com outro sorotipo,
exacerbando a resposta inflamatória (Chaturvedi et al., 2005). Konishi et al. (2006)
desenvolveram um tipo de vacina tetravalente. Contudo, apesar da indução de anticorpos
contra os quatro sorotipos, é necessário muito estudo para estabelecer uma efetividade
satisfatória. Voltando a atenção para o vetor, há também intensa pesquisa em impedir que o
vírus da Dengue se multiplique no mosquito transmissor (Clayton, 2006). Nesse último
caso, ferramentas como RNAi contra o material genético deste vírus já estão em estudo.
Outra questão debilitante enquadra-se na ausência de modelos experimentais
adequados para o estudo de infecção pelo vírus da Dengue. Embora vários modelos
animais sejam sugeridos, modelos que mimetizam de forma equivalente ao que acontecem
em humanos precisam ser melhores estudados. As limitações encontradas nos modelos
propostos na literatura se devem principalmente a alta carga viral injetada em
camundongos adultos (cerca de 10
8
LD
50
) ou a utilização de camundongos recém nascidos,
os quais não apresentam sistema imune maduro.
38
J
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T
I
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39
2
JUSTIFICATIVA
A citocina MIF tem sido amplamente estudada em vários modelos de inflamação,
onde são demonstrados uma crucial participação dessa molécula no desencadeamento de
respostas inflamatórias. Seu mecanismo de ação ainda permanece não totalmente
elucidado, o que torna interessante o estudo em outros modelos experimentais para mais
esclarecimentos. Dessa forma, propusemos um estudo em dois modelos inflamatórios
distintos: o primeiro, de origem não infecciosa, é representado por isquemia e reperfusão
intestinal. O segundo tem origem a partir de uma infecção pelo vírus da dengue. Ambos os
modelos representam dois importantes problemas de saúde pública, uma vez que atinge
grande parcela da população. Além disso, não há um tratamento eficiente para as doenças
associadas com esses modelos, o que torna de extrema relevância o estudo de mediadores
que podem, potencialmente, gerar estratégias terapêuticas a serem utilizadas no tratamento
das mesmas.
40
O
O
B
B
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I
I
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S
41
3
OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral: investigar a importância da citocina MIF na resposta inflamatória em
modelos de inflamação sistêmica.
3.2 Objetivos específicos e abordagem experimental
Os modelos que utilizamos para avaliar o papel da citocina MIF são: isquemia e
reperfusão intestinal e resposta inflamatória desencadeada pela infecção com o vírus da
dengue.
3.2.1 Analisar a participação da citocina MIF no modelo de inflamação induzido por
isquemia e reperfusão intestinal através dos seguintes estudos:
- verificar a produção de MIF nos animais selvagens após isquemia e
reperfusão intestinal;
- verificar a taxa de letalidade utilizando animais deficientes em MIF (MIF
-/-
)
e compará-los com animais selvagens;
- analisar os parâmetros inflamatórios (permeabilidade vascular, hemorragia,
níveis de citocinas e infiltração de neutrófilos) no intestino e pulmão dos
animais (MIF
-/-
e selvagens) submetidos a isquemia e reperfusão intestinal
e compará-los com animais falso-operados (sham).
3.2.2 Demonstrar a importância da citocina MIF no modelo de infecção pelo vírus da
dengue mediante os seguintes testes:
- verificar a produção de MIF nos animais selvagens após infecção com o
vírus da Dengue;
- comparar a taxa de letalidade dos animais MIF
-/-
e selvagens após infecção
pelo vírus da Dengue;
42
- analisar os parâmetros inflamatórios devido à infecção com o vírus do
dengue. Serão avaliados os níveis de citocinas e quimiocinas e infiltração de
neutrófilos. Analisar o nível de hematócrito e também o número de
plaquetas circulantes.
- após a infecção pelo vírus, verificar a quantidade de vírus pela formação de
placas em células Vero em animais MIF
-/-
e compará-los com animais
selvagens.
43
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M
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44
4. MATERIAL E MÉTODOS
1. Isquemia e reperfusão intestinal
1.1 Animais
Foram utilizados camundongos das linhagens SV129 e C57/BL6 (selvagens – WT e
deficientes em MIF – MIF
-/-
), provenientes do Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz -
Fiocruz/BA e do Centro de Bioterismo da Universidade Federal de Minas Gerais. Os
animais utilizados eram machos, com idade entre 8 a 10 semanas, e mantidos no biotério
do Laboratório de Imunofarmacologia com livre acesso à água e ração.
1.2 Protocolo experimental
Camundongos foram anestesiados com uretana (1400 mg/Kg, i.p.) e submetidos à
laparotomia. A artéria mesentérica superior (AMS) foi isolada e a isquemia foi induzida
por total oclusão da AMS por 60 minutos. Após este período de isquemia, a reperfusão foi
iniciada por remoção da oclusão e, 60 minutos após, os animais foram sacrificados e houve
remoção dos tecidos para as análises. Animais falso-operados (sham) foram utilizados
como controle para as lesões induzidas por reperfusão pós-isquemia. Neste grupo, após a
anestesia, os animais eram submetidos à laparotomia, a MAS era isolada, porém sem a sua
oclusão.
1.3 Avaliação da permeabilidade vascular
O extravasamento de Azul de Evans para o tecido foi usado como índice de
aumento de permeabilidade vascular (De Matos et al., 1999). Azul de Evans (2%) foi
administrado (1 mL/kg, i.v.) pela veia caudal 5 minutos antes da reperfusão do leito
45
isquêmico. Após o sacrifício dos animais, um fragmento de 10 cm de duodeno foi cortado
e colocado em placa de Petri para secagem por 24 horas em estufa a 37
o
C. Em seguida, foi
adicionado 1 mL de formamida por 24 horas para extração do corante no tecido seco. O
corante extraído do tecido foi quantificado em leitor de ELISA (comprimento de onda de
620 nm) e a concentração determinada através de curva padrão de 0.375 a 10 µg/mL de
Azul de Evans. Os resultados foram expressos como quantidade de Azul de Evans por 100
mg de tecido seco.
1.4 Quantificação de mieloperoxidase (MPO)
Para avaliar o acúmulo de neutrófilos no intestino e pulmão, foi utilizado o método
de quantificação da atividade de mieloperoxidase como descrito previamente (De Matos et
al., 1999; Ivey et al., 1995). Brevemente, um fragmento de intestino e parte do pulmão
direito (lavado com 10 mL de solução salina, através de perfusão retrograda da veia
pulmonar) foram pesados e picados, suspensos a 5% em salina EDTA, submetido à
homogeneização e centrifugação (3000 g, 10 minutos) .
O sobrenadante foi desprezado e o componente residual (pellet) ressuspendido em
1,5 mL de NaCl 0.2% gelado e 1,5 mL de NaCl 1.6% com glicose 5% gelada para cada
100 mg de tecido. Realizou-se nova centrifugação a 3000 g por 10 minutos. Novamente, o
sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em tampão fosfato com HTAB a 5% e
re-homogenizado por 30 segundos. As amostras foram congeladas e descongeladas
seguidamente (3 vezes) em nitrogênio líquido, submetidas novamente a centrifugação
(3.000 g por 15 minutos) e os sobrenadantes coletados para ensaio de MPO. A atividade de
mieloperoxidase (MPO) das amostras foi determinada através de leitor de ELISA (450 nm)
usando tetramethylbenzine (1.6 mM) e H
2
0
2
(0.5 mM). Os resultados foram expressos
46
unidades relativas por comparação da O.D. do sobrenadante do tecido com neutrófilos do
peritôneo de camundongos processados da mesma maneira.
1.5 Quantificação de citocinas
Os níveis de citocinas foram medidos no soro, intestino e pulmão através de ELISA
(Rees et al., 1999). O soro foi obtido por coagulação do sangue (15 minutos a 37
o
C
seguidos de 30 minutos a 4
o
C), centrifugado a 3000rpm por 15 minutos e estocados a –20
o
C para posterior análise. Cem miligramas de duodeno ou pulmão de animais sham e de
animais submetidos à isquemia e reperfusão foram homogeneizados com PBS contendo
antiproteases (0.1 mM PMSF, 0,1 nM benzethonium clorídrico, 10 mM EDTA e 20 KI
aprotinina A) e 0,05% Tween20. As amostras foram então centrifugadas por 10 minutos a
3000 g e o sobrenadante utilizado para o ensaio de ELISA com diluições variadas de tecido
para tecido. O ensaio de ELISA foi realizado mediante instrução do fabricante (R&D
System) e a absorbância obtida em leitor de ELISA a 492 nm.
