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Adriana Ribeiro de Oliveira-Marques
Filogenia Molecular das Espécies do Gênero Ara
(Psittaciformes, Aves)
São Paulo
2006
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1. Ara severa por Arthur Grosset; 2. Ara macao por Adriana R Oliveira-Marques; 3. Ara militaris por Adriana R
Oliveira-Marques; 4. Ara ararauna por Renato Caparroz; 5. Ara chloroptera por Flávia Presti; 6. Ara
glaucogularis por Luiz Sanfilippo ; 7. Ara rubrogenys por Adriana R Oliveira-Marques.
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Adriana Ribeiro de Oliveira-Marques
Filogenia Molecular das Espécies do Gênero Ara
(Psittaciformes, Aves)
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biociências da Universidade de
São Paulo, para a obtenção do Título
de Mestre em Ciências, na área
Biologia/Genética
Orientadora: Profa. Dra. Cristina
Yumi Miyaki
São Paulo
2006
Oliveira-Marques, Adriana Ribeiro
Filogenia Molecular das espécies do gênero
Ara (Psittaciformes, Aves).
52 páginas
Dissertação de Mestrado – Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo.
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva
1. Psitacídeos 2. Ara 3. Filogenia Molecular
4. DNA mitocondrial. I. Universidade de São
Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de
Genética e Biologia Evolutiva
Comissão Julgadora:
_____________________________ _______________________________
Prof. (a) Dr. (a) Prof. (a) Dr. (a)
________________________________________
Profa. Dra. Cristina Yumi Miyaki
Aos meus pais, Marina e Dirceu, e ao Otinho, com muito AMOR.
Anda, quero te dizer nenhum segredo
Falo desse chão, da nossa casa, vem que tá na hora de arrumar
Tempo, quero viver mais duzentos anos
Quero não ferir meu semelhante, nem por isso quero me ferir
Vamos precisar de todo mundo pra banir do mundo a opressão
Para construir a vida nova vamos precisar de muito amor
A felicidade mora ao lado e quem não é tolo pode ver
A paz na Terra, amor, o pé na terra
A paz na Terra, amor, o sal da Terra
Terra, és o mais bonito dos planetas
Tão te maltratando por dinheiro, tu que és a nave nossa irmã
Canta, leva tua vida em harmonia
E nos alimenta com teus frutos, tu que és do homem a maçã
Vamos precisar de todo mundo, um mais um é sempre mais que dois
Pra melhor juntar as nossas forças é só repartir melhor o pão
Recriar o paraíso agora para merecer quem vem depois
Deixa nascer o amor
Deixa fluir o amor
Deixa crescer o amor
Deixa viver o amor
(O Sal da Terra, Beto Guedes/Ronaldo Bastos)
Agradecimentos
À Professora Dra. Cristina Yumi Miyaki pela orientação com muita dedicação, por estar sempre
disposta a ensinar, apoiar e conversar com muito carinho e simpatia.
Aos psitacídeos que deram seu sangue para que o trabalho pudesse ser realizado.
À Professora Dra. Anita Wajntal pelo apoio e simpatia.
À Erika S. Tavares (Erikinha) pelos ensinamentos desde a parte prática até as análises dos
dados, companheirismo, simpatia, alegria e disposição de sempre ajudar.
Ao Fábio S. Raposo pelas explicações sobre alguns programas de filogenia e pela amizade junto
com a Cibele Biondo.
À Camila C. Ribas pelas fotos de Primolius couloni e pela grande ajuda no final do trabalho
com as datações e biogeografia.
Ao Nathan H. Rice do “Academy of Natural Sciences”, Filadélfia, pelas fotos de Ara
glaucogularis.
Às pessoas que me cederam as fotos para a capa do trabalho.
À Lynx Edicións pela permissão de uso das figuras do livro “Handbook of the Birds of the
World” volume 04.
Ao Rodrigo Pessoa pela ajuda com os mapas de distribuição das espécies.
Ao Professor Dr. Luis Fábio Silveira pela ajuda no museu de Zoologia da USP.
Ao Dr. Alvarenga Herculano pela ajuda no museu de História Natural de Taubaté.
Aos criadouros e zoológicos pelas amostras de sangue utilizadas no presente trabalho, em
especial ao Sr. Alcides Vertematti por abrir as portas de seu criadouro e me deixar fotografar as espécies
Ara militaris e A. rubrogenys.
Às Professoras Dras. Marie-Anne Van Sluys e Mariana C. Oliveira por me receberem tão bem
na USP, pelos ensinamentos nos projetos genomas, que me serão sempre muito úteis e por permitir o uso
dos seqüenciadores automáticos no mestrado.
Ao Professor Dr. Luiz R. Nunes e à Professora Dra. Regina L. B. C. Oliveira por me
apresentarem a Biologia Molecular e pelos meus primeiros passos em um laboratório. Seus ensinamentos
serão sempre fundamentais.
À Flávia Presti pela grande amizade, companheirismo, incentivo, pela foto de Ara chloroptera
da capa, idas ao CEPÊ e por muitos momentos agradáveis.
À Tania Matsumoto (Taninha) pela ajuda no dia-a-dia, amizade, apoio e trabalho em conjunto
com os embriões.
Ao amigos do LGEMA: Celina, Erwin, Fernando H, Fernando N, Gustavo, José, Melina,
Polyana e Renato Caparroz pelas dicas, conversas e principalmente pela convivência sempre agradável no
laboratório.
Às amigas da sala 153 (Botânica): Ana Paula, Daniela Mielstain, Érika, Magdalena, Mina,
Paula, Regininha e Silvia e aos que passaram pela sl. 153 comigo: Cris Souza, Cris Scott, Elisa,
Elisabeth, Elisângela, Ivone, Jonathan, Luciana, Viviane e muitos outros que me apoiaram e
incentivaram para que eu entrasse no mestrado e seguisse em frente.
Aos professores do IB pelos seus ensinamentos e ótimas idéias.
Às funcionárias do IB Carminha, Cláudia, Genuveva, Linácia, Lucilene, Luzia, Maria e
Suzi, pelo apoio de sempre e amizade.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento da pesquisa.
À família que eu ganhei com o passar do anos e sempre me apoiou e torceu para que tudo desse
certo D. Eurides, S. Oton, Renata, Luciano e Daniela.
À minha amiga e irmã do coração, Patrícia, pela amizade de longa data, apoio, torcida e aos
agradáveis almoços.
À minha tia Lusia pela grande ajuda com o abstract.
Aos meus irmãos, Anderson e Amanda, e meu cunhado, Nimai, pela torcida, apoio, carinho,
amor e amizade.
Aos meus pais, Marina e Dirceu, pelo apoio, incentivo, dedicação, amor e por tudo que fizeram
e ainda fazem por mim, eu não seria nada sem vocês.
Ao Otinho pelo seu apoio, incentivo, paciência, companheirismo, amor e que fez desses últimos
dez anos muito especias para mim.
À toda a minha família, amigos e amigas pelo apoio, torcida e carinho.
Índice
Resumo..................................................................................................................................................01
Abstract ................................................................................................................................................02
1. Introdução.......................................................................................................................................03
1.1 Psitacídeos...............................................................................................................03
1.2 Gênero Ara..............................................................................................................04
1.3 DNA mitocondrial..................................................................................................09
1.3.1 Região Controladora...............................................................................09
1.3.2 DNAs ribossomais 12S e 16S...................................................................11
1.3.3 NADH desidrogenase sub-unidade 2 (ND2)..........................................11
1.3.4 Citocromo b..............................................................................................11
1.4 Análises Filogenéticas.............................................................................................12
1.4.1 Máxima Parcimônia.................................................................................12
1.4.2 Máxima Verossimilhança........................................................................13
1.4.3 Valor de sustentação dos ramos (“Bootstrap”).....................................13
1.4.4 Análise Bayesiana....................................................................................13
1.4.5 Mapeamento de caracteres por Máxima Parcimônia...........................14
1.5 Relógio Molecular....................................................................................................15
1.6 Diversificação histórica Neotropical......................................................................15
2. Objetivos.........................................................................................................................................16
3. Materiais e Métodos.......................................................................................................................16
3.1 Análises Moleculares...............................................................................................16
3.1.1 Extração de DNA.....................................................................................16
3.1.2 Reação de Amplificação (PCR – “Polymerase Chain Reaction”)........17
3.1.3 Corte de Banda do produto da RC.........................................................19
3.1.4 Re-amplificação da RC.............................................................................19
3.1.5 Purificação dos produtos amplificados..................................................20
3.1.6 Reação de Seqüenciamento.....................................................................20
3.1.7 Precipitação dos produtos para seqüenciamento..................................20
3.1.8 Seqüenciamento automático....................................................................20
3.1.9 Análises das seqüências............................................................................21
3.2 Análises Morfológicas..............................................................................................22
3.3 Mapeamento de caracteres......................................................................................24
4. Resultados........................................................................................................................................24
4.1 Dados Moleculares.................................................................................................24
4.1.1 Região Controladora...............................................................................25
4.1.2 DNAs ribossomais 12S e 16S..................................................................26
4.1.3 NADH desidrogenase sub-unidade 2 (ND2)..........................................27
4.1.4 Citocromo b..............................................................................................27
4.2 Análises Filogenéticas.............................................................................................27
4.2.1 Região Controladora...............................................................................27
4.2.2 DNAs ribossomais 12S e 16S..................................................................28
4.2.3 NADH desidrogenase sub-unidade 2 (ND2)..........................................30
4.2.4 Citocromo b..............................................................................................31
4.2.5 Seqüências Concatenadas........................................................................33
4.3 Dados Morfológicos ................................................. ..............................................36
4.4 Mapeamento de caracteres.....................................................................................38
4.5 Relógio Molecular...................................................................................................39
5. Discussão.........................................................................................................................................41
6. Conclusão........................................................................................................................................46
7. Bibliografia.....................................................................................................................................46
Resumo
Alguns dos maiores representantes dos psitacídeos são as araras do gênero Ara, que pertencem à
tribo Arini, subfamília Psittacinae. Atualmente esse gênero conta com oito espécies, sendo que no
passado, até 15 espécies estavam incluídas. As relações filogenéticas entre esses táxons ainda não foram
bem exploradas. Assim, o presente trabalho pretende avaliar o monofiletismo do gênero Ara, caracterizar
as relações filogenéticas das demais espécies que já foram incluídas no gênero e analisar a história de
diversificação das espécies estudadas. Assim, foram realizadas análises filogenéticas com seqüências
mitocondriais dos DNAs ribossomais 12S e 16S, da Região Controladora (RC), do citocromo b e da
NADH desidrogenase sub-unidade 2 (totalizando 5053 pb) com todas as espécies dos gêneros Ara e
Primolius e mais oito espécies de psitacídeos. Foram realizadas análises de Máxima Parcimônia, Máxima
Verossimilhança (MV), Análise Bayesiana, as datas de divergência entre as linhagens foram estimadas e
foi realizada a caracterização da RC de todos esses táxons. Os resultados concatenados obtidos nas
análises moleculares sugerem que os gêneros Ara e Primolius sejam reciprocamente monofiléticos e
grupos irmãos. A separação dos dois gêneros parece ter ocorrido entre o final do Plioceno e início do
Pleistoceno, o que coincide com a diversificação de outros gêneros de psitacídeos e com mudanças
paleoclimáticas ocorridas na América do Sul. O clado com as espécies do gênero Primolius se apresentou
bem suportado em todas as análises e foi estimado que as divergências entre as espécies ocorreram no
Pleistoceno. Dentro do gênero Ara um dos clados sempre fortemente suportado foi (A. militaris, A.
ambigua), essas espécies se divergiram recentemente (0,95 milhão de anos atrás). A. macao e A.
chloroptera sempre se apresentaram agrupadas e a data de sua divergência foi estimada para o final do
Plioceno. As espécies A. ararauna e A. glaucogularis também se apresentaram como espécies irmãs com
100% de “bootstrap” e 1.00 de probabilidade posterior e a divergência entre elas foi estimada para a
primeira metade do Plioceno. Em relação à RC, os blocos conservados em aves foram facilmente
identificados. Além disso, foi observado um bloco conservado adicional entre as bases 1030 e 1033 em
todas as espécies estudadas, porém uma trinca (TGG) antes e outra (GGG) após esse bloco, foram
observadas apenas em Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba, Aratinga aurea e Anodorhynchus
hyacinthinus. O mapeamento desse dado na topologia de MV obtida com os dados concatenados indicou
que houve um ganho seguido de uma perda das trincas. Já o mapeamento de algumas características de
coloração das espécies estudadas mostrou que todos os caracteres possuem homoplasia.
1
Abstract
Some of the biggest psitacids belong to the genus Ara that belongs to the tribe Arini, subfamily
Psittacinae. Currently, this genus presents eight species, but up to 15 species have already been included.
The phylogenetic relationships among these taxa have not been thoughrouly explored yet. Thus, the
present study intends to evaluate the monophyly of the genus Ara, characterize the phylogenetic
relationships of the species that were once included in the genus, and analyze the diversification history of
the species studied. We obtained sequences from the mitochondrial genome [ribosomal DNAs 12S and
16S, Control Region (CR), cytochrome b, and NADH dehydrogenase; total of 5053 pb] from all the
species of the genera Ara and Primolius and other eight parrots species. Maximum Parsimony, Maximum
Likelihood (ML), and Bayesian analyses were performed; divergence times were estimated; and the CR
was characterized. The results of the molecular analyses suggested that the genera Ara and Primolius are
reciprocally monophyletic and are sister groups. The divergence of the two genera seems to have occurred
between the end of the Pliocene and the beginning of the Pleistocene, which coincides with the
diversification of other parrots genera and with paleoclimatic changes which took place in South America.
The clade of the genus Primolius was well supported in all analyses and it was estimated that the
divergences among the species occurred in the Pleistocene. Within the genus Ara one of the highly
supported clades was (A. militaris, A. ambigua), these species diverged recently (0,95 million years ago).
A. macao and A. chloroptera were always grouped as sister taxa and the divergence time was estimated to
the end of the Pliocene. The species A. ararauna and A. glaucogularis were also recovered as sister taxa
with 100% of bootstrap and 1.00 of posterior probability, and their divergence was estimated to have
occurred at the first half of the Pliocene. The characterization of the CR revealed that the conserved
blocks in birds can be easily identified. Moreover, an additional conserved block between the bases 1030
and 1033 was observed in all the species studied; but a triplet (TGG) before and another (GGG) after this
block were observed only in Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba, Aratinga aurea, and
Anodorhynchus hyacinthinus. The mapping of this data on the ML topology based on the combined
sequences indicated that there was a gain of this triplet followed by its loss. Also, the mapping of the
color of some body parts showed homoplasy in all characters analyzed.
2
1. Introdução
1.1 Psitacídeos
Os psitacídeos (ordem Psittaciformes) são representados pelos papagaios, araras, periquitos,
maracanãs e afins. São facilmente reconhecidos pela morfologia de seus bicos e por sua plumagem
geralmente bastante colorida. As características principais da ordem são: bico alto, curvado e
arredondado; a maxilia superior encaixa-se sobre a inferior; os pés são zigodáctilos; a cabeça é grande e
larga com o pescoço curto; as pernas são curtas e a língua é grossa e preênsil (Forshaw, 1989; Collar,
1997).
