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ANA APARECIDA BANDINI ROSSI
FILOGEOGRAFIA, DIFERENCIAÇÃO GEOGRÁFICA E
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE
Psychotria ipecacuanha DAS FLORESTAS ATLÂNTICA E AMAZÔNICA
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Genética e
Melhoramento, para obtenção do
título de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
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ANA APARECIDA BANDINI ROSSI
FILOGEOGRAFIA, DIFERENCIAÇÃO GEOGRÁFICA E
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS DE
|Psychotria ipecacuanha DAS FLORESTAS ATLÂNTICA E AMAZÔNICA
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Genética e
Melhoramento, para obtenção do
título de Doctor Scientiae.
APROVADA: 01 de março de 2007.
Prof. Carlos Roberto de Carvalho Prof. Jorge Abdala Dergam dos Santos
(Co-Orientador) (Co-Orientador)
Dra. Eveline Teixeira Caixeta Prof. Lyderson Facio Viccini
Prof. Luiz Orlando de Oliveira
(Orientador)
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ii
Dedico aos meus pais, José e Palmira;
ao meu esposo e companheiro Osvaldo; aos
meus queridos filhos Fernanda e Fernando, a
minha irmã Maria e ao meu irmão Edson.
Obrigada pelo apoio, carinho, solidariedade e,
sobretudo, pelo amor incondicional.
iii
AGRADECIMENTO
Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram no
desenvolvimento deste trabalho. Em especial:
A Deus, pelas forças em todos os momentos desta caminhada;
A Universidade Federal de Viçosa, pela acolhimento e qualificação;
A Universidade do Estado de Mato Grosso, pela oportunidade de
qualificação;
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento da
Universidade Federal de Viçosa pela oportunidade deste aperfeiçoamento;
Ao IEF (Instituto Estadual de Florestas), por permitir a realização de
coletas na Unidade de Conservação Parque Estadual do Rio Doce;
Ao Prof. Dr. Luiz Orlando de Oliveira, pelos sábios conselhos
fornecidos durante a orientação, pelo incentivo e, sobretudo, pela humildade
no repasse de seus conhecimentos. Obrigado pela confiança e amizade;
Obrigado por ter sido, durante todo o tempo, meu orientador e amigo.
Ao Prof. Dr. Carlos Roberto de Carvalho, pelas sugestões,
orientações e pelos ensinamentos que contribuíram para meu crescimento.
Ao Prof. Dr. Jorge Abdala Dergam dos Santos, pela orientação e
pelas contribuições fornecidas durante todo o desenvolvimento do trabalho;
Ao Prof. Dr. Wagner Campos Otoni, pelo companheirismo e
sugestões.
iv
Aos meus pais, pelos ensinamentos e pelos exemplos de vivência;
com eles aprendi a importância de valorizar a vida e a respeitar o próximo;
Ao meu esposo Osvaldo Saragosa Rossi e ao meu filho Fernando
Saragosa Rossi pelo companheirismo, incentivo, apoio e paciência durante o
desenvolvimento deste trabalho;
A minha filha Fernanda Saragosa Rossi e ao seu esposo Marcio
Cristiano Luis, pela compreensão e pelas alegrias;
A Lourdes Iarema e ao Rogério, pela amizade, companheirismo e
apoio dado a mim e a minha família durante nossa estadia em Viçosa;
A Maurecilne Lemes da Silva pela amizade e carinho durante este
período;
A Roberta, a Maria Antonia e ao Maninho, pela amizade e pelas
coletas de material na região de Mato Grosso, sem os quais este trabalho
não teria se concretizado;
A Andreia pelos ensinamentos e ajuda na realização dos trabalhos de
laboratório e também pelas palavras amigas;
Ao Wellington pelas orientações e incentivo no desenvolvimento do
trabalho de citogenética;
Aos colegas Francismar, Bruna, Gisele, Celice, Luiz, Milene, Márcia,
Maíra, Fernanda, Magali, Poliana, Mariana, Beatriz, Cassiana, Isabela enfim,
a todos do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas e do Laboratório de
Citogenética Vegetal pelo convívio e amizade;
Aos demais colegas e amigos de pós-graduação, professores e
funcionários do curso de Pós-Graduação em Genética e melhoramento,
pelos ensinamentos, convívio e amizade;
v
BIOGRAFIA
ANA APARECIDA BANDINI ROSSI, filha de José Bandini e Palmira
Christina Polotto Bandini, nasceu em 25 de outubro de 1965, em Marialva -
Paraná. Em 1982 casou-se com Osvaldo Saragosa Rossi. Em maio de 1983
nasceu Fernanda Saragosa Rossi e em março de 1986 Fernando Saragosa
Rossi, seus dois queridos filhos.
Diplomou-se como Bióloga em janeiro de 1996 pela Universidade do
Estado de Mato Grosso (UNEMAT), na cidade de Alta Floresta MT.
Em maio de 1996, ingressou na UNEMAT como professora substituta
na área de Biologia Geral e em junho de 1998 tornou-se professora efetiva
nesta Instituição de Ensino Superior.
Concluiu o curso de Mestrado em Botânica em 2003 na Universidade
Federal de Viçosa. Durante este período desenvolveu pesquisa na área de
Biologia Reprodutiva de plantas.
Em março de 2003, iniciou o Curso de Doutorado no Programa de
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento da Universidade Federal de
Viçosa, concentrando seus estudos na área de Biologia Molecular de
plantas.
vi
SUMÁRIO
RESUMO .............................................................................................. ix
ABSTRACT xi
INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................... 1
REFERÊNCIAS ..................................................................................... 4
CAPÍTULO I: FILOGEOGRAFIA MOLECULAR DE Psychotria
ipecacuanha ...............................................................
6
RESUMO .......................................................................................... 6
INTRODUÇÃO .................................................................................. 8
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 11
Populações amostradas .............................................................. 11
Extração de DNA ......................................................................... 13
Amplificação, purificação e sequenciamento .............................. 14
Análise das seqüências ............................................................... 15
Estimação da rede de haplótipos ................................................ 16
Análises dos clados aninhados (“Nested Clade Analysis”) e
teste por associação geográfica ..................................................
17
RESULTADOS .................................................................................. 20
Haplótipos .................................................................................... 20
Compartilhamento dos haplótipos ............................................... 22
Estimação da rede de haplótipos e aninhamento ....................... 25
Análise de clados aninhados (NCA) ............................................ 27
DISCUSSÃO ..................................................................................... 32
Inferência da história demográfica entre as florestas Atlântica e
Amazônica ...................................................................................
32
Estrutura filogeográfica de Psychotria ipecacuanha na Floresta
Atlântica .......................................................................................
36
Estrutura filogeográfica de Psychotria ipecacuanha na Floresta
vii
Amazônica ................................................................................... 37
Conclusões e implicações para conservação ............................. 39
REFERÊNCIAS ................................................................................ 41
CAPÍTULO II: AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA DIVERSIDADE
GENÉTICA E DIFERENCIAÇÃO GEOGRÁFICA
ENTRE POPULAÇÕES NATURAIS DE Psychotria
ipecacuanha (RUBIACEAE) NAS FLORESTAS
ATLÂNTICA E AMAZÔNICA ......................................
48
RESUMO .......................................................................................... 48
INTRODUÇÃO .................................................................................. 51
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 56
Material Vegetal ........................................................................... 56
Extração de DNA total ................................................................. 58
Seleção de primers e otimização do PCR ................................... 59
PCR - Amplificação de ISSR ....................................................... 60
Análise dos dados ....................................................................... 62
RESULTADOS .................................................................................. 66
Polimorfismo revelado por marcadores de ISSR ........................ 66
Diversidade genética dentro de populações ............................... 67
Diferenciação genética entre populações ………………………... 69
Similaridade genética entre populações e estrutura geográfica . 71
DISCUSSÃO ..................................................................................... 79
Estrutura populacional ................................................................. 79
Diversidade genética entre populações ...................................... 81
O efeito da disjunção na diversidade genética ............................ 83
Conclusões e implicações para conservação ............................. 85
REFERÊNCIAS ................................................................................ 87
CAPÍTULO III: CYTOGENETIC CHARACTERIZATION AND
NUCLEAR DNA CONTENT OF Psychotria
ipecacuanha …………..………………………...…..
94
SUMMARY ………………………………………………………...…..... 94
INTRODUCTION ………………………………………………………... 96
MATERIALS AND METHODS ………………………………………… 98
viii
Plant material ……………………………………………...………… 98
Flow cytometry ………………………………………………………. 98
Cytogenetic preparations ………………………………………....... 100
Image analysis ………………………………………………………. 101
RESULTS …………………………………………………………...…… 102
DISCUSSION ……………………………………………………………. 105
Flow cytometry ………………………………………………………. 105
Cytogenetics ……………………………………………………........ 106
REFERENCES ………………………………………………………...... 110
CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................. 115
ANEXOS ............................................................................................... 118
ix
RESUMO
ROSSI, Ana Aparecida Bandini, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
março de 2007. Filogeografia, diferenciação geográfica e
caracterização citogenética de populações naturais de Psychotria
ipecacuanha das florestas Atlântica e Amazônica. Orientador: Luiz
Orlando de Oliveira. Co-Orientadores: Carlos Roberto de Carvalho, Jorge
Abdala Dergam dos Santos e Wagner Campos Otoni.
Poaia (Psychotria ipecacuanha) é um pequeno arbusto perene que
cresce abundantemente em áreas úmidas e sombrias das florestas tropicais
do Brasil. A espécie foi utilizada pelos nativos brasileiros que ensinaram as
propriedades medicinais aos colonizadores europeus. As raízes de poaia
alcançaram utilidades mundiais como expectorante, amebicida, e agente
vomitivo, devido à presença de alcalóides isoquinolinicos
farmacológicamente ativos. Porém, a intensa coleta de plantas nativas e à
negligência de replantio após a coleta das raízes conduziu a um severo
declínio de suas pulações nativas. Populações remanescentes ocorrem
naturalmente em três regiões extremamente discreta das florestas tropicais:
1) a América central e partes adjacentes da América do Sul; 2) parte do
sudoeste da Amazona brasileira; e 3) Floresta Tropical Atlântica ao longo da
costa brasileira. Os estudos realizados na presente investigação utilizaram
técnicas combinadas que incluiu filogeografia molecular basead em cpDNA,
estrutura de população via ISSR, e citogenética para caracterizar
populações naturais de poaia das florestas Atlântica e Amazônica do Brasil.
As análises permitiram elaborar e avaliar hipóteses dos fatores históricos e
ecológicos que moldaram a atual distribuição das populações existentes e
x
adicionar informações para a compreensão da história evolutiva desta
importante espécie medicinal. As análises de clado aninhado e análises de
ISSR revelaram diferenças notáveis entre as florestas. Diversidade de
haplótipo de cpDNA foi maior na Floresta Atlântica, que abrigou 11 dos 12
haplótipos encontrados. Um único haplótipo foi encontrado na Floresta
Amazônica. Nenhum dos haplótipos foi compartilhado pelas florestas, o que
indica a presença de monofilia recíproca. As análises de clado aninhado
indicaram a fragmentação alopátrica como sendo a principal força que
moldou as diferenças entre florestas. Quando comparada a Floresta
Amazônica, a Floresta Atlântica exibiu altos níveis de diversidade genética
como demonstrado pelos maiores valores de H
E
, H
B
e I, tanto como uma
média das populações como de grupo, como revelado pelas análises de
ISSR. AMOVA revelou que a maioria da diversidade genética foi
particionada entre tipos de floresta. Fluxo gênico entre florestas é na
atualidade insignificante. As análises de citometria de fluxo evidenciaram
dois grupos com quantidade de DNA distinta (2C = 1.24 pg e 2C = 2.05 pg).
Poaia demonstrou um cariótipo consistindo de 11 pares de cromossomo (2n
= 22), dos quais 4 são metacêntricos e 7 são submetacêntricos. As análises
de citogenética revelaram que as populações naturais podem estar
experienciando poliploidização e sugerem que esta espécie seja tetraplóide.
Em geral, as análises indicaram um evento de colonização recente como
origem das populações da Floresta Amazônica e uma origem antiga para as
populações da Floresta Atlântica. A Floresta Atlântica foi considerada como
um centro de diversidade para poaia. Implicações para conservação são
discutidas.
xi
ABSTRACT
ROSSI, Ana Aparecida Bandini, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa,
March 2007. Phylogeography, geographic differentiation and
cytogenetic characterization of natural populations of Psychotria
ipecacuanha from the Atlantic and Amazon forests. Advisor: Luiz
Orlando de Oliveira. Co-advisors: Carlos Roberto de Carvalho, Jorge
Abdala Dergam dos Santos, and Wagner Campos Otoni.
Ipecac (Psychotria ipecacuanha) is a small perennial shrub, which grew
abundantly under shady areas of tropical rain forests of Brazil. The species
was employed by native Brazilians who taught the medicinal properties to
European settlers. Ipecac roots have achieved worldwide usefulness as an
expectorant, amoebicide, and vomitive agent because of its pharmacological
active isoquinoline alkaloids. However, overharvesting of wild plants and
negligence in replanting ipecac plants after uprooting has led to a severe
decline of native ipecac populations. Remaining populations occur naturally
in the understory of tropical forests from three widely discrete regions: 1)
Central America and adjacent parts of South America; 2) Southwestern part
of the Brazilian Amazon; and 3) Atlantic Rain Forest along the Brazilian
coast. The studies carried out in the present investigation used a combined
approach that included molecular phylogeography based on cpDNA,
population structure via ISSR, and cytogenetics to characterize natural
populations of ipecac from the Atlantic and Amazon forests of Brazil. The
analyses allowed us to develop and evaluate hypotheses on the historical
and ecological factors that shaped the distribution of extant populations and
xii
added a substantial amount of information to the understanding the
evolutionary history of this important medicinal species. Both nested clade
analyses and ISSR analyses revealed remarkable differences between
forests. Diversity of cpDNA haplotype was much higher in the Atlantic Forest,
which harbor 11 out of the 12 haplotypes found. Only a single haplotype was
uncovered in the Amazon Forest. None of the haplotypes was shared across
forest types, which indicated the presence of reciprocal monophyly. The
nested clade analyses pointed allopatric fragmentation as the main causal
force that shaped the differences between forests. When compared to the
Amazon Forest, the Atlantic Forest exhibited higher levels of genetic diversity
as shown by the greater values of H
E
, H
B
and I, both as a mean of
populations and as a group, as revealed by the ISSR analyses. AMOVA
revealed that most of the genetic diversity was partitioned between forest
types. Gene flow between forests is negligible at the present time. The flow
cytometry analyses evidenced two groups with distinct DNA amount (2C =
1.24 pg and 2C = 2.05 pg). Ipecac showed a karyotype consisting of 11
chromosome pairs (2n = 22), of which 4 are metacentric and 7 are
submetacentric. The cytogenetic analyses reveled that natural populations
may be experiencing polyploidization and suggested that this species can be
a tetraploid. Overall, the analyses indicated a recent colonization event as
the origin of the populations found in the Amazon Forest and an ancient
origin for the populations of the Atlantic Forest. The later forest was
considered as a center of diversity for ipecac. Implications for conservation
are discussed.
1
INTRODUÇÃO GERAL
A filogeografia pode ser definida como um campo de estudo que
integra princípios e processos que governam as distribuições espaciais e
temporais de linhagens genealógicas, especialmente aquelas dentro e entre
espécies muito próximas entre si (Avise 2000, Templeton 2004). Como
delineamento teórico, a filogeografia permite caracterizar processos de
diversificação ao nível de espécie e a formulação de hipóteses de
biogeografia histórica. A filogeografia molecular tem sido empregada com
sucesso para explorar associação entre redes de haplótipos e geografia em
um grande número de espécies vegetais, animais e de microorganismos
(Templeton 2004).
Os domínios morfoclimáticos da Amazônia e da Mata Atlântica
compreendem as florestas tropicais de maior diversidade no mundo
(Ab’Saber 1977). Entre essas duas florestas encontra-se uma extensão
geográfica de vegetação mais aberta e baixa, incluindo o Chaco argentino e
paraguaio, a caatinga no nordeste do Brasil e o cerrado na região central
brasileira. Essa extensão geográfica tem sido considerada por muitos
autores como um impedimento à migração das espécies entre as duas
maiores regiões florestais da América do Sul (florestas Amazônica e
Atlântica), tornando-se clara as diferenças na composição florística entre
elas (Oliveira-Filho e Ratter, 1995). Por outro lado, a distribuição disjunta de
um número considerável de espécies na Floresta Atlântica e na Floresta
2
Amazônica sugere a possibilidade de ligação entre elas no passado (Rizzini,
1963; Andrade-Lima, 1982). Tem sido proposta a existência de corredores
de migração histórica de elementos da flora das florestas Atlântica e
Amazônica (Bigarella et al., 1975). As relações filogeográficas e a avaliação
da distribuição intraespecífica da diversidade genética em espécies com
distribuição disjunta nestas duas florestas tem sido pouco explorada.
Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes (Rubiaceae) apresenta
distribuição disjunta em três grandes áreas: a) Florestas da América Central
(Panamá e Costa Rica) e norte da América do Sul (Colômbia); b) sul da
Floresta Amazônica brasileira (nos Estados de Rondônia e Mato Grosso; e,
c) na Floresta Atlântica (principalmente nos Estados da Bahia, Minas Gerais,
Espírito Santo e Rio de Janeiro) (Veloso, 1947; Assis e Giulietti, 1999). É
uma espécie reconhecida mundialmente como planta medicinal,
apresentando atividades farmacológicas comprovadas, cujos princípios
bioativos já foram isolados e identificados. Segundo Carrinconde et al
(1995), são quatro as principais propriedades terapêuticas da poaia:
amebicida, emética (provoca vômitos), expectorante e diaforética/febrífuga; o
que está de acordo com a ação farmacológica dos seus alcalóides
principais. Ocorre em agregados (reboleiras) e habita exclusivamente áreas
de sub-bosque com baixos níveis de luminosidade (Veloso, 1947).
Psychotria ipecacuanha consta na lista das espécies ameaçadas de extinção
no Estado de Minas Gerais (Mendonça e Lins, 2000), o único estado
brasileiro dentro da área de ocorrência da espécie a publicar uma lista de
conservação de espécies vegetais. As populações naturais de Psychotria
ipecacuanha presentes no Brasil, sofreram um extenso processo extrativista,
3
devido a grande demanda do mercado externo. Atualmente, a espécie vem
diminuindo sua densidade populacional e algumas populações naturais
foram extintas devido à fragmentação de seus habitats. Como conseqüência
destes processos, a espécie pode estar sofrendo impactos importantes na
estrutura genética populacional e uma redução da diversidade genética.
A diversidade genética é um fator importante para a persistência das
populações em ambientes variáveis, e é reconhecida como um componente
fundamental da biodiversidade (Mace et al. 1996). O entendimento do
processo de divergência ao nível de população é fundamental para o estudo
da diversificação evolutiva e do reconhecimento de diferentes ações de
conservação. Processos ecológicos e históricos, como deriva genética, fluxo
gênico e migração, moldaram a atual distribuição da diversidade genética de
uma espécie a compreensão destes processos é essencial para a
elaboração e implementação de programas de conservação e manejo.
Este estudo se propõe a investigar os padrões filogeográficos e a
estrutura genética de populações de Psychotria ipecacuanha atualmente
encontradas nas florestas Atlântica e Amazônica, bem como caracterizar
citogenéticamente e determinar o conteúdo de DNA da espécie.
4
REFERÊNCIAS
Ab’Saber AN. 1977. Os domínios morfoclimáticos da América do Sul.
Primeira Aproximação. Geomorfologia, 53: 1-23.
Andrade-Lima D. 1982. Present-day forest refuges in Northeastern Brazil.
Biology diversification in the tropics (ed. G.T. Prance), pp. 245–251. Plenum
Press, New York.
Assis MC, Giulietti AM. 1999. Diferenciação morfológica e anatômica em
populações de “ipecacuanha” - Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes
(Rubiaceae). Revista Brasileira de Botânica, 22: 205-216.
Avise JC. 2000. Phylogeography: the history and formation of species.
Harvard Univ. Press, Cambridge.
Bigarella JJ, Andrade-Lima D, Riehs PJ. 1975. Considerações a respeito
das mudanças paleoambientais na distribuição de algumas espécies
vegetais e animais no Brasil. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 47:
411-464.
Carrinconde C, Moraes D, Fritschen M, et al. 1995. Plantas medicinais e
plantas alimentíceas. Olinda: Centro Nordestino de Medicina Popular.
Costa LP. 2003. The historical bridge between the Amazon and the Atlantic
Forest of Brazil: a study of molecular phylogeography with small mammals.
Journal of Biogeography, 30: 71-86.
Mace GM, Smith TB, Bruford MW, Wayne, RK.1996. An overview of the
issues. In: Molecular genetic approaches in conservation. Eds. Smith, TB;
Wayne, RK. Oxford University Press, New York, 3-12.
