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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
EXPRESSÃO DO RECEPTOR ATIVADOR DE NF-κ
κκ
κBETA (RANK), RANK
LIGANTE (RANKL) E OSTEOPROTEGERINA (OPG) EM SÍTIOS DE
REPARO ÓSSEO DE RATOS DIABÉTICOS
Fernanda Penna Lima Guedes de Amorim
BRASÍLIA – DF
2007
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Fernanda Penna Lima Guedes de Amorim
EXPRESSÃO DO RECEPTOR ATIVADOR DE NF-κ
κκ
κBETA (RANK), RANK
LIGANTE (RANKL) E OSTEOPROTEGERINA (OPG) EM SÍTIOS DE
REPARO ÓSSEO DE RATOS DIABÉTICOS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Médicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de Brasília, como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Medicina.
Orientadora: Profª. Drª. Tarcília Aparecida da Silva.
BRASÍLIA – DF
2007
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ii
DEDICATÓRIA
Dedico esse estudo ao meu filho Eduardo, cujo nascimento me inspirou na
realização desse sonho. Que esse trabalho sirva de exemplo da importância da busca do
conhecimento para seu desenvolvimento pessoal. O anseio pela descoberta do novo há
de estar presente nas suas realizações de vida.
iii
AGRADECIMENTOS
Ao querido Rodrigo, meu companheiro, agradeço por aceitar viver comigo meus
sonhos, compartilhar comigo alegrias e tristezas, incentivando-me a prosseguir.
Obrigada pela confiança, respeito, dedicação e por todos os ensinamentos científicos. E
desculpe-me a ausência em alguns momentos.
A meus pais pelo amor incondicional, pelo incentivo e pelo ensinamento de que o
conhecimento é a principal conquista que devemos objetivar na vida, para que possamos
melhorar como pessoa.
À minha irmã pelo exemplo de dedicação à pesquisa.
Ao meu irmão pela alegria de sua existência.
À professora Tarcília Aparecida da Silva pelo acolhimento, confiança e paciência.
Obrigada pelos ensinamentos científicos.
À professora Aline Carvalho Batista pelo carinho e dedicação.
Ao amigo Sandoval Felicíssimo Diniz pelo companheirismo na realização de todo o
projeto de pesquisa.
À veterinária Gabriela Mariângela Farias de Oliveira e à aluna Tarciane por todo apoio
na etapa experimental da pesquisa.
Aos funcionários José Tavares dos Santos, pelos cuidados aos animais da pesquisa, e
Edvaldo Batista Teles, pelo apoio técnico de radiologia.
Às estagiárias Édelyn Cristina Nunes Silva
e Renata Ribeiro de Souza pela ajuda
valiosa no preparo das peças para análise histopatológica.
À mestranda Helenisa e aos técnicos Erildo Ribeiro da Silva e Simone de Fátima Cruz
iv
pelo apoio técnico na imunohistoquímica.
Ao doutorando Sócrates Sousa Ornelas e prof. Kansaki pelos ensinamentos e ajuda
incondicional em toda etapa de biologia molecular.
Aos amigos André Leite, Paulo Furtado, Hugo Caracas por todo apoio na etapa de
radiologia e análise das imagens.
Ao funcionário do departamento de pós-graduação Alessandro, que me orientou sempre
que precisei.
À minha secretária Denise, que resolveu os problemas relacionados com minha ausência
durante os dois anos desta caminhada.
Aos animais da pesquisa. Sem eles nada poderia ter sido realizado.
v
RESUMO
Os mecanismos envolvidos na modificação do reparo ósseo em diabéticos ainda
permanece pouco elucidado. Assim, esse estudo investigou a expressão de reguladores
do metabolismo ósseo receptor ativador de NFκB (RANK), RANK ligante (RANKL) e
osteoprotegerina (OPG), através da imunohistoquímica e RT-PCR, em sítios de fratura
óssea de ratos diabéticos. Foram realizadas fraturas ósseas fechadas em tíbias esquerdas
de ratos controle e com diabetes induzido pelo aloxano. A análise histomorfométrica
dos sítios de fratura após 7 dias revelaram que os ratos diabéticos (db) apresentaram
menor formação óssea e de cartilagem em comparação com o grupo controle.
Paralelamente, o número de células RANK e RANKL positivas foi reduzido no grupo
diabético. Além disso, células OPG positivas apresentaram-se significantemente
diminuídas no grupo diabético comparado ao grupo controle (p=0,05). Entretanto, a
razão RANKL/OPG foi similar no grupo controle (0,074) e diabético (0,099) nesse
período. Após 14 dias, o número de células RANKL e OPG positivas e a expressão de
RNAm desses marcadores foi maior no grupo controle (p=0.008). Apesar de menores
níveis, a razão RANKL/OPG no grupo diabético (1,29) foi maior do que no grupo
controle (0,90), o que sugere o favorecimento dos mecanismos de reabsorção óssea. Os
resultados obtidos demonstram a expressão de marcadores da atividade de
formação/remodelação de tecidos duros em sítios de fratura. Modificações no balanço
da expressão de RANKL/OPG pode contribuir para o retardo do reparo de fraturas
associado ao estado diabético.
Palavras- chave: RANK, RANKL, OPG, diabetes, reparo ósseo.
vi
ABSTRACT
To clarify the mechanisms of altered bone reapair in diabetic state, we investigate
the RANK, RANKL and OPG expression by immunohistochemistry and RT-PCR in the
fracture sites of diabetic rats. A closed fracture was performed on the anatomical left
tibia in rats either healthy or made diabetic by alloxan. Histomorphometric analysis of
fracture site at 7 days after fracture revealed that diabetic rats (db) have significantly
lesser bone and cartilage formation at fracture site in comparison with controls. Parallel
with this, the number of RANK and RANKL positive cells were slighly decreased in db
group. Furthermore, OPG
+
cells were significantly lower in db than control (p=0.05).
However, the RANKL/OPG ratio was similar in control (0.074) and db (0.099) at this
time. At day 14, the numbers of RANKL and OPG positive cells and the mRNA
expression for these markers were increased in control group (P=0.008). Despite lower
levels, the RANKL/OPG ratio in db group (1.29) was greater than in controls (0.90)
what suggets a favoring of pro-resorptive pathways. Our results demonstrate the
expression of consistent markers of hard tissue formation/remodeling activities in sites
of fractures. The imbalance of RANKL/OPG expression may contribute to the delay of
fracture repair during diabetes course.
