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Universidade Estadual de Londrina
DEPTO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS - CCE
ELIANE KAORI FUKUDA
EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
POLISSACARÍDEOS DA BIOMASSA DO FUNGO
ASCOMICETO Botryosphaeria rhodina MAMB-05
Londrina – PR
2007
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ELIANE KAORI FUKUDA
EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
POLISSACARÍDEOS DA BIOMASSA DO FUNGO
ASCOMICETO Botryosphaeria rhodina MAMB-05
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Biotecnologia, do Departamento
de Bioquímica e Biotecnologia da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito à obtenção
de título de Mestre
Orientadora:
Profª. Dra Maria de Lourdes Corradi Custodio
da Silva
Co-orientadora:
Profª. Dra. Aneli de Melo Barbosa
Londrina - PR
2007
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Catalogação na Publicação Elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
F961e Fukuda, Eliane Kaori.
Extração, purificação e caracterização de polissacarídeos da bio-
massa do fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05 /
Eliane Kaori Fukuda. – Londrina, 2007.
119f. : il.
Orientador : Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva.
Co-orientador : Aneli de Melo Barbosa.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade Estadual
de Londrina, Centro de Ciências Exatas, Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia, 2007.
Inclui bibliografia.
1. Biotecnologia – Teses. 2. Botryosphaeria rhodina – Fungo
ascomiceto – Teses. 3. Polissacarídeos – Teses. 4. Fungos –
Biotecnologia – Teses. I. Silva, Maria de Lourdes Corradi Custódio
da. II. Barbosa, Aneli de Melo. III. Universidade Estadual de
Londrina. Centro de Ciências Exatas. Programa de Pós-Graduação
em Biotecno- logia. IV.Titulo.
CDU 641:577.1
ELIANE KAORI FUKUDA
EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE
POLISSACARÍDEOS DA BIOMASSA DO FUNGO
ASCOMICETO Botryosphaeria rhodina MAMB-05
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós -graduação em Biotecnologia,
do Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito
à obtenção de título de Mestre
COMISSÃO EXAMINADORA
______________________________________
Profª. Dra Maria de Lourdes Corradi
Custodio da Silva
Universidade Estadual Paulista
Julio de Mesquita Filho-UNESP
____________________________________
Profª. Dra Maria Antonia Pedrine
Colabone Celligoi
Universidade Estadual de Londrina
____________________________________
Prof. Dr Carlos Kemmelmeier
Universidade Estadual de Maringá
Londrina, 14 de setembro de 2007.
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos pais, Toshiuki e Teruyo pela
dedicação e carinho que me motivou a sonhar e a ter
coragem e ousadia para tornar o sonho em realidade.
Ao meu esposo Wilson pelo amor e pelo apoio
indispensáveis para a conquista dessa grande vitória.
AGRADECIMENTOS
A Deus todo poderoso, que me deu força possibilitando a vitória nesta
importante batalha que significará muito em minha vida.
Aos meus queridos pais (Toshiuki e Teruyo), pelo exemplo de vida e de
caráter, pelo enorme carinho, pelo apoio e por sempre me motivar acreditando em meu
potencial! Devo a vocês, tudo que consegui até hoje e por tudo que ainda conseguirei nesta
vida!
À minha querida orientadora Dra Maria de Lourdes Corradi da Silva, pela
imensa contribuição como orientadora presente em todos os dias, pelo exemplo de dedicação
e competência tanto como profissional no laboratório e como mãe lapidando seus filhos. Pelos
inúmeros chaqualhões que muitas vezes tirou de meus olhos lágrimas, trabalhos árduos que
me vez suar, mas com objetivo nobre de regar o meu trabalho de dissertação. Um ano que
estive em Presidente Prudente foi o ano mais produtivo, um treinamento intensivo para
crescer como profissional e me lapidar como pessoa.
À minha co-orientadora Dra Aneli de Melo Barbosa, que tenho profunda
admiração pela integridade em pessoa e pela paixão contagiante que tem pela pesquisa
científica.
Ao professor Dr Dekker, pela indispensável contribuição para escrever
trabalhos e artigos científicos.
À prof
a
Dra Joana L. M. S. Ganter, ao Dr Guilherme L. Sassaki e à Dra
Elaine R. Carbonero pela realização das análises de RMN-
13
C e de CG-MS.
Aos docentes e funcionários da UEL e da UNESP de Presidente Prudente,
em especial para o técnico Nelson da UEL e para a técnica Marilsa de Presidente Prudente.
Sem a ajuda de vocês seria impossível realizar este trabalho.
À Aninha Dundi que todos os dias que estive em Presidente Prudente me
recepcionava com um sorriso contagiante e um café muito saboroso que tornava
os meus dias mais alegres!!!
À Ana Flora pela companhia, pela disponibilidade em ajudar e ensinar, e
pelo suor e lágrimas que ajudaram a regar esse trabalho!!!Considere-se a madrinha dele!!!
À Ana Pires que tem um enorme coração, pela amizade e pelos inúmeros
favores realizados!!!
Ao prof. Roberto e a Ana Maria Osório pela atenção e valiosas dicas e
conselhos nos corredores na hora do café!!!
Aos ex-estagiários do laboratório de bioquímica Mariana, Gabriel e a
estagiária Janaína pela profunda amizade, incentivo constante e auxílio no laboratório.
Aos estagiários Nilson e Andreza pela indispensável contribuição na
realização dos experimentos e na preparação e edição das figuras.
À minha querida avó (in memorian) que tive privilégio de conviver e pelos
cuidados e ensinamentos, principalmente a como viver melhor através da sua alegria e de seu
otimismo.
Ao meu amado esposo pelo amor, carinho, compreensão e pelos conselhos
que muitas vezes me serviram para não desanimar e fazer a escolha certa.
Aos meus queridos irmãos, Tomás, Airton e Ernesto, pelos conselhos, pelo
carinho, pelas palavras de incentivo e mesmo na correria do dia-dia, sempre lembraram de me
chamar para o almoço ou para o churrasco de final de semana onde voltava ao trabalho
renovada!!!
Ao meu amigo Ryuiti (in memorian) que foi exemplo de vida e que me
ensinou muito através do jeito bem humorado e Carpe diem!!!
À minha grande amiga Marcela, que para mim é como a irmã e minha super
companheira Michelle, pela profunda amizade e paciência de longa data!!!
Às minhas amigas Amanda, Cinthia, Kaoru, Marcia, Paole, Patrícia,
Rosana, Saori, Sonia, Sueli, Tatiane e Teruko que foram essenciais pelo apoio que me deram
na fase da vida que eu mais precisei.
Aos meus amigos do mestrado, Cassiano, Mimi, Robinho, Tiski, Elaine,
Dani Sassá, Flávio, Josana e Jake, pelo tempo que me aturaram, pelas brincadeiras que me
alegraram!!Adoro vocês, sentirei muitas saudades!!!
A todos os professores do Programa de Mestrado em Biotecnologia, que
contribuíram para a minha formação.
A CAPES pela concessão de bolsa de mestrado.
E a todos os familiares e amigos que torceram e de alguma maneira
contribuíram para a realização deste trabalho!!!
Quando você se lança numa jornada e o fim parece cada vez mais distante, então você
percebe que o verdadeiro fim é o percurso.
Karlfried Grif Durckhein
FUKUDA, Eliane Kaori. Extração, purificação e caracterização de polissacarídeos da
biomassa do fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05. 2007. 119f.
Dissertação (Mestrado em Biotecnologia)-Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
2007.
RESUMO
A biomassa do fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina, cultivado em glucose como fonte
de carbono, foi separada do exopolissacarídeo para investigar a composição, em
polissacarídeos, da biomassa. Para obtenção desses polissacarídeos a biomassa foi lavada com
água, exaustivamente, até que nenhum resíduo de açúcar livre fosse detectado pelo ensaio do
fenol-ácido sulfúrico, garantindo a total remoção do EPS. A massa micelial foi liofilizada,
fragmentada e submetida, consecutivamente, a diferentes procedimentos extrativos, a saber,
água fria (3x), água fervente (4x) e hidróxido de potássio a 2%, 100°C (2x). Esse
procedimento separou as biomoléculas em grupos, de acordo com suas solubilidades. As
frações Q
1
(aquosa a quente)
e
K
1
(alcalina) foram selecionadas para dar prosseguimento aos
estudos por serem quantitativamente majoritárias e com grande diferença percentual entre
seus constituintes monossacarídicos. A fração Q
1
foi fracionada por cromatografia de filtração
em gel Sepharose CL-4B em Q
1A
, Q
1B
, Q
1C
e Q
1D
. A sub-fração Q
1A
com maior tamanho
molecular, de acordo com seu volume de eluição na cromatografia de filtração em gel,
apresentou glucose como componente majoritário. Estudos espectroscópicos por
infravermelho e ressonância magnética nuclear de carbono treze mostraram que todas as
ligações glicosídicas encontravam-se em configuração β. A ausência de sinal na região de δ
60 ppm e a presença de um sinal intenso em 69,01, bem como os resultados provenientes da
metilação permitiram caracterizar a sub-fração Q
1A
como uma β-(1→6)-D-glucana. A sub-
fração Q
1C
, constituída principalmente de galactose, após análises espectroscópicas e de
metilação teve sua estrutura determinada como de uma galactofuranana com unidades 5-O e
6-O substituídas. As sub-frações Q
1B
e Q
1D
não foram investigadas neste trabalho porque os
experimentos conduzidos indicaram a necessidade de etapas adicionais de purificação. A
fração K
1
, obtida como primeira extração alcalina, após neutralização, diálise, precipitação em
etanol e solubilização em água apresentou um resíduo (K
1
P) que foi separado por tratamentos
sucessivos de gelo e degelo da parte solúvel (K
1
S). O material insolúvel, denominado K
1
P,
constituído principalmente de glucose (93%) foi caracterizado como uma glucana β-(1→3)
com ramificação em C-6 através de análises espectroscópicas e de metilação. A fração solúvel
(K
1
S), fracionada por cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL-4B, apresentou três
picos denominados de K
1
S
A
, K
1
S
B
e K
1
S
C
. A sub-fração K
1
S
A
, após hidrólise ácida apresentou
principalmente glucose (92%) e a cromatografia gasosa dos acetatos de alditóis apresentou
três picos, identificados como 2,3,4,6-tetra-O-metil, 2,3,6-tri-O-metil e 2,3-di-O-metil
derivados. Os sinais de FTIR em 1550 e 920 cm
-1
foram característicos de glucanas e em 850
cm
-1
de α-glucanas. O espectro de ressonância magnética nuclear de carbono treze mostrou
sinais que correspondem a uma α-(1→4) D-glucana com pequeno grau de substituição em C-
6. Os resultados encontrados neste estudo indicam que a composição da biomassa do
ascomiceto Botryosphaeria rhodina é semelhante à biomassa de diferentes fungos e,
provavelmente, as diferenças no grau de substituição correspondem às variações no tempo de
cultivo e/ou a necessidade de etapas adicionais de purificação.
Palavras-chave: Botryosphaeria rhodina. Polissacarídeos de biomassa fúngica. Glicanas.
Metilação.RMN-
13
C.
FUKUDA, Eliane Kaori. Extraction, purification and characterisation of the biomass
polysaccharides of the ascomyceteous fungus, Botryosphaeria rhodina MAMB-05. 2007.
119f. Dissertation (Master’s Degree in Biotechnology)-State of University of Londrina,
Londrina. 2007.
ABSTRACT
The composition of the polysaccharides constituting the biomass of the ascomyceteous
fungus, Botryosphaeria rhodina MAMB-05, cultivated on glucose as carbon source was
investigated following separation of the exopolysaccharides (EPS). Fungal mycelial biomass
was exhaustingly washed with water at room temperature until no residual sugars could be
detected (phenol-sulfuric acid method), indicating total removal of the EPS, botryosphaeran.
The mycelium was then lyophilised, followed by homogenisation and consecutively
submitted to the following extraction procedures to extract the biomass polysaccharides: cold
water (3x), boiling water (4x) and 2 % KOH/100 °C (2x), which separated the
biomacromolecules into groups according to their solubilities in these solvents. Fractions Q
1
(hot water extract) and K
1
(alkaline extract) were selected for further studies: quantification
and monosaccharide constitution. Fraction Q
1
was fractionated by Sepharose CL-4B gel
filtration chromatography into four peaks: Q
1A
, Q
1B
, Q
1C
and Q
1D
. Sub-fraction Q
1A
with an
apparent large molecular mass as indicated by its elution volume on a chromatographic run,
presented glucose as the major component. Spectroscopy studies (Fourier Transformation-
Infra-Red (FT-IR), and
13
Carbon-nuclear magnetic resonance,
13
C-NMR) demonstrated that
all of the glycosidic linkages were of the β-configuration. The absence of a signal in the
region δ 60.0 ppm and the presence of an intense signal at 69.01, as well as the results arising
from methylation, characterized Q
1A
as a β-(1→6)-D-glucan. Sub-fraction Q
1C
consisting
mainly of galactose residues had a structure characterised as galactofuranan with substitutions
at 5-O and 6-O as indicated by spectroscopy and methylation analyses. Sub-fractions Q
1B
and
Q
1D
were not further investigated in this work because they required detailed purification. The
fraction from alkaline extraction (K
1
) followed by neutralization, dialysis, ethanol
precipitation and solubilisation in water, presented an insoluble residue (K
1
P) which could be
separated from its soluble counterpart (K
1
S) by successive treatments of freezing and thawing.
K
1
P consisted mainly of glucose (93 %) and was characterized through spectroscopy and
methylation analyses as a β-(1→3)-glucan with ramifications at C-6. K
1
S fractionated by
Sepharose CL-4B gel filtration chromatography resolved into three peaks: K
1
S
A
, K
1
S
B
and
K
1
S
C
. Sub-fraction K
1
S
A
, after acid hydrolysis presented mainly glucose (92 %), and analysis
by gas chromatography of the alditol acetate derivatives presented three peaks identified as:
2,3,4,6-tetra-O-methyl-, 2,3,6-tri-O-methyl- and 2,3-di-O-methyl-glucitol. FT-IR signals at
1550 and 920 cm
-1
were characteristic of glucans, and 850 cm
-1
of α-glucans.
13
C-NMR
spectra showed signals corresponding to α-(1→4)-D-glucan with a low degree of substitution
at C-6. The results found in this study indicate that the composition of the biomass
polysaccharides of the ascomycete Botryosphaeria rhodina MAMB-05 was similar to the
biomass of other fungi reported in the literature, and the differences in the degree of
substitutions of the polysaccharides probably reflects variations in times of cultivation, and/or
the relative degrees of purity.
Keywords: Botryosphaeria rhodina. Fungal biomass polysaccharides. Glycans. Methylation.
13
C-NMR
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Fluxograma de extração e purificação dos polissacarídeos da biomassa do
B.rhodina.................................................................................................................................. 37
Figura 2 - Cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL -4B da primeira extração
aquosa a quente (Q
1
) da biomassa do B. rhodina. Total de material aplicado: 10 mg; fluxo:
1,2mL/min.; eluente: água; fração: 5 mL; volume da coluna: 226 mL....................................54
Figura 3 - Análise dos hidrolisados por HPAEC/PAD das sub-frações provenientes da
cromatografia de filtração em gel da primeira extração aquosa a quente (Q
1
). Condições da
corrida: isocrática (NaOH 14mM, 25 minutos). Coluna: CarboPac PA1. Condições de
hidrólise: TFA 5M, 16 horas, 100
o
C. Quantidade de material: 50 µg. Padrões (Pd): 1- fucose,
2-rhamnose, 3- galactose, 4-glucose e 5-manose......................................................................56
Figura 4 - Espectro de FT-IR das sub-frações Q
1A
e
Q
1C
provenientes da primeira extração
aquosa a quente (Q
1
) do ascomiceto B. rhodina, após purificação por cromatografia de
filtração em gel de Sepharose CL-4B...................................................................................... 57
Figura 5 - Espectros de RMN -
13
C das frações provenientes do extrato a quente do B.
rhodina (Q
1
A e Q
1
C) após purificação por cromatografia de filtração em gel........................ 60
Figura 6 - Cromatografia de filtração em gel Sepharose CL -4B do sobrenadante da primeira
extração alcalina (K
1
S) após o processo de gelo e degelo da biomassa do B. rhodina. Total de
material aplicado: 10 mg; fluxo: 1,2mL/min.; eluente: água; fração: 5 mL; volume da coluna:
225,7 mL.................................................................................................................................. 64
Figura 7 - Análise dos hidrolisados por HPAEC/PAD das sub-frações provenientes da
cromatografia de filtração em gel da primeira extração alcalina a quente (K
1
). Condições da
corrida: isocrática (NaOH 14mM, 25 minutos). Coluna: CarboPac PA1. Condições de
hidrólise: TFA 5M, 16 horas, 100
o
C. Quantidade de material: 50 µg. Padrões (Pd): 1- fucose,
2-rhamnose, 3- galactose, 4-glucose e 5-manose..................................................................... 64
Figura 8 - Espectro de FT-IR das frações da extração alcalina do ascomiceto B. rhodina após
o processo de gelo e degelo e purificação por cromatografia de filtração em gel (CL-
4B)............................................................................................................................................ 65
Figura 9 - Espectros de RMN de
13
C
das frações do extrato alcalino do micélio da B. rhodina
após o processo de purificação de gelo-degelo e filtração por cromatografia de exclusão
molecular (K
1
S
A
e
K
1
P)............................................................................................................ 66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Peso das frações liofilizadas, quantificação de açúcares totais e proteínas dos
diferentes extratos obtidos da biomassa de B. rhodina. ...........................................................50
Tabela 2 - Composição percentual dos açúcares neutros obtidos por hidrólise ácida dos
extratos da biomassa do fitopatógeno Botryosphaeria rhodina por HPAEC/PAD. ................52
Tabela 3 - Composição percentual em monossacarídeos após hidrólise ácida da primeira
extração a quente (Q
1
) e suas sub-frações, obtidas por cromatografia de filtração em gel de
Sepharose CL-4B......................................................................................................................55
Tabela 4 - Acetatos de alditóis parcialmente metilados formados na análise de metilação dos
polissacarídeos encontrados nas subfrações Q
1A
,Q
1C
, K
1
P e K
1
S
A.
..........................................61
Tabela 5 - Composição percentual dos açúcares neutros obtidos por hidrólise ácida das
frações K
1
P
(insolúvel), K
1
S (solúvel) e suas sub-frações analisados por HPAEC/PAD. .......63
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
% - porcentagem
± - aproximadamente
λ - comprimento de onda
α - configuração alfa
β - configuração beta
°C - grau Celsus
ATR - reflexão total acumulada
B. rhodina - Botryosphaeria rhodina
BRMP - polissacarídeo modificador de resposta biológica
BSA - soro albumina bovina
C - carbono
cm - centímetro
cm
-1
- por centímetro
-D- - açúcar da série D
d.i - diâmetro interno
Da - Dalton
DEAE- dietilaminoetil
DMSO - dimetilsulfóxido
DNA - ácido
desoxirribonucleico
EPS - exopolissacarídeo
et al - e outros
eV - elétron volts
f - furanosídico
FT-IR - espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
GAL - galactose
GC-MS (GAS CROMATOGRAPHY MASS SPECTROSCOPY) - cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massa
H
+
- íon hidrogênio
H
2
SO
4 –
Ácido sulfúrico
HPAEC (HIGH PERFORMANCE ANIONIC EXCHANGE CROMATOGRAPHY)-
cromatografia líquida de alta pressão em coluna de troca aniônica
IAD - detector de amperometria integrada
KBr - brometo de potássio
KOH – hidróxido de potássio
L - litro
-L- açúcar da série L
m/v - massa por volume
m/z - massa por carga
m/z - massa por carga
mg - miligrama
MHz - megahertz
min. - minuto
mL- milímetro
mm - milímetro
mM - milimolar
NaOH - hidróxido de sódio
NK - natural killer
nm - nanômetro
O - ligado ao oxigênio (ligação glicogênica)
p - piranosídico
P.A - para análise
p/v - peso por volume
PAD (PULSED AMPEROMETRIC DETECTION) - detecção por amperometria pulsada
Pd - padrão
ppm - partes por milhão
RMN
13
C - ressonância magnética nuclear de carbono-13
RMN
1
H - ressonância magnética nuclear de próton
rpm - rotações por minuto
TFA - ácido trifluoracético
v/v - volume por volume
δ - deslocamento químico
μg - micrograma
μL - microlitro
F
1
– primeiro
extrato aquoso a frio
F
2
– segundo extrato aquoso a frio
F
3
– terceiro extrato aquoso a frio
K
1
– primeiro
extrato alcalino
K
1
P – precipitado do extrato alcalino após gelo-degelo
K
1
S – sobrenadante do extrato alcalino após gelo-degelo
K
1
S
A
– primeira fração do sobrenadante do extrato alcalino após a filtração em gel
K
1
S
B
– segunda fração do sobrenadante do extrato alcalino após a filtração em gel
K
1
S
C
– terceira fração do sobrenadante do extrato alcalino
após a filtração em gel
K
2
– segundo extrato alcalino
Q
1
– primeiro
extrato aquoso a quente
Q
1A
– primeira fração do
extrato aquoso a quente após a filtração em gel
Q
1B
– segunda fração do
extrato aquoso a quente após a filtração em gel
Q
1C
– terceira fração do
extrato aquoso a quente após a filtração em gel
Q
1D
– quarta
fração do
extrato aquoso a quente após a filtração em gel
Q
2
– segundo extrato aquoso a quente
Q
3
– terceiro extrato aquoso a quente
Q
4
–
quarto
extrato aquoso a quente
R
1
– resíduo da extração a frio
R
2
– resíduo da extração a quente
R
3
– resíduo da extração alcalina
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 20
2.1 Biomassa Fúngica.......................................................................................................... 20
2.2 Parede Celular Fúngica.................................................................................................. 22
2.3 Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica ................................................................... 25
2.4 Procedimentos Gerais para Purificação e Caracterização de Polissacarídeos de
Parede Celular ............................................................................................................... 27
2.5 Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica: Purificação e Caracterização ................... 28
2.6 Atividades Biológicas dos Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica ........................ 32
2.7 Botryosphaeria rhodina................................................................................................. 34
3. OBJETIVOS.................................................................................................................. 36
3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................... 36
3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................... 36
4. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................... 37
4.1 Materiais........................................................................................................................ 38
4.1.1 Microrganismo ........................................................................................................... 38
4.1.2 Reagentes.................................................................................................................... 38
4.1.3 Equipamentos ............................................................................................................. 38
4.2 Métodos Gerais.............................................................................................................. 39
4.2.1 Manutenção do microrganismo .................................................................................. 39
4.2.2 Preparo do inoculo...................................................................................................... 39
4.2.3 Isolamento da biomassa.............................................................................................. 40
4.3 Métodos Analíticos........................................................................................................ 40
4.3.1 Quantificação de proteínas nos extratos..................................................................... 40
4.3.2 Quantificação de açúcares totais................................................................................. 41
4.3.3 Quantificação de açúcares redutores .......................................................................... 41
4.4 Extração dos Polissacarídeos......................................................................................... 42
4.4.1 Extração aquosa a fria ................................................................................................ 42
4.4.2 Extração aquosa a quente ........................................................................................... 42
4.4.3 Extração alcalina com KOH 2% a quente .................................................................. 42
4.5 Purificação e Caracterização dos Polissacarídeos ......................................................... 43
4.5.1 Separação dos polissacarídeos solúveis e insolúveis, do precipitado etanólico
da extração alcalina, por congelamento e degelo ....................................................... 43
4.5.2 Cromatografia de filtração em gel em coluna de sepharose CL-4B........................... 43
4.5.3 Análise da composição em monossacarídeos por cromatografia líquida de alta
pressão em coluna de troca aniônica (HPAEC).......................................................... 44
4.5.3.1 Análise dos açúcares neutros................................................................................... 44
4.5.3.2 Análise dos açúcares aminados ............................................................................... 45
4.5.4 Análise das ligações glicosídicas dos polissacarídeos purificados............................. 45
4.5.4.1 Metilação pelo método de Ciucanu e Kerek............................................................ 45
4.5.4.2 Hidrólise e redução.................................................................................................. 46
4.5.4.3 Acetilação................................................................................................................ 46
4.5.4.4 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) .................. 47
4.5.5 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) .................. 47
4.5.6 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)......................................... 47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 48
5.1 Obtenção da Biomassa Celular...................................................................................... 48
5.2 Extração dos Polissacarídeos......................................................................................... 49
5.3 Purificação dos extratos contendo polissacarídeos........................................................ 52
5.3.1 Extrato Q
1
................................................................................................................... 53
5.3.1 Extrato K
1
................................................................................................................... 61
CONCLUSÕES.................................................................................................................. 68
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 70
ANEXOS ............................................................................................................................ 84
ANEXO A - Artigo científico: “Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação
e caracterização”.............................................................................................. 85
ANEXO B-Guia para autores do periódico Semina.......................................................... 117
18
1. INTRODUÇÃO
Os biopolímeros, como proteínas e polissacarídeos, representam os mais
abundantes compostos orgânicos da biosfera, exibindo importantes propriedades e diferentes
aplicações, relacionadas com suas características químicas.