5
Mendonça MP, Lins LV. 2000. Lista vermelha das espécies ameaçadas de
extinção da flora de Minas Gerais. Belo Horizonte: Fundação Biodiversitas,
Fundação Zôo-Botânica de Belo Horizonte.
Oliveira-Filho, AT, Ratter JA. 1995. A study of the origin of central Brazilian
forests by the analysis of plant species distribution patterns. Edinburgh
Journal of Botany 52:141-194.
Pio Correia M. 1969. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas
cultivadas. IBDF, Ministério da Agricultura, Rio de Janeiro. IV.
Rizzini CT. 1963. A flora do cerrado. Análise florística das savannas
centrais. In Simpósio sobre o cerrado (M.G. Ferri, org.). Edusp, São Paulo.
Templeton AR. 2004. Statistical phylogeography: methods of evaluating and
minimizing inference errors. Molecular Ecology, 13: 789-809.
Veloso HP. 1947. As condições ecológicas da Cephaelis ipecacuanha Rich.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 45: 361-372.
6
CAPÍTULO I
FILOGEOGRAFIA MOLECULAR DE Psychotria ipecacuanha
RESUMO
As florestas Atlântica e Amazônica constituem as duas maiores
extensões geográficas da América do Sul. Atualmente encontram-se
separadas por uma extensa região geográfica intermediária. Várias espécies
apresentam padrão de distribuição disjunta na Floresta Atlântica e na
Floresta Amazônica. Neste estudo foi realizada uma análise filogeográfica
molecular em Psychotria ipecacuanha, uma espécie medicinal, que no Brasil
apresenta distribuição disjunta nas florestas Atlântica e Amazônica. As
análises foram baseadas na variabilidade de duas regiões do gene trnT-trnL
do genoma de cloroplasto. Os dados foram obtidos de 107 indivíduos
provenientes de 23 populações sobre a extensão geográfica da espécie nas
duas florestas. Doze haplótipos de cpDNA foram identificados. Os haplótipos
não foram compartilhados pelas duas florestas, demonstrando, portanto
monofilia recíproca. A diversidade de haplótipos foi maior para as
populações da Floresta Atlântica (onde foram identificados 11 dos 12
haplótipos), enquanto que para as populações da Floresta Amazônica
apenas um haplótipo foi observado. Uma única rede contendo os 12
haplótipos foi obtida. Os padrões filogeográficos sugerem uma colonização
7
mais recente na Floresta Amazônica em relação à Floresta Atlântica e a
Floresta Atlântica como um possível refúgio para a espécie. A análise de
clado aninhado do conjunto de haplótipos indicou que a fragmentação
alopátrica é o principal processo influenciando a distribuição espacial atual
dos haplótipos dentro da espécie, enquanto que na Floresta Atlântica o
processo preponderante foi o fluxo gênico restrito com isolamento por
distância. Em geral, as análises indicaram um evento de colonização recente
como origem das populações da Floresta Amazônica e uma origem antiga
para as populações da Floresta Atlântica. A Floresta Atlântica foi
considerada como um centro de diversidade para poaia.
Palavras chaves: Filogeografia, diversidade genética, Psychotria
ipecacuanha.
8
INTRODUÇÃO
Filogeografia, a combinada análise de dados genealógicos e
distribuição geográfica, têm se tornado uma poderosa ferramenta para inferir
eventos biogeográficos históricos (Avise, 2000). Padrões de variação em
marcadores nucleares e de organelas citoplasmáticas têm permitido
inferências de eventos biogeográficos passados em todo tipo de escala
geográfica desde local até continental (Avise, 2004, Takayama et al., 2006;
Lorenz-Lemke et al., 2006). Apesar de progressos recentes nas abordagens
filogeográficas, o conhecimento dos eventos biogeográficos históricos ainda
permanece incompleto devido a lacunas nas amostragens taxonômicas e
seus habitats.
A maioria das investigações filogeográficas moleculares em
angiosperma tem objetivado a identificação de refúgios glaciais e rotas de
colonizações pós-glaciais traçadas por espécies de árvores e arbustos de
florestas temperadas do Velho Mundo (Demesure et al., 1996; Dumolin-
Lapègue et al., 1997; Liepelt et al., 2002; Petit et al., 2003).
Comparativamente, poucos estudos têm se dedicado aos padrões de
variação genética em espécies tropicais (Chiang et al., 2001; Cannon e
Manos, 2003; Collevatti et al., 2003).
As florestas Atlântica e Amazônica são as duas maiores florestas
tropicais da América do Sul. A Floresta Atlântica brasileira foi considerada
um dos oito maiores hotspost de biodiversidade para conservação (Myers et
9
al., 2000). A Floresta Atlântica ocorre ao longo da costa brasileira e está
sujeita ao desflorestamento desde a chegada dos europeus. Atualmente,
menos de 8 % de sua extensão original de 1,3 milhões de km
2
permanecem.
Apesar da perda expressiva de habitat, a Floresta Atlântica ainda abriga uma
parcela significativa da diversidade biológica do Brasil, com altíssimos níveis
de endemismo (Rocha et al., 2006). A Floresta Amazônica, é a maior floresta
tropical do mundo, com uma área original de 4,1 milhões de km
2
que abriga
grande quantidade da biodiversidade mundial (Auler et al., 2004). Entre a
Floresta Atlântica e a Floresta Amazônica encontra-se uma faixa de
vegetação mais aberta, incluindo o chaco argentino e paraguaio, a caatinga
no nordeste do Brasil, e o cerrado no Brasil central. Este corredor seco de
vegetação aberta, também chamado “a maior disjunção da América do Sul”
(Brieger, 1969), foi considerado como um importante impedimento para
migração de espécies entre as duas regiões de Floresta Tropical (Moojen,
1948; Raven e Axelrod, 1974; Rizzini, 1979; Mori et al., 1981; Por, 1992).
Rizzini (1963) e Prance (1982) sugerem conexões passadas entre as
Florestas Atlântica e Amazônica através do cerrado, uma vez que ocorre a
distribuição disjunta de várias espécies nestas duas áreas separadas
geograficamente.
Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes (=Cephaelis ipecacuanha
(Brot.) A. Rich.) (Rubiaceae) denominada de poaia ou ipeca é uma planta
medicinal que apresenta distribuição disjunta, ocorre em três grandes áreas
dos domínios de florestas: a) Florestas da América Central (Panamá e Costa
Rica) e norte da América do Sul (Colômbia); b) sul da Floresta Amazônica
brasileira (nos Estados de Rondônia e Mato Grosso; e, c) na Floresta
10
Atlântica (principalmente nos Estados da Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo
e Rio de Janeiro) (Veloso, 1947; Assis e Giulietti, 1999). Psychotria
ipecacuanha sofreu um intenso processo extrativista, uma vez que suas
raízes constituem em fonte de alcalóides farmacologicamente ativos, está
listada entre as espécies ameaçadas de extinção no Estado de Minas Gerais
(Mendonça e Lins, 2000), o único estado brasileiro dentro da área de
ocorrência da espécie que publicou uma lista de conservação de espécies
vegetais.
Neste estudo, avaliou-se a estrutura filogeográfica de haplótipos de
DNA cloroplastídico de Psychotria ipecacuanha para respondermos as
seguintes questões: (i) Qual dos dois domínios florestais apresenta uma
maior diversidade? (ii) Os padrões filogeográficos de Psychotria
ipecacuanha apoiam a existência de linhagens divergentes em congruência
com a disjunção das florestas Atlântica e Amazônica? (iii) Há indícios de
uma colonização recente em alguma das duas florestas? (iv) O padrão atual
da diversidade genética de Psychotria ipecacuanha indica regiões de
refúgios para a espécie? (v) Há indícios de fluxo gênico recente entre as
populações de Psychotria ipecacuanha entre as duas florestas?
Os conhecimentos obtidos neste estudo poderão ser aplicados na
elaboração de estratégias de conservação e manejo para a espécie, pois
proporcionará um conhecimento sobre a distribuição espacial e temporal da
atual diversidade genética da Psychotria ipecacuanha e sobre as relações
evolutivas históricas entre suas populações.
11
MATERIAL E MÉTODOS
Populações amostradas
Neste estudo, foram avaliados 107 indivíduos de Psychotria
ipecacuanha distribuídos em 23 populações. Doze dessas populações foram
amostradas na Floresta Atlântica e onze na Floresta Amazônica. As
populações amostradas em cada floresta com as respectivas localizações
geográficas e o tamanho da amostra por população e por floresta estão
relacionadas na Tabela 1. O material vegetal foi amostrado durante
expedições de coleta de germoplasma empreendidas entre 1995 e 2006. A
posição de cada população foi georeferenciada por meio de coordenadas
geográficas (GPS II Plus, Garmin Corp. USA), tomadas durante as
expedições de coleta. As populações de VB1, VB2, TAN, BBU, MAN, FRA e
LAM da Floresta Amazônica foram amostradas por moradores locais. As
posições geográficas destas populações foram estimadas por meio do
Google Earth, de acordo com as informações fornecidas pelos coletores. As
localidades das populações amostradas foram escolhidas de tal forma a
abranger a maior distribuição possível da espécie. Foram coletadas folhas
jovens, completamente expandidas, de uma haste por reboleira (agregado)
em cada população. O material foliar foi envolto em papéis molhados para
reter a umidade e acondicionado no campo em sacos plásticos de
polietileno. Posteriormente, o material foi armazenado a –80ºC no laboratório
de sequenciamento de DNA (seqDNA).
12
TABELA 1. Populações amostradas com as respectivas abreviações, código da população (CP), localização geográfica, tamanho da amostra
(N) e distribuição dos haplótipos. NH = número de haplótipos por floresta e população.
Populações CP Latitude (S) Longitude (W) N Distribuição dos haplótipos NH
FLORESTA ATLÂNTICA 73 A B C D E F G H I J L M 11
Trilha da Lagoa do Meio (TLM) 1 19º38’34” 42º30’56” 5 2 3 2
Trilha do Vinhático (TVI) 2 19º45’44” 42º28’56” 10 3 7 2
Trilha Central (TCE) 3 19º33’44” 42º37’57” 3 1 1 1 3
Visconde do Rio Branco (VRB) 4 21°00’37’’ 42°50’26’’ 11 6 1 1 2 1 5
Raposo (RAP) 5 21º06’40” 42º05’43” 18 14 1 1 2 4
Guaraciaba (GUA) 6 20º34´14" 43º00´28" 17 6 8 2 1 4
Dores de Guanhães (DOG) 7 19º02´17" 42º57´27" 2 2 1
Una (UNA) 8 15º20´00" 39º22’00” 2 2 1
Ponte Nova (PTN) 9 20º25´2,6" 42º53’42” 1 1 1
Carangola (CAR) 10 20º44´28" 42º01’33” 1 1 1
Irupi (IRU) 11 20º20´58" 41º38’25” 1 1 1
Conceição do Macabu (CON) 12 22º05´26" 41º52’12” 2 2 2
FLORESTA AMAZÔNIA 34 1
Prata (PRA) 13 15º30’26” 58º01’50” 6 6 1
Rio Vermelho (RVE) 14 15º17’38” 57º51’43” 6 6 1
Soroteca (SOR) 15 15º31’34” 58º00’42” 2 2 1
Tangará da Serra (TAN) 16 14º04’38” 57º03’45” 1 1 1
Mozar (MOZ) 17 15º04’57” 57º58’00” 3 3 1
Vila Bela da Santíssima Trindade 1 (VB1) 18 15º00'29" 59º57'02" 3 3 1
Vila Bela da Santíssima Trindade 2 (VB2) 19 14º59’04” 59º58’49” 3 3 1
Fazenda Manilha (MAN) 20 14º58´00" 57º57’00” 3 3 1
Fazenda Raizama (FRA) 21 14º53´00" 57º16’00” 3 3 1
Barra do Bugres (BBU) 22 14º51´00" 57º48’00” 2 2 1
Lambari D’Oeste (LAM) 23 15º19´27" 58º00’10” 2 2 1
Total 107 38 8 1 3 4 3 10 2 2 1 1 34 12
13
Extração de DNA
DNA genômico total foi extraído de aproximadamente 100 mg de
folhas jovens de uma mesma haste, usando protocolo de CTAB descrito por
Doyle e Doyle (1987), com poucas modificações. O tecido foliar foi
macerado em almofariz na presença de nitrogênio líquido. O material foi
transferido para microtubos de 2 mL, ao qual foram adicionados 800 μL de
tampão de extração CTAB (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M cloreto de
sódio; 20 mM EDTA; 2% CTAB; 2% polivinilpirrolidona (PVP) e 2% β-
mercaptoetanol) e incubado a 65
0
C por 5 minutos. A seguir, foram
adicionados 700 μL de clorofórmio:álcool isoamílico 24:1 (v:v). Os tubos
foram agitados por 1 minuto em vórtex e centrifugados a 13.000 rpm em
centrífuga 5415D, (eppendorf) por 10 minutos. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo e precipitado com o mesmo volume de
isopropanol gelado por 12 horas. Após este período, o material foi
centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos e o precipitado foi lavado uma vez
com etanol 70% e uma vez com etanol 95%. Depois da secagem por 15
minutos em temperatura ambiente, o precipitado foi ressuspendido em 200
μL de TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0) contendo RNAse (40
μg/mL) e a solução incubada a 37ºC por 30 minutos. Posteriormente, a
solução foi precipitada com a adição de acetato de amônio 7,5 M na
proporção 1:10 (acetato:DNA ressuspendido) e 2/3 do volume de
isopropanol gelado por 4 horas. A seguir, o material foi centrifugado a
13.000 rpm por 10 minutos. O precipitado foi lavado uma vez com etanol
70% e uma vez com etanol 95% e ressuspendido em 40-60 μL de TE. A
qualidade e a concentração do DNA foram confirmadas por eletroforese em
14
gel de agarose 0,8% com marcador de DNA λ. As soluções estoque foram
preparadas por diluições com água ulttrapura autoclavada, de forma a se
obter uma solução de trabalho com concentração final de aproximadamente
10 ng/μL de DNA genômico.
Amplificação, purificação e sequenciamento
A região trnT-trnL do genoma de cloroplasto foi amplificada com os
primers A (5’-CATTACAAATGCGATGCTTCT-3’) e D (5’-
GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3’), descritos por Taberlet et al. (1991). Para
as amostras que as amplificações falharam ou cujos produtos possuíam
baixa qualidade com o uso da combinação de primers A e D, a estratégia de
amplificação foi redesenhada, de tal forma que o fragmento foi amplificado
usando duas reações independentes. A primeira reação foi conduzida com a
combinação de primers A e B (5’-TCTACCGATTTCGCCATATC-3’), que tem
como alvo amplificar a região espaçadora intergênica entre o exon 5’ de trnT
(UGU) e trnL (UAA) (Taberlet et al., 1991). A amplificação com este conjunto
de primers resultou em um fragmento denominado “AB”. A segunda reação
foi conduzida com os primers C (5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’) e D e
amplificou o íntron trnL (UAA) (Taberlet et al., 1991). Esta segunda
amplificação resultou em um fragmento denominado “CD”.
As reações da polimerase em cadeia (PCR) foram realizadas em um
volume final de 25 µL, contendo: Tris-HCl 10 mM (pH8,3); 50 mM KCl; 0,1%
de tween 20; 1,5 mM MgCl
2
; 0,5 µM de cada primer; 0,2 mM de cada dNTP;
1,25 U de Taq DNA polimerase; 1,25 µl dedimetil-sulfóxido (DMSO);
aproximadamente 60 ng de DNA e água ultrapura. As amplificações foram
15
conduzidas em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems). A amplificação foi realizada com um ciclo inicial de
desnaturação a 95ºC por 5 minutos, um programa touch down de sete ciclos
de 94
0
C por 1 minuto, 58→52
0
C por 1 minuto, 72
0
C por 2 minutos, seguidos
por 28 ciclos de 94
0
C por 1 minuto, 52
0
C por 1 minuto, 72
0
C por 1,5 minutos
e 1 ciclo de extensão final de 72
0
C por 7 minutos. Os produtos de PCR
foram verificados por eletroforese em gel de agarose 1% e posteriormente
selecionados para purificação e sequenciamento.
Os produtos de PCR foram purificados utilizando o Kit de purificação
QIA-quick (Qiagen). O DNA obtido foi seqüenciado em seqüenciador
automático ABI Prism 377 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ou o
seqüenciador MegaBace DNA Analysis System 500 (Amersham Biosciences
Corp), utilizando o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction.
Os fragmentos “AD”, “AB” e “CD” foram seqüenciados nas direções forward
e reverse com os primers A e D; A e B, C e D, respectivamente.
Análise das seqüências
As seqüências foram importadas para o SEQUENCHER version 4.0.5
(Gene Codes Corp.) sendo editadas e corrigidas manualmente. O
alinhamento completo das seqüências foi realizado com a introdução de
gaps para compensar a presença de indels. O sequenciamento da região
trnT-trnL resultou em dois fragmentos, uma vez que as regiões amplificadas
com os primers A e B e com os primers C e D não se sobrepõe. Para
detecção das diferentes seqüências (haplótipos), uma matriz foi construída
combinando os fragmentos “AB” e “CD” para os 107 indivíduos das 23
16
populações analisadas. O haplótipo é resultante da junção das duas regiões
do genoma cloroplastídico analisadas.
Estimação da rede de haplótipos
O programa computacional TCS versão 1.13 (Clement et al., 2000),
foi utilizado para obter um cladograma não enraizado de haplótipos que
revela as relações genealógicas entre as 107 seqüências. O TCS aplica a
estatística da parcimônia pelo algoritmo desenvolvido por Templeton et al.
(1992). O programa reune as seqüências originais em haplótipos e calcula
uma matriz de distância (número de diferenças mutacionais) para todas as
comparações par a par dos haplótipos até que a probabilidade exceda 95%.
O número de diferenças mutacionais acima deste limite é o número máximo
de conexões mutacionais entre pares de seqüências justificado pelo critério
de parcimônia (Clement et al., 2000). Os indels foram considerados como o
quinto caráter, e foram codificados de tal forma que cada indel,
independentemente de seu tamanho, foi considerado um único evento de
mutação. Os “loops” presentes na rede foram resolvidos utilizando critérios
baseados na teoria da coalescência (Crandall e Templeton, 1993), resumido
por Pfenninger e Posada (2002) como: (i) Critério da freqüência: haplótipos
são mais prováveis de estarem conectados com os haplótipos de maior
freqüência do que com os haplótipos raros; (ii) Critério topológico: haplótipos
são mais prováveis de serem conectados com os haplótipos do interior do
que com os haplótipos da extremidade; (iii) Critério geográfico: haplótipos
são mais prováveis de estarem conectados com os haplótipos da mesma
17
população ou região do que com haplótipos que ocorrem em populações
distantes.
Análises dos clados aninhados (“Nested Clade Analysis”) e teste por
associação geográfica
Para inferir os processos que levaram aos atuais padrões
filogeográficos da espécie, utilizou-se a análise de clados aninhados (NCA)
(Templeton et al., 1995). Para NCA, os haplótipos são aninhados em clados
hierárquicos de acordo com as regras padronizadas em Templeton et al.
(1987) e Templeton e Sing (1993). Os haplótipos são as menores unidades
de análise e são considerados clados de nível zero. O aninhamento inicia na
extremidade da rede de haplótipo e move-se um passo mutacional para o
interior da rede, unindo todos os haplótipos que estão conectados por este
passo dentro de um subconjunto chamado de clado de nível 1. Este
procedimento é então repetido nas porções mais interiores da rede de
haplótipo até todos os haplótipos terem sido colocados dentro de um
subconjunto de clado de nível 1. Os clados de nível 2 são formados
utilizando as mesmas normas de aninhamentos, tendo os clados de nível 1
como unidade. O procedimento é repetido até obter um nível de
aninhamento que resulte em apenas um único clado. Os clados resultantes
são designados por ‘C-N’ onde ‘C’ é o nível de aninhamento do clado e ‘N’ é
o número de um clado particular em um dado nível de aninhamento
(Templeton et al., 1987). O aninhamento resgata a informação temporal mais
confiável contida na rede de haplótipo (Templeton, 1998; 2001; 2004).