Key words: RANK, RANKL, OPG, diabetes, facture repair
vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGEs Produtos finais avançados da glicosilação
BMP Proteínas morfogenéticas ósseas
CGRP Calcitonin gene-related peptide
EGF Fator de crescimento epidérmico
FGF Fator de crescimento dos fibroblastos
GAGs Glicosaminoglicanos
GM-CSF Fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos
GD Grupo diabético
IGF Fator de crescimento semelhante à insulina
IAPP Islet amyloid polypeptide
IFN-
γ Interferon –γ
IL Interleucina
LIF Fator inibidor de leucócitos
M-CSF Fator estimulante de colônia de macrófago
MGP Fetuin-matrix Gla protein complex
MMPs Metaloproteinases
NOD Camundongos diabéticos não-obesos
OCIF Fator inibidor de osteoclastos
ODF Fator de diferenciação dos osteoclastos
OPG Osteoprotegerina
OPGL Osteoprotegerina ligante
OSM Oncostatina M
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
PGF-2 Prostaglandina
PTH Paratormônio
PTHrP PTH related protein
RANK Receptor Ativador de Nf-κBeta
RANKL Receptor Ativador de Nf-kBeta Ligante
TGF Fator transformador do crescimento
TGF Fator de crescimento transformador
TNF Fator de necrose tumoral
TNFR Receptores de fator de necrose tumoral
viii
TRANCE TNF-related activation induced cytokine
TRAP Fosfatase ácida resistente ao tartarato
VDR Vitamina D3 (1,25(OH)2D
3
)
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
ix
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS----------------------------------------------------------------------------iii
RESUMO -------------------------------------------------------------------------------------------v
ABSTRACT----------------------------------------------------------------------------------------vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ---------------------------------------------------vii
1 INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------------10
2 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------18
3 ARTIGO : Imbalance of RANK, RANKL and OPG expression during tibial fracture
repair in diabetic rats -----------------------------------------------------------------------------19
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS -----------------------------------------------------------------37
5 CONCLUSÕES --------------------------------------------------------------------------------43
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------------44
7 ANEXOS ---------------------------------------------------------------------------------------58
10
1- INTRODUÇÃO
O Diabetes mellitus é a doença endócrina mais comum em todas as populações
mundiais, em todas as faixas etárias, e sua prevalência está crescendo drasticamente.
Nos Estados Unidos, essa desordem metabólica afeta aproximadamente 15,7 milhões de
indivíduos, o que representa 5,9% da população (PORTUESE & ORCHARD, 1995;
ABDULWASSIE & DHANRAJANI, 2002; HUAFEI et al., 2005). Segundo as
estimativas e projeções mundiais apresentadas por Zimmet et al. (2001), em 2010
teremos 236 milhões de diabéticos em todo o mundo; no Brasil as estimativas são de 11
milhões (MALERBI et al., 1992; MANDRUP-POULSEN, 1998; FARZAD et al.,
2002).
Existem duas formas da doença: a forma primária ou idiopática, conhecida como
diabetes mellitus insulino-dependente ou diabetes tipo 1, e a segunda forma,
denominada diabetes mellitus não insulino-dependente ou diabetes tipo 2 (IKEGAMI &
OGIHARA, 1996; TUOMINEN et al., 1999). Aproximadamente 10% a 20% dos
indivíduos diabéticos são do tipo 1 (ABDULWASSIE & DHANRAJANI, 2002).
Ambos os tipos da doença estão associados a alta morbidade e mortalidade (FARZAD
et al., 2002). Pacientes diabéticos apresentam, em média, redução de 5 a 10 anos na
expectativa de vida, dependendo do tempo do diagnóstico e da duração da doença
(MANDRUP-POULSEN, 1998).
O diabetes representa uma complexa síndrome, pois a alta concentração de glicose
no sangue irá resultar em complicações sistêmicas secundárias, tais como doenças
cardiovasculares; retinopatias; nefropatias; neuropatias; suscetibilidade à infecções;
atraso na cicatrização tecidual, com destaque para atraso no reparo de fraturas ósseas,
11
entre outras. O diabetes é ainda causa importante de amputação de extremidades sem
trauma prévio e a principal causa de insuficiência renal (FIORELLINI & NEVINS,
2000; ABDULWASSIE & DHANRAJANI, 2002; FARZAD et al., 2002; ALMEIDA et
al. 2002; SIVAN- LOUKIANOVA et al., 2003).
Vários aspectos da fisiopatologia das alterações ósseas desenvolvidas em
decorrência do diabetes vêm sendo estudados. Dentre eles, citam-se: alterações
funcionais nos leucócitos polimorfonucleares (OLIVER & TERVONEN, 1994;
GORCHON et al.,1994; BOUMA et al., 2005), macrófagos e fibroblastos (WETZLER
et al., 2000), com prolongamento da fase inflamatória; diminuição da angiogênese e da
produção de fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) (SIVAN-
LOUKIANOVA et al., 2003; GALIANO et al., 2004) diminuição da biossíntese de
colágeno (MANOUCHEHR-POUR et al., 1981; RAMAMURTHY & GOLUB, 1983;
OLIVER & TERVONEN, 1994; CLARO et al., 2005) e glicosaminoglicanos (GAGs);
formação de produtos finais avançados da glicosilação (AGEs) (FIORELLINI &
NEVINS, 2000; SANTANA et al., 2003; HAYNES, 2004); alterações na síntese
protéica; deficiência na mineralização óssea (GIGLIO et al., 2000; SHYNG et al., 2001;
SIQUEIRA, 2003; PADULA et al., 2003; MARGONAR et al., 2003; FOLLAK, 2004;
FOLLAK, 2005; FACCHINI et al., 2005); redução do turnover ósseo (VERHAEGHE
et al., 1989; CLARO et al., 2005); diminuição do número de osteoblastos e osteoclastos
(WETZLER et al., 2000; ALMEIDA et al. 2002; KOPMAN et al., 2005).
É importante observar que o diabetes tipo 1 e tipo 2 apresentam repercussões
diferentes no metabolismo ósseo. Enquanto a ação do diabetes tipo 1 no osso consiste
em osteopenia, aumento no risco de fratura e significante atraso na consolidação das
fraturas (MACEY et al., 1989; SIQUEIRA, 2003; PADULA et al., 2003;MARGONAR
12
et al., 2003; FOLLAK, 2004; CLARO et al., 2005; STROTMEYER et al., 2005;
HONGBING et al., 2006;), a presença de perda óssea no diabetes tipo 2 não está clara, e
entende-se que essa forma de diabetes não está associada à osteopenia (JEFFCOATE et
al., 2004; THRAILKILL et al., 2005; HONGBING et al., 2006).
Ressalta-se ainda que a insulina exerça importante papel no controle dos níveis
de glicose e modulação dos fatores de crescimento esquelético, estimulando diretamente
a síntese de matriz osteoblástica e, indiretamente, o fator de crescimento semelhante à
insulina-1 (IGF-1) (KWON et al., 2005). Thrailkill et al. (2005) estudaram a
neoformação óssea em fraturas de camundongos diabéticos não obesos (NOD) e
observaram que a insulina aparentemente tem a capacidade de prevenir a perda de
volume do calo ósseo e do osso trabecular. Beam et al. (2002) também mostraram que
não há diferença histomorfométrica na cicatrização de fraturas ósseas entre ratos
espontaneamente diabéticos sob terapia com insulina e o grupo controle (BALSHI et al.,
1999; FIORELLINI et al., 1999; FIORELLINI & NEVINS, 2000; SIQUEIRA et al.,
2003; MARGONAR et al., 2003; FOLLAK et al., 2004; FOLLAK, 2005; KWON et al.,
2005).