A ordem Psittaciformes é uma das mais antigas pertencente à classe Aves (Cooper e Penny, 1997;
Hedges e col, 1996). Fósseis encontrados na França e nos Estados Unidos possuem cerca de 25 milhões
de anos (Mioceno). Já no Brasil, há fósseis de cerca de 20.000 anos de Lagoa Santa e Minas Gerais (Sick,
1997) e ainda poucos fósseis de espécies do gênero Anodorhynchus, procedentes de adjacências de Belo
Horizonte, MG, com idade aproximada de 6 a 10 mil anos atrás (Herculano Alvarenga, comunicação
pessoal). Atualmente ocorrem nas regiões neotropical, afrotropical, oriental e australiano, e
marginalmente no neártico e paleártico, mas sua maior diversidade é observada nos trópicos.
Em todo o mundo, a família Psittacidae está distribuída em 83 gêneros, 332 espécies e 703 táxons,
sendo que 86 espécies estão ameaçadas de extinção (Collar, 1997). Segundo Sick (1997), existem mais de
100 espécies na América do Sul, o que dá a este continente, com larga margem, o primeiro lugar no
mundo em número de espécies; o Brasil destaca-se com 72 espécies, o que o torna o país mais rico do
mundo em psitacídeos, vivendo aqui seus maiores representantes, as araras. Seguindo o Brasil, está a
Colômbia, com 51 espécies e a Venezuela, com 49 espécies. Em comparação, nos demais continentes, a
Austrália possui 52 espécies, a Nova Guiné 46 e a África apenas 35. A Amazônia possui a maior riqueza
de espécies (Sick, 1997).
Suas belas e coloridas penas e sua capacidade de vocalização despertam curiosidade e admiração
nas pessoas, principalmente os papagaios, que podem até imitar a voz humana e, por isso, estas aves têm
sofrido com a captura para o comércio ilegal. No Brasil, várias espécies se encontram ameaçadas de
extinção, pois além da captura, ainda sofrem com a grande pressão ambiental, o que torna urgente a sua
proteção in natura, bem como o estabelecimento de programas de reprodução em cativeiro (Sick, 1997).
Atualmente, a ordem Psittaciformes é organizada em duas famílias (Cacatuidae e Psittacidae;
Rowley, 1997; Collar, 1997). A Família Psittacidae se subdivide em duas subfamílias: Loriinae (53
espécies em 12 gêneros) e Psittacinae (279 espécies em 66 gêneros). A subfamília Psittacinae é dividida
em nove tribos: Psittrichadini (uma espécie); Nestorini (duas espécies); Strigopini (uma espécie);
Micropsittini (seis espécies); Cyclopsittacini (seis espécies); Platycercini (37 espécies); Psittaculini (66
espécies); Psittacini (12 espécies) e Arini (148 espécies) (Collar, 1997).
A tribo Arini agrupa todas as espécies neotropicais e é considerada monofilética (Smith, 1975;
3
Forshaw, 1989; Sick, 1997; de Kloet e de Kloet, 2005). Sick (1997) cita que isso se deve, parcialmente,
pelo fato de a América do Sul, que permaneceu isolada por muito tempo, ser relativamente uniforme
geograficamente. As características exclusivas da tribo são o canal auditivo fechado no momento da
eclosão e postura de cópula sobre uma só perna (Smith, 1975).
1.2 Gênero Ara
Collar (1997) cita que as araras são as espécies que mais se destacam dentro da tribo Arini devido
ao seu grande tamanho e suas cores “maravilhosas”. Segundo esse autor, os táxons conhecidos
popularmente como “araras” englobam as espécies dos gêneros: Anodorhynchus, Cyanopsitta e Ara. No
entanto, Sick (1997) considera que somente as espécies dos gêneros Anodorhynchus e Ara devem ser
consideradas como verdadeiras araras e que Cyanopsitta spixii não é uma arara. As espécies do gênero
Ara variam de pequeno a grande porte, com cauda longa e pontiaguda. Não há dimorfismo sexual entre os
indivíduos e quando jovens, assemelham-se com os adultos, sem muita alteração na coloração (Forshaw,
1989). Outra característica considerada como diagnóstica do gênero é a face nua ao redor dos olhos ou
com poucas pequenas penas em fileira (Forshaw, 1989). Assim, esse autor inclui 15 espécies no gênero
Ara: A. autocthones, A. ararauna, A. glaucogularis, A. militaris, A. ambigua, A. macao, A. chloroptera,
A. tricolor, A. rubrogenys, A. auricollis, A. severa, A. manilata, A. maracana, A. couloni e A. nobilis.
Sendo as espécies Ara tricolor e A. autocthones extintas. Sick (1990), baseando-se na morfologia,
vocalização e comportamento, sugere que Ara auricollis, A. maracana, A. manilata e A. nobilis não
pertenceriam ao gênero Ara e que a nomenclatura adotada por Pinto (1937), deveria ser revalidada, assim,
tais espécies deveriam ser denominadas como: Propyrhura auricollis, P. maracana, Orthopsittaca
manilata e Diopsittaca nobilis, respectivamente. Em 1997, Sick discute que Ara couloni também não
pertenceria ao gênero Ara devido à sua vocalização, estando mais próxima do gênero Propyrhura. Mais
recentemente, Penhallurick (2001) sugere que o nome Primolius proposto por Bonaparte 1857 tem
precedência ao nome Propyrrhura Ribeiro 1920. Assim, adotamos Primolius para designar P. auricollis,
P. couloni e P. maracana. Sick (1997) discute que as espécies dos gêneros Primolius, Orthopsittaca e
Diopsittaca devem ser consideradas como maracanãs.
O Caribe parece ter sido muito rico em espécies do gênero Ara que hoje não existem mais. Entre
aquelas descritas com evidências mais aceitas estão Ara erythrocephala e A. gossei da Jamaica, A.
atwoodi de Dominica, A. martinica de Martinica, A. guadeloupensis de Guadalupe e A. erythrura de uma
ilha desconhecida. Esses psitacídeos foram perdidos nos quatro séculos seguintes à descoberta do Caribe e
um pequeno testemunho disso são as raras peles de museu de Ara tricolor de Cuba e um sub-fóssil da
tíbia-tarso esquerdo de A. autocthones de St. Croix (Forshaw, 1989; Abramson e col., 1995).
Atualmente, oito espécies existentes são reconhecidas no gênero Ara: A. ararauna, A.
glaucogularis, A. macao, A. chloroptera, A. rubrogenys, A. severa, A. militaris e A. ambigua. E três
4
espécies são incluídas dentro do gênero Primolius (P. auricollis, P. couloni e P. maracana), uma espécie
no gênero Orthopsittaca (O. manilata) e uma espécie no gênero Diopsittaca (D. nobilis) (Collar, 1997;
Sick, 1997):
– Ara ararauna (Figura 01-A): conhecida popularmente como arara-canindé, mede cerca de 86
cm, pesa entre 900 e 1200 gramas. Habita beira de mata, várzeas com palmeiras, interior e
bordas de florestas altas. Possui grande área de distribuição no leste do Panamá, Colômbia,
leste e sul da Venezuela, Guianas, Brasil, sul, oeste e leste do Equador, leste do Peru e noroeste
da Bolívia. Não é considerada ameaçada de extinção (Abramson e col., 1995; Collar, 1997;
Sick, 1997).
– Ara glaucogularis (Figura 01-B): morfologicamente muito semelhante a Ara ararauna,
diferindo na garganta e na cor azul de suas penas faciais (negras em A. ararauna). Conhecida
popularmente como arara-de-garganta-azul, mede cerca de 80 cm e pesa entre 600 e 800
gramas. Habita savana inundada e parece depender de local abundante da palmeira Attalea
phalerata. Encontra-se apenas no norte da Bolívia. É considerada ameaçada de extinção
(Abramson e col., 1995; Collar, 1997; Sick, 1997).
– Ara militaris (Figura 01-C): conhecida como arara-militar, mede entre 67 e 73 cm e pesa entre
862 e 1070 gramas. Habita florestas tropicais montanhosas e decíduas. Possui três sub-
espécies: A. m. mexicana, encontrada somente no México, é a maior das três sub-espécies; A.
m. militaris, encontrada no noroeste da Venezuela, Colômbia, leste do Equador e norte do Peru
e A. m. boliviana, encontrada na Bolívia e norte da Argentina, possui penas no pescoço
amarronzadas. É considerada vulnerável (Abramson e col., 1995; Collar, 1997; Sick, 1997).
– Ara ambigua (Figura 01-D): conhecida como arara-ambigua ou Buffon, é muito similar a Ara
militaris. Habita florestas tropicais de baixada, preferencialmente ao longo da costa caribenha
da América Central. Possui duas sub-espécies: A. a. ambigua, com distribuição ao leste de
Honduras e Nicaragua através da Costa Rica e Panamá para o noroeste da Colômbia e A. a.
guayaquilensis, ocorre apenas ao oeste do Equador e possui o bico menor. Também é
considerada vulnerável (Collar, 1997). Segundo Abramson e col. (1995) as distribuições de
Ara ambigua e A. militaris não se sobrepõem e cada uma possui um habitat bem diferente.
– Ara macao (Figura 01-E): conhecida como arara-canga, mede entre 84 e 95 cm, pesa entre 950
e 1150 gramas. Habita copa de florestas úmidas, floresta de margens de rios e clareiras com
árvores altas. Possui duas sub-espécies: A. m. cyanoptera (do sudoeste do México à Nicaragua,
é maior das duas sub-espécies e possui as pontas das asas amarelas azuis, e não verdes) e A. m.
macao (com ampla distribuição: Costa Rica, Panamá, norte e leste da Colômbia, Venezuela,
Guiana, Brasil Central, sul a leste do Equador, leste do Peru e noroeste da Bolívia). Não é
considerada ameaçada de extinção (Abramson e col., 1995; Collar, 1997; Sick, 1997).
5
– Ara chloroptera (Figura 01-F): conhecida como arara-vermelha-grande, muito semelhante a
Ara macao, mede cerca de 93 cm e pesa entre 1250 e 1700 gramas. Habita floresta de baixada
úmida, mas também penetra em florestas decíduas tropicais e matas de galeria em savanas.
Possui ampla distribuição: leste do Panamá, Colômbia, Venezuela, Guianas, Brasil, Paraguai,
leste e oeste do Equador, leste do Peru e noroeste da Bolívia. Sua distribuição se sobrepõe em
vários pontos com a de Ara macao. Também não é considerada ameaçada de extinção (Collar,
1997; Sick, 1997).
– Ara rubrogenys (Figura 01-G): conhecida como arara-de-bochecha-vermelha, mede cerca de
57 cm e pesa entre 450 e 650 gramas. Habita montanhas áridas, decíduas e matas de cactos em
vales entre montanhosas e desfiladeiros de 1100 a 1250 metros. Encontrada apenas na região
central da Bolívia. Considerada ameaçada de extinção (Collar, 1997).
– Ara severa (Figura 01-H): conhecida como maracanã-guaçú ou ararinha-verde, é a menor do
gênero, com cerca de 50 cm e 285 e 387 gramas. Habita floresta de várzea, mata de galeria,
bordas de rios ricas em palmeiras. Ocorre ao leste do Panamá e Colômbia, Equador, leste do
Peru e do norte da Bolívia até a região noroeste e Central do Brasil, Venezuela e Guianas. Não
é considerada ameaçada de extinção (Collar, 1997; Sick, 1997).
– Primolius auricollis (Figura 02-A): conhecida como maracanã-de-colar, mede entre 37 – 45 cm
e pesa entre 240 e 250 gramas. Habita o Cerrado aberto e mata de galeria. Ocorre no noroeste
da Bolívia e do norte do Paraguai até o centro e suldoeste do Brasil e norte da Argentina.
Considerada levemente ameaçada de extinção (Collar, 1997; Sick, 1997).
– Primolius couloni (Figura 02-B): conhecida como maracanã-de-cabeça-azul, mede cerca de 41
cm e pesa entre 207 e 294 gramas. Habita beira de florestas ao longo dos rios (Collar, 1997).
Era considerada endêmica do Peru até ser encontrada no norte da Bolívia e em dois pontos do
estado do Acre. Considerada levemente ameaçada de extinção (Sick, 1997).
– Primolius maracana (Figura 02-C): conhecida como maracanã-do-buriti ou maracanã-
verdadeira, mede entre 36 – 43 cm e pesa entre 246 e 266 gramas. Habita beira da mata,
buritizais, outros palmais e penetra na vegetação da caatinga. Ocorre no Nordeste, Centro e
Sudeste do Brasil, Paraguai e Nordeste da Argentina. Considerada vulnerável (Sick, 1997).
– Orthopsittaca manilata (Figura 02-D): conhecida como maracanã-de-cara-amarela, mede entre
50 – 51 cm e pesa entre 292 e 390 gramas. Habita mata ciliar e buritizais. Ocorre no Sudeste da
Colômbia, do sul até o leste do Equador, leste do Peru e norte da Bolívia e da Venezuela,
Trindade e Guianas até o norte, centro e nordeste do Brasil. Considerada levemente ameaçada
de extinção (Sick, 1997).
– Diopsittaca nobilis (Figura 02-E): conhecida como maracanã-nobre, possui três sub-espécies:
D. n. nobilis, D. n. cumanensis e D. n. longipennis. Mede cerca de 30 cm e pesa entre 129 e
6
169 gramas. Habita savanas naturais (incluindo cerrado), palmais, mata de galeria e beira da
mata. A sub-espécie D.n. nobilis ocorre no leste da Venezuela, nas Guianas e norte do Brasil
(no norte da Amazônia); D. n. cumanensis ocorre no norte do Brasil, do sul da baixa Amazônia
até o nordeste do Brasil; e D. n. longepennis ocorre no sudeste do Peru e do nordeste da
Bolívia até o centro e sudeste do Brasil. Considerada levemente ameaçada de extinção (Sick,
1997).
Figura 01: Oito espécies atuais do gênero Ara. A-Ara ararauna, B-A. glaucogularis, C-A. militaris, D-A.
ambigua, E-A. macao, F-A. chloroptera, G-A. rubrogenys e H-A. severa. Figuras modificadas de Collar, 1997.
Fora de escala.
7
Figura 02: Espécies dos gêneros Primolius, Orthopsittaca e Diopsittaca. A-Primolius auricollis, B-P. couloni, C-
P. maracana, D-Orthopsittaca manilata e E-Diopsittaca nobilis. Figuras modificadas de Collar, 1997. Fora de
escala.
As quatro espécies do gênero Ara que ocorrem na Amazônia (A. ararauna, A. chloroptera, A.
severa e A. macao) são simpátricas e A. glaucogularis, que ocorre ao norte da Bolívia, pode estar em
competição com Ara ararauna nesta região, sendo que a separação ecológica dessas espécies necessita ser
elucidada (Collar, 1997).
Segundo Silveira (comunicação pessoal), as rêmiges e retrizes de psitacídeos são importantes
ferramentas para a sistemática das espécies. Assim, foram realizadas análises de coloração de plumagem
da maioria das espécies estudadas. Estudos filogenéticos que incluem todas as espécies do gênero Ara
ainda não foram realizados, mas os trabalhos com dados moleculares de Tavares (2001, 2005) e Tavares e
col (2004), utilizando duas espécies do gênero Ara, três espécies do gênero Primolius, Orthopsittaca
8
manilata, Diopsittaca nobilis e outros representantes de gêneros de psitacídeos neotropicais, não
descartam o monofiletismo dos gêneros Ara e Primolius.
