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como um fator de virulência com um importante papel na patogenicidade, participando nos
processos de adesão, agregação e simbiose (PYROG 2001).
Polissacarídeos são antigenicamente importantes, como antígenos e também podem estar
envolvidos em mecanismo de reconhecimento célula-célula ou célula-hospedeiro (AHRAZEM et al,
1997). No processo de adesão o fungo invasor conecta-se com resíduos de manose presentes na
membrana plasmática da célula e utiliza resíduos de
N-
acetilglucosamina no processo de ingestão
(LIMONJI et al., 1997). Os fungos da família Herpotrichiellaceae utilizam resíduos de polissacarídeos
para aderirem e entrarem em células a serem parasitadas.
De acordo com (MATSUYAMA et al. 1999),
D
-glucose,
D
-galactose e
D
-manose estão
presentes em muitos EPS na forma piranosídica. Yurlova e Hoog, (2002), observaram que a
quantidade de EPS produzida é diferente quando se cultiva fungos dematiáceos em variados
meios de cultura. A caracterização destes polímeros possibilita esclarecer o papel destas
estruturas durante o processo infeccioso (ALVIANO et al, 1992).
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a linhagem HCEML do fungo
Exophiala
spinifera,
agente de feohifomicose sistêmica, por meios de marcadores morfológicos, moleculares
e bioquímicos caracterizando os polissacarídeos sintetizados por este agente visando determinar
o potencial patogênico desta linhagem através de imunoensaios.
Material e métodos
Extração e quantificação do DNA
A amostra foi cultivada em ágar Sabouraud por sete dias a 28°C. Em seguida 1 cm² do
micélio foi macerado em uma mistura esterilizada com 300
µ
L de tampão CTAB e sílica gel/celite
2:1 por cinco minutos. Adicionou-se 200
µ
L de tampão CTAB, misturando bem em agitador de
tubos e incubado por dez minutos a 65 °C. Após a incubação foram adicionados 500
µ
L de
clorofórmio seguida de centrifugação por cinco minutos a 20500 G. O sobrenadante foi transferido
para outro tubo tipo “eppendorf”, ao qual foram adicionados 800
µ
L de etanol 96% gelado e
colocado no freezer (-20°C) por trinta minutos, para precipitação do DNA. Foi feita nova
centrifugação a 20500 G por cinco minutos seguida da retirada do sobrenadante. O precipitado de
DNA foi lavado com 500
µ
L de álcool 70% gelado e misturado cuidadosamente. Em seguida foi
realizado nova centrifugação a 20500 G por cinco minutos, retirada do sobrenadante e o DNA foi
deixado desidratando a temperatura ambiente por 15 minutos (com o tubo aberto e vertido). O
pellet
foi ressuspendido em solução contendo 97,5
µ
L de tampão TE e a mistura incubada a 37°C
por cinco minutos. A integridade do DNA foi verificada em gel de agarose 0,8% e os DNAs
armazenados à temperatura de -20ºC.
PCR – Ribotipagem e Purificação dos Produtos da PCR
Fragmentos de DNA ribossômico foram amplificados usando os pares de
primers
V9D e
LS266. Para a reação de PCR foi utilizado um volume de 50,3
µ
L contendo 25
µ
L de água ultra
pura; 10 mM tris-HCl; 1,5 mM MgCl
2
6H
2
O; 200 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfatado; 50
pmol de cada
primer
; 0,5 U de Taq DNA polimerase, 2
µ
L de DMSO e entre 10 - 100 ng de DNA
total. O programa de amplificação utilizado consistia de 30 ciclos (30s de desnaturação a 99°C;
60s de anelamento a 55°C; 60s de síntese a 72°C), utilizando dois minutos para a desnaturação
inicial e três minutos de extensão final. Os produtos foram aplicados em gel de agarose 1,6%
(utilizando 7
µ
L de amostra e 3
µ
L de tampão de amostra). O gel foi corado em solução de
Brometo de etídio e os fragmentos de amplificação obtidos foram visualizados em foto-
documentador de gel. O marcador de peso molecular utilizado foi de 1 Kb. Ao tubo da amplificação
foi adicionado 2/3 do volume já existente de acetato de amônia 7,5 M e 2,5 vezes o volume de
amplificação com etanol 96°, foi incubado por 5 minutos. Em seguida realizou-se centrifugação a
20500 G por 15 minutos e o sobrenadante foi descartado. Ao precipitado foi acrescido 100
µ
L de etanol
70% e nova centrifugação a 20500 G por 15 minutos foi realizada. O sobrenadante foi descartado e o
pellet
de DNA secado a vácuo e em seguida suspenso em 15
µ
L de água ultra-pura. Os produtos da
purificação foram visualizados em gel de agarose 1,6% utilizando fago lambda (
λ
Ø) digerido como
marcador de peso molecular referencial para a determinação da concentração do DNA.