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LÍCIA BEZERRA CAVALCANTE
EXPRESSÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA
RESPOSTA IMUNE DE INDIVÍDUOS COM
SÍNDROME DE DOWN FRENTE À DOENÇA
PERIODONTAL
Orientadora:
Profa. Dra. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga
Araraquara
2008
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1
UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARARAQUARA
LÍCIA BEZERRA CAVALCANTE
EXPRESSÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA
RESPOSTA IMUNE DE INDIVÍDUOS COM SÍNDROME
DE DOWN FRENTE À DOENÇA PERIODONTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Odontológicas – Área
de Odontopediatria, da Faculdade de
Odontologia de Araraqauara, da Universidade
Estadual Paulista para obtenção do título de
Mestre em Odontopediatria.
Orientadora:
Profa. Dra. Raquel M. Scarel Caminaga
Araraquara
2008
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2
LÍCIA BEZERRA CAVALCANTE
EXPRESSÃO DE GENES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNE
DE INDIVÍDUOS COM SÍNDROME DE DOWN FRENTE À
DOENÇA PERIODONTAL
COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE
Presidente e Orientadora: Profa. Dra. Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga
2º Examinador: Profa. Dra. Elisa Maria Aparecida Giro
3º Examinador: Prof. Dr. Sergio Roberto Peres Line
Araraquara, 29 de julho de 2008.
3
DADOS CURRICULARES
Lícia Bezerra Cavalcante
NASCIMENTO 18 de Setembro de 1981 – Maceió/AL
FILIAÇÃO José Carlos Cavalcante
Maria Líbia Bezerra Filha
2000/2005 Curso de graduação em Odontologia
Universidade Federal de Alagoas
2005/2006 Estágio de Atualização na disciplina de
Odontopediatria
Faculdade de Odontologia de Araraquara –
UNESP
2007/2008 Curso de Pós-Graduação em Pacientes com
Necessidades Especiais. Nível de Especialização,
Faculdade São Leopoldo Mandic
2007/2008 Curso de Pós-Graduação em Ciências
Odontológicas, Área de concentração
Odontopediatria. Nível Mestrado, Faculdade de
Odontologia de Araraquara - UNESP
4
Dedicatória
A Deus,
Presente em todos os momentos da minha vida, me
abençoando e atendendo minhas preces.
À minha mãe Líbia,
Minha fonte de energia, força e amor. Sempre ao meu
lado em todos os momentos. Minha verdadeira inspiração.
Ao meu pai Carlos,
Que sempre me apoiou nas minhas decisões.
Ao meu namorado Bruno,
Mesmo com todo esse tempo de namoro a distância,
sempre esteve muito presente em todas as etapas vividas.
Obrigada por todas as viagens feitas para Araraquara, pelo
incentivo e por toda a compreensão.
Aos meus irmãos Lula e Caê,
Por fazerem minha vida tão animada e feliz. Sempre me
incentivando a buscar meus sonhos.
5
Dedicatória
Às minhas Primas-irmãs Aninha, Mari, Cris e Lalita,
Que mesmo distantes conseguem confortar a saudade
com palavras de carinho e amor.
Às minhas segunda mãe (Rita e Fátima)
Amores da minha vida que sempre me ajudaram a
confortar a distância. Faziam questão de ir me visitar mesmo quando
eu passava tão pouco tempo em Maceió.
A Reje, Lara e Tuka,
Por conseguirem amenizar minhas ansiedades com atos e
palavras.
6
Agradecimentos especiais
A Profa. Dra. Raquel M. Scarel Caminaga,
Agradeço pelo convite de trabalhar com você em um
momento tão decisivo da minha vida. Agradeço pela orientação desta
dissertação e os momentos de ensinamento no laboratório. Obrigada
por ter me ajudado nas situações de incertezas.
A Profa. Dra. Elisa Maria Ap. Giro,
Muito obrigada por todo ensinamento transmitido, pela
ajuda na coleta das amostras, pelas palavras de tranqüilidade e por ter
me mostrado a verdadeira essência no atendimento aos pacientes com
necessidades especiais.
A Márcia Tanaka,
Minha amiga e companheira em TODOS os momentos da
pesquisa. Sempre me acalmando e ajudando no desenvolvimento
desse trabalho. Amiga só você sabe todos os momentos de incertezas,
dúvidas e conquista que passamos sempre juntas. Muito obrigada.
7
Agradecimentos
À Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, nas
pessoas do Diretor Prof. Dr. José Cláudio Martins Segalla e vice-
diretora Profa. Dra. Andréia Afonsso Barretto Montandon.
Aos professores da Disciplina de Odontopediatria Ângela
Cristina Cilense Zuanon, Cyneu Aguiar Pansani, Elisa Maria
Aparecida Giro, Fábio de Abreu-e-Lima, Josimere Hebling, Lourdes
Aparecida Martins dos Santos-Pinto e Rita de Cássia Loiola Cordeiro,
pela recepção e convivência agradável. Obrigada pela oportunidade.
Às minhas queridas amigas Fernanda Lessa, Lalita, Andreza,
Yeon, Aline, Fer Bello e Carol por todos os momentos compartilhados
nas difilculdades e alegrias. Obrigada amigas por fazerem minha
temporada em Araraquara mais feliz.
Às amigas de curso de mestrado Ana Luiza, Camila, Elcilaine,
Hérica e Indri pelo apoio e ajuda durante todo o curso. Ana obrigada
por sempre ter sido tão sincera e espontânea, Ca valeu pela ajuda
durante o atendimento aos pacientes, Laine (senhora e-mail) obrigada
por nos ajudar a organizar as clínicas e emergências, Heriquete
obrigada pelos papos e pela bondade sempre disposta a ajudar a quem
precisa. A querida amiga Indri por compartilhar os almoços, trabalhos
e alegrias. Muito obrigada a todas.
8
Agradecimentos
Aos amigos da Pós-graduação Andreza, Cármen, Emi, Érika,
Fernanda, Hermes, Jonas, Juliana, Luciana, Michele, Murilo, Nancy e
Simone pelo carinho e convivência compartilhados durante todo o
curso.
Pelas colegas Rita, Marilis e Paloma que ajudaram na coleta da
amostra durante o estágio de pacientes com necessidades especiais.
Rita seu apoio foi fundamental para conseguir finalizar esse trabalho.
Aos colegas de laboratório Carina, Karen e River pela ajuda
fornecida sempre que precisei.
Aos professores Valfrido (cirurgia) e Juliane (emergência) que
abriram as portas da clínica para que eu pudesse desenvolver essa
pesquisa. E todos os profissionais que contribuíram de forma direto ou
indireto para essa pesquisa.
Aos funcionários da Pediatria Dona Odete, Dulce, Tânia e
Cristina pela convivência e ajuda durante as clínicas.
As secretárias do Departamento da Clínica Infantil Celinha e
Soninha por sempre estarem disponíveis a ajudar.
9
Agradecimentos
Aos funcionários do laboratório de ortodontia Pedrinho e Totó
pelas aparelhos, alicates e moldeiras que eram fornecidos quando
precisava.
A todos os funcionários da Pós-graduação por toda atenção e
eficiência.
Aos funcionários da biblioteca pela convivência agradável e
ajuda durante as pesquisas bibliográficas.
À todos os funcionários das APAEs que nos recebeu de forma
tão carinhosa e sempre acreditou em nosso trabalho.
Ao Célio que nos ajudou na montagem das planilhas e
dividindo seus conhecimentos sobre números com a gente.
Aos mestres Eneida e Amaro que me apoiaram desde o início da
vida acadêmica, despertando o interesse e curiosidade nesse meio.
A FAPESP pela credibilidade e auxílio para o desenvolvimento
desta pesquisa e CAPES pela disponibilidade da bolsa de estudo
durante o curso de mestrado e estágio.
10
SUMÁRIO
Lista de Abraviaturas_______________________________________12
Resumo_________________________________________________13
Abstract__________________________________________________16
1 Introdução_______________________________________________19
2 Revisão da literatura_______________________________________23
2.1 Síndrome de Down_________________________________24
2.2 Doença Periodontal_________________________________28
2.3 Síndrome de Down e Doença Periodontal_______________29
2.4 Imunogenética_____________________________________33
3 Proposição______________________________________________40
4 Material e método_________________________________________42
4.1 Delineamento do Estudo e Seleção da Casuística_________43
4.2 Exame Clínico Periodontal___________________________45
4.3 Análise da Expressão Genética_______________________46
4.3.1 Obtenção de Tecido Gengival__________________46
4.3.2 Obtenção de RNA Humano____________________46
4.3.3 Reações de Transcrição Reversa_______________48
4.3.4 Reações de PCR quantitativo em Tempo Real_____49
4.4 Análise Estatística dos Resultados_____________________52
5 Resultado_______________________________________________54
11
6 Discussão_______________________________________________74
7 Conclusão_______________________________________________87
8 Referências______________________________________________89
9 Anexos________________________________________________104
12
LISTA DE ABREVIATURAS
cDNA: Ácido Desoxirribonucléico complementar
CD4+: glicoproteína presente na superfície do linfócito T
CD8+: glicoproteína transmembrana do linfócito T
CD4+CD45RA+: sub divisão da glicoproteína de superfície do linfócito T
COX-2: Ciclooxigenase 2
CuZnSOD 1: Enzima cobre-zinco-superóxido-dismutase 1
DEPC: água tratada com Dietil Pirocarbonato, livre de RNAses, DNAses e resíduos
de proteínas
DP: Doença Periodontal
ICAM1: gene Molécula de Adesão Intercelular 1
ICAM -1: Proteína da Molécula de Adesão Intercelular 1
IFN-γ : Interferon-γ
IgG1: Imunoglobulina 1
IL10: gene Interleucina 10
IL-10: Proteína Interleucina 10
IL-6: Proteína Interleucina 6
IL-12: Proteína Interleucina 12
IL-13: Proteína Interleucina 13
IL10RA: gene Interleucina 10 receptor alfa
IL-10RA: Proteína Interleucina 10 receptor alfa
IL10RB: gene Interleucina 10 receptor beta
IL-10RB: Proteína Interleucina 10 receptor beta
IP10: gene da Proteína 10 Induzível por Interferon Gama
IP-10: Proteína 10 Induzível por Interferon Gama
JAK1: gene Janus-quinase 1
JAK-1: Proteína Janus-quinase 1
LFA-1: Antígeno 1 associado à Função de Linfócitos
LPS: lipopolissacarídeo
MMPs: Metaloproteinases
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
PGE
2
: Prostaglandina E
2
PMN: Polimorfonucleares
qRT-PCR: Reação de PCR quantitativo em tempo real
RNA: Ácido Ribonucléico
SBE: Elemento Ligador da proteína STAT
SD: Síndrome de Down
SOCS3: gene Supressor de Sinalização da Citocina 3
Socs 3: gene Supressor de Sinalização da Citocina 3 em camudongo
STAT3: gene Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 3
STAT-3: Proteína Transdutora de Sinal e Ativador da Transcrição 3
TCR/CD3: receptor celular de linfócito T/ glicoproteína de linfócito T
Th1: Linfócito T auxiliar 1
Th2: Linfócito T auxiliar 2
TNF: Fator de Necrose Tumoral
ZAP-70: cadeia ZETA associada a proteína quinase
13
Resumo
14
Cavalcante LB. Expressão de genes envolvidos na resposta imune de
indivíduos com Sídrome de Down frente à doença periodontal.
[dissertação mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da
UNESP; 2008.
