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Marcele Cristina Caetano
EXPRESSÃO DOS ANTÍGENOS
NUCLEARES DE CÉLULAS EM
PROLIFERAÇÃO NA
SUPERFÍCIE OCULAR DE
CÃES JOVENS E ADULTOS.
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MARCELE CRISTINA CAETANO
Expressão dos antígenos nucleares de células em
proliferação na superfície ocular de cães jovens e
adultos.
Dissertação apresentada à Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Faculdade de
Odontologia – Curso de Medicina Veterinária para
obtenção do Título de Mestre em Ciência Animal
(Fisiopatologia Clínica e Cirúrgica)
Orientador: Prof. Ass. Dr. Alexandre Lima de Andrade
Araçatuba
2006
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DADOS CURRICULARES
DADOS CURRICULARES
Marcele Cristina Caetano
NASCIMENTO
23.02.1976 – Araçatuba/SP
FILIAÇÃO
Claudemir Caetano
Luci Lamar Guermandi Caetano
1995/1999
Curso de Graduação (Medicina Veterinária)
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Campus de Araçatuba
Faculdade de Odontologia
Curso de Medicina Veterinária
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Luci e Claudemir e ao meu esposo Fernando
,
Dedico este trabalho, pois sempre
acreditaram em minha capacidade e
ajudaram-me desde o início a alcançar
mais esta vitória.
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Ao Prof. Ass. Dr. Alexandre Lima de Andrade, que com sua
paciência e senso crítico deu formas definitivas à esse projeto, meu
agradecimento pela orientação e amizade, pontos comuns que trilharam
essa jornada.
À Profa. Ass. Dra. Maria Cecília Rui Luvizzoto, pelos
ensinamentos, orientação e apoio constante, um agradecimento sincero.
A todos os funcionários do Laboratório de Patologia Animal, UNESP-
Araçatuba, pela ajuda e paciência em todos os momentos.
À Profa. Ass. Dra. Renée Laufer Amorim, por ter ajudado no
momento decisivo deste trabalho, sem o qual esse projeto não se
completaria, meu agradecimento especial.
À Profa. Ass. Dra. Silvia Helena Venturolli Perri, pela orientação e
organização na análise estatística.
Aos colegas de pós-graduação, pela amizade, apoio e
companheirismo.
À Capes pelo apoio financeiro.
À todas as bibliotecárias do campus da Medicina Veterinária, pela
ajuda nas referências bibliográficas.
EPÍGRAFE
“Bom mesmo é ir a luta com
determinação, abraçar a vida e viver com
paixão, perder com classe e vencer com
ousadia; pois, o triunfo pertence a quem
se atreve e a vida é muito para ser
insignificante”.
Charles Chaplin
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotomicrografia da córnea de cão
Figura 2 - Fotografia do corte sagital do bulbo ocular
Figura 3 - Processamento dos cortes histológicos
Figura 4 - Representação esquemática do corte sagital de olho
Figura 5 - Representação gráfica da porcentagem de células
imunomarcadas
Figura 6 - Fotomicrografia da região da córnea, limbo e conjuntiva de
olhos de cães dos grupos GA e GB
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Média e erro padrão da média da porcentagem de células
imunomarcadas.
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Lista de Abreviaturas e Símbolos
K5/K14 = par de queratinas basais ou tipo B
K3/K12 = par de queratinas corneais
K6/K16 = par de queratinas hiperproliferativas ou tipo H
AE5 = anticorpo monoclonal anti-queratina 3
AE1 = anticorpo monoclonal anti-queratina 1
X, Y e Z = teoria da regeneração epitelial de THOFT & FRIEND
X representa a proliferação das células epiteliais basais
Y é a proliferação e migração centrípeta das células epiteliais limbares
Z representa a perda celular epitelial
Ki-67 = antígeno de proliferação Ki-67
DNA = ácido desoxiribunucléico
S = fase da mitose com pico de síntese de DNA
GA = grupo A
GB= grupo B
PCNA = antígeno nuclear de proliferação celular
MIB-1 = anticorpo monoclonal anti-Ki-67
H.E = Hematoxilina e eosina
% = por cento
V = volume
°C = graus Celsius
mL = mililitro
µl = microlitro
SAS = statistical analysis system
pH = potencial de hidrogênio iônico
DAB = diaminobenzidina
mM = milimol
SUMÁRIO
Introdução ............................................................................................24
Revisão de literatura ............................................................................27
Objetivos ..............................................................................................40
Material e métodos...............................................................................42
Resultados ...........................................................................................50
Discussão.............................................................................................55
Conclusão ............................................................................................60
Referências..........................................................................................62
Trabalho...............................................................................................68
Anexos .................................................................................................93
RESUMO
As células-tronco (stem cells) têm um papel fundamental nos
processos reparativos e regenerativos da córnea. A exata localização
destas é bem conhecida no olho do homem, bem como as suas funções.
Entretanto, as mesmas ainda não foram descritas em medicina
veterinária, sequer a sua localização em olhos de animais de companhia,
tratando-se assim, de assunto que merece novas e originais
investigações. Anticorpos monoclonais que reagem superficialmente com
as citoqueratinas são empregados para determinar este tipo celular
presente nos tecidos, no entanto, existem outros marcadores capazes de
reagir antigenicamente com núcleos celulares. Entre eles, o PCNA
(antígeno nuclear de proliferação celular) e o Ki-67 (antígeno de
proliferação Ki-67) são capazes de marcar células em proliferação. Uma
vez que isso nunca fora descrito anteriormente, e considerando-se a
necessidade e importância científica em se determinar a localização de
células em proliferação na superfície ocular de cães, o presente estudo
teve por objetivos: 1) determinar a expressão de células em proliferação
pela marcação imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anti-PCNA
e anti-MIB-1 (anticorpo monoclonal anti-Ki-67), bem como, sua localização
na superfície ocular; 2) comparar se há diferença estatística significante
na marcação dessas células em diferentes idades. Para tanto, foram
utilizados 24 cães jovens e adultos, sadios, dos quais o bulbo ocular
esquerdo foi removido, fixado e corado pela H.E. (hematoxilina e eosina),
além da imunoistoquímica empregando-se os anticorpos monoclonais
anti-PCNA e anti-MIB-1. Concluiu-se que a presença de células em
proliferação imunomarcadas pelo PCNA e pelo MIB-1 foi observada em
diferentes tecidos da superfície ocular de cães, sendo os tecidos mais
marcados: o limbo e o epitélio da córnea. É possível que, as células
marcadas pelos imunomarcadores sejam células-tronco da superfície
ocular de cães, no entanto, para tal comprovação sugere-se a
necessidade da utilização de anticorpos monoclonais espécie-específicos
como o AE5.
Palavras-chave: córnea, PCNA, MIB-1, células-tronco
ABSTRACT
The stem-cells has a fundamental paper in process of cornea’s
tissue repair and regeneration. In man, the well-know localization and
functions had been descriebed a long time ago, however the same ones
had not yet been descriebed in veterinary medicine, at least your
localization in eyes of company animals, what deserve new and original
inquiries. Monoclonais antibodies that react superficially with the
cytokeratins are used to determine this cell type presence in ocular
surface. However, exist another markers capable to react with cell
nucleoli, for example, PCNA and MIB-1 are capable to mark proliferation
cells. Considering the necessity and scientific importance to determining
the localization of proliferation cells on dog’s ocular surface, a time that,
never was descriebed previously, the present study had for objectives: 1)
determineted the expression of proliferation cells immunohistochemically
by PCNA and MIB-1 and its localization in ocular surface; 2) compare if
has statistically significant difference in immunoexpression of proliferation
cells in different ages. In the study was used 24 healthy dogs, young and
adults, witch had the left eyes removed, fixed in buffered formalin and
stained with H.E. (hematoxilin and eosin) and with monoclonal antibodies
anti-PCNA and anti-MIB-1. The presence of immunostained cells was
most observed in corneal ephithelium and limbo. Probably the
immunostained cells are stem-cells in dog’s ocular surface, however for
such evidence it is necessary the use of monoclonais antibodies specie-
specific as AE5, not yet avaiable to dogs.
Key-words: cornea, PCNA, MIB-1, stem-cells
INTRODUÇÃO
24
1.
INTRODUÇÃO
Das estruturas que compõem o aparelho da visão, não há como
ressaltar a importância de uma estrutura isoladamente, um detrimento
das demais. Todas, em sua função e conjuntamente, colaboram para uma
boa e perfeita visão. O tempo, a evolução e os avanços médicos têm
demonstrado que cada componente desse sistema participa efetivamente
do mecanismo de formação da imagem, permitindo assim, que o
organismo perceba o meio
externo
através da visão.
A córnea, que representa uma das estruturas da túnica fibrosa do
bulbo ocular, constitui-se em um tecido vulnerável, dada a sua localização
externa. Por ser transparente, está diretamente envolvida na visão e tem
sido estudada intensamente no homem e nos animais nos últimos
tempos, devido ao crescente número de doenças corneais, algumas
ainda, de etiologias e tratamentos desconhecidos.
No entanto, sabe-se do papel fundamental das células-tronco
(stem cells)
no processo regenerativo corneal. A literatura humana
descreve a exata localização, bem como as funções dessas células.