1.6 Quantificação de hemoglobina
O nível de hemoglobina foi utilizado como índice de hemorragia tecidual. Após
lavagem e perfusão do intestino para remover excesso de sangue do espaço intravascular,
uma amostra de aproximadamente 100 mg de duodeno foi retirada e homogeneizada com
reagente de cor Drabkin (Analisa, Belo Horizonte). A suspensão foi centrifugada por 15
minutos a 3000 g e filtrada com filtro de 0.2 µm. A solução resultante foi lida em leitor de
ELISA com o comprimento de onda de 520 nm. A curva padrão foi feita utilizando o
padrão de hemoglobina. As concentrações utilizadas foram de 400 a 25 mg de
hemoglobina.
47
1.7 Histologia
Após o procedimento cirúrgico, os animais foram sacrificados e o intestino e o
pulmão foram retirados e armazenados em Formol Tamponado (10% em PBS) por 18
horas e em álcool (70%) até o processamento das amostras. Para o processamento, os
tecidos sofreram passagens subsequentes em etanol em diferentes concentrações (80%,
90%, absoluto 1 e 2 – 30 minutos cada), xilol (1 e 2 – 20 a 30 minutos cada) e em parafina
líquida (Paraplast Sigma; 1 e 2 – 30 minutos).
Após a solidificação da parafina (24 horas), foram realizados os cortes dos tecidos
em micrótomo (espessura de 5µm). Os cortes foram colocados em água morna e, em
seguida, postos em lâminas de vidro. Após essa fase, os cortes foram desparafinizados
(xilol – 20 minutos; álcool absoluto, 90%, 80% e 70% – 5 imersões; água). Os cortes
foram corados com Hematoxilina de Harris (20 segundos) e Eosina (8 segundos). Em
seguida, houve desidratação (álcool 70, 80, 90% e absoluto 1 e 2 – 5 imersões; xilol 1 e 2 –
5 imersões) e montagem das lâminas com Bálsamo do Canadá sintético.
1.8 Análise estatística
Os resultados são apresentados como a média ± EPM (erro padrão da média) por
grupo de 4 a 5 animais. Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando o teste t
não paramétrico ou a análise de variância a um critério (ANOVA ONE-WAY), seguido de
comparações múltiplas de Newman-Keuls. Os níveis de significância foram estabelecidos
em p<0,05.
48
2. Infecção pelo vírus da dengue
2.1 Vírus
Neste projeto foi utilizado o sorotipo 2 (DEN 2). O vírus foi isolado de amostra
clínica pelos Dr. George Ignatyev do Vector Institute da Rússia depositado no banco de
dados do Gene Bank sob o número de acesso AY927231.
Para aumentarmos a virulência dos isolados no hospedeiro murino, o vírus foi
injetado intracerebralmente em camundongos. No quinto dia após a infecção, os cérebros
foram retirados destes animais, foi feito um homogenato e, novamente, injetado
intracerebralmente em outro animal. Várias passagens foram realizadas como descrito
anteriormente (Atrasheuskaya et al., 2003).
2.2 Titulação do vírus da Dengue
Células Vero foram crescidas em meio DMEM com 5% de SFB, sendo implantadas
em placa de seis poços a uma densidade de 1,5x10
6
células/poço. 450 µL de uma série de
diluições seriadas contendo o vírus a ser titulado foram inoculados em células com
monocamadas recém fechadas, sendo que como controle foi utilizado um poço com células
não infectadas. Após uma hora de incubação do inóculo, o meio foi desprezado, e as
células lavadas com PBS. Em seguida, foi adicionado meio DMEM contendo 1.5% de
carboximetilcelulose e as placas incubadas a 37
o
C por 7 dias. As placas foram coradas com
solução 1% (p/v) de cristal violeta em PBS 1X para a determinação do título das amostras,
as quais foram expressos em PFU/mL (unidades formadoras de placas por mililitro).
49
2.3 Animais
Foram utilizados camundongos Balb/c (8 semanas; selvagens – WT e deficientes
em MIF – MIF
-/-
). Os animais foram infectados com o sorotipo 2 do dengue
(1LD
50
/100µL/animal) e mantidos em micro-isoladores com livre acesso a água e ração.
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética animal da UFMG. Os
animais foram sacrificados no 3º, 5º e 7º dia após a infecção para análise dos parâmetros
inflamatórios.
2.4 Quantificação de citocinas
Níveis de citocinas foram medidos no soro, fígado e baço através de ensaio
enzimático (ELISA). O soro foi obtido por coagulação do sangue (15 minutos a 37
o
C
seguidos de 30 minutos a 4
o
C) e estocado a –20
o
C para posterior análise. Cem miligramas
de fígado ou baço foram homogeneizados com PBS contendo antiproteases (0.1 mM
PMSF, 0,1 nM benzethonium clorídrico, 10 mM EDTA e 20 KI aprotinina A) e 0,05%
Tween20. O ensaio de ELISA foi realizado de acordo com instruções do fabricante (R&D
System) e lido em leitor de ELISA a 492 nm.
2.5 Quantificação dos níveis de plaquetas circulantes
No momento do sacrifício dos animais, 150µL de sangue heparinizado foram
coletados e levados para quantificação de plaquetas em laboratório de análises clínicas, em
aparelho Coulter Counter S-Plus JR
2.6 Análise do índice de hematócrito
Uma pequena amostra de sangue de cada animal foi retirada por meio de um capilar
de vidro, o qual foi centrifugado em uma centrífuga específica (rotação por 10 mim).
50
Depois disso, foi feita uma proporção entre o comprimento das porções vermelha
(concentração de elementos do sangue) e branca (concentração de plasma), através de uma
regra de três simples:
Quanto maior o valor obtido, maior será a concentração de hemácias no sangue.
2.7 Análise estatística
Os resultados são apresentados como a média ± EPM por grupo de 4 a 5 animais.
Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando a análise de variância a um
critério (ANOVA ONE-WAY), seguido de comparações múltiplas de Newman-Keuls. Os
níveis de significância foram estabelecidos em p<0,05.
Branco + Vermelho 100
Vermelho
X
51
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
52
5 RESULTADOS
5.1 Participação da citocina MIF no modelo de isquemia e reperfusão intestinal
5.1.1 Os níveis da citocina MIF encontram-se aumentados após isquemia e reperfusão
intestinal
Em virtude da grave lesão causada por isquemia e reperfusão intestinal (I/R)
demonstrado em outros trabalhos do grupo (Souza et al., 2002, 2003a, b, 2004a) e de
acordo com trabalhos em diferentes modelos de inflamação, nos quais a citocina MIF é
responsável pela liberação de variadas moléculas pró-inflamatórias (Bozza et al., 1999;
Mitchell et al., 1999; Meyer-Siegler, 2000), nosso primeiro passo foi verificar se o
processo de isquemia e reperfusão intestinal leva a um aumento da liberação dessa citocina
no soro de animais submetidos à I/R.
Conforme demonstrado na Figura 3, há significativo aumento dos níveis de MIF
após I/R quando comparados com os animais falso-operados. Este primeiro dado indica
uma possível participação de MIF no desencadeamento da resposta inflamatória neste
modelo experimental. Baseado neste resultado, o nosso próximo passo foi verificar o papel
dessa citocina no processo de isquemia e reperfusão intestinal, utilizando animais
deficientes em MIF.
53
0
300
600
900
1200
Sham I/R
**
MIF (pg/mL)
Figura 3: Concentração de MIF no soro de animais selvagens. Esta figura mostra um
aumento nos níveis de MIF no soro quando os animais são submetidos à isquemia e
reperfusão intestinal em relação aos animais falso operados. ** p<0,01.
