( PDF ) Expressão imuno-histoquímica dos marcadores tumorais p16 e p53 em casos de neoplasia intra-epitelial vulvar e carcinona invasor de vulva

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FUNDAÇÃO FACULDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS MÉDICAS DE PORTO ALEGRE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA

MAURICIO CORDONI NOGUEIRA

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES TUMORAIS p16 E

p53 EM CASOS DE NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL VULVAR E CARCINOMA

INVASOR DE VULVA

Porto Alegre

2005

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MAURICIO CORDONI NOGUEIRA

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES TUMORAIS p16 E

p53 EM CASOS DE NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL VULVAR E CARCINOMA

INVASOR DE VULVA

Dissertação de Mestrado em Patologia Experimental

Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre

Programa de Pós-Graduação em Patologia

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Galleano Zettler

Porto Alegre

2005

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N778e Nogueira, Maurício Cordoni

Expressão imuno-histoquímica dos marcadores tumorais p16 e

p53 em casos de neoplasia intra-epitelial vulvar e carcinoma invasor

de vulva / Mauricio Cordoni Nogueira; orient. Cláudio Galleano

Zettler. Porto Alegre : FFFCMPA, 2005.

83 fl. ; graf. ; tab.

Dissertação (Mestrado) - Fundação Faculdade Federal de

Ciências Médicas de Porto Alegre.

Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em

Patologia. Área de Concentração: Patologia Experimental.

1. Neoplasia vulvar. 2. Imuno-Histoquímica. 3. Marcadores

Tumorais p16 e p53. I. Zettler, Cláudio Galleano II. Título.

C.D.D. 6l6.99467

Ruth Oliveira - CRB10/501

DEDICATÓRIA

Aos meus avós maternos Erna Lutz Cordoni

e Luiz Cordoni Sobrinho (in memoriam) que com

amor e carinho dedicaram-se à minha educação.

AGRADECIMENTOS

Prof. Dr. Cláudio Galleano Zettler: agradeço pela confiança e inestimável ajuda na

elaboração do meu projeto.

Dra. Bernadete Nonnenmacher, Dr. Ernesto de Paula Guedes Neto e Dr. Marcos

Wengrover Rosa: amigos e mestres com quem sempre pude contar. Agradeço o contínuo

aprendizado e amizade.

Profa. Dra. Márcia da Silveira Graudenz: agradeço suas opiniões e críticas na

disciplina “Seminário em Patologia” que muito contribuíram para o desenvolvimento deste

trabalho.

Dra.Alice Zelmanowicz: agradeço suas sugestões na revisão do trabalho e o apoio

demonstrado na pesquisa dos dados registrados no Hospital Santa Rita.

Dr. Fernando Phillipsen (meu amigo “Primo”): sua generosa contribuição e

coleguismo.

Dr. José Pio Furtado e Dr.Augusto Valle Obando: mestres e grandes incentivadores da

minha vida acadêmica.

Vanessa Carpes (acadêmica de medicina): agradeço sua contribuição no levantamento

dos dados da pesquisa e destaco sua energia e competência.

Teresinha Stein, Rosalva Meurer e Ivonice Oliveira Santos (funcionárias da pós-

graduação em Patologia da FFFCMPA): o meu agradecimento especial pela compreensão e

cordialidade.

Ivone Pereira Rodrigues, Ruth Borges de Oliveira, Eleonora Liberato e Mário

Falkembach Pacheco (funcionários da biblioteca da FFFCMPA): sou grato pela atenção e

carinho.

Patrícia Seidel (minha namorada): pelo amor e paciência incondicional que

demonstrou em todos os momentos.

Dr. Sérgio Luiz Cordoni: cuja trajetória na área da ginecologia serviu de exemplo para

minhas conquistas profissionais.

Aos meus familiares pelo apoio na concretização deste projeto.

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ............................................................................................... 7

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................ 8

INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 9

1 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................... 12

1.1 Doenças Dermatológicas Vulvares ............................................................................ 13

1.1.1 Líquen Escleroso .............................................................................................. 13

1.1.2 Hiperplasia Escamosa ....................................................................................... 13

1.1.3 Ceratoacantoma ................................................................................................ 14

1.2 Lesões Condilomatosas da Vulva .............................................................................. 14

1.2.1 Condiloma Acuminado ..................................................................................... 14

2 LESÕES NEOPLÁSICAS DA VULVA ......................................................................... 16

2.1 Epidemiologia ............................................................................................................ 16

2.2 Aspectos Clínicos e Patológicos ................................................................................ 18

2.3 A Idade e as Neoplasias Vulvares ............................................................................. 19

2.4 Neoplasia Intra-epitelial Vulvar ................................................................................ 20

2.5 Câncer de Vulva ........................................................................................................ 22

2.5.1 Carcinoma de Células Escamosas (Epidermóide) ............................................ 22

2.5.2 Carcinoma Verrucoso ....................................................................................... 24

2.5.3 Melanoma Maligno ........................................................................................... 25

2.5.4 Sarcoma ............................................................................................................ 25

2.5.5 Doença de Paget ............................................................................................... 26

2.5.6 Carcinoma de Células Basais ........................................................................... 26

2.5.7 Adenocarcinoma ............................................................................................... 26

2.5.8 Carcinoma de Células de Merkel ...................................................................... 27

2.6 O Ciclo Celular .......................................................................................................... 27

2.7 As Proteínas p16 e p53 .............................................................................................. 28

2.8 O Papel do HPV ......................................................................................................... 29

3 OBJETIVOS .................................................................................................................... 31

3.1 Principal ..................................................................................................................... 31

3.2 Secundário ................................................................................................................. 31

4 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 32

REFERÊNCIAS BIBLIGRÁFICAS .................................................................................. 33

ARTIGO ............................................................................................................................. 41

ANEXOS ............................................................................................................................ 81

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Tabela 1 – Incidência e média de idade dos casos de câncer de vulva no Hospital Santa

Santa Rita (1992-2001) ..................................................................................... 17

Tabela 2 – Modelo de câncer vulvar ................................................................................... 19

Tabela 3 – Trabalhos na literatura que avaliaram a imuno-expressão dos marcadores

P16 e p53 em casos de carcinoma de vulva ...................................................... 29

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CCE: Carcinoma de células escamosas

CDK: Ciclina dependente de quinase

DNA: Ácido desoxirribonucléico

EUA: Estados Unidos da América

HPV: Papiloma vírus humano

NIC: Neoplasia intra-epitelial cervical

NIV: Neoplasia intra-epitelial vulvar

INTRODUÇÃO

As neoplasias intra-epiteliais da vulva (NIV) constituem um grupo de lesões do

epitélio que podem regredir, persistir ou progredir para o câncer invasor

(1)

Esse grupo de

neoplasias é caracterizado por anormalidades nucleares como a perda da polaridade,

pleomorfismo, cromatina nuclear de aspecto grosseiro, irregularidades da membrana nuclear e

figuras mitóticas em vários níveis do epitélio acima da membrana basal

(2)

O câncer de vulva é uma neoplasia incomum representando cerca de 1% dos tumores

malignos femininos

(3)

. A incidência do câncer vulvar parece ter uma distribuição bimodal

(4)

A maioria das neoplasias desenvolve-se como uma lesão solitária em mulheres pós-

menopáusicas, freqüentemente associadas com distrofia crônica vulvar

(5)

. Mais recentemente

trabalhos têm identificado um segundo grupo de neoplasias desenvolvidas em mulheres

jovens, usualmente em associação com carcinoma multifocal in situ ou manifestações da

infecção pelo papiloma vírus humano (HPV)

(6,7)

. A raridade do câncer vulvar faz com que

uma investigação epidemiológica detalhada dos fatores de risco seja dificultosa

(8)

. Recentes

dados da literatura sugerem que uma história prévia de neoplasia genital, infecção pelo HPV,

tabagismo e as distrofias crônicas sejam os fatores mais importantes

(6,9)

A biópsia é o exame fundamental para confirmação diagnóstica de qualquer lesão

vulvar suspeita

(10)

. A vulvoscopia, ou seja, o exame da vulva com auxílio da lente do

colposcópio, pode orientar as biópsias utilizando-se previamente o ácido acético a 5% e

também o teste de Richard Collins, que consiste na embrocação da vulva com solução de azul

de toluidina a 1%

(11)

Pacientes e médicos contribuem para o atraso e correto diagnóstico das doenças

vulvares. De acordo com um estudo, as mulheres com lesão vulvar sintomática ou com queixa

de prurido crônico costumam levar de 2 a 16 meses para procurarem tratamento médico. Por

outro lado, os médicos prescrevem tratamento tópico local para lesões vulvares por até 12

meses, antes de decidirem por realizar uma biópsia local

(12)

. Portanto, as prescrições

inapropriadas de tratamentos locais para melhora de sintomas, algumas vezes, estão

relacionadas ao diagnóstico tardio.

O tratamento das lesões vulvares passou por uma transformação nos últimos anos com

o incremento de novas técnicas de abordagem terapêutica e com altas taxas de cura

(10)

. As

excisões locais conservadoras ganharam maior espaço no tratamento das lesões iniciais

(13)

. A

vulvectomia radical e dissecção bilateral dos linfonodos inguinais ainda são o tratamento

padrão para a maioria das pacientes com câncer vulvar operável, porém cirurgias mais

conservadoras são também aceitas, tais como: hemi-vulvectomias, ressecções locais, técnicas

de preservação do clitóris e mais recentemente, a biópsia do linfonodo sentinela para o

tratamento ganglionar

(13,14,15)

A utilização de marcadores tumorais tem crescido nos últimos anos, tendo sua

aplicabilidade na diferenciação de tecidos neoplásicos, na identificação de tecidos normais e

para possível avaliação prognóstica

(16,17,18)

. Os marcadores tumorais (ou marcadores

biológicos) são substâncias presentes no tumor, no sangue ou em outros líquidos biológicos,

produzidos primariamente por ele ou, secundariamente pelo paciente, em resposta a presença

do tumor

(19)

. Muitos desses marcadores, os quais foram inicialmente identificados através de

estudos moleculares ou bioquímicos podem agora ser localizados em cortes de tecido pelo uso

da técnica imuno-histoquímica

(19,20)

A identificação dos marcadores p16 e p53 merecem destaque nas neoplasias vulvares

por estarem relacionados possivelmente na distinção de padrões de comportamentos tumorais

e, recentemente, trabalhos também têm demonstrado o seu possível papel prognóstico

(17,21,22)

A mutação ou deleção do gene p16 é observada em uma série de tumores, tais como:

melanomas, carcinomas pancreáticos, glioblastomas, carcinomas de esôfago e sarcomas de

partes moles

(23,24)

. A imuno-expressão da proteína p16 nos tecidos do trato genital feminino

parece estar relacionada com carcinomas infectados pelo HPV

(25)

A mutação do gene p53 e a sua imuno-expressão nos tecidos neoplásicos são um

fenômeno comum em numerosos tumores humanos, tais como: pênis, mama, colo uterino,

bexiga, pulmão, entre outros

(26,27,28)

. A expressão aumentada do p53, sobretudo no câncer de

mama, segundo alguns autores está associada a tumores mais agressivos e a um pior

prognóstico

(29)

. A mutação da proteína p53 estaria implicada em neoplasias vulvares não

infectadas pelo HPV, principalmente entre mulheres idosas

(6,21,30)

1 REVISÃO DA LITERATURA

As doenças vulvares representam um amplo espectro de anormalidades que podem ou

não estar relacionadas ao desenvolvimento de câncer invasor. Serão abordados a seguir os

aspectos gerais das lesões mais comumente associadas ao tecido vulvar, com maior ênfase nas

suas características neoplásicas (neoplasia intra-epitelial vulvar e carcinoma de vulva). Por

fim, será revisado o possível papel das proteínas p16 e p53, bem como, do papiloma vírus

humano (HPV) no desenvolvimento neoplásico vulvar.

a) Anatomia

A vulva é composta do monte pubiano, grandes lábios, pequenos lábios, clitóris e

vestíbulo. Com o início da puberdade, o monte pubiano e os bordos laterais dos grandes lábios

adquirem maior volume de gordura subcutânea e desenvolvem um espessamento da pele. As

glândulas sebáceas e apócrinas nessas regiões desenvolvem-se concomitantemente. As

aberturas externas pareadas das glândulas parauretrais (glândulas de Skene) localizam-se em

ambos os lados do meato uretral. As glândulas de Bartholin, localizadas imediatamente

póstero-laterais ao intróito, são glândulas túbulo-alveolares secretoras de muco e ramificadas

na sua extensão

(5)