Diversos estudos
in vitro
têm demonstrado a capacidade de diferenciação
dessas células em um tipo celular requerido em diversos distúrbios da
superfície
ocular.
Entretanto, o mesmo ainda não ocorreu na medicina
veterinária, sequer a localização das células-tronco em olhos de animais
de companhia foi descrito, tratando assim, de assunto que merece novas
25
e originais investigações.
A localização das células tronco no tecido corneal do homem
pode ser influenciada pela idade, mas poucos trabalhos científicos foram
realizados objetivando esse aspecto. É provável que o mesmo ocorra em
animais. Elas se constituem em células germinativas, imaturas, com
função de promover a reposição da massa celular de um determinado
tecido. Essas células são requeridas como um último recurso no caso de
regenerações. Na maioria das vezes, estão concentradas na região do
fórnice conjuntival (Meller et al., 2001), e apresentam um comportamento
cíclico em relação à renovação do epitélio e atividade de células do
sistema imune, que estão sob constante turnover.
Sendo assim, considerando-se a necessidade e importância
científica em se determinar a localização de células em proliferação da
superfície ocular de cães, o presente estudo teve por objetivos: 1)
determinar a expressão de células em proliferação pela marcação
imunoistoquímica por anticorpos monoclonais anti-PCNA e anti-MIB-1,
bem como, sua localização na superfície ocular; 2) comparar se há
diferença estatística significante na marcação dessas células em
diferentes idades.
REVISÃO DA LITERATURA
27
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Córnea
A córnea é uma estrutura anesférica e transparente que,
juntamente com a esclera, compõe a túnica fibrosa do olho. A região de
transição entre essas duas estruturas chama-se Iimbo esclerocorneal, que
é um pouco mais largo nas porções inferior e superior. Naturalmente não
pigmentada e avascular, desempenha as funções de manutenção da
forma do olho, além da convergência dos raios luminosos nela incidentes
(Andrade, 2002; Brunelli, 2004). No cão, a córnea é formada por quatro
camadas distinguíveis, da mais externa para a mais interna: epitélio,
estroma, membrana de Descemet e endotélio (Andrade, 2002) e compõe
um quinto da túnica fibrosa do olho (Brunelli, 2004) (Figura 1).
28
Figura 1.
Fotomicrografia de 2 duas camadas da córnea do cão: E: epitélio; S:
estroma (Andrade, 2002).
2.2 Superfície Ocular
A superfície ocular é composta pelos epitélios da córnea, limbo e
conjuntiva. Os três epitélios apresentam características comuns, porém
diferenciam-se tanto fenotipicamente quanto funcionalmente. São do tipo
pavimentoso, estratificado não-queratinizado e repousam sobre uma
membrana basal composta basicamente de colágeno tipo I e IV e
proteínas da matriz extracelular. Anteriormente, encontram-se revestidos
pelo filme lacrimal, com que tem relação metabólica íntima e fundamental
(Gomes et al., 2000). Além disso, os epitélios corneal e escleral podem
ser distinguidos pela expressão de diferentes tipos de queratina, mucinas
E
S
29
e glicocálice. (Meller et al., 2002).
Vários trabalhos clínicos e experimentais têm fornecido evidências
sobre a importante relação funcional desses epitélios com a manutenção
das funções básicas da superfície ocular:
1) formar uma barreira de proteção à perda líquida e evitar a
entrada de patógenos;
2) pela sua interação com o filme lacrimal, compor uma superfície
lisa e regular;
3) possuir mecanismos cicatriciais altamente desenvolvidos, para
responder de maneira rápida e eficaz às agressões físicas externas
(Gomes, 2000).
O epitélio da superfície ocular, além de ser constantemente
protegido por um filme lacrimal estável, também participa ativamente na
formação da estabilidade desse filme. Isso é garantido pela liberação de
gel formador de mucina pelas células conjuntivais caliciformes, o qual é
um dos importantes componentes do filme lacrimal. Além disso, ambas
as células epiteliais corneais e as conjuntivais não caliciformes
apresentam mucina em suas superfícies, o que as mantém umidificadas
(Andrade, 2002).
2.2.1 Epitélio da córnea
As células basais da córnea são metabolicamente mais ativas e
30
possuem maior número de mitocôndrias do que as células superficiais. As
células epiteliais localizadas mais superficialmente possuem microplicatas
e microvilosidades revestidas por glicocálice, que se encontra
intimamente relacionado com a parte de mucina do menisco lacrimal. Os
nutrientes para a córnea provêm de três fontes principais: o filme lacrimal,
que fornece a maior parte do oxigênio, os vasos sangüíneos limbares e o
humor aquoso, que fornecem glicose e aminoácidos. A membrana basal
do epitélio da córnea é sintetizada pelas células basais epiteliais. Possui
várias funções, como auxiliar a migração e adesão do epitélio corneal,
manter a arquitetura do tecido e atuar como membrana semi-permeável à
passagem de substâncias produzidas pelo
epitélio
e
pelos
ceratócitos. Sua
composição é basicamente de
colágeno
do tipo I
mas também há na
córnea do adulto, laminina, heparina e, em menores quantidades, de
fibronectina e fibrina. O citoesqueleto das células epiteliais é composto
basicamente de três filamentos protéicos: filamentos de actina,
microtúbulos e filamentos intermediários. Os filamentos intermediários são
formados pelas queratinas, que constituem uma família complexa
composta de aproximadamente 30 proteínas, divididas em duas classes:
tipo I ou ácidas e tipo II ou neutro-básicas. Assim que as células epiteliais
começam a diferenciar-se das camadas basais para a camada apical, três
pares de queratinas principais são seqüencialmente expressos:
queratinas basais ou tipo B (K5/K 14); queratinas relacionadas à
diferenciação ou tipo D (corneais K31K12) e hiperproliferativas ou tipo H
31
(K6/K16) (Rodrigues et al., 1986; Gomes, 2000).
2.2.3 Limbo da córnea
O epitélio do limbo tem aproximadamente de 10 a 12 camadas de
células em espessura e contém melanócitos, células de Langerhans e as
terminações em alça da rede vascular conjuntival. O estroma e o epitélio
limbares formam elevações radiais fibrovasculares, denominadas
paliçadas de Vogt, que se encontram presentes em toda a circunferência
da córnea, porém melhor definidas superior e inferiormente (Gomes,
2000).
O epitélio limbal do homem contém stem cells (Girolamo et al.,
1999) e essas são responsáveis pela substituição e regeneração
teciduais. São indispensáveis à manutenção da integridade da superfície
ocular, promovendo sua renovação em condições normais e de
reepitelização em processos reparatórios (Brunelli, 2004).
2.2.4 Epitélio da conjuntiva
A conjuntiva bulbar é composta por 6 a 9 camadas de células
epiteliais. Essas células são menos regulares e estão agrupadas de
maneira menos compacta do que na córnea. Característica típica do
32
epitélio conjuntival é a presença de células caliciformes secretoras de
mucina, que correspondem aproximadamente a 7% da população de
células basais. Algumas células epiteliais podem conter grânulos de
melanina (Gomes, 2000). O epitélio conjuntival contém células
secretórias, denominadas "goblet" (Girolamo et al., 1999).
2.3 Renovação Epitelial da Superfície Ocular
As stem cells são células germinativas, imaturas, com função de
promover a reposição da massa total de células de um determinado
tecido. Essas células são requeridas como último recurso no caso de
regenerações. Na maioria das vezes estão concentradas principalmente
na região do fórnice da conjuntiva (Meller et al., 2001).
A superfície ocular é caracterizada por um comportamento cíclico
em relação
à
renovação do epitélio e atividade de células do sistema
imune que estão sob constante turnover. A população de células epiteliais
da superfície ocular é mantida pelo equilíbrio entre a divisão celular e a
morte celular. As stem cells possuem ilimitada capacidade de divisão. São
consideradas células com capacidade proliferativa “livre de erros” e após
a proliferação ordenada, transformam-se em células de transição e,
finalmente, em epitélio corneal diferenciado (Brunelli, 2004).
A população de células do epitélio corneal é mantida pelo
equilíbrio entre a divisão no limbo e a camada de células basais do
33
epitélio (Zhou et al., 2000). No cão, a renovação se dá em cerca de uma
semana. As células da sua camada superior estão continuamente se
descamando, sendo substituídas por células basais que se proliferam
(Brunelli, 2004). As células maduras migram de forma centrípeta e
anterior e se fixam quando atingem a superfície (Schermer et al., 1986).
As células maduras são eliminadas pelo filme lacrimal e expõem novas
células epiteliais. A manutenção da integridade da superfície epitelial
corneal pode ser explicada pelo modelo X, Y, Z. As células epiteliais
descamadas (componente Z) seriam continuamente renovadas pela
proliferação das células basais (componente X) e pela proliferação e
migração centrípeta das células do limbo (células-tronco, componente Y).
Por tal hipótese, o equilíbrio, quanto a sua renovação, seria mantido
quando X + Y fosse igual a Z (Brunelli, 2004). O deslocamento final para
término da diferenciação celular é feito pelo ato de piscar. Além disso, a
presença de células apoptóticas no epitélio corneal de coelhos sugere um
mecanismo alternativo de morte celular (Cotsarelis et al., 1989). A
renovação do epitélio conjuntival é semelhante ao corneal, entretanto a
localização das stem cells ainda é debatida (Zhou et al., 2000).
