( PDF ) Expressão imuno-histoquímica da metaloproteinase-1, -2 e -9 em ameloblastoma sólido e tumor odontogênico adenomatóide

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BETANIA FACHETTI RIBEIRO

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA

METALOPROTEINASE-1, -2 E -9 EM AMELOBLASTOMA

SÓLIDO E TUMOR ODONTOGÊNICO ADENOMATÓIDE

NATAL – RN

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

CURSO DE MESTRADO EM PATOLOGIA ORAL

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA

METALOPROTEINASE-1, -2 E -9 EM AMELOBLASTOMA

SÓLIDO E TUMOR ODONTOGÊNICO ADENOMATÓIDE

Dissertação apresentada ao Colegiado do

Programa de Pós-Graduação em

Patologia Oral do Departamento de

Odontologia do Centro de Ciências da

Saúde da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

MESTRANDA: BETANIA FACHETTI RIBEIRO

ORIENTADORA: PROFª DRª ROSEANA DE ALMEIDA FREITAS

NATAL – RN

2008

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais e irmãos pela formação que me proporcionaram, pela nossa

união e amizade.

A todos meus familiares pelo incentivo, apoio e carinho que sempre pude

contar.

Ao Eduardo pelo companheirismo, amor e paciência durante essa caminhada.

AGRADECIMENTOS

A minha Orientadora Profª. Drª. Roseana Freitas, exemplo de determinação e

competência, pelo incentivo e pela dedicação na realização desse trabalho e no

decorrer do curso, sempre me orientando o melhor caminho a seguir.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da

UFRN, Dr. Leão Pereira Pinto, Drª. Lélia Batista de Souza, Drª. Hebel Cavalcanti

Galvão, Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Drª.

Márcia Cristina da Costa Miguel, Drª. Ana Miryam Medeiros, meus sinceros

agradecimentos pela dedicação, compreensão e pelos ensinamentos transmitidos

durante o curso.

Ao Prof. Dr. Ângelo Roncalli pela paciência e pelo auxílio na realização da

análise estatística deste trabalho. Muito Obrigada!

À Prof. Adriana Terezinha, que durante o curso de graduação sempre nos

incentivava e estava disposta a nos ajudar, e foi muito importante para a minha

chegada aqui. Minha eterna gratidão!

Aos meus amigos do mestrado, Déborah, Domingos, Marcelo, Pedro Paulo e

Ruth pela amizade, respeito e carinho que nos uniu durante todo o curso. Levarei

comigo lembranças dos momentos difíceis e das muitas alegrias compartilhadas

aqui.

Aos amigos e colegas do curso de Pós-Graduação, Cristina, George, Polliana,

Karuza, Éricka, Marta, Janaína, Claudine, Emanuel, Bruna Rafaela, Bruna Amaral,

Valéria, Alexandre e Cassiano, que de alguma forma contribuíram para a realização

desta pesquisa. Agradeço pela troca de conhecimentos e pelo convívio durante o

curso.

Aos funcionários Gracinha, Idel, Canindé, Sandrinha, Hévio e Lourdinha pela

atenção, dedicação e pelo carinho com que sempre me trataram.

Ao CNPQ pela bolsa de estudo concedida que permitiu concluir esta

pesquisa.

E para todos aqueles que contribuíram, direta ou indiretamente, para a

realização deste trabalho.

Meus sinceros agradecimentos.

RESUMO

O ameloblastoma e o tumor odontogênico adenomatóide são tumores

odontogênicos derivados do epitélio odontogênico que possuem comportamentos

distintos. Na tentativa de compreender a interação existente entre as células

tumorais e a matriz extracelular, o presente trabalho teve como objetivo avaliar e

comparar a expressão das metaloproteinases-1 (MMP-1), -2 (MMP-2) e -9 (MMP-9),

através da técnica imuno-histoquímica em 20 casos de ameloblastoma e 10 de

tumor odontogênico adenomatóide. A MMP-1 teve uma marcação predominante nos

dois tumores, sendo observada tanto no parênquima como no estroma de todos os

tumores estudados. Para a MMP-2, observou-se uma expressão variada, sendo 80%

e 60% das células tumorais imunorreativas nos ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides, respectivamente. Em relação às células do

mesênquima, 65% dos ameloblastomas e 80% tumores odontogênicos

adenomatóides exibiram positividade. Verificou-se imunoexpressão para a MMP-9

nas células parenquimatosas e estromais em todos os casos, sendo que nos

ameloblastomas, houve o predomínio de menos de 50% das células

imunomarcadas; enquanto que em 60% dos tumores odontogênicos adenomatóides

mais de 50% das células apresentaram positividade. Observou-se diferença

estatisticamente significante na expressão da MMP-1 em relação à MMP-2 e -9 nos

ameloblastomas (p<0,001). A análise estatística não pôde ser aplicada para os

tumores odontogênicos adenomatóides, porém verificou-se tendência de maior

expressão da MMP-1 em relação às outras MMPs avaliadas. Os resultados deste

estudo sugerem que as MMPs-1, -2 e -9 estão relacionadas com crescimento e

progressão dos tumores analisados e, particularmente no ameloblastoma, sua maior

agressividade pode resultar, em parte, pela participação também do estroma

presente de forma bem mais marcante permeando o parênquima tumoral e sendo

fonte também das proteases estudadas.

Palavras-chave: Ameloblastoma. Tumor odontogênico adenomatóide.

Metaloproteinase de matriz. Matriz extracelular.

ABSTRACT

Ameloblastoma and adenomatoid odontogenic tumor are odontogenic tumors

arising from the odontogenic epithelium with distinct clinical behavior. In attempt to

comprehend the interaction between the odontogenic tumor cells and the

extracellular matrix, the present work evaluated and compared the

immunohistochemical expression of the matrix metalloproteinases-1 (MMP-1), -2

(MMP-2) and -9 (MMP-9) in 20 cases of ameloblastoma and 10 adenomatoid

odontogenic tumor. MMP-1 exhibited exuberant expression in the parenchyma and in

the stroma of both studied tumors, while the MMP-2 showed varied expression with

about of 80% and 60% of the neoplastic cells exhibiting positivity in the

ameloblastoma and adenomatoid odontogenic tumor, respectively. With relation to

the MMP-2 expression by the mesenchymal cells, it was observed that 65% of the

ameloblastoma and 80% of the adenomatoid odontogenic tumor were positive. The

immunoreactivity of MMP-9 was detected in all studied cases, although its expression

had occurred predominantely in less than 50% of the parenchyma cells of the

ameloblastoma, while in about of 60% of the adenomatoid odontogenic tumor more

than 50% of cells were positive. The mesenchymal cells were positive to MMP-9 in

65% of the ameloblastoma and in 80% of the adenomatoid odontogenic tumor,

respectively. Statistically significant difference was observed to the MMP-1

expression with relation to MMP-2 and MMP-9 in the ameloblastoma (p < 0.001). It

was not possible to perform statistical analysis to the cases of adenomatoid

odontogenic tumor, however there was a tendency toward a differential expression of

the MMP-1 with relation to other studied MMPs. These results suggest that MMP-1, -

2 and -9 are implicated in the growth and progression of both tumors analyzed as

well as the more pronounced participation of the stroma in the ameloblastoma could

together to be related to the higher clinical aggressiveness.

Keywords: Ameloblastoma. Adenomatoid odontogenic tumor. Matrix

metalloproteinases. Extracellular matrix.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

QUADROS

Quadro 01 - Características clínicas dos casos de ameloblastomas 55

Quadro 02 - Características clínicas dos casos de tumores odontogênicos

adenomatóides 56

Quadro 03 - Clone , especificidade, fonte, diluição, incubação e procedimento de

recuperação antigênica dos anticorpos primários 57

FIGURAS

Figura 01 - Ameloblastoma. Padrão folicular (H.E., 200X) 64

Figura 02 - Ameloblastoma. Padrão plexiforme (H.E., 200X) 64

Figura 03 - Tumor odontogênico adenomatóide. Células do epitélio odontogênico

com morfologia variada, organizadas em lençol, com formações ductiformes e

calcificações (H.E., 100X) 64

Figura 04 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-1 nas células tumorais e em

células inflamatórias no estroma do ameloblastoma (SABC, 200X) 70

Figura 05 - Imunoexpressão da MMP-1 em ameloblastoma. Marcação

citoplasmática nas células neoplásicas (SABC, 400X) 70

Figura 06 - Expressão da MMP-1 em ameloblastoma. Marcação citoplasmática nas

células neoplásicas e células estromais (SABC, 400X) 70

Figura 07 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-2 nas células tumorais e em

células inflamatórias no estroma do ameloblastoma (SABC, 400X) 71

Figura 08 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-9 nas células tumorais e em

células inflamatórias no estroma do ameloblastoma (SABC, 400X) 71

Figura 09 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-1 no tumor odontogênico

adenomatóide (SABC, 200X) 72

Figura 10 - Detalhe da expressão imuno-histoquímica da MMP-1 nas células

parenquimatosas do tumor odontogênico adenomatóide (SABC, 400X) 72

Figura 11 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-9 nas células tumorais do tumor

odontogênico adenomatóide (SABC, 200X) 72

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Escores das células tumorais marcadas nos ameloblastomas para as

MMPs-1, -2 e -9. Natal/RN, 2008 67

Tabela 02 - Escores das células tumorais marcadas nos tumores odontogênicos

adenomatóides para as MMPs-1, -2 e -9. Natal/RN, 2008 69

Tabela 03 - Imunoexpressão da MMP-1 em ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides. Natal/RN, 2008 73

Tabela 04 - Imunoexpressão da MMP-2 em ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides. Natal/RN, 2008 74

Tabela 05 - Imunoexpressão da MMP-9 em ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides. Natal/RN, 2008 74

Tabela 06 - Imunoexpressão das MMPs-1, -2 e -9 em ameloblastomas. Natal/RN,

2008 75

Tabela 07 - Imunoexpressão das MMPs-1, -2 e -9 em tumores odontogênicos

adenomatóides. Natal/RN, 2008 75

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BFGF - Fator de crescimento básico de fibroblastos, do inglês basic fibroblast growth

factor;

BSA - Albumina bovina, do inglês bovine serum albumin;

DAB - Agente cromógeno diaminobenzidina;

EGF - Fator de crescimento epidérmico, do inglês epidermal growth factor;

H.E - Hematoxilina e eosina;

HCL - Ácido clorídrico;

kDa - kiloDaltons;

IL-1α

αα

α - Interleucina-1 alfa, do inglês interleukin-1

;

IL-1β

ββ

β - Interleucina-1 beta, do inglês interleukin-1

;

IL-6 - Interleucina-6, do inglês interleukin-6;

MEC - Matriz extracelular;

MMP- Metaloproteinase de matriz extracelular;

MT-MMP - Metaloproteinase de matriz extracelular associada à membrana;

OMS - Organização Mundial da Saúde;

PCNA - Antígeno nuclear de célula em proliferação, do inglês proliferating cell

nuclear antigen;

PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas, do inglês platelet-derived

growth factor;

pH - Potencial hidrogeniônico;

RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa, do inglês

reverse transcription polymerase chain reaction;

SABC - Técnica da estreptavidina-biotina imunoperoxidase, do inglês streptavidin-

biotin complex;

TIMP - Inibidor tecidual das metaloproteinase de matriz extracelular, do inglês tissue

inhibitor of metalloproteinase;

TGF-α

αα

α - Fator de transformação do crescimento-alfa, do inglês transforming growth

factor-

;

TGF-β

ββ

β - Fator de transformação do crescimento-beta, do inglês transforming growth

factor-

;

TNF-α

αα

α - Fator de necrose tumoral-alfa, do inglês tumor necrosis factor-

;

TOA -Tumor odontogênico adenomatóide;

TRIS – Tris-hidroxi-metil-aminocetano;

UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

LISTA DE SÍMBOLOS

ºC - Grau Celsius;

ββ

β - beta;

αα

α - alfa;

µµ

µm - micra.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 24

2 REVISÃO DE LITERATURA 26

2.1 AMELOBLASTOMA

2.1.1 Ameloblastoma sólido ou multicístico 27

2.2 TUMOR ODONTOGÊNICO ADENOMATÓIDE 31

2.3 MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) 36

2.4 METALOPROTEINASES DE MATRIZ (MMPs)

2.4.1 MMP-1 (Colagenase-1) 44

2.4.2 MMP-2 (Gelatinase A) 45

2.4.3 MMP-9 (Gelatinase B) 47

2.4.4 Expressão das MMPs-1, -2 e -9 em lesões odontogênicas 48

3 PROPOSIÇÃO 52

4 MATERIAIS E MÉTODOS 54

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO 54

4.2 POPULAÇÃO 54

4.3 AMOSTRA 54

4.3.1 Caracterização clínica dos ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides 54

4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS ESPÉCIMES 56

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO 57

4.5.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico 57

4.5.2 Análise imuno-histoquímica 59

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 59

4.7 IMPLICAÇÕES ÉTICAS 60

5 RESULTADOS 62

5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS 62

5.1.1 Ameloblastoma 62

5.1.2 Tumor Odontogênico Adenomatóide 62

5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS 65

5.2.1 Ameloblastoma 65

5.2.2 Tumor odontogênico adenomatóide 68

5.3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS 73

5.3.1 Resultados das análises inferenciais dos escores de

imunoexpressão das metaloproteinases-1, - 2 e -9 73

6 DISCUSSÃO 77

7 CONCLUSÕES 89

REFERÊNCIAS 91

APÊNDICE 102

ANEXO 104

INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

O ameloblastoma e o tumor odontogênico adenomatóide constituem dois

representantes de tumores benignos derivados do epitélio odontogênico, sem a

participação do ectomesênquima (BARNES et al, 2005).

O ameloblastoma é definido como neoplasia odontogênica rara que, apesar

de apresentar natureza benigna, possui um comportamento agressivo e invasivo,

podendo causar grande destruição tecidual. De acordo com suas características

clínicas, radiográficas e histológicas, é classificado atualmente em quatro tipos:

sólido ou multicístico, unicístico, desmoplásico e periférico (BARNES et al, 2005).

O tumor odontogênico adenomatóide consiste em uma lesão de crescimento

lento, porém progressiva e compreende 2 a 7% dos tumores odontogênicos. As

lesões são geralmente assintomáticas e localizam-se preferencialmente na maxila,

sendo sua detecção feita, comumente, através de exames radiográficos de rotina,

uma vez que a associação com o canino incluso é comum (REGEZI, SCIUBBA,

2000; SEMPERE et al, 2006).

As MMPs compõem uma família de endopeptidases que possuem a

capacidade de degradar todos os componentes da MEC, incluindo a matriz

intersticial e a membrana basal, participando, portanto, de eventos fisiológicos como

a remodelação tecidual e a embriogênese, além de processos patológicos, como por

exemplo, as neoplasias (SOUZA, LINE, 2002).

Diversos estudos têm enfatizado a ação e a importância das

metaloproteinases de matriz (MMPs) no crescimento de processos patológicos das

mais variadas naturezas. Essas proteases possuem a capacidade de atuar sobre os

componentes da matriz extracelular (MEC) favorecendo a invasão e a proliferação

das células neoplásicas (MOTT, WERB, 2004).

Para uma melhor compreensão do comportamento biológico local dos

ameloblastomas e dos tumores odontogênicos adenomatóides, o presente trabalho

tem como objetivo avaliar e comparar a expressão imuno-histoquímica das MMPs-1,

-2 e -9 nos tumores odontogênicos citados.

REVISÃO DE LITERATURA

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 AMELOBLASTOMA

O ameloblastoma é definido como um tumor odontogênico benigno que

acomete os ossos gnáticos, porém apresenta um comportamento agressivo e

invasivo, causando uma considerável destruição óssea (PINHEIRO et al, 2004;

KUMAMOTO, OOYA, 2005b; KUMAMOTO, OOYA, 2006a; BELLO et al, 2007). De

acordo com a Classificação de Tumores Odontogênicos da Organização Mundial de

Saúde (OMS) de 2005, o ameloblastoma é uma lesão rara, derivada do epitélio

odontogênico, sem a participação do ectomesênquima odontogênico (BARNES et al,

2005).