Resumo
Vários periodontopatógenos podem colonizar muito precocemente
a cavidade bucal de indivíduos com Síndrome de Down (SD). Isso reflete
a alta prevalência (40%) de Doença Periodontal (DP) em adolescentes
com SD, que evolui para cerca de 100% em indivíduos com idade
próxima aos 30 anos. A higienização oral deficiente dos indivíduos com
SD não é capaz de isoladamente explicar a destruição periodontal severa
nesses indivíduos. Esta pesquisa investigou a expressão dos genes IL10
(interleucina 10), IL10RA, IL10RB (receptores Alfa e Beta da IL-10), JAK1
(janus-quinase 1), STAT3 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 3),
SOCS3 (supressor de sinalização de citocina 3), IP10 (proteína 10
induzível por interferon gama) e ICAM1 (molécula de adesão intercelular
1) em indivíduos com Síndrome de Down com Doença Periodontal e sem
DP em relação a indivíduos sem SD com e sem DP. Fizeram parte deste
estudo 80 indivíduos entre 6 e 61 anos de idade subdivididos em 4
grupos: Síndrome de Down com Doença Periodontal (SDcDP); indivíduos
com SD sem DP (SDsDP); indivíduos não-sindrômicos com DP (CcDP) e
indivíduos não-sindrômico sem DP (CsDP). A expressão gênica foi
investigada por meio de quantificação relativa utilizando a técnica da
15
reação em cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real com o sistema
Sybr Green. Obteve-se como resultado uma superexpressão do gene
IL10 em indivíduos não-sindrômico com DP e uma menor expressão em
indivíduos com SD. Nos indivíduos com SD houve uma superexpressão
do IL10RB. Observou-se que os genes SOCS3, IP10 e ICAM1 foram
responsivos à IL10. Portanto, a SD interfere na sinalização da IL10,
causando assim uma imunodeficiência nesses indivíduos e a DP
proporciona uma maior sinalização da IL10 gerando um processo
antiinflamatório.
Palavras-chave: Síndrome de Down; doenças periodontais; Interleucina -
10.
16
Abstract
17
Cavalcante LB. Expression of the genes involved in the immune response
of individuals with Down syndrome and periodontal disease [dissertação
mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2008.
Abstract
Many periodontopathogens can colonize the oral cavity
early in individuals with Down syndrome (DS). This reflects the high
prevalence (40%) of periodontal disease (PD) in adolescents with DS and
affects nearly 100% of these individuals when they are around 30 years
old. The severe periodontal destruction that occurs in these individuals
cannot be explained by poor oral hygiene alone. This study investigated
individuals with DS and PD and individuals with DS without PD regarding
the expression of the genes IL10 (interleukin 10), IL10RA, IL10RB (IL-10
alpha and beta receptors), JAK1 (janus kinase), STAT3 (signal transducer
and activator of transcription 3), SOCS3 (suppressor of cytokine signaling
3), IP10 (gamma interferon-induced protein) and ICAM1 (intercellular
adhesion molecule-1). Eighty individuals aging from 6 to 61 years of age
participated in this study and were divided into 4 groups: Down syndrome
with periodontal disease (DSwPD); Down syndrome without periodontal
disease (DSoPD); individuals without Down syndrome (control) with PD
(CwPD) and control without PD (CoPD). Gene expression was
investigated by relative quantification using the real-time polymerase chain
reaction technique (Real-time PCR) with the system Sybr Green. A
superexpression of the gene IL10 was found in individuals with PD and a
18
smaller expression in individuals with DS. A superexpression of IL10RB
was found in individuals with DS. The genes SOCS3 and ICAM1 were
responsive to IL10. Therefore, DS interferes in IL10 signaling thus causing
an immune deficiency in these individuals and PD promotes greater IL10
signaling, generating an anti-inflammatory process.
Keywords: Down Syndrome; periodontal diseases; Interleukin - 10.
19
Introdução
20
1 Introdução
Um grupo de indivíduos com comprometimento intelectual e
algumas características fenotípicas marcantes foi descrito em 1866 por
John Langdon Down, vindo a ser denominada “Síndrome de Down”
(SD)
24
. Em 1959 foi identificado que a SD é causada pela Trissomia do
cromossomo 21
54
. Atualmente, sabe-se que a trissomia do cromossomo
21 ocorre devido a mecanismo de não disjunção. Além disso, a SD
também pode ser causada por translocação geralmente entre o
cromossomo 21 e o cromossomo 15 ou 14 em cerca de 2% dos afetados.
Essa mesma freqüência dos indivíduos com SD são do tipo mosaicos, ou
seja, possuem uma população de células com 46 cromossomos e outra
com a Trissomia do cromossomo 21. Existe forte correlação entre idade
materna e incidência de SD
35
, sendo que o material cromossômico
adicional tem origem materna em 89,4% dos casos
36
.
Apesar de existirem características clínicas bem marcantes
na SD, a presença delas é bastante variável entre os afetados. Como
características clínicas mais freqüentes entre os indivíduos com SD estão:
comprometimento intelectual (100%), hipotonia (99%), microcefalia (85%),
epicanto e prega única transversa (40%), clinodactilia do 5° dedo e
malformações cardíacas (50%), entre outras. As principais manifestações
orais da SD são: palato ogival, macroglossia, língua fissurada, prevalência
reduzida de cárie e aumentada de doença periodontal
67
. Crianças com SD
exibem menor número de Streptococcus do grupo mutans na saliva e
21
maior pH salivar
94
. A prevalência de Doença Periodontal em adolescentes
com SD é de 30% a 40%, sendo que em indivíduos com idade próxima
aos 30 anos a prevalência sobe para cerca de 100%
75
.
Indivíduos com comprometimento intelectual apresentam
higienização bucal precária, e esse fator é importante para o surgimento
da DP. Entretanto, a higienização oral precária não é capaz de
isoladamente explicar a destruição periodontal severa que ocorre nos
indivíduos com SD, pois foi observado que a prevalência de DP foi maior
em crianças com SD do que em crianças com semelhante retardo
mental
21,95
.
Os indivíduos com SD apresentam algumas alterações no
sistema imune. Foram observadas funções diminuídas de quimiotaxia e
fagocitose por neutrófilos e leucócitos
4,45
; além do desbalanço nas
subpopulações de linfócitos T
9
e ativação defeituosa dos mesmos
85
.
Alguns pesquisadores acreditam que tais características podem contribuir
para o alto índice de DP nesses indivíduos quando comparados com
indivíduos normais ou com deficiência mental
7,75
.
Tem crescido o número de publicações científicas que
investigam o envolvimento imunogenético da DP em indivíduos
normais
30,62,84,90,97
. Apesar de tais estudos contribuírem muito para a
elucidação da etiopatogênese da DP, é importante também investigar
qual o papel de citocinas e seus receptores na DP frente à SD. O papel
de algumas citocinas reconhecidamente importantes na DP, como a
22
Interleucina 10 (IL10) ainda não foi investigado em indivíduos com SD.
Desta forma, mostra-se importante conhecer a resposta imunogenética de
indivíduos com SD que apresentam DP.
23
Revisão de literatura
24
2 Revisão de literatura
2.1 Síndrome de Down
Segundo o Censo de 2000 do IBGE há no Brasil cerca de
300 mil indivíduos com Síndrome de Down e, anualmente nascem cerca
de 8 mil brasileiros com a síndrome
73
.
O cromossomo 21 contém aproximadamente 225 genes, o
que corresponde a menos de 1% de todo genoma humano, sendo assim,
o menor cromossomo existente no ser humano
72
. Este fato faz com que a
trissomia do cromossomo 21 seja a condição aneuplóide mais comum
compatível com a sobrevida a termo
67
. Apesar disso, a taxa de aborto
espontâneo de fetos com SD é de 25% em média, subindo para 33% para
mães com idade mais avançada, até 45 anos
80
. A expectativa de vida de
uma criança com SD está relacionada ao alto risco de mortalidade nos
primeiros anos de vida (principalmente de 0 a 5 anos) por infecções
respiratórias (33,1%) e por malformações cardíacas congênitas (12,8%)
11
.
A SD causada por um cromossomo 21 extra é chamada
Trissomia Simples e ocorre em 95% dos casos. Estudos recentes
evidenciaram que 89,4% dos casos de indivíduos com SD tem como
etiologia a não-disjunção cromossômica durante a meiose materna, 8,8%
durante a meiose paterna e 1,8% dos casos tem origem na não disjunção
durante a mitose do zigoto (Mosaicismo)
36
.
25
A SD também pode ser causada por translocação
geralmente entre o cromossomo 21 e o 14 ou 15, que são todos
cromossomos acrocêntricos
12
. Para ocorrer a translocação os
cromossomos sofrem quebras nas regiões centroméricas, de forma que
um novo cromossomo será constituído pelos braços longos do
cromossomo 21 e do 14 (ou 15), tornando-se um cromossomo
submetacêntrico. Os braços curtos dos cromossomos envolvidos na
translocação tendem a se perder nas divisões subseqüentes. Esse tipo de
translocação é chamada Robertsoniana e é responsável por 2,2% dos
casos de SD
67
. Em alguns casos (1%) a translocação ocorre entre o
cromossomo 21 e o 21 ou 22
68
.
Alguns indivíduos com SD possuem uma população de
células com 46 cromossomos e outra com a Trissomia do 21, ou seja, são
do tipo Mosaico (1,8%)
36
. Isso ocorre por mecanismo de não-disjunção
cromossômica nas primeiras mitoses após a formação do zigoto e pode
originar diferentes percentuais de Mosaicismo. Quanto maior o percentual
de células com trissomia do 21 maiores serão as manifestações clínicas
da SD no indivíduo.
Há forte correlação entre a idade materna e a geração de
filhos com SD, ou seja, numa mulher com 30 anos o risco é 1:1000, e com
40 anos a chance de ter um filho afetado é de 9:1000 nascidos vivos
39,44
.
A explicação mais provável para o efeito da idade materna na maior
predisposição a gerar um filho com SD é o envelhecimento do gameta
26
feminino, pois a gametogênese fica estacionada por muitos anos no fim
da prófase I
12
.
Casos de SD por translocação são mais comuns em famílias
cujas mães são mais jovens. Assim, recomenda-se analisar o cariótipo
dos pais para investigar se há presença de translocações equilibradas,
como a Robertsoniana, onde apesar do indivíduo ser fenotipicamente
normal, ele pode transmitir o cromossomo alterado.
De forma geral, o risco de recorrência da SD é de 1%, ou
seja, mulheres que já tiveram um filho com SD (seja por Trissomia
Simples, por Translocação ou Mosaicismo) têm 1% de chance de ter outro
filho com a mesma síndrome
15
. Um estudo mais aprofundado baseado no
risco de recorrência comparado ao risco associado à idade materna
originou a “taxa de morbidade padrão” à SD, mostrando que a recorrência
para SD foi de 2,4 vezes, e para qualquer outro tipo de trissomia foi 2,3
vezes, independente da idade materna na época de gestação do primeiro
filho com SD
99
.
A SD é uma condição complexa com mais de 30
características clínicas que são bastante variáveis entre os afetados e
estão relacionadas com a superexpressão de genes específicos que se
encontram no cromossomo 21
16
. Entre as características clínicas
importantes em indivíduos com SD estão: hipotonia (99%), microcefalia
(85%), malformações cardíacas (50%) e gastrointestinais congênitas
(3%), deficiências no sistema imune, instabilidade atlanto-axial, maior
27
incidência de ataques convulsivos e de leucemia (15 a 20 vezes maior),
perda auditiva, hipotireoidismo e anomalias oculares
67,69
. Existem outros
sinais de menor comprometimento médico, mas que são úteis na
caracterização da SD: baixa estatura, boca entreaberta (devido a
macroglossia e/ou hipotonia), epicanto, mãos curtas e largas com uma
única prega palmar transversa (linha simiesca – 40%), quinto dedo
encurvado (clinodactilia)
67
. Indivíduos com SD também apresentam
senilidade prematura, provavelmente relacionada a um dano aos lipídios
de células nervosas
13
. Entre as características observadas nos indivíduos
com SD, somente duas ocorrem em praticamente 100% dos casos:
retardo mental e modificações neuropatológicas idênticas às observadas
em indivíduos com a Doença de Alzheimer (em indivíduos com SD de
mais de 35 anos)
69
.
Em relação à cavidade bucal observa-se palato ogival,
macroglossia associada à hipotonia muscular, língua fissurada,
prevalência reduzida de lesões de cárie e aumentada de doença
periodontal
68
. Também são observadas anomalias dentárias como a
presença de dentes conóides, oligodontia e retardo na erupção dentária
77
,
microdontia, hipocalcificação dos dentes, fusão e geminação dentária
18
.
Pelo fato de indivíduos com SD manifestarem várias
complicações clínicas, é necessário que a anamnese e o exame clínico
nesses indivíduos sejam cuidadosos e detalhados para que os
28
procedimentos médicos e odontológicos a serem realizados não tragam
danos à saúde do paciente.