1.3 DNA mitocondrial
O genoma mitocondrial (DNAmt) animal é uma molécula circular que contém os genes para dois
RNAs ribossomais (rRNA), 22 RNAs transportadores (tRNA) e 13 proteínas; além da Região
Controladora (RC). As cadeias são denominadas como leve (L) e pesada (H). Íntrons parecem estar
ausentes e há pequenos espaços intergênicos. Em alguns casos os genes se sobrepõem e ocorre a redução
do comprimento dos códons de parada em uma ou duas bases (Houde e col., 1997).
Os estudos com DNAmt iniciaram-se com o desenvolvimento das técnicas do DNA recombinante.
Isso se deve à facilidade de sua manipulação e purificação em laboratório, sua capacidade de gerar várias
cópias, por ter principalmente herança materna, haver raros eventos de recombinação e evoluir mais
rápido que o genoma nuclear (Quinn, 1997). Esses estudos têm se mostrado de grande utilidade para
resolver os problemas existentes na sistemática tradicional de gêneros de várias espécies, como no caso de
peixes do gênero Pseudolabrus (Mabushi e col., 2004) e aves dos gêneros Pipilo (Zink e col., 1998),
Lophura (Randi e col., 2001), Buteo (Riesing e col., 2003), Aegotheles (Dumbacher e col., 2003) e
Psittacula (Groombridge e col., 2004).
Desjardins e Morais (1990) publicaram o primeiro genoma mitocondrial completo de uma ave, o
da galinha (Gallus gallus). Este estudo revelou que: 1) a maioria dos códons UGA e AUA encontrados
em genes de proteínas no DNAmt de galinha correspondem a triptofano e metionina, respectivamente; já
em mamíferos, UGA é um códon de parada e AUA é um códon de isoleucina; 2) guanina é relativamente
menos freqüente na 3º posição do códon; 3) os genes rDNA 12S e 16S são similares aos de mamíferos,
com regiões altamente conservadas; e 4) a região controladora na galinha é ligeiramente maior (1227 pb)
do que a seqüência correspondente encontrada em humanos (1122 pb), ratos (898 pb) ou vacas (910 pb) e
é menor do que a encontrada em Xenopus laevis (2134 pb). A duas principais diferenças entre o DNAmt
de aves e outros vertebrados são a ordem dos genes adjacentes à região controladora e a ausência da
origem de replicação na cadeia leve entre tRNA
Cys
e tRNA
Asn
(Desjardins e Morais, 1990; Houde e col.,
1997). Recentemente, Harrison e col. (2004) publicaram os genomas mitocondriais de quatro aves:
Anseranas semipalmata (ganso), Ninox novaeseelandiae (coruja), Acanthisitta chloris (passeriforme) e
Strigops habroptilus (psitacídeo).
1.3.1 Região Controladora (RC)
A RC regula a replicação da fita H e a transcrição de todos os genes do DNAmt. Embora o
DNAmt seja relativamente bem conservado, sua ordem gênica tem mostrado variação entre diferentes
grupos de aves; inclusive com a presença de RC duplicada (Figura 03; Bensch e Härlid, 2000; Desjardins
9
e Morais, 1990; Eberhard e col., 2001). A ordem dos genes ao redor da RC foi caracterizada em
representantes da maioria dos gêneros de psitacídeos neotropicais (Tavares, 2005). Os representantes
estudados do gênero Ara e as demais espécies utilizadas no presente trabalho possuem apenas uma RC, ou
seja, esses táxons apresentam a ordem gênica típica de aves (Figura 03 a).
Figura 03: Representação do arranjo gênico ao redor da RC em aves. a) Ordem gênica típica encontrada por
Desjardins e Morais (1990); b) Ordem gênica alternativa encontrada por Mindell e col. (1998); e c) Ordem gênica
encontrada por Eberhard e col. (2001). Cit b: citocromo b; Thr: tRNA de treonina; Pro: tRNA de prolina; ND6:
NADH desidrogenase sub-unidade 6; Glu: tRNA de ácido glutâmico; RC: região controladora; Phe: tRNA de
fenilalanina; 12S: DNA ribossomal 12S; NC: região não codificadora; pND6: pseudogene do NADH
desidrogenase sub-unidade 6; pGlu: pseudogene do tRNA de ácido glutâmico; RC1: região controladora 1; RC2:
região controladora 2.
A variabilidade encontrada na RC ocorre devido a substituições de nucleotídeos, a presença de
curtas deleções e inserções e ao número de repetições em tandem. A RC pode ser dividida em três
domínios:
Domínio I – rico em AC, é a região adjacente ao tRNA
Glu
na ordem gênica típica; possui
seqüências associadas com o término da replicação da fita H (TAS; Doda e col., 1981) e freqüentemente
inclui repetições de número variável (VNTRs) (Fumagalli e col., 1996). Em trabalhos com
Struthioniformes, Galliformes, Falconiformes e Sphenisciformes, foi encontrada uma seqüência de poli-C
na extremidade 5´ desse domínio, sugerindo que essa estrutura deve ser conservada em muitos grupos de
aves (Haring e col., 2001; Ritchie e Lambert, 2000; Roques e col., 2004).
Domínio II – rico em CT, é o domínio mais conservado. Em mamíferos, normalmente possui
cinco blocos conservados (F, E, D, C e B), em aves pode haver quatro (F, E, D e C; Roques e col., 2004;
10
Randi e Lucchini, 1998; Pereira e col., 2004) ou apenas três (F, D e C; Crochet e Desmarais, 2000;
Eberhard e col., 2001; Ruokonen e Kvist, 2002).
Domínio III – rico em AT e muito pobre em G, é a região próxima ao tRNA
Phe
na ordem gênica
típica. É o domínio mais variável devido à sua alta taxa de substituições de nucleotídeos, inserções,
deleções e VNTRs. Contém seqüências conservadas de importância funcional (os promotores de
transcrição das fitas leve e pesada), origem de replicação da fita H e pequenas seqüências de blocos
conservadas (SBCs) (Hoelzel e col., 1993; Fumagalli e col., 1996; Baker e Marshal, 1997; Sbisà e col.
1997).
1.3.2 RNAs ribossomais 12S e 16S
As seqüências de DNA que codificam para os RNAs ribossomais 12S e 16S são muito utilizadas
em trabalhos filogenéticos. O gene rDNA 12S é menor que o do 16S (cerca de 1Kb e 1,6Kb,
respectivamente). Essas regiões não codificam para proteínas, apresentam propriedades semelhantes e são
conservadas em sua estrutura secundária (Desjardins e Morais, 1990; Houde e col., 1997). O gene rDNA
mitocondrial 12S pode ser subdividido em quatro domínios principais, cada qual possui fitas duplas
(regiões formadas por trechos de seqüência que se complementam) e alças. Acredita-se que nas porções
que formam fitas duplas existe certa pressão de conservação na seqüência para manter a estrutura do
ribossomo; enquanto as regiões que formam alças não devem sofrer tal pressão, podendo apresentar
substituições com maior freqüência sem alterar a estrutura secundária da molécula. Porém, existem
regiões de alça que são bem conservadas entre diferentes organismos, assim como regiões de fita
consideradas entre as mais variáveis do gene (Houde e col., 1997). O gene rDNA 16S apresenta
propriedades semelhantes (Desjardins e Morais, 1989)
1.3.3 NADH desidrogenase sub-unidade 2 (ND2)
O gene ND2 do DNA mitocondrial, codifica para a sub-unidade 2 da NADH (Nicotinamida
Adenina Dinucleotídeo Reduzida). O NADH é um importante carreador de elétrons ativados e participa
em muitas reações biossintéticas (Alberts e col., 2004). Por ser um gene codificante, possui baixa taxa de
substituição de aminoácidos e o alinhamento de seqüências de diversos táxons é relativamente simples de
ser realizado (Hackett, 1996; Dimcheff e col., 2002; Ribas, 2004).
1.3.4 Citocromo b
A seqüência do gene citocromo b codifica para um produto protéico importante que apresenta
baixa taxa de substituição de aminoácidos; assim, é relativamente fácil obter o alinhamento de seqüências
de diversos organismos (Moore e De Fillipis, 1997). O citocromo b é um dos citocromos envolvidos no
transporte de elétrons na cadeia respiratória da mitocôndria (Alberts e col., 2004).
11
Como o citocromo b é relativamente conservado, “primers” desenvolvidos para diferentes táxons
podem ser utilizados em outros grupos (Irwin e col., 1991; Moore e De Fillipis, 1997). Por essa razão, a
seqüência do citocromo b é muito utilizada em estudos de análises filogenéticas (Nunn e Cracraft, 1996;
Randi, 1996; Moore e DeFillipis, 1997; Randi e col., 2001).
1.4 Análises Filogenéticas
O conceito de filogenia surgiu com Darwin, junto com o próprio conceito de ancestralidade entre
espécies, que nada mais é que a indicação das relações de ancestralidade supostas para um conjunto de
espécies (Miyaki e col., 2001). Análises filogenéticas de seqüências de DNA ou proteína têm sido
importantes ferramentas para estudar a história evolutiva de vários organismos (Nei e Kumar, 2000).
Estes estudos tentam reconstruir a correta genealogia entre organismos biológicos e até visam estimar o
tempo de divergência entre eles (Graur e Li, 2000).
Desde o final da década de 1950, várias técnicas de biologia molecular têm sido desenvolvidas e
isso iniciou o extensivo uso de dados moleculares em pesquisas filogenéticas. Com o avanço dessas
técnicas, principalmente a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), houve um acúmulo de dados de
seqüências de DNA no final dos anos de 1970, o que resultou em um avanço no campo da filogenia
molecular (Graur e Li, 2000). As relações evolutivas são ilustradas por árvores filogenéticas que podem
ser construídas utilizando métodos de inferência como os de Máxima Parcimônia, de Máxima
Verossimilhança e de Análise Bayesiana.
1.4.1 Máxima Parcimônia
O método de máxima parcimônia é relativamente simples em sua concepção, seu princípio
envolve a identificação de uma topologia que requer o menor número de mudanças evolutivas
(substituições de nucleotídeos) para explicar as diferenças observadas entre os táxons estudados. Esse
método utiliza apenas os sítios variáveis informativos em suas análises, pois os sítios invariáveis não
acrescentam nenhuma mudança na árvore e os sítios variáveis não informativos acrescentam o mesmo
número de mudanças em todas as possíveis árvores (Graur e Li, 2000; Nei e Kumar, 2000; Miyaki e col.
2001). A vantagem desse método em relação aos outros, é o seu conceito simples e é, em geral,
computacionalmente mais rápido que os demais. No entanto, deve-se ter cuidado com homoplasias,
substituições múltiplas e desvio de composição de bases, que não são corrigidos por esse método (Miyaki
e col. 2001).
Há diferentes algoritmos para reconstrução filogenética, no caso da máxima parcimônia, dois deles
são mais utilizados: a busca exaustiva (se o número de táxons for pequeno, até 10) ou a busca heurística
(se houver um grande número de táxons). A busca exaustiva analisa todas as possíveis árvores bifurcadas
para um grupo de táxons. A busca heurística une inicialmente todos os táxons em um único nó interno,
12
formando uma árvore totalmente politômica e em seguida avalia todas as possíveis árvores (Graur e Li,
2000; Nei e Kumar, 2000).
1.4.2 Máxima Verossimilhança
A máxima verossimilhança é um método de inferência filogenética que requer o uso de um
modelo evolutivo e, portanto, pode levar em consideração parâmetros como taxa de substituição entre
pares de nucleotídeos em uma seqüência de DNA e freqüência de bases, entre outros. Os parâmetros
podem ser estimados diretamente dos dados e usados no cálculo da probabilidade de um estado de caráter
ser substituído por outro, de acordo com o modelo evolutivo escolhido (Pereira e col., 2001). O objetivo
desse método é encontrar a árvore, entre todas as possíveis, com o maior valor de probabilidade, chamada
de mais verossímil. A probabilidade de uma árvore filogenética nada mais é que, a probabilidade de
observar as seqüências de nucleotídeos dados uma determinada árvore e um modelo específico de
substituições de DNA (Graur e Li, 2000; Pereira e col., 2001).
A seleção do melhor modelo evolutivo para um grupo de dados pode ser realizada pelo programa
MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998). Esse programa compara hierarquicamente a
verossimilhança de 56 modelos evolutivos, desde o mais simples, que considera apenas um parâmetro,
como o modelo de Jukes e Cantor (1969), até modelos mais complexos, e realiza um teste de razão de
verossimilhança entre os mesmos, penalizando os que possuem parâmetros desnecessários.
O método de máxima verossimilhança, ao contrário do método de máxima parcimônia, utiliza
todos os sítios em suas análises. Além disso, simulações mostram que é menos suscetível a erros nas
construções se o modelo evolutivo escolhido for adequado. Sua desvantagem é ser um método bastante
demorado computacionalmente, embora computadores mais avançados possam minimizar esse problema
(Pereira e col., 2001)
1.4.3 Valor de sustentação dos ramos (“Bootstrap”)
O “bootstrap” não paramétrico (Felseinstein, 1985) é muito utilizado em análises filogenéticas,
tanto em análises por máxima parcimônia, como nas análises por máxima verossimilhança, para estimar o
nível de confiança dos ramos das hipóteses filogenéticas. O teste consiste em uma simples reamostragem
aleatória com reposição dos dados. Para cada réplica é obtida uma árvore e no final, é computada uma
árvore consenso na qual consta a proporção (porcentagem de vezes) que cada agrupamento foi recuperado
nas árvores réplicas (Graur e Li, 2000; Nei e Kumar, 2000; Russo e col., 2001).
1.4.4 Análise Bayesiana
A análise Bayesiana é baseada em probabilidade posterior. O teorema de Bayes é utilizado
combinando a probabilidade a priori de uma filogenia com a sua verossimilhança, para produzir uma
13
probabilidade posterior para as árvores. Essa probabilidade posterior pode ser interpretada como a
probabilidade daquela árvore estar correta. Como na máxima verossimilhança, na análise Bayesiana
também é utilizado um modelo evolutivo. Porém, a análise Bayesiana procura pelo melhor conjunto de
árvores com altos valores de verossimilhança, enquanto a MV procura pela a árvore mais verossímil
(Hall, 2001; Huelsenbeck e col., 2001; Holder e Lewis, 2003).
O cálculo das probabilidades posteriores envolve um conjunto de análises matemáticas para cada
possível árvore e ainda, uma integração sobre todas as possíveis combinações de comprimento de ramos e
valores de modelos de substituição, o que torna impossível analisar o cálculo analiticamente. Então para
implementar o cálculo dessas probabilidades pode-se fazer uma aproximação utilizando o método de
cadeia de Markov de Monte Carlo (“Markov chain Monte Carlo”). Esses cálculos podem ser realizados
pelo programa MrBayes (Huelsenbeck e Ronquist, 2001). Este programa escolhe uma árvore inicial de
acordo com um modelo escolhido e a verossimilhança dessa árvore é calculada, em seguida algum
parâmetro do modelo evolutivo é alterado, uma nova árvore é gerada e sua verossimilhança é calculada;
se essa verossimilhança for maior ou igual à da árvore anterior, essa árvore é aceita e registrada, se a
verossimilhança for menor, a árvore é rejeitada, assim é constituída uma geração. O número de gerações é
determinado pelo usuário. Entre o conjunto de árvores com os melhores valores de verossimilhança, a
melhor árvore é estimada e as probabilidades posteriores de cada clado são apresentadas (Hall, 2001;
Huelsenbeck e col., 2001; Holder e Lewis, 2003).
