ads:
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIOMATERIAIS
COMPÓSITOS DE QUITINA/HIDROXIAPATITA
Leandro Medeiros Motta
Dissertação em Ciência e Tecnologia de Polímeros, submetida ao Instituto de
Macromoléculas Professora Eloisa Mano da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências,
em Ciência e Tecnologia de Polímeros, sob orientação das Professoras Cristina Tristão
de Andrade e Renata Antoun Simão.
Rio de Janeiro
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Dissertação de Mestrado:
Obtenção e caracterização de biomateriais compósitos de quitina/hidroxiapatita
Autor: Leandro Medeiros Motta
Orientador: Cristina Tristão de Andrade e Renata Antoun Simão
Data da defesa: 06 de fevereiro de 2006
Aprovada por:
_________________________________________________
Professora Cristina Tristão de Andrade, DSc
Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano – IMA/UFRJ
Orientador/Presidente da Banca Examinadora
_________________________________________________
Professora Renata Antoun Simão, DSc
COPPE / UFRJ
Orientador
_________________________________________________
Professor Luis Cláudio Mendes, DSc
Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano – IMA/UFRJ
_________________________________________________
Professora Rossana Mara da Silva Moreira Thiré, DSc
COPPE / UFRJ
_________________________________________________
Karim Dahmouche, DSc
Externo
Rio de Janeiro
2006
ads:
iii
MOTTA, LEANDRO MEDEIROS.
Obtenção e caracterização de biomateriais compósitos de
quitina/hidroxiapatita / Leandro Medeiros Motta. – Rio de Janeiro,
2006.
xi, 109 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Polímeros) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Instituto de
Macromoléculas Professora Eloisa Mano – IMA, 2006.
Orientador: Cristina Tristão de Andrade
Renata Antoun Simão
1. Quitina. 2. Hidroxiapatita. 3. Biocompósitos.
4.Polímero/cerâmica. Teses. I. Cristina Tristão de Andrade (Orient.).
II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de
Macromoléculas Professora Eloisa Mano. III. Obtenção e
caracterização de biomateriais compósitos de quitina/hidroxiapatita.
iv
Esta Dissertação de Mestrado foi desenvolvida nos
Laboratórios do Instituto de Macromoléculas
Professora Eloisa Mano da Universidade Federal do
Rio Janeiro, com apoio do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
e da Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do
Rio de Janeiro (FAPERJ).
v
Dedicatória
À Deus, que me deu a saúde e a lucidez necessárias para o término deste
trabalho
Obrigado Senhor
Agradeço à minha mãe, Elizabeth Medeiros Motta, que me mostrou como ser
forte, sem perder a delicadeza.
Obrigado mãe, pela presença, apoio, amor, dedicação e força sempre
Agradeço à minha namorada, Francileide G. da Costa, que esteve presente em
boa parte desta caminhada e que tanto contribuiu para o alcance da vitória.
Amor, obrigado por tudo
Agradeço ao meu irmão, Bruno Medeiros Motta, pelo apoio, amor e amizade.
Valeu cara, te amo
Ás memórias de Newton Motta e Silva e Ivone Olympia de Medeiros, que se
foram, mas deixaram muito de si em mim.
vi
• AGRADECIMENTOS
As Professoras Cristina Tristão de Andrade e Renata Antoun Simão, que se
mostraram presentes em todos os meus momentos profissionais e pessoais, ora
como orientadoras, ora como amigas. Obrigado pelos ensinamentos e pela força.
Aos professores do IMA, que se mostraram grandes amigos durante esta jornada
e que contribuíram para o meu crescimento profissional;
Aos funcionários: Lea Lopes, Márcia Benzi, Nadir, Jorge Rodrigues, Solange,
Maria das Graças, Sandra e todos aqueles que contribuíram para obtenção e
caracterização dos materiais desta tese.
Aos amigos Mateus Binoti e Estevão Teixeira pela amizade e sinceridade sempre
que precisei: Obrigado grandemente pela amizade e por terem me dado forças
para levantar quando necessitei.
Aos amigos da “pensônia” pelos momentos de descontração: Octávio Augusto
(Paulista), Florêncio Gomes, Ronaldo Virgílio, Raio Leiser, Fued Junior, Marcelo
baiano, Felipe (Doc), Bruno (Ursão), Fabio, Marcus, Diego, Neto e Sônia: Valeu
galera
Aos amigos do laboratório: Carlos Ivan, Gisela Lopes, Marcinha, Rossana,
Celiana, Débora, Mateus Binoti, Thiago Ribeiro, Diego, Thiago Valadares e
Fernanda, que contribuíram muito para o andamento da Tese: Obrigado pelas
dicas inteligentes e palavras de incentivo
vii
As minhas tias Margareth e Norma Medeiros Netto pelo apoio, confiança, amor e
torcida:
Amo voces
Aos amigos do curso de mestrado: Leandro L., Emerson, Oscar, Camila, Marcos
F., Marlon, Roberto, Narda, Tatiane, Paula, Gisele, Adriana, Caio, Renata,
Patrícia, Lys, Viviane, Rodrigo, Francisco, Helvécio, Fernando e todos aqueles que
de alguma maneira contribuíram para a realização desta tese.
A amiga Lys pelos ensinamentos sobre difração de raios –X.
Agradeço ao CNPq e à FAPERJ pelo apoio financeiro para a realização da
pesquisa.
viii
“Não é o desafio com o qual nos deparamos, que determina quem somos ou
o que estamos nos tornando, mas a maneira que reagiremos ao desafio.
Somos combatentes, idealistas, mas plenamente conscientes, porque o ter
consciência não nos obriga a termos teoria sobre as coisas, só nos obriga a
sermos conscientes. Problemas para vencer, liberdade para provar e
enquanto acreditarmos em nossos sonhos nada é por acaso” (Henfil)
ix
Resumo da Dissertação apresentada no Instituto de Macromoléculas Professora
Eloisa Mano da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (MSc), em Ciência e
Tecnologia de Polímeros.
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE BIOMATERIAIS COMPÓSITOS DE
QUITINA/HIDROXIAPATITA
Leandro Medeiros Motta
Orientador: Cristina Tristão de Andrade e Renata Antoun Simão
Na maior parte das aplicações de biomaterias para regeneração óssea, a fragilidade
das cerâmicas as coloca em desvantagem. Nesses casos, o uso de compósitos
poliméricos alia as propriedades de ambos, cerâmica e polímero, de modo a formar um
material biomimético, que induza e promova a formação de osso e, ao mesmo tempo,
forneça suporte mecânico temporário. Cascas de camarão cinza (Penaeus schmitti) foram
lavadas, desmineralizadas com ácido clorídrico (HCl) e desproteinizadas com hidróxido de
sódio (NaOH) para a obtenção da quitina, que foi caracterizada por ressonância
magnética nuclear (NMR
13
C), espectroscopia do infravermelho (FTIR) e difratometria de
raios X (XRD). Membranas de quitina, obtidas por meio da dispersão do polímero em
dimetilacetamida/ cloreto de lítio e foram caracterizadas quanto à bioatividade em fluido
fisiológico simulado (SBF), por FTIR, por termogravimetria (TGA) e por microscopia
eletrônica de varredura (SEM). As membranas de quitina mostraram-se bioativas em SBF.
Três hidroxiapatitas foram produzidas (não calcinada, calcinada e porosa) e
caracterizadas por FTIR, XRD e SEM. O aumento do tamanho dos aglomerados
policristalinos esféricos com o tempo de calcinação foi percebido entre as HA.
Biocompósitos com 2%, 4% e 6% de cada hidroxiapatita foram produzidos por
incorporação ao gel de quitina e caracterizados por TGA e MEV. Os compósitos de maior
homogeinização e estabilidade térmica foram os produzidos com HA porosa.
Rio de Janeiro
2006
x
Abstract of Dissertation presented to Instituto de Macromoléculas Professora
Eloisa Mano of Universidade Federal do Rio de Janeiro, as partial fulfillment of the
requirement for the degree of Master/Doctor in Science (MSc/DSc), Science and
Technology fo Polymers.
Production and characterization of composites biomaterials of
chitin/hydroxyapatite
Leandro Medeiros Motta
Advisors: Cristina Tristão de Andrade
Renata Antoun Simão
Ceramics are fragile materials and their performance as biomaterials for
osteoregeneration is not as superior as required. In these cases, the use of
polymer/ceramic composites promotes not only induction of bone formation, but also
temporary mechanical support. In the present dissertation, shells of Penaeus schmitti
shrimp have been washed, demineralized with hydrochloric acid and deprotenized with
sodium hydroxide to extract chitin. This biopolymer has been characterized by nuclear
magnetic resonance (
13
C NMR), infrared spectrometry (FTIR) and X-ray difratometry
(XRD). Chitin membranes, obtained by dispersion in N,N-dimethylacetamide/lithium
chloride, followed by coagulation in a high humidity atmosphere, have been characterized
by FTIR, termogravimetric analysis (TGA) and scanning electron microscopy (SEM), after
exposition to a simulated biological fluid. Their bioactivity has been proved by the
deposition of apatite crystals. Non-calcinated, calcinated and porous hydroxyapatites (HA)
have been produced and characterized by FTIR, XRD and SEM. XRD data allowed to
identify each type of HA by size of its crystals. Chitin/HA composites with 2, 4 and 6% HA
have been produced and characterized by TGA and SEM. The composites with better
homogenezation and termical stabilization are produce with porous HA.
Rio de Janeiro
2006
xi
Parte desta Dissertação de Mestrado foi apresentada e premiada no seguinte
congresso:
8° Congresso Brasileiro de Polímeros 2005, realizado em Águas de Lindóia, São
Paulo.
Título do trabalho: NUCLEAÇÃO DE APATITA EM MEMBRANAS DENSAS E
POROSAS DE QUITINA
xii
SUMÁRIO
1. Introdução 1
2. Revisão Bibliográfica 6
2.1. Morfofisiologia óssea 6
2.2. Cicatrização da fratura óssea 9
2.3. Calcificação 12
2.4. Fosfatos de cálcio 12
2.5. Quitosana 21
2.6. Biocompósitos de quitosana aplicados em regeneração óssea 22
2.7. Quitina 29
3. Objetivos 31
4. Materiais e métodos 32
4.1. Produtos químicos 32
4.2. Equipamentos 32
5. Metodologia 34
5.1. Obtenção da quitina em pó 34
5.2. Obtenção da solução 7% LiCl/DMA 34
5.3. Obtenção do gel de quitina 35
5.4. Obtenção de membranas densas de quitina 35
5.5. Obtenção de membranas porosas de quitina 35
5.6. Obtenção do fluido fisiológico simulado (SBF) 36
5.7. Determinação da bioatividade das membranas de quitina 36
5.8. Obtenção da hidroxiapatita (HA) densa não calcinada 37
5.9. Obtenção da hidroxiapatita densa calcinada 37
5.10. Obtenção da hidroxiapatita porosa 37
5.11. Obtenção dos biocompósitos quitina/hidroxiapatita 38
5.12. Caracterizações 39
5.12.1 Ressonância magnética de alta resolução (NMR
13
C) 39
5.12.2 Espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR) 39
5.12.3 Difração de raios X (RDX) 39
5.12.4 Microscopia eletrônica de varredura (SEM) 41
5.12.5 Espectroscopia de energia dispersiva (EDS) 41
5.12.6 Análise Termogravimétrica (TGA) 42
6. Resultados e discussão 43
6.1. Caracterização da quitina 43
6.1.2. Ressonância magnética de alta resolução (NMR
13
C) 43
6.1.3. Espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIV) 45
6.1.4. Difração de raios-X (RDX) 48
6.2 Caracterização das hidroxiapatitas 50
6.2.1. Espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR) 50
6.2.2. Difração de raios-X (RDX) 53
6.2.3. Microscopia eletrônica de varredura (SEM) 59
6.2.4. Espectroscopia de energia dispersiva (EDS) 60
6.3. Caracterização das membranas de quitina 63
6.3.1. MEV membranas densas e porosas de quitina 64
6.3.2. Determinação da bioatividade das membranas de quitina 66
xiii
6.3.3. Análise termogravimétrica (TGA) 67
6.3.4 Microscopia eletrônica de varredura das membranas 68
6.4. Caracterização dos compósitos quitina/hidroxiapatita 70
6.4.1. Termogravimetria dos biocompósitos 70
6.4.2. SEM dos biocompósitos 75
7. Conclusões 77
8. Sugestões para trabalhos futuros 79
9. Bibliografia 80
10 Anexos 90
1
1. Introdução
Dentro da ciência de materiais, a área de biomateriais tem demonstrado um
desenvolvimento ímpar. Nessa área, o papel dos polímeros tem sido reconhecido,
devido as suas propriedades. Biomateriais poliméricos vêm sendo usados para a
substituição de tecidos epidérmicos, dérmicos e/ou subdérmicos, para a
regeneração de ossos, cartilagens e nervos, dentre outras funções. No caso
particular de regeneração de tecidos ósseos, além de biocompatível, o material
precisa apresentar propriedades mecânicas adequadas, porosidade, ser moldável e
esterelizável, e precisa possuir superfície com características específicas de
bioadesão e morfologia. Esses materiais têm como função a substituição temporária
da função mecânica e devem apresentar taxas de biodegradação apropriada, em
relação à regeneração tecidular. Isso significa que o material deve manter as suas
propriedades mecânicas enquanto se degrada, até que o novo tecido possa suportar
a carga. Por outro lado, o material não deve ser excessivamente forte a ponto de
provocar a erosão de tecido nativo situado na sua vizinhança [1].
Sabe-se que o corpo humano consegue reparar eficientemente pequenas
fraturas nos ossos, de tal forma que o ponto específico da lesão é preenchido por osso
natural, tão forte quanto o osso original. No entanto, fraturas mais extensas geralmente
exigem cuidados especiais, já que o corpo é incapaz de repará-las por si só. Também,
certos defeitos ósseos que podem ocorrer como resultado de anormalidades
congênitas, trauma ou doenças, necessitam de tratamentos especializados [2].
Durante toda a vida, o tecido ósseo é constantemente produzido e reabsorvido
pelo organismo em um processo equilibrado, que tende a manter a integridade desse
tecido. Com o avanço da idade, esse equilíbrio entre formação e reabsorção é afetado
de forma que a perda óssea passa a ser predominante. O processo de
desmineralização tende a deixar o esqueleto mais susceptível a traumatismos e com
uma menor possibilidade de recuperação. Somente nos Estados Unidos são
catalogadas aproximadamente 280.000 fraturas de quadril, 700.000 de vértebras e
250.000 fraturas de colo de fêmur a cada ano, o que representa uma despesa em torno
de 10 bilhões de dólares [3].
Nos métodos tradicionais de implante, ossos autólogos (retirados do próprio
organismo do paciente, tais como a crista anterior do osso ilíaco, porções de costela, da
calota craniana, da tíbia, da fíbula e da tuberosidade maxilar) têm-se mostrado
2
adequados para enxertos, assim como ossos exógenos (retirados de cadáveres
humanos ou de animais) desproteinizados e desmineralizados (DBM) [2,3]. No entanto,
em ambos os casos, o aparecimento de problemas está relacionado à técnica
empregada; duas incisões fazem-se necessárias no primeiro caso, além da
possibilidade de não-regeneração do osso usado. No segundo, o paciente torna-se
sujeito a doenças transmissíveis e riscos de rejeição do implante. Métodos alternativos
têm sido desenvolvidos, mas até então nenhum deles obteve resultado totalmente
satisfatório. Conseqüentemente, pesquisadores e a comunidade médica têm voltado
sua atenção para o promissor campo da engenharia de tecidos, para desenvolver
novos métodos de regeneração óssea [2].
Biomaterial pode ser definido como uma substância ou combinação de duas ou
mais substâncias (Biocompósitos), farmacologicamente inertes, de natureza sintética ou
natural, que são utilizados para melhorar, aumentar ou substituir, parcial ou
integralmente, tecidos e órgãos. Os biomateriais são utilizados desde as civilizações
mais antigas: olhos artificiais, orelhas, dentes e até narizes foram notificados em
múmias egípcias. Chineses e indianos já usavam ceras, resinas e tecidos para
reconstruir partes perdidas ou defeitos do corpo. Ao longo dos séculos, avanços nos
tipos de materiais sintéticos, técnicas cirúrgicas e métodos de esterilização vêm
permitindo o uso de biomateriais em partes do corpo nunca antes imaginadas [4]. Além
disso, esses materiais são produzidos para ser usados em tecidos do corpo que
experimentam níveis consideravelmente altos de agressividade. O pH nos fluídos
corpóreos de vários tecidos varia sob faixas bastante amplas (1 a 9 em alguns casos).
Cotidianamente os ossos são submetidos a tensões de até 4 MPa enquanto os tendões
e ligamentos suportam entre 40 e 80 MPa. Estas tensões são flutuantes e repetitivas, o
que torna o ambiente ainda muito agressivo [5].
O primeiro aspecto que se deve discutir é o tipo de efeito que estes materiais
vão provocar no tecido ósseo. Um enxerto/implante bioativo pode atuar basicamente de
três maneiras, de acordo com a classificação descrita a seguir; como osteocondutor
quando serve como substrato para a formação óssea; porém, não induz modificações
celulares ou estimula a formação de osteoblastos. Quando implantados em sítios não
ósseos não provocam a formação de tecido mineralizado, como osteoindutor, quando
induz a transformação de células indiferenciadas do tecido conjuntivo em condroblastos,
pré-osteoblastos ou osteoblastos. Desta forma quando implantados em sítios não
3
ósseos deverão levar à formação de tecido mineralizado [6]. Um enxerto osteogênico
possui osteoblastos viáveis, levando, desta forma, à ossificação direta. Esta
propriedade é restrita, de forma limitada, a alguns tipos de enxertos ósseos autógenos,
como os obtidos de osso trabeculado e de cavidades ósseas em fase de cicatrização
[6].
O tecido ósseo é constituído de 3 componentes principais: componente mineral,
responsável pela integridade estrutural do tecido, a matriz colagenosa e os fatores de
crescimento. Estes são polipeptídeos com ação semelhante aos hormônios e às
citocinas. Regulam a função local das células ósseas, estimulando diversos eventos
celulares: quimiotaxia, proliferação, diferenciação e produção de proteínas da matriz
extracelular. Diversos fatores de crescimento estão armazenados no próprio tecido
ósseo e atuam por meio de união com receptores específicos presentes nas superfícies
celulares. Seguindo-se este raciocínio, busca-se materiais que, além de
proporcionarem invasão tecidual e neovascularização, promovam também a
osteogênese (regeneração do tecido ósseo). Um dos maiores avanços nessa área tem
sido a purificação e a caracterização de famílias de proteínas indutoras como as
proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) e proteínas osteogênicas (OPs). Essas
proteínas induzem a neoformação óssea in vivo [7].