Especificamente quanto aos procedimentos odontológicos
invasivos a serem realizados em indivíduos com SD, os pacientes com
alterações cardíacas devem ser encaminhados ao cardiologista antes do
procedimento para que seja prescrita uma profilaxia antibiótica adequada
para se evitar o risco de uma complicação como a endocardite
5
.
Apesar da maior freqüência de distúrbios clínicos
importantes, indivíduos com SD que recebam o mais precocemente
possível cuidados médicos e odontológicos adequados, além de
educação que atenda às suas necessidades especiais, podem ter um
bom desenvolvimento neuromotor e da capacidade de socialização, de
forma que eles e seus familiares podem possuir uma boa qualidade de
vida.
2.2 Doença Periodontal
A Doença Periodontal (DP) é uma infecção de ordem
multifatorial, causada por uma combinação de fatores genéticos e
ambientais tendo como fator essencial para seu desenvolvimento a
presença de bactérias específicas
33
.
Algumas bactérias têm relação direta com a doença
periodontal como o Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
29
Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis, Treponema denticola,
entre outras. Essas bactérias iniciam e perpetuam a inflamação podendo
causar destruição no periodonto
96
. Além das bactérias, a resposta
imunoinflamatória é necessária para determinar o grau de destruição dos
tecidos periodontais
40
.
Além dos periodontopatógenos e da resposta do hospedeiro
o caráter multifatorial da DP sofre influência de fatores de risco como o
fumo
43
e diabetes
63
, além de indicadores de risco como stress
57
e
osteoporose
88
. Nas doenças de caráter multifatorial é difícil quantificar
qual a influência de fatores ambientais e de fatores genéticos.
Alguns estudos têm investigado a relação de fatores
genéticos com a Doença Periodontal. Citocinas como a IL-4, IL-6, IL-10,
IL-18 e TNF–α tiveram relação positiva ou negativa com a DP
dependendo da população estudada
27,29,47,84,87
.
Portanto, dependendo do grau de predisposição genética à
DP de um indivíduo, medidas de prevenção devem ser tomadas o mais
precocemente possível, evitando assim a instalação ou progressão da
doença.
2.3 Síndrome de Down e Doença Periodontal
Indivíduos com comprometimento intelectual
apresentam higienização bucal precária, e esse fator é importante para o
30
surgimento da DP. Entretanto, a higienização oral precária não é capaz
de isoladamente explicar a destruição periodontal severa que ocorre nos
indivíduos com SD, pois foi observado que a prevalência de DP foi maior
em crianças com SD do que em crianças com similar retardo mental
21,95
.
A prevalência de DP em adolescentes com SD é de
30% a 40%, sendo que em indivíduos com idade próxima aos 30 anos a
prevalência aumenta para cerca de 100%
75
. Cichon et al.
19
(1998)
sugeriram que a destruição periodontal severa que ocorre nos indivíduos
com SD é consistente com o padrão de periodontite agressiva. Vários
periodontopatógenos podem colonizar muito precocemente a cavidade
oral de indivíduos com SD. Foram detectados por PCR (Reação em
Cadeia da Polimerase) 9 de 10 espécies de periodontopatógenos em
placa subgengival de indivíduos portadores de SD de 2 a 4 anos de idade,
com significativa diferença em relação ao Controle (sem SD). Vale
acrescentar que Tannerella forsythensis (T.forsythensis), Bacteroides
forsythus (B.forsythus) e Treponema denticola (T.denticola), considerados
importantes na periodontite do adulto, foram encontrados em crianças
com SD desde os 2 anos de idade, sendo que em crianças não-
sindrômicas apenas o B. forsythus foi detectado a partir de 8 anos de
idade. A ocorrência de todas as espécies testadas aumentou
gradualmente com a idade (até 13 anos), mas manteve a prevalência
significativamente maior no grupo SD
3
. Aggregatibacter
31
actinomycetemcomitans (A.a.) está associado a Periodontite Agressiva e
é considerado importante na periodontite de indivíduos SD
6
.
Acredita-se que a progressão da DP em indivíduos com
SD seja influenciada por fatores endógenos relacionados ao sistema
imune. Indivíduos com SD apresentam imunodeficiências como:
1) Quimiotaxia deficiente de neutrófilos
4,45,93
, relacionada inclusive à
perda de osso alveolar
42
;
2) Menor atividade de fagocitose de Staphylococci por leucócitos
32,49
;
3) Desbalanço nas subpopulações de linfócitos T, estando a
proporção de CD8+ aumentada e a de CD4+ diminuída, inclusive a
de CD4+CD45RA+, o que pode indicar envelhecimento precoce do
sistema imune de indivíduos com SD
9
. Aumento na proporção de
CD8+ também foi observado em adolescentes com SD (12 a 16
anos), além de maior expressão de LFA1 nos linfócitos T CD4+ e
CD8+ de indivíduos com SD, embora tenha sido demonstrada
menor adesão celular a ICAM1
56
(Figura 1);
32
FIGURA 1
-
A figura mostra a relação de adesão entre LFA-1 e ICAM-1 e a relação
entre uma citocina (ex. IL-10) e seu receptor
(Adaptado de Abbas et al.
1
, 2003).
4) Ativação defeituosa de linfócitos T de indivíduos com SD
caracterizada pela transdução de sinal parcial de complexo
TCR/CD3 associada à falha de fosforilação de resíduos de tirosina
da proteína ZAP-70
85
;
Considerando-se em conjunto tais peculiaridades do
sistema imune de indivíduos com SD isso pode contribuir para que
esses manifestem um alto índice de DP quando comparado com
indivíduos cromossomicamente normais ou com deficiência
33
mental
4,7,45
. Outra característica peculiar do sistema imune dos
indivíduos com SD é a superexpressão da enzima cobre-zinco-
superóxido-dismutase 1 (CuZnSOD 1), cujo gene está localizado no
cromossomo 21. Essa enzima converte rapidamente superóxidos em
peróxido de hidrogênio. Devido a trissomia, encontram-se níveis dessa
enzima de 50% a 150% mais elevados quando comparados ao
controle. Esses altos níveis são capazes de provocar nos
polimorfonucleares (PMN) drástica redução de superóxidos,
diminuindo a capacidade dessas células agirem contra
microrganismos que requeiram estritamente superóxidos para serem
destruídos
67
.
2.4 Imunogenética
É crescente o número de publicações científicas que
investigam o envolvimento imunogenético da DP em indivíduos
normais
30,62,84,90,97
. Em relação à DP que acomete indivíduos com SD,
observa-se que as publicações científicas enfocam mais o papel de
enzimas como as metaloproteinases (MMPs), que são as principais
enzimas que atuam na degradação tecidual
34,47
. Apesar de tais estudos
contribuírem muito para a elucidação da etiopatogênese da DP, é
importante também investigar o papel de citocinas, seus receptores e vias
de sinalização intracelular na DP.
34
O papel de algumas citocinas reconhecidamente
importantes na DP, como a Interleucina 10 (IL-10), ainda não foi
investigado em indivíduos com SD. O mesmo se aplica a outros genes
envolvidos no mecanismo efetor da IL-10, como receptores e moléculas
de transdução do sinal ao núcleo celular que atuam na expressão de
outros genes, que também participam do intrincado mecanismo de
resposta imune.
A IL-10 é produzida principalmente por macrófagos e
atua como um potente inibidor de macrófagos ativos, sendo assim um
excelente regulador de feedback negativo. Os macrófagos secretam
citocinas como a IL-12 e TNF que aumentam a ativação de células T e da
imunidade mediada por células. Como a IL-10 inibe a função dos
macrófagos ativados, ela colabora para o retorno do sistema imune ao
estado de repouso à medida que a infecção bacteriana vai sendo
erradicada
1
. A IL-10 também atua como ativadora de linfócitos B,
estimulando tanto a proliferação quanto a diferenciação dos mesmos.
Yamamoto et al.
102
(1997) analisaram a produção de citocinas em tecidos
gengivais inflamados e observaram a expressão de RNA mensageiro
(RNAm) da IL-10, juntamente com interferon-γ (IFN-γ), interleucina 6 e 13
(IL-6 e IL-13). Como havia predominância das citocinas derivadas de
células Th2, os autores sugeriram que estas poderiam contribuir na
indução de respostas mediadas por células do tipo B nos sítios doentes.
Acredita-se que em uma condição inflamatória ocorra um desbalanço
35
entre a resposta Th1 e Th2, mas ainda não se sabe precisar o real papel
de cada uma na DP
31
.
Cada molécula que compõe o sistema imune é
regulada por uma intrincada rede de comunicação entre citocinas
28
. O
estudo da cinética da doença pode mostrar diferentes padrões de
ativação e inibição de citocinas e enzimas durante a evolução da doença.
Assim, ainda há muitas questões a serem elucidadas, principalmente no
que se refere à DP em indivíduos com SD, os quais apresentam
particularidades no seu sistema imune.
Pelo fato de a resposta imune ocorrer mediante a
ligação das citocinas aos seus receptores na superfície das células, é
válido investigar também a expressão dos receptores da IL-10. Os
receptores da IL-10 pertencem ao tipo II, caracterizados por possuírem
dois domínios extracelulares com cisteínas conservadas
1
. A IL-10 tem
dois receptores: IL10R-α (OMIM 146933) cujo gene está localizado no
cromossomo 11q23.3; e IL10R-β (OMIM 123889) cujo gene está
localizado no braço longo do cromossomo 21 (21q)
74
.
Considerando que a citocina IL-10 liga-se a
receptores do tipo II, o mecanismo pelo qual ocorre a transdução do sinal
que desperta respostas específicas nas células-alvo é mediado pela via
JAK/STAT, ou seja, envolve uma enzima chamada Janus-quinase 1 (JAK-
36
1) e o fator de transcrição STAT-3 (Transdutor de Sinal e Ativador da
Transcrição)
1
.
Quando a citocina IL-10 se liga ao domínio
extracelular do receptor IL10R-α (ou IL10R1) forma-se uma associação
do IL10R2 com o IL10R1 gerando um complexo entre esses receptores
da IL-10 (Figura 2). Isso dá início à cascata de eventos de transdução de
sinal que inclui a fosforilação de JAK-1 (associada ao IL10R1 no domínio
citoplasmático). Essa Kinase então fosforila resíduos específicos de
tirosina (Y) no domínio intracelular da cadeia IL10R1. Uma vez
fosforilados esses resíduos de tirosina servem como sítios de ancoragem
para o fator de transcrição latente STAT-3. A proteína STAT-3 torna-se
ativada e se dissocia do receptor IL10R1 ligando-se a outra molécula
STAT-3. Os dímeros STAT-3 migram para o núcleo da célula e se ligam
às seqüências de DNA (SBE, elemento ligante de STAT) nas regiões
promotoras de genes responsivos a IL-10, e ativam a transcrição desse
gene. Um desses genes, o SOCS3, é um membro de uma família de
genes que produzem proteínas que inibem a sinalização dependente de
JAK/STAT. A habilidade de IL-10 em rapidamente produzir a expressão
de SOCS-3 pode explicar, ao menos em parte, como a IL-10 inibe a
indução de muitos genes (como a IL-1 e TNF-α) em monócitos
1,23
.
Recentemente, foi observado que camundongos com o gene Socs3
inativo que apresentavam artrite reumatóide tiveram seus macrófagos
37
hiper-responsivos a IL-1 e concluiu-se que SOCS-3 é um regulador
negativo importante em artrite inflamatória aguda dependente de IL-1
100
.
FIGURA 2 - Sinalização da citocina IL-10 pela via JAK/STAT. A citocina IL-10 se
liga ao receptor IL10R1 dando início à cascata de eventos de transdução de sinal que
inclui a fosforilação de JAK-1 e conseqüente fosforilação dos resíduos de tirosina
(Y) no receptor IL10R1 que servem como sítios de ancoragem para o STAT-3 que
torna-se ativada e se dissocia do receptor IL10R1 ligando-se a outra molécula STAT-
3. Os dímeros STAT-3 migram para o núcleo da célula e se ligam às seqüências de
DNA nas regiões promotoras de genes responsivos a IL-10, e ativam a transcrição
desse gene. Que neste exemplo é o gene SOCS3 (Donnelly et al.
8
, 1999).