Os novos conhecimentos sobre a fisiologia das células ósseas no diabetes incluem o
estudo da participação de citocinas e fatores de crescimento. Alterações significativas
nos níveis das citocinas e de seus receptores solúveis e antagonistas específicos, no
ambiente celular ósseo, têm sido observados tanto sistêmica como localmente
(JEFFCOATE, 2004). As citocinas são proteínas com peso molecular de 6.000M a
60.000M que regulam as respostas imunológica e inflamatória do hospedeiro, como
também a cicatrização de feridas, hematopoiese e muitos outros processos biológicos.
Em relação ao tecido ósseo, as citocinas podem modificar a remodelação óssea, atuando
na formação e na reabsorção. A reabsorção é iniciada por fatores sistêmicos ou locais e
13
a continuidade do processo depende de fatores locais nos quais as citocinas exercem
importante papel como mediadoras. Algumas citocinas apresentam maior envolvimento
nos processos fisiopatológicos de remodelamento ósseo. Dentre as que estimulam a
reabsorção óssea, citam-se: fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (HAYNES, 2004);
interleucina-1 (IL-1); IL-6; IL-11; o fator estimulador de colônia de granulócitos-
macrófagos (GM-CSF); o fator de crescimento transformador alfa (TGF-α), fator de
crescimento epidérmico (EGF) e IL-11 estimulam a formação dos osteoclastos e a
reabsorção óssea, tanto in vitro como in vivo (MOHAN & BAYLINK, 1991). A IL-1 e
a IL-6 também aumentam a proliferação e atividade dos osteoblastos. Os fatores de
crescimento semelhantes à insulina I e II (IGF-I e II), fator de crescimento
transformador beta (TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator
de crescimento dos fibroblastos (FGF) e proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) atuam
como promotores da formação, enquanto o TNF e interferon –γ (IFN-γ) agem como
inibidores da formação óssea (MOHAN & BAYLINK, 1991; TEITELBAUM, 2007).
O paratormônio (PTH) é um dos principais reguladores da remodelação óssea.
Juntamente com a IL-1, TNF-α e calcitriol (1.25-(OH)2D3), atua nas células
precursoras do estroma dando origem aos osteoblastos. Essas células precursoras
liberam IL-6 e IL-11, que agem sobre o preosteoclasto estimulando sua diferenciação.
Esse processo é complexo, envolvendo a participação das citocinas, fatores de
crescimento e inter-relação dos osteoblastos e osteoclastos. O PTH estimula também a
síntese de IGF-1 e TGF-β pelos osteoblastos, favorecendo a formação óssea
(TEITELBAUM, 2007).
Com relação ao calcitriol, este é produzido por células renais, monócitos, células T,
macrófagos e osteoblastos. O calcitriol, nos osteoblastos, aumenta a expressão do
14
receptor da IL-1 e a produção de IL-6 (LIU et al., 2006), assim como a produção de
matriz protéica, tendo ação também na diferenciação final dos osteoclastos (PINO-
MONTES et al., 2004).
Em 1995, Suda et al propuseram um modelo hipotético para explicar o papel das
células do estroma/osteoblastos que quando estimulados por fatores sistêmicos ou locais
seriam capazes de induzirem a formação dos osteoclastos. As células do estroma/
osteoblastos apresentam os seguintes receptores: vitamina D3 (1,25(OH)2D
3
) (VDR);
sistema proteína quinase A; glicoproteína 130. Esses receptores são ativados por
diferentes estímulos, ou seja, o VDR pelo calcitriol; o sistema quinase A pelo PTH,
PTHrP (PTH related protein), IL-1, TNF e prostaglandina (PGF-2); enquanto a via da
glicoproteína130 pela IL-6, IL-11, oncostatina M (OSM) e fator inibidor de leucócitos
(LIF) (LIU et al., 2006). Quando esses receptores são estimulados, as células expressam
um fator de diferenciação dos osteoclastos, chamado Receptor Ativador de NFk-B
Ligante (RANKL), que se liga à membrana do osteoclasto. Outros nomes para o
RANKL podem ser fator de diferenciação dos osteoclastos (ODF), TNF-related
activation induced cytokine (TRANCE) ou osteoprotegerina ligante (OPGL)
(MOSCHEN et al., 2005; HOFBAUER et al., 2000; GONZÁLEZ, 2000; LACEY et al.,
1998; YASUDA et al., 1998).
O RANKL é um peptídeo com 317 aminoácidos e pertencente à família de fatores
de necrose tumoral, podendo se apresentar em duas formas: solúvel e ligado à
membrana. O RANKL se liga ao RANK (receptor activator de NFκ-B) presente nas
células progenitoras dos osteoclastos e na presença de fator estimulante de colônia de
macrófago (M-CSF), estimula a diferenciação e atividade dos osteoclastos (LACEY et
al. 1998; YASUDA et al. 1998; HOFBAUER et al. 2000; GONZÁLEZ, 2000;
15
HAYNES, 2004; ROGERS & EASTELL; 2005). Camundongos deficientes de RANKL
não apresentam formação de osteoclastos e desenvolvem severa osteopetrose, além de
defeito dos nódulos linfáticos e células B. Em animais normais, ao injetar RANKL
solúvel, verificou-se a rápida indução de hipercalcemia associada à perda óssea
(LACEY et al. 1998).
O RANKL tem sido relatado como mediador de várias doenças: artrite reumatóide
(STOLINA et al., 2005); osteoporose pós-menopausa; osteoporose induzida por
glicocorticóide; osteólises peri-protéticas; hiperparatireoidismo; doença de Paget;
mieloma ósseo; metástases ósseas e infecções periodontais (MOSCHEN et al., 2005;
HAYNES, 2004; ANANDARAJAH & SCHWARZ, 2006).
O RANKL exerce sua ações via interação com o receptor RANK, o qual é uma
proteína de membrana com 616 aminoácidos, da superfamília dos receptores de fator de
necrose tumoral (TNFR), expressa primariamente em células precursoras dos
osteoclastos, células B e T, células dendríticas e fibroblastos (HSU et al. 2006;
ANANDARAJAH & SCHWARZ, 2006). Camundongos que não produzem RANK
desenvolvem osteopetrose e defeito na maturação das células B e T (LU et al., 2006;
HSU et al. 2006).