Fungos, bactérias e plantas vêm sendo pesquisados como potenciais fontes
dessas macromoléculas, principalmente de polissacarídeos. A possibilidade de aplicação
desses compostos na saúde humana, assim como em outras áreas, tem levado a intensivos
estudos relacionados à sua extração e caracterização (GERN, et al., 2007).
Polissacarídeos bioativos isolados da parede celular fúngica têm sido
caracterizados como homopolímeros, heteropolímeros ou, ainda, encontram-se ligados aos
resíduos de proteínas formando complexos polissacarídeo-proteína (ZHANG et al., 2002;
KIM et al., 2003).
Embora estudos sobre a composição da parede celular de vários fungos
sejam efetuados, o maior número de informações disponíveis na literatura está relacionado
com a estrutura de parede do ascomiceto Saccharomyces cerevisiae, que é composta por β-D-
glucanas, quitinas e manoproteínas (LIPKE; OVALLE, 1998; KAPTEYN; VAN DEN
ENDE; KLIS, 1999; NOBEL; VAN DEN ENDE; KLIS, 2000; NOMBELA; GIL; CHAFFIN,
2006). Alguns patógenos humanos, como Candida albicans e espécies do gênero, também
vêm tendo a constituição de parede celular investigada, que poderá ser utilizada como
possível alvo de drogas antifúngicas (GEORGOPAPADAKOU; TKACZ, 1995; SHIBATA et
al., 1995; POULAIN; JOUAULT, 2004).
Estudos realizados por Falch e colaboradores (2000) mostram que glucanas
β-(1→3) ramificadas possuem efeitos estimulantes para o sistema imune. Entretanto os
mecanismos celulares pelos quais estas substâncias agem não estão muito bem definidos,
sendo a principal hipótese a existência de receptores específicos para estas glucanas nas
superfícies das células (MUELLER et al., 2000),
Fatores físico-químicos podem influenciar no efeito destes polissacarídeos
sobre o organismo, dentre eles o grau de ramificação, a massa molecular e a conformação
apresentada pelo material (YOUNG; JACOBS, 1998; LEUNG et al., 2006). Para
compreender os mecanismos de atuação dessas moléculas biológicas todos os parâmetros de
caracterização química e conformação devem ser estudados.
19
O Botryosphaeria rhodina, um fungo filamentoso causador de cancro em
eucalipto e objeto desse estudo, é produtor de lacases (VASCONCELOS et al., 2000) e de
uma goma formada por um exopolissacarídeo que proporciona uma alta viscosidade, quando
cultivado em meio submerso (BARBOSA; DEKKER; HARDY, 1996). O exopolissacarídeo,
denominado botriosferana, foi caracterizado estruturalmente como sendo uma glucana com
ligações do tipo β-(1→3) na cadeia principal e ramificações com ligações do tipo β-(1→6)
(BARBOSA et al., 2003; CORRADI da SILVA et al., 2005). Ainda não existem relatos
quanto à composição química em polissacarídeos da parede celular deste microrganismo.
Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi investigar a composição
química, em polissacarídeos, da biomassa micelial do B. rhodina, para que os conhecimentos
obtidos possam auxiliar, por exemplo, o desenvolvimento futuro de novos medicamentos
antifúngicos, além do que as próprias moléculas isoladas poderão ser aplicadas em diferentes
campos biotecnológicos.
20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Biomassa Fúngica
Os fungos são microrganismos eucariontes heterotróficos que obtêm sua
energia pela ruptura de moléculas orgânicas, podendo ocupar diversos nichos ecológicos,
atuando como parasitas, sapróbios ou então estabelecendo relações simbióticas, por exemplo,
com algas, formando os líquens. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2000).
No ambiente terrestre, os fungos são de importância fundamental como
organismos decompositores, patógenos ou simbiontes, tendo papel importante nos ciclos
biogeoquímicos do carbono, nitrogênio ou fósforo (BOSWELL; et al., 2003). Como
fitopatógenos, estes organismos possuem mecanismos de adesão ao hospedereiro, onde as
moléculas de reconhecimento e união são, na maior parte dos casos, de natureza protéica ou
glicoprotéica. (XIAO et al., 1994; SUGUI; LEITE; NICHOLSON, 1998) e, por isso, a
produção de proteínas e polissacarídeos extracelulares têm sido associadas à capacidade do
microrganismo causar doenças em plantas (DOSS, 1999; GIL-AD; BAR-NUN; MAYER,
2001; LEITE et al., 2001).
Os fungos podem ser considerados como os agentes mais importantes de
degradação da biosfera, principalmente quando se estuda os ecossistemas florestais, onde
esses microrganismos são os principais decompositores de celulose e lignina. A produção de
biomassa em um ecossistema florestal é em grande parte controlado por fungos degradadores
de madeira, que determinam as taxas dos nutrientes liberados e seu retorno ao ecossistema
após a morte das árvores (ESPOSITO; AZEVEDO, 2004).
Além de sua atuação nos ecossistemas, os fungos também apresentam um
grande potencial de aplicação nas diferentes áreas industriais, como alimentos, cosméticos,
medicamentos, assim como na área ambiental, na detoxificação de compostos em ambientes
contaminados. A utilização desses microrganismos pode ser através do seu material celular
(biomassa) ou então de macromoléculas isoladas.
Há uma forte tendência em se explorar comercialmente a biomassa fúngica
para isolamento de seus componentes celulares e consequentemente de seus principais
constituintes, tais como enzimas (invertases, glucosidases), nucleotídeos, proteínas
(manoproteínas) e principalmente polissacarídeos (glucanas, mananas, galactanas), além de
lipídeos, como fosfolipídeos e ergosterol, pois estas substâncias apresentam propriedades
21
específicas de interesse biotecnológico e, conseqüentemente, de grande valor agregado
(CAMERON; COOPER; NEUFELD, 1988; KOLLÁR; STURDIK; SAJBIDOR, 1992;
BELEM; LEE, 1998; BEROVIČ et al., 2003; PAVLOVA, PANCHEV; HRISTOZOVA,
2005).
Trabalhos como os realizados por Mendes-Costa e Moraes (1999)
mostraram que é possível isolar da biomassa de diferentes linhagens de Saccharomyces
cerevisiae frações de carboidratos solúveis, e que estas moléculas podem ser utilizadas como
indutoras de mecanismos de defesa em plantas. O mesmo foi observado em experimentos
com soja (HAHN; ALBERSHEIM, 1978; SHARP; VALENT; ALBERSHEIM, 1984), e
sorgo (PICCININ; DI PIERO; PASCHOLATI, 2005), onde se detectou a produção de
fitoalexinas, substâncias envolvidas no mecanismo de defesa vegetal, quando as plantas foram
colocadas em contato com glucanas isoladas de S. cerevisiae e de Phytophtora megasperma.
A biomassa excedente da produção industrial de antibióticos por Penicillium
chrysogenum, além de ser aproveitada para ração para gado e ou no preparo de fertilizantes
(MUZZARELLI et al., 2000), também vem se mostrando uma fonte viável de moléculas
importantes, como os polissacarídeos do tipo glucanas (WANG et al., 2007), aplicados na
área medicinal devido a suas atividades antitumorais e imunomoduladoras.
Durante um processo fermentativo para a produção de exopolissacarídeos
(EPS), um grande percentual de biomassa também é obtido. Entretanto, as quantidades de
massa micelial e EPS não são necessários proporcionais, sendo dependentes dos diferentes
fatores utilizados no cultivo, tais como fontes de carbono e de nitrogênio, pH, temperatura,
agitação, grau de aeração, entre outros. Estes parâmetros podem interferir tanto na produção
da biomassa quanto dos componentes isolados desse substrato. Segundo alguns autores
(SEVIOUR et al., 1992; WANG; McNEILL, 1995; SELBMANN; CROGNALE;
PETRUCCIOLI, 2002; BARBOSA et al., 2004) o que se espera obter no final do
procedimento, se biomassa ou EPS, determinará como essas variáveis serão aplicadas no
cultivo microbiano.
A influência desses parâmetros pode ser ilustrada, por exemplo, por Park e
colaboradores (2002), que trabalhando com Cordyceps militaris para a produção de
exopolissacarídeos (EPS), observaram que o aumento da taxa de aeração favorecia a produção
de biomassa em relação à de macromoléculas. Tang e Zhong (2003) mostraram que variações
nos níveis de saturação de ar em cultivos de Ganoderma lucidium influenciavam o
fornecimento de oxigênio, levando a produção de quantidades diferentes de polissacarídeos
intracelulares, extracelulares e de ácido ganodérico pelo fungo. Os pesquisadores observaram
22
que uma menor saturação de ar (10 %) favorecia a produção de polissacarídeo extracelular
(0,7 g/L), enquanto que com um grau de saturação de ar maior (25 %) havia um aumento de
polissacarídeos intracelulares (1,6 g/L) e de ácido ganodérico (350 mg/L).
Portanto, pode-se concluir que valores significativos de biomassa podem ser
obtidos por otimização de condições de cultivo, e que isso permite um aumento nas
quantidades de componentes celulares que podem ser extraídos e terem suas moléculas
básicas investigadas, para posteriores aplicações industriais.
2.2 Parede Celular Fúngica
Nos fungos, a estrutura celular é semelhante a dos outros eucariotos,
constituída basicamente por uma membrana, um citoplasma com as organelas distribuídas
aleatoriamente por todo interior celular e um compartimento especial, o núcleo, que armazena
o material genético. As células podem ser encontradas na forma unicelular, como as
leveduras, ou então formando conjuntos de hifas, septadas ou não, denominadas de micélio,
como no caso dos fungos filamentosos. Tanto as células leveduriformes quanto o micélio
estão envolvidos por uma camada protetora externa denominada de parede celular,
quimicamente diferente da parede encontrada em vegetais, ainda que possa exercer os
mesmos tipos de funções (De ROBERTIS; HIB; PONZIO, 2001; MADIGAN; MARTINKO;
PARKER, 2004; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).
A parede celular fúngica pode ser caracterizada como uma estrutura
relativamente rígida, porém dinâmica, que participa de vários processos biológicos essenciais
à célula. Ela determina o formato da célula, fornece suporte osmótico, proteção física, além de
estar relacionada a eventos de sinalização celular, adesão e reprodução (PÉREZ; RIBAS,
2004; NIMRICHTER et al., 2005; MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005), sendo por
isso necessária para o crescimento e desenvolvimento dos fungos nos ambientes onde são
encontrados (DURAN; NOMBELA, 2004).
O crescimento micelial é dependente do processo de translocação, onde o
material celular é direcionado para as regiões em desenvolvimento (BOSWELL et al., 2003),
permitindo a formação das estruturas celulares, como a parede, facilitando a ocupação dos
ambientes pelo microrganismo. Em condições normais de desenvolvimento, a estrutura da
parede celular é baseada na parede já existente nas células progenitoras, que são estendidas e
remodeladas. Neste caso, ela serve como um arcabouço para a incorporação de novos
materiais dentro dos pontos de crescimento (KLIS; BOORSMA; De GROOT, 2006).
23
A parede celular compreende cerca de 20-30% do peso seco da célula
fúngica (SMITH et al., 1999), sua composição química, estrutura e dimensão variam
consideravelmente, dependendo das condições ambientais e/ou de cultivo laboratorial e essa
formação é coordenada com o ciclo celular (KLIS; BOORSMA; De GROOT, 2006).
A composição química da parede celular é bastante complexa, constituída
principalmente por polissacarídeos, ligados ou não a proteínas ou lipídeos, polifosfatos e íons
inorgânicos formando a matriz de cimentação. Quitina, glucanas, galactomananas e proteínas
são compostos mais freqüentes, embora sua quantidade varie entre as diferentes espécies de
fungos (ADAMS, 2004).
O conhecimento da constituição química da parede, principalmente em
relação à presença de polissacarídeos, é um dado importante para o emprego biotecnológico
dos fungos, pois estas moléculas podem ser utilizadas em processos industriais, para a
produção de alimentos, medicamentos, entre outros ou, ainda, serem úteis para a classificação
taxonômica desses organismos (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004).
Vários estudos têm sido realizados para o conhecimento da composição
química da parede celular de fungos, principalmente leveduras, como Schizosaccharomyces
pombe e Saccharomyces cerevisiae, muito utilizadas em industriais de alimentos
(GALICHET et al., 2001; DURAN; NOMBELA, 2004; MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS,
2005; KIM; YUN, 2005; NOMBELA; GIL; CHAFFIN, 2006).
De acordo com Aguilar-Uscanga e François, (2003) a parede celular de
leveduras apresenta como componentes polímeros de manose (constituindo manoproteínas),
glicanas (principalmente beta-glucanas, mas galactanas também podem ser encontradas) e
polímeros de N-acetilglucosamina (formando quitina).
Cerca de 60 a 90% do peso seco da parede celular de S. cerevisiae é
constituída de glucanas e mananas (CHAUD; SGARBIERI, 2006). Para Kapteyn e
colaboradores (1999), a parede celular desta levedura é organizada em duas camadas
formadas por quatro classes de macromoléculas como proteínas de parede celular (CWPs), β-
(1→6)-D-glucana, β-(1→3)-D-glucana e quitina, com estes componentes interconectados
através de ligações covalentes.
Lipke e Ovalle (1998) através de estudos realizados com microscopia
eletrônica observaram a disposição em camadas dos polissacarídeos da parede celular de S.
cerevisiae. A camada mais interna é constituída principalmente por uma β-(1→3)-D-glucana
com pequeno grau de substituição em C-6 por resíduos glucopiranosídicos, que variavam em
24
relação ao grau de maturação da célula. Segundo esses autores, a glucana poderia ser solúvel
ou insolúvel, em solução aquosa, dependendo do percentual de ramificação. Os demais
constituintes da camada interna observados foram a quitina, presente em proporções reduzidas
nas regiões de cicatrizes de brotamento, e uma β-(1→6)-D-glucana altamente ramificada,
solúvel em água (KLIS et al., 2002). Finalmente, uma manana constituída de uma cadeia
principal de α-(1→6)-D-manopiranose altamente ramificada também foi descrita como
constituinte da parede celular em S. cerevisiae. As ramificações foram caracterizadas como
cadeias laterais de comprimentos variados de unidades de manose α-(1→2) e em menor
proporção α-(1→3) ligadas, distribuídas de forma complexa ao longo da cadeia principal
(KAPTEYN; VAN DEN ENDE; KLIS, 1999).
A levedura Schizosaccharomyces pombe, espécie considerada modelo para
o estudo da relação entre a formação da parede celular e o ciclo celular, também apresenta β-
(1→3) glucana com ramificação em C-6 (MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005). Uma
característica distinta desta levedura é a ausência de quitina, um polissacarídeo geralmente
presente em outros fungos. Foram identificados outros polissacarídeos como uma α-(1→3)
glucana e uma galactomanana típica de leveduras, formada por uma cadeia principal de α-
(1→2) manopiranose, com unidades de galactose substituindo as posições terminais (PÉREZ;
RIBAS, 2004).
A parede celular dos fungos Candida albicans e Aspergillus fumigatus,
responsáveis por doenças em humanos, apresenta componentes como manana (Candida),
galactomanana (Aspergillus) e β-(1→3)-D-glucana (ambos os microrganismos) que podem
ser utilizados para o diagnóstico de infecções fúngicas invasivas, pois estas moléculas,
consideradas como antígenos circulantes, são detectados no sangue em uma fase inicial da
infecção e antes do surgimento dos sintomas clínicos. A detecção desses antígenos é um
procedimento mais rápido que os métodos tradicionais, realizados por estudos histológicos ou
cultura de células. A presença desses antígenos também pode ser utilizada para monitorar a
resposta dos pacientes ao tratamento com agentes antifúngicos (ERJAVEČ; VERWEIJ,
2002).
Como a parede celular é essencial para a sobrevivência da célula fúngica e
está ausente em células de mamíferos, ela se torna um alvo atrativo para a ação de drogas.
Portanto, o conhecimento da síntese da parede celular, bem como de sua composição química
podem dar informações valiosas para aplicação desses agentes antifúngicos (PÉREZ; RIBAS,
2004).
25
2.3 Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica
Os polissacarídeos constituem uma classe de biopolímeros produzidos por
todos os organismos vivos. Eles exibem diferentes tipos de estruturas químicas, funções
fisiológicas e aplicações (ZOHURIAAN; SHOKROLAHI, 2004). Estas moléculas são
polímeros de monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas, formadas a partir da
eliminação de uma molécula de água entre o grupo hidroxila hemiacetal/hemicetal de um
resíduo e um grupo hidroxila primário ou secundário de outro resíduo adjacente. Podem ser
constituídos por números variáveis de resíduos em uma estrutura linear, ramificada ou
ocasionalmente cíclica e sua massa molecular pode variar de milhares a milhões de daltons
(PAZUR, 1994).
Nos organismos vivos, os polissacarídeos podem estar sozinhos ou
covalentemente combinados com outros compostos de diferentes classes biológicas,
principalmente proteínas e lipídeos, constituindo os glicoconjugados. Em combinação ou
livres, essas moléculas têm importantes funções biológicas (NELSON; COX, 2002).
Em microrganismos, os polissacarídeos podem ser estruturais, excretados ao
meio como exopolissacarídeos (EPS) ou localizarem-se no citoplasma, exercendo a função de
reserva energética (KRCMAR et al., 1999; NELSON; COX, 2002). Os polissacarídeos
microbianos têm recebido considerável atenção devido ao seu potencial de aplicação em
diferentes áreas industriais incluindo cosméticos e alimentos funcionais, além de
medicamentos (VANDAMME et al., 2002, BAIS et al., 2005, FRANÇOIS; ROJAS;
DARAIO, 2005, METHACANON et al., 2005).
Nos fungos, os polissacarídeos constituem um percentual importante da
biomassa, onde a parede da hifa é formada por mais de 75% dessas moléculas, principalmente
em basidiomicetos. Além de atuarem como um suporte para a hifa, essas macromoléculas
também podem constituir uma “capa” extracelular ao redor do micélio (GUTIÉRREZ;
PRIETO; MARTINEZ, 1996).
A composição e estrutura química dos polissacarídeos de parede celular são
variáveis entre as diferentes espécies de microrganismos. Com base nos resultados
provenientes da caracterização química dessas macromoléculas, alguns autores propõem a sua
utilização como marcadores para a classificação taxonômica de fungos filamentosos,
leveduras e liquens (BARTNICKI-GARCIA, 1968; GORIN; SPENCER, 1970; TEIXEIRA;
IACOMINI; GORIN, 1995; CARBONERO et al., 2003; CARBONERO et al., 2005a;
PESSONI et al., 2005).
26
Devido ao grande número de fungos encontrados na natureza e a
possibilidade de terem em sua composição endopolissacarídeos e exopolissacarídeos com
diferentes aplicações medicinais, estudos estão sendo realizados para verificar o potencial
dessas macromoléculas como antioxidantes, antimutagênicos, anticoagulantes,
antitrombóticos e imunomoduladores. (FREIMUND et al., 2003; ZHANG et al., 2005;
CORRADI da SILVA et al., 2006).
Dentre os polissacarídeos encontrados na parede celular fúngica as glucanas
são os homopolissacarídeos mais comuns. A maioria é linear, com diferentes disposições de
suas ligações glicosídicas, pertencentes à série alfa (α) ou beta (β). As β-glucanas são a forma
predominante, podendo estar livres ou associadas às proteínas, lipídeos e outros
polissacarídeos. A conformação destas moléculas pode variar desde simples até tripla hélice,
que é a forma mais comum, onde três cadeias de polímeros são agregadas por ligações de
hidrogênio nos oxigênios do C-2 (WILLIAMS, 1997).
As β-(1→3)-D-glucanas encontradas em extratos celulares de
Saccharomyces cerevisiae possuem ramificações em C-6 e esses terminais não redutores
podem estar covalentemente ligados à cadeia de quitina através de ligação α-(1→4)
(LESAGE; BUSSEY, 2006).
A síntese de β-glucanas em fungos envolve várias etapas: reações de
iniciação, alongamento da cadeia e ramificação, das quais a mais estudada é o alongamento da
cadeia que envolve a reação catalisada pela enzima glucana β-(1→3) sintase a partir de
uridina difosfato-glucose (UDP-glucose) como substrato (RUIZ-HERRERA, 1991). De
acordo com Douglas (2001), a polimerização dos açúcares é gradativa, sendo adicionado uma
unidade de glucose por vez, até se formar as longas cadeias.
Na parede celular de algumas leveduras, como Candida dubliniensis, foi
encontrado um componente majoritário rico em manose associado a uma proteína,
constituindo as manoproteínas. A esse tipo de glicoconjugado têm sido atribuídas funções de
adesão entre células, habilidades imunomoduladores e variabilidade antigênica
(LIŽIČÁROVÁ et al., 2007). Moléculas de manose podem, também, ser encontradas como
galactomananas, que são heteropolissacarídeos constituídos por uma cadeia principal de
manose ligada a resíduos de galactose, presentes em espécies do gênero Aspergillus, como A.
fumigatus e A. wentii, e Chaetosartorya chrysella, fungos estudados em relação à
patogenicidade humana (GÓMEZ-MIRANDA et al., 2004). Dependendo do grau de
ramificação, bem como do tamanho da cadeia lateral, as galactomananas apresentam
27
propriedades físicas e químicas distintas, que permitem classificá-las como uma família de
macromoléculas.