18
Com base nas localizações geográficas das amostras no cladograma
aninhado, três medidas de distâncias foram calculadas: (i) distância do clado
(D
c
), que é a medida de como geograficamente está espalhado um particular
haplótipo ou clado; (ii) distância do clado aninhado (D
n
), que é a medida de
quanto um haplótipo particular ou clado está espalhado geograficamente em
relação ao clado dentro do qual está aninhado; e (iii) distância interior-
extremidade (I-E), que é a diferença média nos valores de D
c
[(I-E) D
c
] e D
n
[(I-E) D
n
] entre haplótipos ou clados do interior (ancestral) e extremidade
(descendente) (Templeton et al., 1995). Associação entre haplótipo e
geografia foi testada por uma análise de contingência permutacional exata
(10.000 permutações ao acaso), usando o programa GEODIS versão 2.5
(Posada et al., 2000). O resultado da análise de clados aninhados foi
utilizado para investigar associações geográficas, através da análise de
contingência permutacional pelo teste de χ
2
(Hudson et al., 1992; Templeton
e Sing, 1993; Templeton et al., 1995), na qual cada localização geográfica
(população) foi considerada como uma categoria variável. O teste de
contingência foi realizado nos clados com mais de um haplótipo ou clado,
seguindo o algoritmo descrito por Templeton e Sing (1993). Essa análise
permitiu testar a hipótese nula de que não há associação entre os clados e a
localização geográfica da população de origem. A hipótese nula foi
contrastada com a hipótese alternativa de que os clados estejam agrupados
de acordo com a localização geográfica da população de origem. A análise
evidencia interpretações filogeográficas mais ajustadas que permitem
distinguir entre a história e a estrutura da população (Templeton e Sing,
1993; Templeton et al., 1995; Crandall e Templeton, 1993; Templeton,
19
1998). A chave de inferência revisada de Templeton (2004), anexo 1, foi
usada para interpretar associações significativas entre haplótipos e geografia
e fazer a inferência biológica apropriada.
20
RESULTADOS
Haplótipos
Doze haplótipos foram distinguidos entre os 107 indivíduos
analisados. O alinhamento das seqüências revelou a presença de 15 sítios
polimórficos que foram caracterizados por indels ou substituições de bases.
O fragmento “AB” apresentou dez sítios polimórficos, dos quais cinco
foram substituições de bases e cinco foram indels. Os indels do segmento
“AB” se caracterizaram por 14; 9; 7; 213 e 17 pares de bases (Fig. 1). Os
dez sítios polimórficos do segmento “AB” revelaram oito diferentes
haplótipos. Dentre eles o haplótipo M foi o maior, com 506 pb, e ocorreu
somente na Floresta Amazônica. O haplótipo M apresentou uma inserção de
213 pb entre as posições 177 e 389, uma deleção de 14 pb entre as
posições 67 e 80 e três substituições de nucleotídeos nas posições: 109
(G→A), 424 (G→C) 543 (A→C) não detectadas nas demais seqüências.
Exibiu, também, três deleções de 9, 7 e 17 pb entre as posições 138 e 146,
155 e 161 e 516 e 532, respectivamente. Os outros sete haplótipos foram
detectados na Floresta Atlântica e diferiram entre si pela presença de três
indels (9, 7 e 17 pb), variando de tamanho (307, 314, 316 e 324 pb), de
acordo com a inserção ou deleção dos indels e por três substituições nas
posições 15 (G→A), 86 (A→G), e 424 (G→A) (Fig. 1).
21
FIG. 1. Alinhamento de seqüências dos sítios polimórficos do fragmento de cpDNA que define doze haplótipos em Psychotria ipecacuanha.
Cada fragmento combina 553 bp da região espaçadora intergênica entre o éxon 5’ do trnT (UGU) e trnL (UAA) (segmento “AB”) e 479 bp do
intron do trnL (segmento “CD”). Cada ponto indica similaridade ao Haplótipo A e cada traço indica um gap. (# e † correspondem aos dois
maiores “indels”, cujas seqüências estão mostradas acima).
# = CAACGATTAATAGAGCGATATAGAATTTCGATTTATTTACCACTAATACACTAATACAATTCGAATATTATTAAATTTGATATATCTATTTATTTTTATTATTTT
ATTATTTTTGAGTTTTAGATAATTAAAATTAAAGTTTTCGTTTTTGAATTCAAATGGCTTTTGAACTTCTTTTTATTGTATTATCTTATTTGATTCTATATCATAGAT
† = TGGTGTGAATAGATTCTAGCTTATTGATCAAATGATTCACTCCATAGTCTGATAAATCTTTGATTAATTGGG
G TAGTCAAAGTCGAC A G --------- ------- - G ----------------- A A G C T -
. .............. . . --------- ------- - . ----------------- . G . . . -
. .............. . . TCAATCTTG ------- - . ----------------- . . . . . -
A .............. . . --------- ------- - . ----------------- . . . . . -
A .............. . . --------- ------- - . TAAAGAGAAATAGACCC . . . . . -
. .............. . . --------- GAATATT - . ----------------- . . . . . -
. .............. . . --------- GAATATT - . ----------------- . . . . G -
. .............. . . --------- GAATATT - A ----------------- . . . . G -
. .............. G . --------- GAATATT - . ----------------- . . . . . -
. .............. . . --------- GAATATT - . ----------------- . G . . . -
. .............. . . --------- ------- - . ----------------- . . . . . †
. -------------- . A --------- ------- # C ----------------- C . T A . -
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
L
M
1 1 1 1 1 1 3 4 5 5 5 6 7 7 7 8 9
1 6 8 8 0 3 4 5 6 7 8 2 1 3 4 4 0 0 4 3 1
5 7 0 6 9 8 6 5 1 7 9 4 6
2
3 2 5 7 5 8 0
Segmento AB Segmento CD
9bp 7bp 213bp 17bp14bp
73bp
# = CAACGATTAATAGAGCGATATAGAATTTCGATTTATTTACCACTAATACACTAATACAATTCGAATATTATTAAATTTGATATATCTATTTATTTTTATTATTTT
ATTATTTTTGAGTTTTAGATAATTAAAATTAAAGTTTTCGTTTTTGAATTCAAATGGCTTTTGAACTTCTTTTTATTGTATTATCTTATTTGATTCTATATCATAGAT
† = TGGTGTGAATAGATTCTAGCTTATTGATCAAATGATTCACTCCATAGTCTGATAAATCTTTGATTAATTGGG
G TAGTCAAAGTCGAC A G --------- ------- - G ----------------- A A G C T -
. .............. . . --------- ------- - . ----------------- . G . . . -
. .............. . . TCAATCTTG ------- - . ----------------- . . . . . -
A .............. . . --------- ------- - . ----------------- . . . . . -
A .............. . . --------- ------- - . TAAAGAGAAATAGACCC . . . . . -
. .............. . . --------- GAATATT - . ----------------- . . . . . -
. .............. . . --------- GAATATT - . ----------------- . . . . G -
. .............. . . --------- GAATATT - A ----------------- . . . . G -
. .............. G . --------- GAATATT - . ----------------- . . . . . -
. .............. . . --------- GAATATT - . ----------------- . G . . . -
. .............. . . --------- ------- - . ----------------- . . . . . †
. -------------- . A --------- ------- # C ----------------- C . T A . -
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
L
M
1 1 1 1 1 1 3 4 5 5 5 6 7 7 7 8 9
1 6 8 8 0 3 4 5 6 7 8 2 1 3 4 4 0 0 4 3 1
5 7 0 6 9 8 6 5 1 7 9 4 6
2
3 2 5 7 5 8 0
Segmento AB Segmento CD
9bp 7bp 213bp 17bp14bp
73bp
22
No fragmento “CD” do cpDNA ocorreram substituições de nucleotídeos
em quatro posições (642, A→G; 705, G→T; 707, C→A; 745, T→G) e um indel
de 73 pb entre as posições 838 e 910. No total, cinco diferentes seqüências
foram reveladas para o intron trnL, com dois diferentes tamanhos (406 e 479
pb) (Fig. 1).
O alinhamento combinando os dois segmentos (“AB” e “CD”) resultou em
uma sequência de 1032 pb. O haplótipo M encontrado na Floresta Amazônica
possui um tamanho de 912 pb. Os haplótipos de A a L encontrados na Floresta
Atlântica variaram de tamanho em virtude da presença de indels.
A Fig. 2 demonstra os produtos de amplificação dos segmentos “AB” e
“CD” em indivíduos das florestas Atlântica e Amazônica. A amplificação do
segmento “AB” resultou em dois fragmentos de tamanhos diferentes. O
fragmento maior apresentou aproximadamente 850 pb e foi exclusivo dos
indivíduos da Floresta Amazônica, o qual depois de analisado deu origem ao
haplótipo M. O fragmento menor apresentou 630 pb e foi exclusivo das
populações da Floresta Atlântica. Os dados revelaram que é possível um
diagnóstico molecular de origem geográfica em nível de floresta.
Compartilhamento dos haplótipos
A distribuição dos 12 haplótipos entre as 23 populações de Psychotria
ipecacuanha está demonstrada na Tabela 1 e Fig. 3. Sete haplótipos (B, C, F,
H, I, J, L) foram exclusivos, cada um, para uma única população. Dentre estes,
o haplótipo B, foi encontrado na população GUA e foi o que apresentou maior
freqüência.
23
FIG. 2. Diagnóstico molecular da origem geográfica por meio de eletroforese dos
produtos de amplificação via PCR. M = marcador molecular. 1 e 2 = Fragmento “AB” de
cpDNA de indivíduos com origem na Floresta Atlântica e Floresta Amazônica,
respectivamente. 3 e 4 = Fragmentos “CD” de cpDNA de indivíduos com origem na
Floresta Atlântica e Floresta Amazônica, respectivamente.
Quatro haplótipos foram compartilhados entre as populações da Floresta
Atlântica. Um único haplótipo foi encontrado em todas as populações da
Floresta Amazônia. O haplótipo D foi compartilhado pelas populações TLM e
VRB. O haplótipo E foi compartilhado pelas populações TCE, RAP e GUA. O
haplótipo G foi compartilhado pelas populações TVI, TCE, VRB e RAP. O
haplótipo A, mais comum para Psychotria ipecacuanha, apareceu em 10
populações das 12 analisadas na Floresta Atlântica. O haplótipo M foi exclusivo
das populações da Floresta Amazônica.
24
FIG. 3. Distribuição geográfica de doze haplótipos de cpDNA em Psychotria ipecacuanha nas Florestas Atlântica e Amazônica. Os
números no mapa se referem ao código da população apresentado na Tabela1. A rede de haplótipos (veja Fig. 4) está sendo
mostrada como referência para interpretação das relações genealógicas entre os haplótipos.
0 Km
600 Km
01
03
07
02
04
05
06
09
10
11
12
08
600 Km
0 Km
N
S
E
W
NE
SE
NW
SW
13
15
16
17
18
19
20
21
22
23
12
10
0807
06
05
03
02
01
12
11
10
09
08
06
05
04
02
14
0 Km
600 Km
01
03
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0 Km
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W
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SW
13
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0807
06
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03
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10
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08
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05
04
02
0 Km
600 Km
0 Km
600 Km
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600 Km
0 Km
600 Km
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W
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15
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17
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23
12
10
0807
06
05
03
02
01
12
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10
09
08
06
05
04
02
12
10
0807
06
05
03
02
01
12
11
10
09
08
06
05
04
02
14
25
As duas florestas não compartilharam haplótipos, apresentando portanto
monofilia recíproca com relação aos haplótipos de cpDNA. A diversidade de
haplótipos foi maior para as populações da Floresta Atlântica (onde foram
identificados 11 dos 12 haplótipos), enquanto que para as populações da
Floresta Amazônica a diversidade de haplótipos é muito baixa (apenas um
haplótipo foi observado).
Estimação da rede de haplótipos e aninhamento
Uma única rede contendo todos os 12 haplótipos foi obtida (Fig. 4). Esta
rede de haplótipo inicialmente continha um “loop” (ABJF) que foi resolvido
usando o critério da freqüência e o critério geográfico. O haplótipo J foi
conectado em direção ao haplótipo B, que tem maior freqüência, em detrimento
da ligação ao haplótipo F, que possui menor freqüência. O número máximo de
conexões parcimoniosas entre dois haplótipos vizinhos mais divergentes
(haplótipo A e M) foi de sete eventos de mutação.
No processo de estimação da rede de haplótipos foi detectado seis
nodos interiores (representados na Fig 4 por pequenos círculos abertos) para
os quais nenhuma das 107 seqüências pôde ser alocada. De acordo com
Templeton (1998), estes nodos representam haplótipos intermediários inferidos
entre dois haplótipos próximos na rede que diferem por duas ou mais mutações.
Esses haplótipos intermediários se encontram extintos ou estão com uma
freqüência tão baixa na população de forma que não puderam ser amostrados.
26
FIG. 4. Rede de haplótipos de cpDNA obtida com TCS 1.13 e conjunto de clados
aninhados em Psychotria ipecacuanha. “Indels” foram considerados como o 5º estado
de caracter e codificados de tal forma que cada um deles, independentemente do
tamanho, foi considerado como um único caracter. Os dados foram agrupados de
acordo com as regras estabelecidas em Templeton et al. (1995). Os haplótipos estão
representados por círculos coloridos e identificados por letras. Cada linha na rede
representa um evento de mutação e círculos vazios representam haplótipos extintos ou
não amostrados. Clados de 1º nível (1-1 até 1-6), clados de 2º nível (2-1 até 2-3) e
cladograma total estão indicados por caixas. O “loop” ABJF foi esclarecido (linha
pontilhada) usando o critério de freqüência, conforme Crandal e Templeton (1993).
M
A
IH
G
J
B
D
E
F
L
C
1-2
1-3
1-4
1-1
1-6
1-5
2-2
2-1
2-3
Cladograma total
M
A
IH
G
J
B
D
E
F
L
C
M
A
IH
G
J
B
D
E
F
L
C
1-2
1-3
1-4
1-1
1-6
1-5
2-2
2-1
2-3
Cladograma total
27
A análise de clado aninhado foi aplicada na rede de acordo com as
regras de Templeton et al. (1995) e revelou que dois níveis de aninhamento
foram necessários antes do cladograma total. Os haplótipos foram agrupados
em seis clados de primeiro nível e três clados de segundo nível (Fig. 4). O
haplótipo M encontrado nas populações da Floresta Amazônica foi restrito ao
clado 2-1. Enquanto isso, os 11 haplótipos encontrados nas populações da
Floresta Atlântica foram distribuídos nos clados 2-2 e 2-3.
O clado de segundo nível 2-2 contém dois clados de primeiro nível
aninhado: um clado de interior (1-6) e um clado de extremidade (1-2). O clado
de interior 1-6 consiste dos haplótipos I e F encontrados nas populações VRB e
TLM, respectivamente. O clado 1-2 da extremidade também foi formado por
dois haplótipos H e G, sendo o haplótipo H encontrado na população de RAP e
o haplótipo G distribuído em quatro populações (TVI, TCE, VRB e RAP).
O clado de segundo nível 2-3 é formado por três clados de primeiro nível:
1-3, 1-4 e 1-5. O clado de extremidade 1-3 consiste do haplótipo raro J
encontrado na população VRB e do haplótipo B encontrado com grande
freqüência na população GUA. O clado de extremidade 1-4 foi formado pelos
haplótipos E e D, que foram compartilhados por três (RAP, GUA e VRB) e duas
(VRB e TVI) populações, respectivamente. O clado de interior 1-5 consiste do
haplótipo ancestral A, amplamente distribuído, e dos haplótipos raros C e L.
Análise de clados aninhados (NCA)
A análise de contingência aninhada para associações geográficas está
demonstrada na Tabela 2. Clados sem variação de localização geográfica não
28
necessitam de serem testados (Templeton, 1998) e, portanto não foram
incluídos nas análises.
TABELA 2. Análise aninhada de contingência exata das associações geográficas
obtidas com Geodis 2.5, geradas a partir de 10.000 permutações aleatórias. A rede de
haplótipos e o desenho de clado aninhado foram aqueles mostrados na Fig. 4.
Somente clados com variação geográfica ou genética foram testados. Clados com um
valor de probabilidade menor que 0.05 sugerem uma associação significativa entre
haplótipos / subclados com localidade.
Clados Estatística de χ
2
Probabilidade
1-2 7,2000 0,1533
1-3 9,0000 0,1128
1-4 7,0000 0,2008
1-5 44,8120 0,1178
1-6 5,0000 0,1010
2-2 13,7889 0,0061*
2-3 37,7469 0,0244*
Cladograma Total 143,0406 0,0000*
* significativo ao nível de 0.05
Esta análise comparou a hipótese nula de nenhuma associação entre
estrutura da rede e distribuição geográfica dos haplótipos contra a hipótese
alternativa de que os componentes da rede são agrupados de acordo com suas
localizações geográficas. A hipótese nula não pode ser rejeitada para os clados
de primeiro nível. A não rejeição da hipótese nula implica que os membros dos
clados de primeiro nível foram agrupados ao acaso e não de acordo com suas
localizações geográficas. Por outro lado, a rejeição da hipótese nula para os
clados de segundo nível e cladograma total, indica que os haplótipos estão
agrupados de acordo com um padrão geográfico.
Os resultados da análise de distância geográfica para o conjunto de
dados de cpDNA de Psychotria ipecacuanha estão apresentados na Tabela 3.
29
TABELA 3. Resultado da análise de clado aninhado. Para cada clado são listados os
membros e suas posições na rede, as distâncias correspondentes ao clado (D
c
), ao
clado aninhado (D
n
) e o contraste interior-extremidade (I-E). São indicadas as
distâncias significativamente menores (S) ou maiores (L) juntamente com seus níveis
de significância P < 0.05, onde P é a probabilidade de um valor gerado ao acaso ser
igual ou menor (maior) que o valor observado.
Clado Membros
do clado
Posição D
c
P D
n
P
1-2
G
H
I-E
I
E
─
34,44
0
34,44
-0,092
-0,362
+0,464
42,96
133,18
L
-90,22
S
-0,092
+0,046
-0,046
1-3
B
J
I-E
I
E
─
0
0
0
-0,112
+1,000
-0,112
8,39
43,45
-35,05
-0,112
+0,112
-0,112
1-4
D
E
I-E
I
E
─
47,01
62,68
-15,66
-0,488
+0,375
-0,403
50,30
61,59
-11,29
-0,317
+0,375
-0,373
1-5
A
C
L
I-E
I
E
E
─
205,56
L
0
0
205,56
L
+0,030
-1,000
-1,000
+0,030
204,30
L
55,14
96,02
128,72
L
+0,027
-0,096
-0,309
+0,021
1-6
F
I
I-E
I
E
─
0
0
0
-0,101
-0,396
+0,3960
36,23
119,55
-83,31
-0,101
+0,101
-0,101
2-2
1-2
1-6
I-E
E
I
─
50,73
55,61
4,88
-0,451
+0,439
+0,440
50,53
55,74
5,21
-0,318
+0,373
+0,373
2-3
1-3
1-4
1-5
I-E
E
E
I
─
14,07
S
56,04
185,72
153,29
L
-0,000
-0,220
+0,349
+0,024
92,89
69,45
S
183,64
101,00
-0,192
-0,047
+0,261
+0,074
CT
2-1
2-2
2-3
I-E
E
I
E
─
52,49
S
167,03
S
83,61
S
93,79
-0,000
-0,000
-0,000
+0,128
819,30
S
863,26
S
924,00
-25,840
-0,011
-0,030
+0,050
-0,186
I, interior; E, extremidade; CT, cladograma total. Probabilidades com valores maiores
(+) ou menores (-) que o valor esperado, obtidas com 10000 permutações aleatórias.
30
A análise incluiu estimativa dos parâmetros de distâncias geográficas
(D
c
, D
n
, e I-E) entre haplótipos ou clados que foram utilizados para interpretar
processos históricos e contemporâneos de acordo com a chave de Templeton
(2004). A Tabela 4 demonstra a cadeia de inferência correspondente para cada
clado aninhado que apresentou estrutura genética espacial significativa,
evidenciada pela significância de qualquer um dos três parâmetros de distância.
TABELA 4. Análise de contingência aninhada das associações geográficas e
inferências filogeográficas realizadas da análise de haplótipo aninhada de Psychotria
ipecacuanha. Apenas clados demonstrando associações significativas entre haplótipos
e geografia e/ou subclados foram analisados.
Clados Chave do clado* Inferências
1-2 (G-H) 1 - 2: não - 11:
não -17: não
Resultado inconcluso
1-5 (A, C, L) 1, 2
c
, 3: não, 4:
não
Fluxo gênico restrito com
isolamento por distância
2-3 (B, J/ D-E/ A, C, L) 1 - 2
a, d
- 3: não –
4: não
Fluxo gênico restrito com
isolamento por distância
Cladograma Total
(G-H/ F, I/ B, J/ D-E/ A, C, L)
1 - 2
b
- 3
c
- 5
a
, b -
15: sim - 16: sim
Fragmentação alopátrica
*Os números indicam a escolha feita na chave dicotômica de Templeton (2004). As
letras sobrescritas referem para subseções dos parágrafos numerados
consecutivamente da chave de Templeton (2004).
Dentro da extensão geográfica da Floresta Atlântica não foram obtidos
parâmetros de distâncias estatisticamente significativas para os clados 1-3, 1-4,
1-6 e 2-2, excluindo então qualquer inferência nestes níveis de aninhamento.
Por outro lado, parâmetros significativos foram encontrados em todos os níveis
de aninhamento (1-2, 1-5, 2-3 e cladograma total), demonstrando que a
31
hipótese nula de que não haveria associação entre haplótipos e geografia foi
claramente rejeitada.