Em relação à origem do ameloblastoma, Neville et al (2004) afirmam que esse

tumor pode originar-se de remanescentes da lâmina dentária e do órgão do esmalte,

do revestimento epitelial de um cisto odontogênico ou de células da camada basal

da mucosa oral.

Estudos realizados em diferentes países constataram que a freqüência de

tumores odontogênicos é baixa entre as biópsias realizadas, com uma variação de

0,7 a 2,5% (DALEY, WYSOCKI, PRINGLE, 1994; MOSQUEDA-TAYLOR et al, 1997;

SANTOS et al, 2001; OCHSENIUS et al, 2002; MODOLO, et al, 2004; TAMME et al,

2004; FERNANDES et al, 2005).

A freqüência e distribuição dos ameloblastomas, segundo dados da literatura,

variam em diferentes países (SANTOS et al, 2001; ADEBAYO, AJIKE, ADEKEYE,

2005; CAMISASCA et al, 2005; BUCHNER, MERREL, CARPENTER, 2006), porém,

ocupam, geralmente, o primeiro ou segundo lugar dos tumores odontogênicos com

maior ocorrência na cavidade oral.

Em países como Nigéria, China, em uma população do Brasil, Hong-Kong e

Japão, estudos têm demonstrado que o ameloblastoma é o tumor odontogênico

mais comum nessas regiões, com uma freqüência que varia de 45,2% a 73,3%

(ODUKOYA, 1995; LU et al, 1998; ADEBAYO, AJIKE, ADEKEYE, 2002 e 2005;

LADEINDE et al, 2005; FERNANDES et al, 2005; BARNES et al, 2005).

Trabalhos realizados no Canadá, México, Chile e Estados Unidos detectaram

que o ameloblastoma ocupa a segunda posição dentre os tumores odontogênicos

mais freqüentes na cavidade oral, perdendo apenas para o odontoma (DALEY,

WYSOCKI, PRINGLE, 1994; MOSQUEDA-TAYLOR et al, 1997; OCHSENIUS et al,

2002; BUCHNER, MERREL, CARPENTER, 2006).

Na Classificação da Organização Mundial de Saúde de 2005, o

ameloblastoma foi dividido em quatro variantes, de acordo com suas características

clínicas, radiográficas e histopatológicas: ameloblastoma sólido ou multicístico,

ameloblastoma periférico ou extra-ósseo, ameloblastoma unicístico e ameloblastoma

desmoplásico (BARNES et al, 2005). Nas classificações anteriores de 1971 e 1992,

o tipo desmoplásico era considerado apenas uma variante histológica do

ameloblastoma (KRAMER, PINDBORG, SHEAR, 1992). Philipsen e Reichart, em

2002, sugeriram as referidas modificações, uma vez que as variantes citadas do

ameloblastoma possuem características clínicas, radiológicas e histológicas

diferentes, assim como comportamento biológico distinto.

No presente trabalho, será analisado apenas o ameloblastoma sólido

caracterizado por um comportamento mais agressivo em comparação com as

demais variantes do tumor.

2.1.1 Ameloblastoma sólido ou multicístico

O ameloblastoma sólido é um tumor odontogênico benigno de crescimento

lento, porém localmente invasivo (KUMAMOTO, OHKI, OOYA, 2005; GOMES et al,

2006; OKADA, YAMAMOTO, TILAKARATNE, 2007).

A maioria dos ameloblastomas sólidos acomete indivíduos da meia-idade,

sendo geralmente diagnosticados entre 30 e 60 anos. Raramente pessoas com

menos de 20 anos são afetadas (NEVILLE et al, 2004). Buchner, Merrell e Carpenter

(2006) evidenciaram uma média de idade de 48 anos na população da Califórnia,

Estados Unidos, enquanto Okada, Yamamoto e Tilakaratne (2007) encontraram uma

média de idade de 33,2 anos na população do Sri Lanka.

Barnes et al (2005) afirmam que nos ameloblastomas não há predileção por

sexo. Lu et al (1998), Ladeinde et al (2005) e Buchner, Merrell e Carpenter (2006)

relataram em suas pesquisas uma predileção pelo sexo masculino.

Lu et al (1998) encontraram 264 homens (60%) e 179 mulheres (40%) dos

445 casos de ameloblastoma avaliados na população chinesa. Ladeinde et al (2005)

evidenciaram uma ligeira predileção pelo sexo masculino, com 106 casos de

ameloblastoma diagnosticados em homens (53%) e 95 em mulheres (47%), do total

de 201 casos de ameloblastomas avaliados na Nigéria. Buchner, Merrell e Carpenter

(2006) observaram, na população da Califórnia, que o ameloblastoma sólido foi

diagnosticado em 41 homens (59%) e 28 mulheres (41%) do total de 69 casos do

tumor.

Santos et al (2001) observaram uma preferência pelo sexo feminino, com um

percentual de 56,4% e os homens com 43,6%, do total de 39 casos de

ameloblastomas. O mesmo foi verificado por Mosqueda-Taylor et al (1997) na

população do México e por Ochsenius et al (2002) no Chile.

Em relação à localização, a mandíbula é mais afetada do que a maxila, com

uma forte predileção na região posterior. Quando há o envolvimento da maxila,

geralmente o sítio anatômico de eleição é a região posterior, assim como na

mandíbula (BUCHNER, MERELL, CARPENTER, 2006; GOMES et al, 2006;

OKADA, YAMAMOTO, TILAKARATNE, 2007).

Fernandes et al (2005) encontraram 85% dos 154 ameloblastomas

acometendo mandíbula e a região de molares foi a mais afetada. Dados

semelhantes foram encontrados por Mosqueda-Taylor et al (1997), Lu et al (1998),

Santos et al (2001), Ochsenius et al (2002) e Ladeinde et al (2005) nas populações

do México, da China, do Brasil, do Chile e da Nigéria, respectivamente.

Na análise realizada em 157 ameloblastomas no Sri Lanka, Okada,

Yamamoto e Tilakaratne (2007) encontraram 94,3% desses tumores na mandíbula e

apenas 5,7% na maxila, sendo que dos 148 casos que afetaram a mandíbula, 100

casos estavam localizados na região posterior.

A sintomatologia nem sempre se faz presente, sendo que as lesões menores

só são detectadas através de exames radiográficos. O crescimento da lesão é lento,

podendo alcançar grandes tamanhos, causando tumefação e expansão óssea, bem

como reabsorção da raiz de elementos dentários adjacentes. Raramente se observa

dor e parestesia (GOMES et al, 2002; ABU EL-NAAJ, EMODI, PELED, 2005).

Considerando o comportamento biológico dos ameloblastomas, Vered et al

(2005) relatam que os miofibroblastos são encontrados no estroma de neoplasias e

possuem um potencial de facilitar a progressão de lesões neoplásicas de origem

epitelial. De acordo com os referidos autores, a alta freqüência de miofibroblastos no

estroma de lesões odontogênicas agressivas, como nos ameloblastomas sólidos,

pode contribuir para o comportamento biológico dessa lesão.

Estudos genéticos realizados por Lim et al (2006) revelam a existência de

genes superexpressos em ameloblastomas que estão relacionados com o

desenvolvimento e a progressão desse tumor. Esses genes estão envolvidos em

processos celulares como: ciclo celular, crescimento da célula, transcrição, adesão e

invasão celular entre outros. A presença de subexpressão de genes relacionados

com a matriz extracelular, adesão, invasão, resposta imunológica do hospedeiro,

entre outros processos, também pode ser verificada. Para os referidos autores, a

superexpressão e a subexpressão de determinados grupos de genes podem estar

relacionadas com os fatores prognósticos.

Radiograficamente, os ameloblastomas sólidos apresentam uma imagem

radiolúcida multilocular ou unilocular com as bordas festonadas. Quando

multilocular, as loculações grandes são descritas com o aspecto de bolhas de sabão,

enquanto que as menores são denominadas como favos de mel. A imagem

unilocular pode lembrar uma lesão cística. Evidencia-se, ainda, expansão das

corticais ósseas e reabsorção radicular de dentes adjacentes à lesão. Outra

característica que pode ser encontrada é a presença de elemento dentário incluso e,

nesse caso, o terceiro molar inferior é o dente mais frequentemente associado. O

diagnóstico definitivo não pode ser dado apenas com a análise das características

radiográficas, uma vez que outras lesões odontogênicas podem ter um aspecto

radiográfico semelhante (GOMES et al, 2002; SANTANA, BORAKS, SETTANNI,

2004; LEDESMA-MONTES et al, 2007).

Conforme Kumamoto, Kimi e Ooya (2001a), Souza, Sousa e Pinto, (2001) e

Zemann et al (2007), os ameloblastomas sólidos apresentam histologicamente

diversos padrões, podendo ser folicular, plexiforme, acantomatoso, de células

granulares e de células basais. Os tipos folicular e plexiforme são os mais

encontrados e muitas vezes há associação de mais de um tipo histológico.

O tipo folicular consiste em proliferação de ilhas e ninhos de epitélio

odontogênico em um estroma de tecido conjuntivo fibroso maduro. Os ninhos

apresentam as células da periferia colunares e altas, por vezes, cúbicas, que se

assemelham aos ameloblastos. Essas células estão dispostas em paliçadas, com

núcleos hipercromados e polarização invertida. A porção central dos ninhos é

constituída por células arranjadas frouxamente, lembrando o retículo estrelado do

órgão do esmalte. Pode ocorrer a formação de cistos nos ninhos epiteliais. O padrão

plexiforme exibe a formação de cordões de epitélio odontogênico que se

anastomosam, com as células da periferia exibindo morfologia colunar ou cúbica,

semelhante aos ameloblastos e estão circundando células epiteliais frouxamente

arranjadas. O estroma geralmente é frouxo. A formação cística nesse tipo histológico

é mais incomum e quando presente está associada à degeneração do estroma. O

ameloblastoma acantomatoso caracteriza-se pela metaplasia escamosa e pela

presença de ceratina na porção central das ilhas epiteliais de um ameloblastoma do

tipo folicular. O padrão do ameloblastoma de células granulares exibe células

granulares, com citoplasma abundante e grânulos eosinofílicos. Já o tipo basalóide é

o menos comum e consiste em ninho de células basalóides na porção central e

células cúbicas na sua periferia (NEVILLE et al, 2004; BARNES et al, 2005).

Diversas formas de terapia são relatadas na literatura para o tratamento dos

ameloblastoma sólidos. As modalidades terapêuticas podem variar desde uma

enucleação e curetagem à ressecção em bloco com margens de segurança. Porém,

os tratamentos mais conservadores estão associados a uma alta taxa de

recorrência, pois fragmentos do tumor podem permanecer no osso (GOMES et al,

2002).

Abu El-Naaj, Emodi e Peled (2005) relatam que a taxa de recorrência, quando

se estabelece uma simples curetagem em ameloblastoma, pode ser maior que 75%.

Meer et al (2003), Chapelle et al (2004) e Barros et al (2006) relatam que

ameloblastomas sólidos tratados com enucleação e curetagem exibem taxas de

recidiva em torno de 55 a 90%.

A ressecção marginal em bloco com margem de segurança é o tratamento

comumente estabelecido, apresentando uma taxa de recorrência de

aproximadamente 15%. Em ameloblastomas localizados na região posterior da

maxila, há a possibilidade de infiltração para os espaços medulares, dificultando a

definição de uma margem de segurança adequada, sendo indicado um tratamento

mais radical (KIM, JANG, KOREA, 2001; GOMES et al, 2002; CHAPELLE et al,

2004).

Barros et al (2006) relatam que, como opção de tratamento para

ameloblastomas, há a marsupialização que promove descompressão intratumoral e

redução do tamanho da lesão. Consequentemente, a extensão cirúrgica pode ser

minimizada, evitando cirurgias radicais; porém, é necessário haver cooperação e

assiduidade do paciente. Em sua pesquisa, os autores citados verificaram através da

análise imuno-histoquímica do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA, do

inglês proliferating cell nuclear antigen) e da proteína p53, que a utilização da

marsupialização como forma de tratamento não propiciou uma diminuição na

capacidade proliferativa das células tumorais.

Gomes et al (2002) relataram a possibilidade da utilização da crioterapia,

após curetagem ou enucleação como forma de tratamento para o ameloblastoma

sólido. A crioterapia utiliza nitrogênio líquido a baixas temperaturas (-198ºC)

promovendo a desvitalização do osso e manutenção da matriz inorgânica.

De acordo com Vayvada et al (2006) é necessário utilizar métodos de

reconstrução para reabilitação oral após tratamentos mutiladores. Esse

procedimento é satisfatório principalmente se realizado imediatamente após a

mandibulectomia.

O acompanhamento por um período de tempo prolongado deve ser

estabelecido após o tratamento dos ameloblastomas sólidos, uma vez que, as

recorrências podem demorar mais de 10 anos a aparecer (GOMES et al, 2006).

O ameloblastoma raramente apresenta um comportamento maligno, tendo

uma freqüência de malignidade de menos de 1%. Os termos utilizados para as

lesões malignas são ameloblastoma maligno e carcinoma ameloblástico

(KUMAMOTO, KIMI, OOYA, 2001b; REGEZI, 2002). O primeiro exibe uma lesão

metastática que microscopicamente se assemelha ao ameloblastoma, sem

características de malignidade; enquanto o carcinoma ameloblástico apresenta

células com características de malignidade no tumor primário e nos casos de

recorrência e metástase, quando presentes (KUMAMOTO, OHKI, OOYA, 2002;

KUMAMOTO, OOYA, 2005a).

2.2 TUMOR ODONTOGÊNCIO ADENOMATÓIDE

O tumor odontogênico adenomatóide é uma lesão de natureza benigna. Sua

descrição foi realizada primeiramente por Dreiblat em 1907 como

adenoameloblastoma, sendo uma variante do ameloblastoma. A denominação de

tumor adenomatóide ameloblástico também já foi usada como sinônimo para o

referido tumor. Porém, a partir de 1969, Philipsen e Birn propuseram o termo tumor

odontogênico adenomatóide, sendo uma entidade patológica distinta, devido as suas

características clínicas e seu comportamento biológico. Essa denominação foi aceita

e utilizada pela OMS na primeira classificação de tumores odontogênicos em 1971,

na qual era considerado como de natureza epitelial (SILVA et al, 2004; SEMPERE et

al, 2006).

Na classificação da OMS de 1992, o tumor odontogênico adenomatóide

passou a fazer parte dos tumores odontogênicos de epitélio odontogênico com

ectomesênquima, contendo ou não formação de tecido duro dentário (KRAMER,

PINDBORG, SHEAR, 1992). Em 2002, Philipsen e Reichart sugeriram que essa

lesão odontogênica fosse classificada juntamente com os tumores odontogênicos de

epitélio odontogênico sem a participação do ectomesênquima. Os autores afirmaram

que material de dentina displásica pode ser ocasionalmente encontrado nesses

tumores, porém não deve ser considerado dentina normal.

Na nova classificação da OMS de tumores odontogênicos publicada em 2005,

o tumor odontogênico adenomatóide passou a ser enquadrado nos tumores de

epitélio odontogênico sem ectomesênquima (BARNES et al, 2005).

O tumor odontogênico adenomatóide compreende cerca de 2 a 7% dos

tumores odontogênicos (SILVA et al, 2004; LEON et al, 2005). Estudos realizados

em países como Canadá, México, Chile, Brasil e Estados Unidos da América

confirmam esse dado (DALEY, WYSOCKI, PRINGLE, 2004; MOSQUEDA-TAYLOR

et al, 1997; OCHSENIUS et al, 2002; FERNANDES et al, 2005; BUCHNER,

MERRELL, CARPENTER, 2006).

Pesquisas realizadas na China, em uma população do Brasil e na Nigéria

encontraram uma freqüência ligeiramente maior que os estudos citados. Nesses

países, o tumor odontogênico adenomatóide foi o terceiro mais comum dentre os

tumores odontogênicos, com freqüência que variou de 8,3% a 9,0% (LU et al, 1998;

SANTOS et al, 2001; ADEBAYO AJIKE, ADEKEYE, 2002).

A histogênese do tumor odontogênico adenomatóide é controversa, assim

como sua natureza neoplásica ou hamartomatosa. De acordo com Nigam, Gupta e

Chaturvedi (2005), esse tumor é considerado mais uma lesão hamartomatosa do

que um neoplasma verdadeiro. Sua histogênese é incerta, porém há evidências que

esse tumor se origina a partir da lâmina dentária ou de seus remanescentes.