O desenvolvimento de materiais aloplásticos capazes de substituir ou reparar
tecidos danificados vem a ser uma das mais promissoras alternativas para contornar
todos os problemas associados ao uso de enxertos naturais (auto, xeno e aloenxertos).
Materiais metálicos com superfícies passivadas já são utilizados há muito tempo, como
implantes dentários e ortopédicos, visando este tipo de reparo. Os dois motivos
principais para o uso de metais são: a resistência compatível com as solicitações
mecânicas e a integração tecido/implante livre de reações imunológicas contrárias [8].
Ainda assim, os riscos de contaminação do corpo por íons metálicos produzidos pela
possível corrosão desses substratos não podem ser descartados. Outro grande
problema relacionado à utilização de implantes metálicos é o carregamento diferencial
entre o implante e o osso hospedeiro. O implante tende sempre a ser solicitado com
cargas significativamente mais altas que o osso circunvizinho, induzindo problemas de
reabsorção óssea e de integração osso/implante [9].
O biomaterial idealizado pela engenharia de tecidos ósseos deve englobar dois
princípios básicos: (a) ser capaz de promover o desenvolvimento de uma camada
4
superficial de apatita quando em condições fisiológicas e (b) facilitar a adesão,
espraiamento, crescimento e diferenciação de células osteoprogenitoras sobre sua
superfície [10,11].
Em busca de um transportador adequado, os pesquisadores Naoto Saito e
Kunio Takaoka [12] escolheram os polímeros biodegradáveis e biocompatíveis que, por
serem sintéticos, não possuem contra indicações xenogeneicas. Eles implantaram
BMPs associadas a poli(ácido lático) com peso molecular 650 (PLA650) em músculos
de pequenos roedores. A combinação apresentou alto índice de acidez, o que causou
alguns danos ao tecido ósseo formado nas cobaias vivas, além de o polímero ter-se
degradado muito rapidamente. Segundo os pesquisadores, após algumas outras
investigações, esta composição pode ser utilizada no reparo de lesões em que o próprio
organismo não obtém uma regeneração eficiente, como fraturas grandes e de difícil
cicatrização, defeitos decorrentes da extração de tumores, implantes de próteses
porosas de titânio, substituição de enxertos, cirurgias de espinha dorsal e reconstituição
de ossos. Os autores objetivavam conseguir o efeito clínico exemplificado na Figura 1.
BMP/composto polimérico
Biomaterial poroso
Osso re
ceptor
Nova formação óssea
Figura 1
: Exemplo de aplicação do BMP/biopolímero no implante de uma prótese
porosa de titânio. Quando os poros são preenchidos pela combinação, o composto
escoa e forma uma camada cobrindo toda a superfície com os biomateriais. Esta
camada pode envolver o implante e aumentar a sua fixação no osso [12].
Polietileno, polipropileno, poliestireno, poli(cloreto de vinila), poliamidas,
poliuretanos, poli(tereftalato de etileno), polite-tetrafluoretileno, poli(metacrilato de
metila), poli(ácido lático) , poli(ácido glicólico), poli(hidroxibutirato) , polietilenoglicol ,
poli(álcool vinílico) e seus copolímeros são alguns exemplos de materiais poliméricos
usados atualmente ou que já foram usados em implantes ósseos. Polímeros
biodegradáveis e biocompátiveis, como a quitosana, o poli (ácido lático) e poli(ácido
glicólico) já têm uso difundido em outras aplicações clínicas, como peças para implantes
5
ortopédicos, suturas cirúrgicas que são absorvidas naturalmente pelo organismo
quando se degradam e sistemas de liberação controlada de drogas.
A quitina em especial se mostra mais favorável à aplicação em biomateriais
devido ao grupamento acetamida, presente em maior quantidade em sua estrutura,
comparado com a quitosana. Este grupamento é muito similar a ligação amida presente
nas proteínas que constituem o tecido vivo, fazendo a quitina ser mais biocompatível
que a quitosana. O grupamento amina, presente em maior quantidade na quitosana,
tem ação hemostática quando implantada como biomaterial.
6
2. Revisão Bibliográfica
2.1. Morfofisiologia óssea
O osso é uma forma especializada de tecido conjuntivo muito denso. A matriz
óssea é constituída basicamente de colágeno do tipo I, glicoproteínas e fosfato de cálcio
sob forma de hidroxiapatita, Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
. As fibras de colágeno dão ao osso
resistência à tensão elevada, isto é, podem resistir ao alongamento e à torção. Os sais
permitem ao osso resistir à compressão. Esta combinação de fibras e sais confere ao
osso excepcional força, sem torná-lo quebradiço [13]. Uma camada cortical densa e
compacta (osso compacto) compreende a região externa dos ossos longos, enquanto
ossos trabeculares (osso poroso ou canceloso) preenchem o interior de ossos longos.
Como pode ser visto na Figura 2, o componente estrutural principal do osso compacto é
chamado de osteônio. Composto de uma matriz lamelar concêntrica, os osteônios criam
canais cilíndricos chamados de canais Harvesianos, que possibilitam o acesso ao osso
do sistema circulatório e nervoso. Os capilares dos canais Harversianos originam-se de
artérias e veias vindas da cavidade medular. Os canais de Volkmann, transversos ao
sistema Harversiano, aumentam a nutrição sanguínea no osso. Com exceção das
superfícies das articulações, o osso cortical é envolvido por uma fina camada de tecido
conjuntivo, o periósteo, que consiste primariamente de uma camada fibrosa rica em
colágeno e células osteogênicas. O osso poroso não mostra a mesma organização, que
é característica do osso compacto. Embora os osteócitos estejam alojados em lacunas,
que se comunicam através de canais, como no osso compacto, as lamelas não estão
arranjadas em camadas concêntricas. Mais apropriadamente, elas estão arranjadas em
várias direções, que correspondem às linhas de máxima pressão ou tensão. Os
capilares sanguíneos alcançam a vizinhança dos osteócitos passando nos espaços da
medula óssea entre as placas de osso formadas por lamelas. A partir dessas
considerações sobre a estrutura microscópica do osso, fica evidente que o sistema
esquelético é um sistema vivo bem suprido por vasos sanguíneos e nervos. Desse
modo, ele é capaz de executar suas funções dinâmicas de formar células do sangue,
através da medula óssea vermelha, reservar minerais, bem como exercer suas funções
estáticas de suporte, movimento e proteção visceral [14].
7
Figura 2
: Estrutura microscópica de osso cortical.(a) esboço em 3D do
osso cortical, (b) corte do sistema Harversiano, (c) fotomicrografia do
sistema Harversiano [13]
Esta combinação de ossos trabecular e cortical forma uma estrutura tipo
“sanduíche”, bem conhecida por suas ótimas propriedades estruturais [13], o que faz
com que o osso seja um material complexo, com uma micro-estrutura multifásica,
heterogênea e anisotrópica [14].
Os ossos podem crescer, modificar sua forma (modelamento ou remodela-
mento externo), auto-reparar-se quando fraturado (regeneração óssea) e
continuamente renovar-se por remodelamento interno. Todas essas funções são
ministradas por processos fisiológicos, mecânicos e hormonais. O crescimento ósseo
ocorre na maioria das vezes durante a infância, a cicatrização de fraturas somente
ocorre durante o tempo de reparo da lesão, já a reabsorção óssea ocorre durante toda
a vida, seguindo a regra ditada pela evolução microestrutural do osso e,
conseqüentemente, na adaptação de propriedades estruturais e reparos de
microdanos.
A reabsorção óssea somente ocorre nas superfícies internas da matriz óssea
(superfícies trabeculares de ossos cancelosos e sistemas Harversianos de ossos
corticais). Os ossos podem ser reparados ou reabsorvidos por células ósseas presentes
8
em suas superfícies.
Existem quatro tipos de células ósseas, que podem ser classificadas de acordo
com as suas funções, e são definidas a seguir.
• Osteoblastos são as células diferenciadas do mesênquima, que produzem os
ossos. Elas são criadas a partir do periósteo ou do estroma da medula óssea.
• Osteoclastos são as células que removem osso, desmineralizando-os com
ácido e dissolvendo o colágeno com enzimas. Estas células são produzidas
pela medula óssea.
• Células ósseas de revestimento são osteoblastos inativos, que não estão em
contato com o novo osso. Elas continuam na superfície quando a formação
óssea termina, e podem ser reativadas em resposta a estímulos químicos e/ou
mecânicos.
• Osteócitos são formados de osteoblastos que estão em contato com a matriz
óssea. Eles estão localizados em lacunas e se comunicam com as outras
células por canalículos. Muitos autores sugerem que os osteócitos sejam
células mecânico-sensoriais, que controlam o remodelamento do osso, mas
isto não foi provado ainda. Além do mais, é completamente razoável considerar
que os osteócitos, as únicas células presentes na matriz do osso, sejam
afetadas por processos que causam danos à matriz. Uma ruptura na matriz
óssea significa danos diretos aos osteócitos, rompendo suas junções com a
matriz, interrompendo suas comunicações canaliculares ou alterando suas
trocas metabólicas. A fadiga também pode criar uma situação de desuso dos
osteócitos, o que desencadeia um início de reabsorção (remodelamento)
ósseo, que começa com o recrutamento de osteoclastos.
O processo de remodelamento não é feito individualmente por uma célula
sozinha, mas por um grupo de células, que funcionam como unidades organizadas, as
“unidades multicelulares básicas” (BMU). Elas operam no periósteo, endósteo,
superfícies trabeculares e osso cortical, substituindo o “osso velho” por novos tecidos
ósseos, em um processo lento e discreto. As BMUs sempre seguem uma seqüência de
processos bem definida, que é conhecida como ativação-reabsorção-formação (A-R-F)
[14]. A Figura 3 mostra esquematicamente o processo de regeneração de ossos
corticais e trabeculares, onde se tem primeiro uma reabsorção osteoclástica de
9
fragmentos na fratura e depois a regeneração osteoblástica.
Figura 3:
Seqüência A-R-F nos ossos cortical (b) e trabecular (a) [15]
2.2. Cicatrização da fratura óssea
O osso é um tecido vivo que é rotineiramente exposto a esforços mecânicos
capazes de mudar sua integridade estrutural. Existem muitas causas de fraturas no
osso e, ao contrário dos materiais inertes, o tecido ósseo pode regenerar-se para
formar novos tecidos no lugar da fratura ou perda óssea. A cicatrização de uma
fratura é um dos notáveis processos biológicos no corpo. O entendimento da
regeneração tissular é também essencial para explicar processos biológicos
semelhantes, tais como a embriogênese do esqueleto e o crescimento.
A formação óssea no embrião e o crescimento infantil podem ocorrer de
diferentes formas; endocondrial, intramembranoso ou ossificação aposicional. No
primeiro caso, a cartilagem é formada, calcificada e substituída pelo osso. No
segundo, o osso é formado diretamente de osteoblastos (ossos planos como os da
cabeça ou pélvis). No terceiro, a ossificação é adjacente às camadas da membrana
10
de células do mesênquima, que se diferenciam em osteoblastos. Quando os
osteoblastos não partem de uma membrana (como exemplo endósteo, trabecular ou
superfícies dos canais Harversianos), a ossificação é chamada aposicional. O último
tipo de ossificação é normalmente o único que achamos em adultos saudáveis, mas
os dois últimos podem ser ativados durante o processo de cicatrização de uma
fratura. Além do mais, este processo é importante para entender o processo de
reparação tissular bem como a geração de tecidos [14,15].
A cicatrização é um processo muito complexo, que envolve a participação
coordenada de imigração, diferenciação e proliferação de células inflamatórias,
angioblastos, fibroblastos, condroblastos e osteoblastos, que sintetizam e liberam
substâncias bioativas dos componentes da membrana extracelular (como exemplo
podem ser citados os diferentes tipos de colágeno e fatores de crescimento) [14,15].
Pode-se diferenciar dois tipos de cicatrização; primária e secundária. A cicatrização
primária ocorre em casos de extrema estabilidade e de fraturas de pequeno tamanho,
que envolvem esforço direto do osso para autoregenerar-se. A cicatrização secundária
ocorre quando não há auto-regeneração e o tamanho da fratura é moderado. Neste
caso, a cicatrização ativa respostas no periósteo e tecidos cartilaginosos externos, que
formam um calo externo, o qual reduz o movimento inicial por aumentar a dureza no
local. A maioria das fraturas é reparada pela cicatrização secundária, que faz o trabalho
mais completo de substituir o osso velho e danificado [14,15].
A cicatrização secundária de fraturas tem uma série de estágios seqüenciais,
que se sobrepõem em uma extensão certa, incluindo inflamação, diferenciação do calo,
ossificação e remodelamento [14,15]. O primeiro estágio começa depois da fratura do
osso. O sangue emana das veias rompidas e uma hemorragia rapidamente preenche o
espaço aberto pela fratura. Macrófagos removem o tecido morto e geram o tecido
granular inicial para a migração e diferenciação das células mesenquimais, originando
um calo estabilizador inicial. Essas células proliferam-se e migram para a área ao redor
do tecido lesado [16]. No estágio seguinte, as células mesenquimais vão diferenciar-se
em condrócitos, osteoblastos ou fibroblastos, conforme é mostrado na Figura 4,
dependendo das condições biológicas e mecânicas. Estas células diferenciadas
começam a sintetizar a matriz extracelular e seus tecidos adjacentes. O osso
intramembranoso é produzido por diferenciação direta das células-tronco em
osteoblastos, e aparecem adjacentes às paredes da fratura, avançando para o centro
11
do calo. Ao mesmo tempo, no centro do calo, a cartilagem é produzida por
condrogênese [14,15].
Figura 4:
Esquema sobre a diferenciação de células-
tronco mesenquimais
em células de vários tecidos [17]
Uma vez que o calo é preenchido (principalmente por cartilagem), a ossificação
endocondrial inicia uma seqüência complexa de eventos celulares, que incluem a
maturação da cartilagem, a reabsorção do coágulo sanguíneo, a vascularização e a
osteogênese.
A ossificação tem continuidade até que toda a cartilagem seja substituída por
osso e uma ponte óssea ao redor da abertura deixada pela fratura consiga uma boa
estabilização e dureza suficiente. Quando a fratura está completamente estabilizada,
células do mesênquima (Figura 4) começam a invadir a abertura deixada pela fratura.
Uma vez que a abertura é ossificada, remodelamentos ao redor da fratura começam a
restaurar a estrutura e a forma interna (remodelamentos interno e externo do osso). O
último estágio é muito mais longo do que o primeiro (de um ano a várias semanas,
dependendo da espécie de animal).
A evolução de todo o processo acima descrito depende de vários fatores, tais
como pressão exercida sobre o osso, o tipo de osso, o tipo de fratura, o tamanho da
abertura, o suprimento de sangue, hormônios, espécie de animal, sexo, idade, peso,
fatores de crescimento etc [15].
A regeneração do tecido ósseo envolve não somente a síntese de
hidroxiapatita rica em colágeno, mas também a recriação de uma estrutura complexa
que proporciona estabilidade mecânica ao osso.
12
2.3. Calcificação
A calcificação é um processo natural que ocorre durante muitas situações no
corpo humano, por exemplo, depois que um osso é fraturado. O processo de
calcificação natural pode ser reproduzido e investigado em laboratório nos biomateriais
tais como a quitina. A calcificação de biomateriais pode ser denominada de deposição
“in situ”. Os estudos de deposição “in situ” são de grande interesse em vários campos
tecnológicos e científicos. No campo dos materiais, eles conduzem para o
desenvolvimento de materiais mais resistentes e funcionais No campo médico, eles
ajudam o entendimento da formação natural de ossos e dentes e permitem a obtenção
de implantes osteogênicos e próteses para correção ortopédica [2], bem como ajudam
no desenvolvimento de novas estruturas para tecidos de engenharia [3]. Por outro lado,
as biopróteses geralmente falham devido a não calcificação ou calcificação patológica.
O conhecimento detalhado dos processos de biomineralização ajudam a evitar a
calcificação patológica e, conseqüentemente, a falha dos implantes médicos.
Neste contexto, fluidos biológicos sintéticos (SBF), com concentrações
iônicas semelhantes àquelas do plasma do sangue humano, são usados para a
obtenção de apatitas de uma única fase (CHA), em meio aquoso neutro, e foram
considerados como a melhor fonte para a obtenção de apatitas carbonatadas.
2.4. Fosfatos de Cálcio
Existe uma grande quantidade de fosfatos de cálcio na natureza e vários
desses sais são vistos em calcificações normais e patológicas no corpo humano.
Além da solubilidade, a razão Ca/P, cristalinidade, sinterização e presença de poros
são parâmetros que diferenciam a maior parte desses fosfatos. Para compostos
quimicamente puros, a razão Ca/P varia entre 0,5 e 2,0 sendo que quanto menor é a
razão, maior a sua acidez e a sua solubilidade em água, como mostrado na Tabela 1
[17].
A hidroxiapatita [Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
] possui razão Ca/P de 1,67 e é o fosfato
de cálcio mais estável e o menos solúvel de todos. A HA pura cristaliza-se sob a
forma monoclínica com espaçamento de grupo P2
1
/
b
; no entanto, a temperaturas
acima de 250°C, existe a transição da forma monoclínica para hexagonal, com
espaçamento de grupo P6
3
/m [19, 20]. Algumas impurezas, ou substituições parciais
13
da hidroxila por íons cloreto ou fluoreto, estabilizam a forma hexagonal a
temperatura ambiente. Por esse motivo, monocristais naturais de HA geralmente
exibem uma conformação hexagonal [17]. Sua densidade é de 3,16 Kg/m
3
e os
parâmetros de rede são a=b=0,9423 nm e c=0,6875 nm [20]. A Figura 6 mostra o
arranjo de uma célula unitária da HA.
Figura 5
: Rede Cristalina da hidroxiapatita; azul: átomo de Ca
amarelo: átomo de H; vermelho: átomo de P [21]
Tabela 1: Propriedades de fosfatos de cálcio biologicamente importantes. O Kps refere-se ao
produto de solubilidade [18,19].