54
5.1.2 Animais deficientes em MIF apresentam menor resposta inflamatória após
isquemia e reperfusão intestinal
O procedimento de isquemia e reperfusão intestinal promove uma resposta
inflamatória local e sistêmica, onde podem ser observados, dentre outros fatores, um
aumento da permeabilidade vascular e também um quadro de hemorragia (Carden et al.,
2000). Conforme demonstrado na Figura 4, os animais selvagens apresentaram
significativo aumento de permeabilidade vascular (caracterizado por aumento na
concentração do corante Azul de Evans no tecido) bem como aumento no nível
hemorrágico (caracterizado pelo aumento dos níveis de hemoglobina no tecido) no
intestino. Estes aumentos não foram observados nos animais deficientes em MIF. Uma vez
que a inibição destes parâmetros inflamatórios é quase total nos animais MIF
-/-
(em relação
aos animais falso-operados), estes resultados sugerem a citocina MIF possui papel crucial
no desencadeamento da resposta inflamatória induzida por isquemia e reperfusão
intestinal.
Como relatado anteriormente, o processo de isquemia e reperfusão intestinal
acomete o organismo de modo sistêmico, fato esse representado por alterações em órgãos
distantes, como o pulmão (Souza et al, 2003a, 2004b; Tian et al., 2006). Nossos dados
demonstram que a ausência da citocina MIF também reduz o aumento na permeabilidade
vascular no pulmão de animais submetidos à isquemia e reperfusão intestinal (Figura 4B).
Estes dados reforçam a participação de MIF neste modelo.
55
Intestino
Sham I/R Sham I/R
0
3
6
9
W T
MIF
-/-
***
#
Azul de Evans (µ
µ
µ
µ
g per 100
mg de tecido)
Pulmão
Sham I/R Sham I/R
0
2
4
6
8
W T
MIF
-/-
*
Azul de Evans ( µ
µ
µ
µ
g per 100
mg de tecido)
Intestino
Sham I/R Sham I/R
0
100
200
300
W T
MIF
-/-
***
#
Hemoglobina (
µ
µ
µ
µ
g/100mg de
tecido)
A
B
C
Figura 4: Compa
ração de parâmetros inflamatórios após isquemia e reperfusão intestinal
(I/R) entre animais selvagens (WT) e deficientes em MIF (MIF
-/-
). Após (I/R), os animais
WT apresentaram significativo aumento de permeabilidade vascular tanto no intestino (A)
quanto no pulmão (B) e aumento de hemorragia no intestino (C) quando comparados com
os animais falso-operados Nos animais MIF
-/-
, não foi observado aumento nestes
parâmetros inflamatórios, mantendo os valores em níveis basais. * p<0,01; *** p<0,001
(Sham x IR – WT) e # p<0,001 (IR – WT x IR – MIF
-/-
).
56
5.1.3 Animais deficientes em MIF apresentam diminuição da concentração de TNF-α
αα
α
no intestino, pulmão e soro quando submetidos à isquemia e reperfusão intestinal
Em vista da importante participação da citocina TNF-α no desenvolvimento da
resposta inflamatória neste modelo (Souza et al., 2002) e da participação de MIF na
produção dessa citocina (Bozza et al., 1999; Al-Abed et al., 2005), nosso próximo passo
foi avaliar a participação de MIF na produção de TNF-α após I/R.. De acordo com a
Figura 5, pode-se verificar um significativo aumento na quantidade de TNF-α citocina no
intestino, pulmão e soro dos animais selvagens submetidos a I/R em relação aos falso-
operados. Em contrapartida, os animais deficientes em MIF não apresentaram esse
aumento, ficando com os níveis de TNF-α na mesma proporção que os animais controle.
Esses dados reforçam um importante envolvimento da citocina MIF na indução da
liberação de TNF-α neste modelo.
57
Intestino
sham I/R sham I/R
0
100
200
300
400
500
WT MIF
-/-
***
ND
NDND
TNF-
α
α
α
α
(pg/100 mg
de tecido)
Pulmão
sham I/R sham I/R
0
500
1000
1500
WT MIF
-/-
***
#
TNF-α
α
α
α
(pg/100 mg
de tecido)
Soro
sham I/R sham I/R
0
1000
2000
3000
***
WT MIF
-/-
ND
NDND
TNF-α
α
α
α
(pg/mL)
A B
C
Figura 5: Concentração de TNF-
α
tecidual e no soro após isquemia e reperfusão
intestinal. Os animais selvagens (WT) apresentam elevados níveis dessa citocina no
intestino (A), pulmão (B) e soro (C) após isquemia e reperfusão intestinal. Em
contrapartida, os animais deficientes em MIF (MIF
-/-
) não apresentaram aumento da
produção de TNF-α após esta lesão. *** p<0,001 (Sham x IR – WT) e # p<0,001 (IR –
WT x IR – MIF
-/-
).
58
5.1.4 Apesar da diminuição dos parâmetros inflamatórios após isquemia e reperfusão
intestinal, a ausência de MIF não interfere no influxo de neutrófilos
Trabalhos anteriores do nosso grupo demonstram a participação de neutrófilos no
desencadeamento da resposta inflamatória induzida por isquemia e reperfusão intestinal
(Souza et al., 2000, 2004a). Dessa forma, nossos dados sugerem que o infiltrado celular
estaria contribuindo para a liberação de mediadores inflamatórios para a região inicial da
lesão e também em órgãos distantes. No presente trabalho, os animais selvagens
apresentaram aumento no infiltrado celular tanto no intestino quanto no pulmão após
isquemia e reperfusão intestinal. De forma inesperada, também houve um aumento no
infiltrado neutrofílico nos animais deficientes em MIF após isquemia e reperfusão
intestinal (Figura 6).
59
Sham I/R Sham I/R
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
WT MIF
-\-
Unidades relativas
Sham I/R Sham I/R
0
1
2
3
WT MIF
-\-
*
*
Unidades relativas
A B
Figura 6: Avaliação do infiltrado neutrofílico no intestino e pulmão após isquemia e
reperfusão intestinal. Após a lesão, tanto os animais selvagens (WT) quanto os animais
deficientes em MIF (MIF
-/-
) possuem aumento de neutrófilos no intestino (A) e pulmão
(B) quando comparados com os animais falso-operados. * p<0,05 (Sham x IR).
60
5.1.5 Os cortes histológicos retratam os ensaios biológicos: menor lesão em animais
deficientes em MIF, porém com grande infiltrado celular
Após a indução de isquemia e reperfusão intestinal, foram retirados fragmentos do
intestino e do pulmão para a análise histológica. Conforme visualizado nas Figuras 7 e 8,
há considerável perda estrutural tanto do intestino (Figura 7) quanto do pulmão (Figura 8)
nos animais selvagens (WT), com grande preservação nos animais deficientes em MIF
(MIF
-/-
). Após a lesão, podem se observar grandes focos de edema e de hemorragia em
ambos os tecidos nos animais WT, sendo que, nos animais MIF
-/-
, estes parâmetros
encontram-se bastantes reduzidos. Em ambos os animais, podem ser verificados um grande
número de infiltrado celular nos órgãos estudados, tendo como parâmetro analítico os
animais falso-operados. Isso retrata o que foi diagnosticado através do ensaio de MPO
(Figura 6).
61
Figura 7: Análise histológica no intestino entre os animais selvagens e deficientes em MIF
após isquemia e reperfusão intestinal. Após a lesão, os animais selvagens apresentam
considerável perda da integridade física, aumento de infiltrado celular e pontos de
hemorragia no intestino quando comparados com os animais falso-operados. Em relação
aos animais deficientes em MIF, observa-se uma preservação da integridade física do
órgão estudado, reduzidos focos de hemorragia, porém com considerável aumento no
infiltrado celular. A: sham selvagem; B: sham deficiente em MIF; C: IR selvagem; D: IR
deficiente em MIF. (aumento de 40X)
62
Figura 8: Análise histológica no pulmão entre os animais selvagens e deficientes em
MIF após isquemia e reperfusão intestinal. Após a lesão, os animais selvagens possuem
considerável perda da integridade física, aumento de infiltrado celular e pontos de
hemorragia no pulmão quando comparados com os animais falso-operados. Em relação
aos animais deficientes em MIF, observam-se uma preservação da integridade física do
órgão, reduzidos focos de hemorragia, porém com considerável aumento no infiltrado
celular. A: sham selvagem; B: sham deficiente em MIF; C: IR selvagem; D: IR
deficiente em MIF. (aumento de 40X).