Um constituinte menor da parede celular e comum em fungos é a quitina,
um homopolímero linear, longo, formado por resíduos de N-acetilglucosamina β-(1→4)
ligados. Compreende cerca de 1 a 2% da parede celular de leveduras embora seja encontrada
em maior proporção (10 a 20%) em fungos filamentosos. Pontes de hidrogênio inter-cadeia
dão origem a microfibrilas de quitina. Essas estruturas suportam grandes pressões e, portanto,
tornam-se responsáveis pela integridade da parede celular. Quando a síntese da quitina é
interrompida, a parede celular torna-se desorganizada e a célula fúngica sofre deformações e
instabilidade osmótica (BOWMAN; FREE, 2006).
A caracterização química dos constituintes da parede celular fúngica
contribuirá para o conhecimento básico do microrganismo, para o entendimento de suas
relações com o meio e a provável utilização biotecnológica de seus componentes isolados.
2.4 Procedimentos Gerais para Purificação e Caracterização de Polissacarídeos de
Parede Celular
Visto que a biomassa fúngica constitui uma valiosa fonte de proteínas,
lipídeos e principalmente de polissacarídeos que apresentam inúmeras propriedades benéficas
para a saúde humana, animal e vegetal, diferentes métodos são utilizados para o isolamento e
caracterização destes polissacarídeos.
Primeiramente, é necessário efetuar a extração eficiente dos polissacarídeos
evitando, tanto quanto possível, reações de degradação. Os procedimentos mais comuns são
as extrações aquosas a frio, a quente e/ ou alcalina, com NaOH ou KOH, ou até mesmo com
auxílio de enzimas específicas. Os extratos obtidos, geralmente são constituídos por uma
mistura de polissacarídeos (PÉREZ; RIBAS, 2004).
Precedendo a caracterização (PAZUR, 1994), procedimentos de purificação
devem ser efetuados até que a composição monossacarídica da macromolécula em estudo se
mantenha constante por, pelo menos, dois métodos diferentes. Normalmente, métodos
cromatográficos e/ou químicos dão informações em relação à pureza da preparação
polissacarídica (DANISHEFSKY; WHISTLER; BETTELHEIM, 1970; BOYER, 1993).
Considerando-se a pureza do material o primeiro procedimento químico
para conhecer a composição de uma fração rica em carboidrato é fragmentá-la, para ter os
resíduos monossacarídicos que a constitui (NELSON; COX, 2002). Esta fragmentação pode
28
ser realizada através de hidrólises enzimática ou ácida. Estabelecidas às condições ideais de
hidrólise, a identificação dos monômeros passa a ser a etapa seguinte da análise. Os métodos
cromatográficos são os mais utilizados e a cromatografia líquida de alta pressão em troca
aniônica (HPAEC) tem sido, juntamente com a cromatografia gasosa, os de preferência
(RUAS-MADIEDO; LOS REYES-GAVILAN, 2005).
O tipo de ligação glicosídica geralmente é determinado após a análise dos
acetatos de alditóis parcialmente metilados por cromatografia gasosa e espectrometria de
massa (CG-MS) e a configuração anomérica dos monossacarídeos que constituem a
macromolécula por FT-IR. (SILVERSTEIN, 1994; MOHAČEK-GROŠEV; BOŽAC;
PUPPELS, 2001) e RMN de
13
C (GORIN, 1981; CORRADI da SILVA et al., 2006).
2.5 Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica: Purificação e Caracterização
Estudos demonstram que os polissacarídeos fúngicos podem ser isolados da
parede celular do corpo de frutificação, do micélio, do esclerócio (forma de resistência) ou
então serem provenientes de meios de cultivo livres de células (extracelulares) (MONDAL et
al., 2004; WANG et al., 2004; CORRADI da SILVA et al., 2006).
Vários polissacarídeos foram isolados da parede celular do Phytophthora
parasitica, um fungo fitopatogênico. A mistura polissacarídica foi fracionada por
cromatografias sucessivas em DEAE-celulose, Sephadex G-25, Concanavalina-A Sepharose e
Sephadex G-200. Os polissacarídeos neutros consistiam de uma β-D-glucana (1→3,1→6)
cuja massa molecular ficou entre 9 x 10
3
a 200 x 10
3
Da. Todos estes polissacarídeos eram
constituídos por uma cadeia principal de resíduos de glucose β-(1→3) ligados (FABRE et al.,
1984).
O principal componente encontrado no extrato aquoso do corpo de
frutificação de Boletus erythropus foi uma β-glucana contendo resíduos de glucose com
ligações (1→3), sendo substituídas em O-6 por terminais não redutores de -D-Glcp, na
freqüência de 1:3 (CHAUVEUAU et al., 1996).
Ruiz-Herrera e colaboradores (1996) mostraram que as composições
monossacarídicas do micélio e da levedura de Ustilago maydis, um hemibasidiomiceto
fitopatogênico que causa doença em milho, são distintas. Glucose (41%), galactose (32%),
manose (16%) e xilose (11%), monossacarídeos encontrados na forma micelial diferiram
daqueles encontrados na forma leveduriforme: glucose (26%), xilose (23%), manose (23%),
galactose (11%), fucose (6%), arabinose (6%) e ribose (5%).
29
Prieto e colaboradores (1997) isolaram um polissacarídeo complexo, por
extração alcalina, da parede celular dos fungos Trichoderma reesei, T. koningii (forma
teleomórfica) e Hypocrea psychrophila (anamórfica). Esses fungos, encontrados no solo, têm
grande importância econômica por atuarem como agentes de biocontrole de fungos
fitopatogênicos e por serem produtores de enzimas como as celulases. Após hidrólise ácida do
polissacarídeo complexo solúvel em água foram detectados por cromatografia gasosa, como
acetato de alditóis, os açúcares glucose, galactose e manose. Análises de metilação e
ressonância magnética nuclear de carbono 13 e próton uni- e bidimensional mostraram um
estrutura altamente complexa com uma cadeia principal constituída de unidades
manopiranosídicas α-(1→6) ligadas, algumas unidades substituídas em 2 por oligossacarídeos
com unidades galactofuranosídicas alternadas com ácido glucurônico ou em 3 por unidades α
manopiranosídicas.
Ahrazem e colaboradores (1997) caracterizaram um polissacarídeo acídico
isolado da parede celular de Cylindrocladium e de sua forma anamórfica Calonectria, por
extração alcalina. Os acetatos de alditóis, galactose, glucose e manose foram detectados por
cromatografia gasosa, além da presença de ácido urônico. Análises de metilação mostraram os
derivados 2,3,4,6-tetra-O-metil glucitol e 3-5-di-O-metil galacitol, além de 5% de 2,3,4-tri-O-
metil manitol, e 3,4-di-O-metil manitol. O espectro de RMN de
13
C
mostrou apenas dois
sinais na região anomérica, δ 107,1 ppm e 176,2 ppm, atribuídos, respectivamente, aos
resíduos β-galactofuranosídicos e carbonila, confirmando a presença de ácido urônico.
Uma β-D-glucana-(1→3) solúvel substituída em C-6, em uma proporção de
aproximadamente 30%, foi encontrada como principal componente da extração alcalina da
parede celular de Cryphonectria parasítica (MOLINARO et al., 2000).
Zhang e colaboradores (2000) extraíram uma glucana do corpo de
frutificação do basidiomiceto Ganoderma lucidum. Após resultados das análises de metilação,
oxidação pelo periodato, ressonância magnética nuclear de carbono 13 e espectroscopia de
infravermelho, a molécula foi caracterizada como um polímero linear constituído de resíduos
glucosídicos α-(1→3) ligados.
Um polissacarídeo solúvel foi isolado do extrato aquoso a quente do corpo
de frutificação de Agaricus blazei (Murr) por precipitação etanólica, cromatografia de trôca-
iônica e cromatografia de filtração em gel. As análises de metilação, degradação de Smith,
hidrólise branda e espectroscopia de RMN de
13
C mostraram que o polissacarídeo era
30
composto por uma cadeia principal de resíduos glucosídicos em ligação β-(1→6), substituídos
em C-3 por resíduos laminaribiosídicos (DONG et al., 2002).
O corpo de frutificação de Ganoderma lucidum, tem sido usado
tradicionalmente na medicina chinesa e em outros países asiáticos por apresentarem efeitos
medicinais contra câncer, hipertensão, hepatite e hipercolesterolemia e vários polissacarídeos
têm sido obtidos a partir do extrato aquoso dessa estrutura de Ganoderma (BAO et al.,
2002a). Uma das glucanas isoladas foi caracterizada como tendo uma cadeia principal
constituída de unidades glucopiranosídicas β-(1→3) substituídas em O-6 por uma unidade de
glucose (BAO et al., 2001; BAO et al., 2002a). Glucanas com estrutura química semelhantes
também foram isoladas dos esporos deste mesmo fungo (BAO et al., 2002b).
Domenech e colaboradores (2002) isolaram e caracterizaram uma
galactomanana do extrato alcalino da parede celular de três linhagens de Verticillium
fungicola, considerado um dos patógenos mais comuns no cultivo do cogumelo Agaricus
biosporus. A fração F1SS, das três linhagens estudadas, era constituída por manose e
galactose. A análise de metilação mostrou dois picos identificados como 1,5-di-O-acetil-
2,3,4,6-tetra-O-metil-galacitol, que correspondem a galactopiranose, e 1,4,5,6-tetra-O-acetil-
2,3-di-O-metil-manitol e um pequeno percentual de Manp 6-O-substituído. A massa
molecular média dos polissacarídeos, determinada por cromatografia de filtração em gel de
Sepharose CL-6B, ficou entre 70 a 80 kDa. Os resultados da análise de metilação juntamente
com espectros de RMN de H
1
e de
13
C
1
sugeriram uma estrutura formada por uma cadeia
principal de unidades manopiranosídicas α-(1→6) ligadas e substituídas em O-4 por resíduo
β-D-galactopiranosídicos. Esses resultados confirmam a semelhança estrutural dos
polissacarídeos nas diferentes linhagens e reforçam a aplicação dos polissacarídeos como
marcadores taxonômicos.
Ahrazem e colaboradores (2002) caracterizaram um polissacarídeo solúvel
em água, extraída com álcali de paredes celulares das espécies de Geotrichum spp. (forma
anamórfica), Galactomyces e Dipodascus (formas teleomóficas). Por análise de metilação e
ressonância magnética nuclear concluíram que o polissacarídeo era uma galactomanana com
cadeia principal constituída de unidades α-D-manp 1→6 e substituídas em 2 por (α-D-Galp-
(1→2)- α-D-Manp-1→). Todas as espécies estudadas apresentaram o mesmo polissacarídeo e,
portanto, concluíram tratar-se do mesmo gênero.
Uma linhagem selvagem de Poria cocos foi cultivada, separadamente, em
extrato de cevada e em extrato fermentado de milho e denominadas de wb e wc,
31
respectivamente. Seis frações polissacarídeos foram isoladas, seqüencialmente, dos dois
micélios por extrações com NaCl 0,9% (PCM1), aquosa a quente (PCM2), NaOH 0,5M
(PCM3-I e -II) e ácido fórmico a 88% (PCM-4-I e –II). Glucanas extraídas com NaOH 0,5M
se separam em duas frações, denominadas PCM3-I e PCM3-II, após neutralização com ácido
acético. As características físicas e químicas foram determinadas por espectroscopia de IV
(Infra-Vermelho), cromatografia gasosa (CG), RMN-
13
C, light scattering (LS) e viscosimetria.
Os resultados indicaram que as frações PCM-1 e PCM-2 dos cultivos em wb e wc eram
constituídas por heteropolissacarídeos formados por glucose, manose e galactose, enquanto
que em PCM3-I foram encontradas glucanas lineares com ligações do tipo α-(1→3). As
frações PCM3-II, PCM4-I e PCM4-II eram compostas de glucanas lineares com ligações do
tipo β-(1→3) (JIN et al., 2003).
Em 2004, Jia e colaboradores elucidaram a estrutura de um
heteropolissacarídeo de peso molecular de 1,8 x 10
4
Da,
composto por ramnose, glucose e
galactose na proporção de 1,19: 3,81: 1,00, isolado do corpo de frutificação do fungo
medicinal chinês Hericium erinaceus. Suas características estruturais foram investigadas
utilizando análise de metilação, hidrólise parcial, espectroscopia de infravermelho e de RMN.
Os resultados mostraram que a cadeia principal era formada por unidades α-D-
galactopiranosídicas com ramificações em O-2 por resíduos de ramnose e glucose.
Chakraborty e colaboradores (2004) isolaram e caracterizaram uma
heteroglucana da extração aquosa a quente (100ºC, 6h) do corpo de frutificação do fungo
comestível Astraeus hygrometricus que constitui micorrizas crescendo junto com as raízes de
árvores auxiliando na extração de nutrientes, especialmente o fósforo do solo, e de substâncias
orgânicas. A fração solúvel do extrato aquoso foi investigada e os resultados das análises de
hidrólise ácida total, metilação e RMN permitiram concluir que se tratava de uma glucana
com ligações glicosídicas do tipo α-(1→4) e β-(1→6).
Mondal e colaboradores (2004) realizaram uma extração aquosa do corpo de
frutificação (100ºC, 6h) de Termitomyces eurhizus, um cogumelo de grande interesse devido a
suas propriedades imunomoduladoras e seu alto valor nutritivo. O extrato deste
microrganismo, depois de dializado e precipitado com etanol, foi submetido à purificação pela
cromatografia de filtração em gel Sephadex G-50 onde foram separadas duas frações
homogêneas, denominadas PS-I e PS-II. Análises de metilação, oxidação com periodato,
RMN do
13
C
e de
1
H, mostraram que o polissacarídeo da fração PS-I era composto por
32
unidades glucopiranosídicas unidas por ligações do tipo α-(1→3) e α-(1→6) na proporção de
2,5:1. PS-II também era um polímero de glucose mas com ligações do tipo α-(1→6).
Uma glucana isolada do micélio de um fungo comestível chinês Cordyceps
sinensis foi caracterizada por análise de metilação, degradação de Smith, acetólise,
espectroscopia de RMN (
1
H,
13
C,
13
C-
1
H 2D-COSY) e hidrólise ácida total. Os resultados
mostraram que cadeia principal era composta de resíduos α-(1→4)-D-glucopiranosídicos
ligados a um único resíduo α-(1→6)-D-glucosídicos (YALIN; CUIRONG; YUANJIANG,
2006).
Um polissacarídeo insolúvel em água foi isolado da extração alcalina
(NaOH) do micélio de Penicillium chrysogenum. O peso molecular desse polímero, 180 KDa,
foi determinado por cromatografia de permeação em gel. Após hidrólise ácida total e análise
dos derivados acetilados por cromatografia líquido-gasosa (GLC) foram encontrados os
açúcares glucose, manose e galactose nas proporções 98,7: 0,6: 0,7. O espectro de FT-IR
apresentou picos de absorção em 929, 846 e 820 cm
-1
característicos de glucanas com ligações
do tipo α-(1→3). O espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13 apresentou 6
sinais de intensidades semelhantes. Os deslocamentos químicos em 101,20 ppm e 83,66 ppm
foram atribuídos ao carbono anomérico dos resíduos de glucose e ao C-3-O-substituído,
respectivamente (WANG et al., 2007).
Um endopolissacarídeo foi isolado do extrato aquoso a quente do micélio do
Inonotus obliquus, (fungo de degradação branca) e purificado por cromatografia de troca
iônica e de filtração em gel. Após caracterização, o polissacarídeo mostrou-se constituído por
resíduos de fucose, glucose e manose e massa molecular de aproximadamente 1 × 10
6
Da.
Verificou-se que esse endopolissacarídeo é um ativador específico de células B e de
macrófagos. Os resultados in vivo e in vitro comprovaram que a atividade antitumoral não se
deve ao efeito tumoricida e sim ao efeito imunomodulador (KIM et al., 2006).
2.6 Atividades Biológicas dos Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica
Os biopolímeros, de maneira geral, têm sido objetos de pesquisas devido ao
seu potencial de aplicação. Estudos realizados com os polissacarídeos da parede celular
fúngica demonstram que essas moléculas apresentam uma variedade de respostas biológicas
de defesa, mas sua aplicação terapêutica parece estar relacionada com a estrutura química e a
conformação espacial de cada macromolécula, sendo que pequenas diferenças estruturais
33
entre polímeros resultam em características peculiares para novas aplicações biotecnológicas
(CORRADI da SILVA et al, 2006).
Diferentes funções biológicas desses polímeros foram analisadas, como
hipoglicemiantes, anti-trombóticas, antibióticas, atividades anti-tumorais e anti-virais, atuação
na diminuição da pressão arterial e na concentração de lipídios sanguíneos, na inibição da
ação inflamatória e microbiana. (ZHANG et al., 2000; HWANG et al., 2003; ALQUINI et al.,
2004; ZHANG et al., 2007). Estudos com os basidiomicetos Agaricus blazei e Lentinus
edodes, utilizados na medicina popular japonesa e chinesa para prevenção e tratamento de
doenças, mostraram que essas atividades poderiam estar ligadas aos polissacarídeos presentes
nestes fungos (LIMA et al., 2001; DELMANTO et al., 2001; CHEN; SHAO; SU, 2004).
As glucanas são os polissacarídeos mais estudados em relação à atividade
biológica. Essas moléculas, principalmente do tipo β-(1→3) e/ou β-(1→3; 1→6), são capazes
de ativar células do sistema imunológico humano, como macrófagos, neutrófilos e células NK
(natural killer), para a secreção de citocinas (interleucinas, interferon e fator necrosante
tumoral) que são substâncias que atuam como sinais químicos nos processos de diferenciação,
proliferação e apoptose celulares, contribuindo para a manutenção da homeostase no
organismo (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; HABIJANIČ et al., 2001).
Muitos medicamentos utilizados em neoplasias apresentam como efeito
colateral uma ação imunossupressora, que pode acarretar em infecção e septicemia. Devido à
capacidade das β-glucanas em estimular o sistema imunológico, elas podem ser utilizadas
como adjuvantes desses quimioterápicos no tratamento de pacientes imunocomprometidos.
(BOHN; BeMILLER, 1995; LEE et al., 2001; SUGAWARA et al., 2004; ZHANG et al.,
2005; LEUNG et al., 2006).
Além das glucanas, outros polisssacarídeos de parede também estão sendo
investigados com o intuito de determinar suas atividades biológicas.
De acordo com Zhang e colaboradores (2007), manoglucanas,
galactomananas, e glucomananas, obtidas da biomassa de basidiomicetos, tais como
Ganoderma lucidum, Grifola frondosa e diferentes espécies do gênero Pleurotus, como P.
cittinopileatus, também podem apresentar atividades antitumorais ou imunomoduladoras.
Martinichen-Herrero e colaboradores (2005) isolaram e caracterizaram uma
galactomanana do líquen Cladonia ibitipocae e a modificaram quimicamente pela inserção de
grupamentos sulfato, num processo denominado sulfatação; os polissacarídeos original e
modificado apresentaram atividades anticoagulante e antitrombótica distintas em
34
experimentos realizados em ratos, com os resultados mais positivos relacionados à molécula
sulfatada.
Trabalhos realizados por Krizková e colaboradores (2001), investigaram
glucomananas isoladas de Candida utilis e mananas de Saccharomyces cerevisiae e Candida
albicans. Eles observaram que essas moléculas apresentavam atividade antimutagênica, pois
eram capazes de reduzir danos oxidativos ao DNA de cloroplastos do flagelado Euglena
gracilis, e que esta ação poderia estar relacionada à característica das moléculas em seqüestrar
radicais livres, demonstrando também que esses polissacarídeos possuem atividade
antioxidante.
Além das funções biológicas destacadas acima, é importante também
ressaltar que dependendo das características químicas que esses biopolímeros apresentem
como, por exemplo, o grau de solubilidade em soluções aquosas, é possível também a sua
utilização nos mais diversos segmentos industriais, como indústrias de alimentos, cosméticos,
etc (SUTHERLAND, 1998; SHAH et al., 2000; WANG et al., 2004; METHACANON et al.,
2005).
2.7 Botryosphaeria rhodina
O ascomiceto Botryosphaeria sp isolado de cancro de eucalipto por Barbosa
e colaboradores em 1996, foi recentemente classificado como Botryosphaeria rhodina
(GARCIA et al., 2004). Este fungo é um ascomiceto produtor constitutivo de lacases e teve a
produção da enzima aumentada na presença de álcool veratrílico, considerado indutor para
produção de polifenoloxidases (VASCONCELOS et al., 2000; VASCONCELOS et al, 2001).
Em 2001, Dekker e Barbosa relataram a produção de β-D-glucana pelo
Botryosphaeria rhodina quando cultivado em concentrações crescentes de glucose (1 a 4%
m/v). Posteriormente, este exopolisssacarídeo foi caracterizado estruturalmente como uma β-
(1→3; 1→6)-D-glucana, com aproximadamente 22% de ramificação em C-6, o qual foi
denominado botriosferana. Os produtos obtidos da hidrólise ácida parcial do polissacarídeo
demonstraram que as ramificações consistiam de resíduos glucopiranosídicos e
gentiobiosídicos ligados à cadeia principal por ligações do tipo β-(1→6) (BARBOSA et al.,
2003).
A β-D-glucana do Botryosphaeria rhodina foi produzida em diferentes
fontes de carbono tais como glucose, frutose, manose, sacarose e melaço de cana de açúcar. A
35
maior produção do exopolissacarídeo (3,7 ± 0,5 g/L) e de biomassa micelial (17,4 ± 1,9 g/L)
foi obtida em sacarose comercial, seguido da glucose cuja produção de EPS (2,8 ± 0,5 g/L) e
de biomassa (15,4 ± 2,2 g/L) também foram relevantes (STELUTI et al., 2004). O grau de
ramificação do EPS variou nas diferentes fontes de carbono utilizadas. Corradi da Silva e
colaboradores (2005) verificaram que o polissacarídeo obtido em frutose, como fonte de
carbono, possuía 31% de ramificações em sua cadeia principal, diferentemente de sacarose
(21%) e de glucose (20%).
Bioensaios com botriosferana foram realizados por Miranda e colaboradores
e os resultados obtidos demonstraram importantes propriedades como à ausência de
mutagenicidade, atividades antimutagênicas, hipoglicemiantes e hipocolesterolêmicas
(MIRANDA et al., 2006).
Considerando-se que a biomassa micelial passa a ser um resíduo da
produção de EPS por Botryosphaeria rhodina e que não existem relatos na literatura sobre a
composição da biomassa micelial e, principalmente, dos polissacarídeos constituintes da sua
parede celular, faz-se necessário desenvolver estudos sobre sua composição química.
Portanto, este trabalho pretende obter cientificamente parte destas informações, as quais
certamente irão contribuir no futuro para o aproveitamento adequado e racional da biomassa
fúngica, para pesquisas de novas drogas antifúngicas visando o controle de patógenos de
diferentes organismos, ou ainda a utilização biotecnológica das moléculas isoladas.