As inferências para os clados 1-5 e 2-3 revelaram fluxo gênico restrito
com isolamento por distância, sendo, portanto o processo que mais contribuiu
para a distribuição espacial dos haplótipos de cpDNA nas populações da
Floresta Atlântica que se encontram nesses clados. Em nível de cladograma
total, a fragmentação alopátrica é inferida como processo primário responsável
pela diferenciação entre as populações da Floresta Amazônica (clado 2-1) e as
populações da Floresta Atlântica (clados 2-2 e 2-3) na atualidade. Esta
inferência é apoiada por (i) dispersão restrita significativa (D
c
) da Floresta
Amazônica, clado da extremidade 2-1; e (ii) a completa separação do clado 2-1
dos demais clados no grupo aninhado ao longo da Floresta Atlântica.
32
DISCUSSÃO
Inferência da história demográfica entre as florestas Atlântica e
Amazônica
Análise filogeográfica de Psychotria ipecacuanha foi realizada em dois
tipos florestais onde esta espécie ocorre naturalmente: Floresta Atlântica e
Floresta Amazônica. As análises filogeográficas demonstraram que os 107
indivíduos foram separados em dois grupos que coincidem com as duas
florestas: (i) clado 2-1 constituído pelas populações da Floresta Amazônica e (ii)
clados 2-2 e 2-3 formado pelas populações da Floresta Atlântica.
Uma propriedade da NCA é que a polaridade temporal dos clados na
rede pode ser combinada com medidas de distâncias associadas com padrões
de dispersão, expansão e colonização para inferir a direção desses movimentos
(Templeton, 2002). Por exemplo, haplótipos que se dispersam de uma
população ancestral serão mais derivados (descendentes) e provavelmente
aparecerão como haplótipos ou clados em posição na extremidade da rede,
uma expectativa apoiada pela teoria da coalescência (Castelloe e Templeton,
1994). O haplótipo M, único e exclusivo da Floresta Amazônica, está na
extremidade da rede, sugerindo ser um haplótipo mais recente (derivado) e
conectado por sete eventos de mutação ao haplótipo A, mais antigo (ancestral)
e presente nas populações da Floresta Atlântica. Este cenário, aliado ao
número de haplótipos encontrado em cada floresta, indica que as populações
33
de Psychotria ipecacuanha da Floresta Amazônica são mais recentes que as
populações da Floresta Atlântica.
O padrão de distribuição espacial e temporal dos haplótipos de
Psychotria ipacacuanha pode ser atribuído às diferenças históricas das duas
florestas. Grande parte da zona de contato do cerrado com a Floresta
Amazônica apresenta uma depressão geomorfológica com altitude variando de
100 a 500 m, sendo possível que, durante os períodos mais secos do
Quartenário, essa conexão tenha sofrido mudanças drásticas, com efeito
negativo na flora da Floresta Amazônica ali presente (Ab’Saber, 1983; 1988;
Silva, 1996; Salgado-Labouriau, et al., 1997). Este processo pode ter
ocasionado um gargalo gênico e induzido a colonização por um número
pequeno de indivíduos (efeito fundador) nas populações de Psychotria
ipecacuanha da Floresta Amazônica. Diferentemente, a região de conexão
entre o cerrado e a Floresta Atlântica parece ter sido menos influenciada pelas
mudanças climáticas do Quartenário (Brown e Ab’Saber, 1979), o que pode ter
favorecido a manutenção das populações de Psychotria ipecacuanha na
Floresta Atlântica e, consequentemente, preservado a diversidade genética
existente na espécie.
A existência de padrões de distribuição disjunta em várias espécies de
plantas da Floresta Atlântica e Floresta Amazônica sugerem a possibilidade de
conexão entre as floras destas florestas no passado, através de conexões que
se estendiam pelo cerrado (Rizzini, 1963; Prance, 1982). Com base no atual
padrão filogeográfico molecular identificado para Psychotria ipecacuanha,
propomos algumas hipóteses de migração histórica para explicar a presente
34
distribuição disjunta da espécie nas florestas Atlântica e Amazônica: (i) o habitat
da espécie se constituía em um contínuo que foi fragmentado com as
oscilações climáticas, resultando na extinção da espécie na faixa intermediária
entre as duas florestas. Se esta hipótese fosse verdadeira a diversidade
genética de haplótipos seria alta nas duas florestas; (ii) a região que hoje se
constitui o cerrado, poderia ter sido habitado pela espécie antes da
fragmentação das florestas Atlântica e Amazônica e a partir dai a migração ter
ocorrido em direção às duas florestas. Esta hipótese também não explica a
baixa diversidade encontrada na Floresta Amazônica. A não ser que durante a
migração em direção a Floresta Amazônica a espécie tenha sofrido repetidos
ciclos de retração e expansão, ocasionando o efeito fundador, e o mesmo
evento não teria ocorrido na rota em direção a Floresta Atlântica, já que a
mesma apresenta alta diversidade de haplótipos; (iii) o centro de diversidade
para a espécie seria a Floresta Amazônica e a migração teria ocorrido deste
centro em direção a Floresta Atlântica. Esta hipótese é fortemente rejeitada pelo
padrão filogeográfico revelado neste estudo que sugere uma colonização
relativamente recente para Psychotria ipecacuanha na Floresta Amazônica; (iv)
o centro de diversidade para a espécie seria a Floresta Atlântica e a migração
teria ocorrido da Floresta Atlântica em direção a Floresta Amazônica. Esta
hipótese é fortemente apoiada pelo padrão filogeográfico revelado neste estudo
para Psychotria ipecacuanha.
Cabrera e Willink (1973) mencionaram que as florestas de Galeria
presentes na região do cerrado formam atualmente uma rede de conexão entre
as florestas Atlântica e Amazônica. Porém, para Psychotria ipecacuanha esta
35
conexão não é possível, uma vez que as florestas de galeria são de pequenas
extensões e, portanto, não propícia para ocorrência da espécie em estudo.
Durante expedições de coleta de campo, foi observado que a espécie sofre
drásticas conseqüências com a fragmentação, ou seja, é extinta ou em via de
extinção em habitats de extensões pequenas, justificando assim sua não
ocorrência nas florestas de galeria.
A fragmentação alopátrica foi inferida como o principal processo
influenciando a distribuição espacial dos haplótipos no cladograma total. Para
existir uma evidência de fragmentação alopátrica, as linhagens gênicas devem
estar separadas por vários eventos de mutação e por algum tipo de barreira
geográfica (Avise, 2000), conforme observado nas populações de Psychotria
ipecacuanha: (i) o clado 2-1 da Amazônia esta separado do clado 2-3 por seis
haplótipos intermediários (hipotéticos), que podem ter sido extintos durante os
eventos de expansão e contração das populações no processo de colonização
e ou estão em uma freqüência tão baixa que não puderam ser amostrados; (ii) a
Floresta Atlântica encontra-se atualmente separada da Floresta Amazônica por
uma grande extensão geográfica de 1.500 km, o cerrado, que ocupa a região
intermediária entre a Floresta Amazônica e a Floresta Atlântica, constituindo-se
em uma barreira geográfica para o intercâmbio de muitas espécies entre estas
duas florestas (Costa, 2003). Esta barreira física pode ter reduzido o fluxo
gênico (migração) entre as populações de Psychotria ipecacuanha.
36
Estrutura filogeográfica de Psychotria ipecacuanha na Floresta Atlântica
De acordo com Tzedakis et al. (2002) e Huang et al. (2004) uma área
demonstrando alta diversidade genética implica que: (i) esta área pode ter sido
um refúgio, ou seja, uma área que durante as flutuações climáticas, manteve-se
como um habitat estável, e pode ter favorecido a manutenção da diversidade
genética; ou (ii) esta área pode ser uma zona intermediária que recebe
organismos de diferentes fontes resultando em alta diversidade genética em
relação às fontes originais. No primeiro caso, os haplótipos dentro desta área
são proximamente relacionados, enquanto que no caso posterior podem ser
incluídos haplótipos mais distantes. A maior diversidade genética de Psychotria
ipecacuanha encontra-se nas populações da Floresta Atlântica e, portanto, esta
área pode ser o centro de diversidade genética da espécie e, provavelmente, foi
um refúgio no Brasil para Psychotria ipecacuanha durante o Quartenário. O
haplótipo ancestral, identificado na Floresta Atlântica não se sobrepõe ao
haplótipo derivado encontrado na Floresta Amazônica, estando, portanto,
localizados em regiões geográficas distintas. Rowe et al. (2004) propõem que
haplótipos ancestrais devem estar próximos a refúgios, enquanto que os
derivados são mais prováveis de ocorrerem nas extremidades conduzindo a
expansão, reforçando assim que a Floresta Atlântica se constitui em um refúgio
para Psychotria ipecacuanha.
O fluxo gênico é um importante componente da estrutura genética das
espécies, pois reduz a divergência genética entre as populações (Nason, et al.,
1997). O fluxo gênico restrito com isolamento por distância foi inferido como o
principal processo influenciando a distribuição espacial dos haplótipos na
37
Floresta Atlântica. O compartilhamento de haplótipos na Floresta Atlântica,
ocorreu entre a maioria das populações. O haplótipo ancestral “A” foi
compartilhado entre dez populações das doze analisadas, evidenciando a
existência de fluxo gênico. Porém dentre os dez haplótipos derivados (mais
recentes) sete foram exclusivos (B, C, F, H, I, J, L) a determinadas populações,
sugerindo que o fluxo gênico é limitado, pois a presença de haplótipos
exclusivos reforça a inferência de isolamento por distância. Segundo Wright
(1943), populações separadas por longas distâncias e com limitado fluxo gênico
podem tornar-se diferenciadas geneticamente uma das outras pelo processo de
“isolamento por distância”. A ocorrência de fluxo gênico restrito entre as
populações da Floresta Atlântica, pode ser justificada pela fragmentação de seu
habitat que tem ocasionado à subdivisão das populações, tornando-as isoladas
umas das outras e assim dificultando o intercâmbio de pólen pelos agentes
polinizadores. Por outro lado, a fragmentação pode também ter ocasionado a
redução ou extinção dos agentes polinizadores e dos pássaros dispersores de
sementes, limitando ainda mais o fluxo gênico entre as populações de
Psychotria ipecacuanha.
Estrutura filogeográfica de Psychotria ipecacuanha na Floresta Amazônica
A ausência de variação de haplótipos dentro e entre as onze populações
da Floresta Amazônica analisadas, reforça a hipótese de que essas populações
são derivadas de uma colonização relativamente recente. Ao invés de serem
relíquias de uma ampla Floresta Tropical Úmida que cobria toda extensão
geográfica da área de coleta e que, subsequentemente, tornou-se fragmentada,
38
dando origem a manchas de florestas úmidas (refúgios) durante as fases
geralmente secas do Cenozóico (Terciário e Quartenário). Van der Hammen e
Hooghiemstra (2000), revisando a história da vegetação e do clima da Floresta
Amazônica no Terciário Tardio e no Quartenário, estimaram que as chuvas
durante o Último Máximo Glacial podem ter-se reduzido em 30-50%, levando a
uma substancial retração das florestas pluviais úmidas e à formação de refúgios
florestais. Se a hipótese de refúgios na Floresta Amazônica for verdadeira para
Psychotria ipecacuanha, e assumindo que a espécie já ocorria na Floresta
Amazônica com ampla distribuição e era polimórfica para haplótipos de cpDNA,
seria mais provável que as atuais populações fossem fixadas ou quase fixadas
para diferentes haplótipos devido ao efeito ao acaso da deriva genética em
populações fragmentadas, e apresentaria uma diversidade de haplótipos.
Dessa forma, os resultados do presente trabalho, sugerem a não ocorrência de
refúgios para a espécie na Floresta Amazônica. Os resultados reforçam o
proposto por alguns estudos que as florestas da Amazônia jamais foram
afetadas por condições climáticas secas e, portanto, nunca sofreram
fragmentação por vegetação intermediária (Colinvaux et al., 2000; Colinvaux e
de Oliveira 2000; 2001; Jones, 2001). Adicionalmente, os dados podem ainda
indicar que populações de Psychotria ipecacuanha não ocorriam nesta região
no período em que se deu a formação dos refúgios e, consequentemente,
possuem baixa diversidade genética.
39
Conclusões e implicações para conservação
O padrão de diversidade genética revelada neste estudo permite também
subsidiar a elaboração de estratégias de conservação e manejo da espécie.
Atualmente, Psychotria ipecacuanha é uma espécie ameaçada, por ter sofrido
intenso extrativismo nos dois séculos passados e por ter suas áreas de
ocorrência natural reduzidas no presente. Portanto, sua conservação tem
atualmente sido alvo de muitas preocupações. As principais ameaças para esta
espécie incluem a perda de habitat, degradação e fragmentação, com
conseqüente isolamento das populações, como já detectado por Oliveira e
Martins (2002).
A importância da diversidade genética para a persistência a longo prazo
de populações e espécies, já foi reconhecida (Young e Clarke, 2000; Frankham
et al., 2002; Frankham, 2005). Nossos resultados indicam a Floresta Atlântica
como o maior centro de diversidade genética para Psychotria ipecacuanha.
Esta área geográfica atuou como um refúgio no passado, e tem sido local de
vários processos evolutivos que estão entre os mais influentes da história desta
espécie, tais como expansão, colonização de novas áreas e intercâmbio de
material genético. Portanto, proteger este reservatório de diversidade genética é
de grande importância para conservação da espécie.
Os dados demonstraram ainda que a baixa variabilidade genética das
populações localizadas na Floresta Amazônica é de origem histórica, ocorrida
durante o processo de disjunção das florestas Atlântica e Amazônica. A não
ocorrência de fluxo/dispersão gênico pode ser sugerida pela revelação de
haplótipos privativos para cada floresta e pela quantidade de mutação que os
40
separam, com ausência de haplótipos intermediários. Portanto, apesar das
populações de Psychotria ipecacuanha da Floresta Amazônica não
apresentarem diversidade genética quanto a haplótipos de cpDNA, é
necessário a conservação de amostras desta região, já que o haplótipo M foi
exclusivo para esta floresta.
Os resultados indicam que a estrutura genética de Psychotria
ipecacuanha na Floresta Amazônica é conseqüência de um evento de
colonização recente por poucos indivíduos, que ocasionou uma uniformidade
genética nesas populações. Por outro lado, na Floresta Atlântica, o fluxo gênico
e as condições climáticas favoráveis a espécie, proporcionaram-lhe a
manutenção e o acúmulo da diversidade genética, podendo esta região ser
considerada como um refúgio para a espécie.
41
REFERÊNCIAS
Ab’Saber AN. 1983. O domínio dos cerrados: Introdução ao conhecimento.
Revista do Servidor, 111: 41-55.
Ab’Saber AN. 1988. O pantanal mato-grossense e a teoria dos refúgios.
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CAPÍTULO II
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DA DIVERSIDADE GENÉTICA E
DIFERENCIAÇÃO GEOGRÁFICA ENTRE POPULAÇÕES NATURAIS DE
Psychotria ipecacuanha (RUBIACEAE) NAS FLORESTAS ATLÂNTICA E
AMAZÔNICA
RESUMO
Psychotria ipecacuanha é uma espécie medicinal que no Brasil ocorre
nas florestas Atlântica e Amazônica. Atualmente está ameaçada em
conseqüência do intenso extrativismo sofrido no passado e da fragmentação de
seu habitat no presente. Apesar da grande importância econômica da espécie
como fonte de alcalóides isoquinolínicos, pouco se conhece sobre a diversidade
e a distribuição da variação genética em relação a extensão geográfica em que
ocorre. Marcadores ISSR foram utilizados para detectar a variação genética e a
estrutura populacional em 11 populações de Psychotria ipecacuanha, sendo
cinco da Floresta Atlântica e seis da Floresta Amazônica. Para este estudo
foram selecionados 14 primers de ISSR que produziram um total de 193 bandas
com uma porcentagem de 97,4 de polimorfismo em nível de espécie. As
populações da Floresta Atlântica exibiram níveis de diversidade genética
superiores quando comparada as populações da Floresta Amazônica. A média
49
do G
ST
para as populações dentro da Floresta Atlântica e Floresta Amazônica
foi estimada em 0,306 e 0,425 respectivamente. Da variância molecular total,
65,3% foram atribuídas a divergências regionais entre florestas. O Ф
ST
foi
estimado em 0,341 para a Floresta Atlântica e em 0,432 para a Floresta
Amazônica, indicando que 34,1% e 43,2 % da variabilidade genética está
distribuída entre populações nas respectivas florestas. A estimativa de θ
B
pelo
método Bayesiano dentro das florestas Atlântica e Amazônia (θ
B
= 0,348 e
0,404, respectivamente) foi consistente com os resultados da estrutura genética
da AMOVA, demonstrando que a maior diferenciação genética ocorreu dentro
de populações do que entre populações. Os dendrogramas e a análise de
coordenadas principais foram consistentes na formação de dois clados, os
quais demonstraram um padrão geográfico explicável. O padrão de diversidade
genética apresentado por Psychotria ipecacuanha revelou que: (I) a Floresta
Atlântica seria formada por populações de origem mais antiga em relação a
Floresta Amazônica, e se constitui centro de diversidade para a espécie. (II) a
origem das populações de poaia na Floresta Amazônica seria resultado de
colonizações recentes aos invés de se constituirem de mosaicos de habitats
(refúgios) em consequência de fragmentações passadas de uma população
amplamente distribuída. Apesar da diversidade genética da Floresta Atlântica
ser maior do que a diversidade da Floresta Amazônica, a conservação de
Psychotria ipecacuanha, requer amostragem das duas florestas, devido ao
acúmulo de diferenças genéticas particulares a cada floresta. Os níveis de
50
polimorfismo genético detectado ainda asseguram as práticas de conservação,
apesar do tamanho limitado de muitas populações.
Palavras chaves: Conservação, diversidade genética, diferenciação genética,
ISSR, Psychotria ipecacuanha.
51
INTRODUÇÃO
A conservação de recursos genéticos das florestas tropicais é vital para a
preservação da biodiversidade, pois estas não só mantêm a maior diversidade,
como também permite a ocorrência de um grande número de interações
ecológicas. O desconhecimento dos reais valores dessa biodiversidade tem-se
constituído em obstáculos para o reconhecimento da necessidade de introduzir
estratégias de conservação dos recursos biológicos nos planos nacionais de
desenvolvimento. Nas ultimas décadas, a extinção de várias formas de vida tem
aumentado consideravelmente. Estima-se que aproximadamente 25% das
espécies de plantas vasculares existentes serão extintas nos próximos 50 anos
(Kala, 2000). Muitos fatores estão envolvidos com a extinção das espécies,
como por exemplo, a destruição de habitats e, conseqüentemente, a
fragmentação de populações. A perda de habitat é a principal ameaça à
biodiversidade terrestre e é concentrada nas regiões tropicais, onde a
biodiversidade é máxima (Brooks et al., 2002). A mata atlântica, por exemplo,
está incluída entre os 25 hotspots de biodiversidade para conservação
prioritária (Myers et al., 2000). Historicamente, a destruição de habitats no Brasil
foi mais acentuada nas regiões costeiras do sul-sudeste do país e atualmente
apenas 8% da cobertura vegetal da Floresta Atlântica do leste brasileiro ainda
permanecem (Fundação SOS Mata Atlântica e INPE, 2002). Entretanto áreas
florestadas e relativamente pouco perturbadas estão agora ameaçadas, como
52
por exemplo, na Amazônia. Laurance et al. (2001) prevêem a fragmentação e a
degradação extensiva da Amazônia, a substancial perda da biodiversidade em
torno de 2020. Existem poucos estudos sobre a conservação de germoplasma
de espécies vegetais nativas de ecossistemas tropicais, principalmente em
espécies de porte herbáceo. Um grande número de espécies de plantas
medicinais e aromáticas brasileiras esteve, ou ainda está, sob o impacto de
coleta silvestre intensiva (Garcia et al., 1996), podendo inclusive levar ao seu
desaparecimento local ou extinção.
A perda de populações locais e a subseqüente perda da área de ocupação
para cada espécie resultam em perda da diversidade genética e redução do
potencial evolutivo, características estas que são importantes para a adaptação
das espécies frente a mudanças ambientais (Crandall et al., 2000; Smith et al.,
2001; Hoffmann et al., 2003). Muitos programas de conservação de plantas
raras ou ameaçadas visam manter os níveis existentes de variabilidade
genética, evidenciando a importância de pesquisas em genética de populações
para a conservação (James e Ashburner, 1997). Considerando estes fatores, o
sucesso de qualquer programa de conservação depende do conhecimento da
variabilidade genética existente na espécie.
Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes (Rubiaceae) é mundialmente
conhecida como espécie medicinal. Suas propriedades farmacológicas provêm
de alcalóides ativos presentes em suas raízes. Os alcalóides emetina e cefelina
estão presentes nas raízes de Psychotria ipecacuanha durante todo o decorrer
do ano e praticamente não apresentam variação sazonal (Garcia et al., 2005).