. Os linfonodos inguinais e femorais fornecem as vias primárias de

drenagem linfática, exceto o clitóris (homólogo ao pênis), que compartilha a drenagem

linfática da uretra

(2,15)

b) Embriologia

A maioria do trato genital feminino é de origem mesodérmica. As células germinais

são de origem endodérmica; a vulva e o epitélio dos terços médio e distal da vagina são de

origem ectodérmica. Os ductos mullerianos dão origem às trompas de falópio e à porção

superior da vagina

(5)

1.1 DOENÇAS DERMATOLÓGICAS VULVARES

A expressão distúrbios epiteliais não-neoplásicos da pele e da mucosa tem sido

utilizada para substituir a denominação: distrofia vulvar

(31)

. Em geral, tais condições

apresentam-se como lesões brancas da pele vulvar e acompanhada de intenso prurido

(2)

1.1.1 Líquen Escleroso

O acometimento do tecido vulvar caracteriza-se por placas, atrofia da pele e,

ocasionalmente, contratura dos tecidos vulvares

(32)

. A lesão tende a ser simétrica e

freqüentemente estende-se até as áreas perineal e perianal

(33)

. A faixa etária mais comumente

afetada é da meia-idade, porém podendo surgir em qualquer idade

(33)

. O prurido é o sintoma

mais comum e a dispaurenia também é freqüente

(32)

. Histologicamente ocorre hiperceratose,

achatamento ou perda das criptas interpapilares e uma zona homogênea acelular na derme

superior

(33)

. O tratamento clínico é feito com creme de testosterona a 2%, vulvectomias

superficiais pode ser usada em casos graves ou naqueles refratários à medicação

(34)

. As

recorrências são comuns após tratamento cirúrgico. Foi observado o desenvolvimento de

carcinoma numa pequena proporção de pacientes (cerca de 1 a 4%)

(33)

1.1.2 Hiperplasia Escamosa

O epitélio escamoso da vulva pode tornar-se hiperplásico (acantose) quando as cristas

interpapilares ficam aumentadas e confluentes. Muitas vezes, a hiperplasia escamosa é uma

reação inespecífica a irritantes da vulva

(32)

. O aspecto histológico demonstra infiltrado

inflamatório e atipias são ausentes. O epitélio espessado exibe um aumento acentuado da

queratina superficial (hiperceratose), o que confere um aspecto esbranquiçado à vulva

(33)

. O

prurido é o sintoma mais comum. As biópsias são necessárias para se fazer o diagnóstico e

excluir malignidade. O tratamento é a aplicação local de corticosteróide fluorado

(34)

1.1.3 Ceratoacantoma

Lesão de pele, geralmente solitária, de aspecto róseo ou avermelhado, com

protuberância central e depósito de queratina

(35)

. A sua localização vulvar é bastante rara

(35)

Estes tumores podem ocorrer em qualquer parte do corpo, mas freqüentemente desenvolvem-

se em áreas da pele expostas ao sol. Carcinógenos químicos e o HPV têm sido associados com

a etiologia dos ceratoacantomas de pele, mas o excesso de sol em áreas expostas tem sido o

fator mais freqüente nos casos relatados

(36)

. O pico de incidência é entre 50 e 69 anos de

idade. O diagnóstico diferencial com o carcinoma de células escamosas de vulva é de suma

importância, porque pode evitar um tratamento inapropriado. A ressecção cirúrgica local é o

tratamento preconizado

(35)

1.2 LESÕES CONDILOMATOSAS DA VULVA

1.2.1 Condiloma Acuminado

Tumor benigno e sexualmente transmissível que possui aspecto macroscópico

nitidamente verrucoso

(2,5)

. Embora possam ser solitários, os condilomas acuminados são mais

comumente múltiplos e com freqüência coalescem

(37)

. Afetam as regiões perineal, vulvar e

perianal, bem como vagina e colo uterino

(38)

. As lesões são idênticas àquelas encontradas no

pênis e ao redor do ânus em homens. Ao exame histológico, consistem numa proliferação

arboriforme e ramificada de epitélio escamoso estratificado, sustentado por estroma fibroso

(2)

Verifica-se presença de acantose, paraceratose, hiperceratose, atipia nuclear nas células

superficiais com vacuolização perinuclear (denominada coilocitose)

(5)

. Os condilomas são

causados por HPV, principalmente dos tipos 6 e 11

(10)

. O ciclo de vida do vírus termina no

epitélio, especificamente nas células superficiais maduras

(5)

. Os condilomas acuminados

regridem na maioria das vezes de maneira espontânea e não são consideradas lesões pré-

neoplásicas

(37)

2 LESÕES NEOPLÁSICAS DA VULVA

2.1 EPIDEMIOLOGIA

O câncer de vulva é uma doença rara, representando cerca de 3-5% do total das

neoplasias malignas do trato genital feminino, com uma prevalência típica em mulheres

idosas (65-75 anos de idade) e, raramente, visto em pacientes menores de 35 anos de

idade

(3,39)

O Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI), estima que serão

diagnosticados naquele país, cerca de 3870 novos casos no ano de 2005, ocasionando 870

mortes

(40)

Nas últimas décadas têm ocorrido um aumento no número de casos da doença, tanto

nos EUA quanto em centros urbanos do Brasil

(3,40,41)

. Este acréscimo tem sido notado tanto

nas lesões precursoras do câncer, neoplasias intra-epiteliais vulvares (NIV), como nos casos

de neoplasia invasora propriamente dita

(3,7,39)

. Neste último caso, dados recentes sugerem um

incremento maior do número de casos em mulheres jovens, com idade inferior a 50 anos

(40,42)

As possíveis explicações para este acréscimo incluem o aumento da expectativa de vida das

mulheres, o aumento de diagnósticos precoces, o estado de imunossupressão determinado por

doença ou medicamentos e o possível acréscimo da prevalência da infecção pelo papiloma

vírus humano (HPV)

(6,8,39,40,42)

No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, a cidade de Porto Alegre aparece

com destaque no cenário nacional com relação à taxa de incidência do câncer de vulva, ao

lado das cidades de Recife e Goiânia

(41)

. A Organização Mundial da Saúde (OMS) apontou no

ano de 1992 a cidade de Recife como uma das cidades com maior incidência de câncer vulvar

no mundo com uma taxa de 5,6/100.000 mulheres/ano

(43)

No ano de 1996 a cidade de Porto Alegre registrou uma incidência de câncer vulvar de

19 casos por 100.000 mulheres/ano e uma freqüência relativa de 0,87% dentre as neoplasias

malignas femininas, representando a mais alta taxa de neoplasia vulvar do país. Também

neste ano, a cidade de Recife apresentou 7 casos por 100.000 mulheres/ano de doença vulvar

e uma freqüência relativa de 0,43% da doença. A cidade de Goiânia no mesmo período

registrou 7 casos novos por 100.000 mulheres/ano e uma freqüência relativa da doença de

0,59%

(41)

No ano seguinte, ano de 1997, as taxas de novos casos foram 7 (0,30), 8 (0,46) e 14

(0,96) casos novos por 100.000 mulheres/ano e as suas freqüências relativas, respectivamente,

para Porto Alegre, Recife e Goiânia

(41)

No Hospital Santa Rita (HSR) que representa um Centro de Alta Complexidade em

Oncologia (CACON) e pertence ao Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, nos

últimos 10 anos (1992-2001) foram diagnosticados 146 novos casos de câncer invasor da

vulva (Tabela 1). Com uma média de 14,6 casos novos/ano para este período, sendo que

somente no ano de 1993 foram registrados 18 casos da doença

(44)

Tabela 1 - Incidência e média de idade dos casos de câncer de vulva no Hospital Santa Rita

(1992-2001)

Ano Casos (n) Idade (média) Desvio-padrão

1992 9 62 15,8

1993 18 60,6 13,7

1994 16 68,9 14,5

1995 15 67,5 18,7

1996-2001 88 66,2 14,8

Total 146 65,7 15,1

Fonte: Registro Hospitalar de Câncer - Hospital Santa Rita/2005

2.2 ASPECTOS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS

Evidências clínico-patológicas têm caracterizado dois grupos distintos de câncer de

vulva, um acometendo mulheres jovens e outro pacientes idosas

(6,10,13,42)

O primeiro grupo seria constituído por mulheres jovens com idade variando entre 35-

65 anos (pico etário: 55 anos) com diagnóstico prévio de neoplasia intra-epitelial vulvar

causada freqüentemente por infecção do HPV, geralmente de alto grau (tipos 16 e 18)

(6,42)

Em alguns casos, existindo a associação sincrônica ou metacrônica com a infecção pelo HPV

no colo uterino, vagina ou ânus, reforçando a idéia de um mecanismo patogênico

comum

(37,38)

. Outros possíveis fatores associados seriam a infecção pelo herpes genital e o

tabagismo

(6)

Do contrário, as pacientes idosas com idade entre 55-85 anos (pico etário: 77 anos)

teriam uma maior ligação com processos inflamatórios vulvares crônicos e a mutação do

p53

(6)

. Este grupo não teria sua doença relacionada a alterações neoplásicas intra-epiteliais e

sim, a processos inflamatórios crônicos repetitivos como o líquen escleroso e a hiperplasia

celular escamosa (distrofia vulvar mista)

(2,5,6,10)

. Teriam como expressão histológica células

escamosas tipo queratinizadas, ao invés, do tipo verrucoso e basalóide muitas vezes

encontrado no primeiro grupo

(2,5)

Tabela 2 - Modelo de Câncer Vulvar

Características Tipo 1 Tipo 2

Idade Jovem (35-65 anos)

Pico etário: 55 anos

Idosa (55-85 anos)

Pico etário: 77 anos

Neoplasia colo uterino Alta associação Baixa associação

Co-fatores Idade, imunidade, integração

viral

Atípia vulvar, possível

mutação de genes hospedeiros

(ex: mutação p53)

Histologia tumoral Basalóide, pouco diferenciado Queratinizado, carcinoma de

células escamosas, bem

diferenciado

HPV DNA Freqüente (60%) Raramente

Lesão vulvar prévia NIV Líquen escleroso, hiperplasia

celular escamosa, inflamação

vulvar

História de condilomatose Forte associação Rara associação

DST Forte associação Rara associação

Tabagismo Alta incidência Baixa incidência

Abreviações: HPV: papiloma vírus humano; NIV: neoplasia intra-epitelial vulvar; DST:

doença sexualmente transmissível.

Adaptado: Canavan TP, Cohen D.Vulvar cancer.Am Fam Physician 2002;66(7):1269-1274.

Al-Ghamdi A, Freedman D, Miller D, Poh C. Vulvar squamous cell carcinoma in young

women: A clinipathologic study of 21 cases. Gynecol Oncol 2002; 84:94-101.

