Assim, a técnica de PCR em tempo real foi realizada utilizando-se, para um
volume final de 20 µL: 1µL de cDNA de cada amostra, 0,6µL de cada primer à
concentração de 10mM, 8,95µL de H
2
O ultra pura, 3µL de 10X PCR Buffer
(Invitrogen, Brasil), 1,2µL de MgCl
2
a concentração de 50mM (Invitrogen, Brasil),
2,4µL de dNTP’s a concentração de 2,5mM, 1,5µL de DMSO (Dynal Biotech ASA,
Oslo, Norway), 0,45µL de taq platinum DNA polimerase (5U/µL) (Invitrogen,
Brasil) e 0,3µL de SYBR Green.
As condições determinadas para a reação foram: 40 ciclos, 10 minutos à
95ºC (aquecimento inicial), 15 segundos à 95ºC (desnaturação), 60 segundos à
60ºC (anelamento) e 60 segundos à 72ºC (extensão), estas condições foram
determinadas para os três primers desenhados.
Esta PCR avalia o acúmulo do produto na fase logarítmica da reação de
amplificação, o qual está diretamente relacionado à quantidade de molde
existente no início da reação, sendo atualmente considerado um método bastante
preciso e reprodutível para a quantificação da expressão gênica.
Utilizamos o sistema de detecção por SYBR Green, que se baseia no uso
de uma molécula fluorescente, denominada SYBR Green Ι, que quando
intercalada à dupla fita da DNA, passa a ser detectável (WALKER, 2002). Durante
os ciclos iniciais da reação de PCR, o sinal de fluorescência emitido pelo SYBR
Green
Ι
é fraco para ser detectado, isto é, não ultrapassa o sinal de fluorescência
de fundo. Entretanto, no decorrer dos ciclos da reação de PCR, há o aumento do
produto amplificado e conseqüentemente o aumento do sinal de emissão de
fluorescência, passando a ser detectável, sendo assim os valores são
quantificados depois de um número fixo de ciclos, o que representa a quantidade
final de cada produto acumulado, diferente da reação de PCR convencional
(GINZINGER, 2002). A metodologia que utiliza o SYBR Green
Ι
exige cuidadosa
padronização, uma vez que este fluorócromo se intercala a qualquer molécula de
dupla fita presente na reação. A especificidade da detecção de fluorescência com
SYBR Green
Ι
pode ser comprometida pela formação de dímeros de
oligonucleotídeos, pela concentração inadequada de oligonucleotídeos e pela
formação de produtos de amplificação inespecíficos. Todos estes fatores levam à