As desordens do globo ocular representam uma porção
significativa do espectro de doenças oftálmicas com etiologias diferentes
como, inflamatória, infecciosa, neoplásica, tóxica, iatrogênica, congênita,
hereditária, traumática e degenerativa. Algumas dessas injúrias possuem
um tratamento limitado, e em alguns casos, há danos severos na
34
superfície ocular, o que leva
a
uma restrição nos mecanismos de reparo
celular dessa superfície, principalmente das stem cells. Em situação de
estresse, o epitélio corneal inicia uma resposta aumentando o número de
mitoses e a reposição celular, sendo que a migração de células epiteliais
é a primeira resposta diante da injúria. No homem, sabe-se que as stem
cells do epitélio corneal na região do limbo são responsáveis pela
manutenção da integridade da superfície ocular (Han et al., 2002).
A maioria das células encontrada na córnea são células epiteliais,
queratinócitos e células endoteliais. Essas células têm sido usadas para
estudos biológicos referentes ao crescimento celular, proliferação e
diferenciação celular epitelial e endotelial (Minami et al., 1992).
2.4 Queratinas
As queratinas são um grupo de proteínas insolúveis, produzidas
pelos queratinócitos, cujo peso molecular varia de 40-70 kilodaltons, e
compõem filamentos intermediários numa ampla variedade de células
epiteliais. A subunidade da queratina vai depender da variação no tipo de
célula epitelial, do período de desenvolvimento celular, do estágio de
diferenciação histológica e do comportamento do crescimento celular
(Cooper et al., 1984; Moroi et al., 2003). Em 1995, apenas as
citoqueratinas foram descobertas como moléculas constituintes dos
filamentos intermediários, e, desde então, vem sendo investigada a
35
presença dessas proteínas na zona entre o limbo e a córnea periférica, na
intenção de melhor compreender o processo básico de reposição e o
turnover celular no epitélio corneal (Gan et al., 1995).
Estudos bioquímicos e imunológicos demonstraram que todas as
queratinas epiteliais humanas podem ser divididas em dois grupos:
subfamília A (tipo I), que consiste nas queratinas ácidas, as quais reagem
com o AE1 e a subfamília B (tipo
11),
que consiste nas queratinas neutro-
básicas (Cooper et al., 1984).
Han e colaboradores, em 1998, demonstraram que as células do
epitélio corneal derivadas das stem cells do limbo e cultivadas ex-vivo
mantém sua diferenciação específica expressa pela queratina K3. No
estudo, demonstraram que as células de epitélio corneal que cresceram
no cultivo de gel de fibrina e expressam queratina K3 mantém as mesmas
características de diferenciação que as células epiteliais da córnea.
Meller e colaboradores, em 2002, demonstraram que em cultivo
de epitélio conjuntival utilizando-se membrana aminiótica, a resposta do
anticorpo monoclonal AE5 (o qual reconhece a queratina K3) é negativa
na conjuntiva, mas positiva nas células suprabasais do epitélio do limbo.
Em coelhos, a queratina K3, expressa pelo anticorpo monoclonal
AE5 é básica e está localizada na camada suprabasal do limbo e também
em todas as camadas do centro da córnea. A expressão dessa queratina
é característica das células suprabasais, fato que a torna útil para marcar
a diferenciação celular do epitélio corneal. A ausência da queratina K3
36
nas células basais do limbo, mas a sua presença em todas as células
epiteliais do centro da córnea a torna um bom marcador para verificação
do estágio de diferenciação epitelial da córnea (Kiritoshi et al., 1991).
A queratina K3 é uma das queratinas de escolha para o estudo
da diferenciação celular no epitélio corneal, por 3 motivos:
• Está presente em grande quantidade no epitélio corneal (cerca de
30%), mas está ausente no epitélio conjuntival, na epiderme em
outros epitélios,
• A expressão dessa queratina é dependente da diferenciação
celular,
• É caracterizada pela localização suprabasal (Rodrigues et al.,
1987).
2.5 Marcadores nucleares
Além dos anticorpos monoclonais que reagem superficialmente
com as citoqueratinas e determinam o tipo celular presente nos tecidos,
existe marcadores capazes de reagir antigenicamente com os núcleos
celulares. Entre eles, o PCNA e o Ki-67 são capazes de marcar células
em proliferação.
O PCNA é uma proteína nuclear endógena que atua como co-
fator para a polimerase delta, e se expressa diferentemente de acordo
37
com o ciclo celular. A sua taxa de síntese é diretamente proporcional à
taxa de proliferação celular. Essa proteína serve como um marcador não
apenas de células em proliferação, mas também de células em reparo de
DNA. É expressa durante a replicação do DNA, no início da fase G1, com
expressão máxima na fase S e declínio na fase G2. Além disso, as células
PCNA positivas provavelmente são as stem cells na córnea (Gan et al.,
1998). Anteriormente, já haviam sido observadas células PCNA positivas
no epitélio corneal com alta taxa de proliferação, principalmente no limbo,
sugerindo que essa região seja composta principalmente por células-
tronco, porém o endotélio corneal não reage positivamente ao PCNA (Gan
et al., 1995).
Entre os marcadores de proliferação celular utilizados na
imunoistoquímica de tecidos tumorais, o Ki-67 é sem dúvida, o de maior
valor. A proteína Ki-67 é um antígeno de proliferação celular presente nas
fases G1, S, G2 e mitose do ciclo celular (Ruiz et al., 2004). É descrito
como excelente marcador da atividade proliferativa, porém seu uso está
restrito à material fresco congelado (Neto et al., 2001). O MIB-1 constitui
um anticorpo monoclonal desenvolvido contra o antígeno Ki-67, que pode
ser utilizado rotineiramente em tecidos fixados. É produzido pelos
recombinantes do Ki-67 com características equivalentes. Vários grupos
já relataram uma correlação positiva entre o índice de marcação nuclear
do Ki-67 com o MIB-1 (Neto et al., 2001). O MIB-1 também é utilizado
38
para avaliar a atividade de proliferação celular de tumores, permitindo
avaliar a morfologia e cinética das células tumorais (Pich et al., 1994).
A diferença básica entre o PCNA e o MIB-1 é que o primeiro é um
antígeno de proliferação e de reparo de DNA, ao passo que o segundo,
apenas de proliferação do DNA; isso o torna mais específico para se
determinar proliferação celular. Ambos marcadores se caracterizam pela
marcação nuclear, evidenciada pela coloração acastanhada (Ruiz et al.,
2004) em microscopia de luz.
OBJETIVOS
40
3. OBJETIVOS
Considerando-se a necessidade e importância científica em se
determinar a localização de células em proliferação da superfície ocular
de cães, o presente estudo teve por objetivos:
• Determinar a expressão de células em proliferação pela
marcação imunoistoquímica com anticorpo monoclonal anti-
PCNA e anti-MIB-1, bem como, sua localização na superfície
ocular;
• Comparar se há diferença estatística significante na marcação
dessas células em cães jovens e adultos, utilizando-se dois
grupos experimentais distintos.
MATERIAL e MÉTODOS
42
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados 24 cães, entre machos e fêmeas, de diferentes
raças e idades, de peso variado, encaminhados ao Hospital Veterinário
“Luiz Quintiliano de Oliveira”, do Curso de Medicina Veterinária –
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP –
Campus de Araçatuba, que foram a óbito vítimas de traumatismos.
Excluíram-se os animais que apresentavam problemas oftálmicos prévios.
Imediatamente após o óbito, procedeu-se a enucleação
subconjuntival unilateral dos bulbos oculares esquerdos, bem como o
levantamento individual sobre os dados gerais, achados clínicos e exame
oftálmico. Foram formados dois grupos de estudo:
•
Grupo A (GA):
constituído por treze cães com idade entre
dois e doze anos;
•
Grupo B (GB):
. constituído por onze cães com idade entre
um e doze meses.
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética de
Experimentação Animal (CEEA) da Faculdade de Odontologia de
Araçatuba (SP) da UNESP - Campus de Araçatuba.
43
4.1.1 Colheita dos fragmentos oculares para análise e processamento do
material
Após a enucleação subconjuntival unilateral esquerda, o globo
ocular foi fixado em solução de formaldeído 10% tamponado (Formol PA,
Merck
®
) por um período de sete dias. Atentou-se para uma manipulação
cuidadosa do tecido colhido, a fim de se evitarem danos teciduais que
comprometessem a avaliação histológica. Após a fixação, cada bulbo
ocular fora cortado com lâmina de bisturi, no sentido sagital,
compreendendo as regiões de conjuntiva bulbar superior, limbo superior,
córnea, limbo inferior e conjuntiva bulbar inferior (Figura 2).
0,5cm
Figura 2
. Fotografia identificando local do corte sagital no bulbo ocular esquerdo
Os fragmentos de aproximadamente 0,5 cm foram
cuidadosamente introduzidos em cassetes individuais e identificados. Os
cassetes foram incluídos em parafina para realização do processamento
do histotécnico (Histologie, Merck
®
) e cortados em micrótomo a uma
44
espessura de 5µm para a confecção das lâminas. Foram feitas 3 lâminas
para cada animal (lâminas de vidro para histologia com extremidade
fosca) (Figura 3).