36
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Extrair, purificar e caracterizar quimicamente polissacarídeos da biomassa
do fitopatógeno Botryosphaeria rhodina.
3.2 Objetivos Específicos
• Extrair os polissacarídeos, de acordo com suas solubilidades em água fria, água quente e
solução aquosa de hidróxido de potássio, em tempos variáveis e repetidas vezes.
• Purificar os polissacarídeos obtidos nas extrações aquosa e alcalina utilizando
tratamentos de gelo/degelo e cromatografia de filtração em gel.
• Determinar os constituintes monossacarídicos por cromatografia líquida de troca iônica,
após hidrólise ácida total dos polissacarídeos.
• Determinar a configuração da ligação glicosídica por ressonância magnética nuclear de
carbono treze (RMN-
13
C) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
(FTIR).
• Determinar a posição da ligação glicosídica dos polissacarídeos analisando, por
cromatografia gasosa e espectrometria de massa, os acetatos de alditóis parcialmente
metilados.
37
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 1 - Fluxograma de extração e purificação dos polissacarídeos da biomassa do
B.rhodina.
38
4.1 Materiais
4.1.1 Microrganismo
O ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05 do de cancro de eucalipto
por Barbosa, Dekker e Hardy (1996).
4.1.2 Reagentes
Os principais reagentes químicos utilizados para o preparo dos meios de
cultivo, das soluções e os experimentos foram de grau analítico, obtidos da Merck, Fluka ou
Sigma.
4.1.3 Equipamentos
As pesagens, em geral foram realizadas em Balanças Analíticas Mettler
Toledo AB204, Micronal e em balanças semi-analítica Gehaka BG-440; Gehaka BG-2000.
Os meios de cultivo e outros materias foram esterilizados em autoclave
vertical Fabbre, modelo 103, a 121 °C por 20 minutos.
As inoculações dos microrganismos e toda a manipulação de material estéril
foram feitas em câmara de fluxo laminar Veco, modelo VLFS-09.
Os cultivos em meio sólido foram incubados em estufa incubadora Nova
Ética 411D, e os cultivos líquidos foram mantidos em incubadora orbital Cientec CT-712.
As centrifugações foram feitas em centrífuga refrigerada Boeco U-32R na
fase de cultivo para produção da biomassa.
As evaporações foram realizadas em evaporador rotativo Buchi, modelo R-
114, com auxílio do banho-maria Buchi, modelo B-480.
As centrifugações realizadas para o fracionamento de polissacarídeos dos
extratos da biomassa foram realizadas na centrífuga Damon, modelo HT e na microcentrífuga
Beckman.
As determinações espectrofotométricas foram realizadas em
espectrofotômetro Shimadzu modelo UV/VIS-1601.
As hidrólises dos polissacarídeos foram realizadas em bloco de aquecimento
modelo Digi Block, Laboratory Devices INC.
39
As análises de monossacarídeos foram realizadas em Cromatógrafo Líquido
de Troca Iônica (HPAEC) com detector Eletroquímico Modelo ED 40, Bomba Gradiente
Modelo GP 40 e Integrador modelo 4600, marca Dionex.
As purificações dos polissacarídeos foram realizadas por cromatografia de
exclusão molecular em coluna de vidro preenchida de gel sepharose CL-4B, com auxílio da
bomba peristáltica Pump P-1, Amersham Pharmacia Biotech.
As frações obtidas após passar pela coluna cromatográfica foram coletadas
com o coletor Frac-100, Amersham Pharmacia Biotech.
As filtrações dos extratos foram realizadas por um sistema constituído por
um funil de Buchner, filtro de nylon e um kitasato conectado a bomba de vácuo Dia Pump, da
Fanem.
As liofilizações dos materiais em estudo foram feitas em liofilizador modelo
E.C, da Edwards.
As homogeneizações de amostras foram realizadas no agitador de tubos
AP56, da Phoenix, ou no agitador da Fisatom.
O destilador utilizado foi da marca Quimis e deionizador da Water Pro PS,
marca Labconco.
4.2 Métodos Gerais
4.2.1 Manutenção do microrganismo
O ascomiceto Botryosphaeria rhodina foi mantido em BDA (batata-
dextrose-ágar) inclinado, a 4°C, feito repiques trimestrais.
4.2.2 Preparo do inóculo
Para o preparo do inóculo, o fungo foi transferido para placas de Petri
contendo meio mínimo de Vogel (VOGEL, 1956) glucose 1% (p/v) e ágar 2% (p/v). As
placas foram incubadas durante 5 dias a 28±2°C. Após este período de desenvolvimento,
foram transferidas pequenas porções de hifas do fungo da superfície das placas para frascos
de Erlenmeyer de 125 mL, modificados com quatro inserções na parede, contendo meio
mínimo de Vogel e glucose 0,5% (p/v).
O pré-inóculo foi mantido sob agitação constante durante 48 horas a 28±2
°C e 180 rpm. Em seguida os micélios foram transferidos, assepticamente para um
40
homogeneizador, previamente autoclavado, onde foram homogeneizados por 30 segundos a
velocidade máxima. O homogeinato foi centrifugado durante 10 minutos a 1790×g, os
sobrenadantes resultantes foram descartados e os precipitados foram ressuspensos em uma
solução de salina fisiológica estéril. A suspensão micelial foi diluída em solução de salina
fisiológica estéril, até se obter um valor de absorvância entre 0,4 e 0,5 a 400 nm.
Os cultivos foram desenvolvidos em frascos de Erlenmeyer de 2L contendo
400 mL de meio de Vogel (STELUTI et al., 2004) e glucose na concentração de 5% (p/v). Em
cada frasco foi inoculado 16 mL do homogeinato de micélios. Os cultivos foram mantidos sob
agitação constante durante 72 horas a 28±2 °C e 180 rpm.
4.2.3 Isolamento da biomassa
Os cultivos foram interrompidos através de centrifugação (9056×g por 30
minutos) obtendo-se o sobrenadante contendo exopolissacarídeos e o precipitado contendo a
biomassa que foi lavada exaustivamente, com água destilada, para total remoção do
exopolissacarídeos. Este procedimento foi repetido até que a água de lavagem não
apresentasse nenhum açúcar, determinado pelo método de fenol ácido sulfúrico (DUBOIS et
al., 1956).
4.3 Métodos Analíticos
4.3.1 Quantificação de proteínas nos extratos
O método de Bradford foi utilizado para a determinação da concentração de
proteínas em todas as etapas da purificação (BRADFORD, 1976). Este método baseia-se na
ligação do corante (Coomassie Blue G-250) com as moléculas de proteína, formando um
complexo azul. O corante reage preferencialmente com resíduos de arginina e, em menor
extensão, com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenilalanina (COMPTON;
JONES, 1985). Utilizou-se o protocolo original do método, com algumas modificações,
conforme descrito a seguir:
Solução estoque: 40 mg de Coomassie Blue G-250 foram dissolvidos em 20
mL de etanol absoluto. Foram adicionados 40 mL de acido fosfórico 85% e água destilada
para completar 100 mL de solução.
Solução de uso: foi feita uma diluição (1:4, v/v) da solução estoque em
água, e, em seguida filtrada em papel de filtro.
41
Procedimento: adicionou-se 1 mL da solução de uso, contendo o corante, à
100 μL da amostra, e em seguida foi feita a leitura em espectrofotômetro a 595 nm, num
período de 2 a 20 minutos após o início da reação.
A concentração de proteína foi calculada através de uma curva de calibração
com albumina bovina (BSA), na faixa de concentração de 5 a 50 μg.
4.3.2 Quantificação de açúcares totais
O método do fenol-ácido sulfúrico ou de Dubois e colaboradores (1956) foi
utilizado para a determinação da concentração e detecção de carboidrato total durante as
etapas de extração e purificação dos polissacarídeos, bem como durante a caracterização
estrutural. O método consiste na formação do derivado furfural, na presença de H
2
SO
4
concentrado, que reage com o fenol formando um complexo de cor amarela.
Reagentes: Solução de Fenol 5% (m/v), H
2
SO
4
concentrado.
Procedimento: 0,5 mL da solução de Fenol foi adicionada a 0,5 mL da
amostra, e, em um único jato, 2,5mL de H
2
SO
4
concentrado. Após 20 minutos foi feita a
leitura espectrofotométrica a 490 nm.
Para calcular a concentração de carboidratos foi feita uma curva padrão de
glucose (0,01 g %) na faixa de concentração de 10 a 50 μg.
4.3.3 Quantificação de açúcares redutores
No método de Somogyi-Nelson os açúcares redutores reduzem o reativo
cupro-alcalino de Somogyi formando óxido-cuproso. Este na presença do reativo arseno-
molíbdico de Nelson forma um complexo de óxido de molibdênio de cor azul estável
(NELSON, 1944).
Reagentes: reativo arseno-molíbdico de Nelson (1944) e reativo de Somogyi
(1945).
Procedimento: a 0,5 mL da solução contendo de 10 a 80 µg de açúcares
redutores foi acrescentado 0,5 mL do reativo de Somogyi e deixado em banho-maria fervente
por 10 minutos, cobrindo os tubos com pérolas de vidro, evitando a evaporação do solvente.
Após resfriamento foram adicionados 0,5 mL do reativo de Nelson e, em seguida,
acrescentados 3,5 mL de água destilada, agitada e lido em espectrofotômetro a 540 nm.
42
Para calcular a concentração de açúcares redutores nas amostras utilizou-se
uma curva padrão de glucose 0,1 g%, na faixa de 10 a 80 µg, em concentrações variáveis de
acordo com a estimativa do teor de carboidrato da amostra.
4.4 Extração dos Polissacarídeos
4.4.1 Extração aquosa a fria
Aproximadamente, 70 g de biomassa liofilizada e macerada, livre de EPS,
foram extraídos com quatro litros de água destilada, a 4°C, sob agitação em agitadores
magnéticos por um período de 12 horas. Após filtração por tecido de nylon, o resíduo (R
1
) foi
submetido a mais dois procedimentos idênticos de extração. Os extratos aquosos a frio (F
1
, F
2
e F
3
) tiveram seus volumes reduzidos por evaporação à baixa pressão. Em seguida foi
realizada a precipitação das macromoléculas com aproximadamente 3 volumes de etanol P.A.
Os precipitados etanólicos foram separados por centrifugação (8000×g, 15 min.),
ressolubilizados em água e submetidos à diálise exautiva para eliminar impurezas e então
foram liofilizados. Após pesagem de F
1
, F
2
e F
3
foram retiradas alíquotas para hidrólise ácida
total e para quantificação de açúcares totais, redutores e proteínas.
4.4.2 Extração aquosa a quente
O resíduo final da extração aquosa a frio (R
1
)
foi tratado com água destilada
(3L) a 100°C, durante 6 horas. Após esse período, foi filtrado por tecido de nylon, ainda
quente, e o resíduo resultante foi submetido ao mesmo procedimento extrativo, por mais três
vezes.
Os extratos aquosos a quente (Q
1
, Q
2
, Q
3
e Q
4
) foram concentrados,
precipitados com álcool etílico P.A., dialisados exaustivamente e liofilizados e pesados. Após
a pesagem, foram retiradas alíquotas para hidrólise ácida total e para quantificação de
açúcares totais, redutores e proteínas.
4.4.3 Extração alcalina com KOH 2% a quente
O resíduo da extração aquosa a quente (R
2
) foi tratado com solução aquosa
de KOH a 2% (2L), a 100°C, por aproximadamente 2 horas. Após esse período, foi filtrado
por tecido de nylon, ainda quente, e o resíduo resultante foi submetido ao mesmo
procedimento extrativo, por mais uma vez. Em seguida o extrato alcalino (K
1
e K
2
), resultante
43
da filtração, foi neutralizado com ácido acético glacial, sob banho de gelo. No processo de
redução de volume no evaporador rotativo, foi necessária a adição de um tensoativo (octanol)
para evitar o refluxo causado pela intensa formação de espuma. Após a redução de volume
dos extratos foi realizada a precipitação com etanol P.A., seguido de diálise exautiva e a
liofilização dos extratos. Foram realizadas as pesagens dos materiais liofilizados e então
retiradas as alíquotas para hidrólise ácida total e para quantificação de açúcares totais,
redutores e proteínas. O resíduo (R
3
) final foi seco em estufa e então pesado (10,5g).
4.5 Purificação e Caracterização dos Polissacarídeos
4.5.1 Separação dos polissacarídeos solúveis e insolúveis, do precipitado etanólico da
extração alcalina, por congelamento e degelo.
O precipitado etanólico da extração alcalina selecionado para estudo,
denominado K
1
, foi purificado por tratamentos repetidos de gelo e degelo (BARON; GORIN,
IACOMINI, 1989). A fração K
1
foi solubilizada em água destilada, a seguir congelada
(overnight) e então descongelada a temperatura ambiente. Este procedimento gerou um
resíduo insolúvel que foi separado do sobrenadante por centrifugação (8000×g, 30 minutos,
10°C). Este processo de purificação foi repetido diversas vezes, até que o sobrenadante
aquoso não formasse mais resíduo por congelamento e degelo, e o resíduo aquoso após
tentativa de solubilização em água, não apresentasse mais polissacarídeos solúveis em água
fria, detectados pelo teste do fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS et al., 1956).
Após essas etapas, os sobrenadantes foram reunidos, bem como os
precipitados e, individualmente, liofilizados. Deste procedimento de purificação foram
obtidas as frações precipitado e sobrenadante do congelamento e degelo, denominadas,
respectivamente, K
1
P e K
1
S.
4.5.2 Cromatografia de filtração em gel em coluna de sepharose CL-4B
As frações Q
1
e K
1
S, solúveis em água, foram cromatografadas em gel de
agarose.
O gel Sepharose CL-4B é formado por agarose, numa concentração
aproximada de 4%, estabilizado por pontes de hidrogênio. Possui faixa de fracionamento de
6x10
4
– 2x10
7
para proteínas e 10
4
– 1x10
7
para polissacarídeos (BOYER, 1993).
44
Condição da coluna: A coluna de vidro utilizada (2,5 x 50 cm) apresentou
volume de 225,7 mL. O eluente utilizado foi a água destilada com fluxo de 1,2 mL/min e o
volume das frações coletadas foi de 5mL.
Procedimento: 10mg do material liofilizado foram solubilizados em um
volume de 2 mL de H
2
O (0,5%) sob agitação, durante 15 minutos. Em seguida a solução foi
centrifugada a 10000 rpm, durante 5 minutos, e o sobrenadante aplicado na coluna de gel
sepharose CL-4B. Antes de iniciar a aplicação da amostra em cada coluna foi aplicado 1mL
de uma solução de 1mg/mL de Blue Dextran, uma dextrana com elevada massa molecular,
utilizada não para determinar o volume morte, mas sim como um parâmetro par verificar o
empacotamento da coluna. Alíquotas de cada uma das frações foram analisadas para açúcares
totais pelo método do fenol-ácido sulfúrico.
Após determinar o perfil de eluição, as frações referentes aos picos distintos
foram reunidas, reduzidas à baixa pressão e liofilizadas (GUTIÉRREZ; PRIETO;
MARTINEZ, 1996).
4.5.3 Análise da composição em monossacarídeos por cromatografia líquida de alta
pressão em coluna de troca aniônica (HPAEC)
4.5.3.1 Análise dos açúcares neutros
Preparo da Amostra: uma amostra de cada etapa da purificação, contendo
50μg de açúcares totais foi liofilizada em pequenos tubos eppendorf.
Hidrólise: a hidrólise ácida foi feita pela adição de 300 μl de TFA 5M à
amostra seca, o tubo foi selado e aquecido a 100°C por 16 horas (GUTIÉRREZ; PRIETO;
MARTINEZ, 1996, CORRADI da SILVA et al., 2005). O ácido foi removido por evaporação
utilizando-se uma centrífuga a vácuo (Heto – DNA Plus), seguido por três ciclos de adição de
200 μl de H
2
0 e evaporação.
Padrões: para fins comparativos, utilizou-se uma mistura contendo 20 μg/ml
de cada um dos seguintes monossacarídeos: L-fucose, L-ramnose, D-galactose e D-glucose,
D-manose.
Análise por HPAEC (cromatografia líquida de alta pressão em cromatógrafo
de íons): os monossacarídeos foram quantificados por cromatografia líquida de troca iônica de
alta pressão, consistindo de um sistema Dionex DX 500 e um Detector de Amperometria
45
Integrada (IAD). Os cromatogramas foram registrados em um integrador modelo 4600. Os
açúcares neutros foram separados isocraticamente (NaOH 14 mM) usando-se uma coluna
analítica CarboPac PA1 (4 x 250 mm) equipada com uma guarda coluna PA1 a velocidade de
fluxo de 1,0 ml/min. As condições de eluição foram produzidas usando H
2
O deionizada
(eluente 1) e NaOH 200 mM (eluente 2), preparada a partir de solução de NaOH 50%. A
coluna foi regenerada após 25 min de corrida com 100% do eluente 2, por 10 min, seguida
pelo retorno a H
2
O deionizada, precedida por um período de 15 minutos nas mesmas
condições da corrida (para equilibrar a coluna) antes da injeção da amostra.
4.5.3.2 Análise dos açúcares aminados
O tratamento dado aos açúcares aminados diferiu dos neutros nas condições
de hidrólise ácida e da corrida cromatográfica. As modificações estão descritas a seguir.
Hidrólise: foi feita pela adição de 300 μl de TFA 2M à amostra seca. O tubo
foi selado e aquecido a 121°C por 1 hora (MANZI; VARKI, 1993).
Padrão: para fins comparativos utilizou-se uma mistura contendo 20 μg/ml
dos açúcares L-fucose, D-galactosamina, D-glucosamina, D-manose, D-galactose e D-
glucose.
Análise dos Açúcares Aminados por HPAEC: os açúcares aminados foram
separados isocraticamente (NaOH 20 mM), usando uma CarboPac PA 1 (4x250 mm)
equipada com uma guarda coluna Aminotrap na velocidade de fluxo de 1 mL/min. As
condições de eluição foram produzidas usando NaOH 200 mM e H
2
O deionizada. A coluna
foi regenerada após 25 min, com 100% de NaOH 200 mM, por 10 min, seguida do retorno da
coluna nas condições da análise.
4.5.4 Análise das ligações glicosídicas dos polissacarídeos purificados
4.5.4.1 Metilação pelo método de Ciucanu e Kerek
Amostras de 5 a 10 mg dos polissacarídeos (Q
1
A, Q
1
C, K
1
P e K
1
S
A
) foram,
individualmente, solubilizadas em 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e, em seguida,
adicionados 40mg de hidróxido de sódio anidro (micropérolas), permanecendo em agitação
46
por 15 minutos. Após esse tempo, acrescentou-se 0,2 mL de iodeto de metila seguido de
agitação por mais 30 minutos (CIUCANU; KEREK, 1984).
A reação foi interrompida pela adição de 3 mL de água destilada gelada e o
material metilado foi extraído com clorofórmio, ocorrendo a formação de duas fases, aquosa e
clorofórmica. A fase aquosa foi desprezada e a porção clorofórmica, contendo o
polissacarídeo metilado, foi lavada 3 vezes com água destilada gelada. A água residual da fase
clorofórmica foi retirada pela adição de sulfato de sódio anidro, filtrada em algodão e o
material metilado foi levada à secura em evaporador rotativo.
Esse procedimento de metilação foi repetido mais 4 vezes, a fim de garantir
polissacarídeos totalmente metilados.
4.5.4.2 Hidrólise e redução
Os polissacarídeos completamente metilados foram submetidos à hidrólise,
acrescentando 0,5 mL de ácido sulfúrico (H
2
SO
4
) a 50% (v/v), em banho de gelo, até total
dissolução do material, seguido da adição de 4 mL de água destilada de maneira que a
concentração final da solução ficasse próxima de 5,5 %. Esta solução foi mantida em estufa a
100°C por 18 horas (SAEMAN et al., 1954). O excesso de ácido sulfúrico foi eliminado com
carbonato de bário e o filtrado, límpido, foi deionizado por meio de resina catiônica IRA-120
Amberlit (forma H
+
). Após filtração, a solução resultante foi evaporada a um pequeno volume
e tratada com boroidreto de sódio, durante 15 horas, à temperatura ambiente (BLAKENEY et
al., 1983). Decorrido o período de redução, os íons sódio foram eliminados da preparação
pelo tratamento com a resina IRA-120 Amberlit (forma H
+
) e o ácido bórico formado foi
removido, na forma de borato de trimetila, por co-destilação com metanol.
4.5.4.3 Acetilação
A reação para formação dos acetatos a partir dos alditóis parcialmente
metilados foi efetuada pela adição de 1,2 mL de anidrido acético e 1,2 mL de piridina (1:1,
v/v) permanecendo a temperatura ambiente por 16 horas (WOLFROM; THOMPSON, 1963).
A reação foi interrompida pela adição de gelo moído, e os acetatos de alditóis foram extraídos
com clorofórmio. A piridina residual da fração clorofórmica foi extraída por sucessivas
lavagens com solução aquosa de sulfato de cobre a 5% (p/v). À fração clorofórmica, isenta de
piridina, foi adicionado sulfato de sódio anidro e em seguida submetida à filtração. Os
acetatos de alditóis parcialmente metilados foram evaporados à secura e analisados por
cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS).
47
4.5.4.4 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS)
Após derivatização do material na forma de acetatos de alditóis ou acetatos
de alditóis parcialmente O-metilados, foram realizadas análises de cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). As análises foram realizadas em cromatógrafo
gasoso VARIAN (Saturn 2000), tendo hélio como gás de arraste, acoplado em sério a um “ion
trap” com varredura de massa entre 20 e 650 m/z e energia de geração de elétrons de 70 eV
(elétron volts).
A coluna usada para as análises foi OV-225, de sílica fundida com 30 m de
comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno. As amostras foram diluídas em acetona e 1 µL
foi o volume de injeção. A temperatura inicial de corrida foi de 50°C com uma rampa de
40°C.min
-1
até 220°C, permanecendo constante até o final da análise.
4.5.5 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR)
Essa análise foi efetuada para confirmar a configuração anomérica das
ligações glicosídicas dos polissacarídeos Q
1
A, Q
1
C, K
1
P e K
1
S
A
. Os espectros foram obtidos
através de um espectrômetro BRUKER modelo Vector 22, acoplado ao transformador
Fourier. Os polissacarídeos (1,0 mg), em 250 mg de KBr, foram examinados na forma
microparticulada utilizando o acessório de ATR (reflexão total acumulada). As análises foram
conduzidas na região de comprimento de onda (λ) de 4000-400 cm
-1
, com resolução de 1 cm
-1
(MOHAČEK-GROŠEV; BOŽAC; PUPPELS, 2001; LIM et al., 2005).
4.5.6 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear
Os espectros de RMN -
13
C dos polissacarídeos em estudo, Q
1
A, Q
1
C, K
1
P e
K
1
S
A
, foram utilizados para identificar a configuração anomérica das ligações glicosídicas.