63
5.1.6 A diminuição na taxa de letalidade espelha à menor da inflamação dos animais
deficientes em MIF
Em conformidade com a considerável diminuição de lesão nos animais deficientes
em MIF, após o procedimento de isquemia e reperfusão intestinal, há uma diminuição na
taxa de letalidade quando comparado com o grupo representado por animais selvagens
(Figura 9). Após 120 minutos de reperfusão, cerca de 80% dos animais selvagens não
sobreviveram, ao passo que, no mesmo período, aproximadamente 80% dos animais
deficientes em MIF ainda permaneceram vivos.
64
0 30 60 90 120
0
20
40
60
80
100
WT (n= 18)
MIF
-/-
(n= 14)
Tempo (min) após a reperfusão
Letalidade (%)
Figura 9: Curva de letalidade entre os animais selvagens (WT) e deficientes em MIF
(MIF
-/-
) após isquemia e reperfusão intestinal. Após a lesão, os animais deficientes em
MIF apresentam maior sobrevida quando comparados com os animais selvagens.
65
5.2 Importância da citocina MIF no modelo de infecção pelo vírus da Dengue
5.2.1 A infecção pelo vírus da Dengue leva a um aumento da liberação da citocina
MIF circulante
É sabido que a infecção pelo vírus da Dengue causa uma grave resposta
inflamatória no organismo, com a produção de variados mediadores inflamatórios,
principalmente quando a doença envolve o quadro de Dengue Hemorrágico (Lei et al.,
2001). Neste contexto, Chen et al (2006) demonstraram um aumento da concentração da
citocina MIF no soro de pacientes infectados com esse vírus, além de correlacionar a
presença dessa citocina como indicativo de maior gravidade dessa doença.
No presente, trabalho foi avaliado a concentração de MIF no soro de animais
selvagens infectados com o vírus da Dengue. Conforme pode ser visto na Figura 10, no
sétimo dia após a infecção, há um significante aumento dos níveis dessa citocina quando
comparado com os animais não infectados. Esse dado sugere que a citocina MIF participa
no desenvolvimento da resposta inflamatória induzida por essa infecção.
66
MIF
0
25
50
75
100
NI 3 5 7
Dias após a infecção
***
MIF (pg/mL)
Figura 10: Concentração da citocina MIF no soro de animais infectados com o vírus da
Dengue. No sétimo dia após a infecção, os níveis de MIF no soro tiveram seus valores
significativamente aumentados em relação ao grupo de animais não infectados e
também quando comparados com o terceiro e o quinto dias após a infecção. ***
p<0,001.
67
5.2.2 Animais deficientes em MIF apresentam menor produção de citocinas e
quimiocinas após infecção
A produção de mediadores inflamatórios, como citocinas pró-inflamatórias e
também quimiocinas, responsáveis pelo recrutamento celular para o local da inflamação, é
essencial para o combate às infecções que acometem um organismo (Schluter & Deckert,
2000). Porém, uma exacerbação dessa resposta inflamatória compromete a integridade
desse organismo, o que, em muitos casos, pode levar ao óbito do paciente. Após a infecção
pelo vírus da Dengue neste modelo, há aumento na produção de várias citocinas e
quimiocinas, principalmente no dia 7 após a infecção (Figuras 11 e 12).
Dentre as citocinas e quimiocinas já descritas por terem importante participação na
patogênese da Dengue, avaliamos nesse trabalho a produção de:
(i) Interferon (IFN)-γ: O IFN-γ possui função pró-imune em alguns modelos
(Samuel, 2001), uma vez que tem fundamental papel na ativação de macrófagos. Em nosso
modelo, pudemos verificar um aumento significativo da concentração de IFN-γ no soro e
no baço no sétimo dia após a infecção em animais selvagens (Figuras 11A e 11B). Nos
animais deficientes em MIF, os níveis de IFN-γ mantiveram-se ao nível basal em todos os
dias analisados tanto no baço quanto no soro.
(ii) Interleucina (IL)- 6: Já foi demonstrado um aumento de IL-6 no soro de
pacientes com Dengue (Lei et al., 2001) sendo que essa é liberada principalmente por
linfócitos B e monócitos (Lin et al., 2002). De acordo com a figura 11C, há um
significativo aumento dessa citocina nos animais selvagens no sétimo dia após a infecção
em relação aos animais não infectados. Este aumento não foi observado nos animais
deficientes em MIF nos dias analisados.
68
(iii) Fator de Necrose Tumoral (TNF)- α: Trabalhos mostram que a citocina TNF-α
tem importante participação no desencadeamento da resposta inflamatória após a infecção
pelo vírus da Dengue (Chaturvedi et al., 2000; Atrasheuskaya et al., 2003). No presente
estudo, houve um aumento dos níveis de TNF-α em todos os grupos de animais após a
infecção (Figura 11D). Não houve diferença na quantidade de TNF-α entre os animais
deficientes em MIF e selvagens em todos os dias analisados.
(iv) MCP-1: De acordo com a figura 12A, houve um aumento na quantidade de
MCP-1 (CCL2) no 3º dia após a infecção tanto nos animais selvagens quanto nos animais
deficientes em MIF. No 5º e no 7º dias analisados, houve uma redução desses valores nos
animais deficiente em MIF enquanto que os mesmos permaneceram elevados nos animais
selvagens em relação aos animais não infectados.
(v) RANTES: Já foi descrito a participação da quimiocina RANTES (CCL5), na
patogênese da Dengue (Lei et al., 2001) e também na infecção pelo vírus da Encefalite
Japonesa, representante da mesma família do dengue (Chen et al, 2004). No presente
estudo, houve aumento significativo desta quimiocina nos animais selvagens a partir do 5º
dia após a infecção (Figura 12B). Nos animais deficientes em MIF não houve esse
aumento em nenhum dos dias analisados.
69
Figura 11: Análises da
concentração de citocinas em diferentes órgãos após infecção
pelo vírus da Dengue. Foi verificado um aumento na concentração de IFN-γ tanto no
baço (A) quanto no soro (B) apenas nos animais selvagens (WT) no sétimo dia após a
infecção. Da mesma forma, houve um aumento dos níveis de IL-6 no baço. Em relação à
citocina TNF-α, houve um crescente aumento ao longo dos dias analisados, sendo que
não houve diferença entre os animais WT e deficientes em MIF (MIF
-/-
) *** p<0,001
(WT x NI ou MIF
-/-
). NI: animais não infectados.
Fígado
0
250
500
750
1000
NI
W T M IF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
TNF-
α
α
α
α
(pg/100 mg de
tecido)
Baço
0
250
500
750
NI
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
IL-6 (pg/100 mg de
tecido)
Baço
0
5000
10000
15000
NI
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
IFN-
γ
γ
γ
γ
(pg/100 mg de
tecido)
Soro
0
2500
5000
7500
NI
W T M IF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
IFN-γ
γ
γ
γ
(pg/mL)
A
B
C D
70
Figura 12: Análise da concentração das quimiocinas MCP
-
1 e de RANTES
no baço e
fígado, respectivamente, após a infecção pelo vírus da Dengue. No 3º dia após a
infecção, há um significativo aumento de MCP-1 (A) em ambos os grupos estudados,
sendo que estes valores diminuem nos animais deficientes em MIF (MIF
-/-
) a partir do 5º
dia, mantendo-se assim no último dia analisado, enquanto que nos animais selvagens
(WT), os níveis continuam elevados. No sétimo dia após a infecção, os animais WT
apresentaram alta concentração de RANTES (B) em relação aos animais não infectados.
* p<0,05 e ** p<0,01 (WT x NI) e *** p<0,001 (WT ou MIF
-/-
x NI). NI: animais não
Baço
0
1000
2000
NI
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
***
***
*
MCP-1 (pg/100 mg de
tecido)
Fígado
0
1000
2000
3000
4000
5000
NI
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
**
**
RANTES (pg/100 mg de
tecido)
A B
71
5.2.3 Animais deficientes em MIF apresentam menor recrutamento celular no pulmão
após infecção pelo vírus da Dengue
O pulmão é um órgão com altas probabilidades de comprometimento de suas
funções após uma resposta inflamatória sistêmica devido à sua arquitetura (Burns et al.,
2003). Conforme observado na Figura 13, os animais selvagens infectados com o dengue
apresentaram grande influxo neutrofilico (expresso em unidades relativas no ensaio de
MPO) no pulmão no sétimo dia após a infecção. Nos animais deficientes em MIF, a
quantidade de neutrófilos permaneceu baixa em todos os dias analisados. Este aumento de
infiltrado celular nos animais selvagens pode ser explicado pelo aumento também nas
concentrações das quimiocinas MIP-2 e KC, importantes para o recrutamento de
neutrófilos. Em acordo com a inibição do recrutamento de neutrófilos nos animais
deficientes em MIF, não houve aumento nos níveis dessas quimiocinas em nenhum dos
dias analisados, mantendo-se em valores basais.