Os indivíduos de Psychotria ipecacuanha são perenes e se desenvolvem em
53
agregados, denominados reboleiras, em áreas de sub-bosque que recebem
baixos níveis de radiação luminosa (Veloso, 1947). A espécie é distílica e
apresenta certo grau de compatibilidade intraforma, embora sua frutificação
seja maior em polinizações legítimas (Rossi et al., 2005). Psychotria
ipecacuanha pode se reproduzir tanto pela via sexual quanto pela via clonal
(Caminha, 1943; Pio Correia, 1969). Atualmente, a espécie está ameaçada
como conseqüência da fragmentação de seus habitats e do intenso extrativismo
sofrido no passado. No presente, suas áreas de ocorrência natural se
encontram extremamente reduzidas. Psychotria ipecacuanha está listada entre
as espécies ameaçadas de extinção no Estado de Minas Gerais (Mendonça e
Lins, 2000), o único estado brasileiro dentro da área de ocorrência da espécie
que publicou uma lista de conservação de espécies vegetais. Psychotria
ipecacuanha apresenta distribuição disjunta em três grandes áreas: a) Florestas
da América Central (Panamá e Costa Rica) e norte da América do Sul
(Colômbia); b) sul da Floresta Amazônica brasileira (nos Estados de Rondônia e
Mato Grosso; e, c) na Floresta Atlântica (principalmente nos Estados da Bahia,
Minas Gerais, Espírito Santo e Rio de Janeiro) (Veloso, 1947; Assis e Giulietti,
1999). Atualmente, a Floresta Atlântica e a Floresta Amazônica, locais de
ocorrência da espécie e de coleta do material para este estudo, se encontram
isoladas geograficamente por um longo período de tempo devido a uma vasta
savana (o bioma Cerrado) e uma região semi-árida (o bioma Caatinga). O
Cerrado e a Caatinga resultaram em uma grande disjunção de flora e fauna
entre as Florestas Atlântica e Amazônica e, presentemente, pode dificultar ou
54
mesmo impedir a dispersão de espécies e o fluxo gênico entre populações de
uma mesma espécie localizadas nestas duas florestas.
Marcadores ISSR (inter-simple sequence repeat) (Zietklewicz et al.,
1994) são amplamente utilizados em estudos de diversidade genética por não
necessitar de informação prévia da seqüência de DNA, ter baixos custos de
desenvolvimento e os procedimentos laboratoriais podem ser transferidos para
qualquer espécie de planta (Barth et al., 2002). Os primers de ISSRs são
seqüências de microsatélite, ancoradas ou não na extremidade 5’ ou 3’ por
nucleotídeos degenerados. A adição de diferentes bases nas extremidades 5’
ou 3’ torna seu sítio de ligação mais específico e reproduzível (Gupta et al.,
1994; Zietkiewicz et al., 1994; Fang et al., 1997). Os primers de ISSR
amplificam a região entre os dois sítios de ligação. Indels, perda ou ganho de
sítios de ligação dentro da região amplificada são detectados como bandas
polimórficas (Yang et al., 1996). Esta técnica tem demonstrado ser uma
poderosa ferramenta para a investigação da variação genética dentro de
espécies (Wolfe e Liston, 1998). A natureza hipervariável dos marcadores
ISSR e o seu potencial para estudos em nível de populações têm sido
registrados em estudos de populações naturais (Esselman et al., 1999; Culley
e Wolfe, 2001).
Neste estudo a diversidade genética de populações naturais de Psychotria
ipecacuanha das Florestas Atlântica e Amazônica, foi analisada por meio de
marcadores de ISSRs, objetivando responder as seguintes questões: Qual é o
nível de variação de ISSR em Psychotria ipecacuanha? Como a diversidade
55
genética está fracionada dentro e entre as populações de poaia da Floresta
Atlântica? E dentro e entre as populações da Floresta Amazônica? Qual das
duas florestas apresenta maior diversidade genética? Qual a proporção da
diversidade genética compartilhada pelas duas florestas? Qual o efeito da
disjunção das florestas Atlântica e Amazônica na distribuição da diversidade e
na estrutura populacional de Psychotria ipecacuanha? As respostas para estas
questões terão implicações importantes para a eficiência e efetividade na
elaboração de programas de conservação e manejo da espécie.
56
MATERIAL E MÉTODOS
Material Vegetal
Um total de 166 indivíduos representando 11 populações naturais de
Psychotria ipecacuanha foi amostrado em duas florestas brasileiras: Floresta
Atlântica e Floresta Amazônica. Na Tabela 1 encontram-se relacionadas às
populações amostradas em cada floresta, as respectivas localizações
geográficas e o tamanho da amostra por população e por floresta. A distribuição
geográfica das populações pode ser visualizada na Fig. 1.
TABELA 1. Populações de Psychotria ipecacuanha amostradas com as respectivas
abreviações e localizações geográficas.
Populações Código das
Populações
Tamanho
da amostra
Latitude
(S)
Longitude
(W)
FLORESTA ATLÂNTICA 75
Trilha da Lagoa do Meio - PERD TLM 14 19º38’34” 42º30’56”
Trilha do Vinhático - PERD TVI 14 19º45’44” 42º37’57”
Visconde do Rio Branco VRB 15 21°00’37’’ 42°50’26’’
Raposo RAP 17 21º06’40” 42º05’43”
Guaraciaba GUA 15 20º34´14" 43º00´27"
FLORESTA AMAZÔNICA 91
Prata PRA 17 15º30’26” 58º01’50”
Rio Vermelho RVE 15 15º17’38” 57º51’43”
Soroteca SOR 15 15º31’34” 58º 00’42”
Tangará da Serra TAN 15 14º04’38” 57º03’45”
Exu EXU 18 15º40’41” 57º32’03”
Vila Bela da Santíssima Trindade VBS 11 15º00'29" 59º57'02"
57
Na Floresta Atlântica foram amostradas cinco populações. Duas destas
populações, TLM e TVI, estão localizadas no Parque Estadual do Rio Doce, e
encontram-se em grandes áreas de matas conservadas. As outras três
populações; VRB, RAP e GUA; foram amostradas em áreas de propriedade
particular e podem ser consideradas de habitats fragmentados e de pequeno
tamanho.
FIG. 1. Distribuição das populações de Psychotria ipecacuanha amostradas na
Floresta Atlântica (a direita) e na Floresta Amazônica (a esquerda). Os códigos das
populações correspondem aos demonstrados na TABELA 1.
11
10
9
8
6
7
1
2
3
4
5
1- TLM
2- TVI
3- VRB
4- RAP
5- GUA
6- PRA
7- RVE
8- SOR
9- TAN
10- EXU
11- VBS
58
Na Floresta Amazônica, foram amostradas seis populações: PRA, RVE,
SOR, TAN, EXU e VBS. VBS é a que se encontra mais distante
geograficamente, encontra-se a oeste do Pantanal, enquanto que as demais
populações encontram-se ao leste do Pantanal. O pantanal constitui-se em um
isolamento geográfico entre VBS e as demais populações da Floresta
Amazônica. Todas as populações da Floresta Amazônica foram coletadas em
áreas particulares, podendo ser consideradas como sendo de habitats
fragmentados.
Folhas jovens foram coletadas para extração de DNA. O material foliar foi
envolto em papéis molhados para reter a umidade e acondicionado no campo
em sacos plásticos de polietileno. Posteriormente, o material foi armazenado a
–80ºC, no laboratório de sequenciamento de DNA (seqDNA).
Extração de DNA total
DNA genômico total foi extraído de aproximadamente 100 mg de folhas
jovens usando protocolo de CTAB descrito por Doyle & Doyle (1987), com
poucas modificações. O tecido foliar foi macerado em almofariz na presença de
nitrogênio líquido. O material foi transferido para microtubos de 2 mL de
capacidade, ao qual foram adicionados 800 μL de tampão de extração CTAB
(100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M cloreto de sódio; 20 mM EDTA; 2 % CTAB;
2% polivinilpirrolidona (PVP) e 2% β-mercaptoetanol) e incubado a 65
0
C por 5
minutos. A seguir, foram adicionados 700 μL de clorofórmio:álcool isoamílico
24:1 (v:v). Os tubos foram agitados por 1 minuto em vórtex e centrifugados a
59
13.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo
e precipitado com o mesmo volume de isopropanol gelado por 12 horas. Após
este período, o material foi centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos, e o
precipitado foi lavado uma vez com etanol 70% e uma vez com etanol95 %.
Depois da secagem por 15 minutos em temperatura ambiente, o precipitado foi
ressuspendido em 200 μL de TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0)
contendo RNAse (40 μg/mL) e a solução incubada a 37ºC por 30 minutos.
Posteriormente, a solução foi precipitada com a adição de acetato de amônio
7,5 M na proporção 1:10 (acetato:DNA ressuspendido) e 2/3 do volume de
isopropanol gelado por 4 horas. A seguir, o material foi centrifugado a 13.000
rpm por 10 minutos. O precipitado foi lavado uma vez com etanol 70% e uma
vez com etanol 95% e ressuspendido em 40-60 μL de TE. A qualidade e a
concentração do DNA foram confirmadas por eletroforese em gel de agarose
0,8% com marcador de DNA λ. As soluções estoque foram preparadas por
diluições com água Milli-Q autoclavada de forma a se obter uma solução de
trabalho com concentração final de aproximadamente 10 ng/μL de DNA
genômico.
Seleção de primers e otimização do PCR
Um conjunto contendo 100 primers de ISSR foi obtido da Universidade
de British Columbia (UBC set nº 9). Todos os primers foram testados para
amplificação inicial em duas amostras da Floresta Atlântica e duas amostras da
Floresta Amazônica. Com base no padrão de amplificação das quatro amostras
60
25 primers foram selecionados. A seguir foram otimizadas as condições para
detectar ISSRs nestas quatro amostras. Os efeitos da concentração de primer
(0,15; 0,20; 0,25 e 0,33 μM), DNA template (20, 40, 80 e 120 ng), MgCl
2
(2; 2,5
e 3 mM), formamida (1,5; 2, 2,5%) e a influência da temperatura de anelamento
(gradiente de 45- 56ºC) na reprodutibilidade do padrão de bandeamento foram
analisados.
A otimização dos primers foi determinada por avaliações visuais dos
padrões de bandeamento para intensidade, polimorfismo e repetitividade.
Todos os parâmetros avaliados afetaram o padrão de bandeamento. Utilizando-
se os 25 primers e as condições otimizadas selecionou-se 14 primers que
produziram maior número de bandas confiáveis e polimorfismo reproduzível
para as análises definitivas. Seqüências e características destes primers estão
mostradas na Tabela 2.
PCR - Amplificação de ISSR
Amplificações foram realizadas em um volume total de 20 μL contendo:
10 mM Tris-HCl (pH8,3); 50 mM KCl; 0,1% de tween 20; 2,5 mM MgCl
2
; 0,2 mM
de cada dNTP; 0,2 μM de primer, 0,75 U de Taq DNA polimerase, 2%
formamida, aproximadamente 30 ng de DNA template e água Milli-Q. As
amplificações foram conduzidas em termociclador GeneAmp PCR System 9700
(Applied Biosystems) sob as seguintes condições: 1 ciclo inicial de
desnaturação a 94°C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 94ºC por 45
segundos, 45-53
0
C (dependendo do primer utilizado) por 45 segundos e 72
0
C
por 1,5 minutos e 1 ciclo de extensão final de 72
0
C por 7 minutos. Os produtos
61
de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% em
tampão de corrida TBE 1X (89,15 mM de Tris Base; 88,95 mM de Ácido Bórico
e 2,23 mM EDTA), em voltagem constante de 110 V por quatro horas. A
coloração do gel foi feita com brometo de etídeo (0,6 ng/mL). Os tamanhos dos
fragmentos amplificados foram estimados, por comparação, com o marcador
molecular de 100 pb DNA Ladder (Invitrogen). Em seguida, o gel foi fotografado
sob luz ultravioleta usando o sistema de fotodocumentação Eagle Eye II
(Stratagene).
TABELA 2. Primers usados para amplificação de ISSR em 166 indivíduos de
Psychotria ipecacunha amostrados em 11 populações. Temperatura de anelamento
(Tm), número de bandas (NB) e porcentagem de bandas polimórficas (PBP).
Primer NB (PBP)
Código Seqüência
(5’- 3’)
*
Tm
(ºC)
Espécie Floresta
Atlântica
Floresta
Amazônica
UBC 801 (AT)
8
T 50 11 (100) 09 (88,9) 09 (100)
UBC 814 (CT)
8
A 46 14 (100) 07 (71,4) 12 (91,7)
UBC 824 (TC)
8
G 48 13 (100) 13 (100) 05 (40,0)
UBC 834 (AG)
8
YT 45 19 (89,5) 17 (70,6) 16 (81,2)
UBC 835 (AG)
8
YC 52 15 (100) 14 (100) 12 (75,0)
UBC 836 (AG)
8
YA 46 13 (92,3) 11 (72,7) 08 (75,0)
UBC 845 (CT)
8
RG 46 16 (100) 13 (100) 13 (100)
UBC 848 (CA)
8
RG 52 10 (100) 06 (83,3) 09 (66,7)
UBC 850 (GT)
8
YC 46 13 (100) 12 (83,3) 08 (87,5)
UBC 855 (AC)
8
YT 53 15 (100) 09 (77,8) 12 (58,3)
UBC 866 (CTC)
6
52 12 (100) 12 (100) 10 (70,0)
UBC 873 (GACA)
4
48 08 (100) 06 (100) 08 (75,0)
UBC 880 (GGAGA)
3
45 17 (88,2) 15 (73,3) 13 (61,5)
UBC 891 HVH(TG)
7
53 17 (100) 16 (93,3) 15 (60,0)
Total 193 (97,4) 160 (86,9) 150 (75,3)
*Y = C ou T; R = A ou G; H = A, C ou T; V = A, C ou G
62
Análise dos dados
Os fragmentos de ISSR foram codificados como caracteres binários:
presença (1) ou ausência (0) de bandas. Apenas bandas robustas e
inequívocas foram avaliadas. Bandas com intensidade fraca ou coalescentes
com outras bandas foram excluídas. As bandas que se apresentaram
monomórficas para todas as amostras foram descartadas das análises
posteriores.
Os dados da matriz de presença/ausência foram analisados utilizando o
programa POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) para estimar os seguintes
parâmetros de diversidade: porcentagem de locos polimórficos (P), índice de
diversidade de Shannon (I) e a diversidade gênica de Nei (H
E
) (Nei, 1973). P, I
e H
E
foram calculados em três níveis: em nível de população, de florestas e de
espécie. Para examinar a estrutura genética populacional entre as populações,
o coeficiente de diferenciação gênica (G
ST
), foi estimado em nível de floresta e
de espécie. A identidade genética e a distância genética entre populações
foram também computadas usando o modelo apresentado em Nei (1978).
A análise de variância molecular (AMOVA) foi usada para revelar a
distribuição da variabilidade genética dentro e entre as populações. Nesta
análise, a diversidade genética total foi particionada em três níveis hierárquicos
distintos: diferença entre florestas, entre populações e entre indivíduos dentro
de população. A AMOVA foi realizada de acordo com Excoffier et al. (1992),
com o auxílio do programa Arlequim 3.01 (Excoffier et al., 2006). A significância
da diferenciação foi testada com 1000 permutações, onde P denota a
63
probabilidade de se observar um valor ao acaso igual ou maior ao valor
observado. Visto que ISSRs são marcadores dominantes e a espécie em
estudo se propaga vegetativamente, os dados também foram analisados
usando o software Hickory versão 1.0.4 (Holsinger e Lewis, 2005), baseado em
um método Bayesiano (Holsinger et al., 2002) que não requer pressuposições
sobre o sistema reprodutivo e o equilíbrio de Hardy-Weinberg. No programa
Hickory a diversidade genética (H
B
,
análogo ao H
E
) e a diferenciação
populacional (θ
β
, análogo ao Ф
ST
) foram determinadas com cinco repetições de
cada um dos quatro diferentes modelos (full model, f = 0 model, theta = 0 model
e f free model) para assegurar a consistência dos resultados. A escolha do
modelo foi baseada no Deviance Information Criterion (DIC) (Spiegelhalter et
al., 2002). Modelos com menores DIC são preferidos, mas diferenças maiores
que seis unidades no DIC entre os diferentes modelos são requeridas para
indicar que há favorecimento de um modelo sobre o outro (Holsinger e Lewis,
2005).
O programa NTSYS-pc (Rohlf, 2005) foi empregado para a realização da
análise de agrupamento baseado na média aritmética entre pares não
ponderados (UPGMA), empregando o coeficiente de Dice que é similar ao
coeficiente de Nei e Li (1972). O coeficiente de Dice é definido como
2a/2a+b+c, onde a é soma das duplas presenças, para dois setores
comparados (1-1) com peso duplo tanto no numerador quanto no denominador,
b e c são os pares discordantes entre os setores, correspondendo as duas
combinações de presença e ausência (1-0; 0-1). O índice de similaridade de
64
Dice não atribui qualquer significado genético para a coincidência de ausência
de bandas.
Para construir fenogramas representativos das distâncias genética entre
populações, a matriz dos valores de F
ST
par-a-par das populações foi gerada
usando o Arlequin 3.01 (Excoffier et al., 2006), bem como a matriz das
distâncias genéticas de Nei (1978) pelo POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999). As
respectivas matrizes foram importadas para o MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004)
para construir dendrogramas pelos métodos do vizinho mais próximo (NJ) e
UPGMA, respectivamente. A significância dos agrupamentos foram testados
pelo coeficiente de correlação cofenética (CCC), calculado entre os elementos
da matriz original e os da matriz cofenética com o NTSYS-pc (Rohlf, 2005). O
suporte para cada nó foi testado usando 1000 replicações de bootstrap no
programa Phylip 3.66. O teste de Mantel (Mantel, 1967) como implementado na
rotina de MXCOMP com NTSYS-pc (Rohlf, 2005), com 900 permutações, foi
realizado para investigar a correlação entre F
ST
e a matrizes cofenética
baseada na distância da Diversidade Genética de Nei e na Identidade Genética
de Nei. O teste de Mantel foi utilizado também para investigar a correlação
entre distância genética (dada pela estimativa de F
ST
) e a distância geográfica
das populações amostradas. A matriz de distância geográfica foi gerada
calculando a distância em kilômetros entre todas as 11 populações, utilizando
as coordenadas geográficas. O teste de Mantel produz uma correlação (r) que
varia de -1 para +1 e representa a relação entre duas matrizes. Este teste
compara o Z observado com o Z randômico. Para valores de r negativos,
65
quanto mais baixa é a frequência de Z
rdm
≤ Z
obs
, mais alta é a correlação (r)
entre as duas matrizes. Para valores de r positivos, quanto mais baixa é a
frequência de Z
rdm
≥ Z
obs,
mais alta é a correlação (r) entre as duas matrizes.
66
RESULTADOS
Polimorfismo revelado por marcadores de ISSR
Foram analisados 100 primers de ISSR em dois indivíduos selecionados
ao acaso em cada uma das duas florestas. Durante o processo de análise,
foram examinados visualmente as imagens dos géis de eletroforese e
comparados os efeitos que os fatores testados tiveram sobre o padrão de
bandeamento. Os fatores avaliados foram: concentração de magnésio e
formamida, temperatura de anelamento durante a amplificação,
reprodutibilidade, intensidade e número de produto amplificado. Posteriormente,
foram selecionados 14 primers para analisar todas as populações incluidas
neste estudo (Tabela 2). As bandas fracas ou coalescentes foram
desconsideradas das análises. Os 14 primers selecionados produziram um total
de 193 bandas, que variaram entre 400 pb a aproximadamente 2,1 kb,
correspondendo a uma média de 13,8 bandas por primer (Tabela 2). Dos 193
locos investigados 97,4% foram polimórficos em nível de espécie. Cinco bandas
foram monomórficas para todos os 166 indivíduos e foram descartadas das
análises posteriores. Cada indivíduo demonstrou um fenótipo particular de
ISSR. Comparações dos dados revelaram notáveis diferenças entre as duas
florestas. A Floresta Amazônica, quando comparada a Floresta Atlântica,
demonstrou menor número de bandas (150 contra 160), menor porcentagem de
67
bandas polimórficas (75,3% contra 86,9%), menor número de bandas
exclusivas (33 contra 43), e menor número de bandas raras (29 contra 49).
Para este estudo, bandas raras são aquelas nas quais a frequência é menor
que 10% do número total de bandas em cada floresta. A comparação do padrão
de bandeamento entre as populações das Florestas Atlântica e Amazônica
indicou que 39,4% das bandas foram únicas para cada floresta.