Para tal análise os espectros do material em estudo foram comparados aos espectros de
padrões, normalmente encontrados na literatura de espectroscopia de ressonância nuclear
(GORIN, 1981). Os espectros foram obtidos em aparelho Bruker DRX-400 incorporado ao
transformador Fourier. Os polissacarídeos em estudo (15 a 25 mg) foram examinados em
solução DMSO deuterado. As soluções (1mL) contidas em cilindros coaxiais foram
introduzidas em tubos de 100 x 10 mm d.i. e mantidas a 30 °C para serem analisadas. Os
espectros foram obtidos em 400 MHz em relação ao núcleo de
1
H (90,56 MHz em relação ao
núcleo de
13
C). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm, relativos à
ressonância do Me
4
Si (δ=0) determinada em experimento separado.
48
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Obtenção da Biomassa Celular
A parede celular determina a forma da célula fúngica e é essencial para a
sua integridade (KOLLÁR et al., 1995). Caracteriza-se como um sistema dinâmico cuja
função é proteger o microrganismo das adversidades do ambiente e, portanto, a sua
composição e estrutura se modificam em resposta às mudanças no meio (KLIS et al., 2002). A
parede celular é formada principalmente de carboidratos, alguns livres, geralmente como
macromoléculas, e outros ligados à proteína. Os principais componentes são glucanas β-
(1→3) que podem ter ou não ramificações do tipo β-(1→6). Glucanas do tipo β-(1→6)
também são encontradas como constituintes menores das paredes celulares (KOLLÁR et al.,
1995). Essas moléculas formam complexos compactos com quitinas, proteínas e
glicoproteínas. Portanto, para determinar a estrutura química de cada um desses constituintes
é necessário extraí-los, adequadamente, por procedimentos químicos e/ou enzimáticos.
Magnelli e colaboradores (2005) obtiveram polissacarídeos da parede
celular de Saccharomyces cerevisiae utilizando enzimas, um método anteriormente
empregado para determinar a composição da parede celular do patógeno Candida albicans
(HERRERO et al., 2004), entretanto, não pôde se tornar um procedimento padrão devido às
diferenças na composição da parede celular de espécies distintas. O emprego de enzimas para
extração de polissacarídeos requer um conhecimento prévio da composição da parede celular
devido à especificidade desses catalisadores por seus substratos, bem como ao seu elevado
custo de aquisição.
Não há na literatura nenhum registro sobre a composição da biomassa do
fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina que tem sido, na última década, alvo de intensa
investigação como produtor de lacases (DEKKER; LING; BARBOSA, 2000;
VASCONCELOS et al., 2000; VASCONCELOS et al., 2001; DEKKER; BARBOSA, 2001)
e de um exopolissacarídeo, denominado botriosferana (BARBOSA et al., 2003; STELUTI et
al., 2004; CORRADI da SILVA et al., 2005; GIESE et al., 2005). Portanto, numa tentativa de
preencher a lacuna existente, a proposta desse trabalho foi desenvolver estudos, aplicando
métodos convencionais da química de carboidratos, cujos resultados possibilitem determinar,
pelo menos em parte, a composição da biomassa do Botryosphaeria rhodina.
As extrações foram efetuadas com o objetivo de remover as
macromoléculas de acordo com as suas características químicas de solubilidade, desde a
49
utilização de condições suaves (aquosa a frio) até condições mais severas, como alcalina a
quente.
Para obtenção da biomassa o microrganismo Botryosphaeria rhodina foi
cultivado nas condições pré-estabelecidas para a produção de exopolissacarídeos (STELUTI
et al., 2004) e a biomassa, separada por centrifugação, foi lavada com água destilada até que
nenhum resíduo de açúcar fosse detectado na água de lavagem, indicando a remoção completa
do EPS.
5.2 Extração dos Polissacarídeos
A extração aquosa a frio, com a biomassa fragmentada para possibilitar uma
maior interação com o solvente extrativo, remove parte das proteínas e ou glicoproteínas
frouxamente ligadas à parede celular; a extração aquosa a quente remove β-glucanas e parte
das galactomananas (CORRADI da SILVA; GORIN; IACOMINI, 1993) e a extração com
álcali, a quente, destrói a parede celular expondo os constituintes da mesma tais como
glicoproteínas, β glucanas e galactomananas e pode, ainda, saponificar a membrana
plasmática e expor o conteúdo do interior da célula tais como α-glucanas, que são
polissacarídeos de reserva energética dos organismos vivos. Portanto, a aplicação dos
diferentes procedimentos separa, eficientemente, os polissacarídeos em grupos.
A metodologia utilizada para a separação dos polímeros da biomassa do
Botryosphaeria rhodina (Figura 1 - página 37) foi adaptada do trabalho de extração,
purificação e caracterização dos polissacarídeos de diferentes microrganismos (PENG et al.,
2005; ZHANG et al., 2007). A condição de extração foi modificada quando o rendimento em
açúcares totais, para aquela etapa, diminuía sensivelmente (F
1
156 mg e F
3
34 mg). Todos os
extratos foram adicionados, individualmente, ao etanol numa proporção de 1:3, que teve como
objetivo solubilizar componentes de pequena massa molecular e impurezas e separá-los dos
polissacarídeos precipitados.
Os resultados da quantificação de açúcares totais pelo método do fenol-ácido
sulfúrico (DUBOIS et al., 1956) nos diferentes extratos (Tabela 1), mostraram que mais de
95% do material extraído corresponde a carboidratos; somente nas extrações aquosa a frio (F
2
e F
3
) e alcalina (K
1
) o teor de proteínas foi superior a 5%, quando quantificadas pelo método
de Bradford (1976). Os maiores rendimentos em açúcares totais foram encontrados nas
primeiras extrações aquosa a quente (Q
1
) e alcalina (K
1
). A soma das massas encontradas para
açúcares totais e proteínas compreendeu, praticamente, o peso total de cada fração extraída e
liofilizada. A ausência de açúcares redutores nas frações, por quantificação pelo método de
50
Somogyi (1952), indica que a diálise exaustiva separou, eficientemente, os polímeros das
pequenas moléculas de carboidrato que poderiam ter sido extraídas nas condições utilizadas.
Os resultados encontrados mostram que os métodos extrativos adotados
nesse trabalho foram eficientes, principalmente, para a remoção de polissacarídeos.
Procedimentos semelhantes foram utilizados para obtenção de polissacarídeos de parede
celular de liquens (CARBONERO et al., 2003), levedura (KRIŽKOVÁ et al., 2001) e fungos
(PENG et al., 2005). Alguns desses procedimentos foram precedidos por tratamentos com
solventes orgânicos que objetivavam a delipidificação bem como a obtenção de componentes
de baixo peso molecular (CARBONERO et al., 2006). Rout e colaboradores (2006) extraíram
uma fração rica em carboidratos (98%) do corpo de frutificação de Pleurotus florida por
tratamento aquoso a quente (100ºC, 6h). Esta condição quando utilizada no Botryosphaeria
rhodina também rendeu o mesmo percentual de açúcares totais (99% a 97% de Q
1
a Q
4
,
respectivamente).
Tabela 1 - Peso das frações liofilizadas, quantificação de açúcares totais e proteínas dos
diferentes extratos obtidos da biomassa de B. rhodina.
Frações
Peso
(mg)
Açúcar Total
(mg)
Proteína (mg)
Açúcar Total
(%)
Proteína (%)
F
1
162,0 156,8 4,6 97 03
F
2
83,5 77,6 5,6 93 07
F
3
37,0 34,4 2,4 93 07
Q
1
350,0 344,8 4,4 99 01
Q
2
265,0 258,4 5,6 98 02
Q
3
143,0 138,0 4,4 97 03
Q
4
125,0 120,8 4,0 97 03
K
1
1038,0 970,0 59,5 94 06
K
2
396,0 388,0 7,2 98 02
F: Extrações aquosa a frio; Q: Extrações aquosa a quente; K: Extrações alcalinas com KOH.
Antes de iniciar a purificação dos extratos é conveniente conhecer as suas
composições em monossacarídeos. Para isso a hidrólise ácida é geralmente adotada como
primeiro procedimento químico (NELSON; COX, 2002). Embora a condição de hidrólise
utilizada seja muito geral, a detecção do deoxiaçúcar fucose e do monossacarídeo manose
51
(Tabela 2) pode sugerir a possível extração a frio de glicoproteínas, desde que as N-ligadas
possuem um “core” de manose, bem como resíduos de fucose (RICE; CORRADI da SILVA,
1996); entretanto, glucosamina e galactosamina, também comuns em glicoproteínas, não
puderam ser detectados nas condições de hidrólise para açúcares aminados, utilizadas neste
trabalho.
Leung e colaboradores (2006) relataram que as quitinas, formadas por N-
acetilglucosamina, fazem parte de fibras insolúveis encontradas na parede celular de fungos.
A ausência de açúcar aminado nos extratos da biomassa do Botryosphaeria rhodina, poderia
estar associada a um material insolúvel, separado por centrifugação, presente em todos os
extratos aquosos a quente após serem mantidos em temperatura de geladeira, durante a noite.
Embora este precipitado não tenha sido investigado, indicou a necessidade de mudanças no
protocolo de purificação dos polissacarídeos extraídos com KOH a 2%, sugerindo a adição de
um procedimento de gelo-degelo para separação de moléculas insolúveis das solúveis a frio.
A composição percentual dos açúcares (Tabela 2) fucose (4 a 1%), manose
(19 a 2%) e galactose (72 a 19%) decresceu em condições mais severas de extração, enquanto
a concentração de glucose foi crescente (5 a 78%). Esses resultados concordam com aqueles
da literatura que descrevem a parede celular de leveduras como uma camada mais externa
composta de polímeros de manose sobrepondo-se a uma mais interna formada,
principalmente, por polímeros de glucose e extraídos em condições mais severas (GORIN;
BARRETO-BERGTER, 1983; PENG et al., 2005).
De acordo com Kollár e colaboradores (1995) há evidências que diferentes
polissacarídeos da parede celular de leveduras encontram-se covalentemente ligados, tais
como β-(1→3)-D-glucanas e manoproteínas. Em Sacccharomyces cereviseae a presença de
ligações covalentes entre quitina e uma β glucana, extraídas com álcali, foi evidenciada nos
experimentos conduzidos por Mol e Wessels (1987) que, após tratamento com quitinase,
forneceu um polímero de glucose praticamente puro e solúvel em água. No extrato alcalino da
parede celular do Schizosaccharomyces pombe foram encontradas três diferentes D-glucanas:
α-(1→3), β-(1→3) e β-(1→6) e uma α-galactomanana. Esses resultados evidenciam que as
etapas de purificação são necessárias para a separação confiável de diferentes polímeros, bem
como para obtenção de moléculas com pequeno grau de polidispersividade.
52
Tabela 2 - Composição percentual dos açúcares neutros obtidos por hidrólise ácida dos
extratos da biomassa do fitopatógeno Botryosphaeria rhodina por HPAEC/PAD.
Frações Fucose (%) Galactose (%) Glucose (%) Manose (%)
F
1
04 72 05 19
F
2
02 54 26 18
F
3
03 60 19 18
Q
1
03 57 27 13
Q
2
02 28 61 09
Q
3
01 23 68 08
Q
4
01 18 74 07
K
1
01 19 78 02
K
2
01 19 78 02
Condições de hidrólise: TFA 5 M, 16 h, 100 ºC ; condições de análise: isocrática (NaOH 14mM, 25
minutos); Coluna: CarboPac PA1.
Conhecendo-se a composição monossacarídica dos diferentes extratos da
biomassa do Botryosphaeria rhodina a etapa subseqüente foi verificar o grau de pureza de
cada um, antes de dar início aos estudos de caracterização química.
Considerando-se os três diferentes tipos de extração, bem como a repetição
desses procedimentos, um número relativamente grande de extratos foi obtido (9 extratos), de
modo que foram selecionados para este trabalho apenas as primeiras extrações aquosa a
quente (Q
1
) e alcalina a quente (K
1
), por serem quantitativamente majoritários e com grande
diferença percentual entre seus constituintes monossacarídicos.
5.3 Purificação dos extratos contendo polissacarídeos
Extratos contendo mistura de polissacarídeos podem ser purificados por
combinação de técnicas tais como precipitação etanólica, precipitações fracionadas, gelo-
degelo, cromatografias de troca-iônica, filtração em gel e afinidade, entre outras.
Procedimentos químicos para separação de mananas e/ou galactomananas
das glucanas são alcançados pela formação de complexos cúpricos insolúveis (solução de
Fehling) com polímeros contendo manose; separação de polissacarídeos acidícos dos neutros
tem sido realizada pela precipitação dos primeiros com sais de amônio quaternário. Essas
técnicas separam com bastante eficiência os diferentes grupos de moléculas, entretanto,
53
necessitam de várias etapas adicionais para desfazer os complexos, neutralizar as soluções,
deionizar o material pelo uso de resinas além de diálises exaustivas. Essas inúmeras etapas
levam a rendimentos muito baixos, ainda que cuidados sejam tomados.
As separações por métodos cromatográficos como filtração em gel, troca
iônica e afinidade, envolvem um número menor de etapas, porém, como desvantagem, a
quantidade inicial de material a ser purificado não pode exceder a capacidade de
carregamento da fase estacionária, ainda que a separação proceda em condições semi-
preparativas. O perfil da corrida cromatográfica retrata a pureza do polissacarídeo e, a
simetria no pico de eluição pode ser um sinal do grau de homogeneidade do material
(DANISHEFSKY; WHISTLER; BETTELHEIM, 1970; BOYER, 1993).
A cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL-4B foi selecionada
como primeiro procedimento de purificação, sendo a cromatografia de troca-iônica preferida
devido ao baixo percentual de proteína e/ou glicoproteína (Tabela 1), principalmente no
extrato Q
1
, indicando a ausência de moléculas carregadas.
5.3.1 Extrato Q
1
Na cromatografia de filtração em gel a ordem de eluição é diretamente
proporcional ao tamanho das moléculas (BOYER, 1993). Portanto, de acordo com as
condições da análise cromatográfica de Q
1
(Figura 2) eluíram 04 picos em ordem decrescente
de massas moleculares denominados de Q
1A
, Q
1B
, Q
1C
e Q
1D
, após o Blue Dextran, indicando
que o gel utilizado possui tamanho de poros para uma separação confiável e eficiente. A
simetria dos 1º e 3º picos (Q
1A
e Q
1C
) sugere que estes componentes possam estar
homogêneos e, segundo Boyer (1993), a homogeneidade é um forte indicativo de um material
puro.
A caracterização química dos polímeros é um processo laborioso desde que
a estrutura dos açúcares de ocorrência natural é muito diversificada e por isso é difícil definir
um protocolo único para análise, principalmente para polímeros complexos e heteropolímeros
que possuem blocos construtores com disposições variadas. Portanto, a estrutura química é
determinada após um conjunto de técnicas que, juntas, fornecem a composição
monossacarídica, configuração e posição das ligações glicosídicas, seqüência dos
monossacarídeos na molécula, etc.
54
0 50 100 150 200 250 300
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
1D
1C
1B
1A
Q
Q
Q
Q
Blue Dextran
Amostra Q1
Volume Coletado (mL)
ABS 625 nm
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
ABS 490 nm
Figura 2 - Cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL -4B da primeira extração aquosa a
quente (Q
1
) da biomassa do B. rhodina. Total de material aplicado: 10 mg; fluxo: 1,2mL/min.; eluente:
água; fração: 5 mL; volume da coluna: 226 mL.
O primeiro método para determinar a estrutura de um polissacarídeo é a
análise da composição monossacarídica. Esta técnica envolve a quebra de todas as ligações
glicosídicas, fracionamento dos monossacarídeos resultantes e detecção e quantificação de
cada açúcar (AGUILAR-USCANGA; FRANÇOIS, 2003; PÉREZ; RIBAS, 2004). Entre os
vários sistemas utilizados para esse fim, a cromatografia líquida de troca iônica em alta
pressão, com detecção por amperometria integrada (HPAEC-PAD), foi desenvolvida para
substituir os métodos tradicionais, desde que ela não requer a derivatização dos
monossacarídeos presentes no hidrolisado. Os resultados de hidrólise ácida e análise por
HPAEC/PAD mostraram que os monossacarídeos constituintes de cada pico são os mesmos
da fração original, porém, em diferentes proporções (Tabela 3).
O pico Q
1A
que apresenta o maior tamanho molecular, de acordo com a
ordem de eluição na cromatografia de filtração em gel, correspondeu à única sub-fração de Q
1
contendo glucose como componente majoritário de seu polímero, as demais sub-frações Q
1B,
Q
1C
e Q
1D
apresentaram principalmente galactose, além de glucose e manose (Figura 3).
55
Tabela 3 - Composição percentual em monossacarídeos após hidrólise ácida da primeira
extração a quente (Q
1
) e suas sub-frações, obtidas por cromatografia de filtração em gel de
Sepharose CL-4B.
Frações
Fucose (%)
Galactose (%) Glucose (%) Manose (%)
Q
1
03
56 25 16
Q
1A
nd 15 74 11
Q
1B
nd 66 14 20
Q
1C
01 83 04 12
Q
1D
01 67 24 08
Condições de hidrólise: TFA 5M, 16 h, 100 ºC; condições da análise cromatográfica: NaOH 14mM,
25 minutos; coluna: CarboPac PA1.
nd: não detectado.
Para dar continuidade aos experimentos que auxiliam na caracterização das
moléculas os métodos físico-químicos são os primeiros e dentre eles estão as análises
espectroscópicas, em parte, porque, geralmente, não são degradativas e, portanto, o material
utilizado pode ser reaproveitado em outros experimentos.
A espectroscopia de infravermelho, uma espectroscopia vibracional,
detecta as transições entre os níveis de energia resultantes das vibrações das ligações
interatômicas; as freqüências vibracionais são específicas para cada grupo funcional da
molécula e são sensíveis ao ambiente molecular, conformação e características das cadeias
tornando-a um bom método para análises de biopolímeros (CAMPBELL; WHITE, 1989).
Embora o espectro de infravermelho seja característico da molécula como um todo, certos
grupos de átomos dão origem a bandas que ocorrem mais ou menos na mesma freqüência,
independentemente da estrutura da molécula. A presença das bandas características de grupos
permite a obtenção de informações estruturais úteis, através do exame do espectro e de
consulta a tabelas. Esta técnica tem como vantagens a facilidade de execução, utilização de
pequena quantidade de amostra, entre outras (BOULET; WILLIANS; DOCO, 2007).
Os espectros de infravermelho de carboidratos são complexos e usualmente
restringem-se à identificação da configuração das ligações glicosídicas (α e/ou β), a presença
de ácido urônico, através do sinal característico da carboxila e, até mesmo, a presença de
proteína. O espectro de FTIR da sub-fração Q
1A
(Figura 4) apresentou
sinais de absorção em
1558 cm
-1
e 920 cm
-1
correspondendo a polímeros de glucose e em 890 cm
-1
ao anômero β de
glucopiranose. De acordo com Peng e colaboradores (2003) esses sinais de absorção são
característicos de β-D-glucanas.
56
Um sinal de menor intensidade, em 827 cm
-1
, foi atribuído a um anômero
α, que poderia estar relacionado a uma contaminação pela sub-fração eluída como Q
1B,
desde
que ela contém 20% de manose e α-mananas são constituintes da parede celular de leveduras
e fungos (KRIŽKOVÁ et al., 2001).
Figura 3 - Análise dos hidrolisados por HPAEC/PAD das sub-frações provenientes da cromatografia
de filtração em gel da primeira extração aquosa a quente (Q
1
). Condições da corrida: isocrática (NaOH
14mM, 25 minutos). Coluna: CarboPac PA1. Condições de hidrólise: TFA 5M, 16 horas, 100
o
C.
Quantidade de material: 50 µg. Padrões (Pd): 1- fucose, 2-rhamnose, 3- galactose, 4-glucose e 5-
manose.
57
Figura 4 - Espectro de FT-IR das sub-frações Q
1A
e
Q
1C
provenientes da primeira extração aquosa a
quente (Q
1
) do ascomiceto B. rhodina, após purificação por cromatografia de filtração em gel de
Sepharose CL-4B
.
O espectro de ressonância magnética nuclear de carbono treze (RMN –
13
C) da fração Q
1A
(Figura 5) apresentou sinais de deslocamentos químicos consistentes com
aqueles registrados na literatura (SUGAWARA et al., 2004; GONZAGA et al., 2005) para
glucanas β-(1→6). A ausência de sinal na região de δ 60.0 ppm indica que todos os carbonos
primários (C-6) estão envolvidos na ligação glicosídica, neste caso representados pelo sinal
intenso em δ 69,01 ppm. Um único sinal na região de carbono anomérico caracteriza a
molécula como um polímero linear e o δ em 102,96 ppm indica que as unidades
glucopiranosídicas estão em configuração β. Os demais deslocamentos químicos em 75,89,
75,06, 73,22 e 69,93 ppm foram atribuídos aos carbonos C-3, C-5, C-2 e C-4,
respectivamente. Sugawara e colaboradores (2004) isolaram da parede celular do
Schizosaccharomyces pombe um polissacarídeo que foi caracterizado por ressonância
magnética nuclear como uma β-(1→6)-D-glucana, levemente substituída em C-3 por resíduos
glucopiranosídicos. Segundo os mesmos autores tal polímero já havia sido identificado na
parede celular de Saccharomyces cerevisiae, porém com maior grau de substituição em C-3.
58
A ausência de sinal na região entre δ 84,0 e 80,0 ppm indica que β-(1→6)-D-glucana
encontrada em Q
1A
não é substituída em C-3, assim como a glucana isolada do cogumelo
Armillariella tabescents (KIHO, et al., 1992). Gonzaga e colaboradores (2005) isolaram e
caracterizam alguns polissacarídeos da biomassa do basidiomiceto Agaricus blazei Murrill,
entre eles uma β-(1→6)-D-glucana, não substituída, foi extraída a 10°C e a 100°C e separada
dos demais polímeros por precipitação etanólica fracionada.
A metilação da sub-fração Q
1A
, seguida da análise por cromatografia em
fase gasosa e espectrometria de massa de seus respectivos acetatos de alditóis parcialmente
metilados mostrou apenas um derivado. A análise dos fragmentos primários e secundários
(Tabela 4) desse componente o caracterizou como 1,5,6-tri-O-acetil-2,3,4-tri-O-metil-D-
glucitol (SASSAKI et al., 2005).
Os espectros de FTIR das sub-frações Q
1B
, Q
1C
e Q
1D
foram muito
semelhantes (espectros das sub-frações Q
1B
e Q
1D
não foram mostrados). Os resultados da
hidrólise ácida (Tabela 3 e Figura 3) e da ressonância magnética nuclear de carbono 13
mostraram que as três frações continham um polissacarídeo comum, entretanto a fração Q
1C
mostrou-se mais pura que as demais e, portanto foi selecionada para ser estruturalmente
investigada.
O espectro de FT-IR da sub-fração Q
1C
apresentou um sinal intenso de
absorção em 890 cm
-1
(Figura 4) correspondente a um polímero com ligações do tipo β
(PENG et al., 2003) e a ausência de sinais em 1558 e 920 cm
-1
indica que o principal
constituinte dessa fração não é uma glucana. A metilação da sub-fração Q
1C
, seguida da
análise por cromatografia em fase gasosa e espectrometria de massa de seus respectivos
acetatos de alditóis parcialmente metilados, mostrou um cromatograma bastante complexo
embora dois derivados principais foram identificados como resíduos galatocfuranosídicos 5-
O- e 6-O-substituídas (Tabela 4).