A interação entre RANKL e seu receptor RANK nos osteoclastos é controlada pela
osteoprotegerina (OPG) ou fator inibidor de osteoclasto (OCIF) (LIN et al., 2006;
BEETON et al., 2006). A OPG é uma proteína de 401 aminoácidos pertencente à
superfamília dos receptores de fator de necrose tumoral (TNFR). É um receptor solúvel
e age inibindo a ligação do RANKL ao RANK, impedindo, assim, o recrutamento, a
proliferação e a ativação dos osteoclastos (BOYLE et al., 2003; THÉOLEYRE et al.,
2006). Em camundongos, a expressão de RNA mensageiro de OPG tem sido
16
demonstrada em vários tecidos, como: osso, pele, fígado, pulmão, coração, células
endoteliais, rins, estômago, intestino, glândula tireóide, cérebro e medula espinhal
(HOROWITZ et al., 2001; KNUDSEN et al., 2003; ANANDARAJAH & SCHWARZ,
2006).
A OPG neutraliza os efeitos biológicos de RANKL, pois inibe a diferenciação de
osteoclastos, suprime a ativação dos osteoclastos maduros e induz sua apoptose
(HOROWITZ et al., 2001; NAKAMICHI et al., 2007). Animais que não produzem
OPG apresentam severa osteoporose pelo aumento da atividade osteoclástica e
subseqüente reabsorção óssea, calcificação da aorta e das artérias renais (BROWNER et
al., 2001; YAMAZAKI & SASAKI, 2005; NAKAMICHI et al., 2007). Injeções
subcutâneas de OPG na área abdominal de mulheres pós-menopausa rapidamente
reduziram os marcadores do turnover ósseo (HSU et al., 2006). Além disso, a
administração de OPG em animais com artrite induzida experimentalmente, protegeu-os
da perda óssea, enquanto os animais que não receberam OPG apresentaram extensa
perda óssea e de cartilagem (KONG et al., 1999). Ainda não está clara, entretanto, a
associação entre o conteúdo mineral ósseo, o risco de fratura e a concentração
plasmática dessa molécula (HOFBAUER & SCHOPPET., 2001; BOWNER et al.,
2001; KNUDSEN et al., 2003; ANANDARAJAH & SCHWARZ, 2006)
O balanço do sistema OPG/RANKL controla o remodelamento ósseo (ROGERS &
EASTELL; 2005; KWAN et al., 2006; RUCCI et al., 2007). Alterações na concentração
dessas moléculas induzidas por variações dos níveis de outras citocinas, administração
de glicocorticóides ou deficiência de estrogênio podem induzir aumento do número e da
atividade dos osteoclastos, determinando perda de massa óssea (HOFBAUER et al.,
2000; GONZÁLEZ, 2000).
17
Recentes estudos têm mostrado baixos níveis do RANKL e OPG em sítios de
reabsorção óssea em pacientes diabéticos (DUARTE et al., 2007). Em contraste, outros
autores associam a alta expressão desses fatores ao estado diabético (GALLUZZI et al.,
2005; SUZUKI et al., 2005; DUARTE et al., 2007; HIE et al., 2007; KAYAL et al.,
2007). Existem controvérsias acerca da atividade osteoclástica associada ao diabetes
mellitus e até o momento ainda não está esclarecido se ocorre inibição (HE et al., 2004)
ou aumento da atividade osteoclástica (HIE et al., 2007; KAYAL et al., 2007).
Embora o diabetes tenha sido associado à perda óssea, a falta de consenso acerca
do mecanismo que leva à menor formação óssea e ao atraso no reparo ósseo no diabetes
tipo 1 indica a necessidade de futuras investigações. Como o papel do sistema
OPG/RANK/RANKL no controle do remodelamento ósseo tem sido bem documentado,
o presente estudo pretende investigar a expressão dessas moléculas em sítios de fraturas
ósseas de animais com diabetes induzido por aloxano. Sendo assim, justifica-se a
realização do presente estudo, pois os dados obtidos poderão ser úteis para a
compreensão dos mecanismos envolvidos na deficiência de consolidação óssea em
diabéticos, contribuindo na busca de estratégias terapêuticas que possam dar suporte aos
protocolos tradicionais de tratamento.
18
3- OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo são:
1. Avaliar a expressão do Receptor Ativador de NF-kBeta (RANK), RANK ligante
(RANKL) e Osteoprotegerina (OPG), em sítios de reparo ósseo de ratos diabéticos;
2. Correlacionar à expressão de RANK, RANKL e OPG ao processo de consolidação
de fraturas fechadas em tíbia de ratos diabéticos induzidos por aloxano.
19
4- ARTIGO (enviado para publicação sob as normas do Journal of Orthopedic
Research)
Imbalance of RANK, RANKL and OPG expression during tibial fracture repair in
diabetic rats
Running title: RANK, RANKL and OPG expression in diabetic rats
Fernanda Penna Lima Guedes de Amorim
a
; Sócrates Souza Ornelas
b
, Sandoval
Felicíssimo Diniz
a
Aline Carvalho Batista
c
Tarcília Aparecida da Silva
d∗
a
Department of Pathology, Faculty of Medicine, University of Brasília; Brasília,
Distrito Federal, Brazil;
b
Department of Molecular Pathology, Faculty of Medicine, University of Brasília;
Brasília, Distrito Federal, Brazil;
c
Department of Stomatology (Oral Pathology), Dental School, Universidade Federal de
Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil;
d
Department of Oral Pathology and Surgery, Faculty of Dentistry, Universidade Federal
de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil;
∗
Corresponding author: Tarcília Aparecida da Silva Mailing address: Departamento de
Clínica, Patologia e Cirurgia Odontológicas, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal
de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627, CEP 31.270-901, Belo Horizonte, Minas Gerais,
Brazil. Phone: 55 31 3499-2476 (voice); 55 31 3499-2430 (Fax).
E-mail:
tarcilia@odonto.ufmg.br
20
Abstract
To clarify the mechanisms of altered bone reapair in diabetic state, we investigate
the RANK, RANKL and OPG expression by immunohistochemistry and RT-PCR in the
fracture sites of diabetic rats. A closed fracture was performed on the anatomical left
tibia in rats either healthy or made diabetic by alloxan. Histomorphometric analysis of
fracture site at 7 days after fracture revealed that diabetic rats (db) have significantly
lesser bone and cartilage formation at fracture site in comparison with controls. Parallel
with this, the number of RANK and RANKL positive cells were slighly decreased in
db group. Furthermore, OPG
+
cells were significantly lower in db than control (p=0.05).
However, the RANKL/OPG ratio was similar in control (0.074) and db (0.099) at this
time. At day 14, the numbers of RANKL and OPG positive cells and the mRNA
expression for these markers were increased in control group (P=0.008). Despite lower
levels, the RANKL/OPG ratio in db group (1.29) was slightly greater than in controls
(0.90) what suggets a favoring of pro-resorptive pathways. Our results demonstrate the
expression of consistent markers of hard tissue formation/remodeling activities in sites
of fractures. The imbalance of RANKL/OPG expression may contribute to the delay of
fracture repair during diabetes course.