Foi demonstrado em monócitos humanos que IL-10
inibiu a expressão dos genes IP10 (proteína 10 induzível por interferon
38
gama) e ICAM1 (molécula de adesão intercelular 1)
41
. Esses genes são
induzidos por Interferon (IFN-α e IFN-γ) que utilizam a STAT-1 como
molécula transdutora de sinal ao núcleo e que se liga na seqüência SBE
(ou GAS – seqüência ativadora de interferon gama) presente no promotor
dos citados genes IP10 e ICAM1
41
. Portanto, a IL-10 pode diretamente
inibir a expressão de genes induzidos por IFN-α e IFN-γ por meio da
supressão da fosforilação de STAT-1. Isso pode ocorrer devido a
habilidade da IL-10 em induzir a expressão de SOCS-3
37
.
É relevante acrescentar a importância das proteínas
IP-10 e ICAM-1 no sistema imune. A IP-10 é uma citocina quimiotática
(quimiocina) para monócitos e linfócitos T, promove adesão de linfócitos T
a células endoteliais e atua como um potente inibidor de angiogênese in
vivo. Mais recentemente a IP-10 tem sido chamada CXCL-10, pois na
composição de aminoácidos da estrutura protéica do ligante (L) 10, há
dois resíduos conservados de cisteína (C) separados por um único
aminoácido qualquer (X), daí o termo CXCL-10 (OMIM 147310). No que
se refere a ICAM-1, esta é uma molécula de adesão intercelular cuja
principal função é ligar-se a linfócitos T que expressam em sua superfície
a LFA-1 (antígeno 1 associado à função de linfócitos)
1
(OMIM 147840).
Até o momento não foi encontrada na literatura
nenhuma pesquisa investigando expressão diferencial em indivíduos com
SD do gene IL10, seus receptores, moléculas transdutoras de sinal e
fatores de transcrição que influenciam a expressão de genes responsivos
39
à IL-10. Acredita-se que este trabalho poderá contribuir com valiosas
informações sobre peculiaridades do sistema imune de indivíduos com
SD.
40
Proposição
41
3 Proposição
Investigar a expressão dos genes IL10, IL10RA,
IL10RB, JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 em indivíduos com
Síndrome de Down (SD) que apresentam ou não Doença Periodontal.
Esses dados serão comparados com os obtidos de indivíduos não
Sindrômicos com e sem DP.
42
Material e método
43
4 Material e método
4.1 Delineamento do Estudo e Seleção da Casuística
Constituiu-se a casuística deste estudo o total de 80
indivíduos divididos nos seguintes grupos com 20 indivíduos cada:
1) Grupo Síndrome de Down com Doença Periodontal (SDcDP)
2) Grupo Síndrome de Down sem Doença Periodontal (SDsDP)
3) Grupo Controle (não-sindrômicos) com Doença Periodontal
(CcDP)
4) Grupo Controle (não-sindrômicos) sem Doença Periodontal
(CsDP)
Os indivíduos com Síndrome de Down e indivíduos
não sindrômicos selecionados foram de ambos os gêneros e qualquer
etnia com idade a partir dos 6 anos. Os indivíduos do grupo SD foram
selecionados fazendo-se esforços para parear idade seguida do gênero.
Desta forma essas variáveis teriam menor influência na comparação da
expressão gênica entre os grupos.
Os indivíduos com SD foram selecionados na Clínica de
Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de Araraquara –
FOAr/UNESP e na Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais
(APAE) de Araraquara e região. Indivíduos não-sindrômicos foram
selecionados de acordo com a faixa etária nas Clínicas de
Odontopediatria, Periodontia e Cirurgia da FOAr/UNESP.
44
Todos os indivíduos selecionados para compor a
casuística deste estudo tiveram seu histórico médico e odontológico
avaliados sendo considerados os seguintes critérios de exclusão:
√
√√
√ Indivíduos institucionalizados;
√
√√
√ Pacientes SD do tipo mosaico;
√
√√
√ Pacientes SD sem autorização do cardiologista para realização
de procedimento odontológico mais invasivo (ex: exodontia,
gengivectomia)
√
√√
√ História de antibioticoterapia, uso de antiinflamatórios e/ ou de
imunossupressores nos últimos 3 meses;
√
√√
√ História de tratamento periodontal nos últimos 6 meses;
√
√√
√ História de diabetes, alteração sistêmica ou alguma doença
infecciosa.
√
√√
√ Pacientes fumantes
Para que um indivíduo fosse selecionado para este
estudo, além de atender aos critérios de exclusão, o mesmo deveria
apresentar uma área passível de coleta de tecido gengival, ou seja,
deveria haver indicação clínica para realização de exodontia,
gengivectomia ou outro procedimento clínico em que a coleta de um
fragmento gengival não infringisse princípios éticos.
Após explicar de maneira acessível, os objetivos da
pesquisa aos indivíduos selecionados e seus responsáveis, obtendo a
colaboração dos mesmos, estes foram convidados a assinar o termo de
45
consentimento livre e esclarecido (TCLE) que foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa com Seres Humanos – CEP da Faculdade de
Odontologia de Araraquara – UNESP, protocolo n° 79/04 (Anexo 1).
4.2 Exame Clínico Periodontal
Cada sujeito participante desta pesquisa foi
submetido a um exame periodontal realizado por meio de secagem prévia
da região a ser examinada com jato de ar, utilizando uma sonda
periodontal milimetrada tipo Williams, espelho plano e pinça clínica
devidamente esterilizados
91
.
Os exames foram executados por um examinador
previamente treinado, o qual realizou o exame periodontal em todos os
dentes presentes na cavidade bucal. Os parâmetros clínicos de
profundidade de sondagem e nível de inserção clínico (NIC) foram
examinados em seis sítios (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular,
mésio-lingual, lingual e disto-lingual) de cada dente, além de sangramento
à sondagem.
Os seguintes critérios clínicos periodontais foram
utilizados para classificar os indivíduos em:
• Sem Doença Periodontal: indivíduos sem sinais clínicos de
doença periodontal, tendo como características: ausência de
46
sangramento marginal, profundidade de sondagem e NIC ≤
3mm.
• Com Doença Periodontal: indivíduos com pelo menos 3 sítios
não adjacentes apresentando sangramento à sondagem,
profundidade de sondagem e NIC > 3mm.
4.3 Análise da Expressão Genética
4.3.1 Obtenção de tecido gengival
No caso de indivíduos (SD ou Controle) pertencentes
aos grupos com DP foi coletado tecido gengival de área inflamada e do
grupo sem DP o tecido gengival foi obtido de área não inflamada.
Um fragmento de gengiva de aproximadameste 2 mm
foi coletado durante o tratamento odontológico dos indivíduos
selecionados e mergulhado imediatamente em Trizol (Invitrogen, Aukland,
Nova Zelândia) (1 ml/mg de tecido). O microtubo contendo o fragmento de
gengiva em Trizol foi mantido em gelo até ser levado ao laboratório para
ser armazenado a –80ºC.
4.3.2 Obtenção de RNA Humano
No momento de extrair o RNA do tecido gengival, o
microtubo foi mantido em gelo para permitir o descongelamento do tecido
e do Trizol. Fora do gelo, o tecido foi macerado com pistilo de vidro no
próprio microtubo com Trizol para facilitar a extração do RNA. Para cada 1
ml de Trizol foi acrescentado 0,2 ml de clorofórmio (J.T.Baker, Cidade do
47
México, México) e após agitar em vortex por 15 segundos, o microtubo foi
incubado por 5 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, foi
centrifugado a 14.000 rpm a 4°C por 15 minutos. Após a centrifugação, o
conteúdo do microtubo apresentou 3 fases: uma inferior rósea que
contém o fenol/guanidina isotiocianato/clorofórmio; uma fase intermediária
esbranquiçada e uma fase superior aquosa que contém o RNA. A fase
aquosa foi transferida com micropipeta para um novo microtubo onde foi
acrescentado 0,5 ml de isopropanol (Synth, Diadema, São Paulo, Brasil)
com o intuito de precipitar o RNA. A mistura no microtubo foi
homogeneizada (levemente por inversão), incubada por 10 minutos à
temperatura ambiente e centrifugada a 14.000 rpm por 10 minutos a 4°C.
Após a centrifugação foi observado um pellet de RNA no fundo do
microtubo com aparência branco-gelatinosa. Descartou-se o
sobrenadante (isopropanol) de forma cuidadosa e acrescentou-se 1 ml de
etanol 75% (Synth, Diadema, São Paulo, Brasil). Após leve
homogeneização do microtubo, este foi centrifugado a 7.500 rpm por 5
minutos a 4°C. Desprezou-se o sobrenadante (etanol) de forma cuidadosa
e, com o microtubo aberto, permitiu-se que resquícios de etanol
evaporassem à temperatura ambiente, sem no entanto deixar o pellet
secar completamente. O pellet de RNA foi ressuspenso em 20 a 50 µl de
água ultrapura tratada com DEPC (BioAgency, São Paulo, São Paulo,
Brasil) por meio do up-&-down com micropipeta. O microtubo foi incubado
a 55°C por 10 minutos.
48
Uma alíquota de RNA (2 µl) foi dissolvida em 98 µl de
água-DEPC para realizar a quantificação do RNA em espectrofotômetro
(Biophotometer, Eppendorf, Hamburg, Alemanha). Também foi analisada
a pureza do RNA de cada amostra, por meio da razão entre a
absorbância a 260 nm (ácidos nucléicos) e 280 nm (proteínas), ou seja,
A
260/280
.
4.3.3 Reações de Transcrição Reversa
Foi sintetizado o DNA complementar (cDNA) de todas
as seqüências gênicas expressas no tecido gengival coletado por meio da
transcrição reversa utilizando Oligo dT
(20)
e o kit SuperScript III First-
Strand Synthesis Super Mix (Invitrogen).
Em um microtubo de 0,2 ml o volume de RNA
correspondente à concentração de cerca de 350 ng foi acrescido de 1 µl
de Oligo dT, 1 µl de Annealing Buffer e água-DEPC até o volume final de
8 µl. A reação foi incubada a 65°C por 5 minutos. Em seguida, o
microtubo foi mantido em gelo por 1 minuto, onde foi acrescentado 10 µl
do Mix da Reação First-Strand e 2 µl do Mix das enzimas SuperScript III/
RNAseOUT. A reação foi incubada a 50°C por 50 minutos, seguido por
85°C por 5 minutos. Assim foi obtido um volume final de 20 µl de cDNA
que foi armazenado em freezer -80°C até sua utilização para as reações
de amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase).
49
4.3.4 Reações de PCR quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR)
As reações de PCR para amplificar o cDNA referente
a cada gene a ser investigado foram realizadas utilizando um par de
primers específico que foi desenhado no Primer Express 3 do SDS 7500
(anexo 2) e o Kit Power Sybr® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems, São Paulo, São Paulo) no aparelho Real Time PCR SDS
7500 (Applied Biosystems – obtido através do Projeto Multiusuários
FINEP n° 5085/06).
A investigação da expressão genética foi realizada
por meio da quantificação relativa pelo método de comparação de C
T
(Threshold cycle) de cada gene alvo de investigação com o gene
constitutivo β-actina como normalizador (controle endógeno) da reação.
As reações de PCR foram realizadas em microplacas de maneira a
amplificar em um poço um gene de cada vez, ou seja, foi realizado o
método singleplex, em que se amplifica em um poço ou o gene alvo ou o
gene da β-actina de acordo com a utilização dos primers específicos. O
PCR em Tempo Real utilizando o sistema SYBR Green realiza as reações
de amplificação e promove a detecção da expressão gênica na amostra
por meio da fluorescência que é emitida quando o SYBR está intercalado
à fita dupla de DNA recém-formada. A quantificação da expressão do
gene alvo, objetivo da investigação desta pesquisa é relativa à expressão
do gene constitutivo, neste caso, o gene da β-actina. Em cada microplaca
incluiu-se uma amostra de cada um dos quatro grupos que foi investigada
50
em duplicata para cada um dos genes IL10, IL10RA, IL10RB, JAK1,
STAT3, SOCS3, IP10, ICAM1 e ACTB (β-actina). Além disso, havia na
placa o controle positivo da reação de amplificação e o controle negativo
(água ao invés de cDNA).