72
0.0
2.5
5.0
7.5
WT
MIF
-/-
WT
MIF
-/-
WT
MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
Unidades relativas
0
500
1000
1500
NI
WT MIF
-/-
WT MIF
-/-
WT MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
MIP-2 (pg/100 mg de
tecido)
0
1000
2000
3000
NI
WT MIF
-/-
WT MIF
-/-
WT MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
***
KC (pg/100 mg de
tecido)
A
B
C
Figura 13: Avaliação do infiltrado neutrofílico e da concentração das quimiocinas MIP-
2 e KC no pulmão após infecção pelo vírus da Dengue. Os animais selvagens (WT)
infectados apresentaram aumento do infiltrado de neutrófilos (A) no pulmão no sétimo
dia após a infecção. Em concordância com este dado, há aumento dos níveis tanto de
MIP-2 (B) quanto de KC (C) no último dia analisado em comparação aos animais não
infectados. Em relação aos animais deficientes em MIF (MIF
-/-
), não houve aumento
significativo nos níveis das quimiocinas analisadas bem como no infiltrado de
neutrófilos em todos os dias analisados. *** p<0,001. NI: animais não infectados.
73
5.2.4 Animais deficientes em MIF mantêm valores basais de hematócrito e de
plaquetas
A forma mais grave da Dengue, ou seja, a Dengue Hemorrágica, tem como
manifestações clínicas um comprometimento da permeabilidade vascular acompanhada por
anormalidades na hemostasia (Lei et al., 2001). A hemoconcentração é um indicativo de
perda de volume intravascular, o que pode levar à síndrome de choque. Esse sinal pode ser
diagnosticado através do teste de hematócrito, onde o aumento de seu valor corresponde a
um aumento na perda de líquido para o tecido. Como podem ser verificados na Figura
14A, os animais selvagens apresentaram um valor crescente de hematócrito após a
infecção pelo vírus da Dengue, fato esse não observado nos animais deficientes em MIF,
onde os valores foram equivalentes aos observados nos animais não infectados.
Outra característica que acompanha o quadro de Dengue Hemorrágico é uma
diminuição no número de plaquetas circulantes. É sugerido que, após a infecção pelo vírus
da Dengue, há uma redução na síntese plaquetária pela medula óssea, resultando em
trombocitopenia (Saito et al., 2004). Conforme visto na Figura 14B, a partir do quinto dia
após a infecção, a quantidade de plaquetas apresentou maior redução nos animais
selvagens (aproximadamente 60%) em relação aos animais deficientes em MIF
(aproximadamente 21%) quando comparados com o valor obtido nos animais não
infectados. Isso demonstra que a presença de MIF no organismo contribui de maneira
intensa no desenvolvimento de alterações comuns em situações clínicas causadas por essa
infecção.
74
35
40
45
50
WT
MIF
-/-
WT
MIF
-/-
WT
MIF
-/-
3º dia 7º dia5º dia
**
NI
Hematócrito (%)
0
250
500
750
WT
MIF
-/-
3º dia
WT
MIF
-/-
7º dia
WT
MIF
-/-
5º dia
Plaquetas
***
***
**
**
#
#
NI
A
B
Figura 14: Determinação do valor de hematócrito e da concentração de plaquetas
circulantes após infecção pelo vírus da Dengue. Os animais deficientes em MIF (MIF
-/-
)
mantiveram valores basais de hematócrito (A) após a infecção com o vírus da Dengue
em todos os dias analisados, ao passo que os animais selvagens (WT) apresentaram este
valor aumentado no quinto dia de infecção. Em relação à quantidade de plaquetas
circulantes (B), foi observada pequena queda nos animais MIF
-/-
(5º e 7º após a
infecção) em relação aos animais não infectados (NI) quando comparados com os
animais WT, onde houve diminuição bastante acentuada neste valor em relação ao
grupo controle (5º e 7º após a infecção). ** p<0,01 (WT x NI – hematócrito ou MIF
-/-
x
NI – número de plaquetas; *** p<0,001 (WT x NI) e # p<0,001 (WT x MIF
-/-
).
75
5.2.5 Animais deficientes em MIF apresentam menor viremia e carga viral no baço
A partir do momento da infecção, o vírus começa a se replicar em vários órgãos,
como por exemplo, o baço. Esse período de incubação dura cerca de quatro a sete dias em
humanos até que o vírus volte à corrente sanguínea, instalando-se a viremia. O aumento da
gravidade da doença é acompanhado também por um aumento no índice de viremia,
principalmente quando há o quadro de Dengue Hemorrágico (Vaughn et al., 2000).
De acordo com a Figura 15A, pode-se perceber que há menor viremia no sétimo dia
após a infecção em camundongos deficientes em MIF em relação aos animais selvagens.
Da mesma forma, no baço também houve menor quantidade de vírus nos animais
deficientes em MIF ao longo dos dias analisados (Figura 15B).
76
Sangue
10
3
10
4
10
5
W T MIF
-/-
**
Vírus (PFU/mL)
Baço
10
0
10
4
10
8
10
12
**
***
***
3º dia
5º dia 7ºdia
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
W T MIF
-/-
Vírus (PFU/g)
A
B
Figura 15: Quantificação de unidades formadoras de placas (PFU) presente no sangue
e
no baço dos animais infectados com o vírus da Dengue. No sétimo dia após a infecção
pelo vírus da Dengue, os animais deficientes em MIF (MIF
-/-
) apresentaram menor
viremia no soro (A) em comparação com os animais selvagens (WT). Em relação ao
baço (B), em todos os dias analisados, houve menor quantidade de vírus nos animais
MIF
-/-
em comparação com os animais WT. quando comparados com os animais
selvagens (WT). ** p<0,01 (WT x MIF
-/-
) e *** p<0,001 (WT x MIF
-/-
).
77
5.2.6 Animais deficientes em MIF apresentam um atraso na letalidade após infecção
pelo vírus da Dengue
Analisando os resultados apresentados anteriormente em relação à infecção pelo
vírus da Dengue, é nítido que há uma grande redução de mediadores inflamatórios, como
citocinas e quimiocinas, redução nos sinais clínicos, como hemoconcentração e
plaquetopenia, e também redução no infiltrado celular em animais deficientes em MIF
quando comparados com animais selvagens. Estes dados nos indicam que MIF parece
contribuir de maneira significativa para o desenvolvimento da resposta inflamatória
provocada por essa infecção. Assim, foi realizado um teste de letalidade, onde os animais
foram observados por até 13 dias após a infecção pelo vírus da Dengue.
Conforme pode ser verificado na Figura 16, os animais deficientes em MIF
apresentaram um atraso na letalidade quando comparados com o grupo controle. No oitavo
dia após a infecção, todos os animais selvagens já estavam mortos, ao passo que no mesmo
período, aproximadamente 65% dos animais deficientes em MIF ainda permaneciam vivos.
Apenas entre o décimo segundo e o décimo terceiro dias após a infecção é que houve a
morte dos demais animais.
78
6 7 8 9 10 11 12 13
0
25
50
75
100
WT
MIF
-/-
Dias após a infecção
Letalidade (%)
Figura 16: Curva de letalidade dos animais após infecção pelo vírus da Dengue. Os
animais deficientes em MIF (MIF
-/-
) apresentam um atraso na letalidade após a infecção
com o vírus da Dengue. No oitavo dia após a infecção, nenhum animal selvagem (WT)
sobreviveu enquanto que, no mesmo período, aproximadamente 70% dos animais MIF
-/-
ainda permaneciam vivos.