Diversidade genética dentro de populações
A estimativa da diversidade genética em nível de espécie e de tipo de
floresta está resumida na Tabela 3. O índice de diversidade gênica de Shannon
(I) em nível de espécie foi de 0,510. A heterozigosidade esperada (H
E
) foi de
0,345 quando o equilíbrio de Hardy-Weinberg e o modelo de cruzamento ao
acaso foram assumidos (F=0). H
E
foi, assim, similar a estimativa de H
B
(0,355)
que não assume o equilíbrio de Hardy-Weinberg e nem pressuposições sobre o
sistema reprodutivo da espécie. Correlações significantes foram encontradas
entre as estimativas de H
E
e H
B
(r
2
= 0,966; P < 0,01), entre as estimativas de
H
E
e I (r
2
= 1,000; P < 0,01), e entre as estimativas de H
B
e I (r
2
= 0,966; P <
0,01).
Quando as análises foram realizadas em nível de florestas, a
porcentagem de polimorfismo (P) foi de 73,94 para a Floresta Atlântica, quando
considerada como um grupo e de 42,87 como uma média das populações. Na
Floresta Amazônica, a porcentagem de polimorfismo foi menor (60,11) quando
considerada como um grupo e como a média de suas populações (26,86).
Comparada à Floresta Amazônica, a Floresta Atlântica exibiu níveis de
68
diversidade genética superiores, como demonstrado pelos maiores valores de
H
E
H
B
e I, tanto como uma média das populações, quanto como um grupo.
A média dos valores de H
E
,
H
B
e I, ao nível de população, foram: 0,141 –
0,094; 0,144 – 0,098; e 0,213 – 0,140 para a comparação Floresta Atlântica –
Floresta Amazônia, respectivamente. Ao nível de floresta, os valores de H
E
H
B
e
I para a comparação Floresta Atlântica – Floresta Amazônica foram: 0,204 –
0,162; 0,199 – 0,180; e 0,314 – 0,251, respectivamente.
TABELA 3. Diversidade genética dentro de populações.
Populações N P (%) H
E
H
B
I
FLORESTA ATLÂNTICA
TLM 14 40,96 0,138 0,131 0,207
TVI 14 40,96 0,131 0,135 0,197
VRB 15 47,87 0,151 0,162 0,230
RAP 17 45,74 0,157 0,152 0,236
GUA 15 38,83 0,129 0,138 0,194
Média 42,87 0,141 0,144 0,213
Grupo 75 73,94 0,204 0,199 0,314
FLORESTA AMAZÔNICA
PRA 17 34,04 0,131 0,123 0,192
RVE 15 27,66 0,098 0,096 0,148
SOR 15 27,66 0,089 0,094 0,134
TAN 15 29,26 0,094 0,107 0,143
EXU 18 25,00 0,088 0,089 0,131
VBS 11 17,55 0,064 0,077 0,094
Média 26,86 0,094 0,098 0,140
Grupo 91 60,11 0,162 0,180 0,251
Espécie 166 100,00 0,345 0,355 0,510
N, tamanho da amostra; P (%), porcentagem de polimorfismo; H
E
diversidade gênica
de Nei (1973) (assumindo o equilíbrio de Hardy-Weinberg); H
B
, estimativa da
diversidade genética pelo método Bayesiano (sem assumir equilíbrio de Hardy-
Weinberg); I
.
, índice de diversidade gênica de Shannon.
69
Dentre as populações da Floresta Atlântica, VRB e RAP apresentaram
maior diversidade genética, como demonstrado pelos maiores valores de H
E
, H
B
e I (H
E
= 0,151 e 0,157; H
B
= 0,162 e 0,152; I = 0,230 e 0,236), enquanto que
GUA apresentou a menor diversidade genética (H
E
= 0,129; H
B
= 0,138 e I =
0,194 ). Na Floresta Amazônia PRA exibiu os maiores indices de diversidade
(H
E
= 0,131; H
B
= 0,123 e I = 0,192), enquanto VBS apresentou os menores
índices (H
E
= 0,064; H
B
= 0,077 e I = 0,094) (Tabela 3).
Diferenciação genética entre populações
A média de G
ST
para as populações dentro da Floresta Atlântica e
Floresta Amazônica foi estimada como 0,306 e 0,425, respectivamente,
indicando que houve diferenciação entre populações dentro de cada região
(Tabela 4). A estimativa da diferenciação genética pelo método Bayesiano na
Floresta Atlântica e na Floresta Amazônica (G
ST
-B = 0,289 e 0,347,
respectivamente) foi consistente com os resultados da estrutura genética de
Nei. A maior diferenciação genética foi encontrada entre as populações da
Floresta Amazônica como indicado pelo maior valor Ф
ST
, θ
β
, G
ST
, e G
ST
-B
(0,432; 0,404; 0,425 e 0,347, respectivamente), quando comparadas aos
valores apresentados entre as populações da Floresta Atlântica (0,341; 0,348;
0,306 e 0,289, respectivamente) (Tabela 4).
Dentre os modelos avaliados para as análises da diversidade genética,
por meio do programa Hickory, o “full model” foi o escolhido por apresentar
menor DIC, em nível de espécie e de floresta. Na Floresta Atlântica o “full
70
model” revelou um DIC de 2021,2 no qual a média do θ
β
, o estimador de F
ST
, foi
0,348 (SD = 0,0192; intervalo de confiança 2,5% = 0,3113 e de 97,5% =
0.3854). Na Floresta Amazônica o menor DIC foi de 1605,9, obtido com o “full
model” (média do θ
β
= 0,4042; SD = 0,0260; intervalo de confiança 2,5% =
0,3556 e de 97,5% = 0,4573). Em nível de espécie, o menor DIC (3832,8)
também foi revelado pelo “full model” (média do θ
β
= 0,6838; SD = 0,0104;
intervalo de confiança 2,5% = 0,6622 e de 97,5% = 0,7031). Os resultados de “f
= 0 model” indicaram que não há nenhuma evidência de desvios das
proporções genotípicas esperadas pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg dentro
das populações nos níveis avaliados. Enquanto que a estimativa do “theta = 0
model” revelou evidências que há subdivisão genética das populações de
Psychotria ipecacuanha.
TABELA 4. Estatística F de Wright para diferenciação genética*.
Ф
ST
θ
B
G
ST
G
ST
-B
Floresta Atlântica 0,341 0,348 0,306 0,289
Floresta Amazônica 0,432 0,404 0,425 0,347
Espécie 0,786 0,684 0,474 0,666
*Ф
ST
= estimativa da diferenciação genética entre populações usando AMOVA; θ
B =
análogo ao Ф
ST
estimado utilizando o full model com o programa Hickory; G
ST
=
diferenciação genética de Nei (1987), calculado com POPGENE 1.31, assumindo o
equilíbrio de Hardy-Weinberg (F
is
= 0); G
ST
-B = análogo ao G
ST
, estimado utilizando o
full model com o programa Hickory (sem assumir o equilíbrio de Hardy-Weinberg).
A AMOVA revelou que 65,3% da variância molecular total foi atribuída
para divergências regionais entre florestas, 13,3% para diferenças
populacionais dentro de cada floresta e 21,4% para diferenças individuais
71
dentro de populações (Tabela 5). Quando a análise de variância molecular foi
realizada sem considerar a distribuição regional das populações nas duas
florestas, 69,58% da variância total foi atribuída para populações e 30,42% para
diferenças individuais dentro de populações (Tabela 5). Quando a análise de
variância molecular foi realizada dentro de cada floresta, a Floresta Atlântica
apresentou 34,13% da variância total entre populações e 65,87% dentro de
populações. Por outro lado a Floresta Amazônica apresentou 43,20% da
variância atribuída para diferenças entre populações, e 56,80% para diferenças
individuais dentro de populações (Tabela 5). O resultado da estimativa de θ
β
pelo método Bayesiano dentro das florestas Atlântica e Amazônica (θ
β
= 0,348
e 0,404, respectivamente) foi consistente com os resultados da estrutura
genética da AMOVA, demonstrando que a maior diferenciação genética ocorreu
dentro de populações do que entre populações.
Similaridade genética entre populações e estrutura geográfica
A Tabela 6 demonstra uma estimativa da identidade genética e distância
genética de Nei (1978) para todas as comparações par-a-par entre as
populações. A distância genética de Nei varia de 0 a 1 e quanto mais próxima
de 1 for a estimativa entre duas populações mais distante geneticamente as
duas populações serão. A distância genética média para todas as comparações
foi 0,364, variando de 0,0526 entre RAP e TLM (ambas populações da Floresta
Atlântica) até 0,6858 entre GUA e EXU (populações das Florestas Atlântica e
Amazônica, respectivamente).
72
TABELA 5. Análise de variância molecular (AMOVA) para diferentes níveis hierárquicos em populações de Psychotria ipecacuanha.
Fonte de Variação GL Soma dos
quadrados
Componente de
variância
Variação (%) Valor de P*
Dois níveis hierárquicos:
Entre populações
Dentro de populações
Total
10
155
165
3769,00
1647,10
5416,04
24,30
10,623
34,93
69,58
30,42
<0,001
Três níveis hierárquicos
Entre Florestas
Entre populações dentro das florestas
Dentro de populações
Total
1
9
155
165
2778,47
990,49
1647,10
5416,04
32,43
6,61
10,63
49,67
65,30
13,30
21,40
<0,001
<0,001
<0,001
Análise dentro da floresta Atlântica
Entre populações
Dentro de populações
Total
4
70
74
469,58
937,88
1407,47
6,94
13,40
20,34
34,13
65,87
<0,001
Análise dentro da floresta Amazônia
Entre populações
Dentro de populações
Total
5
85
90
520,91
709,22
1230,18
6,34
8,34
14,69
43,20
56,80
<0,001
*Valores de P são as probabilidades de ter um componente de variância maior que os valores observados ao acaso. As
probabilidades foram calculadas por 1000 permutações ao acaso.
73
TABELA 6. Identidade genética (acima da diagonal) e distância genética (abaixo da diagonal), entre as 11 populações de P.
ipecacuanha estimadas pelo método de Nei (1978).
TLM TVI VRB RAP GUA PRA RVE SOR TAN EXU VBS
TLM - 0,9107 0,8995 0,9488 0,8702 0,6030 0,5650 0,5667 0,5718 0,5496 0.5675
TVI 0,0935 - 0,9376 0,9138 0,9288 0,5941 0,5566 0,5574 0,5585 0,5313 0.5415
VRB 0,1059 0,0644 - 0,9202 0,9224 0,5780 0,5505 0,5465 0,5338 0,5244 0.5326
RAP 0,0526 0,0902 0,0832 - 0,8959 0,6092 0,5764 0,5741 0,5649 0,5456 0.5573
GUA 0,1390 0,0738 0,0808 0,1099 - 0,5682 0,5324 0,5239 0,5348 0,5037 0.5086
PRA 0,5058 0,5207 0,5481 0,4956 0,5653 - 0,9389 0,9174 0,9349 0,9319 0.8773
RVE 0,5710 0,5859 0,5969 0,5509 0,6304 0,0631 - 0,9355 0,9247 0,9460 0.8778
SOR 0,5680 0,5845 0,6043 0,5549 0,6465 0,0863 0,0667 - 0,9003 0,9322 0.8773
TAN 0,5590 0,5826 0,6277 0,5711 0,6259 0,0673 0,0783 0,1050 - 0,9402 0.8662
EXU 0,5986 0,6324 0,6455 0,6059 0,6858 0,0706 0,0556 0,0702 0,0617 - 0.8722
VBS 0,5666 0,6134 0,6299 0,5847 0,6762 0,1309 0,1303 0,1309 0,1437 0,1367 -
74
A média da distância genética de Nei (1978) foi maior entre florestas
(0,591) do que dentro de florestas (Floresta Atlântica = 0,089 e Floresta
Amazônica = 0,093). Na Floresta Atlântica, a distância genética entre as
populações variou de 0,0526 (RAP e TLM) a 0,139 (GUA e TLM), com média
de 0,089. A distância genética entre as populações da Floresta Amazônica
variou de 0,0556 (EXU e RVE) a 0,1413 (VBS e TAN), com média de 0,093.
Os resultados indicaram que as populações de RAP e TLM na Floresta
Atlântica e as populações de EXU e RVE na Floresta Amazônica foram as
mais próximas geneticamente dentro de cada uma das floresta.
O dendrograma mostrado na Fig. 2 ilustra a formação de dois clados.
Um clado contém exclusivamente indivíduos das populações da Floresta
Atlântica e o outro clado contém exclusivamente indivíduos das populações
da Floresta Amazônica. Dentro de cada clado, a maioria dos indivíduos
formou agrupamentos bem definidos com indivíduos da mesma população.
A formação dos dois clados foi geograficamente estruturada, pois nenhum
indivíduo com origem nas populações da Floresta Atlântica foi alocado no
clado contendo indivíduos com origem em populações da Floresta
Amazônica, e vice versa. Indivíduos de uma mesma população
demonstraram maior similaridade, bem como, os indivíduos de uma mesma
floresta. Para avaliar o grau de ajuste entre as matrizes de dissimilaridade e
as matrizes resultantes dos agrupamentos na formação do dendrograma,
comparamos as estimativas dos coeficientes de correlação cofenética
(CCC).
75
FIG. 2. Dendrograma de UPGMA em 166 indivíduos de 11 populações de
Psychotria ipecacuanha baseado em 193 bandas de ISSR. Coeficiente de
correlação cofenética r = 0.98016. Para os códigos das populações ver Tabela 1.
VBS
TAN
EXU
SOR
RVE
PRA
VRB
GUA
VRB
TVI
RAP
TLM
RAP
RVE
EXU
SOR
PRA
VBS
TAN
EXU
SOR
RVE
PRA
VRB
GUA
VRB
TVI
RAP
TLM
RAP
RVE
EXU
SOR
PRA
76
Valores de CCC superioes a 0,8 indicam boa representatividade entre
as distâncias e quanto maior o valor do coeficiente, menor é a distorção
provocada pelo agrupamento (Bussab et al., 1990). O alto valor de CCC (r =
0,98) entre as duas matrizes indica a robustez do agrupamento apresentado.
Análise de coordenadas principais complementou a análise de agrupamento,
fornecendo uma representação espacial das relativas semelhanças
genéticas entre indivíduos (Fig. 3).
FIG. 3. Gráfico das três primeiras coordenadas principais para cada indivíduo de
Psychotria ipecacuanha amostrados na floresta Atlântica (losângulos) e na Floresta
Amazônia (círculos). Os valores das coordenadas principais estão demonstrados
em parênteses.
0.29
0.29
0.15
0.15
0.00
0.00
Dim-2
PC2 (4.12%)
-0.14
-0.14
-0.28
-0.28
-
0.34
-0.34
-0.46
-0.46
-0.19
-0.19
-0.21
-0.21
Dim-3
PC3 (2.94%)
-0.05
-0.05
Dim-1
PC1 (50.3%)
0.05
0.05
0.10
0.10
0.31
0.31
0.25
0.25
0.56
0.56
0.29
0.29
0.15
0.15
0.00
0.00
Dim-2
PC2 (4.12%)
-0.14
-0.14
-0.28
-0.28
-
0.34
-0.34
-0.46
-0.46
-0.19
-0.19
-0.21
-0.21
Dim-3
PC3 (2.94%)
-0.05
-0.05
Dim-1
PC1 (50.3%)
0.05
0.05
0.10
0.10
0.31
0.31
0.25
0.25
0.56
0.56
77
O gráfico tridimensional separou claramente o clado da Floresta
Atlântica do clado da Floresta Amazônica (Fig. 3), os quais já haviam sido
revelados pela análise de UPGMA. O resultado da análise de coordenadas
principais demonstra um agrupamento mais denso na Floresta Amazônica,
como conseqüência da similaridade entre os indivíduos desta floresta. Por
outro lado, demonstra também, a maior diversidade dentro do agrupamento
da Floresta Atlântica. A maioria da variação foi explicada pela primeira
dimensão (50,3%), que em conjunto com a segunda e terceira dimensões
explicaram 57,94% da variação.
Para melhor visualização dos grupos formados, os agrupamentos
foram construídos tendo as populações como unidade de análise. Foi
construído um dendrograma pelo método UPGMA baseado nas distâncias
de Nei (1978) par-a-par entre populações (Fig. 4) e um dendrograma pelo
FIG. 4. Dendrograma gerado pelo método UPGMA baseado nas Distâncias de Nei
(1978) de 193 bandas de ISSR entre as 11 populações de Psychotria ipecacuanha
analisadas. Os valores de bootstrap acima de 50% estão demonstrados.
RVE
EXU
PRA
TAN
SOR
VBS
TLM
RAP
GUA
TVI
VRB
0.000.050.100.150.200.25
Clado da Floresta
Amazônica
Clado da Floresta
Atlântica
100
100
100
66
100
58
76
RVE
EXU
PRA
TAN
SOR
VBS
TLM
RAP
GUA
TVI
VRB
0.000.050.100.150.200.25
Clado da Floresta
Amazônica
Clado da Floresta
Atlântica
100
100
100
66
100
58
76
78
método do vizinho mais próximo (NJ) baseado nos valores de F
ST
obtidos
pela AMOVA (Fig. 5). Estes dendrogramas confirmaram a separação das
populações em dois clados de acordo com o tipo de floresta.
FIG.5. Dendrograma gerado pelo método do vizinho mais próximo baseado nos
valores de F
ST
obtidos pela AMOVA entre as 11 populações de Psychotria
ipecacuanha derivado de 193 bandas de ISSR.
Foram encontradas correlações significativas entre F
ST
e a identidade
genética de Nei (r = -0,95607, p [Z
rdm
≤ Z
obs
] = 0,0001), F
ST
e a diversidade
genética de Nei (r = 0,94976, p [Z
rdm
≥ Z
obs
] = 0,0001). Correlação
significativa foi encontrada também entre F
ST
e a distância geográfica (r =
0,94101, p [Z
rdm
≥ Z
obs
] = 0,0001). O alto valor encontrado na correlação
entre matriz de distâncias geográficas e genéticas sugere um padrão
espacial da variabilidade genética existente entre as populações e que estas
estão estruturadas no espaço.
Clado da Floresta
Amazônica
Clado da Floresta
Atlântica
RVE
SOR
EXU
PRA
TAN
VBS
TLM
RAP
GUA
TVI
VRB
0.1
Clado da Floresta
Amazônica
Clado da Floresta
Atlântica
RVE
SOR
EXU
PRA
TAN
VBS
TLM
RAP
GUA
TVI
VRB
RVE
SOR
EXU
PRA
TAN
VBS
TLM
RAP
GUA
TVI
VRB
0.1
79
DISCUSSÃO
Estrutura populacional
O padrão de distribuição da variabilidade genética nas populações de
Psychotria ipecacuanha indica que, tanto na Floresta Atlântica quanto na
Floresta Amazônica, a maior variação genética encontra-se dentro de
populações do que entre populações. Este padrão foi encontrado para a
maioria das espécies de plantas tropicais estudadas (Aldrich et al., 1998;
Margis et al., 2002; White et al., 1999; Gillies et al., 1999; Cardoso et al.,
2000; Lowe et al., 2000). Segundo Loveless e Hamrick (1984), espécies que
apresentam mecanismos eficientes de dispersão de sementes e pólen
favorecem o fluxo gênico entre populações, homogeneizando suas
freqüências alélicas e reduzindo a divergência genética por deriva e seleção,
resultando em uma maior variação genética dentro das populações do que
entre elas. Dispersores de pólen e sementes, dependendo de sua
capacidade de vôo, podem promover um aumento da variabilidade dentro de
populações, enquanto diminuem a divergência entre populações ao mantê-
las ligadas por fluxo gênico. A menor divergência entre do que dentro das
populações de Psychotria ipecacuanha em cada floresta, pode ser em parte
explicada pela autoincompatibilidade apresentada pela espécie e pela
propagação vegetativa.
A espécie apresenta heterostilia na forma de distilia. Os indivíduos de
Psychotria ipecacuanha ocorrem em agregados denominados de reboleiras.
80
As reboleiras são constituídas de indivíduos com apenas uma forma floral,
brevistila ou longistila. Uma população de Psychotria ipecacuanha é
composta de várias reboleiras que se encontram dispersas em seu habitat.
O sucesso reprodutivo da espécie depende do fluxo de pólen entre as
formas florais (polinizações legítimas) e como estas formas florais se
encontram em reboleiras separadas dentro das populações, a espécie é
dependente de polinizadores. Tendo em vista, as atuais situações de
fragmentação que se encontram os habitats naturais de Psychotria
ipecacuanha e particularidades reprodutivas desta espécie, é improvável que
o maior componente da diversidade genética seja ocasionada por fluxo
gênico atual. O padrão de diversidade genética detectado na espécie pode
então ser explicado pelo ciclo de vida perene dos indivíduos nas populações
e pela reprodução assexuada apresentada pela espécie. Neste contexto,
uma reboleira de Psychotria ipecacuanha pode inicialmente ter sido formada
por poucos propágulos geneticamente distintos, que sofreram sucessivas
multiplicações clonais e assim mantiveram a diversidade genética
ocasionada por fluxo gênico antigo através da reprodução assexuada da
espécie. A manutenção dos diferentes genótipos da espécie através de sua
propagação clonal contribui para a conservação da variabilidade genética na
população ao longo dos anos.