Crivelini et al (2003) e Crivelini, Soubhia e Felipini (2005) consideram o tumor

odontogênico adenomatóide como um hamartoma e sua origem estaria relacionada

com o epitélio reduzido do órgão do esmalte.

Sempere et al (2006) relatam que a baixa capacidade de proliferação celular,

a presença de calcificações ou a formação inadequada de tecido dentinóide, além

da produção de material semelhante à substância amilóide são características que

reforçam a idéia de que o tumor odontogênico adenomatóide seria um hamartoma.

Lopes et al (2005) verificaram em uma análise imuno-histoquímica a presença

de citoqueratinas 14 e 19 em tumores odontogênicos adenomatóides e, com isso,

confirmaram a sua origem a partir do epitélio odontogênico.

Takahashi et al (2001) afirmam que a origem odontogênica para o tumor

odontogênico adenomatóide é a mais aceita pelos pesquisadores, pois o mesmo é

uma lesão intra-óssea e frequentemente associado a outras lesões como o cisto

dentígero, assim como dentes impactados. Além disto, possui características

similares aos componentes do órgão do esmalte, da lâmina dentária, epitélio

reduzido do órgão do esmalte e seus remanescentes.

O tumor odontogênico adenomatóide é considerado um tumor odontogênico

de crescimento lento, porém progressivo. Pode causar assimetria facial e geralmente

está associado a um dente incluso (PHILIPSEN, REICHART, 1998; SILVA et al,

2004).

Sempere et al (2006) realizaram um estudo imuno-histoquímico em tumores

odontogênicos adenomatóides e verificaram uma baixa reatividade para o marcador

de proliferação celular Ki67. Apenas 2 a 3% das células tumorais fusiformes e dos

nódulos marcaram para o Ki67, confirmando seu baixo potencial de proliferação.

O período mais frequentemente acometido é a segunda década de vida,

sendo comum em adolescentes e mulheres (SEMPERE et al, 2006; CHUAN-XIANG,

YAN, 2007). Estudos realizados por Okada, Yamamoto e Tilakaratne (2007)

evidenciaram uma média de idade de acometimento de 18,2 anos e uma predileção

pelo sexo feminino na proporção de homem:mulher de 1:2,5. Reiterando os achados

acima citados, citam-se os trabalhos realizados por Mosqueda-Taylor et al (1997) no

México, Lu et al (1998) na China, Santos et al (2001) e Fernandes et al (2005) no

Brasil e Ladeinde et al (2005) na Nigéria.

Ochsenius et al (2002) e Adebayo, Ajike e Adekeye (2005) encontraram

resultados diferentes em suas pesquisas. Ochsenius et al (2002) observaram no

Chile, 54,2% de homens afetados por esse tumor e 45,8% de mulheres. Na Nigéria,

Adebayo, Ajike e Adekeye (2005) verificaram uma prevalência um pouco maior do

tumor odontogênico adenomatóide em homens do que em mulheres, com um

percentual de 56% para o sexo masculino e 44% para o feminino.

Quanto à localização, há uma maior incidência na maxila em relação à

mandíbula, sendo a região anterior o sítio anatômico mais comumente afetado

(SILVA et al, 2004; LEON et al, 2005; SEMPERE et al, 2006). Características

semelhantes foram constatadas em trabalhos realizados por Okada, Yamamoto e

Tilakaratne em 2007, que detectaram na população do Sri Lanka uma distribuição de

57,1% desses tumores em maxila e 42,9% em mandíbula. O mesmo foi evidenciado

por Mosqueda-Taylor et al (1997), Lu et al (1998), Fernandes et al (2005) e Ladeinde

et al (2005) na população mexicana, chinesa, brasileira e nigeriana,

respectivamente.

O tumor odontogênico adenomatóide possui três variantes clinicopatológicas:

o tipo intra-ósseo folicular, quando associado a um elemento incluso; intra-ósseo

extrafolicular, sem associação com elemento incluso; e o tipo periférico ou extra-

ósseo. A variante periférica raramente é observada, correspondendo a 3% dos

tumores odontogênicos adenomatóides. Clinicamente, se assemelha a lesões

fibrosas que acometem a gengiva (NIGAM, GUPTA, CHATURVEDI, 2005; CHUAN-

XIANG, YAN, 2007).

Em 60% a 73% dos casos, o tumor odontogênico adenomatóide está

associado a um elemento incluso, preferencialmente o canino, sendo o tipo folicular

o mais freqüente (SILVA et al, 2004; SEMPERE et al, 2006).

A maioria dos tumores odontogênicos adenomatóides não causa

sintomatologia dolorosa, sendo diagnosticados em exames radiográficos de rotina.

Com o crescimento da lesão, pode ser observada expansão da cortical óssea e

assimetria facial, assim como o deslocamento de dentes adjacentes e sintomatologia

dolorosa (REGEZI, SCIUBBA, 2000; SILVA et al, 2004).

Radiograficamente, o tipo folicular apresenta-se como uma imagem

radiolúcida bem definida, circundando a coroa do dente incluso e se estendendo ao

longo da raiz, ultrapassando a junção esmalte-cemento. A diferenciação do tumor

odontogênico adenomatóide com o cisto dentígero pode ser difícil nesses casos,

porém o prolongamento da imagem radiolúcida para a raiz pode ser uma

característica auxiliar no diagnóstico (PHILIPSEN, REICHART, 1998; NIGAM,

GUPTA, CHATURVEDI, 2005).

O tipo extrafolicular, que representa aproximadamente 24% dos tumores

odontogênicos adenomatóides, não está associado ao elemento incluso e exibe uma

imagem radiolúcida unilocular. Focos radiopacos discretos podem estar presentes

em 2/3 dos tumores odontogênicos adenomatóides intra-ósseos (SILVA et al, 2004;

SEMPERE et al, 2006).

A variante periférica nem sempre exibe uma imagem radiográfica, podendo

ser evidenciada uma erosão no osso alveolar (PHILIPSEN, REICHART, 1998;

KIGAM, GUPTA, CHATURVEDI, 2005).

Conforme Philipsen e Reichart (1998), o tumor odontogênico adenomatóide,

macroscopicamente, é uma lesão geralmente encapsulada com uma cápsula fibrosa

bem definida. A massa tumoral é sólida e pode apresentar espaços císticos

pequenos contendo um material amarelado. No tipo folicular, a coroa e parte da raiz

do dente incluso podem estar associados à massa tumoral.

Em relação aos aspectos microscópicos, o tumor exibe células do epitélio

odontogênico com formas variadas, podendo ser fusiformes, cuboidais ou colunares,

dispostas em ninhos e estruturas semelhantes a rosetas em um escasso estroma de

tecido conjuntivo fibroso. Na porção central das rosetas, pode ser evidenciado um

material eosinofílico amorfo compatível com substância amilóide. Estruturas

semelhantes a ductos ou tubulares podem ser visualizadas, em quantidade variável

ou estar ausentes. As células da periferia desses túbulos que rodeiam o espaço

central são colunares ou cúbicas, com o núcleo polarizado no sentido oposto à

superfície luminal. Essas estruturas não são verdadeiros ductos. O pseudo-lúmen é

formado pela secreção das células epiteliais colunares e pode estar vazio ou

preenchido com material eosinofílico ou células descamadas. Podem ser

visualizados, em alguns casos, focos de calcificação no tumor em quantidade

variável, sendo interpretados como cemento ou material dentinóide (PHILIPSEN,

REICHART, 1998; MURATA et al, 2000; NEVILLE et al, 2004).

O tratamento do tumor odontogênico adenomatóide é a excisão cirúrgica

local, podendo ser realizadas tanto a enucleação como a curetagem. A ressecção

em bloco só é indicada em casos extremos, onde há riscos de fratura óssea. Por ser

uma lesão encapsulada, sua remoção é considerada fácil e a recorrência raramente

ocorre (PHILIPSEN, REICHART, 1998; BARBOZA et al, 2005; NIGAM, GUPTA,

CHATURVEDI, 2005; SEMPERE et al, 2006).

2.3 MATRIZ EXTRACELULAR (MEC)

A matriz extracelular é composta por uma rede complexa de macromoléculas

presente nos espaços intercelulares, responsável por fornecer sustentação para as

células, sendo secretada localmente por estas (RAITZ, MARTINS, ARAÚJO, 2003;

MOTT, WERB, 2004). A MEC está distribuída entre os vários tecidos do organismo

de forma diferente e fornece condições adequadas para o crescimento e

diferenciação celular (PEREIRA et al, 2005).

Labat-Robert (2004) afirma que a matriz extracelular secretada pelas células

ocorre de uma forma programada e geneticamente determinada, porém pode ser

influenciada pelo meio.

Três grupos são responsáveis pela formação da matriz extracelular: proteínas

estruturais fibrosas, proteínas estruturais não-fibrosas e a substância fundamental

com proteínas fibrosas imersas. Dentre as proteínas estruturais fibrosas estão o

colágeno e a elastina. Já as proteínas não-fibrilares são representadas pelas

glicoproteínas adesivas, entre elas a fibronectina e a laminina, além da tenascina,

entactina e ondulina, que têm função de proporcionar adesão célula-matriz. A

substância fundamental é composta por um gel altamente hidratado com

glicosaminoglicanos (ácido hialurônico) e proteoglicanos (PEREIRA et al, 2005).

O colágeno, principal proteína da matriz extracelular, é secretado por

fibroblastos existentes no tecido conjuntivo e outros tipos celulares. Nesse tecido,

encontram-se os colágenos fibrilares, representados pelos tipos I, II, III, V, e XI,

sendo o tipo I o principal colágeno presente na pele e nos ossos; os colágenos

associados a fibrilas, que são os tipos IX e XII; e os formadores de rede,

denominados tipo IV e VII. Sua estrutura é longa e rígida, formada por uma fita tripla

helicoidal, na qual três cadeias polipeptídicas de colágeno estão entrelaçadas

formando uma fita única (ALBERTS et al, 2004).

As macromoléculas que formam a matriz extracelular podem se organizar em

matriz intersticial e membrana basal. A matriz intersticial está presente nos espaços

por entre as células, bem como no tecido conjuntivo, sendo constituída por colágeno

fibrilar (tipo I, III, V) e não-fibrilar, além de elastina, fibronectina, proteoglicanos e

ácido hialurônico (KUMAR, ABBAS, FAUSTO, 2004; PEREIRA et al, 2005).

A membrana basal, constituída por colágeno não-fribilar, principalmente o tipo

IV, laminina, heparan sulfato e proteoglicanas, é produzida por células epiteliais e

mesenquimais, estando associadas à superfície celular (NAKANO et al, 2002;

KUMAMOTO et al, 2003; PEREIRA et al, 2005). Dentre as funções desempenhadas

pela membrana basal estão: atuação no processo de reparo e na orientação da

proliferação celular, indução à diferenciação das células, além de servir como

barreira estrutural à invasão tumoral (OLIVEIRA et al, 2002).

Dentre as diversas funções que a matriz extracelular exerce, pode-se citar:

armazenamento de fatores biologicamente ativos, como os fatores de crescimento,

as citocinas e os hormônios; fornecimento de substrato para adesão, migração e

proliferação das células, influenciando e regulando as funções celulares, assim como

o crescimento, a morfologia e a diferenciação das células. A matriz extracelular

desempenha o papel de sustentação, auxiliando na manutenção das células e dos

tecidos unidos, além de manter um ambiente organizado no qual as células podem

mover-se e interagir umas com as outras (THESLEFF, PARTANEN, VAINIO, 1991;

WERNERT, 1994; MEDEIROS, 2001; RAITZ, MARTINS, ARAÚJO, 2003; MOTT,

WERB, 2004; OLIVEIRA et al, 2004; ANDRADE et al, 2007).

De acordo com Alberts et al (2004), a matriz extracelular é de extrema

importância na regulação dos processos biológicos nos tecidos, seja em processos

fisiológicos do organismo ou em condições patológicas. Seus componentes são

constantemente renovados e sua degradação está associada à atuação de

proteases específicas, denominadas de metaloproteinases de matriz (MMPs), que

são secretadas por células locais.

As MMPs têm a capacidade de degradar os componentes da MEC, alterando

a aderência das células e liberando fatores bioativos armazenados na MEC,

atuando, portanto, na modulação da matriz extracelular (MOTT, WERB, 2004;

PEREIRA et al, 2005).

2.4 METALOPROTEINASES DE MATRIZ (MMPs)

As metaloproteinases de matriz (MMPs) compõem uma família de enzimas

proteolíticas dependentes de zinco e cálcio que têm a capacidade de degradar a

matriz extracelular intersticial e os componentes da membrana basal (KUMAMOTO

et al, 2003; SORSA, TJÄDERHANE, SALO, 2004; PINHEIRO et al, 2004; NAGASE,

VISSE, MURPHY, 2006).

O primeiro membro da família das MMPs, a colagenase, foi descoberto por

Gross e Lapière em 1962 ao estudarem a reabsorção da cauda de girinos. Os

pesquisadores verificaram a degradação do colágeno por ação enzimática durante a

metamorfose (WOESSNER JÚNIOR, 1991; SOUZA, LINE, 2002; ALA-AHO,

KÄHÄRI, 2005). Entretanto, no ano de 1949, já havia relatos da existência de

enzimas, as MMPs, que teriam a capacidade de facilitar o crescimento tumoral

(VERMA, HANSCH, 2007).

As metaloproteinases de matriz podem ser produzidas por células de vários

tipos como: fibroblastos, macrófagos, neutrófilos, linfócitos, células sinoviais e

epiteliais, assim como células tumorais (BAKER et al, 2006; VERMA, HANSCH,

2007).

Atualmente, já foram identificados aproximadamente 24 tipos de

metaloproteinases de matriz e sua classificação é feita de acordo com o substrato

específico que degradam e com sua estrutura molecular. As MMPs se dividem em

MMP tipo-solúvel e MMP associada à membrana. Dentre as MMPs solúveis, estão

as colagenases, gelatinases, estromelisinas, matrilisinas e um grupo heterogêneo de

MMPs. As colagenases são representadas pelas MMP-1, -8 e -13; já as gelatinases

pelas MMP-2 e -9; as estromelisinas pelas MMP-3, -10 e as matrilisinas pelas MMP-

7 e -26. Essas enzimas têm importante função nos eventos de remodelação

(SOUZA, LINE, 2002; NABESHIMA et al, 2002; KUMAMOTO et al, 2003; SORSA,

TJÄDERHANE, SALO, 2004; SILVEIRA et al, 2007).

De acordo com Nabeshima et al (2002), as metaloproteinases de matriz

associadas à membrana são representadas por seis tipos de metaloproteinases,

sendo divididas de acordo com o mecanismo de ancoragem à membrana. As

enzimas MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT5-MMP são do tipo I transmembrana,

enquanto as metaloproteinases MT4-MMP e MT6-MMP estão associadas à

membrana através da molécula de glicosilfosfatilinositol. Entre as funções

desempenhadas por essas MT-MMP estão ações relacionadas com eventos

celulares como migração e invasão celular. As MT-MMPs são ativadas no interior

das células e expressas na sua superfície na forma ativa.

Entre as principais funções exercidas pelas MMPs estão: a degradação dos

componentes da matriz extracelular, a facilitação da migração celular, a

diferenciação celular e a participação nos processos de reparo, de

neovascularização, apoptose e em condições patológicas, como invasão tumoral

(RANDALL, HALL, 2004; NAGASE, VISSE, MURPHY, 2006).

As MMPs são formadas por uma estrutura que contém: domínio pré-peptídico,

seguido do pró-peptídeo e do domínio catalítico, além do domínio c-terminal

hemopexina presente em quase todas metaloproteinases. No domínio pré-peptídico

encontra-se o peptídeo sinalizador, que é removido após o direcionamento e síntese

da enzima no retículo endoplasmático. O pró-peptídeo possui aproximadamente 80

aminoácidos e é responsável pela manutenção da latência da pró-MMP. O domínio

catalítico, com cerca de 170 aminoácidos, contém zinco e necessita de cálcio para

sua estabilidade e atividade. O domínio c-terminal hemopexina, responsável pela

determinação da especificidade do substrato e pela interação com o inibidor

endógeno, possui 200 aminoácidos e está presente em todas metaloproteinases

ligadas ao domínio catalítico, com exceção das matrilisinas (MMP-7 e -26) e da

MMP-23 (STERNLICHT, WERB, 2001; SOUZA, LINE, 2002; NABESHIMA et al,

2002; FOLGUERAS et al, 2004; NAGASE, VISSE, MURPHY, 2006).