79
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
80
6 DISCUSSÃO
Baseado em vários trabalhos na literatura, onde são atribuídas a MIF importantes
funções no desencadeamento de variadas respostas inflamatórias (Calandra et al., 1994;
Bozza et al., 1999; Ohkawara et al., 2005), neste trabalho foi avaliada a participação de
MIF nos processos inflamatórios induzidos por isquemia e reperfusão intestinal e também
por infecção pelo vírus da Dengue. Ambos os modelos estudados compartilham
mediadores com potenciais atividades inflamatórias. Dentre esses mediadores, a citocina
TNF-α recebe especial atenção, haja vista sua importante participação na patogênese de
ambos os processos, onde o tratamento experimental com anticorpo anti-TNF-α foi eficaz
na diminuição de lesão em ambos os modelos (Souza et al., 2001; Atrasheuskaya et al.,
2003). Outro aspecto em comum em ambos os modelos é a disfunção de células
endoteliais. Estas células são altamente susceptíveis a processos isquêmicos e também a
infecção pelo vírus da Dengue, os quais podem provocar alterações na permeabilidade
vascular (Carden et al., 2000; Lei et al., 2001; Dewi et al., 2004). A lesão endotelial em
ambos os modelos leva à produção de variados mediadores inflamatórios, os quais agem de
maneira autócrina, parácrina ou endócrina. Em casos mais graves, quadros de hemorragia e
grande produção de mediadores inflamatórios (I/R e Dengue) e também de
hemoconcentração (Dengue) são fatores importantes no quadro de choque, situação
responsável pelo alto índice de mortalidade dessas duas doenças (Souza & Teixeira, 2005;
Lei et al., 2001).
Por definição, a síndrome de choque é caracterizada por uma falha no sistema
circulatório, resultando em uma inapropriada perfusão tecidual, o que resulta em hipóxia
celular (Graham & Parke, 2005). Pode ocorrer devido a uma hemorragia, falha no sistema
cardíaco, em caso de sepse e também por anafilaxia. A citocina MIF parece contribuir de
81
maneira importante na indução desse quadro, principalmente em casos de sepse, onde é
capaz de promover a formação de variados mediadores (Calandra et al., 2000; Wang et al.,
2005).
Em relação aos modelos estudados nesse trabalho, já foi relatada a presença de MIF
no tecido miocárdio após isquemia e reperfusão cardíaca (Yu et al., 2002) e também no
soro de pacientes infectados pelo vírus da Dengue (Chen et al., 2006). Neste contexto, foi
verificado, no presente trabalho, que tanto nos animais submetidos à isquemia e reperfusão
intestinal quanto nos animais infectados pelo vírus da Dengue houve um considerável
aumento nos níveis de MIF circulantes (Figuras 3 e 10). Baseado nas atividades pró-
inflamatórias relatadas a essa citocina e também na presença dela em modelos
semelhantes, o aumento em relação aos níveis basais sugere a participação de MIF nas
respostas inflamatórias instaladas.
Conforme citado acima, lesões a células endoteliais resultam em alterações na
permeabilidade dos vasos sanguíneos em ambos os modelos. A participação de mediadores
inflamatórios, como as citocinas (Hopkins, 2003), produtos do ácido araquidônico
(Bogatcheva et al., 2005) e moléculas do sistema de complemento (Bossi et al., 2004) são
importantes para esse processo. Em relação à isquemia e reperfusão intestinal, alterações
na produção ou ativação de alguns mediadores como moléculas de adesão (Souza et al.,
2000), síntese de citocinas via ativação do fator de transcrição NF-κB (Souza et al., 2005;
Tial et al., 2006), ativação de moléculas do sistema de complemento e também a síntese de
produtos do ácido araquidônico (Mallick et al., 2004) contribuem diretamente no processo
de infiltração celular. Uma vez no tecido, os neutrófilos, além de promoverem a liberação
de citocinas no local, liberam compostos potencialmente tóxicos (radicais livres e/ou
enzimas com atividade de peroxidase) que acabam danificando a estrutura das células
82
endoteliais com conseqüente amplificação da resposta inflamatória (Souza et al., 2000,
2004a).
Em acordo com trabalhos anteriores (Souza et al., 2003a, b, 2003b), os animais
selvagens, após o processo de isquemia e reperfusão intestinal, apresentaram um aumento
significativo na permeabilidade vascular tanto no intestino quanto no pulmão e elevado
nível de hemorragia no intestino, ao passo que os animais deficientes em MIF se
comportaram de maneira análoga aos animais falso-operados, mantendo os valores ao nível
basal. Nos cortes histológicos, um aumento desses parâmetros inflamatórios também está
mais evidente nos animais selvagens, com grande preservação nos animais deficientes em
MIF. Esses dados sugerem uma participação de MIF em células endoteliais, onde haveria
uma ação direta ou mediante a liberação de outros compostos, como TNF-α.
É comum neste tipo de lesão o comprometimento de órgãos distantes, no caso o
pulmão (Souza et al., 2000, 2003a ; Tian et al., 2006). Nesse órgão, modificações como o
aumento do infiltrado celular, podem levar ao desenvolvimento da síndrome de angústia
respiratória aguda, devido a liberação de mediadores, principalmente pelo neutrófilo
recrutado, os quais provocam lesões estruturais importantes (Mallick et al., 2004).
Acredita-se que essas alterações ocorrem, principalmente, devido à estrutura do tecido
pulmonar. Esse órgão possui capilares sanguíneos com o lúmen extremamente estreito, o
que facilita a diapedese de neutrófilos para o tecido, com menor participação de moléculas
de adesão em relação a outros órgãos (Burns et al., 2003). Assim, com o desenvolvimento
de uma inflamação sistêmica, aumenta-se o número de mediadores inflamatórios na
circulação e, como conseqüência, um maior infiltrado celular pode comprometer a
estrutura dos vasos locais em virtude da liberação de mais mediadores inflamatórios.
Trabalhos anteriores do nosso grupo demonstram uma importante participação de
neutrófilos no desencadeamento do processo inflamatório induzido por isquemia e
83
reperfusão intestinal (Souza et al., 2001, 2004a). Assim, foi avaliada a quantidade de
neutrófilos (através do ensaio enzimático de mieloperoxidase) infiltrados no intestino e no
pulmão após essa lesão. Conforme esperado, o número de neutrófilos infiltrados no
intestino e no pulmão foi maior nos animais selvagens após a lesão de reperfusão em
comparação com os animais falso-operados. De forma surpreendente, o infiltrado celular
no intestino e no pulmão também foi maior entre os grupos de animais deficientes em MIF
quando comparados com o grupo falso-operados. Esse dado é representado nos cortes
histológicos, onde há maior infiltrado celular em ambos os órgãos tanto nos animais
selvagens quantos nos animais deficientes em MIF em relação ao grupo falso-operado. Em
concordância com esse resultado, foi observado um aumento na concentração da
quimiocina KC, importante para o recrutamento de neutrófilos (Abbas & Lichtman, 2005),
no intestino após a lesão de reperfusão (WT: 103,3 ± 3 x 1069 ± 79; MIF
-/-
: 105 ± 56 x 828
± 139 pg/mL no grupo falso-operado em relação ao grupo de isquemia e reperfusão
intestinal, respectivamente).
O aumento no infiltrado celular observado nos animais deficientes em MIF após
isquemia e reperfusão intestinal se contrapõe com alguns dados publicados na literatura.
Gregory et al. (2004) demonstraram o envolvimento de MIF na indução de P-selectina
após a administração de LPS, onde animais deficientes em MIF apresentavam menor
expressão dessa molécula de adesão com conseqüente redução no infiltrado leucocitário.
Em outro trabalho foi demonstrado que MIF atrasa o processo de apoptose de neutrófilos
in vitro (Bauman et al., 2003). Em recente trabalho, pesquisadores observaram que a
superexpressão de MIF aumenta a quantidade de MPO no intestino em modelo de colite
(Ohkawara et al., 2006). O aumento no infiltrado celular nos animais deficientes em MIF
não condiz com um maior número de células circulantes em relação aos animais selvagens,
visto que não houve diferença no número de células totais observadas através de esfregaço
84
sanguíneo (dado não mostrado). Assim, uma explicação para o que foi observado
compreenderia em uma diminuição da ativação dos neutrófilos infiltrados. Essas células,
ao migrarem para o tecido, fazem interação com células residentes mediante a liberação de
alguns mediadores (Lefkowitz & Lefkowitz, 2001), dentre eles o PAF (Souza et al.,
2003b). Dessa forma, uma perda de capacidade dessa interação poderia reduzir a liberação
de TNF-α por macrófagos.