As condições de reação de PCR para cada gene de
interesse foram otimizadas com relação à concentração de primers,
ausência da formação de dímeros (primer-dimer) e eficiência de
amplificação do gene alvo. Inicialmente foi necessário verificar qual a
concentração ideal de cada par de primers que seria utilizado nas reações
de qRT-PCR. Foram testadas as concentrações de 100, 300 e 500 nM.
Constatou-se que a concentração ideal de todos os primers a serem
investigados neste estudo foi de 500 nM. Em seguida, foi necessário
determinar a eficiência de amplificação de cada gene. Para isso foi
realizada a titulação de uma amostra de cDNA de tecido gengival nas
seguintes concentrações: 50, 10, 2, 0,2 e 0,05 ng, tendo sido escolhida a
concentração de 10 ng de cDNA mediante a observação das curvas de
eficiência.
A ciclagem térmica aplicada foi: 2 minutos a 50°C, 10
minutos a 95ºC, e quarenta ciclos de 15 segundos a 95ºC, 1 minuto a
60ºC. Um ciclo final com temperatura crescente de 60 a 95ºC (2°C/min)
teve a fluorescência do produto da PCR medida a cada 15 segundos e
esses dados foram empregados para a obtenção de uma curva de
dissociação dos produtos da reação, utilizada para a análise da
51
especificidade de amplificação. Os resultados foram analisados com base
no valor de C
T
, que foi definido após o término da reação.
Para realizar as reações qRT-PCR de toda a
casuística foram necessárias 20 microplacas. Ao final, foi necessário
analisar os resultados de todas elas em conjunto. Para isso foi utilizado o
programa Microsoft Excell (versão 2000) contendo os cálculos estatísticos
(algoritmos) iguais aos presentes no programa Relative Quantification
(ddCt) Study do termociclador em Tempo Real da Applied Biosystems, o
SDS 7500, versão 1.3. O referido programa, conhecido como RQ Study
analisa simultaneamente somente dez microplacas. Por esse motivo, o
programa Microsoft Excell foi utilizado para análise das 20 microplacas
simultaneamente a partir dos algoritmos descritos no User Bulletin,
Subject: Relative Quantification (RQ) algoritms in Applied Biosystems
Real-Time PCR Systems Software
*
. De forma simplificada, a análise
consistiu em, após normalizar os resultados, ou seja, descontar o C
T
obtido do gene constitutivo do C
T
de cada gene alvo de cada amostra
(∆Ct), foram realizadas comparações dos resultados entre os diferentes
grupos (∆∆Ct), pois a quantificação é relativa. O valor final da análise foi
obtido da equação: 2
-∆∆Ct
.
__________________________________________________________________
*Applied Biosystems. Guide to performing relative quantitation of gene
expression using Real-Time quantitative PCR.
52
4.4 Análise Estatística dos Resultados
A Doença Periodontal e a Síndrome de Down foram
consideradas variáveis independentes, influenciando ou não a expressão
dos genes IL10, IL10RA, IL10RB, JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1,
consideradas variáveis dependentes.
De acordo com a proposição deste trabalho, as
hipóteses testadas foram:
• Se a Síndrome de Down influencia a expressão dos genes
H
0
: A Síndrome de Down não exerce influência sobre a expressão dos
genes
H
1
: A Síndrome de Down exerce influência sobre a expressão dos genes
• Se a Doença Periodontal influencia a expressão dos genes
H
0
: A Doença Periodontal não exerce influência sobre a expressão dos
genes
H
1
: A Doença Periodontal exerce influência sobre a expressão dos genes
• Se a Síndrome de Down associada à Doença Periodontal
influenciam a expressão dos genes
H
0
: A Síndrome de Down associada à Doença Periodontal não exerce
influência sobre a expressão dos genes
H
1
: A Síndrome de Down associada à Doença Periodontal exerce
influência sobre a expressão dos genes
Os dados foram avaliados quanto a sua distribuição.
Por não apresentarem aderência à curva de normalidade, utilizou-se o
53
teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis associado ao método de Student-
Newman-Keuls, por meio do programa BioEstat v.4.0 (UFPA, MCT,
CNPq, Belém, PA, Brasil) para verificar diferenças entre os genes na
análise de um grupo em relação a um calibrador. Para identificar e/ou
confirmar diferenças na expressão genética foi utilizado o teste de Mann-
Whitney (comparações 2 a 2). A análise estatística foi realizada ao nível
de significâcia de 5% (α = 0,05).
54
Resultado
55
5 Resultado
5.1 Casuística, obtenção do RNA e padronização de qRT-PCR
Os indivíduos incluídos neste estudo foram
classificados quanto à presença ou ausência da SD e DP e subdivididos
em quatro grupos. Dentro de cada grupo esses indivíduos foram
organizados quanto ao gênero e suas respectivas idades (Quadro 1).
Quadro 1 - Casuística subdividida nos diferentes grupos especificada por
gênero e idade
Gênero
Feminino (F)
Masculino (M)
Grupos
SDcDP
(n = 20)
SDsDP
(n = 20)
CcDP
(n =20)
CsDP
(n=20)
06
14
11
09
11
09
10
10
Idade e Gênero
Média (± DesvPad)
26 (F)
15 (F)
28 (F)
30 (F)
32 (F)
36 (F)
33(M)
30 (M)
31 (M)
37(M)
33 (M)
25 (M)
25 (M)
32 (M)
40 (M)
20 (M)
28 (M)
34 (M)
38 (M)
39 (M)
30,6 ± 6,34
06 (F)
06 (F)
07 (F)
13 (F)
16 (F)
12 (F)
07 (F)
12 (F)
08 (F)
07 (F)
14 (F)
07 (M)
11 (M)
23 (M)
29 (M)
14 (M)
20 (M)
06 (M)
10 (M)
12 (M)
12 ± 6,18
34 (F)
19 (F)
31 (F)
27 (F)
31 (F)
47 (F)
34 (F)
60 (F)
39 (F)
26 (F)
42 (F)
47 (M)
41 (M)
52 (M)
54 (M)
61 (M)
47 (M)
37 (M)
57 (M)
40 (M)
41,3 ± 11,7
15 (F)
20 (F)
27 (F)
36 (F)
40 (F)
45 (F)
22 (F)
30 (F)
28 (F)
29 (F)
20 (M)
24 (M)
13 (M)
06 (M)
04(M)
06 (M)
9 (M)
10 (M)
13 (M)
14 (M)
20,5 ± 11,7
56
Obteve-se uma porcentagem um pouco maior de
indivíduos do gênero masculino (52,5%) em relação ao feminino (47,5%).
A faixa etária dos indivíduos com SD foi de 6 a 40 anos. Essa amplitude é
justificável pelo desenho experimental deste estudo que incluiu dois
grupos de indivíduos com SD (um com DP e outro sem DP). Era esperado
que indivíduos com SD e com DP fossem mais velhos (30,6 anos em
média) que aqueles que não tivessem desenvolvido DP (12 anos em
média). O grupo CcDP teve a média de idade de 41,3 anos em
comparação à do grupo SDcDP (30,6 anos), enquanto no grupo CsDP a
média de idade foi de 20,5 anos e no grupo SDsDP a idade média foi de
12 anos.
O rendimento médio de RNA total foi de 43,07 ng por
mg de tecido gengival, com pureza média de 1,88. Na padronização de
cada par de primers utilizado neste estudo obtiveram-se curvas de
dissociação com somente um pico indicando a amplificação específica do
respectivo gene alvo (Figuras 3 e 4). Constatou-se que a concentração
ideal dos primers foi de 500 nM e que a concentração de 10 ng de cDNA
era a ideal para ser utilizada nas reações de qRT-PCR, mediante a
observação das curvas de eficiência (Figura 5). As eficiências de
amplificação obtidas foram: 97% (gene IL10RA), 99% (gene JAK1) e
100% (genes ACTB, IL10, IL10RB, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1),
permitindo a utilização de qRT-PCR para investigação da expressão
57
gênica nas amostras de gengiva e a utilização da equação: 2
-∆∆Ct
para
análise dos resultados.
FIGURA 3 - Curvas de dissociação do gene constitutivo ACTB (β-actina) mostrando um
único pico referente ao Tm do respectivo amplicon, o que comprova a especificidade do
par de primers.
ACTB
58
FIGURA 4 - Curvas de dissociação dos genes alvo mostrando um único pico referente
ao Tm do respectivo amplicon, o que comprova a especificidade do par de primers.
IL10
IL10RA
IL10RB JAK1
STAT3 SOCS3
IP10 ICAM1
59
FIGURA 5 - Curva padrão para verificação da eficiência de amplificação por PCR em
Tempo Real utilizando o par de oligonucleotídeos do gene constitutivo ACTB (β-actina) e
diferentes quantidades de cDNA (50, 10, 2, 0,2, 0,05 ng). A eficiência de amplificação é
determinada pela função: Efic = 10
(-1/slope)
-1.
Para análise da expressão gênica pelo método de
comparação de C
T
, após a normalização dos resultados (descontar o C
T
obtido do gene constitutivo do C
T
de cada gene alvo de cada amostra)
onde se obteve o ∆Ct, foram realizadas comparações dos resultados
entre os diferentes grupos (pois a quantificação é relativa), gerando o
∆∆Ct. Por exemplo: Para saber a expressão do gene IL10 no grupo
SDcDP (∆Ct=10,1881) em relação ao grupo SDsDP (∆Ct=11,0443), foi
realizado o cálculo:
∆∆Ct (SDcDP – SDsDP) = 10,1881 - 11,0443
∆∆Ct (SDcDP – SDsDP) = -0.8562
Slope= -3,319
Eficiência= 100%
ACTB
60
Nesse exemplo, o grupo SDsDP é chamado de calibrador,
pois a expressão será relativa à obtida nesse grupo. No presente estudo,
houve a possibilidade de determinarem-se calibradores diferentes
dependendo da forma de se avaliar os dados. Isso foi feito como
apresentado a seguir:
a) Grupo A - B (SDcDP - SDsDP): neste grupo foi avaliado se a
Doença Periodontal faz diferença na expressão gênica de
indivíduos que apresentam Síndrome de Down;
b) Grupo A – C (SDcDP – CcDP): foi avaliado se a Síndrome de
Down interfere na expressão gênica de indivíduos com Doença
Periodontal;
c) Grupo B – D (SDsDP – CsDP): foi avaliado se a Síndrome de
Down interfere na expressão gênica de indivíduos com periodonto
saudável (sem Doença Periodontal);
d) Grupo C – D (CcDP – CsDP): foi avaliado se a Doença Periodontal
faz diferença na expressão gênica de indivíduos não portadores da
Síndrome de Down (pertencentes ao grupo Controle);
e) Grupo A+B – C+D [(SDcDP+SDsDP) – (CcDP+CsDP)]: foi avaliado
se a Síndrome de Down faz diferença na expressão gênica em
comparação a indivíduos cromossomicamente normais,
independente da presença de Doença Periodontal;
61
f) Grupo A+C – B+D [(SDcDP+CcDP) – (SDsDP+CsDP)]: foi avaliado
se a presença da Doença Periodontal faz diferença na expressão
gênica dos indivíduos, independente de serem portadores ou não
da Síndrome de Down.
Com os valores obtidos de ∆∆Ct calcula-se a
expressão relativa por meio da equação: 2
-∆∆Ct
. Seguindo o exemplo
anterior onde ∆∆Ct (SDcDP – SDsDP) = -0.8562, a expressão relativa
será: 2
– (-0.8562)
= 2
+0.8562
= 1,81. Isso significa que indivíduos com SDcDP
têm 1,81 vezes a expressão do gene IL10 em relação ao calibrador
(SDsDP). Convencionando-se o calibrador com uma expressão de IL10
de 100%, o grupo SDcDP tem uma sobre expressão de 81% em relação
ao calibrador. Esse valor de 1,81 é chamado de RQ (relative
quantification), e é o valor médio ponderado obtido para o grupo, levando-
se em consideração o número de placas envolvido no estudo e a
variabilidade estatística entre placas do mesmo grupo (teste t de Student)
de acordo com os algoritmos do RQ Study
4
. Para cada valor de RQ
obteve-se também o valor de RQ mínimo e RQ máximo, indicando os
valores extremos de expressão relativa identificados em cada grupo.