Figura 3.
Em A: fotografia de cassete parafinado com o fragmento de córnea (1),
esclera (2) e conjuntiva (3); em B: micrótomo utilizado para confecção dos cortes
histológicos.
Cada fragmento foi submetido ao processamento convencional
para histopatologia e corados pela H.E. (hematoxilina e eosina) e
processados pela técnica de imunoistoquímica com os marcadores PCNA
(Dako
®
) e MIB-1 (Dako
®
).
A observação das lâminas imunomarcadas com PCNA e MIB-1 foi
individual, usando-se microscópio de luz com aumento de 400x e foram
contadas 100 células em campos bem preservados do epitélio corneal, do
limbo e da conjuntiva (Figura 4). As células imunomarcadas
apresentavam núcleos evidentes e acastanhados. Para a análise
estatística, o número de células imunomarcadas foi convertido em
porcentagem. A positividade aos exames imunoistoquímicos para PCNA e
A
B
(1)
(2)
(3)
45
MIB-1 foi subjetivamente analisada e os resultados obtidos foram
tranformados em cruzes, sendo que:
+ : imunomarcação fraca
++ : imunomarcação média
+++ : imunomarcação forte
Figura 4.
Representação esquemática do corte sagital de olho. No esquema
observam-se as regiões do bulbo ocular aonde foram realizadas as
contagens de células marcadas pelo PCNA e MIB-1. Em (a):
epitélio da córnea; (b): região do limbo e (c): conjuntiva bulbar.
(a)
(c)
(b)
46
4.2 Imunoistoquímica
Inicialmente realizou-se a desparafinização em xilol, à
temperatura ambiente por 30 minutos. A hidratação dos cortes foi
realizada utilizando-se álcool absoluto, 95% e 85% (5 minutos em cada
álcool), seguida de lavagem em água corrente por 10 minutos e
finalizando-se com duas passagens em água destilada.
A recuperação antigênica dos cortes foi realizada pelo calor em
microondas com solução de citrato 10mM (2,1 g de ácido cítrico
monohidratada diluídos em 1000 mL de água destilada), corrigindo-se o
pH = 6.0, em duas passagens no microondas de 5 minutos cada,
deixando-se o material esfriar em temperatura ambiente. É importante na
recuperação antigênica verificar o nível da solução de citrato 10Mm a
cada passagem, pois caso haja sua diminuição é necessário completá-lo.
Ato contínuo, as lâminas foram lavadas em água corrente para a
realização da próxima etapa.
Para o bloqueio da peroxidase endógena, usou-se solução de
100,0 mL de água oxigenada (20V) diluída em 100,0 mL de metanol
durante 30 minutos, com lavagem subseqüente em água corrente e
banho em solução TRIS (tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4: 1000mL de água
destilada + 6g de tris base + 8,5g de cloreto de sódio, com variação de pH
entre 7,2 e 7,6).
47
A incubação com os anticorpos primários aconteceu na
seqüência, enquanto as lâminas ainda estavam na solução TRIS. As
lâminas foram incubadas com os anticorpos primários (anti-MIB-1 e anti-
PCNA, Dako
®
) por 18 horas (overnight) a uma temperatura de 4
0
C (em
geladeira). Em seguida, foram incubadas em estufa a 37
0
C por 120
minutos e, então, as lâminas foram lavadas em solução tampão TRIS
(pH=7,4) por 10 minutos.
Como próxima etapa, realizou-se a incubação com os anticorpos
secundários. As lâminas foram incubadas com “kit” LSAB (Dako
®
), pronto
para uso, que contempla os anticorpos secundários, por 30 minutos em
câmara úmida (37°C). Em seguida fez-se uma passagem em solução
tampão TRIS (pH = 7,4) por 10 minutos. As diluições usadas foram 1:100
para o PCNA e 1:50 para o MIB-1.
Ato contínuo, a revelação foi conduzida utilizando-se o cromógeno
diaminobenzidina (DAB = 100ml de solução tampão TRIS + 0,025g de
DAB + 600µl de água oxigenada 20V), com sucessiva lavagem em
solução tampão TRIS por 5 minutos, em água corrente por 10 minutos e,
por fim, em água destilada por 5 minutos.
Em seguida foi realizada a contra-coloração com Hematoxilina de
Meyer (Dako
®
), usando-se 5,0 mL por lâmina e lavagem em água
destilada por 5 minutos.
48
Para finalização, as lâminas foram desidratadas em lavagens
decrescentes de álcoois, e, posteriormente, montadas em resina sintética
(Permount
®
) e com lamínulas de vidro.
4.3 Análise Estatística
Os dados obtidos da contagem do número de células pelos
marcadores de proliferação celular foram submetidos à análise de
variância em parcelas subdivididas (“split-plot”) onde estas foram
consideradas os grupos, e as sub-parcelas foram consideradas as
técnicas.
A comparação entre as médias foi realizada pelo teste de Tukey,
no nível de significância de 5%. Os resíduos foram testados quanto à
normalidade e homogeneidade de variâncias, considerados pré-requisitos
necessários para a análise de variância. A análise estatística foi efetuada
empregando-se o programa SAS (Statistical Analysis System) (Zar, 1998).
RESULTADOS
50
5. RESULTADOS
Nas lâminas coradas pela H.E., observou-se normalidade no
padrão histológico do bulbo ocular, atentando-se ao tecido corneal, cujas
camadas apresentavam-se íntegras, com o contorno do epitélio bem
definido em toda sua extensão e também as demais regiões anatômicas
do olho estavam preservadas. Essas lâminas, coradas pelo H.E., foram
utilizadas como controle à observação das regiões imunomarcadas.
O presente estudo revelou a expressão do PCNA e do MIB-1 em
células do tecido corneal em cães de diferentes idades, principalmente
nas regiões do limbo e epitélio corneal.
A Tabela 1 apresenta média e o erro padrão da média da
porcentagem de células marcadas pelo PCNA e MIB-1 em ambos os
grupos.
51
Tabela 1.
Média (
x
) e erro padrão da média (EPM) da % de células marcadas,
segundo as técnicas e grupos.
% de células marcadas (
x
±
EPM)
Marcadores de
proliferação
celular
Grupo A
Grupo B
PCNA
68,1
±
5,9 aA
76,9
±
4,6 aA
MIB -1
30,2
±
5,3 bA
43,5
±
6,2 bA
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem entre si
pelo teste de Tukey (P > 0,05).
Nota-se que estatisticamente, não há diferença significativa ao
nível de significância de 5% entre os grupos A e B, ou seja, a idade não
influenciou a proliferação celular na superfície ocular de cães. Entretanto,
biologicamente notou-se essa diferença, pois os cães jovens tiveram um
maior número de células imunomarcadas. Embora fora observado uma
maior marcação para o PCNA, a análise dos dados não revelou diferença
estatística para ambos os marcadores entre os grupos, mas houve
diferença estatística (p>0,05) entre o número de células marcadas pelo
PCNA e MIB-1 dentro de cada grupo (Figura 5).
52
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PCNA
Mib-1
% de células marcadas
% stained cells
Grupo A
Grupo B
Figura 5.
Representação gráfica da porcentagem de células imunomarcadas
pelas técnicas de PCNA e MIB-1 nos grupos de estudo (GA e GB).
Evidenciou-se ainda, que nos animais mais jovens (GB) a
expressão dos marcadores nucleares (PCNA e MIB-1) foi maior do que a
observada nos animais adultos (GA), como mostra a Figura 6. As células
imunomarcadas (núcleos evidentes e acastanhados) concentraram-se
principalmente no limbo e no epitélio corneal em ambos os grupos. A
imunomarcação do MIB-1, entretanto, foi menor nos dois grupos de
estudo, quando comparado com o PCNA. Nos demais tecidos da
superfície ocular a imunomarcação foi discreta, com ausência total de
marcação no endotélio corneal.
53
Em todas as lâminas observou-se que a região limbal fora a mais
imunomarcada, tanto para o PCNA como para o MIB-1, em ambos os
grupos de estudo.
Figura 6.
Fotomicrografia da região da córnea, limbo e conjuntiva de olhos de
cães dos grupos GA e GB coradas pelas técnicas de imunoistoquímica para os
marcadores nucleares PCNA e MIB-1. A: região de limbo de animal adulto (GA)
marcada pelo PCNA; B: região de limbo de animal adulto (GA) marcada pelo
MIB-1; C: região de limbo de animal jovem (GB) marcada pelo PCNA; D: região
de limbo de animal jovem (GB) marcada pelo MIB-1. Nas setas, observam-se as
células imunomarcadas, com núcleos evidentes e acastanhados. Notar maior
imunomarcação de células em proliferação pela técnica do PCNA.