1.4.5 Mapeamento de caracteres por Máxima Parcimônia (MP)
O método de mapeamento de caracteres por MP reconstrói os estados ancestrais que minimizam o
número de mudanças de estados de um caráter dada uma hipótese filogenética. Considerando um exemplo
hipotético no qual os dois estados de um caráter [ausente (preto) e presente (branco)] apresentam a mesma
probabilidade de sofrer mudança, quando esses estados são distribuídos nos terminais de uma dada árvore
filogenética (Figura 04), a hipótese mais parcimoniosa da evolução do caráter sugere a ocorrência de dois
eventos de mudança de estado e que os ancestrais táxon 1 e táxon 2 apresentam o estado de caráter
ausente, enquanto os ancestrais táxons 3 a 6 apresentam estado ancestral do caráter pesente (Maddison e
Maddison, 2004; Ronquist, 2005; Tavares, 2005).
Figura 04: Mapeamento de caracteres por Máxima Parcimônia (MP) em uma hipótese filogenética. Em preto
ausente e em branco presente. Barras representam mudança de estado (modificado de Ronquist, 2005; Tavares,
2005).
14
1.5 Relógio Molecular
Estudos comparativos de seqüências de hemoglobina e citocromo c de diferentes espécies
(Zuckerkandl e Pauling, 1962, 1965; Margoliash, 1963) com datações de seus registros fósseis mostraram
que a distância genética é proporcional ao tempo de divergência, o que leva à sugestão da existência de
uma taxa de substituição constante ao longo do tempo, ou seja, de um relógio molecular. Segundo tal
hipótese, seria possível datar eventos que ocorreram no passado. Desde então, pesquisadores vêm
tentando estimar o tempo de divergência de várias linhagens (Graur e Li, 2000; Nei e Kumar, 2000;
Bromham e Penny, 2003).
Após vários estudos sobre a divergência de diversas linhagens, ainda é muito discutida a existência
de um relógio molecular global, já que, por exemplo, diferentes porções de genes e de proteínas evoluem
com taxas diferentes, por isso atualmente é mais aceita a idéia de um relógio molecular local. O teste de
razão de verossimilhança (LRT - “Likelihood Ratio Test”) pode ser utilizado para testar se é possível
adotar a existência de relógio molecular para um conjunto de dados (Graur e Li, 2000; Nei e Kumar,
2000). Apesar dessas discussões, as datações baseadas em dados moleculares ainda são muito usadas e
são úteis na discussão da história evolutiva de organismos (Van-Tuinen e Hedges, 2001; Groombridge e
col., 2002; Ribas e Miyaki, 2003).
De modo ideal, a calibração do relógio deve ser obtida de registros fósseis. Mas para aves, tal
registro é escasso, assim, eventos ecológicos ou taxas pré-estabelecidas de substituições nucleotídicas têm
sido adotados para calibrar o relógio (Harrison, 1991; Hedges e col., 1996; Cooper e Penny, 1997).
Muitos autores estimaram taxas de divergência de seqüências mitocondriais e a maioria delas está em
torno de 2% de divergência por milhão de anos, a qual será usada no presente trabalho (Shields e Wilson,
1987; Fleischer e Macintosh, 2001).
1.6 Diversificação Histórica na Região Neotropical
A região neotropical apresenta uma grande diversidade biológica, principalmente as florestas
baixas da América do Sul, onde ocorre a mais diversa fauna de qualquer unidade biogeográfica do planeta
(Haffer, 1990). A avifauna da América do Sul, por exemplo, é a mais rica do mundo, possuindo mais de
3000 espécies, dentre estas, 256 são endêmicas (Stotz e col., 1996; Nores, 2000).
A origem da diversidade da América do Sul é bastante discutida e diversas teorias foram
propostas. Entre essas teorias estão os modelos de centros de origem e dispersão (Reig, 1984), rios como
barreira (Wallace, 1852; Hayes e Sewlal, 2004), gradientes ecológicos (Endler, 1982), dinâmica de rios
(Salo e col., 1986), vicariância geotectônica (Nelson e Platnick, 1978), teoria dos refúgios (Haffer, 1969;
Vanzolini e Williams, 1970) e hipótese da laguna (Marroig e Cerqueira, 1997). Nenhuma dessas hipóteses
é aceita como a única explicação, mas vários eventos devem ter contribuido durante a história da América
do Sul gerando a diversidade de fauna e flora atuais (Bush, 1994; Marroig e Cerqueira, 1997). As
15
reconstruções filogenéticas e a estimativa de data dessas divergências podem ajudar a esclarecer a
complexidade da região neotropical (Bush, 1994).
2. Objetivos
A presente dissertação tem por objetivo gerar uma hipótese filogenética do gênero Ara visando:
– avaliar o monofiletismo do gênero Ara;
– identificar o grupo irmão do gênero Ara, com especial ênfase no posicionamento dos
representantes dos gêneros Primolius, Orthopsittaca e Diopsittaca;
– analisar, sob o ponto de vista biogeográfico, o padrão de diversificação das espécies dos
gêneros estudados.
3. Materiais e Métodos
3.1 Análises Moleculares
Foi coletado com seringa de insulina 0,1ml de sangue da veia braquial da asa de cada indivíduo,
sem prejuízo aos animais. A amostra de cada indivíduo está conservada em etanol absoluto e depositada a
–20ºC no acervo de amostras do Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves (LGEMA) do
Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Além de todas as espécies atuais existentes do gênero Ara, outros táxons foram adicionados à
análise por apresentarem-se filogeneticamente próximas do gênero Ara e de acordo com a
disponibilidade de seqüência. Pyrrhura leucotis e Rhynchopsitta pachyryncha foram utilizados como
grupos externos seguindo resultados do trabalho de Tavares e col. (aceito). Os táxons utilizados estão
descritos na tabela 01, assim como suas procedências e seus números de registro.
Foram seqüenciados dois indivíduos espécie do gênero Ara para confirmar a identidade dos
mesmos, exceto Ara glaucogularis (em nosso acervo há apenas uma amostra dessa espécie) e Ara
ararauna (as seqüências dessa espécie foram obtidas de Tavares e col., 2004). Como em todas as análises
filogenéticas os indivíduos de mesma espécie se agrupam, as análises com os dados combinados foram
realizadas com apenas um indivíduo de cada espécie para minimizar o tempo computacional gasto com as
análises. A espécie Rynchopsitta pachyryncha (grupo externo) não foi incluída nas análises concatenadas
por não ter sido possível alinhar sua RC com as demais espécies.
3.1.1 - Extração de DNA
As amostras de DNA total foram extraídas individualmente utilizando o protocolo modificado de
Bruford e col. (1992) que se baseia na digestão com proteinase K, purificação com
fenol:clorofórmio:álcool:isoamílico e precipitação com etanol.
16
3.1.2 - Reação de Amplificação (PCR – “Polymerase Chain Reaction”)
As reações de amplificação foram realizadas com o tampão de reação fornecido junto com a
enzima Taq polimerase (Pharmacia) 10x concentrado (500mM KCl, 15mM MgCl
2
, 100mM Tris/HCl).
Foi acrescentada a seguinte mistura por tubo de 200μl: 1μl de tampão 10x concentrado, 1μl de dNTPs
(2mM de cada), 0,5μl de oligonucleotídeo iniciador (“primer”) L (10μM), 0,5μl de “primer” H (10μM),
4,9μl de água milli-Q, 2μl de DNA (1-20ng) e 0,1μl de Taq polimerase (5U/μl). Os “primers” utilizados
estão descritos na Tabela 02, assim como a localização em Gallus gallus ou Amazona ochrocephala, suas
seqüências e referências bibliográficas.
Tabela 01: Espécies utilizadas, suas procedências e número de registro do acervo do
LGEMA.
Espécies Procedência Número do Registro
Ara ararauna Criadouro 0013*
Ara glaucogularis Criadouro 0623
Ara glaucogularis Criadouro 0624**
Ara militaris Criadouro 2154
Ara militaris Criadouro 2155
Ara ambigua Criadouro 2331
Ara ambigua Criadouro 2333
Ara macao Aldeia A'Ukre - sul do Pará 3127
Ara macao Aldeia A'Ukre - sul do Pará 3133
Ara chloroptera Pantanal, MS 5368
Ara chloroptera Aldeia A'Ukre - sul do Pará 3139
Ara rubrogenys Criadouro 1000
Ara rubrogenys Criadouro 1899
Ara severa Ilha do Marajó - PA 1629*
Ara severa Criadouro 2407*
Cyanopsitta spixii Criadouro 498*
Diopsittaca nobilis Criadouro 973*
Guarouba guarouba Criadouro 04*
Orthopsittaca manilata Criadouro 1852*
Primolius auricollis Criadouro 2345*
Primolius couloni Criadouro 3142*
Primolius maracana Curucú, Ilha do Marajó 1006*
Aratinga aurea Criadouro 346*
Anodorhynchus hyacinthinus Zoo. Sorocaba 114*
Pyrrhura leucotis Criadouro 3921*
Rynchopsitta pachyryncha “African Safari Zoo” 5237***
*Sequências obtidas por Tavares e col., 2004; **Seqüência obtida apenas pra RC ;
***Seqüência de Tavares e col., 2004, Matsumoto (comunicação pessoal) e deste trabalho.
17
Os “primers” tRNA
Glu
L16737 e 12SrDNAH1735 foram utilizados inicialmente para a
amplificação da Região Controladora (RC), mas não produziram resultados satisfatórios, por isso o par de
“primers” utilizados para essa região em todo o trabalho foi NAD6L16384 e 12SrDNAH1735. Para a
amplificação do rDNA 12S foram utilizados os “primers” tRNA
Phe
L1248 e 16SrDNAH3309. Já para a
amplificação do rDNA 16S utilizamos 16SL2702 e tRNA
Leu
H4017. No caso do ND2 utilizamos
tRNA
Glu
L5146 e tRNA
Trp
H6313. Finalmente, para a amplificação do citocromo b foram usados
ND5L14754 e tRNA
Thr
H16082. Os demais “primers” foram utilizados nas reações de seqüenciamento
(Tabela 02).
Tabela 02: “Primers” utilizados para a amplificação e seqüenciamento.
Nome*
1
Local*
2
Seqüência (5' – 3')
Referências *
3
tRNA
Val
H
2294
CTTTCAGGTGTAAGCTGARTGC
1
tRNA
Leu
H
4017
GCTAGGGAGAGGATTTGAACCTC
1
tRNA
Phe
L
1248
AAAGCATGGCACTGAAGAYGCCAAG
2
tRNA
Glu
L
16737
GCCCTGAAAARCCATCGTTG
2
tRNA
Gln
L
5146
GAACCTACACARAAGRGATCAAAAC
1
tRNA
Trp
H
6313
CTCTTATTTAAGGCTTTGAAGGC
1
tRNA
Thr
H
16082
TCTTTTGGTTTACAAGACCAATG
3
ND2 L
4766
CGWAAAATCCTAGCCTTCTCATCC
1
ND2 H
4766
GGAATGAGAAGGCTAGGATTTTWCG
1
CR 1 L
553
CCTCTGGTTCCTARGTCAGG
2
CR 2 L
827
TCATTTTMRCACTGATGCACTTG
3
CR 1H
1028
AGGTGTAAAACAAAGTGCATCAGGGT
3
CR 2 H
1323
GAGATAGTTGAGGCATAAGTGATTAA
3
12S rDNA L
1918
CAGCCTATATACCGCCGTCGCCAGCCC
3
12S rDNA H
1357
GCGGATACTTGCATGTATATG
3
12S rDNA H
1735
GGATTAGATACCCCACTATGC
3
12S rDNA H
2170
AGGGTGACGGGCGGTATGTACG
3
16S rDNA L
2702
CCTACCGAGCTGGGTGATAGCTGGTT
3
16S rDNA L
2992
CCCTACACCCACAGCAGGCYAACCTAT
este trabalho
16S rDNA H
3309
TGCGCTACCTTCGCACGGT
3
ND5 L
14754
GGACCAGAAGGACTTGCCGACCTA
4
CB L
15416
GTCGGGTTGTCTACGGAGA
3
CB L
15637
AACCTCCTAGGAGACCCAGAAAACTTC
3
CB H
15298
TGAGGCCAAATATCATTCTGAGGGGC
5
CB H
15764
CCTCCTAGTTTGTTGGGGATTGA
3
ND6 L
16384
CACCYCACCCYCAAACAA
3
*1
tRNA: RNA transportador; Val: valina; H: cadeia pesada; Leu: leucina; Phe: fenilalanina; L:
cadeia leve; Glu: ácido glutâmico; Gln: glutamina; Trp: triptofano; Thr: treonina; ND2: NADH
desidrogenase sub-unidade 2; CR: região controladora; rDNA: DNA ribossomal; ND5: NADH
desidrogenase sub-unidade 5; CB: citocromo b; ND6: NADH desidrogenase sub-unidade 6.
*2
Localização no genoma de Gallus gallus (Desjardins e Morais, 1990) ou de Amazona ochrocephala
(Eberhard e col., 2001).
*3
1- Sorenson e col., 1999; 2- Eberhard e col., 2001; 3- Tavares e col., 2004; 4-
Ribas, 2004; 5- Cheng e col., 1994.
18
As reações foram colocadas em termociclador (TC2400 Perkin Elmer) nas seguintes condições:1)
para amplificação das regiões da RC e rDNA 12S - 95ºC por 5 minutos (min.); 40 ciclos de 95ºC por 30
segundos (seg.), 59ºC por 30 seg. e 72ºC por 2,5 min; e 72ºC por 10 min; 2) para amplificação das regiões
rDNA 16S e citocromo b - 95ºC por 5 min.; 40 ciclos de 95ºC por 30 seg., 54ºC por 30 seg. e 72ºC por 1
min.; e 72ºC por 10 min.; e 3) para o ND2 - 95ºC por 5 min.; 40 ciclos de 95ºC por 30 seg., 56ºC por 30
seg. e 72ºC por 1 min.; e 72ºC por 10 min. Cerca de 1/10 do volume total das amostras amplificadas
foram carregadas em gel de agarose 1% com padrão de tamanho conhecido para verificar se os
fragmentos obtidos possuíam o tamanho esperado.
3.1.3 - Corte de banda do produto da RC
Devido à existência de bandas extras na amplificação da RC, a banda de interesse, com
aproximadamente 2Kb foi cortada e feita re-amplificação segundo o protocolo a seguir. Todo o material
amplificado foi aplicado em gel de agarose “Low Melting Point” 1% e fracionado sob voltagem baixa
(50V) por aproximadamente 1 hora. Em seguida o gel foi corado com brometo de etídeo e deixado em
água por 30 minutos. Em seguida, uma amostra da banda desejada foi retirada do gel com auxílio de uma
pipeta Pasteur descartável e colocada em um tubo. Logo em seguida foi acrescentado de 50 a 100μl de
água milli-Q e a amostra foi então aquecida por 15 min. a 70ºC e mantida a temperatura ambiente.
3.1.4 - Re-amplificação da RC
Após o corte da banda, para abranger a maior parte possível da RC, foi necessário realizar duas re-
amplificações de cada produto antes de iniciar a reação de seqüenciamento. A Figura 05 mostra a
localização dos “primers” utilizados para a re-amplificação e para o seqüenciamento desses segmentos.