5.2 Análise da expressão gênica de SDcDP em relação a SDsDP
Analisando a expressão dos indivíduos SDcDP em
relação ao grupo SDsDP (calibrador), ou seja A – B, observou-se que há
uma sobre expressão dos genes IL10 (81%), IL10RA (152%), JAK1
62
(214%), SOCS3 (92%), IP10 (23%) e ICAM1 (95%), enquanto os genes
IL10RB (46%) e STAT3 (14%) tiveram diminuição de expressão em
relação ao (grupo) calibrador (Figura 6).
Grupo A - B
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
1
Genes
FIGURA 6 - Comparação da expressão genética dos genes IL10, IL10RA, IL10RB,
JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 do grupo SDcDP em relação ao grupo SDsDP
(calibrador).
Para verificar se existiam diferenças estatisticamente
significantes da expressão gênica entre os diferentes genes do grupo
SDcDP (em relação ao grupo SDsDP), submeteram-se os valores obtidos
de RQ (quantificação relativa = 2
-∆∆Ct
) ao teste não paramétrico de
Kruskal-Wallis. O teste foi realizado adotando-se um intervalo de
confiança de 95%, o que significa um erro α = 0,05. Obtiveram-se os
seguintes resultados (Quadro 2).
2
-
∆
∆
Ct
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1
STAT3
SOCS3
IP10
ICAM1
63
Quadro 2 - Significância das diferenças de expressão (valores RQ) entre
os diferentes genes na análise SDcDP em relação a SDsDP
Genes IL10
IL10RA
IL10RB JAK1 STAT3 SOCS3 IP10 ICAM1
IL10 - ns p=0,022 p=0,031 ns ns ns ns
IL10RA
- p=0,0007
ns p=0,019 ns ns ns
IL10RB
- p<0,0001
ns p=0,035
p=0,032
p=0,010
JAK1 - p=0,0005
p=0,020
p=0,021
ns
STAT3 - ns ns ns
SOCS3
- ns ns
IP10 - ns
ICAM1 -
ns= não significativo, ou seja, p>0,05 (teste Kruskal-Wallis).
Analisando os resultados apresentados na Figura 6 e
no Quadro 2, nota-se que indivíduos com SDcDP expressam quase o
dobro de IL10 (0,81 vezes em relação a SDsDP), juntamente com uma
alta expressão do receptor IL10RA, mas que, em contraste, a expressão
de IL10RB está significativamente menor do que a de IL10 e IL10RA.
Além disso, destaca-se a expressão de JAK1 como a maior em relação
ao calibrador e em comparação com os outros genes investigados,
mostrando expressão significativamente diferente de todos os genes
exceto IL10RA e ICAM1. No grupo SDcDP, STAT3 apresentou sub
expressão em relação a SDsDP, mas SOCS3, IP10 e ICAM1
apresentaram superexpressão, sem no entanto diferirem estatisticamente
entre si. Portanto, comparando indivíduos com SD, os resultados
indicaram que no contexto da inflamação causado pela DP houve maior
expressão do gene IL10, do seu principal receptor (IL10RA), de JAK1,
além dos genes SOCS3, IP10 e ICAM1, os quais pareceram realmente
ser responsivos à IL10.
64
5.3 Análise da expressão gênica de SDcDP em relação a CcDP
Por meio da comparação do grupo SDcDP em relação ao grupo
CcDP (calibrador), ou seja A – C, observou-se uma sutil sobre expressão
somente de dois genes: IL10RB (24%) e JAK1 (12%) (Fig 7). Portanto
foram sub expressos os genes IL10 (81%), IL10RA (24%), STAT3 (31%),
SOCS3 (87%), IP10 (57%) e ICAM1 (73%), indicando que indivíduos com
SD manifestam uma resposta imune deficitária no controle da inflamação
em comparação a indivíduos não-sindrômicos em que ambos apresentam
DP.
Grupo A - C
0
0,5
1
1,5
2
1
Genes
FIGURA 7 - Comparação da expressão genética dos genes IL10, IL10RA, IL10RB,
JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 do grupo SDcDP em relação ao grupo CcDP
(calibrador).
2
-
∆
∆
Ct
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1
STAT3
SOCS3
IP10
ICA
M1
65
Quadro 3 - Significância das diferenças de expressão (valores RQ) entre
os diferentes genes na análise SDcDP em relação a CcDP
Genes IL10
IL10RA IL10RB JAK1 STAT3 SOCS3 IP10
ICAM1
IL10 - p=0,017
p=0,017
p=0,008
p=0,021
ns ns ns
IL10RA
- ns ns ns p=0,001 ns p=0,009
IL10RB
- ns ns p=0,001 ns p=0,009
JAK1 - ns p=0,0004
ns p=0,004
STAT3 - p=0,001 ns p=0,011
SOCS3
- ns ns
IP10 - ns
ICAM1 -
No Quadro 3, pode-se verificar que a sub expressão
de IL10 é estatisticamente significativa em relação a IL10RA, IL10RB,
JAK1 e STAT3, enquanto que houve correspondência entre a baixa
expressão de IL10, SOCS3, IP10 e ICAM1. Esses dados indicam que
indivíduos com SD manifestam uma resposta imune deficitária no controle
da inflamação, dada pela sub expressão de IL10 (ação principalmente
antiinflamatória) assim como de genes responsivos à IL10 (SOCS3, IP10
e ICAM1). Um fato interessante foi, em comparação à expressão de IL10,
a elevada expressão de seus receptores e de JAK/STAT.
5.4 Análise da expressão gênica de SDsDP em relação a CsDP
Analisando a expressão do grupo SDsDP em relação ao
grupo CsDP (calibrador) observou-se uma maior expressão do gene
IL10RB (92%). A expressão do gene STAT3 foi ligeiramente (1%) maior
que a do calibrador. Os genes IL10 (73%), IL10RA (21%), JAK1 (29%),
66
SOCS3 (74%), IP10 (23%) e ICAM1 (70%) expressaram menos em
relação ao calibrador (Figura 8).
Quadro 4 - Significância das diferenças de expressão (valores RQ) entre
os diferentes genes na análise SDsDP em relação a CsDP
Genes IL10 IL10RA
IL10RB JAK1 STAT3
SOCS3 IP10 ICAM1
IL10 - ns p=0,001
ns 0,049 ns ns ns
IL10RA
- ns ns ns ns ns ns
IL10RB
- ns ns p=0,002
ns p=0,001
JAK1 - ns ns ns ns
STAT3 - ns ns ns
SOCS3
- ns ns
IP10 - ns
ICAM1 -
ns= não significativo, ou seja, p>0,05 (teste Kruskal-Wallis).
Nos indivíduos SD em comparação aos
cromossomicamente normais, ambos sem DP, foi possível notar um
padrão semelhante ao de A – C (SDcDP – CcDP) para a expressão dos
genes IL10, IL10RA, SOCS3, IP10 e ICAM1 (Figuras 7 e 8). Esse fato
parece indicar que independentemente da presença da DP a resposta
imune dos indivíduos com SD se mostra semelhante.
Grupo B - D
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1 STAT3
SOCS3
IP10 ICAM1
2
-
∆
∆
Ct
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1
STAT3
SOCS3
IP10
ICAM1
FIGURA 8 - Comparação da expressão genética dos genes IL10, IL10RA, IL10RB,
JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 do grupo SDsDP em relação ao grupo CsDP
(calibrador).
67
5.5 Análise da expressão gênica de CcDP em relação a CsDP
Ao analisar a expressão dos indivíduos CcDP em relação
ao grupo CsDP (calibrador) observou-se uma maior expressão de todos
os genes com exceção do gene da IL10RB (sub expressão em 16%).
Portanto os genes IL10 (157%), IL10RA (162%), JAK1 (98%), STAT3
(26%), SOCS3 (288%), IP10 (123%) e ICAM1 (119%) tiveram
superexpressão em relação ao calibrador.
Grupo C - D
0
1
2
3
4
5
6
1
Genes
FIGURA 9 - Comparação da expressão genética dos genes IL10, IL10RA, IL10RB,
JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 do grupo CcDP em relação ao grupo CsDP
(calibrador).
Quadro 5 - Significância das diferenças de expressão (valores RQ) entre
os diferentes genes na análise CcDP em relação a CsDP
Genes IL10 IL10RA
IL10RB JAK1 STAT3 SOCS3 IP10 ICAM1
IL10 - ns p=0,035
ns p=0,024
ns ns ns
IL10RA
- ns ns ns ns ns ns
IL10RB
- ns ns p=0,003
ns p=0,041
JAK1 - p=0,041
ns ns ns
STAT3 - p=0,001
p=0,034
p=0,032
SOCS3
- ns ns
IP10 - ns
ICAM1 -
ns= não significativo, ou seja, p>0,05 (teste Kruskal-Wallis).
2
-
∆
∆
Ct
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1
STAT3
SOCS3
IP10
ICAM1
68
Neste grupo foi analisado se a DP interferia na
expressão genética de indivíduos cromossomicamente normais.
Observou-se que os indivíduos CcDP tiveram superexpressão de IL10,
IL10RA, JAK1, SOCS3, IP10 e ICAM1 em relação ao calibrador (CsDP).
Apenas o gene da IL10RB apresentou sub expressão (16%) em relação
ao calibrador. Também é possível observar que a expressão de IL10 e
IL10RA são semelhantes, não apresentando diferença estatística entre
esses genes. Os genes SOCS3, IP10 e ICAM1 também manifestaram
aumento de expressão acompanhando a super expressão do gene IL10.
Isso reforça o conceito que os genes SOCS3, IP10 e ICAM1 são
responsivos a IL10. A análise da expressão gênica no grupo CcDP indica
que no processo inflamatório, dado pela Doença Periodontal, indivíduos
cromossomicamente normais têm o desempenho normal da resposta
imune, pois, níveis mais elevados de genes como IL10 (uma citocina anti-
inflamatória) e SOCS3 (regulador negativo da ação de citocinas)
justificam-se pela tentativa do sistema imune em conter o processo
inflamatório e restabelecer o equilíbrio.
5.6 Análise da expressão gênica de SDcDP + SDsDP em relação a
CcDP + CsDP
Ao avaliar a expressão genética em indivíduos com
SD em relação a indivíduos cromossomicamente normais (calibrador),
independente da presença de DP em ambos os grupos, observou-se
69
apenas a superexpressão do gene IL10RB (55%). Os demais genes
IL10 (78%), IL10RA (23%), JAK1 (11%), STAT3 (17%), SOCS3 (82%),
IP10 (43%) e ICAM1 (72%) foram sub expressos nos indivíduos com SD
(grupo A + B) em comparação aos indivíduos cromossomicamente
normais (grupo C + D).
Grupo (A+B) - (C+D)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1
Genes
FIGURA 10 - Comparação da expressão genética dos genes IL10, IL10RA, IL10RB,
JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 do grupo SDcDP + SDsDP em relação ao grupo
CcDP + CsDP (calibrador).
Quadro 6 - Significância das diferenças de expressão (valores RQ) entre
os diferentes genes na análise SDcDP + SDsDP em relação a CcDP +
CsDP
Genes IL10
IL10RA IL10RB JAK1 STAT3 SOCS3 IP10 ICAM1
IL10 - p=0,003
p=0,0002
p=0,004
p=0,007
ns ns ns
IL10RA
- ns ns ns p=0,0008
ns p=0,002
IL10RB
- ns ns p<0,0001
p=0,029
p=0,0001
JAK1 - ns p=0,001 ns p=0,004
STAT3 - p=0,001 ns p=0,0065
SOCS3
- p=0,043
ns
IP10 - ns
ICAM1 -
ns= não significativo, ou seja, p>0,05 (teste Kruskal-Wallis).
O padrão da expressão gênica visto na Figura 10 é
semelhante ao encontrado na análise de A – C e B – D, que também
2
-
∆
∆
Ct
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1
STAT3
SOCS3
IP10
ICAM1
70
compararam indivíduos SD em relação aos não sindrômicos. O único
gene que teve maior expressão em relação ao calibrador foi o IL10RB,
assim como observado nas análises A – C e B – D. Uma possível
explicação é o fato do gene IL10RB estar localizado no cromossomo 21,
portanto, é natural que indivíduos com a trissomia do 21 apresentem
expressão excessiva de genes localizados nesse cromossomo.