A
B
C
D
DISCUSSÃO
55
6. DISCUSSÃO
No homem, a exata localização das células tronco já está bem
estabelecida. Entretanto, não se encontram relatos quanto a este aspecto
em medicina veterinária. Brunelli (2004) investigando experimentalmente
a eficiência do transplante autólogo de limbo em cães com destruição total
desta região ocular, concluiu que o mesmo foi eficiente em possibilitar a
recuperação da transparência corneal dos olhos lesados. No mesmo
sentido, os olhos dos cães doadores não apresentaram complicações,
fornecendo evidências que o limbo seja a fonte doadora dessas células
na superfície ocular. Com as particularidades anatômicas da córnea e
limbo no cão, nem sempre é possível extrapolar, de forma segura, os
resultados de pesquisas desenvolvidas no homem. Sendo assim, optou-
se por estudar a exata localização deste tipo celular nos olhos de cães em
diferentes idades. Para tanto, foram utilizados os marcadores de
proliferação celular PCNA e MIB-1, ainda que a imunomarcação com
anticorpo monoclonal AE5 fosse mais específica por marcar a
citoqueratina K3 que é expressa pelas células-tronco (Kiritoshi et al.,
1991; Han et al., 2002; Meller et al., 2002). Porém, a inexistência no
mercado de anticorpos espécie-específico para o cão com essa
finalidade, foi determinante para a utilização dos dois marcadores de
proliferação celular (PCNA e MIB-1) nesse estudo. Apesar desses dois
56
imunomarcadores também serem espécie-específicos para o homem,
ambos reagem bem com a superfície ocular de cães.
Nos cortes histológicos corados pelo H.E., observou-se
normalidade no padrão histológico do bulbo ocular atentando-se ao tecido
corneal, cujas camadas apresentavam-se íntegras, bem como as demais
regiões anatômicas do olho. Essas, foram utilizadas como controle à
observação das regiões imunomarcadas.
O presente estudo revelou a expressão do PCNA e do MIB-1 em
células do tecido corneal em cães de diferentes idades, principalmente
nas regiões do limbo e epitélio corneal. Gan et al. (1995), descreveram
que a integridade corneal depende de uma constante reposição das
células epiteliais. Qualquer injúria no tecido corneal provocará como
resposta, um aumento na atividade proliferativa de células indiferenciadas
da córnea, mas, que na dependência do estímulo, diferenciar-se-iam em
células epiteliais corneais. É importante ressaltar que o endotélio corneal
não foi marcado, conforme fora descrito no homem pelos mesmos
autores.
Embora fora observado uma maior marcação para o PCNA, a
análise dos dados não revelou diferença estatística para ambos os
marcadores entre os grupos, mas houve diferença estatística (p>0,05)
entre o número de células marcadas pelo PCNA e MIB-1 dentro de cada
grupo. Era esperado que tal fato ocorresse, pois o MIB-1 é mais
específico por marcar apenas células em proliferação. Salienta-se que o
57
emprego desse marcador no olho não fora reportado anteriormente em
medicina humana e veterinária. Pode-se observar que é possível utilizá-lo
em pesquisas desta natureza, sendo, portanto, um marcador confiável
aos objetivos propostos. Alguns estudos têm analisado o valor preditivo
do MIB-1 em carcinomas vesicais e neoplasias prostáticas no homem, e
tumor venéreo transmissível em cães (Neto et al., 2001; Ruiz et al., 2004).
O PCNA, além de ser um marcador de células em proliferação
também se constitui em um marcador de células em reparação (Gan et
al., 1995). Nos olhos aqui estudados, observou-se um maior número de
células marcadas pelo mesmo, no entanto, não se pode afirmar que todas
as células marcadas estejam em proliferação e que, portanto, tratem-se
de células-tronco. A sua utilização em estudos da córnea humana como
marcador de stem cell e células transicionais, permitiu inferir que este é
bom sinalizador de células em proliferação da superfície ocular. O mesmo
pode-se sugerir no estudo ora descrito. Salienta-se, que a taxa de síntese
de PCNA está diretamente correlacionada com a taxa de proliferação
celular (Gan et al., 1998), ou seja, quanto maior positividade da
imunomarcação, maior o grau de proliferação celular. Embora não fosse
objetivo deste estudo correlacionar tal aspecto, foi possível observar a
presença de células fortemente ou fracamente imunomarcadas em todas
as regiões estudadas, independentemente do grupo avaliado.
Os resultados observados permitem sugerir que a região superior
do limbo foi a que apresentou maior taxa de núcleos imunomarcados pelo
58
PCNA e MIB-1, independentemente do grupo estudado. Entretanto,
também foram contadas células imunomarcadas na conjuntiva e na
porção superior do epitélio corneal, em quantidades menores. O mesmo
fora descrito por outros autores que utilizaram o PCNA na identificação de
stem cells na superfície ocular do homem (Gan et al., 1995).
Com esse estudo, evidenciou-se que, nos animais mais jovens
(GB), a expressão dos marcadores nucleares (PCNA e MIB-1) foi maior
do que a observada nos animais adultos e mais velhos (GA). Isso sugere
uma maior atividade de proliferação celular nos animais jovens,
possivelmente em função da taxa do metabolismo mais acelerada.
CONCLUSÕES
60
7. CONCLUSÕES
Com base nas condições aqui adotadas, pode-se concluir ao
término deste trabalho que:
• A presença de células em proliferação imunomarcadas
pelo PCNA e pelo MIB-1 foi observada em diferentes
tecidos da superfície ocular de cães, sendo os tecidos mais
marcados foram o limbo e o epitélio da córnea;
• Cães mais jovens apresentam um maior contingente de
células em proliferação nos tecidos oculares estudados, do
que o observado nos cães adultos, embora
estatisticamente isso não fora visto.
• É provável que, as células imunomarcadas sejam células-
tronco da superfície ocular de cães. No entanto, para tal
comprovação, sugere-se a necessidade da utilização de
anticorpos monoclonais espécie-específico como o AE5 no
homem.
• Esse trabalho servirá de base para futuros estudos e
delineações científicas sobre a cinética, fisiopatologia e
anatomia da superfície ocular de cães
REFERÊNCIAS
62
8. REFERÊNCIAS
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cicatrização de córneas de coelho submetidas a traumas mecânico e
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TRABALHO
68
Instruções aos Autores
• Artigos Científicos
Devem ser estruturados de acordo com os seguintes itens:
1. Página de rosto, com:
• Título do trabalho em português e em inglês, fonte Times New
Roman, tamanho 12, com espaçamento simples, em negrito e
centralizado, no qual somente a primeira letra de cada palavra
deve ser maiúscula. Quando necessário, indicar a entidade
financiadora da pesquisa, como primeira chamada de rodapé;
• Nomes completos dos autores, em que somente a primeira letra de
cada nome deve ser maiúscula, centralizado e em negrito. Digitá-
los, separados por vírgulas, com chamadas
de rodapé numeradas
e em sobrescrito, que indicarão o cargo e o endereço profissional
dos autores (inclusive endereço eletrônico), seguidos da instituição
onde o trabalho foi desenvolvido ou às quais estão vinculados;
• Nome, endereço, telefone, fax e correio eletrônico, para
correspondência;
• Em caso de envolvimento de seres humanos ou animais de
experimentação, encaminhar o parecer da Comissão de Ética ou
equivalente, assinalando, no trabalho, antes das referências, a data
de aprovação.
69
2. Página com resumo e abstract
• Tanto o resumo, como o abstract devem ser seguidos do título do
trabalho, no respectivo idioma, e conter no máximo 400 palavras
cada um, com informações referentes à introdução, metodologia,
resultados e conclusões. O texto deve ser justificado e digitado em
parágrafo único e espaço 1,5, começando por RESUMO. O
abstract, deve ser tradução fiel do resumo. Se for apresentado em
inglês, deve conter também, resumos em português e espanhol; se
for em espanhol, resumos em português e inglês.
• Devem conter, no máximo, cinco palavras-chave e key words que
identifiquem o conteúdo do texto.
3. A estrutura do artigo deverá conter:
Introdução
: Deve ser clara, objetiva e relacionada ao problema
investigado e à literatura pertinente, bem como aos objetivos da pesquisa.
A introdução estabelece os objetivos do trabalho.
Material e Métodos
: Deve oferecer informações de reprodutibilidade da
pesquisa, de forma clara e concisa, como variáveis, população, amostra,
equipamentos e métodos utilizados, inclusive os estatísticos.
Resultados
: Apresentação dos resultados obtidos, que devem ser
descritos sem interpretações e comparações. Poderá ser sob a forma de
70
tabelas, em folha à parte, no máximo de cinco, ordenadas em algarismos
arábicos e encabeçadas pelo título, de acordo com as normas de
apresentação tabular da ABNT/WBR 6023/2000 da Associação Brasileira
de Normas Técnicas, identificadas no texto como Tabela; sob a forma de
figuras, nos casos de gráficos, fotografias, desenhos, mapas, etc.,
ordenadas em algarismos arábicos, até no máximo de seis, e citadas no
texto como Figura. Devem ser identificadas em folha à parte, onde deve
constar o título do artigo. Fotografias podem ser em preto e branco ou
coloridas, identificadas com o(s) nome(s) do(s) autor(es) no verso. No
caso de desenhos originais, a impressão deve ser em papel adequado,
de qualidade. Se o trabalho for apresentado na língua portuguesa ou
espanhola, os enunciados das tabelas e figuras bem como das variáveis
apresentadas deverão estar também escritos em inglês.