Modificações na permeabilidade vascular são bastante comuns na infecção pelo
vírus da Dengue, sendo mais notória no quadro de Dengue Hemorrágico. O vírus da
Dengue é capaz de infectar células endoteliais levando a produção de citocinas e
quimiocinas como IL-6, IL-8 e RANTES, potenciais mediadores no aumento da
permeabilidade vascular (Huang et al., 2000). Outro fator importante refere-se a uma
diminuição da produção de plaquetas (Saito et al., 2004) e também a presença de
anticorpos anti-plaquetários (Lei et al., 2001), instalando-se o quadro de trombocitopenia.
De acordo com a figura 14, pode-se observar que o modelo mimetiza o quadro de Dengue
Hemorrágico, com considerável aumento de hematócrito e também na diminuição de
plaquetas circulantes nos animais selvagens. Nos animais deficientes em MIF não houve
variação significativa no número de plaquetas e no valor de hematócrito em relação ao
grupo não infectado, o que sugere que MIF é importante para essa alteração provocada
pela infecção.
Clinicamente, são bem descritas manifestações como hemoconcentração,
principalmente no quadro de dengue hemorrágico (Rigau-Perez & Laufer, 2006).
Basicamente, isso ocorre devido um aumento de permeabilidade vascular, onde um
extravasamento de plasma para o tecido provocaria uma maior concentração de hemácias
no sangue. Com o quadro de hemoconcentração, a circulação de elementos sanguíneos fica
prejudicada pela perda de mobilidade dos mesmos. O seqüestro de plaquetas para o tecido
85
aumenta a possibilidade de hemorragia, uma vez que essas células são fundamentais para o
processo de coagulação. Por isso, não é recomendável a administração de ácido
acetilsalicílico para combater os sintomas da Dengue, que são comuns a outras doenças. A
aspirina contribui para a redução da produção de tromboxano A
2
, principalmente em
plaquetas. Este produto do ácido araquidônico tem papel importante na agregação
plaquetária, por auxiliar no processo de coagulação (Rang et al., 2004).
Em relação ao infiltrado leucocitário, após a infecção pelo vírus da Dengue, foi
demonstrado que houve um aumento significativo de neutrófilos no pulmão de animais
selvagens no sétimo dia após a infecção. As quimiocinas analisadas neste órgão, KC e
MIP-2, importantes para o recrutamento de neutrófilos (Abbas & Lichtman, 2005),
encontram-se aumentadas apenas no sétimo dia após a infecção nos animais selvagens, o
que se superpõe com o observado no infiltrado celular. Em relação aos animais deficientes
em MIF, a quantidade de neutrófilos no órgão permaneceu baixa nos três dias analisados.
Esse resultado pode ser explicado pelos valores basais de KC e MIP-2 após a infecção pelo
vírus da Dengue.
Com os resultados acima, é notório a contradição entre o aumento de infiltrado de
neutrófilos após isquemia e reperfusão intestinal e a permanência de valores basais após
infecção pelo vírus da Dengue nos animais deficientes em MIF. Como citado
anteriormente, uma disfunção na interação neutrófilo-macrófago diminuiria a capacidade
do macrófago de produzir TNF-α e consequentemente diminuir lesões e letalidade
induzida por isquemia e reperfusão intestinal nos animais deficientes em MIF. Em relação
à infecção pelo vírus da Dengue, o maior infiltrado de neutrófilos no sétimo dia analisado
nos animais selvagens pode ser uma resposta à produção de quimiocinas (KC e MIP-2),
sendo uma resposta secundária ao aumento na quantidade de vírus presente na circulação
desses animais.
86
A detecção dos níveis de citocinas e quimiocinas teciduais e circulantes é um
importante meio para se entender diversos processos inflamatórios, seja em modelos
experimentais, seja em casos clínicos. Essas classes de proteínas são subdivididas em anti-
e pró-inflamatórias, em que a análise de suas concentrações é útil para um diagnóstico
(Hanada & Yoshimura, 2002). Em relação à isquemia e reperfusão intestinal, foi verificado
um considerável aumento na quantidade de TNF-α no intestino, pulmão e soro de animais
selvagens após a lesão, fato este que não aconteceu nos animais deficientes em MIF. Pelo
contrário, nestes últimos, os níveis de TNF-α permaneceram baixos ou não detectáveis,
como nos animais falso-operados. Este dado é condizente com outros trabalhos que
relatam um importante papel de MIF na indução da liberação de TNF-α (Bozza et al.,
1999; Al-Abed et al., 2005). Por sua vez, TNF-α contribui para um aumento na
permeabilidade vascular (Souza et al., 2004a, 2005). São capazes de induzir a expressão de
moléculas de adesão nas células endoteliais, contribuindo para o recrutamento celular e
estimulam a liberação de produtos do ácido araquidônico, como as prostaciclinas, que
provocam vasodilatação (potencialmente importante no aumento de permeabilidade
vascular) (Aggarwal, 2003). A presença de elevadas quantidades de TNF-α na circulação
sanguínea compromete o funcionamento normal de órgãos distantes, onde a denominação
de síndrome da resposta inflamatória sistêmica é parcialmente atribuída a essa citocina
(Souza et al., 2002). Dessa maneira, a menor resposta inflamatória desencadeada nos
animais deficientes em MIF após isquemia e reperfusão intestinal pode estar relacionada às
concentrações basais de TNF-α observadas.
No caso da infecção pelo vírus da Dengue, foi avaliada a quantidade de citocinas e
de quimiocinas em órgãos que são susceptíveis a infecção por esse vírus. O vírus da
Dengue é capaz de infectar tanto o baço quanto o fígado, onde há liberação de mediadores
inflamatórios na circulação (Khongphatthanayothin et al., 2005). No baço, importante
87
órgão linfóide, e também no soro, nota-se que há uma grande liberação de IFN-γ no sétimo
dia de infecção nos animais selvagens, com baixa quantidade nos animais deficientes em
MIF em todos os dias analisados. A família dos Interferons pode ser dividida em duas
classes: tipo I (IFN-α e β) e tipo II (IFN-γ). Estas moléculas são reconhecidas como
potentes agentes anti-virais, principalmente os do tipo I, e vários tipos celulares são
capazes de induzi-las quando há uma infecção viral (Samuel, 2001). O aumento observado
de IFN-γ no sétimo dia após a infecção apenas nos animais selvagens pode ser relatado
como uma resposta secundária à alta concentração de vírus nesses animais.
Ainda no baço, nota-se que há um grande aumento de IL-6 no sétimo de após a
infecção nos animais selvagens, o que não aconteceu entre os animais deficientes em MIF.
Semelhante a esse dado, Lin et al (2002) demonstraram que células B e monócitos
infectados pelo vírus da Dengue são capazes de induzir a liberação de IL-6. Nesse
contexto, os níveis de MCP-1, importante quimiocina para o recrutamento de monócitos
(Abbas & Lichtman, 2005), estão elevados nos três dias analisados nos animais selvagens,
enquanto que apenas no terceiro dia após a infecção houve um aumento desses valores no
grupo de animais deficientes em MIF. Dessa forma, a chegada dessas células no tecido
contribuirá para um aumento na liberação de mediadores inflamatórios, como IL-6,
promovendo uma amplificação da resposta inflamatória. Assim, a modulação do
recrutamento de monócitos e da produção de citocinas relatadas são pontos importantes
através dos quais MIF exerce seu papel pró-inflamatório, uma vez que tanto IL-6 quanto
MCP-1 são potenciais moléculas pró-inflamatórias.
Outro órgão estudado foi o fígado. Vários trabalhos na literatura apontam o fígado
como um dos alvos do vírus da Dengue (Jessie et al., 2004; Shresta et al., 2004;
Khongphatthanayothin et al., 2005). Dessa forma, pode ser diagnosticado hepatomegalia e
um aumento de proteínas do fígado no soro após a infecção (Seneviratne et al., 2006).
88
Ainda, alterações de ordem histológica como esteatose microvesicular, necrose
hepatocelular, destruição e hiperplasia de células de Kupffer bem como grande infiltrado
celular são comuns nesse órgão em pacientes infectados com Dengue (Seneviratne et al.,
2005). Assim, o fígado é um importante órgão para a liberação de mediadores
inflamatórios após a infecção, como demonstrados através de estudos in vitro e in vivo (Lin
et al., 2000; Quaresma et al., 2006)
Dentre os mediadores analisados neste estudo, houve um aumento significativo nos
níveis da quimiocina RANTES no fígado a partir do quinto dia após a infecção nos animais
selvagens, enquanto que nos animais deficientes em MIF, o aumento observado não foi
significativo em relação aos animais não infectados. Essa quimiocina está diretamente
envolvida na patogênese de várias infecções virais (Huang et al., 2000; Chen et al., 2004).