2.3 A IDADE E AS NEOPLASIAS VULVARES

Em um passado recente as neoplasias vulvares acometiam quase que exclusivamente

mulheres idosas na sexta e sétima décadas de vida

(4)

. Muitas vezes, estavam relacionadas a

neoplasias avançadas fruto de um diagnóstico tardio, ocasionado pelo pudor e vergonha de

procurar assistência médica precoce

(10)

Recentes publicações demonstram que cresce o número de casos de neoplasias (NIV e

câncer) entre as mulheres jovens

(1,6,7,42)

. Atualmente existem evidências epidemiológicas que

nas últimas quatro décadas houve uma redução na média de idade entre os grupos de mulheres

portadoras de NIV e câncer

(1,7)

. Em um estudo comparativo entre uma mesma população de

mulheres com idade inferior a 50 anos acompanhada por 20 anos, revelou um acréscimo de 2

para 21% a incidência de câncer vulvar

(45)

As pacientes com idade inferior a 40 anos representam hoje 15% dos casos

diagnosticados de carcinoma invasor, sendo que em séries históricas da década de 70

representavam apenas 2-3% do total dos casos

(13,39)

2.4 NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL VULVAR

Na última década houve um aumento na freqüência das neoplasias intra-epiteliais

vulvares em mulheres com menos de 50 anos

(1,7)

. Acredita-se que isso se deva, possivelmente,

pelo aperfeiçoamento na detecção diagnóstica, mas também pode estar relacionada ao

aumento da incidência do HPV

(1,7,46)

A neoplasia intra-epitelial da vulva (NIV) representa um amplo espectro de alterações

que variam desde atípias celulares mínimas até alterações celulares mais acentuadas próximas

do câncer invasor

(1,2,46)

Nas mulheres jovens observa-se, cada vez mais, uma forma indiferenciada (clássica)

de NIV, algumas vezes denominada displasia verrucosa ou basalóide, comumente associada à

infecção pelo HPV

(1,2,5)

. Uma segunda forma de NIV, encontrada mais freqüentemente em

mulheres idosas, é mais diferenciada

(1,2,5,7)

. De uma maneira geral, acredita-se que as

neoplasias intra-epiteliais vulvares não tratadas podem evoluir para carcinoma invasor de

células escamosas após um tempo médio de 6-7 anos, mas o seu comportamento é baseado

apenas em estudos observasionais

(21,46)

Dessa forma, semelhante à neoplasia intra-epitelial cervical (NIC), a NIV pode ser

considerada uma lesão precursora do carcinoma escamoso de vulva, apesar de não tão

documentada como no colo uterino

(45,46)

A NIV apresenta um aspecto macroscópico variável. As lesões podem ser únicas ou

múltiplas, maculares, papulares ou semelhantes a placas

(1,7)

Microscopicamente, os graus são classificados em NIV I, II e III, correspondendo à

displasia leve, moderada e severa, segundo a nomenclatura da Organização Mundial da

Saúde

(47)

. Os critérios utilizados na graduação da NIV incluem: (1) tamanho e atípias

nucleares, (2) número e grau de mitoses atípicas e (3) perda da diferenciação citoplasmática

em relação à superfície epitelial

(5,47)

A evidência de atípias celulares no terço inferior da espessura epitelial constitui a NIV

I e a existência de atípia nos dois terços representa a NIV II. O grau III também inclui o

carcinoma in situ, onde o comprometimento ocupa mais de dois terços da totalidade da

espessura epitelial

(47)

Na forma indiferenciada, vista em mulheres jovens, o epitélio inteiro consiste em

células com núcleos atípicos e citoplasma insignificante. Mitoses, incluindo muitas formas

atípicas, são freqüentes

(46)

A forma mais diferenciada vista em mulheres idosas, mostra atípia confinada

principalmente à camada basal e parabasais com pérolas de queratina encontradas com

freqüência

(1)

. Esta última forma está mais comumente ligada ao carcinoma invasivo, porém

menos associada à infecção pelo HPV

(21)

A doença de Bowen, uma expressão ainda utilizada na literatura dermatológica, é

sinônimo de NIV III, mas é preferível que seja substituída por esta última

(47)

A neoplasia intra-epitelial vulvar, mesmo excisada localmente, recorre com freqüência

(25%), podendo progredir até carcinoma de células escamosas invasivo (9%)

(7,21,46)

. As

mulheres com NIV podem apresentar neoplasia escamosa em qualquer outro local do trato

genital inferior

(7)

2.5 CÂNCER DE VULVA

A grande maioria dos tumores malignos da vulva são do tipo carcinoma de células

escamosas (epidermóide)

(4,8,10,13)

. Outros tipos histológicos menos freqüentes são: melanomas,

sarcomas, doenças de Paget, carcinomas de células basais, adenocarcinomas e carcinomas de

células de Mekel

(4,13)

2.5.1 Carcinoma de Células Escamosas (Epidermóide)

Os casos de carcinoma de células escamosas representam 95% dos tumores malignos

da vulva

(10)

. No passado, acometia principalmente mulheres idosas (idade superior 65 anos),

mas atualmente ocorre com maior freqüência em mulheres mais jovens

(42,45)

. Uma possível

explicação para este fenômeno também seja o acréscimo de casos de neoplasias intra-epitelias

vulvares associados à infecção pelo HPV

(39,40,42)

Nestas neoplasias malignas são observadas mitoses, mas a queratinização atípica é a

característica histológica do câncer vulvar invasivo. A maioria dos carcinomas escamosos

vulvares mostra queratinização

(2)

. O carcinoma anaplásico pode ser constituído de grandes

células imaturas, de células em fuso ou de pequenas células. Estas últimas podem simular o

carcinoma anaplásico de pequenas células do pulmão ou tumor de células de Merkel

(5)

. As

características histológicas que se correlacionam com a ocorrência de metástases para os

linfonodos inguinais, na ordem de importância são: a invasão vascular, a espessura do tumor,

a profundidade da invasão do estroma e a quantidade aumentada de queratina

(4,8,48)

O carcinoma de células escamosas da vulva é predominantemente uma doença de

mulheres na pós-menopausa; a idade média no diagnóstico é de aproximadamente 65 anos

(8)

A maioria das pacientes apresenta-se com tumoração ou massa vulvar, embora

freqüentemente exista uma longa história prévia de prurido que pode ser causada por doença

dermatológica vulvar

(2)

. As manifestações clínicas menos comuns incluem o sangramento, o

corrimento ou a disúria

(10)

. Ocasionalmente, uma grande massa metastática na região inguinal

pode ser o sintoma inicial de apresentação

(13,49)

Ao exame físico, a lesão geralmente é elevada e pode ter o aspecto carnoso, ulcerado,

leucoplásico ou verrucoso. Cerca de dois terços dos tumores maiores são exofíticos, os outros

são ulcerativos e endofíticos

(19,20)

A maioria dos carcinomas escamosos de vulva ocorre nos

grandes lábios, mas os pequenos lábios, o clitóris e o períneo também podem ser locais

primários

(8)

. Aproximadamente 10% dos casos são muito extensos para se determinar o local

de origem e cerca de 5% dos casos são multifocais

(49)

O diagnóstico requer uma amostra de tecido com representatividade dos tecidos

profundos para uma adequada avaliação

(50)

. A demora do médico em indicar uma biópsia é

um problema comum no diagnóstico do câncer vulvar, particularmente se a lesão tiver aspecto

verrucoso

(10,12)

. Embora os condilomas isolados não exijam confirmação histológica para o

diagnóstico, qualquer lesão verrucosa confluente deve ser biopsiada antes de ser iniciado

tratamento clínico ou ablativo

(12)

Como parte da avaliação clínica, os linfonodos inguinais devem ser avaliados

cuidadosamente e deve ser realizado exame pélvico completo, devido a possibilidade de

associação com outra neoplasia epitelial escamosa do trato genital inferior

(6,8,49,50)

O câncer vulvar se dissemina pela seguintes vias: (1) extensão direta, envolvendo

estruturas adjacentes, tais como: a vagina, a uretra e o ânus (2) embolização linfática para os

linfonodos regionais (3) disseminação hematogênica para locais distantes, incluindo: o

pulmão, o fígado e os ossos

(4)

. Podem ocorrer metástases linfáticas no início da doença

(51)

Inicialmente, a disseminação se faz em geral para os linfonodos inguinais que estão

localizados entre a fáscia de Camper e a fáscia lata. A partir dos linfonodos inguinais

superficiais, a doença será disseminada para os linfonodos femorais que estão localizados ao

longo dos vasos femorais. O linfonodo de Cloquet, situado sob o ligamento inguinal, é o mais

profundo no grupo dos linfonodos femorais

(15,51)

. A partir dos linfonodos ínguino-femorais, o

câncer dissemina-se para os linfonodos pélvicos, particularmente o grupamento illíaco

externo. As metástases para os linfonodos pélvicos ocorrem em cerca de 9% dos casos

(10,15,51)

A Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) adotou o sistema de

estadiamento da Classificação dos Tumores Malignos (TNM) em 1969

(4)

. No ano de 1995 o

estadiamento da doença passou de clínico para cirúrgico

(52)

Após os trabalhos pioneiros de Taussig nos Estados Unidos e de Way na Grã-

Bretanha, a vulvectomia radical em bloco e a dissecção bilateral dos linfonodos inguinais e

pélvicos tornou-se o tratamento padrão para o câncer vulvar operável

(4,10,50)

. A abordagem

moderna para o tratamento das pacientes com carcinoma inicial da vulva deve ser

individualizada, não existindo tratamento “padrão” aplicável a todos os casos. A realização da

cirurgia mais conservadora possível deve ser compatível com a cura da doença

(50)

. A

aplicabilidade da pesquisa do linfonodo sentinela no câncer de vulva parece ser promissora,

porém reservada somente aos casos iniciais (tumores menores que 2 cm) e sem adenopatia

inguinal clínica

(13,15)

. As ressecções conservadoras com preservação do clitóris também

ganham espaço, principalmente no tratamento cirúrgico de mulheres jovens

(14)

. DiSaia e cols.

consideraram os distúrbios psicossexuais como a principal morbidade a longo prazo associada

ao tratamento do câncer vulvar

(4)

A radioterapia, com ou sem a adição de quimioterapia concomitante, tende a

desempenhar papel cada vez mais importante no tratamento das pacientes com câncer

vulvar

(8,10,13,50)

. As indicações de tratamento radioterápico estão relacionadas ao tamanho

tumoral, ao comprometimento linfonodal, margens cirúrgicas e recidiva da doença

(53)

. O

tratamento quimioterápico pode ser oferecido para os casos de metástases à distância

(50)

2.5.2 Carcinoma Verrucoso

O carcinoma verrucoso é uma variante do carcinoma de células escamosas e possui

características clínicas e patológicas distintas

(2,4,10)

. Embora mais comumente encontradas na

cavidade oral, as lesões verrucosas podem ser encontradas em qualquer membrana úmida

composta de epitélio escamoso. Macroscopicamente, os tumores possuem aspecto semelhante

a uma “couve-flor”; microscopicamente, eles contêm múltiplas frondes papilares que não

possuem o centro de tecido conjuntivo que caracteriza os condilomas acuminados

(2,5)

. O

tumor é muito bem diferenciado, sendo composto por grandes ninhos de células escamosas

com citoplasma abundante e núcleos pequenos. São comuns as pérolas escamosas e as

mitoses são raras. O tumor invade com prolongamentos amplos a interface estromal e

freqüentemente exibe um infiltrado intenso de linfócitos e plasmócitos

(54)

. As características

macro e microscópicas do carcinoma verrucoso são muito semelhantes as do condiloma

gigante de Buschke-Lowenstein

(10)

. È necessária uma biópsia adequada da base da lesão, a

fim de diferenciar o carcinoma verrucoso do condiloma acuminado benigno

(54)

. A presença do

HPV do tipo 6, tem sido freqüentemente identificada. O carcinoma verrucoso invade

localmente, mas, de forma típica, não dá metástases

(17,54,55)

2.5.3 Melanoma Maligno

Os melanomas vulvares são raros, embora sejam a segunda neoplasia maligna vulvar

mais comum (5%)

(3)

. A maioria origina-se primariamente, mas podem originar-se de um nevo

juncional pré-existente

(56)

. A grande maioria das pacientes tem idade superior a 50 anos, mas

ocasionalmente pode ser encontrado em mulheres jovens

(57)

. Ocorrem predominantemente em

mulheres brancas na pós-menopausa, mais comumente nos grandes lábios ou no clitóris. A

incidência de melanomas cutâneos em todo o mundo está aumentando

significativamente

(3,10,57)

. A maioria das pacientes com melanoma vulvar não possui sintomas,

exceto pela presença de uma lesão pigmentada que pode estar aumentando

(56)

. Algumas

pacientes apresentam prurido ou sangramento

(56)

. Há três tipos histológicos básicos. O mais

comum é o melanoma difuso superficial, que tende a permanecer relativamente superficial no

início de seu desenvolvimento

(56,57)

. O melanoma lentigo maligno é uma lesão plana, que pode

tornar-se muito extensa, mas também tende a ser superficial

(2,56,57)

. A lesão mais agressiva é o

melanoma nodular que é uma lesão elevada que penetra profundamente e pode metastatizar

amplamente

(57)

2.5.4 Sarcoma

Os sarcomas representam 1-2% das neoplasisas malignas vulvares e constituem um

grupo heterogêneo de tumores

(58,59)