Algumas MMPs, como as MMP- 2 e -9, necessitam de domínios adicionais ou

pequenas inserções. Portanto, verifica-se a presença de três inserções tipo

fibronectina II ligadas ao domínio catalítico nessas metaloproteinases

(STERNLICHT, WERB, 2001; SOUZA, LINE, 2002; NABESHIMA et al, 2002;

FOLGUERAS et al, 2004; NAGASE, VISSE, MURPHY, 2006; CAWSTON, WILSON,

2006).

Já as MT-MMP contêm um domínio adicional transmembrana ou uma

molécula de glicosilfosfatilinositol que permite sua ancoragem na superfície celular

(STERNLICHT, WERB, 2001; VERMA, HANSCH, 2007). Há ainda nas MT-MMPs a

presença de uma inserção adicional localizada entre o pró-peptídeo e o domínio

catalítico que é clivado pela protease semelhante à furina, promovendo a ativação

intracelular da proenzima (FOLGUERAS et al, 2004).

As MMPs são secretadas de forma inativa como um zimógeno e sua ativação

nos tecidos ocorre pela clivagem do pró-peptídeo (SOUZA, LINE, 2002;

NABESHIMA et al, 2002). De acordo com Rundhaug (2003), as MMPs são ativadas

por proteases, como a plasmina e furina, entretanto, algumas metaloproteinases

podem ser ativadas por membros de sua família.

A ação das MMPs é muito importante na regulação da matriz extracelular, no

desenvolvimento embrionário e na remodelação dos tecidos. Essas enzimas

também estão envolvidas em diferentes processos fisiológicos e patológicos como a

inflamação, doença periodontal, artrite reumatóide, osteoporose, invasão tumoral e

metástase (PINHEIRO et al, 2004; SORSA, TJÄDERHANE, SALO, 2004; VICENTE

et al, 2005; KUMAMOTO, OOYA, 2006b).

Segundo Mott e Werb (2004), as MMPs são responsáveis por atuar na

liberação de fatores de crescimento e na modificação da interação na interface

célula-matriz extracelular, sendo necessárias na regulação da matriz extracelular.

Rundhaug (2003), Ala-Aho e Kähäri (2005) e Nagase, Visse e Murphy (2006)

afirmam que a expressão e as atividades das MMPs passam por um processo de

regulação. Portanto, a síntese e a secreção das metaloproteinases ocorrem quando

necessário, por sinais através de citocinas, fatores de crescimento, hormônios,

interação célula-célula e matriz-célula, bem como mecanismos de estresse e

transformações oncogênicas. Em condições normais, a atividade das MMPs nos

tecidos é mínima.

Segundo Thomas, Lewis e Speight (1999), a interleucina-1β (IL-1β, do inglês

interleukin-1

) e o fator de transformação do crescimento-β (TGF-β, do inglês

transforming growth factor-

) são substâncias com capacidade de regular a

expressão das MMPs. O primeiro atua estimulando a expressão das

metaloproteinases, enquanto o TGF-β inibe a expressão gênica das mesmas.

De acordo com Folgueras et al (2004) e Verma e Hansch (2007), as MMPs

em condições fisiológicas normais podem ser controladas em três diferentes

estágios: em nível transcricional, na ativação do zimógeno e na inibição da forma

ativa através do inibidor natural das metaloproteinases de matriz (TIMP). Já em

condições patológicas, o equilíbrio é perdido e o aumento da atividade da MMP

promove a degradação do tecido.

A MMP-2 é a única metaloproteinase não regulada em nível transcricional

como as demais MMPs. Sua expressão é controlada por um mecanismo único de

ativação enzimática e de estabilização pós-transcricional do RNAm (STERNLICHT,

WERB, 2001).

Em relação à regulação transcricional, a expressão gênica das MMPs pode

sofrer influência das variações genéticas, como a presença de fragmentos de

polimorfismo nas regiões promotoras de genes em algumas MMPs, influenciando o

desenvolvimento e a progressão de diferentes patologias (STERNLICHT, WERB,

2001), bem como a susceptibilidade de desenvolver câncer (FOLGUERAS et al,

2004).

A regulação da forma ativa das metaloproteinases de matriz pode ser feita

através de inibidores endógenos. A α2-macroglobulina e os inibidores naturais das

metaloproteinases de matriz (TIMPs) são substâncias endógenas capazes de inibir

as MMPs (NAGASE, VISSE, MURPHY, 2006), sendo o TIMP o inibidor mais

específico das MMPs (FOLGUERAS et al, 2004).

A α2-macroglobulina é uma glicoproteína plasmática de 725kDa capaz de

inibir as MMPs no plasma e nos fluídos tissulares através do aprisionamento dessas

enzimas dentro da macroglobulina e posterior endocitose do complexo α2-

macroglobulina/MMP, removendo a MMP e impedindo consequentemente sua ação

(STERNLICHT, WERB, 2001; NAGASE, VISSE, MURPHY, 2006).

Sternlicht e Werb (2001), Kumamoto et al (2003) e Ala-Aho e Kähäri (2005),

relatam que os inibidores naturais das metaloproteinases de matriz (TIMPs) são os

principais reguladores da atividade das MMPs no meio extracelular. A família dos

TIMPs é composta por quatro pequenas proteínas multifuncionais, com tamanhos

que variam de 21 a 28kDa, que atuam inibindo as formas ativas das MMPs, assim

como formas latentes. São denominados TIMP-1, TIMP-2 , TIMP-3 e TIMP-4. A

estrutura desses inibidores apresenta dois domínios: N-terminal, necessário para a

inibição, e C-terminal, responsável pela especificidade. A atividade inibitória dessas

moléculas é um processo reversível e ocorre de forma semelhante, mas elas diferem

em relação à distribuição nos tecidos, à regulação da sua expressão e à interação

com pro-gelatinases.

A expressão dos TIMPs pode ser regulada por vários fatores como: IL-1β,

interleucina-6 (IL-6, do inglês interleukin-6), fator de crescimento epidérmico (EGF,

do inglês epidermal growth factor), fator de crescimento básico de fibroblastos

(BFGF, do inglês basic fibroblast growth factor), fator de crescimento derivado de

plaquetas (PDGF, do inglês platelet-derived growth factor), fator de necrose tumoral-

α (TNF-α, do inglês tumor necrosis factor-

), TGF-β, retinóides, fatores séricos,

ésteres de forbol e ativadores de quinases A e C. Esses fatores também estão

associados à regulação do crescimento e funções das células, assim como, a

expressão das MMPs e de outras proteínas da matriz extracelular. Acredita-se que

isto ocorra devido à existência de fatores de transcrição comuns nos genes das

MMPs, TIMPs e outras proteínas da MEC (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999;

STAMENKOVIC, 2000).

Westermarck e Kähäri (1999) e Visse e Nagase (2003) relatam outras funções

dos TIMPs, além da capacidade de inibir as metaloproteinases de matriz. Essas

moléculas estão envolvidas em funções biológicas, estimulando o crescimento de

diferentes tipos celulares e induzindo mudanças na morfologia das células. O TIMP-

2 possui a capacidade de inibir a proliferação das células endoteliais induzidas pelo

fator de crescimento básico fibroblástico. Já o TIMP-3 possui uma ação pró-

apoptótica, enquanto os TIMP-1 e -2 são anti-apoptóticos.

Recentemente, outros inibidores endógenos, como o intensificador da

proteinase C-terminal do pró-colágeno, foram descobertos. Essas proteínas

possuem uma seqüência semelhante ao domínio N-terminal dos TIMPs

(FOLGUERAS et al, 2004).

Segundo Souza e Line (2002), Kumamoto et al (2003) e Pinheiro et al (2004),

o equilíbrio entre a expressão das MMPs e dos TIMPs determina a extensão da

degradação da matriz extracelular, seja em condições fisiológicas ou patológicas. O

balanço entre a produção de MMPs e seus inibidores TIMPs é de extrema

importância para a manutenção da homeostase da matriz extracelular. O

desequilíbrio entre elas pode levar ao desenvolvimento de diversas patologias.

Ikebe et al (1999), Nagel et al (2004) e Pinheiro et al (2004) afirmam que a

atividade proteolítica das MMPs desempenha um papel crucial na invasão e na

metástase de diversos tipos de câncer. Dessa forma as gelatinases, representadas

pelas MMPs-2 e -9, exercem uma importante função, já que atuam diretamente

sobre os componentes da membrana basal, considerada a primeira barreira a ser

degradada na invasão tumoral.

Na cavidade oral, diferentes processos patológicos, como a destruição do

tecido periodontal na periodontite, a cárie de raiz, a invasão tumoral e as desordens

temporomandibulares, são associados à ação das MMPs (SOUZA, LINE, 2002).

Baker et al (2006) enfatizam a importância das MMPs no câncer, relatando a

participação dessas enzimas na degradação dos componentes da matriz extracelular

e da membrana basal, na angiogênese, na invasão local, vascular e linfática. Os

autores detectaram, em sua pesquisa realizada com carcinoma de células

escamosas, um aumento nos níveis de MMP-1, -2, -3, e -9 quando comparado com

tecido oral normal.

No estudo de Amorim (2004) observou-se a expressão das matrilisinas (MMP-

7 e -26) e da β-catenina no carcinoma de células escamosas de língua e sua

correlação entre a presença ou não de metástases tumorais. Verificou-se que o

potencial metastático do carcinoma de células escamosas em língua não pode ser

determinado de forma eficaz pelo método utilizado.

Barros (2006) constatou em sua pesquisa a participação marcante das

metaloproteinases -1, -2, -7, -9 e -26 no desenvolvimento de carcinoma epidermóide

de lábio inferior e língua. As MMPs tiveram a expressão mais evidente no front de

invasão. Observou-se positividade para a MMP-1 nas células neoplásicas no front de

invasão em 93,3% dos casos analisados, constatando-se, segundo a autora, a

importância da MMP-1 no processo de invasão tumoral. Em relação à MMP-2, 60%

dos 30 casos de carcinoma epidermóide estudados apresentaram imunomarcação

positiva e 63,33% dos casos exibiram imunorreatividade para a MMP-9, indicando a

participação das gelatinases no desenvolvimento dessa neoplasia, uma vez que

possuem a capacidade de degradar o colágeno tipo IV e outros componentes da

membrana basal.

Vicente et al (2005) afirmam que as gelatinases (MMP-2 e -9) são importantes

no processo de invasão tumoral devido à capacidade de degradar o colágeno tipo

IV, principal constituinte da membrana basal, que é a primeira barreira a ser rompida

nesse processo.

As metaloproteinases também têm sido alvo de estudo em lesões

odontogênicos, como cistos e tumores. Nos cistos odontogênicos estão associadas

ao crescimento e à expansão cística, uma vez que possuem a capacidade de

degradar os constituintes da matriz extracelular. Em relação aos tumores

odontogênicos, a expressão das MMPs está relacionada com o crescimento e

progressão tumoral (KUBOTA et al, 2002; KUMAMOTO et al, 2003; PINHEIRO et al,

2004; SILVEIRA et al, 2007).

De acordo com Kumamoto (2006), as metaloproteinases também atuam nos

tumores odontogênicos uma vez que os mesmos possuem os componentes da

matriz extracelular, como colágeno, fibronectina, tenascina, laminina e

proteoglicanos. As MMPs podem contribuir para a invasividade e progressão do

tumor.

2.4.1 MMP-1 (Colagenase-1)

As colagenases compreendem três tipos de metaloproteinases que possuem

a capacidade de degradar as fibras colágenas tipo I, II, III, V, IX. As colagenases 1, 2

e 3 correspondem às MMPs-1, -8 e -13, respectivamente (ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005;

PEREIRA et al, 2006).

A degradação do colágeno fibrilar leva à formação de moléculas que são

termicamente instáveis e formam gelatinas que posteriormente serão degradadas

por outro membro da família das MMPs (PARDO, SELMAN, 2005).

De acordo com Borkakoti (2000), a colagenase é a única proteína que possui

a capacidade de clivar a tripla hélice do colágeno em um local específico produzindo

fragmentos menores, de ¾ e ¼ da molécula inicial.

A MMP-1, primeira enzima da família das metaloproteinases, descoberta em

1962, é também denominada de colagenase-1, colagenase fibroblástica e

colagenase intersticial (PARDO, SELMAN, 2005).

A clonagem da primeira MMP-1 de seres humanos e o seu sequenciamento

foram obtidos através de fibroblastos da pele de um adulto (ALA-AHO, KÄHÄRI,

2005).

A MMP-1 é sintetizada como um polipeptídeo e secretada como uma pró-

enzima (PARDO, SELMAN, 2005). Para que ocorra a ativação da MMP-1, é

necessária a conversão das formas latentes de 52 e 57kDa em formas ativas de 42

e 47kDa, respectivamente. De forma seqüencial, as proteases atuam no sítio de

clivagem do pró-peptídeo, produzindo uma forma intermediária de meia-vida curta

com 46kDa, que rapidamente é convertida em uma forma estável de 43kDa. A MMP-

1 pode ser ativada por diferentes moléculas, como plasmina, calicreína e quimase,

bem como, as MMP-3, MMP-7, MMP-10. A estrutura gênica da MMP-1 compõe-se

de 10 éxons e 9 íntrons e sua localização se encontra no braço longo do

cromossomo 11 (WOESSNER JUNIOR, 1991; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).

Em tecidos normais seus níveis são baixos, porém na presença de processos

fisiológicos como cicatrização de feridas, processos de remodelação, bem como em

condições patológicas, sua expressão é elevada. Entre os processos patológicos

citam-se as úlceras cutâneas crônicas e os diferentes tipos de tumores malignos

(PARDO, SELMAN, 2005; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).

A MMP-1 age sobre uma variedade de substratos, sendo considerada uma

molécula multifuncional. Essa enzima é responsável pela degradação de fibras

colágenas tipo I, II, III, VII, VIII e X, além de outras moléculas como perlecana,

agrecana, versicana, tenascina-C, anti-tripsina e α2-macroglobulina (PARDO,

SELMAN, 2005; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).

A inibição da forma ativa da MMP-1 ocorre principalmente pela ação da TIMP-

1, que se mostra mais eficiente que a TIMP-2 (ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).

Em doenças como a artrite reumatóide, demonstrou-se um aumento na

expressão da MMP-1 e consequentemente uma maior degradação do colágeno. Em

diferentes tipos de câncer, a MMP-1 também se encontra em alta concentração

(PARDO, SELMAN, 2005).

Ala-Aho e Kähäri (2005) afirmam que a colagenase 1 atua na degradação das

fibras colágenas fibrilares do tipo I, II e III da matriz extracelular, contribuindo e

sendo essencial para a invasão de células malignas.

A MMP-1 é sintetizada por células tumorais e por fibroblastos estromais,

macrófagos, plasmócitos, linfócitos e neutrófilos, em resposta a fatores produzidos

por células do tumor, e sua expressão pode ser evidenciada no local da invasão

tumoral. A superexpressão dessa metaloproteinase foi determinada em diferentes

tipos de câncer em estágio avançado e está associada a um pobre prognóstico

(ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005; SILVEIRA et al, 2007).

Baker et al (2006) encontraram uma maior concentração de MMP-1 em

amostras de carcinoma de células escamosas quando comparadas com amostras

de tecido oral normal. De acordo com Ala-Aho e Kähäri (2005), a expressão da

MMP-1 está geralmente localizada nas células estromais ao redor das ilhas tumorais

do carcinoma de células escamosas, além das próprias células neoplásicas que são

estimuladas a sintetizar essa enzima.

2.4.2 MMP-2 (Gelatinase A)

A MMP-2, também denominada de gelatinase A, foi a segunda

metaloproteinase de matriz a ser descoberta e tem como principal função degradar o

colágeno tipo IV, componente fundamental da membrana basal, e outros

componentes da matriz extracelular (SORSA, TJÄDERHANE, SALO, 2004), dentre

os quais se podem citar colágeno tipo V, VII, X, gelatina tipo I, fibronectina e elastina

(WOESSNER JÚNIOR, 1991; TERONEN et al, 1995).