Razão
Ca/P
Composto Fórmula Química
Solubilidade a
25ºC (–log
K
ps
)
Solubilidade
a 37ºC (–log
K
ps
)
0,5 Fosfato monocálcico hidratado (MCPM) Ca (H
2
PO
4
)
2
. H
2
O 1,14 –
0,5 Fosfato monocálcico anidro (MCPA) Ca (H
2
PO
4
)
2
1,14 –
1,0
Fosfato bicálcico bihidratado (DCPD,
bruxita)
CaHPO
4
. 2H
2
O 6,59 6,63
1,0
Fosfato bicálcico anidro (DCPA,
monetita)
CaHPO
4
6,90 7,02
1,33 Fosfato octacálcico (OCP) Ca
8
(HPO
4
)
2
(PO
4
)
4
. 5H
2
O 96,6 95,9
1,5
Fosfato α-tricálcico (α-TCP) α-Ca
3
(PO
4
)
2
25,5 25,5
1,5
Fosfato β-tricálcico (β-TCP) β-Ca
3
(PO
4
)
2
28,9 29,5
1,2-2,2 Fosfato de cálcio amorfo (ACP) Ca
x
(PO
4
)
y
. nH
2
O 25,7 (pH 7,40) 29,9 (pH 6,00)
1,5-
1,67
Hidroxiapatita deficiente em cálcio
(CDHA)
Ca
10–x
(HPO
4
)
x
(PO
4
)
6–x
(OH)
2–x
(0 < x < 1)
≈85,1 ≈85,1
1,67 Hidroxiapatita (HA) Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
116,8 117,2
2,0 Fosfato tetracálcico (TTCP) Ca
4
(PO
4
)
2
O 38-44 37-42
14
A síntese da HA pode ser conduzida através de uma reação em meio
aquoso, por intermédio de reagentes contendo íons Ca
+2
e PO
4
-3
em pH acima de 9
[20].
As reações podem ser do tipo ácido-base
10Ca(OH)
2
.+ 6H
3
PO
4
→
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
+ 18 H
2
O
Eq. (1)
ou entre dois sais
10CaCl
2
+ Na
2
HPO
4
+ 2H
2
O
→
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
+ 12NaCl + 4H
2
Eq. (2)
10Ca(NO
3
)
2
+ 6(NH
4
)HPO
4
+ 2H
2
O
→
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
+ !2 NH
4
NO
3
+ 8HNO
3
Eq. (3)
A hidroxiapatita cristalina pode ser obtida mais eficientemente por meio de
reações no estado sólido entre fosfatos de cálcio e CaO, Ca (OH)
2
ou CaCO
3
, com
temperaturas acima de 900°C e sob atmosferas constituídas de H
2
O e N
2
. Um
exemplo é a reação entre a brushita e o carbonato de cálcio.
6CaHPO
4
.2H
2
O + 4CaCO
3
900°C
→
Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
+4CO
2
+14H
2
O
Eq. (4)
O biomimetismo é definido como sendo o desenvolvimento de materiais que
imitam a estrutura e função de materiais criados pela natureza. Em vários casos, o
biomimetismo não chega a buscar uma cópia idêntica e sim conceitos- chave do
sistema biológico que podem ser adaptados para a área de biomateriais [22]. Neste
contexto, Allegrett e Bertran [23] estudaram a precipitação de fosfatos de cálcio em
matrizes de colágeno tipo I e compararam este processo com a mineralização de
tecidos vivos, por meio de técnicas de difração de raios-X, espectroscopia de
absorção no infravermelho e microscopia eletrônica de varredura (MEV) [23]. A
Figura 6a mostra a formação de glóbulos de colágeno após a permeação de vapor
de amônia, que resulta no aumento do pH e, conseqüentemente, na precipitação de
fosfato de cálcio em meio à matriz que recobre o sistema. Estes glóbulos controlam
a forma das partículas de fosfato de cálcio precipitados em seu interior (Figura 6b).
Essa figura mostra uma grande semelhança entre as partículas precipitadas com as
presentes na fase óssea inorgânica de ratos da raça Wistar. A observação
cuidadosa da Figura 6b mostra que as partículas formadas no interior dos glóbulos
15
são aglomerados de partículas nanométricas em forma de placas e agulhas que
antes estavam cobertas de colágeno, confirmando que foram formados no seu
interior. A análise por raios-X apresenta espectros com alta intensidade dos picos
atribuídos à presença de Ca e P, comprovando a composição e razão Ca/P das
amostras.
Figura 6:
Microscopia Eletrônica de Varredura matriz
de colágeno sem (a) e com (b) ação de hidrazina [23]
Figura 7 :
DRX de fase mineral óssea de ratos Wistar
e do material sintetizado [23]
O difratograma de raios-X da Figura 7 mostra que o fosfato de cálcio
sintetizado e os materiais constituintes da fase mineral de ossos de ratos Wistar
apresentam padrões de difração muito semelhantes. Os materiais apresentam picos
largos, característicos de materiais pouco cristalinos e com picos em 26° (002) e 32°
(211), típicos das apatitas.
A Figura 8 mostra espectros de FTIR obtidos a partir do fosfato de cálcio
precipitado em colágeno dialisado, após tratamento com hidrazina, e das fases
ósseas inorgânicas de fêmur e de crânio provenientes de ratos com a idade de um
ano, que também sofreram desproteinação por hidrazina. As fases minerais
apresentam bandas características de carbonato. Essas bandas são bastante
comuns nas fases minerais dos ossos, pois o carbonato substitui OH
-
e HPO
4
-2
na
16
estrutura da HA, formando as chamadas apatitas carbonatadas. Para os materiais
obtidos nas sínteses, nenhum cuidado com o controle de CO
2
foi realizado, portanto
a presença de CO
3
-2
nas amostras é perfeitamente aceitável [23].
Figura 8
: Espectros de FTIR da fase óssea inorgânica de crânio e fêmur
de ratos, fosfato após extração com hidrazida [23]
Os materiais de fosfato de cálcio sintetizados e fases ósseas inorgânicas
foram analisados por espectroscopia de emissão atômica por plasma indutivamente
acoplado (ICP/OES). A concentração relativa nas amostras foi determinada, sendo
que materiais sintetizados apresentam razão Ca/P=1,67, ou seja, igual à da
hidroxiapatita (HA) e muito próxima da razão Ca/P=1,70, dos ossos estudados.
Esses resultados confirmam a composição iônica do material reforçando novamente
a semelhança dos fosfatos de cálcio sintetizados e da fase óssea inorgânica. Os
autores chegaram à conclusão de que o colágeno altera a morfologia das partículas
nucleadas e crescidas no seu interior. O colágeno atua na formação do fosfato de
cálcio resultando em partículas com morfologia acicular submicrométricas e com
cristalinidade reduzida ao raio-X exatamente como ocorre nos ossos. A
cristalinidade, morfologia e composição iônica dos materiais sintetizados é
semelhante à da fase mineral óssea. A razão Ca/P destas partículas é igual à da HA.
Os materiais sintetizados, por apresentarem similaridades aos ossos, podem formar
bons osteoindutores e/ou osteointegradores [23].
Recentemente, muitas publicações referentes à produção e precipitação das
cerâmicas de hidroxiapatita têm aparecido na literatura, e uma ampla variação no
17
processo de precipitação e nas propriedades mecânicas desses materiais foi
observada [24-29]. Alguns pesquisadores verificaram a estabilidade térmica dos pós
sintetizados com o objetivo de definir uma faixa de temperatura apropriada para
processá-los [30]. A hidroxiapatita (HA) foi preparada de acordo com a metodologia
anteriormente desenvolvida [31,32] e porções diferentes do pó precipitado foram
tratadas a temperaturas que variaram de 500 a 1200°C. A aplicação da técnica de
difração de raios-X permitiu concluir que o material mantém a sua estabilidade até a
temperatura de sedimentação de 1200°C, como se pode verificar na Figura 9.
Observa-se que a 1300°C surgem novos picos, que correspondem a β-Ca
3
(PO
4
)
2
(β-trifosfato de cálcio ou β-TCP) [30].
Figura 9
: Difratogramas de raios-X de amostra de hidroxiapati-
ta aquecida a 1200
°
C e a 1300
°
C. [30]
18
A Tabela 2 mostra os resultados obtidos de analizador de área específica
(BET). Uma área superficial de 10 m
2
/g é apropriada para evitar aglomerados
indesejáveis, que podem ser produzidos se pós com grande área superficial forem
escolhidos, afetando assim as propriedades mecânicas da hidroxiapatita sintetizada.
A temperatura de 1100°C foi a que levou ao material ter maior resistência à
compressão [30].
Tabela 2: Á
rea superficial da hidroxiapatita após diferentes
tratamentos térmicos [30].
Tratamento
Térmico (°C)
Área superficial específica (BET) (m
2
/g)
Pó inicial 51
500 38
600 25
700 19
800 15
900 9
1000 7
1100 6
1200 3
Uma forma comum de biomaterial de reparo ósseo é o cimento ósseo, que
apresenta muitas vantagens, como por exemplo, o fato de proporcionar um encaixe
ajustável às dimensões da cavidade a ser preenchida, não sendo assim necessário
golpear a prótese, o que evita procedimentos traumáticos para o paciente [33].
As propriedades osteocondutoras das camadas de hidroxiapatita surgem
como um resultado direto de suas propriedades de dissolução. A dissolução da
hidroxiapatita permite a redistribuição dos íons cálcio e fósforo que podem ser
usados pelos tecidos ao redor da fratura no “novo osso” [34-38]. A hidroxiapatita com
diferentes fases de fosfato, bem como diferentes morfologias, tem solubilidades
variáveis in vivo [39].
Ginebra e colaboradores [40] investigaram a possibilidade de controlar as
características micro e nanoestruturais finais de um cimento de fosfato de cálcio,
modificando o tamanho da partícula do pó inicial. O desenvolvimento de fosfatos de
19
cálcio com micro e nanoestruturas definidas poderiam modular algumas respostas
biológicas específicas, tais como a adsorção protéica e a adesão celular, fenômenos
que dependem fortemente do nano-relevo da interface do material [40]. Nesse
estudo, o cimento estudado tinha como único reagente ativo o α-tricálcio fosfato (α-
TCP), principal reagente usado em muitos outros trabalhos recentes. Em estudos
anteriores, foi mostrado que o assentamento e o endurecimento do α-TCP deve-se a
uma reação de hidrólise.
3Ca
3
(PO
4
)
2
+ H
2
O
→
Ca
9
(HPO
4
) (PO
4
)
5
OH
Eq. (5)
Como o tamanho da partícula pode exercer influência sobre as reações
cinéticas e sobre os mecanismos físico-químicos, responsáveis pelas propriedades e
estrutura final do cimento, a granulometria do α-TCP foi controlada por meio de
trituração durante diferentes períodos de tempo (30 e 360 min) e em duas diferentes
velocidades de rotação (525 e 625 rpm, respectivamente). A ambos os cimentos, foi
adicionada uma solução a 2% de hidroxiapatita precipitada, como agente nucleante.
A fase líquida consistiu de uma solução aquosa a 2% de fosfato hidrogênio
dissódico, Na
2
HPO
4
. A relação líquido /pó usada foi de 0,32 ml/g. A distribuição de
tamanho de partícula dos dois pós iniciais, grosso (C) e fino (F), foram obtidas por
difração a laser. Os parâmetros principais que caracterizam a distribuição de
tamanho de partícula e a área superficial específica são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3: Parâmetros de tamanho de partícula e superfície específica de α- TCP [40]
α
αα
α-TCP
D(10)
(µ
µµ
µm)
a
Tamanho
médio
D(50)(µ
µµ
µm)
D(90)(µ
µµ
µm)
b
Volume médio
do tamanho da
partícula
M
v
(µ
µµ
µm)
Número médio
do tamanho da
partícula
M
n
(µ
µµ
µm)
Superfície
específica
(m
2
/g)
Pó C 2,12 10,88 25,12 12,95 2,07 0,54
Pó F 1,39 2,22 11,69 5,06 1,55 2,73
a
D(10) significa que 10% das partículas em pó são menores que o valor determinado;
b
D(90) significa que 90% das partículas em pó são menores que este valor.
Os autores também observaram que um dos efeitos da redução do tamanho
das partículas foi o fato de a pasta (cimento “molhado”) tornar-se mais fina e menos
injetável para o cimento F do que para o cimento C mostrado na Figura 10. Isto foi
explicado pela alta superfície específica do cimento fino, e a grande quantidade de
20
água adsorvida por suas partículas sólidas. A redução do tamanho da partícula
resultou em um cimento de acomodação muito mais rápida. Este comportamento
pode ser explicado como um resultado das diferentes interações que ocorrem na
pasta. No caso dos cimentos finos, devido à alta superfície específica das partículas,
mais altas serão as atrações intermoleculares nas partículas, ou seja o tempo de
coesão foi reduzido à medida em que o tamanho das partículas diminuiu [40].
Figura 10:
(a) Tempo de coesão (C-T), tempo de assentamento inicial (I-
T) e tempo de
assentamento final (F
-
T) para os cimentos com tamanho de partículas grossas (cimento C)
e fina (cimento F) na fase purulenta (de pó). Morfologia dos dois pós iniciais o
bservados
pelo SEM: (b) pó C e (c) pó F [40].
Um método foi elaborado para obter-se a formação de macroporos em
cimentos de fosfato de cálcio (CPC). Esse método apresentou vantagens em relação
aos métodos propostos anteriormente; a temperatura de processamento não
ultrapassa a temperatura ambiente e, além disso, componentes orgânicos ativos
biologicamente podem ser incorporados aos macroporos do CPC [41]. Uma mistura
formada pela solução de fosfato de sódio gelado e pós de CPC foi compactada a
uma pressão de 106 MPa e o fosfato de sódio foi fundido simultaneamente à
formação do cimento, formando assim os poros. O efeito da quantidade de
porogênio (fosfato de sódio) durante a formação dos poros, a distribuição do
tamanho dos poros e a força de compressão foram investigadas.
A Tabela 4 mostra o efeito da macro-porosidade nas propriedades de
compressão mecânica do CPC. A força compressiva diminuiu significativamente na
presença da macroporosidade. Os espécimes feitos com uma relação cimento/gelo
(C:I) de 5 tiveram um nível de macroporosidade calculado de 53%, a força de
compressão foi diminuída em uma casa decimal, comparada com o CPC sem a
adição de gelo. Já os altos níveis de macroporosidade não mudaram claramente a
força de compressão, ou seja, um decréscimo menor foi observado para as forças
21
compressivas medidas nas relações C:I menores (porcentuais de macroporos
maiores).
Tabela 4 : Efeito da porosidade na força de compressão [48].
Relação C:I
Porosidade
Total medida (%)
Força de compressão
(KPa)
em gelo 31 37000
5 53 2930
4 56 640
3 63 430
5:2 62 600
Os autores concluíram que a introdução de macroporos nos cimentos
significava efetivamente na diminuição da força compressiva dos cimentos (CPC).
Como pode ser visto na Tabela 4 [41].
2.5. Quitosana
A quitosana, poli-(1,4)-β-2-amino-2-desoxi-D-glicose, é um biopolímero
natural obtido de fonte renovável, derivado do segundo composto orgânico mais
abundante da Terra, a quitina. A quitina é um polissacarídeo formado de unidades
constitucionais repetitivas de 2-acetamida-2-desoxi-D-glicose [poli(N-acetil-D-
glicosamina)], extraída a partir do exoesqueleto de alguns crustáceos como
caranguejos e camarões [42]. A quitosana é obtida por meio da desacetilação da
quitina, conforme mostra a Equação 6. A quitosana também é um interessante
biomaterial devido ao fato de ser facilmente moldável a pH neutro, o que é bom para
produzir-se biomateriais injetáveis.
Equação 6
: Obtenção de quitosana a partir da desacetilação da quitina [42,43]
22
Porém, devido ao seu grupo amino ser facilmente protonado, a quitosana
dissolve-se em pHs ácidos, enquanto que em pHs básicos, ocorre precipitação. A
quitosana também possui características como hidrofilicidade, biocompatibilidade,
biodegradabilidade, propriedades antibacterianas e afinidade por proteínas.[43]
2.6. Biocompósitos de Quitosana aplicados em regeneração óssea
Tonoli e colaboradores [44] caracteriza-ram cimentos obtidos de quitosana e
das cerâmicas β-TCP e hidroxiapatita, por MEV [44]. A Tabela 5 mostra a
composição dos cimentos.
Tabela 5 : Composição dos cimentos obtidos a partir da quitosana [44]
Número Pó Líquido L/P(mL/g)*
1
100% β-TCP
0% solução de
quitosana
0,8
2
100% β-TCP
1% solução de
quitosana
0,8
3
100% β-TCP
5% solução de
quitosana
0,8
4
100% β-TCP
10% solução de
quitosana
0,8
5
100% β-TCP
30% solução de
quitosana
0,8
6
100% β-TCP
50% solução de
quitosana
0,8
7
100% HA
0% solução de
quitosana
0,8
* L/P(mL/g)- relação líquido/ pó
As Figuras 11a, 11b, 11c, 11d e 11e mostram as fotos obtidas por MEV para
os cimentos de endurecimento satisfatório apresentados na Tabela 5. A análise
dessas figuras permite concluir que a adição de quitosana torna os grãos do cimento
mais interconectados.
23
(a) 0% de quitosana; (b) 1% de quitosana; (c) 5% de quitosana;
(d) 10% de quitosana; (e) 30% de quitosana [44]
Figura 11:
Cimentos contendo porcentagens diferentes de quitosana
Acredita-se que o efeito observado, relativo à maior coesão entre as
partículas e à menor porosidade, devido à adição de quitosana a cimentos
constituídos somente de β-TCP, foi devido à interpenetração das cadeias
macromoleculares nos espaços deixados entre as partículas do precipitado
inorgânico. O grupo amino da quitosana, que é protonado em meio ácido, parece ter
interagido com o precipitado, o que deve ter contribuído para a homogeneização do
compósito. A técnica de MEV possibilitou verificar-se a diferença na
interconectividade dos grãos, entre as amostras que continham quitosana e a
amostra que não continha quitosana. A amostra mais compacta foi aquela preparada
com uma solução ácido fosfórico + quitosana, com 30% de quitosana presente. Isso
levaria a pensar-se que quanto mais quitosana presente na amostra, melhor a
compactação do cimento. No entanto, uma amostra preparada com uma solução
que continha 50% de quitosana não se mostrou viável, uma vez que não endureceu
em tempo satisfatório, e não demonstrou possuir uma resistência mecânica
desejável [44].