. Os leiomiossarcomas são os mais comuns e outros tipos

histológicos incluem: os fibrossarcomas, os neurofibrossarcomas, os lipossarcomas, os

rabdomiossarcomas, os angiossarcomas, os sarcomas epitelióides e os Schawannomas

malignos

(58)

. Os leiomiossarcomas geralmente apresentam-se como massas com crescimento

progressivo, freqüentemente dolorosas, geralmente no grande lábio. Esses tumores geralmente

são grandes, com margens infiltrativas, atipia celular e com pior prognóstico

(58,59)

2.5.5 Doença de Paget

Neoplasia rara caracterizada pela presença de células claras, grandes e intra-

epiteliais

(2)

. Recebe esse nome por causa dos tumores de aspecto semelhante no mamilo e em

pontos extra-mamários, como axila e a região perianal. Em geral, o distúrbio ocorre nos

grandes lábios em mulheres idosas

(60,61)

. As mulheres com doença de Paget da vulva queixam-

se de prurido e de sensação de queimação de maneira crônica

(4)

. A lesão da doença de Paget é

grande, vermelha, úmida e bem demarcada. A célula de Paget típica apresenta um citoplasma

pálido e vacuolizado, que contém glicosaminoglicanos e cora-se pelo ácido periódico de

Schiff (PAS) e mucicarmina

(2,5)

2.5.6 Carcinoma de Células Basais

Os carcinomas de células basais representam cerca de 2% dos cânceres vulvares

(62,63)

Como em outros carcinomas de células basais, as lesões vulvares comumente surgem como

uma “úlcera de roedor” com bordas reviradas, embora nódulos e máculas sejam outras

variedades morfológicas. A maioria das lesões mede menos de 2 cm de diâmetro e geralmente

esta situada nos grandes lábios. Ocasionalmente, hã lesões gigantes. Estas geralmente afetam

mulheres brancas na pós-menopausa e são localmente agressivas

(2,5,8,10)

. A excisão local

radical geralmente é o tratamento adequado

(62,63)

Cerca de 3-5% dos carcinomas de células basais contêm um componente escamoso

maligno, o denominado carcinoma basoescamoso. Estas lesões são mais agressivas e devem

ser tratadas como carcinomas escamosos

(63)

. Outro subtipo de carcinoma de células basais é o

carcinoma de células basais adenóide, que deve ser diferenciado do carcinoma adenóido-

cístico mais agressivo que se origina da glândula de Bartholin ou na pele

(2,63)

2.5.7 Adenocarcinoma

Os casos de adenocarcinomas da vulva geralmente originam-se na glândula de

Bartholin ou ocorrem em associação com a doença de Paget. Raramente, podem originar-se

de apêndices cutâneos, glândulas parauretrais, glândulas vestibulares, tecido mamário

ectópico ou endometriose

(60,64)

2.5.8 Carcinoma de Células de Merkel

Os carcinomas de células de Merckel são carcinomas de pequenas células primários da

pele, que se assemelham a carcinomas de pequenas células do pulmão. Representa uma

entidade bastante rara

(65)

2.6 O CICLO CELULAR

O ciclo celular normal apresenta uma série ordenada de eventos: fase 1 (G1 ou

interfase), síntese (S), fase 2 (G2), mitose (M) e repouso (G0) que determinarão a obtenção de

linhagens celulares semelhantes. O tempo do ciclo celular da maioria das células é de 24 a 48

horas. A grande maioria das células maduras está em estado de repouso no ciclo celular. Isto é

proporcionado por um estado de equilíbrio entre fatores de crescimento estimuladores e

inibidores existentes no microambiente celular

(2,5)

A sua progressão pelas diferentes etapas do ciclo é regulada por uma seqüência de

ativação e inativação de várias ciclínas-quinases dependentes (CDKs-Cyclin-Dependent

Kinases) e ciclinas específicas

(5)

. Além disso, existem pontos de checagem (checkpoints),

entre as etapas celulares para determinar se não existem danos celulares que comprometam a

síntese do DNA. Neste momento, a célula pode ser levada a apoptose (morte celular

programada) ou continuar no ciclo celular

(9,18,20)

O complexo ciclina D/cdk ativado inicia os processos necessários para a síntese do

DNA por meio da ativação do fator de transcrição E2F. Esse fator encontra-se normalmente

associado à proteína do retinoblastoma (pRb), sendo o complexo E2F/pRb inibidor da

replicação do DNA. Os complexos ciclina D1/cdk4 e 6, ciclinaD2/ e D3/cdk2, 4 e 6 e ciclina

E/cdk2 fosforilam sucessivamente a proteína Rb, que, hiperfosforilada, libera fatores de

transcrição (como o E2F) que ativam os genes necessários para a fase S. Esses genes incluem

os que regulam a síntese das enzimas necessárias para a formação dos nucleotídeos e os que

regulam a síntese das proteínas do DNA

(2,5,9,18,20,22)

2.7 AS PROTEÍNAS p16 E p53

Os genes supressores de tumor estão envolvidos no controle de pontos estratégicos da

cadeia de eventos relacionados ao crescimento e à diferenciação celular, evitando proliferação

celular descontrolada. Alguns genes controlam diretamente o ciclo celular, inibindo os

complexos ciclinas/cdk (p53, p16, p27) ou os fatores de crescimento por eles estimulados

(pRb)

(18,20,22,23)

Ao contrário dos oncogenes, que dependem apenas de uma cópia ativa do gene para

manifestar o fenótipo (ação dominante), os genes supressores tumorais precisam ter os dois

alelos afetados para induzir o câncer (comportamento recessivo). Em geral, a perda de uma

cópia do gene decorre de mutação, enquanto a segunda cópia é perdida por deleção do outro

alelo. A perda ou defeito de um alelo do gene supressor tumoral pode ser herdada ou

adquirida. O indivíduo heterozigoto para o gene não tem neoplasia, mas apresenta risco maior

de desenvolver um câncer. A neoplasia somente se instala ocorrendo perda do outro alelo,

quando existe uma homozigose ou que houve perda da heterozigose

(23,24,30,66,67)

A proteína p16, originária do gene supressor tumoral CDKN2A (INK4A) localizado

no cromossoma 9p21, desempenha um papel regulador do ciclo celular, inativando o ciclo

celular por inibição dos complexos ciclinas D/CDK4 e 6

(9,18,23)

. A mutação ou deleção do

gene p16(INK4) pode afetar o balanço entre a p16 e as ciclinas D resultando em um

crescimento anormal das células (oncogênese)

(18)

. As mutações de p16 em linhagens

germinativas estão associadas a um subgrupo de melanomas hereditários

(24,56)

. A deleção ou a

inativação somática adquirida do p16 é observada em casos de carcinoma de pâncreas,

carcinoma de esôfago, glioblastomas e carcinoma de pulmão do tipo pequenas células

(2)

O gene supressor tumoral p53, localizado no cromossoma 17p13, é uma das mais

freqüentes alterações genéticas observadas em tumores humanos

(26,28,30)

. Na grande maioria

dos casos são mutações que originam uma cadeia polipetidica modificada ou deleções do

gene. Como regra geral, o fenótipo neoplásico manifesta-se somente quando hã perda dos dois

alelos do gene, que pode se dar da forma herdada ou adquirida

(30)

O papel desempenhado pelo p53 reside na detecção de lesão do DNA (mecanismos

desconhecidos) e seu reparo, determinando interrupção do ciclo celular na fase G1 ou

iniciando o processo de apoptose

(26,28,30,66,67)

Recentes estudos sugerem o aumento da expressão da proteína p53 como um

importante evento preditor de desenvolvimento de neoplasia intra-epitelial vulvar (lesões

precursoras vulvares) recorrente ou na progressão para carcinoma de células escamosas de

vulva

(7,21)

Tabela 3 - Trabalhos na literatura que avaliaram a imuno-expressão dos marcadores p16 e

p53 em casos de carcinoma de vulva

Autor Casos (n) p16 positivo p53 positivo

Chan (1998) 32 37% (12/32) NA

Knopp (2004) 224 31% (69/224 ) NA

Santos (2004) 45 22% (10/45) 53% (24/45)

Abreviatura: NA: não avaliado.

2.8 O PAPEL DO HPV

Uma quantidade substancial de evidências clínicas e laboratoriais apóia fortemente a

visão de que a infecção pelo HPV está também envolvida na patogenia da NIV e do

carcinoma vulvar

(22,37,48,68)

Entretanto, em contraste com o câncer de colo uterino, onde o HPV é encontrado em

mais de 95% dos casos o câncer de vulva apresenta uma taxa global de infecção para o HPV

de somente 30-40% dos caso

(18,20)

. s. Além disso, a possível não associação entre tipos de

HPV de alto risco, doença recorrente ou invasora têm sido freqüentemente observada

(21,48,68)

Na neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau, a regulação viral do HPV é rompida e

no câncer cervical, o genoma viral é integrado ao genoma celular, resultando em

transformação da célula hospedeira

(18,20)

. O mecanismo de ação do produto dos genes E6 e E7

ainda não foram completamente esclarecidos, mas há fortes indícios que a ação ocorra por

meio de interação com proteínas reguladoras do ciclo celular. Em particular, foi demonstrado

que o E6 liga-se à proteína p53 e o E7 à proteína Rb (proteína do gene do retinoblastoma)

liberando o ciclo para replicação

(18,20,38)

Os oncogenes E6 e E7 do HPV 16 apresentam funções de transformação in vitro, que

podem estar relacionadas com a inativação de produtos de supressão tumoral dos genes p53 e

p16, respectivamente

(9,16,17,18,20,21,22,23,25,26,28)

Possivelmente o mecanismo de ação do HPV relacionado ao aumento da imuno-

expressão do p16 esteja ligado à oncoproteína E7 que inativa a proteína do retinoblastoma,

determinando a perda do feedback negativo da pRb fosforilada. Além disso, a proteína E7 se

liga à pRb no mesmo sítio de ligação do fator E2F; com isso, este fica livre (“não-

sequestrado”) e atua no DNA celular, estimulando a mitose. Também ao se ligar à p53, a E6

bloqueia a atividade transcritora da p53 sobre genes pró-apoptóticos

(21,26,28,30,61,66)

O aumento da imuno-expressão do p16 tem sido visto em lesões pré-malignas e

carcinomas relacionados à infecção pelo HPV, tais como no colo uterino, cavidade oral, ânus

e mais recentemente, na vulva

(9,16,17,18,22,23,24,25)

3 OBJETIVOS

3.1 PRINCIPAL

- Determinar a expressão imuno-histoquímica dos marcadores p16 e p53 em casos de

neoplasia intra-epitelial vulvar e carcinoma invasor de células escamosas de vulva,

diagnosticados no Laboratório de Anatomia Patológica do Complexo Hospitalar Santa Casa

de Porto Alegre;

3.2 SECUNDÁRIO

- Correlacionar a expressão imuno-histoquímica com a idade (inferior e superior a 55

anos) nas mulheres com diagnóstico de carcinoma invasor de células escamosas de vulva.

4 JUSTIFICATIVA

A melhor compreensão do padrão imuno-histoquímico das proteínas p16 e p53 nas

neoplasias vulvares de uma população de mulheres do estado do Rio Grande do Sul, desperta

especial interesse devido à cidade de Porto Alegre ter registrado nos últimos anos uma

crescente prevalência de câncer vulvar.

Deste modo, uma análise detalhada do seu comportamento neoplásico (características

imuno-histoquímica e histológica) poderá ser um forte aliado no tratamento precoce de lesões

precursoras, na prevenção da doença invasora e no melhor entendimento da sua história

natural.

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EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES P16 E P53 EM

CASOS DE NEOPLASIA INTRA-EPITELIAL VULVAR E CARCINOMA

INVASOR DE VULVA

Programa de Pos-Graduação em Patologia da Fundação Faculdade Federal de Ciências

Médicas de Porto Alegre.

Laboratório de Patologia do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre

Maurcio Cordoni Nogueira

Cláudio Galleano Zettler

RESUMO

Introdução: Nos últimos anos, a neoplasia intra-epitelial vulvar (NIV) e o carcinoma

de células escamosas (CCE) de vulva têm sido objeto de especial interesse, devido a sua

crescente prevalência e seu distinto comportamento clínico-patológico entre mulheres jovens

e idosas. Recentes publicações apontam o importante papel das proteínas p16 e p53 no ciclo

celular e seu envolvimento na oncogênese de diversos tumores do trato genital feminino, bem

como, sua possível relação prognóstica.