Figura 05: Esquema da RC com a localização dos pares de “primers” utilizados nas re-amplificações. A re-
amplificação com os pares de “primers” em vermelho (LGlu16737 e CRH1323) foi nomeada re-amplificação A e
a re-amplificação com os pares de “primers” em verde (CRL553 e 12SH1735) foi nomeada re-amplificação B.
“Primers” em preto foram utilizados somente na reação de seqüenciamento. Glu: ácido glutâmico; RC: região
controladora; Phe: fenilalanina; 12S: DNA ribossomal 12S.
19
3.1.5 - Purificação dos produtos amplificados
Quando os produtos de amplificação se mostraram como uma banda única em gel de agarose cerca
de 5μl do produto foram purificados com a adição de 0,5μl de fosfatase alcalina de camarão (1U/μl) e
0,5μl de exonuclease I (10U/μl) e incubados por 1 hora a 37ºC, seguido de 10 minutos a 80ºC.
Na fase final do projeto a purificação foi feita com o Poli-etileno-glicol (PEG) segundo o
protocolo a seguir. Para cada volume de reação de amplificação foi acrescentado o mesmo volume de
PEG 20%, misturado e incubado por 15 min. a 37ºC. Em seguida, centrifugado por 15 min. a 12.000
RPM. Logo depois todo o sobrenadante foi descartado e acrescentado 125μl de etanol 80% e novamente
centrifugado por 15 min. a 12.000 RPM. Em seguida essa operação foi repetida. Para finalizar, o
precipitado foi secado à vácuo e o produto purificado foi então dissolvido em 10μl de água-milli-Q e
reservado por 24 horas.
3.1.6 - Reação de seqüenciamento
O kit de seqüenciamento utilizado foi o “Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit” (Applied
Biosystems). Para cada reação foi adicionada em um tubo de microcentrífuga de 200μl, a seguinte
mistura: 1,5μl de solução “Big Dye”, 1,3μl de “primer” 10μM e aproximadamente 200ng de DNA. As
reações foram colocadas no termociclador (TC2400 ou 9600, Applied Biosystems) na seguinte condição:
96ºC por 1 min., 30 ciclos de 96ºC por 10 seg., 50ºC por 30 seg. e 60ºC por 4 min.
Para a RC todos os “primers” da Figura 05 foram utilizados nas reações de seqüenciamento, sendo
que o “primer” CRL827 foi utilizado para o seqüenciamento das amostras a partir da re-amplifiação B e o
"primer" CRH1028 a partir da re-amplificação A.
3.1.7 - Precipitação dos produtos para seqüenciamento
Antes de carregar as amostras no gel de seqüenciamento, elas foram purificadas individualmente,
segundo o protocolo a seguir. Foi acrescentado à reação 80μl de isopropanol 70%, misturado, deixado em
repouso por 20 min. e centrifugada por 30 min. Em seguida, todo o sobrenadante foi descartado e
acrescentado 200μl de etanol 75% e centrifugado por 10 min. Para finalizar, o DNA precipitado foi seco à
vácuo.
3.1.8 - Seqüenciamento automático
O seqüenciador utilizado foi o ABI 377/36 (Applied Biosystems) adquirido junto ao projeto
genoma Xylella fastidiosa (FAPESP). O gel de acrilamida foi preparado seguindo as instruções do
fabricante. O produto do seqüenciamento foi ressuspendido em 1,6μl de formamida:dextran azul 25mM
EDTA (5:1) e desnaturado por 2 minutos à 90ºC em banho seco. Foram carregados no gel 1,6μl de cada
amostra. Algumas amostras foram seqüenciadas no ABI 3700 ou 3100 nesse caso, o produto de
20
seqüenciamento foi re-ssuspendido em 10μl de formamida Hi-Di e também desnaturado.
3.1.9 - Análises das sequências
Para cada fragmento amplificado, foi seqüenciada tanto a cadeia leve, quanto a cadeia pesada.
Ambas seqüências foram comparadas com seqüências de um banco de dados público, “GenBank”
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), para confirmar sua identidade. Esta pesquisa é realizada utilizando-se de
um programa de alinhamento denominado “BLASTn”. As seqüências da cadeia pesada, obtidas para cada
região de cada indivíduo foram revertidas e complementadas para que ficassem idênticas às da cadeia
leve. Este procedimento foi realizado no programa de computador “Sequence Navigator” (Applied
Biosystems). Estas seqüências foram alinhadas no programa “Clustal X” (Thompson e col., 1997). A
seguir, a matriz de seqüências foi exportada como arquivo texto e importada para o MacClade 4.0
(Maddison e Maddison, 2000) para nova verificação do alinhamento.
Foram construídos gráficos de saturação com todos os táxons estudados. Em tais gráficos, foram
comparados os números de transições e de transversões pela distância p para cada região do genoma
mitocondrial. Se essa relação não é linear, mas em forma de hipérbole, indica que existe saturação dos
dados por substituições múltiplas. Tal problema poderia ser minimizado atribuindo-se pesos a diferentes
tipos de substituições (no presente estudo isso não foi necessário). Também foi realizado um teste de
composição de bases baseado no X
2
com todos os táxons no programa PUZZLE 4.0 (Strimmer e Haeseler,
1997), pois grandes diferenças nas composições de bases podem resultar em topologias incorretas.
As seqüências dos diferentes genes foram analisadas isoladamente e concatenadas por máxima
parcimônia (MP) e máxima verossimilhança (MV) no PAUP* (versão 4.0b8; Swofford e col., 2001) por
busca heurística e algoritmo “tree bisection and reconnection” (TBR) para gerar diferentes topologias. Nas
análises utilizando a metodologia de MP foram utilizadas buscas heurísticas com 1000 réplicas e as
inserções e deleções não foram consideradas (“missing data”). Nas análises de MV foram utilizados os
modelos evolutivos selecionados pelo programa MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998) e buscas
heurísticas com 10 réplicas e as inserções e deleções não foram consideradas (“missing data”). Para
avaliar a sustentação dos agrupamentos obtidos nas árvores, foi utilizado o “bootstrap” (Felsenstein,
1985), com 1000 réplicas para MP (“full heuristic search”) e 100 réplicas para MV (“fast stepwise-
addition”).
A matriz de seqüências combinadas foi testada quanto à compatibilidade entre os genes, “Partition
Homogeneity test” (Farris e col., 1995) no PAUP* (versão 4.0b8; Swofford e col., 2001). Esse teste
analisa a matriz de seqüências avaliando se há ou não conflito filogenético entre os genes. Além disso,
foram realizadas análises utilizando métodos bayesianos implementados no programa Mr. Bayes v3.0b4
(Huelsenbeck e Ronquist 2001). Essas análises foram realizadas somente com os genes concatenados.
Duas análises (uma por 2 milhões e a outra por 4 milhões de gerações) foram realizadas considerando a
21
existência de diferentes partições, ou seja, adotando os modelos evolutivos selecionados para cada gene
pelo programa MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998). Outras duas análises (uma por 2 milhões e a
outra por 4 milhões de gerações) foram realizadas sem considerar as partições, ou seja, foi adotado um
único modelo evolutivo para a matriz com os genes concatenados, também selecionado no programa
MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998), Em todas as análises foram utilizadas cinco cadeias (quatro
quentes e uma fria). Essas análises foram realizadas na “Computational Biology Service Unit at the
Cornell Theory Center” da Universidade de Cornell (http://cbsuapps.tc.cornell.edu) que dispõe de um
“cluster” de computadores de uso público.
Para testar a hipótese do relógio molecular, um teste de razão de verossimilhança (LRT) com o
número de terminais menos dois graus de liberdade foi aplicado à matriz com os dados concatenados para
comparar os valores de verossimilhança das árvores de MV com e sem a restrição do relógio molecular
(Huelsenbeck e Rannala, 1997). A taxa de calibração adotada foi de 2% de divergência no citocromo b
por milhão de anos (m.a.), esta taxa foi inicialmente descrita para mamíferos (Brown e col., 1982), mas
também foi estimada e aplicada em trabalhos com aves (Shields e Wilson, 1987; Randi, 1996; Klicka e
Zink, 1997; Lucchini e col., 2001). Como essa taxa foi originalmente estimada para seqüências do
citocromo b e os nossos dados estão baseados em genes adicionais, utilizamos a árvore de MV obtida com
os dados combinados e consideramos os valores dos tamanhos de ramos baseados somente nas seqüências
do citocromo b. Com esses dados, estimamos a data de um dos nós desta árvore adotando a taxa de 2%
por m.a. Essa data foi então usada para obter uma taxa para as seqüências de todos os genes estudados.
Finalmente, essa taxa re-calibrada foi aplicada aos tamanhos de ramos da mesma árvore de MV baseados
nas seqüências concatenadas. Essa estratégia foi utilizada por Ribas (2005).
3.2 Análises Morfológicas
Foram analisadas peles de Ara ararauna, A. macao, A. chloroptera, A. severa, Orthopsittaca
manilata, Primolius maracana, P. auricollis, Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba, Aratinga aurea,
Cyanopsitta spixii e Anodorhynchus hyacinthinus do Museu de Zoologia da USP; peles de Ara militaris
do Museu de História Natural de Taubaté; dois indivíduos de cativeiro de Ara militaris e um indivíduo de
cativeiro de Ara rubrogenys; e fotos de Ara glaucogularis do “American Museum of Natural History” e
de Primolius couloni da “Academy of Natural Sciences of Philadelphia” (não foi possível localizar peles
ou aves vivas dessas espécies). Adicionalmente, foram consultados dados da literatura sobre essas
espécies, inclusive de A. ambigua.
A coloração das seguintes partes do corpo foi analisada: maxila; mandíbula; rêmiges primária e
secundária (vistas dorsal e ventral); grandes coberteiras das primárias e secundárias (vista dorsal);
coberteiras inferiores; porção distal das retrizes (vista dorsal); porção medial das retrizes (vista dorsal);
porção proximal das retrizes (vista dorsal); vista ventral das retrizes; e anel perioftálmico. Também foi
22
analisada a presença ou ausência de penas ao redor dos olhos e penas em fileiras na região perioftálmica.
A figura 06 ilustra as partes do corpo estudadas. Foi realizada análise por Máxima Parcimônia com 1000
réplicas, “full heuristic search” no programa PAUP* (versão 4.0b8; Swofford e col., 2001) com os dados
obtidos.
Figura 06: Nomenclatura das partes do corpo de uma ave. A-Ara chloroptera e B-Anodorhynchus hyacinthinus.
Figura modificada de Abramson e col., 1995.
23
3.3 Mapeamento de Caracteres
Os estados dos caracteres morfológicos e de algumas trincas de seqüências da Região Controladora foram
mapeados na topologia de MV dos dados combinados no programa Mesquite 1.05 (Maddison e Maddison, 2004)
para avaliar a informação filogenética dos mesmos. O mapeamento foi realizado por MP.
4. Resultados
4.1Dados moleculares
Para todas as seqüências de segmentos estudados separados e combinados, foi analisada a presença
de saturação e em todos os casos foi encontrado uma relação linear crescente entre as taxas de transição e
transversão versus distância p, o que indica que não foi detectada evidência de saturação dos dados (dados
não apresentados). Em pesquisa no “GenBank” as seqüências apresentaram alta identidade com as de
espécies de psitacídeos depositadas no banco (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004). Além disso, o
programa PUZZLE 4.0 (Strimmer e Haeseler, 1997) identificou que, estatisticamente, a composição de
bases é similar entre os táxons (dados não apresentados). O teste de compatibilidade entre os genes,
“Partition Homogeneity Test” (Farris e col., 1995) não indicou conflito filogenético entre as regiões
estudadas (dados não apresentados).
As evidências de que as seqüências obtidas no presente trabalho possuem origem mitocondrial
são: 1) os segmentos amplificados apresentaram tamanhos superiores a 1Kb, o que corresponde a
tamanhos maiores que a média detectada de porções mitocondriais translocadas para o genoma nuclear de
galinha (Pereira e Baker, 2004); 2) obtenção de somente uma banda visível no gel de agarose (exceto para
a região controladora) e de tamanho esperado; 3) identidade alta com seqüências depositadas no
“GenBank”; 4) os eletroferogramas não apresentaram picos duplos, sugerindo que somente um produto de
PCR foi seqüenciado; 5) a porcentagem de A e C é maior que de G e T (Tabela 03), o que é esperado para
o DNA mitocondrial (Desjardins e Morais, 1990); 6) não foram encontrados códons de término
inesperados nas seqüências dos genes codificadores de proteína (ND2 e citocromo b); 7) nas seqüêcias da
RC foram facilmente identificados os blocos conservados e cada domínio possui freqüência de bases de
acordo com outros trabalhos (Randi e Lucchini, 1998; Crochet e Desmarais, 2000; Ruokonen e Kvist,
2002; Pereira e col., 2004; Roques e col., 2004).
O comprimento da seqüência, o número de táxons analisados, o número de sítios invariáveis, o
número de sítios variáveis não informativos e informativos para parcimônia e a freqüência de
nucleotídeos para cada gene e para os dados combinados estão apresentados na tabela 03.
24
Tabela 03: Comprimento das seqüências obtidas, número de táxons analisados, número de sítios
invariáveis, número de sítios variáveis não informativos e informativos para parcimônia, taxas de
transição e transversão (ti/tv) e freqüência de bases para os táxons estudados.
RC
12S
16S
ND2
Cit. b
Concatenados
Comprimento (pb)
1478
956
837
894
888
5053
Número de táxons analisados
18
19
19
19
19
18
Sítios invariáveis
853
720
626
519
582
3314
Sítios variáveis não informativos
219
105
89
145
109
666
Sítios variáveis informativos
406
131
122
230
197
1073
Ti/Tv
3,06
15,90
14,01
8,56
14,68
5,67
A%
25,30
31,97
34,45
31,49
26,90
29,45
C%
27,90
31,20
30,01
35,75
33,45
31,26
G%
15,14
19,27
18,00
08,83
13,12
14,93
T%
31,66
17,56
17,54
23,93
26,53
24,36
4.1.1 Região Controladora
As primeiras amplificações da RC foram realizadas com os “primers” tRNA
Glu
L16737 e
12SrDNAH1735 (Tabela 02), porém apenas na primeira reação esse par de “primers” apresentou produto,
resultando em apenas uma banda em gel de agarose. Em seguida, as amplificações resultaram em arrasto
com bandas muito fracas. Depois de alguns testes com diferentes temperaturas de hibridação sem
resultado, uma nova alíquota de “primer” tRNA
Glu
L16737 foi sintetizada, mas o problema não foi
solucionado. Então, um outro par de “primers” foi testado: NAD6L16384 e 12SrDNAH1735, o que
resultou em um produto de aproximadamente 2Kb com algumas bandas inespecíficas, por isso a banda
desejada foi retirada do gel de agarose e re-amplificada. O alinhamento das seqüências resultou em uma
matriz com 1478 caracteres.
O domínio I ou TAS, foi delimitado entre as bases 7 e 460. Esse domínio tem uma porcentagem
similar de A, C e T e baixa quantidade de G (Tabela 04). Foi detectada a região poli-C
(CCCCCCCTACCCCCCC) identificada como início desse domínio, entre as bases 7 e 22 e quatro
repetições de TAS (TATAT, entre 60-64pb, 94-98pb e 139-143pb; TACAT, entre 89-93pb).