Kim e colaboradores [45] propuseram um novo cimento ósseo bioativo
(BBC), composto de pó de osso natural (HA), pó de quitosana e um cimento ósseo já
disponível no mercado à base de poli (metacrilato de metila) (PMMA), para uso em
24
cirurgias ortopédicas, tais como vertebroplastias e cirurgias de preenchimento ósseo
[45]. Nesse estudo, a HA [Ca
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
, Ca/P=1,67] foi obtida de pedaços de
ossos trabeculares de espinhas de porco, que foram aquecidas em forno tubular. Os
autores classificaram as amostras em quatro tipos (BBC I, II, III, e PMMA puro) de
acordo com a relação de PMMA no pó ósseo (Tabela 6). As amostras foram
preparadas adicionando metacrilato de metila na concentração de 1,52 g/ml.
Tabela 6 : Classificação das espécies [45]
Pó (peso%)
Cimentos ósseos
PMMA Osso (HA) Quitosana
Simplex P
100 0 0
BBC I 50 40 10
BBC II 40 50 10
BBC III 30 60 10
O PMMA, que é muito usado como cimento ósseo, apresenta limitações; por
exemplo, o PMMA adere-se insufici-entemente às superfícies ósseas (não possui
bioatividade) [46], é mais fraco que um osso cortical, tem reações exotémicas a altas
temperaturas [45], e o seu monômero exibe toxicidade [47,48]. As características
mecânicas dos cimentos de PMMA têm também apresentado problemas; cimentos
produzidos pela mistura de fases com este polímero são frágeis e têm pouca
resistência à fadiga [49].
A Figura 12 mostra micrografias obtidas por SEM de pós de PMMA, HA e de
pó de quitosana, anteriormente à formação dos cimentos (BBCs) [45].
Figura 12:
Morfologias do pó de PMMA (a), pó de HA (b) e pó de quitosana antes da
mistura para a formação dos BBCs, obtidas por SEM [45]
As investigações morfológicas das misturas feitas por SEM mostraram a
coexistência de partículas de PMMA e de sulfato de bário (Figura 12a).
25
Observações dos cimentos ósseos, obtidas por SEM, revelaram que os
BBCs são altamente porosos e possuem as estruturas porosas da HA e da
quitosana muito bem conectadas, enquanto os cimentos de PMMA puros não
possuem estruturas porosas (Figura 13A). Depois de cerca de 8 semanas de
degradação em um ambiente equivalente ao fisiológico (0,9% NaCl, pH 7,4 ajustado
diariamente e 37°C de temperatura), os tamanhos de poros de BBCs aumentam
para cerca de 200 µm e o cimento de PMMA puro não mostrou qualquer variação na
sua microestrutura (Figura 13B).
Segundo os autores, a série de BBCs tem uma aplicabilidade clínica em
potencial. As observações feitas por SEM indicam que os BBCs possuem espaços
porosos para osteocondução, após a degradação da quitosana. Os poros em BBCs
possibilitam o crescimento ósseo dentro do material e os ancora melhor às superfícies
orgânicas [50]. Estudos prévios mostraram que existe um tamanho específico de poro
para que as células ósseas cresçam otimamente, que é de no mínimo 150 µm [51], o
que faz com que os BBCs II e III, com tamanho médio de poros de cerca de 200 µm
depois da implantação, sejam o de maior potencial neste quesito. Estudos prévios
também reportaram que a porosidade, combinada com um material bioativo deve ser
responsável pelo aumento da colonização do material por células, atividade
Figura 13: Microestruturas de tipos de BBCs observadas por SEM (300
×
): (a) antes da
degradação (b) depois da degradação (8 semanas) [45].
26
osteoblástica, osteoindução, processos de osteocondução e remodelamento ósseo
[52,53]. Tanto o exame radiológico, quanto o histológico demonstraram que os BBCs
são biocompatíveis e osteocondutores. Observações feitas na área interfacial entre o
osso regenerado e o cimento ósseo revelaram que, devido ao BBC-II ter muito mais
poros, o espaçamento entre o osso e o material é menor do que no caso do PMMA
puro, depois de 4 semanas (Figura 14).
O espaço entre o osso e o PMMA puro torna-
se
maior com o passar do tempo, embora a área interfacial permaneça estável entre
o osso e o cimento BBC II
Figura 14: Observações feitas por SEM de interfac
es entre o osso e os cimentos ósseos (A)
osso- PMMA ;(B) osso- BBC II. [45].
27
Figura 15
: O exame histológico das interfaces entre o osso e os cimentos ósseos
depois de 2 e 4 semanas de implantação. Depois de 4 semanas de implante, a
formação óssea foi percebida ser mais eficaz em BBC II do que no PMMA puro [45].
Muitos artigos têm publicado efeitos interessantes da quitina e quitosana no
processo de cicatrização celular e osteogênese. A quitina e a quitosana induzem os
fibroblastos a liberar interleucina- 8, que é um mediador celular envolvido na migração e
proliferação de fibroblastos e células endoteliais vasculares [54]. Okamoto e
colaboradores [55] investigaram os efeitos da quitina e quitosana e seus oligômeros e
monômeros na migração de fibroblastos e células endoteliais vasculares in vitro [55]. A
quitina (MW, 300 kDa) e a quitosana (MW, 80kDa) de 3,5 µm de tamanho de partícula
foram esterelizadas usando o gás óxido de etileno, e suspensas em solução-tampão
fosfato pH: 7,2 (PBS, pH 7,2) na concentração de 10 mg/ml. Cada oligômero e
monômero foram dissolvidos em PBS na concentração de 10 mg/ml e então filtrados
em membranas com diâmetros de poro de 0,45 µm. As concentrações de todos os
reagentes foram ajustadas para valores finais entre 10
-4
e 1,0 mg/ml em cada meio de
cultura utilizado.
Outro material utilizado foi constituído de partículas de látex
(Polyscienec,Inc., USA) no tamanho de 2,8 µm, que foram suspensas em PBS na
concentração de 10 mg/ml (essas partículas foram usadas como controle). O meio
de cultura utilizado continha células 3T6, derivadas de fibroblastos de fetos de ratos
e células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC), em concentrações
apropriadas. A observação dos efeitos diretos da quitina e da quitosana na atividade
migratória de células 3T6 são mostradas na Figura 16. A atividade migratória das
28
células 3T6 foi reduzida para quitina nas concentrações entre 0,01 e 1,0 mg/ml,
quando comparada com os controles positivo (PF4- fator recombinante plaquetário
humano 4) e negativo (esferas de látex). Entretanto, os oligômeros e monômeros da
quitina, GlcNAc e da quitosana (D-glicosamina, GlcN) não tiveram atividade reduzida
(a concentração de 1,0 mg/ ml de GlcNAc teve um pequeno efeito atrativo pelas
células 3T6). A atividade migratória das células 3T6 foi reduzida significativamente
para a quitosana e seus monômeros (GlcN) nas concentrações de 0,1 e 1,0 mg/ml,
comparadas com os controles; seus oligômeros reduziram a atividade celular nas
concentrações mais altas.
Figura 16
: Atividade migratória de cel 3T6. Controle: meio de cultura, GlcNAc:
N
-acetil-d-glicosamina, GlcN: D-
glicosamina, oligômero de quitina: mistura de
GlcNAc1
-GlcNAc6 [55]
A Figura 17 mostra os efeitos da quitina e da quitosana na atividade
migratória de HUVECs. A atividade migratória de HUVECs foi significativamente
aumentada para quitina na concentração de 1,0 mg/ml e para GlcNAc nas
concentrações de 0,01 e 1,0 mg /ml e não foi aumentada para os oligômeros de
quitina. A atividade migratória das HUVECs foi significativa-mente aumentada para a
quitosana nas concentrações de 0,1 e 1,0 mg/ml, com-paradas com os controles. Os
oligômeros de quitosana, entretanto, mostraram atividade aumentada em proporção
inversa a sua concentração. Na concentração de 0,01 mg/ml, o oligômero de
quitosana reduziu significativamente sua atividade migratória celular. O TGF-α, fator
α de crescimento recombinante em células ósseas, é quimioatraente das células
29
endoteliais vasculares, por isso foi utilizado como controle positivo [55].
Figura 17 :
Atividade migratória de HUVEC. Controle: meio de cultura,
GlcNAc, GlcN, oligômero de quitina: mistura de GlcNAc1
-
GlcNAc6,
oligômero de quitosana: mistura de GlcN1
-GlcN6, TGF-
α
-
Fator de
crescimento recombinante humano
α
. [55]
2.7 Quitina
A quitina é um polissacarídeo linear, constituído de unidade repetitivas de
(1,4)-β-2-desoxi-2-acetamido-D-glicose, semelhante à celulose tanto do ponto de
vista estrutural, quanto à abundância na natureza. Insolúvel na maioria dos
solventes comuns, a quitina pode ser encontrada nos tecidos estruturais de animais
invertebrados, fungos e bactérias [56]. No estado nativo, esse biopolímero ocorre
como fibrilas altamente cristalinas, associado a proteínas, pigmentos, lipídeos e a
substâncias inorgânicas [57]. Três formas morfológicas, α, β e γ têm sido propostas
para as quitinas naturais, de acordo com resultados de difração de raios-X. A α-
quitina consiste na forma polimorfa mais abundante e de maior aplicação. Cascas de
crustáceos descartadas são fontes importantes da quitina [58] e, portanto, da
quitosana, derivado desacetilado da quitina, com inúmeras aplicações, devido a
propriedades como hidrofilicidade, biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-
antigenicidade, não-toxicidade e biofuncionalidade. A quitina, bem como a quitosana
30
possuem superfície hidrofílica, que promove adesão, proliferação e diferenciação
celular [59].
A fórmula estrutural da quitina é muito similar à celulose (Figura 18),
diferindo apenas quanto ao substituinte ligado ao C
2
, que se constitui no grupamento
acetamido (-NHCOCH
3
) na quitina, e na hidroxila (OH) para a celulose.
Figura 18: Estruturas de quitina, quitosana e celulose
Quitina
Quitosana
Celulose
31
3 .Objetivos
Obter a quitina
Caracterizar a amostra de quitina
Obter amostras de hidroxiapatita (HA)
Caracterizar as amostras de HA
Desenvolver biomateriais compósitos
Caracterizar os biomateriais compósitos
32
4. Materiais e métodos
4.1 Produtos químicos
Ácido ortofosfórico P.A. (H
3
PO
4
), Vetec Química Fina Ltda., Rio de Janeiro,
RJ; Bicarbonato de sódio P.A.(NaHCO
3
), Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro,
RJ; Cloreto de cálcio P.A.diidratado (CaCl
2
.2H
2
O), Vetec Química Fina Ltda, Rio de
Janeiro, RJ; Cloreto de lítio P.A.(LiCl), Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, RJ;
Cloreto de magnésio P.A.hexaidratado (MgCl
2
.6H
2
O), Vetec Química Fina Ltda, Rio
de Janeiro, RJ; Cloreto de sódio P.A. (NaCl), Vetec Química Fina Ltda, Rio de
Janeiro, RJ; Cloreto de Potássio P.A. (KCl), Vetec Química Fina Ltda, Rio de
Janeiro, RJ; EDTA (Etilenodiamino tetra acetato de Sódio) P.A.
(C
10
H
14
N
2
Na
2
O
8
.2H
2
O), Quimibrás Indústrias Químicas Ltda, Rio de Janeiro, RJ;
Fosfato de Amônio Dibásico P.A.(H
9
N
2
O
4
P), Vetec Química Fina Ltda, Rio de
Janeiro, RJ; Hidróxido de amônio P.A. (NH
4
OH), Vetec Química Fina Ltda, Rio de
Janeiro, RJ; Fosfato de sódio bibásico P.A.(Na
2
HPO
4
.2H
2
O), Vetec Química Fina
Ltda, Rio de Janeiro, RJ; Hidróxido de cálcio P.A.[Ca(OH)
2
], Proanalysi Indústria
Química Ltda, São Paulo, SP; Hidroxipropil metil celulose grau técnico, The Dow
Chemical Company, Ontário, Canadá; Nitrato de Cálcio tetrahidratado P.A.
(Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O), Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, RJ; N,N- Dimetil
acetamida (C
4
H
9
NO) ,Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, RJ; Sulfato de sódio
anidro P.A.(Na
2
SO
4
) ,Vetec Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, RJ; TRIS
(NH
2
C(CH
2
OH)
3
), USB, Cleveland, Ohio,USA.
4.2 Equipamentos
Além dos instrumentos normalmente utilizados em laboratório de pesquisa,
foram empregados os seguintes equipamentos especiais:
Calorímetro diferencial de varredura Perkin Elmer
a
, modelo DSC-7 (Norwalk,
USA). Difratômetro Rigaku, modelo Miniflex, operado com comprimento de onda de
CuKα de 1,542Å. Microscopia eletrônica de varredura (SEM), utilizando um
33
microscópio da Zeiss, modelo DSM 940
A
b
. Moinho de disco Pertem Instruments,
modelo 3600 (Huddigrge, Suíça)
c
; Moinho de martelo Pertem Instruments, modelo
3100 (Huddigrge, Suíça)
c
.
a. NUCAT/ PEQ/COPPE/UFRJ
b. PEMM/COPPE/UFRJ
c. EMBRAPA/ Agroindústria de alimentos
34
5. Metodologia
5.1 Obtenção da quitina em pó [60-64]
Aproximadamente 5 kg de cascas de camarão cinza (Penaeus schmitti), as
mais comumente encontradas em entrepostos pesqueiros, foram lavadas e
descarnadas uma a uma.
Após três banhos de imersão em água destilada e deionizada, que duraram
aproximadamente 3 horas cada um e que serviram para completa eliminação dos
sais por diferença de potencial químico, as cascas foram colocadas na estufa, sob
uma temperatura de 50°C durante uma noite.
Após a completa secagem as cascas foram moídas no moinho de martelo e
no moinho de facas (EMBRAPA) até atingirem a granulometria de 0,8 mm. O pó
resultante da moagem foi então submetido a um tratamento com ácido clorídrico
0,25 N, em volume adequado à massa de material sólido moído, durante 30 minutos.
Foram então realizadas exaustivas lavagens com água destilada e deionizada até a
neutralização do pó desmineralizado pelo ácido.
O último passo realizado foi o tratamento do pó com uma solução de NaOH
1N, em volume adequado à massa de material sólido moído, sob temperatura
ambiente e agitação magnética por 24 horas. Este procedimento foi realizado para
desproteinização. Foram então realizadas exaustivas lavagens com água destilada e
deionizada até a neutralização e obtenção do pó de quitina.
5.2 Obtenção da solução 7% LiCl /DMA [65]
Para obter-se uma solução de cloreto de lítio (LiCl) a 7% em N,N- dimetil-
acetamida (DMAc), 65,8g de LiCl foram dissolvidos em 800 mL de DMAc e o volume
completado para 1000 mL em balão volumétrico.
35
5.3 Obtenção do gel de quitina, método adaptado da literatura [66]
Quitina em pó (1g) foi dispersa em 100 mL de solução de LiCl a 7% em
DMAc por meio de agitação magnética durante 24 horas.
5.4 Obtenção de membranas densas de quitina, método adaptado da
literatura [66]
O gel de quitina obtido no item 5.3 foi vazado para 5 placas de Petri
pequenas que foram acondicionadas em recipientes de plástico com tampa, onde
também foram colocados 4 copinhos de poliestireno com água destilada e
deionizada em posições eqüidistantes. Os recipientes foram fechados com 4
copinhos descartáveis de poliestireno em posições equidistantes durante 3 dias.
5.5 Obtenção de membranas porosas de quitina, método adaptado da
literatura [67]
Para a obtenção de membranas porosas de quitina, uma solução de LiCl a
5% foi preparada em 100 mL de DMAc. À solução, sob agitação magnética
constante, foram adicionados 2 g de carbonato de cálcio (CaCO
3
) e, logo em
seguida, 0,5 g de pó de quitina para a preparação da mistura 2% CaCO
3
/ 0,5% CH
/5% LiCl em DMA. Após 24 horas sob agitação magnética o gel de quitina/ CaCO
3
foi
obtido. O gel resultante foi então vazado para placas de Petri e acondicionado como
descrito anteriormente no item 5.4. As membranas dopadas com CaCO
3
foram
submersas em solução de HCl 1N, sob agitação magnética constante, por 1 hora e
posteriormente lavadas em água deionizada. A reação processada foi a seguinte:
CaCO
3
+ HCl → CaO + CO
2
↑
36
5.6 Obtenção do fluido fisiológico simulado (SBF) [68- 70]
Cada reagente, em quantidades apropriadas, foi dissolvido em água
deionizada. As quantidades de soluto foram as seguintes: 6,547g de NaCl, 2,268g
de NaHCO
3
, 0,373g de KCl, 0,178g de Na
2
HPO
4
.2H
2
O, 0,305g de MgCl
2
.6H
2
O,
0,368g de CaCl
2
.2H
2
O, 0,071g de Na
2
SO
4
e 6,057g de (CH
2
OH)
3
CNH
2
. Depois de
dissolvidos, os reagentes foram adicionados, na ordem em que se dispõe no texto,
um por um em um becher maior e o volume completado, com o auxílio de uma
proveta para 700 mL.
Preparou-se uma solução de 50 mL de HCl 1M, com auxílio de um balão
volumétrico; uma alíquota de 15 mL desta solução foi adicionada antes da adição do
sexto reagente solubilizado em água (CaCl
2
.2H
2
O). Outros 25 mL de solução de HCl
1M foram adicionados durante a mistura subseqüente. Após a adição do oitavo
reagente (CH
2
OH)
3
CNH
2
a temperatura foi aumentada da temperatura ambiente
para 37°C. O pH final da solução foi ajustado com o restante da solução de HCl 1M.
Durante o processo de ajuste de pH (pH≅10) e temperatura, a solução foi também
continuamente diluída com adições consecutivas de água deionizada, até obter-se o
volume final de 1 litro. Foi observado na literatura que as soluções de SBF
preparadas podem ser armazenadas a 8°C por um mês sem haver degradação.