Objetivos: O objetivo do estudo é determinar a imuno-expressão dos marcadores p16

e p53 em peças de neoplasia intra-epitelial vulvar (NIV) e carcinoma invasor (CCE) de uma

amostra de mulheres tratadas em um único centro hospitalar de Porto Alegre (Brasil). Além

disso, associar os casos com imuno-histoquímica positiva para os marcadores p16 e p53 com

a idade (inferior e superior a 55 anos) no grupo carcinoma invasor (CCE).

Material e Métodos: Estudo transversal, retrospectivo e prospectivo com 77 amostras

de tecido vulvar, tratados cirurgicamente no Complexo Hospitalar Santa Casa, no período de

junho de 2000 a novembro de 2004. O estudo imuno-histoquímico foi conduzido nos casos

classificados histologicamente como neoplasia intra-epitelial vulvar (n=28), carcinoma

invasor de vulva (n= 37) e casos controle (n= 12).

Resultados: A porcentagem de positividade imuno-histoquímica para o p16 foi assim

distribuída entre os grupos: NIV: 21,4% (6/28), câncer: 24,3% (9/37) e controle:

ausente.(p=0,202) O marcador p53 foi imuno-expresso da seguinte maneira: NIV: 60,7%

(17/28), câncer: 18,9% (7/37) e controle: 8,3% (1/12).(p=0,01) A imuno-expressão para a

proteína p16 no grupo câncer (média idade: 63,4) foi encontrada em 9 casos (24,3%, 9/37),

sendo positivo em 6 casos do grupo de jovens (idade inferior a 55 anos) e apenas 3 casos nas

mulheres com idade superior a 55 anos (54,5% versus 11,5%, p= 0,01). A positividade do p53

não foi observada nas mulheres jovens com câncer e foi expressa em 7 casos no grupo de

mulheres acima de 55 anos (26,9%, 7/26, p=0,08).

Conclusão: A imuno-expressão das proteínas p16 e p53 parece ser um importante

marcador na avaliação do comportamento das lesões neoplásicas vulvares. Nossos resultados

sugerem uma forte correlação entre o aumento da expressão imuno-histoquímica da proteína

p16 na presença de carcinoma invasor de vulva em mulheres jovens (idade inferior a 55 anos)

e possivelmente associado a uma baixa expressão do p53.

Palavras-chaves: Vulva, Carcinoma de células escamosas, Neoplasia intra-epitelial,

Imuno-histoquímica, p16, p53.

INTRODUÇÃO

O câncer de vulva é uma doença rara, representando cerca de 3-5% do total das

neoplasias malignas do trato genital feminino, com uma prevalência típica em mulheres

idosas (65-75 anos de idade) e, raramente, visto em pacientes menores de 35 anos de

idade

(1,2)

O Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI), estima que serão

diagnosticados naquele país, cerca de 3870 novos casos no ano de 2005, ocasionando 870

mortes

(3)

Nas últimas décadas têm ocorrido um aumento no número de casos da doença, tanto

nos EUA quanto em centros urbanos do Brasil

(1,2,4)

. Este acréscimo tem sido notado tanto nas

lesões precursoras do câncer, neoplasias intra-epiteliais vulvares (NIV), como nos casos de

neoplasia invasora propriamente dita

(5,6)

. Neste último caso, dados recentes sugerem um

incremento maior do número de casos em mulheres jovens, com idade inferior a 55 anos

(7)

As possíveis explicações para este acréscimo incluem o aumento da expectativa de

vida das mulheres, o estado de imunossupressão determinado por doença ou medicamentos e

o possível acréscimo da prevalência da infecção pelo papiloma vírus humano (HPV)

(8,9)

No Brasil, a cidade de Porto Alegre aparece com destaque no cenário nacional com

relação à taxa de incidência do câncer de vulva, ao lado das cidades de Goiânia e Recife

(3)

. A

Organização Mundial da Saúde (OMS) apontou no ano de 1992 a cidade de Recife como uma

das cidades com maior incidência de câncer vulvar no mundo com uma taxa de 5,6/100.000

mulheres/ano

(10)

No ano de 1996 a cidade de Porto Alegre registrou uma incidência de câncer vulvar de

19 casos por 100.000 mulheres/ano e uma freqüência relativa de 0,87% dentre as neoplasias

malignas femininas, representando a mais alta taxa de neoplasia vulvar do país. Também

neste ano, as cidades de Goiânia e Recife apresentaram uma taxa de 7 casos por 100.000

mulheres/ano da doença e uma freqüência relativa da doença de 0,59% e 0,43%,

respectivamente

(3)

Evidências clínico-patológicas têm caracterizado dois grupos distintos de carcinoma

de células escamosas (CCE) de vulva

(8,11)

. O primeiro grupo constituído por mulheres jovens

de 35-65 anos (pico etário: 55 anos) com diagnóstico prévio de neoplasia intra-epitelial vulvar

causada freqüentemente por infecção do papiloma vírus (HPV), geralmente de alto grau (tipos

16 e 18)

(12,13)

. Em alguns casos, existindo a associação sincrônica ou metacrônica com a

infecção pelo HPV no colo uterino, vagina ou ânus, reforçando a idéia de um mecanismo

patogênico comum

(14,15)

O segundo grupo seria formado por mulheres idosas de 55-85 anos (pico etário: 77

anos) que teriam uma maior ligação com processos inflamatórios vulvares crônicos e a

mutação do p53

(8,11)

. Não teriam sua doença relacionada a alterações neoplásicas intra-

epiteliais e sim, a processos inflamatórios crônicos repetitivos como o líquen escleroso e

hiperplasia celular escamosa (distrofia vulvar mista)

(9,11)

. Teriam como expressão histológica

células escamosas tipo queratinizadas, ao invés, do tipo verrucoso e basalóide muitas vezes

encontrado no primeiro grupo

(9,11,15)

Entretanto, em contraste com o câncer de colo uterino, onde o HPV é encontrado em

mais de 95% dos casos

(15)

. O câncer de vulva apresenta uma taxa global de infecção para o

HPV de somente 30-40% dos casos

(16)

O ciclo celular é regulado por uma seqüência de ativação e inativação de várias

ciclínas-quinases dependentes (CDK) em diferentes estágios do ciclo celular. Além disso,

existem pontos de checagem (checkpoints), entre as etapas celulares, para certificar se não

existe qualquer tipo de dano celular que comprometa a síntese de DNA. Neste momento, a

célula pode ser levada a apoptose (morte celular programada) ou continuar no ciclo celular

(17)

A passagem de G1 para S é determinada, entre outros eventos, pela ação da ciclina D e das

CDKs 4 e 6. Na fase G1 a ligação entre a ciclina D e CDK4 ou CDK6 irá fosforilar a proteína

do retinoblastoma (pRB). Este evento irá determinar a liberação do E2F, fator de transcrição

de genes essenciais à síntese de DNA desencadeando a replicação do DNA e progressão para

a fase S

(17,18)

O gene supressor tumoral p16(INK4A) desempenha um papel regulador do ciclo

celular, inativando a sua progressão por inibição dos complexos ciclinas D/CDK4 e 6

(17,19)

. A

mutação ou deleção do gene p16(INK4) pode afetar o balanço entre a proteína p16 e as

ciclinas D resultando em um crescimento anormal das células (oncogênese)

(18,20)

. O aumento

da imuno-expressão do p16 tem sido visto em lesões pré-malignas e carcinomas relacionados

à infecção pelo HPV, tais como no colo uterino, cavidade oral, ânus e mais recentemente, na

vulva

(18,19,20,21)

O gene p53, localizado no cromossoma 17p13, é uma das mais freqüentes alterações

genéticas observadas em tumores humanos. O papel desempenhado pelo p53 reside na

detecção de lesão do DNA (mecanismos desconhecidos) e seu reparo, determinando

interrupção do ciclo celular na fase G1 ou iniciando o processo de apoptose

(22,23)

. O aumento

da expressão imuno-histoquímica da proteína p53 tem sido associado com o desenvolvimento

de neoplasia intra-epitelial vulvar recorrente e com progressão para carcinoma invasor de

vulva, geralmente em tecidos não infectados pelo HPV

(24)

Este estudo foi desenhado para analisar a imuno-expressão dos marcadores p16 e p53

em peças de neoplasia intra-epitelial vulvar (NIV), carcinoma invasor (CCE) e tecido vulvar

sem evidência de lesão de uma amostra de mulheres tratadas em um único centro hospitalar

de Porto Alegre (Brasil). Além disso, avaliamos a possível associação entre a expressão

imuno-histoquímica positiva dos marcadores p16 e p53 com a idade (inferior e superior a 55

anos) do grupo carcinoma invasor (CCE) de vulva.

1 MATERIAL E MÉTODOS

Foram selecionadas retrospectivamente 77 peças de tecido no Laboratório de Patologia

do Complexo Hospitalar Santa Casa, no período de junho de 2000 a novembro de 2004. A

classificação histológica se distribuiu da seguinte forma: 28 casos neoplasia intra-epitelial

vulvar (NIV I: 14, NIV II: 4 e NIV III: 10 casos), 37 casos de carcinoma invasor de células

escamosas e 12 casos epitélio escamoso vulvar normal. O tratamento cirúrgico da população

estudada foi de 35 casos de vulvectomia radical, 2 casos de hemi-vulvectomia, 28 casos de

excisão local e 12 casos de biópsias incisionais.

A presença de um registro primário, no nosso banco de dados, com diagnóstico de

carcinoma de células escamosas de vulva ou neoplasia intra-epitelial vulvar tornavam o caso

elegível para o estudo. Os seguintes critérios de exclusão foram considerados: 1) discordância

entre o laudo anátomo-patológico revisado pelos pesquisadores e o emitido historicamente,

bem como, a não localização do bloco de parafina em nossos arquivos. 2) laudos

anatopatologicos que não constaram tumor residual na peça operatória, 3) casos de recidiva

neoplásica, e 4) pacientes submetidas à quimioterapia e a radioterapia pré-operatória.

Os 12 casos controle, epitélio escamoso vulvar normal, foram prospectivamente

selecionados de mulheres submetidas à cirurgia de perineoplastia, produto de uma amostra de

tecido vulvar. Os critérios de inclusão no grupo controle eram a ausência de história clínica

prévia de infecção por HPV (vulvar, cervical e anal) e ausência de lesão macroscópica vulvar.

As pacientes voluntariamente assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido para

participarem do estudo, conforme regulamentação prévia no comitê de ética em pesquisa da

instituição (parecer nº 866/04).

Todos os espécimes histológicos foram revisados por um dos autores do projeto

(CGZ) que não teve acesso a qualquer tipo de informação clínica prévia. As neoplasias foram

classificadas e graduadas segundo recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS)

e do Colégio Americano de Patologistas (CAP-Protocolo de revisão/2005)

(25)

1.1. IMUNO-HISTOQUÍMICA

Os tecidos armazenados em blocos de parafina e embebidos em formol a 10% foram

seccionados (5µm espessura), desparafinados em temperatura de 60°C (estufa) durante 30

min. e em seguida usado: xileno (2 x 5 min.), passado em concentrações alcoólicas

decrescentes (absoluto, 90%, 70% e 50%) e lavado em água destilada. A recuperação

antigênica foi realizada com o aquecimento até 92°C em banho-maria com solução de citrato

(pH: 6,0) pelo período de 40 minutos, após foram deixados resfriar por 20 minutos em

temperatura ambiente e lavados com água destilada. O bloqueio da peroxidase endógena

utilizou-se solução de metanol (95 ml) mais (5ml) água oxigenada 30vol., 2 x 10 min.

(protegido da luz). Em seguida lavado em água destilada e lavado em PBS (Phosphate-

Buffered Saline) por 2 x 5 min. O bloqueio das ligações inespecíficas foi obtido com a

incubação com uma solução de proteína inócua (DAKO®-Protein Block Serum-Free, EUA) à

amostra por 30 min. O anticorpo primário foi aplicado (overnight) a 4°C na geladeira.