Discussão
: Deve ser entendida como a interpretação dos resultados,
confrontando com a literatura pertinente, apresentada na introdução. Se
julgar conveniente, os resultados e a discussão poderão ser apresentados
conjuntamente.
Conclusões
: É a síntese final, fundamentada nos resultados e na
discussão.
71
Referências
: Devem ser apresentadas de acordo com as normas da
ABNT, e o arranjo deve ser em ordem alfabética por sobrenome do autor
(modelos anexos).
Deverão ser editorados em Microsoft Word for Windows, para edição de
textos, Excel (qualquer versão) para gráficos, formato JPEG ou GIF
(imagem) para fotografias, desenhos e mapas, em três vias (uma
original e duas cópias) impressas, formato A4 (21,0 x 29,7 cm), em
espaço duplo, mantendo margens de 2,5 cm, nas laterais, no topo e pé de
cada página, fonte Times New Roman, tamanho 12 e numeração
consecutiva das páginas em algarismos arábicos, a partir da folha de
identificação. Ilustrações e legendas devem ser apresentadas em folhas
separadas. Encaminhar cópia em disquete 3 ½” de alta densidade ou CD,
identificado com título do artigo e nome dos autores. Nas duas cópias
deve(m) ser omitido(s) o(s) nome(s) do(s) autor(es), o local onde se
realizou o trabalho, bem como o rodapé.
Não serão fornecidas separatas. Os artigos estarão disponíveis no
formato PDF no endereço eletrônico da revista. Para as demais seções da
revista são válidas as normas anteriores. Não devem exceder a 15
páginas. Abreviaturas não usuais devem ser empregadas após escritas
por extenso na primeira utilização.
Expressão de Antígenos Nucleares de Células em Proliferação na Superfície Ocular de Cães
Jovens e Adultos
Expression of Proliferation Cells Nuclear Antigens in Ocular Surface of Young and Adult
Dogs
Marcele Cristina Caetano
1
, Alexandre Lima de Andrade
2
,
Maria Cecília Rui Luvizotto
3
, Renée
Laufer Amorin
4
,
Silvia Helena Venturolli Perri
3
____________________________________
1
Médica Veterinária Autônoma, Pós-graduanda da Universidade Estadual Paulista – Campus de
Araçatuba – Faculdade de Odontologia – Programa de Pós-graduação em Ciência Animal. Rua
Paraguai, 1810 Sala 03. Centro, Medianeira (PR). Fones: (45) 3264-5798; (45) 3240-2647; (45)
9934-4021.
marcelecaetano@hotmail.com
2
Professor Assistente Doutor – Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Curso de Medicina
Veterinária - Universidade Estadual Paulista – Unesp – campus de Araçatuba.
3
Professora Assistente Doutora - Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Curso de Medicina
Veterinária - Universidade Estadual Paulista – Unesp – campus de Araçatuba.
4
Professora Assistente Doutora – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade
Estadual Paulista – Unesp – campus de Botucatu
RESUMO
Expressão dos antígenos nucleares de células em proliferação na superfície
ocular de cães jovens e adultos
As células-tronco (stem cells) têm um papel fundamental nos processos
reparativos e regenerativos da córnea. A exata localização destas é bem conhecida
no olho do homem, bem como as suas funções. Entretanto, as mesmas ainda não
foram descritas em medicina veterinária, sequer a sua localização em olhos de
animais de companhia, tratando-se assim, de assunto que merece novas e originais
investigações. Anticorpos monoclonais que reagem superficialmente com as
citoqueratinas são empregados para determinar este tipo celular presente nos
tecidos, no entanto, existem outros marcadores capazes de reagir antigenicamente
com núcleos celulares. Entre eles, o PCNA (antígeno nuclear de proliferação
celular) e o Ki-67 (antígeno de proliferação Ki-67) são capazes de marcar células-
tronco em proliferação. Uma vez que isso nunca fora descrito anteriormente, e
considerando-se a necessidade e importância científica em se determinar a
localização de células em proliferação na superfície ocular de cães, o presente
estudo teve por objetivos: 1) determinar a expressão de células em proliferação
pela marcação imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anti-PCNA e anti-
MIB-1 (anticorpo monoclonal anti-Ki-67), bem como, sua localização na
superfície ocular; 2) comparar se há diferença estatística significante na marcação
dessas células em diferentes idades. Para tanto, foram utilizados 24 cães jovens e
adultos, sadios, dos quais o bulbo ocular esquerdo foi removido, fixado e corado
pela H.E. (hematoxilina e eosina), além da imunoistoquímica empregando-se os
anticorpos monoclonais anti-PCNA e anti-MIB-1. Concluiu-se que a presença de
células em proliferação imunomarcadas pelo PCNA e pelo MIB-1 foi observada
em diferentes tecidos da superfície ocular de cães, sendo os tecidos mais
marcados: o limbo e o epitélio da córnea. É possível que as células marcadas
pelos imunomarcadores sejam células-tronco da superfície ocular de cães. No
entanto, para tal comprovação sugere-se a necessidade da utilização de anticorpos
monoclonais espécie-específicos como o AE5 (anticorpo monoclonal anti-
queratina 3), ainda não disponíveis.
Palavras-chave: córnea, PCNA, MIB-1, células-tronco
ABSTRACT
Expression of proliferation cells nuclear antigens in ocular surface from
young and adults dogs
The stem-cells has a fundamental paper in process of cornea’s tissue repair
and regeneration. In man, the well-know localization and functions had been
descriebed a long time ago, however the same ones had not yet been descriebed in
veterinary medicine, at least your localization in eyes of company animals, what
deserve new and original inquiries. Monoclonais antibodies that react superficially
with the cytokeratins are used to determine this cell type presence in ocular
surface. However, exist another markers capable to react with cell nucleoli, for
example, PCNA and MIB-1 that are capable to mark proliferation cells.
Considering the necessity and scientific importance to determining the
localization of proliferation cells on dog’s ocular surface, that, never was
descriebed previously, the present study had for objectives: 1) determineted the
expression of proliferation cells immunohistochemically by PCNA and MIB-1
and its localization in ocular surface; 2) compare if has statistically significant
difference in immunoexpression of proliferation cells in different ages. In the
study was used 24 healthy, young and adults dogs, witch had the left eyes
removed, fixed in buffered formalin and stained with H.E. (hematoxilin and eosin)
and with anti-PCNA and anti-MIB-1 monoclonal antibodies.The presence of
immunostained cells was more evident in corneal ephithelium and limbo.
Probably the immunostained cells are stem-cells in dog’s ocular surface, however
for such evidence it is necessary the use of monoclonais antibodies specie-specific
as AE5, not yet avaiable.
Key-words: cornea, PCNA, MIB-1, stem-cells
INTRODUÇÃO
A superfície ocular é composta pelos epitélios da córnea, limbo e conjuntiva.
Os três epitélios apresentam características comuns, porém diferenciam-se tanto
fenotipicamente quanto funcionalmente (Gomes, 2000). A capacidade regenerativa
destas estruturas tem sido alvo de incansáveis estudos em várias espécies,
tratando-se ainda de assunto polêmico. No entanto, sabe-se do papel fundamental
das células tronco (stem cells) neste processo regenerativo. A literatura humana
descreve a exata localização, bem como as funções destas células. Entretanto, as
mesmas ainda não foram descritas em medicina veterinária, sequer a sua
localização em olhos de animais de companhia, tratando-se assim, de assunto que
merece novas e originais investigações.
A localização das células tronco no tecido corneal no homem pode ser
influenciada pela idade, mas poucos trabalhos científicos foram realizados
objetivando esse aspecto. É provável que o mesmo ocorra em animais. Elas se
constituem de células germinativas, imaturas, com função de promover a
reposição da massa celular de um determinado tecido. São requeridas como um
último recurso no caso de regenerações. Na maioria das vezes estão concentradas
na região do fórnice conjuntival (Meller et al., 2001) e apresentam um
comportamento cíclico em relação à renovação do epitélio e atividade de células
do sistema imune, que estão sob constante turnover. A população de células do
epitélio corneal é mantida pelo equilíbrio entre a divisão no limbo e a camada de
células basais do epitélio. As células maduras migram centripetamente e
anteriormente e se fixam quando atingem a superfície (Schermer et al., 1986). As
células antigas são eliminadas pelo filme lacrimal e expõem as novas células
epiteliais. O deslocamento final para término da diferenciação celular é feito pelo
ato de piscar. Em coelhos, a presença de células em apoptose no epitélio corneal
sugere um mecanismo alternativo de morte celular. Cotsarelis et al. (1989)
relataram, ainda, que a rápida e eficiente renovação e proliferação do epitélio
limbal reflete diretamente a eficácia da regeneração do epitélio corneal, e isso
reforça a hipótese de que o epitélio limbal é o maior sítio de células-tronco na
superfície ocular. A renovação do epitélio conjuntival é semelhante à corneal,
entretanto, a localização das stem cells ainda é discutida (Zhou et al., 2000).