5.7 Determinação da bioatividade das membranas de quitina [71]
As membranas densa e porosa de quitina foram submersas em becheres
contendo SBF. Sabendo-se, pela literatura, que o SBF é uma solução metaestável,
este sistema foi colocado em um dessecador de vidro (devidamente limpo e seco),
que foi submetido a variações de pressão, no primeiro dia de imersão, com o auxílio
de uma bomba de vácuo. Foram realizadas quatro sucções pela bomba de vácuo,
que duraram cerca de uma hora cada e que logo em seguida a cada uma a pressão
atmosférica foi reestabelecida pelo desligamento da bomba e abertura do sistema.
Após as sucções, o sistema foi mantido sob pressão atmosférica por um
período de sete dias. As membranas foram secas até peso constante em estufa a
37
50°C. As membranas assim obtidas foram submetidas à análise por espectroscopia
de absorção no infravermelho, análise termogravimétrica e por microscopia
eletrônica de varredura.
5.8 Obtenção da hidroxiapatita (HA) densa não calcinada [72]
A HA densa não calcinada foi preparada a partir de 52 mL de ácido fosfórico
85% adicionado a 100 mL de água deionizada para formar a pré-mistura ácida.
Separadamente, 24 g de hidróxido de cálcio foram adicionados, com agitação, a 300
mL de água deionizada. O ácido fosfórico foi então adicionado lentamente à solução
de hidróxido de cálcio. Esta pré-mistura apresentou um pH de 2,1.
O remanescente estequiométrico de hidróxido de cálcio, 78 g, foi adicionado
com agitação a 600 mL de água deionizada. A pré-mistura ácida foi adicionada
lentamente à solução com hidróxido de cálcio e o pH atingido foi de
aproximadamente 11. Esta mistura foi agitada por 24 horas e seca em estufa a 100
ºC para obter-se aproximadamente 120 g de pó de hidroxiapatita sem calcinação.
5.9. Obtenção da hidroxiapatita densa calcinada [73]
Seguiu-se a técnica de obtenção de hidroxiapatita densa não calcinada (item
5.8). A pasta obtida foi calcinada a 900 8 C por 2 horas.
5.10 Obtenção da hidroxiapatita porosa, técnica adaptada da literatura
[74]
Seguiu-se a técnica de obtenção de hidroxiapatita densa não calcinada (item
5.8) até a obtenção da mistura contendo hidroxiapatita; A 1l de mistura contendo HA
foram adicionados 10 g de hidroxipropil metil celulose à mistura contendo HA, para
obter-se uma concentração de 10g/l. A nova mistura foi então colocada no ultra-som
38
por 30 minutos para desgaseificação e homogeneização do material produzido. A
mistura contendo HA foi então calcinada a 900 °C por 3 horas.
5.11 Obtenção dos biocompósitos quitina/ hidroxiapatita [66]
Obteve-se 200 mL de gel de quitina, seguindo-se a técnica de obtenção do
gel descrita no item 5.3. Pesou-se separadamente 0,2; 0,4 e 0,6 gramas de cada
hidroxiapatita, preparadas nos itens 5.8, 5.9 e 5.10. Mediu-se, com auxílio de uma
proveta volumétrica 10 mL do gel de quitina para cada concentração. O objetivo de
tais medições foi o de obter-se corpos de prova com as seguintes concentrações:
2%, 4%, e 6% de cada HA em géis de 1% CH (7% LiCl/ DMAc).
A hidroxiapatita foi macerada dentro do almofariz, onde se verteu aos
poucos o gel de quitina. Após cuidadosa homogeneização, o gel de quitina/
hidroxiapatita foi vazado para moldes retangulares de vidro, que foram colocados em
atmosfera úmida em grandes recipientes de plástico com tampa, onde também
foram colocados 4 copinhos descartáveis de poliestireno contendo água destilada e
deionizada em posições eqüidistantes. Os recipientes foram fechados os moldes
foram mantidos a 37°C e 88% de umidade, medidas com o auxílio de um termo-
higrômetro, colocado junto dos moldes e dentro do recipiente, por 3 dias
consecutivos.
Os corpos de prova foram macerados no almofariz e submetidos a análise
termogravimétrica (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (SEM).
39
5.12 Caracterizações
5.12.1 Ressonância magnética de alta resolução (NMR
13
C)
O espectro do copolímero extraído foi obtido através do espectrômetro de RMN
da marca Varian, modelo VXR-300, em solução de ácido fosfórico na temperatura de
40°C. Esta técnica foi utilizada para determinar o grau de desacetilação do pó de
quitina extraída.
5.12.2 Espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR)
Os compostos inorgânicos também absorvem radiações na região do
infravermelho (IV) do espectro. A radiação infravermelha não tem energia suficiente
para excitar os elétrons e provocar transições eletrônicas, mas ela faz com que os
átomos ou grupos de átomos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em
torno das ligações covalentes que os unem. Estas vibrações são quantizadas e,
quando ocorrem, os compostos absorvem energia IV em certas regiões do espectro.
Nas vibrações, as ligações covalentes comportam-se como se fossem pequenas
molas unindo os átomos. Quando os átomos vibram, só podem oscilar com certas
freqüências, e as ligações sofrem várias deformações. Quando a ligação absorve
energia, ela sofre alterações e, ao retornar ao estado original, libera essa energia,
que então é detectada pelo espectõmetro [75].
A espectroscopia do infravermelho foi utilizada neste trabalho para
caracterização qualitativa das estruturas da quitina extraída, das HA produzidas e da
saída do solvente, por diferença de potencial químico das membranas de quitina.
5.12.3 Difração de raios X (DRX)
Os métodos experimentais mais importante usados em estudos estruturais
são as difrações de raios-X e de nêutrons pelos materiais, utilizando comprimentos
de onda de 1Å a 10 Å. Os raios-X são produzidos quando elétrons são acelerados a
40
partir do catodo e atingem a anodo metálico, mantido o alto potencial elétrico. O
processo mais importante na geração dos raios-X consiste na desaceleração dos
elétrons ao penetrar na matéria [76].
Os difratogramas de raios–X para o pó seco de quitina e para as HA
produzidas foram obtidos no Difratômetro Rigaku, modelo Miniflex, operado com
radiação de CuKα de 1,542 nm. gerada por uma voltagem de 40 kV e corrente de 40
mA na variação angular de 5- 35° (2θ), ao passo de 1° por segundo, a temperatura
ambiente.
Utilizou-se o programa Winploter
®
para a seleção dos picos cristalográficos
mais evidentes da amostra, juntamente com seus 2θ, intensidade e cálculo das
respectivas larguras a meia altura.
Para o cálculo do percentual de cristalinidade do pó de quitina seco utilizou-
se a seguinte relação:
X
c
% = Σ cristalino / Σ crist + Σ amorfo x 100
Onde X
c
é o percentual de cristalinidade, Σ crist é o somatório das larguras a
meia altura dos picos considerados cristalinos, aqueles de menor largura a meia
altura e Σ amorfo é o somatório das larguras a meia altura dos picos considerados
amorfos, aqueles de maiores larguras a meia altura. O percentual de cristalinidade é
uma característica polimérica, pois os polímeros são materiais em que podemos
encontrar uma fase cristalina separada da fase amorfa [77].
Para o cálculo das distâncias interplanares dos picos cristalinos utilizou-se a
Equação de Bragg :
d= λ / 2 sen θ
Onde d é a distância interplanar, λ é uma constante de valor igual a 1,5418 e
o θ é ângulo formado entre os raios refletidos e os planos cristalinos consecutivos.
Para o cálculo dos tamanhos cristalinos utilizou-se a seguinte equação [78]:
L= λ x 0,9/ Fw*x cosθ
Onde d é a distância interplanar , λ é uma constante de valor igual a 1,5418
e o θ é ângulo formado entre os raios refletidos e os planos cristalinos. Já Fw* é
41
uma transformação que a distância a meia altura dada pelo Winploter
®
precisa sofrer
para que a distância interplanar seja calculada em ângstrons.
Fw*=Fw x π/ 180
Onde Fw é a largura a meia altura dos picos cristalográficos e π é a
constante de valor igual a 3,1416.
5.12.4 Microscopia eletrônica de varredura (SEM)
As fotomicrografias dos pós de de hidroxiapatitas foram obtidas no
microscópio de varredura eletrônica GEOL JSN 6460 LV numa aceleração de
voltagem de 15 kv.
Fotomicrografias das membranas densas e porosas de quitina e dos
compósitos de quitina nas várias concentrações de HA também foram obtidas.
5.12.5 Espectroscopia de energia dispersiva (EDS)
Apesar da técnica de EDS ser uma análise de espectroscopia, ela é
usualmente apresentada juntamente com a microscopia eletrônica de varredura pela
sua disponibilidade nestes equipamentos. Os microscópios eletrônicos de varredura
podem possuir equipamento de microanálise acoplado, o que permite a obtenção de
informações em áreas da ordem de micrômetros. As informações qualitativas e
quantitativas sobre os elementos presentes são obtidas pela captação dos raios-X
característicos resultantes da interação do feixe primário com a amostra [79].
Foram feitos espectros de EDS para as HA produzidas.
42
5.12.6 Análise Termogravimétrica (TGA)
A análise termogravimétrica é definida como um processo contínuo que
envolve a medida da variação de massa de uma amostra em função da temperatura
(varredura de temperatura), ou do tempo a uma temperatura constante (modo
isotérmico).
A amostra pode ser aquecida ou resfriada, a uma velocidade selecionada,
ou pode ser mantida a uma temperatura fixa. O modo mais comum de operação na
análise de sistemas poliméricos é o programa de aquecimento, a velocidade varia de
5 a 10°C/ min [80].
O comportamento térmico da quitina, do compósito obtido pela deposição de
CHA em membrana densa e dos compósitos de quitina nas várias concentrações de
HA foram avaliados até 900°C por análise termogravimétrica numa taxa de
aquecimento de 20°C por minuto.
43
6. Resultados e discussão
Para facilitar a interpretação e a discussão dos resultados obtidos, eles
serão apresentados, algumas vezes, em ordem diferente daquela utilizada nos
materiais e métodos experimentais.
6.1. Caracterização da quitina
O pó seco de quitina foi caracterizado por difração de raios-X e pelas
espectroscopias de RMN
13
C e de absorção no infravermelho.
6.1.2. Ressonância magnética de alta resolução (NMR
13
C) [81-83]
Para determinação de tais percentuais de desacetilação, 100 mg de quitina
foram dissolvidos em ácido fosfórico e o espectro foi obtido com pulso de 90.0° e
tempo de espera de 1,747 s.
As unidades repetitivas da quitina estão representadas abaixo (Figura 19). O
espectro do copolímero apresenta um pico a 177,510 ppm que corresponde ao (C=O)
da carbonila (a), 100,302 ppm que corresponde ao C
1
do anel glicosídico (b), 78,970
ppm que corresponde ao C
4
do anel glicosídico (c); 77,445 ppm que corresponde ao
C
5
do anel glicosídico (d); 72,929 ppm que corresponde ao C
3
do anel glicosídico (e);
62,813 ppm, que corresponde ao C
6
do anel glicosídico (f); 58,738 ppm que
corresponde ao C
2
do anel glicosídico (g) e 24,907 ppm, que corresponde ao CH
3
do
grupo acetamida (h). A Figura 19 mostra os monômeros constituintes da quitina
Figura 19: Representação esquemática das unidades repetitivas
Monômero desacetilado Monômero acetilado
44
A figura 20 traz o espectro de NMR para a amostra de quitina.
Figura 20: Espectro de NMR para a amostra de quitina
Para estimar-se o grau de acetilação da quitina, a fórmula citada na literatura
[80] foi usada.
3
1 2 3 4 5 6
CH
C C C C C C
100 x I
DA(%) =
I +I +I +I +I +I 6
onde I
CH3
representa a intensidade do pico atribuído aos grupos CH
3
e I
C1
,
I
C2
, I
C3
, I
C4
, I
C5
e I
C6
representam as intensidades dos picos correspondentes aos
átomos de carbono C
1
, C
2
, C
3
, C
4
, C
5
e C
6
, respectivamente.
A Tabela 7 traz as principais atribuições dos picos com suas respectivas
intensidades.
a
b
c d e
f
g
h
45
Tabela 7: Atribuições dos picos de NMR
13
C da quitina
a b c d e f g h
Atribuições
C=O C
1
C
4
C
5
C
3
C
6
C
2
CH
3
Intensidades
(ppm)
177,5 100,3 78,9 77,4 72,9 62,8 58,7 24,9
O grau de acetilação encontrado para amostra de quitina foi de 66,88%.
6.1.3. Espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR)
A Figura 21 traz o espectro de infravermelho do pó seco de quitina.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
10
20
30
40
50
60
70
Transmitância
Comprimento de ondas (cm
-1
)
Figura 21:
Espectro de absorção na região do infravermelho de pó de
quitina (Transmitância)
46
Tabela 8: Atribuições das bandas do espectro de FTIR da quitina
Banda (cm
-1
)
Atribuição
3700-3000 Bandas múltiplas N-H e O-H
3480* L.H. intramol. OH C
6
e C=O
acetamida
3260 e 3100* L.H. intermol. N-H da acetamida
3000-2800 Deformação axial de C-H
2990,2950,2880 Deformação axial de C-H
1825,1758 Deformações axiais acopladas,
assimétrica e simétrica de C=O
1465 Deformação simétrica no plano CH
2
1040 Deformação axial de C-CO-O-CO-
C
3350 Deformação axial assimétrica de N-
H acoplado , amida primária em
ligação de hidrogênio
3170 Deformação axial simétrica de N-
H
acoplado, amida primária em
ligação de hidrogênio
2960 Deformação axial de C-H alifático
1640 Deformação axial de C=O, banda
de amida I
1640 Deformação angular de N-H, banda
de amida II
1425 Deformação axial de C-N
700-600 Larga, deformação angular fora do
plano de N-H
1660* L.H entre C=O e NH
1625* L.H. entre C=O, NH e OH
* Bandas características da quitina
O espectro (Figura 21) obtido foi comparado com o reportado na literatura
[84]. Embora os espectros de quitina e quitosana apresentem semelhanças, que são
atribuídas a diferentes teores de grupos acetamida, principalmente nas regiões
correspondentes aos seguintes intervalos de número de onda: 3700 cm
-1
– 3000 cm
-
1;
3000 cm
-1
– 2800 cm
-1
e 1800 cm
-1
– 1500 cm
-1
. De fato, embora ocorra uma
banda muito larga e intensa na região definida pelo primeiro intervalo citado acima,
atribuída à deformação axial de grupos O- H e N- H, podem ser observados mais
detalhes no espectro de quitina do que naqueles de quitosana, como pode ser
observado na amostra [85].
47
Essas diferenças não devem ser atribuídas somente às diferentes estruturas
primárias de quitina e quitosanas com respeito ao teor de grupos acetamida, mas
também à ocorrência de empacotamento mais ordenado entre as macromoléculas
de quitina. Assim, o pequeno ombro em torno de 3480 cm
-1
no espectro de quitina,
que não é observado nos espectros de quitosana, pode ser atribuído às ligações de
hidrogênio intramoleculares envolvendo o grupo O- H ligado ao carbono da posição
6 do anel de glicopiranose e o grupo C= O das acetamidas, como pode ser
observado na amostra.
As bandas em torno de 3260 cm
-1
e 3100 cm
-1
no espectro de quitina, que
não são observadas no espectro de quitosana, são atribuídas aos grupos N- H da
acetamida em ligações intermoleculares de hidrogênio. Na região de deformação
axial de C- H, correspondente ao intervalo 3000 cm
-1
- 2800 cm
-1
, o espectro de
quitina apresenta bandas mais intensas e em maior número do que observado nos
espectros de quitosana, devido ao elevado teor de grupos acetamidas do primeiro
polímero. No intervalo 1800 cm
-1
– 1500 cm
-1
, no qual são observadas as bandas
denominadas de amidas I e amidas II, os espectros de quitina e quitosana são muito
diferentes. No espectro de quitina, podem ser observados dois sinais de
intensidades semelhantes, próximos de 1660 cm
-1
e de 1625 cm
-1
correspondentes à
banda de amida I. O desdobramento da banda de amida I, como observado no
espectro de quitina é associado com interações intermoleculares. A primeira banda é
atribuída às ligações de hidrogênio de grupos C= O e grupos N-H, enquanto que a
banda centrada em 1625 cm
-1
é atribuída às ligações de hidrogênio envolvendo
grupos C=O, N-H e O-H ligado ao carbono da posição 6 do anel de glicopiranose. A
banda de amida I é menos intensa nos espectros de quitosana [85].
48
6.1.4. Difração de raios X (XRD)
A Figura 22 apresenta o difratograma de raios-X do pó de quitina. Pode-se
observar o pico onde o 2υ = 9,408 , que é associado ao plano (020), onde
encontramos as regiões mais ordenadas envolvendo os grupos acetamida,
presentes em altas intensidades em amostras de quitina. Outro forte pico aparece a
2υ = 19,408.
5 10 15 20 25 30 35
0
100
200
300
400
500
Intensidade
2
θ
Figura 22:
Difratograma de raios X do pó seco de quitina
O percentual de cristalinidade calculado para o pó seco de quitina foi de
53,4%.
A Tabela 9 compara as distâncias interplanares e as posições dos picos
cristalográficos da amostra de filmes de quitina isolados a partir da casca de
camarões adultos da espécie Penaeus Schmitti com o padrão estabelecido pela
referência [81]. Pode-se observar que tanto a amostra quanto o padrão são
similares quanto às posições e intensidades das reflexões.
49
Para as amostras de quitina, os dados indicam que há uma preferência de
orientação dos cristalitos, já que as reflexões equatoriais (hk0) são mais intensas.
Considerando uma célula de unidade ortorrômbica com um grupo espacial
P2
1
2
1
2
1
, como reportado na literatura [81], os parâmetros de unidade celular são a=
0,476 ± 0,003 nm, B= 1,876 ± 0,007 nm e c= 1,023 ± 0,007 nm.