A forma latente dessa protease possui 72 kDa, enquanto que a ativa possui

66 kDa. Sua estrutura gênica é composta por 13 éxons e 9 íntrons e localiza-se no

cromossomo 16 (WOESSNER JÚNIOR, 1991; O’TOOLE, 2001).

De acordo com Rundhaug (2003), a ativação da MMP-2 depende não apenas

da MT-MMP, mas também do TIMP-2. Reiterando essa afirmativa, Kumamoto, Kimi

e Ooya (2001a) e Vicente et al (2005) referem que a MMP-2 é secretada na forma

inativa de zimógeno (pró-MMP-2) e para que ocorra a conversão para a forma ativa,

a pró-MMP-2 forma um complexo juntamente com a MT1-MMP e o TIMP-2 na

superfície da célula. Posteriormente, a pró-MMP-2 é ativada pela MT1-MMP.

Ala-Aho e Kähäri (2005) e Nagase, Visse e Murphy (2006) relatam que

diferentes MMPs podem ativar formas latentes de MMPs. Em relação à ativação da

MMP-2, diversas MMPs, como as MMP-1, -3, -7, -10, -12, -13, e as MT-MMP 1, 2, 3,

5 e 6, podem exercer essa função.

Fanchon et al (2004) sugeriram, em um estudo realizado com germes

dentários de ratos, a participação das gelatinases (MMP-2 e MMP-9), além das

MMP-3 e MMP-20 durante o processo inicial de formação e da mineralização do

esmalte e da dentina, reiterando a ação das MMPs durante a odontogênese, sendo

superexpressa quando há a degradação da membrana basal e diferenciação dos

odontoblastos e subexpressa quando se inicia a deposição da matriz da dentina e do

esmalte.

De forma semelhante, Cotrim et al (2002) verificaram a expressão progressiva

da MMP-2 durante a formação do primeiro molar em ratos desde o nascimento até o

15º dia de vida. Na região da papila dentária, a expressão desta metaloproteinase foi

maior do que no órgão dentário. Portanto, durante o desenvolvimento e a maturação

do germe dentário em ratos, a MMP-2 tem expressão e atividade variadas.

Em um estudo realizado por Baker et al (2006), verificou-se uma maior

concentração de MMP-2 e -9 em carcinoma de células escamosas em relação ao

tecido oral normal. De acordo com Pereira et al (2006), na literatura há diversos

estudos que demonstram elevados níveis de MMP-2 e MMP-9 em carcinoma de

células escamosas, associando este fato a um alto potencial de invasão e

metástase.

Vicente et al (2005) realizaram uma pesquisa para avaliar a expressão das

MMP-2 e MMP-9 em 68 casos de carcinoma de células escamosas oral. De acordo

com os resultados encontrados, os autores verificaram a participação dessas

metaloproteinases, através da imuno-histoquímica, na invasão tumoral.

2.4.3 MMP-9 (Gelatinase B)

A MMP-9 é uma protease com 92kDA, também denominada de gelatinase B.

Assim como a MMP-2, possui a capacidade de degradar o colágeno do tipo IV e V,

além das gelatinas I e V (WOESSNER JÚNIOR, 1991; O’TOOLE, 2001;

KUMAMOTO et al, 2003).

Semelhante a outras metaloproteinases, a MMP-9 é secretada na forma

inativa, como um zimógeno. Sua ativação depende da ação de diferentes

metaloproteinases como as MMPs-2, -3, -7, -13, e -26 (ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).

Sorsa, Tjäderhane e Salo (2004) relatam que a MMP-9 é sintetizada em

carcinoma pelas células tumorais e células inflamatórias. Pacientes portadores do

carcinoma de células escamosas com alta expressão de MMP-2 e MMP-9 têm um

pobre prognóstico em relação aos tumores com baixa atividade das gelatinases.

Corroborando os dados citados anteriormente, Vicente et al (2005) apontam

que a MMP-9 está relacionada com um pobre prognóstico em pacientes com

carcinoma de células escamosas oral sem metástase para linfonodos regionais.

Barros, em 2006, verificou em seu trabalho a participação dessa metaloproteinase

na invasão tumoral.

Kubota et al (2000) demonstraram em seus estudos que as formas latentes e

ativas da MMP-9 são reguladas pela IL-1α secretada por células epiteliais do

ceratocisto odontogênico. A IL-1α regula a secreção e a ativação da pró-MMP-9,

sugerindo sua participação na expansão dos cistos ósseos odontogênicos.

Em 2001, Kubota et al identificaram em uma pesquisa, através da zimografia,

as formas ativas e latentes da MMP-9 no fluído de ceratocistos odontogênicos

enquanto nos ameloblastomas o percentual dessa metaloproteinase foi bem menor.

Os autores afirmam que através da análise do fluído dessas duas lesões pode ser

feito a diferenciação entre elas.

2.4.4 Expressão das MMPs-1, -2 e -9 em lesões odontogênicas

Estudos têm sido realizados para verificar a participação das

metaloproteinases em lesões odontogênicas como cistos e tumores (KUBOTA et al,

2002; KUMAMOTO, 2006).

Em 1995, Teronen et al relatam a participação das MMP-2 e MMP-9 nos

mecanismos de expansão dos cistos ósseos por ação da degradação dos

componentes da membrana basal e da matriz osteóide. Os autores verificaram a

presença dessas enzimas na parede de cistos odontogênicos como radicular,

dentígero, residual e ceratocisto, através da técnica Western-blot, sendo que a

MMP-9 foi encontrada em maior quantidade que a MMP-2.

Em relação aos cistos odontogênicos, Lin et al (1997) verificaram a expressão

da MMP-1 e do TIMP-1 em 30 cistos radiculares através da imuno-histoquímica. Os

resultados encontrados mostraram positividade para MMP-1 no revestimento

epitelial, bem como, em fibroblastos, macrófagos, células endoteliais e osteoblastos.

Em relação ao TIMP-1, evidenciou-se marcação positiva em todos os casos para os

osteoblastos, os osteócitos e as células endoteliais, sendo que, em apenas cinco

casos de cistos radiculares com intenso infiltrado inflamatório subepitelial, detectou-

se o TIMP-1 no revestimento epitelial e na parede cística. Os autores concluíram que

há a participação da MMP-1 na expansão dos cistos radiculares e que a fraca

expressão do TIMP-1 no revestimento epitelial cístico evidencia o desequilíbrio entre

a produção da MMP-1 e TIMP-1, proporcionando a expansão do cisto radicular.

Em 2002, Kubota et al relatam que já está sendo observada a expressão de

MMPs, como a MMP-1, MMP-2, MMP-8 e MMP-9, nos cistos odontogênicos e em

seus fluídos, assim como a participação dessas enzimas na degradação da

membrana basal e da matriz extracelular promovendo a expansão cística. De acordo

com os referidos autores, a ativação da pró-MMP-2 secretada pelos fibroblastos em

ceratocistos odontogênicos é aumentada pela IL-1α devido à maior expressão da

MT1-MMP em fibroblastos, sugerindo a participação da IL-1α na expansão desses

cistos.

No estudo realizado por Silveira et al (2007), observou-se a expressão das

MMPs-1, -2 e -9 no epitélio e no mesênquima de cistos radiculares, residuais,

dentígeros e ceratocistos odontogênicos. Os autores constataram maior

expressividade da MMP-1 no epitélio dos cistos radiculares, residuais e dentígero,

assim como nas células mesenquimais dos ceratocistos odontogênicos. A expressão

da MMP-2 foi variada, sendo focal no epitélio dos cistos radiculares e dos

ceratocistos odontogênicos e difusa na maioria dos casos de cistos residuais. Em

relação ao mesênquima, os ceratocistos e cistos dentígeros apresentaram marcação

focal no mesênquima enquanto que, nos demais cistos, a marcação foi

predominantemente negativa. A expressão da MMP-9 no epitélio dos cistos foi, na

maioria dos casos, focal. No mesênquima dos ceratocistos odontogênicos observou-

se expressão marcante da MMP-9, enquanto nos demais cistos a marcação foi

predominantemente negativa. Os autores concluíram que as metaloproteinases

estudadas estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e expansão cística e a

maior expressividade das MMPs no mesênquima dos ceratocistos pode estar

relacionada com a maior agressividade dessa lesão.

Nos tumores odontogênicos, estudos têm sido realizados para avaliação da

expressão das MMPs e sua relação com a progressão tumoral, uma vez que esses

tumores possuem os substratos degradados pelas metaloproteinases de matriz

(KUMAMOTO et al, 2003).

Reiterando a participação das MMPs na progressão dos tumores

odontogênicos, Kumamoto (2006) afirma que componentes da matriz extracelular,

como colágeno, tenascina, fibronectina, laminina e proteoglicanos, presentes nessas

neoplasias, sofrem degradação por ação das MMPs. Em tumores benignos, como

ameloblastomas e mixomas odontogênicos, a presença das MMP-1, -2 e -9 já foi

detectada, contribuindo para a degradação da matriz extracelular e da membrana

basal. As moléculas inibidoras das MMPs, TIMPs-1 e -2, também foram encontradas

em ameloblastomas.

Kumamoto et al (2003) avaliaram em sua pesquisa a expressão imuno-

histoquímica das MMPs-1, -2 e -9, e dos inibidores TIMPs-1 e -2 na progressão

tumoral em 22 casos de ameloblastoma, assim como verificaram a marcação em 7

germes dentários. Verificou-se marcação intensa para as MMPs e TIMPs no

citoplasma dos fibroblastos e fraca reação nas células endoteliais dos germes

dentários e nas células tumorais dos ameloblastomas. A MMP-1 foi detectada nas

células estromais, mas não nas células tumorais dos ameloblastoma analisados. Na

MMP-2 observou-se fraca marcação nas células tumorais de 19 casos de

ameloblastoma e 3 casos não apresentaram positividade. Para a MMP-9 detectou-se

fraca marcação no citoplasma das células tumorais em 4 casos e os demais casos

foram negativos. Em relação às células estromais, todos os 22 casos foram positivos

para as MMPs- 2 e -9. Os autores concluíram que a expressão das MMPs e dos

TIMPs está associada à interação entre as células epiteliais e mesenquimais nos

tecidos odontogênicos neoplásicos e normais e que essas moléculas são

importantes na regulação da progressão dos tumores como ameloblastoma e

também no processo da odontogênese.

Pinheiro et al (2004) analisaram a participação e a importância das MMPs na

invasão local dos ameloblastomas. Os autores verificaram a expressão positiva,

através da análise imuno-histoquímica, das MMPs-1, -2 e -9 em 12 casos de

ameloblastoma e a atuação dessas enzimas na degradação da matriz óssea e na

liberação de fatores mitogênicos, proporcionando um aumento na proliferação

tumoral. As MMPs-1, -2 e -9 apresentaram positividade nas células colunares da

periferia dos ninhos de epitélio odontogênico dos ameloblastoma analisados, assim

como no estroma e na interface osso/neoplasma. Através do Western blot e da

enzimografia, os autores observaram a presença de formas ativas e inativas das

MMPs-1, -2 e -9. A produção das metaloproteinases estaria sendo regulada e

estimulada por citocinas e fatores de crescimento como interleucina-1α (IL-1α, do

inglês interukin-1

), IL-1β, TNF-α, fator de transformação do crescimento -α (TGF-α,

do inglês transforming growth factor-

), entre outros.

No trabalho desenvolvido por Nonaka (2006), evidenciou-se a expressão das

MMPs-1, -2 e -9 em mixomas odontogênicos, demonstrando a participação dessas

enzimas na degradação da matriz extracelular. Em relação à MMP-1, foi constatado

um maior número de células neoplásicas positivas quando comparado com a MMP-2

e -9, revelando a grande importância dessa metaloproteinase na degradação da

MEC e na capacidade de invasão no referido tumor.

PROPOSIÇÃO

3 PROPOSIÇÃO

O presente trabalho tem como objetivo avaliar e comparar a expressão

imuno-histoquímica das metaloproteinases-1 (MMP-1), -2 (MMP-2) e -9 (MMP-9) em

ameloblastomas sólidos e tumores odontogênicos adenomatóides visando

compreender a relação das células tumorais com o estroma para o melhor

entendimento do comportamento local destes tumores.

MATERIAL E MÉTODOS

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

A presente pesquisa consistiu em uma análise semi-quantitativa, descritiva e

comparativa do padrão de expressão das metaloproteinases-1(MMP-1), -2 (MMP-2)

e -9 (MMP-9) em uma série de casos de ameloblastomas sólidos e tumores

odontogênicos adenomatóides.

4.2 POPULAÇÃO

A população deste estudo foi representada por todos os casos de

ameloblastomas sólidos e tumores odontogênicos adenomatóides registrados e

armazenados nos arquivos do Laboratório de Anatomia Patológica da Disciplina de

Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), no período

de 1977 a 2007.

4.3 AMOSTRA

A amostra objeto desta pesquisa constituiu-se por 20 casos de

ameloblastomas sólidos e 10 de tumores odontogênicos adenomatóide registrados

no Serviço supracitado.

Como critérios de inclusão, foram considerados os seguintes: (1) quantidade

suficiente de tecido neoplásico no material arquivado referente a cada caso; (2) boas

condições de armazenamento do espécime incluído em parafina; (3) lesões intra-

ósseas.

4.3.1

Caracterização clínica dos ameloblastomas e tumores odontogênicos

adenomatóides

Os dados clínicos dos casos de ameloblastoma e

tumor odontogênico

adenomatóide selecionados, obtidos nas fichas clínicas dos pacientes, podem ser

observados nos quadros 01 e 02, respectivamente.

Quadro 01 - Características clínicas dos casos de ameloblastomas. Natal/RN, 2008

Caso

Sexo

Idade (anos)

Raça

Localização

Anatômica

Feminino 36 Não-branca Corpo mandíbula

Masculino 92 Branca Trígono retromolar

Feminino 22 Branca Corpo e ramo mandibular

Feminino 45 Branca N/E

Masculino 43 Branca Mandíbula

Feminino 65 Não-branca Mandíbula (região de mento)

Masculino 46 Não-branca Região de 34 a 38

Masculino 51 Não-branca Região 34,35,36

Feminino 23 Branca Mandíbula (região 48)

Feminino 80 Não-branca Região posterior mandíbula

Masculino 19 Branca Região 44,45

Feminino 41 N/E Mandíbula

Masculino 26 N/E Mandíbula (região posterior)

Masculino 54 Não-branca Região 43

Feminino N/E N/E Pré-maxila

Masculino 53 Não-branca Região 34 a 48

Masculino 46 Não-branca Região 34 a 38

Masculino N/E Branca Mandíbula (rebordo alveolar)

Feminino 18 Branca Região de 34 a 44

Masculino 20 Não-branca Mandíbula (rebordo alveolar)

Legenda: N/E – não especificado.

Quadro 02 - Características clínicas dos casos de tumores odontogênicos

adenomatóides. Natal/RN, 2008

Caso

Sexo

Idade (anos)

Raça

Localização

Anatômica

Masculino 26 Branca Mandíbula (região de mento)

Feminino 15 Branca Região anterior da maxila

Feminino 19 Branca Rebordo alveolar (região 21 a

23)

Masculino 14 Branca Maxila

Feminino 16 Não-branca Palato (região incisivos)

Masculino 12 Branca Região seio maxilar com

elemento incluso

Masculino 13 Branca Maxila

Feminino 14 Branca Região anterior da mandíbula

Feminino 13 Branca Região anterior da maxila

Feminino N/E N/E Mandíbula (região 34 incluso)

4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA DOS ESPÉCIMES

Realizou-se análise descritiva dos cortes histológicos corados pela técnica de

rotina da hematoxilina e eosina (H.E.), em lâminas já existentes nos arquivos do

Laboratório de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da UFRN sob

microscopia de luz (microscópio Olympus CH30, Olympus Co.; Ltd., Japão). Foram

descritos os aspectos referentes aos padrões de organização das células

neoplásicas, aos tipos morfológicos assumidos pelas células e às características do

estroma dos tumores odontogênicos em estudo, de acordo com a Classificação da

OMS de Tumores Odontogênicos (BARNES et al, 2005).