Key words: RANK, RANKL, OPG, diabetes, facture repair
21
Introduction
It has been recognized a relationship between diabetes and the delayed healing of
fractures and bone defects in human and animal models [1-6]. Several mechanisms have
been proposed to explain the greater incidence of the delayed healing and nonunion of
fractures in diabetes. These include the reduction in the blood supply and angiogenesis
[7]; more severe inflammatory response [8]; decrease in collagen synthesis [1, 9];
disturbance in the mineralization process [5, 6] and the imbalance between bone
resorption by osteoclasts and bone deposition by osteoblasts [10]. In this setting, the
receptor activator of NF-kappaB (RANK), RANK ligand (RANKL) and osteoprotegerin
(OPG) provide the cellular and molecular basis for osteoblast-osteoclast cross-talks,
which are crucial during bone remodeling. RANK belongs to the tumor necrosis factor
(TNF) receptor superfamily and is activated by RANKL, a homotrimeric, TNF-like
cytokine. RANK is present on the surface of osteoclast cell precursors, where its
interaction with RANKL induces the cells’ terminal differentiation into osteoclasts, thus
increasing bone breakdown [11, 12]. The secreted, soluble receptor OPG interrupts this
activation by binding directly to RANKL [11-13].
An imbalance of RANK/RANKL/OPG system has been observed in osteoporosis,
osteopetrosis, rheumatoid arthritis and periodontal diseases [13, 14]. Recent studies
have been showed lower levels of RANKL and OPG at bone resorption sites in diabetic
patients [14]. In contrast, a higher expression of these factors has been associated with
diabetic state by others [14-18]. Controversy also surrounds the osteoclastic activity in
that it has not been defined whether an inhibition [10] or increased osteoclastic activity
[17, 18] is associated with diabetes mellitus.
Although the diabetes has been associated with a net loss of bone, the lack of
consensus regarding the mechanism of diminished bone formation and delayed bone
22
repair in type 1 diabetes point to the need for further investigation into the impact of
diabetes on bone. As the roles of OPG/RANK/RANKL system in controlling bone
remodeling have been well documented, we investigate in this study the expression of
these proteins at bone fracture sites in a model of alloxan-induced diabetes. Our results
suggest that the imbalance of RANKL/OPG expression may have a role on the delay of
fracture repair during diabetes course.
Methods
Animals
The Animal Care Committee at University of Brasília approved all procedures
performed. In total, 54 skeletally mature, male, 3-month-old Wistar rats (Rattus
norvegicus albinus) weighing 250 to 350 g were used for the study. Rats were randomly
assigned to the diabetic or control group.
Alloxan-induced diabetes model
Diabetes was induced by the intraperitoneal injection of 150 mg kg
-1
of
monohydrated alloxan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) dissolved in sterile
0.9% saline solution. Rats were kept on fasting prior to alloxan injection. After 12 hours
of alloxan administration, a 10% glucose solution was offered to the animals to prevent
hypoglycemia [19, 20]. After 72 hours, blood samples were collected from the tail vein
of the animals for evaluation of the plasma glucose levels by the glucose-oxidase
enzymatic method using Accu-Chek Advantage (Boehringer Mannheim, IN, USA).
Animals presenting glucose levels above 200 mg/dL (the normal levels of serum
glucose in Rattus novergicus ranges from 50 to 135 mg/dL). The examinations were
repeated every 7 days to confirm the maintenance of the glucose levels. The animals
presenting reversion of the signs of diabetes, ie, presenting glucose levels below 200
23
mg/dL, were excluded from this study. The pancreas was obtained in the two surgical
times from control and diabetic animals for routine histopathological analysis, five
animals for each group.
Tibia fracture and Specimen Preparation
Using general anesthesia with ketamine (200 mg kg
-1
) and xylazine (10 mg kg
-1
),
closed fracture was inflicted manually on the middle of the left tibia. The traces of all
fractures were similar, with no exposure to the outer environment; as previously
described [21]. All procedures were performed by one operator. The animals were
sacrificed at 7 and 14 days following the fracture. For the histological studies, the entire
tibia was used after disarticulating it from the knee and ankle. The specimens were fixed
in 10% buffered formaldehyde for 24 h, delcalcified in 1% nitric acid for 24 hours and
embedded in paraffin blocks. Approximately 30 sections, 5-µm thick, were available
from each paraffin block. Approximately 6 hematoxylin and eosin-stained sections with
the largest areas of fracture callus surrounding the site of injury were selected from each
paraffin block for use in subsequent analyses. Microscopic analysis was performed by
two pathologists who were blinded to the identity of the specimen.
Histomorphometry
Three representative slides were selected from each animal for histomorphometric
analysis. Measurements of the areas of fibrous connective, cartilaginous and bone
tissues at fracture callus were averaged in six fields selected by systematic sampling in a
stepwise manner, moving the microscope stage from left to right and then down and
across in order to avoid measuring the same area again. The area of each tissue at 25x
magnification was obtained by drawing around the boundaries using the software Image
J (National Institutes of Health, USA).
24
Immunohistochemistry
For immunostaining, paraffin-embedded tissues sectioned at 5 µm and collected in
serial sections on glass slides coated with 2% 3-aminopropyltriethylsilane (Sigma
Chemicals, St. Louis, MO) were deparaffinized and dehydrated. Sections were then
incubated with 3% hydrogen peroxide and immersed in citrate buffer, pH 6.0, for 20
minutes at 95°C. Sections were then blocked by incubation with 3% normal goat serum
at room temperature, for 20 minutes and slides were incubated with the following
primary rabbit polyclonal antibodies: anti-OPG (H-249, sc11383, Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA) diluted 1:200; anti-RANK (H-300, sc9072, Santa
Cruz) diluted 1:200; anti-RANKL (FL-327, sc9073, Santa Cruz) diluted 1:150; at 4°C,
overnight, in a humidified chamber. After washing in TBS, the sections were treated
with a labeled streptavidin-biotin (LSAB) kit (K0492, Dako, Carpinteria, CA). The
sections were then incubated in 3,3’-Diaminobenzidine (K3468, Dako) for 2 to 5
minutes and stained with Mayer´s hematoxylin. The specimens of peripheral giant cell
granuloma were employed as positive controls for all markers. Negative controls were
obtained by the omission of primary antibodies and substitution of primary antibodies
by non-immune rabbit serum (X0902, Dako).
The number of cells was evaluated in sites of fracture by two independent
examiners blinded to the stans of groups. The number of positive cells was counted in
five representative and consecutive microscopic high-power fields (x100) using the
integration graticule (4740680000000, Carl Zeiss, Göttingen, Germany), at this
magnification each field had an area of 0.0961 mm
2
. Results were expressed as the
mean of positive cells per mm
2
± standard deviation (SD) of n observations.