Lavados em PBS por 2 x 5 min. e aplicado o anticorpo p53 diluição 1:200 (DAKO®-Anti-

Human p53 Protein, Clone DO-7, EUA) e o anticorpo p16 diluição 1:200 ( NEOMARKES®-

p16 INK4a/MTS1, Mitotie/Supressor Protein, AB-4 Clone 16P04, EUA). Incubado com

anticorpo secundário biotinilado (DAKO®, Ely, USA) por 40 min. à temperatura ambiente e

após lavado em PBS (2 x 5 min.) e novamente incubado com o complexo biontina-peroxidase

(DakoCytomation®, Kit LABS/System-HRP, EUA) por 40 min. à temperatura ambiente,

lavado em PBS (2 x 5 min.) e revelado com substrato cromógeno (DAB) numa distribuição de

60mg de DAB em 100ml de PBS e 1ml de água oxigenada 30vol.(durante 5 min). Em seguida

lavado em água corrente e destilada, desidratado e montado em lâminas.

A imuno-expressão do p16 e p53 foi calculada com base na coloração apresentada na

média de 10 campos microscópicos com uma magnificação de 400x, sendo o resultado

expresso em porcentagem.

A positividade da imuno-expressão para o marcador p16 foi considerada a partir de

5% das células nucleares e citoplasmáticas coradas. As amostras de tecido para evidência do

p53, com coloração apenas nuclear, foram consideradas positivas com expressão igual ou

superior a 25% das células

(26)

. O controle positivo para o marcador p53 foi um caso de

carcinoma ductal infiltrante de mama e para o p16 utilizamos um caso de carcinoma de

células escamosas (epidermóide) de colo uterino, dos arquivos do laboratório.

1.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada com o teste t de student e exato de Fisher, variáveis

categóricas e contínuas, para testar associações entre os marcadores p16 e p53. O nível de

significância adotado foi de 0,05. Os dados foram analisados e processados no programa

Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, EUA) versão 10.1.

2 RESULTADOS

Um total de 77 amostras de tecido vulvar (grupo NIV: 28, grupo câncer: 37, grupo

controle: 12) foram avaliadas quanto a imuno-expressão para os marcadores p16 e p53. Os 28

casos com diagnóstico de neoplasia intra-epitelial vulvar foram distribuídos pelo seu grau

histológico em: NIV I: 14, NIV II: 4 e NIV III: 10.

A distribuição das médias de idades dos grupos estudados (NIV, câncer e controle)

demonstrou uma semelhança entre o grupo controle e o câncer.(Gráfico 1) A maior média de

idade entre os grupos foi constatada no grupo câncer (média idade: 63,64), tendo sido

observado 6 pacientes com idade inferior a 40 anos.(Tabela 1)

Os 12 casos controles não apresentaram positividade (ausência de imuno-expressão

nas células) para o marcador p16 e apenas em um caso a imuno-histoquímica foi considerada

positiva (imuno-expressão ≥25% nuclear) para a proteína p53 (8,3%, 1/12).

A análise estatística foi realizada entre os três grupos (NIV, câncer e controle) quanto

à positividade para os marcadores p16 e p53.(Tabela 2) O grupo NIV teve uma expressão

imuno-histoquímica positiva (imuno-expressão ≥5% das células) para a proteína p16 em 6

casos (21,4%, 6/28, p=0,202) e 17 casos positivos para a proteína p53 (60,7%, 17/28,

p=0,001). Não houve uma diferença estatisticamente significativa de imuno-expressão para o

p16 ou p53 com relação aos graus histológicos das NIV I, II e III.(Tabela 3) O grupo câncer

apresentou uma positividade para a proteína p16 em 9 casos (24,3%, 9/37, p=0,202) e para o

p53 em 7 casos (18,9%, 7/37, p=0,001).(Tabela 2)

Entre as peças de NIV III tivemos um caso de uma paciente com 42 anos com extensa

lesão vulvar (aspecto histológico basalóide) e doença cervical sincrônica com diagnóstico de

carcinoma in situ. A análise do p16 revelou forte imuno-expressão (superior a 50% das

células citoplasmáticas e nucleares) e ausência de imuno-expressão do p53.

A divisão etária do grupo câncer (idade inferior e superior a 55 anos) e sua associação

com a positividade imuno-histoquímica para o p16 revelou a presença de 6 casos de mulheres

jovens (Tabela 4) e 3 casos com idade superior a 55 anos (54,5% versus 11,5%, p=0,011). A

positividade do p53 não foi observada nas mulheres jovens com câncer e foi expressa em 7

casos no grupo de mulheres acima de 55 anos (26,9%, 7/26, p=0,08).

3. DISCUSSÃO

A história natural da NIV e o seu exato potencial biológico em relação a carcinogênese

ainda não estão bem estabelecidos

(27)

. Estudos de revisão da literatura têm demonstrado que

as lesões intra-epiteliais, em pacientes jovens, podem apresentar um comportamento

estacionário ou de regressão espontânea. Ao contrário, as mulheres idosas têm uma tendência

à progressão para invasão tecidual

(5,24,27,28)

Um recente estudo demonstrou a associação da positividade da imuno-expressão para

o p16 com a presença do HPV de alto-risco (tipo 16) em casos de NIV e de CCE de vulva,

apresentando um valor preditivo positivo de 97% e 95%, respectivamente. Sugerindo que o

aumento da imuno-expressão da proteína p16 pode ser um importante preditor de infecção por

HPV nos tecidos neoplásicos vulvares

(29)

Possivelmente o mecanismo de ação do HPV relacionado ao aumento da imuno-

expressão do p16 esteja ligado a oncoproteína E7 que inativa a proteína do retinoblastoma,

determinando a perda do feedback negativo da pRb fosforilada. Além disso, a proteína E7 se

liga à pRb no mesmo sítio de ligação do fator E2F; com isso, este fica livre (“não-

sequestrado”) e atua no DNA celular, estimulando a mitose

(19,21)

A mutação do gene p53 tem sido relacionada ao aumento da expressão imuno-

histoquímica da proteína p53 nos tecidos neoplásicos, representando um produto nuclear sem

função e com tempo de meia-vida prolongado

(22,23,24,30)

Um estudo que incluiu uma amostra de mulheres com diagnóstico de NIV III e foram

acompanhadas prospectivamente para avaliação de recidiva, após tratamento cirúrgico local,

demonstrou que a mutação do gene p53 pode desempenhar um importante papel

prognóstico

(24)

. O aumento da imuno-expressão do p53 estaria relacionado a um maior

número de casos de recidiva ou progressão para doença invasora

(23,24)

. Além disso, a

recorrência ou a neoplasia invasora tem uma tendência de ocorrer na mesma área, sugerindo

uma alteração molecular local

(24)

. Estes mesmos trabalhos demonstraram que na patogênese

de determinadas neoplasias intra-epiteliais vulvares podem existir um comportamento

independente da infecção pelo HPV de alto-risco e apenas associado à mutação do p53

(23,24)

No nosso estudo, o perfil imuno-histoquímico do grupo NIV apresentou uma alta

prevalência de positividade para o p53 (60,7%, 17/28), quando comparado com o grupo

câncer (18,9%, 7/37) e controle (8,3%, 1/12). Este resultado pode sugerir uma amostra de

mulheres portadora de NIV com maior potencial para doença invasora e de recorrência local

após tratamento. A imuno-expressão do p16 no grupo NIV (21,4%, 6/28) poderia representar

um marcador indireto da taxa de infecção pelo HPV nos tecidos precursores. Resultado este

muito próximo dos 30% de taxa de infecção pelo HPV em casos de NIV relatado na

literatura

(26,29)

Os resultados tiveram um diferente comportamento imuno-histoquímico quando

dividimos em idade inferior e superior a 55 anos. (Tabela 3) O primeiro grupo de mulheres

jovens com diagnóstico de câncer apresentou uma notada imuno-expressão para o p16 (6/11)

e nas pacientes com idade superior a 55 anos uma menor presença (3/26), resultado este com

significância estatística (54,5% versus 11,5%, p= 0,011). Quando analisada a imuno-

expressão para o p53 não foi evidenciado nenhum caso de positividade para mulheres com

menos de 55 anos e 7 casos (7/26) para as pacientes com idade superior (26,9%, p= 0,08).

Vários trabalhos na literatura têm demonstrado este comportamento bimodal para o

CCE de vulva

(6,7,8,9,11)

. Primeiramente, um grupo formado por mulheres jovens (pico etário:

55 anos) com freqüência infectadas pelo HPV e apresentando uma provável associação com o

aumento da imuno-expressão do p16

(6,7)

. Um segundo grupo, representado por mulheres

idosas (pico etário:77 anos), mais freqüentemente relacionado a mutação do p53 e baixa

expressão do p16, possivelmente denotando um mecanismo oncogênico distinto

(8,9,11,31)

CONCLUSÃO

A imuno-expressão das proteínas p16 e p53 parece ser um importante marcador na

avaliação do comportamento das lesões neoplásicas vulvares.

Nossos resultados sugerem uma significativa correlação entre o aumento da expressão

imuno-histoquímica da proteína p16 na presença de carcinoma invasor de vulva em mulheres

jovens (idade inferior a 55 anos) e possivelmente uma associação com uma baixa imuno-

expressão do p53. A avaliação da presença do HPV de alto risco nos casos analisados poderá

ser o próximo objetivo dos investigadores na tentativa de elucidar o perfil neoplásico das

mulheres jovens de nossa população.

123728N =

controlescâncer invasorNIV

I. C. 95% para a média da idade

Gráfico 1- Distribuição das médias de idades dos grupos (controle, NIV e câncer).

Tabela 1 - Distribuição da idade e positividade imuno-histoquímica para os marcadores p16 e

p53 entre os grupos controle, NIV e câncer

Tipo

histológico

Idade (média ± dp)

(amplitude)

p16 positivo (%) p53 positivo(%)

Controle 12

59,1 ± 8,4 (38-68)

0/15 1/25 (4)

NIV I, II e III 28

45,1 ± 15 (19-79)

6/15 (40) 17/25 (68)

Câncer 37

63,64 ± 16,34 (31-85)

9/15 (60) 7/25 (28)

Total

56,42 ± 17,25 (19-85)

15 25

Tabela 2 - Resultados da imuno-expressão positiva dos marcadores p16 e p53 entre os grupos

Controle (%) NIV I, II e III (%)

Câncer invasor

(%)

valor - p

p16 positivo 0/12 (0) 6/28 (21,4) 9/37 (24,3) 0.202

p53 positivo 1/12 (8,3) 17/28 (60,7) 7/37 (18,9) 0,001*

Teste Exato de Fischer

*Significância estatística

Tabela 3 - Distribuição da imuno-expressão positiva entre as neoplasias intra-epiteliais

vulvares (grau I, II e III)

NIV

I II III

Total

P16 positivo 1/14 2/4 3/10 6

P53 positivo 10/14 3/4 4/10 17

Tabela 4 - Análise da distribuição dos marcadores positivos entre casos de câncer invasor

com idade inferior e superior a 55 anos de idade

Idade inferior a 55 anos (%) Maiores de 55 anos (%) valor - p

p16 positivo 6/11 (54,5) 3/26 (11,5) 0,011*

p53 positivo 0/11 (0) 7/26 (26,9) 0,080

Teste Exato de Fischer

*Significância estatística

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IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION OF P16 AND P53 MARKERS IN

CASES OF VULVAR INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA AND INVASIVE

CARCINOMA OF THE VULVA

Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre

Laboratory of Pathology, Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre (Brazil)

Maurcio Cordoni Nogueira

Cláudio Galleano Zettler

ABSCTRACT

Introduction: In recent years, vulvar intraepithelial neoplasia (VIN) and squamous

cell carcinoma (SCC) of the vulva have been a subject of special interest because of their

increasing prevalence and their distinct clinicopathologic behavior among young and older

women. Recent publications point to the significant role of the p16 and p53 proteins in the

cell cycle and their involvement in the oncogenesis of several tumors in the female genital

tract, as well as their possible prognostic value.

Aims: The aim of the study is to determine the immunoexpression of p16 and p53

markers in pieces of vulvar intraepithelial neoplasia (VIN), invasive carcinoma (SCC), and

vulvar tissue with no evidence of lesion from a sample of women cared for at a single hospital

center in Porto Alegre (Brazil), as well as to associate the cases of positive

immunohistochemistry for p16 and p53 markers with age (below and above 55 years) in the

group of invasive carcinoma (SCC).