A presença desses resíduos foi confirmada na análise de ressonância
magnética nuclear de carbono treze em δ 107,90 e 107,11 ppm (Figura 5) correspondendo,
respectivamente, ao C-1 das unidades 5-O-substituídas e 6-O-substituídas de β
galactofuranose (PRIETO et al., 1997; CORDEIRO et al., 2005). Essas atribuições
correspondem aos deslocamentos químicos encontrados em polissacarídeos constituídos por
resíduos de galactose furanosídicas isoladas de bactérias (NAGAOKA et al., 1996), de liquens
(CARBONERO et al., 2005b; CORDEIRO et al., 2005) e de fungos (LEAL et al., 1995;
AHRAZEM et al., 1997, PRIETO et al., 1997; SASSAKI et al., 2002; AHRAZEM et al.,
2007). Os sinais entre δ 83,42 ppm a 81,36 ppm, muitos deles sobrepostos correspondem aos
59
C-4 e C-2 de todas as unidades galactofuranosídicas (AHRAZEM et al., 2007). Os sinais em δ
77,01 ppm e δ 74,69 ppm foram atribuídos aos C-5 substituído e livre (SASSAKI et al., 2002)
e δ 70,90 e 63,01 ppm aos C-6 substituído e livre, respectivamente (CORDEIRO et al., 2005).
A atribuição de sinais no espectro de ressonância magnética nuclear é um
processo efetuado em comparação à composição monossacarídica do polissacarídeo
hidrolisado. É importante realçar que as condições de hidrólise ácida realizada nesse trabalho
provavelmente tenham degradado unidades glactofuranosídicas, que são mais ácido-lábeis
que as piranosídicas e, como conseqüência, os percentuais de manose e glucose, nessa fração,
foram superestimados. Essa proposição pode ser confirmada desde que os sinais de carbono
anomérico no RMN-
13
C corresponderam apenas às unidades galactofuranosídicas. Não há
sinal na região de carbono anomérico que possa ser atribuído à estrutura piranosídica (Figura
5), entretanto, de acordo com vários registros há um grande número de polissacarídeos
contendo cadeias galactofuranosídicas com diferentes tipos de ligação “atachadas” a um
núcleo constituído por resíduos α-D-manopiranosídicos-(1→6) ligados.
Leal e colaboradores (1995) isolaram da parede celular do fungo
Neosartorya uma β-galactofurana com uma cadeia principal constituída de unidades 1→5 e
1→6 substituídas na proporção de 2:1 também encontrada em fungos dos gêneros
Penicillium, Aspergillus e Eupenicillium. Sassaki e colaboradores (2002) isolaram um
polímero do fitopatógeno Guignardia citricarpa constituído, principalmente, por unidades β-
D-galactofuranosídicas 6-O-substituídas e menor proporção de unidades 5,6-di-O-substituídas
e terminais não redutores de galf.
Galactofurananas com diferentes tipos de substituição têm sido encontradas
em extratos alcalinos da parede celular de fungos (AHRAZEM et al., 2001; AHRAZEM et
al., 2006; AHRAZEM et al., 2007) cuja presença é associada, entre outras funções, ao
fenômeno de reconhecimento célula-célula e célula-hospedeiro.
A complexidade da fração Q
1C
, visualizada no RMN-
13
C, demanda maior
tempo de investigação para que todos os sinais de ressonância possam ser adequadamente
atribuídos, embora seja possível deduzir que se trata de um polímero com uma cadeia
principal formada, principalmente, por resíduos β-galactofuranosídicas 5-O-substituídos e
uma menor proporção de resíduos 6-O-substituídos. As sub-frações, Q
1B
e Q
1D
do extrato
aquoso e K
1
S
B
e K
1
S
C
, do extrato alcalino apresentaram espectros de ressonância semelhantes
(dados não mostrados), mas para serem caracterizadas, necessitarão de várias etapas
adicionais de purificação, fragmentação e caracterização dos fragmentos, incompatível com o
tempo de realização deste trabalho.
60
Figura 5 - Espectros de RMN -
13
C
das frações provenientes do extrato a quente do B. rhodina (Q
1A
e
Q
1C
) após purificação por cromatografia de filtração em gel.
61
Tabela 4 - Acetatos de alditóis parcialmente metilados formados na análise de metilação dos
polissacarídeos encontrados nas subfrações Q
1A
,Q
1C
, K
1
P e K
1
S
A.
Sub
frações
Acetatos de alditóis
parcialmente metilados
T
R
a
Principais Fragmentos
Composição
relativa (%)
Tipo de
ligações
Q
1A
2,3,4 - Me
3
-glcp 2,20
87, 99, 101, 117,
129, 161, 189, 233
100
→6)-glcp-(1→
2,3,6-Me
3
-galf 2,22
87, 101, 113, 117,
131, 162, 173, 233
70
→5)-galf-(1→
Q
1C
2,3,5-Me
3
-galf 2,76
102, 117, 118, 130,
162, 173, 233
30
→6)-galf-(1→
2,3,4,6-Me
4
-glcp 1,00
87, 101, 117, 129,
145,161, 205
20
glcp-(1→
K
1
P
2,4,6-Me
3
-glcp 1,82 87, 101, 117, 129, 161 62
→3)-glcp-(1→
2,4-Me
2
-glcp 4,20
87, 117, 129, 139,
159, 189, 201, 217
18
→3,6)-glcp-(1→
2,3,4,6-Me
4
-glcp 1,00
87, 101, 117, 129,
145, 161, 205
08
glcp-(1→
K
1
S
A
2,3,6-Me
3
-glcp 2,32
87, 99, 101, 113,
117, 233
87
→4)-glcp-(1→
2,3-Me
2
-glcp 4,50 101, 117, 261 05
→4,6)-glcp-(1→
a
Os tempos de retenção dos derivados acetatos de alditóis parcialmente metilados foram
comparados ao 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glucitol. Coluna OV 225.
5.3.1 Extrato K
1
A primeira extração alcalina denominada K
1
, como dito anteriormente, foi
selecionada para este trabalho porque apresentou melhor rendimento e composição percentual
de açúcares diferente daquela encontrada na extração aquosa. O extrato alcalino (K
1
), após
neutralização e diálise exaustiva, foi concentrado a pequeno volume e precipitado em etanol
absoluto numa proporção de 1:3. O precipitado etanólico, contendo os polissacarídeos,
quando solubilizados em água formaram uma solução de coloração marrom escura, levemente
turva, sugerindo a necessidade da separação desse material insolúvel, da parte solúvel.
O procedimento adotado para a separação foi submeter o material a
tratamentos de gelo e degelo, até que nenhum precipitado fosse formado após o degelo. Esta
técnica tem sido utilizada com sucesso para separação de polissacarídeos extraídos com álcali
a quente, mas insolúveis em água. A aplicação deste protocolo tem separado eficientemente
β-glucanas insolúveis de α-glucanas, galactoglucomananas e/ou galactomananas solúveis
(CORRADI da SILVAet al., 1993; CARBONERO et al., 2002). A utilização desse tratamento
rendeu uma sub-fração de K
1
solúvel (K
1
S) contendo 75% dos açúcares da fração inicial e um
precipitado, denominado K
1
P.
O resultado da análise monossacarídica da fração K
1
P mostrou
principalmente glucose (Tabela 5). Os sinais no espectro de FTIR (Figura 8) em 1558 e 920
cm
-1
indicam a presença de uma glucana e aquele em 890 cm
-1
especifica uma β-glucana. O
62
espectro de RMN-
13
C (Figura 9) foi semelhante àquele encontrado na literatura para glucanas
β-(1→3) com ramificação em C-6. A possibilidade de unidades em configuração α foi
descartada pela ausência de sinais na região de 100 ppm. O sinal em 102,98 ppm, o mais
intenso nessa região, foi atribuído ao C-1 das unidades glucopiranosídicas 3-O-substituídas.
Considerando que a regra geral da glicosilação do carbono anomérico do tipo β desloca o
sinal de ressonância para campo mais alto (SCHMID et al., 2001; BARBOSA et al., 2003),
pode-se inferir que o sinal δ 102,54 ppm pode ser atribuído ao C-1 das unidades 3-O-
substituídas com ramificação em C-6. Os sinais de carbono 3 foram detectados em δ 84,80 e δ
84,58 ppm; o mais intenso em δ 84,80 ppm foi atribuído aos C-3 da cadeia principal e δ 84,58
ppm às unidades 3,6 di-O-substituídas. Os sinais em δ 69,97 e 60,99 ppm foram atribuídos
aos C-6 substituído e livre, respectivamente. Os demais deslocamentos químicos em δ
75,93/75,06; 73,20 e 68,98/68,32 foram assinalados para os C-5, C-2 e C-4 dos resíduos
glucopiranosídicos 3-O e/ou 3,6-di-O-substituídos. Toda a atribuição foi efetuada por
comparação aos espectros de polissacarídeos semelhantes, encontrados na literatura (GORIN,
1981; GORIN; BARRETO-BERGTER, 1983; ZHANG et al., 1995; GUTIÉRREZ; PRIETO;
MARTINEZ, 1996; CARBONERO et al., 2006; SMIDERLE et al., 2006).
A metilação da fração K
1
P, seguida da análise por cromatografia em fase
gasosa e espectrometria de massa de seus respectivos acetatos de alditóis, parcialmente
metilados, mostrou três derivados principais, identificados como 1,5-di-O-acetil-2,3,4,6 tetra-
O-metil-D-glucitol; 1,3,5-tri-O-acetil-2,4,6 tri-O-metil-D-glucitol e 1,3,5,6-tetra-O-acetil-2,4
di-O-metil-D-glucitol (Tabela 4). Esses resultados validam a análise de ressonância
mostrando que o polissacarídeo em estudo é uma glucana com cadeia principal constituída por
unidades glucopiranosídicas (1→3) com ramificação em C-6. O ascomiceto Botryosphaeria
rhodina produz um exopolissacarídeo, denominado botriosferana, constituído por uma cadeia
principal de resíduos glucosídicos β-(1→3) e substituídos em O-6 por unidades glucosídicas
e/ou gentiobiosídicas.(BARBOSA et al., 2003).
Várias glucanas β-(1→3) e β-(1→3; 1→6) têm sido isoladas de diferentes
fungos e estudadas por suas atuações como imunomoduladores e antitumorígenos (ZHANG et
al., 2005; CHAKRABORTY et al., 2006; CARBONERO et al., 2006; DONG; JIA; FANG,
2006). Apesar desses efeitos positivos, tem sido constatado que a administração de soluções
contendo β-glucanas pode provocar hepatoesplenomegalia, microembolismo e aumento das
toxinas endógenas devido, em parte, à solubilidade limitada dessas moléculas. Portanto, para
amenizar essa resposta indesejada reações de derivatização dessas β-glucanas, como
sulfatação e carboxilação, têm sido realizadas com o propósito principal de aumentar a
63
solubilidade das soluções polissacarídicas. β-glucanas do tipo (1→3; 1→6) podem ser
solúveis ou insolúveis em sistemas aquosos e essa característica físico-química está
relacionada com a proporção dessas ligações na molécula (LEE et al., 2001).
A fração solúvel do tratamento por gelo/degelo, denominada K
1
S, foi
hidrolisada e os resultados, mostrados na Tabela 5, indicaram a necessidade de purificação
adicional. A cromatografia de filtração em gel foi selecionada como primeiro procedimento
para purificação dessa fração solúvel e a análise foi realizada nas mesmas condições utilizadas
para a purificação da fração Q
1.
Tabela 5 - Composição percentual dos açúcares neutros obtidos por hidrólise ácida das
frações K
1
P
(insolúvel), K
1
S (solúvel) e suas sub-frações analisados por HPAEC/PAD.
Sub-frações Galactose (%) Glucose (%) Manose (%)
K
1
P
07 93 nd
K
1
S
30 65 05
K
1
S
A
08 92 nd
K
1
S
B
50 42 08
K
1
S
C
44 50 06
Condições de hidrólise: TFA 5M, 16 h, 100 ºC; condições da análise cromatográfica: NaOH 14mM,
25 minutos; coluna: CarboPac PA1.
Os resultados da análise cromatográfica de K
1
S foram três picos, eluídos em
ordem decrescente de massa molecular de acordo com o princípio da separação por filtração
em gel (BOYER, 1993), denominadas de K
1
S
A
, K
1
S
B
e
K
1
S
C
(Figura 8).
A sub-fração denominada K
1
S
A
, após hidrólise ácida apresentou
principalmente glucose (92%), com pequeno percentual de galactose (9%) e ausência de
manose. Considerando que as demais sub-frações K
1
S
B
e K
1
S
C
têm como principal
constituinte monossacarídico a galactose, é provável que esse açúcar seja um contaminante da
sub-fração K
1
S
A
(Figura 7).
64
0 50 100 150 200 250
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
1 B
K S
1 C
K S
1 A
K S
Blue Dextran
Amostra K
1
S
Volume Coletado (mL)
ABS 625 nm
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
ABS 490 nm
Figura 6 - Cromatografia de filtração em gel Sepharose CL -4B do sobrenadante da primeira extração
alcalina (K
1
S) após o processo de gelo e degelo da biomassa do B. rhodina. Total de material aplicado:
10 mg; fluxo: 1,2mL/min.; eluente: água; fração: 5 mL; volume da coluna: 225,7 mL.
Figura 7 - Análise dos hidrolisados por HPAEC/PAD das sub-frações provenientes da cromatografia
de filtração em gel da primeira extração alcalina a quente (K
1
). Condições da corrida: isocrática
(NaOH 14mM, 25 minutos). Coluna: CarboPac PA1. Condições de hidrólise: TFA 5M, 16 horas,
100
o
C. Quantidade de material: 50 µg. Padrões (Pd): 1- fucose, 2-rhamnose, 3- galactose, 4-glucose e
5-manose.
65
Figura 8 - Espectro de FT-IR das frações da extração alcalina do ascomiceto B. rhodina após o
processo de gelo e degelo e purificação por cromatografia de filtração em gel (CL-4B)
A cromatografia gasosa dos acetatos de alditóis metilados da fração K
1
S
A
mostrou três picos que foram identificados como 2,3,4,6-tetra-O-metil, 2,3,6-tri-O-metil e 2,3-
di-O-metil derivados, de acordo com seus fragmentos de massa (Tabela 4). Esses resultados
indicam um polissacarídeo com uma cadeia principal 1→4 com ramificações 1→6. O
espectro de infravermelho (Figura 8) mostrou picos de absorção em 1558 e 920 cm
-1
característicos de glucanas e um sinal intenso em 850,0 cm
-1
, característico de α-D-glucanas
(WANG et al., 2007). O espectro de ressonância magnética nuclear de carbono treze (Figura
9) mostrou seis sinais mais intensos relativos aos carbonos das unidades glucosídicas α-(1→4)
em δ 100,39 ppm, atribuído ao carbono anomérico, e δ 78,26 ppm ao C-4 envolvido na
ligação glicosídica; os demais valores de deslocamentos químicos 73,95, 72,32, 72,07 e 61,41
ppm foram assinalados para os C-3, C-2, C-5 e C-6, respectivamente (GONZAGA et al.,
2005; CUI et al., 2007). Sinais menos intensos em δ99,26 e δ 70,33 ppm foram assinalados
para os C-1 das unidades 4,6-di-O-substituídas e aos C-6 substituídos, respectivamente. Esses
sinais menos intensos concordam com os dados de metilação, mostrando que o polímero é
uma α-(1→4)-D-glucana com pequeno grau de ramificação em C-6. Um polissacarídeo
66
semelhante foi isolado do micélio de um fungo comestível, Cordyceps sinensis que após
estudos de metilação, degradação de Smith, acetólise e RMN de carbono e prótons teve sua
estrutura elucidada como uma α-D-glucana constituída por uma cadeia principal (1→4), com
poucos resíduos 6-O-substituídos, por unidades glucosídicas (YALIN; CUIRONG;
YUANJIANG, 2006).
Figura 9 - Espectros de RMN de
13
C
das frações do extrato alcalino do micélio da B. rhodina
após o processo de purificação de gelo-degelo e filtração por cromatografia de exclusão
molecular (K
1
S
A
e
K
1
P).
67
Vários polissacarídeos e/ou complexos polissacarídeo-proteína têm sido
isolados de fungos e estão sendo usados como fontes de agentes terapêuticos. Beta glucanas
do tipo (1→3) e (1→6) e α-glucanas com ligações (1→4) são usadas como agentes
antitumorais e imunomoduladores (YALIN; CUIRONG; YUANJIANG, 2006; PANG et al.,
2007).
Os resultados de hidrólise ácida e RMN-
13
C das sub-frações K
1
S
B e
K
1
S
C
indicaram a necessidade de purificação adicional, antes da caracterização química. Portanto,
essas sub-frações, assim como algumas obtidas no extrato aquoso a quente, serão
posteriormente investigadas.
É importante salientar que todas as moléculas isoladas e caracterizadas neste
trabalho, com exceção de K
1
P, foram completamente solúveis em água. Essa propriedade
confere à solução desses polissacarídeos facilidade na aplicação dos testes de atividade
biológica (LEE et al., 2001).
Considerando que o Botryosphaeria rhodina é um fitopatógeno, o
conhecimento da composição da biomassa micelial poderá fornecer dados auxiliares para o
desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e a grande quantidade de biomassa,
proveniente da produção do botriosferana (EPS), poderá ser aproveitada como fonte de
diferentes polímeros que poderão ser, futuramente, matéria prima para as indústrias de
alimento, farmacêutica e cosmética.
68
CONCLUSÕES
Os métodos de extração, purificação e caracterização dos polissacarídeos da biomassa do
fungo Botryosphaeria rhodina requereram uma laboriosa e cuidadosa execução dos
protocolos estabelecidos.
1. Procedimentos extrativos distintos possibilitaram extrair os polissacarídeos de acordo com
a sua solubilidade e pela localização na biomassa micelial.
2. O extrato aquoso a quente (Q
1
) e o extrato alcalino (K
1
) foram selecionadas por serem
quantitativamente majoritárias e com grande diferença percentual entre seus constituintes
monossacarídicos.
3. A sub-fração Q
1A
por hidrólise ácida rendeu principalmente glucose. Os resultados da
espectroscopia de infravermelho e ressonância magnética nuclear de carbono treze mostraram
tratar-se de uma β-glucana. As atribuições dos sinais de deslocamentos químicos no RMN-
13
C
bem como os resultados das análises de metilação permitiram concluir que a subfração Q
1A
é
uma β-(1→6)-D-glucana.
4. A sub-fração Q
1C
,
constituída principalmente de galactose, por análise de seus espectros de
FTIR e RMN-
13
C e de seus derivados metilados mostrou ser uma β-galactofuranana 5-O e 6-
O-substituída.
5. A sub-fração K
1
P, constituída principalmente de glucose, teve sua estrutura determinada
como sendo uma β-(1→3)-D-glucana, com ramificações em C-6.
6. A subfração K
1
S
A
, constituída principalmente de glucose, foi caracterizada por análises de
FTIR, RMN-
13
C e metilação como uma α-(1→4)-D-glucana, com pequeno grau de
ramificação em C-6.
7. As demais sub-frações Q
1B
, Q
1D,
K
1
S
B
e K
1SC
não foram caracterizadas por necessitarem de
purificação adicional.
69
8. Com base nos resultados apresentados neste trabalho é possível concluir que a biomassa do
Botryosphaeria rhodina, considerado um resíduo na produção de EPS constitui uma excelente
fonte de diferentes polissacarídeos. As características químicas dos polissacarídeos como a
composição em açúcares, tipo de ligação, anomericidade separam em grupos que apresentam
propriedades diferenciadas permitindo o direcionamento da aplicação desses polissacarídeos
nos diversos setores industriais e medicinais.
70
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84
ANEXOS
85
ANEXO A
Artigo científico: “Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação e caracterização”
86
Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação e caracterização
Autor Principal: Maria de Lourdes Corradi da Silva
Livre-docente em Bioquímica – Química de Carboidratos
Universidade Estadual Paulista-UNESP/2003
Pós-doutorado pela Ohio State University/1992 a 1994
Supervisor: Dr. Kevin Gerald Rice
Doutorado em Bioquímica pela UFPR/1992
Química de Carboidratos
Orientador: Prof. Dr. Philip Albert James Gorin
Mestre em Bioquímica pela UFPR/1986
Química de Carboidratos
Orientador: Dr. Philip Albert James Gorin
Graduação: Farmacêutica-Bioquímica
UFRJ/1980
Endereço Profissional:
Faculdade de Ciências e Tecnologia – UNESP Caixa Postal 467
Departamento de Física, Química e Biologia.
Rua Roberto Simonsen, 305.
CEP 19061-520 Presidente Prudente, SP.
Email: [email protected]
Fone: (18) 32295355 ramal 26 e 27.
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Categoria do trabalho: revisão
Área de publicação da Semina: Agrárias
Área CNPq: 2.08.00.00-2
Sub-área CNPq: 2.08.01.00-9
Especialidade: 2.08.01.03-3
87
Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação e caracterização
Fungal cell wall polysaccharides: purification and characterization
Eliane Kaori Fukuda
1
, Ana Flora D. Vasconcelos
2
, Andreza C. Mathias
2
, Aneli de Melo
Barbosa
1
, Robert F. H. Dekker
3
, Maria de Lourdes Corradi da Silva
1,2*
1
Programa de pós-graduação em Biotecnologia, Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Centro
de Ciências Exatas, Universidade Estadual de Londrina.
2
Departamento de Física, Química e Biologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
3
Universidad de Castilla-La Mancha – IRICA, 13071 Ciudad Real, España.
88
Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação e caracterização
RESUMO
A parede celular é uma estrutura rígida, essencial para a sobrevivência dos fungos, e o conhecimento
de sua composição poderá ser útil para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Neste
contexto, os polissacarídeos que estão entre os seus principais componentes têm sido alvos de intensa
investigação científica. As informações, provenientes do conhecimento da estrutura dessas
macromoléculas, poderão ser valiosas para o entendimento dos mecanismos de síntese da parede
celular de fungos causadores de patologias, tanto em plantas quanto em animais. A determinação da
estrutura química de um endopolissacarídeo deve ser precedida por experimentos de extração e
purificação. As extrações, geralmente conduzidas em soluções aquosas neutras e/ou alcalinas,
separaram as biomoléculas em grupos, de acordo com suas solubilidades. Os extratos, contendo
mistura de polissacarídeos, podem ser purificados pela combinação de métodos químicos e
cromatográficos. Após purificação, os polissacarídeos considerados homogêneos são caracterizados
estruturalmente com as técnicas convencionais em química de carboidratos tais como hidrólise,
metilação, FT-IR e RMN-
13
C e
1
H. Esta revisão tem como proposta efetuar um levantamento das
principais investigações científicas conduzidas com o objetivo de caracterizar polissacarídeos da
parede celular fúngica.