O domínio II ou central conservado, foi delimitado entre as bases 461 e 849. Esse domínio tem
baixa porcentagem de A e G comparada com C e T (Tabela 04). Os blocos conservados F, E, D e C e
bloco de aves (“bird box”), foram facilmente identificados nas seqüências obtidas quando comparados
com seqüências de outros trabalhos (Randi e Lucchini, 1998; Crochet e Desmarais, 2000; Ruokonen e
Kvist, 2002; Pereira e col., 2004; Roques e col., 2004):
Bloco F: TGACTACTCACGAGAGATCACCAACCCGG, entre 452 e 480pb;
Bloco E: AGCGTCAGGTCCATTCTTTCCCCCTACACCC, entre 504 e 534pb;
Bloco D: CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT, entre 557 e 581pb;
Bloco C: CTGGCCATCTGGTTCGCTATT, entre 611 e 631pb e
25
“Bird Box”: CACTGATGCACTT, entre 837 e 849pb.
O domínio III, foi delimitado a partir da base 850. Esse domínio é rico em A, C e T e muito pobre
em G (Tabela 04). A Origem de Replicação da fita-H (OH) foi localizada entre as bases 850 e 863
(GCTCCCCCATTCGG). Foi encontrada a SBC-1 (ACTTAATGCGACGGTTG) entre as bases 962 e
978, porém SBC-2 e 3 e o promotor optativo bidirecional (Pereira e col., 2004) não foram encontrados.
Este domínio é o mais variável.
Tabela 04: Composição de bases dos três domínios da RC de 18
táxons.
Freqüências dos nucleotídeos
Domínios
A %
C %
G %
T %
I
26,10
24,93
18,40
30,57
II
18,94
28,01
19,60
33,45
III
28,70
30,14
09,72
31,44
Foi observado um bloco conservado entre as bases 1030 e 1033 em todas as espécies estudadas,
porém uma inserção de 3 pares de base (TGG) à esquerda desse bloco (1027 a 1029pb) e uma inserção de
3 pares de base (GGG) à direita desse bloco (1034 a 1036pb) foram observadas apenas nas espécies
Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba, Aratinga aurea e Anodorhynchus hyacinthinus (Tabela 05).
Tabela 05: Porção da Região Controladora entre as bases 1027 e 1036.
Táxons
Seqüências do bloco observado
Espécies do gênero Ara
- - - T T A T - - -
Espécies do gênero Primolius
- - - T T A T - - -
Orthopsittaca manilata
- - - T T A T - - -
Cyanopsitta spixii
- - - T T A T - - -
Pyrrhura leucotis
- - - T T A T - - -
Diopsittaca nobilis
T G G T T A T G G A
Guarouba guarouba
T G G T T A T G G G
Aratinga aurea
T G G T T A T G G G
Anodorhynchus hyacinthinus
T G G T T A T G G G
4.1.2 rDNAs 12S e 16S
A amplificação do rDNA 12S gerou um fragmento de aproximadamente 2Kb, tamanho esperado
com base no genoma mitocondrial de Gallus gallus (Desjardins e Morais, 1990) e não apresentou
nenhuma banda inespecífica. Foram sequenciadas as fitas L e H com os “primers” tRNA
Phe
L1248,
12SrDNAH2170, 12SrDNAL1735, 12SrDNAL1918 e tRNA
Val
H2294 (Tabela 02). Apenas com a amostra
0623 (Ara glaucogularis) não foi obtida a amplificação de um produto de 2Kb, provavelmente isso se
26
deve ao fato de o DNA dessa amostra estar um pouco degradado, então foram utilizados os “primers”
tRNA
Phe
L1248 e tRNA
Val
H2294, para a amplificação do rDNA 12S, o que resultou em uma banda de
aproximadamente 1Kb (para as reações de seqüenciamento, foram utilizados os mesmos “primers”).
Depois das seqüências alinhadas obtivemos 956pb (Tabela 03).
Para a obtenção das seqüências do rDNA 16S, utilizamos os “primers” 16SL2702 e tRNA
Leu
H4017 (Tabela 02), obtendo um fragmento de aproximadamente 1,4Kb sem nenhuma banda inespecífica.
Tal produto permitiu realizar o seqüenciamento das fitas L e H, com os “primers” 16SL2702, 16SL2992,
16SL3309, 16SH3309 e tRNA
Leu
H4017 resultando em 837 pb alinhados (Tabela 03).
4.1.3 ND2
A amplificação do gene ND2 resultou em um único segmento de DNA em gel de agarose de
aproximadamente 1,2Kb. Para as amostras 0623, 2154, 2155, 2331 e 2333, a temperatura de hibridação
foi alterada para 50ºC pois não amplificaram a 56ºC. Somente para a amostra 0623 foram necessárias
duas amplificações: uma com os “primers” tRNA
Glu
L5146 e ND2H5766 e outra com os “primers”
ND2L5766 e tRNA
Trp
H6313. Foram seqüenciadas as fitas L e H com os “primers” tRNA
Glu
L5146,
ND2L5766, ND2H5766 e tRNA
Trp
H6313 (Tabela 02) para todas as amostras. Após o alinhamento das
seqüências, obtivemos 894 pb.
4.1.4 Citocromo b
A amplificação da região do citocromo b, resultou em uma única banda de DNA em gel de agarose
de aproximadamente 1,3Kb. Para a amostra 0623, novamente foram necessárias duas amplificações: uma
com os “primers” ND5L14754 e CBH15764 e outra com os “primers” CBL15298 e tRNA
Thr
H16082.
Foram sequenciadas as fitas L e H com os “primers” ND5L14754, CBH15416, CBL15298, CBH15764,
CBL15637 e tRNA
Thr
H16082 (Tabela 02) para todas as amostras. Após o alinhamento das seqüências,
obtivemos 888 pb.
4.2 Análises Filogenéticas
4.2.1 - RC
A análise de MP resultou em quatro árvores com 1529 passos (dados não apresentados), nas quais
os gêneros Ara e Primolius aparecem dentro do mesmo clado. O mesmo resultado é observado na árvore
de MP com “bootstrap” (Figura 07-A), com o gênero Primolius monofilético com 100% de “bootstrap”.
Para as análises de MV, primeiramente foi selecionado um modelo evolutivo pelo programa
MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998). Neste caso, o modelo determinado foi o HKY + I + G
(Hasegawa e col., 1985), o qual considera os parâmetros de freqüências de bases iguais (A=0,2606;
C=0,2773; G=0,1434 e T=0,3187), de freqüências de transições e transversões variáveis, de proporção de
27
sítios invariáveis (0,2868) e de distribuição gamma (α = 0,6157). A árvore resultante sem “bootstrap”,
apresenta os gêneros Ara e Primolius como reciprocamente monofiléticos, porém nas análises de MV
com “bootstrap” (Figura 07-B) os dois gêneros aparecem no mesmo clado com 52% de “bootstrap”.
Como grupo irmão desse clado surge Orthopsittaca manilata com 67% de “bootstrap”. Os clados bem
suportados nessa análise são (Ara ararauna, A. glaucogularis) com 92% de “bootstrap”, ((A. militaris, A.
ambigua), (A. macao, A. chloroptera)) com 92% de “bootstrap”, sendo que o clado (A. militaris, A.
ambigua) apresenta 100% de “bootstrap” e o clado (A. macao, A. chloroptera) com 85% de “bootstrap”.
Ainda nessas análises, o clado ((Primolius auricollis, P. maracana), P. couloni) apresentou 100% de
“bootstrap” e o clado (Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba) apresentou um “bootstrap” de 100% ,
estando fora do clado das espécies dos gêneros Ara e Primolius.
Figura 07: Árvores enraizadas baseadas em 1478 pb da região controladora com valores de “bootstrap” acima de
50% assinalados. A) máxima parcimônia e B) máxima verossimilhança.
4.2.2 – rDNAs 12S e 16S
A análise de MP com 956 pb do rDNA 12S resultou em apenas uma árvore mais parcimoniosa
com 496 passos (dados não apresentados). Nessa árvore os gêneros Ara e Primolius apresentam-se
reciprocamente monofiléticos, sendo que a espécie Orthopsittaca manilata aparece no clado com as
espécies do gênero Primolius. A árvore resultante de MP com valores de “bootstrap” (Figura 08-A),
apresentou uma politomia basal, tendo um clado monofilético das espécies do gênero Ara com apenas
28
79% de “bootstrap” e, internamente, o clado (A. militaris, A. ambigua) apresenta o maior valor de
“bootstrap” de 100%. Os clados (P. couloni, (P. auricollis, P. maracana) e (Diopsittaca nobilis,
Guarouba guarouba) também apresentam 100% de “bootstrap”.
O modelo evolutivo escolhido pelo MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998) para o segmento
do rDNA12S, foi o TrN + I + G (Tamura e Nei, 1993), no qual as freqüências de bases são variáveis
(A=0,3248; C=0,3201; G=0,1786; T=0,1765), as freqüências de transversões são iguais e as de transição
são variáveis, possui proporção de sítios invariáveis de 0,4456 e distribuição gamma com α = 0,5648. A
árvore de MV sem “bootstrap” (não apresentada), mostra o gênero Ara como monofilético, sendo o táxon
mais próximo Orthopsittaca manilata e o clado mais próximo a este grupo, o do gênero Primolius. Já na
árvore de MV com “bootstrap” (Figura 08-B), a árvore se apresenta politômica com alguns clados bem
suportados: (A. macao, A. chloroptera, (A. militaris, A. ambigua)) com 88% de “bootstrap”, (A. militaris,
A. ambigua) apresenta 96% de “bootstrap”, (Primolius couloni, P. auricollis, P. maracana) apresenta
99% de “bootstrap” e ainda (Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba) com 100% de “bootstrap”.
Figura 08: Árvores enraizadas baseadas em 956 pb do rDNA 12S com valores de “bootstrap” acima de 50%
assinalados. A) máxima parcimônia e B) máxima verossimilhança.
A análise de MP para a região do rDNA 16S resultou em apenas uma árvore mais parcimoniosa de
435 passos (não apresentada). Nessa análise, as espécies dos gêneros Ara e Primolius apresentam-se como
grupos irmãos reciprocamente monofiléticos. Apenas o monofiletismo do gênero Primolius é sustentado
29
pela análise de MP com “bootstrap” (Figura 09-A). Além disso, os mesmos clados bem apoiados com as
análises da região do rDNA 12S foram também obtidos na presente análise com a adição de (A. ararauna,
A. glaucogularis) com 82% de “bootstrap”.
O modelo evolutivo apontado pelo programa MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998) foi o
TrN + G (Tamura e Nei, 1993), o qual considera os parâmetros de freqüências de bases iguais (A=0,3489;
C=0,3056; G=0,1716 e T=0,1739) de freqüências de transversões iguais, de freqüências de transições
variáveis e de distribuição gamma (α = 0,1527). Tal modelo foi utilizado na análise por MV. Na análise
sem “bootstrap” (não apresentada), os gêneros Ara e Primolius aparecem novamente como grupos irmãos.
A análise com “bootstrap” (Figura 09-B) as espécies dos gêneros Ara, Primolius e Orthopsittaca
apresentam-se no mesmo clado, com apenas 52% de “bootstrap”. Apenas três clados apresentaram-se bem
sustentados: o das espécies do gênero Primolius, com “bootstrap” de 99%, (A. ambigua, A. militaris) com
98% e (Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba) com 97%.
Figura 09: Árvores enraizadas baseadas em 837 pb do rDNA 16S com valores de “bootstrap” acima de 50%
assinalados. A) máxima parcimônia e B) máxima verossimilhança.
4.2.3 ND2
A análise de MP para a região do ND2 (894 pb), resultou em apenas uma árvore mais
parcimoniosa de 848 passos (não paresentada). Na análise de MP com “bootstrap” (Figura 10-A) a árvore
30
apresenta o gênero Ara como monofilético com 85% de “bootstrap” e ainda dentro desse clado, (A.
ambigua, A. militaris) apresenta “bootstrap” de 99% e (((A. ambigua, A. militaris), A. chloroptera), A.
macao) possui 100% de “bootstrap”. As espécies do gênero Primolius se agrupam com 100% de
“bootstrap” e ainda (D. nobilis, G. guarouba) apresenta 100% de “bootstrap”.
O programa MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998) apontou o modelo evolutivo TrN + G
(Tamura e Nei, 1993), o qual considera os parâmetros de freqüências de bases iguais (A=0,3159;
C=0,3732; G=0,0829 e T=0,2280), de freqüências de transversões iguais, de freqüências de transições
variáveis e de distribuição gamma (α = 0,2912). Na análise sem o “bootstrap” as espécies dos gêneros Ara
e Primolius aparecem como grupos irmãos e reciprocamente monofiléticos (não apresentada). A figura
10-B ilustra a árvore de MV com “bootstrap” com um clado com apenas 68% de “bootstrap” com todas as
espécies dos gêneros Ara, Primolius e Orthopsittaca. Dentro desse clado, os mais bem suportados são (A.
ambigua, A. militaris) com 99% de “bootstrap”, (((A. ambigua, A. militaris), A. chloroptera), A. macao)
com 96% de “bootstrap” e ((P. auricollis, P. maracana), P. couloni) com 99% de “bootstrap”.
Figura 10: Árvores enraizadas baseadas em 894 pb do ND2, com valores de “bootstrap” acima de 50%
assinalados. A) máxima parcimônia e B) máxima verossimilhança.
4.2.4 Citocromo b
A árvore de MP sem “bootstrap” resultou em apenas uma árvore mais parcimoniosa com 756
31
passos, a qual apresentou o gênero Ara como monofilético e Orthopsittaca manilata como irmã desse
clado (dado não apresentado). A árvore de MP com “bootstrap” (Figura 11-A), apresenta-se politômica,
com 3 clados bem apoiados: (Ara ararauna, A. glaucogularis) com 85% de “bootstrap”, ((Primolius
auricollis, P. maracana) P. couloni) com 100% de “bootstrap” e (Diopsittaca nobilis e Guarouba
guarouba) com 96% de “bootstrap”.
O modelo selecionado pelo programa MODELTEST 3.6 (Posada e Crandall, 1998), foi o TVM + I
+G (Rodríguez e col., 1990), esse modelo considera os parâmetros de freqüências de bases variáveis
(A=0,2843; C=0,3566; G=0,1203 e T=0,2388), de freqüência de transições iguais e de freqüência de
transversões variáveis, de proporção de sítios invariáveis (0,4576) e de distribuição gamma (α = 0,6863).
A árvore de MV sem “bootstrap” (não mostrada) apresenta as espécies do gênero Ara e a espécie
Orthopsittaca manilata no mesmo clado e o gênero Primolius como grupo irmão desse clado. A figura
11-B, apresenta a árvore de MV com “bootstrap”, essa análise resultou em uma árvore politômica, com 4
clados bem sustentados: (Ara ararauna, A. glaucogularis) com 97% de “bootstrap”, ((A. macao, A.
chloroptera), (A. militaris, A. ambigua)) com 81% , (Primolius auricollis, P. maracana, P. couloni) com
99% e (Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba) com 100%.
Figura 11: Árvores enraizadas baseadas em 888 pb do citocromo b, com valores de “bootstrap” acima de 50%
assinalados. A) máxima parcimônia e B) máxima verossimilhança.