Com a fusão dos grupos A+B e a comparação de
C+D, foi possível observar o padrão de expressão dos genes em relação
à presença da SD. Nessa análise também ficou evidente a responsividade
de SOCS3 e ICAM1 à IL10. Apesar do gene IP10 ser também responsivo
à IL10, o padrão de expressão de SOCS3 e ICAM1 parecem bem mais
relacionados entre si (Figuras 6, 7 e 8), do que IP10, sugerindo que haja
outros fatores influenciando na sua expressão.
Considerando a Figura 10 e o Quadro 6 compreende-
se que indivíduos com SD em comparação aos cromossomicamente
normais apresentaram uma diminuição na expressão de IL10 e genes
responsivos a essa citocina, demonstrando uma deficiência imunológica
desses indivíduos independente da presença do processo inflamatório
ocasionado pela DP.
71
5.7 Análise da expressão gênica de SDcDP + CcDP em relação a
SDsDP + CsDP
Analisando a expressão genética dos indivíduos
SDcDP+CcDP em relação a SDsDP+CsDP (calibrador), ou seja, unindo
todos os indivíduos com DP em um mesmo grupo e todos os indivíduos
sem DP em outro grupo, independente de apresentarem SD, observou-
se maior expressão dos genes IL10 (116%), IL10RA (157%),
JAK1(150%), STAT3 (4%), SOCS3 (173%), IP10 (65%) e
ICAM1(106%). Apenas o gene IL10RB mostrou sub expressão (33%)
em relação ao calibrador. Tal padrão de expressão foi semelhante ao
demonstrado na Figura 9 para a análise C – D, onde não havia
indivíduos com SD.
Grupo (A+C) - (B+D)
0
1
2
3
4
5
6
1
Genes
FIGURA 11 - Comparação da expressão genética dos genes IL10, IL10RA, IL10RB,
JAK1, STAT3, SOCS3, IP10 e ICAM1 do grupo SDcDP + CcDP em relação ao grupo
SDsDP + CsDP (calibrador).
2
-
∆
∆
Ct
IL10
IL10RA
IL10RB
JAK1
STAT3
SOCS3
IP10
ICAM1
72
Quadro 7 - Significância das diferenças de expressão (valores RQ) entre
os diferentes genes na análise SDcDP + CcDP em relação a SDsDP +
CsDP
Genes IL10
IL10RA
IL10RB JAK1 STAT3 SOCS3 IP10 ICAM1
IL10 - ns p=0,004
ns p=0,012
ns ns ns
IL10RA
- p=0,022
ns ns ns ns ns
IL10RB
- p=0,001
ns p=0,001
p=0,034
p=0,016
JAK1 - p=0,003
ns ns ns
STAT3 - p=0,004
ns p=0,042
SOCS3
- ns ns
IP10 - ns
ICAM1 -
ns= não significativo, ou seja, p>0,05 (teste Kruskal-Wallis).
Considerando a Figura 11 e o Quadro 7, é possível
compreender que a DP (independentemente da presença de SD)
promoveu a superexpressão de todos os genes investigados neste
estudo (com exceção de IL10RB), com destaque para IL10, SOCS3 e
ICAM1 pela sua importância na resposta imune conduzindo o sistema a
controlar o processo inflamatório e restabelecer o equilíbrio.
De forma geral, neste estudo foi possível notar que
indivíduos normais (sem síndrome) expressam mais IL10 e outros genes
a ele relacionados do que indivíduos com Síndrome de Down,
independente de terem DP.
Comparando-se os genes IL10, SOCS3, ICAM1 e
IP10, observou-se que os indivíduos sem SD expressam em média 2,8
vezes mais que os indivíduos sindrômicos frente ao mesmo estímulo
inflamatório (DP). Portanto, indivíduos com SD apresentaram
73
imunodeficiência quando comparados com indivíduos
cromossomicamente normais.
74
Discussão
75
6 Discussão
No delineamento deste estudo houve o intuito de
selecionar indivíduos com SD que apresentassem DP e indivíduos com
SD sem DP, por esse motivo a faixa etária de indivíduos com SD foi
ampla (6 a 40 anos). Há grande prevalência de gengivite em indivíduos
com SD mais jovens (de 4 a 10 anos)
65
, ocorrendo evolução para
periodontite na adolescência numa prevalência de 30% a 40%, subindo
para cerca de 100% em indivíduos com idade próxima aos 30 anos
75
.
Pelos critérios clínicos periodontais estabelecidos neste estudo,
indivíduos com gengivite estão incluídos nos grupos sem DP, juntamente
com indivíduos com periodonto plenamente saudável. Assim, no grupo
SDsDP, onde também há indivíduos com gengivite, nota-se que a idade
média é 18,6 anos menor em relação ao grupo SDcDP, onde estão
incluídos somente indivíduos com periodontite estabelecida, inclusive com
perda óssea. Portanto, a idade média dos indivíduos nos grupos com SD
encontrada neste estudo concorda com o relatado na literatura.
Foram feitas tentativas de pareamento principalmente
por idade, seguida do gênero, entre os grupos com SD e sem síndrome,
pois desta forma essas variáveis teriam menor influência na comparação
da expressão gênica entre os grupos. Houve dificuldade para compor o
grupo CcDP com indivíduos na faixa etária de 25 a 35 anos, pois a
periodontite em indivíduos cromossomicamente normais afeta com maior
prevalência indivíduos com idade superior aos 40 anos
50
. O tipo de DP
76
que afeta preferencialmente indivíduos jovens até cerca de 35 anos
sistemicamente (e cromossomicamente) normais, é a periodontite
agressiva
96
.
Pelo fato de crianças e adolescentes com SD terem
alta prevalência de gengivite e que esta se manifesta de forma extensiva
progredindo rapidamente para periodontite
14,64,81
, é de extrema
necessidade o acompanhamento odontológico desses pacientes com
medidas de motivação de higiene oral (envolvendo inclusive os
responsáveis e/ou cuidadores do paciente) e controle de placa bacteriana,
no intuito de prevenir e/ou conter o processo inflamatório da
periodontite
22,79
.
Está comprovado que a DP é causada por fatores
etiológicos locais, especialmente a placa bacteriana, mas distúrbios
sistêmicos podem reduzir ou alterar a resistência ou a resposta do
hospedeiro e então predispor a alterações periodontais
25
. Em vista disto,
o fator etiológico e a reação tecidual não podem ser equacionados como
uma simples reação de causa e efeito, além disso, não se pode atribuir
aos fatores locais (com sua intensidade, freqüência e duração) toda a
responsabilidade do processo, pois os tecidos são governados pelo
estado de saúde geral do paciente
52
.
A higiene oral precária dos indivíduos com SD por si
só não é o fator determinante da DP, pois foi observado que a prevalência
de DP foi maior em crianças com SD do que em crianças com retardo
77
mental
21,95
. Em outro estudo semelhante onde foram analisados pacientes
com SD, pareados por idade com pacientes com retardo mental, mas sem
SD, observou-se que os indivíduos com SD também apresentavam
prevalência maior de DP
82
. Agholme et al.
2
(1999) observaram que
indivíduos com SD apresentaram uma perda óssea alveolar de 74% em
um estudo longitudinal de 7 anos de acompanhamento, mostrando assim
a rápida evolução da DP nesses indivíduos com idade média de 23,5
anos. Essa rápida evolução da DP nos indivíduos com SD pode ser
explicada por deficiências no sistema imunológico
75,76
.
Os indivíduos com SD apresentam alterações no
sistema imune como funções diminuídas de quimiotaxia e fagocitose por
neutrófilos e linfócitos
4,32,45,49,93
e ativação defeituosa de linfócitos T
85
.
Também foi observado que a proporção de imunoglobulina G1 (IgG1) em
indivíduos com SD é maior que em indivíduos normais
7
. Fibroblastos
gengivais de portadores de SD estimulados com lipopolissacarídeos
(LPS) de A.a. expressam mais ciclooxigenase 2 (COX-2) que induz a
produção de prostaglandina E
2
(PGE
2
), a qual é um potente estimulador
de reabsorção óssea, e que esta se apresenta em níveis elevados no
fluido gengival de portadores de SD
8,70
.
A investigação mais ampla em busca de conhecer
outras diferenças envolvendo a resposta imune de indivíduos com SD em
relação àqueles cromossomicamente normais frente à DP, é necessária
em vista da pouca informação existente nessa área, considerando-se a
78
magnitude de mecanismos da resposta imune que participam do processo
inflamatório.
Este estudo focou de forma inédita a expressão de
genes que fazem parte da cascata de sinais da IL-10 em indivíduos com e
sem SD frente à DP. Lembrando que a IL-10 é uma citocina com ação
principalmente anti-inflamatória e que faz parte da resposta imune tipo
Th2
26
, observou-se neste estudo que indivíduos com DP mas sem SD
manifestaram super expressão de IL10 como uma forma de conter o
processo inflamatório desencadeado pela DP (Fig. 9). Esse resultado
condiz com o de Garlet et al.
30
(2003) que mostra maior expressão de
IL10 no tecido gengival de indivíduos com Doença Periodontal Crônica
em comparação com indivíduos sem DP. Também foi demonstrado que a
IL-10 tem papel inibidor sobre a ação de LPS de T.forsythensis
que é uma
bactéria importante no desenvolvimento da DP
98
.
Indivíduos com SD, independente de apresentarem
DP, manifestaram uma sub expressão de IL10 (Figuras 7, 8 e 10). Dentre
os indivíduos que têm SD (A – B), o processo inflamatório dado pela DP
promove maior expressão IL10 numa tentativa de conter a inflamação. No
entanto, nota-se que a expressão de IL10 é quase a metade (82% -
Figura 6) em comparação à expressão de IL10 nos indivíduos que não
tem síndrome (157% - Figura 9) e 1,4 vezes menor que aqueles que têm
DP independentemente da SD (116% - Figura 11), frente ao mesmo
estímulo inflamatório dado pela DP.
79
Para iniciar a sinalização da IL-10, esta citocina tem
que se ligar a receptores na superfície celular, que são os IL10RA e
IL10RB
23,38,48,58,61
. A IL10 se liga primeiramente ao IL10RA por apresentar
uma alta afinidade com esse receptor. Em seguida, depois de já ligados
IL10/IL10RA, o receptor IL10RB se associa ao complexo
48
. Esse
mecanismo funcional concorda com os achados desta pesquisa, já que, o
nível de expressão de IL10 foi compatível com a do IL10RA nas
comparações independentes da SD (Figuras 9 e 11). Nos indivíduos com
SD quando comparados com diferentes calibradores formados por
indivíduos sem síndrome (Figuras 7, 8 e 10), a expressão de IL10 e
IL10RA foi proporcional, mostrando uma deficiência principalmente na
expressão de IL10 (de 78 a 81%) e em menor nível de IL10RA (de 21 a
24%).
É possível notar uma super expressão de IL10RB nos
grupos onde a SD é o fator diferencial em relação ao calibrador (24%
Figura 7; 92% Figura 8; 55% Figura 10). Esse resultado condiz com o fato
do gene IL10RB estar localizado no cromossomo 21
74
. Os indivíduos com
SD apresentam um cromossomo 21 a mais, o que explica a super
expressão desse gene em relação a indivíduos cromossomicamente
normais.
A ligação de IL10 aos receptores dá início à
transdução do sinal para o meio intracelular que inclui a fosforilação de
JAK1, que está associada ao IL10RA (Figura 2)
23,48
. Resultados obtidos
80
nesta pesquisa comprovam uma correspondência entre os níveis de
expressão de IL10RA e JAK1, uma vez que não houve diferença
estatística em nenhuma das comparações entre os diferentes grupos para
os níveis de expressão de IL10RA e JAK1 (Quadros 2, 3, 4, 5, 6 e 7).
Segundo Donnelly et al.
23
(1999) o STAT3 é um fator
de transcrição essencial na via de sinalização de IL10, sendo, portanto
ativado pela IL10. Já para Crepaldi et al.
20
(2001), Kinjyo et al.
46
(2006) e
Cassatella et al.