Material and Methods: This is a cross-sectional, retrospective and prospective study

with 77 samples of vulvar tissue, treated surgically in the Complexo Hospitalar Santa Casa,

from Jun 2000 to Nov 2004. The immunohistochemical study was conducted in cases

histologically classified as vulvar intraepithelial neoplasia (n=28), invasive carcinoma of the

vulva (n= 37), and vulvar tissue with no evidence of lesion (n= 12).

Results: The percentage of immunohistochemical positivity for p16 had the following

distribution across the groups: VIN: 21.4% (6/28), cancer: 24.3% (9/37) and control: absent

(p=0.202) The p53 marker showed the following percentages: VIN: 60.7% (17/28), cancer:

18.9% (7/37) and control: 8.3% (1/12).(p=0.01)

Immunoexpression of p16 in the cancer group (mean age: 63.4 yr) was detected in 9

cases (24.3%, 9/37), was positive in 6 cases of the young group (age below 55 years) and in 3

cases of women above age 55 (54.5% versus 11.5%, p= 0.01). P53 positivity was not detected

in young females with cancer and was expressed in 7 cases of the group of females above 55

years of age (26.9%, 7/26, p=0.08).

Conclusion: The immunoexpression of proteins p16 e p53 appears to be an

important tool in the evaluation of the behavior of vulvar neoplastic lesions. Our results

suggest a strong correlation between the increase in the immunohistochemical expression

of protein p16 in the presence of invasive carcinoma of the vulva in young women (below

55 years of age) and possible association with a low expression of p53.

Keywords: vulva, squamous cell carcinoma, intraepithelial neoplasia,

immunohistochemistry, p16, p53.

INTRODUCTION

The carcinoma of the vulva is a rare disease, accounting for about 3-5% of the totality

of malignant tumors in the female genital tract, with a typical prevalence in aged women (65-

75 years) and seldom seen in patients below 35 years of age

(1,2)

The National Cancer Institute (NCI) of the United States has estimated that 3,870 new

cases of vulvar cancer will be diagnosed in that country in the year 2005, leading to 870

deaths

(3)

For the last decades, there has been an increase in the number of cases of the disorder

both in the United States and in urban areas of Brazil

(1,2,4)

. This increase has been noted for

both the precursor lesions of cancer, i.e. vulvar intraepithelial neoplasias (VIN), and the cases

of invasive neoplasia proper

(5,6)

. For the latter, recent data suggest a higher increase in the

number of cases among young women below 55 years of age

(7)

Possible explanations for such an increase include women's longer life expectancy,

disease- or drug-related immunosuppressive states, and a potential rise in the prevalence of

human papillomavirus (HPV)

(8,9)

infection.

In Brazil, Porto Alegre stands out in the national scenario as of one the cities with the

highest incidences of vulvar cancer, along with the cities of Goiânia and Recife

(3)

. In 1992,

the World Health Organization (WHO) indicated the city of Recife as one of the cities with

the highest incidences of vulvar cancer in the world, with a rate of 5.6/100.000

women/year

(10)

In 1996, the incidence of vulvar cancer in Porto Alegre was 19 cases per 100.000

women/year with a relative frequency of 0.87% among female malignant neoplasms,

representing the highest rate of vulvar neoplasia in the country. In the same year, the cities of

Goiânia and Recife presented a rate of 7 cases per 100.000 women/year and a relative

frequency of the disease of 0.59% and 0.43%, respectively

(3)

Clinicopathologic evidence has characterized two distinct groups of squamous cell

carcinoma (SCC) of the vulva

(8,11)

. The first comprised young women at 35-65 years of age

(age peak: 55 years) with previous diagnosis of vulvar intraepithelial neoplasia often caused

by infection with the human papilloma virus (HPV), generally of high grade (types 16 and

18)

(12,13)

. In some cases, there was a synchronic or metachronic association with infection by

HPV in the uterine cervix, vagina or anus, reinforcing the idea of a shared pathogenic

mechanism

(14,15)

. The second group was composed of aged women at 55-85 years of age (age

peak: 77 years) who presented a greater connection with chronic vulvar inflammatory

processes and mutation of p53

(8,11)

. Their disorder wasn´t related to intraepithelial neoplastic

alterations but rather to recurrent chronic inflammatory processes such as lichen sclerosus and

squamous cell hyperplasia (mixed dystrophy)

(9,11)

. In terms of histological expression, they

presented squamous cells of the keratinized type rather than the verrucous and basaloid types

often found in the former group

(9,11,15)

However, in contrast to cancer of the uterine cervix, where the HPV is found in over

95% of the cases

(15)

, vulvar cancer presents an overall rate of HIV infection of only 30-40%

of the cases

(16)

The cell cycle is regulated by a sequence of activation and inactivation of various

cyclin-dependent kinases at different stages of the cell cycle. Moreover, there are several

checkpoints between the cell stages to check for the existence of any sort of cell damage that

could compromise DNA synthesis. At this point the cell may be led to apoptosis (programmed

cell death) or remain in the cell cycle (17). The passage from G1 to S is determined, among

other events, by the action of cyclin D and CDKs 4 and 6. In the G1 phase, the binding

between cyclin D and CDKs 4 and 6 will phosphorylate the retinoblastoma protein (RBp).

This event will determine the release of E2F, a transcription factor of genes essential to DNA

synthesis, triggering DNA replication and progression to phase S

(17,18)

Tumor suppressor gene p16 (INK4A) plays a regulatory role in the cell cycle,

inactivating its progression by inhibiting cyclin complexes D/CDK4 and 6

(17,19)

. The mutation

or deletion of gene p16(INK4) can affect the balance between protein p16 and cyclins D,

resulting in an abnormal cell growth (oncogenesis)

(18,20)

. An increase in the

immunoexpression of p16 has been seen in premalignant lesions and carcinomas related to

HPV infection, such as those of the uterine cervix, oral cavity, anus and, more recently, the

vulva

(18,19,20,21)

Gene p53, located in chromosome 17p13, is one of the most frequent genetic

alterations observed in human tumors. The role played by p53 lies in detecting damage to the

DNA (unknown mechanisms) and its repair, determining interruption in the cell cycle in the

G1 phase or initiating the process of apoptosis

(22,23)

. An increase in the immunohistochemical

expression of protein p53 has been associated with the development of recurrent vulvar

intraepithelial neoplasia and with progression to invasive carcinoma of the vulva, generally in

tissues not infected by the HPV

(24)

This study was designed to investigate the immunoexpression of p16 and p53 markers

in specimens of vulvar intraepithelial neoplasia (VIN), invasive carcinoma (SCC), and vulvar

tissue with no evidence of lesion from a sample of women cared for at a single hospital center

in Porto Alegre, Brazil. In addition, we have assessed the possible association between the

positive immunohistochemical expression of p16 and p53 markers and age (below and above

55 years) in the group of invasive carcinoma (SCC) of the vulva.

1. MATERIAL AND METHODS

Seventy-seven tissue specimens were selected at the Complexo Hospitalar Santa Casa

Pathology Laboratory from June 2000 to November 2004. The histological classification was

distributed as follows: 28 cases of vulvar intraepithelial neoplasia (VIN I: 14, VIN II: 4, and

VIN III: 10 cases), 37 cases of invasive squamous cell carcinoma and 12 cases of normal

vulvar squamous epithelium. The surgical treatment of the studied population comprised 35

cases of radical vulvectomy, 2 cases of hemivulvectomy, 28 cases of local excision, and 12

cases of incisional biopsies.

The presence of a primary record in our database, with diagnosis of squamous cell

carcinoma of the vulva or vulvar intraepithelial neoplasia, made the case eligible for study.

The following exclusion criteria were considered: 1) disagreement between the

anatomicopathological report reviewed by the researchers and the one historically issued, as

well as the non-localization of the paraffin block in our archives; 2) anatomicopathological

reports that didn´t find a residual tumor in the operative specimen; 3) neoplastic relapse cases;

and 4) patients subjected to chemotherapy and preoperative radiotherapy.

The 12 control cases, normal vulvar squamous epithelium, were prospectively selected

from women subjected to perineoplasty, product of a vulvar tissue sample. The inclusion

criteria in the control group were absence of previous clinical history of HPV infection

(vulvar, cervical and anal), and absence of macroscopic vulvar lesion. The patients voluntarily

signed an informed consent form to participate in the study, as regulated by the intitution´s

research ethics committee.

All histological specimens were reviewed by one of the authors of the project (CGZ)

who didn´t have access to any sort of previous clinical information. The neoplasias were

classified and graded as recommended by the World Health Organization (WHO) and the

College of American Pathologists (CAP protocol revision- 2005)

(25)

1.1. IMMUNOHISTOCHEMISTRY

The tissues stored in paraffin blocks and impregnated in 10% formaldehyde were

sectioned (5 µm thick), deparaffinized at a temperature of 60°C (heater) for 30 min, and

submitted to xylene (2 x 5 min.), decreasing alcohol concentrations (absolute, 90%, 70% and

50%), and then rinsed with distilled water. Antigen retrieval was performed by heating up to

92°C in double boiler with citrate solution (pH: 6.0) for a period of 40 min, then left to cool

for 20 min at room temperature and rinsed in distilled water. Blockage of endogenous

peroxidase was performed with a methanol solution (95 ml) plus hydrogen peroxidase (30

vol, 5 ml) 2 x 10 min (protected from light ). Subsequently, it was rinsed in distilled water and

then in phosphate-buffered saline (PBS) for 2 x 5 min. The blockage of unspecific bindings

was achieved through incubation with an innocuous protein solution (DAKO®-Protein

Block Serum-Free, USA) in the sample for 30 min. The primary antibody was applied

overnight at 4°C in refrigerator, then rinsed in PBS for 2 x 5 min, and the antibodies p53

(DAKO®-Anti-Human p53 Protein, Clone DO-7, EUA) and p16 (NEOMARKES®-p16

INK4a/MTS1, Mitotie/Supressor Protein, AB-4 Clone 16P04, USA) were applied at 1:200

dilution, respectively. The material was then incubated with biotinilated secondary antibody

(DAKO®, Ely, USA) for 40 min at room temperature and then rinsed in PBS (2 x 5 min) and

again incubated with the biotin-peroxidase complex (DakoCytomation®, Kit LABS/System-

HRP, USA) for 40 min at room temperature, rinsed in PBS (2 x 5 min), and developed with

chromogen substrate (DAB) at a proportion of 60mg of DAB in 100 ml of PBS and 1 ml of

30 vol. hydrogen peroxide (for 5 min). Subsequently it was rinsed in current water and

distilled, dehydrated and mounted onto slides.

P16 and p53 immunoexpression was calculated on the basis of the staining presented

on an average of 10 microscopic fields at 400x magnification, the result being expressed as a

percentage.

Positivity of immunoexpression for the p16 marker was considered when 5% or more

of nuclear and cytoplasmic cells were stained. Tissue samples for evidence of p53 with only

nuclear staining were considered positive if expression was equal to or above 25% of cells

(26)

The positive control for p53 marker was a case of infiltrating duct carcinoma of the breast,

and for p16 we used a case of squamous (epidermoid) cell carcinoma of the uterine cervix

from the laboratory archives.

1.2. STATISTICAL ANALYSIS

The statistical analysis was performed with Student's t-test and Fisher's exact test,

categorical and continuous variables, to test associations between p16 and p53 markers. The

level of significance used was 0.05. The data were analyzed and processed with the Statistical

Package for the Social Sciences (SPSS, USA) version 10.1.

2 RESULTS

A total of 77 samples of vulvar tissue (VIN: 28, cancer: 37, control: 12) were

evaluated for the immunoexpression of p16 and p53. The 28 cases with a diagnosis of vulvar

intraepithelial neoplasia had the following distribution according to their histological status:

VIN I: 14, VIN II: 4, and VIN III: 10.

The distribution of mean age in the studied groups (VIN, cancer and control) showed a

similarity between the control and cancer groups (graph 1 ). The highest mean age between

the groups was found in the cancer group (mean age: 63.64), in which there were 6 patients

under 40 years of age. (Table 1)

The 12 cases of vulvar epithelium with no evidence of lesion did not present positivity

(absence of immunoexpression in cells) for marker p16 and only in one case

immunohistochemistry was considered positive (immunoexpression ≥25% nuclear) for

protein p53 (8.3%, 1/12).