32
4.2.5 Seqüências Concatenadas
Como o teste de compatibilidades entre os genes, “Partition Homogeneity test” (Farris e col.,
1995), realizado com a matriz de dados combinados não revelou conflito filogenético, foram realizadas as
análises de MP e MV com as seqüências de todos os genes concatenados. A análise de MP resultou em
uma árvore mais parcimoniosa com 3821 passos (não mostrada). Essa árvore apresenta os gêneros Ara e
Primolius reciprocamente monofiléticos e como grupos irmãos, este monofiletismo se mantém nas
análises com “bootstrap” (Figura 12) com 100% de suporte para cada clado, porém o nó que une esses
dois grupos como irmãos é de 61%. A espécie Orthopsittaca manilata apresenta-se como grupo irmão
desse clado e, mais basalmente, surge a espécie Cyanopsitta spixii. As espécies Diopsittaca nobilis e
Guarouba guarouba mantêm-se em um clado com 100% de “bootstrap”, dentro de um clado maior com
Anodorhynchus hyacinthinus, com apenas 65% de “bootstrap”.
Figura 12: Árvore de máxima parcimônia enraizada baseada em 5053 pb dos genes combinados (região
controladora, rDNA12S, rDNA 16S, ND2 e citocromo b), com valores de “bootstrap” acima de 50% assinalados.
33
Para as análises de MV o modelo evolutivo selecionado foi o TrN+I+G (Tamura e Nei, 1993),
com freqüências de bases variáveis (A=0,3019; C=0,3171; G=0,1418; T=0,2392), freqüências iguais de
transversões e as de transição variáveis, proporção de sítios invariáveis (0,4066) e distribuição gamma
(α=0,6479). Na análise de MV sem “bootstrap” (não apresentado) também foi recuperado o
monofiletismo recíproco dos gêneros Ara e Primolius e os dois como grupos irmãos. Esses resultados se
mantiveram na árvore de MV com “bootstrap” (Figura 13), com 89% de “bootstrap” no clado do gênero
Ara e 100% no clado do gênero Primolius e o nó que une esses dois grupos foi de 76%. Orthopsittaca
manilata aparece como grupo irmão desse clado maior com “bootstrap” de 91%. Já Diopsittaca nobilis se
agrupa a Guarouba guarouba com 100% de “bootstrap”.
Figura 13: Árvore de máxima verossimilhança enraizada baseada em 5053 pb dos genes combinados (região
controladora, rDNA12S, rDNA 16S, ND2 e citocromo b), com valores de “bootstrap” acima de 50% assinalados.
34
Todas as árvores resultantes das análises bayesianas considerando ou não modelos evolutivos
distintos para cada partição e número de gerações diferentes, resultam na mesma topologia e mostram que
os gêneros Ara e Primolius são reciprocamente monofiléticos com probabilidades posteriores de 1.00 para
ambos e para o nó que une os dois clados. A árvore apresentada no presente trabalho é a da análise de
quatro milhões de gerações considerando as partições (Figura 14). Ainda nessa árvore, o clado dos
gêneros Ara e Primolius apresenta Orthopsittaca manilata como grupo irmão com probabilidade posterior
de 1.00. Enquanto Diopsittaca nobilis se agrupa a Guarouba guarouba também com probabilidade
posterior de 1.00.
Figura 14: Árvore de análise bayesiana enraizada baseada em 5053 pb dos genes combinados (região
controladora, rDNA12S, rDNA 16S, ND2 e citocromo b), com valores de probabilidades posteriores acima de 0.50
apresentadas acima dos ramos.
35
4.3 Dados Morfológicos
A matriz com os dados morfológicos está apresentada na tabela 06 com as características e estados
estudados. A análise filogenética dos dados morfológicos por MP, resultou em quatro árvores com 112
passos. Em nenhuma topologia o gênero Ara aparece monofilético. A árvore de MP com “bootstrap”
(Figura 15) apresenta-se politômica com apenas três clados bem sustentados: (Ara ararauna, Ara
glaucogularis) com 100% de “bootstrap”; (Anodorhynchus hyacinthinus, (Ara ararauna, Ara
glaucogularis)) com 93% de “bootstrap” e (Ara chloroptera, Ara macao) com 95% de “bootstrap”.
Tabela 06: Matriz de caracteres morfológicos
Espécies
Caracteres
1
1111111
1234567890123456
Ara ararauna
0000110010001111
Ara glaucogularis
0000110010001111
Ara chloroptera
4000444440664111
Ara macao
4000444440664010
Ara rubrogenys
0000223320332111
Ara militaris
0000223320662121
Ara ambigua
0000223320662121
Ara severa
0000333330663111
Primolius couloni
1100223320662101
Primolius auricollis
1000223320662010
Primolius maracana
0000223320662010
Orthopsittaca manilata
3033223323432010
Diopsittaca nobilis
3033223323332110
Cyanopsitta spixii
0022552252225010
Guarouba guarouba
2133115515541110
Aratinga aurea
00332233233320?0
Anodorhynchus hyacinthinus
0011001101110130
Pyrrhura leucotis
00000033246341?0
1
Caracteres e seus estados definidos como se segue: (1) Maxila: 0 preta, 1 preta
com ponta córnea, 2 córnea, 3 córnea com ponta preta e 4 córnea com base e ponta
preta; (2) Mandíbula: 0 preta e 1 córnea; (3) Rêmiges primárias, vista dorsal: 0 azul
turquesa ou metálico, 1 azul cobalto, 2 azul acinzentado e 3 verde militar ou lima; (4)
Rêmiges secundárias, vista dorsal: 0 azul turquesa ou metálico, 1 azul cobalto, 2 azul
acinzentado e 3 verde militar ou lima; (5) Rêmiges primárias, vista ventral: 0 preto, 1
amarelo brilhante, 2 amarelo ouro, 3 amarelo oliva, 4 vermelho violeta, 5 vermelho vivo
ou escarlate e 6 marrom; (6) Rêmiges secundárias, vista ventral: 0 preto, 1 amarelo
brilhante, 2 amarelo ouro, 3 amarelo oliva, 4 vermelho violeta, 5 vermelho vivo ou
escarlate e 6 marrom; (7) Grandes coberteiras das primárias, vista dorsal: 0 azul
turquesa ou metálico, 1 azul colbato, 2 azul acinzentado, 3 verde militar ou lima, 4
36
verde militar mais azul ou mais amarelo, 5 amarelo brilhante; (8) Grandes coberteiras
das secundárias, vista dorsal: 0 azul turquesa ou metálico, 1 azul colbato, 2 azul
acinzentado, 3 verde militar ou lima, 4 verde militar mais azul ou mais amarelo, 5
amarelo brilhante; (9) Coberteiras inferiores: 0 preto, 1 amarelo brilhante ou amarelo
ouro, 2 amarelo oliva, 3 vermelho violeta, 4 vermelho vivo ou escarlate e 5 marrom;
(10) Porção distal das retrizes, vista dorsal: 0 azul turquesa ou metálico, 1 azul cobalto,
2 azul acinzentado, 3 verde militar ou verde militar mais azul, 4 vermelho bordô e 5
amarelo brilhante; (11) Porção mediana das retrizes, vista dorsal: 0 azul turquesa ou
metálico, 1 azul cobalto, 2 azul acinzentado, 3 verde militar ou lima, 4 verde militar
mais azul ou mais verde, 5 amarelo brilhante e 6 vermelho bordô ou vermelho bordô
mais verde; (12) Porção proximal das retrizes, vista dorsal: 0 azul turquesa ou metálico,
1 azul cobalto, 2 azul acinzentado, 3 verde militar, 4 amarelo brilhante, 5 vermelho vivo
ou escarlate e 6 vermelho bordô; (13) Retrizes, vista ventral: 0 preto, 1 amarelo
brilhante ou amarelo ouro, 2 amarelo oliva, 3 vermelho violeta, 4 vermelho vivo, 5
marrom; (14) Penas ao redor do anel perioftálmico: 0 ausente e 1 presente; (15) Cor do
anel perioftálmico: 0 preto, 1 branco, 2 rosado e 3 amarelo ouro; (16) Fileira de penas
na região da face: 0 ausente e 1 presente.
Figura 15: Árvore de Máxima Parcimônia enraizada, baseada em caracteres morfológicos, com valores de
“bootstrap” acima de 50% assinalados.
37
4.4 Mapeamento de Caracteres
Considerando as relações filogenéticas da árvore de MV com os dados moleculares concatenados,
todos os caracteres morfológicos estudados apresentam homoplasia (Figura 16). É interessante ressaltar
que Ara macao, A. chloroptera e seu ancestral comum possuem estados exclusivos para os caracteres
maxila; rêmiges primárias e secundárias, vista dorsal; grandes coberteiras das primárias e secundárias,
vista dorsal; e coberteiras inferiores. Vale ressaltar que o caráter “fileira de penas na região perioftálmica”
mostra que dentro do gênero Ara, somente para A. macao essas fileiras estão ausentes. O mapeamento da
presença ou ausência de duas trincas de bases na região controladora (bases 1027 a 1029 e bases 1034 a
1036) revelou que pode ter havido um evento de ganho das trincas seguido de outro de perda das mesmas.
Figura 16: Mapeamento dos caracteres. A área de cada cor nos círculos nos nós representa a probabilidade de
cada estado no respectivo ancestral.
38
Continuação da Figura 16
4.5 Relógio Molecular
O teste de razão de verossimilhança (“Likelihood ratio test”, Huelsenbeck e Rannala, 1997), não
detectou diferenças significativas entre a árvore de MV com e sem relógio molecular. Com a árvore de
MV obtida com os dados combinados e as seqüências do citocromo b, uma estimativa de tempo foi obtida
para o nó que separa a espécie Cyanopsitta spixii das espécies dos gêneros Ara, Primolius e Orthopsittaca
(9,15 m.a.). Usando essa estimativa de tempo, uma nova taxa foi calculada para as seqüências
concatenadas (1,83% por m.a.). Essa taxa foi então utilizada para datar as divergências observadas (Figura
17). O intervalo de data de cada nó foi calculado baseado na menor distância p entre o referido nó e um dos
terminais e na maior distância p entre o referido nó e o outro terminal seguindo Moyle (2005).
39
/---------------------- Ara ararauna
/--------4,13
| \---------------------- Ara glaucogularis (Mapa A)
6,04
|\-------------------------------- Ara rubrogenys
|
| /----- Ara militaris
| /----------0,95(0,8-1,1) (Mapa B)
/----6,13(6,1-6,8) | \----- Ara ambigua
| | /------------3,12(3,0-3,5)
| | | | /-------------- Ara macao
| | | \-2,54(2,5-2,62) (Mapa C)
| \5,75(5,70-6,44) \-------------- Ara chloroptera
| |
/7,4(6,7-8,6)\------------------------------ Ara severa (Mapa D)
| |
| | /------- Primolius auricollis
| | /1,26(0,9-1,5)
/8,17(7,86-8,63) | \------- Primolius maracana (Mapa E)
| | \-----------------------------1,76(1,6-2,0)
| | \--------- Primolius couloni
/-9,15(9,00-10,49)
| | \-------------------------------------------- Orthopsittaca manilata (Mapa F)
| |
| \------------------------------------------------- Cyanopsitta spixii
/-10,44(9,6-12,1)
| | /------------------------ Diopsittaca nobilis
| | /------------------------4,51(4,1-4,6) (Mapa G)
| | | \------------------------ Guarouba guarouba
/--11,11(9,2-13,3)\---9,50(8,8-9,6)
| | \--------------------------------------------------- Anodorhynchus hyacinthinus
| |
14,03(10,2-16,4)\---------------------------------------------------------- Aratinga aurea (Mapa H)
|
\--------------------------------------------------------------------------- Pyrrhura leucotis
Figura 17: Árvore de máxima verossimilhança linearizada com relógio molecular. As datas de divergência
estimadas em milhão de anos (m. a.) se encontram nos nós e o intervalo das datas entre parênteses. Os mapas
apresentam a distribuição geográfica das espécies estudadas e suas sobreposições geográficas.
40
5. Discussão
Dentre todos os genes estudados, a RC apresenta a maior porcentagem de sítios variáveis
informativos para parcimônia, seguida dos genes que codificam para proteína (ND2 e citocromo b;
25,73% e 21,24%, respectivamente) e, finalmente, os genes ribossomais (12S e 16S; 13,71% e 14,58%,
respectivamente). As seqüências da região controladora (RC) revelaram que as porções conservadas em
aves (poli-C, repetições TAS, blocos conservados F a C, origem de replicação OH e SBC) foram
facilmente identificadas. O domínio II ou central da RC foi o mais conservado entre as espécies
estudadas, enquanto que os domínios I e III apresentaram maior variação, esse padrão era o esperado de
acordo com o que foi descrito em aves (Randi e Lucchini, 1998; Crochet e Desmarais, 2000; Ruokonen e
Kvist, 2002; Pereira e col., 2004; Roques e col., 2004). Considerando todos os táxons ou somente as
espécies do gênero Ara, a média das distâncias p da RC é maior (0,1258 e 0,083, respectivamente) do que
a do citocromo b (0,0951 e 0,074, respectivamente). Já os valores encontrados somente entre as espécies
do gênero Primolius mostram maior média de diferenças com o citocromo b (0,032 versus 0,027 para a
RC). Segundo Ruokonen e Kvist (2002), as médias de divergência desses genes variam de acordo com
cada gênero, pois nesse estudo, a taxa de divergência da RC foi maior do que a do citocromo b entre as
espécies do gênero Cyanoramphus e o inverso nas espécies dos gêneros Alectoris e Polioptila.
A análise filogenética dos genes separados resultou em topologias bastante concordantes, sendo
que as obtidas com a RC foram as que se apresentaram mais semelhantes àquelas resultantes dos dados
combinados. O monofiletismo do gênero Ara não foi obtido em nenhuma análise com os genes isolados.
Já o monofiletismo do gênero Primolius foi obtido com bons valores de “bootstrap” em todas as análises.
Alguns clados se apresentaram com bom suporte em quase todas análises com os genes independentes:
(Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba), figuras 07 a 11; ((Ara ambigua, A. militaris), (A. chloroptera,
Ara macao)), figuras 07, 08, 09, 10 e 11. O fragmento analisado do gene ND2 foi o único que não
apresentou Ara ararauna e A. glaucogularis como espécies irmãs, assim como A. chloroptera e A.
macao. A. macao mostrou-se basal no clado (((A. ambigua, A. militaris), A. chloroptera), A. macao)). As
relações das espécies Orthopsittaca manilata, Cyanopsitta spixii, Anodorhynchus hyacinthinus e Aratinga
aurea não foram bem resolvidas. As espécies Rynchopsitta pachyryncha e Pyrrhura leucotis foram
utilizadas como grupo externo em todas as análises, exceto para a RC, pois não foi possível alinhar a
seqüência de Rynchopsitta pachyryncha com as demais espécies, possivelmente por ser uma espécie
filogeneticamente distante das demais espécies estudadas (Tavares e col., aceito).