25
RT-PCR
Tibia samples (five for each group) were immersed in TRIZOL reagent (Gibco BRL,
Life Technologies, Rockville, MD, USA) and stored at –70°C. RNA Extraction was
performed after addition of 200 µL of chloroform followed by centrifugation. RNA was
recovered from the aqueous phase by precipitation with isopropyl alcohol. The RNA
stored in 70% ethanol at -20°C until use. Total RNA was quantified
spectrophotometrically, and the integrity of the RNA preparations was examined by
agarose gel electrophoresis. Complementary DNA (cDNA) was synthesized using 100
ng of RNA through a reverse transcription reaction (Superscript II, Gibco). The
standard PCR conditions were 95°C (10 minutes), and then 40 cycles of 94°C (1
minute), 54°C (1 minute), and 72°C (2 minutes). The primers sequences used were as
follows:
OPG forward 5’GCCAACACTGATGGAGCAGAT3’;
OPG reverse 5’TCTTCATTCCCACCAACTGATG3’;
RANK forward 5’CGTCCTGCTCCTCTTCATCTCT3’;
RANK reverse 5’CCCTGAGGACTCCTTATTTCCA3’;
RANKL forward 5’GCTCACCTCACCATCAATGCT3’;
RANKL reverse 5’GGTACCAAGAGGACAGACTGACTTTA3’;
GAPDH forward 5’AAATTCCATGGCACCGTCAA3’;
GAPDH reverse 5’AGGGATCTCGCTCCTGGAA3’.
For each run, water was the negative control. The reaction product was
quantified by measuring the densities of bands using a Spot-denso-program with Alpha
Ease software (Alpha Innotech, San Leandro, CA), and values representing the average
density per area unit were plotted. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH) was used as the reference gene.
26
Statistical analysis
Data are expressed as means± standard deviation (SD) of n samples. Comparative
analysis was performed using the non-parametric Mann-Whitney test. All analysis were
made using the SPSS 12.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA) statistical software package
and probability values of less than 0.05 were considered as statistically significant.
Results
Alloxan-induced diabetes
As expected, blood-glucose levels were significantly (P < 0.01) higher in diabetic
rats than controls at all time points before the surgery and postoperatively. Furthermore,
pancreatic islets under the action of alloxan showed disorganization, reduction of sized
and loss of architeture in comparison with controls. Treatment with alloxan did not
significantly affected body weight throughout the experimental period.
Histomorphometric Findings
On day 7, diabetic rats have significantly lesser bone (4.2 ± 2.6; 1.9 ± 0.8,
respectively for control and diabetic) cells per mm² (P=0.068) and cartilage (6.9 ± 3.3;
3.4 ± 1.4; respectively for control and diabetic) (P=0.045) and greater fibrous
connective (8.5 ± 1.7; 14.1 ± 1.2, respectively for control and diabetic) (P=0.006) tissue
formation at fracture site in comparison with controls. Similar results were found at day
14. Results concerning relative data of morphometric analysis (values were corrected in
relation to the total analysed area) showed the mostly identical outline of absolute
values for both groups.
RANK, RANKL and OPG expression at tibia-fracture sites
Immunohistochemical reactivity for RANK, RANKL, and OPG was detected in
the cytoplasm and membrane of connective and bone tissue cells. The presence of
27
positive fibroblasts, endothelial cells, bone surrounding cells, osteocytes, bone marrow
cells and chondrocytes was observed (Figure 1).
At day 7, the number of RANK (299.7 ± 139.5) and RANKL (7.5 ± 2.5) positive
cells per mm
2
were slighly decreased in db group when compared with controls (362.1
± 128.1; 32.4 ± 10.9, respectively for RANK and RANKL). Furthermore, OPG
+
cells
were significantly lower in db (75.6 ± 35.6) than control (442.8 ± 163.1) (P=0.05). The
RANKL/OPG ratio was similar in control (0.074) and db (0.099) at this time. A
significant decrease in the the number of RANK positive cells at day 14 was observed
in both groups in relation to day 7 (P<0.05). Although not statistically significant, we
also observed a tendency of control group to have less OPG at day 14.
At day 14, the numbers of RANK positive cells were similar in controls (58.8 ±
35.3) and db (74.51 ± 43.45). Although no significant differences were observed
concerning the numbers of RANKL and OPG immunostained cells in both groups, we
observed a tendency of db group have lesser positive cells for RANKL (29.9 ± 19.9; 6.9
± 2.7; respectively for db and control groups) and OPG (137.4 ± 46.0; 72.1 ± 26.0,
respectively for db and control groups). In line with these results, RT-PCR analysis
revealed a significantly higher mRNA expression of RANK, RANKL and OPG in
control when compared with db group. However, the RANKL/OPG ratio was greater in
db group (1.29) than in controls (0.90) (Figure 2).
No positive staining was observed when primary antibodies were omitted or
substituted by PBS or non-immune rabbit serum. Furthermore, an intense
immunostaining for RANKL, RANK, and OPG was observed in the giant cell
granuloma, used as positive controls (data not shown).
28
Discussion
The impact of type 1 diabetes on bone is reflected by a significant delay in
fracture healing. Consistent with previous data [1-6] we found that alloxan-induced
diabetes delays fracture healing in a rat model of closed fracture. The effects of diabetes
on bone have generally been attributed to impairment in osteoblast function observed in
animals and humans [10, 17]. A number of studies have reported that type 1 diabetes
alters bone remodeling by reducing the formation of new bone, leading to osteopenia.
This has been shown by a decrease in bone mineral density in human and alterations in
the formation of new bone in animal studies [10, 22-25].
In this study, we obtained comparable results regarding immunostaining and
mRNA expression. The immunohistochemical reactivity for RANK, RANKL, and OPG
was detected in the cytoplasm and membrane of connective and bone tissue cells in
accordance with previous studies [26].
In parallel with decreased bone formation at fracture site of diabetic rats at day 7,
we also found a reduced expression at protein and mRNA level of RANK, RANKL and
OPG at sites of fracture. Given that the osteoclast maturation and activity (and bone
homeostasis) are regulated in vivo by RANK-RANKL and OPG levels of expression
[11-13] our results suggest a decreased osteoclastic recruitment and differentiation at
bone fracture sites of diabetic rats at day 7. In accordance with our findings, it has been
previously showed a low osteoclastogenesis in diabetic mice in a model of bacteria-
stimulated bone loss [10] and low bone resorption activity in diabetic individuals [27].
At 14 days of fracture, although we also observed reduced levels of RANK, RANKL and
OPG at fracture sites of diabetic, the RANKL/OPG ratio was significantly higher in
diabetic group suggesting an increase of resorptive activity. Our results are similar to
that observed in periodontitis-associated bone resorption of diabetic patients, in which a
29
reduced expression of RANKL and OPG, but an augmented RANKL/OPG ratio was
observed in diabetic individuals [14]. The increased markers of osteoclast function such
as urine excretions of calcium, hydroxyproline, and deoxypyridinoline [16, 28, 29] and
expression of Tartarate-resistant acid phosphatase (TRAP), cathepsin K and RANKL
[17, 18] were reported in subjects with diabetes. On the other hand, normal activity of
bone resorption was also reported. [30]. Recently, it has been suggested that impaired
fracture healing in diabetes is characterized by increased rates of cartilage resorption
[18]. Different from our results, these authors demonstrated a high expression of
RANKL at fracture site of diabetic animals. However, they did not determine the OPG
levels at these sites.