Observa-se também na Tabela 9 os cálculos feitos para o tamanho de cristal
e distâncias interplanares dos vários (hkl)s presentes na amostra de quitina. Pode-se
perceber um aumento nas distâncias interplanares de todos os (hkl)s, em relação ao
trabalho de Andrade e colaboradores [81]. Este fato é explicado pelas diferentes
fontes de extração da quitina
Tabela 9: Parâmetros cristalográficos da quitina
θ
Largura a
meia altura
Fw
hkl
Intensidade
Tamanho
de cristal
(Å)
Distância
interplanar
(Å)
Distância
interplanar
(nm)[75]
4,5546 1,3 020 654,21 * 59,76 9,71 0,94
6,228 2,7 021 221,76 29,96 7,105 0,68
9,5147 1,4 110 1722,28 * 58,16 4,664 0,46
10,2798
1,7 110 600,85 * 47,65 4,320 0,46
11,4963
2,1 130 511,56 * 38,27 3,8680 0,4
12,9328
1,7 112 283,18 48,60 3,4446 0,34
14,0177
2,2 060 262,40 37,162 3,1829 0,31
• Altas intensidades cristalinas nos (hkl)s equatoriais
50
6.2. Caracterização das HA sintetizadas
As HA sintetizadas foram caracterizadas por FTIR, RDX e SEM
6.2.1. Espectroscopia de absorção no infravermelho (FTIR)
A Figura 23 mostra os espectros de infravermelho das três HA produzidas
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
400140024003400
Número de ondas (1/cm)
Absorbância (a.u.)
HÁ s/ calcinação
HÁ calcinada
HÁ porosa
Figura 23:
Espectros no infravermelho das HA sintetizadas
_____
HA s/ calcinação
_____
HA calcinada
_____
HA porosa
51
A Tabela 10 mostra as principais bandas e suas atribuições.
Banda/cm
-1
Atribuição
3580 Estiramento OH de hidroxila
3400 Estiramento OH de água
2900 Estiramento CH
2349 Estiramento CO
2
1645 Deformação H-O-H de H
2
O
1440-1400 Deformação P-CH
3
, PCH
2
1435 Estiramento simétrico de CO
3
-2
1384 Estiramento NO
3
-
1128 Estiramento PO
3
-
em HPO
4
-2
1100,1093,1047
Estiramento assimétrico de PO
4
-3
ou estiramento PO
3
em HPO
4
-2
965 Estiramento simétrico PO
4
-3
918 Estiramento P-OH em HPO
4
-2
884 Estiramento antissimétrico de CO
3
-2
650 Estiramento OH de hidroxila
616,581 Deformação O-P-O em PO
4
-3
ou
deformação O-P-O em HPO
4
-2
Tabela 10: Atribuições aos picos dos espectros de IV de HA
A apatita carbonatada sintética (CHAp) é classificada em dois tipos
diferentes A e B, dependendo do modo que o CO
3
-2
for substituído: CO
3
-2
por OH
-
(tipo A) ou CO
3
-2
por PO
4
-3
(tipo B). As apatitas biológicas são principalmente do tipo
B [86]. Nos pós sintetizados de hidroxiapatita, alguns grupos PO
4
-3
, bem como de
OH
-
, são substituídos por CO
3
-2
(tipo AB).
O tempo e a temperatura de calcinação são importantes parâmetros para
controlar a quantidade e o tipo de substituição dos íons carbonato. A presença do
CO
3
-2
na estrutura da hidroxiapatita influencia na decomposição, solubilidade e
reatividade biológica da mesma.[86].
Os espectros (Figura 23) obtidos foram comparados com a literatura [86].
Podemos observar nos três espectros a presença da banda de absorção a
52
3572 cm
-1
, bem como as bandas na região 572-632 cm
-1
, que são atribuídas
aos grupos OH da HA.
Pode-se observar também em todos os espectros a presença de duas
bandas de absorção bem pronunciadas em 1050 e 1090 cm
-1
, que são referentes
aos grupos fosfato da hidroxiapatita. Observa-se também deformações em 1460 cm
-
1
nos três espectros, referentes ao carbonato da HA.
Como dito anteriormente, o tempo e a temperatura de calcinação irão mudar
a quantidade de CO
3
-2
substituído. Para se comparar a quantidade destas
substituições para cada hidroxiapatita sintetizada, fez–se a relação entre as
absorbâncias referentes ao carbonato (1400 cm
-1
) e ao fosfato (1052 cm
-1
),
respectivamente e obteve-se os seguintes resultados: 0,44 para HA não calcinada;
1,56 para a HA calcinada e 1,38 para a HA porosa.
Em todas as hidroxiapatitas carbonatadas preparadas o aumento das
substituições do CO
3
-2
foi percebido com o aumento do tempo de calcinação entre
as hidroxiapatitas não calcinada, calcinada e porosa. Isto também pode ser visto nos
espectros pelo aumento das bandas referentes ao CO
3
-2
[86,87].
53
6.2.2. Difração de raios X (DRX).
As posições relativas às linhas de difração (2θ) e as respectivas intensidades
dos difratogramas das hidroxiapatitas sintetizadas foram comparadas com valores
reportados para a hidroxiapatita hexagonal no “Joint Committee on Powder
Diffraction Standards, card No 9-432 “ [86].
Para os cálculos de distanciamento interplanar e tamanho de cristal das hidro-
xiapatitas produzidas utilizou-se a mesma metodologia empregada no item 6.1.4
deste trabalho, com exceção do cálculo de percentual de cristalinidade, que é uma
característica exclusiva dos polímeros. A Figura 24 mostra os difratogramas de
raios-X das três HA produzidas, pode-se notar uma maior definição de picos entre as
HA não calcinada, calcinada e porosa, devido ao crescente aumento no tempo de
calcinação. As Tabelas 11, 12 e 13 trazem os resultados dos cálculos de distância
interplanar e tamanho de cristal das três HA produzidas.
0 20 40 60 80
Não calcinada
2
θ
Calcinada
Intensidade
Porosa
Figura 24
: Difratogramas de raios X das H
As
54
Tabela 11: HA não calcinada
θ
θθ
θ
Largura a
meia altura
Fw
Intensidade
Tamanho de
cristal
(Å)
Distância
interplanar
(Å)
12,930 0,4 26,18 198,231 3,4454
14,587 0,6 12,64 126,955 3,0609
16,026 0,9 153,29 93,128 2,7926
16,536 0,6 59,06. 127,304 2,7087
17,073 0,5 25,68 163,06 2,6261
19,930 0,9 37,89 91,111 2,2617
23,408 0,7 33,45 126,147 1,9406
24,760 0,4 20,18 238,833 1,8407
26,092 0,3 8,58 245,162 1,7528
26,586 0,4 21,10 230,310 1,7227
Tabela 12: HA calcinada
θ
θθ
θ
Largura a
meia altura
Fw
Intensidade
Tamanho de
cristal
(Å)
Distância
interplanar
(Å)
12,95415 0,3 45,87 309,25 3,439
14,5273 0,6 35,69 128,01 3,073
15,9287 0,3 151,08 248,81 2,809
16,1329 0,3 62,17 314,083 2,774
16,5105 0,3 80,80 292,438 2,7202
17,0755 0,3 40,65 249,572 2,6252
19,9397 0,4 45,28 219,908 2,2603
23,3976 0,3 60,42 252,294 1,9413
24,1059 0,4 29,23 218,523 1,8876
24,7715 0,3 65,83 301,656 1,8398
25,2926 0,3 36,21 266,850 1,8043
25,7016 0,4 27,71 244,730 1,7775
26,0936 0,2 22,58 354,890 1,7528
26,6222 0,2 30,51 356,806 1,7204
55
Tabela 13: HA porosa
θ
θθ
θ
Intensidade Largura a
meia altura
Fw
Tamanho de
cristal
(Å)
Distância
interplanar
(Å)
12,9375 27,61 0,3 268,658 3,4438
14,5377 18,55 0,6 136,523 3,0713
15,9263 107,55 0,3 236,59 2,8094
16,1360 57,62 0,3 277,801 2,7740
16,4983 74,57 0,4 201,101 2,7149
17,0636 23,32 0,3 237,932 2,6275
18,716 6,60 0,2 419,22 2,4027
19,934 32,73 0,4 225,03 2,2610
23,392 44,50 0,3 243,87 1,9418
24,1462 31,68 0,8 101,88 1,8846
24,7674 52,71 0,4 224,752 1,8403
25,2778 24,98 0,4 239,244 1,8054
25,6795 27,20 0,5 171,311 1,7791
26,0960 21,23 0,4 245,292 1,7526
Comparando-se os valores dos distanciamentos interplanares nos vários hkls
das hidroxiapatitas produzidas com os distanciamentos da HA padrão foi observado
uma não alteração de valores, ou seja, não houve crescimento preferencial em
nenhuma das direções dos cristais das hidroxiapatitas produzidas.
Para facilitar a comparação entre o tamanho dos cristais e o distanciamento
interplanar das hidroxiapatitas produzidas foram feitas as Tabela 14 e 15, com as
Figuras 25 e 26, que mostram gráficos comparativos entre as distâncias
interplanares (Figura 25) e o tamanho de cristal(Figura 26) das três HA.
56
6.2.3 Tabelas e gráficos comparativos entre as HAs
Tabela 14: Tamanho de cristal (Å)
hkl HA não calcinada
HA calcinada HA porosa
002 198,231 309,25 268,658
210 126,955 128,01 136,523
112 93,128 314,083 277,801
300 127,304 292,438 201,101
202 163,06 249,572 237,932
310 91,111 219,908 225,03
222 126,147 252,294 243,87
213 238,833 301,656 224,752
402 245,162 354,890 245,292
Tamanho de Cristal
2
300
310
402
2
112
300
213
402
202
112
222
210
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 100 200 300 400 500
hkl
Tamanho (Å)
HA não calcinada
HA calcinada
HA porosa
Figura 25: Comparação entre o tamanho de cristal das HAs
002
002
002
112
300
57
Tabela 15: Distâncias interplanares (Å)
hkl HA não
calcinada
HA calcinada
HA porosa Distância
interplanar
(nm)[109]
002 3,4454 3,439 3,4438 0,34
210 3,0609 3,073 3,0713 0,30
112 2,7926 2,774 2,7740 0,27
300 2,7087 2,7202 2,7149 0,27
202 2,6261 2,6252 2,6275 0,26
310 2,2617 2,2603 2,2610 0,22
222 1,9406 1,9413 1,9418 0,19
213 1,8407 1,8398 1,8403 0,18
402 1,7528 1,7528 1,7526 0,17
DISTANCIAS INTERPLANARES
2
210
112
300
202
310
222
402
213
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 100 200 300 400 500
hkl
Distâncias (Å)
HA não calcinada
HA calcinada
HA porosa
Figura 26: Comparação entre as distãncias interplanares das HAs
002
58
A medida da extensão de peridiodicidade, numa região ordenada de cerâmica,
numa dada direção cristalográfica (hkl) é denominada tamanho de cristalito na
referida direção.
A determinação do tamanho de cristalitos é uma avaliação aproximada do
tamanho das regiões ordenadas nos materiais devido à presença de distorções da
rede, cujo efeito é produzir um fator de alargamento de linha de difração [87, 88].
Conforme se pode observar na Figura 25 houve um aumento no tamanho dos
cristais em todos os planos (hkl) observados da hidroxiapatita não calcinada para
hidroxiapatita calcinada, evidenciando o aumento do cristal com o aumento do
tempo de calcinação (2 horas a 900°C, para a HA calcinada).
Já para a hidroxiapatita porosa, o aumento do tamanho do cristal foi menos
acentuadodo que para a hidroxiapatita calcinada, devido ao uso do ultra-som por 30
minutos para desgaseificação e homogeneização do material produzido. Não foi
observado no difratograma da hidroxiapatita porosa o surgimento de picos relativos a
outros fosfatos de cálcio, resultantes da degradação da hidroxiapatita, logo o motivo
para o menor crescimento do tamanho dos cristais foi o uso do ultra-som, o que
levou a um aumento dos núcleos cristalinos iniciais, antes da calcinação (3 horas a
900 °C) e um menor crescimento depois da calcinação.
Não se observou qualquer alteração significativa em qualquer direção
cristalográfica (hkls) das distãncias interplanares entre as hidroxiapatitas produzidas.
Conclui-se então que as alterações observadas no tamanho de cristal das
hidroxiapatitas foram proporcionais, não privilegiando nenhuma direção (hkl) dos
cristais formados (Figura 26).
59
6.2.3. Microscopia eletrônica de varredura.
Figura 27:
Microscopia eletrônica de varredura das hidroxiapatitas a: não calcinada; b: calcinada; c: porosa
a b c
a b c
a b c
a
60
A Figura 27 traz micrografias em vários aumentos das HA não calcinada,
calcinada e porosa.
Pode-se observar que os agregados de cristais referentes às hidroxiapatitas
não calcinadas são maiores, menos esféricos e porosos que os agregados da
hidroxiapatita calcinada. Misturas e gases foram liberados durante a calcinação, o
que propiciou o surgimento de uma estrutura mais porosa nos pós calcinados de
hidroxiapatita. À medida que se aumenta o tempo de calcinação, os agregados
esféricos vão ficando mais definidos e estáveis, como pode ser visto nos vários
aumentos das três hidroxiapatitas produzidas (a- não calcinada; b- calcinada e c-
porosa) [89].
O tratamento realizado com ultra-som criou mais núcleos cristalinos na mistura
pré calcinada da hidroxiapatita porosa, o que ocasionou a formação de agregados
de cristais menores e em maior número do que da hidroxiapatita calcinada.
A grande porosidade obtida na HA porosa foi devida à liberação durante a
calcinação da hidroxipropil metil celulose, que foi propositalmente misturada à pasta
de HA antes da calcinação.
6.2.4. Espectroscopia de energia dispersiva (EDS)
As Figuras 28, 29 e 30 mostram os espectros de energia dispersiva das
hidroxiapatitas sintetizadas.
61
Figura 28: EDS de HA não calcinada
Figura 29: EDS de HA calcinada
62
Figura 30: EDS de HA porosa
Sabe-se que a relação Ca/ P da hidroxiapatita padrão é de ± 1,67 [91]. Foram
feitas estimativas pelo EDS desta razão para as várias hidroxiapatitas obtidas. As
relações Ca/P estimadas para cada HA foram 2,57 para a não calcinada, 2,48 para a
calcinada e 2,92 para a porosa.
Durante a calcinação dos pós de hidroxiapatita foi observada uma mudança de
cor dos pós de hidroxiapatita de branco para um azul claro. De acordo com Bernt e
Gross [90], a mudança de cor é devida à presença de íons magnésio ou outros
elementos de transição localizados na estrutura interna do cristal. Pode-se notar a
presença de traços deste íons nas três hidroxiapatitas produzidas.
Uma grande quantidade de traços de carbono foi detectada na superfície dos
pós da hidroxiapatita porosa devido ao carregamento anterior à calcinação com
hidroxipropil metil celulose.
Os outros traços de impureza detectados na superfície dos pós de
hidroxiapatitas (Al
+3
, Mg
+2
e Si) deveram-se aos reagentes usados na preparação e
caracterização dos pós.
63
6.3. Caracterização das membranas de quitina
A Figura 31 mostra os espectros de absorção na região do infravermelho das
lavagens feitas nas membranas densas de quitina para visualização da retirada do
solvente
4000 3000 2000 1000
10
20
30
40
50
60
70
lavagem 1
lavagem 2
lavagem 3
lavagem 4
lavagem 5
Transmitância (u.a.)
Figura 31:
Espectros de absorção na região do infravermelho das lavagens feitas nas
membranas densas de quitina
Com a intenção de retirar o solvente das membranas por equilíbrio
químico, através de lavagens com água deionizada a cada 2 horas. Foram então
realizadas 5 lavagens das membranas densas de quitina para observação da
retirada do solvente, tóxico se utilizado como biomaterial. Observou-se a ausência
dos picos característicos do solvente N,N-dimetilacetamida já na primeira lavagem,
ou seja, conseguiu-se retirar todo o solvente após a imersão por 2 horas das
membranas em água deionizada.
Pode-se notar também um alargamento das bandas entre as regiões de 610,
898 e 947 cm
-1
, o que denota um aumento no número de ligações de hidrogênio
64
inter e intramoleculares (610 cm
-1
) e de ligações de hidrogênio entre as cadeias de
quitina e a água de lavagem (898 e 947 cm
-1
) [86].
6.3.1. Microscopia eletrônica de varredura de membranas densas e
porosas de quitina
Figura 32:
Microscopia eletrônica de v
arredura (SEM) das membranas
densas (a, b, c) e porosas (e, f, g) de quitina nos aumentos de 70x, 200x e
1000x
a
c
b
c
g
e
f
d
65
A Figura 32 mostra as micrografias das membranas densas e porosas de
quitina.
Sabe-se que a quitina extraída da casca de camarão é visualizada como
microfibrilas de várias espessuras e formas. Algumas microfibrilas são empacotadas
em formas helicoidais, outras encontram-se alinhadas e ambas ocorrem na
exocutícula. Nota-se também a presença de falhas nessas microfibrilas da
exocutícula, decorrentes do processo periódico de troca de exoesqueleto dos
crustáceos denominado ecdise. [84].
As micrografias das membranas densas de quitina mostram uma superfície
irregular resultante do encolhimento provocado pelas ligações de hidrogênio entre os
grupos acetamina das cadeias de quitina durante a coagulação do gel sob atmosfera
úmida (Figura 32a e 32b).
A uniformidade distribuída em pequenas áreas (Figura 32c) surge da
interação entre as cadeias de quitina formando “ilhas” micelares sub-microscópicas e
que interagem entre si (Figura 32d).
Devido à evolução de gases de dióxido de carbono, após tratamento com
HCl 1N das matrizes de quitina carregadas com CaCO
3
, podemos observar o
surgimento de fissuras proporcionais a este carregamento ou ao tensionamento das
membranas durante a etapa da coagulação [67].
Uma superfície irregular foi observada nas membranas porosas de quitina,
devido ao carregamento anterior dos géis de quitina com CaCO
3
(Figuras 32d, 32e e
32f) [67].
66
6.3.2. Determinação da bioatividade das membranas de quitina
A Figura 33 mostra espectros de absorção no infravermelho de quitina (a) e
do pó obtido a partir da membrana densa de quitina após imersão em SBF (b). Na
Figura 33a, três picos podem ser observados na região de absorção de grupo
carbonila, a 1652, 1627 e 1558 cm
-1
. Essas absorções, assim com aquela a 1420
cm
-1
são características da quitina [78]. Embora haja interferência da fase polimérica
e as bandas características do grupo fosfato a 1030 cm
-1
e do grupo carbonato a
1460 cm
-1
não estejam resolvidas, as bandas mais largas nessas regiões e na região
de estiramento de grupo –OH e a banda a 870 cm
-1
indicam a deposição de CHA na
membrana [73].