Palavras-chave: Biomassa, Parede celular fúngica, Polissacarídeos, Caracterização química.
89
Fungal cell wall polysaccharides: purification and characterization
ABSTRACT
The cell wall is a rigid structure essential for the survival of fungi. A knowledge of its composition is
therefore useful for the development of novel anti-fungal drugs. In this context, polysaccharides as
main components of the fungal cell wall have been the subject of intense scientific study over the
years. The information gained from the knowledge of the structure of these macrobiomolecules could
therefore be valuable in elucidating the mechanisms of their biosynthesis in the cell walls of
pathogenic fungi infecting plants and animals alike. Determination of the chemical structures of these
polysaccharides (endo) is preceded by their extraction and purification. The extractions, generally lead
to neutral and/or alkaline soluble biopolymers in groups according to their solubilities. Mixtures of
polysaccharides in these extracts can then be purified by a combination of chemical and
chromatographic methods. Following purification, the polysaccharides, considered homogeneous, can
be characterized structurally using conventional techniques of carbohydrate chemistry, such as
hydrolysis, methylation analysis, and FT-IR,
13
C- and
1
H- NMR spectroscopy. This review surveys the
main scientific literature that characterizes polysaccharides constituting the fungal cell wall.
Key words: Biomass; fungal cell wall; polysaccharides; chemical characterization.
Apoio financeiro: CAPES (bolsa de mestrado), FAPESP (processo 06/61794-0; 05/53879-3)
90
Introdução
Os biopolímeros, como proteínas e polissacarídeos, representam os mais
abundantes compostos orgânicos da biosfera, exibindo importantes propriedades e diferentes
aplicações, relacionadas com suas características químicas.
Fungos, bactérias e plantas vêm sendo pesquisados como potenciais fontes dessas
macromoléculas, principalmente de polissacarídeos. A possibilidade de aplicação desses compostos na
saúde humana, assim como em outras áreas, tem levado a intensivos estudos relacionados à sua
extração e caracterização (GERN, et al., 2007).
Polissacarídeos bioativos isolados da parede celular fúngica têm sido
caracterizados como homopolímeros, heteropolímeros ou, ainda, encontram-se ligados aos resíduos de
proteínas formando complexos polissacarídeo-proteína (ZHANG et al., 2002; KIM et al., 2003).
Embora estudos sobre a composição da parede celular de vários fungos sejam
efetuados, o maior número de informações disponíveis na literatura está relacionado com a estrutura
de parede do ascomiceto Saccharomyces cerevisiae, que é composta por β-D-glucanas, quitinas e
manoproteínas (LIPKE; OVALLE, 1998; KAPTEYN; VAN DEN ENDE; KLIS, 1999; NOBEL;
VAN DEN ENDE; KLIS, 2000; NOMBELA; GIL; CHAFFIN, 2006). Alguns patógenos humanos,
como Cândida albicans e espécies do gênero Aspergillus, também vêm tendo a constituição de parede
celular investigada, que poderá ser utilizada como possível alvo de drogas antifúngicas
(GEORGOPAPADAKOU; TKACZ, 1995; SHIBATA et al., 1995; POULAIN; JOUAULT, 2004).
Estudos realizados por Falch e colaboradores (2000) mostram que glucanas β-
(1→3) ramificadas possuem efeitos estimulantes para o sistema imune. Entretanto os mecanismos
celulares pelos quais estas substâncias agem não estão muito bem definidos, sendo a principal hipótese
a existência de receptores específicos para estas glucanas nas superfícies das células (MUELLER et
al., 2000),
91
Fatores físico-químicos podem influenciar no efeito destes polissacarídeos sobre o
organismo, dentre eles o grau de ramificação, a massa molecular e a conformação apresentada pelo
material (YOUNG; JACOBS, 1998; LEUNG et al., 2006). Para compreender os mecanismos de
atuação dessas moléculas biológicas todos os parâmetros de caracterização química e conformação
devem ser estudados.
Portanto, esta revisão tem como principal objetivo apresentar dados de pesquisas
referentes à caracterização química dos polissacarídeos de parede celular fúngica, fornecendo material
inicial para investigação nessa área de conhecimento.
92
Biomassa Fúngica
Os fungos são microrganismos eucariontes heterotróficos que obtêm sua energia
pela ruptura de moléculas orgânicas, podendo ocupar diversos nichos ecológicos, atuando como
parasitas, sapróbios ou então estabelecendo relações simbióticas, por exemplo, com algas, formando
os líquens. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2000).
No ambiente terrestre, os fungos são de importância fundamental como organismos
decompositores, patógenos ou simbontes, tendo papel importante nos ciclos biogeoquímicos do
carbono, nitrogênio ou fósforo (BOSWELL; et al., 2003). Como fitopatógenos, estes organismos
possuem mecanismos de adesão ao hospedereiro, onde as moléculas de reconhecimento e união são,
na maior parte dos casos, de natureza protéica ou glicoprotéica. (XIAO et al., 1994; SUGUI; LEITE;
NICHOLSON, 1998) e, por isso, a produção de proteínas e polissacarídeos extracelulares têm sido
associadas à capacidade do microrganismo causar doenças em plantas (DOSS, 1999; GIL-AD; BAR-
NUN; MAYER, 2001; LEITE et al., 2001).
Os fungos podem ser considerados como os agentes mais importantes de
degradação da Terra, principalmente quando se estuda os ecossistemas florestais, onde esses
microrganismos são os principais decompositores de celulose e lignina. A produção de biomassa em
um ecossistema florestal é em grande parte controlado por fungos degradadores de madeira, que
determinam as taxas dos nutrientes liberados e seu retorno ao ecossistema após a morte das árvores
(ESPOSITO; AZEVEDO, 2004)
Além de sua atuação nos ecossistemas, os fungos também apresentam um grande
potencial de aplicação nas diferentes áreas industriais, como alimentos, cosméticos, medicamentos,
assim como na área ambiental, na detoxificação de compostos em ambientes contaminados. A
utilização desses microrganismos pode ser através do seu material celular (biomassa) ou então de
macromoléculas isoladas.
Há uma forte tendência em se explorar comercialmente a biomassa fúngica para
isolamento de seus componentes celulares e consequentemente de seus principais constituintes, tais
93
como enzimas (invertases, glucosidades), nucleotídeos, proteínas (manoproteínas) e principalmente
polissacarídeos (glucanas, mananas, galactanas), além de lipídeos, como fosfolipídeos e ergosterol,
pois estas substâncias apresentam propriedades específicas de interesse biotecnológico e,
conseqüentemente, de grande valor agregado (CAMERON; COOPER; NEUFELD, 1988; KOLLÁR;
STURDIK; SAJBIDOR, 1992; BELEM; LEE, 1998; BEROVIČ et al., 2003; PAVLOVA,
PANCHEV; HRISTOZOVA, 2005).
Trabalhos como os realizados por Mendes-Costa e Moraes (1999) mostraram que é
possível isolar da biomassa de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae frações de
carboidratos solúveis, e que estas moléculas podem ser utilizadas como indutoras de mecanismos de
defesa em plantas. O mesmo foi observado em experimentos com soja (HAHN; ALBERSHEIM,
1978; SHARP; VALENT; ALBERSHEIM, 1984), e sorgo (PICCININ; DI PIERO; PASCHOLATI,
2005), onde se detectou a produção de fitoalexinas, substâncias envolvidas no mecanismo de defesa
vegetal, quando as plantas foram colocadas em contato com glucanas isoladas de S. cerevisiae e de
Phytophtora megasperma.
A biomassa excedente da produção industrial de antibióticos por Penicillium
chrysogenum, além de ser aproveitada para ração para gado e ou no preparo de fertilizantes
(MUZZARELLI et al., 2000), também vem se mostrando uma fonte viável de moléculas importantes,
como os polissacarídeos do tipo glucanas (WANG et al., 2007), aplicados na área medicinal devido a
suas atividades antitumorais e imunomoduladoras.
Durante um processo fermentativo para a produção de exopolissacarídeos (EPS),
um grande percentual de biomassa também é obtido. Entretanto, as quantidades de massa micelial e
EPS não são necessários proporcionais, sendo dependentes dos diferentes fatores utilizados no cultivo,
tais como fontes de carbono e de nitrogênio, pH, temperatura, agitação, grau de aeração, entre outros.
Estes parâmetros podem interferir tanto na produção da biomassa quanto dos componentes isolados
desse substrato. Segundo alguns autores (SEVIOUR et al., 1992; WANG; McNEILL, 1995;
SELBMANN; CROGNALE; PETRUCCIOLI, 2002; BARBOSA et al., 2004) o que se espera obter no
final do procedimento, se biomassa ou EPS, determinará como essas variáveis serão aplicadas no
cultivo microbiano.
94
A influência desses parâmetros pode ser ilustrada, por exemplo, por Park e
colaboradores (2002), que trabalhando com Cordyceps militaris para a produção de exopolissacarídeos
(EPS), observaram que o aumento da taxa de aeração favorecia a produção de biomassa em relação à
de macromoléculas. Tang e Zhong (2003) mostraram que variações nos níveis de saturação de ar em
cultivos de Ganoderma lucidium influenciavam o fornecimento de oxigênio, levando a produção de
quantidades diferentes de polissacarídeos intracelulares, extracelulares e de ácido ganodérico pelo
fungo. Os pesquisadores observaram que uma menor saturação de ar (10 %) favorecia a produção de
polissacarídeo extracelular (0,7 g/L), enquanto que com um grau de saturação de ar maior (25 %)
havia um aumento de polissacarídeos intracelulares (1,6 g/L) e de ácido ganodérico (350 mg/L).
Portanto, pode-se concluir que valores significativos de biomassa podem ser
obtidos por otimização de condições de cultivo, e que isso permite um aumento nas quantidades de
componentes celulares que podem ser extraídos e terem suas moléculas básicas investigadas, para
posteriores aplicações industriais.
Parede Celular Fúngica
Nos fungos, a estrutura celular é semelhante a dos outros eucariotos, constituída
basicamente por uma membrana, um citoplasma com as organelas distribuídas aleatoriamente por todo
interior celular e um compartimento especial, o núcleo, que armazena o material genético. As células
podem ser encontradas na forma unicelular, como as leveduras, ou então formando conjuntos de hifas,
septadas ou não, denominadas de micélio, como no caso dos fungos filamentosos. Tanto as células
leveduriformes quanto o micélio estão envolvidos por uma camada protetora externa denominada de
parede celular, quimicamente diferente da parede encontrada em vegetais, ainda que possa exercer os
mesmos tipos de funções (De ROBERTIS; HIB; PONZIO, 2001; MADIGAN; MARTINKO;
PARKER, 2004; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).
A parede celular fúngica pode ser caracterizada como uma estrutura relativamente
rígida, porém dinâmica, que participa de vários processos biológicos essenciais à célula. Ela determina
95
o formato da célula, fornece suporte osmótico, proteção física, além de estar relacionada a eventos de
sinalização celular, adesão e reprodução (PÉREZ; RIBAS, 2004; NIMRICHTER et al., 2005;
MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005), sendo por isso necessária para o crescimento e
desenvolvimento dos fungos nos ambientes onde são encontrados (DURAN; NOMBELA, 2004).
O crescimento micelial é dependente do processo de translocação, onde o material
celular é direcionado para as regiões em desenvolvimento (BOSWELL et al., 2003), permitindo a
formação das estruturas celulares, como a parede, facilitando a ocupação dos ambientes pelo
microrganismo. Em condições normais de desenvolvimento, a estrutura da parede celular é baseada na
parede já existente nas células progenitoras, que são extendidas e remodeladas. Neste caso, ela serve
como um arcabouço para a incorporação de novos materiais dentro dos pontos de crescimento (KLIS;
BOORSMA; De GROOT, 2006).
A parede celular compreende cerca de 20-30% do peso seco da célula fúngica
(SMITH et al., 1999), sua composição química, estrutura e dimensão variam consideravelmente,
dependendo das condições ambientais e/ou de cultivo laboratorial e essa formação é coordenada com o
ciclo celular (KLIS; BOORSMA; De GROOT, 2006).
A composição química da parede celular é bastante complexa, constituída
principalmente por polissacarídeos, ligados ou não a proteínas ou lipídeos, polifosfatos e íons
inorgânicos formando a matriz de cimentação. Quitina, glucanas, galactomananas e proteínas são
compostos mais freqüentes, embora sua quantidade varie entre as diferentes espécies de fungos
(ADAMS, 2004).
O conhecimento da constituição química da parede, principalmente em relação à
presença de polissacarídeos, é um dado importante para o emprego biotecnológico dos fungos, pois
estas moléculas podem ser utilizadas em processos industriais, para a produção de alimentos,
medicamentos, entre outros ou, ainda, serem úteis para a classificação taxonômica desses organismos
(MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004).
Vários estudos têm sido realizados para o conhecimento da composição química da
parede celular de fungos, principalmente leveduras, como Schizosaccharomyces pombe e
Saccharomyces cerevisiae, muito utilizadas em industriais de alimentos (GALICHET et al., 2001;
96
DURAN; NOMBELA, 2004; MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005; KIM; YUN, 2005;
NOMBELA; GIL; CHAFFIN, 2006).
De acordo com Aguilar-Uscanga e François, (2003) a parede celular de leveduras
apresenta como componentes polímeros de manose (constituindo manoproteínas), glicanas
(principalmente beta-glucanas, mas galactanas também podem ser encontradas) e polímeros de N-
acetilglucosamina (formando quitina).
Cerca de 60 a 90% do peso seco da parede celular de S. cerevisiae é constituída de
glucanas e mananas (CHAUD; SGARBIERI, 2006). Para Kapteyn e colaboradores (1999), a parede
celular desta levedura é organizada em duas camadas formadas por quatro classes de macromoléculas
como proteínas de parede celular (CWPs), β-(1→6)-D-glucana, β-(1→3)-D-glucana e quitina, com
estes componentes interconectados através de ligações covalentes.
Lipke e Ovalle (1998) através de estudos realizados com microscopia eletrônica
observaram a disposição em camadas dos polissacarídeos da parede celular de S. cerevisiae. A camada
mais interna é constituída principalmente por uma β-(1→3)-D-glucana com pequeno grau de
substituição em C-6 por resíduos glucopiranosídicos, que variavam em relação ao grau de maturação
da célula. Segundo esses autores, a glucana poderia ser solúvel ou insolúvel, em solução aquosa,
dependendo do percentual de ramificação. Os demais constituintes da camada interna observados
foram a quitina, presente em proporções reduzidas nas regiões de cicatrizes de brotamento, e uma β-
(1→6)-D-glucana altamente ramificada, solúvel em água (KLIS et al., 2002). Finalmente, uma
manana constituída de uma cadeia principal de α-(1→6)-D-manopiranose altamente ramificada
também foi descrita como constituinte da parede celular em S. cerevisiae. As ramificações foram
caracterizadas como cadeias laterais de comprimentos variados de unidades de manose α-(1→2) e em
menor proporção α-(1→3) ligadas, distribuídas de forma complexa ao longo da cadeia principal
(KAPTEYN; VAN DEN ENDE; KLIS, 1999).
A levedura Schizosaccharomyces pombe, espécie considerada modelo para o
estudo da relação entre a formação da parede celular e o ciclo celular, também apresenta β-(1→3)
glucana com ramificação em C-6 (MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005). Uma característica
97
distinta desta levedura é a ausência de quitina, um polissacarídeo geralmente presente em outros
fungos. Foram identificados outros polissacarídeos como uma α-(1→3) glucana e uma galactomanana
típica de leveduras, formada por uma cadeia principal de α-(1→2) manopiranose, com unidades de
galactose substituindo as posições terminais (PÉREZ; RIBAS, 2004).
A parede celular dos fungos Candida albicans e Aspergillus fumigatus,
responsáveis por doenças em humanos, apresenta componentes como manana (Candida),
galactomanana (Aspergillus) e β-(1→3)-D-glucana (ambos microrganismos) que podem ser utilizados
para o diagnóstico de infecções fúngicas invasivas, pois estas moléculas, consideradas como antígenos
circulantes, são detectados no sangue em uma fase inicial da infecção e antes do surgimento dos
sintomas clínicos. A detecção desses antígenos é um procedimento mais rápido que os métodos
tradicionais, realizados por estudos histológicos ou cultura de células. A presença desses antígenos
também pode ser utilizada para monitorar a resposta dos pacientes ao tratamento com agentes anti-
fúngicos (ERJAVEČ; VERWEIJ, 2002).
Como a parede celular é essencial para a sobrevivência da célula fúngica e está
ausente em células de mamíferos, ela se torna um alvo atrativo para a ação de drogas. Portanto, o
conhecimento da síntese da parede celular, bem como de sua composição química podem dar
informações valiosas para aplicação desses agentes antifúngicos (PÉREZ; RIBAS, 2004).
Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica
Os polissacarídeos são uma classe de biopolímeros produzidos por todos os
organismos vivos. Eles exibem diferentes tipos de estruturas químicas, funções fisiológicas e
aplicações (ZOHURIAAN; SHOKROLAHI, 2004). Estas moléculas são polímeros de
monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas, formadas a partir da eliminação de uma molécula
de água ente o grupo hidroxila hemiacetal/hemicetal de um resíduo e um grupo hidroxila primário ou
secundário de outro resíduo adjacente. Podem ser constituídos por números variáveis de resíduos em
98
uma estrutura linear, ramificada ou ocasionalmente cíclica e sua massa molecular pode variar de
milhares a milhões de daltons (PAZUR, 1994).
Nos organismos vivos, os polissacarídeos podem estar sozinhos ou covalentemente
combinados com outros compostos de diferentes classes biológicas, principalmente proteínas e
lipídeos, constituindo os glicoconjugados. Em combinação ou livres, essas moléculas têm importantes
funções biológicas (NELSON; COX, 2002).
Em microrganismos, os polissacarídeos podem ser estruturais, excretados ao meio
como exopolissacarídeos (EPS) ou localizarem-se no citoplasma, exercendo a função de reserva
energética (KRCMAR et al., 1999; NELSON; COX, 2002). Os polissacarídeos microbianos têm
recebido considerável atenção devido ao seu potencial de aplicação em diferentes áreas industriais
incluindo cosméticos e alimentos funcionais, além de medicamentos (VANDAMME et al., 2002,
BAIS et al., 2005, FRANÇOIS; ROJAS; DARAIO, 2005, METHACANON et al., 2005).
Nos fungos, os polissacarídeos constituem um percentual importante da biomassa,
onde a parede da hifa é formada por mais de 75% dessas moléculas, principalmente em
basidiomicetos. Além de atuarem como um suporte para a hifa, essas macromoléculas também podem
constituir uma “capa” extracelular ao redor do micélio (GUTIÉRREZ; PRIETO; MARTINEZ, 1996).
A composição e estrutura química dos polissacarídeos de parede celular são
variáveis entre as diferentes espécies de microrganismos. Com base nos resultados provenientes da
caracterização química dessas macromoléculas, alguns autores propõem a sua utilização como
marcadores para a classificação taxonômica de fungos filamentosos, leveduras e liquens (GORIN;
SPENCER, 1970; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1995; CARBONERO et al., 2003;
CARBONERO et al., 2005; PESSONI et al., 2005).
Devido ao grande número de fungos encontrados na natureza e a possibilidade de
terem em sua composição endopolissacarídeos e exopolissacarídeos com diferentes aplicações
medicinais, estudos estão sendo realizados para verificar o potencial dessas macromoléculas como
antioxidantes, antimutagênicos, anticoagulantes, antitrombóticos e imunomoduladores. (FREIMUND
et al., 2003; ZHANG et al., 2005; CORRADI da SILVA et al., 2006).
99
Dentre os polissacarídeos encontrados na parede celular fúngica as glucanas são os
homopolissacarídeos mais comuns. A maioria é linear, com diferentes disposições de suas ligações
glicosídicas, pertencentes à série alfa (α) ou beta (β). As β-glucanas são a forma predominante,
podendo estar livres ou associadas às proteínas, lipídeos e outros polissacarídeos. A conformação
destas moléculas pode variar desde simples até tripla hélice, que é a forma mais comum, onde três
cadeias de polímeros são agregadas por ligações de hidrogênio nos oxigênios do C-2 (WILLIAMS,
1997).
As β-(1→3)-D-glucanas encontradas em extratos celulares de Saccharomyces
cerevisiae possuem ramificações em C-6 e esses terminais não redutores podem estar covalentemente
ligados à cadeia de quitina através de ligação α-(1→4) (LESAGE; BUSSEY, 2006).
A síntese de β-glucanas em fungos envolve várias etapas: reações de iniciação,
alongamento da cadeia e ramificação, das quais a mais estudada é o alongamento da cadeia que
envolve a reação catalisada pela enzima glucana β-(1→3) sintetase a partir de uridina difosfato-
glucose (UDP-glucose) como substrato (RUIZ-HERRERA, 1991). De acordo com Douglas (2001), a
polimerização dos açúcares é gradativa, sendo adicionado uma unidade de glucose por vez, até se
formar as longas cadeias.
Na parede celular de algumas leveduras, como Cândida dubliniensis, foi
encontrado um componente majoritário rico em manose associado a uma proteína, constituindo as
manoproteínas. A esse tipo de glicoconjugado têm sido atribuídas funções de adesão entre células,
habilidades imunomoduladores e variabilidade antigênica (LIŽIČÁROVÁ et al., 2007). Moléculas de
manose podem, também, ser encontradas como galactomananas, que são heteropolissacarídeos
constituídos por uma cadeia principal de manose ligada a resíduos de galactose, presentes em espécies
do gênero Aspergillus, como A. fumigatus e A. wentii, e Chaetosartorya chrysella, fungos estudados
em relação à patogenicidade humana (GÓMEZ-MIRANDA et al., 2004). Dependendo do grau de
ramificação, bem como do tamanho da cadeia lateral, as galactomananas apresentam propriedades
físicas e químicas distintas, que permitem classificá-las como uma família de macromoléculas.
Um constituinte menor da parede celular e comum em fungos é a quitina, um
homopolímero linear, longo, formado por resíduos de N-acetilglucosamina β-(1→4) ligados.
100
Compreende cerca de 1 a 2% da parede celular de leveduras embora seja encontrada em maior
proporção (10 a 20%) em fungos filamentosos. Pontes de hidrogênio inter-cadeia dão origem a
microfibrilas de quitina. Essas estruturas suportam grandes pressões e, portanto, tornam-se
responsáveis pela integridade da parede celular. Quando a síntese da quitina é interrompida, a parede
celular torna-se desorganizada e a célula fúngica sofre deformações e instabilidade osmótica
(BOWMAN; FREE, 2006).
A caracterização química dos constituintes da parede celular fúngica contribuirá
para o conhecimento básico do microrganismo, para o entendimento de suas relações com o meio e a
provável utilização biotecnológica de seus componentes isolados.
Procedimentos Gerais para Purificação e Caracterização de Polissacarídeos de Parede Celular
Visto que a biomassa fúngica constitui uma valiosa fonte de proteínas, lipídeos e
principalmente de polissacarídeos que apresentam inúmeras propriedades benéficas para a saúde
humana, animal e vegetal, diferentes métodos são utilizados para o isolamento e caracterização destes
polissacarídeos.