As desordens do globo ocular representam uma porção significativa do
espectro de doenças oftálmicas de diferentes etiologias, tais como: inflamatória,
infecciosa, neoplásica, tóxica, iatrogênica, congênita, hereditária, traumática e
degenerativa. Algumas dessas injúrias possuem um tratamento limitado e, em
alguns casos, há danos severos na superfície ocular, o que leva à restrição nos
mecanismos de reparo celular dessa superfície, principalmente das células troco.
Em situação de estresse, o epitélio corneal inicia uma resposta aumentando o
número de mitoses e a reposição celular, sendo que a migração de células
epiteliais é a primeira resposta frente à injúria. No homem, sabe-se que as stem
cells do epitélio corneal localizadas na região do limbo são responsáveis pela
manutenção da integridade da superfície ocular (Han et al., 2002).
Existem marcadores capazes de reagir antigenicamente com os núcleos
celulares. Entre eles, o PCNA e o Ki-67 são capazes de marcar células em
proliferação. O PCNA é uma proteína nuclear que atua como co-fator para a
polimerase delta, e se expressa diferentemente de acordo com o ciclo celular. A
sua taxa de síntese é diretamente proporcional à taxa de proliferação celular (Gan
et al., 1995). Essa proteína constitui-se em um marcador de células em
proliferação, sendo expressa durante a replicação do DNA, no início na fase G1,
com expressão máxima na fase S e declínio na fase G2. Além disso, as células
PCNA positivas provavelmente sejam as stem cells. As células PCNA positivas
no epitélio corneal com alta taxa de proliferação, principalmente no limbo,
sugerem que essa região seja composta principalmente por células-tronco (Gan et
al., 1995). Em outros estudos, Gan et al. (1998), demonstraram que o endotélio
corneal não reage positivamente ao PCNA. A proteína Ki-67 é um antígeno de
proliferação celular presente nas fases G1, S, G2 e mitose do ciclo celular (Ruiz et
al., 2004). O MIB-1 constitui um anticorpo monoclonal produzido pelos
recombinantes do Ki-67 com características equivalentes. Vários grupos já
relataram uma correlação positiva entre o índice de marcação nuclear do Ki-67
com o MIB-1 (Neto et al., 2001). A diferença básica entre o PCNA e o MIB-1 é
que o primeiro é um antígeno de proliferação e de reparo de DNA, ao passo que o
segundo, apenas de proliferação do DNA; isso o torna mais específico para se
determinar proliferação celular. Ambos marcadores se caracterizam pela marcação
nuclear, evidenciada pela coloração acastanhada (Ruiz et al., 2004) em
microscopia de luz.
Sendo assim, considerando-se a necessidade e importância científica em se
determinar a localização de células em proliferação da superfície ocular de cães, o
presente estudo teve por objetivos: 1) determinar a expressão de células em
proliferação através da marcação imunoistoquímica pelo PCNA e pelo MIB-1,
bem como, sua localização na superfície ocular; 2) comparar se há diferença
estatística significante na marcação dessas células em diferentes idades.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Foram utilizados 24 cães, entre machos e fêmeas, de diferentes raças e idades,
adquiridos junto aos serviços hospitalares do Hospital Veterinário “Luiz
Quintiliano de Oliveira”, do Curso de Medicina Veterinária – Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Campus de Araçatuba,
que foram a óbito vítimas de traumatismos. Foram excluídos os animais que
apresentaram problemas oftálmicos prévios. Imediatamente após o óbito,
procedeu-se a enucleação subconjuntival unilateral dos bulbos oculares esquerdos,
bem como o levantamento individual sobre os dados gerais, achados clínicos e
exame oftálmico. Foram formados dois grupos de estudo: 1) Grupo A (GA)
constituído por treze cães com idade entre dois e doze anos e 2) Grupo B (GB),
constituído por onze cães com idade entre um e doze meses.
Colheita dos fragmentos oculares para análise e processamento do material
Após a enucleação, o globo ocular foi fixado em formol tamponado 10%
por um período de sete dias. Após esse período, cada globo ocular foi cortado em
fragmentos de 0,5 cm na sua região central, no sentido sagital, compreendendo as
regiões de conjuntiva bulbar superior, limbo superior, córnea, limbo inferior e
conjuntiva bulbar inferior. Ato contínuo ao corte, colocou-se os fragmentos em
cassetes individuais e identificou-se. Esses foram incluídos em parafina e cortados
em micrótomo a uma espessura de 5µm para a confecção das lâminas, fazendo-se
três lâminas para cada animal, pois cada fragmento foi submetido ao
processamento convencional para histopatologia e corado pela H.E. e processados
pela técnica de imunoistoquímica com os marcadores PCNA e MIB-1. Os cortes
foram avaliados em microscópio de luz quanto aos padrões histológicos normais e
em relação à quantidade de células marcadas pelos dois marcadores de
proliferação celular. Para tanto, em cada lâmina foram contadas as células do
epitélio corneal, do limbo e da conjuntiva (Figura 1), totalizando a contagem de
100 células por campo observado, atentando-se para a positividade aos exames
imunoistoquímicos do PCNA e MIB-1.
Figura 1 –Na representação esquemática observam-se as regiões do bulbo ocular aonde
foram realizadas as contagens de células marcadas pelo PCNA e MIB-1. Em (a): Epitélio
da córnea; (b): região do limbo e (c): conjuntiva bulbar.
(c)
(b)
(a)
Imunoistoquímica
Inicialmente realizou-se a desparafinização dos cortes histológicos em
xilol, à temperatura ambiente por 30 minutos. A hidratação foi realizada
utilizando-se álcool absoluto, 95% e 85% (5 minutos em cada), seguida de
lavagem em água corrente por 10 minutos e finalizando-se com duas passagens
em água destilada. A recuperação antigênica pelo calor foi feita em microondas
com solução de citrato 10,0 mM, pH = 6.0, em duas passagens de 5 minutos cada,
deixando-se o material esfriar em temperatura ambiente e lavagem em água
corrente. Para o bloqueio da peroxidase endógena, usou-se solução de água
oxigenada (20V) diluída em metanol, em iguais proporções, durante 30 minutos,
com lavagem subseqüente em água corrente. Na seqüência, as lâminas foram
incubadas com os anticorpos primários (anti-MIB-1 e anti-PCNA, Dako
) por 18
horas a uma temperatura de 4
0
C. As diluições usadas foram 1:100 para o PCNA e
1:50 para o MIB-1. Em seguida foram incubadas em estufa a 37
0
C por 120
minutos e, então, as lâminas foram lavadas em solução tampão TRIS (pH=7,4).
As lâminas foram incubadas com “kit” LSAB (Dako
), que contempla o anticorpo
secundário, por 30 minutos em câmara úmida e, em seguida, em uma passagem
em solução tampão. A revelação foi conduzida utilizando-se o cromógeno
diaminobenzidina (DAB), com sucessiva lavagem em solução tampão, água
corrente e água destilada. Por fim, foi realizada a contra-coloração com
Hematoxilina de Meyer (Dako
), 5,0 mL por lâmina e lavagem em água destilada.
As lâminas foram desidratadas em lavagens decrescentes de alcóois e,
posteriormente, montadas em resina sintética. A observação das lâminas marcadas
com PCNA e MIB-1 foi individual, usando-se microscópio de luz com aumento
de 400x e foram contadas 100 células em campos bem preservados. As células
imunomarcadas apresentavam núcleos evidentes e acastanhados.
Análise Estatística
Os dados obtidos da contagem do número de células pelos marcadores de
proliferação celular foram submetidos à análise de variância em parcelas
subdivididas (“split-plot”) onde as parcelas foram consideradas os grupos, e as
sub-parcelas as técnicas. A comparação entre as médias foi realizada pelo teste de
Tukey, no nível de significância de 5%. Os resíduos foram testados quanto à
normalidade e homogeneidade de variâncias, considerados pré-requisitos
necessários para a análise de variância. A análise estatística foi efetuada
empregando-se o programa SAS (Statistical Analysis System) (Zar, 1998).
RESULTADOS
Nos cortes histológicos corados pela H.E. observou-se normalidade no
padrão histológico do bulbo ocular atentando-se ao tecido corneal, cujas camadas
apresentavam-se íntegras, bem como as demais regiões anatômicas do olho. Essas
foram utilizadas como controle à observação das regiões imunomarcadas.
O presente estudo revelou a imunomarcação do PCNA e do MIB-1 em
células do tecido corneal em cães jovens e adultos, principalmente nas regiões do
limbo e epitélio corneal.
A Tabela 1 apresenta média e o erro padrão da média da porcentagem de
células marcadas pelo PCNA e MIB-1 em ambos os grupos.
Tabela 1. Média (
x
) e erro padrão da média (EPM) da % de células marcadas,
segundo as técnicas e grupos.
% de células marcadas (
x
± EPM)
Marcadores de
proliferação celular
Grupo A
Grupo B
PCNA
68,1± 5,9 aA
76,9 ± 4,6 aA
MIB -1
30,2 ± 5,3 bA
43,5 ± 6,2 bA
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem entre si
pelo teste de Tukey (P > 0,05).