4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

4.5.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico

Toda a amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina,

foi submetida a cortes histológicos de 3µm de espessura e estendidos em lâminas

de vidro devidamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3-

aminopropyltrietroxisilano, Signa Chemical CO, USA). Posteriormente, submeteu-se

o material à técnica da estreptavidina-biotina imunoperoxidase (SABC, do inglês

streptavidin-biotin complex) utilizando anticorpos anti-MMP-1, anti-MMP-2 e anti-

MMP-9 (Quadro 03).

Como controle positivo interno, foram utilizados cortes de mucosa oral normal

contido em alguns espécimes e como controle negativo, em alguns cortes, substitui-

se o anticorpo primário por albumina de soro bovino a 1% (BSA, do inglês bovine

serum albumin) em uma solução tampão.

Quadro 03 - Clone, especificidade, fonte, diluição, incubação e procedimento

de recuperação antigênica dos anticorpos primários*

Clone Especificidade Fonte Diluição Incubação

Recuperação

Antigênica

41-1E5 MMP-1 Calbiochem 1:100

Overnight

(18 horas)

Citrato pH 6.0

Pascal

17B11 MMP-2 Novocastra 1:50 60 min

EDTA pH 8.0

Pascal

2C3 MMP-9 Novocastra 1:20

Overnight

(18 horas)

Citrato pH 6.0

Pascal

* segundo recomendações dos fabricantes.

A técnica utilizada seguiu o seguinte protocolo:

 Desparafinização – realizada por meio de 2 banhos em xilol, sendo o

primeiro em temperatura de 60°C por 30 minutos e o segundo em

temperatura ambiente durante 20 minutos;

 Re-hidratação em banhos de etanóis com concentrações decrescentes:

• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

• Álcool etílico 95° GL (5 minutos);

• Álcool etílico 80° GL (5 minutos).

 Imersão em solução de hidróxido de amônia a 10% por 10 minutos, com

a finalidade de remoção do pigmento formólico;

 Lavagem do material em água corrente por 10 minutos e duas passagens

por água destilada;

 Recuperação antigênica (Quadro 03);

 Passagem em água corrente durante 10 minutos;

 Imersão em água destilada por 2 vezes, com tempo de 5 minutos cada;

 Duas passagens dos cortes, durante 15 minutos cada, em solução de

peróxido de hidrogênio a 10 volumes;

 Lavagem em água corrente durante 10 minutos;

 Duas imersões em água destilada, com tempo de 5 minutos cada;

 Duas imersões em solução tampão de TRIS-HCl (pH 7.4) durante 5

minutos cada;

 Incubação dos cortes com os anticorpos primários diluídos, conforme

determinação do fabricante, em preparado com albumina bovina (BSA) a

1%;

 Lavagem com TRIS-HCl (pH 7.4);

 Incubação em TRIS-HCl (pH 7.4) (duas trocas de 5 minutos cada);

 Incubação com o complexo estreptavidina-biotina (Dakocytomation LSAB

+ System-HRP, Dakocytomation, A/S, Glostrup, Dinamarca), durante 30

minutos à temperatura ambiente;

Observação: tanto o anticorpo secundário quanto o complexo estreptavidina-

biotina foram diluídos em tampão TRIS-HCl (pH 7.4).

 Incubação em duas trocas de TRIS-HCl (pH 7.4) por 5 minutos cada;

 Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina (DAB), durante 3

minutos, diluído em TRIS-HCl (pH 7.4) e ativada pelo peróxido de

hidrogênio a 10 volumes, em câmara escura;

 Lavagem em água corrente e água destilada durante 10 minutos cada;

 Contra-coloração utilizando hematoxilina de Mayer durante 10 minutos;

 Desidratação em série de etanóis com concentrações ascendentes:

• Álcool etílico 80° GL (3 minutos);

• Álcool etílico 95° GL (3 minutos);

• Álcool etílico absoluto I (3 minutos);

• Álcool etílico absoluto II (3 minutos);

• Álcool etílico absoluto III (3 minutos).

 Imersão em xilol I (5 minutos);

 Imersão em xilol II (5 minutos);

 Montagem em resina Erv-mount para observação ao microscópio de luz.

4.5.2 Análise imuno-histoquímica

Após obtenção das lâminas coradas pela técnica da imuno-histoquímica, cada

caso de ameloblastoma e tumor odontogênico adenomatóide foi analisado ao

microscópio de luz e as características do padrão de expressão de cada

metaloproteinase foram anotadas em fichas (Apêndice A).

Os aspectos analisados nos referidos tumores foram os descritos a seguir:

• Presença ou não de expressão imuno-histoquímica das MMPs-1, -2 e -

• Localização da imunomarcação (células parenquimatosas e estromais);

• Padrão de distribuição (focal ou difusa);

• Análise semi-quantitativa das células imunomarcadas de acordo com

os seguintes escores (adaptado de NAGEL et al, 2004):

 Escore 0: < 10% de células tumorais positivas;

 Escore 1: 10 - 50% de células tumorais positivas;

 Escore 2: > 50% de células tumorais positivas.

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As informações coletadas na análise imuno-histoquímica dos espécimes

teciduais, referentes a cada metaloproteinase, foram em seguida apropriadamente

tabuladas e tratadas estatisticamente no software SPSS, versão 13.0 para Windows

(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, EUA).

Para avaliar a diferença entre os escores e a associação entre as

metaloproteinases em cada tumor, utilizou-se o teste não-paramétrico Qui-quadrado

de Pearson, com nível de significância de 5% e para diminuir a dispersão dos dados,

os escores foram dicotomizados, sendo os escores 0 e 1 unidos em uma única

classe, resultando em: ausência ou < 50% das células imunomarcadas (união dos

escores 0 e 1), e o escore 2 significando mais de 50%. Porém para o tumor

odontogênico adenomatóide, essa mesma estratégia estatística não pôde ser

realizada, uma vez que os dados dos resultados não permitiram a realização da

análise estatística, sendo esta descritiva.

4.7 IMPLICAÇÕES ÉTICAS

O presente trabalho faz parte do projeto “Expressão Imuno-histoquímica de

Metaloproteinases em Cistos e Tumores Odontogênicos” já aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a sua

execução através do protocolo 139/05 (Anexo A).

RESULTADOS

5 RESULTADOS

5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS

5.1.1 Ameloblastoma

A análise morfológica dos espécimes de ameloblastomas realizada em cortes

histológicos de 5 µm de espessura, corados pela técnica de hematoxilina e eosina

(H.E.), examinados em microscopia de luz, revelou a proliferação de células de

epitélio odontogênico que se organizavam em diferentes padrões, ora formando

ninhos e ilhas, ora cordões (figuras 01 e 02). Houve o predomínio do padrão folicular

em 65% (13 casos), seguido do padrão plexiforme com 25% (05 casos). Em 02

casos (5%) não havia predomínio entre esses dois padrões.

As células da periferia dos ninhos apresentavam-se colunares, por vezes

cúbicas, com núcleos hipercromados e com polarização invertida, dispostas em

paliçada, semelhantes aos ameloblastos. As células da porção central estavam

arranjadas frouxamente lembrando o retículo estrelado do órgão do esmalte.

Evidenciou-se a presença de metaplasia em 06 casos e de degeneração cística em

diversos ninhos epiteliais. Quando arranjadas em cordões, estes se apresentavam

longos e tendiam a se anastomosar. As células na periferia dos cordões se

assemelhavam a ameloblastos, apresentando-se ora colunares, ora cúbicas, e as

células epiteliais da porção central embora menos evidentes que no padrão folicular,

estavam, também, frouxamente organizadas.

O estroma dos espécimes era representado por tecido conjuntivo fibroso de

densidade variada, sendo predominantemente denso. Verificou-se que dois casos

mostraram extensa área de hialinização do estroma. Em 15 casos, evidenciou-se a

presença de células inflamatórias, principalmente linfócitos e plasmócitos.

5.1.2 Tumor Odontogênico Adenomatóide

Os espécimes de tumor odontogênico adenomatóide analisados

morfologicamente sob microscopia de luz, em cortes de 5 µm de espessura, corados

pela técnica de hematoxilina e eosina (H.E.), revelou um parênquima que exibia

células de epitélio odontogênico com morfologia variada, apresentando-se ora

fusiforme, ora cuboidal arranjadas em lençol e ninhos. As células também se

organizavam formando rosetas e algumas delas exibiam um material eosinofílico

amorfo no seu interior.

Evidenciaram-se estruturas semelhantes a ductos em quantidade variável,

sendo que as células da periferia dessas estruturas eram cúbicas ou colunares e a

porção central, em alguns casos, continha um material eosinofílico (figura 03). A

presença de calcificações foi detectada em alguns espécimes (03 casos).

O estroma constituía-se de escasso tecido conjuntivo fibroso e, em 06

espécimes, evidenciou-se a presença de células inflamatórias.

Figura 01 – Ameloblastoma. Padrão folicular (H.E., 200X)

Figura 02 – Ameloblastoma. Padrão plexiforme (H.E., 200X)

Figura 03 – Tumor odontogênico adenomatóide. Células do epitélio odon-

togênico com morfologia variada, organizadas em lençol, com formações

ductiformes e calcificações (H.E., 100X)

5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

5.2.1 Ameloblastoma

MMP-1

A expressão imuno-histoquímica da MMP-1 foi evidenciada em todos os 20

casos de ameloblastomas analisados (100%). As células neoplásicas exibiram

citoplasma fortemente imunomarcado independente de estarem localizadas na

periferia ou na porção central dos ninhos (figuras 04 e 05). Em relação ao padrão de

distribuição, houve o predomínio do padrão difuso com 19 casos (95%) e apenas 01

espécime (5%) com marcação focal. Na tabela 01, observa-se o percentual de

células imunomarcadas, onde se verifica que 90% dos espécimes apresentaram

mais de 50% das células positivas (escore 2).

Em áreas com metaplasia escamosa, observou-se uma intensificação na

imunorreação, e nas áreas de degeneração cística, foi constatada uma menor

expressão da MMP-1.

No estroma, também se evidenciou positividade para esta proteína,

principalmente em fibroblastos, células endoteliais e células inflamatórias nos 20

casos de ameloblastomas analisados (figura 06). Em dois casos, verificou-se

estroma com intensa hialinização, onde a expressão da MMP-1 nas células

neoplásicas dos ninhos próximos dessa região foi negativa.

MMP-2

Em relação à MMP-2, constatou-se 16 casos com marcação positiva

correspondendo a 80% dos 20 casos de ameloblastomas (figura 07) e em 04 casos

(20%) não se evidenciou imunorreatividade nas células tumorais. Quanto ao padrão

de distribuição da imunoexpressão nos 16 casos positivos, 08 exibiram marcação

difusa e 08, focal. O percentual de células tumorais marcadas pode ser observado

na tabela 01, onde se detectou o predomínio de escore 0, correspondendo a menos

de 10% de positividade nas células tumorais.

Os casos com metaplasia escamosa apresentaram imunomarcação variada,

sendo positivo em alguns casos e por vezes negativo.

Considerando o estroma, 65% dos casos de ameloblastoma apresentaram

positividade (13 casos) em alguns fibroblastos, células endoteliais e inflamatórias.

Os outros 07 casos, correspondente a 35%, foram negativos para as células

estromais.

MMP-9

A MMP-9 apresentou expressão imuno-histoquímica nas células do

parênquima em 100% dos casos de ameloblastoma avaliados (20 casos). As células

tumorais exibiram positividade independente da localização celular nos ninhos

tumorais (figura 08). O padrão de distribuição que predominou foi o difuso em 55%

dos casos (11) e 45% (09 casos) apresentaram padrão de marcação focal. Na tabela

01, observa-se o percentual de células imunomarcadas. Verificou-se que 85% dos

casos apresentaram menos de 50% das células positivas, sendo 09 casos com

escore 0 (menos de 10%) e 8 casos com escore 1 (10 a 50%). Em apenas 15% (03

casos) a imunorreatividade foi detectada em mais de 50% das células.

Nos casos que apresentavam metaplasia escamosa, a expressão mostrou-se

variada nestas áreas para a MMP-9, com alguns casos apresentando positividade e

outros não.

Em relação ao estroma, 100% dos casos apresentaram positividade para a

MMP-9, localizada em fibroblastos, células endoteliais e células inflamatórias.

Tabela 01 - Escores das células tumorais marcadas nos ameloblastomas para as

MMPs-1, -2 e -9. Natal/RN, 2008

Caso

Escores atribuídos ao percentual de células

imunorreativas

MMP-1 MMP-2 MMP-9

2 1

2 1 0

2 1

2 1 0

0 0 1

2 0 1

2 0 2

2 0 0

1 1 1

1 0

2 2 0

2 0 0

2 0 2

2 0 0

2 0 1

0 0

Escore 0: menos de 10% das células imunorreativas; escore 1: 10 a 50%; escore 2: mais de 50%.

5.2.2 Tumor odontogênico adenomatóide

MMP-1

Nos 10 casos de tumor odontogênico adenomatóide analisados observou-se

marcação positiva para a MMP-1 nas células tumorais (figuras 09 e 10). O padrão de

distribuição, em 100% dos casos foi difuso. Na tabela 02, observa-se o percentual de

células imunorreativas. Constatou-se que em todos os casos mais de 50% das

células epiteliais exibiram positividade para a MMP-1 (escore 2).

Observou-se que no material presente dentro das estruturas ductiformes

houve marcação em alguns casos. Em outros, onde a celularidade organizava-se em

um arranjo predominantemente cordonal, verificou-se imunoexpressão menos

exuberante. Considerando as calcificações presentes, a expressão para a MMP-1 foi

variada, sendo ora positiva e ora negativa.

Em relação ao estroma, todos os 10 casos (100%) exibiram expressão para a

MMP-1 nos fibroblastos, nas células endoteliais e nas células inflamatórias.

MMP-2

Considerando a MMP-2, evidenciou-se expressão positiva em 60% dos casos

nas células tumorais e 40%, foram negativos. O padrão de distribuição predominante

foi o focal, observado em 05 casos dos 06 espécimes de tumor odontogênico

adenomatóide que apresentaram positividade para a MMP-2. Em apenas 01 caso,

constatou-se o padrão de distribuição difuso. Em relação ao percentual de células

imunomarcadas, foi detectado que a maioria dos casos (83%) que expressaram a

MMP-2 exibiu menos de 10% (escore 0) das células tumorais positivas, como pode

ser observado na tabela 02. As calcificações presentes não apresentaram expressão

para a MMP-2.

A positividade nas células do estroma foi variada, com 08 casos (80%)

apresentando positividade e 02 casos (20%) negativos.

MMP-9

A expressão imuno-histoquímica da MMP-9 foi observada no parênquima de

100% (10 casos) dos tumores odontogênicos adenomatóides, com o predomínio do

padrão difuso detectado em 90% dos casos (figura 11). Detectou-se apenas 01 caso

(10%) com padrão de distribuição focal. Na tabela 02, observa-se o percentual de

células neoplásicas que expressaram a MMP-9. Constatou-se que em 60% (06

casos) dos tumores odontogênicos adenomatóides, mais de 50% das células

tumorais foram positivas. Deve-se destacar que um caso apresentou expressão

menos exuberante em áreas cordonais. As calcificações presentes apresentaram

marcação ora positiva ora negativa para a MMP-9.

Em relação às células do estroma, observou-se que em 100% dos casos

houve expressão para a MMP-9 nos fibroblastos, células endoteliais e inflamatórias.

Tabela 02 - Escores das células tumorais marcadas nos tumores odontogênicos

adenomatóides para as MMPs-1, -2 e -9. Natal/RN, 2008

Caso

Escores atribuídos ao percentual de células

imunorreativas

MMP-1 MMP-2 MMP-9

2 0 2

2 1 2

2 0 2

2 0 0

2 0 1

2 0 2

Escore 0: menos de 10% das células imunorreativas; escore1: 10 a 50%, escore 2: mais de 50%.