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
b
a
Transmitância (u.a)
Número de ondas (cm
-1
)
Figura 33:
Espectroscopia do infravermelho do pó de quitina (a)
e do pó da membrana densa de quitina após uma semana de
imersão em SBF(b)
67
6.3.3. Análise Termogravimétrica (TGA)
Observou-se que a perda de água adsorvida ocorreu pelo aquecimento até
150°C em ambas as amostras. A decomposição da amostra de quitina se deu em
duas etapas, com perdas significativas de massa entre 330 e 400°C e entre 400 e
750°C. Para o compósito, na faixa estudada, perda significativa de massa ocorreu
na faixa 250 a 400 °C. Uma maior estabilidade térmica foi observada próximo a 40%
de massa, tanto para o pó da membrana, quanto para o precipitado filtrado
evidenciando a presença da fase mineral (Figuras 34a, 34b e 34c).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Temp [C]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
TGA
Sample Name: po_de_quitina
Sample Weight: 3.380[mg]
Atmosphere: Nitrogen
Flow Rate: 20[ml/min]
Figura 34 a : Termograma do pó de quitina
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Temp [C]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
TGA
Sample Name: pptado_SBF
Sample Weight: 1.955[mg]
Atmosphere: Nitrogen
Flow Rate: 20[ml/min]
Figura 34 b : Termograma do precipitado filtrado do SBF
68
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Temp [C]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
%
TGA
Sample Name: composito_quitina_HA
Sample Weight: 6.297[mg]
Atmosphere: Nitrogen
Flow Rate: 20[ml/min]
Figura 34 c : Termograma do compósito quitina apatita carbonatada
6.3.4. Microscopia eletrônica de varredura das membranas
Baseando-se no conceito de biomineralização, as funções orgânicas
presentes nas macromoléculas são importantes no crescimento de cristais de HA
[91,92]. De acordo com a literatura recente, o mesmo fenômeno é reportado;
superfícies com funções orgânicas negativamente carregadas estimulam a
nucleação de HA na solução supersaturada chamada “fluido corpóreo simulado”
(SBF), enquanto superfícies com funções orgânicas positivamente carregadas
inibem essa nucleação [93]. A interpretação aceita é que o acúmulo de íons Ca
+2
aumenta devido à atração eletrostática desses íons às superfícies negativas e, como
resultado, a nucleação é favorecida nessas superfícies.
As Figuras 35 a-d mostram imagens de microscopia eletrônica de varredura
(SEM) de membranas densa (a, c) e porosa (b, d) após a nucleação de CHA em
SBF. Nas Figuras 35a e 35b, a morfologia das superfícies, com cristais de CHA,
pode ser observada. As Figuras 35c e 35d mostram micrografias de seções
transversais, analisadas após imersão das membranas em nitrogênio líquido.
Cristais de CHA podem ser visualizados na Figura 35d, enquanto que na membrana
densa, a CHA depositada apresenta-se como material de maior cristalinidade e
menor homogeneidade entre os pontos de depósito.
69
Figura 36:
Micrografias eletrônicas de varredura das superfícies de membranas
densa (a) e porosa (b) e de seções transversais de membranas densa (c) e
porosa (d), após imersão em SBF durante 7 dias.
a b
c d
Os resultados obtidos comprovam que a quitina não se comporta como
material inerte em SBF e que induz a nucleação de CHA. Cristais de CHA foram
visualizados por microscopia eletrônica de varredura sobre a superfície de
membranas densas e porosas e no interior de membranas porosas, após imersão
em SBF durante 7 dias. Observa-se também que o número de núcleos
cristalográficos é maior na membrana de quitina porosa, evidenciando uma maior
afinidade entre a superfície dessa membrana e o fosfato de cálcio precipitado. Esse
fenômeno foi possível devido à dopagem das membranas porosas com CaCO
3
, que
além de ser precursor dos poros dessas membranas, levou ao aumento do número
de pontos de nucleação
[94- 100].
70
6.4. Caracterização dos compósitos quitina/hidroxiapatita
6.4.1. Termogravimetria dos biocompósitos
Os Termogramas dos compósitos de HA não calcinada/ quitina, HA não
calcinada/ quitina e HA porosa/ quitina em vários teores de HA encontram-se nos
anexos (item 10) deste trabalho.
A temperatura de início de degradação (‘on set”) é definida como a menor
temperatura em que pode ser detectado o início de variação de massa, para um
determinado conjunto de condições experimentais.
O pico da derivada da curva de um termograma indica a temperatura em que
é máxima a velocidade de decomposição da amostra.
O resíduo é o percentual que sobra da massa da amostra após uma corrida
térmica [93]. Para o cálculo do resíduo remanescente utilizou-se a seguinte fórmula:
RR(%)=100%-RD(%)
Onde RR é o resíduo remanecente da amostra e RD corresponde ao
percentual de massa degradada.
Tabela 16 Parâmetros termogravimétricos de compósitos HA não calcinada/quitina
Amostra
T
o
(°
°°
°C) T
p
(°
°°
°C)
Resíduo (%)
Quitina 364,5 417,4 40,8
2% HA n calc/QUI 340,9 388,3 69,6
4%HA n calc/QUI 340,7 385,3 79
6%HA n calc/QUI 330,0 381,0 83
Tabela 17 Parâmetros termogravimétricos de compósitos HA calcinada/quitina
Amostra
T
o
(°
°°
°C) T
p
(°
°°
°C)
Resíduo(%)
Quitina 364,5 417,4 40,8
2% HA calc/QUI 340,2 393,7 74,86
4%HA calc/QUI 335,3 387,6 84
6%HA calc/QUI 327,7 380 88,6
Tabela 18 Parâmetros termogravimétricos de compósitos HA porosa/quitina
Amostra
T
o
(°
°°
°C) T
p
(°
°°
°C)
Resíduo(%)
Quitina 364,5 417,4 40,8
2% HA por/QUI 348,4 399 77
4% HA por/QUI 341 385,2 84,83
6% HA por/QUI 335,6 387 89,3
71
Tabela 19 Comparação entre os compósitos de mesma composição de HA (2%)
Amostra
T
o
(°
°°
°C) T
p
(°
°°
°C)
Resíduo(%)
2% HA n calc/QUI 340,9 388,3 69,6
2% HA calc/QUI 340,2 393,7 74,86
2% HA por/QUI 348,4 399 77
Tabela 20 Comparação entre os compósitos de mesma composição de HA (4%)
Amostra
T
o
(°
°°
°C) T
p
(°
°°
°C)
Resíduo(%)
4% HA n calc/QUI 340,7 385,3 79
4% HA calc/QUI 335,3 387,6 84
4% HA por/QUI 341 385,2 84,83
Tabela 21 Comparação entre os compósitos de mesma composição de HA (6%)
Amostra
T
o
(°
°°
°C) T
p
(°
°°
°C)
Resíduo(%)
6% HA n calc/QUI 330,0 381,0 83
6% HA calc/QUI 327,7 380 88,6
6% HA por/QUI 335,6 387 89,3
Para ajudar a interpretação e comparação dos resultados foram feitos gráficos
em Excel
: Figuras 36, 37 e 38
72
Figura 36: Temperaturas de início de degradação observadas para os compósitos
HA/quitina
325
330
335
340
345
350
355
360
365
370
0 1 2 3 4 5 6 7
Teor de HA (%)
Temperatura de degradação (ºC)
HA não calcinada/QUI
HA calcinada/QUI
HA porosa/QUI
Pode-se observar que em todos os compósitos preparados, à medida que se
aumenta a concentração de hidroxiapatita, a temperatura de início de degradação
diminui, ou seja, há uma diminuição da estabilidade térmica com o aumento da
concentração de HA nos compósitos.
Os compósitos que se mantiveram mais estáveis termicamente, em todas as
concentrações, foram aqueles feitos com HA porosa, seguidos dos compósitos feitos
com HA não calcinada, que curiosamente na concentração de 4% igualou sua
temperatura de início de degradação com a mesma concentração de HA
porosa/quitina. As menores taxas de estabilidade térmica foram para os compósitos
de HA calcinada/quitina.
Como pode ser visto nas imagens de MEV das HA, o aglomerado cristalino de
menor tamanho foi da HA porosa , a seqüência crescente em tamanhos de
aglomerados cristalinos das HAs foi: HA porosa, HA não calcinada e HA calcinada.
Ao se realizar misturas físicas, como as feitas neste trabalho para se obter os
compósitos, quanto menor o tamanho dos cristais melhor, pois propicia um aumento
de superfície entre a matriz polimérica de quitina e as partículas de HA.
Conseqüentemente as maiores temperaturas de início de degradação (“on set”)
73
foram para as misturas melhor compatibilizadas: HA porosa/quitina, seguidas das
HA não calcinada/quitina e HA calcinada/quitina.
Figura 37: Temperaturas de velocidade máxima de decomposição de compósitos
HA/quitina.
375
380
385
390
395
400
405
410
415
420
0 1 2 3 4 5 6 7
Teor de HA (%)
Pico de máxima degradaçã0 (ºC)
HA não calcinada/QUI
HA calcinada/QUI
HÁ porosa/QUI
O cristal de HA não calcinada é menos estável ao calor, por isso tem maiores
velocidades de degradação em temperaturas mais baixas. À medida que se
aumenta o tempo de calcinação (2 horas para a HA calcinada e 3 horas para a HA
porosa), aumenta-se também as temperaturas de velocidade máxima de degradação
da amostra, pois aumenta-se a estabilidade do cristal.
74
Figura 38: Teor de resíduos remanescentes de compósitos HA/quitina
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8
Teor de HA
Resíduo
HA não calcinada/QUI
HA calcinada/QUI
HÁ porosa/QUI
O porcentual de resíduo foi maior para os compósitos de HA porosa/quitina
porque a calcinação propicia uma maior estabilidade térmica ao aglomerado
cristalino. Os compósitos de HA calcinada/quitina tiveram mais resíduo do que a HA
não calcinada/quitina, devido à maior estabilidade térmica do cristal de HA calcinada.
75
6.4.2. Microscopia eletrônica de varredura dos compósitos HA/quitina
Figura 39: Compósitos HA não calcinada/quitina (2%-a, 4%-b e 6%-c de HA) 10000x
Figura 40: Compósitos HA calcinada/quitina (2%-a, 4%-b e 6%-c de HA) 10000x
Figura 41: Compósitos HA porosa/quitina (2%-a, 4%-b e 6%-c de HA) 10000x
a
b
c
a b
c
a b c
76
A maioria dos óxidos inorgânicos com estrutura cristalina, como a
hidroxiapatita possui uma alta constante dielétrica [101]. No caso da
homogeneização de misturas físicas destas cerâmicas com polímeros é necessário
que os últimos tenham constante dielétrica também alta. Assim a quitosana, que usa
ácido acético diluído como solvente (CD da H
2
O- 80,1), possui uma maior constante
dielétrica que a quitina, pois essa usa N,N-dimetilacetamida como solvente (CD da
DMA 38,85). Logo a quitosana é mais fácil de ser homogeneizada em misturas
físicas com a hidroxiapatita do que a quitina [44]
Podemos observar pelas imagens de SEM que as amostras de melhor
homegeneização foram as feitas com HA porosa, que por terem um menor tamanho
de aglomerados policristalinos estão mais expostas aos grupamentos –NH
2
Li
+
e
NHCOCH
3
Li
+
da quitina (Figuras 41a, 41b e 41c), a sequência de melhor
homogeneização foi seguida pelas concentrações de HA calcinada e HA não
calcinada, de maior tamanho de agregados de cristais.
77
7. Conclusões
Pelo FTIR em todas as hidroxiapatitas carbonatadas preparadas o aumento
das substituições do CO
3
-2
foi percebido com o aumento do tempo de calcinação.
Conforme se pode observar por XRD houve um aumento no tamanho dos
cristais em todos os planos (hkl) observados da hidroxiapatita não calcinada para
hidroxiapatita calcinada, evidenciando o aumento do cristal com o aumento do
tempo de calcinação (2 horas a 900°C, para a HA calcinada).
Já para a hidroxiapatita porosa, o aumento do tamanho do cristal não foi tão
evidente quanto para a hidroxiapatita calcinada, devido ao uso do ultra-som por 30
minutos para desgaseificação e homogeneização do material produzido.
O aumento do tamanho dos cristais foi devido ao aumento em número das
lamelas cristalográficas e não em distanciamento interplanar.
Os resultados obtidos por FTIR, TGA e SEM comprovam que a quitina não se
comporta como material inerte em SBF e que induz a nucleação de CHA.
O número de núcleos cristalográficos é maior na membrana de quitina porosa,
evidenciando uma maior afinidade entre a superfície dessa membrana e o fosfato de
cálcio precipitado.
Quanto menor o tamanho dos agregados de cristais propicia um aumento de
superfície entre a matriz polimérica de quitina e as partículas de HA.
Conseqüentemente as maiores temperaturas de início de degradação (“on set”)
foram para as misturas melhor compatibilizadas: HA porosa/quitina, seguidas das
HA não calcinada/quitina e HA calcinada/quitina.
O cristal de HA não calcinada é menos estável ao calor, por isso tem maiores
velocidades de degradação em temperaturas mais baixas. À medida que se
aumenta o tempo de calcinação (2 horas para a HA calcinada e 3 horas para a HA
porosa), aumenta-se também as temperaturas de velocidade máxima de degradação
da amostra.
O porcentual de resíduo foi maior para os compósitos de HA porosa/quitina
porque a interação destes agregados de cristais com a matriz polimérica foi maior
devido ao seu menor tamanho. Os compósitos de HA calcinada/quitina tiveram mais
78
resíduo do que a HA não calcinada/quitina, devido à maior estabilidade térmica do
cristal de HA calcinada.
Podemos observar pelas imagens de SEM que as concentrações de melhor
homogeinização foram as feitas com HA porosa, que por terem um menor tamanho
de agregados de cristais estão mais expostas a matriz da quitina
A seqüência de melhor homogeinização foi seguida pelas concentrações de
HA porosa e HA calcinada.
79
8. Sugestões para trabalhos futuros
Determinar as propriedades mecânicas dos compósitos quitina/ hidroxiapatita, nas
concentrações preparadas no presente trabalho e em maiores concentrações.de
hidroxiapatita
Obter as reais relações Ca/P das hidroxiapatitas sintetizadas
Medir as constantes dielétricas da quitina e da hidroxiapatita separadamente e em
compósitos
Sintetizar e caracterizar a hidroxiapatita nanoestruturada
Preparar biomateriais nanoestruturados com nanohidroxiapatita/quitina
Incorporação de BMPs nos compósitos e realizar testes de liberação controlada in
vitro.
Realizar testes de viabilidade osteoblástica, como o da fosfatase alcalina.
Realizar testes de imunogeneicidade.
Realizar ensaios in vivo: Implantes destes materiais em tíbias de coelhos, para
observação, após 8 semanas do crescimento celular
80
9. Bibliografia
1. Hollister, S.J.; Kikuchi, N. (1994). “Homogenization theory and digital imaging:
a basis for studying the mechanics and design principles of bone tissue”,
Biotechnology and Bioengineering, 43, 586-596.
2. Hollinger,J.O.; Winn,S.; Banadio,J. (2000); ”Options for tissue engineering to
address challenges of the ageing skeleton”, Tissue Engineering, 6, 341-350.
3. Seal, B.L.; Otero, T.C; Panitch, A.(2001); “Polymeric biomaterials for tissue and
organ regeneration”; Materials Science & Engineering, 34,147-230.
4. Schilling, A.F.; Linhart, W.; Filke, S.; Gebauer, M.; Schinke, T.; Rueger, J.M.;
Amling, M.(2004); “Resorbability of bone substitute biomaterials by human
osteoclasts”; Biomaterials 25, 3963-3972.
5. Ramakrishna, S.; Mayer,J.; Wintermantel,E.; Leong,K.W. (2001); ”Biomedical
applications of polymer-composite materials: un review”; Composites Science
and Technology 61,1189-1224.
6. Black,J. (1990); “Biological engineering- has its time come”; Engineering
Education 80, 454-454.
7. Tunes, U.R.; Rapp, G.E. (1999); “Atualização em periodontia e
implantodontia”; Artes médicas- Revisão odontológica. SOBRAPE.
8. Ripamonti, U.; Duneas, N. (1998); “Tissue morphogenesis and regeneration by
bone morphogenetic proteins”; Plastic and Reconstructive Surgery 101,
227-239.
9. Thull, R. (2002); ”Physicochemical principles of tissue material interactions”;
Biomolecular Engineering 19, 43-50.
10. Tiedeman, J. J.; Garvin, K.L.; Kile, T.A.; Connolly, J.F. (1995); “The role of a
composite, demineralized bone matrix and bone marrow in the treatment of
osseous defects”; Orthopaedics 18, 1153-1158.
11. Hsu, F.Y.; Chueh,S.; Wang,Y.J (1999);”Microspheres of
81
hydroxiapatite/reconstituted collagen as supports for osteoblast cell growth”;
Biomaterials 20; 1931-1936.
12. Risbud, M.; Sittinger, M.; (2002); “Tissue engineering advances in vitro
cartilage generation”; Trends Biotechnology 20; 351-356.
13. Saito, N.; Takaoka, K. (2003); “New synthetic biodegradable polymers as BMP
carries for bone tissue engineering”; Biomaterials 24, 2287-2293.
14. Doblaré, M.; García, J. M.; Gómez, M.J. (2004); “Modelling bone tissue fracture
and healing: a review”; Engineering Fracture Mechanics 71, 1809-1840.
15. Boyan, B.D.; Lohmann, C.H.; Romero, J.(1999); ”Bone and cartilage tissue
engineering”; Clinics in Plastic Surgery 26, 629-645.
16. Prêle, C.M.; Horton, M.A.; Caterina, P. (2003); “Identification of the molecular
mechanisms contributing to polarized trafficking in osteoblasts”; Experimental
Cell Research 282, 24-34.
17. Dorozhkin, S.V.; Epple, M. (2002); “Biological and medical significance of
calcium phosphates”; Angewandte Chemie- International Edition 41, 3130-
3146.
18. Fernandez, E.; Gil, F.J.; Ginebra, M.P.(1999);”Calcium phosphate bone
cements for clinical applications- part I: solution chemistry"; Journal of
Materials Science Materials in Medicine 10, 169-176.
19. Fernandez, E; Gil, F.J.; Ginebra, M.P.(1999) ”Calcium phosphate bone
cements for clinical applications- part II"; Journal of Materials Science-
Materials in Medicine 10,177-183.