Besides the role of RANK-RANKL-OPG system in bone resorption, current
evidence indicates that interactions between members of the TNF family and their
specific receptors (TNFRs) are influential in several functions, including immune cell
regulation [13, 31] induction of leukocytes transmigration [32], prevention of apoptosis
of endothelial cells [33]. In this setting, it is possible that these factors have an effect on
bone remodeling by also affecting cell proliferation, inflammatory cell migration,
vascularity or the delaying of apoptosis. Thus, these aspects need to be further explored
in diabetes.
One potential explanation for our results is that there is reduced coupling of bone
resorption and formation in the diabetic group after bone fracture, compared with robust
coupling that occurs in normoglycemic littermates. The reduced coupling may be a
result of decreased expression of RANK, RANKL and OPG. These results might be
helpful in minimizing the effect of diabetic state in bone consolidation.
30
Acknowledgment
The authors are grateful to Gabriela Mariângela Farias de Oliveira, Édelyn Cristina
Nunes Silva and Renata Ribeiro de Souza for their hepful technical assistance. This
work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq).
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35
Figure 1 Representative immunohistochemical reactivity for RANKL (A, B) and OPG
(C, D) at sites of tibia fracture of control (A, C) and alloxan-induced diabetic rats (B, D)
at 14 days. [Immunohistochemical staining, original magnification x 400].
36
OPG
RANK
RANKL
GAPDH
GC GD
0
5
10
15
RANK RANKL OPG
*
*
*
mRNA/GAPDH (Relative intensity)
Figure 2 RANK, RANKL and OPG mRNA expression in bone callus of controls (GC)
and alloxan-induced diabetic rats (GG) at 14 days after tibia fracture. Total RNA was
extracted from bone callus tissue and expression of RANK, RANKL and OPG was
analyzed by RT-PCR. Lanes 1-2 represent controls and lanes 3-4 represent diabetic
animals. Bars represent the mean ± standard deviation (SD) of densitometric analysis of
RANK, RANKL and OPG mRNA normalized by GAPDH levels per lane. The
experiment is representative of two.*P<0.05 compared to each control. Control (white
bars) and alloxan-induced diabetic (squared bars).
37
5- CONSIDERAÇÕES FINAIS
O diabetes tipo 1 está associado a várias desordens da saúde esquelética, incluindo
diminuição da densidade óssea (FACCHINI et al., 2005), aumento do risco de
osteoporose (THRAILKILL et al., 2005; GALLUZZI et al., 2005) e risco de fraturas,
assim como retardo na cicatrização óssea e na capacidade regenerativa (THRAILKILL et
al., 2005). Dados prévios da literatura (MACEY et al., 1989; FUNK et al., 2000;
FOLLAK et al., 2003; FOLLAK et al., 2004a; FOLLAK et al., 2004b; FOLLAK et al.,
2005; HONGBING et al., 2006) foram coincidentes ao verificado nesse estudo com
relação ao atraso do reparo de fraturas fechadas em ratos com diabetes induzido pelo
aloxano.
A consolidação de fraturas ósseas é uma complexa cascata de eventos celulares,
e sua regulação é pouco conhecida (GIORDANO et al., 2000). A relação entre
consolidação de fraturas e diabetes tipo 1 é complexa (PADULA et al., 2003). Vários
trabalhos foram realizados com intuito de explicar a relação entre diabetes e reparo
ósseo. Alterações nos mecanismos de resposta imune dos pacientes diabéticos, tais
como a inibição da capacidade fagocitária dos neutrófilos associada a alterações
vasculares, podem comprometer o processo de reparo das fraturas (CLARO et al.,
2005). Dificuldades na fase inicial da cicatrização das fraturas também têm sido
associadas à inibição da proliferação celular, que pode estar relacionada à diminuição da
expressão do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e dos níveis de fatores
de crescimento semelhantes à insulina I e II (IGF-I e II), fator de crescimento
transformador beta (TGF-β) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF) (TYNDALL
et al., 2003).
38
Além disso, distúrbios na regulação dos níveis de metaloproteinases (MMPs) e a
formação de AGEs, característicos do estado diabético, resultam em alterações de
solubilidade do colágeno (SIQUEIRA et al., 2003), levando a alterações estruturais e
funcionais do tecido conjuntivo (RAMAMURTHY & GOLUB, 1983; KOPMAN et
al.,2005).
Os efeitos do diabetes no osso podem ser ainda atribuídos ao desequilíbrio na
função dos osteoblastos, o que se explica pela diminuição da expressão dos fatores de
transcrição que regulam a diferenciação destas células (LACEY et al., 1998; YASUDA
et al., 1998; BOYLE et al., 2003; HE et al., 2004; GALLUZZI et al., 2005; SUZUKI et
al., 2005; THRAILKILL et al., 2005; DUARTE et al., 2007; HIE et al., 2007) e pelo
aumento da apoptose das células precursoras de osteoblastos (VERHAEGHE et al,
1997; THRAILKILL et al., 2005). Paralelamente, alguns estudos têm mostrado que no
diabetes tipo 1 observa-se redução de marcadores séricos correlacionados com a
formação óssea, tais como osteocalcina (MCCRACKEN et al., 2000; THRAILKILL et
al., 2005; KOPMAN et al., 2005; HONGBING et al., 2006) e fosfatase alcalina
(THRAILKILL et al., 2005). Em acréscimo, a alteração do remodelamento ósseo pela
redução na formação de novo osso leva à osteopenia (VERHAEGHE et al.,1989;
HONGBING et al., 2006). Estudos prévios demonstraram diminuição da densidade
mineral óssea e alterações de formação de novo osso nos humanos e em animais (HE et
al., 2004; HORCAJADA-MOLTENI et al., 2001; LEVIN et al., 1976; TUOMINEN. et
al., 1999; KRAKAUER et al., 1995; SIQUEIRA et al., 2003).
As razões para menor densidade mineral óssea em diabetes tipo 1 ainda não são
conhecidas (FACCHINI et al., 2005). Krakauer et al. (1995), entretanto, especula-se que
exista redução na formação óssea durante o período de pico da massa óssea. Em
oposição, Tuominen et al. (1999), ao examinar pacientes com diabetes tipo 1 e tipo 2
39
com mais de 30 anos, sugerem que no diabetes tipo 1 ocorre maior perda de massa
óssea, e a causa seria devido ao diabetes tipo 1 provocar efeitos profundos na fisiologia
da remodelação óssea comparado ao diabetes tipo 2.
No presente estudo, os resultados obtidos pela avaliação imunohistoquímica e RT-
PRC foram semelhantes. A reatividade imunohistoquímica de RANK, RANKL e OPG
foi detectada no citoplasma e membrana de células dos tecidos conjuntivo e ósseo, assim
como observado em estudos prévios (SILVESTRINI et al., 2005).