Em geral, espécies autógamas possuem baixa diversidade genética
dentro de populações e alta diferenciação genética entre populações
comparadas com espécies alógamas (Hamrick e Godt, 1996). Portanto, os
dados de estrutura genética de populações em Psychotria ipecacuanha
sugerem que a espécie seja de natureza alógama. Estes resultados são
81
consistentes com os documentados em estudo de populações de Psychotria
ipecacuanha da Floresta Atlântica, onde as maiores porcentagens de
frutificação foram registradas em polinizações legítimas (Rossi et al., 2005).
O sistema reprodutivo das espécies vegetais superiores, normalmente afeta
a diferenciação genética (Hamrick e Godt, 1989). Para espécies com
reprodução cruzada, estimativas da diferenciação genética entre populações
baseada em dados de AMOVA com marcadores de RAPD tem normalmente
sido < 28%. Para espécies com autofecundação, a estimativa da variação
genética interpopulacional tem normalmente sido > 70% (Nybom e Bartish,
2000). As estimativas da variação genética detectada entre as populações
de Psychotria ipecacuanha com ISSR (Floresta Atlântica = 34,13% e
Floresta Amazônica = 40,92%), foram próximas às estimativas de Nybom e
Bartish (2000) para espécies com reprodução cruzada.
Diversidade genética entre populações
A diversidade genética de uma espécie ou população é resultado dos
efeitos combinados da história genealógica e processos evolutivos. Portanto,
além do sistema reprodutivo, dos fatores ecológicos e da história de vida do
organismo é necessário também compreender como esses fatores
influenciam a dinâmica evolutiva e ecológica das populações (Loveless et
al., 1998). Baixos níveis de polimorfismo de ISSR foram revelados nas
populações de Psychotria ipecacuanha da Floresta Amazônica em relação
as populações da Floresta Atlântica. As Florestas Atlântica e Amazônica
apresentaram níveis de diversidade genética diferenciados, indicando que
fatores ecológicos e/ou evolutivos podem ter atuado ou estar atuando de
82
forma diferenciada nas populações destas florestas. A diferenciação quanto
aos níveis de diversidade genética entre as populações das duas florestas,
pode também ser explicada pelos processos históricos da dispersão da
espécie durante a disjunção das duas florestas.
O processo histórico da disjunção das florestas Atlântica e Amazônica
e a distribuição disjunta de Psychotria ipecacuanha nos permitem propor os
seguintes cenários para explicar o atual padrão de diversidade genética
apresentado pela espécie: (I) a Floresta Atlântica seria formada por
populações de origem mais antiga em relação à Floresta Amazônica, e se
constitui centro de diversidade para a espécie. (II) a origem das populações
de poaia na Floresta Amazônica seria resultado de colonizações recentes ao
invés de se constituirem de mosaícos de habitats (refúgios) em
consequência de fragmentações passadas de uma população amplamente
distribuída.
Os resultados reforçam a hipótese de que a Floresta Atlântica seja o
centro de diversidade para a espécie, pois os maiores índices de diversidade
foram detectados nas populações dessa floresta. Sugere-se também a
hipótese de que as populações da Floresta Amazônica sejam resultado de
colonizações recentes e que os menores níveis de diversidade genética
abrigada em suas populações pode estar refletindo eventos de extinção e
recolonização durante as flutuações climáticas do período Quartenário. Os
eventos de extinções durante o processo de colonização da Floresta
Amazônica podem ter ocasionado os gargalos gênicos e subsequentes
colonizações por poucos indivíduos (o efeito fundador), oriundos de
sementes e raízes gemíferas de indivíduos sobreviventes.
83
O efeito da disjunção na diversidade genética
A disjunção das Florestas Atlântica e Amazônica, ocasionada por
sucessivos eventos climatológicos, resultou em uma separação espacial
destas duas grandes áreas geográficas pela formação de uma extensa área
xeromórfica entre elas. Esta extensão geográfica entre as duas maiores
regiões florestais da América do Sul (florestas Atlântica e Amazônica) tem
sido considerada por muitos autores como um impedimento à migração das
espécies (Oliveira-Filho e Ratter, 1995). Porém, a distribuição disjunta de
várias espécies na Floresta Atlântica e na Floresta Amazônica sugere a
possibilidade de ligação entre elas no passado (Rizzini, 1963; Mori, 1989,
Andrade-Lima, 1982).
Psychotria ipecacuanha apresenta distribuição disjunta nestas duas
florestas brasileiras. A disjunção das florestas Atlântica e Amazônica pode
ter fragmentado o que se constituía uma população contínua de Psychotria
ipecacuanha, através de uma região intermediária de habitat não favorável a
espécie. Este ambiente não favorável pode ter imposto uma pressão de
seleção extremamente forte aos indivíduos de Psychotria ipecacuanha ali
existentes e qualquer genótipo não adaptado pode ter sido eliminado
rapidamente. A estrutura genética das populações de Psychotria
ipecacuanha revelada neste estudo, como a menor diversidade nas
populações da Floresta Amazônica e um alto índice de diferenciação entre
as populações das duas Florestas, podem estar refletindo o resultado
cumulativo deste efeito. Portanto, a estrutura detectada nas populações de
Psychotria ipecacuanha existentes na Floresta Amazônica pode ser
84
resultado da baixa variabilidade inerente ao efeito fundador e a deriva
genética causada pela pressão da disjunção.
Segundo Wright (1943), populações separadas por longas distâncias
e com limitado fluxo gênico podem tornar-se diferenciadas geneticamente
uma das outras pelo processo de “isolamento por distância”. A alta
porcentagem de variação atribuída para divergências regionais entre
florestas para a espécie Psychotria ipecacuanha, pode ser explicada como
um efeito da disjunção que dificulta ou mesmo impede o fluxo gênico entre
essas duas florestas para a espécie em estudo.
O processo de disjunção das duas florestas ocasionou a formação
das matas de galeria que ocorre ao longo da região do cerrado. Segundo
Oliveira-Filho e Ratter (1995), as matas de galeria servem de corredores
mésicos para os elementos dependentes de maior umidade nas floras
dessas florestas. A presença das matas de galeria poderia então sugerir um
habitat favorável para Psychotria ipecacuanha nesta região intermediária, se
constituindo em um corredor para intercâmbio da espécie entre as duas
florestas. Porém, não há nenhum registro histórico da ocorrência de poaia
nas matas de galeria e/ou de coletas realizadas nestas matas. Este fato
pode ser justificado pela característica ecológica da espécie que ocorre em
subbosque úmido das florestas tropicais e sofrem redução e extinção de
suas populações em fragmentos pequenos. Portanto, apesar do ambiente
ter propiciado a presença de matas de galeria durante a disjunção das duas
florestas, as atuais matas de galeria não constituem corredores para o
intercâmbio da espécie entre as populações da Floresta Atlântica e da
Floresta Amazônica.
85
Conclusões e implicações para conservação
A manutenção da variação genética é um dos maiores objetivos para
a conservação de espécies ameaçadas de extinção (Avise e Hamrick, 1996).
A principal meta da conservação é assegurar a sobrevivência contínua de
populações e manter seu potencial evolutivo. O conhecimento dos níveis
reais da variação genética entre e dentre populações de espécies raras e
ameaçadas fornecem informações essenciais para a formulação de
apropriadas estratégias de conservação (Falk e Holsinger, 1991; Milligan et
al., 1994). A intensa perda de habitat e a fragmentação, atualmente atribuída
à pressão antrópica, tem ocasionado uma diminuição nas populações de
Psychotria ipecacuanha determinando sua inclusão na lista de espécies
ameaçadas de extinção. Apesar da atual fragmentação e da redução das
populações de Psychotria ipecacuanha, este estudo ainda detectou uma
relevante diversidade genética em suas populações, fato este que pode ser
atribuído à longevidade dos indivíduos e ao alto índice de reprodução
vegetativa apresentado por Psychotria ipecacuanha. Estes fatores podem
estar perpetuando o polimorfismo antigo já existente nos indivíduos desta
espécie.
Os resultados obtidos neste estudo permitem-nos fazer inferências
para a conservação da diversidade genética de Psychotria ipecacuanha.
Para as populações da Floresta Atlântica a moderada diferenciação
encontrada entre suas populações, indica que a estratégia mais efetiva para
preservar sua variação genética pode ser conservar um grande número de
indivíduos em grandes populações. Portanto populações como TLM e TVI
86
que já se encontram em áreas de preservação, podem ser mantidas como
fonte da variabilidade genética da espécie nesta floresta. Na Floresta
Amazônica, as populações de PRA e RVE abrigam relativamente as maiores
quantidades de diversidade genética entre as populações pesquisadas e
podem portanto serem consideradas como prioridades para ações de
conservação in situ.
Apesar da diversidade genética da Floresta Atlântica ser maior do que
a diversidade da Floresta Amazônica, a conservação ex situ de Psychotria
ipecacuanha, requer amostragem das duas florestas, devido ao acúmulo de
diferenças genéticas particulares a cada área. Nas estratégias de
conservação ex situ deve-se, portanto, evitar a mistura de indivíduos das
duas florestas, para preservar a identidade de cada uma delas. Os níveis de
polimorfismo genético mantidos nesta espécie nas duas florestas analisadas
asseguram as práticas de conservação, apesar do tamanho limitado de
muitas populações.
87
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94
CAPÍTULO III
CYTOGENETIC CHARACTERIZATION AND NUCLEAR DNA CONTENT
OF Psychotria ipecacuanha
SUMMARY
Psychotria ipecacuanha, ipecac, is a perennial, medicinal herb that
grows in clusters in the understory of humid and shady areas of the Brazilian
Atlantic and Amazon forests. Cytogenetic studies performed in this species
have reported 2n = 22 chromosomes, with limited karyotypic information. The
present study was conducted in order to apply cytogenetic and flow
cytometric tools in samples of ten ipecac populations, five from the Atlantic
and five from the Amazon forest, with the purpose of characterizing their
karyotype and measuring their 2C DNA content. The flow cytometry analyses
evidenced two groups with distinct DNA amounts: MOZ population with 2C =
1.24 pg and GUA, TVI, TLM, VRB, RAP, MAN, RVE, BBU and PRA
populations with 2C = 2.05 pg. Metaphasic chromosomes obtained from root
apical meristems of GUA, TLM and TVI showed a karyotype consisting of 11
chromosome pairs, 4 metacentric (4, 5, 8 and 9) and 7 submetacentric (1, 2,
3, 6, 7, 10 and 11), with lengths varying from 3.97 to 2.53 µm. The secondary
constriction was identified in the long arm of chromosome 6. Cytogenetic
characterization also reveled that the chromosomes 2 – 3; 4 – 5; 6 – 7; 8 – 9
95
and 10 – 11 are cytogenetically similar, with regard to total length, short and
long arm size, and chromosomic class, suggesting that this species might be
a tetraploid organism.
Keywords 2C DNA content, chromosome, cytogenetics, flow cytometry,
ipecac, Psychotria ipecacuanha.
96
INTRODUCTION
Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes (Rubiaceae), also known as
ipecac, occurs naturally in three well-defined tropical geographic regions: 1 –
Central America and northern parts of South America; 2 – Southwestern part
of the Brazilian Amazon; and 3 – Atlantic Rain Forest along the Brazilian
coast (Skorupa and Assis 1998, Assis and Giulietti 1999). Ipecac populations
are generally very small and discontinuous, due to fragmentation of its
habitat.
Ipecac is an important medicinal plant (Yoshimatsu et al. 1994),
inasmuch as this species produces the alkaloids emetine and cephaeline
(Shamma 1972, Bruneton 1995, Scharman et al. 2000), which have been
used as expectorant for bronchitis, croup, asthma and whooping cough
(Yoshimatsu et al. 1994). Due to these properties, this species has been
intensely explored since the XVI century (Oliveira and Martins 1998), with the
result that ipecac is considered an organism in extinction (Mendonça and
Lins 2000).
On account of the medicinal importance of ipecac, most researches
are dedicated to the pharmacological properties of this species, which raises
gaps in others scientific areas, as taxonomy (Assis and Giulietti 1999).
Nevertheless, Assis and Giulietti (1999) and Souza et al. (2006) obtained
cytogenetic data in ipecac that contribute with taxonomy studies in this
species. Apart from taxonomy, others authors have highlighted that
cytogenetic information may also contribute with evolutionary (Galasso et al.
2001, Doyle et al. 2004) and plant breeding (Ohmido et al. 1998, Harper and
97
Cande 2000, Klein et al. 2000, Galasso et al. 2001, Stephens et al. 2004)
researches.
Initially, Assis and Giulietti (1999), using meiotic cells, related that
ipecac possesses 2n = 22. The same chromosomic number was also
mentioned by Rout et al. (2000), who used root tips obtained from somatic
embryos. Souza et al. (2006) not only confirmed the chromosomic number in
meiotic cells, but also reported that this species exhibited small,
morphologically similar metacentric chromosomes.
In spite of theses studies, neither work has characterized the ipecac
mitotic chromosomes for the purpose of assembling its karyotype. In this
context, the present study was conducted in order to apply cytogenetic
techniques for obtaining good quality metaphasic cells, to classify the
homologous sets of chromosomes, and to assemble the karyotype of ipecac.
In addition, we used flow cytometry tools to measure the 2C DNA content in
this species.
98
MATERIALS AND METHODS
Plant material
Samples of ten P. ipecacuanha populations were collected in the
Atlantic and Amazon forest, being five of each area and three plants per
population (Table 1 and fig. 1). All the plants were maintained in green house
in hydroponic solution. The cytogenetic and flow cytometric analyses were
carried out at the Laboratory of Cytogenetics and Cytometry, Department of
General Biology, UFV.
TABLE 1. Description of the original localization of Psychotria ipecacuanha
populations.
Populations Latitude (S) Longitude (W)
ATLANTIC FOREST
Trilha da Lagoa do Meio (TLM) 19º38’34” 42º30’56”
Trilha do Vinhático (TVI) 19º45’44” 42º37’57”
Visconde do Rio Branco (VRB) 21°00’37’’ 42°50’26’’
Raposo (RAP) 21º06’40” 42º05’43”
Guaraciaba (GUA) 20º34´14" 43º00´27"
AMAZON FOREST
Prata (PRA) 15º30’26” 58º01’50”
Rio Vermelho (RVE) 15º17’38” 57º51’43”
Mozar (MOZ) 15º04’57” 57º58’00”
Barra do Bugres (BBU) 57º48’00” 14º71’00”
Manilha (MAN) 57º57’00” 14º98’00”
Flow cytometry
Vigorous and young leaves were collected from all plants of P.
ipecacuanha and from the internal standard, Lycopersicon esculentum (1.96
picogramas – pg). The internal standard was gently supplied by Dr. Jaroslav
Doležel, Experimental Institute of Botany, Czech Republic.
99
FIG. 1 – Map showing the locations of populations of Psychotria ipecacuanha.
Population symbols are in accordance with Table 1.
The flow cytometry analyses were accomplished as described in the
CyStain PI absolute P Partec
®
protocol, with few modifications. The leaves
were placed in distilled water at 4 ºC and cut into 2 cm
2
fragments. Nuclei
suspension was obtained by chopping the leaves in 0.5 mL of Partec
®
extraction buffer. The suspension was filtered in nylon filter with 30 µm mesh
diameter, after 2 min incubation. Subsequently, the nuclear suspension was
stained with 1.5 mL Partec
®
staining solution, supplemented with 15 µM
propidium iodide (PI) + 50 µM RNAse, for 15 min in the dark, and analyzed
with a Partec PAS
®
flow cytometer (Partec
®
Gmbh, Munster, Germany),
equipped with a Laser source and a series of filters (TK 420, TK 560 and RG
610). The equipment was calibrated and aligned using microbeads and
TLM
TVI
VRB
RAP
GUA
PRA
RVE
MOZ
BBU
MAN
TLM
TVI
VRB
RAP
GUA
PRA
RVE
MOZ
BBU
MAN
100
standard solutions, according to the manufacturer’s recommendations
(Partec
®
). FlowMax
®
software (Partec
®
) was used for data analyses. More
than 10,000 nuclei were analyzed, and three independent replications and
average values of the 2C DNA content are reported in pg.
The 2C DNA content of ipecac populations was measured by the peak
corresponding to nuclei stained with PI in G0/G1 of internal standard and of
the sample, with the internal standard peak calibrated to channel 100. The
first ipecac population (MOZ) analyzed by flow cytometry was used as
internal standard to measure the DNA amount of the others populations.
Cytogenetic preparations
Owing to unavailability of ipecac seeds, stakes of the ten samples of
P. ipecacuanha populations were rooted in Hoagland solution (Hoagland and
Arnon 1938). Roots showing 0.5 – 1.0 cm were treated with 2.0, 2.5 or 3.0
μM microtubule inhibiting amiprophos-methyl (Nihon Bayer Agrochem K. K.
®
)
or oryzalin (Sigma
®
) solutions, for periods of 3, 4, 5, 6 h, at 30
0
C, or 10, 12,
14, 16, 18, 20, 22 or 24 h, at 4
0
C. They were subsequently washed with
distilled water for 20 min, and then fixed in fresh methanol:acetic acid
(Merck
®
) solution (3:1). The fixative was changed three times and the
samples were stored at - 20
0
C.
Ipecac roots were washed and macerated with an enzymatic solution
of pectinase (Sigma
®
) and distilled water, in a ratio of 1:20, 1:30 or 1:40
(enzyme: distilled water), for 1h45min, 2h, 2h15min and 2h30min at 32 °C.
Next, the roots were washed for 30 min in distilled water, fixed again and
stored at – 20 °C.
101
The slides were prepared using the technique of cell dissociation of
enzymatically macerated roots, and subsequently air-dried on a hot plate at
50 °C (Carvalho and Saraiva 1993, 1997). The slides were immediately
stained with a 5% Giemsa solution (Merck
®
) in phosphate buffer (pH 6.8) for
5 min, washed twice in distilled water and air-dried.
Image analysis
Images of the chromosomes were captured with a CoolSNAP-Pro cf
(Roper Scientific) video camera of 12 bits, assembled on an Olympus
TM
BX-
60 fluorescence microscope with a 100x objective lens and a WB filter. The
frame was digitalized using an Image Pro
®
-Plus analysis system (Media
Cybernetics). Image analysis was performed on a Power Macintosh G4
®
computer, using the freely available (http://reg.ssci.liv.ac.uk) Image SXM
software (Barrett 2002). This is a spin-off of the public domain image analysis
application NIH Image, developed by Rasband (1998).
The morphometry of the ipecac chromosomes was characterized
following the arm length (in micrometers) criteria described by Levan et al.
(1964) and revised by Guerra (1986), except of the chromosome with
secondary constriction (SC), whose portion was discounted of total length.
102
RESULTS
Flow cytometry analyses of the nuclei suspension stained with PI
generated histograms with peaks corresponding to the average of the G0/G1
relative nuclei DNA content of ipecac, and the comparative standard. The
high quality of the nuclear suspensions, with intact nuclei isolated in sufficient
quantity, allowed the obtention of histograms showing CVs inferior to 3%
and, consequently, enough resolution to discriminate between the G0/G1
peaks of the internal standard and samples (Fig. 2 a – b) and to calculate the
2C DNA amount of all populations. The results evidenced that MOZ
population possesses a nuclear DNA amount of 1.24 pg (Fig. 2a), whereas
the other nine ipecac populations showed 2.05 pg (Fig. 2 b).
FIG. 2. Estimation of absolute genome size in P. ipecacuanha. DNA – histogram
showing G0/G1 peaks resulting from simultaneous processing and analysis of
nuclear suspensions of tissue from young and vigorous leaves, stained with PI. a) L.
esculentum (internal standard 2C = 1.96 pg, channel 100) and MOZ ipecac
population (2C = 1.24 pg). b) MOZ population (internal standard 2C = 1.24 pg,
channel 100) and TVI population (2C = 2.05 pg), representing the other eight ipecac
populations. Note that MOZ population possesses 0.81 pg less than the other
populations.
a)
b)
103
Cytogenetically, it was possible to characterize the chromosomes and
assemble the karyotype of 3 ipecac populations (GUA, TVI and TLM),
because of difficult rooting of the stakes. Ipecac roots treated with 3.0 μM
oryzalin for 16 h at 4
0
C, with enzymatic solution in a ratio of 1:40 for 2 h,
whose meristems were cellular dissociated and air-dried provided excellent
standard C-metaphases. These metaphases exhibited few overlapped
chromosomes and well-defined primary and secondary constrictions, which
facilitated the pairing of homologues and assembly of the first karyogram for
this species (Fig. 3 a – b).