20. Aoki,H. (1994), Medical application of hydroxyapatite; I ed, Tokyo; Ishiyaku;
EuroAmericana
21. http://www.cbpf.br/RevistaCBPF/pdf/BioMat.pdf, acesso outubro de 2004.
22. Almqvist, N.; Thonson, N.H.; Smith, B.L.(1999); “Methods for fabricating and
characterizing a new generation of biomimetic materials”; Materials Science &
82
Engineering 7; 34-43.
23. Allegretti, L.J.M.; Bertran, L.A. (2004); ”Precipitação de fosfato de cálcio em
matrizes de colágeno.Comparação com processos de mineralização em
tecidosvivos”; Fac .Engenharia Química , Universidade Estadual de Campinas,
Campinas (SP), Brasil, Anais do III Congresso Latino Americano de Órgãos
Artificiais e Biomateriais, Julho de 2004.
24. Royer, A.; Viguie, J.C.; Heughebaert, M.; Heughebaert, J.C. (1993);
“Stoichiometry of hydroxyapatite: influence on the flexural strength”; Journal of
Materials Science-Materials in Medicine 4, 76-82.
25. Puajindanert, S.; Best, S.; Bondfield, W. (1993); “Preparation, characterization
and sintering of hydroxyapatite”; British Ceramics 3, 96-99.
26. Planell, J.A.; Vallet-Regi, M.; Fernandez, E.; Rodriguez, L.M.; Salinas, A.;
Bermudez, O.; Baraduc, B.; Gil, F.J.; Driessens, F.C.M. (1994); “Fracture
toughness evaluation of sintered hydroxyapatite”; Bioceramics 7,17-22.
27. Santos, J.D.; Knowles, J.; Reis,R.; Monteiro, F.J.; Hastings, G.W. (1994);
“Microestructural characterization of glass-reinforced hydroxyapatite
composites”; Biomaterials 15, 5-10.
28. Raynauc, S.; Champion, E.; Bernache-Assolant, D.; Tetard, D.(1998);”Dynamic
fatigue and degradation in solution of hydroxyapatite ceramics”; Journal of
Materials Science Materials in Medicine 9, 221-227.
29. Suchanec, W.; Yoshimura, M. (1998); ”Processing and properties of
hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement
implants”; Journal of Materials Research 13, 94-117.
30. Rodríguez-Lorenzo, L.M.; Vallet-Regí, M.; Ferreira, J.M.F. (2001); “Fabrication
of hydroxyapatite bodies by uniaxial pressing from a precipitated powder”;
Biomaterials 22, 583-588.
31. Rodriguez-Lorenzo, L.M.(1999); “Síntesis, procesado y propiedades de
cerámicas de fosfato de calcio con interés clínico”; Tesis doctoral; Universidad
Complutense de Madrid
83
32. Rodríguez-Lorenzo, L.M.; Vallet-Regí, M.(2000); “Controlled crystallisation of
calcium phosphate apatites”; Chemistry of Materials 12, 2460-2465.
33. Hutmacher, D.W. (2000); “Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage”;
Biomaterials 21, 2529- 2543
34. Orly, I.; Greigore, M.; Mennaneau, J.; Heughebaert, M.; Kerebel, B. (1989);
”Chemical changes in hydroxyapatite biomaterial under in vivo and in vitro
biological conditions”; Calcified Tissue International 45, 20-26.
35. Debruijn, J.D.; Klein, C.P.A.T.; de Groot, K.; Van Blitterswijk, C. A.(1992); “The
ultrastructure of the bone- implant interface in vitro”;Journal Biomedical
Materials Research 26, 1365-1382.
36. Bagambisa, F. B.; Joos, U.; Schilli, W.(1993); “ Mechanisms and structure of
the bond between bone and hydroxyapatite ceramics”; Journal Biomedical
Materials Research 27, 1047-1055.
37. Debruijn, J.D.; van Blitterswijk, C.A.; Davies, J.E.(1995) ; “Initial bone matriz
formation at the hydroxyapatite interface in vivo”; Journal Biomedical
Materials Research 29, 89-99.
38. Ban, S.; Maruno, S.; Iwata, H.; Itoh, H.;(1994); “Calcium phosphate
precipitation on the surface of HA-G-Ti composite under physiologic
conditions”; Journal Biomedical Materials Research 28, 65-71.
39. Zyman, Z.; Weng, J.; Liu, X.; Zhang, X. (1994); “Phase and structural changes
in hydroxyapatite coatings under heat treatment”; Biomaterials 15; 151-155.
40. Ginebra, M. P.; Driessens, F.C.M.; Planell, J.A. (2004); “Effect of the particle
size on the micro and nanostructural features of a calcium phosphate cement:
a Kinetic analysis”; Biomaterials 25, 3453-3462.
41. Barralet, J.E.; Grover, L.; Gaunt, T.; Wright, A.J.; Gibson, I.R. (2002);
“Preparation of macroporous calcium phosphate cement tissue engineering
scaffold”; Biomaterials 23, 3063-3072.
84
42. Kumar, M.N.V.R.(2000); “A review of chitin and chitosan applications”;
Reactive & Functional Polymers 46, 1-27.
43. Khor, E. (2002);”Chitin: a biomaterial in waiting”; Current Opinion in Solid
State & Materials Science 6, 313- 317.
44. Tonoli, M.S.; Leal, C.V.; Beppu, M.M.; “Preparação e caracterização de
cimentos de quitosana e β-TCP”, Fac. Engenharia Química e Fac. Engenharia
Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP), Brasil, Anais
do III Congresso Latino Americano de Órgãos Artificiais e Biomateriais, Julho
de 2004.
45. Kim, S.B.; Kim, Y.J.; Yoon, T.L.; Park, S.A.; Cho, I.H.; Kim, E.J.; Kim, I. A.;
Shin, J.W. (2004); “The characteristics of a hydroxyapatite-chitosan-PMMA
bone cement”; Biomaterials 25, 5715-5723.
46. Cunin, G.; Boissonnet, H.; Petite, H.; Blanchat, C.; Guillemin, G. (2000);
“Experimental vertebroplasty using osteocondutive granular material”; Spine
25, 1070-1076.
47. Lu,J.X.; Huang, Z.W.; Tropicano, P.(2002); ”Human biological reactions at the
interface between bone tissue and polymethylmethacrylate cement”; Journal
of Materials Science in Medicine 13, 803-809.
48. Heini, P.F.; Walchli, B.; Berlemann, U. (2000); “Percutaneos transpedicular
vertebroplasty with PMMA: operative technique and early results”; European
Spine Journal 9, 445-450
49. Barralet, J.E.; Gibson, I.R.; Knowles, J.K.; Gaunt, T.; Wright, A.J. (2002)
;”Effect of porosity reduction on compressive strength and microstructure of
calcium phosphate cement”. Journal of Biomedical Materials Research
63,1-9.
50. Mayr-Wohlfart, U.; Fiedler, J.; Gunter, K.P.; Pahl, W.; Kessler, S. (2001);
“Proliferation and differentiation rates of a human osteoblast- like cell line
(Saos-2) in contact with different bone substitute materials”; Journal of
Biomedical Materials Research 57, 132-139.
85
51. Benesh, J.; Tengvall, P.; ”Blood protein adsorption onto chitosan”; (2002);
Biomaterials 23, 2561-2568.
52. Midy, V.; Dard, M.; Holland, E.(2001); “Evaluation of the effect of three calcium
phosphate powders on osteoblast cells”; Journal of Biomedical Materials
Research 12, 259-265.
53. Moursi, A.M.; Winnard, A.V.; Winnard, P.L.; Lannutti, J.J.; Seghi, R.R. (2002);
“Enhanced osteoblast response to a polymethylmethacrylate- hydroxyapatite
composite”; Biomaterials 23, 133-144.
54. Maruyama, M.; Ito, M.(1996); “In vitro properties of a chitosan-bonded self-
hardening paste with hydroxyapatite granules”; Journal of Biomedical
Materials Research 32, 527-532.
55. Mori, T.; Okumura, M.; Matsuura, M.; Ueno, K.; Tokura, S.; Okamoto,Y.;
Miname, S.; Fujinaga, T.(1997); “Effect of chitin and its derivatives on the
proliferation and cytokine production of fibroblasts in vitro”; Biomaterials 18,
947-951.
56. Muzzarelli, R.; Baldassarre, V.; Conto, F.; Ferrara, P.; Biagini, G.; Vasi,
G.(1988); “Biological activity of chitosan: ultrastructural study”; Biomaterials
93, 247-252.
57. Rinaldo, M.; Dung, P.; Milas, M.; Desbrieres, J.(1999); “Water soluble
derivatives obtained by controlled chemical modifications of chitosan”;
Carbohydrate Polymers 24, 209-214.
58. Tolaimate, A.; Desbrieres, J.; Rhazi, M.; Alagui, A.; Vincendon, M.; Vottero,
P.(2000); “On the influence of deacetylation process on the physicochemical
characteristics of chitosan from squid chitin”; Polymer 41, 2463-2469.
59. Torrado, S.; Torre, P.(2003); “Interpolymer complexes of poly (acrylicacid) and
chitosan: influence of the ionic hydrogel-forming medium”; Biomaterials 24,
1459-1468.
60. Percot, A.; Viton, C..; Domand, A. (2003); “Optimization of chitin extraction
from shrimp shells”; Biomacromolecules 4, 12-18.
86
61. lDung, P.; Milas, M.; Rinaldo, M.; Desbrières, J. (1994); “Water soluble
derivatives obtained by controlled chemical modifications of chitosan”;
Carbohydrate Polymers 24, 209-214.
62. Tolaimate, A.; Desbrières, J.; Rhazi, M.; Alagui, A.;Vincedon, M.;Vottero, P.
(2000); “On the influence of deacetylation process on the physicochemical
characteristics of chitosan from squid chitin”; Polymer 41, 2463-2469.
63. Sorlier, P.; Viton, C.; Domard, A. (2002); “Relation between solution properties
and degree of acetylation of chitosan: role of aging”; Biomacromolecules 3,
1336-1342.
64. Rinaldo, M.; Milas, M.; lê Dung, P. (1993); ”Characterization of chitosan.
Influence of ionic strength and degree of acetylation on chain expansion”;
International Journal of Biological Macromolecules 15, 281-285.
65. McCormick,C.; Callais P.; Hutchinnson, B. (1985); “Solution studies of cellulose
in lithion chloride and N,N-dimethylacetamide”; Macromolecules 18, 2394-
2401.
66. Yusof, N.; Lim, L.; Khor, E. (2004); “Flexible chitin films: structural studies”;
Carbohydrate Research 339, 2701-2711.
67. Chow, K.; Khor, E. (2000); “ Novel fabrication of open- pore chitin matrixes”;
Biomacromolecules 1, 61-67.
68. Bayraktar, D.; Tas,A. (1999); “Chemical preparation of carbonated calcium
hydroxyapatite powders at 37°C in urea- containing synthetic body fluids”;
Journal of the European Ceramic Society 19, 2573-2579.
69. Zhang, R.; Ma, P. (2003); “Biomimetic polymer/ apatite composite scaffolds for
mineralized tissue engineering”; Macromolecular Bioscience 4, 100-111.
70. Landi, E.; Tampieri, A.; Celotti, G.; Langenati, R.; Sandri, M.; Sprio, S.(2005)
“Nucleation of biomimetic apatite in synthetic body fluids: dense and porous
scaffolds development”; Biomaterials 26, 2835-2845.
87
71. Zhu, P.; Masuda, Y.; Koumoto, K. (2004); “The effect of surface charge on
hydroxyapatite nucleation”; Biomaterials 25, 3915-3921.
72. Palmer, J.; Rosenstiel, T. (1989); “Process of preparing hydroxyapatite” U S
Patent number 4849,193.
73. Tas, A.(1999); “Synthesis of biomimetic Ca- hydroxyapatite powder at 37°C in
synthetic body fluids”; Biomaterials 21, 1429-1438.
74. Engin, N.; Tas, A. (1999); “Manufacture of macroporous calcium
hydroxyapatite bioceramics”; Journal of the European Ceramic Society 19,
2569-2572.
75. Kweh, S.; W.; K.; Khor, K.; A.; Cheang, P.(1999); “The production and
characterization of hydroxyapatite (HA) powders”; Journal of Materials
Processing Technology 89- 90, 373- 377.
76. Berguer, M.(1966); “X-Ray crystallography introduction to the investigation of
crystals by their diffraction of monochromatic X- radition”; John Wiley &
&&
& Sons.
77. .Pereira, R.A.; (1997); “Estudo cristalográfico dos polietilenos de alta e baixa
densidade por difração de raios-X a altos ângulos”; Tese de doutorado. IMA-
UFRJ.
78. Guimier, A. (1963); “X-ray diffraction in crystals, imperfect crystals and
amorphous bodies”; W.H. Freemann, San Francisco.
79. Oréfice, R.,L.; Pereira, M.; Mansur, H, S. (2006); Biomateriais: Fundamentos e
Aplicações”; Cultura Médica Rio de Janeiro, RJ Brasil, 185-235.
80. Lucas, E.; Soares, B.; Monteiro, E.(2001);”Caracterização de polímeros:
Determinação de peso molecular e análise térmica”; E-papers Serviços
Editoriais Rio de Janeiro, Brasil.
81. Andrade, C.; Silva, K.; Tavares, M.; Simão, R.; Achete, C.; Perez, C. (2000);
“Comparative study on structural features of α chitin from Xiphopenaeus
kroyeri and its precipitated product from phosphoric acid solution”; Journal of
Applied Polymer Science 83, 151-159
88
82. Velde, K.; Kiekens, P.(2004); “Structure analysis and degree of substitution of
chitin, chitosan and dibutylchitin by FT-IR spectroscopy and solid state
13
C
NMR”; Carbohydrate Polymers 58, 409-416.
83. .Lavertu, M.; Xia, Z.; Serreqi, A.; Berrada, M.; Rodrigues, A.; Wang, D.;
Buschmann, M.; Gupta, A. (2003);”A validated
1
H NMR method for the
determination of the degree of deacetylation of chitosan”; Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32, 1149-1158.
84. Andrade, C.; Silva, K.; Simão, R.; Achete, C.(2002); “Exploring chitin
morphologies in cuticle fragments of Xiphopenaeus kroyeri by atomic force
microscopy”; Carbohydrate Polymers 47, 59-71.
85. Duarte, M.; Ferreira, M.; Marvão, M.; Rocha, J. (2002); “An optimised method
to determine the degree of acetylation of chitin and chitosan by FTIR
spectroscopy”; International Journal of Biological Macromolecules 31, 1-8.
86. Kweh, S.; W.; K.; Khor, K.; A.; Cheang, P.(1999); “The production and
characterization of hydroxyapatite (HA) powders”; Journal of Materials
Processing Technology 89- 90, 373- 377.
87. Powder Diffraction File: Inorganic Phases, Joint Committee on Powder
Diffraction Standards, Swarthmore (1986); Card No. 9-432
88. Kakudo, M.; Kasai, N.(1972); “X-Ray diffraction by polymer” Kodansha
Scientific Books, New York 1972.
89. Alexander, L.E.; “X-Ray Diffraction Methods in Polymer Science”; Robert and
Krieger Publishing Huntington, New York, 1979.
90. “Preparation and Comprehensive Characterization of a Calcium
Hydroxyapatite Reference Material” (2004); Journal of Research of the
National Institute of Standards and Technology, 109, 553- 568.
91. Landi, E.;Tampieri, A.; Celotti, E.; Langenati, M.; Sandri, S.;Sprio, S
(2005);”Nucleation of biomimetic apatite in synthetic body fluids dense and
porous scaffolds development” Biomaterials, 26, 2835-2845.
89
92. Simkiss, K.; Wilbur, K. (1989); “Biomineralization- cell biology and mineral
deposition”; San Diego, CA; Academic Press; 284-293
93. .Mann, S. (1988); “Molecular recognition in biomineralization”; Nature 332,
119-124.
94. Calvert, P.; Mann, S.(1997); “The negative side of crystal growth”; Nature
386, 127-128.
95. Zhu, P.; Masuda, Y.; Koumoto, K. (2003); “The effect of surface charge on
hydroxyapatite nucleation”; Biomaterials 25, 3915- 3921.
96. Aimoli, C.; Torres, M.; Beppu, M.(2005); “Investigations into the early stages
of “in vitro” calcification on chitosan films”; Materials Science and
Engineering xx, xxx-xxx.
97. Lu, X.; Leng, Y. (2004); “Theorical analysis of calcium phosphate
precipitation in simulated body fluid”; Biomaterials 26, 1097- 1108.
98. Landi, E.; Tampieri, A.; Celotti, G.; Langenati, R.; Sandri, M.; Sprio, S.
(2004); “Nucleation of biomimetic apatite in synthetic body fluids: dense and
porous scaffolds development”; Biomaterials 26, 2835- 2845.
99. Toworfe, G.; Composto, R.; Shapiro, I.; Ducheyne, P.(2005); “Nucleation
and growth of calcium phosphate on amine-, carboxyl-and hydroxyl-silano
self-assembled monolayers”; Biomaterials xx, xxx-xxx.
100. Li, P.; Nakanishi, K.; Kokubo, T.; Groot, K. (1993); “Induction and
morphology of hydroxyapatite, precipitated from metastable simulated body
fluids on sol- gel prepared silica”; Biomaterials 14, 963- 968.
101. Li, L.; Hao, T.; Kikuchi, R.; Hayakawa, T.; Tsurumi, T.; Kakimoto, M. (2005);
“Novel Polymer-Ceramic Nanocomposite Based for Embedded Capacitor
Application”; Leee Transactions on Components and Packaging
Technologies 28, 754-758.
90
10 ANEXOS
Figura I: Termograma do pó de quitina
91
Figura II: Termograma do compósito 2% HA não calcinada/ quitina
92
-
Figura III: Termograma do compósito 4% HA não calcinada/ quitina
93
Figura IV: Termograma do c
ompósito 6% HA não calcinada/ quitina
94
Figura V: Termograma do compósito 2% HA calcinada/ quitina
95
Figura VI: Termograma do compósito 4% HA calcinada/ quitina
96
Figura VII: Termograma do compósito 6% HA calcinada/ quitina
97
Figura VIII: Termogra
ma do compósito 2% HA porosa/ quitina
98
Figura IX: Termograma do compósito 4% HA porosa/ quitina
99
Figura X: Termograma do compósito 6% HA porosa/ quitina
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