Primeiramente, é necessário efetuar a extração eficiente dos polissacarídeos
evitando, tanto quanto possível, reações de degradação. Os procedimentos mais comuns são as
extrações aquosas a frio, a quente e/ ou alcalina, com NaOH ou KOH, ou até mesmo com auxílio de
enzimas específicas. Os extratos obtidos, geralmente são constituídos por uma mistura de
polissacarídeos (PÉREZ; RIBAS, 2004).
Precedendo a caracterização (PAZUR, 1994), procedimentos de purificação devem
ser efetuados até que a composição monossacarídica da macromolécula em estudo se mantenha
constante por, pelo menos, dois métodos diferentes. Normalmente, métodos cromatográficos e/ou
químicos dão informações em relação à pureza da preparação polissacarídica (DANISHEFSKY;
WHISTLER; BETTELHEIM, 1970; BOYER, 1993).
101
Considerando-se a pureza do material o primeiro procedimento químico para
conhecer a composição de uma fração rica em carboidrato é fragmentá-la, para ter os resíduos
monossacarídicos que a constitui (NELSON; COX, 2002). Esta fragmentação pode ser realizada
através de hidrólises enzimática ou ácida. Estabelecidas às condições ideais de hidrólise, a
identificação dos monômeros passa a ser a etapa seguinte da análise. Os métodos cromatográficos são
os mais utilizados e a cromatografia líquida de alta pressão em troca aniônica (HPAEC) tem sido,
juntamente com a cromatografia gasosa, os de preferência (RUAS-MADIEDO; LOS REYES-
GAVILAN, 2005).
O tipo de ligação glicosídica geralmente é determinado após a análise dos acetatos
de alditóis parcialmente metilados por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (cg/em) e a
configuração anomérica dos monossacarídeos que constituem a macromolécula por FT-IR.
(SILVERSTEIN, 1994; MOHAČEK-GROŠEV; BOŽAC; PUPPELS, 2001) e RMN de
13
C (GORIN,
1981; CORRADI da SILVA et al., 2006).
Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica: Purificação e Caracterização
Estudos demonstram que os polissacarídeos fúngicos podem ser isolados da parede
celular do corpo de frutificação, do micélio, do esclerócio (forma de resistência) ou então serem
provenientes de meios de cultivo livres de células (extracelulares) (MONDAL et al., 2004; WANG et
al., 2004; CORRADI da SILVA et al., 2006).
Vários polissacarídeos foram isolados da parede celular do Phytophthora
parasitica, um fungo fitopatogênico. A mistura polissacarídica foi fracionada por cromatografias
sucessivas em DEAE-celulose, Sephadex G-25, Concanavalina-A Sepharose e Sephadex G-200. Os
polissacarídeos neutros consistiam de uma β-D-glucana (1→3,1→6) cuja massa molecular ficou entre
9 x 10
3
a 200 x 10
3
Da. Todos estes polissacarídeos eram constituídos por uma cadeia principal de
resíduos de glucose β-(1→3) ligados (FABRE et al., 1984).
102
O principal componente encontrado no extrato aquoso do corpo de frutificação de
Boletus erythropus foi uma β-glucana contendo resíduos de glucose com ligações (1Æ3), sendo
substituídas em O-6 por terminais não redutores de -D-Glcp, na freqüência de 1:3 (CHAUVEUAU et
al., 1996).
Ruiz-Herrera e colaboradores (1996) mostraram que as composições
monossacarídicas do micélio e da levedura de Ustilago maydis, um hemibasidiomiceto fitopatogênico
que causa doença em milho, são distintas. Glucose (41%), galactose (32%), manose (16%) e xilose
(11%), monossacarídeos encontrados na forma micelial diferiram daqueles encontrados na forma
leveduriforme: glucose (26%), xilose (23%), manose (23%), galactose (11%), fucose (6%), arabinose
(6%) e ribose (5%).
Prieto e colaboradores (1997) isolaram um polissacarídeo complexo, por extração
alcalina, da parede celular dos fungos Trichoderma reesei, T. koningii (forma teleomórfica) e
Hypocrea psychrophila (anamórfica). Esses fungos, encontrados no solo, têm grande importância
econômica por atuarem como agentes de biocontrole de fungos fitopatogênicos e por serem produtores
de enzimas como as celulases. Após hidrólise ácida do polissacarídeo complexo solúvel em água
foram detectados por cromatografia gasosa, como acetato de alditóis, os açúcares glucose, galactose e
manose. Análises de metilação e ressonância magnética nuclear de carbono 13 e próton uni- e
bidimensional mostraram um estrutura altamente complexa com uma cadeia principal constituída de
unidades manopiranosídicas α-(1→6) ligadas, algumas unidades substituídas em 2 por
oligossacarídeos com unidades galactofuranosídicas alternadas com ácido glucurônico ou em 3 por
unidades α manopiranosídicas.
Ahrazem e colaboradores (1997) caracterizaram um polissacarídeo acídico isolado
da parede celular de Cylindrocladium e de sua forma anamórfica Calonectria, por extração alcalina.
Os acetatos de alditóis, galactose, glucose e manose foram detectados por cromatografia gasosa, além
da presença de ácido urônico. Análises de metilação mostraram os derivados 2,3,4,6-tetra-O-metil
glucitol e 3-5-di-O-metil galacitol, além de 5% de 2,3,4-tri-O-metil manitol, e 3,4-di-O-metil manitol.
O espectro de RMN de
13
C
mostrou apenas dois sinais na região anomérica, δ 107,1 ppm e 176,2 ppm,
103
atribuídos, respectivamente, aos resíduos β-galactofuranosídicos e carbonila, confirmando a presença
de ácido urônico.
Uma β-D-glucana-(1→3) solúvel substituída em C-6, em uma proporção de
aproximadamente 30%, foi encontrada como principal componente da extração alcalina da parede
celular de Cryphonectria parasítica (MOLINARO et al., 2000).
Zhang e colaboradores (2000) extraíram uma glucana do corpo de frutificação do
basidiomiceto Ganoderma lucidum. Após resultados das análises de metilação, oxidação pelo
periodato, ressonância magnética nuclear de carbono 13 e espectroscopia de infravermelho, a molécula
foi caracterizada como um polímero linear constituído de resíduos glucosídicos α-(1→3) ligados.
Um polissacarídeo solúvel foi isolado do extrato aquoso a quente do corpo de
frutificação de Agaricus blazei (Murr) por precipitação etanólica, cromatografia de trôca-iônica e
cromatografia de filtração em gel. As análises de metilação, degradação de Smith, hidrólise branda e
espectroscopia de RMN de
13
C mostraram que o polissacarídeo era composto por uma cadeia principal
de resíduos glucosídicos em ligação β-(1→6), substituídos em C-3 por resíduos laminaribiosídicos
(DONG et al., 2002).
O corpo de frutificação de Ganoderma lucidum, tem sido usado tradicionalmente
na medicina chinesa e em outros países asiáticos por apresentarem efeitos medicinais contra câncer,
hipertensão, hepatite e hipercolesterolemia e vários polissacarídeos têm sido obtidos a partir do extrato
aquoso dessa estrutura de Ganoderma (BAO et al., 2002a). Uma das glucanas isoladas foi
caracterizada como tendo uma cadeia principal constituída de unidades glucopiranosídicas β-(1→3)
substituídas em O-6 por uma unidade de glucose (BAO et al., 2001; BAO et al., 2002a). Glucanas com
estrutura química semelhantes também foram isoladas dos esporos deste mesmo fungo (BAO et al.,
2002b).
Domenech e colaboradores (2002) isolaram e caracterizaram uma galactomanana
do extrato alcalino da parede celular de três linhagens de Verticillium fungicola, considerado um dos
patógenos mais comuns no cultivo do cogumelo Agaricus biosporus. A fração F1SS, das três
linhagens estudadas, era constituída por manose e galactose. A análise de metilação mostrou dois
104
picos identificados como 1,5-di-O-acetil-2,3,4,6-tetra-O-metil-galacitol, que correspondem a
galactopiranose, e 1,4,5,6-tetra-O-acetil-2,3-di-O-metil-manitol e um pequeno percentual de Manp 6-
O-substituído. A massa molecular média dos polissacarídeos, determinada por cromatografia de
filtração em gel de Sepharose CL-6B, ficou entre 70 a 80 kDa. Os resultados da análise de metilação
juntamente com espectros de RMN de H
1
e de
13
C
1
sugeriram uma estrutura formada por uma cadeia
principal de unidades manopiranosídicas α-(1→6) ligadas e substituídas em O-4 por resíduo β-D-
galactopiranosídicos. Esses resultados confirmam a semelhança estrutural dos polissacarídeos nas
diferentes linhagens e reforçam a aplicação dos polissacarídeos como marcadores taxonômicos.
Ahrazem e colaboradores (2002) caracterizaram um polissacarídeo solúvel em
água, extraída com álcali de paredes celulares das espécies de Geotrichum spp. (forma anamórfica),
Galactomyces e Dipodascus (formas teleomóficas). Por análise de metilação e ressonância magnética
nuclear concluíram que o polissacarídeo era uma galactomanana com cadeia principal constituída de
unidades α-D-manp 1→6 e substituídas em 2 por (α-D-Galp-(1→2)- α-D-Manp-1→). Todas as
espécies estudadas apresentaram o mesmo polissacarídeo e, portanto, concluíram tratar-se do mesmo
gênero.
Uma linhagem selvagem de Poria cocos foi cultivada, separadamente, em extrato
de cevada e em extrato fermentado de milho e denominadas de wb e wc, respectivamente. Seis frações
polissacarídeos foram isoladas, seqüencialmente, dos dois micélios por extrações com NaCl 0,9%
(PCM1), aquosa a quente (PCM2), NaOH 0,5M (PCM3-I e -II) e ácido fórmico a 88% (PCM-4-I e –
II). Glucanas extraídas com NaOH 0,5M se separam em duas frações, denominadas PCM3-I e PCM3-
II, após neutralização com ácido acético. As características físicas e químicas foram determinadas por
espectroscopia de IV (Infra-Vermelho), cromatografia gasosa (CG), RMN-
13
C, light scattering (LS) e
viscosimetria. Os resultados indicaram que as frações PCM-1 e PCM-2 dos cultivos em wb e wc eram
constituídas por heteropolissacarídeos formados por glucose, manose e galactose, enquanto que em
PCM3-I foram encontradas glucanas lineares com ligações do tipo α-(1→3). As frações PCM3-II,
PCM4-I e PCM4-II eram compostas de glucanas lineares com ligações do tipo β-(1→3) (JIN et al.,
2003).
105
Em 2004, Jia e colaboradores elucidaram a estrutura de um heteropolissacarídeo de
peso molecular de 1,8 x 10
4
Da,
composto por ramnose, glucose e galactose na proporção de 1,19:
3,81: 1,00, isolado do corpo de frutificação do fungo medicinal chinês Hericium erinaceus. Suas
características estruturais foram investigadas utilizando análise de metilação, hidrólise parcial,
espectroscopia de infravermelho e de RMN. Os resultados mostraram que a cadeia principal era
formada por unidades α-D-galactopiranosídicas com ramificações em O-2 por resíduos de ramnose e
glucose.
Chakraborty e colaboradores (2004) isolaram e caracterizaram uma heteroglucana
da extração aquosa a quente (100ºC, 6h) do corpo de frutificação do fungo comestível Astraeus
hygrometricus que constitui micorrizas crescendo junto com as raízes de árvores auxiliando na
extração de nutrientes, especialmente o fósforo do solo, e de substâncias orgânicas. A fração solúvel
do extrato aquoso foi investigada e os resultados das análises de hidrólise ácida total, metilação e
RMN permitiram concluir que se tratava de uma glucana com ligações glicosídicas do tipo α-(1→4) e
β-(1→6).
Mondal e colaboradores (2004) realizaram uma extração aquosa do corpo de
frutificação (100ºC, 6h) de Termitomyces eurhizus, um cogumelo de grande interesse devido a suas
propriedades imunomoduladora e seu alto valor nutritivo. O extrato deste microrganismo, depois de
dializado e precipitado com etanol, foi submetido à purificação pela cromatografia de filtração em gel
Sephadex G-50 onde foram separadas duas frações homogêneas, denominadas PS-I e PS-II. Análises
de metilação, oxidação com periodato, RMN do
13
C
e de
1
H, mostraram que o polissacarídeo da fração
PS-I era composto por unidades glucopiranosídicas unidas por ligações do tipo α-(1→3) e α-(1→6) na
proporção de 2,5:1. PS-II também era um polímero de glucose mas com ligações do tipo α-(1→6).
Uma glucana isolada do micélio de um fungo comestível chinês Cordyceps
sinensis foi caracterizada por análise de metilação, degradação de Smith, acetólise, espectroscopia de
NMR (1H, 13C, 13C-1H 2D-COSY) e hidrólise ácida total. Os resultados mostraram que cadeia
principal era composta de resíduos α-(1→4)-D-glucopiranosídicos ligados a um único resíduo α-
(1→6)-D-glucosídicos (YALIN; CUIRONG; YUANJIANG, 2006).
106
Um polissacarídeo insolúvel em água foi isolado da extração alcalina (NaOH) do
micélio de Penicillium chrysogenum. O peso molecular desse polímero, 180 KDa, foi determinado por
cromatografia de permeação em gel. Após hidrólise ácida total e análise dos derivados acetilados por
cromatografia líquido-gasosa (GLC) foram encontrados os açúcares glucose, manose e galactose nas
proporções 98,7: 0,6: 0,7. O espectro de FT-IR apresentou picos de absorção em 929, 846 e 820 cm
-1
característicos de glucanas com ligações do tipo α-(1→3). O espectro de ressonância magnética
nuclear de carbono 13 apresentou 6 sinais de intensidades semelhantes. Os deslocamentos químicos
em 101,20 ppm e 83,66 ppm foram atribuídos ao carbono anomérico dos resíduos de glucose e ao C-3-
O-substituído, respectivamente (WANG et al., 2007).
Um endopolissacarídeo foi isolado do extrato aquoso a quente do micélio do
Inonotus obliquus, (fungo de degradação branca) e purificado por cromatografia de troca iônica e de
filtração em gel. Após caracterização, o polissacarídeo mostrou-se constituído por resíduos de fucose,
glucose e manose e massa molecular de aproximadamente 1 × 10
6
Da. Verificou-se que esse
endopolissacarídeo é um ativador específico de células B e de macrófagos. Os resultados in vivo e in
vitro comprovaram que a atividade antitumoral não se deve ao efeito tumoricida e sim ao efeito
imunomodulador (KIM et al., 2006).
Atividades Biológicas dos Polissacarídeos de Parede Celular Fúngica
Os biopolímeros, de maneira geral, têm sido objetos de pesquisas devido ao seu
potencial de aplicação. Estudos realizados com os polissacarídeos da parede celular fúngica
demonstram que essas moléculas apresentam uma variedade de respostas biológicas de defesa, mas
sua aplicação terapêutica parece estar relacionada com a estrutura química e a conformação espacial
de cada macromolécula, sendo que pequenas diferenças estruturais entre polímeros resultam em
características peculiares para novas aplicações biotecnológicas (CORRADI da SILVA et al, 2006).
Diferentes funções biológicas desses polímeros foram analisadas, como
hipoglicemiantes, anti-trombóticas, antibióticas, atividades anti-tumorais e anti-virais, atuação na
107
diminuição da pressão arterial e na concentração de lipídios sanguíneos, na inibição da ação
inflamatória e microbiana. (ZHANG et al., 2000; HWANG et al., 2003; ALQUINI et al., 2004;
ZHANG et al., 2007). Estudos com os basidiomicetos Agaricus blazei e Lentinus edodes, utilizados na
medicina popular japonesa e chinesa para prevenção e tratamento de doenças, mostraram que essas
atividades poderiam estar ligadas aos polissacarídeos presentes nestes fungos (LIMA et al., 2001;
DELMANTO et al., 2001; CHEN; SHAO; SU, 2004).
As glucanas são os polissacarídeos mais estudados em relação à atividade
biológica. Essas moléculas, principalmente do tipo β-(1→3) e/ou β-(1→3; 1→6), são capazes de
ativar células do sistema imunológico humano, como macrófagos, neutrófilos e células NK (natural
killer), para a secreção de citocinas (interleucinas, interferon e fator necrosante tumoral) que são
substâncias que atuam como sinais químicos nos processos de diferenciação, proliferação e apoptose
celulares, contribuindo para a manutenção da homeostase no organismo (ABBAS; LICHTMAN;
POBER, 2000; HABIJANIČ et al., 2001).
Muitos medicamentos utilizados em neoplasias apresentam como efeito colateral
uma ação imunossupressora, que pode acarretar em infecção e septicemia. Devido à capacidade das β-
glucanas em estimular o sistema imunológico, elas podem ser utilizadas como adjuvantes desses
quimioterápicos no tratamento de pacientes imunocomprometidos. (BOHN; BeMILLER, 1995; LEE
et al., 2001; SUGAWARA et al., 2004; ZHANG et al., 2005; LEUNG et al., 2006).
Além das glucanas, outros polisssacarídeos de parede também estão sendo
investigados com o intuito de determinar suas atividades biológicas.
De acordo com Zhang e colaboradores (2007), manoglucanas, galactomananas, e
glucomananas, obtidas da biomassa de basidiomicetos, tais como Ganoderma lucidum, Grifola
frondosa e diferentes espécies do gênero Pleurotus, como P. cittinopileatus, também podem
apresentar atividades antitumorais ou imunomoduladoras.
Martinichen-Herrero e colaboradores (2005) isolaram e caracterizaram uma
galactomanana do líquen Cladonia ibitipocae e a modificaram quimicamente pela inserção de
grupamentos sulfato, num processo denominado sulfatação; os polissacarídeos original e modificado
108
apresentaram atividades anticoagulante e antitrombótica distintas em experimentos realizados em
ratos, com os resultados mais positivos relacionados à molécula sulfatada.
Trabalhos realizados por Krizková e colaboradores (2001), investigaram
glucomananas isoladas de Candida utilis e mananas de Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans
Eles observaram que essas moléculas apresentavam atividade antimutagênica, pois eram capazes de
reduzir danos oxidativos ao DNA de cloroplastos do flagelado Euglena gracilis, e que esta ação
poderia estar relacionada à característica das moléculas em seqüestrar radicais livres, demonstrando
também que esses polissacarídeos possuem atividade antioxidante.
Além das funções biológicas destacadas acima, é importante também ressaltar que
dependendo das características químicas que esses biopolímeros apresentem como, por exemplo, o
grau de solubilidade em soluções aquosas, é possível também a sua utilização nos mais diversos
segmentos industriais, como indústrias de alimentos, cosméticos, etc (SUTHERLAND, 1998; SHAH
et al., 2000; WANG et al., 2004; METHACANON et al., 2005).
109
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117
ANEXO B
Guia para autores do periódico Semina
118
Normas Editoriais para Publicação
Apresentação dos Trabalhos
1. Os originais devem ser enviados em disquete (3 ½ ), acompanhado de três cópias
impressas, com entrelinhamento duplo. O trabalho deverá ser elaborado no editor de
texto Microsoft Word for Windows, fonte Times New Roman, tamanho 11, normal; com
margens de no mínimo 2cm, respeitando-se o número de páginas de acordo com a
categoria do trabalho e devem estar devidamente numeradas.
2. Categorias dos Trabalhos:
a) artigos e revisões no máximo 40 páginas;
b) comunicações; divulgações e resenhas no máximo 20 páginas;
c) resenhas de livros e revistas no máximo 4 páginas; e
3. Na primeira lauda do original deverá constar o título do trabalho, nome completo do
autor principal, minicurrículo, endereço postal, número do telefone e/ou fax e e-mail;
categoria do trabalho; área de publicação da Semina e classificação das áreas/sub-áreas
do CNPq/CAPES.
3.1. Título do trabalho: o título, acompanhado de sua tradução para o inglês, deve ser
breve e suficientemente específico e descritivo, contendo as palavras-chave que
representem o conteúdo do texto.
3.2. Nome(s) completo(s) do(s) autor(es): Os demais dados como título e/ou
credenciais, cargo(s) ocupado(s) pelo(s) autor(es) e local de realização do trabalho
deverão constar em nota de rodapé.
3.3. Resumo: deve ser incluído um resumo informativo de aproximadamente 200
palavras, em português, acompanhado de sua tradução para o inglês, digitado com
entrelinhamento duplo, na segunda lauda do original. (NBR 6028 da ABNT)
3.4. Agradecimentos: agradecimentos a auxílios recebidos para a elaboração do trabalho
deverão ser mencionados no final do artigo.
3.5. Notas: notas referentes ao corpo do artigo devem ser indicadas com um asterisco
alto, imediatamente depois da frase a que diz respeito. As notas deverão vir no rodapé
do texto.
3.6. Apêndices: apêndices podem ser empregados no caso de listagens extensivas,
estatísticas e outros elementos de suporte.
3.7. Materiais gráficos: fotografias nítidas e gráficos (estritamente indispensáveis à
clareza do texto) poderão ser aceitos e deverão ser assinalados, no texto, pelo seu
número de ordem, os locais onde devem ser intercalados. Se as ilustrações enviadas já
tiverem sido publicadas, mencionar a fonte e a permissão para reprodução.
3.8. Quadros e Tabelas: os quadros e/ou tabelas deverão ser acompanhados de
cabeçalho que permita compreender o significado dos dados reunidos, sem necessidade
de referência ao texto. Assinalar, no texto, por seu número de ordem, os locais onde os
quadros e/ou tabelas devem ser intercalados.
3.9. As grandezas, unidades e símbolos deverão obedecer às normas nacionais
correspondentes (ABNT).
3.10. Citações: deverão seguir o sistema de chamada alfabética (NBR 10520 da ABNT).
3.11. Referências bibliográficas: as referências bibliográficas, redigidas segundo a norma
NBR 6023/2000 da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), deverão ser
listadas na ordem alfabética no final do artigo. A exatidão e adequação das referências a
trabalhos que tenham sido consultados e mencionados no texto do artigo são da
responsabilidade do autor.
119
4. O autor principal deverá enviar, junto com o original, autorização para publicação do
trabalho na SEMINA, comprometendo-se a não publicá-lo em outro periódico.
5. A publicação dos trabalhos depende de parecer da Assessoria Científica "Ad hoc" da
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UEL.
6. Após impressa a revista, o autor principal receberá gratuitamente um (1) exemplar da
revista.
7. Os trabalhos não aceitos para publicação serão devolvidos ao autor.
8. As questões e problemas não previstos na presente norma serão dirimidos pelo Comitê
Editorial da área para a qual foi submetido o artigo para publicação.
9. Os trabalhos devem ser enviados para:
Universidade Estadual de Londrina
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
Edição da SEMINA
Campus Universitário - Caixa Postal 6001
86051-990 - Londrina, Paraná, Brasil.
Contatos com a Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação:
Nome - Área - Ramal: e-mail:
Prof. Dr. Édison Miglioranza - PROPPG/DP - 4513 emiglior@uel.br
Ivone Yurika Mizubuti - PROPPG/DCA - 4105
Égle Maria de Souza - PROPPG/DCA - 4449 [email protected]
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