Figura 04 — Expressão imuno-histoquímica da MMP-1 nas células tumorais e em cé-

lulas inflamatórias no estroma do ameloblastoma (SABC, 200X)

Figura 05 - Imunoexpressão da MMP-1 em ameloblastoma. Marcação citoplasmática

nas células neoplásicas (SABC, 400X)

Figura 06 - Expressão da MMP-1 em ameloblastoma. Marcação citoplasmática nas cé-

lulas neoplásicas e células estromais (SABC, 400X)

Figura 07 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-2 nas células tumorais e em células inflamatórias no estroma

do ameloblastoma (SABC, 400X)

Figura 08 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-9 nas células tumorais e em células inflamatórias no estroma

do ameloblastoma (SABC, 400X)

Figura 09 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-1 no tumor odontogênico adenomatóide

(SABC, 200X)

Figura 10 – Detalhe da expressão imuno-histoquímica da MMP-1 nas células parenquima-

tosas do tumor odontogênico adenomatóide (SABC, 400X)

Figura 11 - Expressão imuno-histoquímica da MMP-9 nas células tumorais do tumor odon-

togênico adenomatóide (SABC, 200X)

5.3 RESULTADOS ESTATÍSTICOS

5.3.1 Resultados das análises inferenciais dos escores de imunoexpressão das

metaloproteinases-1, - 2 e -9

Não foi possível estabelecer diferença estatística significativa entre os

escores de imunomarcação de cada metaloproteinase individualmente (MMP-1,

MMP-2 e MMP-9) e as lesões analisadas, uma vez que o teste estatístico não pôde

ser aplicado devido ao tamanho da amostra.

Entretanto, pode-se observar na tabela 03 que na maioria dos casos dos dois

tumores, houve o predomínio do escore 2 para a MMP-1, em 90% dos

ameloblastomas e 100% dos tumores odontogênicos adenomatóides.

Para a MMP-2, o escore 0 foi predominante em mais de 50% dos casos nos

dois tumores, como pode ser verificado na tabela 04.

Considerando a MMP-9, na tabela 05 evidencia-se que 85% dos casos de

ameloblastomas mostraram menos de 50% das células tumorais imunomarcadas;

enquanto que no tumor odontogênico adenomatóide, o predomínio foi do escore 2,

com mais de 50% das células positivas, em 60% dos casos.

Tabela 03 - Imunoexpressão da MMP-1 em ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides. Natal/RN, 2008

AMELOBLASTOMA TOA TOTAL

n % n % n %

Escore 2 18 90,0% 10 100,0% 28 93,4%

Escore 1 1 5,0% 0 0,0% 1 3,3%

Escore 0 1 5,0% 0 0,0% 1 3,3%

Total

20 100,0%

0 100,0%

30 100,0%

Legenda: TOA = tumor odontogênico adenomatóide

Tabela 04 - Imunoexpressão da MMP-2 em ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides. Natal/RN, 2008

AMELOBLASTOMA TOA TOTAL

n % n % n %

Escore 2 3 15,0% 0 0,0%

3 10,0%

Escore 1 5 25,0% 1 10,0% 6 20,0%

Escore 0 12 60,0% 9 90,0% 21 70,0%

Total 20 100,0%

10 100,0%

30 100,0%

Legenda: TOA = tumor odontogênico adenomatóide

Tabela 05 - Imunoexpressão da MMP-9 em ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides. Natal/RN, 2008

AMELOBLASTOMA TOA TOTAL

n % n % n %

Escore 2 3 15,0% 6 60,0%

9 30,0%

Escore 1 8 40,0% 3 30,0% 11 36,7%

Escore 0 9 45,0% 1 10,0% 10 33,3%

Total

20 100,0%

10 100,0%

30 100,0%

Legenda: TOA = tumor odontogênico adenomatóide

Para avaliar a metaloproteinase com maior expressão nas células tumorais

dos ameloblastomas e dos tumores odontogênicos adenomatóides, os escores 0 e 1

da imunomarcação das MMPs em ambas as lesões foram agrupados para diminuir a

dispersão dos dados. Utilizou-se o teste não-paramétrico Qui-quadrado de Pearson

com nível de significância de 5%. Para tanto foi utilizado o software SPSS, versão

13.0 para Windows.

Evidenciou-se que nos ameloblastomas analisados, houve uma diferença

estatisticamente significativa entre a positividade da MMP-1 nas células tumorais

quando comparado com a MMP-2 e -9 (tabela 06).

Nos tumores odontogênicos adenomatóides, a imunomarcação da MMP-1 foi

mais evidente que a MMP-2 e -9, porém o teste estatístico não pôde ser aplicado

(tabela 07).

Tabela 06 - Imunoexpressão das MMPs-1, -2 e -9 em ameloblastomas. Natal/RN,

2008

METALOPROTEINASE

MMP-1 MMP-2 MMP-9 TOTAL

n % n % n % n %

Ausente ou

até 50,0%

2 10,0%

17 85,0% 17 85,0% 36 60,0%

Mais de 50,0%

18 90,0%

3 15,0% 3 15,0% 24 40,0%

Total

20 100,0%

20 100,0% 20 100,0% 6

0 100,0%

Teste Qui-quadrado Pearson p<0,001

Tabela 07 - Imunoexpressão das MMPs-1, -2 e -9 em tumores odontogênicos

adenomatóides. Natal/RN, 2008

METALOPROTEINASE

MMP-1 MMP-2 MMP-9 TOTAL

n % n % n % n %

Ausente ou

até 50,0%

0 0,0%

10 100,0% 4 40,0% 14 46,6%

Mais de 50,0%

10 100,0%

0 0,0% 6 60,0% 16 56,4%

Total

10 100,0%

10 100,0% 10 100,0%

30 100,0%

DISCUSSÃO

6 DISCUSSÃO

O ameloblastoma e o tumor odontogênico adenomatóide são tumores

odontogênicos benignos que derivam do epitélio odontogênico e possuem

comportamentos distintos. O ameloblastoma apresenta maior agressividade e

capacidade de invadir localmente causando destruição tecidual, enquanto o tumor

odontogênico adenomatóide tem um crescimento mais lento e indolente

(KUMAMOTO et al, 2003; SEMPERE et al, 2006).

Na literatura, há uma concordância entre os autores no que diz respeito ao

comportamento agressivo e à capacidade de invasão local dos ameloblastomas

(PINHEIRO et al, 2004; GOMES et al, 2006; OKADA, YAMAMOTO, TILAKARATNE,

2007).

Diferentes trabalhos foram realizados para tentar elucidar importantes

aspectos da histogênese e patogênese dos ameloblastomas, destacando-se,

estudos que investigam proteínas do ciclo celular (KUMAMOTO, KIMI, OOYA,

2001a; MEER et al, 2003; SANTANA, BORAKS, SETTANNI, 2004; BARBOZA et al,

2005; KUMAMOTO, OHKI, OOYA, 2005); moléculas de adesão (MODOLO et al,

2004; ANDRADE et al, 2007; BELLO et al, 2007); fatores relacionados com apoptose

(KUMAMOTO, KIMI, OOYA, 2001b; KUMAMOTO, OOYA, 2005a) e com

diferenciação celular (CRIVELINI et al, 2003; KUMAMOTO, OOYA, 2005b; LOPES

et al, 2005); componentes da matriz extracelular da neoplasia (MEDEIROS, 2001;

SOUZA, SOUSA, PINTO, 2001; KUMAMOTO, OHKI, OOYA, 2002; NAKANO et al,

2002; VERED et al, 2005; KUMAMOTO, OOYA, 2006a) e proteases, como as

metaloproteinases (KUMAMOTO et al, 2003; PINHEIRO et al, 2004; KUMAMOTO,

OOYA, 2006b).

Em relação aos tumores odontogênicos adenomatóides, realizaram-se

estudos para analisar fatores relacionados com a diferenciação celular (CRIVELINI

et al, 2003; CRIVELINI, SOUBHIA, FELIPINI, 2005; LEON et al, 2005; LOPES et al,

2005); moléculas de adesão (ANDRADE et al, 2007); moléculas da matriz

extracelular (MURATA et al, 2000; MEDEIROS, 2001; CRIVELINI, SOUBHIA,

FELIPINI, 2005; KUMAMOTO, OOYA, 2006a) e proteínas do ciclo celular

(BARBOZA et al, 2005; CRIVELINI, SOUBHIA, FELIPINI, 2005; LEON et al, 2005;

SEMPERE et al, 2006).

O conhecimento do comportamento biológico das lesões é de extrema

importância para que se estabeleça um tratamento adequado e eficaz para o

paciente (BARROS, 2006).

Sabe-se que a matriz extracelular atua na regulação das funções celulares e

de processos biológicos nos tecidos. As interações existentes entre epitélio-

mesênquima são necessárias no controle e na regulação de funções celulares como

proliferação, diferenciação, apoptose e migração (MEDEIROS, 2001; RAITZ,

MARTINS, ARAÚJO, 2003; MOTT, WERB, 2004).

A importância do estroma tumoral no comportamento biológico de uma

neoplasia começou a ser estudada em 1970, por Judah Folkman, que demonstrou a

importância da vascularização para o crescimento tumoral. Até essa data, apenas as

células neoplásicas eram foco de pesquisas. A partir desta descoberta, a estrutura e

os componentes do estroma passaram e ser estudados (WERNERT, 1997). As

células estromais também participam do processo de degradação da matriz

extracelular através de proteases, como as metaloproteinases, favorecendo assim, a

invasão tumoral e a migração das células neoplásicas (MOTT, WERB, 2004; ALA-

AHO, KÄHÄRI, 2005).

O ameloblastoma e o tumor odontogênico adenomatóide, apesar de serem

classificados no mesmo grupo de tumores odontogênicos possuem comportamento

clínico e biológico diferente e por essa razão foram escolhidos para o presente

trabalho que teve como objetivo, avaliar, através da técnica de imuno-histoquímica, a

participação de três metaloproteinases, as MMPs-1, -2 e -9, uma vez que atuam na

modificação estrutural da MEC, nos tumores odontogênicos citados.

As metaloproteinases são importantes proteases que atuam na modulação da

MEC, atuando na modificação estrutural e funcional dos componentes da matriz

extracelular. Em condições fisiológicas normais, as MMPs são pouco expressas

pelos tecidos, enquanto que em processos patológicos, há superexpressão das

mesmas devido ao desequilíbrio na atividade das metaloproteinases e seus

inibidores TIMPs (PEREIRA et al, 2005; NAGASE, VISSE, MURPHY, 2006; VERMA,

HANSCH, 2007).

As MMPs desempenham importante papel na invasão e metástase de

diversos tipos de câncer, como carcinoma de esôfago, de pele, do endométrio, de

laringe e oral, entre outros, destacando-se as metaloproteinases-2 e -9 que atuam

na degradação dos componentes da membrana basal (STAMENKOVIC, 2000;

NAGEL et al, 2004; VICENTE et al, 2005; PEREIRA et al, 2006; PINHEIRO et al,

2006).

Na literatura, afirma-se que em lesões malignas encontra-se uma elevada

expressão das MMPs (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; NAGEL et al, 2004;

PARDO, SELMAN, 2005). Em carcinoma de células escamosas orais, já foi

detectado um aumento na expressão das MMPs-1, -3, -2, -9, -7 e -26 (IKEBE et al,

1999; BAKER et al, 2006; BARROS, 2006), sendo que a MMP-9 está relacionada a

um pobre prognóstico (VICENTE et al, 2005).

Corrobando os achados anteriores, Barros (2006) evidenciou que a MMP-9

em carcinomas de células escamosas orais localizados na língua exibiu uma maior

expressão estatisticamente significante em relação aos carcinomas localizados em

lábio inferior, o que pode contribuir para o comportamento mais invasivo das células

neoplásicas nas lesões localizadas na língua.

Em lesões odontogênicas, as MMPs também têm sido detectadas através de

estudos que mostram a participação dessas enzimas na progressão das lesões. Em

cistos odontogênicos já se verificou a participação das metaloproteinases no seu

desenvolvimento, uma vez que as proteases atuam na degradação dos constituintes

da MEC, promovendo assim, a expansão cística (LIN et al, 1997; KUBOTA et al,

2002; SILVEIRA et al, 2007).

A MMP-1 já foi detectada em cistos radiculares (LIN et al, 1997; SILVEIRA et

al, 2007), cistos residuais e dentígeros, assim como nos ceratocistos odontogênicos,

tendo uma maior expressão no epitélio dos cistos radiculares, residuais e dentígeros

e nas células mesenquimais dos ceratocistos (SILVEIRA et al, 2007).

As gelatinases (MMP-2 e MMP-9) também são moléculas que participam do

desenvolvimento dos cistos odontogênicos, promovendo a degradação da

membrana basal e da matriz osteóide, com conseqüente participação no

crescimento cístico (TERONEN et al, 1995; SILVEIRA et al, 2007). Porém, a

expressão dessas metaloproteinases é menos exuberante do que a imunomarcação

da MMP-1 (SILVEIRA et al, 2007). Deve-se ressaltar que as MMPs-2 e -9 são de

extrema importância para completa degradação do colágeno, que foi clivado

inicialmente por ação da MMP-1 (TERONEN et al, 1995; SILVEIRA et al, 2007).

Nos ceratocistos odontogênicos, Silveira et al (2007) evidenciaram uma

marcação proeminente da MMP-9 nas células mesenquimais o que poderia estar

relacionada com a maior agressividade dessa lesão.

A IL-1α secretada por células do epitélio odontogênico tem a capacidade de

estimular a secreção e ativação da pró-MMP-9 que quando ativada degrada o

colágeno intersticial. A regulação da expressão da IL-1α tem importante papel na

expansão dos cistos (KUBOTA et al, 2000). Ela também promove um aumento na

expressão da MT1-MMP, induzindo a ativação da pró-MMP2 secretado por

fibroblastos em ceratocisto (KUBOTA et al, 2002).

Considerando os tumores odontogênicos, poucos trabalhos foram realizados

para avaliar a expressão de metaloproteinases nessas lesões. No presente estudo,

de uma forma geral, as MMPs foram expressas tanto nas células tumorais como nas

estromais dos dois tumores analisados, sendo mais evidente a marcação da MMP-1.

Todos os casos de ameloblastoma exibiram positividade para a MMP-1 nas células

tumorais e estromais, com predomínio do padrão de distribuição difuso. Esse

resultado é comparável com o obtido por Pinheiro et al (2004), em que a MMP-1 foi

observada nas células tumorais, no estroma e na interface neoplasma-osso dos

ameloblastomas.

Porém, estes autores verificaram a presença da MMP-1 apenas nas células

da periferia dos ninhos dos ameloblastomas, diferentemente do trabalho ora

apresentado, que constatou marcação dessa enzima nas células da periferia e da

porção central dos ninhos de epitélio. Esse resultado pode ser explicado pela

presença da tenascina detectada na porção central dos ninhos que lembram o

retículo estrelado do órgão do esmalte observado por Medeiros (2001). Este autor

sugere que a presença dessa molécula da MEC nesta localização, possivelmente,

está associada à formação de microcistos nos ninhos de epitélio odontogênico dos

ameloblastomas, a exemplo do que sugerem Oliveira et al (2004) a respeito do

crescimento cístico em seu estudo, onde a tenascina foi expressa nas células mais

superficiais do revestimento epitelial de cistos odontogênicos.

Contrariamente aos resultados anteriormente citados, Kumamoto et al (2003)

detectaram a marcação da MMP-1 apenas nas células estromais dos

ameloblastomas e não nas tumorais. Já nos germes dentários foi possível detectar a

MMP-1 no folículo dentário e na papila dentária. Os autores sugerem que a

produção dessa metaloproteinase pelas células deve estar relacionada com a

progressão do tumor e com a regulação da formação do elemento dentário,

respectivamente.

Considerando ainda os gemes dentários, Nonaka (2006) evidenciou

expressão da MMP-1 no retículo estrelado do órgão do esmalte e ocasionalmente

em ameloblastos e odontoblastos. Esses achados corroboram, de certa forma, a

presença da MMP-1 na porção central que se assemelha ao retículo estrelado do

órgão do esmalte e nas células da periferia dos folículos de epitélio odontogênico

dos ameloblastomas.

A obtenção de resultados divergentes, pode ser explicado pela utilização de

diferentes clones ou, possivelmente, pela expressão temporal desta MMP na

dependência das necessidades da evolução da neoplasia.

A maior expressão estatisticamente significante da MMP-1 em relação à

MMP-2 e -9 nos ameloblastomas, detectada através do teste Qui-quadrado de

Pearson (p<0,001), mostra que essa metaloproteinase é uma das principais enzimas

que atuam na degradação da matriz extracelular, sendo essencial para o

crescimento tumoral, o que é facilmente verificado e explicado no ameloblastomas

através de seu marcado potencial de crescimento. O mesmo pôde ser verificado por

Nonaka (2006) em mixoma odontogênicos e por Silveira et al (2007) ao analisar

cistos odontogênicos, evidenciando de forma marcante a MMP-1 no epitélio e na

cápsula dos cistos.