A statistical analysis was performed among the three groups (VIN, cancer and

control) for positivity of ma

P53 positivity was not detected in young women with cancer and was expressed in 7 cases in

the group of women above 55 years of age (26.9%, 7/26, p=0.08).

3. DISCUSSION

The natural history of VIN and its precise biological potential for carcinogenesis are

not well established yet

(27)

. Reviews of the literature have demonstrated that intraepithelial

lesions in young patients can present a steady behavior or spontaneous regression. In contrast,

aged women show a tendency towards progression to tissue invasion

(5,24,27,28)

A recent study demonstrated the association of positivity of p16 immunoexpression

with the presence of high-risk HPV (type 16) in cases of VIN and SCC of the vulva,

presenting a positive predictive value of 97% and 95%, respectively, and suggesting that the

increase in p16 immunoexpression may be an important predictor of HPV infection in the

vulvar neoplastic tissues

(29)

The action mechanism of the HPV related to the increased p16 expression might be

connected with oncoprotein E7, which inactivates the retinoblastoma protein, determining the

loss of the negative feedback of phosphorylated RBp. Moreover, protein E7 binds to RBp at

the same binding site of factor E2F, which thus remains free (non-sequestered) and acts on the

cell DNA, stimulating mitosis

(19,21)

Mutation of gene p53 has been associated with increased immunoexpression of p53 in

neoplastic tissues, representing a nuclear product without a function and with a prolonged

half-life

(22,23,24,30)

A study which included a sample of women with diagnosis of VIN III who were

prospectively followed up for evaluation of relapse after local surgical treatment demonstrated

that mutation of the p53 gene may play an important prognostic role

(24)

. The increased p53

expression is likely to be related to an increase in the cases of relapse or progression to

invasive disease

(23,24)

. In addition, recurrence or invasive neoplasia has a tendency to occur at

the same area, suggesting a local molecular alteration

(24)

The same studies show that in the pathogenesis of certain vulvar intraepithelial

neoplasias there may be a behavior unrelated to the high-risk HPV infection and solely

associated with p53 mutation.

(23,24)

In our study, the immunohistochemical profile of the VIN group presented a high

prevalence of p53 positivity (60.7%, 17/28) as compared with the cancer (18.9%, 7/37) and

control (8.3%, 1/12) groups. This finding may suggest a sample of women with VIN who

have a higher potential for invasive disease and recurrence after treatment. P16 expression in

the VIN group (21.4%, 6/28) might represent an indirect marker for the rate of HPV infection

in the precursor tissues, a result which is very close to the 30% rate of HPV infection in VIN

cases reported in the literature

(26,29)

The results showed a different immunohistochemical behavior when age was divided

as under and above 55 years. The first group of young women with a diagnosis of cancer

presented marked p16 immunoexpression (6/11), and in patients above 55 years of age a

smaller presence was observed (3/26), this being a statistically significant result (54.5%

versus 11.5%, p= 0.011). When p53 expression was analyzed, no case of positivity was found

for women below 55 years of age, and there were 7 cases (7/26) for older patients (26.9%, p=

0.08).

Several works in the literature have demonstrated this bimodal behavior by SCC of the

vulva

(6,7,8,9,11)

. Firstly, we have a group composed of young women (age peak: 55 years)

frequently infected with HPV and presenting a probable association with increased p16

expression

(6,7)

. Then there is a second group, represented by aged women (age peak: 77

years), more frequently associated with p53 mutation and low p16 expression, possibly

denoting a distinct oncogenic mechanism

(8,9,11,31)

CONCLUSION

Immunoexpression of p16 and p53 appears to be an important tool in evaluating the

behavior of vulvar neoplastic lesions.

Our results suggest a significant correlation between the increased

immunohistochemical expression of p16 in the presence of invasive carcinoma of the vulva in

young women (age below 55 years) and possibly an association with low p53 expression. The

evaluation of the presence of high-risk HPV in the analyzed cases may be the next aim of the

researchers in an attempt to elucidate the neoplastic profile of young women in our

population.

123728N =

controlescâncer invasorNIV

I. C. 95% para a média da idade

Graph 1 – Mean age distribution of the groups (control, VIN, and cancer).

Table 1 . Distribution of age and immunohistochemical positivity for p16 and p53 markers in

the controls, VIN and cancer groups.

Histological type n Age (mean  sd)

(range)

positive p16 (%) positive p53 (%)

Control 12 59.1  8.4 (38-68) 0/15 1/25 (4)

VIN I, II and III 28 45.1  15 (19-79) 6/15 (40) 17/25 (68)

Cancer 37 63.64  16.34 (31-85) 9/15 (60) 7/25 (28)

Total

77 56.42  17.25 (19-85) 15 25

Table 2 : Results of positive immuno-expression of p16 and p53 markers in the different

groups

Control (%) VIN I, II and III (%)Invasive cancer (%) p value

positive p16 0/12 (0) 6/28 (21,4) 9/37 (24,3) 0.202

positive p53 1/12 (8,3) 17/28 (60.7) 7/37 (18.9) 0.001*

Fischer's exact test

*Statistical significance

Table 3 : Distribution of positive immuno-expression in the different vulvar intraepithelial

neoplasias (grades I, II and III).

VIN

I II III

Total

positive p16 1/14 2/4 3/10 6

positive p53 10/14 3/4 4/10 17

Table 4 : Analysis of the distribution of positive markers among the cases of invasive cancer

in women above and below 55 years of age

Age below 55 years (%) Above 55 years (%) p value

positive p16 6/11 (54.5) 3/26 (11.5) 0.011*

positive p53 0/11 (0) 7/26 (26.9) 0.080

Fischer's exact test

*Statistical significance

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ANEXOS

Figura 1: Esquema ilustrando o papel das ciclinas e das quinases ciclina-dependentes (CDKs)

na regulação do ciclo celular.

Figura 2: Ilustração demonstrando as etapas de fosforilação da proteína rb e liberação do

fator de transcrição E2F, essencial para o processo de mitose celular.

Figura 3 - Carcinoma invasor de células escamosas de vulva - HE - 100x.

Figura 4 - Carcinoma invasor de células escamosas de vulva - HE - 200x

Figura 5 - Imuno-expressão do p16 em carcinoma invasor de vulva - HE - 100x

Figura 6 - Imuno-expressão do p16 em carcinoma invasor de vulva - HE - 200x

Figura 7 - Detalhe da Imuno-expressão do p16 em carcinoma invasor de vulva - HE - 400x

Figura 8 - Detalhe da Imuno-expressão do p53 em carcinoma invasor de vulva - HE - 400x

Foto 1 - Paciente de 42 anos de idade com diagnóstico de NIV III e lesão vulvar extensa

com aspecto de placa, acometendo a margem do ânus e carcinoma in situ (sincrônico) no

colo uterino

Foto 2 - Produto da excisão cônica do colo uterino, demonstrando carcinoma de colo

uterino in situ (sincrônico) sugestivo de infecção pelo HPV de alto grau.

Tabela 1

Distribuição da idade entre casos de câncer de vulva diagnosticados no Hospital Santa Rita

(Complexo Hospitalar Santa Casa) no período de 1996-2001

Fonte: Registro de Câncer Hospitalar/ HSR

Tabela 2

Distribuição da incidência e freqüência relativa de câncer de vulva em capitais brasileiras no

período de 1993-2000

1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Porto

Alegre

(1,01)

(0,64)

(0,53)

(0,87)

(0,30)

Gôiania 7

(0,59)

(0,96)

(0,82)

(0,46)

(0,88)

Brasília 9

(0,34)

(0,08)

(0,39)

Recife 3

(0,25)

(0,43)

(0,46)

(0,11)

Fonte: Ministério da Saúde. INCA/2005

Idade x Câncer de Vulva HSR (1996-2001)

100

Casos Novos Câncer Vulva

Distribuição Idade

IDADE

Colégio Americano de Patologistas (CAP)

Protocolo de Classificação dos Tumores Vulvares - 2005

Lesões Benignas

(1) Hiperplasia de células escamosas

(2) Líquen escleroso

(3) Condiloma acuminado

Lesões Pré-Neoplásicas

(1) Displasia/Neoplasia Intra-epitelial Vulvar (NIV)

(2) Nevu juncional

Lesões Escamosas

Neoplasia Intra-Epitelial Vulvar (NIV):

Displasia leve (NIV 1)

Displasia moderada (NIV 2)

Displasia severa (NIV 3)

Carcinoma in situ (NIV 3)

Carcinoma de células escamosas:

Queratinizado

Não-queratinizado

Basalóide

Verrucoso

Condilomatoso

Outros

Carcinoma de células basais

Lesões glandulares

Doença de Paget

Carcinoma de glândula de Bartholin

Adenocarcinoma:

Carcinoma adenóide cístico

Carcinoma adeno-escamoso

Carcinoma de células transicionais

Adenocarcinomas de outros tipos

Grau histológico

G1: bem diferenciado

G2: moderadamente diferenciado

G3: pouco diferenciado

G4: indiferenciado

Fonte: Branton PA. College of American Pathologists (CAP). Protocol Revision date: January

2005.(Based on WHO, AJCC/UICC, TNM 6

and FIGO Annual Report). Washington

(DC);2005 (Protocol applies to premalignant and invasive carcinomas of the vulva).

Comitê de Ética em Pesquisa

Obtido parecer favorável pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Complexo Hospitalar

Santa Casa de Porto Alegre (protocolo número 866/04) em 27 de maio de 2004.

Realizado também parecer consubstanciado (PN 166/04) para avaliação e aplicabilidade de

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) em 6 de julho de 2004 (pacientes

submetidas à biópsia do grupo controle), tendo sido aprovado.

Modelo de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (grupo controle)

Nome do Paciente:_______________________________________

Registro:_______________________________________________

Prezada Paciente,

Seu médico lhe informou que você tem um defeito anatômico no assoalho pélvico (porção

posterior da vagina), necessitando tratamento cirúrgico reparador (perineoplastia posterior).

Este estudo que você está sendo convidada a participar irá pesquisar a presença de dois

marcadores tumorais relacionados a oncogênese do câncer de vulva (proteínas p16 e p53).

Objetivo do Estudo

O tecido proveniente da sua cirurgia (que normalmente é desprezado pelo cirurgião) irá servir

como um grupo de tecido normal a ser comparado com tecidos vulvares arquivados com

diagnóstico de câncer de vulva de mulheres operadas no Complexo Hospitalar Santa Casa.

Como este estudo foi desenhado?

37 casos de câncer de vulva serão examinados retrospectivamente para verificar a imuno-

expressão das proteínas p16 e p53.

12 casos de tecido normal (provenientes de perineoplastia posterior) serão considerados o

grupo controle.

Como será o procedimento de retirada do tecido?

O seu médico conforme sua técnica cirúrgica própria irá retirar o tecido vulvar (pele) e

encaminhar para o grupo de pesquisadores envolvidos no projeto. Não será feita nenhuma

recomendação quanto ao tamanho ou local a ser retirado, bem como, nenhuma modificação da

técnica cirúrgica a ser empregada.

O que mais você deve saber?

Sua participação no estudo é voluntária. Você pode retirar-se do estudo a qualquer tempo,

sem ter que fornecer uma razão para a sua decisão. Isso não afetará o padrão de cuidados que

você recebe.

A informação que obtivermos aqui pode ajudar os médicos a tratar com mais eficiência no

futuro mulheres portadoras de câncer de vulva.

Antes do estudo ser iniciado, ele foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Complexo

Hospitalar Santa Casa. Este estudo está sendo conduzido de acordo com as normas éticas

(conforme Declaração de Helsinki) e as exigências locais.

Quaisquer dados pessoais colhidos durante o estudo serão manipulados de acordo com a lei de

proteção de dados e a legislação local.

Ao permitir que dados pessoais armazenados sejam transmitidos dessa forma, você libera o

médico responsável do estudo das obrigações de confidencialidade para essa finalidade e

apenas para essa finalidade.

Quem deve ser contatado para obter mais informações?

Se você tiver qualquer pergunta a respeito do estudo, ou se desejar obter informações mais

tarde, deve contatar:

Mauricio Cordoni Nogueira (investigador principal e médico ginecologista)

Ambulatório do Hospital Santa Rita

Rua Sarmento Leite, 176 CEP 90020-090

Porto Alegre-RS

Fone: (51) 3214-8453

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