Nas análises com os dados moleculares combinados (Figuras 12, 13 e 14), o gênero Ara apresenta-
se monofilético tendo o clado com as espécies do gênero Primolius como grupo irmão de Ara. Essa
relação de grupos irmãos está de acordo com estudos prévios (Tavares e col, 2004; aceito), porém a
sustentação para essa relação não estava bem suportada nesses trabalhos. As relações entre as espécies do
gênero Primolius se apresentaram bem estabelecidas, sendo P. auricollis e P. maracana espécies irmãs
41
(98 % de bootstrap” em MP, 87 % de “bootstrap” em MV e 1.00 de probabilidade posterior) e P. couloni
sendo a mais basal. Algumas relações entre as espécies do gênero Ara também se apresentaram bem
sustentadas. Ara ararauna e A. glaucogularis se mostram como espécies irmãs com 100 % de “bootstrap”
tanto para MP como para MV e 1.00 de probabilidade posterior. Essas espécies são muito parecidas
morfologicamente (Figura 01 A e B). As espécies A. militaris e A. ambigua também se apresentam como
irmãs com 100 % de “bootstrap” tanto para MP como para MV e 1.00 de probabilidade posterior, elas
também são muito parecidas morfologicamente (Figura 01 C e D), e outra relação de espécies irmãs bem
suportada é a relação entre A. macao e A. chloroptera (97 % de “bootstrap” em MP, 79% em MV e 1.00
de probabilidade posterior), essas espécies também são morfologicamente muito semelhantes (Figura 01
E e F). Ainda nessas análises, o clado ((A. militaris, A. ambigua), (A. macao, A. chloroptera)) também
aparece muito bem suportado (100 % de “bootstrap” em MP e em MV e 1.00 de probabilidade posterior).
As relações filogenéticas de A. rubrogenys e de A. severa dentro do clado com as demais espécies do
gênero Ara não puderam ser bem estabelecidas. Na análise de MP A. rubrogenys e A. severa se agrupam
com 81 % de “bootstrap” este clado aparece como irmão do grupo (A. ararauna, A. glaucogularis) com
72 % de “bootstrap”. Já nas análises por MV A. rubrogenys e A. severa não apresentam relações bem
resolvidas com as demais espécies do gênero Ara. Finalmente, nas análises Bayesianas A. severa agrupa-
se com o clado ((A. militaris, A. ambigua), (A. macao, A. chloroptera)), porém com baixíssima
probabilidade posterior (0.65) e A. rubrogenys não tem relação bem definida com nenhum táxon ou clado
do gênero Ara. Para tentar melhorar a resolução, foram seqüenciados fragmentos do gene nuclear beta-
fibrinogênio. No entanto, a variação entre as seqüências foi bastante baixa, com distâncias p entre pares
de táxons de 0,0033 e 0,0099. As análises filogenéticas por MP e MV não melhoraram a resolução das
relações de Ara rubrogenys e de A. severa. Assim, estas relações ainda permanecem em aberto.
A espécie Orthopsittaca manilata deve ser a espécie irmã do clado dos gêneros Ara e Primolius
(76 % de “bootstrap” em MP, 91% em MV e 1.00 nas análises Bayesianas). Relacionado a esse grupo, se
encontra Cyanopsitta spixii (98 % de “bootstrap” em MP, 93% em MV e 1.00 nas análises Bayesianas).
Essa associação próxima entre o clado dos gêneros Ara e Primolius, O. manilata e C. spixii foi também
encontrada por Tavares e col. (aceito).
Diopsittaca nobilis se apresenta sempre agrupada com Guarouba guarouba (100 % de “bootstrap”
em MP e em MV e 1.00 de probabilidade posterior) essa relação também foi obtida nos trabalhos de
Tavares e col. (2004) e de Tavares e col. (aceito) com altos valores de “bootstrap”. A taxonomia de ambas
as espécies foi bastante discutida, sendo que D. nobilis já foi incluída no gênero Ara e Sick (1997) cita
que sua vocalização é semelhante às das espécies do gênero Aratinga. Enquanto G. guarouba já foi
incluída no gênero Aratinga e Sick (1997) cita também que sua etologia pode lembrar a das araras. Assim,
a relação entre essas espécies necessitaria ser estudada com mais cuidado. A espécie Anodorhynchus
hyacinthinus, apesar de também ser conhecida popularmente como arara, se apresenta filogeneticamente
42
distante das demais espécies conhecidas como araras (gêneros Ara, Orthopsittaca e Cyanopsitta) ou
maracanãs (gênero Primolius). Finalmente, a relação de Aratinga aurea dentro do grupo de táxons
estudados, não pôde ser estabelecida.
A análise de MP dos dados morfológicos gerou uma árvore politômica com algumas relações com
boa sustentação (Figura 15). Os clados (Ara ararauna, A. glaucogularis) e (Ara chloroptera, A. macao)
com 100% de “bootstrap” refletem a semelhança morfológica desses pares de táxons. Já o nó que une
Anodorhynchus hyacinthinus com (Ara ararauna, A. glaucogularis) parece ser resultado de convergência
das cores de plumagem, pois tal relação nunca foi proposta e não apresenta qualquer embasamento.
Assim, esse conjunto de características morfológicas não parece apresentar sinal filogenético suficiente
para estabelecer as relações entre os táxons estudados. O mapeamento dessas características na topologia
obtida com as seqüências concatenadas mostrou que todos apresentaram homoplasia.
A região entre as bases 1027 e 1036 da RC (Tabela 05) parece ser informativa para separar as
espécies Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba, Aratinga aurea e Anodorhynchus hyacinthinus das
demais espécies estudadas. No entanto, o mapeamento da ausência ou presença das trincas sugere que
houve um evento de ganho das trincas e um de perda. Seria interessante ampliar a amostragem de espécies
para compreender melhor esse padrão.
Apesar de ser bastante questionado, o uso do relógio molecular permite estimar datas de
divergências baseadas em dados moleculares. Porém, o relógio é sujeito a vários erros, pois as seqüências
podem não apresentar taxas evolutivas constantes e semelhantes ao longo do tempo e a calibração
utilizada pode não ser adequada aos dados. Apesar disso, a datação nos permite formular melhor a história
da diversificação dos grupos. Assim, discutimos a diversificação das espécies estudadas baseada em uma
recalibração da taxa de 2% de divergência por milhão de anos (m.a.). As datas estimadas de divergência
entre as espécies do presente trabalho foram de 0,95 a 14,03 m. a. (Figura 17). Essas datas coincidem com
o final do Mioceno (24 a 5 m.a.) até o meio do Pleistoceno (1 a 0,01 m.a.). Nesse intervalo os Andes
atingiram sua configuração atual e o rio Amazonas atingiu o oceano (Hoorn, 1995). O final do Plioceno
foi marcado pelo estabelecimento do istmo do Panamá (3,1 a 2,8 m. a.) e por uma diminuição das
temperaturas em escala global, de modo que o Pleistoceno teve início com um período frio, considerado o
primeiro período glacial do Quaternário (Hooghiemstra e Ran, 1994). Além das variações climáticas
dessa época, o nível do mar também oscilou muito, causando grandes transgressões marinhas e formação
de lagos de água salobra o que resultou em mudanças na floresta Amazônica (Marroig e Cerqueira, 1997).
A história do Pleistoceno na América do Sul ainda precisa ser melhor estudada, mas se hipotetiza que os
seus ciclos climáticos, com alternância de períodos frios e secos e períodos quentes e úmidos, foram
resultantes de períodos glaciais e interglaciais, respectivamente (Haffer, 1969; Vanzolini e Williams,
1970).
A data de divergência mais antiga obtida no presente trabalho é de 14,03 m.a., que corresponde à
43
divergência de Pyrrhura leucotis das demais espécies (Figura 17). Nores (1999) sugere que nesse período
tenha iniciado uma transgressão marinha com elevação de 150 m do nível do mar e tenha dividido a
Amazônia nos escudos das Guianas e do Brasil. Esse evento também pode ter influenciado nas
divergências da linhagem de Aratinga aurea (11,11 m.a.) e das linhagens de Anodorhynchus hyacinthinus
e de (D. nobilis, G. guarouba) (9,50 m.a.). As datas estimadas para a divergência das linhagens de
Orthopsittaca manilata e Cyanopsitta spixii (8,17 m.a. e 9,15 m.a., respectivamente) coincidem com o
término das incursões marinhas desse período. A divergência encontrada entre Diopsittaca nobilis e
Guarouba guarouba foi há 4,51 m.a., o que corresponde ao início do Plioceno (5 a 2 m. a.). Essa data
coincide com outra transgressão marinha com cerca de 100m de elevação do nível do mar, durante 800
mil anos, causando formações de ilhas que podem ter produzido algum grau de diferenciação entre elas.
Nores (1999) e Newton (2003) hipotetizam que essas incursões marinhas tenham provocado fragmentação
das populações de aves florestais e não-florestais na região da Amazônia e quando o nível do mar abaixou
essas populações voltaram a se expandir.
A data de divergência encontrada entre os gêneros Ara e Primolius foi de 7,48 m.a. (Figura 17),
que coincide com a divergência de espécies de outros gêneros de psitacídeos como Aratinga e Pionus
(Ribas, 2005). Nessa época ocorreram muitas mudanças na América do Sul, como o soerguimento do
leste dos Andes, flutuações do nível do mar alterando habitats na Amazônia e mudanças nas drenagens
dos rios. (Hoorn e col., 1995; Nores, 1999; Lundberg e col., 1998).
Há cerca de 6,13 m.a. algumas linhagens do gênero Ara se divergiram (Figura 17), sendo as de A.
rubrogenys (6,04 m.a.) e A. severa (5,75 m.a.) as mais antigas. Essas datas coincidem com o final do
Mioceno, época na qual estavam ocorrendo muitas mudanças climáticas e ambientais na região
amazônica. Essas espécies são alopátridas. Ara severa habita várzeas, bordas de rios e dificilmente
ultrapassa 600m de altitude e possui ampla distribuição geográfica na América do Sul. Enquanto A.
rubrogenys habita montanhas áridas de 1100 a 2500 metros de altitude e só é encontrada na região central
da Bolívia (Collar, 1997). As relações dessas espécies com as demais do gênero Ara podem não ter ficado
bem estabelecidas devido a uma possível divergência em curto espaço de tempo, ou porque os nossos
dados não foram informativos o suficiente para recuperar essa relação.
A divergência entre A. ararauna e A. glaucogularis foi datada em 4,13 m.a. (Figura 17). Essa data
é bastante semelhante à datação encontrada para a separação de Diopsittaca nobilis e Guarouba
guarouba. Essa datação coincide com o início do Plioceno, quando ocorreu o soerguimento final da
Cordilheira dos Andes e com as alterações dos rios amazônicos, formando parte da bacia Amazônica
como é conhecida atualmente. Acredita-se que ainda nessa época campos e savanas se diversificaram e
houve um esfriamento global com um clima seco. Essas mudanças podem ter isolado linhagens em
remanescentes de floresta e, dado o tempo suficiente, elas podem ter se diferenciado em espécies. Com a
expansão das florestas em épocas de clima favorável, as espécies poderiam entrar em simpatria (Haffer,
44
1997; Lundberg e col., 1998; Newton, 2003).
O tempo estimado de divergência entre os clados (A. militaris, A. ambigua) e (A. macao, A.
chloroptera) foi de 3,12 m.a (Figura 17). Nessa época, a América do Norte se uniu à América do Sul com
a formação da América Central (Newton, 2003; Nores, 1999). Esse evento poderia estar relacionado à
separação da linhagem que deu origem ao clado (A. militaris, A. ambigua), que possui hoje distribuição
mais a oeste da América do Sul até o México enquanto o clado (A. macao, A. chloroptera) encontra-se
mais a leste.
A data de divergência entre as espécies A. macao e A. chloroptera encontrada em nossos estudos
foi de 2,54 m. a. (Figura 17). Essa data coincide com o final do Plioceno (2 m.a.) e início do Pleistoceno,
quando se iniciaram os períodos glaciais e interglaciais. Como essas duas espécies dependem de
ambientes florestais, talvez durante períodos glaciais grupos foram isolados em refúgios florestais (Haffer,
1969, 1990, 1997; Vanzolini e Williams, 1970) e, passado o devido tempo, possam ter se diferenciado em
espécies. Uma vez que as condições climáticas tenham se tornado favoráveis à expansão de ambientes
florestais, as duas espécies também expandiram suas distribuições e atualmente são simpátricas. No
entanto, seria necessário realizar um estudo com vários indivíduos de cada uma dessas espécies com
procedência conhecida para compreender melhor tal padrão.
As espécies A. militaris e A. ambigua seriam as que se divergiram mais recentemente, há 0,95 m.a.
(Figura 17), no final do Pleistoceno. De acordo com Abramson (1995), essas espécies não se sobrepõem
geograficamente e cada uma possui um tipo de hábitat diferente: Ara militaris habita florestas tropicais
montanhosas e decíduas, ocorre na zona tropical da Colômbia, noroeste da Venezuela, leste do Equador,
norte do Peru, Bolívia e México; enquanto A. ambigua habita florestas tropicais de baixada e úmidas ao
longo da Costa do Caribe, leste de Honduras, Nicaragua, Costa Rica, Panamá, noroeste e suldoeste da
Colômbia e oeste do Equador (Collar, 1997).
A diversificação entre as espécies do gênero Primolius ocorreu há um pouco mais de 1 m.a. com a
linhagem de Primolius couloni se divergindo há 1,76 m.a. (Figura 17). Já P. auricollis e P. maracana se
divergiram mais recentemente, há 1,26 m.a. Estas datas indicam que essas espécies também se divergiram
no Pleistoceno. É interessante notar que esse padrão de diversificação parece indicar uma mudança de
preferência de hábitat. Pois o grupo irmão do gênero Primolius (o gênero Ara) possui espécies mais
associadas a áreas florestadas e a primeira linhagem a se divergir, P. couloni, habita florestas úmidas e
matas ciliares no leste do Peru e do extremo oeste ao sul do Brasil para o norte da Bolívia. Já P.
maracana habita bordas de florestas tropicais e penetra na caatinga no noroeste, centro e sudeste do
Brasil, Paraguai e noroeste da Argentina. Enquanto P. auricollis habita o cerrado aberto ao leste da
Bolívia e norte do Paraguai, Pantanal e norte da Argentina (Collar, 1997; Figura 17). Assim, parece haver
alguma tendência a que a preferência de tipo de vegetação tenha se modificado de um ambiente mais
florestal pra um mais aberto.
45
De modo geral, esses resultados mostram que as espécies alopátridas se divergiram mais
recentemente, como Ara militaris, A. ambigua e as espécies do gênero Primolius. Enquanto as espécies
simpátricas mostram divergências mais antigas, como o par Ara ararauna e A. glaucogularis e o par A.
macao e A. chloroptera. E ainda, quando comparadas as distâncias p par-a-par entre esses pares, as
espécies alopátridas são mais próximas geneticamente enquanto as simpátricas são mais distantes.
6. Conclusão
Os resultados de filogenia molecular obtidos sugerem que os gêneros Ara e Primolius sejam
reciprocamente monofiléticos e que Orthopsittaca manilata seja o grupo irmão desse clado. Já
Diopsittaca nobilis se agrupa com alto suporte com Guarouba guarouba. As relações entre as espécies do
gênero Ara foram relativamente bem estabelecidas, com exceção de Ara rubrogenys e Ara severa, talvez
devido a uma rápida diversificação dessas espécies ou a uma limitação do conjunto de dados utilizado. A
datação da diversificação dos gêneros Ara e Primolius coincide com a diversificação de outros gêneros de
psitacídeos e com mudanças paleoclimáticas ocorridas na América do Sul no final do Terciário e início do
Quaternário.
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