A elevada expressão da MMP-1 nos ameloblastomas pode estar relacionada

com a maior proliferação celular existente nessa neoplasia como já foi verificado por

Meer et al (2003), Santana, Boraks e Settanni (2004) e Barboza et al (2005),

possibilitando seu elevado ritmo de crescimento, uma vez que é fundamental a

degradação dos componentes da MEC, principalmente do colágeno tipo I, que sofre

a ação da MMP-1, para o crescimento local da neoplasia.

Em 2001, Medeiros verificou a presença de proteínas da matriz extracelular,

como o colágeno I e a tenascina em ameloblastomas, estando localizados

principalmente no estroma e nas adjacências dos ninhos e lençóis epiteliais,

respectivamente. Esses componentes da MEC sofrem degradação por ação da

MMP-1, favorecendo o crescimento tumoral.

O tumor odontogênico adenomatóide, caracterizado por ser uma lesão menos

agressiva e com um menor potencial proliferativo que o ameloblastoma (BARBOZA

et al, 2005), também teve imunomarcação para a MMP-1 nas células

parenquimatosas e mesenquimais em todos os casos analisados, revelando a

extrema importância dessa enzima na degradação da matriz extracelular,

independentemente da agressividade do tumor.

Medeiros (2001) verificou, no tumor odontogênico adenomatóide, intensa

marcação do colágeno I no estroma e uma expressão variada e escassa da

tenascina no estroma e na região de membrana basal, sendo que em áreas

próximas ao parênquima tumoral, a marcação foi mais acentuada. Isso pode explicar

a positividade para MMP-1 verificada no presente trabalho, tanto em células

parenquimatosas como do mesênquima, confirmando a atuação dessa enzima no

crescimento e expansão tumoral. No interior de estruturas ductiformes, a expressão

dessa metaloproteinase pôde ser observada em alguns casos analisados,

confirmando a presença de colágeno I, verificado por Medeiros (2001), também em

apenas alguns casos de tumor odontogênico adenomatóide no interior destas

estruturas.

A expressão das metaloproteinases-2 e -9 nos ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides foi variada, sendo que a MMP-9 apresentou maior

imunorreatividade quando comparada com a MMP-2. O mesmo foi evidenciado em

trabalhos realizados por Teronen et al (1995) e Silveira et al (2007) em cistos

odontogênicos. Esses achados podem sugerir um papel secundário das gelatinases

nas lesões avaliadas, uma vez que a MMP-1 é a principal protease responsável por

degradar o colágeno I, tendo, portanto, um papel crucial no processo de degradação

da matriz extracelular e no crescimento tumoral. As MMP-2 e -9 atuam de forma

conjunta com a MMP-1, já que são essenciais para degradação das gelatinas,

oriundas da quebra do colágeno tipo I, iniciada pela MMP-1.

A maioria dos casos analisados nos dois tumores teve uma fraca marcação

para MMP-2 nas células parenquimatosas, independente da localização, o que já

era esperado, uma vez que trabalhos como o de Kumamoto et al (2003), Barros

(2006) e Silveira et al (2007) demonstraram baixa imunoexpressão dessa

metaloproteinase em ameloblastomas, carcinoma de células escamosas e cistos

odontogênicos, respectivamente. Resultados parcialmente semelhantes foram

obtidos por Pinheiro et al (2004) que verificaram imunomarcação para a MMP-2 nas

células tumorais, porém apenas naquelas localizadas na periferia dos ninhos de

epitélio odontogênico dos ameloblastomas, enquanto Kumamoto et al (2003), e o

presente trabalho, demonstraram fraca reatividade para a MMP-2 tanto nas células

da periferia como nas células da porção central dos ninhos de epitélio odontogênico

dos ameloblastomas. Kumamoto et al (2003) detectaram ainda baixa expressão

dessa metaloproteinase na lâmina dentária de germes dentários.

A MMP-2 degrada principalmente o colágeno tipo IV, presente na membrana

basal, além de outros componentes da MEC como laminina, elastina, fibronectina,

gelatina, colágeno V, VII e X. Acreditamos que a baixa expressão da MMP-2 se deva

à necessidade de preservação, pelo menos em parte, dos constituintes da

membrana basal, fundamental para o processo de diferenciação das células

neoplásicas bem como para a manutenção da arquitetura estrutural nos ninhos

tumorais, característicos no ameloblastoma.

Deve-se ressaltar que a membrana basal desempenha importantes funções

nos tecidos, participando do processo de reparo, da proliferação e migração celular,

bem como na indução da diferenciação de células (OLIVEIRA et al, 2002). Souza,

Sousa e Pinto (2001) observaram que a membrana basal dos ameloblastomas com

padrão folicular exibiu expressão do colágeno tipo IV delimitada e contínua,

enquanto nos outros padrões histológicos, a mesma apresentou-se descontínua.

Estes achados justificam a fraca expressão da MMP-2 observada no presente

estudo.

Medeiros (2001) verificou positividade da fibronectina no estroma dos

ameloblastomas e tumores odontogênicos adenomatóides, assim como na interface

epitélio-mesênquima. Células da porção central dos ninhos de epitélio odontogênico

dos ameloblastomas também exibiram expressão da fibronectina, enquanto no tumor

odontogênico adenomatóide, a imunomarcação nas células epiteliais foi focal. Esses

achados justificam os resultados ora obtidos na presente pesquisa, em que a MMP-2

foi expressa, mesmo que fracamente, no parênquima e mesênquima dos

ameloblastomas, sendo predominantemente focal nas células tumorais dos tumores

odontogênicos adenomatóides.

Sabe-se que há uma relação entre a fibronectina e a polarização de células

que estão a ela conectados e que durante a odontogênese, essa proteína da MEC

participa das interações célula-matriz, que culminam com a indução da polarização e

diferenciação dos odontoblastos (THESLEFF, PARTANEN, VAINIO, 1991).

Diante do exposto, Medeiros (2001) verificou que as regiões de membrana

basal nos ameloblastomas exibiram intensa expressão da fibronectina e nos tumores

odontogênicos adenomatóides ocorreu de forma descontínua e linear. Isso pode ser

explicado pela disposição das células da periferia dos ninhos e cordões dos

ameloblastomas que exibem morfologia colunar alta, por vezes cúbica, dispostas em

paliçada, com polarização inversa e núcleos hipercromados, lembrando os

ameloblastos.

No espaço luminal das estruturas ductiformes dos tumores odontogênicos

adenomatóides, Murata et al (2000) detectaram fibronectina e outras proteínas da

MEC relacionadas com a membrana basal, como o colágeno tipo IV e V, heparan

sulfato e laminina. Os autores sugeriram que as células do tumor odontogênico

adenomatóide, de forma similar aos pré-ameloblastos, possuem a capacidade de

sintetizar proteínas da MEC constituintes da membrana basal, apesar de não se

observar indução para camada odontoblástica e pré-dentina.

No presente trabalho observou-se positividade para a MMP-9 nas células

tumorais dos ameloblastomas e tumores odontogênicos adenomatóides,

evidenciando a participação desta metaloproteinase na degradação da matriz

extracelular. A gelatinase B é importante, assim como a MMP-2, para completa

degradação do colágeno iniciada pela MMP-1 (TERONEN et al, 1997; COTRIM et al,

2002) e conseqüente promoção do crescimento tumoral. Os resultados encontrados

por Kumamoto et al (2003) e Pinheiro et al (2004) em ameloblastomas se

assemelham em parte ao resultado ora apresentado, uma vez que a fraca expressão

da MMP-9 só foi verificada nas células da periferia, enquanto que no presente

trabalho, tanto a porção central quanto a periferia dos ninhos e cordões de epitélio

odontogênico exibiram imunorreatividade para essa metaloproteinase.

Kumamoto et al (2003) evidenciaram ainda baixa expressão da MMP-9 nos

componentes epiteliais e mesenquimais dos germes dentários e acreditam que isso

pode estar associado à regulação das interações que ocorrem entre epitélio-

mesênquima. Já Nonaka (2006) observou expressão da MMP-9 no retículo estrelado

do órgão do esmalte e no epitélio interno do órgão do esmalte de germes dentários,

confirmando a participação dessa enzima durante a odontogênese.

Sabe-se que durante o desenvolvimento dos germes dentários, a papila

dental e o órgão do esmalte sofrem alterações morfológicas e biológicas (COTRIM et

al, 2002). Fanchon et al (2004) observaram que as gelatinases A e B participam do

processo inicial de formação do esmalte e da dentina durante a odontogênese,

juntamente com as MMPs-3 e -20. Já Randall e Hall (2002) evidenciaram a

participação das metaloproteinases-1, -2, -3 e -9, através da técnica imuno-

histoquímica, durante as fases iniciais da odontogênese em germes dentários de

ratos. Utilizando métodos mais sensíveis, como reação em cadeia da polimerase

com transcriptase reversa (RT-PCR, do inglês reverse transcription polymerase

chain reaction) e enzimografia, Cotrim et al (2002) detectaram a MMP-2 em germes

dentários de ratos nos primeiros 15 dias de vida. Essa protease exibiu um aumento

progressivo na sua expressão e se mostrou maior na papila dentária que no órgão

dentário.

A baixa expressão da MMP-2 relatada durante a odontogênese, no órgão do

esmalte, que tem como um de seus constituintes o epitélio interno do órgão do

esmalte composto por células que sofrem diferenciação em ameloblastos durante a

odontogênese, pode estar relacionada com a menor positividade dessa enzima nos

ameloblastomas, uma vez que, durante a odontogênese, ela atua na degradação da

membrana basal, antes de iniciar a formação da matriz do esmalte e da dentina.

Como no ameloblastoma este processo de diferenciação não se completa, não se

faz necessária modificação estrutural da membrana basal através da sua

degradação, não sendo necessário, portanto, grande quantidade das MMPs-2 e -9

para degradar o colágeno IV.

A presença das MMPs-2 e -9 nos ameloblastomas e nos tumores

odontogênicos adenomatóides possivelmente está relacionada com a diferenciação

celular que ocorre nas células tumorais. De acordo com Murata et al (2000) as

células que formam as estruturas ductiformes nos tumores odontogênicos

adenomatóides se diferenciam em células semelhantes à ameloblastos, porém não

sofrem o processo de maturação e possuem a capacidade de produzem moléculas

da MEC. De forma semelhante, os ameloblastomas exibem as células da periferia

dos ninhos de epitélio odontogênico cúbicas ou colunares altas, lembrando os

ameloblastos, porém também não atingem a maturação necessária para que ocorra

a formação de esmalte (TSUJIGIWA et al, 2005).

A positividade exibida pelas três metaloproteinases estudadas nas células

estromais dos dois tumores demonstra que essas enzimas são produzidas por

fibroblastos, células endoteliais e inflamatórias, como linfócitos, plasmócitos,

macrófagos e neutrófilos que também participam da degradação da MEC,

contribuindo para a expansão da massa tumoral. De forma semelhante, os

resultados obtidos por Kumamoto et al (2003) e Pinheiro et al (2004) exibiram

positividade para as MMPs avaliadas nas células mesenquimais dos

ameloblastomas, mostrando que essas enzimas provavelmente são sintetizadas por

indução tumoral e em resposta a citocinas, fatores de crescimento, hormônios e

estão associadas à progressão tumoral, concordando com Mott e Werb (2004) e Ala-

Aho e Kähäri (2005) que afirmam a participação das células estromais na

degradação da MEC por ação de MMPs, facilitando a migração das células

neoplásicas e a invasão tumoral.

Vicente et al (2005) afirmam, ainda, que as MMPs-2 e -9 participam da

angiogênese e do crescimento tumoral, estando associadas a um comportamento

mais agressivo de algumas neoplasias.

De forma semelhante aos resultados obtidos nesse trabalho, Lin et al (1997)

evidenciaram imunomarcação para MMP-1 em células inflamatórias, fibroblastos e

células endoteliais em cistos radiculares e sugeriram a participação dessa

metaloproteinase na expansão cística. O mesmo foi afirmado por Sorsa, Tjäderhane

e Salo (2004) em relação ao carcinoma de células escamosas.

Corrobando os resultados citados, Silveira et al (2007) verificaram maior

expressão das MMPs-1, -2 e -9 nas células mesenquimais de ceratocistos

odontogênicos, quando comparado com cistos radiculares, residuais e dentígeros,

confirmando a participação dessas enzimas no crescimento dessa lesão, assim

como justificando a maior agressividade dos ceratocistos odontogênicos.

Apesar de não detectarmos diferença estatisticamente significante entre a

expressão das MMPs nas células parenquimatosas dos ameloblastomas e dos

tumores odontogênicos adenomatóides, a maior agressividade do ameloblastoma

possivelmente pode estar associado à maior quantidade de estroma existente nesse

tumor, uma vez que também detectamos as metaloproteinases nas células

mesenquimais, confirmando sua participação na degradação dos constituintes da

MEC, favorecendo assim o crescimento tumoral.

Deve-se ressaltar que através da técnica imuno-histoquímica, o trabalho ora

realizado, assim como o de Kumamoto et al (2003), permite detectar a presença ou

não das MMPs-1, -2, e -9 nos tumores analisados, não sendo possível determinar a

atividade enzimática dessas metaloproteinases. Porém no estudo desenvolvido por

Ikebe et al (1999), observou-se que há correlação entre a técnica de zimografia

realizada para verificar a atividade das metaloproteinases e o grau de marcação

exibido através da imuno-histoquímica.

No trabalho realizado por Pinheiro et al (2004), além da técnica imuno-

histoquímica, os autores utilizaram as técnicas de zimografia e Western-blot para

verificar a atividade funcional das metaloproteinases-1, -2 e -9 em ameloblastoma,

confirmando a participação dessas enzimas na degradação da matriz óssea, com

conseqüente liberação de fatores mitogênicos e aumento da proliferação tumoral.

Diante dos resultados obtidos, que caracterizaram a presença das MMPs-1, -

2 e -9 nas células do parênquima e do estroma dos ameloblastomas e tumores

odontogênicos adenomatóides e sua ativa participação no crescimento dos referidos

tumores, acredita-se que outros trabalhos utilizando técnicas mais sensíveis devam

ser realizados na tentativa de uma melhor compreensão da atuação e influência

dessas enzimas no comportamento local dos tumores estudados.

CONCLUSÕES

7 CONCLUSÕES

Diante dos resultados encontrados nessa pesquisa, pode-se concluir que:

1. As MMPs-1, -2 e -9 são expressas nas células parenquimatosas e estromais

dos ameloblastomas e tumores odontogênicos adenomatóides, o que sugere

sua contribuição para o crescimento e expansão tumoral. A presença das

referidas metaloproteinases nas células estromais revela a participação ativa

dessas células, juntamente com as células parenquimatosas, na degradação

dos constituintes da MEC, contribuindo para o crescimento dos tumores

estudados.

2. A expressão da MMP-1 foi mais marcante que as demais metaloproteinases

estudadas nos dois tumores analisados, sendo estatisticamente significante

nos ameloblastomas (p<0,001), mostrando o papel fundamental que essa

protease exerce na degradação da MEC e no crescimento tumoral.

3. A presença de grande quantidade de estroma positivo para as MMPs

estudadas permeando os ninhos epiteliais no ameloblastoma, nos leva a

sugerir que o maior potencial de invasão local desta neoplasia, deva-se, em

parte, à soma de secreção das MMPs tanto pelo parênquima quanto pelo

estroma.

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102

APÊNDICE

103

APÊNDICE

APÊNDICE A - Ficha para coleta de dados referentes às MMP-1, -2 e -9 em

ameloblastoma e tumor odontogênico adenomatóide

Caso:

Imunomarcação

( ) + ( ) –

Localização imunomarcação ( ) células tumorais ( ) estroma

Padrão de distribuição ( ) focal ( ) difusa

Percentual de células imunorreativas ( ) escore 0 ( ) escore 1 ( ) escore 2

OBS:

104

ANEXO

105

ANEXO

Anexo A - Protocolo n° 139/05 de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

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