17
(1999) a expressão de STAT3 não é completamente
dependente do gene IL10. Neste estudo comparando os níveis de
expressão de IL10 e STAT3, os resultados parecem concordar com a
idéia de correlação entre IL10 e STAT3, pois viu-se que havia uma
diferença estatística entre eles (Quadros 3, 4, 5, 6 e 7), exceto para a
comparação dos grupos A-B. Portanto, os resultados deste estudo
parecem indicar uma relação significante na expressão de IL10 e STAT3,
pois também se observa que quando a expressão de IL10 aumenta a
expressão de STAT3 diminui (Figuras 9 e 11) ou o contrário (Figuras 7, 8
e 10). Além disso, analisando os níveis de expressão de STAT3 não se
observou diferença estatística nas diferentes comparações entre grupos,
portanto, neste estudo a expressão de STAT3 apresentou-se
independente da presença de SD e/ou DP (Figuras 6, 7, 8, 9, 10 e 11).
A expressão de IL10 induz rapidamente (30 min.) a
expressão de SOCS3 pela habilidade de induzir a fosforilação de tirosina
do STAT3
41
. Donnelly et al.
23
(1999) concorda com Ito et al.
41
(1999) ao
81
afirmar que IL10 induz a expressão de SOCS3 em monócitos. Analisando
as diferentes comparações entre os grupos investigados neste estudo,
(Figuras 6, 7, 8, 9, 10 e 11) observa-se uma equivalência de expressão
entre o IL10 e SOCS3, o que concorda com a afirmação de que IL10
induz a expressão de SOCS3
41,89
. É possível notar que quando a
expressão de IL10 aumenta, a expressão de SOCS3 também aumenta
nas comparações evidenciando a presença da DP (Figuras 6, 9 e 11);
quando IL10 diminui, SOCS3 parece acompanhá-lo nas comparações
evidenciando a presença da SD (Fig 7, 8 e 10). Como SOCS3 funciona
como um feedback negativo para o IL10
100
, acredita-se que o organismo
imunocompetente busque um equilíbrio entre a expressão desses genes,
controlando assim o processo inflamatório
59
. No entanto, em um
organismo com resposta imune deficiente, como no caso deste estudo
que foca indivíduos com SD, tanto IL10 quanto SOCS3 estão expressos
em níveis menores (1,9 vezes para IL10 e 3 vezes para SOCS3). Em
outras palavras, evidenciando a presença de DP como estímulo
inflamatório, indivíduos cromossomicamente normais têm super
expressão de IL10 (157%) e de SOCS3 (288%) (Figura 9), já indivíduos
com SD têm níveis bem menores de expressão de IL10 (81%) e SOCS3
(92%).
A IL-10 pode inibir a expressão de alguns genes que
são induzidos pelo IFN-γ, dentre eles citam-se o ICAM1 e IP10
41,92
. Ito et
al.
41
(1999) demonstrou em monócitos humanos que IL-10 inibiu a
82
expressão dos genes IP10 e ICAM1. A habilidade de IL-10 em inibir
ICAM1 e IP10 está correlacionada com a indução de SOCS3
41
. A
expressão de SOCS3 atuaria como um gene intermediário na via de
inibição da expressão de outros genes como IP10 e ICAM1
41
. Tanto o
ICAM1 como o IP10 apresentam uma seqüência ativadora interferon
gama (GAS) na sua região promotora
41
, a qual tem função semelhante ao
elemento ligante de STAT (SBE) presente na região promotora do
SOCS3
23
. Os achados desta pesquisa mostram uma responsividade à
IL10 pelos genes SOCS3 e ICAM1 (Figuras 6, 7, 8, 9, 10 e 11). A
expressão do gene IP10 não apresentou uma relação tão estreita com a
expressão dos genes IL10, SOCS3, e ICAM1, como se pode observar
principalmente na Figura 10. Esses dados podem ser interpretados como
uma indicativa de que na expressão de IP10 haveria influência de outros
genes que não aqueles presentemente investigados (ex. STAT1).
Segundo Luster et al.
60
(1995), Sgadari et al.
86
(1996) e Xia et al.
101
(1997), o IP10 tem maior expressão nos processos inflamatórios crônicos.
Essa afirmativa concorda com os resultados visualizados nas Figura 9
(superexpressão em 123%), Figura 11 (65%), e em menor nível (23% -
Figura 6); onde se nota maior expressão de IP10 nos grupos com DP
(processo inflamatório) quando comparados a um calibrador formado por
um grupo que não tinha DP.
Em um estudo que investigou a expressão genética
no timo de quatro crianças com SD pareadas por idade com crianças sem
83
síndrome, demonstrou que ICAM1 foi mais expresso nos indivíduos com
SD e que a distribuição de ICAM1 na região cortical e medular do timo
estava alterada em comparação com indivíduos cromossomicamente
normais
66
. Essa elevada expressão de ICAM1 e sua distribuição anômala
no timo pode levar à interação aumentada e inapropriada entre os
timócitos em desenvolvimento e o estroma do timo
66
. Essas interações
aberrantes podem resultar em deleção aumentada de timócitos no timo de
indivíduos com SD e explicam a depleção cortical
10,55
, além da proporção
diminuída de linfócitos maduros expressando altos níveis de TCR-α,β e
CD3 no timo de indivíduos com SD
66
. Diferentemente do timo, neste
estudo em que foi avaliada a expressão genética em tecido gengival,
observou-se que indivíduos com SD manifestaram sub expressão de
ICAM1 (72%) em comparação com indivíduos cromossomicamente
normais, independentemente de terem DP (Figura 10). Considerando que
a expressão de ICAM1 é um fator importante no mecanismo de adesão
de linfócitos T CD8
+
a células apresentadoras de antígenos, pode-se
depreender que se indivíduos com SD expressam menos ICAM1 isso
pode contribuir com a imunodeficiência que esses indivíduos apresentam.
Um importante dado que dá suporte à essa suposição foi a constatação
de que linfócitos de indivíduos com SD são menos adesivos a ICAM1 em
relação a indivíduos cromossomicamente normais, embora a expressão
de LFA1 tenha sido compatível entre eles; portanto, linfócitos de
indivíduos com SD têm menos adesividade comparando-se a indivíduos
84
sem síndrome
56
. No entanto, no presente estudo foi observado que em
indivíduos cromossomicamente normais frente à DP, ICAM1 está super
expresso (119% - Figura 9; 106% - Figura 11) acompanhando a super
expressão de IL10 e SOCS3. Esse resultado concorda com dados prévios
que demonstraram maior expressão de ICAM1 em biópsias de tecido
gengival de indivíduos com periodontite e (em menor grau) com
gengivite
51
, assim como em cultura de células (indivíduos
cromossomicamente normais) de: a) epitélio oral após indução por
produtos solúveis de Eikenella corrodens, um importante
periodontopatógeno
103
; b) células endoteliais após estímulo de P.
gingivalis
78
; c) monócitos e células de ligamento periodontal após indução
por periodontopatógenos do gênero Treponema
53
; d) fibroblastos
gengivais após estímulo com a citocina pró-inflamatória IL-2
71
.
Do presente estudo, que permitiu várias comparações
entre grupos com diferentes calibradores resultando em várias
informações, de forma geral, depreendeu-se que os genes IL10, SOCS3,
IP10 e ICAM1 foram os que mais se destacaram, demonstrando
expressão significativamente menor em indivíduos com SD independente
da presença de DP (A+B – C+D), comparando-se aos indivíduos
cromossomicamente normais com DP (C-D). Adicionalmente, entre
indivíduos com SD, os que têm DP (A-B) mostraram uma elevação da
expressão desses mesmos genes em relação à comparação (A+B –
C+D), mas esta foi cerca de 2,8 vezes menor que a expressão observada
85
em indivíduos cromossomicamente normais (C-D), frente ao mesmo
estímulo inflamatório dado pela DP. Esses dados parecem indicar que
indivíduos com SD têm deficiência em um importante mecanismo da
resposta antiinflamatória que parece ser inerente à trissomia do
cromossomo 21, e que mesmo entre indivíduos com SD o controle da
inflamação é menor se comparado a indivíduos com número normal de
cromossomos. Isso provê uma nova informação à gama de mecanismos
da resposta imune que se mostram deficientes em indivíduos com
SD
4,9,32,45,49,56,85,93
. O menor controle da resposta inflamatória dada pela
sub expressão dos genes IL10, SOCS3, IP10 e ICAM1 em indivíduos com
SD em relação aos cromossomicamente normais, pode explicar em parte
a maior susceptibilidade que indivíduos com SD manifestam a doenças
infecciosas e inflamatórias relacionadas, por exemplo, ao aparelho
respiratório
11
e periodontais
6
.
Acredita-se que os achados dessa pesquisa
contribuem com a compreensão mais aprofundada do comportamento
do sistema imune de indivíduos com SD frente à DP, ou independente
dela, revelando outros aspectos da resposta imune que se apresentam
deficientes nesses indivíduos em comparação com aqueles
cromossomicamente normais. Isso pode nortear outros grupos de
pesquisadores em busca de terapias mais direcionadas e eficientes em
indivíduos com SD, como novos fármacos, o que poderia proporcionar
86
melhoria da saúde dos portadores da SD e ganhos inestimáveis à sua
qualidade de vida e dos seus responsáveis.
87
Conclusão
88
Conclusão
Em tecido gengival humano, ao avaliar a expressão
do gene IL10 e outros relacionados à sua cascata de ação em indivíduos
com Síndrome de Down frente à Doença Periodontal, comparando-se a
indivíduos cromossomicamente normais com e sem DP observou-se que:
• indivíduos com SD apresentaram uma expressão
significativamente maior do gene IL10RB, o qual reside no
cromossomo 21;
• indivíduos com SD independente da presença de DP (A+B – C+D),
têm expressão significativamente menor dos genes IL10 (p=0,001),
SOCS3 (p<0,0001), IP10 (p=0,002) e ICAM1 (p=0,0001) que
indivíduos cromossomicamente normais com DP (C-D), indicando
uma imunodeficiência em um importante mecanismo de controle da
inflamação que parece ser inerente à SD;
• indivíduos com SD frente à DP apresentaram uma elevação na
expressão dos genes IL10, SOCS3, IP10 e ICAM1 como uma
tentativa de controlar a inflamação, mas mesmo assim, ainda
apresentaram 2,8 vezes menor expressão que indivíduos sem
síndrome frente ao mesmo estímulo inflamatório dado pela DP.
89
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104
Anexos
105
Anexo 1
Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo 2
Gene Alvo Número de Acesso
Primer Produto
Tm (ºC)
Tipo Sequencia Região de Anelamento
Comprimento
Amplicon (pb)
β-Actina
NM_001101.3
F 5’ AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA 3’ 1509 - 1530
88 58
R 5’ AATTTACACGAAAGCAATGCTATCA 3’ 1596 - 1572
IL-10 NM_000572
F 5’ GCCAGGGCACCCAGTCT 3’ 121-137
74 58
R 5’ TCGGAGATCTCGAAGCATGTT 3’ 194-174
IL10-RA NM_001558
F 5’ CGCTCCTGAGGTATGGAATAGAG 3’ 253-275
115 58
R 5’ GCCCGGTAGCCATTGCT 3’ 367-351
IL10-RB NM_000628
F 5’ AATGGAGTGAGCCTGTCTGTGA 3’ 707-728
90 58
R 5’ TGAAGACCGAGGCCATGAG 3’ 796-778
JAK-1 NM_002227
F 5’ GTCACAACCTCTTTGCCCTGTAT 3’ 470-492
91 58
R 5’ CGGAGGGACATCTTGTCATCA 3’ 560-540
STAT-3 NM_139276
F 5’ TGCTGAAATCATCATGGGCTATA 3’ 2190-2212
90 58
R 5’ TCCTTGGGAATGTCAGGATAGAG 3’ 2279-2257
SOCS3 NM_003955
F 5’ TCCCCCCAGAAGAGCCTATT 3’ 893-912
90 58
R 5’ GTCTTCCGACAGAGATGCTGAA 3’ 1003-982
IP-10 NM_001504
F 5’ ACTGCCCTTCTCATTTGGAAAC 3’ 1410-1431
100 58
R 5’ CCTGGGCTGTGGCTTCAT 3’ 1509-1492
ICAM-1 NM_000201
F 5’ GAAAATTCCCAGCAGACTCCAA 3’ 1288-1309
94 59
R 5’ CGATGGGCAGTGGGAAAGT 3’ 1381-1363
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