Paralelamente à diminuição da formação óssea no sítio de fratura dos ratos
diabéticos após 7 dias foi também verificada a redução da expressão protéica e dos níveis
de RANK, RANKL e OPG nos sítios de fratura. Sabendo-se que a maturação dos
osteoclastos e atividade (e homeostase óssea) são reguladas, in vivo, por níveis de
expressão de RANK-RANKL e OPG (LACEY et al., 1998; YASUDA et al., 1998;
BOYLE et al., 2003), os resultados encontrados sugerem a diminuição do recrutamento e
diferenciação osteoclástica nos sítios de fratura óssea nos ratos diabéticos no sétimo dia.
Corroborando os achados desse estudo, trabalhos prévios demonstraram redução da
osteoclastogênese em camundongos diabéticos em modelo de perda óssea induzida pela
inoculação de bactérias (HE et al., 2004) e ainda menor atividade de reabsorção óssea em
indivíduos diabéticos (GUARNERI et al., 1993).
Após 14 dias da fratura, apesar de observado também redução nos níveis de
RANK, RANKL e OPG nos sítios de fratura dos diabéticos, a razão RANKL/OPG foi
significativamente maior no grupo diabético sugerindo aumento da atividade de
reabsorção. Esses resultados são similares aos observados na perda óssea associada à
periodontite em pacientes diabéticos, nos quais houve redução da expressão de RANKL
e OPG, mas aumento da razão RANKL/OPG (DUARTE et al., 2007).
40
A expressão de RANKL e OPG durante o reparo de fraturas tem sido estudada em
modelos animais. Picos da expressão de OPG têm sido verificados no período de 24
horas até 7 dias após a fratura, coincidindo com o pico de formação de cartilagem. A
expressão de RANKL, entretanto, atinge seu pico entre o terceiro dia e o décimo quarto
dia após a fratura, quando os níveis de OPG estão diminuindo (ROGERS & EASTELL,
2005).
O estudo da cicatrização de fraturas em humanos após fratura traumática da tíbia
mostrou diminuição da concentração sérica de OPG, sendo a menor concentração de
OPG observada 8 semanas após a fratura. A correlação negativa entre a concentração
sérica de OPG e os marcadores de formação óssea como a osteocalcina e a porção N-
terminal do propeptídeo de colágeno tipo I foi também observada. Esses dados sugerem
que a razão RANKL/OPG está envolvida no processo de reparo de fraturas, apesar de
não demonstrarem necessariamente causa e efeito. Deve-se notar também que
camundongos que não expressam RANK apresentam normal cicatrização de fraturas
(ROGERS & EASTELL, 2005).
A expressão de OPG e RANKL é modulada, direta ou indiretamente, por um
grande número de fatores, incluindo TNF-α, IL-1 e IL-17, outras interleucinas, esteróides
(SWANSON et al., 2006), hormônio do crescimento, IGF-1, M-CSF, óxido nítrico,
leptina (LAMGHARI et al., 2006), fetuin-matrix Gla protein (MGP) complex,
hormônios da tireóide e paratireóide, vitamina D e lipoproteínas (JEFFCOATE, 2004).
Mais significantemente a expressão é afetada pela calcitonina e hormônios relacionados,
calcitonin gene-related peptide (CGRP) e islet amyloid polypeptide (IAPP)
(JEFFCOATE, 2004).
A relação entre a expressão tecidual e a concentração na circulação sangüínea é
incerta (ROGERS & EASTELL, 2005), entretanto, tem-se sido verificado que as
41
concentrações séricas de RANKL e OPG apresentam-se elevadas em doenças associadas
ao aumento do turnover ósseo (JEFFCOATE, 2004).
O aumento de marcadores da função osteoclástica excretados na urina, como
cálcio, hidroxiprolina e deoxipiridinolina (OLMOS et al., 1994; HERRERO et al., 1998;
SUZUKI et al., 2005) e a expressão de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP),
catepsina K e RANKL (HIE et al., 2007; KAYAL et al., 2007) foram reportados em
indivíduos com diabetes. Por outro lado, estudos relatam atividade normal de reabsorção
óssea nestes indivíduos (MIAZGOWSKI & CZEKALSKI, 1998).
Recentemente, foi sugerido por alguns autores que o retardo da cicatrização de
fraturas nos diabéticos é caracterizado pelo aumento das taxas de reabsorção de
cartilagem (KAYAL et al., 2007). Esses autores demonstraram a alta expressão de
RANKL nos sítios de fratura dos animais diabéticos, divergindo dos resultados obtidos
no presente estudo. Entretanto, os níveis de OPG nesses sítios não foram verificados por
estes autores.
KNUDSEN et al. (2003), observaram um aumento de OPG no plasma dos
pacientes com diabetes tipo 2. Esta observação está de acordo com os resultados
encontrados no estudo de BOWNER et al. (2001) que relatou aumento das
concentrações de OPG em pacientes diabéticos. Estes autores também verificaram que
os níveis de OPG plasmático estavam significantemente aumentados apenas nos
pacientes com complicações microvasculares, sugerindo que o aumento de OPG no
plasma pode indicar perigo microvascular.
Além do papel do sistema RANK/RANKL/OPG na reabsorção óssea, evidências
atuais indicam que interações entre os membros da família de fatores de necrose
tumoral (TNF) e seus receptors específicos (TNFRs) influenciam várias funções,
incluindo regulação das células do sistema imune (BOYLE et al., 2003; SO et al.,
42
2006), indução de transmigração de leucócitos (ZAULI et al., 2007), prevenção da
apoptose de células endoteliais (KOBAYASHI-SAKAMOTO et al., 2006). Nesse
cenário, é possível que esses fatores que tenham efeito no remodelamento ósseo por
afetarem a proliferação celular, a migração de células inflamatórias, vascularização ou
apoptose. Assim, esses aspectos necessitam ser melhor explorados no diabetes.
Uma possível explicação para os resultados obtidos neste estudo é que há redução
conjunta da reabsorção e formação óssea no grupo diabético após fratura óssea,
comparado à forte atividade metabólica observada nos animais normoglicêmicos. A
redução conjunta pode ser resultado da menor expressão de RANK, RANKL e OPG.
Esses resultados podem ser úteis para futuras terapias na tentativa de minimizar o efeito
do estado diabético na consolidação óssea.
43
6-CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos e, com base na metodologia utilizada, pode-
se concluir que:
a) O diabetes induzido pelo aloxano atrasa significativamente o processo de
reparação de fraturas ósseas;
b) O estado diabético interfere com a expressão dos fatores reguladores da
remodelação óssea RANK, RANKL e OPG em sítios de fratura;
c) O atraso no reparo de fraturas observado nos ratos diabéticos parece estar
associado à redução na expressão das proteínas RANK, RANKL e OPG causando um
desequilíbrio nos níveis de RANKL e OPG nos sítios de reparo ósseo.
44
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ANEXO 2