Tem por função a quimioatração por células T, monócitos, eosinófilos e também basófilos
(Abbas & Lichtman, 2005). Em concordância com os nossos dados, uma alta expressão
dessa quimiocina foi vista em estudo in vitro com o sorotipo 2 do dengue (Lin et al., 2000)
e também em grande quantidade em culturas de células neuronais após infecção pelo vírus
da Encefalomielite Japonesa, pertencente à mesma família do Dengue (Chen et al., 2004).
Em relação à citocina TNF-α, houve um crescente aumento na sua concentração
após a infecção pelo vírus da Dengue tanto nos animais selvagens quanto nos animais
deficientes em MIF ao longo dos dias analisados. Este dado contradiz aos dados da
literatura onde MIF é importante indutor da liberação de TNF-α (Bozza et al., 1999; Al-
Abed et al., 2005). Este dado também é contraditório com o observado após a resposta
inflamatória induzida por isquemia e reperfusão intestinal, onde os animais deficientes em
MIF apresentaram valores basais de TNF-α após a lesão. Dados da literatura demonstram
que o vírus da Dengue pode se multiplicar em vários tipos celulares, como células
dendríticas (Kwan et al., 2005), células endoteliais (Dewi et al., 2004), monócitos,
89
macrófagos, células T e B (Lin et al., 2002) bem como células hepáticas (Seneviratne et
al., 2006). Dessa forma, um aumento na produção de TNF-α não envolveria a participação
da citocina MIF.
Outra análise realizada foi a quantificação viral. Além da viremia, órgãos como o
baço, são susceptíveis ao ataque do vírus da Dengue. Para que haja a replicação viral, é
preciso uma susceptibilidade e permissividade da célula em questão, ou seja, a célula deve
se submeter a dois fatores: é preciso que o vírus entre na célula e também é necessário que
mediadores intracelulares capacitem o vírus a se multiplicar (Fields et al., 1996). Para
infectar um determinado tipo celular, o vírus da Dengue precisa, primeiramente, atacar a
superfície celular. Um importante fator para a infecção do vírus da Dengue seria a
participação de células dendríticas, as quais, através da expressão de uma proteína de
membrana específica (DC-SIGN), permitem a entrada do vírus, estabelecendo um contato
inicial dessas células com células T (Navarro-Sánchez et al., 2005). Em casos de nova
infecção com outro sorotipo, o receptor da porção Fc de anticorpo na superfície celular
parece facilitar a entrada do vírus na célula (Stephenson, 2005).
Os animais deficientes em MIF apresentaram menor viremia (detectável apenas no
sétimo dia após a infecção) além de apresentarem menor carga viral no baço (em todos os
dias estudados) quando comparados com os animais selvagens. Essa maior carga viral
detectada nos animais selvagens pode ser uma conseqüência do processo inflamatório
instalado após a infecção, ou seja, uma elevada e desordenada resposta inflamatória
iniciada a partir do momento da infecção pode comprometer importantes mecanismos de
defesa do hospedeiro, como por exemplo, as células endoteliais. Vaughn et al (2000)
demonstraram que uma alta concentração do vírus da Dengue no soro de pacientes
infectados está diretamente relacionada com uma maior gravidade da doença. Conforme
observado no conjunto de parâmetros inflamatórios estudados, onde níveis de citocinas,
90
quimiocinas e hematócrito estão, de maneira geral, aumentados nos animais selvagens, nos
quais também há o quadro de trombocitopenia grave, pode haver um comprometimento na
resposta imune do organismo para combater a infecção. O quadro de choque instalado
compromete a circulação de células diretamente envolvidas no combate às infecções, ou
seja, há uma produção exarcebada de mediadores inflamatórios que culmina em lesões por
todo o organismo (Wang et al., 2005). Dessa forma, haveria uma deficiência no combate à
replicação viral pelo organismo, em que o vírus da Dengue consegue escapar do sistema
imune, fazendo assim, uma multiplicação facilitada. Em virtude da redução de viremia nos
animais deficientes em MIF, ferramentas como anticorpos contra essa citocina podem ser
de grande valia no combate à replicação viral.
Toda a resposta inflamatória instalada, tanto no modelo de isquemia e reperfusão
intestinal quanto na infecção pelo vírus da Dengue, está relacionado com a letalidade dos
animais. Com isso, a observação desse fato tem grande impacto face ao desenvolvimento
de medicamentos que combatam ou diminuam a ação dos mediadores responsáveis pela
patogênese dessas doenças. Em relação ao modelo de isquemia e reperfusão intestinal, os
animais deficientes em MIF apresentam significativa diminuição na letalidade após a lesão
quando comparados com os animais selvagens. Este dado pode estar diretamente envolvido
com os níveis de TNF-α presentes no soro de animais selvagens, ausentes nos animais
deficientes em MIF. Esse dado está de acordo com estudos prévios que demonstram uma
relação direta entre a produção sistêmica de TNF-α e letalidade (Souza et al., 2001, 2002).
Em relação ao modelo de infecção pelo vírus da Dengue, onde os animais deficientes em
MIF apresentaram menor resposta inflamatória quando comparados com os animais
selvagens, houve um atraso na letalidade nesses animais em relação ao outro grupo
(animais selvagens). O fato de que não houve diminuição na letalidade nos animais
deficientes em MIF pode ser explicado por um aumento em comum (WT e MIF
-/-
) nos
91
níveis de TNF-α. Esse dado deve ser observado de maneira satisfatória, uma vez que no
oitavo dia de infecção, todos os animais selvagens já haviam morrido, enquanto que
aproximadamente 70% dos animais deficientes em MIF continuavam vivos.
Outro fator que poderia explicar apenas um atraso na letalidade, e não uma
prevenção, seria a ausência da própria citocina MIF. Esse fato contraditório resume-se
assim: MIF é extremamente importante para o desencadeamento de uma resposta
inflamatória através da liberação de vários mediadores importantes para isso (Calandra &
Roger, 2003). Nos primeiros momentos da infecção, a ausência de MIF impediria uma
exacerbada resposta inflamatória provocada pelo vírus, o que pode ser explicado pela
menor produção de mediadores inflamatórios em animais deficientes em MIF quando
comparados a animais selvagens. A partir desse momento, quase todos os animais
selvagens já morreram. Porém, a partir desse ponto (8º ao 12º dia após a infecção), o
crescente aumento na quantidade de vírus no sangue e no baço nos animais deficientes em
MIF observados principalmente no sétimo dia após a infecção estaria contribuindo para a
letalidade desses animais. Como esses animais não expressam essa citocina, não haveria,
portanto, uma linha de defesa que combata a infecção generalizada e, como conseqüência,
o processo inflamatório se instala, de forma ineficaz, causando a morte dos mesmos. Esta
explicação é baseada em um trabalho onde a administração de MIF recombinante em
camundongos submetidos à sepse e desafiados com diferentes linhagens de bactérias
aumentou a sobrevida em relação ao grupo que não recebeu MIF recombinante (Pollak et
al., 2005).
Conforme visto neste estudo, a citocina MIF é importante no desencadeamento da
resposta inflamatória tanto na lesão de reperfusão quanto na infecção pelo vírus da
Dengue. As ações dessa citocina contribuem para um aumento nos parâmetros
inflamatórios em ambos os modelos analisados. Dessa forma, a redução de inflamação nos
92
animais deficientes em MIF reflete em menor lesão e diminuição ou atraso na letalidade.
Portanto, no conjunto de resultados na literatura e os obtidos neste trabalho, a
citocina MIF mostra-se ser de grande importância para o desenvolvimento de um processo
inflamatório. Apesar da instalação do processo inflamatório ser necessária para o controle
de uma infecção, uma exacerbação dessa resposta pode causar danos ao organismo. Assim,
a utilização de fármacos que modulem a resposta inflamatória, como anticorpos anti-MIF,
podem potencialmente ser utilizados como terapia no tratamento de doenças inflamatórias.
93
R
R
E
E
F
F
E
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N
C
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R
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I
I
C
C
A
A
S
S
94
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