FIG. 3. Chromosomes obtained from root apical meristems of GUA, TLM and
TVI P. ipecacuanha populations treated with 3 μM oryzalin solution for 16 h
at 4°C. a) Dispersed metaphasic chromosomes, stained with Giemsa 5%,
displayed well-defined centromeric and secondary constrictions. b)
Karyogram of P. ipecacuanha showing 4 metacentric (4, 5, 8 and 9), 7
submetacentric (1, 2, 3, 6, 7, 10 and 11) chromosomes and emphasizing the
secondary constriction in the long arm of the chromosome 6. The
karyograms of the 3 populations not showed differences, therefore was
demonstrated only TVI population karyogram. Note that the chromosomic
pairs 2 – 3; 4 – 4; 6 – 7; 8 – 9 and 10 – 11 are cytogenetically similar (Table
2), suggesting that this species is tetraploid. Bar = 5 µm.
a)
b)
104
The morphometric characterization of the chromosomes was carried out
in 20 metaphases of GUA, TVI and TLM populations. The 11 ipecac
chromosomes showed lengths varying from 3.97 to 2.53 µm (Fig. 3 a, table
2). This species presents four metacentric (4, 5, 8 and 9) and seven
submetacentric chromosomes (1, 2, 3, 6, 7, 10 and 11). The secondary
constriction was located in the long arm of chromosome 6. No karyotype
difference was observed among the three ipecac populations.
TABLE 2. Cytogenetic morphometry and classification of the P. ipecacuanha
chromosomes (2n = 22).
Arm
Chrom
Fl
short long
r
Cc*
Rl
1 3.97 1.32 2.65 2.01 SM 12.71
2 3.09 1.18 1.91 1.62 SM 9.88
3 2.96 1.17 1.79 1.53 SM 9.48
4 2.79 1.47 1.32 0.90 M 8.94
5 2.72 1.45 1.27 0.88 M 8.72
6 2.67 0.88 1.79 2.03 SM 8.53
7 2.64 0.74 1.90 2.57 SM 8.45
8 2.64 1.32 1.32 1.00 M 8.44
9 2.63 1.18 1.45 1.23 M 8.42
10 2.60 0.88 1.72 1.96 SM 8.33
11 2.53 1.01 1.52 1.50 SM 8.10
*SM = submetacentric. M = metacentric. Chrom: chromosome. Fl: full length (µm). r:
ratio between arms. Cc: chromosome class. Rl: relative length (%).
105
DISCUSSION
Flow cytometry
As a result of the high quality nuclei suspensions, the flow cytometry
histograms presented CVs inferior to 3%. Brown et al. (1991) and Doležel
(1997) related that in order to distinguish the peaks among plants
simultaneously analyzed by flow cytometry, the CV should be smaller than
half of the difference between these plants, being that CVs below 3% are
considered appropriate for measurement by this technique. Additionally, the
PI fluorochrome, added to the Partec
®
staining solution, colaborated with the
obtention of CVs below 3%. Doležel et al. (1992, 1998) and Doležel and
Bartoš (2005) highlighted that PI, as well as ethidium bromide, is
recommended for absolute DNA measurements.
Given that the DNA content of MOZ was the first to be measured, with
1.24 pg (Fig. 2 a), this plant was used as internal standard in the flow
cytometry measurement of each one of the nine populations (Fig. 2 b),
seeing that Doležel and Bartoš (2005) mentioned that the flow cytometry
estimative is more accurate when the chromatin structure of the standard and
the sampled nuclei is similar and converts in a common way to compounds
that interfere with the accessibility of fluorochromes to the DNA. Besides, the
utilization of MOZ population as internal standard was also important
because the existence of two groups was evidenced in all analyses, with
varied DNA amounts: MOZ, 2C = 1.24 pg, and others nine populations, 2C =
2.05 pg (Fig. 2 b).
106
The difference in 2C DNA content showed by MOZ population,
compared to the other populations, can be correlated with the ploidy level
and/or lengths of the chromosomes. Nevertheless, Greilhuber (1998) and
Murray (2005) reported that the intraspecific variability in genome size is an
important phenomenon during plant speciation, and can precede phenotypic
differences.
Distinct authors also evidenced intraspecific differences in 2C DNA
content in soybean (Graham et al. 1994, Rayburn et al. 1997), sunflower
(Michaelson et al. 1991), pea (Arumuganathan and Earle 1991) and maize
(Rayburn et al. 1989). In some cases, these results were correlated with
environmental gradients or development conditions (Doležel and Bartoš
2005, Knight et al. 2005). Ŝmarda (2006) detected, by flow cytometry,
intraspecific and intrapopulational variability in Festuca pallens, and related
that two geographically distant populations differed 1.092-fold in DNA
content. In this research, a difference of 1.650-fold was detected.
Cytogenetics
The standardization of the cytogenetic protocol was a fundamental
step for supplying metaphasic chromosomes and enabling the assembly of
the first karyogram of ipecac. Microtubule inhibiting agent oryzalin was
efficient in the accumulation of metaphases in sufficient number for
accomplishment of the morphometric analyses. Enzymatic maceration in
solution with the proportion of 1:40 for 2 h was effective in cell wall
elimination without damage in the chromatin structure, so avoiding
inadequate Giemsa staining (Fig. 3 a – b).
107
Moreover, cell dissociation of macerated ipecac root meristems, in
association with air-dried slide preparations, was suitable for providing
chromosomes well-spread in the same focus plane, without cytoplasmic
background, overlaps or structural deformations, which facilitated the
observation of primary and secondary constrictions. Identical results were
obtained in Zea mays (Carvalho and Saraiva 1993, 1997), Capsicum
annuum (Almeida and Carvalho 2004), Aniba rosaeodora (Contim et al.
2005), Coffea canephora (Clarindo and Carvalho 2006) and Bixa orellana
(Almeida et al. 2006). We considered these methodologies to be
fundamental, as they supply more adequate chromosomic preparations in
comparison with those yielded by the squashing technique (Carvalho and
Saraiva 1993), usually applied in cytogenetic studies of ipecac (Assis and
Giulietti 1999, Rout et al. 2000, and Souza et al. 2006).
In accordance with Ohmido et al. (1998), Guzzo et al. (2000), Bauchan
et al. (2001) and Clarindo and Carvalho (2006), the digital image analysis
tools also contributed for providing high quality images of metaphasic cells
and for discriminating subtle measurement differences in chromosomes.
As a consequence of the difficult rooting of the ipecac stakes, in this
study, the karyogram of this species was assembled according to
morphometric information obtained from metaphasic chromosomes of GUA,
TVI and TLM populations (Fig. 3 b), since the three populations did not show
karyotypic differences. The determination of the number of mitotic
chromosomes was also accomplished by Rout et al. (2000); however, this
author used root apical meristem of somatic embryos. Alternatively, the
ipecac cytogenetic works of Assis and Giulietti (1999) and Souza et al.
108
(2006) were carried out in meiotic cells. These data evidence the difficulty in
the characterization of the mitotic chromosomes of ipecac.
Ipecac possesses 2n = 22 chromosomes (Fig. 3 a – b, table 2), the
same result mentioned by Assis and Giulietti (1999), Rout et al. (2000) and
Souza et al. (2006). In contrast to previous researches (Assis and Giulietti
1999, Rout et al. 2000, Souza et al. 2006), the methodologies used in the
present study allowed verifying the occurrence of four metacentric (4, 5, 8
and 9) and seven submetacentric (1, 2, 3, 6, 7, 10 and 11) chromosomes.
Additionally, the secondary constriction was identified in chromosome 6.
Different from the results related in this study, Souza et al. (2006),
applying the squash technique in anther, reported that this species
possesses small metacentric chromosomes with similar morphology, and did
not identify the chromosome with secondary constriction.
In addition, the morphometric data of ipecac suggest that this species
is a tetraploid plant (Fig. 3 b), in that the chromosomic pairs 2 – 3, 4 – 5, 6 –
7, 8 – 9 and 10 – 11 are cytogenetically similar with regard to total length,
short and long arm size, and chromosomic class (Table 2). This observation
allows the suggestion that the chromosomic complement of this species is
smaller than x = 11. The process of polyploidization is a common and
important phenomenon in genome evolution of plants (Soltis et al. 2003,
Madlung et al. 2005). However, this event involves changes in genome
structure (Wolfe 2001, Madlung et al. 2005) and gene expression (Otto e
Whitton 2000).
In this study, the cytogenetic methodology permitted the obtention of
high quality metaphasic chromosomes and, consequently, an accurate
109
description of the karyotype of Psychotria ipecacuanha. Morphometric data
also allowed proposing the hypothesis that this species may be a tetraploid
organism. Moreover, flow cytometry analyses detected the occurrence of
populations with DNA content of 1.24 pg (MOZ population) and 2.05 pg (the
other populations).
110
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115
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados apresentados no primeiro capítulo sugerem que:
¾ A diversidade de haplótipos é maior para as populações da Floresta
Atlântica (onde foram identificados 11 dos 12 haplótipos), enquanto
que para as populações da Floresta Amazônica a diversidade de
haplótipos é baixa (apenas um haplótipo foi observado);
¾ As duas florestas não compartilham haplótipos, apresentando,
portanto monofilia recíproca para os haplótipos de cpDNA;
¾ A espécie foi claramente separada em dois grupos de acordo com
suas duas regiões de ocorrência no Brasil. Um grupo constituído
exclusivamente pelas populações da Floresta Atlântica e o outro
constituído exclusivamente pelas populações da Floresta Amazônica;
¾ A não ocorrência de fluxo gênico entre as duas florestas é sugerida
pela revelação de haplótipos privativos para cada floresta e pela
quantidade de mutação que os separam com ausência de haplótipos
intermediários;
¾ A Floresta Atlântica é atualmente o centro de diversidade genética
para Psychotria ipecacuanha. Portanto, proteger este reservatório de
diversidade genética é de grande importância para conservação da
espécie;
116
¾ A estrutura genética de Psychotria ipecacuanha na Floresta
Amazônica foi devido ao evento de colonização recente por poucos
indivíduos, o que ocasionou uma uniformidade genética nesta região.
O segundo capítulo nos permite inferir que:
¾ Os marcadores ISSR revelaram maior diversidade genética nas
populações da Floresta Atlântica e menor diversidade nas populações
da Floresta Amazônica;
¾ A maior variação genética encontra-se dentro de populações do que
entre populações de Psychotria ipecacuanha tanto na Floresta
Atlântica quanto na Floresta Amazônica;
¾ Apesar da atual fragmentação e da redução das populações de
Psychotria ipecacuanha, por meio dos marcadores ISSR foi possível
ainda detectaram uma relevante diversidade genética nas populações
naturais desta espécie;
¾ Na Floresta Atlântica as populações de TLM e TVI, que já se
encontram em áreas de preservação, podem ser mantidas como fonte
da variabilidade genética da espécie;
¾ Na Floresta Amazônica, as populações de PRA e RVE que
apresentaram relativamente os maiores indices de diversidade
genética entre as populações, podem ser consideradas como
prioridades para ações de conservação in situ;
117
¾ Apesar da diversidade genética da Floresta Atlântica ser maior do que
a diversidade da Floresta Amazônica, a conservação ex situ de
Psychotria ipecacuanha, requer amostragem das duas florestas,
devido ao acúmulo de diferenças genéticas particulares a cada área;
¾ Os níveis de polimorfismo genético mantidos nesta espécie nas duas
florestas analisadas asseguram as práticas de conservação, apesar
do tamanho limitado de muitas populações.
O terceiro capítulo permite inferir que:
¾ Psychotria ipecacuanha possui 2n = 22 cromossomos;
¾ Seu cariótipo apresenta 4 cromossomos metacêntricos e 7
submetacêntricos;
¾ Possui uma constrição secundária no braço longo do cromossomo
número 6;
¾ A poliploidização é um processo que pode estar ocorrendo nas
populações naturais de Psychotria ipecacuanha;
¾ A espécie apresenta dois grupos de populações com relação ao
conteúdo absoluto de DNA, um grupo representado por MOZ com 2C
= 1,24 pg e o outro grupo constituído pelas demais populações com
2C = 2,05 pg.
ANEXOS
118
Inference Key for the Nested Haplotype Tree Analysis of Geographical
Distances (Templeton, 2004)
Start with haplotypes nested within a 1-step clade and work up to clades
nested within the total tree. If the tree is not rooted through an outgroup or if
none of the clades nested at the total tree level have the sum of the outgroup
probabilities of their haplotypes greater than or equal to 0.95, regard all
clades nested at the total tree level as tips. When rooting is deemed reliable,
interiors should also refer to the older clades in a nesting category, and tips
to their evolutionary descendants.
This key is applied only if there are some significant values for Dc, Dn, or I-T
within the nesting clade. If there are no statistically significant distances
within the clade, the null hypothesis of no geographical association of
haplotypes cannot be rejected (either panmixia in sexual populations,
extensive dispersal in non-sexual populations, small sample size, or
inadequate geographical sampling). In that case, move on to another clade at
the same or higher level.
1. Are all clades within the nesting clade found in separate areas with no
overlap?
• NO – Go to step 2.
• YES - Go to step 19.
2. Is at least one of the following conditions satisfied?
a. The Dc’s for one or more tips are significantly small and the Dc's for one
or more of the interiors are significantly large or non-significant.
b. The Dc’s for one or more tips are significantly small or non-significant
and the D
c's for some but not all of the interiors are significantly small.
c. The D
c’s for one or more interiors are significantly large and the Dc’s for
the tips are either significantly small or non-significant
d. The I-T Dc is significantly large.
• NO - Go to step 11.
• YES - Go to step 3.
• Tip/Interior Status Cannot be Determined - Inconclusive Outcome.
3. Is at least one of the following conditions satisfied?
a. Some Dn and/or I-T Dn values are significantly reversed from the Dc
values.
b. One or more tip clades show significantly large Dn’s.
c. One or more interior clades show significantly small Dn’s.
d. I-T has a significantly small Dn with the corresponding Dc value non-
significant.
• NO - Go to step 4.
119
• YES - Go to step 5.
4. Are both of the following conditions satisfied?
a. The clades (or 2 or more subsets of them) with significantly small Dc or
Dn values have ranges that are completely or mostly non-overlapping
with the other clades in the nested group (particularly interiors).
b. The pattern of completely or mostly non-overlapping ranges in the
above condition represents a break or reversal from lower level trends
within the nested clade series (applicable to higher-level clades only).
• NO - Restricted Gene Flow with Isolation by Distance (Restricted
Dispersal by Distance in Non-sexual species). This inference is
strengthened if the clades with restricted distributions are found in
diverse locations, if the union of their ranges roughly corresponds to
the range of one or more clades (usually interiors) within the same
nested group (applicable only to nesting clades with many clade
members or to the highest level clades regardless of number), and if
the Dc values increase and become more geographically widespread
with increasing clade level within a nested series (applicable to lower
level clades only).
• YES - Go to step 9.
5. Are both of the following conditions satisfied?
a. The clades (or 2 or more subsets of them) with significantly small Dc
values have ranges that are completely or mostly non-overlapping with
the other clades in the nested group (particularly interiors).
b. The pattern of completely or mostly non-overlapping ranges in the
above condition represents a break or reversal from lower level trends
within the nested clade series (applicable to higher-level clades only).
• NO - Go to step 6.
• YES - Go to step 15.
6. Do clades (or haplotypes within them) with significant reversals or
significant Dn values without significant Dc values define two or more
geographically concordant subsets.
• No - Go to step 7.
• YES - Go to step 13.
• TOO FEW CLADES (< 2) TO DETERMINE CONCORDANCE –
Insufficient Genetic Resolution to Discriminate between Range
Expansion/Colonization and Restricted Dispersal/Gene Flow -
Proceed to step 7 to determine if the geographical sampling is
sufficient to discriminate between short versus long distance
movement.
7. Are the clades with significantly large Dn’s (or tip clades in general when Dn
for I-T is significantly small) separated from the other clades by intermediate
geographical areas that were sampled?
• NO - Go to step 8.
• YES - Restricted Gene Flow/Dispersal but with some Long
Distance Dispersal.
120
8. Is the species absent in the non-sampled areas?
• NO - Sampling Design Inadequate to Discriminate between
Isolation by Distance (Short Distance Movements) versus Long
Distance Dispersal
• YES - Restricted Gene Flow/Dispersal but with some Long
Distance Dispersal over Intermediate Areas not Occupied by the
Species; or Past Gene low Followed by Extinction of Intermediate
Populations.
9. Are the different geographical clade ranges identified in step 4 separated
by areas that have not been sampled?
• NO - Allopatric Fragmentation. (If inferred at a high clade level,
additional confirmation occurs if the clades displaying restricted by at
least partially nonoverlapping distributions are mutationally connected
to one another by a larger than average number of steps.)
• YES - Go to step 10.
10. Is the species absent in the non-sampled areas?
• NO - Geographical Sampling Scheme Inadequate to Discriminate
Between Fragmentation and Isolation By Distance.
• YES - Allopatric Fragmentation. (If inferred at a high clade level,
additional confirmation occurs if the clades displaying restricted by at
least partially nonoverlapping distributions are mutationally connected
to one another by a larger than average number of steps.)
11. Is at least one of the following conditions satisfied?
a. The Dc value(s) for some tip clade(s) is/are significantly large.
b. The Dc value(s) for all interior(s) is/are significantly small.
c. The I-T Dc is significantly small.
• NO - Go to step 17
• YES - Range Expansion, go to step 12.
12. Are the D
n and/or I-T Dn values significantly reversed from the Dc values?
• NO - Contiguous Range Expansion.
• YES - Go to step 13.
13. Are the clades with significantly large Dn’s (or tip clades in general when
D
n for I-T is significantly small) separated from the geographical center of the
other clades by intermediate geographical areas that were sampled?
• NO - Go to step 14.
• YES - Long Distance Colonization Possibly Coupled with
Subsequent Fragmentation (subsequent fragmentation is indicated if
the clades displaying restricted but at least partially non-overlapping
distributions are mutationally connected to one another by a larger
than average number of steps) or Past Fragmentation Followed by
Range Expansion. To see if secondary contact is involved, perform
the supplementary tests given in Templeton, Molecular Ecology 10:
779-791, 2001. To discriminate the type of movement leading to this
pattern, go to step 21.
121
14. Is the species present in the intermediate geographical areas that were
not sampled?
• YES - Sampling Design Inadequate to Discriminate between
Contiguous Range Expansion, Long Distance Colonization, and
Past Fragmentation.
• NO - Long Distance Colonization and/or Past Fragmentation (not
necessarily mutually exclusive). If inferred at a high clade level,
fragmentation rather than colonization is inferred if the clades
displaying restricted but at least partially nonoverlapping distributions
are mutationally connected to one another by a larger than average
number of steps. If the branch lengths are short, a colonization event
is inferred, perhaps associated with recent fragmentation. To
discriminate the type of movement leading to this pattern, go to step
21.
15. Are the different geographical clade ranges identified in step 5 separated
by areas that have not been sampled?
• NO - Past Fragmentation and/or Long Distance Colonization (not
necessarily mutually exclusive). If inferred at a high clade level,
fragmentation rather than colonization is inferred if the clades
displaying restricted but at least partially nonoverlapping distributions
are mutationally connected to one another by a larger than average
number of steps. If the branch lengths are short, a colonization event
is inferred, perhaps associated with recent fragmentation. To
discriminate the type of movement leading to this pattern, go to step
21.
• YES - Go to step 16.
16. Is the species present in the intermediate geographical areas that were
not sampled?
• YES - Go to step 18.
• NO - Allopatric Fragmentation. If inferred at a high clade level,
additional confirmation occurs if the clades displaying restricted by at
least partially nonoverlapping distributions are mutationally connected
to one another by a larger than average number of steps.
17. Are either of the following conditions satisfied?
a. The Dn values for tip or some (but not all) interior clades are
significantly small.
b. The Dn for one or more interior clades is/are significantly large.
c. The I-T Dn value is significantly large.
• NO - Inconclusive Outcome.
• YES - Go to step 4.
18. Are the clades found in the different geographical locations separated by
a branch length with a larger than average number of mutational steps.
• NO - Geographical Sampling Scheme Inadequate to Discriminate
Between Fragmentation, Range Expansion, and Isolation By
Distance.
122
• YES - Geographical Sampling Scheme Inadequate to Discriminate
Between Fragmentation and Isolation By Distance.
19. Is the species present in the areas between the separated clades?
• NO – Allopatric Fragmentation. If inferred at a high clade level,
additional confirmation occurs if the clades displaying restricted by at
least partially non-overlapping distributions are mutationally connected
to one another by a larger than average number of steps.
• YES - Go to step 20.
20. Was the species sampled in the areas between the separated clades?
• NO – Inadequate Geographical Sampling.
• YES – Go to step 2.
21. Are all of the following true?
a. Is it biologically realistic that the organism could have undergone long-
distance movement?
b. Are the nested haplotypes that mark a potential long-distance
colonization event within a clade that shows evidence of population
growth by other methods (such as mismatch distributions)?
c. At the level of the entire cladogram, does the clade not inferred to have
produced long-distance colonization not show evidence of past
population growth with other methods?
• YES – Long-distance movement.
• NO – Insufficient evidence to discriminate between long-distance
movements of the organism and the combined effects of gradual
movement during a past range expansion and fragmentation. If the
case against long-distance movement is compelling, then the
inference is past gradual range expansion followed by
fragmentation.
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