Nota-se, entretanto, que estatisticamente, não há diferença significativa ao
nível de significância de 5% entre os grupos A e B, ou seja, a idade não
influenciou a proliferação celular na superfície ocular de cães. Embora fora
observado uma maior imunomarcação pelo o PCNA, a análise estatística dos
dados não revelou diferença para ambos os marcadores entre os grupos, mas
houve diferença estatística (p>0,05) entre o número de células marcadas pelo
PCNA e MIB-1 dentro de cada grupo (Figura 2).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PCNA
Mib-1
% de células marcadas
Grupo A
Grupo B
Figura 2. Representação gráfica da porcentagem de células imunomarcadas pelas
técnicas de PCNA e MIB-1 nos grupos de estudo (GA e GB).
As células imunomarcadas concentraram-se principalmente no limbo e
no epitélio corneal em ambos os grupos. A imunomarcação do MIB-1, entretanto,
é menor nos dois grupos de estudo, quando comparado com o PCNA. Nos demais
tecidos da superfície ocular a imunomarcação foi discreta, com ausência total de
marcação no endotélio corneal.
Figura 3.
Fotomicrografia da região da córnea, limbo e conjuntiva de olhos de cães dos grupos
GA e GB coradas pelas técnicas de imunoistoquímica para os marcadores nucleares PCNA e MIB-
1. A: região de limbo de animal adulto (GA) marcada pelo PCNA; B: região de limbo de animal
adulto (GA) marcada pelo MIB-1; C: região de limbo de animal jovem (GB) marcada pelo PCNA;
D: região de limbo de animal jovem (GB) marcada pelo MIB-1.
Observa-se maior imunomarcação de células em proliferação pelo PCNA.
A
B
C
D
DISCUSSÃO
No homem, a exata localização das células tronco no homem já está bem
estabelecida. Entretanto, não se encontram relatos quanto a este aspecto em
medicina veterinária. Brunelli (2004) investigando experimentalmente a eficiência
do transplante autólogo de limbo em cães com destruição total desta região ocular,
concluiu que o mesmo foi eficiente em possibilitar a recuperação da transparência
corneal dos olhos lesados. No mesmo sentido, os olhos dos cães doadores não
apresentaram complicações, fornecendo evidências que o limbo seja a fonte
doadora dessas células na superfície ocular. Com as particularidades anatômicas
da córnea e limbo no cão, nem sempre é possível extrapolar, de forma segura, os
resultados de pesquisas desenvolvidas no homem. Sendo assim, optou-se por
estudar a exata localização deste tipo celular nos olhos de cães em diferentes
idades. Para tanto, foram utilizados os marcadores de proliferação celular PCNA e
MIB-1, ainda que a imunomarcação com anticorpo monoclonal AE5 fosse mais
específica por marcar a citoqueratina K3 que são expressas pelas células-tronco
(Kiritoshi et al., 1991; Han et al., 2002; Meller et al., 2002).
O presente estudo revelou a expressão do PCNA e do MIB-1 em células
do tecido corneal em cães de diferentes idades, principalmente nas regiões do
limbo e epitélio corneal. Gan et al. (1995), descreveram que a integridade corneal
depende de uma constante reposição das células epiteliais. Qualquer injúria no
tecido corneal provocará como resposta, um aumento na atividade proliferativa de
células indiferenciadas da córnea, mas, que na dependência do estímulo,
diferenciar-se-ão em células epiteliais corneais. O PCNA, além de ser um
marcador de células em proliferação também se constitui em um marcador de
células em reparação. Nos olhos aqui estudados, observou-se um maior número de
células marcadas pelo mesmo, no entanto, não se pode afirmar que todas as
células marcadas estejam em proliferação e que, portanto, tratem-se de células-
tronco. A sua utilização em estudos da córnea humana como marcador de stem
cell e células transicionais, permitiu inferir que este é bom sinalizador de células
em proliferação da superfície ocular. O mesmo pode-se sugerir no estudo ora
descrito. Salienta-se, que a taxa de síntese de PCNA está diretamente
correlacionada com a taxa de proliferação celular (Gan et al., 1998), ou seja,
quanto maior positividade da imunomarcação, maior o grau de proliferação
celular. Embora não fosse objetivo deste estudo correlacionar tal aspecto, foi
possível observar a presença de células mais ou menos marcadas em todas as
regiões estudadas, independentemente do grupo avaliado.
Os resultados observados permitem sugerir que a região superior do limbo
foi a que apresentou maior taxa de núcleos imunomarcados pelo PCNA e MIB-1,
independente dos grupos estudados. Entretanto, também foram contadas células
imunomarcadas na conjuntiva e na porção superior do epitélio corneal, em
quantidades menores. O mesmo fora descrito por outros autores que utilizaram o
PCNA na identificação de stem cells na superfície ocular do homem (Gan et al.,
1995).
Com esse estudo, evidenciou-se que, nos animais mais jovens (GA), a
expressão dos marcadores nucleares (PCNA e MIB-1) foi maior do que a
observada nos animais adultos e mais velhos (GB). Isso sugere uma maior
atividade de proliferação celular nos animais jovens, possivelmente em função da
taxa do metabolismo mais acelerada.
CONCLUSÕES
Com base nas condições aqui adotadas, pode-se concluir que:
• A presença de células em proliferação imunomarcadas pelo PCNA e pelo
MIB foi observada em diferentes tecidos da superfície ocular de cães,
sendo os tecidos mais marcados o limbo e o epitélio da córnea;
• Cães mais jovens apresentam um maior contingente de células em
proliferação na região do limbo e do epitélio corneal do que os cães o
observado em cães adultos;
• É provável que as células marcadas pelos imunomarcadores sejam
células-tronco da superfície ocular de cães. No entanto, para tal
comprovação, sugere-se a necessidade da utilização de anticorpos
monoclonais espécie-específico como o AE5, ainda não disponíveis.
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ANEXOS
93
Anexo A – Modelo de ficha para imunoistoquímica
Laboratório de Imunoistoquímica – Patologia Veterinária – FMVZ – UNESP – Botucatu
Data ____/____/____
N°
lâmina
N°
exame
N°
origem
Anticorpo
primário
Título
soro 1°
Bloqueio
Complexo
Tempo
OBS
94
Anexo B – Fichas individuais dos 24 cães usados no estudo.
Grupo A: média de idade: 76,62 meses
Número cão
Raça
Sexo
Peso
aproximado
(kg)
Idade
aproximada
(meses)
1
SRD
M
12
60
2
Poodle
F
3
120
3
Boxer
F
22
24
4
SRD
F
2
48
5
SRD
M
35
84
6
Lhasa Apso
M
5
48
7
SRD
M
8
72
8
Boxer
F
25
96
9
Dogue Alemão
M
50
36
10
SRD
F
5
144
11
Poodle
M
6
96
12
Poodle
M
3
60
13
Yorkshire
F
2
108
Grupo B: média de idade: 6,1 meses
Número cão
Raça
Sexo
Peso
aproximado
(kg)
Idade
aproximada
(meses)
1
SRD
M
2
9
2
Beagle
F
2
3
3
SRD
M
5
3
4
Rottweiler
M
15
11
5
Boxer
M
8
10
6
Pinscher
F
1
2
7
SRD
F
5
7
8
Pinscher
M
1
1
9
SRD
M
10
9
10
SRD
M
4
6
11
Teckel
F
3
6
95
Anexo C –
Resultado da leitura dos cortes histológicos imunomarcados pelo
PCNA e MIB-1.
Grupo A
Cão 1
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
++
+++
+++ epitélio
Epitélio córnea
82/100
MIB-1
+
++
+ epitélio
Limbo
11/100
Cão 2
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
93/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
23/100
Cão 3
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
++
+++
++
Limbo
65/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
54/100
Cão 4
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
+++
Epitélio córnea
93/100
MIB-1
+
+++
++
Limbo
68/100
Cão 5
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
87/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
13/100
Cão 6
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
79/100
MIB-1
+
+++
++
Limbo
44/100
Cão 7
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
92/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
56/100
Cão 8
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
++
+++
Epitélio córnea
88/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
31/100
Cão 9
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
++
+
Limbo
62/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
81/100
Cão 10
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
++
+
Limbo
38/100
MIB-1
+
++
++
Limbo
51/100
Cão 11
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
89/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
66/100
Cão 12
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
73/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
50/100
Cão 13
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
++
++
Limbo
59/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
18/100
96
Grupo B
Cão 1
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
++
+++
++ epitélio
Limbo
94/100
MIB-1
+
++
++ epitélio
Limbo
21/100
Cão 2
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
88/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
73/100
Cão 3
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
++
+++
Não visualizada
Limbo
84/100
MIB-1
+
++
Não visualizada
Limbo
39/100
Cão 4
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
Sem marcação
++
+
Limbo
37/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
16/100
Cão 5
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
++
+
Limbo
32/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
11/100
Cão 6
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
81/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
39/100
Cão 7
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
++
++
++
Limbo
72/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
19/100
Cão 8
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
63/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
27/100
Cão 9
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
++
+
Limbo
60/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
43/100
Cão 10
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
+
+++
++
Limbo
71/100
MIB-1
+
++
+
Limbo
28/100
Cão 11
Conjuntiva
Limbo
Córnea
Região mais
Marcada
N° céls.
Marcadas
PCNA
++
+++
++
Limbo
67/100
MIB-1
+
++
++
Limbo
16/100
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